【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バキュロウイルスを有効成分として含有する抗ウイルス剤（特には抗インフルエンザウイルス剤）及び抗癌剤に関する。なお、本明細書において、抗ウイルス剤には、ウイルス予防剤及び治療剤の両方が含まれ、好ましくは予防剤である。また、抗癌剤には、癌治療剤及び癌予防剤の両方が含まれ、好ましくは癌治療剤である。
【０００２】
【従来の技術】
バキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ；ＡｃＮＰＶ）は、バイオ農薬として、あるいは、昆虫細胞における効率的な組換えタンパク質産生ツールとして、長く使用されてきた。その宿主特異性は、節足動物に由来する細胞に限定されるものと当初は考えられていた。しかし、最近、適当な真核生物プロモーターを含むＡｃＮＰＶが、いくつかの哺乳動物細胞及び動物モデルに効率よく導入され、外来遺伝子を発現することがいくつかのグループから報告された。遺伝子治療への適用におけるＡｃＮＰＶの有利な特徴としては、高い感染多様度（ｍ．ｏ．ｉ．）にもかかわらず哺乳動物細胞における低い細胞毒性、哺乳動物細胞における先天的な複製不能、及び動物におけるバキュロウイルスに対する先在抗体の不在が挙げられる。
【０００３】
一般的に、哺乳動物細胞へのウイルス感染は、インターフェロン（ＩＦＮ）ファミリーを含む種々のサイトカインの産生を引き起こす。多くのＲＮＡ及びＤＮＡウイルスの複製中に産生される二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、種々の細胞においてα／βＩＦＮｓを誘導する。或る報告では、野生型のバキュロウイルスが、マウス胚性線維芽細胞を含む哺乳動物細胞においてＩＦＮ産生を誘導し、インビボにて脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）感染からマウスを防御した（非特許文献１）。しかし、ＩＦＮ誘導及び致死のＥＭＣＶ感染からの防御の基礎となる正確な機構は、未だ不明である。また、別の報告によれば、バキュロウイルス感染が、ラット幹細胞の初代培養において、フェノバルビタール介在性の遺伝子誘導を抑制し、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、及びＩＬ−１β発現を刺激する（非特許文献２）。
【０００４】
【非特許文献１】
「ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９９９年，第７３巻，ｐ．９９４４−９９５１
【非特許文献２】
「ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」，（英国），２０００年，第７巻，ｐ．１２７４−１２８３
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）を発現する組換えバキュロウイルスで免疫したマウスにおける、致死のインフルエンザ感染に対する防御的免疫の誘導について検討した。致死のインフルエンザウイルス接種に対する防御に関して、組換えバキュロウイルスで鼻腔内免疫したマウスだけでなく、野生型バキュロウイルスで免疫したマウスについても観察した。また、バキュロウイルスの接種は、マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７において、炎症性サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の分泌を促進した。これらの結果は、バキュロウイルスが、マウスにおける致死のインフルエンザウイルス接種からの防御を可能とする、先天性免疫を誘導することを示している。
【０００６】
このように、本発明者は、インフルエンザヘマグルチニンを発現する組換えバキュロウイルスだけでなく、野生型バキュロウイルスも、抗インフルエンザウイルス活性を有することを新たに見いだした。インフルエンザヘマグルチニンを発現する組換えバキュロウイルスを、抗インフルエンザウイルス剤として用いた場合、長期間の発現と免疫寛容可能性が低い、あるいは、抗ＨＡ抗体が誘導されるなどの欠点がある。
従って、本発明の課題は、従来技術の前記の欠点を解消し、長期間の発現と免疫寛容可能性が高く、抗ＨＡ抗体が誘導されることのない、抗ウイルス剤（特には抗インフルエンザウイルス剤）を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、バキュロウイルスを有効成分とする、抗ウイルス剤により解決することができる。本発明の好ましい態様によれば、前記抗ウイルス剤が抗インフルエンザウイルス剤である。
また、本発明は、バキュロウイルスを有効成分とする、抗癌剤に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の抗ウイルス剤について、本発明の抗インフルエンザウイルス剤を例として主に説明するが、本発明の抗インフルエンザウイルス剤に関する以下の説明は、インフルエンザウイルス以外の抗ウイルス剤についても、そのまま適用することができる。
【０００９】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、その有効成分としてバキュロウイルスを含有する。本明細書において「インフルエンザウイルス」とは、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型の各インフルエンザウイルス、並びにそれらの変異体を含む。
バキュロウイルスは、環状の二本鎖ＤＮＡ（分子量５９×１０６〜１６４×１０６）を遺伝子としてもつ昆虫の病原ウイルスであり、例えば、核多角体病ウイルス（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｕｒｓ；ＮＰＶ）、ゲアヌロウイルス（ｇｅａｎｕｌｏｖｉｒｕｓ；ＧＶ）、又は非閉寒性ウイルス（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅｄ ｖｉｒｕｓ）等が知られている。前記核多角体病ウイルスには、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｒｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）又はカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）等が含まれる。
【００１０】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤では、これらの任意のバキュロウイルスを有効成分として用いることができ、エンベロープの主要成分としてエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４を含むバキュロウイルスを用いることがより好ましい。エンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４は、出芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ）のエンベロープの主要成分であり、エンドサイトーシスによる宿主細胞へのウイルス侵入に関連するタンパク質である（文献１８〜２４）。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分としては、ＮＰＶが好ましく、ＡｃＮＰＶ又はＢｍＮＰＶがより好ましく、ＡｃＮＰＶが特に好ましい。
【００１１】
バキュロウイルスは、昆虫細胞における効率的な組換えタンパク質産生ツールとして、長く使用されており（文献１、２）、適当な真核生物プロモーターを含むＡｃＮＰＶが、いくつかの哺乳動物細胞（文献３〜９）及び動物モデル（文献１０〜１３）に効率よく導入され、外来遺伝子を発現することがいくつかのグループから報告されている。
外来遺伝子を発現するための組換えタンパク質産生ツールとしてバキュロウイルスを用いる場合には、バキュロウイルスのゲノムサイズが巨大であるため、バキュロウイルストランスファーベクターに外来遺伝子を組み込んだ後、組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスとを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組換えを起こすことにより、組換えバキュロウイルスを作製することができる。
【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤では、野生型のバキュロウイルス（すなわち、生バキュロウイルス）をそのまま用いることもできる。
【００１３】
また、本発明には、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４を有効成分とする抗インフルエンザウイルス剤も含まれる。本発明の前記抗インフルエンザウイルス剤は、エンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４を、抗インフルエンザウイルス活性を示す形で含有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、精製したエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４として、粗製のエンベロープの形で、あるいは、バキュロウイルスの形で、含有することができる。
【００１４】
また、本発明の抗インフルエンザウイルス剤の有効成分である、バキュロウイルスは、先天性免疫を誘導することから、インフルエンザウイルス以外のウイルス、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症侯群）ウイルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＡＴＬ（成人Ｔ細胞白血病）ウイルス、又はＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルスなどに対しても有効であり、更には、抗癌剤（癌治療剤及び癌予防剤を含み、特には癌治療剤）としても有効である。すなわち、本発明には、バキュロウイルス（又はエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４）を有効成分とする抗ウイルス剤及び／又は抗癌剤も含まれる。
【００１５】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分であるバキュロウイルスを単独で、あるいは、所望により薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤と共に、含有することができる。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、これに限定されるものではないが、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で、有効成分を含有することができる。
本発明の抗インフルエンザウイルス剤の投与量は、治療対象動物（哺乳類、特にはヒト）の種及びその薬剤に対する個体の応答性、並びに選択される製剤の剤形及び投与時間や間隔などに応じて、適宜選択することができる。
【００１６】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、有効成分であるバキュロウイルス以外に、場合により医薬的に許容することのできる公知の担体又は希釈剤との組合せで、経口、非経口、又は局所的な経路のいずれかにより、単回又は複数回で投与することができる。より具体的な投与経路としては、鼻腔内投与が特に好ましいが、例えば、筋肉内、皮内、腹膣内、又は尾静中でもよい。本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、種々の異なる剤形、例えば、粉末剤、スプレー剤、ローション剤、水性懸濁剤、注射用溶液剤、又はシロップ剤などにすることができる。
【００１７】
以下の実施例で具体的データに基づいて示すように、生バキュロウイルスは、（例えば、インビトロ及びインビボでのマクロファージ細胞による）先天性免疫応答を刺激し、活性化する。バキュロウイルスによるマウスの筋肉内及び腹腔内免疫は、特定の抗体応答をより高いレベルで誘導したが、鼻腔内免疫のみがインフルエンザウイルス接種に対する防御を達成した。ＨＡを発現する組換えバキュロウイルスの鼻腔内接種は、鼻腔内洗浄液において、低いレベルのＩｇＡを誘導したにすぎなかった。更に、コントロールウイルスベクターとして用いた野生型バキュロウイルスで鼻腔内免疫したマウスでも、インフルエンザウイルス接種に対して、前記組換えウイルスで得られたのと同じ防御が得られた。これらの結果は、バキュロウイルス接種が非特異的抗ウイルス活性をマウスに与えることを示す。グロノウスキ（Ｇｒｏｎｏｗｓｋｉ）らは、生バキュロウイルスが、哺乳動物細胞及びＥＭＣＶ感染マウスにおいて抗ウイルス活性を示したことを報告した（文献１４）。彼らは、ＩＦＮ誘導が、バキュロウイルスのエンベロープタンパク質ｇｐ６４と応答細胞膜上の受容体との間の相互作用を必要とすることを示唆した。しかしながら、インビトロ及びインビボにおけるバキュロウイルス誘導ＩＦＮ発現の基礎となる機構は不明である。
【００１８】
バキュロウイルスエンベロープ糖タンパク質ｇｐ６４は、出芽ウイルス（ｂｕｄｄｅｄ ｖｉｒｕｓ）のエンベロープの主要成分であり、エンドサイトーシスによる宿主細胞へのウイルス侵入に関連する（文献１８〜２４）。ｇｐ６４エンベロープタンパク質は、マンノース、フコース、及びＮ−アセチルグルコサミンを含有するが、ガラクトース又は末端シアル酸残基は検出されない（文献２５）。昆虫細胞系で産生される組換え糖タンパク質に結合するグリカンは、天然哺乳動物産物で見いだされるものと異なる。本発明者は、以下の実施例において、ＡｃＮＰＶが先天性免疫（例えば、マクロファージによる免疫）をインビボで刺激することを示した。ＡｃＮＰＶ処理したマウスの肺は、インフルエンザウイルス感染の後、マクロファージを含む単球の顕著な湿潤を示した。このように、肺硬化に対するバキュロウイルス処理の効果は、肺組織のウイルス増殖の阻害に依存する。更に、ＡｃＮＰＶ感染させたマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７細胞では、活性化リガンド（ＣＤ６９及び成熟マクロファージ抗原受容体）の発現が増加し、産生される炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）も増加した。これらのデータは、ＲＡＷ２６４．７マクロファージからの炎症性サイトカインの放出を促進する免疫刺激能をＡｃＮＰＶが有するとの結論を強く支持する。マンノース受容体（ＭＲ）は、微生物の表面及び細胞壁に存在するいくつかの炭水化物を認識する。ＭＲは、本来、マクロファージ及び樹状細胞で発現し、ＭＲ介在エンドサイトーシス及びファゴサイトーシスに関連する。加えて、ＭＲは、宿主防御において主要な役割を果たし、先天性免疫を誘導する。従って、ＡｃＮＰＶを接種されたマウスは、特定の粘膜部位（例えば、鼻腔関連リンパ組織及び肺組織）内に存在するマクロファージ及び樹状細胞の表面に発現するＭＲと相互作用するマンノース含有ｇｐ６４エンベロープタンパク質により、直接刺激された可能性がある。
【００１９】
最近の研究では、先天性免疫の活性化は、宿主の防御的及び二次適応性免疫応答と密接に関連した。ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）ファミリーに属する各種タンパク質は、この過程の本質的成分である（文献２６〜２８）。哺乳動物系で１０種類のＴＬＲが同定されているが、現時点のパラダイムは特有である。各ＴＬＲは、異なったリガンドを有する（文献２８）。ＴＬＲ４は、グラム陰性細菌由来のＬＰＳに対する受容体であり、ＴＬＲ２は、種々の細菌細胞壁成分（リポテイコ酸、ペプチドグリカン、及び細菌外膜リポタンパク質を含む）に対する細胞応答性を制御し、ＴＬＲ５は、細菌フラジェリン誘導細胞活性化を媒介する（文献２９〜３１）。ＴＬＲファミリーに属する各種タンパク質は、シグナルペプチドからなる細胞外ドメイン、多様なロイシンリッチ反復、及び細胞質内ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ ＩＬ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）ドメインを含む、いくつかの共通する構造的性質を有する。本発明において、ＡｃＮＰＶが、免疫細胞の強力な刺激剤であることを示した。マンノース含量の高いバキュロウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ６４が、ＴＬＲ分子を認識し、免疫応答を刺激する可能性がある。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ウイルスの調製》
（１）バキュロウイルスの調製
組換えバキュロウイルスによる免疫の効率を決定するために、ＣＡＧプロモーターの制御下にインフルエンザウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）のＨＡ遺伝子を発現する組換えバキュロウイルス（ｐＡｃＣＡＧ−ＨＡ；図１）を構築した。ＣＡＧプロモーターは、種々の哺乳動物細胞系において広く利用されており、ＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターよりも強力な発現を示す（文献１７）。
【００２１】
本実施例及び以下の実施例において、ＡｃＮＰＶ及び組換えバキュロウイルスは、１００μｇ／ｍＬカナマイシン及び１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有のＴＭＮ−ＦＨ培地（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）にて、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）９（Ｓｆ９）細胞を用いて増殖させた。
バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＣＡＧ−ＨＡは、バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＣＡＧＭＣＳ（文献６）のクローニングサイトに、全長ヘマグルチニン（ＨＡ）ｃＤＮＡを挿入することによって構築した。
インフルエンザウイルスＨＡゲノムを含む組換えバキュロウイルス（ＡｃＣＡＧ−ＨＡ）は、前記トランスファーベクター及び線状化バキュロウイルスＤＮＡ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）をＳｆ９細胞にコトランスフェクションし、相同組換えにより作製した（文献１）。
【００２２】
ＡｃＣＡＧ−ＨＡ及びＡｃＮＰＶは、以下の手順で精製した。すなわち、感染から３〜４日で培養上清を回収し、遠心（５０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により細胞片を除去した。ウイルスを遠心［２５０００ｒｐｍ（５７０００Ｇ）、９０分間、４℃］により沈殿させ、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）１ｍＬに再懸濁し、１０〜６０％（Ｗ／Ｖ）スクロース勾配上に載せ、遠心［２５０００ｒｐｍ（５７０００Ｇ）、９０分間、４℃］した。ウイルスバンドを回収し、ＰＢＳに再懸濁し、遠心［２５０００ｒｐｍ（５７０００Ｇ）、９０分間、４℃］した。ウイルス沈殿をＰＢＳに再懸濁し、プラークアッセイ（文献１）により感染力価を決定した。
なお、本実施例及び以下の実施例で使用した全ての組織培養培地及び培地成分は、エンドトキシンを含まないもの（エンドトキシンフリー）であった。これらのウイルス中のエンドトキシンレベルは、市販のキット（Ｐｙｒｏｄｉｃｋ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｍｅａｓｕｒｅ ｋｉｔ； Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｃｏ．）を用いて測定したように、エンドトキシンフリー（＜０．０１ＥＵ／ｍＬ）であった。
【００２３】
（２）インフルエンザウイルスの調製
インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）は、グルコース（１０００ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（３μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、及び１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活化ＦＢＳ含有のダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ Ｃｏ．）で培養するマジン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞にて、３日間増殖させた。培養上清を回収し、−８０℃で保存した。ウイルス力価は、プラークアッセイ（文献１６）により決定した。肺におけるウイルス力価を決定するために、希ジエチルエーテル麻酔下でマウスを屠殺した。続いて、肺ホモジェネートを調製し、生理食塩水で連続的に希釈した後、プラークアッセイによりウイルス力価を決定した。
【００２４】
（３）ウイルス感染培養細胞におけるＨＡタンパク質の検出
組換えバキュロウイルス感染によるＨＡタンパク質の発現を、ＨＡタンパク質により上昇させたポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析により、検討した。
具体的には、ヒト肝癌細胞系Ｈｕｈ７を１０％熱不活化ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで維持し、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ及びＡｃＮＰＶ（ｍ．ｏ．ｉ．＝２０又は２００）をそれぞれ感染させた。感染から２４時間後、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１ｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び１０％グリセロール含有の溶解バッファーで、細胞を溶解した。細胞抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）上にブロットした。前記ブロット上でのＨＡタンパク質の検出は、連続的なインキュベーション、すなわち、１：２００希釈の抗Ａ／ＰＲ／８／３４マウスポリクローナル抗体（精製インフルエンザウイルスで免疫したマウスから得た血清）によるインキュベーション、及び１：１０００希釈のＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．）によるインキュベーションにより、市販のキット［ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ （ＥＣＬ） ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ］を用いて、実施した。
【００２５】
結果を図２に示す。細胞抽出液は、７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、インフルエンザウイルスに対するマウスポリクローナル抗体を用いるイムノブロッティングにより分析した。図２において、レーン１は、モック（ｍｏｃｋ）感染の細胞ライセートであり、レーン２は、ＡｃＮＰＶ感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝２００）の細胞ライセートであり、レーン３は、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝２０）の細胞ライセートであり、レーン４は、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ感染（ｍ．ｏ．ｉ．＝２００）の細胞ライセートである。矢印はＨＡタンパク質を示す。
図２に示すように、ＡｃＣＡＧ−ＨＡを感染させたＨｕｈ７細胞では、ＨＡタンパク質の発現が用量依存的に検出されたのに対して、ＡｃＮＰＶを感染させた細胞では、バンドが観察されなかった。
【００２６】
【実施例２】
《組換えバキュロウイルスで免疫したマウスにおける、致死インフルエンザウイルス接種に対する防御》
ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶ（１．１×１０８ｐｆｕ／マウス／回）によるマウスの免疫は、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ；ｉ．ｍ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ；ｉ．ｄ）、腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ；ｉ．ｐ）、又は鼻腔内（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ；ｉ．ｎ）の各投与経路にて、２週間の間隔をおいて２回実施した（図３）。２回目の免疫から３週間後に、致死量（５．６×１０５ｐｆｕ）のインフルエンザウイルスを前記マウスに接種した。
【００２７】
より具体的には、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｊａｐａｎ， Ｉｎｃ．）の腹部表皮中に、２週間離して２回、バキュロウイルス（ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶ）を接種（１．１×１０８ｐｆｕ／マウス）した。生理食塩水５０μＬ中に５．６×１０５ｐｆｕのマウス適合Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルス（１００ＬＤ５０）からなる、致死のインフルエンザウイルス接種は、２回目の免疫から３週間後に、鼻腔内投与により実施した。この接種は、肺における急速且つ広範なウイルス複製を引き起こし、５〜７日以内で死に至った。インフルエンザウイルス接種後に、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶで免疫したマウスにおける生存率を比較した。
【００２８】
ＡｃＣＡＧ−ＨＡによる免疫の有効性を、ＨＡタンパク質に対するＩｇＧ及びＩｇＡの誘導、並びにマウス生存率により評価した。コントロールマウスには、ＡｃＮＰＶを免疫した。最初の免疫から１４日後及び２１日後、並びにインフルエンザウイルス接種から３日後に、血清試料及び鼻腔内洗浄試料を取得し、ＨＡに対する特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ応答について、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）により検討した。
【００２９】
より具体的には、ＨＡに対する抗体価を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡは、固相（９６−ｗｅｌｌ Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐ／Ｎ； Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）上に、以下の一連の試薬を順次添加することにより実施した。
第１試薬：Ａ／ＰＲ／８／３４インフルエンザウイルスから精製したＨＡ分子
第２試薬：血清試料
第３試薬：ビオチン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ， Ｉｎｃ．）
第４試薬：ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ， Ｉｎｃ．）
最終試薬：ｐ−ニトロフェニル−ホスフェート（Ｍｏｓｓ， Ｉｎｃ．）
生成したクロモゲンの４０５ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートオートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ Ｍｕｌｔｉｃａｎ Ｌａｂｓｙｎｔｅｍ Ｏｙ）を用いて測定した。
【００３０】
結果を表１に示す。表１は、種々の投与経路を介して、ヘマグルチニンタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、又は野生型バキュロウイルスで免疫したマウスにおける、鼻腔内及び血清中の抗Ａ／ＰＲ８ＨＡ ＩｇＡ及びＩｇＧの抗体価を示す。マウスは、０日目及び１４日目に、野生型バキュロウイルス又は組換えバキュロウイルスの種々の経路を介した接種により、免疫した。３週間後、致死量のインフルエンザウイルスを接種した。３８日目（インフルエンザウイルス接種から３日後）に、抗体価測定用の血清試料及び鼻腔内洗浄試料を取得した。表１に示す値は、各群の「平均値±標準偏差」を示し、記号「ＮＴ」は、試験を実施しなかったことを示す。
【００３１】
【００３２】
表１に示すように、筋肉内（ｉ．ｍ）又は腹腔内（ｉ．ｐ）への組換えバキュロウイルスによるマウス免疫は、他の投与経路による免疫と比べ、高い抗体応答を誘導した。ＡｃＣＡＧ−ＨＡの接種用量（１０５〜１０８ｐｆｕ／マウス）と、ＨＡに対する抗体の誘導との間には、有意な相関が認められた（データは示さず）。ＡｃＣＡＧ−ＨＡによる鼻腔内（ｉ．ｎ）免疫は、低くはあるが検出可能なＩｇＧ応答を誘導したが、鼻腔内洗浄液中には抗ＨＡ ＩｇＡ応答は検出されなかった。
【００３３】
組換えバキュロウイルスＡｃＣＡＧ−ＨＡ又は野生型バキュロウイルスＡｃＮＰＶ（１．１×１０８ｐｆｕ／マウス／接種）で２回免疫したマウスに、２回目の免疫から２１日後に、希ジエチルエーテル麻酔下で、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（５．６×１０５ｐｆｕ／マウス）５０μＬを接種した。インフルエンザウイルス接種から１４日目までのマウスの生存率を記録した。
結果を図４に示す。図４において、黒菱形及び黒丸は、それぞれ、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶで鼻腔内免疫したマウスの結果を示し、黒四角は、ＡｃＣＡＧ−ＨＡで筋肉内免役したマウスの結果を示し、黒三角は、コントロールとして、生理食塩水を接種したマウスの結果を示す。
【００３４】
図４に示すように、ＡｃＣＡＧ−ＨＡによる筋肉内免疫は、特定の抗体応答を誘導したが、実際の防御は鼻腔内免疫によってのみ達成された。他の接種経路により免疫されたマウスは、抗体応答の誘導にもかかわらず、防御されなかった（データは示さず）。更に、ＡｃＮＰＶで鼻腔内免疫されたマウスも、インフルエンザウイルス接種に対して防御されたが、鼻腔内以外の経路で接種されたマウスでは防御されなかった（データは示さず）。
【００３５】
典型的な体重減少カーブを図５に示す。図５において、黒丸及び黒菱形は、それぞれ、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶで鼻腔内免疫したマウスの結果を示し、黒四角は、ＡｃＣＡＧ−ＨＡで筋肉内免役したマウスの結果を示し、黒三角は、コントロールとして、生理食塩水を接種したマウスの結果を示す。なお、免疫及びインフルエンザウイルス接種の各用量及び実施スケジュールは、図４に示す実験と同じ条件で実施した。
図５に示すように、ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶで鼻腔内免疫されたマウスは、致死接種の感染に対して防御され、減少した体重も有意に少なかった。生理食塩水により、あるいは、鼻腔内以外の経路により免役された動物では、有意な体重減少が維持され、死に至る前に、初期体重の３０〜４０％に達した。
【００３６】
急性肺インフルエンザ感染に対するマウスの防御を評価するために、インフルエンザウイルス接種から３日後の肺におけるウイルス力価及び炎症性サイトカインを測定した。
肺ホモジェネート中のＩＬ−６（炎症性サイトカインの１つ）量は、市販のキット（ＯｐｔＥＩＡＴＭ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−６ Ｓｅｔ； ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。より具体的には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｐ／Ｎ； Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、捕捉用抗体としての抗マウスＩＬ−６モノクローナル抗体［コーティングバッファー（０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５）で希釈したもの］を４℃で一晩コートした。０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳによる洗浄と、１０％ＦＢＳ含有ＰＢＳによる室温での２時間のブロッキングの後、１０倍希釈の肺ホモジェネート又は連続的に希釈したマウス組換えＩＬ−６（１００μＬ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化マウスＩＬ−６モノクローナル抗体及びアビジン−ＨＲＰ結合体（計１００μＬ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。充分な洗浄の後、基質溶液（１００μＬ）を加え、室温で３０分間インキュベートした後、停止溶液（１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ３ＰＯ４）（５０μＬ）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ Ｍｕｌｔｉｃａｎ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）でＯＤ（４５０〜５４０ｎｍ）を測定した。ＩＬ−６含量は、ブランクとして基質溶液を用いる、マウス組換えＩＬ−６の標準曲線から算出した。
【００３７】
結果を表２に示す。表２は、種々の投与経路を介して、ヘマグルチニンタンパク質を発現する組換えバキュロウイルス、又は野生型バキュロウイルスで免疫したマウスにおける、インフルエンザウイルス接種に対する防御を示す。マウスは、０日目及び１４日目に、野生型バキュロウイルス又は組換えバキュロウイルスの種々の経路を介した接種により、免疫した。３週間後、致死量のインフルエンザウイルスを接種した。３８日目（インフルエンザウイルス接種から３日後）に、サイトカイン産生及びウイルス力価測定用の肺ホモジェネートを取得した。表２に示す値は、各群の「平均値±標準偏差」を示し、記号「＊」は、有意差（ｐ＜０．０５）があったことを示す。
【００３８】
【００３９】
ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶで鼻腔内免疫されたマウスでは、鼻腔内以外の経路で免役したマウス、あるいは、非免疫マウスと比較して、肺におけるウイルス力価及びＩＬ−６産生のいずれに関しても、有意な減少を誘導した（表２）。これらの結果は、マウスにおけるバキュロウイルス接種により、先天性免疫応答が誘導されたことを示す。
【００４０】
【実施例３】
《ＡｃＮＰＶによるマウス先天性免疫応答の誘導》
バキュロウイルス接種により誘導される抗ウイルス効果を、更に詳細に決定するために、インフルエンザウイルス感染からの防御について、精製したマウスＩＦＮ−α又はポリ：（Ｉ）−（Ｃ）を用いた処理で誘導した場合と比較した（図６）。インフルエンザウイルス接種の２４時間前に、ＡｃＮＰＶ、マウスＩＦＮ−α、又はポリ：（Ｉ）−（Ｃ）を鼻腔内投与した。
【００４１】
結果を図６に示す。図６において、黒四角は、ＡｃＮＰＶ（１．１×１０８ｐｆｕ）を鼻腔内接種したマウスの結果を示し、黒菱形は、ポリ：（Ｉ）−（Ｃ）（１００μｇ）を腹腔内接種したマウスの結果を示し、黒丸は、マウスＩＦＮ−α（１μｇ）を腹腔内接種したマウスの結果を示し、黒三角は、コントロールとして、生理食塩水を接種したマウスの結果を示す。各グループ当たり６匹のマウスに、前記の各接種を行ってから２４時間後に、致死量のインフルエンザウイルスを接種し、前記インフルエンザウイルス接種から１４日目まで生存率を記録した。
【００４２】
驚くべきことに、ＡｃＮＰＶを鼻腔内接種したマウスは、インフルエンザウイルス接種後のほんのわずかの体重減少、活動及びグルーミングの変化のなさ、並びに１００％の生存率によって示されるように、完全に防御された。生理食塩水を接種したコントロールマウスは、１０日以内に全て死亡した。マウスＩＦＮ−α（１μｇ）及びポリ：（Ｉ）−（Ｃ）（１００μｇ）で、それぞれ、腹腔内処理されたマウスは、３３．３％及び６６．６％の生存を示した。これらの結果は、インフルエンザウイルス接種の２４時間前の野生型バキュロウイルスによる鼻腔内接種は、致死のインフルエンザウイルス感染からマウスを完全に防御することを示す。
【００４３】
ＡｃＮＰＶの防御有効性を、他の血清型のインフルエンザウイルス接種により、更に評価した。
具体的には、インフルエンザウイルス接種の２４時間前にＡｃＮＰＶを鼻腔内接種し、致死量のインフルエンザウイルスＡ／Ｇｕｉｚｈｏｕ及びＢ／Ｉｂａｒａｋｉを、それぞれ、マウスに接種した。感染コントロールマウスとして、ＡｃＮＰＶの予備接種を行うことなく、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ又はＢ／Ｉｂａｒａｋｉを接種した。各グループ当たり５匹のマウスに、前記の各接種を行ってから２４時間後に、致死量のインフルエンザウイルスを接種し、前記インフルエンザウイルス接種から１４日目まで生存率を記録した。
【００４４】
結果を図７に示す。図７において、黒四角及び白丸は、ＡｃＮＰＶの予備接種後に、それぞれ、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ又はＢ／Ｉｂａｒａｋｉを接種したマウスの結果を示し、黒三角及び黒菱形は、ＡｃＮＰＶの予備接種を行うことなく、それぞれ、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ又はＢ／Ｉｂａｒａｋｉを接種したコントロールマウスの結果を示す。
図７に示すように、ＡｃＮＰＶを鼻腔内接種されたマウスは、別の血清型のインフルエンザウイルス、すなわち、Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ（Ｈ３Ｎ２）及びＢ／Ｉｂａｒａｋｉの致死接種に対しても、防御を示した。
【００４５】
【実施例４】
《ＡｃＮＰＶ鼻腔内接種後にインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺における形態学的変化》
肺における病理学的変化の顕微鏡評価のために、インフルエンザウイルス感染から７日後に、ジエチルエーテル吸入による軽い麻酔下にてマウスを屠殺した。肺を摘出し、ＰＢＳ中の１０％ホルマリンで膨張させた。固定後、肺をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００４６】
ＡｃＮＰＶを鼻腔内接種された後にインフルエンザウイルス接種したマウスの肺における組織学的変化を、図８〜図１３に示す。図８及び図９（Ａ−１，Ａ−２）は、非感染のコントロールであり、図１０及び図１１（Ｂ−１，Ｂ−２）は、未処置でインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺であり、図１２及び図１３（Ｃ−１，Ｃ−２）は、インフルエンザウイルス接種の２４時間前に、ＡｃＮＰＶ（１．１×１０８ｐｆｕ）を鼻腔内接種したマウスの肺である。
【００４７】
未処置コントロールの肺では、炎症性細胞も損傷組織も観察されなかった（Ａ−１，Ａ−２）。インフルエンザウイルス感染から７日後に、生理食塩水のみで処理したマウスの肺表面には、顕著な損傷が認められた（データは示さず）。好中球浸潤及び鬱血が、細気管支周囲及び肺胞周囲の各空間の内部に、はっきりと認められた（Ｂ−１）。更に、単核細胞の浸潤、多形核細胞、及び嚢腫形成層が、肺胞周囲の空間に観察された（Ｂ−２；矢印参照）。それに対して、ＡｃＮＰＶを予め接種されたマウスでは、マクロファージを含む単球の顕著な浸潤を示し（Ｃ−１，Ｃ−２；矢印参照）、インフルエンザウイルス接種後の肺表面の損傷はより少なく（データは示さず）、細気管支周囲及び肺胞周囲の各空間に含まれる好中球はより少なかった（データは示さず）。これらの結果は、マクロファージを含む単球が、ＡｃＮＰＶの予備接種により強く誘導され、更に、これらの活性化された免疫担当細胞が、肺組織におけるインフルエンザウイルス感染の広がりを抑制したことを示す。
【００４８】
【実施例５】
《ＡｃＮＰＶによるマウスマクロファージ細胞系における炎症性サイトカイン産生の誘導》
これらのインビボ実験は、組換えバキュロウイルスだけでなく、野生型ウイルスＡｃＮＰＶも、マウスにおける先天性免疫応答を誘導することを明らかにした。ＡｃＮＰＶ処理がインビトロにおける先天性免疫応答を刺激し、活性化するかを決定するために、マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７にＡｃＮＰＶを接種し、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）の産生を検討した。ポジティブコントロールとしては、細菌ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；マクロファージ活性化の周知の誘導物質）を使用した。
【００４９】
より具体的には、サイトカイン産生におけるＡｃＮＰＶ感染の効果を決定するために、マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７を６ウェルプレートに蒔いた（２×１０６細胞／ウェル）。２４時間の培養の後、ＲＡＷ２６４．７細胞に、種々濃度のＡｃＮＰＶ又は細菌ＬＰＳ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を接種した。前記接種後２４時間のインキュベーションを行った。培養上清中の炎症性サイトカイン（ＩＬ−６及びＴＮＦ−α）量は、市販のキット（ＯｐｔＥＩＡＴＭ ｍｏｕｓｅ ＩＬ−６ ａｎｄ ＴＮＦ−α Ｓｅｔ； ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量化した。
【００５０】
結果を図１４及び図１５に示す。図１４及び図１５に示すデータは、培養上清中のＴＮＦ−α又はＩＬ−６の平均濃度±３回の独立した実験のＳＤ（それぞれ３回実施した）を示す。図１４及び図１５に示すように、ＡｃＮＰＶ又は細菌ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞において、高レベルのＴＮＦ−α及びＩＬ−６産生が用量依存的に検出された。
【００５１】
マクロファージ活性化を決定するために、ＡｃＮＰＶ又は細菌ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞における、ＣＤ６９及び成熟マクロファージ抗原受容体の細胞表面の発現を、フローサイトメトリーにより検討した。具体的には、ＡｃＮＰＶ又はＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＤ６９、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ、並びに成熟マクロファージ抗原受容体の発現は、特定抗体［ＣＤ６９並びにＭＨＣクラスＩ及びＩＩに対する各抗体；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、成熟マクロファージ抗原受容体に対する抗体ｃｌｏｎｅ Ｆ４／８０；Ｙａｍａｓａ］で染色した後、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。
【００５２】
ＣＤ６９に関する結果を図１６に示し、成熟マクロファージ抗原受容体に関する結果を図１７に示す。フルオレセインイソチオシアネート標識化抗ＣＤ６９抗体とＰＥ標識化抗成熟マクロファージ抗原受容体抗体とで、ＲＡＷ２６４．７細胞を二重染色し、フローサイトメトリーで分析した。図１６及び図１７において、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、相対的蛍光強度及び細胞数を示し、黒で塗りつぶしたヒストグラム（線ａ）は、染色されなかった細胞を示し、線ｂ〜線ｄは、それぞれ、刺激されなかった細胞（ｕｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）、ＡｃＮＰＶで処理した細胞、及びＬＰＳで処理した細胞を示す。
【００５３】
図１６及び図１７に示すように、ＡｃＮＰＶによる処理においても、ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＤ６９及び成熟マクロファージ抗原受容体の両方の発現が誘導されたが、細菌ＬＰＳによる誘導と比較して、その程度は少なかった。一方、ＡｃＮＰＶ及び細菌ＬＰＳで処理した後の各ＲＡＷ２６４．７細胞における、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ分子の発現には、有意な差異はなかった（データは示さず）。これらのインビボ及びインビトロにおけるデータは、ＡｃＮＰＶが、マウスにおいて強力な先天性免疫応答を刺激し、マクロファージにおける炎症性サイトカインの産生を誘導することを示す。
【００５４】
【実施例６】
《ＡｃＮＰＶによるマクロファージ活性化におけるヌクレアーゼ処理及び加熱処理の効果》
ＡｃＮＰＶによるマクロファージ活性化の原因成分を決定するために、誘導中のＲＮアーゼＡ処理、ＤＮアーゼＩ処理、及び加熱処理の各効果を決定した。
具体的には、ＡｃＮＰＶ（５μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍＬ）、及びポリ：（Ｉ）−（Ｃ）（５μｇ／ｍＬ）を、それぞれ、ＲＮアーゼＡ（５０μｇ／ｍＬ）又はＤＮアーゼＩ（７５Ｕ／ｍＬ）で処理（３７℃、３０分間）するか、あるいは、加熱処理（５６℃、３０分間）した。これらの処理した化合物をＲＡＷ２６４．７細胞に添加し、２４時間インキュベートした。ＴＮＦ−α産生は、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
結果を図１８〜図２０に示す。図１８〜図２０に示すデータは、上清中のＴＮＦ−αの平均濃度±３回の独立した実験のＳＤ（それぞれ３回実施した）を示す。
【００５５】
図１８〜図２０に示すように、ＡｃＮＰＶによるマクロファージの刺激は、ＲＮアーゼＡ又はＤＮアーゼＩ処理により影響を受けなかったが、５６℃での３０分間の加熱により完全に失われた。一方、ポリ：（Ｉ）−（Ｃ）による刺激は、ＲＮアーゼＡ処理により失われたが、ＤＮアーゼＩ処理又は加熱によっては失われなかった。ＬＰＳによる刺激は、全ての前記処理に対して耐性であった。これらのデータは、ＡｃＮＰＶによるマクロファージ活性化が、非耐熱性のウイルス成分によりもたらされるものであって、ＬＰＳの混入によるものではないことを示す。
【００５６】
【発明の効果】
本発明の抗ウイルス剤（特には抗インフルエンザウイルス剤）によれば、先天性免疫を誘導することにより、ウイルス（特にはインフルエンザウイルス）の予防及び／又は治療が可能である。本発明の抗ウイルス剤（特には抗インフルエンザウイルス剤）は、長期間の発現と免疫寛容可能性が高く、抗ＨＡ抗体が誘導されることがない。
【００５７】
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２１． Ｍａｒｋｏｖｉｃ， Ｉ．， Ｈ． Ｐｕｌｙａｅｖａ， Ａ． Ｓｏｋｏｌｏｆｆ， ａｎｄ Ｌ． Ｖ． Ｃｈｅｒｎｏｍｏｒｄｉｋ， １９９８． Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｇｐ６４ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｇｐ６４ ｔｒｉｍｅｒｓ ｉｎｔｏ ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４３：１１５５−１１６６．
２２． Ｍｏｎｓｍａ， Ｓ． Ａ．， ａｎｄ Ｇ． Ｗ． Ｂｌｉｓｓａｒｄ， １９９５． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＧＰ６４ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６９：２５８３−２５９５．
２３． Ｍｏｎｓｍａ， Ｓ． Ａ．， Ａ． Ｇ． Ｐ． Ｏｏｍｅｎｓ， ａｎｄ Ｇ． Ｗ． Ｂｌｉｓｓａｒｄ， １９９６． Ｔｈｅ ＧＰ６４ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｃｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０：４６０７−４６１６．
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２５． Ｊａｒｖｉｓ， Ｄ．Ｌ．， ａｎｄ Ｅ． Ｅ． Ｆｉｎｎ， １９９５． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１２：５００−５１１．
２６． Ｕｌｅｖｉｔｃｈ， Ｒ． Ｊ．， Ｔｏｌｌ ｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ． １９９９． Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７５５−７５６．
２７． Ｌｅｖａｓｈｉｎａ， Ｅ． Ａ．， Ｅ． Ｌａｎｇｌｅｙ， Ｃ． Ｇｒｅｅｎ， Ｄ． Ｇｕｂｂ， Ｍ． Ａｓｈｂｕｒｎｅｒ， Ｊ． Ａ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｍ． Ｒｅｉｃｈｈａｒｔ， １９９９． Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｓｅｒｐｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９１７−１９１９．
２８． Ａｄｅｒｅｍ， Ａ．， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｕｌｅｖｉｔｃｈ， ２０００． Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔｕｒｅ ４０６：７８２−７８７．
２９． Ｐｏｌｔｏｒａｋ， Ａ．， Ｘ． Ｈｅ， Ｉ． Ｓｍｉｒｎｏｖａ， Ｍ． Ｙ． Ｌｉｕ， Ｃ． Ｖ． Ｈｕｆｆｅｌ， Ｘ． Ｄｕ， Ｄ． Ｂｉｒｄｗｅｌｌ， Ｅ． Ａｌｅｊｏｓ， Ｍ． Ｓｉｌｖａ， Ｃ． Ｇａｌａｎｏｓ， Ｍ． Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇ， Ｐ． Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ−Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ， Ｂ． Ｌａｙｔｏｎ， Ｂ．， ａｎｄ Ｂ． Ｂｅｕｔｌｅｒ， １９９８． Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＬＰＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ ａｎｄ Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＣｒ ｍｉｃｅ：ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｔｌｒ４ ｇｅｎｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：２０８５−２０８８．
３０． Ｙａｎｇ， Ｒ．Ｂ．， Ｍ． Ｒ． Ｍａｒｋ， Ａ． Ｇｒａｙ， Ａ． Ｈｕａｎｇ， Ｍ． Ｈ． Ｘｉｅ， Ｍ． Ｚｈａｎｇ， Ａ． Ｇｏｄｄａｒｄ， Ｗ． Ｉ． Ｗｏｏｄ， Ａ． Ｌ． Ｇｕｒｎｅｙ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｇｏｄｏｗｓｋｉ， １９９８． Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ． Ｎａｔｕｒｅ ３９５：２８４−２８８．
３１． Ｈａｙａｓｈｉ， Ｆ．， Ｋ． Ｄ． Ｓｍｉｔｈ， Ａ． Ｏｚｉｎｓｋｙ， Ｔ． Ｒ． Ｈａｗｎ， Ｅ． Ｃ． Ｙｉ， Ｄ． Ｒ． Ｇｏｏｄｌｅｔｔ， Ｊ． Ｋ． Ｅｎｇ， Ｓ． Ａｋｉｒａ， Ｄ． Ｍ． Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ， Ａ． Ａｄｅｒｅｍ， ２００１． Ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５． Ｎａｔｕｒｅ ４１０：１０９９−１１０３．
【図面の簡単な説明】
【図１】インフルエンザウイルスヘマグルチニンを発現するバキュロウイルストランスファーベクターを模式的に示す説明図である。
【図２】組換えバキュロウイルスＡｃＣＡＧ−ＨＡを感染させたＨｕｈ７細胞に由来する細胞抽出液を電気泳動し、前記細胞におけるＨＡタンパク質の発現を示す、図面に代わる写真である。
【図３】ＡｃＣＡＧ−ＨＡ又はＡｃＮＰＶの免疫、及びインフルエンザウイルスの接種のスケジュールを示す説明図である。
【図４】インフルエンザウイルスの致死接種からの防御に関して、生存率を示すグラフである。
【図５】インフルエンザウイルス接種後の体重減少を示すグラフである。
【図６】インフルエンザウイルスの致死接種に対するＡｃＮＰＶによる防御に関して、生存率を示すグラフである。
【図７】別の血清型インフルエンザウイルスの致死接種に対するＡｃＮＰＶによる防御に関して、生存率を示すグラフである。
【図８】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、非感染のコントロールマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図９】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、非感染のコントロールマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１０】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、未処置でインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１１】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、未処置でインフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１２】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、インフルエンザウイルス接種の２４時間前に、ＡｃＮＰＶを鼻腔内接種したマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１３】インフルエンザウイルスを感染させたマウスの肺の形態における組織学的評価に関して、インフルエンザウイルス接種の２４時間前に、ＡｃＮＰＶを鼻腔内接種したマウスの肺の形態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。
【図１４】ＡｃＮＰＶ又は細菌ＬＰＳで処理したマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７の活性化に関して、ＴＮＦ−αの産生量を示すグラフである。
【図１５】ＡｃＮＰＶ又は細菌ＬＰＳで処理したマウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７の活性化に関して、ＩＬ−６の産生量を示すグラフである。
【図１６】ＣＤ６９に対する、マウスマクロファージ細胞のＡｃＮＰＶ又はＬＰＳ処理の効果を示す、フローサイトメトリーの分析パターンである。
【図１７】成熟マクロファージ抗原受容体に対する、マウスマクロファージ細胞のＡｃＮＰＶ又はＬＰＳ処理の効果を示す、フローサイトメトリーの分析パターンである。
【図１８】ＡｃＮＰＶによるマクロファージ活性化に対する、ヌクレアーゼ処理及び加熱処理の効果を示すグラフである。
【図１９】ＬＰＳによるマクロファージ活性化に対する、ヌクレアーゼ処理及び加熱処理の効果を示すグラフである。
【図２０】ポリ：（Ｉ）−（Ｃ）によるマクロファージ活性化に対する、ヌクレアーゼ処理及び加熱処理の効果を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an antiviral agent (particularly an anti-influenza virus agent) and an anticancer agent containing baculovirus as an active ingredient. In the present specification, the antiviral agent includes both a virus preventive agent and a therapeutic agent, and is preferably a prophylactic agent. Anticancer agents include both cancer therapeutic agents and cancer preventive agents, preferably cancer therapeutic agents.
[0002]
[Prior art]
Baculovirus autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) has long been used as a biopesticide or as an efficient recombinant protein production tool in insect cells. Its host specificity was initially thought to be limited to cells derived from arthropods. Recently, however, several groups have reported that AcNPV, including a suitable eukaryotic promoter, has been efficiently introduced into several mammalian cells and animal models and expresses foreign genes. The advantageous features of AcNPV in gene therapy applications include low cytotoxicity in mammalian cells, innate replication in mammalian cells, and animals despite high infectious diversity (moi) In the absence of pre-existing antibodies to baculovirus.
[0003]
In general, viral infection of mammalian cells causes the production of various cytokines, including the interferon (IFN) family. Double-stranded RNA (dsRNA) produced during the replication of many RNA and DNA viruses induces α / βIFNs in various cells. In one report, wild-type baculovirus induced IFN production in mammalian cells, including mouse embryonic fibroblasts, and protected mice from encephalomyocarditis virus (EMCV) infection in vivo. 1). However, the exact mechanism underlying the protection from IFN induction and lethal EMCV infection remains unclear. According to another report, baculovirus infection suppresses phenobarbital-mediated gene induction and stimulates TNF-α, IL-1α, and IL-1β expression in primary cultures of rat stem cells (non- Patent Document 2).
[0004]
[Non-Patent Document 1]
“Journal of virology”, (USA), 1999, Vol. 73, p. 9944-9951
[Non-Patent Document 2]
“Gene therapy” (UK), 2000, Vol. 7, p. 1274-1283
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventor examined induction of protective immunity against lethal influenza infection in mice immunized with recombinant baculovirus expressing influenza hemagglutinin (HA). With respect to protection against lethal influenza virus inoculation, we observed not only mice immunized intranasally with recombinant baculovirus but also mice immunized with wild-type baculovirus. Inoculation with baculovirus also promoted secretion of inflammatory cytokines such as TNF-α and IL-6 in the murine macrophage cell line RAW264.7. These results indicate that baculovirus induces innate immunity that allows protection from lethal influenza virus inoculation in mice.
[0006]
Thus, the present inventors have newly found that not only recombinant baculovirus expressing influenza hemagglutinin but also wild-type baculovirus has anti-influenza virus activity. When a recombinant baculovirus expressing influenza hemagglutinin is used as an anti-influenza virus agent, there are drawbacks such as long-term expression and low immunotolerability, or induction of anti-HA antibodies.
Therefore, the object of the present invention is to solve the above-mentioned drawbacks of the prior art, to develop an antiviral agent (particularly an anti-influenza virus) which has a long-term expression and a high possibility of immunological tolerance and does not induce anti-HA antibodies. Agent).
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The above-mentioned problems can be solved by the antiviral agent according to the present invention containing baculovirus as an active ingredient. According to a preferred embodiment of the present invention, the antiviral agent is an anti-influenza virus agent.
The present invention also relates to an anticancer agent containing baculovirus as an active ingredient.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the antiviral agent of the present invention will be described mainly using the anti-influenza virus agent of the present invention as an example. However, the following description of the anti-influenza virus agent of the present invention is also applied to antiviral agents other than influenza virus as they are. Can be applied.
[0009]
The anti-influenza virus agent of the present invention contains baculovirus as its active ingredient. As used herein, “influenza virus” includes influenza viruses of type A, B, and C, and variants thereof.
Baculovirus is a circular double-stranded DNA (molecular weight 59 × 10 6 ~ 164 × 10 6 ) As a gene, for example, a nuclear polyhedrosis virus (NPV), a guanulovirus (GV), or a non-occlusive virus is known. . Examples of the nuclear polyhedrosis virus include Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV), and the like.
[0010]
In the anti-influenza virus agent of the present invention, any of these baculoviruses can be used as an active ingredient, and it is more preferable to use a baculovirus containing envelope glycoprotein gp64 as the main component of the envelope. The envelope glycoprotein gp64 is a major component of the envelope of budded virus, and is a protein related to virus entry into host cells by endocytosis (References 18 to 24).
As an active ingredient of the anti-influenza virus agent of the present invention, NPV is preferable, AcNPV or BmNPV is more preferable, and AcNPV is particularly preferable.
[0011]
Baculovirus has long been used as an efficient recombinant protein production tool in insect cells (References 1 and 2), and AcNPV containing appropriate eukaryotic promoters has been used in several mammalian cells (References 3 to 3). It has been reported from several groups that it is efficiently introduced into 9) and animal models (References 10 to 13) and expresses foreign genes.
When a baculovirus is used as a recombinant protein production tool for expressing a foreign gene, the genome size of the baculovirus is enormous. Therefore, after integrating the foreign gene into the baculovirus transfer vector, the recombinant transfer vector and baculovirus Recombinant baculovirus can be produced by co-transfecting the virus with insect cells and causing homologous recombination.
[0012]
In the anti-influenza virus agent of the present invention, wild-type baculovirus (that is, live baculovirus) can be used as it is.
[0013]
The present invention also includes an anti-influenza virus agent containing envelope glycoprotein gp64 as an active ingredient. The anti-influenza virus agent of the present invention is not particularly limited as long as it contains the envelope glycoprotein gp64 in a form exhibiting anti-influenza virus activity. For example, as a purified envelope glycoprotein gp64, a crude envelope It can be contained in the form or in the form of a baculovirus.
[0014]
In addition, the baculovirus, which is an active ingredient of the anti-influenza virus agent of the present invention, induces innate immunity. Therefore, viruses other than influenza viruses such as AIDS (acquired immunodeficiency group) virus, C type It is also effective against hepatitis virus, ATL (adult T-cell leukemia) virus, SARS (severe acute respiratory syndrome) virus, etc., and further includes anticancer agents (including cancer therapeutic agents and cancer preventive agents, particularly cancer treatments) It is also effective as an agent. That is, the present invention also includes an antiviral agent and / or an anticancer agent containing baculovirus (or envelope glycoprotein gp64) as an active ingredient.
[0015]
The anti-influenza virus agent of the present invention can contain baculovirus, which is an active ingredient, alone or together with a known carrier or diluent that can be pharmaceutically or veterinarily acceptable if desired.
Although the anti-influenza virus agent of this invention is not limited to this, 0.01-99 weight%, Preferably it can contain an active ingredient in the quantity of 0.1-80 weight%.
The dose of the anti-influenza virus agent of the present invention depends on the species of the animal to be treated (mammals, particularly humans) and the individual's responsiveness to the drug, the dosage form of the selected preparation, and the administration time and interval. Can be appropriately selected.
[0016]
The anti-influenza virus agent of the present invention, in addition to baculovirus as an active ingredient, optionally in combination with a known pharmaceutically acceptable carrier or diluent, can be administered by the oral, parenteral or topical route. Either can be administered in a single or multiple doses. As a more specific administration route, intranasal administration is particularly preferable, but for example, intramuscular, intradermal, abdominal vagina, or caudal may be used. The anti-influenza virus agent of the present invention can be in a variety of different dosage forms such as powders, sprays, lotions, aqueous suspensions, injectable solutions, or syrups.
[0017]
Live baculovirus stimulates and activates innate immune responses (eg, by macrophage cells in vitro and in vivo), as shown based on specific data in the examples below. Intramuscular and intraperitoneal immunization of mice with baculovirus induced specific antibody responses to higher levels, but only intranasal immunization achieved protection against influenza virus inoculation. Intranasal inoculation of recombinant baculovirus expressing HA only induced low levels of IgA in the nasal lavage fluid. Furthermore, mice immunized intranasally with wild-type baculovirus used as a control virus vector provided the same protection against influenza virus inoculation as obtained with the recombinant virus. These results indicate that baculovirus inoculation provides mice with nonspecific antiviral activity. Gronowski et al. Reported that live baculoviruses showed antiviral activity in mammalian cells and EMCV-infected mice (Reference 14). They suggested that IFN induction requires an interaction between the baculovirus envelope protein gp64 and a receptor on the responding cell membrane. However, the mechanism underlying baculovirus-induced IFN expression in vitro and in vivo is unclear.
[0018]
The baculovirus envelope glycoprotein gp64 is a major component of the envelope of budded virus and is associated with virus entry into host cells by endocytosis (References 18-24). The gp64 envelope protein contains mannose, fucose, and N-acetylglucosamine, but no galactose or terminal sialic acid residues are detected (Reference 25). Glycans that bind to recombinant glycoproteins produced in insect cell lines differ from those found in natural mammalian products. Inventors have shown that AcNPV stimulates innate immunity (eg, immunity with macrophages) in vivo in the following examples. AcNPV-treated mouse lungs showed significant wetting of monocytes, including macrophages, after influenza virus infection. Thus, the effect of baculovirus treatment on lung sclerosis depends on the inhibition of virus growth in lung tissue. Furthermore, in AcNPV infected mouse macrophage RAW264.7 cells, the expression of activating ligands (CD69 and mature macrophage antigen receptor) is increased and inflammatory cytokines produced (eg, TNF-α and IL-6) are also produced. Increased. These data strongly support the conclusion that AcNPV has an immunostimulatory capacity to promote the release of inflammatory cytokines from RAW264.7 macrophages. Mannose receptors (MR) recognize several carbohydrates present on the surface and cell walls of microorganisms. MR is originally expressed in macrophages and dendritic cells and is associated with MR-mediated endocytosis and phagocytosis. In addition, MR plays a major role in host defense and induces innate immunity. Thus, mice inoculated with AcNPV are affected by mannose-containing gp64 envelope proteins that interact with MR expressed on the surface of macrophages and dendritic cells present in specific mucosal sites (eg, nasal associated lymphoid tissue and lung tissue). May have been directly stimulated.
[0019]
In recent studies, the activation of innate immunity was closely associated with the host's protective and secondary adaptive immune responses. Various proteins belonging to the TLR (Toll-like receptor) family are essential components of this process (References 26 to 28). Although 10 TLRs have been identified in mammalian systems, the current paradigm is unique. Each TLR has a different ligand (Ref. 28). TLR4 is a receptor for LPS from Gram-negative bacteria, TLR2 regulates cell responsiveness to various bacterial cell wall components (including lipoteichoic acid, peptidoglycan, and bacterial outer membrane lipoprotein), and TLR5 is a bacterial Mediates flagellin-induced cell activation (refs. 29-31). Various proteins belonging to the TLR family have several common structural properties including an extracellular domain consisting of a signal peptide, various leucine-rich repeats, and an intracytoplasmic TLR (Toll IL-1 receptor) domain. In the present invention, AcNPV has been shown to be a potent stimulator of immune cells. Baculovirus envelope protein gp64 with high mannose content may recognize TLR molecules and stimulate immune responses.
[0020]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples, but these do not limit the scope of the present invention.
[Example 1]
<Preparation of virus>
(1) Preparation of baculovirus
In order to determine the efficiency of immunization with recombinant baculovirus, recombinant baculovirus (pAcCAG-HA; FIG. 1) expressing the HA gene of influenza virus (A / PR / 8/34) under the control of the CAG promoter. It was constructed. The CAG promoter is widely used in various mammalian cell lines and shows stronger expression than the CMV promoter and RSV promoter (Reference 17).
[0021]
In this example and in the following examples, AcNPV and recombinant baculovirus were treated with Spodoptera in TMN-FH medium (BD PharMingen) containing 100 μg / mL kanamycin and 10% fetal bovine serum (FBS). Growth was carried out using Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) cells.
The baculovirus transfer vector pAcCAG-HA was constructed by inserting full-length hemagglutinin (HA) cDNA into the cloning site of the baculovirus transfer vector pAcCAGMCS (Reference 6).
A recombinant baculovirus containing the influenza virus HA genome (AcCAG-HA) was prepared by co-transfecting the transfer vector and linearized baculovirus DNA (BD PharMingen) into Sf9 cells (Reference 1). .
[0022]
AcCAG-HA and AcNPV were purified by the following procedure. That is, the culture supernatant was collected 3 to 4 days after infection, and cell debris was removed by centrifugation (5000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.). The virus is precipitated by centrifugation [25000 rpm (57000 G), 90 min, 4 ° C.], resuspended in 1 mL of phosphate buffered saline (PBS), and on a 10-60% (W / V) sucrose gradient. And centrifuged [25000 rpm (57000 G), 90 minutes, 4 ° C.]. The virus band was collected, resuspended in PBS, and centrifuged [25000 rpm (57000 G), 90 minutes, 4 ° C.]. The virus precipitate was resuspended in PBS and the infectious titer was determined by plaque assay (Reference 1).
In addition, all the tissue culture media and media components used in this example and the following examples were those that did not contain endotoxin (endotoxin-free). Endotoxin levels in these viruses were endotoxin free (<0.01 EU / mL) as measured using a commercially available kit (Pyrodick endotoxin measurement kit; Seikagaku Co.).
[0023]
(2) Preparation of influenza virus
Influenza virus A / PR / 8/34 (H1N1) contains glucose (1000 mg / L), L-glutamine (3 μg / mL), penicillin (100 IU / mL), streptomycin (100 μg / mL), and 10% (vol / vol) 3 days in Madin-Darby canine kidney cells cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (SIGMA-ALDRICH Co.) containing heat inactivated FBS Allowed to grow. The culture supernatant was collected and stored at -80 ° C. Virus titer was determined by plaque assay (Reference 16). To determine the viral titer in the lung, mice were sacrificed under dilute diethyl ether anesthesia. Subsequently, lung homogenates were prepared, serially diluted with saline, and virus titers were determined by plaque assay.
[0024]
(3) Detection of HA protein in virus-infected cultured cells
Expression of HA protein by recombinant baculovirus infection was examined by Western blot analysis using a polyclonal antibody raised by HA protein.
Specifically, the human hepatoma cell line Huh7 was maintained in DMEM containing 10% heat-inactivated FBS and infected with AcCAG-HA and AcNPV (moi = 20 or 200), respectively. 24 hours after infection, cells were lysed with lysis buffer containing 50 mmol / L Tris-HCl (pH 6.8), 0.1 mol / L dithiothreitol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), and 10% glycerol. . Cell extracts were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and proteins were blotted onto polyvinylidene difluoride membranes (Roche Molecular Biochemicals). The detection of the HA protein on the blot was performed by continuous incubation, ie, incubation with a 1: 200 dilution of anti-A / PR / 8/34 mouse polyclonal antibody (serum from mice immunized with purified influenza virus), And 1: 1000 dilution of the HRP-conjugated anti-mouse IgG antibody (Amersham Biosciences, Inc.) was performed using a commercially available kit [enhanced chemistry detection (ECL) detection system; Amersham Biosciences].
[0025]
The results are shown in FIG. Cell extracts were separated by 7.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by immunoblotting using a mouse polyclonal antibody against influenza virus. In FIG. 2, lane 1 is a mock-infected cell lysate, lane 2 is an AcNPV-infected (moi = 200) cell lysate, and lane 3 is an AcCAG-HA infection ( The cell lysate of moi = 20), lane 4 is the cell lysate of AcCAG-HA infection (moi = 200). The arrow indicates the HA protein.
As shown in FIG. 2, HA protein expression was detected in a dose-dependent manner in Huh7 cells infected with AcCAG-HA, whereas no band was observed in cells infected with AcNPV.
[0026]
[Example 2]
<Protection against lethal influenza virus inoculation in mice immunized with recombinant baculovirus>
AcCAG-HA or AcNPV (1.1 × 10 8 Immunization of mice with pfu / mouse / times is intramuscular (i.m), intradermal (i.d.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.p.). Each administration route of n) was performed twice with an interval of 2 weeks (FIG. 3). Three weeks after the second immunization, lethal dose (5.6 × 10 6 5 pfu) influenza virus was inoculated into the mice.
[0027]
More specifically, 6 weeks old female BALB / c mice (Charles River Japan, Inc.) were inoculated with baculovirus (AcCAG-HA or AcNPV) twice a week for 2 weeks apart (1. 1 × 10 8 pfu / mouse). 5.6 × 10 in 50 μL of physiological saline 5 pfu mouse compatible A / PR / 8/34 influenza virus (100LD 50 The lethal influenza virus inoculation consisted of intranasal administration 3 weeks after the second immunization. This inoculation caused rapid and extensive viral replication in the lungs and resulted in death within 5-7 days. Survival rates in mice immunized with AcCAG-HA or AcNPV after influenza virus inoculation were compared.
[0028]
The effectiveness of immunization with AcCAG-HA was assessed by induction of IgG and IgA against HA protein and mouse survival. Control mice were immunized with AcNPV. Serum samples and intranasal lavage samples were obtained 14 and 21 days after the first immunization and 3 days after influenza virus inoculation, and specific IgG and IgA responses to HA were examined by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). did.
[0029]
More specifically, the antibody titer against HA was measured using ELISA. The ELISA was performed by sequentially adding the following series of reagents on a solid phase (96-well Nunc Maxisorp P / N; Nalge Nunc International).
First reagent: HA molecule purified from A / PR / 8/34 influenza virus
Second reagent: serum sample
Third reagent: biotin-conjugated goat anti-mouse IgG (KPL, Inc.)
Fourth reagent: Streptavidin-conjugated alkaline phosphatase (KPL, Inc.)
Final reagent: p-nitrophenyl-phosphate (Moss, Inc.)
Absorbance of the generated chromogen at 405 nm was measured using a microplate auto reader (Titertec Multilabym Oy).
[0030]
The results are shown in Table 1. Table 1 shows antibody titers of anti-A / PR8HA IgA and IgG in nasal and serum in mice immunized with recombinant baculovirus expressing hemagglutinin protein or wild type baculovirus via various routes of administration. Show. Mice were immunized on day 0 and day 14 by inoculation via various routes of wild type or recombinant baculovirus. Three weeks later, a lethal dose of influenza virus was inoculated. On the 38th day (3 days after influenza virus inoculation), a serum sample and an intranasal wash sample for antibody titer measurement were obtained. The values shown in Table 1 indicate “mean value ± standard deviation” of each group, and the symbol “NT” indicates that the test was not performed.
[0031]
[0032]
As shown in Table 1, mouse immunization with recombinant baculoviruses intramuscularly (im) or intraperitoneally (ip) induced a higher antibody response compared to immunization by other routes of administration. Inoculation dose of AcCAG-HA (10 5 -10 8 There was a significant correlation between pfu / mouse) and induction of antibodies against HA (data not shown). Intranasal (in) immunization with AcCAG-HA induced a low but detectable IgG response, but no anti-HA IgA response was detected in the intranasal lavage fluid.
[0033]
Recombinant baculovirus AcCAG-HA or wild type baculovirus AcNPV (1.1 × 10 8 mice immunized twice with pfu / mouse / inoculation) 21 days after the second immunization, under dilute diethyl ether anesthesia, influenza virus A / PR / 8/34 (5.6 × 10 6 5 pfu / mouse) was inoculated with 50 μL. The survival rate of mice from influenza virus inoculation until day 14 was recorded.
The results are shown in FIG. In FIG. 4, black diamonds and black circles show the results of mice immunized intranasally with AcCAG-HA or AcNPV, black squares show the results of mice immunized intramuscularly with AcCAG-HA, As a control, the results of mice inoculated with physiological saline are shown.
[0034]
As shown in FIG. 4, intramuscular immunization with AcCAG-HA induced a specific antibody response, but actual protection was achieved only by intranasal immunization. Mice immunized by other routes of inoculation were not protected despite induction of antibody response (data not shown). Furthermore, mice immunized intranasally with AcNPV were also protected against influenza virus inoculation, but not in mice inoculated by routes other than intranasal (data not shown).
[0035]
A typical weight loss curve is shown in FIG. In FIG. 5, black circles and black diamonds indicate the results of mice immunized intranasally with AcCAG-HA or AcNPV, black squares indicate the results of mice immunized intramuscularly with AcCAG-HA, As a control, the results of mice inoculated with physiological saline are shown. In addition, each dose and implementation schedule of immunization and influenza virus inoculation were implemented on the same conditions as the experiment shown in FIG.
As shown in FIG. 5, mice immunized intranasally with AcCAG-HA or AcNPV were protected against lethal inoculation and had a significantly reduced weight. In animals immunized with saline or by routes other than intranasal, significant weight loss was maintained, reaching 30-40% of initial weight before death.
[0036]
To assess the protection of mice against acute pulmonary influenza infection, viral titers and inflammatory cytokines in the lungs were measured 3 days after influenza virus inoculation.
The amount of IL-6 (one of the inflammatory cytokines) in the lung homogenate was measured using a commercially available kit (OptEIA). TM Measured by sandwich ELISA using mouse IL-6 Set; BD PharMingen). More specifically, a 96-well ELISA plate (Nunc Maxisorp P / N; Nalge Nunc International) was coated with an anti-mouse IL-6 monoclonal antibody [coating buffer (0.2 mol / L sodium phosphate, pH 6. 5) was coated overnight at 4 ° C. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20 and blocking for 2 hours at room temperature with PBS containing 10% FBS, 10-fold diluted lung homogenate or serially diluted mouse recombinant IL-6 (100 μL) was added. Added and incubated at room temperature for 2 hours. After washing, biotinylated mouse IL-6 monoclonal antibody and avidin-HRP conjugate (total 100 μL) were added to each well and the plate was incubated at room temperature for 1 hour. After thorough washing, substrate solution (100 μL) is added and incubated for 30 minutes at room temperature, followed by stop solution (1 mol / L H 2 3 PO 4 ) (50 μL) was added, and OD (450 to 540 nm) was measured with a microplate reader (Titertec MultiLab system). IL-6 content was calculated from a standard curve of mouse recombinant IL-6 using the substrate solution as a blank.
[0037]
The results are shown in Table 2. Table 2 shows protection against influenza virus inoculation in mice immunized with recombinant baculovirus expressing hemagglutinin protein or wild type baculovirus via various routes of administration. Mice were immunized on day 0 and day 14 by inoculation via various routes of wild type or recombinant baculovirus. Three weeks later, a lethal dose of influenza virus was inoculated. On day 38 (3 days after influenza virus inoculation), lung homogenates for cytokine production and virus titration were obtained. The values shown in Table 2 indicate “mean value ± standard deviation” of each group, and the symbol “*” indicates that there was a significant difference (p <0.05).
[0038]
[0039]
In mice immunized intranasally with AcCAG-HA or AcNPV, mice immunized by routes other than intranasal or significantly less in both lung virus titer and IL-6 production compared to nonimmunized mice. A significant decrease was induced (Table 2). These results indicate that the innate immune response was induced by baculovirus inoculation in mice.
[0040]
[Example 3]
<Induction of mouse innate immune response by AcNPV>
In order to determine in more detail the antiviral effect induced by baculovirus inoculation, protection against influenza virus infection was induced by treatment with purified mouse IFN-α or poly: (I)-(C) It compared with the case where it did (FIG. 6). AcNPV, mouse IFN-α, or poly: (I)-(C) was administered intranasally 24 hours prior to influenza virus inoculation.
[0041]
The results are shown in FIG. In FIG. 6, the black square is AcNPV (1.1 × 10 8 pfu) shows the results of mice inoculated intranasally, black diamonds show the results of mice inoculated intraperitoneally with poly: (I)-(C) (100 μg), and black circles show mouse IFN-α (1 μg). Shows the results of mice inoculated intraperitoneally, and the black triangles show the results of mice inoculated with physiological saline as a control. Six mice per group were inoculated with a lethal dose of influenza virus 24 hours after each of the inoculations, and the survival rate was recorded until day 14 after the influenza virus inoculation.
[0042]
Surprisingly, mice nasally inoculated with AcNPV were fully protected as shown by only a slight weight loss after influenza virus inoculation, no change in activity and grooming, and 100% survival. . All control mice inoculated with saline died within 10 days. Mice treated intraperitoneally with mouse IFN-α (1 μg) and poly: (I)-(C) (100 μg), respectively, showed 33.3% and 66.6% survival. These results indicate that intranasal inoculation with wild-type baculovirus 24 hours prior to influenza virus inoculation completely protects mice from lethal influenza virus infection.
[0043]
The protective efficacy of AcNPV was further evaluated by inoculation with other serotypes of influenza virus.
Specifically, AcNPV was inoculated intranasally 24 hours prior to influenza virus inoculation, and mice were inoculated with lethal doses of influenza viruses A / Guizuhou and B / Ibaraki, respectively. As an infected control mouse, A / Guizuhou or B / Ibaraki was inoculated without pre-inoculation with AcNPV. Five mice per group were inoculated with a lethal dose of influenza virus 24 hours after each of the inoculations, and the survival rate was recorded up to 14 days after the influenza virus inoculation.
[0044]
The results are shown in FIG. In FIG. 7, black squares and white circles show the results of mice inoculated with A / Guizuhou or B / Ibaraki, respectively, after pre-inoculation with AcNPV, and black triangles and black rhombus without pre-inoculation with AcNPV, The results of control mice inoculated with A / Guizuhou or B / Ibaraki, respectively, are shown.
As shown in FIG. 7, mice intranasally inoculated with AcNPV also showed protection against lethal inoculation of other serotypes of influenza viruses, namely A / Guizuhou (H3N2) and B / Ibaraki.
[0045]
[Example 4]
<< Morphological changes in lungs of mice infected with influenza virus after intranasal inoculation of AcNPV >>
For microscopic evaluation of pathological changes in the lungs, mice were sacrificed 7 days after influenza virus infection under light anesthesia with diethyl ether inhalation. The lungs were removed and swollen with 10% formalin in PBS. After fixation, the lungs were embedded in paraffin, sectioned and stained with hematoxylin and eosin.
[0046]
The histological changes in the lungs of mice inoculated with influenza virus after intranasal inoculation with AcNPV are shown in FIGS. FIGS. 8 and 9 (A-1, A-2) are non-infected controls, and FIGS. 10 and 11 (B-1, B-2) are untreated mice infected with influenza virus. FIG. 12 and FIG. 13 (C-1, C-2) show AcNPV (1.1 × 10 4) 24 hours prior to influenza virus inoculation. 8 pfu) is the lungs of mice inoculated intranasally.
[0047]
In the untreated control lungs, neither inflammatory cells nor damaged tissue were observed (A-1, A-2). Seven days after influenza virus infection, significant damage was observed on the lung surface of mice treated with saline alone (data not shown). Neutrophil infiltration and congestion were clearly observed inside the spaces around the bronchiole and around the alveoli (B-1). In addition, mononuclear cell infiltration, polymorphonuclear cells, and cyst-forming layers were observed in the space around the alveoli (B-2; see arrows). In contrast, mice pre-inoculated with AcNPV showed significant infiltration of monocytes including macrophages (C-1, C-2; see arrows) and less lung surface damage following influenza virus inoculation ( (Data not shown), less neutrophils were contained in peribronchial and alveolar spaces (data not shown). These results indicate that monocytes containing macrophages were strongly induced by pre-inoculation with AcNPV, and that these activated immunocompetent cells suppressed the spread of influenza virus infection in lung tissue.
[0048]
[Example 5]
<< Induction of inflammatory cytokine production in mouse macrophage cell line by AcNPV >>
These in vivo experiments revealed that not only recombinant baculovirus but also wild type virus AcNPV induces innate immune responses in mice. To determine if AcNPV treatment stimulates and activates innate immune responses in vitro, the mouse macrophage cell line RAW264.7 is inoculated with AcNPV and inflammatory cytokines (eg, TNF-α and IL-6) The production of was examined. As a positive control, bacterial LPS (lipopolysaccharide; well-known inducer of macrophage activation) was used.
[0049]
More specifically, to determine the effect of AcNPV infection on cytokine production, the murine macrophage cell line RAW264.7 was seeded in 6-well plates (2 × 10 6 Cells / well). After 24 hours of culture, RAW264.7 cells were inoculated with various concentrations of AcNPV or bacterial LPS (SIGMA-ALDRICH). Incubation was performed for 24 hours after the inoculation. The amount of inflammatory cytokines (IL-6 and TNF-α) in the culture supernatant was measured using a commercially available kit (OptEIA). TM Quantified by sandwich ELISA using mouse IL-6 and TNF-α Set; BD PharMingen).
[0050]
The results are shown in FIGS. The data shown in FIG. 14 and FIG. 15 shows the mean concentration of TNF-α or IL-6 in the culture supernatant ± SD of 3 independent experiments (each performed 3 times). As shown in FIGS. 14 and 15, high levels of TNF-α and IL-6 production were detected in a dose-dependent manner in RAW264.7 cells treated with AcNPV or bacterial LPS.
[0051]
To determine macrophage activation, cell surface expression of CD69 and mature macrophage antigen receptors in RAW264.7 cells treated with AcNPV or bacterial LPS was examined by flow cytometry. Specifically, the expression of CD69, MHC class I and II, and mature macrophage antigen receptor in RAW264.7 cells stimulated with AcNPV or LPS is expressed by specific antibodies [CD69 and respective antibodies against MHC class I and II; PharMingen, After staining with the antibody clone F4 / 80; Yamasa] against mature macrophage antigen receptor, analysis was performed by flow cytometry (Becton Dickinson).
[0052]
The results for CD69 are shown in FIG. 16, and the results for mature macrophage antigen receptor are shown in FIG. RAW264.7 cells were double stained with fluorescein isothiocyanate labeled anti-CD69 antibody and PE labeled anti-mature macrophage antigen receptor antibody and analyzed by flow cytometry. 16 and 17, the X axis and the Y axis indicate the relative fluorescence intensity and the number of cells, respectively, and the histogram (line a) filled with black indicates the unstained cells, and the lines b to d Indicate unstimulated cells, cells treated with AcNPV, and cells treated with LPS, respectively.
[0053]
As shown in FIGS. 16 and 17, the treatment with AcNPV also induced the expression of both CD69 and mature macrophage antigen receptor in RAW264.7 cells, but to a lesser extent compared to the induction with bacterial LPS. There were few. On the other hand, there was no significant difference in the expression of MHC class I and II molecules in each RAW264.7 cell after treatment with AcNPV and bacterial LPS (data not shown). These in vivo and in vitro data indicate that AcNPV stimulates a strong innate immune response in mice and induces the production of inflammatory cytokines in macrophages.
[0054]
[Example 6]
<< Effects of nuclease treatment and heat treatment on macrophage activation by AcNPV >>
In order to determine the causative component of macrophage activation by AcNPV, the effects of RNase A treatment, DNase I treatment, and heat treatment during induction were determined.
Specifically, AcNPV (5 μg / mL), LPS (50 ng / mL), and poly: (I)-(C) (5 μg / mL) were added to RNase A (50 μg / mL) or DNase I, respectively. (75 U / mL) (37 ° C., 30 minutes), or heat treatment (56 ° C., 30 minutes). These treated compounds were added to RAW264.7 cells and incubated for 24 hours. TNF-α production was measured by sandwich ELISA.
The results are shown in FIGS. The data shown in FIGS. 18-20 show the mean concentration of TNF-α in the supernatant ± SD of 3 independent experiments (each performed 3 times).
[0055]
As shown in FIGS. 18-20, stimulation of macrophages by AcNPV was not affected by RNase A or DNase I treatment, but was completely lost by heating at 56 ° C. for 30 minutes. On the other hand, stimulation with poly: (I)-(C) was lost by RNase A treatment but not by DNase I treatment or heating. Stimulation with LPS was resistant to all the treatments. These data indicate that macrophage activation by AcNPV is caused by a non-thermostable viral component and not by LPS contamination.
[0056]
【The invention's effect】
According to the antiviral agent (especially anti-influenza virus agent) of the present invention, it is possible to prevent and / or treat viruses (particularly influenza virus) by inducing innate immunity. The antiviral agent (especially anti-influenza virus agent) of the present invention has a high possibility of long-term expression and immune tolerance, and anti-HA antibody is not induced.
[0057]
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[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory view schematically showing a baculovirus transfer vector expressing influenza virus hemagglutinin.
FIG. 2 is a photograph, instead of a drawing, showing the expression of HA protein in the cells after electrophoresis of a cell extract derived from Huh7 cells infected with recombinant baculovirus AcCAG-HA.
FIG. 3 is an explanatory diagram showing a schedule of AcCAG-HA or AcNPV immunization and influenza virus inoculation.
FIG. 4 is a graph showing survival rate in terms of protection from lethal inoculation of influenza virus.
FIG. 5 is a graph showing weight loss after influenza virus inoculation.
FIG. 6 is a graph showing survival in terms of protection by AcNPV against lethal inoculation of influenza virus.
FIG. 7 is a graph showing survival in terms of protection by AcNPV against lethal inoculation of another serotype influenza virus.
FIG. 8 is a photomicrograph in place of drawing showing the lung morphology of uninfected control mice for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus.
FIG. 9 is a photomicrograph in place of drawing showing the lung morphology of uninfected control mice for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus.
FIG. 10 is a photomicrograph instead of a drawing showing the lung morphology of an untreated mouse infected with influenza virus for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus.
FIG. 11 is a photomicrograph in place of a drawing showing the lung morphology of an untreated mouse infected with influenza virus for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus.
FIG. 12 is a photomicrograph replacing the drawing showing the lung morphology of mice nasally inoculated with AcNPV 24 hours prior to influenza virus inoculation for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus. It is.
FIG. 13 is a photomicrograph instead of a drawing showing the lung morphology of mice nasally inoculated with AcNPV 24 hours prior to influenza virus inoculation for histological evaluation in the lung morphology of mice infected with influenza virus. It is.
FIG. 14 is a graph showing the amount of TNF-α produced with respect to activation of mouse macrophage cell line RAW264.7 treated with AcNPV or bacterial LPS.
FIG. 15 is a graph showing IL-6 production for activation of mouse macrophage cell line RAW 264.7 treated with AcNPV or bacterial LPS.
FIG. 16 is a flow cytometric analysis pattern showing the effect of AcNPV or LPS treatment of mouse macrophage cells on CD69.
FIG. 17 is a flow cytometric analysis pattern showing the effect of AcNPV or LPS treatment of mouse macrophage cells on mature macrophage antigen receptor.
FIG. 18 is a graph showing the effect of nuclease treatment and heat treatment on macrophage activation by AcNPV.
FIG. 19 is a graph showing the effect of nuclease treatment and heat treatment on macrophage activation by LPS.
FIG. 20 is a graph showing the effect of nuclease treatment and heat treatment on macrophage activation by poly: (I)-(C).
