JP2005052145A - 前立腺上皮細胞を除去または死滅させるための生物学的試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】前立腺特異的膜抗原の外膜ドメインに結合する生物学的試薬の使用であって、正常な前立腺上皮細胞、良性の過形成前立腺上皮細胞、および癌性前立腺上皮細胞を除去または死滅させる組成物を製造するための使用。
【選択図】 なし
Description
C=シトシン、A=アデノシン、
T=チミジン、G=グアニン。
1つの実施態様では、pSPORT/ベクター(Gibco −BRL)のNot I/SalI部位中にPSM配列をクローニングしする。このプラスミドp55A-PSMは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づき1992年8月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection(ATCC),12301, Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.)に寄託されている。プラスミドp55A-PSMには、ATCC受託番号75294が付与されている。
<材料および方法>:
該遺伝子をクローニングするためのアプローチには、免疫沈降法による該抗原の精製、およびポリメラーゼ連鎖反応(19, 20)で後で用いる縮重オリゴヌクレオチドプライマーの合成に使用するためのいくつかの内部ペプチドのミクロシークエンシングが必要とされた。部分cDNAをPCR生成物として増幅し、これを相同性プローブとして使用して、LNCaP(前立腺のリンパ節癌)細胞株cDNAプラスミドライブラリー(8)から完全長cDNA分子をクローニングした。
低張性溶解の後、ショ糖密度勾配上で遠心分離を行うことにより、膜タンパク質を細胞から単離した(21)。10〜20μgのLNCaP、DU−145およびPC−3膜タンパク質を、10%SDS−PAGE分離ゲルおよび4%濃縮用ゲル中、9〜10ミリアンペアで16〜18時間電気泳動した。タンパク質をトランスファーバッファー(48mMトリス塩基、39mMグリシン、20%メタノール)中、25ボルト、4℃で一晩、PVDF膜(Millipore Corp.)にエレクトロブロットした。膜をTSB(0.15M NaCl、0.01Mトリス塩基、5%BSA)中で30分間、室温でブロッキングし、ついで10〜15μg/mlのCYT−356モノクローナル抗体(Cytogen Corp.)と共に2時間インキュベートした。ついで、膜を10〜15μg/mlのウサギ抗マウス免疫グロブリン(Accurate Scientific)と共に室温で1時間インキュベートし、ついで125I−プロテインA(AmershamTM)と共に1×106cpm/mlで室温でインキュベーションした。ついで膜を洗浄し、−70℃で12〜24時間オートラジオグラフィーに付した(図1)。
免疫組織化学的検出のアビジン−ビオチン法を用いて、PSM抗原発現に関してヒト組織切片および細胞株の両方を分析した(22)。クリオスタット切断前立腺組織切片(4〜6μm厚)をメタノール/アセトン中で10分間固定した。ガラススライド上で、50,000細胞/100μl/スライドを用いて細胞サイトスピン(cytospin)を作製した。あらゆる内因性ペルオキシダーゼ活性を除去するために、サンプルをPBS中1%過酸化水素で10〜15分間処理した。組織切片をPBS中で数回洗浄し、ついで適切なサプレッサー血清と共に20分間インキュベーションした。該サプレッサー血清を排出し、ついで該切片または細胞を、該希釈CYT−356モノクローナル抗体と共に1時間インキュベーションした。ついでサンプルをPBSで洗浄し、第2抗体(ウマまたはヤギ免疫グロブリン、1:200希釈、30分間)およびアビジン−ビオチン複合体(1:25希釈、30分間)と順次インキュベーションした。色素原としてDABを使用し、ついでヘマトキシリン対比染色し、封入した。それぞれの実験では、2通りの細胞サイトスピンおよび前立腺サンプルの凍結切片を対照として用いた。陽性対照として、前記と同じ方法に従い、抗サイトケラチンモノクローナル抗体CAM5.2を使用した。組織切片は、該細胞の少なくとも5%が免疫反応性を示せば、PSM抗原を発現するとみなした。得点系は、以下のとおりである:1=<5%、2%=5〜19%、3=20〜75%、および4=>75%陽性細胞。同質性対異質性は、陽性および陰性細胞を3〜5の高性能光学顕微鏡視域(400×)で評価し、100〜500個の細胞中の陽性細胞の割合を記録することにより計数した。免疫染色の強度は、1+〜4+の範囲で評価し、陽性対照に対して、1+は穏やか、2〜3+は適度、および4+は強力な免疫染色を表すこととした。
100mmペトリ皿中の80%集密性のLNCaP細胞を、メチオニンを含まないRPMI培地中において2時間飢餓状態にし、ついで35S−メチオニンを100μCi/mlで加え、該細胞をさらに16〜18時間増殖させた。ついで、細胞を洗浄し、4℃で20分間インキュベーションしながら、1mlの溶解緩衝液(1%トリトンX−100、50mMヘペス,pH7.5、10%グリセロール、150mM MgCl2、1mM PMSFおよび1mM EGTA)を加えることにより該細胞を溶解した。溶解物を、4℃で90分間、パンソルビンセル(PansorbinTM cells; CalbiochemTM)と混合することにより前清澄化した。ついで細胞溶解物を、4℃で3〜4時間、CYT−356抗体(Cytogen Corp.)およびRAM抗体(Accurate Scientific)に前結合させたプロテインAセファロース CL−4Bビーズ(PharmaciaTM )と混合した。ペトリ皿当たり3mgのビーズ当たり12μgの抗体を使用した。ついでビーズをHNTG緩衝液(20mMヘペス, pH7.5、150mM NaCl、0.1%トリトンX−100、10%グリセロールおよび2mMオルトバナジン酸ナトリウム)で洗浄し、β−メルカプトエタノールを含有するサンプル添加緩衝液中に再懸濁し、95℃で5〜10分間変性させ、10%SDS−PAGEゲルおよび4%濃縮用ゲル上、10ミリアンペアで一晩移動させた。ゲルをクーマシーブルーで染色し、酢酸/メタノールで脱染し、真空乾燥機中60℃で乾燥した。ついでゲルを−70℃で16〜24時間オートラジオグラフィーに付した(図2A〜2D)。
約6×107のLNCaP細胞を含有する8個の集密化したペトリ皿を用いて、免疫沈降のための前記方法を繰り返した。該免疫沈降産物をプールし、10%SDS−PAGEゲルの2つのレーンに添加し、9〜10ミリアンペアで16時間電気泳動した。タンパク質を、トランスファーバッファー中、75ボルト、4℃で2時間、ニトロセルロースBA−85膜(Schleicher and Schuell TM )上にエレクトロブロットした。膜をポンソーレッドで染色して、該タンパク質を可視化し、その100kDタンパク質のバンドを切り出し、可溶化し、トリプシンでタンパク質分解的に消化した。ついで、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)171C型を用いて、該消化サンプルのHPLCを行い、明らかな主ペプチドピ−クを選び、改変ポストリキッド(post liquid)アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)477A型タンパク質/ペプチドミクロシークエンサー上の改変エドマン分解により配列決定した(23)。該ペプチドのすべての配列決定データが本明細書中に含まれている。PSM抗原を免疫沈降法により精製し、エレクトロブロッティングによりPVDF膜(Millipore )へ移すことを含む同様の方法により、PSM抗原のアミノ末端を配列決定した。タンパク質を、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)477A型タンパク質/ペプチドシークエンサー上で分析したところ、該アミノ末端がブロックされていることが判明し、したがって、この技術により配列データを得ることはできなかった。
2T17 #5 SLYES(W)TK(配列番号)
2T22 #9 (S)YPDGXNLPGG(g)VQR(配列番号)
2T26 #3 FYDPMFK(配列番号)
2T27 #4 IYNVIGTL(K)(配列番号)
2T34 #6 FLYXXTQIPHLAGTEQNFQLAK(配列番号)
2T35 #2 G/PVILYSDPADYFAPD/GVK(配列番号)
2T38 #1 AFIDPLGLPDRPFYR(配列番号)
2T46 #8 YAGESFPGIYDALFDIESK(配列番号)
2T47 #7 TILFAS(W)DAEEFGXX(q)STE(e)A(E)...(配列番号)
注:Xは、この位置で残基を同定できなかったことを意味する。大文字は同定結果を示すが、信頼性は低い。(小文字)は、存在するが非常に低レベルである残基を意味する。...は、配列が続くが検出限界未満であることを示す。
前記ペプチドの部分に対応する長さのセンスおよびアンチセンス5'−非リン酸化縮重オリゴヌクレオチドプライマーの17〜20ヌクレオチドを、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)394A型DNAシンセサイザー上で合成した。これらのプライマーは、32〜144の縮重を有する。使用したプライマーを以下に示す。該ペプチド中の下線を付したアミノ酸は、プライマー設計で使用した残基を示す。
PSMプライマー「A」 TT(CまたはT) - TA (CまたはT) - GA (CまたはT) - CCX - ATG - TT (配列番号 )
PSMプライマー「B」 AAC -ATX - GG(AまたはG) - TC(AまたはG) - TA(AまたはG) - AA(配列番号 )
プライマーAはセンスプライマーであり、Bはアンチセンスである。縮重は32倍である。
PSMプライマー「C」 AT(TまたはCまたはA) - TA(TまたはC) - AA(TまたはC) - GTX - AT(TまたはCまたはA) - GG(配列番号 )
PSMプライマー「D」 CC(AまたはTまたはG) - ATX - AC(GまたはA) - TT(AまたはG) - TA(AまたはGまたはT) - AT(配列番号 )
プライマーCはセンスプライマーであり、Dはアンチセンスプライマーである。縮重は144倍である。
PSMプライマー「E」 CCX - GCX - GA(TまたはC) - TA(TまたはC) - TT(TまたはC) - GC(配列番号 )
PSMプライマー「F」 GC(GまたはA) - AA(AまたはG) - TA(AまたはG) - TXC - GCX - GG(配列番号 )
プライマーEはセンスプライマーであり、Fはアンチセンスである。縮重は128倍である。
PSMプライマー「I」 ACX - GA(AまたはG) - CA(AまたはG) - AA(TまたはC) - TT(TまたはC) - CA(AまたはG) - CT(配列番号 )
PSMプライマー「J」 AG - (TまたはC)TG - (AまたはG)AA - (AまたはG)TT - (TまたはC)TG - (TまたはC)TC - XGT(配列番号 )
PSMプライマー「K」 GA(AまたはG) - CA(AまたはG) - AA(TまたはC) - TT(TまたはC) CA(AまたはG) - CT(配列番号 )
PSMプライマー「L」 AG - (TまたはC)TG - (AまたはG)AA - (AまたはG)TT - (TまたはC)TG - (TまたはC)TC(配列番号22)
プライマーIおよびKはセンスプライマーであり、JおよびLはアンチセンスである。IおよびJは128倍の縮重を有し、KおよびLは32倍の縮重を有する。
PSMプライマー「M」 TGG - GA(TまたはC) - GCX - GA(AまたはG) - GA(AまたはG) - TT(CまたはT) - GG(配列番号 )
PSMプライマー「N」 CC - (GまたはA)AA - (TまたはC)TC - (TまたはC)TC - XGC - (AまたはG)TC - CCA(配列番号 )
PSMプライマー「O」 TGG - GA(TまたはC) - GCX - GA(AまたはG) - GA(AまたはG) - TT(配列番号 )
PSMプライマー「P」 AA - (TまたはC)TC - (TまたはC)TC - XGC - (AまたはG)TC - CCA(配列番号 )
プライマーMおよびOはセンスプライマーであり、NおよびPはアンチセンスである。MおよびNは64倍の縮重を有し、OおよびPは32倍の縮重を有する。
1.0μl オリゴdTプライマー(0.5μg)
4.5μl dH 2 O
10μl
68℃×10分間のインキュベーション。
4μl 5×RT緩衝液
2μl 0.1M DTT
1μl 10mM dNTPs
0.5μl RNアシン(Promega)
1.5μl dH 2 O
19μl
37℃で2分間インキュベーション。
(GibcoTM -BRL)
37℃で1時間インキュベーション。
5μl 2.5mM dNTP混合物
5μl プライマー混合物(センスおよびアンチセンスプライマーのそれぞれの0.5〜1.0μgを含有)
5μl 100mM β−メルカプトエタノール
2μl LNCaP cDNA鋳型
5μl 25mM MgCl2(2.5mM 最終)
21μl dH2O
2μl 希釈Taqポリメラーゼ(0.5U/μl)
50μlの合計容量
管に60μlの軽鉱油を重層し、30サイクル増幅した。各サンプル5μlを2〜3%アガロースゲル上で電気泳動し、ついで臭化エチジウムで染色し写真撮影することにより、PCR生成物を分析した。
166mM NH4SO4
670mM トリス, pH8.8
2mg/ml BSA
PCR生成物を示す代表的な写真を図5に示す。
これらのPCR生成物をさらに分析するために、「TAクローニング」(InvitrogenTM Corp.)を用いてこれらの産物を適切なプラスミドベクター中にクローニングした。ここで用いたクローニング戦略では、伸長するT残基を該挿入部位に有するプラスミドベクター中にPCR生成物を直接連結するが、これは、伸長するA残基をTaqポリメラーゼが該PCR生成物の末端に残すという事実を利用している。該連結混合物をコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞中に形質転換し、得られたコロニーを成長させ、プラスミドDNAをアルカリ溶解法(24)により単離し、制限分析によりスクリーニングした(図6A〜6B)。
ついでPCR生成物のTAクローンを、シークエナーゼ(U.S. Biochemical)を用いるジデオキシ法(25)により配列決定した。各プラスミドDNA3〜4μgをNaOHで変性させ、エタノール沈殿させた。製造業者の推奨に従い、35S−ATPを用いて標識反応を行い、同じプロトコールに従い該反応を停止した。ついで配列決定産物を、IBI配列決定装置を用いて6%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲル上で分析した。ゲルを120ワットで2時間泳動させた。電気泳動後、該ゲルを10%メタノール/10%酢酸中で15〜20分間固定し、ワットマン3MM紙に移し、バイオラッド(BioradTM )真空乾燥機中、80℃で2時間乾燥した。ついでゲルを室温で16〜24時間オートラジオグラフィーに付した。該PCR生成物が正しいクローンであるか否かを判定するために、該分子の5'および3'末端で得られた配列を、正しいプライマー配列、および該プライマーの設計で未使用のペプチド部分に対応する隣接配列に関して分析した。
ACG GAG CAA AAC TTT CAG CTT GCA AAG(配列番号)
T E Q N F Q L A K (配列番号)
であった。下線を付したアミノ酸は、このセンスプライマーを設計するのに使用したペプチド6の一部分であり、該ペプチド内に存在するアミノ酸と合致する残りのアミノ酸は、該分子のこの末端が正しいタンパク質(PSM抗原)を示すことを証明するものである。
CTC TTC GGC ATC CCA GCT TGC AAA CAA AAT TGT TCT(配列番号)
であり、センス(相補的)配列は、
AGA ACA ATT TTG TTT GCA AGC TGG GAT GCC AAG GAG(配列番号)
R T I L F A S W D A E E (配列番号)
であった。ここで下線を付したアミノ酸は、プライマーNを作製するのに使用したペプチド7の一部分を示す。IN−20クローン中、このプライマーの上流のアミノ酸はすべて正しく、ペプチド7中に見いだされるアミノ酸と合致する。さらに、DNA配列決定を行った結果、該陽性クローン内のDNA配列中の他のPSMペプチドの存在を同定することが可能となった。
スーパースクリプト(SuperscriptTM )プラスミド系(BRLTM -Gibco)を用いて、LNCaP mRNAからcDNAライブラリーを構築した。該ライブラリーを、コンピテントなDH5−α細胞を用いて形質転換し、LBおよび100μg/mlカルベニシリンを含有する100mmプレート上に播種した。プレートを37℃で一晩成長させ、ニトロセルロースフィルターにコロニーを移した。グルンシュタイン(Grunstein)およびホグネス(Hogness)(26)に従い、フィルターを加工し、ランダムプライミング(27)により32P−dCTPで放射能標識した1.1kbの部分cDNA相同性プローブを用いてスクリーニングした。8個の陽性コロニーを得、DNA制限および配列決定分析に付したところ、それは、PSM抗原をコードする完全長cDNA分子を示すことが判明した。図7に示すのは、該ライブラリー中に提示されるcDNA分子のサイズを示すオートラジオグラムである。図8には、いくつかの完全長クローンの制限分析を示す。図9は、図8中のサンプルのプラスミドサザン分析であり、それらがすべて1.1kb部分cDNAプローブとハイブリダイゼーションすることを示す。
PSM遺伝子のノーザン分析(28)により、発現は前立腺および前立腺癌に限定されることが示された。
15個のヒト前立腺サンプル上でPCRを行って、PSM遺伝子発現を測定した。それぞれ正常前立腺組織、良性前立腺過形成および前立腺癌からの5個のサンプルを使用した(組織はMSKCC Pathology Departmentにより確認された)。
100kDのPSM抗原をコードする遺伝子を同定した。完全なcDNA配列を配列番号1に示す。その核酸配列の真下に、推定翻訳アミノ酸配列を示す。該アミノ酸の総数は750である(配列番号2)。該推定タンパク質配列の親水性を図16:1〜11に示す。図17A〜17Cに示すのは、親水性の最高点を有する3つのペプチドである。それらは、Asp-Glu-Leu-Lys-Ala-Glu(配列番号)、Asn-Glu-Asp-Gly-Asn-Glu(配列番号)およびLys-Ser-Pro-Asp-Glu-Glyである。
PSM抗原の潜在的用途:
1.腫瘍検出:
顕微鏡的:
種々の抗原に対するプローブを使用することにより、はっきりと腫瘍を明示することができる。前立腺癌には、PSM抗原プローブが有益と考えられる。したがって、PSMは診断用に使用でき、本出願人らがクローニングしたcDNAのコーディング領域由来のセンス(対照)およびアンチセンスプローブを用いるin-situハイブリダイゼーションにより、これを顕微鏡的レベルで行うことができる。これは、局所的前立腺外拡張、リンパ節、骨または他の転移部位の関連性の評価に使用することができる。骨転移は前立腺癌の大きな問題であるため、特に病期分類のためには、転移拡張の初期検出が必要である。いくつかの腫瘍では、骨髄中の腫瘍細胞が検出されれば厳しい予後が予想され、転移に向けた介入を試みることが提案される。骨髄吸引液または切片におけるPSM抗原発現の検出から、そのような初期情報が得られるかもしれない。PCR増幅またはin-situハイブリダイゼーションを行ってもよい。RT−PCRにより、血行性転移による循環中の細胞を検出することができる。
該抗原のcDNAを知ることにより、該抗原の特異的アミノ酸配列に対して用いる抗体の産生用の優れた抗原として機能する領域が同定される。そのような配列は、PSM抗原の外部、膜または内部などの種々の領域に存在するかもしれない。これらの特異的抗体を産生させれば、該抗原を免疫組織化学的に同定できるであろう。したがって、これらの誘導抗体を、特に、免疫診断に最も有用なパラフィン固定切片および凍結切片中で働く抗体用に開発できるであろう。
制限断片長多型(RFLPS)は、発癌イニシエーションおよびプロモーション中に生じる遺伝的損傷の進行を示すのに有用であることが判明している。PSM配列制限マッピング中の変化が前立腺腫瘍のリスクまたは悪性潜在性または進行の素因の証拠を与えることが、PFLP分析から示されるかもしれない。
抗原特異的抗体を産生させることにより、該抗原または選択抗原断片が血清中に出現すれば、それらは転移疾患の存在についての血清マーカーを与え、単独または他の前立腺特異的マーカーと併用して有用と考えられる。
エキソフェイシャル(exofacial)表面上のタンパク質の大部分を有する膜伸長タンパク質の特徴を該抗原が有することが該cDNA配列から暗示されるため、該腫瘍に露出し該腫瘍に特異的なペプチド断片に対する抗体、特にモノクローナル抗体により、転移腫瘍または前立腺切除術または照射後の残存腫瘍の腫瘍イメージング局所拡張が得られるかもしれない。コーディング領域を知ることによりモノクローナル抗体の産生が可能となり、これらを併用して最大のイメージング目的を達成することができる。該抗原はトランスフェリン受容体とcDNA分析に基づく類似性(約54%)を共有するため、この抗原に対する特異的な正常リガンドが存在し、該リガンドの同定から別のイメージング手段が得られるかもしれない。
PSM抗原は、それに結合する正常リガンドの単離に使用することができる。特異性に依存するこれらのリガンドを標的化に使用してもよいし、あるいは、それらの血清レベルは病態の予想に有用かもしれない。PSMに対する正常リガンドが担体分子だとわかれば、PSMを治療目的でそのリガンドに結合させるのに用いて(鉄キレート物質のように)、循環から該リガンドを除去する助けとなるかもしれない。該リガンドが腫瘍成長または転移を促進するならば、可溶性PSM抗原を与えることにより、該リガンドが前立腺に結合できなくなるであろう。PSM抗原構造の知見は、同じ目的で機能しうるリガンドに結合する小断片を得るのに有用であろう。
a)リガンド。PSM抗原のcDNAの構造がトランスフェリン受容体と構造的相同性を共有する(核酸レベルで54%)という知見は、トランスフェリン様であるかそうでない受容体に対する内因性リガンドが存在する可能性を暗示する。トランスフェリンは、トランスフェリン受容体に結合した後、細胞中へ鉄を輸送するリガンドだと考えられている。しかしながら、アポトランスフェリンは、トランスフェリン受容体を発現するいくつかの細胞の増殖因子だと報告されている(30)。トランスフェリンがこの抗原のリガンドなのか、あるいは、何らかの他のリガンドがこのリガンドに結合するのかは明らかではない。リガンドが同定されれば、該リガンドにより金属イオン(鉄、亜鉛など)などの特異的物質を該腫瘍中へ運ばせてもよく、したがって、該リガンドは、毒性物質(放射性または細胞障害性化学物質、すなわち毒素、例えばリシンまたは細胞障害性アルキル化剤または細胞障害性プロドラッグ)を該腫瘍へ輸送する手段として使用しうる。
PSM抗原は他の用途を有する可能性もある。前立腺は亜鉛に富むことがよく知られており、該抗原がこれに関連する機能または他の生物的機能を付与すれば、PSM抗原は、良性過形成増殖および/または前立腺炎などの他の前立腺病変の治療で有用かもしれない。
前立腺特異的膜抗原の発現
PSMをコードする2.65kbの相補的DNAをクローニングした。7E11−C5.3抗体を用いてPSM発現に関してLNCaP、DU−145およびPC−3前立腺癌細胞株を免疫組織化学的分析すると、LNCaP細胞では強い染色が示され、DU−145およびPC−3細胞では共に発現が検出されない。2.65kbの完全長PSM cDNAのインビトロ転写/翻訳共役により、PSMの予想ポリペプチド分子量に相当する84kDaのタンパク質が得られる。膵臓イヌミクロソームによるこのタンパク質の翻訳後修飾により、予想される100kDaのPSM抗原が得られる。PC−3細胞を真核発現ベクター中の完全長PSM cDNAでトランスフェクションした後、本出願人は、7E11−C5.3モノクローナル抗体を用いるウエスタン分析により、PSM糖タンパク質の発現を検出する。ヒト組織におけるPSM mRNAの発現はほとんど完全に前立腺特異的であることが、リボヌクレアーゼプロテクション分析により示された。PSM発現は無ホルモン状態で最高であるらしく、ステロイドによりホルモン的にモジュレーションされ、DHTはヒト前立腺癌細胞株LNCaPにおけるPSM発現を8〜10倍ダウンレギュレーションし、テストステロンはPSMを3〜4倍ダウンレギュレーションし、コルチコステロイドは有意な効果を示さない。正常および悪性前立腺組織は一貫して高いPSM発現を示すが、良性前立腺過形成では不均一であり、時にはPSMの発現が無い。ヌードマウスの皮下に正所性移植し成長させたLNCaP腫瘍は、PSMを豊富に発現し、PSM発現の調節およびモジュレーションの研究のための優れたインビボモデル系を提供する。
細胞および試薬:
LNCaP、DU−145およびPC−3細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている(5A, 7A, 8A)。特に示さない限り、LNCaP細胞は、L−グルタミン、非必須アミノ酸および5%ウシ胎仔血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で補足したRPMI 1640培地中、CO2インキュベーター中37℃で成長させた。DU−145およびPC−3細胞は、10%ウシ胎仔血清で補足した最少必須培地中で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー(Media Preparation Facility)から入手した。特に示さない限り、制限および修飾酵素はGibco-BRLから購入した。
検出のアビジン−ビオチン法を用いて、PSM抗原発現に関して前立腺癌細胞株を分析した(9A)。ガラススライド上で、5×104細胞/100ul/スライドを用いて細胞サイトスピン(cytospin)を作製した。スライドをPBSで2回洗浄し、ついで適当なサプレッサー血清と共に20分間インキュベーションした。該抑制血清を排出し、ついで該細胞を、希釈7E11−C5.3(5g/ml)モノクローナル抗体と共に1時間インキュベーションした。ついでサンプルをPBSで洗浄し、第2抗体と30分間、そしてアビジン−ビオチン複合体と30分間、順次インキュベーションした。色素原および発色現像用にジアミノベンジジンを使用し、ついでヘマトキシリン対比染色し、封入した。それぞれの実験では、2通りの細胞サイトスピンを対照として用いた。陽性対照として、前記と同じ方法に従い、抗サイトケラチンモノクローナル抗体CAM5.2を使用した。ヒトEJ膀胱癌細胞を陰性対照として使用した。
プラスミドpSPORT 1(Gibco-BRL)中に完全長2.65kb PSM cDNAを含有するプラスミド55Aを、プロメガ(Promega)TNT系(Promega Corp. Madison, WI)を用いてインビトロで転写した。ウサギ網状赤血球溶解物、メチオニンを欠くアミノ酸混合物、緩衝液および35S−メチオニン(Amersham)を含有する反応混合物中のcDNAへ、T7 RNAポリメラーゼを加え、30℃で90分間インキュベーションした。該反応混合物(Promega Corp. Madison、 WI.)へ膵臓イヌミクロソーム(Pancreatic canine microsomes)を加えることにより、得られたタンパク質の翻訳後修飾を行った。タンパク質産物の分析を行うために、該タンパク産物を10%SDS−PAGEゲル上で電気泳動し、ついで、製造業者の指示に従いアンプリファイ・オートラジオグラフィー・エンハンサー(Amersham, Arlington Heights, IL.)で処理し、真空乾燥機中80℃で乾燥した。ハイパーフィルム(Hyperfilm)MP(Amersham)を用いて、ゲルを−70℃で一晩オートラジオグラフィーに付した。
pREP7 真核発現ベクター(Invitrogen, San Diego, CA.)へ、完全長PSM cDNAをサブクローニングした。キアゲンマキシ−プレップ(Qiagen maxi-prep)プラスミド単離カラム(Qiagen Inc., Chatsworth, CA.)を用いて、形質転換DH5−α細菌(Gibco-BRL)からプラスミドDNAを精製した。精製プラスミドDNA(6〜10g)を900ulのオプティメン(Optimen)培地(Gibco-BRL)で希釈し、900lのオプティメン培地で既に希釈されている30ulのリポフェクチン試薬(Gibco-BRL)と混合した。オプティメン培地中の40〜50%集密性PC−3細胞のT−75フラスコへ、この混合物を加えた。24〜36時間後、細胞をトリプシン処理し、10%ウシ胎仔血清および1mg/mlのハイグロマイシンB(Calbiochem, La Jolla, CA.)で補足したRPMI 1640培地を含有する100mm皿に落とした。使用したハイグロマイシンBの用量は、時間経過/用量反応細胞毒性アッセイにより、前もって決定しておいた。離散コロニーが出現するまで、4〜5日毎に培地およびハイグロマイシンBを変えながら、細胞をこの培地中で2〜3週間維持した。6mmのクローニングシリンダーを用いて、コロニーを単離し、同じ培地中に広げた。対照として、PC−3細胞もpREP7プラスミド単独でトランスフェクションした。該トランスフェクション細胞からRNAを単離し、RNアーゼプロテクション分析(後記)およびノーザン分析の両方によりPSM mRNA発現を検出した。
既に記載されているとおりに(10A)、粗製タンパク質溶解物をLNCaP、PC−3およびPSM−トランスフェクションPC−3細胞から単離した。公開されている方法(10A)に従い、LNCaP細胞膜も単離した。BioRadタンパク質試薬キット(BioRad, Richmond, CA.)を用いるブラッドフォード(Bradford)法により、タンパク質濃度を定量した。変性後、20μlのタンパク質を10%SDS−PAGEゲル上、25mAで4時間電気泳動した。ゲルをイモビロン(Immobilon)P膜(Millipore, Bedford, MA.)に4℃で一晩エレクトロブロットした。膜を0.15M NaCl/0.01M トリス−HCl(TS)および5%BSAでブロッキングし、ついで7E11−C5.3モノクローナル抗体(10μg/ml)と共に1時間インキュベーションした。ブロットを0.15M NaCl/0.01M トリス−HCl/0.05%トリトン−X100(TS−X)で4回洗浄し、10μg/mlの濃度のウサギ抗マウスIgG(Accurate Scientific, Westbury, N.Y.)と共に1時間インキュベーションした。
0.25%トリプシンおよび0.02%EDTAの溶液に1分間さらすことにより、LNCaP細胞を亜密集的(sub-confluent)培養から得た。細胞を、5%ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640培地へ再懸濁し、マトリゲル(Matrigel)(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA.)またはカルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス均衡塩類溶液(HBSS)のいずれかで洗浄し希釈した。トリパンブルー排除により90%を越える生存度を有する単細胞懸濁液のみをインビボ注射に使用した。4〜6週齢の雄の無胸腺Swiss(nu/nu)ヌードマウスをメモリアル・スロアン・ケタリング・キャンサー・センター・アニマル・ファシリティー(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Animal Facility)から入手した。皮下腫瘍細胞注射には、28ゲージ針が付いている使い捨てシリンジを用いて、0.2mlのマトリゲルに再懸濁した百万個のLNCaP細胞を各マウスの後肢に注射した。正所性注射のために、まずペントバルビタールの腹腔内注射によりマウスを麻酔し、背臥位で置いた。腹部をベタジン(Betadine)で洗浄し、前立腺を正中切開により露出させた。0.1ml中の250万個のLNCaP腫瘍細胞を、1mlの使い捨てシリンジおよび28ゲージ針を用いて、いずれかの後葉に直接注射した。マトリゲルの存在下および不存在下でLNCaP細胞を注射した。オートクリップ・ウーンド・クリップス(Autoclip wound clips)(Clay Adams, Parsippany, N.J.)を用いて、一層で腹部を閉じた。腫瘍は6〜8週間で収穫し、メモリアル・スロアン・ケタリング・キャンサー・センター・パソロジー・デパートメント(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Pathology Department)のメンバーにより組織学的に確認され、後続のRNA単離のために液体窒素中で凍結した。
標準的な技術(11, 12)により、およびRNAzol B(Cinna/Biotecx, Houston, TX.)を用いて、全細胞RNAを細胞および組織から単離した。RNA濃度および質を、ベックマン(Beckman)DU 640分光光度計でUV分光法により、およびゲル分析により評価した。ヒト組織全RNAサンプルは、クローンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーティッド(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA.)から購入した。
PSM cDNAの一部をプラスミドベクターpSPORT 1(Gibco-BRL)中にサブクローニングし、フランキングT7およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーターに対する該cDNA挿入の配向を制限分析により確認した。該PSM挿入の上流のこのプラスミドを線状化し、ついでSP6 RNAポリメラーゼにより転写することにより、400ヌクレオチドのアンチセンスRNAプローブが得られる。そのうちの350ヌクレオチドがPSM RNAによりRNアーゼ消化から保護されているはずである。このプローブは図20で使用した。また、プラスミドpCR II(Invitrogen)中に1kbの部分PSM cDNAを含有するプラスミドIN−20をリボプローブ合成に使用した。Xmn I(Gibco-BRL)で線状化したIN−20を、SP6 RNAポリメラーゼを用いて転写すると、298ヌクレオチドのアンチセンスRNAプローブが得られるが、そのうちの260ヌクレオチドはPSM mRNAによりRNアーゼ消化から保護されているはずである。このプローブは図21および22で使用した。公開されているプロトコールに従い(13)、SP6 RNAポリメラーゼ(Gibco-BRL)、rNTP(Gibco-BRL)、RNアシン(Promega)および32P−rCTP(NEN, Wilmington, DE.)を用いてプローブを合成した。プローブをNENSORB 20精製カラム(NEN)上で精製し、約百万cpmの精製放射性標識PSMプローブを10μlの各RNAと混合し、RPA IIキット(Ambion, Austin, TX)からの緩衝液および試薬を用いて45℃で一晩ハイブリダイズした。製造業者の指示に従い、サンプルを加工し、Seq ACRYL試薬(ISS, Natick, MA.)を用いて5%ポリアクリルアミド/7M 尿素変性ゲル上で分析した。ゲルを55℃まで前加熱し、25ワットで約1〜2時間移動させた。ついでゲルを10%メタノール/10%酢酸中で30分間固定し、バイオラッド(BioRad)真空乾燥機中80℃でワットマン3MM紙上で乾燥し、ハイパーフィルム(Hyperfilm)MP(Amersham)を用いて一晩オートラジオグラフに付した。走査型レーザーデンシトメーター(LKB, Piscataway, NJ.)を用いることによりPSM発現を定量した。
LNCaP細胞(2百万)を、5%ウシ胎仔血清で補足したRPMI 1640培地中のT−75フラスコ上に播種し、約30〜40%密集になるまで24時間成長させた。ついでフラスコをリン酸緩衝食塩水で数回洗浄し、5%木炭抽出血清で補足したRPMI培地を加えた。ついで細胞をさらに24時間成長させ、この時点で、ジヒドロテステロン、テストステロン、エステラジオール、プロゲステロンおよびデキサメタゾン(Steraloids Inc., Wilton, NH.)を最終濃度2nMで加えた。細胞をさらに24時間成長させ、ついで、既に記載されているとおりにRNAを収穫し、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイによりPSM発現を分析した。
PSMの免疫組織化学的検出:
7E11−C5.3抗PSMモノクローナル抗体を用いた場合、PSM発現は、LNCaP前立腺癌細胞株では明らかに検出可能であるが、PC−3およびDU−145細胞株では可能でない(図17A〜17C)。分析したすべての正常および悪性前立腺組織は、PSM発現について陽性に染色された。
図18に示すとおり、2.65kbの完全長PSM cDNAのインビトロ転写/翻訳共役は、750アミノ酸PSMオープンリーディングフレームからの予想タンパク質産物と一致して、84kDaのタンパク質種を与える。膵臓イヌミクロソームを用いる翻訳後修飾の後、100kDaのグリコシル化タンパク質種が得られ、これは成熟天然PSM抗原と一致した。
pREP7発現ベクター中の完全長PSM cDNAでトランスフェクションされたPC−3細胞を、ノーザン分析によりSM mRNAの発現に関してアッセイした。7E11−C5.3抗体を用いるウエスタンブロット法によるPSM抗原分析には、高いPSM mRNA発現を有するクローンを選んだ。図19では、100kDaのPSM抗原が、LNCaP細胞溶解物および膜画分、およびPSMでトランスフェクションされたPC−3細胞ではよく発現しているが、天然PC−3細胞では発現していない。該トランスフェクションPC−3細胞中のこの検出可能な発現は、既にクローニングされている2.65kbのPSM cDNAが、7E11−C5.3抗前立腺モノクローナル抗体により認識される抗原をコードすることを証明するものである。
正常ヒト組織におけるPSM mRNAの発現を、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイにより分析した。PSMの組織発現は主に前立腺内で現れ、ヒト脳および唾液腺で検出可能な発現は非常に低レベルであった(図20)。ノーザン分析で分析したところ、検出可能なPSM mRNAの発現は非前立腺ヒト組織では明らかでなかった。検出可能なPSM発現が正常ヒト小腸組織で認められことがあるが、このmRNA発現は、使用する特異的リボプローブに応じて変化しうる。アッセイした正常ヒト前立腺およびヒト前立腺腺癌のすべてのサンプルでは明らかに検出可能なPSM発現が示されたが、良性過形成を示す組織では、PSMの発現が一般に低下しているか発現していなかった(図21)。ヌードマウスにおいて正所的におよび皮下の両方で成長させたヒトLNCaP腫瘍では、皮下移植されたLNCaP細胞の成長に必要なマトリゲルを使用した場合または使用しない場合に、豊富なPSM発現が検出された(図21)。PSM mRNAの発現は、生理学的用量のステロイドの存在により明らかにモジュレーションされる(図22)。DHTは24時間後に発現を8〜10倍下方調節し、テストステロンはPSM発現を3〜4倍減少させた。エストラジオールおよびプロゲステロンも、LNCaP細胞におけるPSM発現をダウンレギュレーションしたが、おそらくこれは、LNCaP細胞中に存在していることが公知の突然変異アンドロゲン受容体に対する結合の結果であろう。全体では、ステロイド枯渇培地中で成長させた未処理LNCaP細胞[ホルモンの無い(去勢)状態をインビボで刺激する状態である]においてPSM発現は最高である。この実験を2〜200nMのステロイド用量および6時間〜7日間の時点で繰り返しても同様の結果が得られ、PSM mRNAの最大ダウンレギュレーションは、24時間の時点でDHTにより2〜20nMの用量で認められた。
以前の研究で、2つの貴重な前立腺生物学的マーカー(PAPおよびPSA)が得られており、その両者は、前立腺悪性疾患の診断、治療および処置に大きな影響を与えている。前立腺特異的膜抗原(PSM)の予備的特徴づけを記載している本研究は、それが、多くの興味深い特徴を有する遺伝子であることを示す。PSMは、PAPおよびPSAと同様、ほぼ完全に前立腺特異的であり、それ自体により、前立腺の独特の機能および挙動がさらに明らかになるかもしれない。PSMタンパク質の予想配列(3)およびLNCaP細胞膜中のその存在(ウェスタンブロット法および免疫組織化学的方法により判定)は、それが内在性膜タンパク質であることを示す。したがって、PSMは抗体指向性診断用イメージングおよび細胞障害性標的化法のための興味深い細胞表面エピトープを与える(14)。PSM抗原をインビトロで合成し、高レベルのPSM発現を維持する腫瘍異種移植片を産生できれば、PSM発現の調節およびモジュレーションについてさらに研究し特徴づけるための便利で興味深いモデル系が得られる。また、LNCaP細胞で高レベルのPSMが発現されるため、優れたインビトロモデル系が得られる。PSM発現はステロイドに対してホルモン反応性であり、ホルモン無反応性疾患ではPSMが高レベルで発現される可能性がある(15)。脳、唾液腺および小腸は、7E11−C5.3抗体を用いる免疫組織化学的方法では、PSM抗原の発現に関して陰性であるが(16)、これらの組織における微少量のPSM mRNAの検出はさらなる研究を保証するものである。これらのすべての組織、特に小腸においては、3'末端付近のPSM cDNAの領域に対応するプローブを用いるmRNA発現であるが、5'末端PSMプローブを用いた場合には発現は検出されなかった。これらの結果は、PSM mRNA転写物が種々の組織で選択的スプライシングを受けることを示しているのかもしれない。
遺伝子治療のための「キメラDNA」を確立するためには、種々のDNAセグメントをつないで、該結合に関与する両前駆体DNA種の特徴を有する新しいDNAを作製することが必要である。この提案の場合、結合されているその2つの断片はDNAの種々の機能的態様を含み、mRNAの生成のための該DNAの読み取りを許容するプロモーター領域は特異性を付与し、該mRNAをコードするDNA配列は治療用機能的DNAを与える。
抗腫瘍薬は、有効であれば、非常に大量の腫瘍の後退を起こしうる。抗腫瘍薬活性発現のための主な要件は、細胞死が生じるよう十分な細胞障害を保証するために腫瘍を毒性薬物にさらす場合の十分に長い時間(t)および十分に高い濃度(c)の両方(cxt)を得る要件である。また、薬物は「活性」でなければならず。腫瘍に対する毒性は、宿主の正常細胞に対するものより大きくなければならない(22)。腫瘍に対する薬物の有効性は、腫瘍血流および薬物の拡散能に依存する。多数の正常組織への血流は腫瘍への血流と同程度かそれを上回ることが多いため、腫瘍への血流は選択性を付与しない。化学療法用の細胞障害性薬物の大部分は、腫瘍組織に対する毒性と正常組織に対する毒性が同程度であることが多い。***中の細胞は非***正常細胞より感受性であることが多いが、前立腺癌などの成長が遅い多数の固形腫瘍では、これによる抗腫瘍特異性は得られない(22)。
結果からは、膀胱および前立腺などの腫瘍が免疫原性でないことが示された。すなわち、照射腫瘍細胞を動物へ投与し、ついで非照射腫瘍細胞を投与しても、腫瘍産生腫瘍細胞数を減少させることも、該腫瘍の成長速度を低下させることもなかった。しかし、該腫瘍をレトロウイルスおよび高濃度の分泌サイトカイン(例、Il−2)でトランスフェクションすれば、これは抗腫瘍ワクチンとして働き、既に樹立され成長中の腫瘍の成長可能性を低下させることができた。IL−2が最も優れており、GM−CSFも活性を有していたが、他のいくつかのサイトカインははるかに低活性であった。免疫刺激に単にIL−2を用いる臨床研究では、非常に高濃度を与えなければならず、毒性であることが判明した。サイトカイン遺伝子修飾腫瘍細胞の成功への鍵は、サイトカインを腫瘍部位で局所的に産生させ、毒性でないこと、およびそれが該腫瘍の免疫認識を刺激し、該腫瘍の特異的および無毒性認識を可能にすることである。腫瘍細胞によるIL−2産生が免疫認識を活性化する正確なメカニズムは完全にはわかっていないが、1つの説明は、それがヘルパーT細胞によるサイトカイン産生の必要性を回避し、腫瘍抗原活性化細胞障害性CD8細胞を直接的に刺激する、というものである。抗原提示細胞の活性化が生じる可能性もある。
非前立腺腫瘍系:
プロモーター特異的活性化により、トランスフェクション遺伝子の組織特異的遺伝子発現が選択的に得られることが、非前立腺腫瘍で認められている。黒色腫では、メラニン発現を起こす酵素をコードするチロシナーゼプロモーターの使用により、黒色腫細胞におけるプロモータ−駆動レポーター遺伝子発現の50倍を越える発現が得られたが、非黒色腫細胞ではこのようなことはなかった。マウス中で成長中にトランスフェクションされた黒色腫細胞で同様の特異的活性化が認められた。その実験では、非黒色腫またはメラノサイト細胞は、チロシナーゼ駆動レポーター遺伝子産物を発現しなかった。ウェルカム・ラボラトリーズ(Welcome Laboratories)の研究グループは、癌胎児性抗原(CEA)をコードする遺伝子のプロモーター領域をクローニングし配列決定した。CEAは、結腸および結腸癌細胞上で発現されるが、転移の場合は特異的である。シトシンデアミナーゼの遺伝子キメラを得た。5−フルオロシトシンを5−フルオロウラシルへ変換するシトシンデアミナーゼでは、CEAプロモーター駆動結腸腫瘍細胞を選択的に殺す(正常肝細胞は殺さない)能力の大きな増強が認められた。彼らは、シトシンデアミナーゼ遺伝子でトランスフェクションされていないバイスタンダー(bystander)腫瘍細胞も殺され、処理後に大きな腫瘍が後退する際に宿主動物に対する毒性がないことを、インビボで観察した。単純ヘルペスウイルス(HSV)、チミジンキナーゼも同様に、***中の癌細胞に対して毒性となるようプロドラッグであるガンシクロビルを活性化し、HSVチミジンキナーゼは、組織特異的プロモーターにより特異的に活性化されうることが示されている。
有効な癌治療のための治療上の鍵は、特異性を獲得し、患者の毒性を抑制することである。非必須組織、例えば前立腺および前立腺腫瘍が組織特異的タンパク質、例えば酸ホスファターゼ(PAP)、前立腺特異的抗原(PSA)、およびクローニングされた遺伝子、前立腺特異的膜抗原(PSM)を産生する点で、遺伝子治療は特異性の鍵部分を与えるかもしれない。前立腺などの組織は、これらの組織特異的mRNAのDNAのプロモーター領域に対する結合を起こす選択された組織特異的転写因子を含有する。PSAのプロモーターは既にクローニングされている。通常、転移前立腺癌の治療をされている患者は、PSAのmRNAの発現を劇的に減少させるアンドロゲン喪失療法を受けている。一方、PSMではホルモン喪失により発現が増加し、このことは、ホルモン療法で治療されている患者でPSMがより一層強く発現されることを意味する。
ポリメラーゼ連鎖反応においてPSAおよびPSA由来プライマーを用いる前立腺血行性微小転移の高感度検出
前立腺癌の患者における血行性微小転移の高感度検出を可能とするPCRに基づくアッセイを開発した。前立腺特異的抗原および前立腺特異的膜抗原に対してユニークなmRNA配列を増幅することにより「ネスティッド(nested)PCR」を行い、それらのそれぞれの結果を比較した。PSA由来プライマーを用いるPCRにより2/30人(6.7%)の患者で微小転移が検出され、PSM由来プライマーを用いた場合には、19/16人(63.3%)の患者で腫瘍細胞が検出された。合計8の陰性対照は、PSAおよびPSMの両方のPCRで陰性であった。結果を確認するためにアッセイを繰り返し、DNA配列決定およびサザン分析によりPCR生成物を確認した。PSMでは検出されるがPSA−PCRでは検出されない循環前立腺腫瘍細胞を保持する患者として、このアッセイの時点で既に根治的前立腺切除術による治療を受けており測定できない血清PSAレベルを有する4人の患者が含まれていた。将来の疾患の再発に関するこれらの知見の重要性を調べることとする。
細胞および試薬:
LNCaPおよびMCF−7細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(Rockville, MD.)から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている(11, 12)。細胞は、L−グルタミン、非必須アミノ酸[MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー(Media Preparation Facility)から入手]および5%ウシ胎仔血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で補足したRPMI 1640培地中、CO2インキュベーター中37℃で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー(Media Preparation Facility)から入手した。通常の化学試薬は可能な限り高い等級のものであり、シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Company)(St. Louis, MO.)から入手した。
この研究で使用したすべての血液標本は、MSKCCのスタッフである泌尿器科医が外来診察室で会った患者からのものである。定期的に予定された採血時に、患者1人当たり2本の抗凝血(パープルトップ(purple top))管を得た。標本の入手は、MSKCCインスティチューショナル・レビュー・ボード(Institutional Review Board)の承認に従い行った。サンプルは、すぐに加工するためにただちに研究室へ運んだ。血清PSAおよびPAP測定は、MSKCCクリニカル・ケミストリー・ラボラトリー(Clinical Chemistry Laboratory)による標準的な技術により行った。PSAの測定は、タンデムPSAアッセイ(Hybritech, San Diego, CA.)により行った。陰性対照として使用した8個の血液標本は、正常な血清PSA値および生検により判明したBPHを有する2人の男性、1人の健康な女性、3人の健康な男性、1人の膀胱癌患者および1人の急性前骨髄球性白血病患者からのものであった。
4mlの全抗凝血静脈血を3mlの氷冷リン酸緩衝食塩水と混合し、ついで15mlポリスチレン管中の8mlのフィコール(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上に注意深く重層した。管を200×g、4℃で30分間遠心した。無菌パスツールピペットを用いて、バフィーコート層(約1ml)を注意深く除き、50mlポリプロピレン管中、50mlになるまで氷冷リン酸緩衝食塩水で再希釈した。ついでこの管を2000×g、4℃で30分間遠心した。該上清を注意深くデカントし、該ペレットを滴下乾燥した。ついで1mlのRNazol Bを該ペレットに加え、製造業者の指示に従い(Cinna/Biotecx, Houston, TX.)、全RNAを単離した。RNA濃度および純度は、ベックマン(Beckman)DU 640分光光度計によるUV分光法およびゲル分析により測定した。
RNAzol Bを用いて、LNCaP細胞および一定の比率(すなわち、1:100、1:1000など)のLNCaP細胞とMCF−7細胞との混合物からRNAを単離した。ついで、該アッセイの検出限界を測定するために、PSAとPSMの両プライマーを用いて後記のとおりにネスティッドPCRを行った。LNCaP:MCF−7(1:100,000)cDNAを蒸留水で希釈して、1:1,000,000および1:10,000,000の濃度を得た。MCF−7は既に試験されており、PSMを発現しないことがPCRにより示されていたため、MCF−7細胞を選んだ。
PSA外側プライマーにエキソン4および5の伸長部を用いて、486bpのPCR生成物を得、cDNAと可能な混入ゲノムDNA増幅との間の識別が可能となった。PSA cDNA配列中のヌクレオチド494から始まる上流プライマー配列は、5'-TACCCACTGCATCAGGAACA-3'(配列番号)であり、ヌクレオチド960の下流プライマーは、5'-CCTTGAAGCACACCATTACA-3'(配列番号)である。PSA内側上流プライマー(ヌクレオチド559から始まる)5'-ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3'(配列番号)および下流プライマー(ヌクレオチド894から始まる)5'-GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3'(配列番号)は、355bpのPCR生成物を与える。すべてのプライマーは、MSKCCマイクロケミストリー・コア・ファシリティー(Microchemistry Core Facility)により合成された。5μgの全RNAを、製造業者の推奨に従いスーパースクリプト(Superscript)逆転写酵素(Gibco-BRL)を用いて合計容量20μl中でcDNAに逆転写した。1μlのこのcDNAを外側プライマーPCR反応の出発鋳型として使用した。20μlのPCR混合物には、0.5U Taqポリメラーゼ(Promega Corp., Madison, WI.)、プロメガ(Promega)反応緩衝液、1.5mM MgCl2、200mM dNTPおよび1.0μMの各プライマーが含まれていた。ついで、この混合物をパーキンエルマー(Perkin Elmer)9600DNAサーマルサイクラーに移し、25サイクルのインキュベーションを行った。該PCRプロフィールは、以下のとおりであった:94℃×15秒、60℃×15秒および72℃×45秒。25サイクルの後、サンプルを氷上に載せ、この反応混合物の1μlを、該内側プラマーを用いる別のPCRラウンドの鋳型として使用した。管の最初のセットを該サーマルサイクラーへ戻し、さらに25サイクル行った。ゲノムDNAでなくcDNAが増幅されていることを保証するために、PSM−PCRには、イントロンに伸長するプライマー対を選ぶ必要があった。
TAクローニング系(Invitrogen)を用いて、PCR生成物をpCR IIプラスミドベクター中にクローニングした。これらのプラスミドを、標準的な方法(13)を用いてコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞中に形質転換し、マジック・マニプレップス(Magic Minipreps)(Promega)を用いてプラスミドDNAを単離し、制限分析によりスクリーニングした。ついで、シークエナーゼ(U.S. Biochemical)を用いてジデオキシ法(14)によりTAクローンを配列決定した。3〜4gの各プラスミドをNaOHで変性し、エタノール沈殿させた。製造業者の推奨に従い、35S−dATP(NEN)を用いて標識反応を行い、同じプロトコールの記載に従い該反応を停止した。ついで配列決定産物を、120ワットで2時間移動させる6%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲル上で分析した。ゲルを10%メタノール/10%酢酸中で20分間固定し、ワットマン3MM紙に移し、真空乾燥機中、80℃で2時間乾燥した。ついでゲルを室温で18時間オートラジオグラフィーに付した。
PCR生成物のエチジウム染色アガロースゲルを、0.2N HClに15分間、ついで0.5N NaOH/1.5M NaClおよび0.1Mトリス(pH7.5/1.5M NaCl)にそれぞれ30分間浸けた。ついで、ゲルを10×SSC(1.5M NaCl/0.15M クエン酸ナトリウム)中で10分間平衡化した。DNAを、10×SSC中、ポシ・ブロッター(Posi-blotter)(Stratagene)を用いる圧力ブロッティングによりナイトラン(Nytran)ナイロン膜(Schleicher and Schuell)に移した。UVストラタリンカー(Stratalinker)(Stratagene)を用いて、DNAを該膜にクロスリンキングした。ブロットを65℃で2時間プレハイブリダイズし、ついで変性32P−標識ランダムプライムドcDNAプローブ(PSMまたはPSAのいずれか)とハイブリダイズした(9, 15)。ブロットを1×SSPE/0.5%SDS中、42℃で2回、0.1×SSPE/0.5%SDS中、50℃で2回、それぞれ20分間洗浄した。膜を風乾し、コダック(Kodak)X-Omatフィルムを用いて−70℃で30分〜1時間オートラジオグラフィーに付した。
PSAまたはPSM由来プライマーのいずれかを用いるネスティッドプライマーによるPCR増幅により前立腺細胞の検出レベルが向上し、10,000個のMCF−7細胞当たり約1個の前立腺細胞から、百万個のMCF−7細胞当たり1個の細胞より優れた検出レベルになった(図26および27)。これは、微小疾患(minimal disease)を検出する能力の実質的な向上を示す。臨床段階、治療、血清PSAおよびPAP値に関して分析した16人の患者の特徴、および該アッセイの結果を示す。全体で、PSA−PCRは2/30人の患者(6.7%)で腫瘍細胞を検出したが、PSM−PCRは19/30人の患者(63.3%)で細胞を検出した。腫瘍細胞がPSAで陽性であるが、PSMで陽性でない患者はいなかったが、PSMは、PSAで検出されない8人の陽性患者を検出した。表1中の患者10および11は共に、非常に進行したホルモン無反応性疾患を有する患者であり、PSAおよびPSMの両方で検出された。これらの両患者は、これらのサンプルを得た後で死亡している。患者4、7および12はすべて、臨床的限局性疾患のために根治的前立腺切除術で治療され、手術の1〜2年後にはその全員が測定できない血清PSA値を有していた患者であり、これらの患者は循環前立腺腫瘍細胞に関して、PSM−PCRでは陽性であったが、PSA−PCRでは陰性であった。PSM−PCRの代表的なエチジウム染色ゲル写真を図28に示す。レーンA中を移動したサンプルは、該外側プライマーから生じたPCR生成物を示し、Bと表示されたレーン中のサンプルは内側プライマー対の産物である。対応するPSMサザンブロットオートラジオグラフを図29に示す。いくつかのサンプルでは、該外側産物が図28では見えないが、図29に示すサザンブロット法では検出可能なことからわかるとおり、該サザンブロット分析の感度は、エチジウム染色の感度を上回るものであった。さらに、図28および29のサンプル3(図30の患者6)は、残りの患者の対応するバンドより小さい外側および内側両方のバンドを含有しているらしい。DNA配列決定により、これらのバンドのヌクレオチド配列が、小さな欠失を除きPSMのものと符号することが確認された。これは、PCRの人工産物、この患者のPSM mRNAの選択的スプライシングまたはPSM突然変異のいずれかを示している可能性がある。サザン分析により配列決定し分析したすべてのサンプルは、PSAおよびPSMに関して真に陽性であることが確認された。
前立腺癌の患者を診断時に正確に段階づけしうることは、適当な治療法を選択し、治療に対する長期的反応および治癒の可能性を予想する上で最も重要であることは明らかである。手術前の段階づけは、現在、身体的検査、血清PSAおよびPAP測定および多数のイメージング法(例、経直腸超音波検査法、CTスキャン、放射性核種骨スキャン、MRIスキャン)よりなる。しかしながら、現在の治療法のなかには、血行性微小転移疾患の問題や、それから生じうる予後に対する潜在的な否定的影響に向けられているものはない。以前の研究では、固形転移形成への進行を避けられないのは循環腫瘍細胞のうちのごくわずかであることが示されているが(16)、循環腫瘍細胞の検出および潜在的定量の負担は、疾患をより正確に段階づけするのに貴重かもしれない。血行性微小転移疾患の長期的影響は、循環内にこれらの細胞を有すると判明している患者の臨床経過を、試験で陰性の同様の段階および治療の患者と比較して研究する必要がある。
前立腺特異的膜抗原(PSM)の発現は、トランスフェリンによる攻撃的ヒト前立腺癌細胞の***促進刺激を抑制する
トランスフェリンとヒト前立腺癌との関連性が、いくつかの研究から示唆されている。前立腺癌患者の発現前立腺分泌物はトランスフェリン含量に富み、前立腺癌細胞はトランスフェリン受容体に富むことが示されている(J. Urol. 143, 381, 1990)。骨髄由来のトランスフェリンは、攻撃的前立腺癌細胞の成長を選択的に刺激することが示されている(PNAS 89, 6197, 1992)。DNA配列分析により、該コーディング領域の一部分(ヌクレオチド1250〜1700)が、ヒトトランスフェリン受容体に対して54%の相同性を有することが示された。PC−3細胞は、PSM mRNAまたはタンパク質を発現せず、トランスフェリンに応答して細胞成長の増加を示すが、LNCaP前立腺癌細胞は、PSMを高度に発現し、トランスフェリンに対する応答性が非常に弱い。前立腺癌細胞によるPSM発現が、トランスフェリンに対するその***促進応答に影響を及ぼすか否かを判定するために、完全長PSM cDNAをPC−3前立腺癌細胞にトランスフェクションした。PSM mRNAを高度に発現するクローンをノーザン分析により同定し、PSMタンパク質の発現を、抗PSMモノクローナル抗体7E11−C5.3を用いるウエスタン分析により確認した。
前立腺特異的膜抗原(PSM)プロモーターのクローニングおよび特徴づけ
PSM遺伝子の発現および調節は複雑である。免疫染色法により、PSM抗原は、転移した腫瘍および器官限局性腫瘍では強く発現されるが、正常前立腺組織ではより低度であり、BPHではより不均一であることが判明した。PSMは、退形成腫瘍およびホルモン無反応性腫瘍の両方で強力に発現される。PSM mRNAは、アンドロゲンによりダウンレギュレーションされることが示されている。また、PSM RNAの発現は、サイトカインおよび増殖因子の宿主によりモジュレーションされる。PSM発現の調節についての知見は、前立腺癌のイムノシンチグラフィーイメージングおよび前立腺特異的プロモーター駆動遺伝子治療のような診断および治療戦略で助けとなるはずである。
細胞株
LNCaPおよびPC−3前立腺癌細胞株(American Type Culture Collection)を、それぞれRPMIおよびMEM(5%ウシ胎仔血清で補足したもの)中、37℃、5%CO2で培養した。結腸細胞株であるSW620は、メリサ(Melisa)から贈呈された。
該反応は、以下の最終濃度の試薬を含む50μl容量中で行った:16.6mM NH4SO4、67mM トリス−HCl, pH8.8、アセチル化BSA0.2mg/ml、2mM MgCl2、250μM dNTP、10mM β−メルカプトエタノールおよび1U rth 111 Taqポリメラーゼ(Boehringer Mannhiem, CA)。以下のプロフィールで合計25サイクルを完了した:サイクル1、94℃4分;サイクル2〜25、94℃1分、60℃1分、72℃1分。最終反応は延長した(72℃で10分間)。該反応のアリコートを、1×トリス−酢酸−EDTA緩衝液中、1%アガロースゲル上で電気泳動した。
ピアス(Pierce)らのPCR法を用いて、ヒト繊維芽細胞ゲノムDNA(Genomic Systems, Inc., St. Louis, MI.)のバクテリオファージP1ライブラリーをスクリーニングした。PSM cDNAの5'末端に位置するプライマーは、5'-CTCAAAAGGGGCCGGATTTCC-3'および5'-CTCTCAATCTCACTAATGCCTC-3'であった。陽性クローンp683をXho1制限酵素で消化した。PSM cDNAの末端(extreme)5'からAva-1部位のDNAプローブを用いる制限断片のサザン分析により、3kb断片がPSM遺伝子の5'調節配列を含有することが確認された。該3kb Xho1断片をpKSBluscrptベクター中にサブクローニングし、ジデオキシ法により配列決定した。
プロモーターの無いpCAT基礎またはpCAT−エンハンサーベクター(Promega)へ挿入することにより、Smal-HindIII断片またはサブフラグメント(制限酵素サブフラグメントまたはPCRのいずれかを使用)からクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子プラスミドを構築した。リン酸カルシウム法(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD.)により、pCAT−構築物をpSVβgalプラスミド(5μgの各プラスミド)と共に細胞株に2通りにコトランスフェクションした。72時間後に該トランスフェクション細胞を収穫し、LSC法によりCAT活性に関して、そしてβgal活性に関して(Promega)アッセイした(15μgの溶解物)。CAT活性を、βgal活性の場合と比較することにより標準化した。
PSM遺伝子の5'末端の配列
RNA開始部位からのDNAの500bpを含むp683の3kb XhoI断片のDNA配列を決定した(図31A〜31D)。配列683XFRVSは、PSMプロモーターの5'遠位末端から始まり、公開されているPSM推定プロモーターとnt2485で重複する。すなわち、該推定転写開始部位はnt2485にある。配列683XF107は逆である(683XFRVSの相補体)。該XhoI断片からの配列は、真核プロモーターおよび調節領域(他の遺伝子中で見いだされるもの)に特徴的な注目に値する一連の要素およびモチーフを示した(図32)。
2つの前立腺細胞株:LNCaP、PC−3および結腸SW620で、種々のpCAT-PSMプロモーター構築物のプロモーター活性を試験した(図33)。CAT活性の誘導は、1070bpのPSM5'プロモーター断片を含有するp1070-CATにおいても、641bpのPSM5'プロモーター断片を含有するp676-CATにおいても観察されなかった。しかしながら、追加的SV−40エンハンサーを用いると、−565〜+76の配列(p676-CATE)はプロモーター活性を、LNCaPにおいては示したが、PC−3およびSW620においては示さなかった。
前立腺特異的膜抗原RNAの選択的にスプライシングされた変異体:進行の潜在的測定としての発現の割合
<材料および方法>
細胞株
LNCaPおよびPC−3前立腺癌細胞株を、5%ウシ胎仔血清で補足された、それぞれRPMIおよびMEM中、37℃、5%CO2で培養した。
一次前立腺組織を、MSKCCの企業内腫瘍入手サービスから入手した。粗大標本が、MSKCCの病理学サービスにより病理学的に段階づけされた。
RNAzol Bキット(Tel-Test, Friendswood, TX)を用いる改変グアニジニウムチオシアナート/フェノール/クロロホルム法により、全RNAを単離した。RNAは、ジエチルピロカルボナートで処理された水中に−80℃で保存した。RNAは、分光光度吸収により260nmで定量した。
外傷により死亡した男性から得た正常mRNA(Clontech, Palo Alto, CA)の2つの異なるバッチを70℃で10分間変性させ、ついでランダムヘキサマーおよびスーパースクリプト(Superscript)II逆転写酵素(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)を50℃で30分間使用し、ついで94℃で5分間インキュベーションすることにより、cDNAへ逆転写した。
PSM cDNAの5'および3'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー(5'-CTCAAAAGGGGCCGGATTTCC-3'および5'-AGGCTACTTCACTCAAAG-3')を、該cDNA配列が伸長するように設計した。該反応は、以下の最終濃度の試薬を含む50μl容量中で行った:16.6mM NH4SO4、67mM トリス−HCl, pH8.8、アセチル化BSA 0.2mg/ml、2mM MgCl2、250μM dNTP、10mM β−メルカプトエタノールおよび1U rTthポリメラーゼ(Perkin Elmer, Norwalk, CT)。以下のプロフィールで合計25サイクルを完了した:サイクル1、94℃4分;サイクル2〜25、94℃1分、60℃1分、72℃1分。最終反応は延長した(72℃で10分間)。該反応のアリコートを、1×トリス−酢酸−EDTA緩衝液中、1%アガロースゲル上で電気泳動した。
TAクローニング法により、インビトロゲン(Invitrogen)(San Diego, CA)からのキットを用いて、PCR生成物をpCRIIベクター中にクローニングした。連結反応混合物をコンピテント大腸菌(Escherichia coli)Inv5α中に形質転換した。
US バイオケミカル(Biochemical)(Cleveland, OH)からのシークエナーゼキットを用いてジデオキシ法により配列決定を行った。配列決定産物を、5%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上、52℃で電気泳動した。
完全長PSM cDNAクローンをNgoM 1およびNhe1で消化した。350bpの断片を単離し、pSPORT1ベクター(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)中にサブクローニングした。得られたプラスミドpSP350を線状化し、該挿入物をSP6 RNAポリメラーゼにより転写して、395ヌクレオチド長のアンチセンスプローブを得た。該プローブのうちの355ヌクレオチドおよび/または210ヌクレオチドは、それぞれPSMまたはPSM' RNAによりRNアーゼ消化から保護されるはずである(図2)。種々の組織からの全細胞RNA(20μg)を前記のアンチセンスRNAプローブとハイブリダイゼーションさせた。記載されているとおりに(7)、アッセイを行った。tRNAを陰性対照として使用した。LNCaPおよびPC−3についてRPAを繰り返した。
正常前立腺組織からのmRNAのRT−PCR
正常前立腺からのmRNAの2つの独立したRT−PCRを、「材料および方法」に記載のとおりに行った。ついで行った該PCR生成物のクローニングおよび配列決定から、選択的にスプライシングされた変異体(PSM')の存在が示された。PSM'は、PSM(2653ヌクレオチド)より短いcDNA(2387ヌクレオチド)を有する。配列分析の結果を図34に示す。これらのcDNAは、PSM cDNAの5'末端付近の266ヌクレオチド領域(ヌクレオチド114〜380)がPSM' cDNA中に存在しないことを除き、同一である。種々のmRNAサンプルのRT−PCRを独立して2回繰り返しても同じ結果が得られた。
PSM RNAに相補的でPSM' RNAの3'スプライス部位に伸長するRNAプローブを使用して、PSM mRNAとPSM' mRNAの発現を相対的に測定した(図35)。このプローブを用いて、LNCaP細胞中のPSMおよびPSM'双方のRNAを検出したところ、優勢な形態はPSMであった。PSMおよびPSM'のRNAは共に、PC−3細胞では検出されなかったが、これは、既に行われているノーザンおよびウエスタンブロットのデータと一致する(5, 6)。図36からは、ヒト一次前立腺組織中の両スプライス変異体の存在が示された。一次前立腺腫瘍では、PSMが優勢な形態である。これに対し、正常な前立腺はPSMよりPSM'を多く発現した。BPHサンプルは、両変異体のほぼ等しい発現を示した。
PSMとPSM'との発現(図36)をデンシトメトリーにより相対的に定量し、腫瘍指数として表した(図37)。LNCaPは9〜11、CaPは3〜6、BPHは0.75〜1.6、正常前立腺は0.075〜0.45の指数を有する。
5'および3'末端PSMオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合のヒト正常前立腺mRNA由来のPCR生成物の配列決定データは、既に記載されているPSM cDNAに加え、第2のスプライス変異体PSM'を示した。
PSMプライマーを用いる高感度ネスティッド逆転写−PCRアッセイによる前立腺血行性微小転移の検出の強化(PSAプライマーを用いる場合との比較)
前立腺癌の患者からランダムに選択された77サンプルを分析したところ、PSMおよびPSAプライマーが、それぞれ48人(62.3%)および7人(9.1%)の患者で循環前立腺細胞を検出することが示された。治療段階がDの疾患の患者で、PSMプライマーは24人中16人(66.7%)で細胞を検出したが、PSAプライマーは24人中6人(25%)で細胞を検出した。ホルモン無反応性前立腺癌(D3段階)では、PSAおよびPSMの両プライマーにより7人中6人の患者が陽性であった。精力的な細胞障害性化学療法にもかかわらず、これらの6人の患者は全員、そのアッセイ後2〜6カ月以内に死亡したのに対し、試験結果が陰性であったこのグループの1人の患者はそのアッセイ後15カ月生存している。このことは、PSA−PCRの陽性結果が早期死亡の予測因子として働きうることを示唆する。陰性の血清PSA値を有する根治的前立腺切除術後の患者において、PSMプライマーは31人中21人(67.7%)の患者で転移を検出したが、PSAプライマーは33人中わずか1人(3.0%)で細胞を検出したにすぎず、このことは、微小転移の広がりが前立腺癌の比較的初期のイベントであるらしいことを示す。前立腺癌と判明していない40人の分析から、このアッセイが非常に特異的であるとの証拠が得られ、臨床的に明白な前立腺癌を有さない患者でPSM発現が発癌を予想しうることが示唆される。PSMプライマーを用いることにより、40人中4人の対照で微小転移が検出された。そのうちの2人は前立腺生検によりBPHであると判明していたが、後で血清PSA値が上昇したので前立腺生検を繰り返したところ、以前に未検出だった前立腺癌を有することが判明した。これらの結果は、PSMプライマーを用いる血行性微小転移前立腺細胞の検出の臨床的重要性、およびこの分子アッセイの潜在的有用性を示す。
インビトロでの前立腺特異的膜抗原(PSM)発現のサイトカインおよび増殖因子によるモジュレーション
CYT−356イメージングの有効性は、PSMの発現を操作することにより向上する。PSM mRNA発現は、ステロイドによりダウンレギュレーションされる。このことは、PSMが退形成病変およびホルモン無反応性病変の両方で強く発現されるという臨床的観察と一致する。これに対して、PSA発現はホルモン停止により減少する。ホルモン無反応性疾患では、腫瘍細胞が増殖因子および受容体の両方を産生し、そして細胞が正常な成長拘束を克服するのを可能にする自己分泌ループを確立すると考えられている。多数の前立腺腫瘍上皮細胞は、TGFαおよびその受容体である上皮増殖因子受容体の両方を発現する。結果は、ヒト前立腺癌細胞株LNCaPにおけるPSMのインビトロでの発現に対するTGFαおよび他の選択された増殖因子およびサイトカインの効果を示す。
プライマーを用いるネスティッドRT−PCTで検出したところによれば、根治的前立腺切除術前のネオアジュバント(neoadjuvant)アンドロゲン喪失療法(ADT)により、残存微小転移疾患の発生率が有意に減少する
臨床的に限局性の前立腺癌に対する根治的前立腺切除術は「金本位(gold standard)」的治療であると考える人は多い。過去10年にわたる進歩は、罹患率を劇的に減少させるのに役立っている。臨床家が手術前に患者をよりよく段階づけするのを助けることを意図した改良が開発されてきたが、前立腺外拡張の発生率は、依然として50%を越えることが、多数の研究で報告されている。フェーズIIIの予見的無作為臨床研究を行った。この研究は、根治的前立腺切除術を受けている患者での3カ月間のADTの効果を、手術だけを受け同様に調和させた対照と比較するように設計されている。既に完了しているフェーズIIの研究は、ADT群(N=69)では10%のマージン陽性率を示したのに対して、手術だけの群では33%の陽性率(N=72)を示した。
循環前立腺腫瘍細胞の高感度ネスティッドRT−PCR検出−PSMおよびPSAに基づくアッセイ間での比較
高感度血清PSAアッセイ、CTスキャン、経直腸超音波検査法、直腸内co.I MRIなど、現在臨床家が利用できる多種多様な治療法が改良され拡大しているにもかかわらず、骨盤リンパ節切開および根治的前立腺切除術の際に転移疾患を有することが判明する患者が依然として多い。現在利用できる段階づけ方法によれば未検出のままとなる不顕性血行性微小転移前立腺細胞を検出する能力を有する高感度の逆転写PCRアッセイが開発された。このアッセイは、前立腺癌および他の悪性疾患の患者で行う同様のPCRアッセイの変法である(2, 3, 4, 5)。該アッセイは、前立腺特異的抗原(6)および最近クローニングされ配列決定された前立腺特異的膜抗原のcDNA配列に由来するPCRプライマーを使用する。
細胞および試薬
LNCaPおよびMCF−7細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(Rockville, MD.)から入手した。これらの細胞株の樹立および特徴づけに関する詳細は、すでに公開されている(8, 9)。細胞は、L−グルタミン、非必須アミノ酸および5%ウシ胎仔血清(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)で補足したRPMI 1640培地中、CO2インキュベーター中37℃で成長させた。すべての細胞培地は、MSKCC メディア・プレパレーション・ファシリティー(Media Preparation Facility)から入手した。通常の化学試薬は可能な限り高い等級のものであり、シグマ・ケミカル・カンパニー(Sigma Chemical Company)(St. Louis, MO.)から入手した。
この研究で使用したすべての血液標本は、MSKCCのスタッフである泌尿器科医が外来診察室で会った患者からのものである。定期的に予定された採血時に、患者1人当たり2本の抗凝血管を得た。標本の入手は、各患者のインフォームドコンセントにより、MSKCCインスティチューショナル・レビュー・ボード(Institutional Review Board)の承認に従い行った。サンプルは、すぐに加工するためにただちに研究室へ運んだ。前立腺癌の患者からの77個の標本を無作為に選び、陰性対照からのサンプルと共に、「盲検的」に研究室へ移し、加工した。これらは、D段階の疾患の24人の患者(3人はD0、3人はD1、11人はD2、および7人はD3)、根治的前立腺切除術を既に受けており検出不可能な術後血清PSAレベルを有する31人の患者(18人はpT2病変、11人はpT3、および2人はpT4)、根治的前立腺切除術後の限局性再発性疾患の2人の患者、外部ビーム放射線治療または間隙性I125インプラントを受けた4人の患者、未治療の臨床段階がT1〜T2の疾患の10人の患者、および抗アンドロゲン療法を受けている臨床段階がT3の疾患の6人の患者を含んでいた。陰性対照として使用した40個の血液標本は、10人の健康な男性、生検により判明したBPHおよび上昇した血清PSAレベルを有する9人の男性、7人の健康な女性、4人の腎細胞癌の男性患者、2人の前立腺上皮内癌(PIN)患者、2人の膀胱および病理学的に正常な前立腺の移行上皮癌患者、1人の急性前立腺炎患者、1人の急性前骨髄球性白血病患者、1人の精巣癌患者、1人の腎細胞癌の女性患者、1人の肺癌患者、および1人の精巣嚢胞患者からのものであった。
4mlの全抗凝血静脈血を3mlの氷冷PBSと混合し、ついで14mlポリスチレン管中の8mlのフィコール(Pharmacia, Uppsala, Sweden)上に注意深く重層した。管を200×g、4℃で30分間遠心した。無菌パスツールピペットを用いて、バフィーコート層(約1ml)を注意深く除き、50mlポリプロピレン管中、50mlになるまで氷冷PBSで再希釈した。ついでこの管を2000×g、4℃で30分間遠心した。該上清を注意深くデカントし、該ペレットを滴下乾燥した。ついで1mlのRNazol Bを該ペレットに加え、製造業者の指示に従い(Cinna/Biotecx, Houston, TX.)、全RNAを単離した。RNA濃度および純度は、ベックマン(Beckman)DU 640分光光度計によるUV分光法およびゲル分析により測定した。
RNAzol Bを用いて、LNCaP細胞および一定の比率(すなわち、1:100、1:1000など)のLNCaP細胞とMCF−7細胞との混合物からRNAを単離した。ついで、該アッセイの検出限界を測定するために、PSAとPSMの両プライマーを用いて後記のとおりにネスティッドPCRを行った。LNCaP:MCF−7(1:100,000)cDNAを蒸留水で希釈して、1:1,000,000の濃度を得た。ヒト乳癌細胞株MCF−7は既に本発明者らにより試験されており、PSMもPSAも発現しないことが免疫組織化学的方法および通常のPCRおよびネスティッドPCRにより示されていたため、MCF−7細胞を選んだ。
PSA外側プライマーは、PSA cDNAのエキソン4中のヌクレオチド494〜513(センス)およびエキソン5中のヌクレオチド960〜979(アンチセンス)である。これらのプライマーは、考えられる混入ゲノムDNAからの合成産物から識別できるPSA cDNAからの486bpのPCR生成物を与える。
PSA-960 5'-CCT TGA AGC ACA CCA TTA CA-3'
PSA内側上流プライマーはヌクレオチド559から始まり、下流プライマーはヌクレオチド894から始まり、355bpのPCR生成物を与える。
PSA-894 5'-GTC CAG CGT CCA GCA CAC AG-3'
すべてのプライマーは、MSKCCマイクロケミストリー・コア・ファシリティー(Microchemistry Core Facility)により合成された。5μgの全RNAを、製造業者の推奨に従い、ランダムヘキサマープライマー(Gibco-BRL)およびスーパースクリプト(Superscript)II 逆転写酵素(Gibco-BRL)を用いてcDNAに逆転写した。1μlのこのcDNAを外側プライマーPCR反応の出発鋳型として使用した。20μlのPCR混合物には、0.5U Taqポリメラーゼ(Promega)、プロメガ(Promega)反応緩衝液、1.5mM MgCl2、200mM dNTPおよび1.0μMの各プライマーが含まれていた。ついで、この混合物をパーキンエルマー(Perkin Elmer)9600DNAサーマルサイクラーに移し、25サイクルのインキュベーションを行った。該PCRプロフィールは、以下のとおりであった:94℃×15秒、60℃×15秒および72℃×45秒。25サイクルの後、サンプルを氷上に載せ、この反応混合物の1μlを、該内側プラマーを用いる別の25サイクルの鋳型として使用した。管の最初のセットを該サーマルサイクラーへ戻し、さらに25サイクル行った。PSM外側上流プライマー配列はヌクレオチド1368〜1390であり、該下流プライマーはヌクレオチド1995〜2015であり、67bpのPCR生成物を与える。
PSM-2015 5'-AAC ACC ATC CCT CCT CGA ACC-3'
PSM内側上流プライマーはヌクレオチド1689〜1713に伸長し、該下流プライマーはヌクレオチド1899〜1923に伸長し、234bpのPCR生成物を与える。
PSM-1923 5'-ACT GTG ATA CAG TGG ATA GCC GCT-3'
該PCRアッセイの出発DNA鋳型として、2μlのcDNAを使用した。該50μlのPCR混合物には、1U Taqポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)、250M cNTP、10mM−β−メルカプトエタノール、2mM MgCl2および5μlの10×緩衝液混合物(166mM NH4SO4、670mMトリス, pH8.8および2mg/mlのアセチル化BSAを含有)が含まれていた。PCRは、以下のパラメーターを有するパーキンエルマー(Perkin Elmer)480DNAサーマルサイクラー中で行った:94℃×4分で1サイクル、94℃×30秒、58℃×1分および72℃×1分で25サイクル、ついで72℃×10分。ついでサンプルを氷冷し、この反応混合物の2.5μlを、該内側PSMプライマーを含有する新しい反応混合物を用いる別の25サイクルの鋳型として使用した。cDNAの質は、遍在性ハウスキーピング遺伝子であるβ−2−ミクログロブリン遺伝子配列(10)由来のプライマーを用いる対照反応を行うことにより確認した。これらのプライマーはエキソン2〜4に伸長し、620bpのPCR生成物を与える。これらのプライマーの配列は、以下のとおりである:
β-2(エキソン2) 5'-AGC AGA GAA TGG AAA GTC AAA-3'
β-2(エキソン4) 5'-TGT TGA TGT TGG ATA AGA GAA-3'。
TAクローニング系(Invitrogen)を用いて、PCR生成物をpCR IIプラスミドベクター中にクローニングした。これらのプラスミドを、標準的な方法(11)を用いてコンピテント大腸菌(E. coli)細胞中に形質転換し、マジック・マニプレップス(Magic Minipreps)(Promega)を用いてプラスミドDNAを単離し、制限分析によりスクリーニングした。ついで、35S−cCTP(NEN)およびシークエナーゼ(U.S. Biochemical)を用いてジデオキシ法(12)により二本鎖TAクローンを配列決定した。ついで、記載されているとおりに、配列決定産物を6%ポリアクリルアミド/7M 尿素ゲル上で分析し、固定し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。
製造業者の指示に従いポシ・ブロッター(Posi-blotter)(Stratagene)を用いる圧力ブロッティングにより、PCR生成物を、エチジウム染色アガロースゲルからナイトラン(Nytran)ナイロン膜(Schleicher and Schuell)に移した。UVストラタリンカー(Stratalinker)(Stratagene)を用いて、DNAを該膜にクロスリンキングした。ブロットを65℃で2時間プレハイブリダイズし、ついで変性32P−標識ランダムプライムド(13)cDNAプローブ(PSMまたはPSAのいずれか)とハイブリダイズした(6, 7)。ブロットを1×SSC/0.5%SDS中、42℃で2回、0.1×SSC/0.5%SDS中、50℃で2回、それぞれ20分間洗浄した。膜を風乾し、ハイパーフィルム(Hyperfilm)MP(Amersham)を用いて室温で1〜3時間オートラジオグラフィーに付した。
PSAおよびPSMネスティッドPCRアッセイ:
ネスティッドPCRを適用することにより、検出レベルが、外側プライマーだけを用いた場合の平均値である1:10,000から、1:1,000,000より優れた値にまで上昇した。PSAおよびPSM−PCRの場合のこの感度の増加を示す希釈曲線を、それぞれ図1および2に示す。図1に示すとおり、PSA外側プライマーセットの486bpの産物は、エチジウム染色により1:10,000希釈まで明確に検出可能であり、一方、PSA内側プライマーの355bpの産物は、示しているすべての希釈において明確に検出可能である。また、図2では、PSM外側プライマーの647bpの産物が通常のPCRにより明確に検出可能なのは1:10,000までの希釈にすぎないが、PSM内側ネスティッドPCRの234bpの産物は1:1,000,000に希釈においても検出される。特異性を確認するために、対照のすべておよび患者のサンプルのほとんで、サザンブロット法を行った。それぞれの希釈曲線のサザンブロットから、該プライマーの特異性は確認されたが、感度の有意な増加は示されなかった。
材料および方法の項に記載したとおりに、患者およびボランティアからの40個のサンプルについてネスティッドPSAおよびPSM PCRを行った。図48は、陽性対照に加えて4つの代表的陰性対照標本からの結果を示す。この図に示すとおり、RNAの完全性を確認するために、この研究の各標本はβ−2−ミクログロブリン対照と共にアッセイした。PSAプライマーを用いた場合には、これらのサンプルの39個で陰性結果が得られたが、PSMネスティッドPCRでは4個の陽性結果が得られた。これらの「偽陽性」の2つは、血清PSA値が上昇し、前立腺が拡大しており、経直腸前立腺生検を受けたところ間質および線維筋過形成が示された患者に相当する。これらの両患者では、血清PSAレベルが上昇し続け、後日再び行った前立腺生検により前立腺癌が示された。精巣嚢胞で該診察室に現れた1人の患者は、PSMネスティッドPCRで陽性結果を有することが判明し、これについては説明不可能である。残念なことに、この患者はフォローアップに戻らなかったため、このアッセイを繰り返すための別の血液サンプルを得られなかった。腎細胞癌の61歳の男性患者で、PSAおよびPSMの両プライマーを用いて陽性結果が得られた。この患者は、血清PSAレベルが正常であり、指による直腸検査が正常である。全体としては、陽性PCR(他の臨床試験ではない)が前立腺癌の存在を正確に予想した2人の患者を除外すれば、36/38(94.7%)の陰性対照がPSMプライマーで陰性であり、39/40(97.5%)がPSAプライマーを用いて陰性であった。
研究スタッフに各標本の性質が知られないように「盲検的」に、40個の陰性対照と無作為に混合した77人の患者からの117個のサンプルをアッセイした。既に記載したとおり、その患者のサンプルは、種々の異種群から選ばれたものである。いくつかの代表的な患者のサンプルを図49に示すが、これは、限局性および散在性の両方の疾患の患者からの陽性結果に対応する。患者4および5は共にD段階の前立腺癌の患者であり、外側および内側の両プライマー対により陽性結果を示したが、これは、他のサンプルと比べて、大きな循環腫瘍細胞負荷を示すものである。既に示したとおり、PSMおよびPSAプライマーはLNCaP希釈曲線で同様の感度を示したが、PSMプライマーは該患者サンプルの62.3%で微小転移を検出したのに対し、PSAプライマーは9.1%を検出したにすぎなかった。抗アンドロゲン治療を受けている実証された転移前立腺癌(D0〜D3段階)の患者で、PSMプライマーは16/24(66.7%)で微小転移を検出したのに対し、PSAプライマーは6/24(25%)で循環細胞を検出したにすぎなかった。この研究では、ホルモン無反応性前立腺癌(D3段階)の6/7の患者が陽性だった。この研究で、PSAプライマーが微小転移細胞を示したのは、根治的前立腺切除術後のpT3またはpT4(局所的に進行した)のいずれかの前立腺癌患者のわずか1/15(6.7%)であった。PSMプライマーは、これらの患者の9/15(60%)で循環細胞を検出した。興味深いことに、根治的前立腺切除術後のpT2(器官限局性)前立腺癌の13/18(72.2%)の患者で、PSMプライマーを用いることにより循環細胞が検出された。これらの患者のサンプルはいずれも、PSA−PCRで陽性ではなかった。
蛍光in-situハイブリダイゼーションによるコスミドクローン194および683の染色体上の位置決定:
まずPSMをマッピングしたところ、これは染色体11p11.2−p13上に位置していた(図51〜54)。さらにcDNAin-situハイブリダイゼーション実験の情報からは、q腕上でp腕と同程度のハイブリダイゼーションが示された。ゲノムDNAのより一層大きな断片がコスミドとして得られ、これらのうちの2つ(それぞれ約60キロベースで、一方は3'へ、もう一方は5'へ伸長する)は、厳密性の低い条件下で第11染色体のpおよびqに対する結合性を示した。しかしながら、より高い緊縮条件下では、11q14〜q21での結合だけが残った。この結果は、PSMと非常に類似したもう1つの遺伝子が11p上に存在することを示唆する。なぜなら、それは、ゲノムDNAの約120キロベースに対して非常に強く結合するからである(図50)。
ペプチダーゼ酵素活性
PSMは2型膜タンパク質である。ほとんどの2型膜タンパク質は結合タンパク質、輸送タンパク質またはペプチダーゼである。PSMはペプチダーゼ活性を有するらしい。基質N−アセチル−アスパルチル−14Cグルタミン酸(NAAG)を用いてLNCaP細胞を調べたところ、グルタミン酸が遊離したため、カルボキシペプチダーゼとして働いている。インビトロで翻訳されたPSMメーセージもこのペプチダーゼ活性を有していた。
前立腺組織内のチャンネル型グルタミン酸受容体の分布
<緒言>:
中枢神経系(CNS)での興奮性神経伝達は、主にグルタミン酸受容体により媒介される。ヒトCNSでは、2つの型のグルタミン酸受容体(第2メッセンジャー系と共役している代謝調節型受容体、およびリガンド依存性イオンチャネルとして働くイオンチャンネル型受容体)が同定されている。ヒト前立腺組織内のイオンチャネル型グルタミン酸受容体の存在を調べた。
パラフィン包埋ヒト前立腺組織で抗GluR2/3および抗ビオチン免疫組織化学技術を用いて、グルタミン酸受容体発現の検出を行った。PSM抗原は、グルタミン酸を遊離するように作用するニューロカルボキシペプチダーゼである。CNSにおいて、グルタミン酸はグルタミン酸作動性イオンチャンネルに作用することにより神経伝達物質として作用し、カルシウムイオンなどのイオン流動を増加させる。グルタミン酸シグナルが細胞活性に変換される1つの方法は、NOシンターゼの活性化である。最近、NOシンターゼはヒト組織中に存在することが判明した。NOは主要なシグナル伝達機構であり、細胞の成長および死の制御、炎症に対する応答、平滑筋細胞収縮などに関与している。前立腺では、支質のほとんどが平滑筋である。前立腺はグルタミン酸作動性受容体に富むことが知見されており、この関係が解明され始めている。支質異常は、BPHの重要な特徴である。支質上皮相互作用はBPHおよびCaPの両方で重要である。もう一方のグルタミン酸作動性受容体は、Gタンパク質を介して細胞の代謝を変化させる。
抗GluR2/3免疫反応性は前立腺支質に特有であり、前立腺上皮画分には存在しなかった。強力な抗GluR4免疫反応性が前立腺房の基底細胞で観察された。
イオンチャネル型グルタミン酸受容体サブタイプの分布が前立腺の支質と上皮の画分間で異なることについては、未だ記載されていない。前立腺特異的膜抗原(PSMA)は同様の前立腺分布を有し、発現は上皮画分に限定される。PSM抗原は、NAAG1からグルタミン酸を遊離するように作用するニューロカルボキシペプチダーゼであり、神経伝達物質である可能性もある。CNSで、グルタミン酸はグルタミン酸作動性(glutaminergic)イオンチャンネルに作用することにより神経伝達物質として作用し、カルシウムイオンなどのイオン流動を増加させる。グルタミン酸シグナルが細胞活性に変換される1つの方法は、NOシンターゼの活性化である。最近、NOシンターゼはヒト組織中に存在することが判明した。NOは主要なシグナル伝達機構であり、細胞の成長および死の制御、炎症に対する応答、平滑筋細胞収縮などに関与している。前立腺では、支質のほとんどが平滑筋である。前立腺はグルタミン酸作動性受容体に富む。支質異常は、BPHの重要な特徴である。支質上皮相互作用はBPHおよびCaPの両方で重要である。もう一方のグルタミン酸作動性受容体は、Gタンパク質を介して細胞の代謝を変化させる。グルタミン酸は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)のカルボキシペプチダーゼ活性を介して大脳皮質内で産生されうる。この場所で、PSMAはアセチル−アスパルチル−グルタミン酸からグルタミン酸を切断する。総合すると、これらの観察はヒト前立腺におけるPSMAの機能を示唆するものであり、グルタミン酸は、おそらく上皮−支質相互作用を媒介する自己分泌および/またはパラ分泌シグナル伝達分子と考えられる。イオンチャンネル型グルタミン酸受容体は、ヒト前立腺内で独特の区画分布を示す。
ヒト前立腺癌中で発現される膜結合プテロイルポリガンマグルタミルカルボキシペプチダーゼ(葉酸加水分解酵素)の同定
PSMは、葉酸加水分解酵素およびカルボキシニューロペプチダーゼとしての活性を有すると考えられる。細胞障害性薬メトトレキセートが腫瘍毒素となるためには、それが該細胞内に入り、ポリガンマグルタミン酸化されて活性化される必要がある。なぜなら、ポリガンマグルタミン酸化形態は酵素基質として働き、また、ポリガンマグルタミン酸化形態または毒素は該細胞により保持されるからである。葉酸加水分解酵素は競合的反応で作用し、メトトレキセートを脱グルタミン酸化し、ついでこれは該細胞から逆拡散しうる。葉酸加水分解酵素にさらされ過ぎた細胞は、メトトレキセートに抵抗性である。このことは、前立腺癌が常にメトトレキセート療法に絶対無反応性である理由を説明しうる。なぜなら、前立腺および前立腺癌は多量の葉酸加水分解活性を有するからである。しかしながら、この活性に基づき、腫瘍部位で活性化されるプロドラッグ(例、N−ホスホノアセチル−1−アスパラギン酸−グルタミン酸)を生成させてもよい。PALgluは、NAAGを基質とする酵素活性の阻害剤である。
− 可溶化および輸送:26のタイプの類似体は疎水性であり水性媒体中で不溶性であるが、体内に固有の水溶性ジペプチドにより、基質21は、NAAGが輸送され体内に貯蔵されるのと同じ経路をたどるはすである。
PSMエキソン/イントロン結合配列のゲノム体制
エキソン 1 イントロン 1
1F. 鎖
CGGCTTCCTCTTCGG
cggcttcctcttcgg taggggggcgcgtcgcggag...tatttttca
1R. 鎖 ...ataaaaagtCCCACCAAA
エキソン 2 イントロン 2
2F. 鎖
ACATCAAGAAGTTCT
acatcaagaagttct caagtaagtccatactcgaag...
2R. 鎖 ...caagtggtcATTAAAATG
エキソン 3 イントロン 3
3F. 鎖
GAAGATGGAAATGAG
gaagatggaaatgag gtaaaatataaataaataaataa...
エキソン 4 イントロン 4
4F. 鎖
AAGGAATGCCAGAGG
aaggaatgccagagg taaaaacacagtgcaacaaa...
4R. 鎖 ...agagttgTCCCGCTAGAT
エキソン 5 イントロン 5
5F. 鎖
CAGAGGAAATAAGGT
cagaggaaataaggt aggtaaaaattatctctttttt...
...gtgttttctAGGTTAAAAATG
5R. 鎖 ...cacttttgaTCCAATTT
エキソン 6 イントロン 6
6F. 鎖
GTTACCCAGCAAATG
gttacccagcaatg gtgaatgatcaatccttgaat...
6R. 鎖 ...aaaaaaagtCTTATACGAATA
エキソン 7 イントロン 7
7F. 鎖
ACAGAAGCTCCTAGA
acagaagctcctaga gtaagtttgtaagaaaccargg...
7R . 鎖 ...aaacacaggttatcTTTTTACCCA
エキソン 8 イントロン 8
8F. 鎖
AAACTTTTCTACACA
aaacttttctacaca gttaagagactatataaatttta...
8R. 鎖 ...aaacgtaatcaTTTTCAGTTCTAC
エキソン 9F. イントロン 9
9F. 鎖
AGCAGTGGAACCAG
agcagtggaaccag gtaaaggaatcgtttgctagca...
...tttctagatAGATATGTCATTC
9R. 鎖 ...aaagaTCTGTCTATACAGTAA
エキソン 10 イントロン 10
10F. 鎖
CTGAAAAAGGAAGG
ctgaaaaaggaagg taatacaaacaaatagcaagaa...
エキソン 11 イントロン 11
11F. 鎖
TGAGTGGGCAGAGG
agagg ttagttggtaatttgctataatata...
エキソン 13 イントロン 12
12R. 鎖
GAGTGTAGTTTCCT
gtagtttcct gaaaaataagaaaagaatagat...
エキソン 14 イントロン 13
13R. 鎖
AGGGCTTTTCAGCT
agggcttttcagct acacaaattaaaagaaaaaaag...
エキソン 14 イントロン 14
14F. 鎖
GTGGCATGCCCAGG
gtggcatgcccagg taaataaatgaatgaagtttcca...
エキソン 16 イントロン 15
15R. 鎖
AATTTGTTTGTTTCC
aatttgtttgtttcc tacagaaaaaacaacaaaaca...
エキソン 16 イントロン 16
16F. 鎖
CAGTGTATCATTTG
cagtgtatcatttg gtatgttacccttcctttttcaaatt...
...tttcagATTCACTTTTTT
16R. 鎖 ...aaagtcTAAGTGAAAA
エキソン 17 イントロン 17
17F. 鎖
TTTGACAAAAGCAA
tttgacaaaagcaa gtatgttctacatatatgtgcatat...
17R. 鎖 ...aaagagtcGGGTTA
エキソン 18 イントロン 18
18F. 鎖
GGCCTTTTTATAGG
ggcctttttatagg taaganaagaaaatatgactcct...
18R. 鎖 ...aatagttgTGTAAACCC
エキソン 19 イントロン 19
19F. 鎖
GAATATTATATATA
gaatattatatata gttatgtgagtgtttatatatgtgtgt...
注: F: フォワード鎖
: R: リバース鎖
Claims (1)
- 前立腺特異的膜抗原の外膜ドメインに結合する生物学的試薬の使用であって、正常な前立腺上皮細胞、良性の過形成前立腺上皮細胞、および癌性前立腺上皮細胞を除去または死滅させる組成物を製造するための使用。
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