JP2005035945A - Combined therapy for tissue regeneration - Google Patents

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芳樹 澤
Satoru Takeya
哲 竹谷
Shigeru Miyagawa
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new therapeutic system of heart disease and heart disorder, based on an entirely new concept taking the place of heart transplantation and an assistant system by medical equipment, especially a fundamental therapeutic method corresponding to intractable heart disease the fundamental therapeutic method of which is absolutely or substantially not present. <P>SOLUTION: The composition and kit for regenerating the tissue of an organ of an organism and for treating disease are provided. The composition includes a cell bioactive substance and a cell in a shape suitable for importation to the heart. The kit has the cell bioactive substance, the cell and an instruction sheet. The method for regenerating the tissue of the organ of the organism, and the method for treating the disease are also provided. The method comprises a step of providing the cell bioactive substance and a step of providing the cell. As a result, the damaged tissue of the organ of the organism can be regenerated absolutely without using the organ transplantation and the assistant system by the medical equipment. Therefore, the intractable disease such as myocardial infarction and distention miocardiopathy can be treated by utilizing the invention. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本願発明は、細胞移植併用療法（「ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ」）の分野に関する。より詳細には、細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）と細胞移植を組み合わせて用いて生物の臓器または器官（例えば、心臓、脳、肺など）の組織を再生させる方法および心疾患を治療する方法ならびにそれを実現するための組成物およびキットなどに関する。以下に発明の詳細な説明を記載する。   The present invention relates to the field of cell transplantation combination therapy (“combined regenerative therapy”). More specifically, a method for regenerating tissue of an organ or organ (eg, heart, brain, lung, etc.) of a living body using a combination of a cell physiologically active substance (eg, cytokine, cell growth factor, etc.) and cell transplantation and the heart The present invention relates to a method for treating a disease, a composition and a kit for realizing the method, and the like. A detailed description of the invention is described below.

再生医学を利用した疾患治療の発展には、近年目を見張るものがある。しかし、臓器移植を必要とする疾患に対して利用されるまでには至っていない。従って、そのような疾患の治療として、臓器移植のほか、医療機器での補助システムを利用することが現在行われている。しかし、これらの処置には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。   The development of disease treatment using regenerative medicine has been remarkable in recent years. However, it has not yet been used for diseases requiring organ transplantation. Therefore, as a treatment for such diseases, in addition to organ transplantation, an auxiliary system in a medical device is currently used. However, these treatments have problems such as donor shortage, rejection, infection, and service life.

例えば、心臓外科の分野において、上記事情は同様である。心不全治療の医学的、外科的な処置においては近年目を見張る進展がある。しかし、末期心不全、特に虚血が原因のものは、世界的にも未だ主要な死因である。心臓移植（非特許文献１）および医療機器での補助システム（LVAS)移植（非特許文献２）は、これら患者を補助する究極の助命手段として充分に認知されている。しかし、これらの処置には、ドナー不足、拒絶、心臓移植に関する感染（非特許文献３）、LVASの耐用年数のような制限がある。例えば、米国では年間約７万例の心臓移植対象者がいるが、移植例はここ数年間わずか２０００例にとどまっている。また、日本でも臓器移植法施行後、脳死者からの心臓移植が行われているが、数十例にとどまっており、実用的な処置法にはほど遠い。   For example, in the field of cardiac surgery, the above situation is the same. In recent years there has been remarkable progress in medical and surgical procedures for the treatment of heart failure. However, end-stage heart failure, particularly caused by ischemia, is still the leading cause of death worldwide. Cardiac transplantation (Non-patent Document 1) and medical device assist system (LVAS) transplantation (Non-patent Document 2) are well recognized as the ultimate life support means to assist these patients. However, these treatments have limitations such as donor shortage, rejection, infection related to heart transplantation (Non-Patent Document 3), and the useful life of LVAS. For example, in the United States, there are about 70,000 heart transplant recipients per year, but only 2000 have been transplanted in recent years. In Japan, heart transplantation from brain dead is performed after organ transplantation, but it is only a few dozen cases and is far from practical treatment.

分子生物学の近年の進歩により、生物の器官を修復する試みがなされている。例えば、心臓機能損傷を回復するための新たなアプローチが提供されている（非特許文献5）。しかし、この方法には、問題がいくつか残存している。細胞が移植されてもその部位に十分な生着をえるのは困難である。さらに、心筋細胞等が注射によって移植されても、心筋梗塞に陥った部位をこの細胞によっては再生することはできない。また、移植されたばらばらの細胞が細胞間接着を再構築し、心臓組織形態に変化するか不明である。   Recent advances in molecular biology have attempted to repair the organs of organisms. For example, a new approach for recovering cardiac function damage has been provided (Non-Patent Document 5). However, this method still has some problems. Even if cells are transplanted, it is difficult to obtain sufficient engraftment at the site. Furthermore, even if cardiomyocytes or the like are transplanted by injection, a site that has suffered myocardial infarction cannot be regenerated by these cells. In addition, it is unclear whether the transplanted discrete cells reconstruct cell-cell adhesion and change to a heart tissue morphology.

細胞を移植して組織を再生させる試みも行われている。例えば、心筋細胞またはその前駆細胞（組織幹細胞）に特定の遺伝子を導入して移植に適した細胞にする治療法の開発が試みられているが、いまだに実用レベルには達しておらず、移植した細胞が損傷を受けた心臓組織を再生させるまでには至らない。このような状況は、脳細胞、骨格筋細胞などでも同様であり、実用化には程遠い。   Attempts have also been made to regenerate tissues by transplanting cells. For example, attempts have been made to develop a therapeutic method that introduces a specific gene into cardiomyocytes or their progenitor cells (tissue stem cells) to make them suitable for transplantation. It is not enough for the cells to regenerate damaged heart tissue. This situation is the same for brain cells, skeletal muscle cells, etc., and is far from practical use.

他方、細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）が注目されている。細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）は、免疫系、造血系、内分泌系、神経系などの生体の種々の高次機能を維持する上で重要な生理活性物質である。その多機能性を利用して、臨床応用が試みられている。例えば、貧血治療のためにエリスロポエチン（ＥＰＯ）が用いられている。しかし、本発明者らの知る限り、サイトカインのような細胞生理活性物質を再生医療に利用することに成功したという報告はなされていない。   On the other hand, cellular physiologically active substances (for example, cytokines, cell growth factors, etc.) are attracting attention. Cell physiologically active substances (for example, cytokines, cell growth factors, etc.) are important physiologically active substances in maintaining various higher-order functions of living bodies such as immune system, hematopoietic system, endocrine system, and nervous system. Clinical applications have been attempted using this multi-functionality. For example, erythropoietin (EPO) is used for the treatment of anemia. However, as far as the present inventors know, there has been no report that cell physiologically active substances such as cytokines have been successfully used for regenerative medicine.

心臓組織の再生についても、ＥＰＯ、インターロイキンのような細胞生理活性物質は、単独で心臓組織の再生に効果があるという報告はない。細胞生理活性物質が心臓再生に効果の可能性を記載する報告においても、完全な再生を達成したものはない。心臓再生を必要とする疾患または障害に本格的に利用することができるものは皆無である。   Regarding the regeneration of heart tissue, there is no report that cell physiologically active substances such as EPO and interleukin are effective for the regeneration of heart tissue alone. None of the reports describing the potential effects of cellular bioactive substances on cardiac regeneration have achieved complete regeneration. None can be used in earnest for diseases or disorders that require heart regeneration.

このように、従来の内科的、外科的治療により改善しない重症心不全に対する現在の治療方法は補助人工心臓と心移植であるが、現段階では前者はその耐久性に、後者はドナーの確保に問題があり、すべての症例に対する普遍的治療と言いがたいのが実情である。   Thus, the current treatment methods for severe heart failure that cannot be improved by conventional medical and surgical treatment are assistive artificial heart and heart transplantation. At present, the former is a problem in terms of durability and the latter is a problem in securing donors. In reality, it is difficult to say that this is a universal treatment for all cases.

拡張型心筋症（ＤＣＭ）等の重症心不全または難治性心不全に対する治療の一選択肢として、細胞移植、遺伝子治療などの研究が行われており、いずれも心機能がある程度改善したという報告がある。しかし、ＤＣＭの治療には、線維化の抑制、脱落した心筋細胞の補填、および心筋細胞骨格の修復が重要であるが、これらに有効な治療法は報告されていない。   Cell transplantation and gene therapy have been studied as options for treatment of severe heart failure or refractory heart failure such as dilated cardiomyopathy (DCM), and there are reports that cardiac function has improved to some extent. However, for the treatment of DCM, suppression of fibrosis, replacement of dropped cardiomyocytes, and repair of the cardiomyocyte skeleton are important, but no effective therapy has been reported.

ＤＣＭは5年生存率が40％程度との報告もあるが、ＡＣＥ阻害剤やβ遮断薬などの進歩により、その予後は改善しつつある。しかし、薬剤抵抗性の難治性心不全を呈した場合補助人工心臓と心移植しか治療法がないのが実情である。   There is a report that the 5-year survival rate of DCM is about 40%, but the prognosis is improving due to the progress of ACE inhibitors and β-blockers. However, in the case of drug-refractory intractable heart failure, there are only treatment methods for assistive heart and heart transplantation.

このように、ＤＣＭを含む難治性心不全については、根本的な治療法が無いのが問題であり、しかも、心臓移植適応除外症例（たとえば、高齢者、透析症例など）の場合は、心臓移植の代替治療が不可欠である。そのような代替治療としてBatista手術が試みられたが、代替治療になり得ないことが報告されている（非特許文献35）。また、心臓移植治療において補助人工心臓のブリッジ使用も試みられているが、処置自体に技術を要するものであることから、やはり代替治療が必要となることが予想される。従って、新たな内科的治療の展開が期待されている。   Thus, there is no fundamental treatment for refractory heart failure including DCM, and in cases where heart transplantation is excluded (for example, elderly people, dialysis cases, etc.) Alternative treatment is essential. Batista surgery has been attempted as such an alternative treatment, but it has been reported that it cannot be an alternative treatment (Non-patent Document 35). In addition, the use of an auxiliary artificial heart bridge in heart transplantation therapy has also been attempted, but it is expected that an alternative therapy will be required because the procedure itself requires a technique. Therefore, development of new medical treatment is expected.

「心臓移植」とは、脳死患者（ドナー）などから得た心臓を患者（レシピエント）に移植する手術をいい、心疾患の最後の治療法として注目されている。しかし、心臓移植のレシピエントは、従来の治療法では救命または延命の期待が望めない重症心疾患患者に適用されている。特に、適応症としては、たとえば、拡張型心筋症、拡張相肥大型心筋症、虚血性心疾患、その他学会など当該分野において承認された心疾患が対象とされている。適応症としての条件としては、長時間または反復した入院治療が必要であり、β遮断薬およびＡＣＥ阻害薬などの薬物療法がNYHA（ニューヨーク心臓協会分類）III〜IVから改善しない症例、および現存するいかなる治療法でも無効な致死性重症不整脈を有する症例などが挙げられる。   “Heart transplantation” refers to an operation in which a heart obtained from a brain-dead patient (donor) or the like is transplanted into a patient (recipient), and is attracting attention as the last treatment for heart disease. However, heart transplant recipients are applied to patients with severe heart disease for whom conventional treatments cannot be expected to save lives or prolong life. In particular, as indications, for example, dilated cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy, ischemic heart disease, and other cardiac diseases approved in the field such as academic societies are targeted. Indications include long-term or repeated hospitalization treatment, and cases where pharmacotherapy such as beta-blockers and ACE inhibitors do not improve from NYHA (New York Heart Association classification) III-IV, and currently exists Examples include fatal severe arrhythmias that are ineffective with any treatment.

ただし、心機能改善によっても生命予後の改善が期待できないと考えられる状態の患者は除外されており、また、以下のような絶対的除外条件がある：（１）肝臓、腎臓などの不可逆的機能障害、（２）活動性感染症、（３）肺高血圧症、（４）薬物依存、（５）悪性腫瘍、（６）HIV抗体陽性など。また、相対的除外要件として、たとえば、（１）肝臓、腎臓の機能障害、（２）活動性消化性潰瘍、（３）インスリン依存性糖尿病、（４）精神神経症、（５）肺拘束症の既往歴、肺血管閉塞病変、（６）膠原病などの全身性疾患などが挙げられれる。これらの除外条件に該当する場合は特に、現在、根治的治療がまったく存在しないことになり、その治療法が渇望されている。特にＤＣＭについては、心筋繊維配列の乱れと線維化の進行により心筋壁の菲薄化、収縮性の低下を生じ、心拡大を呈するＤＣＭの根本治療には心筋繊維配列の乱れの改善、線維化の抑制、脱落した筋細胞の補填等の複合治療が必要と考えられる。   However, patients who are considered unable to expect improvement in vital prognosis due to improved cardiac function are excluded, and there are the following absolute exclusion conditions: (1) Irreversible functions such as liver and kidney Disorder, (2) active infection, (3) pulmonary hypertension, (4) drug dependence, (5) malignant tumor, (6) HIV antibody positive. Relative exclusion requirements include, for example, (1) liver and kidney dysfunction, (2) active peptic ulcer, (3) insulin-dependent diabetes, (4) psychoneuropathy, (5) lung restraint Past history of pulmonary vascular occlusion, systemic diseases such as (6) collagen disease, and the like. Especially when these exclusion conditions are met, there is currently no radical treatment and there is a craving for such treatment. In particular, for DCM, the myocardial fiber array is disturbed and the progression of fibrosis causes thinning of the myocardial wall and a decrease in contractility. Combined treatment such as suppression and replacement of dropped muscle cells is considered necessary.

これらの状況のもと、移植に頼らないどのような臓器または器官でも適用可能な新たなコンセプトの代用療法への開発が試みられつつある。
特開平５−０１１１８３公報 米国特許第４，５５４，１０１号 Canver CC, Chanda J. Heart transplantation.Ann Thorac Surg.2001;72:658-660 Frazier OH, Benedict CR, Radovancevic B etal. Improved left ventricular function after chronic left ventricular unloading.Ann Thorac Surg. 1996;62:675-681 Hosenpud JD, Bennett LE, Keck BM et al. TheRegistry of the International Society for Heart and Lung Transplantation:fifteenth official report-1998J Heart Lung Transplant. 1998; 17:656-668 El-Banayosy A, Korfer R, Arusoglu L et al.Device and PatientManagement in a Bridge-to-TransplantSetting. Ann Thorac Surg.2001;71:S98-102 Li R-K, Jia ZQ, Weisel RD et al.Cardiomyocyte transplantation improves heart function. Ann Thorac Surg. 1996;62:654-661 Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P et al.Regeneration of functional myocardium: Improved performance after skeletalmyoblast transplantation. Nature Med. 1998;4:929-933 Reinlib L, Field L. Cell transplantation asfuture therapy for cardiovascular disease? 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JP-A-5-011183 US Pat. No. 4,554,101 Canver CC, Chanda J. Heart transplantation. Ann Thorac Surg. 2001; 72: 658-660 Frazier OH, Benedict CR, Radovancevic B etal. Improved left ventricular function after chronic left ventricular unloading. Ann Thorac Surg. 1996; 62: 675-681 Hosenpud JD, Bennett LE, Keck BM et al. TheRegistry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: fifteenth official report-1998J Heart Lung Transplant. 1998; 17: 656-668 El-Banayosy A, Korfer R, Arusoglu L et al. Device and Patient Management in a Bridge-to-TransplantSetting. Ann Thorac Surg. 2001; 71: S98-102 Li RK, Jia ZQ, Weisel RD et al. Cardiomyocyte transplantation improves heart function. Ann Thorac Surg. 1996; 62: 654-661 Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P et al. Regeneration of functional myocardium: Improved performance after skeletalmyoblast transplantation.Nature Med. 1998; 4: 929-933 Reinlib L, Field L. Cell transplantation asfuture therapy for cardiovascular disease? 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II), 382-388, 1997 Gene 108,193-200, 1991 Nakamura, T., Nishizawa, T., Hagiya, M., Seki, T., Shimonishi, M., Sugimura, A., Tashiro, K., and Shimizu, S. Nature 342, 440-443, 1989 Kyte. J and Doolittle, RFJ Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982 New Surgery System, Volume 12, Heart Transplantation / Lung Transplantation From Technical and Ethical Development to Implementation (Revised 3rd Edition), Nakayama Shoten The latest treatment for cardiovascular diseases 2002-2003, Shigei Shinoyama, Yoshio Yazaki, Nanedo, 2002

従って、本発明は、心臓移植および医療機器での補助システムに代わる、全く新しい概念の新規の心疾患・心障害の治療システムの開発を課題とする。特に、根治的治療法がまったく無いか実質的に無い難治性心不全に関し、根治的治療を提供することを課題とする。   Therefore, an object of the present invention is to develop a novel heart disease / disorder treatment system with a completely new concept, which can replace an assist system for heart transplantation and medical devices. In particular, it is an object to provide a radical treatment for intractable heart failure with no or substantially no radical treatment.

本発明は、細胞を心臓へ移植する際に、細胞生理活性物質（例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなど）を投与することで、心臓組織の再生が促進されるという予想外の発見に基づいて開発された。   The present invention was developed based on an unexpected discovery that regeneration of heart tissue is promoted by administering a cell physiologically active substance (for example, HGF, VEGF, FGF, etc.) when cells are transplanted into the heart. It was done.

本発明者らはまた、梗塞心において細胞移植とＨＧＦなどの細胞生理活性物質の遺伝子導入とを併用することにより、移植細胞の細胞骨格の再生および不全心の機能・組織の改善が予想外に得られたことを見出した。加えて、心疾患、特に、ＤＣＭなどを含む難治性心不全に対しても、細胞移植とＨＧＦとの併用により、細胞の補填、繊維化の抑制のみならず、残存心筋細胞骨格の再生効果も見いだされ、心機能改善効果、心筋組織の再生効果が見出され。従って、本発明は、心疾患、特に、ＤＣＭなどを含む難治性心不全の病因制御による新たな治療法として有用であることを見出した。特に、心臓移植が適応できない難治性心不全にとっては、初めて根治的治療が提供されたことになり、その効果は絶大である。   The present inventors have also unexpectedly improved the function of the transplanted cell cytoskeleton and the improvement of function / tissue of the failing heart by combining cell transplantation and gene transfer of a cell physiologically active substance such as HGF in the infarcted heart. Found that it was obtained. In addition, for cardiovascular disease, especially refractory heart failure including DCM etc., combined use of cell transplantation and HGF has found not only cell replenishment and suppression of fibrosis, but also regeneration effect of residual cardiomyocyte skeleton. As a result, it has been found to improve cardiac function and regenerate myocardial tissue. Therefore, the present invention has been found to be useful as a new treatment method by controlling the etiology of heart diseases, particularly refractory heart failure including DCM. In particular, for intractable heart failure to which heart transplantation cannot be applied, the first radical cure has been provided, and the effect is enormous.

本発明は、具体的には、以下を提供する。
（１） 生物の心疾患の治療、予防または予後のための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む、
組成物。
（２） 上記心疾患は、難治性心不全（たとえば、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患）を含む、項目１に記載の組成物。
（３） 上記心疾患は拡張型心筋症を含む、項目１に記載の組成物。
（４） 上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有する、項目１に記載の組成物。
（５） 上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有する、項目１に記載の組成物。
（６） 上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用を有する、項目１に記載の組成物。
（７） 上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、項目１に記載の組成物。
（８） 上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、項目１に記載の組成物。
（９） 上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（１０） 上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦである、項目１に記載の組成物。
（１１） 上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦである、項目１に記載の組成物。
（１２） 上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである、項目１に記載の組成物。
（１３） 上記細胞は、胚性幹細胞または組織幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（１４） 上記細胞は、分化した細胞である、項目１に記載の組成物。
（１５） 上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（１６） 上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（１７） 上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（１８） 上記細胞は、間葉系幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（１９） 上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞である、項目１に記載の組成物。
（２０） 上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞である、項目１に記載の組成物。
（２１） 上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択される、項目１に記載の組成物。
（２２） 上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞である、項目１に記載の組成物。
（２３） 上記細胞は、骨髄由来である、項目１に記載の組成物。
（２４） 上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞である、項目１に記載の組成物。
（２５） 上記細胞は、自己由来である、項目１に記載の組成物。
（２６） 上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態である、項目１に記載の組成物。
（２７） 上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態である、項目１に記載の組成物。
（２８） 上記細胞生理活性物質は、核酸形態である、項目１に記載の組成物。
（２９） 上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在する、項目１に記載の組成物。
（３０） 上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在する、項目１に記載の組成物。
（３１） 徐放性形態である、項目１に記載の組成物。
（３２） さらに生体親和性材料を含む、項目１に記載の組成物。
（３３） シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つの生体親和性材料を含む、項目１に記載の組成物。
（３４） 上記細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質である、項目１に記載の組成物。
（３５） さらに他の薬剤を含む、項目１に記載の組成物。
（３６） 上記細胞は２種類以上の細胞を含む、項目１に記載の組成物。
（３７） 上記細胞は、ヒト由来である、項目１に記載の組成物。
（３８） 上記生物は、ヒトである、項目１に記載の組成物。
（３９） 生物の心疾患の治療、予防または予後のためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、上記指示書は、
上記細胞生理活性物質を上記細胞の心臓への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。
（４０） 上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記心臓への移植の前に投与することを指示する、項目３９に記載のキット。
（４１） 上記指示書は、上記細胞生理活性物質および上記細胞を上記心臓の罹患部位、傷害部位または虚血部位へと投与することを指示する、項目３９に記載のキット。
（４２） 上記心疾患は難治性心不全（たとえば、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患）を含む、項目３９に記載のキット。
（４３） 上記心疾患は拡張型心筋症であり、上記細胞生理活性物質および上記細胞の投与は、左心室を含む部位に投与することを含む、項目３９に記載のキット。
（４４）
生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための薬学的組成物であって、
細胞生理活性物質、
を含む、薬学的組成物。
（４５）
生物の心疾患の治療、予防または予後のための方法であって、
細胞生理活性物質を上記器官へ提供する工程；および
細胞を心臓へ提供する工程、
を包含する、方法。
（４６）
上記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、項目４５に記載の方法。
（４７）
上記心疾患は拡張型心筋症を含む、項目４５に記載の方法。
（４８）
生物の心疾患の治療、予防または予後のための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。
（４９）
上記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、項目４８に記載の使用。
（５０）
上記心疾患は拡張型心筋症を含む、項目４８に記載の使用。
（５１）
生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための、細胞生理活性物質の使用。 Specifically, the present invention provides the following.
(1) A composition for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease,
Comprising a cell bioactive substance and cells in a form suitable for transfer to the organ,
Composition.
(2) Item 1 includes refractory heart failure (for example, at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy, and dilated cardiomyopathy). A composition according to 1.
(3) The composition according to item 1, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy.
(4) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has hematopoietic activity, colony stimulating activity, or cell proliferation activity.
(5) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has at least one activity of angiogenic activity and antifibrotic activity.
(6) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has angiogenic activity and antifibrotic effect.
(7) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has a kinase receptor as a receptor.
(8) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has a tyrosine kinase type receptor as a receptor.
(9) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is selected from the group consisting of FGF, HGF and VEGF.
(10) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is HGF.
(11) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is VEGF.
(12) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance has c-met as its receptor.
(13) The composition according to item 1, wherein the cell is an embryonic stem cell or a tissue stem cell.
(14) The composition according to item 1, wherein the cell is a differentiated cell.
(15) The composition according to item 1, wherein the cell is a stem cell derived from ectoderm, mesoderm or endoderm.
(16) The composition according to item 1, wherein the cell is a stem cell derived from mesoderm.
(17) The composition according to item 1, wherein the cell is a hematopoietic stem cell or a mesenchymal stem cell.
(18) The composition according to item 1, wherein the cell is a mesenchymal stem cell.
(19) The composition according to item 1, wherein the cell is a myeloid tissue stem cell.
(20) The composition according to item 1, wherein the cell is a differentiated cell derived from a mesenchymal stem cell.
(21) The composition according to item 1, wherein the cells are selected from the group consisting of cardiomyocytes, skeletal myoblasts and osteoblasts.
(22) The composition according to item 1, wherein the cell is a primary cultured cardiomyocyte or a differentiated cardiomyocyte.
(23) The composition according to item 1, wherein the cell is derived from bone marrow.
(24) The composition according to item 1, wherein the cell is a cell derived from the same lineage, from the same lineage or from a different lineage.
(25) A composition according to item 1, wherein the cell is autologous.
(26) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is in a protein form or a nucleic acid form.
(27) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is in a protein form.
(28) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is in the form of a nucleic acid.
(29) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is present in the form of a viral vector or a non-viral vector.
(30) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is present in the form of an HVJ liposome.
(31) A composition according to item 1, which is a sustained release form.
(32) The composition according to item 1, further comprising a biocompatible material.
(33) The composition according to item 1, comprising at least one biocompatible material selected from the group consisting of silicone, collagen, gelatin and a copolymer of glycolic acid / lactic acid.
(34) The composition according to item 1, wherein the cell physiologically active substance is two or more kinds of cell physiologically active substances.
(35) The composition according to item 1, further comprising another drug.
(36) The composition according to item 1, wherein the cell comprises two or more types of cells.
(37) A composition according to item 1, wherein the cell is derived from a human.
(38) A composition according to item 1, wherein the organism is a human.
(39) A kit for treatment, prevention or prognosis of a heart disease of a living body,
Cell physiologically active substance;
A cell; and instructions for transplanting the cell bioactive substance and the cell into the organ,
Where the above instructions are
Instructing to administer the cell bioactive substance before, simultaneously with, or after transplantation of the cells into the heart;
kit.
(40) The kit according to item 39, wherein the instructions indicate that the cell physiologically active substance is administered before transplantation of the cells into the heart.
(41) The kit according to item 39, wherein the instructions indicate that the cell physiologically active substance and the cells are administered to a diseased site, injury site or ischemia site of the heart.
(42) In item 39, the cardiac disease comprises refractory heart failure (eg, at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy). The described kit.
(43) The kit according to item 39, wherein the heart disease is dilated cardiomyopathy, and the administration of the cell physiologically active substance and the cell includes administration to a site including the left ventricle.
(44)
A pharmaceutical composition for administration with cells for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease comprising:
Cell physiologically active substance,
A pharmaceutical composition comprising:
(45)
A method for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease,
Providing a cell bioactive substance to the organ; and providing a cell to the heart;
Including the method.
(46)
46. The method of item 45, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy.
(47)
46. The method of item 45, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy.
(48)
Use of a cell physiologically active substance; and a cell for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease.
(49)
49. Use according to item 48, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy.
(50)
49. Use according to item 48, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy.
(51)
Use of a cell physiologically active substance for administration with a cell for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism.

本発明により、心臓移植および医療機器での補助システムを全く使用することなく、拡張型心筋症、心筋梗塞などの種々の心臓疾患を治療および予防することが可能になった。本発明により、根治的治療がほとんど不可能であった難治性心不全に対して初めて根治的治療を提供することができるという顕著な効果が奏される。   The present invention has made it possible to treat and prevent various heart diseases such as dilated cardiomyopathy and myocardial infarction without using any assistive system in heart transplantation and medical devices. According to the present invention, there is a remarkable effect that a radical treatment can be provided for the first time for intractable heart failure for which a radical treatment is almost impossible.

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、独語の場合の「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその格変化形、仏語の場合の「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｄｅｓ」、「ｌｅ」、「ｌａ」、「ｌｅｓ」など、他の言語における対応する冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。   The present invention will be described below. Throughout this specification, singular articles such as “ein”, “der”, “das”, “die” in German, such as “a”, “an”, “the” in English, etc. And its case-change forms, such as “un”, “une”, “des”, “le”, “la”, “les”, etc. in French, corresponding articles, adjectives, etc.) in particular It should be understood that the plural forms are also included unless otherwise stated. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified.

（用語の定義）
本明細書において使用される「併用療法」（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｈｅｒａｐｈｙ）とは、細胞移植と細胞生理活性物質（例えば、サイトカイン、細胞増殖因子など）の投与とを組み合わせた治療をいう。「組合せ（併用）」とは、同じ被検体（または患者）に両方の処置が何らかの形態で施されることをいい、両方の処置が同時に施される必要はないが、同時に両方の処置が行われてもよい。本明細書では、併用療法は、複合療法ともいい、両用語は同義で用いられる。 (Definition of terms)
As used herein, “combined therapy” refers to treatment that combines cell transplantation and administration of a cell bioactive substance (eg, cytokine, cell growth factor, etc.). “Combination” means that both treatments are given to the same subject (or patient) in some form, and both treatments need not be given at the same time, but both treatments are performed at the same time. It may be broken. As used herein, combination therapy is also referred to as combination therapy, and both terms are used interchangeably.

本明細書において用いられる「細胞生理活性物質」（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）とは、細胞に作用する物質を言う。細胞生理活性物質には、サイトカインおよび増殖因子が含まれる。細胞生理活性物質は、天然に存在するものであっても、合成されたものでもよい。好ましくは、細胞生理活性物質は、細胞が産生するものまたはそれと同様の作用を有するものである。本明細書では、細胞生理活性物質はタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。   As used herein, “cell physiologically active substance” refers to a substance that acts on cells. Cell bioactive substances include cytokines and growth factors. The cell physiologically active substance may be naturally occurring or synthesized. Preferably, the cell physiologically active substance is one produced by a cell or one having the same action. As used herein, a cytophysiologically active substance can be in protein form or nucleic acid form or other form, but at the point of actual action, cytokine usually means protein form.

本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じまたは異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制禦作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質形態を意味する。   As used herein, “cytokine” is defined in the same manner as the broadest meaning used in the art, and refers to a physiologically active substance produced from a cell and acting on the same or different cells. Cytokines are generally proteins or polypeptides, and have a suppressive action on the immune response, regulation of the endocrine system, regulation of the nervous system, antitumor action, antiviral action, regulation of cell proliferation, regulation of cell differentiation, etc. . As used herein, cytokines can be in protein or nucleic acid form or other forms, but at the point of action, cytokines usually mean protein forms.

本明細書において用いられる「増殖因子」または「細胞増殖因子」とは、本明細書では互換的に用いられ、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、成長因子または発育因子ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。   As used herein, “growth factor” or “cell growth factor” is used interchangeably herein and refers to a substance that promotes or regulates cell growth. Growth factors are also referred to as growth factors or growth factors. Growth factors can be added to the medium in cell or tissue culture to replace the action of serum macromolecules. Many growth factors have been found to function as regulators of the differentiation state in addition to cell growth.

サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。   Cytokines typically include interleukins, chemokines, hematopoietic factors such as colony stimulating factors, tumor necrosis factors, and interferons. Typical growth factors include platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF). Those having a proliferative activity such as

サイトカインおよび増殖因子などの細胞生理活性物質は一般に、機能重複現象（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）があることから、他の名称および機能で知られるサイトカインまたは増殖因子であっても、本発明に使用される細胞生理活性物質の活性を有する限り、本発明において使用され得る。また、サイトカインまたは増殖因子は、本明細書における好ましい活性を有してさえいれば、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用することができる。   Since cell physiologically active substances such as cytokines and growth factors generally have a redundancy, even the cytokines or growth factors known by other names and functions are used in the present invention. As long as it has the activity of a substance, it can be used in the present invention. Cytokines or growth factors can also be used in preferred embodiments of the combination therapies of the invention as long as they have the preferred activity herein.

本発明の併用療法では、どのような細胞生理活性物質も使用され得る。本発明の併用療法の１つの好ましい実施形態において、細胞生理活性物質として、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有するサイトカインまたは増殖因子が使用される。造血活性またはコロニー刺激活性を有するサイトカインとしては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド（ＳＣＦ）などが挙げられる。細胞増殖活性を有する増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞増殖活性を有する細胞生理活性物質（例えば、サイトカインまたは増殖因子）が使用され得る。   Any cell bioactive substance may be used in the combination therapy of the present invention. In one preferred embodiment of the combination therapy of the present invention, a cytokine or growth factor having hematopoietic activity, colony stimulating activity or cell proliferation activity is used as the cell bioactive substance. As cytokines having hematopoietic activity or colony stimulating activity, granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), multi-CSF (IL -3), erythropoietin (EPO), leukemia inhibitory factor (LIF), c-kit ligand (SCF) and the like. Examples of growth factors having cell growth activity include platelet-derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF) insulin. Like growth factor (IGF). In one preferred embodiment of the present invention, a cell bioactive substance having cell proliferation activity (eg, cytokine or growth factor) may be used.

サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、そのレセプター（例えば、サイトカインレセプター）によって分類することもできる。サイトカインレセプターは、非キナーゼ型およびキナーゼ型に分類される。非キナーゼ型としては、Ｇタンパク質結合型レセプター、ＮＧＦ／ＴＮＦレセプターファミリー、ＩＦＮレセプターファミリー、サイトカインレセプタースーパーファミリーなどが挙げられる。キナーゼ型としては、増殖因子型レセプター（チロシンキナーゼ型、例えば、ＨＧＦの場合はｃ−ｍｅｔ）、ＴＧＦβレセプターファミリー（セリン・スレオニンキナーゼ型）などが挙げられる。本発明の併用療法の好ましい実施形態では、キナーゼ型（特に増殖因子型レセプターに結合する細胞生理活性物質（例えば、ＨＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦなど））が使用される。細胞生理活性物質は、場合により、レセプターサブユニットを共有することから、上記好ましいサイトカインおよび増殖因子とレセプターサブユニットを共有するサイトカインおよび増殖因子もまた、好ましいサイトカインおよび増殖因子であり得る。   Cell bioactive substances such as cytokines and growth factors can also be classified by their receptors (eg, cytokine receptors). Cytokine receptors are classified into non-kinase and kinase types. Examples of the non-kinase type include G protein-coupled receptors, NGF / TNF receptor family, IFN receptor family, cytokine receptor superfamily and the like. Examples of the kinase type include growth factor type receptors (tyrosine kinase type, for example, c-met in the case of HGF), TGFβ receptor family (serine / threonine kinase type), and the like. In a preferred embodiment of the combination therapy of the present invention, a kinase type (in particular, a cell physiologically active substance that binds to a growth factor type receptor (eg, HGF, FGF, VEGF, etc.)) is used. Since the cytophysiologically active substance optionally shares the receptor subunit, the cytokine and the growth factor sharing the receptor subunit with the preferred cytokine and the growth factor may also be a preferable cytokine and growth factor.

サイトカインおよび増殖因子のような細胞生理活性物質はまた、タンパク質型または核酸型の場合、相同性比較により分類され得る。従って、本発明の好ましい実施形態として、本発明の好ましい細胞生理活性物質と相同性のある細胞生理活性物質が使用される。そのような相同性を有する細胞生理活性物質としては、例えば、Ｂｌａｓｔのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対照の細胞生理活性物質に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の相同性を有する細胞生理活性物質が挙げられる。   Cell bioactive substances such as cytokines and growth factors can also be classified by homology comparison in the case of protein or nucleic acid types. Therefore, as a preferred embodiment of the present invention, a cell physiologically active substance having homology with the preferred cell physiologically active substance of the present invention is used. Such cell bioactive substances having such homology include, for example, at least about 30%, about 35%, about 40% relative to the control cell bioactive substance when compared using the Blast default parameters. %, About 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about 95%, about 99% Examples thereof include cell physiologically active substances having homology.

本発明の別の好ましい実施形態において、増殖因子は、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦである。最も好ましい実施形態では、サイトカインおよび増殖因子はＨＧＦであり得る。   In another preferred embodiment of the invention, the growth factor is FGF, HGF, VEGF, IGF, NGF. In the most preferred embodiment, the cytokine and growth factor can be HGF.

ＨＧＦは分子量約85000のタンパク質であり、肝臓の一部を切ったラットの血液中から、肝細胞の増殖を促進する物質として分離された。1989年にこのタンパク質のアミノ酸配列が解明され、四つ葉のクローバーのような独特の分子構造を持つことが示された。ＨＧＦは細胞の増殖・遊走・形態形成を促して組織の再構築をもたらす活性を有しており、それゆえに様々な急性・慢性臓器疾患に対し強い発症阻止・治癒作用を示す。とりわけ肝硬変や慢性腎不全などの慢性疾患では線維化を促すTGF-βの過剰発現と相反して内因性ＨＧＦの発現低下が起こり、これが線維性疾患の発症につながる。これに対し、ＨＧＦは上皮細胞や内皮細胞の再生を促す一方でTGF-βの発現を抑制し、強い治癒・再生作用を示す。従って、血管新生作用および／または抗線維化作用を有する他のサイトカインおよび増殖因子もまた、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用され得る。   HGF is a protein having a molecular weight of about 85,000, and was isolated from the blood of a rat that had been partially cut off as a substance that promotes the proliferation of hepatocytes. In 1989, the amino acid sequence of this protein was elucidated, and it was shown to have a unique molecular structure like a four-leaf clover. HGF has an activity of promoting cell proliferation, migration, and morphogenesis to cause tissue remodeling. Therefore, it exhibits a strong onset prevention / curing action against various acute and chronic organ diseases. In particular, in chronic diseases such as cirrhosis and chronic renal failure, the expression of endogenous HGF is reduced contrary to the overexpression of TGF-β that promotes fibrosis, which leads to the onset of fibrotic disease. In contrast, HGF promotes the regeneration of epithelial cells and endothelial cells, while suppressing the expression of TGF-β, and exhibits a strong healing / regenerating action. Thus, other cytokines and growth factors that have angiogenic and / or antifibrotic effects may also be used in preferred embodiments of the combination therapy of the present invention.

近年ＨＧＦは、血管新生作用を有し（非特許文献８および９）、抗線維化作用を有する（非特許文献１０）ことが明らかになった。このＨＧＦは、オートクライン様作用（非特許文献１０）およびパラクライン様作用（非特許文献１１）を有する。さらに、ＨＧＦは、細胞間相互作用および細胞と細胞外マトリクスとの間の相互作用を増強する（非特許文献１２）。この相互作用は、β１インテグリン、ラミニンおよびフィブロネクチンの調節により制禦される（非特許文献１２）。従って、血管新生作用および／または抗線維化作用を有する他のサイトカインおよび増殖因子もまた、本発明の併用療法の好ましい実施形態において使用され得る。   In recent years, it has become clear that HGF has an angiogenic action (Non-Patent Documents 8 and 9) and an anti-fibrotic action (Non-Patent Document 10). This HGF has an autocrine-like action (Non-patent document 10) and a paracrine-like action (Non-patent document 11). Furthermore, HGF enhances cell-cell interaction and interaction between cells and extracellular matrix (Non-patent Document 12). This interaction is controlled by regulation of β1 integrin, laminin and fibronectin (Non-patent Document 12). Thus, other cytokines and growth factors that have angiogenic and / or antifibrotic effects may also be used in preferred embodiments of the combination therapy of the present invention.

本明細書において用いられる「血管新生作用（活性）」とは、ある因子が標的に作用したとき、その標的において血管を新たに形成する能力をいう。血管新生作用を測定する方法としては、代表的には、コントラスト剤を用いた超音波測定、血管に特異的な遺伝子産物に対する抗体を用いた血管数計数などが挙げられる。本明細書において、増殖因子が血管新生作用を有するか否かは、第ＶＩＩＩ因子関連抗原等で免疫組織化学染色した後に血管数を計数することによって判定される。この計数方法では、検体を１０％の緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、各々の検体から数個の連続切片を調製し、凍結する。次いで、凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでＰＢＳで洗浄する。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液で約１０分間覆って、非特異的反応をブロックする。検体を、ＨＲＰと結合する、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体と共に一晩インキュベートする。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（例えば、ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸漬して、陽性染色を得る。染色された血管内皮細胞を、例えば、２００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数し、例えば、計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわす。特定のサイトカインおよび増殖因子の処置後、血管数が統計学的に有意に増加しているか否かを判定することにより、血管新生活性を判定することができる。   As used herein, “angiogenic action (activity)” refers to the ability of a factor to form a new blood vessel at a target when it acts on the target. Typical methods for measuring the angiogenic action include ultrasonic measurement using a contrast agent, blood vessel count using an antibody against a gene product specific to blood vessels, and the like. In the present specification, whether or not a growth factor has an angiogenic action is determined by counting the number of blood vessels after immunohistochemical staining with a factor VIII-related antigen or the like. In this counting method, specimens are fixed with 10% buffered formalin, embedded in paraffin, several serial sections are prepared from each specimen and frozen. The frozen sections are then fixed with a 2% paraformaldehyde solution in PBS for 5 minutes at room temperature, immersed in methanol containing 3% hydrogen peroxide for 15 minutes, and then washed with PBS. This sample is covered with bovine serum albumin solution for about 10 minutes to block nonspecific reactions. The specimen is incubated overnight with an EPOS-conjugated antibody against Factor VIII-related antigen that binds HRP. After the samples are washed with PBS, they are immersed in a diaminobenzidine solution (eg, 0.3 mg / ml diaminobenzidine in PBS) to obtain a positive staining. Stained vascular endothelial cells are counted, for example, under an optical microscope with a magnification of 200 times. For example, the counting result is expressed as the number of blood vessels per square millimeter. Angiogenic activity can be determined by determining whether the number of blood vessels has increased statistically after treatment with certain cytokines and growth factors.

本明細書において用いられる「抗線維化作用」とは、ある因子が標的に作用したとき、その標的における線維症を抑制する能力をいう。抗線維化作用は、マッソントリクローム染色法により判定することができる。
マッソントリクローム染色法は以下のとおりである：マッソントリクローム染色では、鉄ヘマトキシリンで核が染められ、その後に拡散速度の大きい小色素分子（酸フクシン、ポンソーキシリジン）が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子（アニリン青）が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す。 As used herein, “antifibrotic effect” refers to the ability to suppress fibrosis at a target when a factor acts on the target. The anti-fibrotic effect can be determined by Masson trichrome staining method.
Masson's trichrome staining method is as follows: In Masson's trichrome staining, nuclei are dyed with iron hematoxylin, and then small diffusion molecules (acid fuchsin and ponsoxylysine) with a high diffusion rate enter the reticulopoies of cells. The large pigment molecule (aniline blue), which penetrates and then has a low diffusion rate, enters the crude structure of collagen fibers and dyes blue.

マッソントリクローム染色で使用される試薬
Ａ）媒染剤
10%トリクロル酢酸水溶液 1容
10%重クロム酸カリウム水溶液 1容
Ｂ）ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（使用時に1液と2液を等量混合）
１液
ヘマトキシリン 1ｇ
100%エタノール 100ml
２液
塩化第二鉄 2.0ｇ
塩酸（25％） 1ml
蒸留水 95ml
Ｃ）1%塩酸70%アルコール
Ｄ）I 液
1%ビーブリッヒスカーレット 90ml
1%酸性フクシン 10ml
酢酸 1ml
Ｅ）II液
リンモリブデン酸 5ｇ
リンタングステン酸 5ｇ
蒸留水 200ml
Ｆ）III液
アニリン青 2.5ｇ
酢酸 2ml
蒸留水 100ml
Ｇ）1%酢酸水
マッソントリクローム染色法の手順
1.脱パラ、水洗、蒸留水
2.媒染（10〜15分）
3.水洗（5分）
4.ワイゲルトの鉄ヘマトキシリン液（5分）
5.軽く水洗
6.1%塩酸70%アルコールで分別
7.色出し、水洗（10分）
8.蒸留水
9.I 液（2〜5分）
10.軽く水洗
11.II液（30分以上）
12.軽く水洗
13.III液（5分）
14.軽く水洗
15.1%酢酸水（5分）
16.水洗（すばやく）
17.脱水、透徹、封入。 Reagents used in Masson Trichrome staining A) Mordant
1 volume of 10% trichloroacetic acid aqueous solution
10% aqueous potassium dichromate solution 1 volume B) Weigert's iron hematoxylin solution (1 and 2 solutions are mixed in equal amounts during use)
1 liquid hematoxylin 1g
100ml ethanol 100ml
2 liquids
Ferric chloride 2.0g
Hydrochloric acid (25%) 1ml
Distilled water 95ml
C) 1% hydrochloric acid 70% alcohol D) Liquid I
1% Biebrich Scarlet 90ml
1% acid fuchsin 10ml
1ml acetic acid
E) II liquid Phosphomolybdic acid 5g
Phosphotungstic acid 5g
200ml distilled water
F) III liquid aniline blue 2.5g
Acetic acid 2ml
100ml distilled water
G) 1% acetic acid water Masson trichrome staining procedure
1. Deparalysis, water washing, distilled water
2.Mordant (10-15 minutes)
3. Washing with water (5 minutes)
4. Weigert's iron hematoxylin solution (5 minutes)
5. Lightly washed with water
Separation with 6.1% hydrochloric acid 70% alcohol
7. Coloring and washing (10 minutes)
8.Distilled water
9. Liquid I (2-5 minutes)
10. Lightly wash
11.II liquid (more than 30 minutes)
12. Lightly washed
13.III liquid (5 minutes)
14. Lightly wash
15.1% acetic acid water (5 minutes)
16. Washing with water (quickly)
17. Dehydrated, transparent, sealed.

マッソントリクローム染色法では、膠原線維、細網線維、糸球体基底膜は、鮮やかな青に染まり、核は黒紫色に染まり、細胞質は淡赤色に染まり、赤血球は橙黄色〜深紅色に染まり、粘液は青色に染まり、細胞分泌顆粒は好塩基性が青に好酸性が赤に染まり、線維素は赤に染まる。従って、青く染まった面積を線維化した部位として算出することができる。本明細書において、特定のサイトカインおよび増殖因子の処置後、線維症化した面積が統計学的に有意に減少しているか否かを判定することにより、抗線維化作用を判定することができる。   In Masson trichrome staining, collagen fibers, reticulofibers, glomerular basement membrane are dyed bright blue, nuclei are dyed black purple, cytoplasm is dyed light red, red blood cells are dyed orange yellow to crimson, Mucus stains blue, cell secretion granules stain basophile blue, acidophilic red stains, and fibrin stains red. Therefore, the area stained blue can be calculated as a fibrotic site. As used herein, an anti-fibrotic effect can be determined by determining whether the fibrotic area is statistically significantly reduced after treatment with certain cytokines and growth factors.

本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の併用療法においては、どのような細胞も使用され得る。本発明で使用される「細胞」は移植に適した形態で提供されることが好ましく、本明細書においてそのような細胞を「移植細胞」ともいう。   A “cell” as used herein is defined in the same way as the broadest meaning used in the art, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism, surrounded by a membrane structure that isolates the outside world, Refers to a living organism having self-regenerative ability and having genetic information and its expression mechanism. Any cell can be used in the combination therapy of the invention. The “cell” used in the present invention is preferably provided in a form suitable for transplantation, and such a cell is also referred to as “transplant cell” in the present specification.

本発明において、細胞は、幹細胞または分化した細胞であり得る。「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能を有し、組織が傷害を受けたときに再生することができる細胞をいう。本発明において使用される幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）または組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある（非特許文献２７）。従って、本発明の１つの好ましい実施形態では、細胞として胚性幹細胞が使用され得る。本発明の併用療法において胚性幹細胞が使用されるときは、予め心筋細胞へ分化させてから使用することもできる。心筋細胞への分化は、白血病阻害因子（ＬＩＦ）で処理することによって誘導することができる。   In the present invention, the cells can be stem cells or differentiated cells. “Stem cells” refer to cells that have the ability to self-replicate, have pluripotency, and can be regenerated when a tissue is damaged. Stem cells used in the present invention can be embryonic stem cells (ES) or tissue stem cells (also referred to as tissue-specific stem cells or somatic stem cells). Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine (Non-patent Document 27). Thus, in one preferred embodiment of the present invention, embryonic stem cells can be used as cells. When embryonic stem cells are used in the combination therapy of the present invention, they can be used after differentiation into cardiomyocytes in advance. Differentiation into cardiomyocytes can be induced by treatment with leukemia inhibitory factor (LIF).

組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。従って、本発明の１つの好ましい実施形態において、細胞として心臓組織へと方向付けられた組織幹細胞が使用され得る。   Unlike embryonic stem cells, tissue stem cells are cells in which the direction of differentiation is limited, are present at specific positions in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Tissue stem cells have a high nucleus / cytoplasm ratio and poor intracellular organelles. Tissue stem cells generally have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain proliferative ability over the life of the individual. Thus, in one preferred embodiment of the present invention, tissue stem cells directed to heart tissue as cells can be used.

組織幹細胞は、由来により、外胚葉、中胚葉、内胚葉由来の幹細胞に分類され得る。外胚葉由来の組織幹細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞が含まれる。中胚葉由来の組織幹細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞が含まれる。内胚葉由来の組織幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞、膵幹細胞が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、中胚葉由来の幹細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、間葉系幹細胞が使用され得る。   Tissue stem cells can be classified into ectoderm, mesoderm, and endoderm-derived stem cells according to origin. Tissue stem cells derived from ectoderm are mainly present in the brain and include neural stem cells. Tissue stem cells derived from mesoderm are mainly present in the bone marrow, and include hemangioblasts, hematopoietic stem cells, and mesenchymal stem cells. Endoderm-derived tissue stem cells exist mainly in organs, and include liver stem cells and pancreatic stem cells. In a preferred embodiment of the present invention, mesoderm-derived stem cells can be used. In a more preferred embodiment of the invention, mesenchymal stem cells can be used.

由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。心臓組織を構成する心筋細胞は間葉系幹細胞に由来することから、本発明の併用療法の１つの実施形態では、骨髄系の組織幹細胞が使用され得、本発明の併用療法の１つの好ましい実施形態では、間葉系幹細胞が好ましく使用され得る。   When classified according to the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, and nervous system. Examples of skin tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells. Examples of digestive tissue stem cells include pancreatic (common) stem cells and liver stem cells. Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Examples of nervous system tissue stem cells include neural stem cells and retinal stem cells. Since the cardiomyocytes constituting the heart tissue are derived from mesenchymal stem cells, in one embodiment of the combination therapy of the present invention, myeloid tissue stem cells can be used, and one preferred implementation of the combination therapy of the present invention. In the form, mesenchymal stem cells can be preferably used.

本明細書において「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明の１つの実施形態において、骨髄に由来する細胞（例えば、骨芽細胞）が使用され得る。本発明の好ましい実施形態においては、心筋細胞、骨格筋芽細胞、骨芽細胞のような間葉系幹細胞に由来する細胞が使用され得る。本発明のより好ましい実施形態では、心筋細胞が使用され得る。心筋細胞は、初代細胞でも、幹細胞などから分化誘導させた細胞でもよい。   As used herein, “differentiated cells” refers to cells with specialized functions and morphology (eg, muscle cells, nerve cells, etc.), and unlike stem cells, there is no or almost no pluripotency. . Examples of differentiated cells include epidermal cells, pancreatic parenchymal cells, pancreatic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, neurons, vascular endothelial cells, pigment cells, Examples include smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes. In one embodiment of the invention, cells derived from bone marrow (eg, osteoblasts) can be used. In a preferred embodiment of the present invention, cells derived from mesenchymal stem cells such as cardiomyocytes, skeletal myoblasts, osteoblasts can be used. In a more preferred embodiment of the invention, cardiomyocytes can be used. Cardiomyocytes may be primary cells or cells induced to differentiate from stem cells or the like.

本明細書において用いられる心筋原細胞は、幹細胞を５−アザシチジンで処理することにより作製することができる。心筋原細胞を得るためには以下のような処置を行うことができる。例えば、ラットなどの被検体から大腿骨の骨髄初代培養を作成し、５−アザシチジンで分化誘導する。分化誘導した細胞から自己拍動能を有する細胞をスクリーニングして心筋原細胞を得ることができる。   The cardiomyocyte used in the present specification can be prepared by treating stem cells with 5-azacytidine. In order to obtain myocardial progenitor cells, the following treatment can be performed. For example, a primary bone marrow bone marrow culture is prepared from a subject such as a rat and induced to differentiate with 5-azacytidine. A cardiomyocyte can be obtained by screening a cell having a self-pulsation ability from the differentiated cell.

本発明の併用療法で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合同種異系由来であってもよい。   The cells used in the combination therapy of the present invention may be derived from the same strain (derived from the self (autologous)), derived from the same species (derived from other individuals (other families)), or derived from different species. Self-derived cells are preferred because rejection is considered, but they may be allogeneic if rejection is not a problem.

本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（例えば、脊椎動物、無脊椎動物）でもよい。好ましくは、脊椎動物由来の細胞が用いられ、より好ましくは、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）由来の細胞が用いられる。さらに好ましくは、霊長類由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。   The cells used in the present invention may be cells derived from any organism (for example, vertebrates and invertebrates). Preferably, cells derived from vertebrates are used, and more preferably cells derived from mammals (for example, primates, rodents, etc.) are used. More preferably, cells derived from primates are used. Most preferably, human-derived cells are used.

本発明が対象とする組織は、生物のどの臓器または器官でもよい。本明細書において臓器または器官とは、互換的に用いられ、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。一般に多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような臓器または器官としては、血管系に関連する臓器または器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする器官は、虚血性または糖尿病性の器官（脳虚血、虚血性の脳梗塞を患った脳、心筋梗塞を起こした心臓、虚血を起こした骨格筋など）が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする器官は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢、網膜などが挙げられる。１つの好ましい実施形態では、本発明が対象とする器官は、心臓である。   The tissue targeted by the present invention may be any organ or organ of an organism. In this specification, an organ or an organ is used interchangeably, and refers to a structure in which a function of a living individual is localized and operated in a specific part of the individual, and that part is morphologically independent. Say. In general, in a multicellular organism (eg, animal, plant), an organ is composed of several tissues having a specific spatial arrangement, and the tissue is composed of many cells. Such organs or organs include organs or organs associated with the vascular system. In one embodiment, an organ targeted by the present invention is an ischemic or diabetic organ (cerebral ischemia, brain with ischemic cerebral infarction, heart with myocardial infarction, ischemic skeleton. Muscle). Preferably, organs targeted by the present invention include heart, brain, lung, pancreas, liver, limb periphery, retina and the like. In one preferred embodiment, the organ targeted by the present invention is the heart.

本発明が対象とする組織および使用する細胞の組合せとしては、例えば、心疾患（例えば、虚血性心疾患）を起こした心臓への心筋細胞の投与、脳虚血または脳梗塞を起こした脳への神経細胞、神経細胞へ分化可能な細胞または神経前駆細胞の投与、心筋梗塞、骨格筋虚血部位への血管内皮細胞または血管内皮細胞に分化可能な細胞の投与が挙げられる。   Examples of the combination of the tissue to be used by the present invention and the cells to be used include, for example, administration of cardiomyocytes to the heart in which heart disease (for example, ischemic heart disease) has occurred, brain to which brain ischemia or cerebral infarction has occurred. Administration of cells that can be differentiated into neurons, neural progenitor cells, myocardial infarction, vascular endothelial cells or cells that can differentiate into vascular endothelial cells at the site of skeletal muscle ischemia.

本発明が対象とする組織は、どのような種類の生物由来であり得る。本発明が対象とする生物としては、脊椎動物または無脊椎動物が挙げられる。好ましくは、本発明が対象とする生物は、哺乳動物（例えば、霊長類、齧歯類など）である。より好ましくは、本発明が対象とする生物は、霊長類である。最も好ましくは、本発明はヒトを対象とする。   The tissue targeted by the present invention can be derived from any kind of organism. Examples of organisms targeted by the present invention include vertebrates and invertebrates. Preferably, the organism targeted by the present invention is a mammal (eg, primate, rodent, etc.). More preferably, the organism targeted by the present invention is a primate. Most preferably, the present invention is directed to humans.

本発明の併用療法において、細胞生理活性物質（サイトカイン、増殖因子など）はどのような形態でも送達され得る。従って、細胞生理活性物質は、タンパク質形態でも核酸形態でもよく、最終的に機能する細胞生理活性物質（サイトカインおよび増殖因子の場合はタンパク質形態）が標的に送達される限り、他の形態も可能である。本発明の併用療法ではまた、細胞生理活性物質はどのような経路でも送達され得る。細胞生理活性物質が機能するとは、細胞生理活性物質の少なくとも１つの上述した機能（例えば、細胞増殖活性、血管新生作用、抗線維化作用など）を少なくとも一つ発揮することをいう。   In the combination therapy of the present invention, the cell physiologically active substance (cytokine, growth factor, etc.) can be delivered in any form. Thus, the cell bioactive substance may be in protein or nucleic acid form, and other forms are possible as long as the final functioning cell bioactive substance (protein form in the case of cytokines and growth factors) is delivered to the target. is there. Also in the combination therapy of the present invention, the cell bioactive agent can be delivered by any route. The function of the cell physiologically active substance means that at least one of the above-mentioned functions (for example, cell proliferation activity, angiogenesis action, antifibrotic action, etc.) of the cell physiologically active substance is exhibited.

タンパク質形態の場合、直接または間接的に送達され得る。直接投与する場合は、タンパク質形態の細胞生理活性物質を直接処置部位に投与し得る。間接的に送達する場合は、目的とするタンパク質形態の細胞生理活性物質が最終的に処置部位に送達される、当該分野において公知の任意の方法を使用することができる。そのような方法としては、注射により注入を用いる投与方法が挙げられる。   In the case of protein form, it can be delivered directly or indirectly. When administered directly, the protein form of the cell bioactive substance can be administered directly to the treatment site. For indirect delivery, any method known in the art can be used in which the desired protein form of the cell bioactive agent is ultimately delivered to the treatment site. Such methods include administration methods that use infusion by injection.

本発明の併用療法において、細胞生理活性物質の投与は、細胞移植と同時でもよく、細胞生理活性物質投与が細胞移植前でも細胞生理活性物質が細胞移植後でもよい。細胞生理活性物質が細胞移植より前であることが好ましい。   In the combination therapy of the present invention, the cell physiologically active substance may be administered at the same time as the cell transplantation, and the cell physiologically active substance may be administered before or after the cell transplantation. It is preferable that the cell physiologically active substance is before cell transplantation.

本明細書において「再生」とは、損傷した組織が元通りに回復することをいい、病理的再生ともいう。生物の体は一生の間に外傷や病気によって臓器の一部を失ったり、大きな傷害を受けたりする。その場合、損傷した臓器が再生できるか否かは、臓器によって（または動物種によって）異なる。自然には再生できない臓器（または組織）を再生させ、機能を回復させようというのが再生医学である。組織が再生したかどうかは、その機能が改善したかにどうかによって判定することができる。哺乳動物は、組織・器官を再生する力をある程度備えている（例えば、皮膚および肝臓の再生）。しかし、心臓を含むほとんどの器官は、一旦損傷すると、哺乳動物はほとんど再生させることができない。従って、例えば、心臓組織が損傷した場合、従来は心臓移植による処置しか有効な措置がなかった。本発明は、心臓などの臓器の組織を「再生させる」画期的な方法を提供するという有用性および格別の効果を提供する。   As used herein, “regeneration” means that damaged tissue is restored to its original state, and is also referred to as pathological regeneration. The body of an organism loses a part of its organ or suffers a major injury during a lifetime due to trauma or disease. In that case, whether or not a damaged organ can be regenerated depends on the organ (or animal species). Regenerative medicine is to regenerate organs (or tissues) that cannot be regenerated naturally and restore their functions. Whether an organization has regenerated can be determined by whether its function has improved. Mammals have a certain level of power to regenerate tissues and organs (for example, regeneration of skin and liver). However, most organs including the heart, once damaged, can hardly be regenerated by mammals. Therefore, for example, when the heart tissue is damaged, conventionally, only the treatment by the heart transplantation has been effective. The present invention provides the utility and exceptional effect of providing an innovative method of “regenerating” tissue of an organ such as the heart.

本明細書において「器官への移入に適した」とは、器官（例えば、心臓）に細胞を移植をするために適切な任意の形態をいう。そのような形態は当該分野において公知であり、そのような方法としては、例えば、注射器を使用して細胞を注入する方法が挙げられる。当業者は、例えば、日本薬局方、米国薬局方などを参照して容易にその形態を調製することができる。細胞生理活性物質の「心臓への移入に適した」としては、例えば、リポソーム形態が挙げられる。   As used herein, “suitable for organ transfer” refers to any form suitable for transplanting cells into an organ (eg, heart). Such forms are known in the art, and examples of such methods include a method of injecting cells using a syringe. Those skilled in the art can easily prepare the form with reference to, for example, the Japanese Pharmacopoeia and the US Pharmacopoeia. Examples of “suitable for transfer to the heart” of a cell physiologically active substance include a liposome form.

本発明の併用療法が対象とする「疾患」は、組織に傷害がある任意の心疾患であり得る。そのような心疾患としては、心不全、心筋梗塞、心筋症などが挙げられる。本発明の併用療法は、組織傷害の再生を目的とする限り、心臓以外の臓器の傷害を再生するためにも適用され得る。特定の実施形態において、本発明の方法が対象とする疾患は、難治性心不全である。   The “disease” targeted by the combination therapy of the present invention can be any heart disease in which tissue is damaged. Such heart diseases include heart failure, myocardial infarction, cardiomyopathy and the like. The combination therapy of the present invention can also be applied to regenerate damage to organs other than the heart as long as the purpose is to regenerate tissue damage. In a specific embodiment, the disease targeted by the method of the present invention is refractory heart failure.

「心不全」とは、心機能不全、循環機能不全、収縮力減退など心臓自体に障害があって、全身の臓器へ必要な量および質の血液を循環し得なくなった状態をいう。心不全は、心筋梗塞、心筋症などの心臓疾患の末期の症状である。重症心不全とは、その程度が重症であるものをいい、末期心不全ともいう。   “Heart failure” refers to a condition in which the heart itself is damaged, such as cardiac dysfunction, circulatory dysfunction, and contraction force decline, and a necessary amount and quality of blood cannot be circulated to organs throughout the body. Heart failure is a terminal symptom of heart diseases such as myocardial infarction and cardiomyopathy. Severe heart failure means that the degree is severe and is also called end-stage heart failure.

「難治性心不全」とは、内科的治療、薬物治療では改善が困難な治療抵抗性心不全をいい、慢性心不全または末期的心不全とほぼ同義に用いられる。このような難治性心不全は、通常のジギタリス薬、利尿薬、ＡＣＥ阻害薬などを用いるトリプルセラピー、β遮断薬を加えた薬物治療ではコントロールできない。これらの治療には、ＩＡＢＰ（ｉｎｔｒａ−ａｏｒｔｉｃ ｂａｌｌｏｏｎ ｐｕｍｐｉｎｇ）またはＰＣＰＳ（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｕｐｐｏｒｔ）などによる機械的循環補助、あるいは心臓移植を必要とすることから、簡便でかつ根本的な治療の開発が求められていた。特に、心臓移植は、ドナー不足が深刻であり、心臓移植適応除外症例（たとえば、高齢者、透析症例など）の場合は難治性心不全は大きな問題となっており、心臓移植代替治療が切望されている。   “Refractory heart failure” refers to treatment-resistant heart failure that is difficult to improve by medical treatment or drug treatment, and is used almost synonymously with chronic heart failure or end-stage heart failure. Such intractable heart failure cannot be controlled by triple therapy using conventional digitalis drugs, diuretics, ACE inhibitors, etc., or drug treatment with β-blockers. These treatments require mechanical circulatory support such as IABP (intra-aural ballon pumping) or PCPS (percutaneous cardiopulmonary support), or heart transplantation, and therefore the development of simple and fundamental treatment is required. It was. In particular, heart transplantation has a serious shortage of donors, and refractory heart failure has become a major problem in cases exempted from heart transplantation (for example, elderly people, dialysis cases, etc.). Yes.

「心筋梗塞」とは、冠状動脈の種々の病変による高度狭窄、閉塞によってその灌流領域に虚血性壊死が生じる疾患である。心筋梗塞の重傷度判定には、種々の分類がある。そのような分類としては、例えば、時間的経過による分類、形態学的分類（心筋層内範囲、部位、壊死の大きさなど）、心筋の壊死形態、梗塞後の心室再構築、血行動態的分類（治療、予後などに関連する）、臨床的重症度による分類などが挙げられる。ここで重症度が高いものを特に重症心筋梗塞という。   “Myocardial infarction” is a disease in which ischemic necrosis occurs in the perfusion region due to severe stenosis and occlusion due to various lesions of the coronary artery. There are various classifications for determining the severity of myocardial infarction. Such classification includes, for example, classification by time course, morphological classification (intramyocardial range, site, size of necrosis, etc.), myocardial necrosis, ventricular reconstruction after infarction, hemodynamic classification (Related to treatment, prognosis, etc.), classification by clinical severity, etc. Those with a high degree of severity are particularly called severe myocardial infarction.

「心筋症」とは、心筋の器質的および機能的な異常に起因する疾患の総称であり、高血圧、代謝異常症、虚血などの基礎疾患に続発する二次性心筋症、および見かけ上の基礎疾患なしに発症する突発性心筋症に分類される。病理的変化としては、心筋肥大、線維化、変性などが認められる。   “Cardiomyopathy” is a general term for diseases caused by organic and functional abnormalities of the myocardium, secondary cardiomyopathy secondary to basic diseases such as hypertension, metabolic disorders and ischemia, and apparent Classified as idiopathic cardiomyopathy that develops without underlying disease. Pathological changes include myocardial hypertrophy, fibrosis, and degeneration.

「拡張型心筋症」とは、左室の拡張を伴った左心室の機能不全をいい、「うっ血性心筋症」とも言われる。本明細書において「ＤＣＭ」（dilated cardiomyopathy）と略することがある。拡張型心筋症では、収縮不全が伴い、慢性心不全をきたす。病因としては、たとえば、ウイルス感染、遺伝子変異など多様なものが挙げられる。一般的には、他に明らかな一義的原因のある虚血性心筋症、代謝異常などに伴う心筋疾患などの特定心筋疾患（従来、二次性心筋疾患と称されていた疾患）は含まれないとされるが、本発明の目的では、その治療効果が示される限り、本発明の範囲内に入る。大部分の患者は全体に収縮力低下を示すが孤立性に部分的壁運動異常が起こることもあるといわれる。通常はうっ血を伴う心不全徴候を示すが，低心拍出量状態を現す倦怠感を示すこともある。拡張型心筋症は、原因不明で、特発性の心筋疾患である。主な病態は心筋収縮力の低下であり、その結果左室内腔の拡大をきたす。左室拍出血液量の減少、左室拡張期圧の上昇などを起こす。発症は急性または潜行性であり、末期では難治性心不全を呈することが多い。病理組織学的には，びまん性にあるいは局所的に心筋組織の変性、線維化、萎縮が認められる。残存心筋細胞が肥大している例も多い。心不全のほか重篤な不整脈、血栓塞栓症をきたし，予後はきわめて不良である。診断上とくに有用なものは心エコー図であり、びまん性壁運動の低下、心室壁の菲薄化、心室内腔の拡大を証明する。これに冠動脈造影術にて冠動脈病変の否定、心筋生検（心筋バイオプシー）を行うことによりより確実に診断することができる。従って、本発明では、心臓超音波検査、心臓カテーテル検査、核医学検査（心筋シンチ検査）、心筋生検など当該分野において周知の検査手法を行うことによって拡張型心筋症の改善を確認することができる。   “Dilated cardiomyopathy” refers to dysfunction of the left ventricle with dilation of the left ventricle and is also referred to as “congestive cardiomyopathy”. In this specification, it may be abbreviated as “DCM” (dilated cardiomyopathy). In dilated cardiomyopathy, systolic failure is accompanied by chronic heart failure. Examples of the etiology include various things such as viral infection and gene mutation. In general, specific myocardial diseases such as ischemic cardiomyopathy and other myocardial cardiomyopathy with metabolic causes are not included (diseases previously called secondary cardiomyopathy) However, for the purpose of the present invention, it is within the scope of the present invention as long as the therapeutic effect is shown. Most patients show reduced contractile force overall, but it is said that partial wall motion abnormalities may occur in isolation. It usually presents with signs of heart failure with congestion, but may also exhibit fatigue that presents with low cardiac output. Dilated cardiomyopathy is an idiopathic myocardial disease of unknown cause. The main pathological condition is a decrease in myocardial contractility, resulting in enlargement of the left ventricular cavity. Reduces left ventricular blood volume and increases left ventricular diastolic pressure. Onset is acute or insidious and often presents with intractable heart failure at the end. Histopathologically, diffuse or localized myocardial tissue degeneration, fibrosis, and atrophy are observed. In many cases, the remaining cardiomyocytes are enlarged. In addition to heart failure, severe arrhythmia and thromboembolism occur, and the prognosis is extremely poor. Particularly useful for diagnosis are echocardiograms, which demonstrate reduced diffuse wall motion, thinning of the ventricular wall, and enlargement of the intraventricular lumen. This can be diagnosed more reliably by performing coronary angiography denial of coronary artery lesion and performing myocardial biopsy (myocardial biopsy). Therefore, in the present invention, improvement of dilated cardiomyopathy can be confirmed by performing well-known inspection techniques in the art such as cardiac ultrasound examination, cardiac catheter examination, nuclear medicine examination (myocardial scintigraphy), myocardial biopsy, etc. it can.

従来、拡張型心筋症では、ＡＣＥ阻害薬、利尿薬、β遮断薬、強心薬などによる薬物療法、塩分・水分摂取制限、運動制限などの生活指導が行われているが、いずれも疾患そのもののに対する治療ではない。不整脈に対してはアミオダロンなどの抗不整脈投与が行われているが、これも対症療法としかなり得ない。血栓、塞栓にはワルファリンなどの抗凝固薬が使用されるが、これも対症療法に過ぎない。外科的療法として、ペースメーカー、埋め込み型除細動器、補助循環装置（バイパス）、心臓移植などが行われているが、心臓移植以外は根治的とはいえず、ドナー不足が深刻な現在、心臓移植にも限界が存在する。本発明の治療技術は、このような拡張型心筋症などにも有効であり、画期的な治療効果をもたらす。   Conventionally, in dilated cardiomyopathy, ACE inhibitors, diuretics, β-blockers, cardiotherapy with cardiotonic drugs, etc., lifestyle guidance such as salt / water intake restriction, exercise restriction, etc. have been conducted, but all of them are of the disease itself It is not treatment for. Antiarrhythmic drugs such as amiodarone have been administered for arrhythmia, but this is also not a symptomatic treatment. Anticoagulants such as warfarin are used for blood clots and emboli, but this is only symptomatic treatment. Surgical therapy includes pacemakers, implantable defibrillators, auxiliary circulators (bypasses), heart transplants, etc., but other than heart transplants are not radical, and the current shortage of donors is serious. There are also limitations to transplantation. The therapeutic technique of the present invention is also effective for such dilated cardiomyopathy and the like, and brings about an epoch-making therapeutic effect.

「肥大型心筋症」（hypertrophic cardiomyopathy；HCM）は、心筋の異常な肥厚および左心室肥大による拡張期コンプライアンスの低下を主な症状とする心筋症をいう。心収縮機能は通常保たれている。５年および10年の生存率は、それぞれ約90％、約80％であり、良好であるが、突然死の原因とされており、臨床上の問題となっていることから、その根治的治療が求められている。本発明の治療技術は、このような肥大型心筋症などにも有効であり、画期的な治療効果をもたらす。   “Hypertrophic cardiomyopathy” (HCM) refers to cardiomyopathy whose main symptoms are abnormal myocardial thickening and reduced diastolic compliance due to left ventricular hypertrophy. The systolic function is usually maintained. The survival rates at 5 and 10 years are about 90% and about 80%, respectively, which are good, but they are the cause of sudden death. Is required. The treatment technique of the present invention is also effective for such hypertrophic cardiomyopathy, and brings about a breakthrough therapeutic effect.

「拡張相肥大型心筋症」とは、肥大型心筋症のうち、経過中に心筋の線維化が進み、心室壁の菲薄化、収縮力の低下が生じ、心室内腔の拡張をきたして拡張型心筋症のような症状を呈したものをいう。きわめて予後不良といわれているが、無症状のものも多数存在しており、臨床上の問題となっている。従って、この拡張相肥大型心筋症もまた、根治的治療が求められている。本発明の治療技術は、このような拡張相肥大型心筋症などにも有効であり、画期的な治療効果をもたらす。   "Expansive phase hypertrophic cardiomyopathy" is a hypertrophic cardiomyopathy, in which the myocardial fibrosis progresses, the ventricular wall thins, the contractile force decreases, and the ventricular chamber dilates and expands Refers to those with symptoms such as dilated cardiomyopathy. Although it is said to have a very poor prognosis, there are many asymptomatic ones, which is a clinical problem. Therefore, this dilated phase hypertrophic cardiomyopathy also requires radical treatment. The treatment technique of the present invention is also effective for such dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and the like, and brings about a breakthrough therapeutic effect.

上述のような難治性心不全の従来の治療および診断法などについては、非特許文献３５などに記載されている。つい最近に刊行された非特許文献３５に記載されているように、難治性心不全については、根治的治療法がなく、本発明はこのような心疾患、特に難治性心不全に対して初めて治療法を提供したという効果を奏する。   The conventional treatment and diagnosis methods for intractable heart failure as described above are described in Non-Patent Document 35 and the like. As described in non-patent document 35 published recently, there is no cure for refractory heart failure, and the present invention is the first treatment for such heart disease, particularly refractory heart failure. There is an effect of providing.

本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないようにするか、そのような状態を低減した状態で生じさせるかまたはその状態が起こることを遅延させるように処置することをいう。   As used herein, “prophylaxis” or “prevention” refers to a certain disease or disorder that prevents or reduces such a condition before it is triggered. Treatment that occurs in a condition or delays the occurrence of the condition.

本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。本明細書では「根治的治療」とは、病的過程の根源または原因の根絶を伴う治療をいう。従って、根治的治療がなされる場合は、原則として、その疾患の再発はなくなる。   As used herein, “treatment” refers to preventing a disease or disorder from deteriorating, preferably maintaining the status quo, more preferably reducing, when a certain disease or disorder becomes such a condition. Preferably, it means that it is reduced. As used herein, “curative treatment” refers to treatment involving the eradication of the root or cause of a pathological process. Therefore, when a radical treatment is given, in principle, the disease will not recur.

本明細書において「予後」とは、予後の処置ともいい、ある疾患または障害について、治療後の状態を診断または処置することをいう。   As used herein, “prognosis” is also referred to as prognosis treatment, and refers to diagnosing or treating a post-treatment condition for a certain disease or disorder.

（発明を実施する最良の形態）
本発明は、１つの局面において、生物の器官の組織を再生するための組成物を提供する。この組成物は、細胞生理活性物質および細胞を、器官への移入に適した形態で含む。 (Best Mode for Carrying Out the Invention)
In one aspect, the present invention provides a composition for regenerating tissue of an organism's organs. The composition comprises a cytophysiologically active substance and cells in a form suitable for transfer to an organ.

別の局面において、本発明は、生物の器官の疾患を治療するための組成物を提供する。この組成物は、細胞生理活性物質および細胞を、上記器官への移入に適した形態で含む。本発明では、特に、心疾患（特に、難治性心疾患）を治療するための組成物および方法を提供する。従って、細胞生理活性物質および細胞は、心疾患を処置するに適した形態で提供されることが好ましい。   In another aspect, the present invention provides a composition for treating a disease of an organism's organs. The composition comprises a cytophysiologically active substance and cells in a form suitable for transfer to the organ. In particular, the present invention provides compositions and methods for treating heart disease, particularly refractory heart disease. Therefore, it is preferable that the cell physiologically active substance and the cell are provided in a form suitable for treating a heart disease.

別の局面において、本発明は、生物の器官の組織を再生するためのキットを提供する。このキットは、細胞生理活性物質；細胞；ならびに上記細胞生理活性物質および上記細胞の生物の器官への移植に関する指示書を備える。ここで、上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の生物の器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。   In another aspect, the present invention provides a kit for regenerating an organ tissue of an organism. The kit comprises a cell bioactive substance; a cell; and instructions for transplantation of the cell bioactive substance and the cell into an organ of an organism. Here, the instruction manual describes a word indicating that the cell physiologically active substance is administered before, simultaneously with, or after transplantation of the cell into an organ of a living organism. This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the United States) where the present invention is implemented, and is approved by the supervisory authority. It is clearly stated that it has been received. The instruction is a so-called package insert and is usually provided as a paper medium, but is not limited thereto. For example, a form such as an electronic medium (for example, a homepage or e-mail provided on the Internet) is used. But it can be provided.

別の局面において、本発明は、生物の器官の疾患を治療するためのキットを提供する。このキットは、細胞生理活性物質；細胞；ならびに上記細胞生理活性物質および上記細胞の上記器官への移植に関する指示書、を備える。ここで、上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の上記器官への移植の前、同時または後に投与することを指示する。本発明では、特に、心疾患（特に、難治性心疾患）を治療するためのキットを提供する。従って、細胞生理活性物質および細胞は、心疾患を処置するに適した形態で提供されることが好ましい。このようなキットは、医療機関内で細胞が取得される場合には、細胞に代えて細胞を取得する指示書が添付されていてもよい。そのような場合、細胞は宿主（患者）の自己細胞であり得る。   In another aspect, the present invention provides a kit for treating diseases of an organ of an organism. The kit comprises a cell bioactive substance; a cell; and instructions for transplantation of the cell bioactive substance and the cell into the organ. Here, the instructions indicate that the cell physiologically active substance is administered before, simultaneously with, or after transplantation of the cells into the organ. In particular, the present invention provides a kit for treating heart disease (particularly refractory heart disease). Therefore, it is preferable that the cell physiologically active substance and the cell are provided in a form suitable for treating a heart disease. When such cells are obtained in a medical institution, instructions for obtaining the cells may be attached instead of the cells. In such cases, the cell may be a host (patient) autologous cell.

本発明の組成物およびキットは、通常は医師の監督のもとで実施されるが、その国の監督官庁および法律が許容する場合は、医師の監督なしに実施することができる。   The compositions and kits of the present invention are usually performed under the supervision of a physician, but may be practiced without the supervision of a physician if the national supervisory authority and law allow.

別の局面において、本発明は、生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための薬学的組成物であって、細胞生理活性物質を含む薬学的組成物を提供する。細胞生理活性物質は、従来、単独で用いられており、細胞とともに投与されることはほとんど無かった。本発明では、予想外に、細胞とともに投与することによって心臓の再生が促進され、難治性心不全の治癒をそれぞれを単独で投与したときよりもはるかに（統計学的に優位な改善を伴って）促進したという効果を奏する。従って、本発明は、心疾患の治療、予防または予後のために、細胞とともに投与するという、細胞生理活性物質の新たな用途を見出したことになる。   In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for administration with a cell for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism, comprising a cell bioactive substance. Conventionally, a cell physiologically active substance has been used singly and was hardly administered together with cells. In the present invention, unexpectedly, administration with cells promotes the regeneration of the heart, much more (with statistically significant improvements) than when each of the refractory heart failure cures is administered alone. It has the effect of promoting. Therefore, the present invention has found a new use of a cell physiologically active substance that is administered together with cells for the treatment, prevention or prognosis of heart disease.

他の局面では、本発明は、生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための、細胞生理活性物質の使用を提供する。この用途は上述のように、新たな用途であり、従来の単独投与の効果からは予測できなかったものである。   In another aspect, the present invention provides the use of a cell bioactive substance for administration with cells for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease. As described above, this use is a new use and could not be predicted from the effect of conventional single administration.

さらに別の局面において、本発明は、生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するためのキットであって、細胞生理活性物質；および細胞生理活性物質と細胞とを投与する方法を記載する指示書を含むキットを提供する。ここで、上記指示書は、上記細胞生理活性物質を上記細胞の生物の心臓または心臓へと供給される身体部位への移植の前、同時または後に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。   In yet another aspect, the present invention is a kit for administration with a cell for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism, comprising administering a cell physiologically active substance; and the cell physiologically active substance and the cell A kit is provided that includes instructions describing the method. Here, the above-mentioned instruction manual describes a word indicating that the cell physiologically active substance is administered before, simultaneously with, or after transplantation of the cell biological body to the heart or a body part supplied to the heart. . This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the United States) where the present invention is implemented, and is approved by the supervisory authority. It is clearly stated that it has been received. The instruction is a so-called package insert and is usually provided as a paper medium, but is not limited thereto. For example, a form such as an electronic medium (for example, a homepage or e-mail provided on the Internet) is used. But it can be provided.

１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、サイトカインまたは増殖因子であり得る。１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有し得る。別の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有し得る。   In one embodiment, the cell bioactive substance can be a cytokine or a growth factor. In one embodiment, the cell physiologically active substance may have hematopoietic activity, colony stimulating activity, or cell proliferation activity. In another embodiment, the cell bioactive substance may have hematopoietic activity or colony stimulating activity. Preferably, the cell physiologically active substance may have cell proliferation activity.

別の好ましい実施形態において、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の両方を有し得る。   In another preferred embodiment, the cell physiologically active substance may have at least one activity of angiogenic activity and antifibrotic activity. More preferably, the cell physiologically active substance can have both angiogenic activity and anti-fibrotic effect.

他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔであり得る。   In another embodiment, the cell physiologically active substance may have a kinase receptor as a receptor. More preferably, the cell physiologically active substance can have a tyrosine kinase type receptor as a receptor. Preferably, the cell physiologically active substance may have c-met as its receptor.

他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦであり得る。他の好ましい実施形態では上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦであり得る。   In another embodiment, the cell bioactive substance can be selected from the group consisting of FGF, HGF and VEGF. Preferably, the cell physiologically active substance may be HGF. In another preferred embodiment, the cell physiologically active substance can be VEGF.

本発明で用いる細胞生理活性物質は、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦなどを含め、公知の物質であり、医薬として使用することができる程度に精製された物であれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。市販されている細胞生理活性物質製剤を使用してもよい（例えば、東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１（ＨＧＦ）など）。   The cell physiologically active substances used in the present invention are known substances including HGF, VEGF, FGF, etc., and can be prepared by various methods as long as they are purified to the extent that they can be used as pharmaceuticals. Can be used. Commercially available cell physiologically active substance preparations may be used (for example, Toyobo No. HGF-101 (HGF)).

タンパク質形態の細胞生理活性物質を製造する方法としては、例えば、その細胞生理活性物質を産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりその細胞生理活性物質を得ることができる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、その細胞生理活性物質をコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換え細胞生理活性物質を得ることができる（例えば、特許文献１、非特許文献３２）。上記宿主細胞は、機能性細胞生理活性物質を発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞生理活性物質は、天然型の細胞生理活性物質と実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。   As a method for producing a cell physiologically active substance in protein form, for example, a primary cultured cell or a cell line that produces the cell physiologically active substance is cultured, and the cell physiologically active substance is isolated or purified from the culture supernatant. An active substance can be obtained. Alternatively, using a gene manipulation technique, a gene encoding the cell physiologically active substance is incorporated into an appropriate expression vector, and an expression host is transformed using the gene, and a recombinant cell is transformed from the culture supernatant of the transformed cell. A physiologically active substance can be obtained (for example, Patent Document 1, Non-Patent Document 32). The host cell is not particularly limited as long as it expresses a functional cell physiologically active substance, and various host cells conventionally used in genetic manipulation (for example, E. coli, yeast, animal cells, etc.) are used. Is possible. As long as the cell physiologically active substance thus obtained has substantially the same action as that of the natural cell physiologically active substance, one or more amino acids in the amino acid sequence are substituted, added and / or deleted. The sugar chain may be substituted, added and / or deleted.

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。   Certain amino acids can be substituted for other amino acids in a protein structure, such as, for example, a cationic region or a binding site of a substrate molecule, without an apparent reduction or loss of interaction binding capacity. It is the protein's ability to interact and the nature that defines the biological function of a protein. Thus, specific amino acid substitutions can be made in the amino acid sequence or at the level of its DNA coding sequence, resulting in proteins that still retain their original properties after substitution. Thus, various modifications can be made in the peptide disclosed herein or in the corresponding DNA encoding this peptide without any apparent loss of biological utility.

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（非特許文献３３）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。   In designing such modifications, the hydrophobicity index of amino acids can be considered. The importance of the hydrophobic amino acid index in providing interactive biological functions in proteins is generally recognized in the art (Non-patent Document 33). The hydrophobic nature of amino acids contributes to the secondary structure of the protein produced and then defines the interaction of the protein with other molecules (eg, enzymes, substrates, receptors, DNA, antibodies, antigens, etc.). Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on their hydrophobicity and charge properties. They are: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1 .8); Glycine (−0.4); Threonine (−0.7); Serine (−0.8); Tryptophan (−0.9); Tyrosine (−1.3); Proline (−1.6) ); Histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9) And arginine (-4.5)).

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。特許文献２（米国特許第４、５５４、１０１号）に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。   It is well known in the art that one amino acid can be replaced by another amino acid having a similar hydrophobicity index and still result in a protein having a similar biological function (eg, an equivalent protein in enzymatic activity). It is. In such amino acid substitution, the hydrophobicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5. It is understood in the art that such amino acid substitutions based on hydrophobicity are efficient. As described in US Pat. No. 4,554,101, the following hydrophilicity indices have been assigned to amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); Aspartic acid (+ 3.0 ± 1); Glutamic acid (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (−0. 4); proline (-0.5 ± 1); alanine (-0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1. 5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). It is understood that an amino acid can be substituted with another that has a similar hydrophilicity index and can still provide a biological equivalent. In such amino acid substitution, the hydrophilicity index is preferably within ± 2, more preferably within ± 1, and even more preferably within ± 0.5.

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。   In the present invention, “conservative substitution” refers to a substitution in which the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of the amino acid to be replaced with the original amino acid are similar as described above. Examples of conservative substitutions are well known to those skilled in the art and include, for example, substitutions within the following groups: arginine and lysine; glutamic acid and aspartic acid; serine and threonine; glutamine and asparagine; and valine, leucine, and isoleucine; However, it is not limited to these.

本明細書中において、機能的に等価なペプチドフルクトース化合物を作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。   As used herein, in addition to amino acid substitutions, amino acid additions, deletions, or modifications can also be made to produce functionally equivalent peptide fructose compounds. Amino acid substitution means that the original peptide is substituted with one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids. The addition of amino acids means that one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added to the original peptide chain. Deletion of amino acids means deletion of one or more, for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids from the original peptide. Amino acid modifications include, but are not limited to, amidation, carboxylation, sulfation, halogenation, alkylation, glycosylation, phosphorylation, hydroxylation, acylation (eg, acetylation), and the like. The amino acid to be substituted or added may be a natural amino acid, a non-natural amino acid, or an amino acid analog. Natural amino acids are preferred.

用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。   The term “peptide analog” refers to a compound that is different from a peptide but is equivalent to the peptide in at least one chemical or biological function. Thus, peptide analogs include those in which one or more amino acid analogs are added or substituted to the original peptide. Peptide analogs have the same function as the original peptide (for example, similar pKa values, similar functional groups, similar binding modes with other molecules, Such additions or substitutions are made so as to be substantially similar to (eg, similarity in sex). Such peptide analogs can be made using techniques well known in the art.

本明細書において使用される細胞生理活性物質の核酸形態は、その細胞生理活性物質のタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。この核酸分子は、発現される細胞生理活性物質が天然型の細胞生理活性物質と実質的に同一の活性を有する限り、上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、細胞生理活性物質をコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、その細胞生理活性物質と実質的に同一の機能を有する細胞生理活性物質をコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。   As used herein, a nucleic acid form of a cell physiologically active substance refers to a nucleic acid molecule that can express the protein form of the cell physiologically active substance. As long as the cell bioactive substance to be expressed has substantially the same activity as the natural cell bioactive substance, a part of the nucleic acid molecule is deleted or other bases as described above. It may be substituted, or another nucleic acid sequence may be partially inserted. Alternatively, another nucleic acid may be bound to the 5 'end and / or the 3' end. Alternatively, it may be a nucleic acid molecule that hybridizes under stringent conditions with a gene encoding a cell physiologically active substance and encodes a cell physiologically active substance having substantially the same function as the cell physiologically active substance. Such genes are known in the art and can be used in the present invention.

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。   Such a nucleic acid can be obtained by a well-known PCR method, and can also be chemically synthesized. These methods may be combined with, for example, a site-specific displacement induction method or a hybridization method.

別の実施形態では、本発明で使用される細胞生理活性物質は、合成された物質である。合成物質がペプチドまたは核酸である場合、ペプチド自動合成器または核酸自動合成器のような自動化された機器を用いて合成することができる。   In another embodiment, the cell physiologically active substance used in the present invention is a synthesized substance. When the synthetic substance is a peptide or a nucleic acid, it can be synthesized using an automated instrument such as an automatic peptide synthesizer or an automatic nucleic acid synthesizer.

他の実施形態において、上記細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または組織幹細胞）または分化した細胞であり得る。   In other embodiments, the cells can be stem cells (eg, embryonic stem cells or tissue stem cells) or differentiated cells.

別の実施形態において、上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞であり得る。好ましくは、上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞であり得る。より好ましくは、上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞であり得る。さらに好ましくは、上記細胞は、間葉系幹細胞であり得る。他の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞であり得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞であり得る。   In another embodiment, the cell may be a stem cell derived from ectoderm, mesoderm or endoderm. Preferably, the cell may be a stem cell derived from mesoderm. More preferably, the cell can be a hematopoietic stem cell or a mesenchymal stem cell. More preferably, the cell may be a mesenchymal stem cell. In other preferred embodiments, the cells may be myeloid tissue stem cells. In another preferred embodiment, the cell may be a differentiated cell derived from a mesenchymal stem cell.

他の好ましい実施形態において、上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄由来であり得る。   In other preferred embodiments, the cells may be selected from the group consisting of cardiomyocytes, skeletal myoblasts and osteoblasts. In another preferred embodiment, the cells can be derived from bone marrow.

他の実施形態において、上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞であり得る。   In other embodiments, the cells can be primary cultured cardiomyocytes or differentiated cardiomyocytes.

他の実施形態において、上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞であり得る。同系由来が好ましい。同種異系由来の場合は、拒絶反応を起こさない系統のものが好ましいが、拒絶反応を起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。異種由来の細胞もまた、拒絶反応が問題にならない場合または必要に応じて拒絶反応を解消する処置を講じる場合に使用され得る。   In other embodiments, the cells can be syngeneic, allogeneic or xenogeneic cells. The same origin is preferred. In the case of allogeneic origin, those that do not cause rejection are preferable, but those that cause rejection can also be used by performing treatment to eliminate rejection as necessary. Heterogeneous cells can also be used when rejection is not an issue or if necessary, measures are taken to eliminate the rejection.

本発明の併用療法において、上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態であり得る。核酸形態の場合、上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在し得る。核酸形態の場合はまた、上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪ−リポソームの形態で存在し得る。   In the combination therapy of the present invention, the cell physiologically active substance may be in a protein form or a nucleic acid form. In the nucleic acid form, the cell physiologically active substance can be present in the form of a viral vector or a non-viral vector. In the case of the nucleic acid form, the cell physiologically active substance may also exist in the form of HVJ-liposomes.

本発明の組成物またはキットは、生物の器官（たとえば、心臓または心臓へと送達され得る部位）への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。   The composition or kit of the present invention can be provided in any formulation form that is suitable for transfer to an organ of a living organism (eg, a heart or a site that can be delivered to the heart). Examples of such a pharmaceutical form include a liquid, an injection, and a sustained release agent. Examples of administration routes include oral administration, parenteral administration, and direct administration to the affected area.

注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。ＨＶＪ−リポソームのようなリポソーム形態の場合には、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤のようなリポソーム製剤に必要な試薬を加えることができる。リポソームは、非経口的に投与することが好ましい。従って、リポソームを投与する場合には、非侵襲的なカテーテルまたは非侵襲的な注射器などによる投与方法を用いることができる。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法としては、例えば、心室内腔により心筋内に直接本発明の組成物を注入することが挙げられる。   Injections can be prepared by methods well known in the art. For example, after dissolving in an appropriate solvent (physiological saline, buffer solution such as PBS, sterilized water, etc.), sterilized by filtration with a filter, and then filled into a sterile container (eg, ampoule) Can be prepared. This injection may contain a conventional pharmaceutical carrier, if necessary. In the case of a liposome form such as HVJ-liposomes, reagents necessary for the liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, and a centrifugal concentrated freezing agent can be added. Liposomes are preferably administered parenterally. Therefore, when administering liposome, the administration method by a noninvasive catheter or a noninvasive syringe etc. can be used. Examples of the administration method using a non-invasive catheter include injecting the composition of the present invention directly into the myocardium through the intraventricular lumen.

１つの実施形態において、本発明の組成物またはキットは、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。   In one embodiment, the compositions or kits of the invention can be provided in a sustained release form. The sustained-release form can be any form known in the art as long as it can be used in the present invention. As such a form, for example, it may be a preparation such as a rod form (pellet form, cylinder form, needle form, etc.), a tablet form, a disc form, a spherical form or a sheet form. Methods for preparing sustained release forms are known in the art and are described, for example, in the Japanese Pharmacopeia, the US Pharmacopeia and pharmacopoeia in other countries. Examples of the method for producing a sustained-release agent (sustained administration agent) include a method utilizing dissociation of a drug from a complex, a method of making an aqueous suspension injection, a method of making an oily injection or an oily suspension injection. And an emulsion injection solution (o / w type, w / o type emulsion injection solution, etc.).

徐放性形態の場合、徐放性製剤（ミニペレット製剤など）を投与部位付近に埋め込むこともできる。または、徐放性製剤は、オスモチックポンプなどを用いて投与部位に連続的に徐々に投与することもできる。   In the case of a sustained release form, a sustained release preparation (such as a mini-pellet preparation) can also be implanted in the vicinity of the administration site. Alternatively, the sustained-release preparation can be gradually and gradually administered to the administration site using an osmotic pump or the like.

本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。   The composition or kit of the present invention may also further comprise a biocompatible material. This biocompatible material is, for example, a group consisting of silicone, collagen, gelatin, glycolic acid / lactic acid copolymer, ethylene vinyl acetic acid copolymer, polyurethane, polyethylene, polytetrafluoroethylene, polypropylene, polyacrylate, and polymethacrylate. It may include at least one more selected. Silicone is preferred because it is easy to mold. Examples of biodegradable polymers include collagen, gelatin, α-hydroxycarboxylic acids (eg, glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid, etc.), hydroxydicarboxylic acids (eg, malic acid, etc.) and hydroxytricarboxylic acids (eg, , Citric acid, etc.) from one or more selected from the group consisting of polymers, copolymers or mixtures thereof, poly-α-cyanoacrylates, polyamino acids (for example, Poly-γ-benzyl-L-glutamic acid and the like), and polyanhydrides of maleic anhydride copolymers (for example, styrene-maleic acid copolymer and the like). The form of polymerization may be random, block, or graft. When α-hydroxycarboxylic acids, hydroxydicarboxylic acids, and hydroxytricarboxylic acids have an optically active center in the molecule, D-form, L-form, and DL-form Any of these can be used. Preferably, a copolymer of glycolic acid / lactic acid can be used.

核酸形態の細胞生理活性物質を投与する場合、その細胞生理活性物質は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、非特許文献２８、非特許文献２９などに詳説されている。   When a cell bioactive substance in nucleic acid form is administered, the cell bioactive substance can be administered in a non-viral vector form or a viral vector form, or in a form of direct administration with naked DNA. Such administration forms are well known in the art, and are described in detail in, for example, Non-Patent Document 28 and Non-Patent Document 29.

非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（非特許文献３１）、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）、ゼラチンなどの核酸導入促進物質の利用などが挙げられる。   In the case of a non-viral vector form, a method for introducing nucleic acid molecules using liposomes (liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofectin method, lipofectamine method, etc.), microinjection method, gene gun (Gene Gun) ) And a method of transferring nucleic acid molecules into cells together with carriers (metal particles). Examples of the expression vector include pCAGGS (Non-patent Document 31), pBJ-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (available from Invitrogen, Stratagene, etc.), use of nucleic acid introduction promoting substances such as gelatin, and the like.

ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、非特許文献２８、非特許文献２９および下記実施例に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。   The HVJ-liposome method involves encapsulating a nucleic acid molecule in a liposome made of a lipid bilayer and fusing the liposome with an inactivated Sendai virus (Hemagglutinating virus of Japan, HVJ). This HVJ-liposome method is characterized in that it has a much higher fusion activity with the cell membrane than the conventional liposome method. HVJ-liposome preparation methods are described in detail in Non-Patent Document 28, Non-Patent Document 29, and the following Examples. As HVJ, any strain can be used (for example, ATCC VR-907, ATCC VR-105, etc.), and Z strain is preferable.

ウイルスベクター形態の場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、核酸形態の細胞生理活性物質を導入し、細胞にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。   In the case of a viral vector form, a viral vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus is used. DNA viruses or RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, Sindbis virus, Sendai virus, SV40, human immunodeficiency virus (HIV), A gene can be introduced into a cell by introducing a cell physiologically active substance in nucleic acid form and infecting the cell with this recombinant virus. In these viral vectors, the adenoviral vector system is preferably used because the infection efficiency of adenovirus is much higher than that of other viral vectors.

Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、非特許文献３０に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。   In the case of the Naked DNA method, the above-described non-viral vector expression plasmid is dissolved in physiological saline and administered as it is. For example, it can be directly injected into a tissue of a living organism by the method described in Non-Patent Document 30.

本発明では、細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が使用される場合、類似の機能を発揮する細胞生理活性物質が組み合わされてもよく、異なる機能を有する細胞生理活性物質が補完的に組み合わされてもよい。   In the present invention, the cell physiologically active substance can be two or more kinds of cell physiologically active substances. When two or more types of cell physiologically active substances are used, cell physiologically active substances that exhibit similar functions may be combined, or cell physiologically active substances having different functions may be complementarily combined.

本発明の組成物またはキットは、さらに他の薬剤を含み得る。そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤であり得る。当然、本発明の組成物またはキットは、２種類以上の他の薬剤を含んでいてもよい。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などの最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、生物の器官に対して効果を有するものであり得る。そのような薬剤としては、例えば、血栓溶解剤、血管拡張剤、組織賦活化剤が挙げられる。   The composition or kit of the present invention may further contain other agents. Such an agent can be any agent known in pharmacy. Of course, a composition or kit of the present invention may contain more than one other agent. Examples of such drugs include those listed in the latest editions of the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, the pharmacopoeia of other countries, and the like. Such an agent may preferably have an effect on the organs of the organism. Examples of such agents include thrombolytic agents, vasodilators, and tissue activators.

他の実施形態において、上記細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。   In other embodiments, the cells may include more than one type of cell. When using two or more types of cells, cells of similar nature or origin may be used, or cells of different nature or origin may be used.

本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞生理活性物質および細胞の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。   The amount of the cell physiologically active substance and the cells contained in the composition and kit of the present invention is determined in consideration of the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, etc. A person skilled in the art can easily determine.

従って、本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞生理活性物質の量は、例えば、タンパク質の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５μｇ〜約１００ｍｇであり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約１ｍｇの間の任意の数値であり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の上限は、例えば、約１０００ｍｇ、約９００ｍｇ、約８００ｍｇ、約７００ｍｇ、約６００ｍｇ、約５００ｍｇ、約４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、約７５ｍｇ、約５０ｍｇ、約２５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５ｍｇなど、約１０００ｍｇ〜約１ｍｇの任意の数値であり得る。核酸の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約５μｇ〜約４００μｇであり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約２０μｇの間の任意の数値であり得る。細胞生理活性物質の量の範囲の上限は、例えば、約１０ｍｇ、約９ｍｇ、約８ｍｇ、約７ｍｇ、約６ｍｇ、約５ｍｇ、約４ｍｇ、約３ｍｇ、約２ｍｇ、約１ｍｇ、約７５０μｇ、約５００μｇ、約２５０μｇ、約１００μｇなど、約１０ｍｇ〜約１０μｇの任意の数値であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が含まれる場合も、上記の量が個々に適用される。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。投与頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。   Accordingly, the amount of the cell physiologically active substance contained in the composition and kit of the present invention is, for example, about 1 μg to about 1000 mg, preferably about 5 μg to about 100 mg for an adult (body weight: about 60 kg) in the case of protein. obtain. The lower limit of the amount of the cell bioactive substance is, for example, about 1 μg, about 2 μg, about 3 μg, about 4 μg, about 5 μg, about 6 μg, about 7 μg, about 8 μg, about 9 μg, about 10 μg, about 15 μg, about 20 μg, etc. , Any number between about 1 μg and about 1 mg. The upper limit of the range of the amount of the cell physiologically active substance is, for example, about 1000 mg, about 900 mg, about 800 mg, about 700 mg, about 600 mg, about 500 mg, about 400 mg, about 300 mg, about 200 mg, about 100 mg, about 75 mg, about 50 mg, It can be any number from about 1000 mg to about 1 mg, such as about 25 mg, about 10 mg, about 5 mg, and the like. In the case of a nucleic acid, it may be about 1 μg to about 10 mg, preferably about 1 μg to about 1000 μg, more preferably about 5 μg to about 400 μg for an adult (body weight about 60 kg). The lower limit of the amount of the cell bioactive substance is, for example, about 1 μg, about 2 μg, about 3 μg, about 4 μg, about 5 μg, about 6 μg, about 7 μg, about 8 μg, about 9 μg, about 10 μg, about 15 μg, about 20 μg, etc. , Any number between about 1 μg and about 20 μg. The upper limit of the range of the amount of the cell bioactive substance is, for example, about 10 mg, about 9 mg, about 8 mg, about 7 mg, about 6 mg, about 5 mg, about 4 mg, about 3 mg, about 2 mg, about 1 mg, about 750 μg, about 500 μg, It can be any number from about 10 mg to about 10 μg, such as about 250 μg, about 100 μg, etc. When two or more kinds of cell physiologically active substances are contained, the above amounts are applied individually. When administered as a viral vector or a non-viral vector, the dose is usually 0.0001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg, more preferably 0.01 to 1 mg. Examples of the administration frequency include daily administration-once every several months (for example, once a week-once a month).

本発明の組成物およびキットにおいて含まれる細胞の量は、例えば、約１×１０３細胞〜約１×１０１１細胞、好ましくは約１×１０４細胞〜約１×１０１０細胞、より好ましくは約１×１０５細胞〜約１×１０９細胞などであり得る。これらの細胞は、例えば、約０．１ｍｌ、０．２ｍｌ、０．５ｍｌ、１ｍｌの生理食塩水のような溶液として存在し得る。細胞の量の範囲の上限としては、例えば、約１×１０１１細胞、約５×１０１０細胞、約２×１０１０細胞、約１×１０１０細胞、約５×１０９細胞、約２×１０９細胞、約１×１０９細胞、約５×１０８細胞、約２×１０８細胞、約１×１０８細胞、約５×１０７細胞、約２×１０７細胞、約１×１０７細胞などが挙げられる。細胞の量の下限としては、例えば、約１×１０３細胞、約２×１０３細胞、約５×１０３細胞、約１×１０４細胞、約２×１０４細胞、約５×１０４細胞、約１×１０５細胞、約２×１０５細胞、約５×１０５細胞、約１×１０６細胞などが挙げられる。 The amount of cells included in the compositions and kits of the present invention is, for example, from about 1 × 10 3 cells to about 1 × 10 11 cells, preferably from about 1 × 10 4 cells to about 1 × 10 10 cells, more preferably From about 1 × 10 5 cells to about 1 × 10 9 cells and the like. These cells may be present as solutions such as, for example, about 0.1 ml, 0.2 ml, 0.5 ml, 1 ml saline. As the upper limit of the range of the amount of cells, for example, about 1 × 10 11 cells, about 5 × 10 10 cells, about 2 × 10 10 cells, about 1 × 10 10 cells, about 5 × 10 9 cells, about 2 × 10 9 cells, about 1 × 10 9 cells, about 5 × 10 8 cells, about 2 × 10 8 cells, about 1 × 10 8 cells, about 5 × 10 7 cells, about 2 × 10 7 cells, about 1 × 10 7 cells and the like. As the lower limit of the amount of cells, for example, about 1 × 10 3 cells, about 2 × 10 3 cells, about 5 × 10 3 cells, about 1 × 10 4 cells, about 2 × 10 4 cells, about 5 × 10 4 cells. Examples include cells, about 1 × 10 5 cells, about 2 × 10 5 cells, about 5 × 10 5 cells, and about 1 × 10 6 cells.

組成物およびキットの処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方、などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべき細胞生理活性物質および細胞量を決定することができる。   Composition and kit formulation procedures are known in the art and are described, for example, in the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, the Pharmacopoeia of other countries, and the like. Therefore, a person skilled in the art can determine the cell physiologically active substance and the amount of cells to be administered without undue experimentation as described herein.

１つの実施形態において、本発明のキットに備えられる指示書には、上記細胞生理活性物質を上記細胞の生物の器官への移植の前に投与することを指示する文言が記載され得る。特定の実施形態では、細胞生理活性物質を事前に投与することにより、損傷部位およびその周辺部位が組織再生により適した状況となるからである。   In one embodiment, the instructions provided in the kit of the present invention may include language indicating that the cell physiologically active substance is to be administered prior to transplantation of the cell into an organism organ. This is because, in a specific embodiment, pre-administration of the cell physiologically active substance makes the damaged site and the surrounding site more suitable for tissue regeneration.

別の実施形態において、上記指示書には、上記細胞生理活性物質および上記細胞を生物の器官の傷害部位または心虚血部位へと投与することを指示する文言が記載され得る。   In another embodiment, the instructions may include language instructing administration of the cytophysiologically active substance and the cells to an injury site or cardiac ischemia site of an organism's organ.

別の実施形態において、上記指示書には、上記生物の器官が心不全、心筋梗塞、心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症などの心疾患から選択される状態であるときに、上記投与を指示する文言が記載され得る。このような心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択され得る。特に好ましい実施形態では、この心疾患は、拡張型心筋症である。   In another embodiment, the instructions include the organ of the organism selected from heart diseases such as heart failure, myocardial infarction, cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy, etc. A word indicating the administration may be written when the condition is to be performed. Such heart disease may be selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. In a particularly preferred embodiment, the heart disease is dilated cardiomyopathy.

他の局面において、本発明は、生物の器官の組織を再生するための方法を提供する。この方法は、細胞生理活性物質を生物の器官（たとえば、心臓または心臓へ送達され得る部位）へ提供する工程；および細胞を生物の器官へ提供する工程、を包含する。   In another aspect, the present invention provides a method for regenerating tissue of an organism's organs. The method includes providing a cell bioactive substance to an organ of an organism (eg, the heart or a site that can be delivered to the heart); and providing a cell to the organ of the organism.

他のさらなる局面において、本発明は、心疾患を治療するための方法を提供する。この方法は、細胞生理活性物質を生物の器官（たとえば、心臓または心臓へ送達され得る部位）へ提供する工程；および細胞を生物の器官へ提供する工程、を包含する。   In another further aspect, the present invention provides a method for treating heart disease. The method includes providing a cell bioactive substance to an organ of an organism (eg, the heart or a site that can be delivered to the heart); and providing a cell to the organ of the organism.

本発明の方法の１つの実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有し得る。別の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、造血活性またはコロニー刺激活性を有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、細胞増殖活性を有し得る。   In one embodiment of the method of the present invention, the cell physiologically active substance may have hematopoietic activity, colony stimulating activity, or cell proliferation activity. In another embodiment, the cell bioactive substance may have hematopoietic activity or colony stimulating activity. Preferably, the cell physiologically active substance may have cell proliferation activity.

別の好ましい実施形態において、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の両方を有し得る。   In another preferred embodiment, the cell physiologically active substance may have at least one activity of angiogenic activity and antifibrotic activity. More preferably, the cell physiologically active substance can have both angiogenic activity and anti-fibrotic effect.

他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。より好ましくは、上記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有し得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである細胞生理活性物質であり得る。   In another embodiment, the cell physiologically active substance may have a kinase receptor as a receptor. More preferably, the cell physiologically active substance can have a tyrosine kinase type receptor as a receptor. Preferably, the cell physiologically active substance may be a cell physiologically active substance whose receptor is c-met.

他の実施形態において、上記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択され得る。好ましくは、上記細胞生理活性物質は、ＨＧＦであり得る。他の好ましい実施形態では上記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦであり得る。   In another embodiment, the cell bioactive substance can be selected from the group consisting of FGF, HGF and VEGF. Preferably, the cell physiologically active substance may be HGF. In another preferred embodiment, the cell physiologically active substance can be VEGF.

他の実施形態において、上記細胞は、幹細胞（例えば、胚性幹細胞または組織幹細胞）または分化した細胞であり得る。   In other embodiments, the cells can be stem cells (eg, embryonic stem cells or tissue stem cells) or differentiated cells.

別の実施形態において、上記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞であり得る。好ましくは、上記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞であり得る。より好ましくは、上記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞であり得る。さらに好ましくは、上記細胞は、間葉系幹細胞であり得る。他の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄系の組織幹細胞であり得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞であり得る。   In another embodiment, the cell may be a stem cell derived from ectoderm, mesoderm or endoderm. Preferably, the cell may be a stem cell derived from mesoderm. More preferably, the cell can be a hematopoietic stem cell or a mesenchymal stem cell. More preferably, the cell may be a mesenchymal stem cell. In other preferred embodiments, the cells may be myeloid tissue stem cells. In another preferred embodiment, the cell may be a differentiated cell derived from a mesenchymal stem cell.

他の好ましい実施形態において、上記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択され得る。別の好ましい実施形態では、上記細胞は、骨髄由来であり得る。   In other preferred embodiments, the cells may be selected from the group consisting of cardiomyocytes, skeletal myoblasts and osteoblasts. In another preferred embodiment, the cells can be derived from bone marrow.

他の実施形態において、上記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞であり得る。   In other embodiments, the cells can be primary cultured cardiomyocytes or differentiated cardiomyocytes.

他の実施形態において、上記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞であり得る。同系由来が好ましい。同種異系由来の場合は、拒絶反応を起こさない系統のものが好ましいが、起こすものも必要に応じて拒絶反応を解消する処置を行うことにより利用することができる。異種由来の細胞もまた、拒絶反応が問題にならない場合または必要に応じて拒絶反応を解消する処置を講じる場合に使用され得る。従って、本発明の方法の好ましい実施形態では、本発明の方法は、拒絶反応を回避する工程をさらに包含する。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、非特許文献３４に記載されている。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられる。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリン、ステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の併用療法と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしもひつようではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の併用療法の前または後にも投与され得る。   In other embodiments, the cells can be syngeneic, allogeneic or xenogeneic cells. The same origin is preferred. In the case of allogeneic origins, those that do not cause rejection are preferred, but those that occur can also be used by performing treatment to eliminate rejection as necessary. Heterogeneous cells can also be used when rejection is not an issue or if necessary, measures are taken to eliminate the rejection. Thus, in a preferred embodiment of the method of the invention, the method of the invention further comprises the step of avoiding rejection. Procedures for avoiding rejection reactions are known in the art and are described, for example, in Non-Patent Document 34. Examples of such methods include methods such as the use of immunosuppressants and steroids. Immunosuppressants that prevent rejection are currently "cyclosporine" (Sandimune / Neoral), "Tacrolimus" (Prograf), "Azathioprine" (Imlan), "Steroid Hormone" (Predonin, Methylpredonin), "T cells There are “antibodies” (OKT3, ATG, etc.), and the method used in many facilities around the world as a preventive immunosuppressive therapy is a combination of three drugs “cyclosporine, azathioprine, steroid hormone”. The immunosuppressive agent is desirably administered at the same time as the combination therapy of the present invention, but not necessarily at all. Therefore, as long as the immunosuppressive effect is achieved, the immunosuppressive agent can be administered before or after the combination therapy of the present invention.

本発明の方法において、上記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態であり得る。核酸形態の場合、上記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在し得る。核酸形態の場合はまた、上記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在し得る。   In the method of the present invention, the cell physiologically active substance may be in a protein form or a nucleic acid form. In the nucleic acid form, the cell physiologically active substance can be present in the form of a viral vector or a non-viral vector. In the case of the nucleic acid form, the cell physiologically active substance can also exist in the form of HVJ liposomes.

１つの実施形態において、本発明の方法では、細胞生理活性物質および／または細胞は、徐放性形態で提供され得る。本発明の生物の器官の組織を再生するための方法で使用される組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。   In one embodiment, in the methods of the present invention, the cell bioactive agent and / or cells can be provided in a sustained release form. The composition or kit used in the method for regenerating the organ tissue of the organism of the present invention may further comprise a biocompatible material. The biocompatible material may include, for example, at least one selected from the group consisting of silicone, collagen, gelatin, and a copolymer of glycolic acid / lactic acid.

本発明の方法で使用される細胞生理活性物質は、２種類以上の細胞生理活性物質であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質が使用される場合、類似の機能を発揮する細胞生理活性物質が組み合わされてもよく、異なる機能を有する細胞生理活性物質が補完的に組み合わされてもよい。これらの細胞生理活性物質は、同時に投与されても別の時期に投与されてもよい。   The cell physiologically active substance used in the method of the present invention may be two or more kinds of cell physiologically active substances. When two or more types of cell physiologically active substances are used, cell physiologically active substances that exhibit similar functions may be combined, or cell physiologically active substances having different functions may be complementarily combined. These cell physiologically active substances may be administered simultaneously or at different times.

本発明の方法では、他の薬剤でのさらなる処置が施され得る。そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤であり得る。そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。そのような薬剤は、好ましくは、生物の器官のに対して効果を有するものであり得る。   In the methods of the invention, further treatment with other agents may be performed. Such an agent can be any agent known in pharmacy. Such an agent can be two or more other agents. Examples of such drugs include those listed in the latest editions of the Japanese Pharmacopoeia, the US Pharmacopoeia, and the pharmacopoeias of other countries. Such an agent may preferably have an effect on the organs of the organism.

他の実施形態において、上記細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。   In other embodiments, the cells may include more than one type of cell. When using two or more types of cells, cells of similar nature or origin may be used, or cells of different nature or origin may be used.

本発明において使用される細胞は、どのような生物に由来する細胞でもよい。１つの実施形態では、脊椎動物から得られた細胞であり得る。別の実施形態では、上記細胞は、哺乳動物の細胞である。好ましい実施形態では、上記細胞は霊長類の細胞であり、最も好ましくは、ヒト細胞である。   The cell used in the present invention may be a cell derived from any organism. In one embodiment, it can be a cell obtained from a vertebrate. In another embodiment, the cell is a mammalian cell. In a preferred embodiment, the cell is a primate cell, most preferably a human cell.

本発明では、上記生物は、どのような生物でもよい。１つの実施形態では、上記生物は、脊椎動物である。別の実施形態では、上記生物は、哺乳動物である。好ましい実施形態では、上記生物は霊長類であり、最も好ましい実施形態では、上記生物はヒトである。   In the present invention, the organism may be any organism. In one embodiment, the organism is a vertebrate. In another embodiment, the organism is a mammal. In a preferred embodiment, the organism is a primate, and in a most preferred embodiment, the organism is a human.

本発明では、上記器官はどのような器官でもよい。１つの実施形態では、上記器官は、虚血性病変を伴う器官であり得る。別の実施形態では、上記器官は、心臓、脳、肺、膵臓、肝臓、四肢末梢および網膜からなる群より選択される。好ましくは、上記器官は、心臓であり得る。別の好ましい実施形態では、上記器官は、脳である。他の好ましい実施形態では、上記器官は、肺である。   In the present invention, the organ may be any organ. In one embodiment, the organ may be an organ with an ischemic lesion. In another embodiment, the organ is selected from the group consisting of heart, brain, lung, pancreas, liver, extremity and retina. Preferably, the organ may be a heart. In another preferred embodiment, the organ is the brain. In another preferred embodiment, the organ is the lung.

本発明の方法において使用される細胞生理活性物質および細胞の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、被験体の年齢、体重、性別、既往歴、細胞生理活性物質の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。   The amount of cellular physiologically active substance and cells used in the method of the present invention are the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), subject's age, weight, sex, medical history, form of cellular physiologically active substance. Alternatively, it can be easily determined by those skilled in the art in consideration of the type, cell morphology or type, and the like.

本発明の方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。   The frequency of applying the method of the present invention to a subject (or patient) also considers the purpose of use, the target disease (type, severity, etc.), the patient's age, weight, sex, medical history, and treatment course. Thus, it can be easily determined by those skilled in the art. Examples of the frequency include administration every day to once every several months (for example, once a week to once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the course.

好ましい実施形態では、上記細胞生理活性物質の提供工程は、上記細胞を生物の器官のへ提供する工程の前に行われ得る。細胞生理活性物質を事前に投与することにより、損傷部位およびその周辺部位が組織再生により適した状況となるからである。   In a preferred embodiment, the step of providing the cell physiologically active substance can be performed before the step of providing the cell to the organ of the organism. This is because administration of the cell physiologically active substance in advance makes the damaged site and the surrounding site more suitable for tissue regeneration.

好ましい実施形態では、上記細胞生理活性物質および上記細胞は、生物の器官のの傷害部位または心虚血部位へと投与され得る。   In a preferred embodiment, the cytophysiologically active substance and the cells can be administered to an injury site or cardiac ischemia site of an organism's organ.

１つの実施形態において、上記器官は心臓である。特定の実施形態において、この心臓は、特に難治性心不全である。難治性心不全については、従来根本的な治療、移植を伴わないなどの簡便な治療が実質的に存在しなかったことから、このような難治性心不全にとっては実質的に初めて治療法が提示されたことになり、医学界におけるその効果、意義は絶大である。従って、心臓疾患としては、たとえば、心不全、心筋梗塞および心筋症、拡張型心筋症から選択される疾患であり得る。難治性心不全としては、たとえば、心筋症のうち、たとえば、心筋炎、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症などが挙げられる。これらの炎症は、本発明によってもたらされる心筋などの再生によって実質的に初めて治療が達成されたことから、史上初めて治療方法および治療技術を提供するという顕著な効果が達成される。   In one embodiment, the organ is the heart. In certain embodiments, the heart is particularly refractory heart failure. With regard to refractory heart failure, there has been virtually no simple treatment such as radical treatment or non-transplantation, so the first treatment for such refractory heart failure was presented for the first time. Therefore, its effects and significance in the medical community are tremendous. Therefore, the heart disease can be, for example, a disease selected from heart failure, myocardial infarction and cardiomyopathy, and dilated cardiomyopathy. Examples of refractory heart failure include, for example, myocarditis, dilated cardiomyopathy, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy, and the like. Since these inflammations were treated for the first time by regeneration of the myocardium and the like brought about by the present invention, the remarkable effect of providing a treatment method and a treatment technique for the first time in history is achieved.

（遺伝子治療）
特定の実施形態において、本発明の遺伝子をコードする配列を含む核酸は、本発明の併用療法において、遺伝子治療の目的で投与され得る。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。 (Gene therapy)
In certain embodiments, a nucleic acid comprising a sequence encoding a gene of the present invention can be administered for gene therapy purposes in the combination therapy of the present invention. Gene therapy refers to a therapy performed by administering to a subject a nucleic acid that is expressed or expressible. In this embodiment of the invention, the nucleic acids produce their encoded protein, which mediates a therapeutic effect.

当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。   Any method for gene therapy available in the art can be used in accordance with the present invention. An exemplary method is as follows.

遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。   For a general review of methods of gene therapy, see Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12: 488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596 (1993); Mulligan, Science 260: 926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); May, TIBTECH 11 (5): 155-215 (1993). Commonly known recombinant DNA techniques used in gene therapy are described in Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene TransferMand Transfer and ExplorMorL. , Stockton Press, NY (1990).

したがって、本発明では、ＨＧＦなどの細胞生理活性物質またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり得る。   Therefore, in the present invention, gene therapy using a nucleic acid molecule encoding a cell physiologically active substance such as HGF or a variant or fragment thereof may be useful.

本明細書において「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。   In the present specification, the “effective amount for diagnosis, prevention, treatment or prognosis” refers to an amount which is recognized as being medically effective in diagnosis, prevention, treatment (or treatment) or prognosis, respectively. Such amounts can be determined by one skilled in the art using techniques well known in the art, taking into account various parameters.

本発明が対象とする動物は、神経系または類似の系を有するものであれば、どの生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物））でもよい。好ましくは、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）であり得る。例示的な被験体としては、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が用いられる。最も好ましくはヒト由来の細胞が用いられる。   The animal targeted by the present invention may be any organism (eg, animal (eg, vertebrate, invertebrate)) as long as it has a nervous system or a similar system. Preferably, it is a vertebrate (for example, larvae, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.), more preferably mammals (for example, single holes, marsupials, Rodents, crustaceans, wings, carnivores, carnivores, long noses, odd hoofs, even hoofs, rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents , Rabbit eyes, etc.). Exemplary subjects include, but are not limited to, animals such as cows, pigs, horses, chickens, cats, dogs and the like. More preferably, cells derived from primates (eg, chimpanzee, Japanese monkey, human) are used. Most preferably, human-derived cells are used.

本発明の核酸分子またはポリペプチドが医薬として使用される場合、そのような組成物は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。   When the nucleic acid molecule or polypeptide of the present invention is used as a medicament, such a composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and the like. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention include any substance known in the art.

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、細胞生理活性物質またはその改変体もしくはフラグメントなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。   Such suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers. Examples include, but are not limited to, agents, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants. Typically, the medicament of the present invention comprises a polypeptide or polynucleotide, such as a cell physiologically active substance or a variant or fragment thereof, or a variant or derivative thereof, one or more physiologically acceptable carriers, enhancers. It is administered in the form of a composition comprising a form or diluent. For example, a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other materials common to compositions for parenteral delivery. .

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。   Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used, for example Phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, α-tocopherol; low molecular weight polypeptide; protein (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymer (eg, polyvinylpyrrolidone); amino acid (Eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, mannitol or sorbitol) Salt formation vs. Io (E.g., sodium); and / or non-ionic surface-active agents (e.g., Tween, Pluronic (pluronic) or polyethylene glycol (PEG)) but the like are not limited thereto.

例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。   Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin. Preferably, the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose). Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired. Other exemplary compositions include pH 7.0-8.5 Tris buffer or pH 4.0-5.5 acetate buffer, which may further include sorbitol or a suitable substitute thereof. .

以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。   The general preparation method of the pharmaceutical composition of this invention is shown below. In addition, veterinary drug compositions, quasi drugs, marine drug compositions, food compositions, cosmetic compositions and the like can also be produced by known preparation methods.

本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、座剤等の固形製剤、またはシロップ剤、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として経口または非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアとしては、上述のように、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、溶解補助剤、安定化剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明の細胞生理活性物質のポリヌクレオチド形態、ポリペプチド形態など以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、経鼻、直腸、膣および経皮等が挙げられるがそれらに限定されない。   The polypeptide, polynucleotide and the like of the present invention are mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, and are solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders, powders, suppositories, or syrups, injections, suspensions. It can be administered orally or parenterally as a liquid preparation such as an agent, solution or spray. As described above, the pharmaceutically acceptable carrier includes an excipient, a lubricant, a binder, a disintegrant, a disintegration inhibitor, an absorption enhancer, an adsorbent, a humectant, a solubilizing agent in a solid preparation, Stabilizers, solvents in liquid preparations, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers, soothing agents and the like can be mentioned. In addition, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, sweeteners and the like can be used as necessary. In addition, substances other than the polynucleotide form, polypeptide form, etc. of the cell physiologically active substance of the present invention can be added to the composition of the present invention. Parenteral routes of administration include, but are not limited to, intravenous injection, intramuscular injection, nasal, rectal, vaginal and transdermal.

固形製剤における賦形剤としては、例えば、グルコース、ラクトース、スクロース、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デンプン、炭酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、塩化ナトリウム、カオリンおよび尿素等が挙げられる。   Examples of the excipient in the solid preparation include glucose, lactose, sucrose, D-mannitol, crystalline cellulose, starch, calcium carbonate, light anhydrous silicic acid, sodium chloride, kaolin and urea.

固形製剤における滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ホウ酸末、コロイド状ケイ酸、タルクおよびポリエチレングリコール等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the lubricant in the solid preparation include, but are not limited to, magnesium stearate, calcium stearate, boric acid powder, colloidal silicic acid, talc, and polyethylene glycol.

固形製剤における結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、白糖、Ｄ−マンニトール、結晶セルロース、デキストリン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、デンプン溶液、ゼラチン溶液、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、リン酸カリウム、およびシェラック等が挙げられる。   Examples of the binder in the solid preparation include water, ethanol, propanol, sucrose, D-mannitol, crystalline cellulose, dextrin, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, starch solution, gelatin solution, polyvinylpyrrolidone, calcium phosphate , Potassium phosphate, shellac and the like.

固形製剤における崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カンテン末、ラミナラン末、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、ステアリン酸モノグリセリド、ラクトースおよび繊維素グリコール酸カルシウム等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of disintegrants in solid preparations include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, agar powder, laminaran powder, croscarmellose sodium, sodium carboxymethyl starch, sodium alginate, sodium hydrogen carbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid Examples include, but are not limited to, esters, sodium lauryl sulfate, starch, stearic acid monoglyceride, lactose, and calcium calcium glycolate.

固形製剤における崩壊阻害剤の好適な例としては、水素添加油、白糖、ステアリン、カカオ脂および硬化油等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the disintegration inhibitor in the solid preparation include, but are not limited to, hydrogenated oil, sucrose, stearin, cocoa butter and hydrogenated oil.

固形製剤における吸収促進剤としては、例えば、第四級アンモニウム塩基類およびラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the absorption enhancer in the solid preparation include, but are not limited to, quaternary ammonium bases and sodium lauryl sulfate.

固形製剤における吸着剤としては、例えば、デンプン、ラクトース、カオリン、ベントナイトおよびコロイド状ケイ酸等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the adsorbent in the solid preparation include, but are not limited to, starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid.

固形製剤における保湿剤としては、例えば、グリセリン、デンプン等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the humectant in the solid preparation include, but are not limited to, glycerin and starch.

固形製剤における溶解補助剤としては、例えば、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the solubilizer in the solid preparation include, but are not limited to, arginine, glutamic acid, aspartic acid and the like.

固形製剤における安定化剤としては、例えば、ヒト血清アルブミン、ラクトース等が挙げられるがそれらに限定されない。   Examples of the stabilizer in the solid preparation include, but are not limited to, human serum albumin and lactose.

固形製剤として錠剤、丸剤等を調製する際には、必要により胃溶性または腸溶性物質（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）のフィルムで被覆していてもよい。錠剤には、必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーテイング錠あるいは二重錠、多層錠が含まれる。カプセル剤にはハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。座剤の形態に成形する際には、上記に列挙した添加物以外に、例えば、高級アルコール、高級アルコールのエステル類、半合成グリセライド等を添加することができるがそれらに限定されない。   When preparing tablets, pills and the like as solid preparations, they may be coated with a film of a gastric or enteric substance (sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.) as necessary. Tablets include tablets with ordinary coatings as necessary, such as sugar-coated tablets, gelatin-encapsulated tablets, enteric-coated tablets, film-coated tablets or double tablets, and multilayer tablets. Capsules include hard capsules and soft capsules. When forming into the form of a suppository, for example, higher alcohols, higher alcohol esters, semi-synthetic glycerides and the like can be added in addition to the additives listed above, but are not limited thereto.

液状製剤における溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。   Preferable examples of the solvent in the liquid preparation include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil and corn oil.

液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the solubilizer in the liquid preparation include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate and sodium citrate. It is not limited to them.

液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられるがそれらに限定されない。   Suitable examples of the suspending agent in the liquid preparation include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, Examples include, but are not limited to, hydrophilic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.

液状製剤における等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the isotonic agent in the liquid preparation include, but are not limited to, sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like.

液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等の緩衝液等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the buffer in the liquid preparation include, but are not limited to, buffers such as phosphate, acetate, carbonate and citrate.

液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the soothing agent in the liquid preparation include, but are not limited to, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride and the like.

液状製剤における防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the preservative in the liquid preparation include, but are not limited to, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, 2-phenylethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.

液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。   Preferable examples of the antioxidant in the liquid preparation include, but are not limited to, sulfite, ascorbic acid, α-tocopherol and cysteine.

注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましい。通常、これらは、バクテリア保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。   When preparing as an injection, it is preferable that the solution and suspension are sterilized and isotonic with blood. Usually, these are sterilized by filtration using a bacteria retention filter or the like, blending with a bactericidal agent, or irradiation. Furthermore, after these treatments, solidify by freeze-drying or other methods, and add sterile water or sterile diluent for injection (lidocaine hydrochloride aqueous solution, physiological saline, aqueous glucose solution, ethanol, or a mixed solution thereof) just before use. May be.

さらに、必要ならば、医薬組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。   Furthermore, if necessary, the pharmaceutical composition may contain coloring agents, preservatives, flavors, flavoring agents, sweeteners, and the like, as well as other agents.

本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。   The medicament of the present invention can be administered orally or parenterally. Alternatively, the medicament of the present invention can be administered intravenously or subcutaneously. When administered systemically, the medicament used in the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable aqueous solution free of pyrogens. Such a pharmaceutically acceptable composition can be easily prepared by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability and the like. In this specification, the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, intrarectal administration, intravaginal administration, local administration to the affected area, Skin administration, etc.). Formulations for such administration can be provided in any dosage form. Examples of such a pharmaceutical form include a liquid, an injection, and a sustained release agent.

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。   The medicament of the present invention may be a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 14th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR, as required). Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) can be prepared and stored in the form of a lyophilized cake or aqueous solution by mixing a sugar chain composition having a desired degree of purity.

様々な送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなど）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。   Various delivery systems are known and can be used to administer the compounds of the invention (eg, liposomes, microparticles, microcapsules, etc.). Introduction methods include, but are not limited to, intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, epidural, and oral routes. The compound or composition can be administered by any convenient route (eg, by infusion or bolus injection, by absorption through the epithelium or mucosal lining (eg, oral mucosa, rectal mucosa, intestinal mucosa, etc.), and others. It can be administered with a biologically active agent. Administration can be systemic or local. In addition, the pharmaceutical compounds or compositions of the invention may include any suitable route (including intraventricular and intrathecal injection; intraventricular injection, for example, intraventricularly attached to a reservoir, such as an Ommaya reservoir. It may be desirable to introduce into the central nervous system by a catheter). Pulmonary administration can also be used, for example, by use of an inhaler or nebulizer, and formulation with an aerosolizing agent.

特定の実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは組成物を、処置の必要な領域（例えば、心臓など）に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。   In certain embodiments, it may be desirable to administer the polypeptide, polynucleotide or composition of the invention locally to the area in need of treatment (eg, the heart, etc.); this is not a limiting purpose For example, by local injection during surgery, by topical application (eg in combination with a post-surgical wound dressing), by injection, by catheter, by suppository, or by an implant (this implant is a sialastic membrane) A porous, non-porous, or glue-like material) comprising a membrane or fiber such as Preferably, when administering a protein of the invention, including antibodies, care must be taken to use materials that do not absorb the protein.

別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中に封入された状態で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。あるいは、化合物または組成物は、ゼラチンなどの遺伝子導入促進物質とともに投与され得る。   In another embodiment, the compound or composition can be delivered encapsulated in vesicles, particularly liposomes (Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious). Disesease and Cancer, Lopez-Berstein and Fidler (eds.), Liss, New York, pages 353-365 (1989); see Lopez-Berstein, pages 317-327; see broadly the same book). Alternatively, the compound or composition can be administered with a gene transfer promoter such as gelatin.

さらに別の実施形態において、化合物または組成物は、制御された徐放系中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと）。   In yet another embodiment, the compound or composition can be delivered in a controlled sustained release system. In one embodiment, a pump can be used (Langer (supra); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321: 574 (1989)). In another embodiment, polymeric materials can be used (Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (ed.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled DrugDrivable Drug Bioavailability. And Ball (eds.), Wiley, New York (1984); see Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); Levy et al., Science 228: 190 1985); During et al., Ann. l.25: 351 (1989); see also Howard et al., J. Neurosurg. 71: 105 (1989)).

さらに別の実施形態において、制御された徐放系は、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。   In yet another embodiment, the controlled sustained release system can be placed near the therapeutic target, i.e., the brain, and therefore requires only a portion of the systemic dose (e.g., Goodson, Medical Applications of Controlled Release). , (Supra), Vol. 2, pages 115-138 (1984)).

他の制御された徐放系は、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。   Other controlled sustained release systems are discussed in a review by Langer (Science 249: 1527-1533 (1990)).

本明細書中、「投与する」とは、本発明の細胞生理活性物質（たとえば、ポリペプチド形態、ポリヌクレオチド形態、またはその他の形態の因子）および細胞を含む医薬を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、生体に取り込ませることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤あるいは細胞のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。ある実施形態では、本発明では、細胞と細胞生理活性物質とは別々に投与され得る。   As used herein, “administering” refers to a pharmaceutical agent containing a cell physiologically active substance of the present invention (eg, polypeptide form, polynucleotide form, or other form of factor) and a cell alone or other It means that it is taken into a living body in combination with a therapeutic agent. The combinations can be administered, for example, either as a mixture simultaneously, separately but simultaneously or in parallel; or sequentially. This includes presentation where the combined drugs are administered together as a therapeutic mixture, and also includes a procedure where the combined drugs are administered separately but simultaneously. “Combination” administration further includes the separate administration of one of the compounds or agents or cells given first, followed by the second. In certain embodiments, in the present invention, cells and cytophysiologically active substances can be administered separately.

本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。   In the present specification, the “instruction” describes a method for administering or diagnosing the pharmaceutical of the present invention to a doctor, a patient or other person who performs administration, or a person to be diagnosed (which may be the patient). It is. This instruction describes a word for instructing a procedure for administering the diagnostic agent or medicine of the present invention. This instruction is prepared in accordance with the format prescribed by the national supervisory authority (for example, the Ministry of Health, Labor and Welfare in Japan and the Food and Drug Administration (FDA) in the United States, etc. in the United States) where the present invention is implemented, and is approved by the supervisory authority. It is clearly stated that it has been received. The instruction sheet is a so-called package insert, and is usually provided as a paper medium, but is not limited thereto. For example, an electronic medium (for example, a home page (web site) or e-mail provided on the Internet) It can also be provided in such a form.

本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査室の結果または本発明が対象とする疾患（例えば、拡張型心筋症などの心疾患）に特徴的な臨床症状の消滅によって支持され得る。治療は、対象とする疾患（例えば、拡張型心筋症などの心疾患）の再発により再開することができる。   The end of treatment according to the method of the present invention may be determined by standard clinical laboratory results from commercially available assays or instrumentation or diseases targeted by the present invention (eg, heart diseases such as dilated cardiomyopathy). Can be supported by the disappearance of clinical symptoms characteristic of Treatment can be resumed by recurrence of the disease of interest (eg, heart disease such as dilated cardiomyopathy).

このように、本発明により生物の器官の移植および医療機器での補助システムを全くまたはほとんど使用することなく、損傷した生物の器官の組織を再生することが可能になった。これは、生物の器官の移植以外には実質的に根本的な治癒が期待できなかった重症心不全、重症心筋梗塞、心筋症などの患者に対して、新規な救済処置を提供することになった。従って、このような効果は、従来技術にはない格別な効果であるといえ、その有用性は筆舌に尽くしがたい。   Thus, the present invention has made it possible to regenerate the tissue of a damaged biological organ with little or no use of biological organ transplantation and assistive systems in medical devices. This would provide a new remedy for patients with severe heart failure, severe myocardial infarction, cardiomyopathy, etc. that could not be expected to undergo a radical cure other than organ transplantation. . Therefore, it can be said that such an effect is an exceptional effect that is not found in the prior art, and its usefulness is hard to beat.

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。   The present invention will be described below based on examples, but the following examples are provided for illustrative purposes only. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the above detailed description of the invention nor the following examples, but is limited only by the scope of the claims.

以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Sigmaから得た。
（実施例１：ＨＧＦと心筋細胞移植との併用療法）
本実施例では、例示として、ＨＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 The reagents used in the examples shown below were obtained from Wako Pure Chemicals, Sigma unless otherwise stated.
(Example 1: Combination therapy with HGF and cardiomyocyte transplantation)
In this example, by way of example, the effect of combination therapy on cardiac tissue regeneration was demonstrated using HGF and cardiomyocyte transplantation.

（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
４４匹の雄性Ｌｅｗｉｓ系統ラットを本実施例において用いた。NationalSociety for Medical Researchが作成した「Principles of Laboratory Animal Care」、およびInstituteof Laboratory Animal Resourceが作成しNational Intitute of Healthが公表した「Guide for theCare and Use of Laboratory Animals」（NIH Publication No.86-23,1985改訂）に遵って、動物愛護精神に則った世話を動物に対して行った。 (Materials and methods)
Myocardial infarction rat model 44 male Lewis strain rats were used in this example. “Principles of Laboratory Animal Care” created by the National Society for Medical Research, and “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” created by the Institute of Laboratory Animal Resource and published by the National Intitute of Health (NIH Publication No.86-23,1985) In accordance with (Revision), animals were cared for in accordance with the spirit of animal welfare.

急性心筋梗塞を非特許文献１３に記載されるように誘導した。簡潔には、ラット（３００ｇ、８週齢）をペントバルビタールナトリウムで麻酔をし、陽圧式呼吸を行った。ラットの心筋梗塞モデルを作製するために、左第四肋間で胸郭を開き左冠動脈を根元から３ｍｍの距離で、８−０ポリプロピレン糸で完全に結紮した。   Acute myocardial infarction was induced as described in [13]. Briefly, rats (300 g, 8 weeks old) were anesthetized with sodium pentobarbital and positive pressure respiration was performed. In order to create a rat myocardial infarction model, the thorax was opened between the left 4th ribs and the left coronary artery was completely ligated with 8-0 polypropylene thread at a distance of 3 mm from the root.

心筋の単離および培養
心筋細胞を、非特許文献１４に記載されるように新生Lewis系統ラットから単離した。簡潔には、生後1-2日後の新生仔Lewisラットより心筋細胞を単離した。新生仔ラットを犠死させ、すばやく心臓を摘出し、PBSにて数回洗浄した。摘出心を砕片し、collagenase-Trypsin存在下に、37℃、30分間静置し、数回ピペッティングを行った。溶解した心臓をメッシュに通し、10mlの10％DMEMを添加した。この溶液を1000回転5分間遠心し、沈殿物を10％DMEMに溶解し、1時間37℃にてpreplatingを行い、心筋細胞を純化した。 Myocardial Isolation and Culture Cardiomyocytes were isolated from newborn Lewis strain rats as described in [14]. Briefly, cardiomyocytes were isolated from newborn Lewis rats 1-2 days after birth. Newborn rats were sacrificed, the heart was quickly removed and washed several times with PBS. The excised heart was crushed and allowed to stand at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of collagenase-Trypsin, and pipetting was performed several times. The dissolved heart was passed through the mesh and 10 ml of 10% DMEM was added. This solution was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the precipitate was dissolved in 10% DMEM, and preplating at 37 ° C. for 1 hour to purify the cardiomyocytes.

心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ ｃDNA（配列番号１）を、ｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。 Introduction of human HGF gene into heart Human HGF cDNA (SEQ ID NO: 1) was placed in a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15).

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は非特許文献１６の記載に従っておこなった。以下に簡潔に示す。DNA溶液200μlを加え、30秒間振盪し、37度恒温槽に30秒間静置する。これを8回繰り返す。5秒間超音波処理をし、30秒間振盪する。0.3mlのBSSを加え、37度恒温槽で振盪する。不活化したHVJを加え、氷上で10分間置く。37度恒温槽にて1時間振盪する。超遠心チューブに60％と30％のショ糖溶液をそれぞれ1ml、6mlで重層し、HVJリポソーム液をのせ、BSSをチューブの付近まで加える。62,800g、4度で1.5時間超遠心する。30%ショ糖溶液層のすぐ上を回収し、４度に保存し、遺伝子導入に用いた。   Sendai virus (HVJ) and liposome complex were prepared according to the description in Non-Patent Document 16. The following is a brief description. Add 200 µl of DNA solution, shake for 30 seconds, and leave it in a 37 ° C thermostatic bath for 30 seconds. Repeat this 8 times. Sonicate for 5 seconds and shake for 30 seconds. Add 0.3ml of BSS and shake in a 37 ° C constant temperature bath. Add inactivated HVJ and place on ice for 10 minutes. Shake for 1 hour in a 37 ° C oven. Superimpose 60% and 30% sucrose solutions with 1 ml and 6 ml, respectively, in an ultracentrifuge tube, place HVJ liposome solution, and add BSS to the vicinity of the tube. Centrifuge for 1.5 hours at 62,800g at 4 degrees. Immediately above the 30% sucrose solution layer was collected, stored four times, and used for gene transfer.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、hＨＧＦ cDNAのがんｙベクターを梗塞を起こした心筋にトランスフェクトした。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Institite of Immunology））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（非特許文献１７）。完結には抗原をPBSにて1μgに調製し、ELISA用の96穴プレートに50 ng(50μl)ずつ加え、PBSで2-3回水洗した後、Blocking solutionを200μl/well加え室温で2時間放置する。一次抗体を加える。室温1時間放置した後、2次抗体を加え、室温で1時間放置する。反応を止めたのち、405 ｎmの求光度で定量する。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 15 μg of human HGF cDNA) was injected into the myocardial infarct region. For the control group, the infarcted myocardium was transfected with the hYGF cDNA cancer y vector. Human HGF concentration in heart tissue was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-human HGF monoclonal antibody (Tokyo, Japan, Institite of Immunology, Inc.) (Non-patent Document 17). . To complete, prepare 1 μg of antigen in PBS, add 50 ng (50 μl) to a 96-well plate for ELISA, wash 2-3 times with PBS, add 200 μl / well of Blocking solution and leave at room temperature for 2 hours. To do. Add primary antibody. After standing at room temperature for 1 hour, add the secondary antibody and leave at room temperature for 1 hour. After stopping the reaction, it is quantified with a photometry of 405 nm.

心筋細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。Ｔ群（新生ラット心筋細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ、ｎ＝１１）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体投与、ｎ＝１０）；Ｔ−Ｈ群（新生ラット心筋細胞懸濁物と、ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体同時投与、ｎ＝１０）；Ｃ群（培養培地単独、ｎ＝１３）。これらの物質を、30Gツベルクリンシリンジを用いて左前下降枝結紮2週後に梗塞部位に移植した。 Cardiomyocyte transplant recipient rats were anesthetized and the thorax was opened between the left fifth intercostal space to expose the heart. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction area. Group T (neoplastic rat cardiomyocyte suspension (1 × 10 6 cells / 0.2 ml, n = 11 in serum-free culture medium); Group H (administered HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA, n = 10 ); TH group (co-administration of neonatal rat cardiomyocyte suspension and HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA, n = 10); Group C (culture medium alone, n = 13). 2 weeks after ligation of the left anterior descending branch using a 30G tuberculin syringe, it was transplanted to the infarct site.

ラット心臓の心機能の測定
梗塞モデル作成2週後、移植後4週、8週後に、心臓超音波（SONOS5500, Agilent Technologies社製）にて心機能を測定した。12-MHzのtransducerを用い、左側方より、左室が最大径を示す位置で、短軸像を描出した。B-modeにて、左室収縮末期面積(endsystolic area)、M-modeにて、左室拡張末期径(LVDd)、左室収縮末期径(LVDs)、左室前壁厚(LVAWTh)を測定し、LVEF、LVFSを算出した。 Measurement of cardiac function of rat heart Two weeks after the creation of the infarct model, 4 weeks and 8 weeks after transplantation, cardiac function was measured by cardiac ultrasound (SONOS5500, manufactured by Agilent Technologies). Using a 12-MHz transducer, a short-axis image was drawn from the left side at the position where the left ventricle showed the maximum diameter. Left ventricular end systolic area (B-mode), left ventricular end diastolic diameter (LVDd), left ventricular end systolic diameter (LVDs), left ventricular anterior wall thickness (LVAWTh) LVEF and LVFS were calculated.

ＬＶＥＦ（％）＝（（ＬＶＤｄ３−ＬＶＤｓ３）／ＬＶＤｄ３）×１００
ＬＶＦＳ（％）＝（（ＬＶＤｄ−ＬＶＤｓ）／ＬＶＤｄ）×１００
心筋コントラスト剤での心エコー検査
ラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔し、陽圧呼吸を行った後、２１Ｆｒのカテーテルを、右の大腿静脈に挿入し、コントラスト剤Levobist（日本、大阪、日本シエリング（Schering Corporation））を注入した。SONOS5500を用いて、左室短軸像を描出し、評価を行った。 LVEF (%) = ((LVDd 3 -LVDs 3) / LVDd 3) × 100
LVFS (%) = ((LVDd−LVDs) / LVDd) × 100
Echocardiographic Examination with Myocardial Contrast Agent Rats were anesthetized with sodium pentobarbital and positive pressure respiration was performed, and then a 21 Fr catheter was inserted into the right femoral vein and contrast agent Levobist (Japan, Osaka, Japan Schering) Corporation)). Using SONOS5500, left ventricular short-axis images were drawn and evaluated.

１． 画像面の深さ、パワー、ゲイン、リジェクションおよび周波数設定を実験のはじめに最適化し、そして実験中は変更しなかった。コントラスト剤の注射前およびその間に撮った画像はすべて、ビデオ記録して後に分析した。非特許文献19を参考にして、梗塞部位および非梗塞領域の局所血流を、評価した。   1. Image depth, power, gain, rejection and frequency settings were optimized at the beginning of the experiment and were not changed during the experiment. All images taken before and during contrast agent injection were video recorded and analyzed. With reference to Non-Patent Document 19, the local blood flow in the infarcted area and the non-infarcted area was evaluated.

右大腿静脈に挿入したカテーテルより約0．3ml/kgのコントラスト剤を注入した。収縮末期の像をコンピュータに保存し、この収縮末期像より、各領域の時間強度曲線を作成した。時間強度曲線が山型のピークを示した時、灌流良好と判定した。他方、平坦な時間強度曲線を示した場合、灌流不良と判定した。   About 0.3 ml / kg of contrast agent was injected from the catheter inserted into the right femoral vein. An end-systolic image was stored in a computer, and a time intensity curve for each region was created from the end-systolic image. When the time intensity curve showed a mountain-shaped peak, it was determined that perfusion was good. On the other hand, when a flat time intensity curve was shown, it was determined that the perfusion was poor.

組織学的分析
心筋細胞移植後、8W後に心臓を摘出し、短軸にて切断し、10％ホルムアルデヒド溶液につけ、パラフィン固定を行った。切片を作成し、ヘマトキシリンーエオジン染色、マッソン-トリクローム染色を行った。また同時期の凍結切片を作成し、FactorVIII免疫染色、各種接着蛋白（インテグリン、ラミニン、α-ジストログリカン、β１-ジストログリカン）免疫染色を行った。 Histological analysis After transplantation of cardiomyocytes, the heart was removed 8 W later, cut with a short axis, placed in a 10% formaldehyde solution, and fixed with paraffin. Sections were prepared, and hematoxylin-eosin staining and Masson-trichrome staining were performed. In addition, frozen sections at the same time were prepared, and Factor VIII immunostaining and various adhesion proteins (integrin, laminin, α-dystroglycan, β1-dystroglycan) immunostaining were performed.

血管数を定量化するため、第VIII因子関連抗原の免疫組織化学染色を行った。凍結切片をＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液で５分間、室温にて固定し、３％過酸化水素を含むメタノール中に１５分間浸漬し、次いでPBSで洗浄した。このサンプルをウシ血清アルブミン溶液（DAKO LSAB Kit CORPORATION、デンマーク）で１０分間覆って、非特異的反応をブロックした。標本を、ＨＲＰと結合した、第VIII因子関連抗原に対するＥＰＯＳ結合体化抗体（ＤＡＫＯ ＥＰＯ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅ ｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ／ＨＲＰ、ＤＡＫＯ、デンマーク）と共に一晩浸透した。サンプルをＰＢＳで洗浄した後、これらを、ジアミノベンジジン溶液（ＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン）中に浸透した。染色された血管内皮細胞を、２００倍の倍率の光学顕微鏡下で計数した。計数結果を、１平方ミリメートルあたりの血管の数としてあらわした。   To quantify the number of blood vessels, immunohistochemical staining of factor VIII-related antigen was performed. The frozen sections were fixed with a 2% paraformaldehyde solution in PBS for 5 minutes at room temperature, immersed in methanol containing 3% hydrogen peroxide for 15 minutes, and then washed with PBS. This sample was covered with bovine serum albumin solution (DAKO LSAB Kit CORPORATION, Denmark) for 10 minutes to block nonspecific reactions. Specimens were infiltrated overnight with an EPOS-conjugated antibody against Factor VIII-associated antigen (DAKO EPO Anti-Human Von Willebrand Factor / HRP, DAKO, Denmark) conjugated with HRP. After the samples were washed with PBS, they were permeated into diaminobenzidine solution (0.3 mg / ml diaminobenzidine in PBS). Stained vascular endothelial cells were counted under a light microscope at 200 × magnification. The counting result was expressed as the number of blood vessels per square millimeter.

いくつかの接着蛋白の免疫染色を行うため、以下の抗体を用いた。一次抗体、ラミニンに対するウサギポリクローナル抗体（ICN Biomedicals,USA）、β１−インテグリンに対するハムスターモノクローナル抗体（住友電気工業株式会社（Sumitomo Electric Industries）、日本、大阪）、α−ジストログリカン（alpha-Dystroglycan）に対するマウスモノクローナル抗体（Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY 12946）およびβ−ジストログリカンに対するマウスモノクローナル抗体（CASTRA NOVO,UK）；二次抗体、ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリン（DAKO,Denmark）、ビオチン化抗ハムスター免疫グロブリン（Vector laboratories,USA）およびビオチン化抗マウス免疫グロブリン（Amersham Pharmacia Biotech,UK）。   The following antibodies were used to immunostain several adhesion proteins. Primary antibody, rabbit polyclonal antibody against laminin (ICN Biomedicals, USA), hamster monoclonal antibody against β1-integrin (Sumitomo Electric Industries, Osaka, Japan), mouse against α-dystroglycan Monoclonal antibody (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY 12946) and mouse monoclonal antibody against β-dystroglycan (CASTRA NOVO, UK); secondary antibody, biotinylated anti-rabbit immunoglobulin (DAKO, Denmark), biotinylated anti-hamster immunoglobulin (Vector laboratories, USA) and biotinylated anti-mouse immunoglobulin (Amersham Pharmacia Biotech, UK).

データ分析
データを、平均±標準偏差として表した。群間の差の有意性を評価するために、独立ｔ検定によって統計学的評価を行った。有意なＦ比が得られた場合、２因子反復測定分散分析を用いて評価した。０．０５未満のｐ値を有する場合、統計学的有意差があると決定した。 Data analysis data were expressed as mean ± standard deviation. Statistical evaluation was performed by independent t-test to evaluate the significance of differences between groups. When a significant F ratio was obtained, it was evaluated using a two-factor repeated measures analysis of variance. A p-value less than 0.05 was determined to be statistically significant.

（結果）
in vivoでの心臓のヒトＨＧＦ遺伝子導入
ヒトＨＧＦを心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定した。ヒトＨＧＦ遺伝子を遺伝子導入した心臓において、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇのヒトＨＧＦタンパク質を検出した。一方、ヒトＨＧＦ遺伝子を含まないリポソームを注入した群においては、ヒトＨＧＦタンパクを検出しなかった（図１）。 (result)
In vivo introduction of human HGF into the heart 3 days after introduction of human HGF into the heart, the HGF protein content of the introduced heart was measured. Human HGF protein content was measured by ELISA using an anti-human HGF monoclonal antibody. In the heart into which the human HGF gene was introduced, 7 ± 1.2 ng / g of human HGF protein was detected on the third day after the gene introduction. On the other hand, no human HGF protein was detected in the group injected with liposomes containing no human HGF gene (FIG. 1).

心機能評価
術前における駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期断面積および左室前壁厚は、４つの群の間で有意差を認めなかった。 Ejection rate, left ventricular shortening rate, left ventricular end systolic cross-sectional area and left ventricular anterior wall thickness before cardiac function evaluation were not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（図２）および左室短縮率（図３）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示した。これらの機能改善は、移植後８週間まで維持された。左室収縮末期断面積は、移植の４週後および８週後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に縮小した（図４）。移植の４週後、左室前壁は、Ｔ−Ｈ群では有意に増加した。そしてこの壁厚は、移植後８週まで維持された（図５）。   Echocardiography was performed 4 weeks after the injection, and ejection fraction (Fig. 2) and left ventricular shortening rate (Fig. 3) in the TH group were significantly improved compared to the other three groups. Indicated. These functional improvements were maintained up to 8 weeks after transplantation. The left ventricular end systolic cross-sectional area was significantly reduced in the TH group compared to the other groups at 4 and 8 weeks after transplantation (FIG. 4). Four weeks after transplantation, the left ventricular anterior wall increased significantly in the TH group. This wall thickness was maintained up to 8 weeks after transplantation (FIG. 5).

組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、左室前壁厚の有意な増加および左室断面積の有意な減少を示した。Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、移植心筋細胞は、梗塞巣に層状に生着した。左室前壁は、Ｔ−Ｈ群において顕著な増大を認めた。さらに、Ｔ−Ｈ群において、移植した心筋細胞は、著明に重合したサルコメアを形成した。（図６）。マッソンートリクローム染色法により、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維化の有意な減少を認めた。非梗塞領域での線維化率は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少した（Ｔ−Ｈ：Ｔ：Ｈ：Ｃ＝１３．５±３．５：２４．５±６．８：１８．５±１２．０：３６．７±８．２％；Ｐ＜０．０５）（図７）。 Histological evaluation The TH group showed a significant increase in left ventricular anterior wall thickness and a significant decrease in left ventricular cross-sectional area compared to the other groups. In the T group and the TH group, the transplanted cardiomyocytes engrafted in a layered manner in the infarct. The left ventricular anterior wall showed a marked increase in the TH group. Furthermore, in the TH group, the transplanted cardiomyocytes formed markedly polymerized sarcomere. (FIG. 6). Masson-trichrome staining showed a significant decrease in fibrosis in the TH group compared to the T group. The fibrosis rate in the non-infarct region was significantly reduced in the TH group compared to the other groups (TH: T: H: C = 13.5 ± 3.5: 24.5 ±). 6.8: 18.5 ± 12.0: 36.7 ± 8.2%; P <0.05) (FIG. 7).

移植の８週後、Ｔ−Ｈ群において、心筋細胞表面にてβ１-インテグリンおよびβ−ジストログリカンは強く濃染された。Ｔ群では、β１-インテグリンおよびβ−ジストログリカンの発現を認めたが、Ｔ−Ｈ群と比較して、発現は顕著に弱く、そして、Ｈ群およびＣ群においては、発現を認めなかった。α−ジストログリカンおよびラミニンの発現は、Ｔ−Ｈ群において、基底膜に強い濃染性を認めた。Ｔ群においては、極めて弱い発現を認めた。Ｈ群およびコントロール群において染色性を認めなかった（図６）。   Eight weeks after transplantation, β1-integrin and β-dystroglycan were intensely stained on the surface of cardiomyocytes in the TH group. In the T group, expression of β1-integrin and β-dystroglycan was observed, but the expression was significantly weaker than that in the TH group, and no expression was observed in the H and C groups. The expression of α-dystroglycan and laminin showed a strong dark staining in the basement membrane in the TH group. In group T, very weak expression was observed. No staining was observed in the H group and the control group (FIG. 6).

梗塞巣内の血管密度を評価するために、光学顕微鏡を用いて、第VIII因子関連抗原陽性細胞を計数した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高値であった（Ｔ−Ｈ：Ｔ：Ｈ：Ｃ＝１４．２±２．３：３．９±０．７：４．９±０．６：１．５±０．７×１０２／ｍｍ２；Ｐ＜０．０５）（図８）。 In order to evaluate the blood vessel density within the infarct area, factor VIII-related antigen positive cells were counted using a light microscope. In the combination therapy group, the blood vessel density was significantly higher than in the other groups (TH: T: H: C = 14.2 ± 2.3: 3.9 ± 0.7: 4. 9 ± 0.6: 1.5 ± 0.7 × 10 2 / mm 2 ; P <0.05) (FIG. 8).

梗塞巣における血液灌流の改善
Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークを伴った山型の曲線を示し、梗塞巣における血液灌流が良好であった。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示し、血液灌流は不良であった。 Improvement of blood perfusion in the infarct lesion The time-intensity curve for the TH group showed a mountain-shaped curve with a peak, and blood perfusion in the infarct lesion was good. On the other hand, Group H, Group T, and Group C showed flat time-intensity curves and blood perfusion was poor.

（考察）
心臓移植および左心補助人工心臓の装着は、普遍的な治療とはなりえず、これまでの置換型治療にかわる新しい治療法として再生型治療が注目されている。不全心に、いくつかの増殖因子を遺伝子導入することにより、血管新生を促進し、心機能の改善が得られることが報告されている。しかし、この機能改善は、血管新生のみによるものであり、左室拡張の一つの原因である梗塞巣を治療対象としていないため、心筋細胞の欠失を伴った心不全の治療には、不十分であるものと思われる。他方、心筋細胞移植は、心筋細胞が絶対的に減少した梗塞部に対する治療であり、虚血および間質の線維化に対して無治療のままである。それゆえ、本発明者らは、心筋細胞移植を、心筋再生・血管新生因子の遺伝子治療を併用することにより、各々の治療の欠点を補い、そしてより優れた心筋再生効果をもたらすと仮定した。 (Discussion)
Heart transplantation and left ventricular assist artificial heart attachment are not universal treatments, and regenerative treatments are attracting attention as new treatments replacing conventional replacement treatments. It has been reported that gene transfer of several growth factors into failing hearts promotes angiogenesis and improves cardiac function. However, this functional improvement is only due to angiogenesis, and it is not sufficient for the treatment of heart failure with cardiomyocyte loss because it does not treat infarcts that are one cause of left ventricular dilatation. There seems to be. On the other hand, cardiomyocyte transplantation is a treatment for infarcts with absolutely reduced cardiomyocytes and remains untreated for ischemia and interstitial fibrosis. Therefore, the present inventors hypothesized that cardiomyocyte transplantation is combined with myocardial regeneration and angiogenic factor gene therapy to compensate for the shortcomings of each treatment and to provide a better myocardial regeneration effect.

本発明の併用療法の効果を調べるために、本発明者らは、ラット心筋梗塞モデルにおいて心機能評価、および組織学的評価を行った。本発明の併用療法により、心筋の再生、血管新生、線維化の軽減、および左室前壁厚の顕著な増加を認めた。移植心筋細胞間、移植心筋細胞-細胞外マトリックス間の接着蛋白の発現増強を認めた。心筋細胞移植とｈＨＧＦ遺伝子導入併用療法は、梗塞心の心筋再生に有用であることが示唆された。   In order to examine the effect of the combination therapy of the present invention, the present inventors performed cardiac function evaluation and histological evaluation in a rat myocardial infarction model. With the combination therapy of the present invention, myocardial regeneration, angiogenesis, reduction of fibrosis, and significant increase in left ventricular anterior wall thickness were observed. Increased expression of adhesion protein between transplanted cardiomyocytes and between transplanted cardiomyocytes and extracellular matrix was observed. It was suggested that cardiomyocyte transplantation and hHGF gene transfer combination therapy is useful for myocardial regeneration of infarcted hearts.

移植細胞への血液供給は、移植細胞のviabilityの維持に重要である。Ｔａｙｌｏｒらは、移植した細胞の分化増殖において、移植細胞を栄養する血管の構築は、不可欠であることを述べている（非特許文献６）。さらに、ＲｅｉｎｌｉｂおよびＦｉｅｌｄは、移植された心筋細胞は、虚血に弱く、細胞移植に加え、血管を新生させる付加治療が必要であると強調している（非特許文献７）。本研究において、移植細胞は十分な血液の供給を受けることにより、良好な細胞-細胞間の接着、および著明に発達したサルコメアを形成した。よって、移植細胞に十分血液を供給することは、移植細胞のviabilityの維持に重要であると思われる。   Blood supply to transplanted cells is important for maintaining the viability of the transplanted cells. Taylor et al. State that the construction of blood vessels that feed transplanted cells is indispensable for the differentiation and proliferation of transplanted cells (Non-patent Document 6). Furthermore, Reinlib and Field stress that transplanted cardiomyocytes are vulnerable to ischemia and require additional therapy to revascularize in addition to cell transplantation (Non-patent Document 7). In this study, transplanted cells received good blood supply to form good cell-cell adhesion and well-developed sarcomere. Therefore, supplying sufficient blood to the transplanted cells seems to be important for maintaining the viability of the transplanted cells.

これまで、多くの血管新生因子が報告されており、その中でＶＥＧＦは公知の最も強力な因子である。しかし、過度のＶＥＧＦは、多数の未熟な血管を誘導し、顕著な出血および浮腫をもたらす。ＨＧＦもまた、強力な血管新生因子であり、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａらは、ＨＧＦによる閉塞性動脈硬化症患者に対する血管新生療法は有効であることを報告している（非特許文献８）。さらに、ＨＧＦは、血管新生因子であるだけでなく、抗線維化作用および心筋肥大作用を含む種々の機能を有することで知られている。また、ＨＧＦはautocrine、paracrine作用を有し、レシピエント心、および移植細胞に対して、その効果を発揮するものと思われる。よって、ＨＧＦ遺伝子導入と心筋細胞移植の併用は、不全心の機能組織再生に有効であるものと思われる（非特許文献１１）。   To date, many angiogenic factors have been reported, of which VEGF is the most potent factor known. However, excessive VEGF induces numerous immature blood vessels leading to significant bleeding and edema. HGF is also a powerful angiogenic factor, and Morishita et al. Reported that angiogenic therapy for patients with obstructive arteriosclerosis by HGF is effective (Non-patent Document 8). Furthermore, HGF is known not only to be an angiogenic factor but also to have various functions including an anti-fibrotic effect and a myocardial hypertrophy effect. Moreover, HGF has an autocrine and paracrine action, and is considered to exert its effect on recipient hearts and transplanted cells. Therefore, the combined use of HGF gene introduction and cardiomyocyte transplantation seems to be effective for functional tissue regeneration of failing hearts (Non-patent Document 11).

移植細胞間接着および移植細胞−細胞外マトリクス間接着は、移植細胞の生着、機能維持の点で重要である。免疫染色にて、β１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンは、心筋細胞膜上で強発現を認め、α−ジストログリカンおよびラミニンも、基底膜において強い発現を認めた。インテグリンは、細胞−細胞外マトリクス接着において、最も重要な分子である。インテグリンを介する細胞−細胞外マトリクス間接着が阻害された場合、細胞は「アノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）」と呼ばれる、アポトーシスに陥る。また、細胞は、インテグリンによって媒介される細胞−マトリクス相互作用を通して、種々の機能（細胞の増殖、分化、細胞の運動性およびタンパク質産生）を発揮する。本発明の併用療法群により、β１−インテグリンが細胞膜上で極めて強い発現を認めたことより、細胞外マトリクスとの接着により、移植心筋細胞が、最も効果的に機能する可能性があるものと思われる。インテグリン分子以外に、筋原性細胞は、その機能を発揮するため、ジストログリカンを必要とする。β−ジストログリカンは、骨格筋細胞膜上に発現し、そして、アクチンフィラメントに結合しているジストロフィンと呼ばれる別の分子に細胞内で結合している。また、細胞外では、β−ジストログリカンは、α−ジストログリカンと結合し、これは、基底膜に存在するラミニンと結合する。β−ジストログリカンは、細胞膜上にて、αサブユニット、βサブユニット、γサブユニットおよびδサブユニットから構成されるサルコグリカン（ｓａｒｃｏｇｌｙｃａｎ）複合体に結合している。α−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカンは、サルコグリカン複合体と共に複合体を形成する。この複合体は、ジストロフィンと結合し、骨格筋の機能において重要な役割を果たす：この系におけるこの分子の点変異は、いくつかの種類の筋ジストロフィーを引き起こすことが知られている。近年、この接着系は、心筋細胞においても重要であることが報告され、これらの分子における変異は、心筋症を引き起こし得る（非特許文献２０）。本発明の併用療法群によって、α−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカンが強発現したことより、ＨＧＦ遺伝子導入と心筋細胞移植を併用することにより、心筋細胞における別の細胞接着分子の発現が誘導されている可能性があるものと思われる。ラミニンは、基底膜の主成分である。ラミニンレセプターとしては、筋原性細胞膜上の、インテグリンならびにα−ジストログリカンおよびβ−ジストログリカン複合体が挙げられる。併用療法により、基底膜におけるラミニンの発現が増強されることは、移植された心筋細胞が基底膜のラミニンに最も有効に接着し得るだけでなく、併用療法が細胞−細胞外マトリクス接着の再構築を通して、移植細胞が生着するための、最も適切な微小環境を誘導し得ることを示唆するものと思われる。   Implantation between transplanted cells and adhesion between transplanted cells and extracellular matrix are important in terms of engraftment and maintenance of functions of the transplanted cells. By immunostaining, β1-integrin and β-dystroglycan were strongly expressed on the myocardial cell membrane, and α-dystroglycan and laminin were also strongly expressed on the basement membrane. Integrins are the most important molecules in cell-extracellular matrix adhesion. If cell-extracellular matrix-mediated adhesion through integrins is inhibited, the cells will fall into apoptosis, referred to as “anoikis”. Cells also exert a variety of functions (cell proliferation, differentiation, cell motility and protein production) through integrin-mediated cell-matrix interactions. From the fact that β1-integrin was highly expressed on the cell membrane by the combination therapy group of the present invention, it seems that transplanted cardiomyocytes may function most effectively by adhesion to the extracellular matrix. It is. In addition to integrin molecules, myogenic cells require dystroglycans to perform their functions. β-dystroglycan is expressed on the skeletal muscle cell membrane and is bound intracellularly to another molecule called dystrophin that is bound to actin filaments. Also, extracellularly, β-dystroglycan binds to α-dystroglycan, which binds laminin present in the basement membrane. β-dystroglycan is bound to a sarcoglycan complex composed of an α subunit, a β subunit, a γ subunit, and a δ subunit on the cell membrane. α-dystroglycan and β-dystroglycan form a complex with the sarcoglycan complex. This complex binds dystrophin and plays an important role in skeletal muscle function: point mutations of this molecule in this system are known to cause several types of muscular dystrophy. In recent years, this adhesion system has been reported to be important in cardiomyocytes, and mutations in these molecules can cause cardiomyopathy (Non-patent Document 20). Since the combination therapy group of the present invention strongly expressed α-dystroglycan and β-dystroglycan, the combined use of HGF gene introduction and cardiomyocyte transplantation induced the expression of another cell adhesion molecule in cardiomyocytes. It seems that there is a possibility. Laminin is the main component of the basement membrane. Laminin receptors include integrins and α-dystroglycan and β-dystroglycan complexes on myogenic cell membranes. The combination therapy enhances the expression of laminin in the basement membrane, not only can the transplanted cardiomyocytes adhere most effectively to laminin in the basement membrane, but the combination therapy also reconstructs cell-extracellular matrix adhesion This suggests that the most appropriate microenvironment for engraftment of the transplanted cells can be induced.

心筋梗塞では、機能不全に陥った心筋細胞は線維芽細胞に置き換わり、間質の線維化が起こる（非特許文献２１）。特に、非梗塞領域における間質の線維化は、虚血性心筋症における「左室拡大の主な原因」であると考えられる（非特許文献２２）。従って、心筋細胞移植を行う場合でさえ、梗塞心の完全な再生のためには、間質の線維化に対する付加治療が必要と思われる。   In myocardial infarction, myocardial cells that have become dysfunctional are replaced with fibroblasts, causing interstitial fibrosis (Non-patent Document 21). In particular, interstitial fibrosis in a non-infarct region is considered to be “a main cause of left ventricular enlargement” in ischemic cardiomyopathy (Non-patent Document 22). Therefore, even when cardiomyocyte transplantation is performed, additional treatment for interstitial fibrosis may be necessary for complete regeneration of the infarcted heart.

ＴＧＦ-βおよびアンギオテンシン-IIは、不全心の線維化に重要な役割を果たすと考えられている（非特許文献２３）。興味深いことに、これらの分子は、局所ＨＧＦ産生の強力な負の調節因子である（非特許文献２４、２５）。さらに、ＨＧＦは、その抗線維化作用だけでなく（非特許文献９）、アンギオテンシン-II産生の阻害作用により（非特許文献２６）、不全心の線維化を抑制する。本発明では、ＨＧＦは、おそらく、これらの機構を通して、非梗塞領域の線維化を顕著に抑制することが考えられる。   TGF-β and angiotensin-II are thought to play an important role in fibrosis of failing hearts (Non-patent Document 23). Interestingly, these molecules are potent negative regulators of local HGF production (Non-Patent Documents 24 and 25). Furthermore, HGF suppresses fibrosis of the failing heart not only by its anti-fibrotic effect (Non-patent Document 9) but also by an inhibitory action on angiotensin-II production (Non-patent Document 26). In the present invention, it is thought that HGF significantly suppresses fibrosis in non-infarct areas, probably through these mechanisms.

心筋細胞移植とＨＧＦ遺伝子導入との併用療法にて、血管の構築、線維化の抑制、移植心筋細胞の著明に重合したサルコメア形成を主とした組織再生がもたらされ、強力な左室拡大抑制と、心収縮能の回復が認められた。このようにＨＧＦと心筋細胞の移植を用いた併用療法は梗塞心の組織機能再生に有効であることが実証された。   Combined therapy with cardiomyocyte transplantation and HGF gene transfer brings about tissue regeneration mainly due to the formation of blood vessels, suppression of fibrosis, and formation of markedly polymerized sarcomere of transplanted cardiomyocytes, and powerful left ventricular enlargement Suppression and recovery of cardiac contractility were observed. Thus, it was demonstrated that the combination therapy using HGF and cardiomyocyte transplantation is effective for regenerating the tissue function of the infarcted heart.

（実施例２：ＦＧＦと心筋細胞移植との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＦＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 2: Combination therapy with FGF and cardiomyocyte transplantation)
Next, in this example, FGF and cardiomyocyte transplantation were used as examples to demonstrate the effect of the combination therapy on cardiac tissue regeneration.

（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。 (Materials and methods)
Myocardial infarction rat model The myocardial infarction rat model was prepared as described in Example 1.

心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。 Cardiomyocytes Cardiomyocytes were isolated and cultured as described in Example 1.

ＦＧＦ
ＦＧＦは、核酸送達系を利用して送達した。具体的には、ヒトＦGF ｃDNAを、ｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。 FGF
FGF was delivered using a nucleic acid delivery system. Specifically, human FGF cDNA was placed in a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15).

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１と同様に行った。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex was carried out in the same manner as in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＦＧＦ濃度を、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（非特許文献１７）。   About 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex was injected into the myocardial infarction area. For the control group, an empty vector was introduced into the infarcted myocardium. Human FGF concentration in heart tissue was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Non-patent Document 17).

細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞移植（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｆ群（ヒトＦＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｆ群（胎児ラット心筋細胞移植と、ヒトＦＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。 The cell transplant recipient rats were anesthetized and the thorax was opened between the left fifth intercostal space to expose the heart. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction area. The four groups are as follows. Group T (fetal rat cardiomyocyte transplantation (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group F (administered HVJ liposome plasmid complex containing human FGF cDNA); Group TF (fetal rat (Combination of cardiomyocyte transplantation with HVJ liposome plasmid complex containing human FGF cDNA); Group C (culture medium alone) In all cases, these materials were transferred to the myocardium 2 weeks after LAD ligation using a 30G tuberculin syringe. Injection into the infarct area.

ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of the heart function of the rat heart Measurement of the heart function of the rat heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
インビボでの心臓のＦＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＦＧＦを用いて心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＦＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＦＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＦＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＦＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に10.0ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＦＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＦＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった。 (result)
In vivo gene transfer of the heart FGF gene Three days after gene transfer into the heart using human FGF, we measured the FGF protein content of the gene-transferred heart. Human FGF protein content was measured using ELISA with anti-human FGF monoclonal antibody. The heart transfected with the FGF gene contained human FGF protein at a level of about 10.0 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human FGF was not detected in heart tissue obtained from hearts transgenic with an empty vector.

梗塞を起こした心筋層の機能評価
注射の４週間後、心エコー検査では、Ｔ−Ｈ群における駆出率、および左室短縮率は、他の３つの群と比較して優れた効果が見られる。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。 Functional evaluation of infarcted myocardium 4 weeks after injection, echocardiography showed a superior effect on ejection fraction and left ventricular shortening rate in the TH group compared to the other three groups. It is done. These functional improvements are maintained for up to 8 weeks after injection.

組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、左室前壁厚の有意な増加および左室断面積の有意な減少が見られる。Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、移植心筋細胞は、梗塞巣に層状に生着が見られる。左室前壁は、Ｔ−Ｈ群において顕著な増大を認める。マッソンートリクローム染色法により、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維化の有意な減少を認める。 Histological evaluation The TH group shows a significant increase in the left ventricular anterior wall thickness and a significant decrease in the left ventricular cross-sectional area compared to the other groups. In the T group and the TH group, transplanted cardiomyocytes are engrafted in a layered manner in the infarct. The left ventricular anterior wall is markedly increased in the TH group. By the Masson-Trichrome staining method, a significant decrease in fibrosis is observed in the TH group compared to the T group.

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第VIII因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定された。梗塞巣内の血管密度を評価するために、光学顕微鏡を用いて、第VIII因子関連抗原陽性細胞を計数した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも優れた効果が認められる。   Blood vessel density in myocardial scar tissue was assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels were identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. In order to evaluate the blood vessel density within the infarct area, factor VIII-related antigen positive cells were counted using a light microscope. In the combination therapy group, the blood vessel density has a better effect than in the other groups.

瘢痕における心筋層灌流の改善
Ｔ−Ｈ群は瘢痕における良好な心筋層灌流が見られる。 Improved myocardial perfusion in the scar The TH group shows good myocardial perfusion in the scar.

（考察）
本実施例より、ＦＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that the combination therapy of the present invention is effective for regeneration of heart tissue even with FGF.

（実施例３：ＶＥＧＦと骨格筋芽細胞移植との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＶＥＧＦと心筋細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 3: Combination therapy with VEGF and skeletal myoblast transplantation)
Next, in this example, VEGF and cardiomyocyte transplantation were used as examples to demonstrate the effect of the combination therapy on cardiac tissue regeneration.

（材料および方法）
心筋梗塞ビーグル犬モデル
心筋梗塞ビーグル犬モデル（体重８〜１０ｋｇ、２４匹）は、実施例１に記載に従って以下の改変を施して作製した。ビーグル犬を全身麻酔下、左開胸にて心臓を露出し、LAD結紮により心筋梗塞モデルを作成した。 (Materials and methods)
Myocardial infarction beagle dog model A myocardial infarction beagle dog model (body weight 8 to 10 kg, 24 animals) was prepared by performing the following modifications as described in Example 1. A beagle dog was exposed to the left thoracotomy under general anesthesia, and a myocardial infarction model was created by LAD ligation.

骨格筋芽細胞移植
骨格筋芽細胞の単離および培養
骨格筋芽細胞を、同種同系ビーグル犬の下肢骨格筋から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、骨格筋細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養し、骨格筋芽細胞を得た。 Skeletal myoblast transplantation
Skeletal myoblast isolation and culture Skeletal myoblasts were isolated from lower limb skeletal muscle of allogeneic syngeneic beagle dogs. Briefly, the medium was perfused with a culture solution and a collagenase solution, and the skeletal muscle cells were isolated and cultured, then the purity was increased by centrifugation, and subculture was performed to obtain skeletal myoblasts.

ＶＥＧＦ
ＶＥＧＦは、核酸送達系を利用して送達した。具体的には、ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを、ｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。核酸送達系を利用して送達した。 VEGF
VEGF was delivered using a nucleic acid delivery system. Specifically, human VEGF cDNA was put into a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15). Delivered using a nucleic acid delivery system.

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１と同様に行った。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex was carried out in the same manner as in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１２５μｇのヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 125 μg of human VEGF cDNA) was injected into the myocardial infarct region. For the control group, an empty vector was introduced into the infarcted myocardium.

細胞移植
レシピエントビーグル犬を麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このビーグル犬を心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群（各々６匹）に分けた。４群は以下のとおりである。ＶＥＧＦ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）と、ヒトＶＥＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ、ｎ＝６）；ＨＧＦ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、ＨＧＦ ｃＤＮＡ（１２５μｇ）を含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）；コントロールとして、Ｌ群（新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、ＬａｃＺ（２５０μｇ）を含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）；Ｓ群（Ｓｈａｍ；新生ビーグル犬骨格筋芽細胞懸濁物と、空のＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ；ｎ＝６）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。 The cell transplant recipient beagle dog was anesthetized and the thorax was opened between the left fifth intercostal space to expose the heart. The beagle dogs were divided into 4 groups (6 animals each) according to the substance administered to the myocardial infarction region. The four groups are as follows. VEGF group (new beagle dog skeletal myoblast suspension (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium) and HVJ liposome plasmid complex containing human VEGF cDNA, n = 6) HGF group (combination of newborn beagle skeletal myoblast suspension and HVJ liposome plasmid complex containing HGF cDNA (125 μg); n = 6); Group L (newborn beagle skeletal myoblast as control) Combination of suspension with HVJ liposome plasmid complex containing LacZ (250 μg); n = 6); Group S (Sham; newborn beagle skeletal myoblast suspension and empty HVJ liposome plasmid complex N = 6). In all cases, these substances were injected into the myocardial infarct area 2 weeks after LAD ligation using a 30G tuberculin syringe.

ビーグル犬心臓の心機能の測定
ビーグル犬心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of the heart function of the beagle dog heart The cardiac function measurement of the beagle dog heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
インビボでの心臓のＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＶＥＧＦを用いて心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＶＥＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＶＥＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＶＥＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＶＥＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に15.0ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＶＥＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＶＥＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった。 (result)
Transgenic Heart VEGF Gene Transgenic In Vivo Three days after gene transduction into the heart using human VEGF, we measured the VEGF protein content of the transduced heart. Human VEGF protein content was measured using ELISA with anti-human VEGF monoclonal antibody. The heart transfected with the VEGF gene contained human VEGF protein at a level of about 15.0 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human VEGF was not detected in heart tissue obtained from hearts transgenic with an empty vector.

梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はなかった。 The ejection fraction, left ventricular shortening rate, left ventricular end systolic area and anterior wall thickness score at the baseline functional evaluation of the infarcted myocardium were not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところＶＥＧＦ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、ＨＧＦ群同等の改善を示した。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＶＥＧＦ群では有意に回復した。そしてこの前壁の回復は、注射後８週間まで保たれた（示さず）。   Four weeks after injection, 2D echocardiography was performed, and ejection fraction (not shown) and left ventricular shortening rate (not shown) in the VEGF group showed an improvement comparable to the HGF group. The reduced anterior wall thickness after LAD ligation was significantly recovered in the VEGF group 4 weeks after injection. And this anterior wall recovery was maintained for up to 8 weeks after injection (not shown).

このように、ＬａｃＺを含むベクターおよび空のベクター（Ｓｈａｍ）を用いて同様の処置を行った群（それぞれＬ群およびＳ群）、ならびにＨＧＦ ｃＤＮＡを用いたもの（ＨＧＦ）および本実施例のものを比較したところ、図９に示されるように、ＶＥＧＦはＨＧＦと同様に本発明の併用療法において統計学的に有意な有効性を示すことが実証される。   Thus, the group which performed the same treatment using the vector containing LacZ and the empty vector (Sham) (the L group and the S group, respectively), the one using the HGF cDNA (HGF) and the present example As shown in FIG. 9, it is demonstrated that VEGF shows a statistically significant efficacy in the combination therapy of the present invention, like HGF.

（組織学的評価）
ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、本発明者らは、新たに形成された心臓組織が、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において顕著に増強された。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群においてのみ観察された（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｖ群において線維化にたいするの有効性が示される。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率％）は、他の群と比較して、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において有効性が示される。 (Histological evaluation)
The HGF and VEGF groups showed a significant increase in LV wall thickness and a decrease in LV cross-sectional area compared to the other groups. In microscopic examination, we found that newly formed heart tissue compensated for the infarcted region of the LV wall in the HGF and VEGF groups. However, the thickness of the newly formed LV wall was significantly enhanced in the HGF and VEGF groups. Furthermore, straight and thick, fully regenerated sarcomere with striated bundles were only observed in the HGF and VEGF groups (not shown). The Masson trichrome staining method is shown to be more effective for fibrosis in the TV group compared to the T group. The ratio of the area occupied by fibrosis in the region away from the infarction (fibrosis rate%) is more effective in the HGF group and the VEGF group than in the other groups.

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価した。血管を、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって識別した。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される。   Blood vessel density in myocardial scar tissue was assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope. Vessels were identified by positive staining with antibodies to factor VIII related antigen. In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups.

コントロールとしてＬ群およびＳ群、ならびに実施例１および本実施例のものを比較したところ、図１１に示されるように、ＶＥＧＦ群はＨＧＦ群と同様に本発明の併用療法において統計学的に有意な有効性を示すことが実証された。   As a control, the L group and the S group, and those of Example 1 and this example were compared. As shown in FIG. 11, the VEGF group was statistically significant in the combination therapy of the present invention as in the HGF group. It was proved to show the effectiveness.

コントロール群（Ｌ群およびＳ群）ならびにＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群の結果を処置前のものとともに図１２に示す。図から明らかなように、ＶＥＧＦは、ＨＧＦと同様に、本発明の併用療法の心筋層灌流改善効果においても有効であることが実証された。   The results of the control group (L group and S group) and the HGF group and VEGF group are shown in FIG. 12 together with those before treatment. As is clear from the figure, VEGF was demonstrated to be effective in the myocardial perfusion improvement effect of the combination therapy of the present invention as well as HGF.

（考察）
本実施例より、ＶＥＧＦでもＨＧＦと同様に本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that the combination therapy of the present invention is also effective for regeneration of heart tissue in VEGF as in HGF.

（実施例４：ＨＧＦと心筋細胞との併用療法：タンパク質形態）
次に、本実施例では、例示としてタンパク質形態のＨＧＦの投与と心筋細胞移植とを併用して、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 4: Combination therapy with HGF and cardiomyocytes: protein form)
Next, in this example, administration of protein form of HGF and cardiomyocyte transplantation were used in combination as examples to demonstrate the effect of the combination therapy on cardiac tissue regeneration.

（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。 (Materials and methods)
Myocardial infarction rat model The myocardial infarction rat model was prepared as described in Example 1.

心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。 Cardiomyocytes Cardiomyocytes were isolated and cultured as described in Example 1.

ＨＧＦ
ＨＧＦは、タンパク質形態で送達した。簡潔には、組換え産生したヒトＨＧＦタンパク質を用いた。ヒト組換えＨＧＦは、市販のもの（東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１）を用いた。 HGF
HGF was delivered in protein form. Briefly, recombinantly produced human HGF protein was used. A commercially available human recombinant HGF (Toyobo No. HGF-101) was used.

約１ｍｌ（約1-100μｇ）のヒト組換えＨＧＦタンパク質の生理食塩水溶液を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、ヒト組換えＨＧＦタンパク質溶液と同容量の生理食塩水溶液を梗塞を起こした心筋に注射した。   About 1 ml (about 1-100 μg) of a physiological saline solution of human recombinant HGF protein was injected into the myocardial infarction region. For the control group, a saline solution having the same volume as the human recombinant HGF protein solution was injected into the infarcted myocardium.

細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒト組換えＨＧＦタンパク質を投与）；Ｔ−Ｈ群（ヒト組換えＨＧＦタンパク質と胎児ラット心筋細胞との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。 The cell transplant recipient rat is anesthetized and the heart is exposed by opening the rib cage between the left fifth intercostal space. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction area. The four groups are as follows. Group T (fetal rat cardiomyocytes (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group H (administered human recombinant HGF protein); Group TH (human recombinant HGF protein and fetal rat Group C (culture medium alone) In all cases, these substances were injected into the myocardial infarct area 2 weeks after LAD ligation using a 30G tuberculin syringe.

ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of the heart function of the rat heart Measurement of the heart function of the rat heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
（梗塞を起こした心機能評価）
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアには、４つの群の間で有意差はないことが確認される。 (result)
(Evaluation of cardiac function causing infarction)
The baseline ejection fraction, left ventricular shortening rate, left ventricular end systolic area and anterior wall thickness score are confirmed to be not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。収縮末期面積は、注射の４週間後および８週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少する（示さず）。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復するが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。   Four weeks after injection, 2D echocardiography was performed, and ejection fraction (not shown) and left ventricular shortening rate (not shown) in the TH group were significantly improved compared to the other three groups. Indicates. These functional improvements are maintained for up to 8 weeks after injection. The end systolic area is significantly smaller in the TH group than in the other groups at 4 and 8 weeks after injection, and the LV end systolic area increases compared to the other groups in the TH group. Decrease (not shown). The anterior wall thickness decreased after LAD ligation is significantly recovered in the TH group 4 weeks after injection, but no other wall thickness recovery is seen in the other groups.

（組織学的評価）
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察される（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。 (Histological evaluation)
The TH group shows a significant increase in LV wall thickness and a decrease in LV cross-sectional area compared to the other groups. Under microscopic examination, it is found that newly formed heart tissue supplements the infarcted region of the LV wall in the T and TH groups. However, the thickness of the newly formed LV wall is significantly enhanced in the TH group. Furthermore, straight and thick, fully regenerated sarcomere with striated bundles are only observed in the TH group (not shown). Masson trichrome staining showed a significant reduction in fibrosis in the TH group compared to the T group. The ratio of the area occupied by fibrosis in the region away from the infarction (fibrosis rate) is significantly decreased in the TH group (not shown) compared to the other groups.

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。   Blood vessel density in myocardial scar tissue is assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels are identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査では、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における心筋層灌流が良好であることを示す。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示す。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。 Improving myocardial perfusion in scars In contrast-enhanced cardiography, the time-intensity curve for the TH group showed a flow in the form of a peak. This indicates good myocardial perfusion in the scar. On the other hand, Group H, Group T and Group C show flat time-intensity curves. This indicates poor myocardial perfusion.

（考察）
本実施例より、タンパク質形態のＨＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that the combination therapy of the present invention is effective for the regeneration of heart tissue even with protein form of HGF.

（実施例５：ＨＧＦと骨格筋芽細胞との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと骨格筋芽細胞移植とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 5: Combination therapy with HGF and skeletal myoblasts)
Next, in this example, the effect of the combination therapy on heart tissue regeneration was demonstrated using HGF and skeletal myoblast transplantation as examples.

（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。 (Materials and methods)
Myocardial infarction rat model The myocardial infarction rat model was prepared as described in Example 1.

骨格筋芽細胞の単離および培養
骨格筋芽細胞を、新生Lewis系統ラットの下肢骨格筋から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、骨格筋細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養し、骨格筋芽細胞を得た。 Skeletal myoblast isolation and culture Skeletal myoblasts were isolated from lower limb skeletal muscle of newborn Lewis strain rats. Briefly, the medium was perfused with a culture solution and a collagenase solution, and the skeletal muscle cells were isolated and cultured, then the purity was increased by centrifugation, and subculture was performed to obtain skeletal myoblasts.

心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ ｃDNAを、実施例１に記載のようにｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。 Transduction of human HGF gene into heart Human HGF cDNA was placed in a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15) as described in Example 1.

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように非特許文献１６の記載に従っておこなった。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex was carried out according to the description of Non-Patent Document 16 as described in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（非特許文献１７）。具体的手順は実施例１に従って行った。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 15 μg of human HGF cDNA) was injected into the myocardial infarct region. For the control group, an empty vector was introduced into the infarcted myocardium. Human HGF concentration in the heart tissue was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-human HGF monoclonal antibody (Tokyo, Japan, Institutional of Immunology Co., Ltd.) (Non-patent Document 17). . The specific procedure was performed according to Example 1.

骨格筋芽細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（ラット骨格筋芽細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ、ｎ＝5）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与、ｎ＝5）；Ｔ−Ｈ群（ラット骨格筋芽細胞と、ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ、ｎ＝5）；Ｃ群（培養培地単独、ｎ＝5）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮後２週間で心筋梗塞領域に注射した。 Skeletal myoblast transplant recipient rats were anesthetized and the heart was exposed by opening the rib cage between the left fifth intercostal spaces. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction area. The four groups are as follows. Group T (rat skeletal myoblast (in serum-free culture medium, 1 × 10 6 cells / 0.2 ml, n = 5); Group H (administered HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA, n = 5) Group TH (combination of rat skeletal myoblasts and HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA, n = 5); group C (culture medium alone, n = 5). The substance was injected into the myocardial infarct region 2 weeks after LAD ligation using a 30G tuberculin syringe.

ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of the heart function of the rat heart Measurement of the heart function of the rat heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、本発明者らは、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含んでいた。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されなかった。 (result)
Three days after transfection into the heart with human HGF, we measured the HGF protein content of the transgenic heart. Human HGF protein content was measured using ELISA with anti-human HGF monoclonal antibody. The heart transfected with the HGF gene contained human HGF protein at a level of about 7 ± 1.2 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human HGF was not detected in heart tissue obtained from hearts transgenic with an empty vector.

梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積、拡張末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はなかった。 The ejection fraction, left ventricular shortening rate, left ventricular end systolic area, end diastolic area and anterior wall thickness score at the baseline baseline evaluation of the function of the infarcted myocardium were not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群において、駆出率（図１３）および左室短縮率（図１４）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示した。拡張末期面積（図１５）および収縮末期面積（図１６）は、注射の４週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少した。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られなかった。   When 2D echocardiography was performed 4 weeks after injection, ejection fraction (Fig. 13) and left ventricular shortening rate (Fig. 14) were significant in the TH group compared to the other three groups. Showed improvement. End diastolic area (FIG. 15) and end systolic area (FIG. 16) were significantly smaller in the TH group than in the other groups at 4 weeks after injection, and the LV end systolic area increased in the other groups. Decreased in the TH group. The anterior wall thickness that decreased after LAD ligation was significantly recovered in the TH group 4 weeks after injection, but no other wall thickness recovery was seen in the other groups.

組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示した。顕微鏡検査では、本発明者らは、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことを見出した。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強された。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察された（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少した（示さず）。 Histological evaluation TH group showed a significant increase in LV wall thickness and a decrease in LV cross section compared to the other groups. In microscopic examination, we found that the newly formed heart tissue compensated for the infarcted region of the LV wall in the T and TH groups. However, the thickness of the newly formed LV wall was significantly enhanced in the TH group. Furthermore, straight and thick, fully regenerated sarcomere with striated bundles were only observed in the TH group (not shown). Masson trichrome staining showed a significant reduction in fibrosis in the TH group compared to the T group. The ratio of the area occupied by fibrosis in the region away from the infarction (fibrosis rate) was significantly decreased in the TH group compared to the other groups (not shown).

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定された。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出された（示さず）。   Blood vessel density in myocardial scar tissue was assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels were identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. In the combination therapy group, vascular density was found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査によって、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における良好な心筋層灌流を示す。一方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示した。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。 Improvement of myocardial perfusion in the scar By time-enhanced echocardiography, the time-intensity curve for the TH group showed a peak-shaped flow. This indicates good myocardial perfusion in the scar. On the other hand, the H group, the T group, and the C group showed flat time-intensity curves. This indicates poor myocardial perfusion.

（考察）
本実施例より、ＨＧＦと骨格筋芽細胞とを用いた併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that the combination therapy using HGF and skeletal myoblasts is effective for the regeneration of heart tissue.

（実施例６：ＨＧＦと胚性幹細胞との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと胚性幹細胞とを用いて、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 6: Combination therapy with HGF and embryonic stem cells)
Next, in this example, the effect of the combination therapy on heart tissue regeneration was demonstrated using HGF and embryonic stem cells as examples.

（材料および方法）
心筋梗塞ヌードラットモデル
心筋梗塞ヌードラットモデルは、ヌードラットを用いて実施例１の方法にしたがって行った。 (Materials and methods)
Myocardial infarction nude rat model The myocardial infarction nude rat model was performed according to the method of Example 1 using nude rats.

胚性幹細胞の単離および培養ならびに心筋細胞への分化
マウス胚性幹細胞のうちMHCの発現する遺伝子のプロモーターの部位に耐性遺伝子を導入し、分化させると心筋細胞以外に分化する細胞は淘汰される高濃度薬剤選択性培養を行い、心筋細胞を選択した。 Isolation and culture of embryonic stem cells and differentiation into cardiomyocytes When a resistance gene is introduced into the promoter site of a gene expressed by MHC among mouse embryonic stem cells and differentiated, cells that differentiate other than cardiomyocytes are trapped High concentration drug selective culture was performed to select cardiomyocytes.

心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ ｃDNAを、実施例１に記載のようにｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。 Transduction of human HGF gene into heart Human HGF cDNA was placed in a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15) as described in Example 1.

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように非特許文献１６の記載に従って行った。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex was carried out as described in Non-Patent Document 16 as described in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含む）を心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした心筋に遺伝子導入した。心臓組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（非特許文献１７）。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 15 μg of human HGF cDNA) was injected into the myocardial infarct region. For the control group, an empty vector was introduced into the infarcted myocardium. Human HGF concentration in the heart tissue was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-human HGF monoclonal antibody (Tokyo, Japan, Institutional of Immunology Co., Ltd.) (Non-patent Document 17). .

分化した胚性幹細胞の移植
レシピエントヌードラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させた。このヌードラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（分化胚性幹細胞懸濁物（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（分化胚性幹細胞懸濁物と、ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮後２週間で心筋梗塞領域に注射した。 Recipient nude rats transplanted with differentiated embryonic stem cells were anesthetized and the thorax was opened between the left fifth intercostal space to expose the heart. The nude rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction region. The four groups are as follows. Group T (differentiated embryonic stem cell suspension (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group H (administered HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA); Group T-H ( (Combination of differentiated embryonic stem cell suspension and HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA); Group C (culture medium alone) In all cases, these materials were combined with LAD ligation using a 30G tuberculin syringe. Two weeks were injected into the myocardial infarction area.

心臓の心機能の測定
心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of cardiac function of the heart Measurement of the cardiac function of the heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
ＨＧＦの発現
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された心臓のＨＧＦタンパク質含量を測定した。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した心臓は、遺伝子導入後３日目に７±１．２ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含んだ。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した心臓から得られた心臓組織では検出されない。 (result)
Expression of HGF Three days after gene transfer into the heart with human HGF, the HGF protein content of the gene-introduced heart was measured. Human HGF protein content was measured using ELISA with anti-human HGF monoclonal antibody. The heart transfected with the HGF gene contained human HGF protein at a level of about 7 ± 1.2 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human HGF is not detected in heart tissue obtained from hearts transgenic with an empty vector.

梗塞を起こした心筋層の機能評価
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮、末期面積および前壁厚みスコアは、４つの群の間で有意差はない。 The ejection fraction, left ventricular shortening rate, left ventricular contraction, end-stage area and anterior wall thickness score in the functional assessment baseline of the infarcted myocardium are not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群において、駆出率および左室短縮率は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。   When 2D echocardiography was performed 4 weeks after injection, ejection fraction and left ventricular shortening rate were significantly improved in the TH group compared to the other three groups. The anterior wall thickness that decreased after LAD ligation was significantly recovered in the TH group 4 weeks after injection, but no other wall thickness recovery was seen in the other groups.

組織学的評価
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示す。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。 Histological evaluation The TH group shows a significant increase in LV wall thickness and a decrease in LV cross-sectional area compared to the other groups. Under microscopic examination, it is found that newly formed heart tissue supplements the infarcted region of the LV wall in the T and TH groups. However, the thickness of the newly formed LV wall is significantly enhanced in the TH group. Masson trichrome staining shows a significant reduction in fibrosis in the TH group compared to the T group. The ratio of the area occupied by fibrosis in the region away from the infarction (fibrosis rate) is significantly decreased in the TH group (not shown) compared to the other groups.

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。   Blood vessel density in myocardial scar tissue is assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels are identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

（考察）
本実施例より、ＨＧＦと分化した胚性幹細胞とを用いた併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that combination therapy using HGF and differentiated embryonic stem cells is effective for regeneration of heart tissue.

（実施例７：ＨＧＦと血管内皮細胞の肺組織への投与との併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと血管内皮細胞とを用いて、肺組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 7: Combination therapy with administration of HGF and vascular endothelial cells to lung tissue)
Next, in this example, the effect of combination therapy on lung tissue regeneration was demonstrated using HGF and vascular endothelial cells as an example.

（材料および方法）
肺梗塞ラットモデル
肺梗塞ラットモデルは、マイクロスフェア（50um）を60mg/kg投与することで肺梗塞ラットモデルを作成した。 (Materials and methods)
Pulmonary Infarction Rat Model A pulmonary infarction rat model was prepared by administering 60 mg / kg of microspheres (50 um).

血管内皮細胞の単離および培養
血管内皮細胞を、新生Lewis系統ラットの下肢血管から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、血管内皮細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、経代培養した。 Vascular Endothelial Cell Isolation and Culture Vascular endothelial cells were isolated from lower limb blood vessels of newborn Lewis strain rats. Briefly, the cells were perfused with a culture solution and a collagenase solution, and vascular endothelial cells were isolated and cultured, and then purified by centrifugation and subcultured.

心臓へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ ｃDNAを、実施例１に記載のようにｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れた。 Transduction of human HGF gene into heart Human HGF cDNA was placed in a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15) as described in Example 1.

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように非特許文献１６の記載に従って行った。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex was carried out as described in Non-Patent Document 16 as described in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含む）を肺梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした肺に遺伝子導入した。肺組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した（非特許文献１７）。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 15 μg human HGF cDNA) was injected into the lung infarct region. For the control group, an empty vector was introduced into the infarcted lung. The human HGF concentration in the lung tissue was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-human HGF monoclonal antibody (Tokyo, Japan, Institute of Immunology) (Non-patent Document 17). .

血管内皮細胞の移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて左肺動脈を露出させた。このラットを肺梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（血管内皮細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（血管内皮細胞と、ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いて左肺動脈より肺に注射した。 Vascular endothelial cell transplant recipient rats were anesthetized and the thorax was opened between the left fifth intercostal space to expose the left pulmonary artery. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the pulmonary infarct area. The four groups are as follows. Group T (vascular endothelial cells (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group H (administered HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA); Group T-H (vascular endothelial cells and , In combination with HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA) Group C (culture medium alone) In all cases, these substances were injected into the lung from the left pulmonary artery using a 30G tuberculin syringe.

肺の機能の測定
肺機能のうちガス交換能は動脈血ガス濃度により測定した。 Measurement of pulmonary function Among pulmonary functions, gas exchange capacity was measured by arterial blood gas concentration.

組織学的分析
組織学的分析は、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
ヒトＨＧＦで肺に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された肺のＨＧＦタンパク質含量を測定する。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した肺は、遺伝子導入後３日目に10ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含む。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した肺から得られた肺組織では検出されない。 (result)
Three days after gene transfer to the lung with human HGF, the HGF protein content of the gene-transferred lung is measured. Human HGF protein content is measured using an ELISA with anti-human HGF monoclonal antibody. Lungs that have been transfected with the HGF gene contain human HGF protein at a level of about 10 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human HGF is not detected in lung tissue obtained from lungs transgenic with an empty vector.

組織学的評価
肺瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。 Histological evaluation Vascular density in lung scar tissue is assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels are identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. . In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

（考察）
本実施例より、ＨＧＦと血管内皮細胞との併用療法が肺組織の再生に有効であることが実証される。 (Discussion)
This example demonstrates that combined therapy with HGF and vascular endothelial cells is effective for regeneration of lung tissue.

以上の結果より、どのような細胞を用いても、かつ、どのような細胞生理活性物質を用いても、本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが示される。   From the above results, it is shown that the combination therapy of the present invention is effective for the regeneration of heart tissue regardless of what cells are used and what cell physiologically active substance is used.

（実施例８：ＨＧＦと血管内皮細胞の脳組織への併用療法）
次に、本実施例では、例示としてＨＧＦと血管内皮細胞とを用いて、脳組織再生に対する併用療法の効果を実証する。 (Example 8: Combination therapy of HGF and vascular endothelial cells to brain tissue)
Next, in this example, the effect of the combination therapy on brain tissue regeneration is demonstrated using HGF and vascular endothelial cells as an example.

（材料および方法）
脳梗塞ラットモデル
脳梗塞ラットモデルは、２０分間両側の頚動脈を結紮し、再還流し、作成した。 (Materials and methods)
Cerebral infarction rat model The cerebral infarction rat model was prepared by ligating the carotid arteries on both sides for 20 minutes and reperfusion.

血管内皮細胞の単離および培養
血管内皮細胞を、新生Lewis系統ラットの下肢血管から単離した。簡潔には培養液とコラゲナーゼ溶液にて灌流し、血管内皮細胞を単離培養した後、遠心分離により純度の上げ、継代培養した。 Vascular Endothelial Cell Isolation and Culture Vascular endothelial cells were isolated from lower limb blood vessels of newborn Lewis strain rats. Briefly, the cells were perfused with a culture solution and a collagenase solution, and vascular endothelial cells were isolated and cultured, then the purity was increased by centrifugation, and the cells were subcultured.

脳へのヒトＨＧＦ遺伝子の遺伝子導入
ヒトＨＧＦ ｃDNAを、実施例１に記載のようにｐUC−SRα発現ベクター（非特許文献１５）中に入れる。 Introduction of Human HGF Gene into Brain Human HGF cDNA is put into a pUC-SRα expression vector (Non-patent Document 15) as described in Example 1.

センダイウイルス（ＨＶＪ）およびリポソーム複合体の調製は、実施例１に記載のように非特許文献１６の記載に従って行う。   Preparation of Sendai virus (HVJ) and liposome complex is carried out as described in Non-Patent Document 16 as described in Example 1.

約０．２ｍｌのセンダイウイルスリポソーム−プラスミド複合体（１５μｇのヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含む）を脳梗塞領域に注射する。コントロール群に対しては、空のベクターを梗塞を起こした脳に遺伝子導入する。脳組織におけるヒトＨＧＦ濃度を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体（日本、東京、株式会社特殊免疫研究所（Ｉｎｓｔｉｔｉｔｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））を用いて酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定する（非特許文献１７）。   Approximately 0.2 ml of Sendai virus liposome-plasmid complex (containing 15 μg human HGF cDNA) is injected into the cerebral infarct region. For the control group, an empty vector is introduced into the infarcted brain. The human HGF concentration in the brain tissue is measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using an anti-human HGF monoclonal antibody (Tokyo, Japan, Institute of Immunology) (Non-patent Document 17). .

血管内皮細胞の移植
２０分間両側の頚動脈を結紮し、再還流し、作成した脳梗塞ラットモデルの両側頚動脈より脳梗塞領域に投与した物質に従って４群に分ける。４群は以下のとおりである。Ｔ群（血管内皮細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体を投与）；Ｔ−Ｈ群（血管内皮細胞と、ヒトＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソームプラスミド複合体との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いて両側頚動脈より脳に注射する。 The carotid artery on both sides was ligated for 20 minutes after transplantation of vascular endothelial cells, recirculated, and divided into 4 groups according to substances administered to the cerebral infarction region from the bilateral carotid artery of the prepared cerebral infarction rat model. The four groups are as follows. Group T (vascular endothelial cells (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group H (administered HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA); Group T-H (vascular endothelial cells and In combination with HVJ liposome plasmid complex containing human HGF cDNA) Group C (culture medium alone) In all cases, these substances are injected into the brain from the bilateral carotid artery using a 30G tuberculin syringe.

組織学的分析
組織学的分析は、実施例１に記載されるように行う。 Histological analysis The histological analysis is performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行う。 Data analysis Data analysis is also performed as described in Example 1.

（結果）
ヒトＨＧＦで心臓に遺伝子導入した３日後、遺伝子導入された脳のＨＧＦタンパク質含量を測定する。ヒトＨＧＦタンパク質含量を、抗ヒトＨＧＦモノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡを用いて測定する。ＨＧＦ遺伝子で遺伝子導入した脳は、遺伝子導入後３日目に10ｎｇ／ｇ組織程度のレベルでヒトＨＧＦタンパク質を含む。対照的に、ヒトＨＧＦは、空のベクターで遺伝子導入した脳から得られた脳組織では検出されない。 (result)
Three days after gene transfer into the heart with human HGF, the HGF protein content of the transgenic brain is measured. Human HGF protein content is measured using an ELISA with anti-human HGF monoclonal antibody. The brain introduced with the HGF gene contains human HGF protein at a level of about 10 ng / g tissue on the third day after gene introduction. In contrast, human HGF is not detected in brain tissue obtained from brains transgenic with an empty vector.

組織学的評価
脳瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。 Histological evaluation Vascular density in cerebral scar tissue is assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, which are identified by positive staining with an antibody against factor VIII-related antigen . In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

（考察）
本実施例より、ＨＧＦと血管内皮細胞との併用療法が脳組織の再生に有効であることが実証される。 (Discussion)
This example demonstrates that combined therapy with HGF and vascular endothelial cells is effective for the regeneration of brain tissue.

（実施例９：ＨＧＦと心筋細胞との併用療法：徐放形態）
次に、本実施例では、例示として徐放形態に処方したタンパク質形態のＨＧＦの投与と心筋細胞移植とを併用して、心臓組織再生に対する併用療法の効果を実証した。 (Example 9: Combination therapy with HGF and cardiomyocytes: sustained release form)
Next, in this example, administration of a protein form of HGF formulated in a sustained release form and cardiomyocyte transplantation were used in combination to demonstrate the effect of the combination therapy on cardiac tissue regeneration.

（材料および方法）
心筋梗塞ラットモデル
心筋梗塞ラットモデルは、実施例１に記載のように作製した。 (Materials and methods)
Myocardial infarction rat model The myocardial infarction rat model was prepared as described in Example 1.

心筋細胞
心筋細胞は、実施例１に記載されるように単離および培養を行った。 Cardiomyocytes Cardiomyocytes were isolated and cultured as described in Example 1.

ＨＧＦ
ＨＧＦは、徐放形態に処方したタンパク質形態で送達した。簡潔には、組換え産生したヒトＨＧＦタンパク質を用いた。ヒト組換えＨＧＦは、市販のもの（東洋紡Ｎｏ．ＨＧＦ−１０１）を用いた。これを、２％コラーゲン含有水溶液にこのＨＧＦを溶解し、０．６〜６０μｇ／ｍｌのＨＧＦ溶液を調製して溶液状のＨＧＦ徐放性製剤を作製した。 HGF
HGF was delivered in protein form formulated in sustained release form. Briefly, recombinantly produced human HGF protein was used. A commercially available human recombinant HGF (Toyobo No. HGF-101) was used. This HGF was dissolved in a 2% collagen-containing aqueous solution to prepare a 0.6-60 μg / ml HGF solution to prepare a solution-like HGF sustained-release preparation.

この徐放性製剤を約０．２ｍｌ（約０．1〜１０μｇ）の心筋梗塞領域に注射した。コントロール群に対しては、この製剤と同容量の生理食塩水溶液を梗塞を起こした心筋に注射した。   This sustained-release preparation was injected into a myocardial infarction region of about 0.2 ml (about 0.1 to 10 μg). For the control group, the same volume of physiological saline solution as this preparation was injected into the infarcted myocardium.

細胞移植
レシピエントラットを麻酔し、左第五肋間で胸郭を開いて心臓を露出させる。このラットを心筋梗塞領域に投与した物質に従って４群に分けた。４群は以下のとおりである。Ｔ群（胎児ラット心筋細胞（無血清培養培地中、１×１０６細胞／０．２ｍｌ）；Ｈ群（徐放性ＨＧＦ製剤を投与）；Ｔ−Ｈ群（徐放性ＨＧＦ製剤と胎児ラット心筋細胞との組合せ）；Ｃ群（培養培地単独）。すべての場合、これらの物質を、３０Ｇツベルクリンシリンジを用いたＬＡＤ結紮の２週間後に心筋梗塞領域に注射した。 The cell transplant recipient rat is anesthetized and the heart is exposed by opening the rib cage between the left fifth intercostal space. The rats were divided into 4 groups according to the substance administered to the myocardial infarction area. The four groups are as follows. Group T (fetal rat cardiomyocytes (1 × 10 6 cells / 0.2 ml in serum-free culture medium); Group H (administered sustained release HGF formulation); Group T (Sustained release HGF formulation and fetal rat) Group C (culture medium alone) In all cases, these substances were injected into the myocardial infarct area 2 weeks after LAD ligation using a 30G tuberculin syringe.

ラット心臓の心機能の測定
ラット心臓の心機能測定は、実施例１に記載されるように行った。 Measurement of the heart function of the rat heart Measurement of the heart function of the rat heart was performed as described in Example 1.

心筋コントラスト心エコー検査
心筋コントラストの心エコー検査もまた、実施例１に記載されるように行った。 Myocardial contrast echocardiography Echocardiography of myocardial contrast was also performed as described in Example 1.

組織学的分析
組織学的分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Histological analysis Histological analysis was also performed as described in Example 1.

データ分析
データ分析もまた、実施例１に記載されるように行った。 Data analysis Data analysis was also performed as described in Example 1.

（結果）
（梗塞を起こした心筋層の機能評価）
ベースラインにおける駆出率、左室短縮率、左心室収縮末期面積および前壁厚みスコアには、４つの群の間で有意差はないことが確認される。 (result)
(Functional evaluation of infarcted myocardium)
The baseline ejection fraction, left ventricular shortening rate, left ventricular end systolic area and anterior wall thickness score are confirmed to be not significantly different among the four groups.

注射の４週間後、２Ｄ心エコー検査を行ったところ、Ｔ−Ｈ群における駆出率（示さず）および左室短縮率（示さず）は、他の３つの群と比較して有意な改善を示す。これらの機能的改善は、注射後８週間まで保たれる。収縮末期面積は、注射の４週間後および８週間後において、Ｔ−Ｈ群では他の群よりも有意に小さく、そしてＬＶ収縮末期面積の拡大が、他の群と比較してＴ−Ｈ群で減少する（示さず）。ＬＡＤ結紮後に減少した前壁厚みは、注射の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復するが、他の群では壁の厚みの回復は見られない。そしてこの前壁の回復は、注射後８週間まで保たれる（示さず）。   Four weeks after injection, 2D echocardiography was performed, and ejection fraction (not shown) and left ventricular shortening rate (not shown) in the TH group were significantly improved compared to the other three groups. Indicates. These functional improvements are maintained for up to 8 weeks after injection. The end systolic area is significantly smaller in the TH group than in the other groups at 4 and 8 weeks after injection, and the LV end systolic area increases compared to the other groups in the TH group. Decrease (not shown). The anterior wall thickness decreased after LAD ligation is significantly recovered in the TH group 4 weeks after injection, but no other wall thickness recovery is seen in the other groups. This anterior wall recovery is then maintained for up to 8 weeks after injection (not shown).

（組織学的評価）
Ｔ−Ｈ群は、他の群と比較して、ＬＶ壁の厚みにおける有意な増加およびＬＶ断面積の減少を示す。顕微鏡検査では、新たに形成された心臓組織が、Ｔ群およびＴ−Ｈ群において、ＬＶ壁のうちの梗塞を起こした領域を補うことが見出される。しかし、新たに形成されたＬＶ壁の厚みは、Ｔ−Ｈ群において顕著に増強される。さらに、横紋束を有するまっすぐでかつ厚い、充分に再生された筋節は、Ｔ−Ｈ群においてのみ観察される（示さず）。マッソントリクローム染色法は、Ｔ群と比較してＴ−Ｈ群において線維症の有意な減少を示した。梗塞から離れた領域での線維症が占める面積の比率（線維化率）は、他の群と比較して、Ｔ−Ｈ群において有意に減少する（示さず）。 (Histological evaluation)
The TH group shows a significant increase in LV wall thickness and a decrease in LV cross-sectional area compared to the other groups. Under microscopic examination, it is found that newly formed heart tissue supplements the infarcted region of the LV wall in the T and TH groups. However, the thickness of the newly formed LV wall is significantly enhanced in the TH group. Furthermore, straight and thick, fully regenerated sarcomere with striated bundles are only observed in the TH group (not shown). Masson trichrome staining showed a significant reduction in fibrosis in the TH group compared to the T group. The ratio of the area occupied by fibrosis in the area away from the infarction (fibrosis rate) is significantly reduced in the TH group compared to the other groups (not shown).

免疫組織化学検査では、移植の８週間後、Ｔ−Ｈ群において心筋細胞表面でのβ１−インテグリンおよびβ−ジストログリカンの最大の発現が示される。Ｔ群では、β−１インテグリンおよびβ−ジストログリカンの発現は極めて強いが、他方、Ｔ−Ｈ群においてよりも顕著に低く、そして弱い免疫反応性は、Ｈ群およびＣ群において観察される。α−ジストログリカンおよびラミニンの発現は、Ｔ−Ｈ群における心筋細胞の下の基底膜において検出される。他の群では移植８週間後で、これらの発現は、Ｔ群においてかなり弱い。α−ジストログリカンおよびラミニンの陽性免疫反応は、Ｈ群およびコントロール群において見出されないことが確認される。   Immunohistochemistry shows maximum expression of β1-integrin and β-dystroglycan on the surface of cardiomyocytes in the TH group 8 weeks after transplantation. In the T group, the expression of β-1 integrin and β-dystroglycan is very strong, while it is significantly lower than in the TH group, and weak immunoreactivity is observed in the H and C groups. Expression of α-dystroglycan and laminin is detected in the basement membrane below the cardiomyocytes in the TH group. In other groups, after 8 weeks of transplantation, these expressions are rather weak in the T group. It is confirmed that no positive immune reaction of α-dystroglycan and laminin is found in the H group and the control group.

心筋瘢痕組織における血管密度は、高出力光学顕微鏡を用いて、血管の数を数えることによって評価され、この血管は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する抗体を用いた陽性染色によって同定される。併用療法群では、血管密度は、他の群においてよりも有意に高いことが見出される（示さず）。   Blood vessel density in myocardial scar tissue is assessed by counting the number of blood vessels using a high power light microscope, and the blood vessels are identified by positive staining with an antibody against factor VIII related antigen. In the combination therapy group, the vascular density is found to be significantly higher than in the other groups (not shown).

瘢痕における心筋層灌流の改善
超音波造影心臓図検査では、Ｔ−Ｈ群についての時間−強度曲線は、ピークの形をしたフローを示した。このことは、瘢痕における心筋層灌流が良好であることを示す。他方、Ｈ群、Ｔ群およびＣ群は、平坦な時間−強度曲線を示す。このことは、乏しい心筋層灌流を示す。 Improving myocardial perfusion in scars In contrast-enhanced cardiography, the time-intensity curve for the TH group showed a flow in the form of a peak. This indicates good myocardial perfusion in the scar. On the other hand, Group H, Group T and Group C show flat time-intensity curves. This indicates poor myocardial perfusion.

（考察）
本実施例より、徐放化形態のＨＧＦでも本発明の併用療法が心臓組織の再生に有効であることが実証された。徐放化形態のＨＧＦを本発明に用いた場合、そうでないタンパク質形態のＨＧＦを本発明の併用療法に用いた場合よりも、処置後少なくとも８週間までの本発明の効果の持続において顕著な改善が見られることが実証された。 (Discussion)
From this example, it was demonstrated that the combination therapy of the present invention is effective for the regeneration of heart tissue even in sustained-release form of HGF. When sustained release form of HGF is used in the present invention, a significant improvement in sustaining the effect of the present invention for at least 8 weeks after treatment, compared to the use of a non-protein form of HGF in the combination therapy of the present invention It was proved to be seen.

（実施例１０；拡張型心筋症の治療）
細胞移植およびＨＧＦ遺伝子導入の併用により、拡張型心筋症（ＤＣＭ）ハムスターにおげる心機能改善効果および心筋組織の再生効果が見られるかどうかを本実施例において実証した。 (Example 10: Treatment of dilated cardiomyopathy)
In this example, it was demonstrated whether the combined use of cell transplantation and HGF gene transfer has the effect of improving cardiac function and the regeneration of myocardial tissue in dilated cardiomyopathy (DCM) hamsters.

（材料および方法）
ＤＣＭハムスターモデル
ＤＣＭハムスターモデルは、Sakamoto A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci．USA, 94.13873-13878(1997）に記載されているようにδサルコグリカンが欠損しているハムスターを作製することによって用意した。本明細書においてこのハムスターはBIOTO-2ハムスターと呼ぶ。このハムスターは、本実施例では27週齢のものを用いた。このハムスターは18週齢ではそれほど症状が見られないが、27週齢になると拡張型心筋症の性質を提示する（図17を参照）。 (Materials and methods)
DCM hamster model The DCM hamster model is described in Sakamoto A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Prepared by preparing hamsters deficient in δ sarcoglycan as described in USA, 94.13873-13878 (1997). This hamster is referred to herein as a BIOTO-2 hamster. The hamster used in this example was 27 weeks old. This hamster is less symptomatic at 18 weeks of age, but presents the nature of dilated cardiomyopathy at 27 weeks of age (see Figure 17).

この実施例では、細胞生理活性物質としてＨＧＦを用い、細胞としてFIBハムスター由来の筋芽細胞を用いた。   In this example, HGF was used as the cell physiologically active substance, and FIB hamster-derived myoblasts were used as the cells.

ＨＧＦは実施例１に記載されるようにHVJを用いた形態を投与した。筋芽細胞は、実施例3に記載される方法を一部改変して用いて調製した。具体的にはＢＩＯＦＩＢハムスター（図19を参照）の下肢骨格筋から細胞を取り出し、コラゲナーゼ処理をして培養ディッシュに播いた。24時間後に上清を別のディッシュに移し培養し、４〜５日間培養してコンフルエントにし、この細胞を細胞移植に用いた。筋芽細胞は図20に示すようにデスミン染色された。   HGF was administered in a form using HVJ as described in Example 1. Myoblasts were prepared using a partial modification of the method described in Example 3. Specifically, cells were taken out from the lower limb skeletal muscles of the BIOFIB hamster (see FIG. 19), treated with collagenase, and seeded in a culture dish. After 24 hours, the supernatant was transferred to another dish, cultured, cultured for 4-5 days to confluence, and the cells were used for cell transplantation. Myoblasts were stained for desmin as shown in FIG.

上記DCMハムスターモデルに対して、以下の群のいずれかの処置を行った。   The DCM hamster model was treated in any of the following groups.

Ａ）培地のみ投与した群（DMEM 0.15ml；Ｃ群）
Ｂ）筋芽細胞溶液（５×105細胞／0.15ml）のみを注入した群（Ｔ群；ｎ＝10）
Ｃ）ＨＧＦ（ｈＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソーム 0.15ｍｌ）のみ投与した群（Ｈ群；ｎ=10）
Ｄ）筋芽細胞とｈＨＧＦ ｃＤＮＡを含むＨＶＪリポソーム 0.15ｍｌを注入した群（Ｔ−Ｈ群、ｎ＝10）
注入方法：
各群とも直視下に左心室の３箇所および右心室の１箇所に針を用いて注射した（図21）。処置前、処置後の各週ごとに、心臓超音波によりＬＶＤｄおよびＬＶＤｓを測定し、ＬＶＦＳおよびＬＶＥＦを算出し、各群間で比較した。組織評価として、処置前および処置後各週ごとに組織を採取し、ＨＥおよびマッソントリクローム染色を行った。また、電子顕微鏡観察により、ミトコンドリア、核およびサルコメア構造を確認した。そのタイムスケジュールは、図１８に示す。 A) Group to which only medium was administered (DMEM 0.15 ml; Group C)
B) Group injected with only myoblast solution (5 × 10 5 cells / 0.15 ml) (T group; n = 10)
C) Group administered with only HGF (HVJ liposome 0.15 ml containing hHGF cDNA) (H group; n = 10)
D) Group injected with 0.15 ml of HVJ liposome containing myoblasts and hHGF cDNA (TH group, n = 10)
Injection method:
In each group, injection was performed using a needle at three locations in the left ventricle and one location in the right ventricle under direct viewing (FIG. 21). LVDd and LVDs were measured by cardiac ultrasound and LVFS and LVEF were calculated and compared between groups before and after treatment. For tissue evaluation, tissues were collected before treatment and every week after treatment, and stained with HE and Masson trichrome. In addition, mitochondrial, nuclear, and sarcomeric structures were confirmed by electron microscope observation. The time schedule is shown in FIG.

（結果）
LVDd、LVDsの結果を図２２に示す。ＬＶＥＦおよび体重の結果を図23に示す。図22に示されるように、LVDdについては、各群間で有意差を認めなかったが、LVDsでは術後3週間まではC群に比べH群、T群およびT+H群で改善した。しかもT+H群は、他の群に比べ、より顕著に改善していた。また、術後3週にはLVDsは図22に示されるように、それぞれＣ群：6.2mm（平均mm）、Ｈ群：5.8mm（平均mm）、Ｔ群：5.6mm（平均mm）、T+H群：5.2mm（平均mm）となっていた。EF群は図23に示されるように術後3週に、Ｃ群：26.0％（平均％）、Ｈ群：35.0％（平均％）、Ｔ群：37.1％（平均％）、T+H群：44.5％（平均％）と、Ｃ群に比べ、Ｈ群、Ｔ群およびT+H群で有意に改善した。しかも、T+H群は、Ｈ群に対しても有意差をもって改善しており、Ｔ群に対しても顕著に効果が改善していた。 (result)
The results of LVDd and LVDs are shown in FIG. The LVEF and body weight results are shown in FIG. As shown in FIG. 22, there was no significant difference between LVDd groups, but LVDs improved in the H group, T group, and T + H group up to 3 weeks after surgery compared to C group. Moreover, the T + H group improved more significantly than the other groups. In addition, as shown in FIG. 22, the LVDs at 3 weeks after the operation were as follows: Group C: 6.2 mm (average mm), Group H: 5.8 mm (average mm), Group T: 5.6 mm (average mm), T + H group: 5.2 mm (average mm). As shown in FIG. 23, in the EF group, 3 weeks after the operation, C group: 26.0% (average%), H group: 35.0% (average%), T group: 37.1% (average%), T + H group : 44.5% (average%), which was significantly improved in the H group, the T group, and the T + H group as compared with the C group. Moreover, the T + H group improved with a significant difference compared to the H group, and the effect was significantly improved over the T group.

術後4週以後はいずれの群も心機能低下が徐々に進行したが、T+H群ではＨ群およびＴ群に比べ心機能が高い傾向にあった。組織ではＨＥ染色において、Ｃ群にくらべＨ群、Ｔ群およびH+T群で、左心室壁厚が増大傾向にあった（図24）。線維化は、Ｈ群およびT+H群で抑制されていた。   After 4 weeks after surgery, the decline in cardiac function gradually progressed in all groups, but the T + H group tended to have higher cardiac function than the H group and T group. In the HE staining, the left ventricular wall thickness tended to increase in the H group, the T group, and the H + T group compared to the C group in the HE staining (FIG. 24). Fibrosis was suppressed in the H group and the T + H group.

電顕写真でミトコンドリアの様子を確認したところ、コントロールではミトコンドリアが増加しており、不整配列がみられ、クリスタが減少していたが、H+T群（右）では、ミトコンドリアは正常な配列をしていた（図26）。この正常化は、Ｈ群、Ｔ群よりも顕著であった。したがって、ミトコンドリアレベルでもH+T群は有意な効果を示すといえる。   When the state of mitochondria was confirmed by an electron micrograph, mitochondria increased in the control, irregular sequences were observed, and crystals were decreased. However, in the H + T group (right), the mitochondria showed a normal sequence. (Figure 26). This normalization was more prominent than the H and T groups. Therefore, it can be said that the H + T group shows a significant effect even at the mitochondrial level.

（まとめ）
ＤＣＭハムスターに対して、ＨＧＦ遺伝子導入および筋芽細胞移植の併用療法はそれぞれの単独療法に比べ心機能の顕著な改善がみられた。拡張型心筋症における一般的な病態の改善は、本発明のＨＧＦ遺伝子導入と筋芽細胞移植との併用療法が、拡張型心筋症はもちろん、他の難治性心不全における組織機能再生に有用な方法であり、根治的治療になり得ることを示す。従って、本発明は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症などの難治性心不全の治療、予防および予後の処置にも有用である。 (Summary)
For DCM hamsters, combined therapy of HGF gene transfer and myoblast transplantation showed a marked improvement in cardiac function compared to each monotherapy. The improvement of general pathological conditions in dilated cardiomyopathy is a method in which the combined therapy of HGF gene transfer and myoblast transplantation of the present invention is useful for regeneration of tissue function in diabetic cardiomyopathy as well as other intractable heart failure And shows that it can be a radical treatment. Therefore, the present invention is also useful for the treatment, prevention and prognosis treatment of intractable heart failure such as myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy.

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。   As mentioned above, although this invention has been illustrated using preferable embodiment of this invention, it is understood that the scope of this invention should be construed only by the claims. Patents, patent applications, and references cited herein should be incorporated by reference in their entirety as if the contents themselves were specifically described herein. Understood.

本発明により、心臓移植および医療機器での補助システムを全く使用することなく、損傷した心臓組織を再生することが可能になった。従って、本発明を利用することにより心筋梗塞のような心疾患を治療することができる。本発明の組成物およびキットは、医師以外に、例えば、製薬企業などが業として生産することができることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。本発明の方法もまた、純粋な医療目的の治療方法に加え、間接的または直接的に実施することにより、医療業の隣接産業において利用される可能性が十分考えられることから、産業上の利用可能性または有用性は十分にあると考えられる。   The present invention has made it possible to regenerate damaged heart tissue without the use of any assistive system in heart transplantation and medical devices. Therefore, heart diseases such as myocardial infarction can be treated by using the present invention. Since the composition and kit of the present invention can be produced as a business by, for example, a pharmaceutical company other than a doctor, it is considered that there is sufficient industrial applicability or usefulness. Since the method of the present invention is also considered to be used in an adjacent industry of the medical industry by performing it indirectly or directly in addition to a treatment method for a pure medical purpose, There seems to be plenty of potential or usefulness.

図１は、レシピエント心臓におけるｈＨＧＦの検出を示す図である。遺伝子導入の３日後にレシピエント心臓においてＨＧＦが検出された。FIG. 1 shows the detection of hHGF in the recipient heart. HGF was detected in the recipient heart 3 days after gene transfer. 図２は、心臓超音波検査における左室機能向上を示す図である。左室機能は、移植の４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。この機能改善は、この併用療法の投与の８週間後まで保持された。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。FIG. 2 is a diagram showing improvement in left ventricular function in cardiac ultrasonography. Left ventricular function was significantly improved in the TH group 4 weeks after transplantation. This functional improvement was retained until 8 weeks after administration of this combination therapy. C: control, H: HGF gene introduction only, T: cell transplantation only, TH: cell transplantation and HGF combination therapy of the present invention. 図３は、心臓超音波検査における左室収縮性の向上を示す図である。左室収縮性は、移植の４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。この収縮性の改善は、この併用療法の投与の８週間後まで保持された。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。FIG. 3 is a diagram showing improvement in left ventricular contractility in cardiac ultrasonography. Left ventricular contractility was significantly improved in the TH group 4 weeks after transplantation. This improvement in contractility was maintained until 8 weeks after administration of this combination therapy. C: control, H: HGF gene introduction only, T: cell transplantation only, TH: cell transplantation and HGF combination therapy of the present invention. 図４は、心臓超音波検査における収縮末期面積を示す図である。収縮末期面積は、移植の４週間後および８週間後４週間後にＴ−Ｈ群において有意に改善していた。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。FIG. 4 is a diagram showing an end systolic area in cardiac ultrasonography. The end systolic area was significantly improved in the TH group 4 weeks after transplantation and 4 weeks after 8 weeks. C: Control, H: HGF gene transfer only, T: Cell transplantation only, TH: Combination therapy of cell transplantation and HGF of the present invention. 図５は、心臓超音波検査における左室前壁の壁厚を示す図である。ＬＡＤ結紮後に減少した左室前壁の壁厚は、移植の４週間後においてＴ−Ｈ群では有意に回復したが、他の群では壁の厚みの回復は見られなかった。この前壁の回復は、移植後８週間まで保たれた。Ｃ：コントロール、Ｈ：ＨＧＦ遺伝子導入のみ、Ｔ：細胞移植のみ、Ｔ−Ｈ：本発明の細胞移植とＨＧＦの併用療法。FIG. 5 is a diagram showing the wall thickness of the anterior left ventricular wall in cardiac ultrasonography. The wall thickness of the anterior left ventricular wall that decreased after LAD ligation was significantly recovered in the TH group at 4 weeks after transplantation, but no other wall thickness recovery was observed in the other groups. This anterior wall recovery was maintained for up to 8 weeks after transplantation. C: Control, H: HGF gene transfer only, T: Cell transplantation only, TH: Combination therapy of cell transplantation and HGF of the present invention. 図６（図６Ａおよび図６Ｂ）は、細胞移植群では、梗塞巣に移植した心筋細胞が認められるものの、左室内腔が拡大し、非梗塞部に間質の線維化が及んでいる。一方、心筋細胞移植と遺伝子導入を併用した群では、左室前壁は、肥厚し、左室内腔は小さく、非梗塞巣の線維化は抑制された。また、細胞移植群のみでは、α−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、α−ジストログリカンの染色性の向上を認めた。β−ジストログリカンの免疫染色において、細胞移植群では、β−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、β−ジストログリカンは強く染色された。β１−インテグリンにおいては、併用療法群において、心筋細胞膜状に染色性の向上を認めた。パネルＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＨは、ヘマトキシリンエオジン染色を示す。パネルＢおよびＥは、マッソントリクローム染色を示す。パネルＨ，Ｉは、α−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＪ、Ｋ、は、β−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＬ、Ｍ、は、併用療法群におけるβ１−インテグリン免疫染色を示す。In FIG. 6 (FIGS. 6A and 6B), in the cell transplantation group, although the myocardial cells transplanted into the infarct are observed, the left ventricle is enlarged and the interstitial fibrosis reaches the non-infarcted part. On the other hand, in the group using both cardiomyocyte transplantation and gene transfer, the left ventricular anterior wall was thickened, the left ventricular cavity was small, and fibrosis of the non-infarcted lesion was suppressed. In addition, the expression of α-dystroglycan was not observed only in the cell transplantation group, but in the combination therapy group, the staining property of α-dystroglycan was improved. In β-dystroglycan immunostaining, β-dystroglycan expression was not observed in the cell transplant group, but β-dystroglycan was strongly stained in the combination therapy group. In β1-integrin, in the combination therapy group, an improvement in staining was observed in the form of a myocardial cell membrane. Panels A, C, D, F, G and H show hematoxylin and eosin staining. Panels B and E show Masson trichrome staining. Panels H and I show α-dystroglycan immunostaining. Panels J, K show β-dystroglycan immunostaining. Panels L and M show β1-integrin immunostaining in the combination therapy group. 図６（図６Ａおよび図６Ｂ）は、細胞移植群では、梗塞巣に移植した心筋細胞が認められるものの、左室内腔が拡大し、非梗塞部に間質の線維化が及んでいる。一方、心筋細胞移植と遺伝子導入を併用した群では、左室前壁は、肥厚し、左室内腔は小さく、非梗塞巣の線維化は抑制された。また、細胞移植群のみでは、α−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、α−ジストログリカンの染色性の向上を認めた。β−ジストログリカンの免疫染色において、細胞移植群では、β−ジストログリカンの発現を認めなかったが、併用療法群では、β−ジストログリカンは強く染色された。β１−インテグリンにおいては、併用療法群において、心筋細胞膜状に染色性の向上を認めた。パネルＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＨは、ヘマトキシリンエオジン染色を示す。パネルＢおよびＥは、マッソントリクローム染色を示す。パネルＨ，Ｉは、α−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＪ、Ｋ、は、β−ジストログリカン免疫染色を示す。パネルＬ、Ｍ、は、併用療法群におけるβ１−インテグリン免疫染色を示す。In FIG. 6 (FIGS. 6A and 6B), in the cell transplantation group, although the myocardial cells transplanted into the infarct are observed, the left ventricle is enlarged and the interstitial fibrosis reaches the non-infarcted part. On the other hand, in the group using both cardiomyocyte transplantation and gene transfer, the left ventricular anterior wall was thickened, the left ventricular cavity was small, and fibrosis of the non-infarcted lesion was suppressed. In addition, the expression of α-dystroglycan was not observed only in the cell transplantation group, but in the combination therapy group, the staining property of α-dystroglycan was improved. In β-dystroglycan immunostaining, β-dystroglycan expression was not observed in the cell transplant group, but β-dystroglycan was strongly stained in the combination therapy group. In β1-integrin, in the combination therapy group, an improvement in staining was observed in the form of a myocardial cell membrane. Panels A, C, D, F, G and H show hematoxylin and eosin staining. Panels B and E show Masson trichrome staining. Panels H and I show α-dystroglycan immunostaining. Panels J, K show β-dystroglycan immunostaining. Panels L and M show β1-integrin immunostaining in the combination therapy group. 図７は、組織線維化率（線維化率％）を示す。線維化率％は、併用療法群において有意に抑制されていることが見出された。細胞移植のみを施したモデルでは、心筋細胞の肥大がみられ、線維症化率％は増加していた。FIG. 7 shows the tissue fibrosis rate (fibrosis rate%). It was found that the percent fibrosis was significantly suppressed in the combination therapy group. In the model to which only cell transplantation was applied, cardiomyocyte hypertrophy was observed, and the fibrosis rate% increased. 図８は、血管数を示す図である。第ＶＩＩＩ因子関連抗原に対する免疫染色で評価したところ、併用療法群において、血管数が有意に増加していたことが示された。FIG. 8 is a diagram showing the number of blood vessels. When evaluated by immunostaining for the factor VIII-related antigen, it was shown that the number of blood vessels was significantly increased in the combination therapy group. 図９は、心臓超音波検査における左室前壁の壁厚を示す図である。ＬａｃＺを含むベクターおよびコントロール（Ｓｈａｍ）を用いて同様の処置を行った群（それぞれＬ群およびＳ群）、ならびにＨＧＦおよびＶＥＧＦを用いた。コントロールとして、正常領域のデータおよび処置前のデータを示す。虚血領域における壁厚は、ＨＧＦ群およびＶＥＧＦ群において顕著に改善していたが、Ｌ群およびＳ群では、有意な回復は見られなかった。FIG. 9 is a diagram showing the wall thickness of the anterior left ventricular wall in cardiac ultrasonography. Groups treated with vectors containing LacZ and controls (Sham) (L and S groups, respectively), and HGF and VEGF were used. As a control, normal area data and pre-treatment data are shown. Wall thickness in the ischemic region was significantly improved in the HGF and VEGF groups, but no significant recovery was seen in the L and S groups. 図１０は、第ＶＩＩＩ因子関連抗原での免疫組織化学染色の様子を示す写真である。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により血管数が増加しているのに対し、ＬａｃＺでの処置では増加が乏しい様子が分かる。FIG. 10 is a photograph showing the state of immunohistochemical staining with a factor VIII-related antigen. It can be seen that the number of blood vessels was increased by treatment with HGF and VEGF, whereas the increase was poor with treatment with LacZ. 図１１は、虚血領域での毛細血管数の増加を示すグラフである。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により、Ｌ群およびＳ群に比べて有意に血管数が増していることが分かる。ＦおよびＶＥＧＦでの処置により血管数が増加しているのに対し、ＬａｃＺでの処置では増加が乏しい様子が分かる。FIG. 11 is a graph showing an increase in the number of capillaries in the ischemic region. It can be seen that the number of blood vessels is significantly increased by treatment with HGF and VEGF as compared with the L group and the S group. It can be seen that the number of blood vessels is increased by treatment with F and VEGF, whereas the increase is poor with treatment with LacZ. 図１２は、虚血領域での局所的血流の変化を示すグラフである。ＨＧＦおよびＶＥＧＦでの処置により、有意に血流が増していることが分かる。虚血領域の局所的血流を正常領域のものの％として示した。局所的血液灌流により、ＨＧＦおよびＶＥＧＦ群の療法で、有意な回復が見られた。ＬａｃＺおよびＳｈａｍでは効果はなかった。ＦおよびＶＥＧＦでの処置により血管数が増加しているのに対し、ＬａｃＺでの処置では増加が乏しい様子が分かる。FIG. 12 is a graph showing changes in local blood flow in the ischemic region. It can be seen that treatment with HGF and VEGF significantly increased blood flow. The local blood flow in the ischemic area is shown as% of the normal area. Local blood perfusion showed significant recovery with the HGF and VEGF groups of therapies. LacZ and Sham had no effect. It can be seen that the number of blood vessels is increased by treatment with F and VEGF, whereas the increase is poor with treatment with LacZ. 図１３は、骨格筋芽細胞移植後の左室機能の変化を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。FIG. 13 is a graph showing changes in left ventricular function after skeletal myoblast transplantation. Control is no treatment, CTx is skeletal myoblast transplantation only, HGF is HGF administration only, and CTx + HGF is a combination therapy of skeletal myoblast transplantation and HGF administration. It can be seen that the combination therapy is significantly effective. 図１４は、骨格筋芽細胞移植後の左室収縮性を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。FIG. 14 is a graph showing left ventricular contractility after skeletal myoblast transplantation. Control is no treatment, CTx is skeletal myoblast transplantation only, HGF is HGF administration only, and CTx + HGF is a combination therapy of skeletal myoblast transplantation and HGF administration. It can be seen that the combination therapy is significantly effective. 図１５は、骨格筋芽細胞移植後の拡張末期の面積を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。FIG. 15 is a graph showing the end-diastolic area after skeletal myoblast transplantation. Control is no treatment, CTx is skeletal myoblast transplantation only, HGF is HGF administration only, and CTx + HGF is a combination therapy of skeletal myoblast transplantation and HGF administration. It can be seen that the combination therapy is significantly effective. 図１６は、骨格筋芽細胞移植後の収縮末期の面積を示すグラフである。コントロールは、処置なし、ＣＴｘは骨格筋芽細胞移植のみ、ＨＧＦはＨＧＦ投与のみ、ＣＴｘ＋ＨＧＦは骨格筋芽細胞移植とＨＧＦ投与との併用療法を示す。併用療法が有意に効果を示すことが分かる。FIG. 16 is a graph showing the area at the end systole after skeletal myoblast transplantation. Control is no treatment, CTx is skeletal myoblast transplantation only, HGF is HGF administration only, and CTx + HGF is a combination therapy of skeletal myoblast transplantation and HGF administration. It can be seen that the combination therapy is significantly effective. 図１７は、BTO TO-2ハムスター（DCMハムスター）の心筋写真を示す。左は18週齢のものであり、右は27週齢のものである。FIG. 17 shows a myocardial photograph of a BTO TO-2 hamster (DCM hamster). The left is 18 weeks old and the right is 27 weeks old. 図１８は、実施例１０において行った実験スキームを示す。FIG. 18 shows the experimental scheme performed in Example 10. 図１９は、BIO FIBハムスター例を示す。FIG. 19 shows an example of a BIO FIB hamster. 図２０は、筋芽細胞のデスミン染色例を示す。FIG. 20 shows an example of desmin staining of myoblasts. 図２１は、細胞移植の針注射位置例を示す。FIG. 21 shows an example of a needle injection position for cell transplantation. 図２２は、実施例１０のＬＶＤｄ、ＬＶＤｓの結果を示す。それぞれ左からＣ群（コントロール）、Ｔ群（細胞のみ）、Ｈ群（ＨＧＦのみ）およびT+H群（併用）を示す。FIG. 22 shows the results of LVDd and LVDs in Example 10. From left, C group (control), T group (only cells), H group (only HGF) and T + H group (combination) are shown. 図２３は、実施例１０のＬＶＥＦおよび体重の結果を示す。それぞれ左からＣ群（コントロール）、Ｔ群（細胞のみ）、Ｈ群（ＨＧＦのみ）およびT+H群（併用）を示す。FIG. 23 shows the LVEF and body weight results of Example 10. From left, C group (control), T group (only cells), H group (only HGF) and T + H group (combination) are shown. 図２４は、実施例１０のＨＥ染色の様子を示す。上段は左からＣ群（コントロール）、Ｔ群（細胞のみ）、Ｈ群（ＨＧＦのみ）およびT+H群（併用）を示す。下段は、移植された筋芽細胞の様子を示す。FIG. 24 shows the state of HE staining in Example 10. The upper row shows C group (control), T group (only cells), H group (only HGF) and T + H group (combination) from the left. The lower row shows the state of the transplanted myoblast. 図２５は、実施例１０のマッソントリクローム染色の様子を示す。FIG. 25 shows the state of Masson trichrome staining of Example 10. 図２６は、実施例１０の電顕写真を示す。左はコントロール、右はT+H群を示す。FIG. 26 shows an electron micrograph of Example 10. The left shows the control and the right shows the T + H group.

配列番号１は、ヒトＨＧＦ cDNAであり、配列番号２は、ヒトＨＧＦである。   SEQ ID NO: 1 is human HGF cDNA and SEQ ID NO: 2 is human HGF.

Claims (51)

生物の心疾患の治療、予防または予後のための組成物であって、
細胞生理活性物質および細胞を、該器官への移入に適した形態で含む、
組成物。 A composition for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism,
Comprising a cell bioactive substance and cells in a form suitable for transfer to the organ,
Composition. 前記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. 前記心疾患は拡張型心筋症を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy. 前記細胞生理活性物質は、造血活性、コロニー刺激活性または細胞増殖活性を有する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance has hematopoietic activity, colony stimulating activity, or cell proliferation activity. 前記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用の少なくとも１つの活性を有する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance has at least one activity of angiogenic activity and antifibrotic activity. 前記細胞生理活性物質は、血管新生活性および抗線維化作用を有する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance has an angiogenic activity and an anti-fibrotic effect. 前記細胞生理活性物質は、キナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance has a kinase receptor as a receptor. 前記細胞生理活性物質は、チロシンキナーゼ型レセプターをレセプターとして有する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance has a tyrosine kinase type receptor as a receptor. 前記細胞生理活性物質は、ＦＧＦ、ＨＧＦおよびＶＥＧＦからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is selected from the group consisting of FGF, HGF and VEGF. 前記細胞生理活性物質は、ＨＧＦである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is HGF. 前記細胞生理活性物質は、ＶＥＧＦである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is VEGF. 前記細胞生理活性物質は、そのレセプターがｃ−ｍｅｔである、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the receptor for the cell physiologically active substance is c-met. 前記細胞は、胚性幹細胞または組織幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is an embryonic stem cell or a tissue stem cell. 前記細胞は、分化した細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is a differentiated cell. 前記細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉に由来する幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells are stem cells derived from ectoderm, mesoderm or endoderm. 前記細胞は、中胚葉に由来する幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells are stem cells derived from mesoderm. 前記細胞は、造血幹細胞または間葉系幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells are hematopoietic stem cells or mesenchymal stem cells. 前記細胞は、間葉系幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is a mesenchymal stem cell. 前記細胞は、骨髄系の組織幹細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is a myeloid tissue stem cell. 前記細胞は、間葉系幹細胞に由来する分化細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is a differentiated cell derived from a mesenchymal stem cell. 前記細胞は、心筋細胞、骨格筋芽細胞および骨芽細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells are selected from the group consisting of cardiomyocytes, skeletal myoblasts and osteoblasts. 前記細胞は、初代培養心筋細胞または分化させた心筋細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells are primary cultured cardiomyocytes or differentiated cardiomyocytes. 前記細胞は、骨髄由来である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is derived from bone marrow. 前記細胞は、同系由来、同種異系由来または異種由来の細胞である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is a cell derived from a syngeneic, allogeneic or heterogeneous cell. 前記細胞は、自己由来である、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the cell is autologous. 前記細胞生理活性物質は、タンパク質形態または核酸形態である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is in a protein form or a nucleic acid form. 前記細胞生理活性物質は、タンパク質形態である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is in a protein form. 前記細胞生理活性物質は、核酸形態である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is in a nucleic acid form. 前記細胞生理活性物質は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの形態で存在する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is present in the form of a viral vector or a non-viral vector. 前記細胞生理活性物質は、ＨＶＪリポソームの形態で存在する、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is present in the form of HVJ liposomes. 徐放性形態である、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1 in a sustained release form. さらに生体親和性材料を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1 further comprising a biocompatible material. シリコーン、コラーゲン、ゼラチンおよびグリコール酸・乳酸の共重合体からなる群より選択される少なくとも１つの生体親和性材料を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, comprising at least one biocompatible material selected from the group consisting of silicone, collagen, gelatin and a copolymer of glycolic acid / lactic acid. 前記細胞生理活性物質は２種類以上の細胞生理活性物質である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell physiologically active substance is two or more kinds of cell physiologically active substances. さらに他の薬剤を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1 further comprising another agent. 前記細胞は２種類以上の細胞を含む、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cells include two or more types of cells. 前記細胞は、ヒト由来である、請求項１に記載の組成物。 The composition according to claim 1, wherein the cell is derived from a human. 前記生物は、ヒトである、請求項１に記載の組成物。 The composition of claim 1, wherein the organism is a human. 生物の心疾患の治療、予防または予後のためのキットであって、
細胞生理活性物質；
細胞；ならびに
該細胞生理活性物質および該細胞の該器官への移植に関する指示書、
を備え、ここで、該指示書は、
該細胞生理活性物質を該細胞の心臓への移植の前、同時または後に投与することを指示する、
キット。 A kit for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease,
Cell physiologically active substance;
A cell; and instructions regarding the transplantation of the cell bioactive substance and the cell into the organ;
Where the instructions are
Directing administration of the cell bioactive substance prior to, simultaneously with, or after transplantation of the cells into the heart;
kit. 前記指示書は、前記細胞生理活性物質を前記細胞の前記心臓への移植の前に投与することを指示する、請求項３９に記載のキット。 40. The kit of claim 39, wherein the instructions direct administration of the cell bioactive substance prior to transplantation of the cells into the heart. 前記指示書は、前記細胞生理活性物質および前記細胞を前記心臓の罹患部位、傷害部位または虚血部位へと投与することを指示する、請求項３９に記載のキット。 40. The kit according to claim 39, wherein the instructions indicate that the cell physiologically active substance and the cells are administered to a diseased site, injury site or ischemia site of the heart. 前記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、請求項３９に記載のキット。 40. The kit of claim 39, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. 前記心疾患は拡張型心筋症であり、前記細胞生理活性物質および前記細胞の投与は、左心室を含む部位に投与することを含む、請求項３９に記載のキット。 40. The kit according to claim 39, wherein the heart disease is dilated cardiomyopathy, and the administration of the cell physiologically active substance and the cells comprises administration to a site including the left ventricle. 生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための薬学的組成物であって、
細胞生理活性物質、
を含む、薬学的組成物。 A pharmaceutical composition for administration with cells for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease comprising:
Cell physiologically active substance,
A pharmaceutical composition comprising: 生物の心疾患の治療、予防または予後のための方法であって、
細胞生理活性物質を該器官へ提供する工程；および
細胞を心臓へ提供する工程、
を包含する、方法。 A method for the treatment, prevention or prognosis of a biological heart disease,
Providing a cell bioactive substance to the organ; and providing a cell to the heart;
Including the method. 前記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. 前記心疾患は拡張型心筋症を含む、請求項４５に記載の方法。 46. The method of claim 45, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy. 生物の心疾患の治療、予防または予後のための医薬組成物の製造のための、細胞生理活性物質；および細胞の使用。 Use of a cell physiologically active substance; and a cell for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism. 前記心疾患は、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症および拡張型心筋症からなる群より選択される少なくとも１つの疾患を含む、請求項４８に記載の使用。 49. Use according to claim 48, wherein the heart disease comprises at least one disease selected from the group consisting of myocarditis, hypertrophic cardiomyopathy, dilated phase hypertrophic cardiomyopathy and dilated cardiomyopathy. 前記心疾患は拡張型心筋症を含む、請求項４８に記載の使用。 49. Use according to claim 48, wherein the heart disease comprises dilated cardiomyopathy. 生物の心疾患の治療、予防または予後のために細胞とともに投与するための、細胞生理活性物質の使用。
Use of a cell physiologically active substance for administration with a cell for the treatment, prevention or prognosis of a heart disease of an organism.
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