JP2005046066A - New bacterium for producing protein and method for producing the protein - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a bacterial host for producing a recombinant protein improved in both the efficiency of transcription and translation by genetic modification. <P>SOLUTION: The bacterium is characterized by being increased in the content of tRNA and suppressed in the degradation of mRNA. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、組換え蛋白質生産に利用できる、新規な遺伝的改変が施された宿主バクテリア、及び該バクテリアを用いた蛋白質の製造方法に関する。   The present invention relates to a host bacterium that has been subjected to a novel genetic modification and can be used for production of a recombinant protein, and a method for producing a protein using the bacterium.

宿主微生物、特に大腸菌などのバクテリアにおける組換え蛋白質の発現効率を向上させるため、これまでに転写・翻訳・ポリペプチドの折りたたみといった成熟蛋白質に到達するまでの様々の過程を改善する目的で、遺伝子工学的な手法による改善が試みられている（Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９ １０，４１１−４２１）。   In order to improve the expression efficiency of recombinant proteins in host microorganisms, especially bacteria such as Escherichia coli, genetic engineering has been aimed at improving various processes until reaching mature proteins such as transcription, translation and polypeptide folding. An improvement by a conventional technique has been attempted (Baneyx, F., Curr. Opin. Biotechnol., 1999 10, 411-421).

例えば、分子量サイズの大きいポリペプチドを生産しようとする場合には、発現されたｍＲＮＡが分解されることがあるが、組換え蛋白質の生産においてこのｍＲＮＡの分解を抑制することは有効な手段である。これに関して、バクテリアでのｍＲＮＡの分解に関与する特定因子のリボヌクレアーゼ活性を低下させる技術が報告されている（特許文献１参照）。   For example, when trying to produce a polypeptide having a large molecular weight size, the expressed mRNA may be degraded, but it is an effective means to suppress degradation of this mRNA in the production of recombinant protein. . In this regard, a technique for reducing the ribonuclease activity of a specific factor involved in the degradation of mRNA in bacteria has been reported (see Patent Document 1).

また、宿主バクテリアにおける使用頻度が低いコドンに対応するｔＲＮＡの枯渇は外来遺伝子の翻訳途中での停止、生産されるポリペプチド鎖におけるアミノ酸の取り込みミス等を起こすことになり、これは組換え蛋白質生産における重大な問題点の原因となる。例えばＡＧＡ／ＡＧＧ、ＣＧＧ／ＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＡＵＡ（Ｉｌｅ）、ＣＵＡ（Ｌｅｕ）及びＣＣＣ（Ｐｒｏ）は大腸菌では使用頻度が極めて低い。従って、これらのコドンが頻繁に採用されている真核生物や古細菌の遺伝子の翻訳過程においては、その速度低下、翻訳途中での停止、読みとり配列のフレームシフト、及び誤ったアミノ酸の取り込みといった悪い影響を及ぼす可能性がある（Ｋｕｒｌａｎｄ， Ｃ． ａｎｄ
Ｇａｌｌｅｔ， Ｊ． １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７
， ４８９−４９３）。この問題を回避する目的で、バクテリアでの発現量が非常に少な
いｔＲＮＡを補充する遺伝的改変がなされている（非特許文献１）。 In addition, the depletion of tRNA corresponding to codons that are infrequently used in host bacteria can result in termination of translation of foreign genes and misincorporation of amino acids in the produced polypeptide chain. Cause serious problems. For example, AGA / AGG, CGG / CGA (Arg), GGA (Gly), AUA (Ile), CUA (Leu) and CCC (Pro) are very rarely used in E. coli. Therefore, in the translation process of eukaryotic and archaeal genes in which these codons are frequently employed, the speed is slow, the translation is stopped, the reading sequence is frame-shifted, and the wrong amino acid is incorporated. (Kurland, C. and
Gallet, J.M. 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7
, 489-493). For the purpose of avoiding this problem, genetic modification for supplementing tRNA with a very low expression level in bacteria has been made (Non-patent Document 1).

しかしながら、上記のｍＲＮＡの分解抑制（すなわちｍＲＮＡの安定化）又はｔＲＮＡの補充を行う、いずれか一方のみの遺伝的改変では、真核生物や古細菌由来の蛋白質の発現が十分ではないことがしばしばあった。ｍＲＮＡの分解が抑制されてもこれに対応するポリペプチド鎖の伸長を完全に行う際には、ｔＲＮＡの枯渇といった別の問題に直面するものと考えられる。これまでに転写・翻訳に関わる上記の両方の遺伝的改変を施し、組換え蛋白質の生産性を向上させる試みはなされていなかった。また、真核生物由来の蛋白質をバクテリアで生産する場合には、目的とする蛋白質が過剰に生産されたとしても不活性な不溶性凝集体として生産される場合が多く、また生産されるポリペプチド鎖が正常に折りたたまれないこともあった。   However, it is often the case that the expression of proteins from eukaryotes and archaea is not sufficient in the above-described genetic modification that suppresses degradation of mRNA (that is, stabilizes mRNA) or supplements tRNA. there were. Even if the degradation of mRNA is suppressed, it is considered that another problem such as tRNA depletion is encountered when the corresponding polypeptide chain is completely extended. Until now, no attempt has been made to improve the productivity of recombinant proteins by carrying out both of the above-described genetic modifications related to transcription and translation. In addition, when a protein derived from a eukaryote is produced by bacteria, it is often produced as an inactive insoluble aggregate even if the target protein is produced in excess, and the produced polypeptide chain May not fold normally.

従って、当該技術分野においては、正確な配列及び立体構造を有する蛋白質を高効率に生産するための方法及びツールが望まれていた。   Therefore, in this technical field, a method and a tool for producing a protein having an accurate sequence and a three-dimensional structure with high efficiency have been desired.

ＷＯ ００／０８１８３号パンフレットWO 00/08183 brochure Ｂａｃａ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｈｏｌ， Ｗ．Ｇ．Ｊ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ３０， １１３−１１８ （２０００）Baca, A.M. M.M. and Hol, W.H. G. J. et al. , Int. J. et al. Parasitology 30, 113-118 (2000)

本発明は、遺伝的改変によって転写及び翻訳の両方の効率が高められた組換え蛋白質生産用バクテリア宿主を提供し、さらに本発明のバクテリア宿主にて産生される蛋白質の折りたたみを改善させる目的で、蛋白質折りたたみに関与する蛋白質因子及びその遺伝子を用いる技術をも提供する。   The present invention provides a bacterial host for producing a recombinant protein in which the efficiency of both transcription and translation is enhanced by genetic modification, and for the purpose of improving the folding of the protein produced in the bacterial host of the present invention, A protein factor involved in protein folding and a technique using the gene are also provided.

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バクテリアにおけるｍＲＮＡの分解を抑制し、かつ該バクテリアにおいて使用頻度が低いコドンに対応するｔＲＮＡの含有量を増加させる遺伝的改変をバクテリアに施すことによって、それぞれ単独の遺伝的改変を行った場合よりもその蛋白質生産効率が改善されることを見出した。また本発明者は、特に蛋白質生産において不活性な不溶性凝集体が形成される場合には、上記遺伝的改変に加えて、さらに分子シャペロンの共存下にて目的とする蛋白質を発現させることによって、正確な折りたたみを有する蛋白質が可溶性画分に産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。   As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has made genetic modifications that suppress the degradation of mRNA in bacteria and increase the content of tRNA corresponding to codons that are infrequently used in the bacteria. It has been found that the protein production efficiency is improved by applying to bacteria as compared with the case where each genetic modification is performed individually. In addition to the above genetic modification, the inventor further expressed the target protein in the presence of a molecular chaperone, particularly when inactive insoluble aggregates are formed in protein production. It has been found that a protein having an accurate folding is produced in the soluble fraction, and the present invention has been completed.

すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１８）を提供する。
（１）ｔＲＮＡの含有量が増加され、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。
上記バクテリアにおいて、ｍＲＮＡ分解の抑制は、例えば、ヌクレアーゼ活性の抑制により、具体的には、産生されるＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）の一部又は全部の欠損又はアミノ酸置換により行うことができる。また上記バクテリアにおいて、ｔＲＮＡは、該バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡであることが好ましい。 That is, the present invention provides the following (1) to (18).
(1) A bacterium characterized in that the content of tRNA is increased and the degradation of mRNA is suppressed.
In the above bacteria, suppression of mRNA degradation can be performed, for example, by suppression of nuclease activity, specifically, by deletion or amino acid substitution of a part or all of the C-terminal domain (477 amino acids) of RNaseE produced. . In the bacterium, the tRNA is preferably a tRNA corresponding to at least one codon that is not frequently used in the bacterium.

（２）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを有し、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。
上記バクテリアにおいて、ｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドはゲノム当たり１０コピー以上複製され得るものであることが好ましい。 (2) A bacterium having a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage frequency in the bacterium, and mRNA degradation is suppressed.
In the bacterium described above, it is preferable that the plasmid containing the gene encoding tRNA can be replicated 10 copies or more per genome.

（３）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれ、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。 (3) A bacterium characterized in that a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage frequency in the bacterium is integrated into the genome and the degradation of mRNA is suppressed.

（４）上記バクテリアにおいて、さらに分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とするバクテリア。
上記（１）〜（４）のバクテリアとしては、例えば大腸菌が挙げられる。 (4) In the bacterium, a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof is further introduced. Bacteria.
Examples of the bacteria (1) to (4) include Escherichia coli.

（５）以下の工程を含む、上記（１）〜（４）のいずれかのバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおいてｔＲＮＡの含有量を増加させる工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡ分解を抑制させる工程 (5) A method for producing the bacterium according to any one of (1) to (4), comprising the following steps.
(A) increasing the tRNA content in the bacteria; and (b) suppressing mRNA degradation in the bacteria.

（６）以下の工程を含む、上記（２）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程 (6) A method for producing the bacterium of (2) above, comprising the following steps.
(A) introducing a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one of codons infrequently used in bacteria into the bacteria; and (b) a gene encoding a protein involved in mRNA degradation in the bacteria. For deleting or mutating

（７）以下の工程を含む、上記（３）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を該バクテリアのゲノムに組み込む工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程 (7) A method for producing the bacterium of (3) above, comprising the following steps.
(A) a step of incorporating a gene encoding tRNA corresponding to at least one codon that is not frequently used in bacteria into the genome of the bacteria; and (b) a gene encoding a protein involved in the degradation of mRNA in bacteria. Or the step of mutating

（８）以下の工程を含む、上記（４）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程；並びに
（ｃ）分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程 (8) A method for producing the bacterium of (4) above, comprising the following steps.
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) introducing into the bacterium a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one of the less frequently used codons in the bacterium; and (c) a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, A step of introducing a plasmid containing a gene encoding at least one protein selected from protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof into bacteria.

（９）以下の工程を含む、上記（４）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を該バクテリアのゲノムに組み込む工程；
（ｃ）分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程 (9) A method for producing the bacterium of (4) above, comprising the following steps.
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) integrating a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage in bacteria into the bacterial genome;
(C) introducing a plasmid containing a gene encoding a gene encoding at least one protein selected from molecular chaperones, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof into bacteria.

（１０）以下の工程を含む、上記（４）のバクテリアを製造する方法。
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子と、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子とを含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程 (10) A method for producing the bacterium of (4) above, comprising the following steps.
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon that is not frequently used in bacteria, and at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase, and thioredoxin Introducing a plasmid containing a gene encoding the partial peptide into the bacterium

（１１）上記（１）〜（４）のいずれかのバクテリアに目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
上記形質転換体において、目的蛋白質又はペプチドとしては、例えば可溶性蛋白質、膜蛋白質などが挙げられる。 (11) A transformant in which a gene encoding a target protein or peptide is introduced into the bacterium of any one of (1) to (4) above.
In the transformant, examples of the target protein or peptide include a soluble protein and a membrane protein.

（１２）上記（１）〜（４）のいずれかのバクテリアの粗抽出物を含むことを特徴とする組成物。 (12) A composition comprising the bacterial bacterial extract of any one of (1) to (4) above.

（１３）上記（１１）の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的蛋白質又はペプチドを回収することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。 (13) A method for producing a target protein or peptide, comprising culturing the transformant of (11) above and recovering the target protein or peptide from the obtained culture.

上記方法は、さらにｉｎ ｖｉｔｒｏにて目的蛋白質又はペプチドの不溶性凝集体を可溶化させ、再構成する工程を含んでもよく、この場合、不溶性凝集体の再構成は、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、
プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドの共存下で行われることが好ましい。
また上記方法においては、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子を、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子と共発現させてもよいし、あるいは、目的蛋白質又はペプチドを、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる１つの蛋白質又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として発現させてもよい。 The above method may further include a step of solubilizing and reconstituting insoluble aggregates of the target protein or peptide in vitro. In this case, the reconstitution of the insoluble aggregates is performed by molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans. Isomerase, disulfide isomerase,
It is preferably carried out in the presence of at least one protein selected from protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof.
In the above method, the gene encoding the target protein or peptide is a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase, and thioredoxin, or a partial peptide thereof. The target protein or peptide may be co-expressed or expressed as a fusion protein with one protein selected from molecular chaperones, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof You may let them.

（１４）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、上記（１２）の組成物を用いて目的蛋白質又
はペプチドを産生することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。 (14) A method for producing a target protein or peptide, which comprises producing the target protein or peptide using the composition of (12) above in an in vitro translation system.

上記（１３）又は（１４）の方法においては、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が、真核生物由来ｃＤＮＡの全長配列、又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするその部分配列であることが好ましい。   In the above method (13) or (14), the gene encoding the target protein or peptide is a full-length sequence of eukaryotic cDNA or a partial sequence encoding an amino acid sequence of 6 residues or more. preferable.

（１５）上記（１３）又は（１４）の方法により製造された目的蛋白質又はペプチド、上記（１１）の形質転換体、又は上記（１２）の組成物のいずれかを動物に免疫する工程を含むことを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法。
（１６）上記（１５）の方法によって得られる抗体。
（１７）上記（１５）に記載される免疫動物より抗体遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質又はペプチドに対する抗体をコードする遺伝子の調製方法。（１８）上記（１７）の方法によって得られる抗体遺伝子、及び抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードする遺伝子。 (15) immunizing an animal with the target protein or peptide produced by the method of (13) or (14), the transformant of (11), or the composition of (12) A method for producing an antibody against a target protein or peptide.
(16) An antibody obtained by the method of (15) above.
(17) A method for preparing a gene encoding an antibody against a target protein or peptide, comprising a step of separating an antibody gene from the immunized animal described in (15) above. (18) A gene encoding an antibody gene obtained by the method of (17) above and a peptide having 6 or more residues in the antigen recognition region of the antibody.

本発明により、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつｔＲＮＡ含有量が増加されており、また場合によっては分子シャペロンを含むバクテリアが提供される。このバクテリアは、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に生産するために有用である。   According to the present invention, there is provided a bacterium that suppresses the degradation of mRNA, has an increased tRNA content, and optionally contains a molecular chaperone. This bacterium is useful for producing a desired protein or peptide with high efficiency while maintaining an accurate sequence and folding.

以下、本発明を詳細に説明する。   Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明の新規なバクテリアは、ｔＲＮＡの含有量が増加され、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするものであり、これを目的蛋白質又はペプチドの遺伝子組換え手法による製造に用いた場合には、該目的蛋白質又はペプチドを高効率に製造することができる。   The novel bacterium of the present invention is characterized in that the content of tRNA is increased and the degradation of mRNA is suppressed, and this was used for production of a target protein or peptide by a genetic recombination technique. In some cases, the target protein or peptide can be produced with high efficiency.

１．バクテリア及びその製造
（１）バクテリア
本発明において使用するバクテリアとしては、蛋白質生産に利用されている一般的なバクテリアであれば特に限定されるものではなく、例えば、大腸菌、枯草菌等が含まれる。本発明においては、簡便性の点から大腸菌を使用することが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。 1. Bacteria and production thereof (1) Bacteria Bacteria used in the present invention are not particularly limited as long as they are general bacteria used for protein production, and include, for example, Escherichia coli and Bacillus subtilis. In the present invention, it is preferable to use E. coli from the viewpoint of simplicity. Examples of Escherichia coli include Escherichia coli DH5α, and examples of Bacillus subtilis include Bacillus subtilis.

（２）ｍＲＮＡ安定化
組換え蛋白質の生産においてｍＲＮＡの分解を抑制し、ｍＲＮＡを安定化させることは組換えポリペプチドの生産性を向上させるための有効な手段である。ｍＲＮＡの分解を抑制するには、例えばｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質の活性を抑制することが挙げられる。例えばそのような活性としてはヌクレアーゼ活性があり、このヌクレアーゼ活性を抑制することによってｍＲＮＡを安定化させることができる。 (2) mRNA stabilization Suppressing the degradation of mRNA in the production of a recombinant protein and stabilizing the mRNA is an effective means for improving the productivity of the recombinant polypeptide. In order to suppress the degradation of mRNA, for example, the activity of a protein involved in the degradation of mRNA can be suppressed. For example, such activity includes nuclease activity, and mRNA can be stabilized by suppressing this nuclease activity.

バクテリアにおけるｍＲＮＡの分解には、デグラダゾームと呼ばれるヌクレアーゼ活性を有する蛋白質複合体が主に関与していると考えられている（Ｍａｒｉａｎｎｅ Ｇｒｕｎｂｅｒｇ−Ｍａｎａｇｏ，Ａｎｎｕ. Ｒｅｖ.Ｇｅｎｅｔ. １９９９，３３， １９３−２２７）。従って、このデグラダゾームのｍＲＮＡ分解活性を抑制（欠損又は低下）させることによって、ｍＲＮＡを安定化させることが可能である。デクラダゾームは、主にＲＮａｓｅＥ、ＰＮＰａｓｅ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓ
ｅ）、ヘリカーゼ活性を有するＲｈｌＢ、及びエノラーゼなどの蛋白質により構成されている。ＲＮａｓｅＥ（１０６１アミノ酸）のＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）は、デグラダゾームの他の蛋白質の集合の足場となっており、またＮ末端ドメイン（５８４アミノ酸）は、単独でエンドヌクレアーゼ活性を有し、ｍＲＮＡのプロセッシンングに関与し、またバクテリアの生育に必要である。以上のことから、バクテリアのｍＲＮＡの分解活性を抑制するには、例えば、以下に示すＬｏｐｅｔｚらの知見を利用することが挙げられる。Ｌｏｐｅｔｚらは、ＲＮａｓｅＥのＣ末端側４７７アミノ酸が欠損した大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株（ｒｎｅ１３１変異株）では、ｍＲＮＡの分解が抑制されたことを報告し
ている（Ｌｏｐｅｔｚ Ｐ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９９， ３３（１）， １８８−１９９）。すなわち、ＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメインの全部又は一部を欠損又はアミノ酸置換することにより、このＲＮａｓｅのｍＲＮＡ分解活性を抑制することができる。このような蛋白質の全部又は一部の欠損及びアミノ酸置換手法は当技術分野で周知である。例えば、ＲＮａｓｅＥ以外のｍＲＮＡ分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させることにより、蛋白質の全部又は一部を欠損させたり、アミノ酸を置換させたりすることができる。このような遺伝子の欠損及び変異手法もまた当技術分野では周知である。 It is considered that a protein complex having a nuclease activity called degradasome is mainly involved in degradation of mRNA in bacteria (Marianne Grunberg-Manago, Annu. Rev. Genet. 1999, 33, 193-227). . Therefore, mRNA can be stabilized by suppressing (deleting or reducing) the mRNA degradation activity of this degradasome. Decladasome is mainly composed of RNase E, PNPase (polynucleoside phosphorous
e), RhlB having helicase activity, and a protein such as enolase. The C-terminal domain (477 amino acids) of RNase E (1061 amino acids) serves as a scaffold for the assembly of other proteins of degradasome, and the N-terminal domain (584 amino acids) has endonuclease activity by itself, It is involved in processing and is necessary for bacterial growth. From the above, in order to suppress the degradation activity of bacterial mRNA, for example, the following knowledge of Lopetz et al. Can be used. Lopetz et al., E. coli BL21 lacking the C-terminal 477 amino acids of RNaseE.
In the (DE3) strain (rne131 mutant), it was reported that the degradation of mRNA was suppressed (Lopetz PJ et al., Mol. Microbiol. 1999, 33 (1), 188-199). In other words, deletion or amino acid substitution of all or part of the C-terminal domain of RNase E can suppress the RNase mRNA degradation activity. All or part of such protein deletion and amino acid substitution techniques are well known in the art. For example, by deleting or mutating a gene encoding a protein involved in mRNA degradation other than RNase E, all or part of the protein can be deleted or amino acids can be substituted. Such gene deletion and mutation techniques are also well known in the art.

以上のようにｍＲＮＡ分解が抑制されたバクテリアは、発現されたｍＲＮＡの分解が低減し、例えば分子量の大きい蛋白質又はペプチドであっても高効率で生産することができる。   As described above, the bacterium in which the degradation of mRNA is suppressed, the degradation of the expressed mRNA is reduced, and for example, even a protein or peptide having a large molecular weight can be produced with high efficiency.

（３）ｔＲＮＡ補充
本発明では、前項（２）に記載したｍＲＮＡの分解を抑制させる遺伝的改変に加えて、バクテリアにおけるｔＲＮＡの含有量を増加させる。これによって、組換え蛋白質の生産性はさらに向上するとともに、間違ったアミノ酸配列のものが生産される可能性は極めて低くなると考えられる。例えば、バクテリアにおける使用頻度が低いコドンに対応するｔＲＮＡのうち、少なくとも１つ以上を補充することで、翻訳の効率を上昇させることが可能である。 (3) tRNA supplementation In the present invention, in addition to the genetic modification that suppresses the degradation of mRNA described in (2) above, the content of tRNA in bacteria is increased. As a result, the productivity of the recombinant protein is further improved, and the possibility of producing the wrong amino acid sequence is considered to be extremely low. For example, it is possible to increase the efficiency of translation by supplementing at least one of tRNAs corresponding to codons that are not frequently used in bacteria.

ｔＲＮＡは、該ｔＲＮＡをコードする遺伝子をバクテリアのゲノム上に導入して補充してもよく、また該遺伝子をプラスミドＤＮＡとしてバクテリアに導入して補充してもよい。本明細書中、「ｔＲＮＡの補充」とは、バクテリアにおけるｔＲＮＡの含有量を増大させることを指す。例えば、ランバダインテグラーゼを発現させ得るバクテリアにて、ランバダインテグラーゼの部位特異的組換え機能を利用して、少なくともプロモーター部位（−３５〜−１０領域）、ｔＲＮＡ遺伝子及び転写停止領域を含むｔＲＮＡの発現ユニットを宿主ゲノムへ組み込むことが可能である（Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１４，１６０−１６６）。ｔＲＮＡの発現ユニットはＴｉｔｏらの方法（Ｔｉｔｏ，ＢＪ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９
９５，１７７，７０８６）に従って作製すればよい。この場合、挿入しようとするｔＲＮＡの発現ユニット遺伝子を事前に複数連結したものをゲノムに導入することでｔＲＮＡの含有量をより増加させることが可能となる。 The tRNA may be supplemented by introducing a gene encoding the tRNA onto the bacterial genome, or by introducing the gene into a bacterium as plasmid DNA. As used herein, “tRNA supplementation” refers to increasing the tRNA content in bacteria. For example, in a bacterium capable of expressing lavada integrase, by utilizing the site-specific recombination function of lavada integrase, a tRNA comprising at least a promoter site (-35 to -10 region), a tRNA gene and a transcription termination region. Expression units can be integrated into the host genome (Olson, P. et al. 1998, Protein Expr. Purif. 14, 160-166). The expression unit of tRNA was determined by the method of Tito et al. (Tito, BJ. et al., J. Bacteriol 19
95, 177, 7086). In this case, it is possible to further increase the tRNA content by introducing into the genome a plurality of tRNA expression unit genes to be inserted in advance.

一方、プラスミドＤＮＡによりｔＲＮＡを補充する場合、その種類は特に問わないが、後述する目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子を含む発現プラスミドと共存可能な複製領域を有していることが必要であり、またプラスミドのコピー数がゲノム当たり５コピー程度以上、好ましくは１０コピー以上のものが好ましい。現在市販されているほとんどの発現プラスミドはＣｏｌＥ１由来の複製部位を有するため、ｔＲＮＡをコードする遺伝子を補充するために使用可能なプラスミドとしては、これと同一細胞内で共存可能なプラスミドである、例えば複製部位がＰ１５Ａに由来するｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７プラスミド（Ｃｈａｎｇ，ＡＣＹ．ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｏｉｏｌ．１３４，１１４１）、複製部位の由来がＲ６−５であるｐＳＣ１０１（Ｃｏｈｅｎ，ＳＮ．ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２，７３４）、及びこれらの誘導体が挙げられる。ｔＲＮＡを補充するためのプラスミドのコピー数は高いほどその効果が期待されるため、ｐＵＣ１８、ｐＴＺ等の複製部位がＣｏｌＥ１であるハイコピープラスミドでｔＲＮＡを発現させてもよい。この場合、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子の発現ユニットとｔＲＮＡの発現ユニットは同一プラスミドに配置するか、あるいは、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子の発現ユニットをｐＡＣＹＣプラスミド等の、ｔＲＮＡの発現ユニットを含むプラスミド（例えばＣｏｌＥ１）と共存可能なプラスミドに配置すればよい。   On the other hand, when tRNA is supplemented with plasmid DNA, the type is not particularly limited, but it is necessary to have a replication region capable of coexisting with an expression plasmid containing a gene encoding a target protein or peptide described below, Further, the plasmid copy number is preferably about 5 copies or more, preferably 10 copies or more per genome. Since most expression plasmids currently on the market have a replication site derived from ColE1, a plasmid that can be used to supplement a gene encoding tRNA is a plasmid that can coexist in the same cell, for example, PACYC184, pACYC177 plasmid (Chang, ACY. Et al., 1978, J. Bacteroiol. 134, 1141) whose replication site is derived from P15A, and pSC101 (Cohen, SN. Et al. 1977, J. Bacteriol. 132, 734), and derivatives thereof. Since the effect is expected as the copy number of the plasmid for supplementing tRNA is higher, the tRNA may be expressed in a high copy plasmid whose replication site is ColE1, such as pUC18 and pTZ. In this case, the expression unit of the gene encoding the target protein or peptide and the expression unit of the tRNA are arranged on the same plasmid, or the expression unit of the gene encoding the target protein or peptide is the tRNA expression unit such as pACYC plasmid. It may be arranged on a plasmid that can coexist with a plasmid (for example, ColE1).

補充するｔＲＮＡの種類は問わないが、補充しようとするバクテリアにおいて使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応していることが好ましい。例えば、バクテリアとして大腸菌を用いる場合には、ＡＧＡ／ＡＧＧ、ＣＧＧ／ＣＧＡ（Ａｒｇ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＡＵＡ（Ｉｌｅ）、ＣＵＡ（Ｌｅｕ）及びＣＣＣ（Ｐｒｏ）の少なくとも１つのコドンに対応するｔＲＮＡを補充すればよいが、あらゆる遺伝子配列に対応できる点から全ての上記コドンに対応するｔＲＮＡを補充することが特に好ましい。例えば、コドンＡＧＡ／ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＵＡ（Ｉｌｅ）、及びＧＧＡ（Ｇｌｙ）に対応するｔＲＮＡであるｇｌｙＴ、ａｒｇＵ及びｉｌｅＸが補充されたｐＡＣＹＣ１８４誘導体プラスミドｐＲＩＧを保持した大腸菌において、大腸菌での使用頻度が低いコドンを多く有する寄生虫由来の蛋白質をコードする遺伝子を高レベルで発現することに成功している（Ｂａｃａ，Ａ．Ｍ．２０００、 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ３０，１１３−１１８）
。 The type of tRNA to be supplemented is not limited, but preferably corresponds to at least one codon that is used infrequently in bacteria to be supplemented. For example, when E. coli is used as a bacterium, tRNA corresponding to at least one codon of AGA / AGG, CGG / CGA (Arg), GGA (Gly), AUA (Ile), CUA (Leu) and CCC (Pro) However, it is particularly preferable that tRNAs corresponding to all the above-mentioned codons are supplemented from the viewpoint that all gene sequences can be supported. For example, in E. coli carrying the pACYC184 derivative plasmid pRIG supplemented with the tRNAs glyT, argU and ileX corresponding to the codons AGA / AGG (Arg), AUA (Ile) and GGA (Gly), the frequency of use in E. coli Has succeeded in expressing a gene encoding a protein derived from a parasite having many low codons at a high level (Baca, AM 2000, Int. J. Parasitology 30, 113-118).
.

例えば、バクテリアとして大腸菌を使用する場合には、予め大腸菌において使用頻度が低いコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、ＣＣＣ及びＧＧＡ）に対応するｔＲＮＡがクロラムフェニコール耐性プラスミドｐＲＡＲＥに組み込まれ、それがＴｕｎｅｒ株（大腸菌ＢＬ２１株のラックパーミアーゼ欠損株）へ導入されて作製された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ株とその系統株が市販されており（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、このような市販の大腸菌株を用いても本発明のバクテリアを製造することができる。   For example, when E. coli is used as a bacterium, tRNA corresponding to codons (AGG, AGA, AUA, CUA, CCC and GGA) that are not frequently used in E. coli are previously incorporated into the chloramphenicol resistant plasmid pRARE, Escherichia coli Rosetta strain and its strains are commercially available (Novagen) prepared by introducing the strain into Tuner strain (a rack permease deficient strain of E. coli BL21 strain). Bacteria of the invention can be produced.

以上のように、ｔＲＮＡを補充することによって、種々の生物に由来する蛋白質又はペプチドであっても、正確なアミノ酸配列を有する蛋白質又はペプチドを、翻訳時の速度低下などの問題なく生産することができる。   As described above, by replenishing tRNA, a protein or peptide having an accurate amino acid sequence can be produced without problems such as a decrease in translation speed even if it is a protein or peptide derived from various organisms. it can.

（４）分子シャペロン様活性を有する蛋白質の存在
本発明は、上述したように、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつｔＲＮＡの含有量が増加されているバクテリア宿主（以下、Ｃｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ Ｐｌｕｓとも称する。）を提供し、該バクテリアを用いることにより、あらゆる蛋白質又はペプチドの高効率生産を達
成することができる（蛋白質製造に関しては、「４．目的蛋白質及びペプチドの製造」の項を参照されたい）。 (4) Presence of protein having molecular chaperone-like activity As described above, the present invention is also referred to as a bacterial host (hereinafter referred to as Codon / mRNA Plus) in which the degradation of mRNA is suppressed and the content of tRNA is increased. ) And the use of the bacterium makes it possible to achieve high-efficiency production of any protein or peptide (for protein production, see section “4. Production of target protein and peptide”).

しかしながら、一般的に特に真核生物由来の蛋白質又はペプチドをバクテリアにて大量発現しようとした場合には、その蛋白質又はペプチドが不活性な不溶性凝集体となってしまうことが多い。一度形成された不溶性凝集体を可溶化させて活性体を高効率で回収するための手段は現在はあまり有効ではなく、また非効率でもある。そのため本発明が提供するＣｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ Ｐｌｕｓ型のバクテリアを宿主として用いた場合でも、不溶性凝集体形成の問題は解消できない場合があると考えられる。従って、本発明は、そのような蛋白質又はペプチドを生産させる場合に可溶性画分への蛋白質又はペプチドの生産効率を向上させる目的で、さらに、Ｃｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ Ｐｌｕｓバクテリア内で、目的蛋白質又はペプチドを、蛋白質の折りたたみに関与する蛋白質因子と共発現させたり、該蛋白質因子との融合蛋白質として発現させる技術をも包含する。   However, in general, when a large amount of a protein or peptide derived from a eukaryote is to be expressed in bacteria, the protein or peptide often becomes an inactive insoluble aggregate. The means for solubilizing the once formed insoluble aggregates and recovering the actives with high efficiency is currently not very effective and inefficient. Therefore, even when the Codon / mRNA Plus type bacterium provided by the present invention is used as a host, the problem of insoluble aggregate formation may not be solved. Accordingly, the present invention aims to improve the production efficiency of a protein or peptide in a soluble fraction when such a protein or peptide is produced, and further, in the Codon / mRNA Plus bacteria, Also included are techniques for co-expression with a protein factor involved in protein folding or for expression as a fusion protein with the protein factor.

生体内には、新生ポリペプチドが正常に折りたたまれて成熟蛋白質に至るまでの過程を支援している蛋白質群が存在し、これらは、分子シャペロン（Ｈａｒｔｌ，ＦＵ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，１８５２；Ｔｈｏｍａｓ，ＪＤ ｅｔ ａ
ｌ．，１９９７，Ａｐｐｌｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６６，１９７）、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ（以下、ＰＰＩａｓｅとも称する）、ジスルフィドイソメラーゼ（以下、Ｄｓｂとも称する）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（以下、ＰＤＩとも称する）及びチオレドキシンである。分子シャペロンは、ＡＴＰの存在下及び非存在下で不安定な折りたたみ中間体に結合し、蛋白質の凝集形成を抑制する作用がある。分子シャペロンには、シャペロニン、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ及びＧｒｐＥ、並びにその他の熱ショック蛋白質（ＨＳＰ）群が含まれる。一方、蛋白質又はペプチドにおけるプロリンのＮ末端側のペプチド結合は、トランス異性体よりも安定なシス異性体をとる場合があり、シス異性体の形成は蛋白質の立体構造形成で重要な役割を果たす。プロリン残基の立体異性化反応は蛋白質折りたたみ過程の律速段階であるが、これを触媒する酵素がＰＰＩａｓｅである。また蛋白質の構造形成過程でシステインを介したジスルフィド結合の形成・交換反応も重要であり、ＰＤＩ、Ｄｓｂ及びチオレドキシンがこれを触媒することが知られている。また、興味深いことに、一部のＰＰＩａｓｅ及びＰＤＩは本来の機能とは独立して、蛋白質の折りたたみ中間体に結合することにより、分子シャペロンのように、蛋白質の凝集形成を抑制することが知られている（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，４５３；Ｓｏｎｇ，ＪＬ．，
１９９５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１，３１２）。近年では、ＰＰＩａｓｅ、Ｄｓｂ、ＰＤＩ及びチオレドキシンも分子シャペロンの１種と見なされている（本発明では、分子シャペロン、ＰＰＩａｓｅ、Ｄｓｂ、ＰＤＩ及びチオレドキシンを一括して「分子シャペロン」と称する）。 In vivo, there is a group of proteins that support the process in which a nascent polypeptide is normally folded to a mature protein, and these are molecular chaperones (Hartl, FU et al., 2002, Science 295, 1852; Thomas, JD et a
l. , 1997, Appli. Biochem. Biotechnol. 66, 197), peptidyl prolyl cis trans isomerase (hereinafter also referred to as PPIase), disulfide isomerase (hereinafter also referred to as Dsb), protein disulfide isomerase (hereinafter also referred to as PDI) and thioredoxin. Molecular chaperones bind to unstable folding intermediates in the presence and absence of ATP and have the effect of inhibiting protein aggregate formation. Molecular chaperones include chaperonins, DnaK, DnaJ and GrpE, and other heat shock protein (HSP) groups. On the other hand, the peptide bond on the N-terminal side of proline in a protein or peptide may take a cis isomer that is more stable than the trans isomer, and the formation of the cis isomer plays an important role in the formation of the three-dimensional structure of the protein. The stereoisomerization reaction of proline residues is the rate-limiting step of the protein folding process, and the enzyme that catalyzes this is PPIase. In addition, formation and exchange reactions of disulfide bonds via cysteine are important in the process of protein structure formation, and it is known that PDI, Dsb and thioredoxin catalyze this. Interestingly, some PPIases and PDIs are known to inhibit protein aggregation, like molecular chaperones, by binding to protein folding intermediates independently of their original functions. (Furutani, M. et al., 2000, Biochemistry 39, 453; Song, JL.,
1995, Eur. J. et al. Biochem. 231, 312). In recent years, PPIase, Dsb, PDI, and thioredoxin are also regarded as one type of molecular chaperone (in the present invention, molecular chaperone, PPIase, Dsb, PDI, and thioredoxin are collectively referred to as “molecular chaperone”).

すなわち、本発明では、Ｃｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ ＰｌｕｓバクテリアとしてｍＲＮＡ分解を抑制しかつｔＲＮＡの含有量を増加させるだけではなく、分子シャペロンに属する蛋白質又はシャペロン活性を保持したこれらの部分ペプチドと、目的蛋白質又はペプチドとを共発現させる、又はこれらを融合蛋白質として発現させることをも含む。本発明においては、上記共発現又は融合蛋白質としての発現のいずれでもよい。例えば、目的蛋白質又はペプチドを分子シャペロンとの融合蛋白質として発現させることにより、それらを時空間的に接近させることができることから、不溶性凝集体形成の抑制効果が高いと考えられ、その点からは融合蛋白質としての発現が好ましい。一方、融合蛋白質として発現させる場合は、分子シャペロンと目的蛋白質又はペプチドを、これらの間に介在する配列を特異的に切断するプロテアーゼによって切断する工程を必要とするため、共発現法で不溶性凝集体形成を抑制できる場合には、融合蛋白質として発現させる必要はない。従って、目的蛋白質又はペプチドの性質に応じて共発現と融合蛋白質としての発現を使い分ければよい
。 That is, in the present invention, as Codon / mRNA Plus bacteria, not only suppress mRNA degradation and increase the content of tRNA, but also proteins belonging to molecular chaperones or partial peptides retaining chaperone activity, target proteins or peptides And co-expressing these or expressing them as a fusion protein. In the present invention, either of the above co-expression or expression as a fusion protein may be used. For example, by expressing the target protein or peptide as a fusion protein with a molecular chaperone, they can be brought close to each other in space and time. Expression as a protein is preferred. On the other hand, when expressed as a fusion protein, it requires a step of cleaving the molecular chaperone and the target protein or peptide with a protease that specifically cleaves the sequence intervening between them. When formation can be suppressed, it is not necessary to express it as a fusion protein. Therefore, co-expression and expression as a fusion protein may be properly used depending on the properties of the target protein or peptide.

共発現法を行う場合、目的蛋白質若しくはペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミド（「２．形質転換体」の項を参照）、又はこれと共存可能なｔＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド（上記（３）を参照）のいずれかに分子シャペロン蛋白質をコードする遺伝子の発現ユニットを含有させることで、本発明の意図する効果を達成することが可能である。また、互いに複製部位の異なる３種のプラスミドを用いることも可能である。例えば、目的蛋白質又はペプチドの発現は、複製部位がＣｏｌＥ１由来であるプラスミド、ｔＲＮＡの発現は複製部位がＲ６Ｋ（Ｋｏｌｔｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｐｌａｓｍｉｄ １， ５７１）由来であるプラスミド、そして分子シャペロンの発現は複製部位がＰ１５Ａ由来であるプラスミドを使用することができる。これらのプラスミドに互いに異なる薬剤耐性遺伝子を含ませることで３種のプラスミドをバクテリア内部で安定的に複製させることが可能である。   When carrying out the co-expression method, a plasmid containing a gene encoding the target protein or peptide (see “2. Transformant”) or a plasmid containing a tRNA gene capable of coexisting therewith (see (3) above) ) Can contain the expression unit of the gene encoding the molecular chaperone protein, the intended effect of the present invention can be achieved. It is also possible to use three types of plasmids having different replication sites. For example, expression of a target protein or peptide is a plasmid whose replication site is derived from ColE1, expression of tRNA is a plasmid whose replication site is derived from R6K (Kolter, R. et al., 1978, Plasmid 1, 571), and molecule For expression of the chaperone, a plasmid whose replication site is derived from P15A can be used. By including different drug resistance genes in these plasmids, three types of plasmids can be stably replicated inside the bacteria.

本発明で使用できる分子シャペロンは、これに定義されるもの全てを含むが、その分子種の多様性は高い。例えばシャペロニンの場合、グループ１型と２型に分類されており、前者にはバクテリア、ミトコンドリア若しくは葉緑体のもが属し、後者には古細菌及び真核生物細胞質由来のものが属するが、いずれのグループのものでも蛋白質の折りたたみを改善する効果が期待でき、本発明において使用可能である。   The molecular chaperones that can be used in the present invention include all those defined therein, but the variety of molecular species is high. For example, chaperonins are classified into group 1 and type 2. The former belongs to bacteria, mitochondria or chloroplast, and the latter belongs to archaea and eukaryotic cytoplasm. Even those in this group can be expected to have an effect of improving protein folding and can be used in the present invention.

シャペロニンのサブユニットは、頂上ドメイン（ａｐｉｃａｌ ｄｏｍａｉｎ）、中間ドメイン（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｄｏｍａｉｎ）、及び赤道ドメイン（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ ｄｏｍａｉｎ）の３つのドメインから構成されており、頂上ドメインは不安定な蛋白質の折りたたみ中間体を特異的に捉えて結合する活性を有し、シャペロニンの蛋白質折りたたみ機能において特に重要な役割を果たしている。従って、本発明のＣｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ Ｐｌｕｓバクテリアにおいて、目的蛋白質又はペプチドを、シャペロニンの全長又はその頂上ドメインのペプチドと共発現させたり、融合蛋白質として発現させることは有効である。本発明においては、分子シャペロンの部分ペプチド、例えばシャペロニンの場合には頂上ドメインを含む部分ペプチドを、目的蛋白質又はペプチドと共発現又は融合蛋白質として発現させることを含む。   The subunit of chaperonin is composed of three domains, the apical domain, the intermediate domain, and the equator domain, and the apical domain is specific to the folding intermediate of unstable proteins. It has the activity of capturing and binding specifically, and plays an especially important role in the protein folding function of chaperonin. Therefore, in the Codon / mRNA Plus bacterium of the present invention, it is effective to co-express the target protein or peptide with the full-length chaperonin or the peptide of its top domain, or to express it as a fusion protein. In the present invention, a partial peptide of a molecular chaperone, for example, in the case of chaperonin, a partial peptide containing a top domain is co-expressed with a target protein or peptide or expressed as a fusion protein.

ＰＰＩａｓｅは、シクロフィリン（サイクロスポリン結合性蛋白質）、ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びパーブリンの３種に分類されるが、これらは全て蛋白質中のプロリン残基の立体異性化反応を触媒する。中でも古細菌由来ＦＫＢＰは、ＰＰＩａｓｅ活性以外に蛋白質の折りたたみ中間体の凝集形成を抑制する分子シャペロン様の活性を持つ（Ｆｕｒｕｔａｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９，４５３；Ｉｄｅｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００１）３５７，４６５）。古細菌のＦＫＢＰの中には、ＰＰＩａｓｅ活性自体は殆ど無いが、強い分子シャペロン様活性を有するものも存在する（Ｉｄｅｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２６７，３１３９）。従って、不溶性凝集体の形成抑制を効果的に行うには、ＰＰＩａｓｅの中でも古細菌由来のＦＫＢＰと、目的蛋白質又はペプチドとを共発現したり、あるいはこれらを融合蛋白質として発現させることが好ましい。   PPIases are classified into three types, cyclophilin (cyclosporin binding protein), FKBP (FK506 binding protein), and perbulin, all of which catalyze the stereoisomerization reaction of proline residues in the protein. Among them, archaeal FKBP has a molecular chaperone-like activity that suppresses aggregate formation of protein folding intermediates in addition to PPIase activity (Furutani, M. et al. Biochemistry (2000) 39, 453; Ideno, A. et. al., Biochem. J. (2001) 357, 465). Some archaeal FKBPs have little PPIase activity per se, but some have strong molecular chaperone-like activity (Ideno, A. et al. Eur. J. Biochem. (2000) 267, 3139). Therefore, in order to effectively suppress the formation of insoluble aggregates, among PPIases, it is preferable to co-express FKBP derived from archaea and the target protein or peptide, or to express them as a fusion protein.

目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとを融合蛋白質として発現させる場合には、使用する分子シャペロンの種類及び由来に応じて、融合蛋白質における目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドの数の比を選択することが好ましい。例えば、分子シャペロン：目的蛋白質の比がｎ：１（ｎ＝約１．０〜９．０）となることが好ましい。   When the target protein or peptide and the molecular chaperone or its partial peptide are expressed as a fusion protein, the number of the target protein or peptide and the molecular chaperone or its partial peptide in the fusion protein depends on the type and origin of the molecular chaperone used. It is preferable to select the ratio. For example, the molecular chaperone: target protein ratio is preferably n: 1 (n = about 1.0 to 9.0).

融合蛋白質における目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの連結パターンとしては、分子シャペロン又はその部分ペプチドのＣ末端若しくはＮ末端、又は分子シャペロンが連結しているその連結部に目的蛋白質又はペプチドを配置することが好ましい。また、目的蛋白質又はペプチドの細胞膜に対する親和性が極めて高い場合には、分子シャペロン又はその部分ペプチドの複数の部分に配置することによって毒性蛋白質の発現を抑制することが可能となる。また、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの連結は、限定するものではないがペプチド結合が挙げられる。さらに、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの間に、トロンビンやエンテロキナーゼなどのプロテアーゼの切断配列を配置させ、発現された融合蛋白質においてその両者を切断しやすくしてもよい。   The target protein or peptide in the fusion protein and the connection pattern of the molecular chaperone or its partial peptide include the C-terminal or N-terminal of the molecular chaperone or its partial peptide, or the target protein or peptide connected to the connecting part where the molecular chaperone is connected Is preferably arranged. In addition, when the target protein or peptide has a very high affinity for the cell membrane, the expression of the toxic protein can be suppressed by arranging it in a plurality of parts of the molecular chaperone or its partial peptide. In addition, the connection between the target protein or peptide and the molecular chaperone or its partial peptide includes, but is not limited to, a peptide bond. Furthermore, a cleavage sequence of a protease such as thrombin or enterokinase may be arranged between the target protein or peptide and the molecular chaperone or a partial peptide thereof so that both of them can be easily cleaved in the expressed fusion protein.

融合蛋白質として発現させるには、制限酵素を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる方法などの通常の遺伝子工学手法を利用して、融合蛋白質をコードする遺伝子を構築し、これを挿入した発現ベクター又はプラスミドを宿主バクテリアに導入し、該宿主において融合蛋白質として発現させることができる。   To express as a fusion protein, a gene encoding the fusion protein is constructed using ordinary genetic engineering techniques such as a restriction enzyme method and a polymerase chain reaction (PCR) method. A vector or plasmid can be introduced into a host bacterium and expressed as a fusion protein in the host.

以上のように本発明では、転写・翻訳系が強化されたＣｏｄｏｎ／ｍＲＮＡ Ｐｌｕｓバクテリアを提供するとともに、このバクテリア宿主内で遺伝子工学的に目的蛋白質又はペプチドを分子シャペロン又はその部分ペプチドと共発現又は融合蛋白質として発現させることによって、特に真核生物のｃＤＮＡにコードされるポリペプチドを活性型蛋白質（正確に折りたたまれた蛋白質）として、不溶性凝集体の形成を抑制して高効率で生産するものである。   As described above, the present invention provides a Codon / mRNA Plus bacterium with an enhanced transcription / translation system, and co-expresses a target protein or peptide with a molecular chaperone or a partial peptide thereof in a genetic manner in the bacterial host. By expressing it as a fusion protein, the polypeptide encoded by eukaryotic cDNA, especially as an active protein (an accurately folded protein), can be produced with high efficiency by suppressing the formation of insoluble aggregates. is there.

（５）その他の改変
以上の改変に加えて、さらに目的に応じてその他の様々な遺伝的改変と組み合わせてもよい。例えば、生産される蛋白質又はペプチドの宿主プロテアーゼによる分解を抑制するには、ｌｏｎ，ＯｍｐＴのようなプロテアーゼをコードする構造遺伝子を欠損又は変異させればよい（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ ａｌ．１９８４，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９，２８３−２８７）。生産しようとする蛋白質又はペプチドが構造形成にＳ−Ｓ（ジスルフィド）結合の形成を必要する場合は、バクテリアの細胞質内を酸化的に保つために、チオレドキシン還元酵素遺伝子及びグルタチオン還元酵素をコードする遺伝子を欠損又は変異させればよい（Ｐｒｉｎｚ，Ｗ．Ａ．ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５６６１−１５６６７）。また、宿主バクテリアに導入されたプラスミド内に繰り返し配列が存在する場合は、プラスミドの安定化を計るために、特定のリコンビナーゼ遺伝子を欠損又は変異させればよい。本発明が提供する宿主バクテリアの改良はこれらに限られるものではない。 (5) Other Modifications In addition to the above modifications, various other genetic modifications may be combined depending on the purpose. For example, in order to suppress degradation of a produced protein or peptide by a host protease, a structural gene encoding a protease such as lon or OmpT may be deleted or mutated (Phillips, et al. 1984, J. Bacteriol). 159, 283-287). Genes encoding thioredoxin reductase gene and glutathione reductase in order to keep the inside of the bacterial cytoplasm oxidative when the protein or peptide to be produced requires the formation of an SS (disulfide) bond for structure formation May be deleted or mutated (Prinz, WA et al. 1997, J. Biol. Chem. 272, 15661-15667). In addition, when a repetitive sequence is present in a plasmid introduced into host bacteria, a specific recombinase gene may be deleted or mutated in order to stabilize the plasmid. The improvement of host bacteria provided by the present invention is not limited to these.

２．形質転換体
本発明の形質転換体は、上記「１．バクテリア及びその製造」の項に記載のバクテリアを宿主とし、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする。 2. Transformant The transformant of the present invention is characterized in that the bacterium described in the section "1. Bacteria and its production" is used as a host and a gene encoding a target protein or peptide is introduced.

本発明において、目的蛋白質としては、特に限定されないが、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウィルス等の病原性ウィルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）；ｓｃＦＶ（一本鎖抗体）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）₂、及び完全抗体（ＩｇＧ）型である治療・診断用抗体；Ｇ蛋白質共役型受容体等の
膜受容体；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血液幹細胞成長因子、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長・栄養因子（ＮＧＦ又はＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等の成長因子に
属するもの；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン（ＩＬ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、アルブミン、ヒト成長ホルモン等に属するもの、が挙げられる。その他、ヒト、マウス及び線虫等の高等生物由来の疾病関連遺伝子産物の全てが、本発明に従って発現させる対象の目的蛋白質となり得る。 In the present invention, the target protein is not particularly limited, but is a protein encoded by a pathogenic virus genome such as hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, human immunodeficiency virus (HIV), influenza virus, etc. (Coat protein, core protein, protease, reverse transcriptase, integrase, etc.); scFV (single chain antibody), Fab, (Fab) ₂ , and therapeutic / diagnostic antibody of complete antibody (IgG) type; G Membrane receptors such as protein-coupled receptors; platelet-derived growth factor (PDGF), blood stem cell growth factor, hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth / nutrient factor (NGF or NF) Belonging to growth factors such as fibroblast growth factor (FGF) and insulin-like growth factor (IGF); tumor necrosis factor (T F), interferon (IFN), interleukin (IL), erythropoietin (EPO), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), albumin, human growth hormone, etc. . In addition, all disease-related gene products derived from higher organisms such as humans, mice and nematodes can be the target protein to be expressed according to the present invention.

本発明においては、宿主として使用するバクテリアの性質から、可溶性蛋白質又は膜蛋白質をも目的蛋白質として発現対象とすることができる。そのような可溶性蛋白質としては、核内受容体、病原性ウイルスゲノムにコードされる蛋白質（外被蛋白質、コア蛋白質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼ等）、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）₂、及び完全ＩｇＧ型である治療・診断用抗体、血小板増殖因子、血液幹細胞成
長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、神経成長・栄養因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因等の成長因子に属するもの、腫瘍壊死因子、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージ・コロニー刺激因子、アルブミン、ヒト成長ホルモン等が好ましく、また膜蛋白質としては、チロシンカイネース型受容体、Ｇ蛋白質共役型受容体、イオンチャンネル構成蛋白質及びイオンチャンネル共役型膜貫通型受容体等が好ましい。 In the present invention, a soluble protein or a membrane protein can be expressed as a target protein because of the nature of the bacterium used as the host. Such soluble proteins include nuclear receptors, proteins encoded by pathogenic virus genomes (envelope protein, core protein, protease, reverse transcriptase, integrase, etc.), scFv (single chain antibody), Fab, (Fab) ₂ , and complete IgG type therapeutic / diagnostic antibody, platelet growth factor, blood stem cell growth factor, hepatocyte growth factor, transforming growth factor, nerve growth / nutrient factor, fibroblast growth factor, insulin-like Those belonging to growth factors such as growth factors, tumor necrosis factor, interferon, interleukin, erythropoietin, granulocyte colony stimulating factor, macrophage colony stimulating factor, albumin, human growth hormone, etc. are preferred. Nasse receptor, G protein-coupled receptor, ion channel configuration White and ion channels coupled transmembrane receptors, and the like are preferable.

また本発明においては、宿主として使用するバクテリアの性質から、分子量が大きい蛋白質、例えば分子量が１５〜８００キロダルトン、好ましくは１００〜５００キロダルトンの蛋白質をも目的蛋白質として生産することができる。   In the present invention, a protein having a large molecular weight, for example, a protein having a molecular weight of 15 to 800 kilodaltons, preferably 100 to 500 kilodaltons, can be produced as a target protein because of the nature of the bacteria used as the host.

さらに本発明においては、上記目的蛋白質の部分ペプチドをコードする遺伝子をバクテリアに導入し、本発明の形質転換体を作製してもよい。その場合、部分ペプチドは、蛋白質の全長アミノ酸配列のうち６残基以上のアミノ酸からなるものとすることができる。従って、本発明の形質転換体は、目的蛋白質をコードするｃＤＮＡのうち、６残基以上のアミノ酸配列をコードする部分配列が導入されたものであってもよい。   Furthermore, in the present invention, a transformant of the present invention may be prepared by introducing a gene encoding a partial peptide of the above target protein into bacteria. In this case, the partial peptide can be composed of 6 or more amino acids in the full-length amino acid sequence of the protein. Therefore, the transformant of the present invention may be one in which a partial sequence encoding an amino acid sequence of 6 residues or more is introduced in cDNA encoding the target protein.

形質転換体は、適当なプラスミド又はベクターに所望の目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子、並びにこれらの遺伝子を発現させるのに必要な配列を連結（挿入）することによりプラスミド又はベクターを構築し、該プラスミド又はベクターを宿主バクテリアに導入することにより得ることができる。   A transformant constructs a plasmid or vector by linking (inserting) a gene encoding a desired target protein or peptide and a sequence necessary for expressing these genes into an appropriate plasmid or vector, It can be obtained by introducing a plasmid or vector into a host bacterium.

本発明で使用するプラスミド又はベクターとしては、宿主バクテリア中で複製可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。   The plasmid or vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in the host bacteria. For example, bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like can be mentioned.

プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４，ｐＲＫ４０１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１，ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０，λＺＡＰ等）が挙げられる。   Plasmid DNA includes actinomycete-derived plasmids (eg, pK4, pRK401, etc.), E. coli-derived plasmids (eg, pET21, pBR322, pUC118, etc.), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110), and yeast-derived plasmids (eg, YEp13). , YCp50, etc.), and phage DNA includes λ phage (λgt10, λZAP, etc.).

プラスミド又はベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、それを適当なプラスミド又はベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してプラスミド又はベクターに連結する方法などが採用される。   In order to insert a gene into a plasmid or vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and then inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of an appropriate plasmid or vector DNA. The method of connecting is adopted.

目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにプラスミド又はベクターに組み込まれることが必要である。そこで、プラスミド又はベク
ターには、プロモーター、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 The gene encoding the target protein or peptide needs to be incorporated into a plasmid or vector so that the function of the gene is exhibited. Therefore, in addition to a gene encoding a promoter, a target protein or peptide, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), etc., are linked to a plasmid or vector. can do. Examples of the selection marker include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.

宿主がバクテリアであるため、プラスミド又はベクターＤＮＡは、該バクテリア中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。プロモーターは、大腸菌等のバクテリア中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。   Since the host is a bacterium, the plasmid or vector DNA can be autonomously replicated in the bacterium, and at the same time, the plasmid or vector DNA is composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a gene encoding the target protein or peptide, and a transcription termination sequence. preferable. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained. Any promoter may be used as long as it can be expressed in bacteria such as Escherichia coli. For example, promoters derived from E. coli or phages such as trp promoter and lac promoter are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used.

また、本発明においては、上記「１．バクテリア及びその製造」の項に記載したバクテリアの改変を行うための蛋白質又はその部分ペプチドと、所望の目的蛋白質又はペプチドとを共発現させることもある。本明細書中、「共発現」とは、２つ以上の異なる蛋白質をコードする遺伝子が、同じか又は異なるプロモーターに作動可能に結合されており、同時期に発現されることを意味する。したがって、共発現が可能であるならば、上記のそれぞれの遺伝子を同一のベクター若しくはプラスミドに組み込んでもよいし、又は、異なるベクター若しくはプラスミドに組み込んでバイナリーベクターとして使用してもよい。   In the present invention, the protein or partial peptide thereof for modifying bacteria described in the above section “1. Bacteria and production thereof” may be co-expressed with a desired target protein or peptide. In the present specification, “co-expression” means that genes encoding two or more different proteins are operably linked to the same or different promoters and expressed at the same time. Therefore, as long as co-expression is possible, each of the above genes may be incorporated into the same vector or plasmid, or may be incorporated into different vectors or plasmids and used as a binary vector.

プラスミド又はベクターＤＮＡを宿主バクテリアに導入する手法は、バクテリアにＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。   The method for introducing plasmid or vector DNA into host bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria, and examples thereof include a method using calcium ions and an electroporation method.

３．バクテリア抽出物を含む組成物
本発明のバクテリアの抽出物は無細胞翻訳反応にも利用可能であり、これも発明の対象となる。該抽出物を得るためには、バクテリアの細胞は比較的穏和な条件で破砕することが好ましく、例えば、ガラスビーズによる破砕、リゾチーム処理と浸透圧ショックを組み合わせた方法による破砕が挙げられる。このとき使用する緩衝液は転写、翻訳に関わる蛋白質、酵素等の活性を低下させないものが好ましく、例えばｐＨ６．０〜７．８、１０〜５０ｍＭのリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液等が挙げられる。また必要に応じて５〜２００ｍＭのＮａＣｌ等の塩類を添加してもよい。細胞抽出液は３０００−５０００ｇで遠心分離を行うことで、沈殿物と分離して回収されうる。無細胞翻訳反応に供するためには、得られた細胞抽出液にアミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー物質、及びヌクレオチド等を添加して使用する。通常さらにｔＲＮＡの補充を行うが、本発明のバクテリアの抽出物を用いる場合は、補充量が少なくてすみ、経済的に優位である。また本発明のバクテリアの抽出物のＲＮＡ分解活性は抑制されているので、効率的に翻訳反応が進行する。 3. Compositions containing bacterial extracts The bacterial extracts of the present invention can also be used in cell-free translation reactions and are also subject of the invention. In order to obtain the extract, it is preferable to disrupt bacterial cells under relatively mild conditions. Examples thereof include disruption by glass beads and disruption by a method combining lysozyme treatment and osmotic shock. The buffer used at this time is preferably one that does not decrease the activity of proteins and enzymes involved in transcription and translation. For example, pH 6.0 to 7.8, 10 to 50 mM phosphate buffer, Tris hydrochloride buffer, Hepes- KOH buffer solution etc. are mentioned. Moreover, you may add salts, such as 5-200 mM NaCl, as needed. The cell extract can be separated from the precipitate and collected by centrifuging at 3000-5000 g. In order to use for a cell-free translation reaction, an amino acid, an energy substance such as ATP, and nucleotides are added to the obtained cell extract. Usually, tRNA is further supplemented. However, when the bacterial extract of the present invention is used, the supplement is small, which is economically advantageous. Moreover, since the RNA degradation activity of the bacterial extract of the present invention is suppressed, the translation reaction proceeds efficiently.

４．目的蛋白質及びペプチドの製造
本発明のバクテリアは、上述したように、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつｔＲＮＡ含有量が増加されており、また場合によっては分子シャペロンを含むものであるため、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に、不溶性凝集体の形成を抑制して生産するために有用である。従って、本発明は、さらに本発明のバクテリアを用いることを特徴とする目的蛋白質又はペプチドの製造方法を提供する。 4). Production of Target Protein and Peptide As described above, the bacterium of the present invention suppresses the degradation of mRNA, increases the tRNA content, and possibly contains a molecular chaperone. Is useful for maintaining the correct sequence and folding and with high efficiency while suppressing the formation of insoluble aggregates. Therefore, the present invention further provides a method for producing a target protein or peptide characterized by using the bacterium of the present invention.

本発明において、目的蛋白質又はペプチドは、上記「２．形質転換体」の項に記載の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」と
は、培養上清、培養菌体、又は菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培地で培養する方法は、バクテリアの培養に用いられる通常の方法に従って行われる。 In the present invention, the target protein or peptide can be obtained by culturing the transformant described in the above section “2. Transformant” and collecting it from the culture. “Culture” means any of culture supernatant, cultured cells, or disrupted cells. The method of culturing the transformant of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for bacterial culture.

バクテリアを培養する培地としては、バクテリアが資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、バクテリアの培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。   As a medium for cultivating bacteria, a natural medium or a synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by bacteria, and can cultivate bacteria efficiently. It may be used.

炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。   As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, alcohols such as ethanol and propanol, and aromatic hydrocarbons such as dibenzofuran, gentisic acid and salicylic acid are used. As the nitrogen source, ammonia, ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, peptone, meat extract, corn steep liquor, or other nitrogen-containing compounds are used. As the inorganic substance, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.

培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で１０〜５０時間行う。培養期間中、ｐＨは約７．４（５．０〜７．９）に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。   The culture is usually carried out at 25-37 ° C. for 10-50 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration-agitation culture. During the culture period, the pH is maintained at about 7.4 (5.0 to 7.9). The pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as necessary.

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いたプラスミド又はベクターで形質転換したバクテリアを培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換したバクテリアを培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いたプラスミド又はベクターで形質転換したバクテリアを培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。   When cultivating bacteria transformed with a plasmid or vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when cultivating bacteria transformed with an expression vector using the lac promoter, culture bacteria transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with a plasmid or vector using the trp promoter. Indole acetic acid (IAA) or the like may be added to the medium.

培養後、目的蛋白質又はペプチドが菌体内に生産される場合には、菌体を破砕することにより当該目的蛋白質又はペプチドを抽出する。また、目的蛋白質又はペプチドが菌体外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体を除去する。その後、蛋白質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的の蛋白質又はペプチドを単離精製することができる。   After the culture, when the target protein or peptide is produced in the microbial cell, the target protein or peptide is extracted by crushing the microbial cell. When the target protein or peptide is produced outside the cells, the culture solution is used as it is, or the cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, a general biochemical method used for protein isolation and purification, for example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. can be used alone or in appropriate combination in the culture. Thus, the target protein or peptide can be isolated and purified.

また、目的蛋白質又はペプチドが、分子シャペロン又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として生産される場合には、この融合蛋白質をそのまま精製して使用してもよいし、あるいは融合蛋白質から目的の蛋白質又はペプチドのみを分離してもよい。この分離は、培養物をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理し、マグネシウム及びＡＴＰを含有しない緩衝液に対して透析を行い、マグネシウム及びＡＴＰを取り除く。これによって分子シャペロン又はその部分ペプチドの立体構造が破壊され、目的蛋白質又はペプチドが露出することになる。また、透析内液にトロンビンなどのプロテアーゼを作用させ、目的蛋白質又はペプチドと分子シャペロン又はその部分ペプチドとの切断を行ってもよい。   In addition, when the target protein or peptide is produced as a fusion protein with a molecular chaperone or a partial peptide thereof, the fusion protein may be used as it is, or the target protein or peptide may be purified from the fusion protein. Only may be separated. For this separation, the culture is treated with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and dialyzed against a buffer containing no magnesium and ATP to remove magnesium and ATP. This destroys the three-dimensional structure of the molecular chaperone or its partial peptide, exposing the target protein or peptide. Further, a protease such as thrombin may be allowed to act on the dialysis internal solution to cleave the target protein or peptide and the molecular chaperone or its partial peptide.

目的蛋白質又はペプチドが不溶性凝集体を形成した場合には、この不溶性凝集物を回収し、リポソーム、界面活性剤、蛋白質変性剤（グアニジウム塩酸、尿素）又は適当な担体の存在下にて可溶化させ、分子シャペロン又はその部分ペプチドの存在下にて再構成（再折りたたみ）してもよい。この工程により、正しい折りたたみを有する目的蛋白質又はペ
プチドを再生することができる。 When the target protein or peptide forms an insoluble aggregate, the insoluble aggregate is recovered and solubilized in the presence of liposome, surfactant, protein denaturant (guanidinium hydrochloride, urea) or an appropriate carrier. , Reconstitution (refolding) may be performed in the presence of a molecular chaperone or a partial peptide thereof. By this step, the target protein or peptide having the correct folding can be regenerated.

あるいは、当業者には周知のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を利用して目的蛋白質又
はペプチドを製造することも可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系とは、ｍＲＮＡ転写及
び／又は蛋白質翻訳に必要な成分が含まれ、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを添加することにより、それらの成分が細胞内と同様に機能して、蛋白質が生産される系を指し、このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系は当業者に周知である。本発明においては、
このｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系は、上記「３．バクテリア抽出物を含む組成物」の項に記載
の組成物を利用して行うことができる。簡単に説明すると、本発明のバクテリアの抽出物を含む組成物中に、目的蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを添加し、該目的蛋白質又はペプチドを発現させ、その組成物から目的蛋白質又はペプチドを回収する。 Alternatively, as is well known to those skilled in the art, the target protein or peptide can be produced using an in vitro translation system. The in vitro translation system includes components necessary for mRNA transcription and / or protein translation, and by adding DNA or RNA encoding a desired protein, these components function in the same manner as in cells, This refers to a system in which proteins are produced, and such in vitro translation systems are well known to those skilled in the art. In the present invention,
This in vitro translation system can be performed by using the composition described in the above section “3. Composition containing a bacterial extract”. Briefly, a DNA or RNA encoding a target protein or peptide is added to a composition containing the bacterial extract of the present invention, the target protein or peptide is expressed, and the target protein or peptide is expressed from the composition. Recover.

５．抗体及び抗体をコードする遺伝子
人工的に調製される組換えマウス・ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が、今後、蛋白医薬の中でも最も成長する素材の一つであると予測されている。従って本発明は、哺乳動物由来のｃＤＮＡから上述したように生産された目的蛋白質又はペプチドを動物に免疫することを含む、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法、及びその抗体をコードする遺伝子の単離方法をも包含する。 5. Antibodies and genes encoding antibodies Artificially prepared recombinant mouse / human chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies are expected to be one of the most promising materials in protein medicine. Therefore, the present invention provides a method for producing an antibody against a target protein or peptide, which comprises immunizing an animal with the target protein or peptide produced as described above from cDNA derived from a mammal, and a gene encoding the antibody. The separation method is also included.

現在では、抗原（目的蛋白質又はペプチド）を動物に免疫して免疫応答を誘発することができる。動物の免疫手法は当該技術分野で周知であり、また抗体の単離も慣例的な手法に従って行うことができる。また抗体をコードする遺伝子を単離する場合には、免疫した動物の抗体産生組織からｍＲＮＡを回収し、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって抗体可変領域に相当する遺伝子を増幅し、例えば大腸菌を用いたファージディスプレイ法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３）等によって抗体可変領域遺伝子をクローニングすることができる。クローン化された可変領域遺伝子とヒト抗体遺伝子と融合させることで、キメラ又はヒト化抗体が作製可能である。また免疫動物としてヒト抗体産生マウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７，３９１；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，７２２）を用いることにより、直接ヒト抗体及びその遺伝子を得ることも
可能である。目的蛋白質が膜蛋白質である場合、バクテリア宿主の膜画分に蓄積する場合が多いため、バクテリア宿主自体を動物に免疫しても膜蛋白質に対する抗体及びその遺伝子は取得できる。このような膜蛋白質又はそのペプチドに対する抗体は、膜蛋白質に対するアゴニスト（作動薬）又はアンタゴニスト（拮抗薬）の作用を示すものと考えられ、医薬として多大な可能性を有する。 Currently, animals can be immunized with an antigen (protein of interest or peptide) to induce an immune response. Animal immunization techniques are well known in the art, and antibody isolation can be performed according to conventional techniques. When isolating the gene encoding the antibody, mRNA is recovered from the antibody-producing tissue of the immunized animal, and the gene corresponding to the antibody variable region is amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). For example, antibody variable region genes can be cloned by the phage display method using E. coli (Winter, G. et al., 1994, Ann. Rev. Immunol. 12, 433) and the like. A chimeric or humanized antibody can be produced by fusing a cloned variable region gene and a human antibody gene. In addition, human antibody-producing mice (Bruggemann, M. et al., 1996, Immunol. Today 17, 391; Tomizuka, et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 722) are used as immunized animals. Thus, it is also possible to obtain a human antibody and its gene directly. When the target protein is a membrane protein, it often accumulates in the membrane fraction of the bacterial host. Therefore, even when the bacterial host itself is immunized to an animal, an antibody against the membrane protein and its gene can be obtained. Such an antibody against a membrane protein or peptide thereof is considered to exhibit an action of an agonist (agonist) or an antagonist (antagonist) against the membrane protein, and has great potential as a medicine.

以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples. However, the present invention is not limited to these examples.

〔実施例１〕ｔＲＮＡの含有量が増加され、かつｍＲＮＡの分解が抑制されたバクテリアの調製
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株（ｉｎＮｏｖａｔｉｏｎ，２００１，１２，１−３）を、クロラムフェニコールを３４μｇ／Ｌ含むＬＢ培地にて培養し、プラスミドｐＲＡＲＥを回収した。ｐＲＡＲＥは、大腸菌での使用頻度が低いコドンに対応する６個のｔＲＮＡ遺伝子（ｐｒｏＬ，ｌｅｕＷ，ａｒｇＷ，ｇｌｙＴ，ａｒｇＵ，及びｉｌｅＸ）がｐＡＣＹＣプラスミドに導入されたものである（ｉｎＮｏｖａｔｉｏｎｓ，２００１，１２，１−３）。回収されたｐＲＡＲＥで大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社）を形質転換し，クロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて選択することによりｐＲＡＲＥを保持したＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（以下、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株と称する）を得た。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株は、ｍＲＮＡ分解に大きく関与する蛋白質であるＲＮａｓｅＥの遺伝子の一部が欠損しており、該株ではｍＲＮＡの安定化が図れている（Ｌｏｐｅｔｚ Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３，１９９９，１８８−１９９）。従って、本実施例によってｍＲＮＡ分解の抑制とｔＲＮＡの補充の両方の遺伝的形質を持ち合わせた大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株が作製された。 Example 1 Preparation of Bacteria with Increased tRNA Content and Suppression of mRNA Degradation Escherichia coli Rosetta (DE3) strain (inNovation, 2001, 12, 1-3) was added to 34 μg / chloramphenicol. After culturing in LB medium containing L, plasmid pRARE was recovered. pRARE is obtained by introducing six tRNA genes (proL, leuW, argW, glyT, argU, and ileX) corresponding to codons that are less frequently used in E. coli into a pACYC plasmid (inNovations, 2001, 12, 1-3). The recovered pRARE is used for E. coli BL21 star (DE3) strain (Invi
the BL21 star (DE3) strain (hereinafter referred to as BL21 star (DE3) / pRARE strain) retaining pRARE by selection in an LB medium containing 34 μg / ml of chloramphenicol. Obtained. The BL21 star (DE3) strain lacks part of the gene for RNase E, which is a protein that is greatly involved in mRNA degradation, and the strain can stabilize mRNA (Lopetz PJ et al.,). Mol. Microbiol. 33, 1999, 188-199). Therefore, according to the present example, an E. coli BL21 star (DE3) / pRARE strain having both genetic characteristics of suppressing mRNA degradation and supplementing with tRNA was prepared.

〔実施例２〕アクチン蛋白質の発現
配列番号１に記載にされたヒト由来アクチン蛋白質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ００３５１）をｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、発現ベクターｐＡＣＴを得た。このｐＡＣＴを用いて実施例１で調製されたＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて選択することにより形質転換体ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株（ａ）を得た。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にｐＲＡＲＥを導入したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＰＡＲＥ株（ｄ）、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（ｃ）、及びＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣ株（ｂ）にｐＡＣＴを導入して同様の条件下で発現実験を行った。各菌体培養液ＯＤ６００値を２．０に調整した後、これをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドを数値化して発現レベルを定量し、各発現実験におけるアクチン蛋白質の発現レベルを比較した。アクチン蛋白質の発現は、抗アクチンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。この結果を表１に示す。 [Example 2] Expression of actin protein A gene (GenBank No. X00351) encoding a human-derived actin protein described in SEQ ID NO: 1 was inserted into pET21 (Novagen) to obtain an expression vector pACT. This pACT is used to transform the BL21 star (DE3) / pRARE strain prepared in Example 1 and selected in an LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml. BL21 star (DE3) / pRARE / pACT strain (a) was obtained. BL21 star (DE3) / pRARE / pACT strain is cultured in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml at 37 ° C. until the OD600 value becomes 1.5, 1 mM
After IPTG was added to induce expression and further cultured at 37 ° C. for 3 hours, the cells were collected by centrifugation. As a control expression experiment, pACT was introduced into BL21 (DE3) / pPARE strain (d), BL21 star (DE3) strain (c), and BL21 star (DE3) / pACYC strain (b) in which pRARE was introduced into BL21 (DE3) strain. The expression experiment was conducted under the same conditions. Each microbial cell culture solution OD600 value was adjusted to 2.0, and then analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Each band was digitized from SDS-PAGE data by EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level, and the expression level of actin protein in each expression experiment was compared. The expression of actin protein was confirmed by Western blotting using an anti-actin polyclonal antibody. The results are shown in Table 1.

表１に示されるように、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株でアクチン蛋白質の最も高い発現量が得られた。以上のことから、ｍＲＮＡ分解の抑制とｔＲＮＡの補充の両方の遺伝的形質がアクチン蛋白質の発現に有効であることが明らかとなった。   As shown in Table 1, the highest expression level of actin protein was obtained in the BL21 star (DE3) / pRARE strain. From the above, it has been clarified that the genetic traits of both suppression of mRNA degradation and tRNA supplementation are effective for the expression of actin protein.

〔実施例３〕チューブリン蛋白質の発現
配列番号２に記載にされたヒト由来チューブリン蛋白質をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｋ００５５８）をｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、発現ベクターｐＴＵＢを得た。このｐＴＵＢを用いて実施例１で調製されたＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニ
コール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて選択することにより形質転換体ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＵＢ株（ａ）を得た。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＵＢ株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にｐＲＡＲＥを導入したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＰＡＲＥ株（ｄ）、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（ｃ）、及びＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣ株（ｂ）にｐＴＵＢを導入して同様の条件下で発現実験を行った。各菌体培養液のＯＤ６００値を２．０に調整した後、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドを数値化して発現レベルを定量し、各発現実験におけるチューブリン蛋白質の発現レベルを比較した。チューブリンの発現は抗チューブリンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。結果を表２に示す。 [Example 3] Expression of tubulin protein The gene (GenBank No. K00558) encoding the human-derived tubulin protein described in SEQ ID NO: 2 was inserted into pET21 (Novagen) to obtain an expression vector pTUB. This pTUB is used to transform the BL21 star (DE3) / pRARE strain prepared in Example 1 and selected in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml. BL21 star (DE3) / pRARE / pTUB strain (a) was obtained. BL21 star (DE3) / pRARE / pTUB strain is cultured in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml at 37 ° C. until the OD600 value becomes 1.5, and 1 mM IPTG is added. After inducing the expression and further culturing at 37 ° C. for 3 hours, the cells were collected by centrifugation. As control expression experiments, p21 was introduced into BL21 (DE3) / pPARE strain (d), BL21 star (DE3) strain (c), and BL21 star (DE3) / pACYC strain (b) in which pRARE was introduced into BL21 (DE3) strain. The expression experiment was conducted under the same conditions. After adjusting the OD600 value of each cell culture solution to 2.0, this was analyzed by SDS-PAGE. Each band was digitized from the SDS-PAGE data using an EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level, and the expression level of tubulin protein in each expression experiment was compared. Tubulin expression was confirmed by Western blotting using an anti-tubulin polyclonal antibody. The results are shown in Table 2.

表２に示されるように、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株でチューブリン蛋白質の最も高い発現量が得られた。以上のことから、ｍＲＮＡ分解の抑制とｔＲＮＡの補充の両遺伝的形質がチューブリン蛋白質の発現にも有効であることが明らかとなった。   As shown in Table 2, the highest expression level of tubulin protein was obtained in the BL21 star (DE3) / pRARE strain. From the above, it has been clarified that both genetic traits of suppression of mRNA degradation and supplementation of tRNA are also effective for the expression of tubulin protein.

〔実施例４〕古細菌シャペロニンサブユニット４回連結体の発現
配列番号３に記載にされた古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１株由来シャペロニンαサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ００１０８０）の４回連結体をｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、発現ベクターｐＴＣＰ４を得た。このｐＴＣＰ４を用いて実施例１で調製されたＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて選択することにより形質転換体ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＣＰ４株（ａ）を得た。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＣＰ４株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にｐＲＡＲＥを導入したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＰＡＲＥ株（ｄ）、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（ｃ）、及びＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣ株（ｂ）にｐＴＣＰ４を導入して同様の条件下で発現実験を行った。各菌体培養液のＯＤ６００値を１．０に調整した後、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドを数値化して発現レベルを定量し、各発現実験におけるシャペロニン４回連結体の発現レベルを比較した。結果を表３に示す。 [Example 4] Expression of archaeal chaperonin subunit quadruple ligation The archaeon Thermococcus sp. A four-fold ligated product of chaperonin α subunit gene (GenBank No. AB001080) derived from KS-1 strain was inserted into pET21 (Novagen) to obtain an expression vector pTCP4. This pTCP4 is used to transform the BL21 star (DE3) / pRARE strain prepared in Example 1, and the transformant is selected by selection in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml. BL21 star (DE3) / pRARE / pTCP4 strain (a) was obtained. BL21 star (DE3) / pRARE / pTCP4 strain is cultured in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml at 37 ° C. until the OD600 value becomes 1.5, and 1 mM IPTG is added. After inducing the expression and further culturing at 37 ° C. for 3 hours, the cells were collected by centrifugation. As control expression experiments, pTCP4 was introduced into BL21 (DE3) / pPARE strain (d), BL21 star (DE3) strain (c), and BL21 star (DE3) / pACYC strain (b) into which pRARE was introduced into the BL21 (DE3) strain. The expression experiment was conducted under the same conditions. After adjusting the OD600 value of each cell culture solution to 1.0, this was analyzed by SDS-PAGE. Each band was digitized from the SDS-PAGE data using an EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level, and the expression level of the four chaperonin conjugates in each expression experiment was compared. The results are shown in Table 3.

表３に示されるように、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株で最も高い発現量が得られた。以上のことから、ｍＲＮＡ分解の抑制とｔＲＮＡの補充の両遺伝的形質が古細菌由来の巨大蛋白質（約２４０ｋＤａ）の発現にも有効であることが明らかとなった。   As shown in Table 3, the highest expression level was obtained in the BL21 star (DE3) / pRARE strain. From the above, it has been clarified that both genetic traits of suppression of mRNA degradation and replenishment of tRNA are also effective for the expression of a giant protein (about 240 kDa) derived from archaea.

〔実施例５〕古細菌シャペロニンβサブユニット８量体の発現
配列番号４に記載にされた古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１株由来シャペロニンβサブユニット遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ００１０８１）の８回連結体をｐＥＴ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、発現ベクターｐＴＣＰ８を得た。このｐＴＣＰ８を用いて実施例１で調製されたＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて選択することにより形質転換体ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＣＰ８株（ａ）を得た。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＴＣＰ８株を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びクロラムフェニコール３４μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＢＬ２１（ＤＥ３）株にｐＲＡＲＥを導入したＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＰＡＲＥ株（ｄ）、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）株（ｃ）、及びＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＡＣＹＣ株（ｂ）にｐＴＣＰ８を導入して同様の条件下で発現実験を行った。各菌体培養液のＯＤ６００値を２.０に調整した後、これをＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドを数値化して発現レベルを定量し、各発現実験におけるシャペロニン８回連結体の発現レベルを比較した。結果を表４に示す。 [Example 5] Expression of archaeal chaperonin β subunit octamer Archaea Thermococcus sp. Described in SEQ ID NO: 4 An eight-fold conjugate of the KS-1 strain-derived chaperonin β subunit gene (GenBank No. AB001081) was inserted into pET21 (Novagen) to obtain an expression vector pTCP8. Using this pTCP8, the BL21 star (DE3) / pRARE strain prepared in Example 1 was transformed and selected by LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml. BL21 star (DE3) / pRARE / pTCP8 strain (a) was obtained. BL21 star (DE3) / pRARE / pTCP8 strain is cultured in LB medium containing ampicillin 100 μg / ml and chloramphenicol 34 μg / ml at 37 ° C. until the OD600 value becomes 1.5, and 1 mM IPTG is added. After inducing the expression and further culturing at 37 ° C. for 3 hours, the cells were collected by centrifugation. As a control expression experiment, pTCP8 was introduced into BL21 (DE3) / pPARE strain (d), BL21 star (DE3) strain (c), and BL21 star (DE3) / pACYC strain (b) in which pRARE was introduced into BL21 (DE3) strain. The expression experiment was conducted under the same conditions. After adjusting the OD600 value of each cell culture solution to 2.0, this was converted to SDS-
Analysis by PAGE. Each band was digitized from SDS-PAGE data using an EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level, and the expression levels of the eight chaperonin conjugates in each expression experiment were compared. The results are shown in Table 4.

表４に示されるように、ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ株で最も高い発現量が得られた。以上のことから、ｍＲＮＡ分解の抑制とｔＲＮＡの補充の両遺伝的形質が
古細菌由来の巨大蛋白質（約４８０ｋＤａ）の発現にも有効であることが明らかとなった。 As shown in Table 4, the highest expression level was obtained in the BL21 star (DE3) / pRARE strain. From the above, it has been clarified that both genetic traits of suppression of mRNA degradation and tRNA supplementation are also effective for the expression of a giant protein (about 480 kDa) derived from archaea.

〔実施例６〕ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼとの共発現によるアクチン蛋白質の発現
配列番号５に記載にされた古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＳ−１株由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＢ０１２２０９）をｐＥＴ３ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入した後、ＴｃＦＫ遺伝子のＴ７系発現ユニットをＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩを用いた制限酵素反応によって切り出した。これをｐＳＣ１０１（Ｃｏｈｅｎ，ＳＮ．ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２，７３４）の誘導体(複製領域：Ｒ６−５)に挿入し、ｐＲＴＦＫを構築した。このｐＲＴＦＫを実施例１にて作製した大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株に導入し、アクチンとＴｃＦＫの共発現が可能な大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ／ｐＲＴＦＫ株を構築した。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ／ｐＲＴＦＫ株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で３時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＴｃＦＫ遺伝子を導入していないＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地にて同様の条件下で発現実験を行った。各菌体を超音波によって破砕した後、遠心分離によって上清と沈殿に分離し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって各バンドを数値化して発現レベルを定量した。またアクチン蛋白質の発現は抗アクチンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。アクチンのみの発現では殆ど全てが沈殿画分に存在し、上清には殆ど検出されなかった（コントロール）が、ＴｃＦＫとの共発現によって細胞質可溶性全蛋白質の約１２％にアクチンが発現していることがわかった。以上のことからＴｃＦＫのシャペロン活性によってアクチン蛋白質が大腸菌細胞質可溶性画分に発現したと考えられる。 [Example 6] Expression of actin protein by co-expression with peptidylprolyl cis-trans isomerase Archaea Thermococcus sp. The KS-1 strain-derived FKBP-type PPIase (TcFK) gene (GenBank No. AB012209) was inserted into a pET3 vector (Novagen), and then the TcFK gene T7 expression unit was excised by a restriction enzyme reaction using BglII-BamHI. . This was inserted into a derivative (replication region: R6-5) of pSC101 (Cohen, SN. Et al., 1977, J. Bacteriol. 132, 734) to construct pRTFK. This pRTFK was introduced into the E. coli BL21 star (DE3) / pRARE / pACT strain prepared in Example 1 to construct an E. coli BL21 star (DE3) / pRARE / pACT / pRTFK strain capable of co-expression of actin and TcFK. . The BL21 star (DE3) / pRARE / pACT / pRTFK strain was tested for OD600 at 37 ° C. in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) and kanamycin (50 μg / ml). After culturing until 1.5, 1 mM IPTG was added to induce expression and further cultured at 37 ° C. for 3 hours, and then the cells were collected by centrifugation. As a control expression experiment, BL21 (DE3) star / pRARE / pACT strain not introduced with the TcFK gene was subjected to the same conditions in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) and chloramphenicol (34 μg / ml). Expression experiments were performed below. Each bacterial cell was disrupted by ultrasonic waves and then separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation, and these were analyzed by SDS-PAGE. Each band was digitized from SDS-PAGE data by EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level. The expression of actin protein was confirmed by Western blotting using an anti-actin polyclonal antibody. Almost all of the expression of actin was present in the precipitate fraction and was hardly detected in the supernatant (control), but actin was expressed in about 12% of the total cytosolic soluble protein by co-expression with TcFK. I understood it. From the above, it is considered that the actin protein was expressed in the E. coli cytosolic soluble fraction by the chaperone activity of TcFK.

〔実施例７〕大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳとの共発現によるアクチン蛋白質の発現
配列番号６に示された大腸菌ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳオペロン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｏ．Ｘ０７８５０）をｐＥＴ２１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入した後、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ遺伝子のＴ７系発現ユニットをＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩを用いた制限酵素反応によって切り出した。これをｐＳＣ１０１の誘導体に導入し、ｐＲＴＧＲＯを構築した。ｐＲＴＧＲＯを実施例１にて作製した大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ （ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株に導入し、アクチンとＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳの共発現が可能な大腸菌ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ／ｐＲＴＧＲＯ株を構築した。ＢＬ２１ ｓｔａｒ（ＤＥ３）／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ／ｐＲＴＧＲＯ株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地にて３７℃でＯＤ６００値が１．５となるまで培養し、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して発現を誘導しさらに３７℃で４時間培養した後、菌体を遠心分離によって回収した。コントロール発現実験として、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ遺伝子を導入していないＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ／ｐＲＡＲＥ／ｐＡＣＴ株を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地にて同様の条件下で発現実験を行った。菌体を超音波によって破砕した後、遠心分離によって上清と沈殿に分離し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥデータからＥＤＡＳ２００電気泳動解析システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって
各バンドを数値化して発現レベルを定量した。またアクチン蛋白質の発現は抗アクチンポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロッティングによって確認した。アクチンのみの発現では殆ど全てが沈殿画分に存在し、上清には殆ど検出されなかった（コントロール）が、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳとの共発現によって細胞質可溶性全蛋白質の約１１％にアクチンが発現していることがわかった。以上のことから、ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳのシャペロン活性によってアクチン蛋白質が大腸菌細胞質可溶性画分に発現したと考えられる。 [Example 7] Expression of actin protein by co-expression with E. coli chaperonin GroEL / GroES E. coli GroEL / GroES operon gene (GenBank shown in SEQ ID NO: 6)
No. X07850) was inserted into pET21 vector (Novagen), and then the T7 expression unit of GroEL / GroES gene was excised by restriction enzyme reaction using BglII-NotI. This was introduced into a derivative of pSC101 to construct pRTGRO. pRTGRO is introduced into the E. coli BL21 star (DE3) / pRARE / pACT strain prepared in Example 1, and an E. coli BL21 star (DE3) / pRARE / pACT / pRTGRO strain capable of co-expression of actin and GroEL / GroES is constructed. did. The BL21 star (DE3) / pRARE / pACT / pRTGRO strain was measured at 37 ° C. in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml), chloramphenicol (34 μg / ml) and kanamycin (50 μg / ml). After culturing to 1.5, 1 mM IPTG was added to induce expression and further cultured at 37 ° C. for 4 hours, and then the cells were collected by centrifugation. As a control expression experiment, BL21 (DE3) star / pRARE / pACT strain into which GroEL / GroES gene was not introduced was similarly treated in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) and chloramphenicol (34 μg / ml). Expression experiments were performed under the conditions of The cells were disrupted by ultrasonic waves and then separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation, and these were analyzed by SDS-PAGE. Each band was digitized from SDS-PAGE data by EDAS200 electrophoresis analysis system (Invitrogen) to quantify the expression level. The expression of actin protein was confirmed by Western blotting using an anti-actin polyclonal antibody. Almost all of the actin expression was present in the precipitate fraction and was hardly detected in the supernatant (control), but actin was expressed in about 11% of the total cytosolic soluble protein by co-expression with GroEL / GroES. I found out. From the above, it is considered that the actin protein was expressed in the E. coli cytosolic soluble fraction by the chaperone activity of GroEL / GroES.

本発明により、ｍＲＮＡの分解が抑制され、かつｔＲＮＡ含有量が増加されており、また場合によっては分子シャペロンを含むバクテリアが提供される。このバクテリアは、所望の蛋白質又はペプチドを、正確な配列及び折りたたみを保ち、かつ高効率に生産するために有用である。   According to the present invention, there is provided a bacterium that suppresses the degradation of mRNA, has an increased tRNA content, and optionally contains a molecular chaperone. This bacterium is useful for producing a desired protein or peptide with high efficiency while maintaining an accurate sequence and folding.

Claims (30)

ｔＲＮＡの含有量が増加され、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。   A bacterium characterized in that the content of tRNA is increased and the degradation of mRNA is suppressed. ｍＲＮＡ分解の抑制が、ヌクレアーゼ活性の抑制により行われる請求項１記載のバクテリア。   The bacterium according to claim 1, wherein the mRNA degradation is suppressed by suppressing nuclease activity. ｍＲＮＡ分解の抑制が、産生されるＲＮａｓｅＥのＣ末端ドメイン（４７７アミノ酸）の一部又は全部の欠損又はアミノ酸置換により行われる請求項１又は２記載のバクテリア。   The bacterium according to claim 1 or 2, wherein suppression of mRNA degradation is performed by deletion or amino acid substitution of a part or all of the C-terminal domain (477 amino acids) of RNaseE produced. ｔＲＮＡが、バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡである請求項１〜３のいずれか１項に記載のバクテリア。   The bacterium according to any one of claims 1 to 3, wherein the tRNA is a tRNA corresponding to at least one of codons that are not frequently used in bacteria. バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを有し、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。   A bacterium characterized by having a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage frequency in bacteria, and in which degradation of mRNA is suppressed. プラスミドがゲノム当たり１０コピー以上複製され得るものである請求項５記載のバクテリア。   6. The bacterium according to claim 5, wherein the plasmid is capable of replicating 10 copies or more per genome. バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子がゲノムに組み込まれ、かつｍＲＮＡの分解が抑制されていることを特徴とするバクテリア。   A bacterium characterized in that a gene encoding a tRNA corresponding to at least one of codons with low frequency of use in the bacterium is integrated into the genome, and degradation of mRNA is suppressed. さらに、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバクテリア。   Furthermore, a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof is introduced. 8. The bacterium according to any one of 7 above. バクテリアが大腸菌である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバクテリア。   The bacterium according to any one of claims 1 to 8, wherein the bacterium is Escherichia coli. 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおいてｔＲＮＡの含有量を増加させる工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡ分解を抑制させる工程；
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) increasing the content of tRNA in bacteria; and (b) suppressing mRNA degradation in bacteria;
The method of manufacturing the bacteria of any one of Claims 1-8 containing these. 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
を含む、請求項５又は６記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) introducing a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one of codons infrequently used in bacteria into the bacteria; and (b) a gene encoding a protein involved in mRNA degradation in the bacteria. Deficient or mutated;
A method for producing a bacterium according to claim 5 or 6. 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を該バクテリアのゲノムに組み込む工程；及び
（ｂ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
を含む、請求項７記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) a step of incorporating a gene encoding tRNA corresponding to at least one codon that is not frequently used in bacteria into the genome of the bacteria; and (b) a gene encoding a protein involved in the degradation of mRNA in bacteria. Or mutating;
A method for producing a bacterium according to claim 7, comprising: 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程；
（ｃ）分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程；
を含む、請求項８記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) introducing a plasmid containing a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage in bacteria into the bacteria;
(C) introducing a plasmid containing a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof into bacteria;
A method for producing a bacterium according to claim 8. 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子を該バクテリアのゲノムに組み込む工程；
（ｃ）分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドをバクテリアに導入する工程；
を含む、請求項８記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) integrating a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon of low usage in bacteria into the bacterial genome;
(C) introducing a plasmid containing a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin or a partial peptide thereof into bacteria;
A method for producing a bacterium according to claim 8. 以下の工程：
（ａ）バクテリアにおいてｍＲＮＡの分解に関与する蛋白質をコードする遺伝子を欠損又は変異させる工程；
（ｂ）バクテリアにおける使用頻度が低いコドンの少なくとも１つに対応するｔＲＮＡをコードする遺伝子と、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子とを含むプラスミドを該バクテリアに導入する工程；
を含む、請求項８記載のバクテリアを製造する方法。 The following steps:
(A) deleting or mutating a gene encoding a protein involved in degradation of mRNA in bacteria;
(B) a gene encoding a tRNA corresponding to at least one codon that is not frequently used in bacteria, and at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase, and thioredoxin Introducing a plasmid containing a gene encoding the partial peptide into the bacterium;
A method for producing a bacterium according to claim 8. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のバクテリアに目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。   A transformant in which a gene encoding a target protein or peptide is introduced into the bacterium according to any one of claims 1 to 9. 目的蛋白質又はペプチドが可溶性である請求項１６記載の形質転換体。   The transformant according to claim 16, wherein the target protein or peptide is soluble. 目的蛋白質又はペプチドが膜蛋白質である請求項１６記載の形質転換体。   The transformant according to claim 16, wherein the target protein or peptide is a membrane protein. 請求項１〜９のいずれか１項に記載のバクテリアの粗抽出物を含むことを特徴とする組成物。   A composition comprising the bacterial bacterial extract according to any one of claims 1 to 9. 請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物から目的蛋白質又はペプチドを回収することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。   A method for producing a target protein or peptide, comprising culturing the transformant according to any one of claims 16 to 18 and recovering the target protein or peptide from the obtained culture. さらにｉｎ ｖｉｔｒｏにて目的蛋白質又はペプチドの不溶性凝集体を可溶化させ、再構成する工程を含む、請求項２０記載の方法。   21. The method according to claim 20, further comprising the step of solubilizing and reconstituting insoluble aggregates of the target protein or peptide in vitro. 不溶性凝集体の再構成が、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドの共存下で行われる、請求項２１記載の方法。   The method according to claim 21, wherein the reconstitution of the insoluble aggregate is performed in the presence of at least one protein selected from a molecular chaperone, a peptidylprolyl cis-trans isomerase, a disulfide isomerase, a protein disulfide isomerase, and a thioredoxin. . 目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子を、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる少なくとも１つの蛋白質又はその部分ペプチドをコードする遺伝子と共発現することを特徴とする、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。   Co-expressing a gene encoding a target protein or peptide with a gene encoding at least one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase, and thioredoxin The method according to any one of claims 20 to 22. 目的蛋白質又はペプチドを、分子シャペロン、ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼ及びチオレドキシンから選ばれる１つの蛋白質又はその部分ペプチドとの融合蛋白質として発現することを特徴とする、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。   The target protein or peptide is expressed as a fusion protein with one protein selected from a molecular chaperone, peptidylprolyl cis-trans isomerase, disulfide isomerase, protein disulfide isomerase and thioredoxin, or a partial peptide thereof. The method of any one of -22. ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、請求項１９記載の組成物を用いて目的蛋白質又はペ
プチドを産生することを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドの製造方法。 A method for producing a target protein or peptide, which comprises producing the target protein or peptide using the composition according to claim 19 in an in vitro translation system. 目的蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子が、真核生物由来ｃＤＮＡの全長配列、又は６残基以上のアミノ酸配列をコードするその部分配列である、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。   The method according to any one of claims 20 to 25, wherein the gene encoding the target protein or peptide is a full-length sequence of eukaryotic cDNA or a partial sequence encoding an amino acid sequence of 6 residues or more. . 請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法により製造された目的蛋白質又はペプチド、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の形質転換体、又は請求項１９記載の組成物のいずれかを動物に免疫する工程を含むことを特徴とする、目的蛋白質又はペプチドに対する抗体の作製方法。   Any one of the target protein or peptide manufactured by the method of any one of Claims 20-26, the transformant of any one of Claims 16-18, or the composition of Claim 19. A method for producing an antibody against a target protein or peptide, comprising a step of immunizing an animal. 請求項２７記載の方法によって得られる抗体。   The antibody obtained by the method of Claim 27. 請求項２７に記載される免疫動物より抗体遺伝子を分離する工程を含むことを特徴とする、目的タンパク質又はペプチドに対する抗体をコードする遺伝子の調製方法。   A method for preparing a gene encoding an antibody against a target protein or peptide, comprising a step of separating an antibody gene from the immunized animal according to claim 27. 請求項２９に記載の方法によって得られる抗体遺伝子、及び抗体の抗原認識領域の６残基以上のペプチドをコードする遺伝子。
tttttttttt An antibody gene obtained by the method according to claim 29, and a gene encoding a peptide having 6 or more residues in the antigen recognition region of the antibody.
tttttttttt