JP2005046110A - β−アミラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 酵素活性が高く、耐熱性が高くβ−アミラーゼを得るとともに、そのβ−アミラーゼにより、高品質なマルトースを効率よく得る技術を提供すること。
【解決手段】 カンショの搾汁液をｐＨ３．９〜４．０に調整した酸性処理液を得るｐＨ調整工程、前記酸性処理液を５９〜６１℃で、３５〜４５秒加熱処理する加熱工程、加熱処理された液を中和処理する中和処理工程を順に行なう。
【選択図】 なし

Description

本発明は、β−アミラーゼの製造方法、及び、そのβ−アミラーゼによりマルトースを製造する技術に関する。β−アミラーゼは、一般的にマルトースの生産や澱粉の老化防止に用いられる。

従来、β−アミラーゼは、大豆、小麦、大麦から抽出、精製して製造されるものが工業的に用いられている。これらのβ−アミラーゼのうち、前記大豆由来のものは、酵素活性が高く、耐熱性にも優れることが知られているが、高価である。その上、β−アミラーゼは、大豆油搾汁液の水可溶画分から製造されていたものの、近年、有機溶剤を用いた抽出により大豆油を得る製造方法が主流となり、β−アミラーゼはこの製造工程中で失活することから、β−アミラーゼの製造には適さなくなり、現在では大豆由来のβ−アミラーゼはあまり製造されていないという事情もある。また、前記小麦、大麦由来のものは、原料が豊富に入手できる等の理由から、安価ではあるが、耐熱性が低いために使用用途、条件に大きな制約を受けるという問題点があった。

また、マルトースは、澱粉材料に前記β−アミラーゼ等の酵素剤を添加して糖化し、得られた糖化液を精製して製造される。この際の糖化温度は高いほど生産速度が早いが酵素が失活しやすく、酵素反応自体が効率よく行なわれないために、酵素の利用効率が低くなり不経済である。また糖化温度を低くすると酵素は失活しにくくなるが、その酵素反応に要する時間が長くなるとともに、雑菌の繁殖しやすい条件となり作業工程管理が煩雑になりがちで、しかも、酵素反応のための前処理の工程や後処理の工程と処理温度がおおきく異なり、作業工程のみならず、エネルギー効率の面からも不経済であるという問題が発生していた。

そのため、大豆、小麦、大麦由来のβ−アミラーゼの代替となるβ−アミラーゼの製造方法が求められている。

そこで、豊富な原材料を安価に入手可能なカンショに含まれるβ−アミラーゼの利用が検討されているが、カンショから得られる酵素にはα−アミラーゼが含まれ、精製が困難である等の理由から、工業的に利用可能な水準に達していないという現状にある。

従って、本発明の目的は、上記実情に鑑み、酵素活性が高く、耐熱性が高いβ−アミラーゼを得るとともに、そのβ−アミラーゼにより、高品質なマルトースを効率よく得る技術を提供することにある。

本発明者らは、カンショに含まれる酵素中のβ−アミラーゼについて鋭意研究した結果、このβ−アミラーゼは、比較的耐熱性が高いことがわかった。また、前記酵素は、特定の条件を選択することによって、含有するα−アミラーゼを選択的に失活させることができ、純度の高いβ−アミラーゼを得ることが出来る事を見出した。本発明は、上記新知見に基づきなされたものであって、上記目的を達成するための本発明のβ−アミラーゼの製造方法の特徴構成は、
カンショの搾汁液をｐＨ３．９〜４．０に調整した酸性処理液を得るｐＨ調整工程、
前記酸性処理液を５９〜６１℃で、３５〜４５秒加熱処理する加熱工程、
加熱処理された液を中和処理する中和処理工程、
を順に行なう点にある。

尚、前記カンショが九州１４０号、サニーレッドから選ばれる少なくとも一種を主成分とすることが好ましい。

また、本発明のマルトースの製造方法は、カンショ由来のβ−アミラーゼを含有する酵素製剤を澱粉質原料に混合して澱粉から糖への転化反応をさせる事を特徴とし、
本発明のマルトースシラップはカンショ由来のβ−アミラーゼを含有する酵素製剤を澱粉質原料に混合し、６５℃〜７０℃で２２〜２６時間澱粉から糖への転化反応をさせてあることを特徴とする。

〔作用効果〕
つまり、カンショ由来の酵素中にはα−アミラーゼ、β−アミラーゼが含まれ、そのβ−アミラーゼについて鋭意研究の結果、カンショ由来のβ−アミラーゼは、現在汎用されている小麦、大麦由来のβ−アミラーゼに比べきわめて耐熱性に優れる。

従って、耐熱性の高いβ−アミラーゼを用いて糖の転化反応等を行なうと、その反応に必要な熱処理の際に、酵素活性が低下するような問題が起きにくくなるとともに、従来よりも高温条件下で反応を行なえることになるから、反応速度を上昇させられ、短時間で反応を終了でき、前記反応による生成物の生産性を向上させられる。また、通常このような反応を行なう場合には、天然有機物由来の反応ということになるから、雑菌の混入繁殖防止等に留意する必要があるが、雑菌の繁殖しにくい高温条件を選択することによって、このような衛生管理を容易にすることが出来、生成物の品質の向上、生産管理の省力化を図ることができる利点がある。

また、カンショ由来のβ−アミラーゼは澱粉から糖への転化反応に対する反応活性も高く、このβ−アミラーゼを用いてマルトース生産を行なえば、澱粉から糖への転化率が８０％を超えることが後述の実験例より明らかになっており、特にマルトースの製造に有用であることがわかった。このようにしてマルトースを得ると、上述のように、衛生面で品質が高いものを生産性高く得ることが出来る。

さらに、上述のマルトース製造方法で得られたマルトースシラップは、従来のマルトースシラップに比べ、糖の転化率が極めて高く、シラップとして高品質であり、しかも、衛生面でも品質がきわめて高い。また、安価な原料で効率よく生産できるために製品を安価に供給するのにも役立つ。

また、上述の酵素は、後述の実験例から明らかなように、特定の条件を選択することにより、前記α−アミラーゼのみを選択的に失活させることができる。そのため、純度の高いβ−アミラーゼを得ることができそのβ−アミラーゼに基づく糖の転化反応等を選択的に行うことが出来るようになった。

また、さらに得られた実験事実として、種々のカンショをスクリーニングしたところ、九州１４０号、サニーレッドが、特に酵素含量の高いカンショであることがわかりβ−アミラーゼの製造の原料として適していることがわかった。

また、カンショ由来のα−アミラーゼは、貯蔵中に活性が上昇するため、収穫後速やかに加工することが望ましいことがわかった。

さらに、カンショ由来のβ−アミラーゼは精製されるほど酵素反応の選択性が高くなるものの、活性が低下することがわかり、カンショ粉末を過度に精製することなく、そのまま酵素製剤として用いると、マルトース製造などの用途で好適に用いられることも明らかになった。

尚、前記ｐＨ調整工程では、カンショの搾汁液をｐＨ３．９〜４．０に調整することが好ましく、後述の実験例よりｐＨ３．９未満だとβ−アミラーゼが失活するおそれがあって好ましく無い。

また、加熱工程は、５９〜６１℃で、３５〜４５秒加熱処理することが好ましく、５９℃以下だとα−アミラーゼの失活が十分でない。また、６１℃以上による加熱だと、β−アミラーゼの失活のおそれがあって好ましくない。

さらに、前記β−アミラーゼを用いた澱粉から糖への転化反応を行う場合には、６５℃〜７０℃で２２〜２６時間の処理を行うことが好ましく６５℃以下だと上述の衛生管理上の問題があり、転化反応に要する時間が長くなって、反応効率が低下するという問題がある。一方、７０℃以上だとβ−アミラーゼの活性が低下しやすく、酵素の耐久性が低くなるため、やはり、反応効率の低下につながる。特に上述の条件下で転化反応を行えば、澱粉からマルトースへの転化率が８０％以上の特に高品質なマルトースシラップが効率よく得られるので好ましいといえる。

以下に本発明の実施の形態を説明する。
＜β−アミラーゼ＞
カンショ（九州１４０号）の塊根搾汁液を得るとともに、この搾汁液に塩酸を添加してｐＨ３．９〜４．０に調整する（ｐＨ調整工程）。この工程には、前記搾汁液を８０ｍＬ／分、前記塩酸を４ｍＬ／分で連続的にミキサーに供給して、約１分５０秒混合する連続的な処理を適用することが出来た。

次に、得られた酸性処理液を６０℃で、約４０秒加熱処理する（加熱工程）。ここで、加熱には加熱プレートを用いれば、連続的に加熱工程が行なえる。

このような処理により、前記搾汁液に含まれていたα−アミラーゼは失活し、β−アミラーゼを選択的に含有するものとなる。

さらに、加熱処理された加熱処理液は、中和用のアンモニア水を用いて中和処理する（中和処理工程）。この工程には、前記加熱処理液を８０ｍＬ／分、前記アンモニアを８０ｍＬ／分で連続的にミキサーに供給して、約１分５０秒混合する連続的な処理を適用することが出来た。この中和処理により得られた処理液はｐＨ６．０〜６．２程度に中和される。

このようにして得られたカンショ水抽出液は、冷水を用いた冷却プレートを用いて常温に冷却した後凍結乾燥して、粉末状のβ−アミラーゼ製剤に加工される。

このような処理により得られたこのβ−アミラーゼ製剤は、５２３３Ｕ／ｇＤＳのβ−アミラーゼ、ほぼ０Ｕ／ｇＤＳのα−アミラーゼを含有し、β−アミラーゼ活性が高く他の酵素活性の低い、高品質なβ−アミラーゼ製剤となっていることがわかった。

尚、ここで、Ｕ／ｇＤＳとは、それぞれの固形分重量に対する酵素の活性量を示す単位である。また、βアミラーゼの活性を示すＵは、過剰のα‐グルコシダーゼ存在下において、ｐ−ニトロフェニルマルトペンタオシド（終濃度０．２３８％）にｐＨ ５．８、４０℃で作用するとき、反応初期の１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離するのに必要な酵素量を１Ｕとする。また、α−アミラーゼの活性Ｕは、０．２７ ｍｌの基質溶液（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、アミロースアズール５．４ ｍｇ 含有２０ ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ ５．８））に酵素液０．０３ ｍｌを添加し、４０。Ｃで１０分間反応させ、０．２ｍｌの１８％酢酸溶液を加えて反応を終了させ、遠心後上清に遊離してきた可溶性色素の５９５ ｎｍの吸光度を２．５上昇させるに必要な酵素量をαーアミラーゼの１Ｕとした。

尚、市販酵素製剤等に含有されるβ−アミラーゼ量は表１のようになっており、前記β−アミラーゼ製剤は高濃度のβ−アミラーゼを含有していると言えることがわかる。

＜マルトースシラップ＞
３７％コーンスターチ乳を水酸化カルシウムによりｐＨ５．５に調整したものに、市販の耐酸耐熱α−アミラーゼ（大和化成社製クライスターゼＹ７）を混和して、９５℃にて５０分間混和させた。これにより、前記コーンスターチ乳が液化した液化液が得られる。前記液化液を１３０℃で１０分間保持し、酵素を失活させるとともにＤＥ２．０に調整した前処理液を得る。

前記前処理液を６５℃〜７０℃に冷却させ、１６Ｕ／ｇＤＳの前記β−アミラーゼ、１Ｕ／ｇＤＳの耐熱性プルラナーゼ（大和化成社製クライスターゼＰＬ４５）及び水を混合し、コーンスターチ濃度３５％で糖化反応を行った。

６５℃〜７０℃で２４時間澱粉から糖への転化反応を行うと、表２記載の組成となり、Ｇ２に該当するマルトース生成率が８０％を超える高品質なマルトースシラップが得られることがわかった。また、この反応において雑菌汚染に起因するｐＨ低下など衛生面に関する問題は認められなかった。

以下に、上述の実施の形態で用いた製造条件を選定し、効果を確認するために行った実験例を示す。
＜カンショの選抜＞
種々のカンショの塊根搾汁液に含まれるβ−アミラーゼ活性を調べたところ、図１に示すようになり、サニーレッド、九州１４０号などのカンショがβ−アミラーゼ製造に好適であることがわかった。

尚、β−アミラーゼ活性は、９６穴のマイクロプレートに２０μＬの搾汁液及び、２０μＬの合成基質ｐ−ニトロフェニル−α−［Ｄ］マルトペンタオシド（５ｍｍｏｌ／Ｌ）と２Ｕのαグルコシダーゼを加え、１分間撹拌した後、４０℃で１０分間恒温で酵素反応させ、０．２ｍＬのトリズマ塩基を添加して反応を終了させた後、吸光度の測定により評価した。

このような活性測定法によれば、多品種のカンショを少ない基質量で迅速かつ簡便に評価できる。

さらに、前記カンショ塊根を貯蔵する場合、カンショ中のα−アミラーゼは経日的に活性が向上する（図２（ａ））のに対して、β−アミラーゼはほとんど活性が変化しない（図２（ｂ））ために、カンショは収穫後直ちに加工するほど、β−アミラーゼ比率の高い酵素が抽出できることがわかる。

尚、この実施例では１２〜１５℃の冷暗所にてカンショを貯蔵している。
＜β−アミラーゼの耐熱性＞
種々のβ−アミラーゼ製剤の耐熱性を調べたところ図３のようになった。
また、九州１４０号のβ−アミラーゼについて精製度合いの異なる酵素製剤について耐熱性を調べたところ、図４に示すようになった。

図３より、カンショ由来のβ−アミラーゼ製剤は、大豆由来酵素製剤には及ばないものの、小麦フスマに比べて高い耐熱性を示すことがわかり、マルトース製造時の高温処理に対して高い耐性を示すことがわかった。また、図４より、酵素製剤の精製度が上がるにつれ、耐熱性が低下することがわかり、カンショ搾汁液には、β−アミラーゼの耐熱性を向上させる他の物質が含まれていることが予想される。従って、前記カンショ由来のβ−アミラーゼを高温で使用する目的で精製する場合、過度の精製は好ましくなく、むしろ、カンショ水抽出液をそのまま酵素製剤として用いることが望ましい場合があることがわかる。

尚、耐熱性は、各酵素製剤等の４０℃における活性を１００とし、昇温して２０分保持した後の酵素活性（残存活性）を相対値で示してある。

さらに、上述の実施の形態において用いたβ−アミラーゼを種々の温度条件でマルトース製造に用いたところ、図５のようになった。図５より大麦由来のβ−アミラーゼを用いた場合には、５８℃の反応条件において澱粉のマルトース生成率８０％程度の高い反応性を示すが、反応温度を上げるに従って、急激に生成率が減少し、６５℃では３７％しか示さなくなるのに対して、カンショ由来のβ−アミラーゼは、６５℃の高温域まで８０％以上の高い生成率を維持しており、耐熱性に優れることがわかった。

尚、図５における試験は、前記実施の形態におけるマルトースシラップの製造条件において、反応時間を４８時間として行ったものである。
＜α−アミラーゼの失活＞ 前記カンショ搾汁液の原液を種々の酸性条件下で１１０秒間撹拌し、４０秒間熱処理した後アンモニア水を添加してｐＨ６．０〜６．２に中和した酵素残存活性は、表３のようになった。

この結果から、カンショからβ−アミラーゼを抽出する際には搾汁液のｐＨを３．９〜４．０に調整して撹拌後、約６０℃で４０秒間保持する熱処理を行うことが好ましいことがわかる。
＜別実施の形態＞
β−アミラーゼの製造には、前記カンショ搾汁液に代えて、カンショ粉末、粉末からの抽出液、濃縮液等を用いてもよく、さらには、カンショ加工廃液であっても構わない。尚、カンショ加工廃液からβ−アミラーゼを抽出することとすれば、廃棄物の低減及び、資源の有効利用につながるために特に好ましい。

また、マルトースシラップの製造についても同様に、種々の澱粉材料を適用できる。

カンショ品種間でのβ−アミラーゼ活性の相違を示す図 カンショの貯蔵中におけるアミラーゼ活性の経日変化を示す図 原材料の種類間でのβ−アミラーゼの耐熱性の相違を示す図 精製度の相違によるβ−アミラーゼの耐熱性の相違を示す図 β−アミラーゼの相違によるマルトース生成率の相違を示す図

Claims (4)

1. カンショの搾汁液をｐＨ３．９〜４．０に調整した酸性処理液を得るｐＨ調整工程、
   前記酸性処理液を５９〜６１℃で、３５〜４５秒加熱処理する加熱工程、
   加熱処理された液を中和処理する中和処理工程、
   を順に行なうβ−アミラーゼの製造方法。
2. 前記カンショが九州１４０号、サニーレッドから選ばれる少なくとも一種を主成分とする請求項１に記載のβ−アミラーゼの製造方法。
3. カンショ由来のβ−アミラーゼを含有する酵素製剤を澱粉質原料に混合して澱粉から糖への転化反応をさせるマルトースの製造方法。
4. カンショ由来のβ−アミラーゼを含有する酵素製剤を澱粉質原料に混合し、６５℃〜７０℃で２２〜２６時間澱粉から糖への転化反応をさせてあるマルトースシラップ。

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