JP2004537321A - ｐ５３経路のモディファイヤーとしてのＨＰＲＰ４ｓおよび使用方法 - Google Patents

ｐ５３経路のモディファイヤーとしてのＨＰＲＰ４ｓおよび使用方法 Download PDF

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Abstract

ヒトｈＰＲＰ４遺伝子はｐ５３経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥ｐ５３機能に関連する疾患の治療上の標的である。ｈＰＲＰ４の活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ｐ５３のモジュレーターを同定する方法が提供される。

Description

【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
本出願は、２００１年８月６日出願の米国特許仮出願第６０／３１０，３６２号および２００２年２月１５日出願の米国特許仮出願第６０／３５７，５０１号の優先権を主張するものである。先の出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の分野）
ｐ５３遺伝子は、家族性および自発性の癌を含めた５０種類を超える種類の異なるヒト癌にわたって変異しており、ヒト癌の中で最も広く変異した遺伝子であると考えられている（ZambettiおよびLevine、FASEB、1993年、7:855〜865;Hollstein他、Nucleic Acids Res.、1994年、22:3551〜3555）。ｐ５３遺伝子中の変異のうち９０％を超えるものが、ｐ５３機能を不活性化させる、単一アミノ酸を変化させるミスセンス変異である。ヒトｐ５３の異常型は、予後不良、より活動性の高い腫瘍、転移、および短期生存率に関連している（Mitsudomi他、Clin Cancer Res、2000年10月、6(10):4055〜63；Koshland、Science、1993年、262:1953）。
【０００３】
ヒトｐ５３タンパク質は通常、ＤＮＡ損傷、低酸素症、ヌクレオチド欠乏、および発癌遺伝子活性化を含めたシグナルの中枢インテグレーター（ｃｅｎｔｒａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）として機能する（Prives、Cell、1998年、95:5〜8）。これらのシグナルに応答して、ｐ５３タンパク質レベルが大きく上昇し、その結果、蓄積したｐ５３がこれらシグナルの性質および強度に応じて細胞周期抑止またはアポトーシスを活性化させる。実際、複数系統の実験的証拠により、腫瘍抑制因子としてのｐ５３の主要な役割が指摘された（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。たとえば、ホモ接合性のｐ５３「ノックアウト」マウスでは、発生は正常であるが、生後１年のうちにほぼ１００％の新生組織形成の発生率が示された（Donehower他、Nature、1992年、356:215〜221）。
【０００４】
正常細胞および癌細胞内でｐ５３が機能する生化学的機構および経路は完全には分かっていないが、ｐ５３機能の明らかに重要な一面は、遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知のｐ５３応答エレメントを有する遺伝子の中には、ＧＡＤＤ４５、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、サイクリンＧ、Ｂａｘ、ＩＧＦ−ＢＰ３、およびＭＤＭ２を含めた、細胞周期またはアポトーシスのいずれかの制御における役割がよく特徴づけられたものが、いくつか存在する（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。
【０００５】
マイトジェン活性タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）及びサイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞の分化及び増殖に決定的な役割を果たす重要なプロリン指向性Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである。ＰＲＰ（前ｍＲＮＡ処理遺伝子）は、ＭＡＰＫｓと相同性を有するＣＤＫ様キナーゼである（Huang, Y.他、2000年、Biochem Biophys Res Commun; 271(2):456〜63）。
【０００６】
前ｍＲＮＡ処理４（ＰＲＰ４）は、ＥＧＦ刺激により活性化されたセリンスレオニンキナーゼで、転写制御に参画し、前ｍＲＮＡのスプライシング及び細胞内信号伝達に関与することができる（Kojima, T.他、２００１年、J Biol Chem 276, 32247〜56; Gross, T.他、1997年、Nucleic Acids Res. 25:1028〜1035）。シゾサッカロマイセス・ポンベのＰｒｐ４遺伝子は、前ｍＲＮＡのスプライシングに関与していると思われるタンパク質キナーゼをコードする（Gross他、上掲）。ＰＲＰ４キナーゼの配列及び前ｍＲＮＡのスプライシングにおけるその機能は、酵母及びヒトにおいて高度に保存されている（Wang他、Hum Mol Genet.、1997年11月、 6(12):2117〜26; Schwelnus他、EMBO Rep.、2001年1月、2(1):35〜41）。キナーゼドメイン配列に基づき、Ｐｒｐ４はＣｌｋ（ＣＤＣ様キナーゼ）ファミリーに属し、ＣＬＫ１と相互作用する（Kojima他、上掲）。
【０００７】
著しい進化的保存性のため、線虫などのモデル生物のゲノムを操作することができれば、さらに複雑な脊椎動物に直接関連する、生化学的プロセスを分析するための強力な手段が得られる。遺伝子と経路の高い保存レベルにより、これらモデル生物と哺乳動物との間の細胞プロセス及び遺伝子の機能保存の高い類似性、特定の経路における新規遺伝子の進化の同定、及びそのようなモデル生物におけるそれら新規遺伝子の機能は、哺乳動物におけるそれら新規遺伝子の調整方法及び相関的経路の理解に直接寄与することができる（例えば、Dulubova I. 他、J Neurochem、2001年4月、77(1):229〜38; Cai T. 他、Diabetologia、2001年1月、44(1):81〜8; Pasquinelli AE, 他、Nature. 2000年11月 2、408(6808):37〜8; Ivanov IP, 他、EMBO J 2000年4月17、19(8):1907〜17; Vajo Z他、Mamm Genome 1999年10月、10(10):1000〜4）。たとえば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（たとえばノックアウト）または過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｔｒｙ ｐｏｉｎｔ）」と呼ばれる）を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為にまたは標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーポイントにより引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じまたは重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがｐ５３などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【０００８】
参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号の配列情報およびウェブサイトの参照を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００９】
（発明の概要）
本発明者らは、線虫でｐ５３経路を改変させる遺伝子を発見し、ヒトにおけるそのオルソログを同定し、本明細書中では以降これをｈＰＲＰ４と呼ぶ。本発明は、これらのｐ５３モディファイヤー遺伝子およびポリペプチドを利用して、ｐ５３及び／又はｈＰＲＰ４機能の欠陥又は不全に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるｈＰＲＰ４調節剤（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を同定する方法を提供する。好ましいｈＰＲＰ４調節剤は、ｈＰＲＰ４ポリペプチドに特異的に結合してｐ５３機能を修復する。他の好ましいｈＰＲＰ４調節剤は、アンチセンスオリゴマーなど核酸モジュレーターや、たとえば対応する核酸（すなわちＤＮＡまたはｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することによってｈＰＲＰ４遺伝子発現または生成物の活性を抑制するＲＮＡｉである。
【００１０】
ｈＰＲＰ４調節剤は、ｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸との分子相互作用のための任意の都合のよいインビトロまたはインビボのアッセイによって評価することができる。一実施形態では、ｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸を含むアッセイ系を用いて候補ｈＰＲＰ４調節剤を試験する。
【００１１】
コントロールと比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる作用剤は、候補ｐ５３調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞ベースでも、無細胞でもよい。ｈＰＲＰ４調節剤には、ｈＰＲＰ４関連タンパク質（たとえばドミナントネガティブ変異体やバイオ治療薬）；ｈＰＲＰ４に特異的な抗体；ｈＰＲＰ４に特異的なアンチセンスオリゴマーおよび他の核酸モジュレーター；特異的にｈＰＲＰ４に結合する、またはｈＰＲＰ４と相互作用する、又は（例えばｈＰＲＰ４の結合パートナーに結合することにより）ｈＰＲＰ４の結合パートナーと競合する化学剤が含まれる。特定の一実施形態では、キナーゼアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、および低酸素誘発アッセイから選択される。
【００１２】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の変化など、ｐ５３経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ｐ５３経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞または非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、アポトーシス、または細胞増殖の疾患（たとえば癌）などｐ５３経路に関係づけられた疾病または疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【００１３】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のｈＰＲＰ４機能及び／又はｐ５３経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体であってよく、ｐ５３経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【００１４】
（発明の詳細な記載）
ホモ接合性のｐ５３欠失変異体を使用した線虫におけるｐ５３経路のモディファイヤーを同定するために、遺伝子スクリーニングを設計した。様々な特異的遺伝子をＲＮＡ阻害（ＲＮＡｉ）により沈黙させた。線虫の遺伝子を沈黙させるためにＲＮＡｉを使用する方法は、従来技術に既知である（Fire A.他、1998年、Nature 391:806〜811; Fire, A. Trends Genet. 15, 358〜363、1999年; WO9932619）。寄生虫の表現型を変化させる遺伝子を、Ｐ５３経路のモディファイヤーとして同定した。特に興味深いモディファイヤーであるＦ２２Ｄ６．５を同定し、続いてそのヒトオルソログを同定した。
【００１５】
本発明では、ｈＰＲＰ４機能を評価するインビトロおよびインビボの方法を提供する。ｈＰＲＰ４またはその対応する結合パートナーの変調は、正常状態および病態におけるｐ５３経路とそのメンバーとの関連性を理解し、ｐ５３に関連する病状の診断方法および治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的または間接的に、たとえば酵素（たとえば触媒）活性または結合活性などのｈＰＲＰ４機能に影響を与えてｈＰＲＰ４の発現を阻害または亢進することによって作用するｈＰＲＰ４調節剤を同定することができる。ｈＰＲＰ４調節剤は、診断、治療、および製薬の開発に有用である。
【００１６】
本発明の核酸およびポリペプチド
本発明で使用することができるｈＰＲＰ４核酸およびポリペプチドに関連する配列は、核酸はＧＩ＃１４５７１５０５（配列番号１）、１７９９９５３４（配列番号２）、１４７４６９７８（配列番号３）、１４７１４４０２（配列番号４）、及び１３９９４６１（配列番号５）、ポリペプチドはＧＩ＃１４５７１５０６（配列番号７）として、Ｇｅｎｂａｎｋに開示されている（Ｇｅｎｂａｎｋ識別（ＧＩ）番号により参照）。さらに、クローン（配列番号６）を本発明の方法に使用することができる。
【００１７】
ｈＰＲＰ４は、キナーゼドメインを有する核セリン／スレオニンキナーゼタンパク質である。用語「ｈＰＲＰ４ポリペプチド」とは、完全長のｈＰＲＰ４タンパク質またはその機能的に活性のある断片または誘導体を言う。「機能的に活性のある」ｈＰＲＰ４断片または誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ｈＰＲＰ４タンパク質に関連する機能活性を１つまたは複数示す。ｈＰＲＰ４タンパク質、誘導体および断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、キナーゼドメインや結合ドメインなどｈＰＲＰ４の構造ドメインを１つまたは複数含む断片も含まれる。タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2）。たとえば、ＧＩ＃１４５７１５０６（配列番号７）由来のｈＰＲＰ４のキナーゼドメインは、概ね、アミノ酸残基６８７−１００３に位置している（ＰＦＡＭ０００６９）。ｈＰＲＰ４ポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。一部の実施形態では、好ましい断片は、機能的に活性のある、配列番号７（ｈＰＲＰ４）の少なくとも２５個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは７５個、最も好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含むドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、この断片はキナーゼ（の機能的に活性のある）ドメインの全体を含む。
【００１８】
用語「ｈＰＲＰ４核酸」とは、ｈＰＲＰ４ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。好ましくは、このｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸あるいはその断片はヒト由来であるが、ｈＰＲＰ４と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するオルソログまたはその誘導体でもよい。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在および／または３次元構造のために、同じ機能を保持している。一般に、オルソログは、通常タンパク質ベイトシーケンスを使用し、ＢＬＡＳＴ分析のようなシーケンス相同分析により同定される。フォワードＢＬＡＳＴ結果のうち最も合致するシーケンスが、リバースＢＬＡＳＴの元のクエリ配列を取り出すのであれば、シーケンスを潜在的オルソログとして指定する（Huynen MAおよびBork P, Proc Natl Acad Sci、1998年、95:5849-5856; Huynen MA他、Genome Research、2000年、10:1204-1210）。ＣＬＵＳＴＡＬ（Thompson JD他、1994年、Nucleic Acids Res 22:4673-4680）など、多重シーケンス整列のためのプログラムを使用して、オルソログのタンパク質の保存域および／または残基をハイライトし、系統樹を作成してもよい。多様種の多重相同シーケンス（例えばＢＬＡＳＴ分析により取り出されたもの）を表す系統樹において、２種のオルソログシーケンスは、それら２種のそれ以外の全シーケンスに対し、系統樹中最も接近して現われる。構造のスレッディング、またはタンパク質の折りたたみのその他分析法（例えばＰｒｏＣｅｒｙｏｎ（バイオサイエンス、オーストリア国ザルツブルク）を使用したもの）により潜在的なオルソログを同定してもよい。進化において、種分化に続いて遺伝子重複が起こるとき、線虫など単一種の単一遺伝子は、ヒトなど別の種の複数の遺伝子に対応する場合がある（パラログ）。本明細書において、「オルソログ」という表現は、パラログも含む。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410）によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列（またはその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【００１９】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミンおよびアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システインおよびグリシンである。
【００２０】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489;database:European Bioinformatics Institute;SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C. アメリカ合衆国）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。スコアをつけるのに初期パラメータを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ伸張ペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００２１】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号１、２、３、４、５又は６の核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズおよび洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley&Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌのニシン***ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡおよび０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行うこと、および；０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、２、３、４、５、又は６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【００２２】
他の実施形態では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ***ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理すること；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ***ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行うこと；次いで、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄することを含む、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用する。
【００２３】
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ***ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートすること；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、および；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間フィルターを洗浄することを含む、低いストリンジェントな条件を使用することができる。
【００２４】
ｈＰＲＰ４核酸およびポリペプチドの単離、生成、発現、およびミスエクスプレッション
ｈＰＲＰ４核酸およびポリペプチドは、ｈＰＲＰ４機能を調節する作用剤の同定および試験、ならびにｐ５３経路におけるｈＰＲＰ４の関与に関連する他の用途に有用である。ｈＰＲＰ４核酸ならびにその誘導体およびオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。たとえば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、および精製方法の詳細が規定される。たとえば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニングまたは抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（たとえば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などｈＰＲＰ４機能を評価するのに使用するアッセイのためのｈＰＲＰ４タンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、および精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（たとえば、Higgins SJおよびHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク）。具体的な実施形態では、組換えｈＰＲＰ４は、欠陥ｐ５３機能を有することで知られている細胞系（たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能なＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３ＡおよびＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９およびＤＬＤ−１大腸癌細胞、）中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞ベーススクリーニングアッセイ系で使用する。
【００２５】
ｈＰＲＰ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルは、ネイティブｈＰＲＰ４遺伝子および／またはそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（たとえばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、かつ／または特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【００２６】
ｈＰＲＰ４遺伝子産物を検出するために、発現ベクターは、ｈＰＲＰ４遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つまたは複数の複製起点、および１つまたは複数の選択可能なマーカー（たとえばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、インビトロアッセイ系（たとえば免疫アッセイ）におけるｈＰＲＰ４タンパク質の物理的または機能的特性に基づいてｈＰＲＰ４遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【００２７】
たとえば精製または検出を促進するために、ｈＰＲＰ４タンパク質、断片、またはその誘導体を、任意選択で融合体またはキメラタンパク質産物（すなわち、ｈＰＲＰ４タンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、たとえばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。
【００２８】
ｈＰＲＰ４遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動）を使用して遺伝子産物を単離および精製することができる。あるいは、標準の方法（たとえば免疫親和性精製）によって、天然源からネイティブｈＰＲＰ４タンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、または結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【００２９】
本発明の方法では、ｈＰＲＰ４またはｐ５３経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、および無発現（たとえば遺伝子のノックアウトまたは通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００３０】
遺伝子改変動物
候補ｐ５３調節剤の活性を試験するため、またはアポトーシスや細胞増殖などｐ５３経路のプロセスにおけるｈＰＲＰ４の役割をさらに評価するために、ｈＰＲＰ４の発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、インビボアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したｈＰＲＰ４の発現により、正常なｈＰＲＰ４発現を有する対照動物に比べて低減または上昇した細胞増殖、血管形成、またはアポトーシスのレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、ｐ５３発現が変化していてもよい（たとえばｐ５３ノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス）、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌおよびネコなどの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、およびショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（たとえば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、または異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、たとえば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【００３１】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、RubinおよびSpradling、Science、1982年、218:348〜53および米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵および鳥でのマイクロインジェクションについては、HoudebineおよびChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、たとえばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号およびＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００３２】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはｈＰＲＰ４発現が検出不可能または僅かとなるようにｈＰＲＰ４機能の低下をもたらす、内因性ｈＰＲＰ４遺伝子の配列中のヘテロ接合性またはホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、または置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（たとえばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。たとえば、マウスゲノム中の内因性ｈＰＲＰ４遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスｈＰＲＰ４遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物および他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（HoudebineおよびChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scan J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜400）。
【００３３】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、たとえばｈＰＲＰ４の追加のコピーを導入することによって、またはｈＰＲＰ４遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、ｈＰＲＰ４遺伝子の発現の変化（たとえば発現の増大（異所性の増大を含む）および低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーターおよびエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性またはヘテロ接合性であることができる。
【００３４】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、たとえば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施形態では、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘｐおよびＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される（Sun X他、2000年、Nat Genet、25:83〜6）。
【００３５】
遺伝学の研究において欠陥ｐ５３機能に関係する疾病および疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のインビボ試験のために、遺伝子改変動物を使用してｐ５３経路をさらに解明することができる。この候補治療剤をｈＰＲＰ４機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物および／または候補治療剤を与えたｈＰＲＰ４発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【００３６】
ｈＰＲＰ４機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ｐ５３機能（およびそれ以外は正常なｈＰＲＰ４機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。たとえば、以下に記載するインビトロアッセイのうち１つで同定された候補ｐ５３調節剤の活性をインビボで評価するために、ｐ５３ノックアウトマウスを使用することができる。ｐ５３ノックアウトマウスは文献に記載されている（Jacks他、Nature、2001年;410:1111〜1116、1043〜1044;Donehower他、上掲）。好ましくは、候補ｐ５３調節剤をｐ５３機能に欠陥がある細胞を有するモデル系に投与した場合、モデル系において検出可能な表現型の変化がもたらされ、これにより、ｐ５３機能が修復されている、すなわち細胞が正常な細胞周期進行を示していることが示される。
【００３７】
調節剤
本発明は、ｈＰＲＰ４の機能および／またはｐ５３経路と相互作用し及び／またはこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。本方法によって同定された調節剤も本発明の一部である。このような作用剤は、ｐ５３経路に関連する様々な診断および治療用途、ならびにｈＰＲＰ４タンパク質およびｐ５３経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ｈＰＲＰ４相互作用剤または調節剤を投与することによってｈＰＲＰ４活性を特異的に調節する工程を含む、ｐ５３経路を調節する方法も提供する。
【００３８】
本明細書で使用する「ｈＰＲＰ４−調節剤」とは、ｈＰＲＰ４と相互作用する作用剤など、ｈＰＲＰ４機能を調節することにより、ｈＰＲＰ４活性を阻害または増強させるか、正常なｈＰＲＰ４機能にその他の影響を与える任意の作用剤である。転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含め、ｈＰＲＰ４機能への影響はいかなるレベルでもありうる。好ましい実施形態では、ｈＰＲＰ４調節剤はｈＰＲＰ４の機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸に直接結合し、好ましくはｈＰＲＰ４の機能を阻害、増強、または他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、これらの表現は、（たとえば、ｈＰＲＰ４の結合パートナーと、またはタンパク質／結合パートナー複合体と結合してｈＰＲＰ４機能を変化させることによって）ｈＰＲＰ４と結合パートナー、基質またはコファクターとの相互作用を変化させる調節剤も包含する。さらに好ましい実施形態では、ｈＰＲＰ４調節剤はｐ５３経路のモジュレーターであり（例えば、ｐ５３機能を回復及び／又は上方制御する）、よってｐ５３調節剤でもある。
【００３９】
好ましいｈＰＲＰ４調節剤には、小分子化合物；抗体および生物療法剤を含むｈＰＲＰ４相互作用タンパク質；およびアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、たとえば組合せ療法などにおけるような他の活性成分および／または適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、作用剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合または投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。
【００４０】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有しかつ／またはタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００未満、好ましくは５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、たとえばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知または推定ｈＰＲＰ４タンパク質の特性に基づいて合理的に設計または同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてｈＰＲＰ４変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann JおよびGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。
【００４１】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ｐ５３経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、および候補モジュレーターの改変および試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的および薬理的特性に特に注意を払って作製される。たとえば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、インビトロおよびインビボアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００４２】
タンパク質モジュレーター
特異的なｈＰＲＰ４相互作用タンパク質は、ｐ５３経路および関連疾患に関連する様々な診断上および治療上の用途、ならびに他のｈＰＲＰ４調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性または細胞外活性を含めた正常なｈＰＲＰ４機能に影響を与える。別の実施形態では、ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質は、癌などｐ５３に関連する疾患に関連性があるので、ｈＰＲＰ４タンパク質の機能に関する情報を検出および提供するのに有用である（たとえば診断上の手段用）。
【００４３】
ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質は、ｈＰＲＰ４発現、局在化、および／または活性を調節するｈＰＲＰ４経路のメンバーなど内因性のもの、すなわちｈＰＲＰ４と自然に遺伝学的または生化学的に相互作用するものであってよい。ｈＰＲＰ４モジュレーターには、ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質およびｈＰＲＰ４タンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母２ハイブリッドおよび変異体スクリーニングにより、内因性ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.およびHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、169〜203頁;Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal MおよびLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（たとえば、Pandley AおよびMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。
【００４４】
ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質は、ｈＰＲＰ４に特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（たとえば、HarlowおよびLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory;HarlowおよびLane、1999年、Using antibodies:a laboratory manual.、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー:Cold Spring Harbor Loboratory Press参照）。ｈＰＲＰ４抗体については以下でさらに論じる。
【００４５】
好ましい実施形態では、ｈＰＲＰ４相互作用タンパク質はｈＰＲＰ４タンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、ｈＰＲＰ４調節剤はｈＰＲＰ４基質、結合パートナー、またはコファクターと結合する。
【００４６】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはｈＰＲＰ４に特異的な抗体アゴニストまたはアンタゴニストである。この抗体は治療上および診断上の用途を有しており、ｈＰＲＰ４モジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。また、様々な細胞応答ならびにｈＰＲＰ４の通常のプロセッシングおよび成熟を担当するｈＰＲＰ４経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【００４７】
周知の方法を使用してｈＰＲＰ４ポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はｈＰＲＰ４ポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトｈＰＲＰ４に、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。たとえば、配列番号７に示すアミノ酸配列に対する抗原性を探すための通常のｈＰＲＰ４スクリーニングによって、またはこれに対するタンパク質の抗原性領域を選択する理論的な方法を施用することによって、特に抗原性であるｈＰＲＰ４のエピトープを選択することができる（HoppおよびWood、1981年、Proc.Nati.Acad.Sci.U.S.A.、78:3824〜28;HoppおよびWood、1983年、Mol.Immunol.、20:483〜89;Sutcliffe他、1983年、Science、219:660〜66）。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、またはそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（HarlowおよびLane、上掲;Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ｈＰＲＰ４の粗細胞抽出物または実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ｈＰＲＰ４断片を使用する場合は、これらは、好ましくはｈＰＲＰ４タンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ｈＰＲＰ４に特異的な抗原および／または免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。たとえば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。
【００４８】
固定した対応するｈＰＲＰ４ポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ｈＰＲＰ４に特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【００４９】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ｈＰＲＰ４ポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。たとえば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域および定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列および約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下または排除される（Co MSおよびQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501;Morrison SL.、1992年、Ann.Rev.Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体およびそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号）。
【００５０】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるｈＰＲＰ４特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426;Huston他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。
【００５１】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をインビトロで、抗原ポリペプチド、または代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（HarlowおよびLane、1988年、上掲）。
【００５２】
本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変してまたは改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質または標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合または非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識およびコンジュゲーション技術が知られており、科学文献および特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；及び第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００５３】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、または静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量および投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（たとえば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、および５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、またはリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高めるまたは他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；ＷＯ００７３４６９号）。
【００５４】
核酸モジュレーター
他の好ましいｈＰＲＰ４調節剤としては、一般的にｈＰＲＰ４活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。好ましい核酸モジュレーターは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのｈＰＲＰ４ ＲＮＡの転位、ｈＰＲＰ４ ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ｈＰＲＰ４ ＲＮＡをスプライシングして１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得ること、またはｈＰＲＰ４ ＲＮＡに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、ｈＰＲＰ４核酸の機能を妨げる。
【００５５】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってｈＰＲＰ４ ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ｈＰＲＰ４に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、または３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００５６】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルフォリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯおよび他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法および使用方法は、当分野で周知である（たとえば、ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton JおよびWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。
【００５７】
好ましい代替ｈＰＲＰ４核酸モジュレーターは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトで遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年;Sharp, P.A.、RNA interference 2001.、Genes Dev.、15、485〜490、2001年;Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.、Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001;Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；ＷＯ０１２９０５８号；ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498）。
【００５８】
核酸モジュレーターは一般的に、研究試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、核酸モジュレーターは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。たとえば、アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、ｐ５３経路におけるｈＰＲＰ４の役割、および／またはｈＰＲＰ４とこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ｈＰＲＰ４に特異的な核酸モジュレーターを使用する。本発明の別の態様では、ｐ５３に関連する病態を処置する治療剤として、ｈＰＲＰ４に特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【００５９】
アッセイ系
本発明は、ｈＰＲＰ４活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系およびスクリーニング方法を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出かつ／または測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ｈＰＲＰ４核酸またはタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果または分子効果を同定または確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたｈＰＲＰ４調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がｐ５３経路に関連する方式でｈＰＲＰ４に影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ｈＰＲＰ４モジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【００６０】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（たとえばキナーゼ活性）が系によってもたらされる条件下で、ｈＰＲＰ４ポリペプチド又は核酸を含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤偏向活性と基準活性との統計的に有意な差により、この候補剤がｈＰＲＰ４活性を、したがってｐ５３経路を調節することが示される。アッセイに使用されるｈＰＲＰ４ポリペプチド又は核酸は、上述の核酸又はポリペプチドのいずれを含んでもよい。
【００６１】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００６２】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせるまたは保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91および付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞ベース」とは、生細胞、死滅細胞、または膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性または組換えによって生成された）、部分的に精製したまたは粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（たとえば受容体−リガンド結合）、転写活性（たとえばレポーター遺伝子）、酵素活性（たとえば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、および細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、および電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【００６３】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ｈＰＲＰ４を組換えによって発現する系および個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母２ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニングおよび質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにｈＰＲＰ４相互作用タンパク質を使用する場合、ｈＰＲＰ４タンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（たとえば候補ｈＰＲＰ４に特異的に結合する作用剤の、ｈＰＲＰ４発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（たとえばマウス、ラット、ヤギまたはウサギなどの異種宿主中でｈＰＲＰ４に特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素および受容体について、結合はそれぞれ基質およびリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００６４】
スクリーニングアッセイでは、ｈＰＲＰ４ポリペプチド、その融合タンパク質、またはこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞または膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ｈＰＲＰ４ポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なｈＰＲＰ４活性を保持しているその断片でもよい。ｈＰＲＰ４ポリペプチドは、検出または固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ｈＰＲＰ４ポリペプチドは、好ましくはヒトｈＰＲＰ４、あるいは上記のようなそのオルソログまたは誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、ｈＰＲＰ４と内因性タンパク質、外因性タンパク質、またはｈＰＲＰ４に特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なｈＰＲＰ４遺伝子機能を評価することができる。
【００６５】
ｈＰＲＰ４モジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループットまたは超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、Curr Opin Chem Biol、1998年、2:597〜603;Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。好ましい一実施形態では、スクリーニングアッセイで、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質−タンパク質またはＤＮＡ−タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（たとえば、Selvin PR、Nat Struct Biol、2000年、7:730〜4;Fernandes PB、上掲;Hertzberg RPおよびPope AJ、Curr Opin Chem Biol、2000年、4:445〜451）。
【００６６】
候補ｈＰＲＰ４およびｐ５３経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（たとえば、米国特許第６，１６５，９９２号（キナーゼアッセイ）；米国特許第５，５５０，０１９および第６，１３３，４３７号（アポトーシスアッセイ）；米国特許第６，０２０，１３５号（ｐ５３の変調））。特定の好適なアッセイを以下により詳細に記載する。
【００６７】
キナーゼアッセイ。いくつかの好適な実施形態では、スクリーニングアッセイにより、ｈＰＲＰ４ポリペプチドのキナーゼ活性を変調する試薬の能力を検出する。さらなる実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系を使用することにより候補ｐ５３調節剤を同定するが、アポトーシスアッセイまたは低酸素アッセイなどの二次的な細胞に基づくアッセイ（後述）を使用して、候補ｐ５３調節剤をさらに特徴付けてもよい。多種多様なキナーゼのアッセイが文献に報告されており、当業者に周知である（例えば、米国特許第６，１６５，９９２号；Zhu他、Nature Genetics、2000年、26:283-289; ＷＯ００７３４６９）。ガンマリン酸の転移をモニターするラジオアッセイが頻繁に使用される。例えば、ｐ５６（ｌｃｋ）キナーゼ活性のシンチレーションアッセイは、ガンマ−３３ＰＡＴＰからビオチン化したペプチド基質へのガンマリン酸の転移をモニターする；基質はシグナルを伝達するストレプトアビジン被覆ビーズに捕らえられる（Beveridge M他、J Biomol Screen、2000年、5:205-212）。このアッセイはシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を使用する。ＳＰＡにおいては、ＳＰＡビーズの表面に拘束された受容体に結合したラジオリガンドのみが、内部に固定化されたシンチラントによって検出され、それにより自由リガンドから結合体を分離することなく、結合を測定することができる。
【００６８】
タンパク質キナーゼ活性のための他のアッセイでは、リン酸化した気質を特異的に認識する抗体が使用される。例えば、キナーゼレセプター活性（ＫＩＲＡ）アッセイでは、培養細胞中の無傷レセプターを刺激し、次いで特異的抗体で可溶化されたレセプターを捕獲し、ホスホチロシンＥＬＩＳＡによりリン酸化を定量化するリガンドにより、レセプターチロシンキナーゼ活性を測定する（Sadick MD, Dev Biol Stand、1999年、97:121-133）。
【００６９】
タンパク質キナーゼ活性のための抗体に基づくアッセイの別の例として、ＴＲＦ（時間分解蛍光光度法）が挙げられる。この方法では、ユーロピウムキレート標識抗ホスホチロシン抗体を使用して、マイクロタイタプレートのウェル上にコーティングされた上方体基質へのリン酸塩の転移を検出する。次いで、時間分解、解離亢進蛍光光度法を使用してリン酸化の量を検出する（Braunwalder AF他、Anal Biochem、1996年7月、1;238(2):159-64）。
【００７０】
アポトーシスアッセイ。アポトーシス用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによってアポトーシスに特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によってアポトーシスをさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。アポトーシスアッセイ系は、ｈＰＲＰ４を発現する細胞、および任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えないコントロールと比較したアポトーシスの誘発における変化により、候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ｈＰＲＰ４機能がアポトーシスにおいて直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてｈＰＲＰ４を過剰発現または過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較したアポトーシス応答の差により、ｈＰＲＰ４がアポトーシス応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。
【００７１】
細胞増殖および細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J.Immunol.Meth.、107、79）、または他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。
【００７２】
また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995年、J.Biol.Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ ３８００液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。
【００７３】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。たとえば、ｈＰＲＰ４で形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【００７４】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる（Gray JW他、1986年、Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med、49:237〜55）。ｈＰＲＰ４で形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）で評価することができる。
【００７５】
したがって、細胞増殖または細胞周期アッセイ系は、ｈＰＲＰ４を発現する細胞、および任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えないコントロールと比較した細胞増殖または細胞周期の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖または細胞周期アッセイを使用することができる。また、ｈＰＲＰ４機能が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてｈＰＲＰ４を過剰発現または過少発現する細胞で細胞増殖または細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖または細胞周期の差により、ｈＰＲＰ４が細胞増殖または細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。
【００７６】
血管形成。臍帯、冠動脈、または真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）；血管形成エンハンサーまたはサプレッサーが存在するまたは存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、ｈＰＲＰ４を発現する細胞、および任意選択で欠陥ｐ５３機能を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えないコントロールと比較した血管形成の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、ｈＰＲＰ４機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてｈＰＲＰ４を過剰発現または過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、ｈＰＲＰ４が血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。
【００７７】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、インビトロで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ｈＰＲＰ４で形質移入させた細胞を（たとえばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、および残りはＮ２を用いた）低酸素条件下および正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性または発現を評価することによってアッセイすることができる。たとえば、低酸素誘発アッセイ系は、ｈＰＲＰ４を発現する細胞、および任意選択で変異したｐ５３を有する（たとえば、野生型細胞に比べてｐ５３が過剰発現または過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補ｐ５３調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ｈＰＲＰ４機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。たとえば、野生型細胞に比べてｈＰＲＰ４を過剰発現または過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ｈＰＲＰ４が低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【００７８】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在するまたは存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、または細胞の相互接着を測定する。細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。たとえば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。ネガティブコントロールで使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【００７９】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然にまたは組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【００８０】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンドおよびペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチドおよびモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をｉｎ ｓｉｔｕで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。
【００８１】
細胞移動。侵入／移動アッセイ（移動アッセイとも呼ぶ）では、細胞の、物理的障壁を克服して血管形成促進シグナルへ向かって移動する能力を試験する。移動アッセイは当技術分野で周知である（たとえば、Paik JH他、2001年、J Biol Chem. 276:11830-11837）。典型的な実験設定では、培養した内皮細胞を通常の細胞より小さい径の孔を有する基質で被覆した薄膜に埋め込む。上述したように、基質は通常細胞外マトリックスの環境を刺激する。薄膜は典型的にはトランスウェル（transwell）ポリカーボネート膜（Corning Costar Corporation, マサチューセッツ州ケンブリッジ）などの膜であり、通常血管形成促進刺激物を含む下部チャンバと液体接点を有する上部チャンバの一部である。通常、刺激物で一晩インキュベートしてから移動をアッセイするが、これよりも長い、または短い時間を採用してもよい。移動の評価は薄膜を通過した細胞の数で行い、ヘモトキシリン（hemotoxylin）溶液（VWR Scientific, カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）で染色した細胞を使用して検出するか、細胞の数を決定するためのその他任意の方法で検出することができる。別の例示的設定では、細胞を蛍光標識し、Ｆａｌｃｏｎ ＨＴＳ ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｋ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）などの蛍光読み取りを使用して移動を検出する。刺激物がなくても観察できる移動はあるが、血管形成促進因子に反応して移動が大きく増加する。上述したように、移動／侵入の好ましいアッセイ系は、腫瘍血管形成および炎症性血管形成剤を含む様々な血管形成促進因子に対するｈＰＲＰ４の反応を試験すること、および無血清培地での細胞培養を含む。
【００８２】
出芽アッセイ。出芽アッセイは、ゲルベースのコラーゲン基質に埋め込まれた内皮細胞の細胞数決定スフェロイド凝集（「スフェロイド」）を使用する３次元のインビトロ血管形成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックスへの侵入（「細胞出芽」と呼ぶ）による毛細血管状構造の出芽の開始点、およびそれに続く複合網状ネットワーク形成の役割を果たす（KorffおよびAugustin、1999年、J Cell Sci 112:3249-58）。一例示的実験設定では、非接着性９６ウェルプレートの１つのウェルにつき、ヒト臍帯静脈内皮細胞４００個をピペットで取り分け、一晩スフェロイド凝集を行うことによりスフェロイドを調製する（KorffおよびAugustin: J Cell Biol 143:1341-52、1998年）。スフェロイドを回収し、９００μｌのメトセル(methocel)コラーゲン溶液に蒔き、２４ウェルプレートの各ウェルにピペットで取り分け、コラーゲンゲル重合させる。３０分後、１０倍に濃縮した試験物質の作用希釈液１００μｌをゲル頂部にピペットで取ることにより試薬を加える。プレートを３７℃で２４時間インキュベートする。パラホルムアルデヒドを添加することにより、実験的インキュベーション期間の最後にディッシュを固定する。自動化画像分析系により１スフェロイド当たりの累積発芽長を測定することにより、内皮細胞の発芽強度を定量化することができる。
【００８３】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ｈＰＲＰ４タンパク質に対する抗体の親和性および特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性および特異性を試験する方法は当分野で周知である（HarlowおよびLane、1988年、1999年、上掲）。ｈＰＲＰ４に特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、および蛍光アッセイが含まれる。
【００８４】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがｈＰＲＰ４遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害または増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下または非存在下の細胞の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってｈＰＲＰ４を発現する２種の細胞プール）中のｈＰＲＰ４発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。たとえば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（たとえばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、またはマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でｈＰＲＰ４ ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DHおよびGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはｈＰＲＰ４タンパク質または特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体または抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、インサイツ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow EおよびLane D、1988年および1999年、上掲）。
【００８５】
二次アッセイ
調節剤がｐ５３経路に関連する様式でｈＰＲＰ４に影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したｈＰＲＰ４調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するｈＰＲＰ４調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物または他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的または生化学的経路における調節剤の活性を試験するために、あるいは調節剤がｈＰＲＰ４と相互作用する特異性を試験することもできる。
【００８６】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下または非存在下において、細胞や動物の類似集団（たとえば、内因的にまたは組換えによってｈＰＲＰ４を発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ｈＰＲＰ４調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置または偽薬で処置した）細胞や動物と比較してｐ５３経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、ｐ５３または相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【００８７】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥ｐ５３機能を有することで知られている様々な哺乳動物細胞系（たとえば、とりわけアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能であるＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３ＡおよびＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９およびＤＬＤ−１大腸癌細胞）を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性ｐ５３経路活性を検出するか、あるいはこれはｐ５３経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入するまたは任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【００８８】
動物アッセイ
候補ｈＰＲＰ４モジュレーターを試験するために、正常または欠陥のあるｐ５３経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥ｐ５３経路のモデルでは、ｐ５３経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（たとえば過剰発現または発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【００８９】
好ましい実施形態では、新血管新生および血管形成をモニターすることによってｐ５３経路の活性を評価する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける、ｈＰＲＰ４に対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるｐ５３および正常なｐ５３を有する動物モデルを使用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦなど様々な血管形成剤、またはｈＰＲＰ４を過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入（ＳＣ）する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、または静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを回収する（Ｓｉｇｍａ ｐｌａｓｍａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｋｉｔ）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、ｈＰＲＰ４における候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、異種移植ヒト腫瘍をＳＣで、既存の腫瘍由来またはインビトロ培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植する。内因的にｈＰＲＰ４を発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によってＩＶ、ＳＣ、ＩＰ、またはＰＯで送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【００９１】
診断および治療上の使用
特異的なｈＰＲＰ４調節剤は、疾病または疾病予後が血管形成、アポトーシス、または増殖疾患などｐ５３経路の欠陥又は不全（例えばｐ５３の過剰発現、発現不足又は異常発現、或いは遺伝子突然変異によるもの）に関連している様々な診断および治療用途に有用である。したがって、本発明は、ｈＰＲＰ４活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与する工程を含む、細胞、好ましくは欠陥ｐ５３機能を有することが事前に確定されている細胞におけるｐ５３経路を調節する方法も提供する。好ましくは、調節剤は細胞中に検出可能な表現型の変化を生じさせ、これにより、ｐ５３機能が修復されたことが示される。本明細書において、「機能が修復された」という表現及びそれと同等の表現は、所望の表現型が達成されたこと、或いは未処理の細胞と比較して正常に近づいたことを意味する。例えば、ｐ５３機能が修復されると、細胞周期を通じて細胞増殖及び／又は細胞発達が正常化するか、又は未処理の細胞と比較して正常に近づく。本発明はまた、ｐ５３経路を調節するｈＰＲＰ４調節剤の治療的有効量を投与することにより、ｐ５３機能の不全に関連する疾病又は疾患の治療方法を提供する。本発明はさらに、ｈＰＲＰ４調節剤を投与することにより、細胞、好ましくはｈＰＲＰ４機能の欠陥又は不全を有することが事前に決定された細胞のｈＰＲＰ４機能を調節する方法を提供する。加えて、本発明は、ｈＰＲＰ４調節剤の治療的有効量を投与することによるｈＰＲＰ４機能不全に関連する疾病又は疾患の治療法を提供する。
【００９２】
ｈＰＲＰ４がｐ５３経路に関係しているという発見により、ｐ５３経路の欠陥に関与する疾病および疾患の診断および予後評価、ならびにこのような疾病および疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【００９３】
特定の試料でｈＰＲＰ４が発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、およびマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;BlohmおよびGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ｈＰＲＰ４を発現する欠陥ｐ５３シグナル伝達に関係づけられている疾病または疾患を有する組織は、ｈＰＲＰ４調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、ｐ５３欠陥組織は正常組織に比べてｈＰＲＰ４を過剰発現する。たとえば、完全または部分ｈＰＲＰ４ ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍および正常細胞系由来、または腫瘍および同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がｈＰＲＰ４を発現または過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織および腫瘍試料中のｈＰＲＰ４発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用する（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００９４】
たとえばｈＰＲＰ４オリゴヌクレオチドなどの試薬、およびｈＰＲＰ４に対する抗体を利用して、上に記載した（１）ｈＰＲＰ４遺伝子変異の存在の検出、または疾患でない状態と比較したｈＰＲＰ４ ｍＲＮＡの過剰発現または過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したｈＰＲＰ４遺伝子産物の過剰存在または過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ｈＰＲＰ４に媒介されたシグナル伝達経路における摂動または異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【００９５】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得ること、（ｂ）試料をｈＰＲＰ４発現用のプローブと接触させること、（ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較すること、および（ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、ｈＰＲＰ４発現の変調に関連する患者の疾病又は疾患を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは卵巣癌である。プローブは、ＤＮＡまたは抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【００９６】
以下の実験セクションおよび実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【００９７】
Ｉ．線虫ｐ５３のスクリーニング
ｐ５３欠失にホモ接合する寄生虫において様々な遺伝子の系統的ＲＮＡｉを実行した。ｐ５３（−／−）寄生虫は正常な表現型を持つが、ＤＮＡ損傷応答にｐ５３が関与するイオン化放射への生殖系列アポトーシス反応に欠陥を有する。ＲＮＡｉにより各遺伝子を沈黙させた後、寄生虫をガンマ放射に曝し、表現型をスコア化した。寄生虫Ｆ２２Ｄ６．５はＤＮＡ損傷により生殖系列に誘発されたアポトーシスにおいてｐ５３ブロックを抑制した。
【００９８】
ＢＬＡＳＴ分析（Altschul他、上掲）を行って線虫のモディファイヤーのターゲットを同定した。例えば、ｈＰＲＰ４の代表的配列ＧＩ＃１４５７１５０６（配列番号７）は、線虫Ｆ２２Ｄ６．５と、４０％のアミノ酸同一性を共有している。
【００９９】
タンパク質の様々なドメイン、シグナル、および機能的サブユニットを、ＰＳＯＲＴ（Nakai K.およびHorton P.、Trends Biochem Sci、1999年、24:34-6; Kenta Nakai、Protein sorting signals and prediction of subcellular localization, Adv. Protein Chem. 54, 277-344、2000年）、ＰＦＡＭ（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260-2; http://pfam.wustl.edu）、ＳＭＡＲＴ（Ponting CP他、SMART: identification and annotation of domains from signaling and extracellular protein sequences. Nucleic Acids Res.、1999年1月 1;27(1):229-32）、ＴＭ−ＨＭＭ（Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne、およびAnders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. In Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, P175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, and C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press、1998年）、およびクラスト（clust）（Remm MおよびSonnhammer E. Classification of transmembrane protein families in the Caenorhabditis elegans genome and identification of human orthologs. Genome Res. 2000年11月；10(11):1679-89）プログラムを使用して分析した。たとえば、ＧＩ＃１４５７１５０６（配列番号７）のｈＰＲＰ４のキナーゼドメインは、概ねアミノ酸残基６８７−１００３に位置している（ＰＦＡＭ０００６９）。
【０１００】
ＩＩ．ハイスループットのインビトロ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したｈＰＲＰ４ペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光のコントロール値に対する変化により、試験化合物がｈＰＲＰ４活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【０１０１】
ＩＩＩ．ハイスループットのインビトロ結合アッセイ
３３Ｐ標識のｈＰＲＰ４ペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）に加えて、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに添加し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いないコントロールに比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補ｐ５３調節剤として同定された。
【０１０２】
ＩＶ．免疫沈降および免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、ｈＰＲＰ４タンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、および１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
【０１０３】
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼおよび高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【０１０４】
Ｖ．キナーゼアッセイ
精製したか、部分的に精製したｈＰＲＰ４を、適切な反応緩衝液、例えば、塩化マグネシウムまたは塩化マンガン（１−２０ｍＭ）、および、ミエリン塩基性タンパク質またはカゼインなどのペプチドまたはポリペプチド基質（１−１０μｇ／ｍｌ）を含むｐＨ７．５のＨｅｐｅｓ５０ｍＭに希釈する。キナーゼの最終濃度は１−２０ｎＭである。酵素反応をマイクロタイタープレートで行い、アッセイのスループットを増大させることにより反応条件の最適化を促進する。９６ウェルのマイクロタイタープレートを用い、最終容量を３０−１００μｌとする。３３ＰガンマＡＴＰ（０．５μＣｉ／ｍｌ）を加えて反応を開始させ、０．５から３時間室温でインキュベートする。酵素活性に必要な二価カチオン（Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋）をキレート化するＥＤＴＡの添加によりネガティブコントロールを提供する。インキュベーション後、ＥＤＴＡを使用して酵素反応を停止させる。反応試料を９６ウェルのガラスファイバーフィルタプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。続いてフィルタをリン酸緩衝生理食塩水、希リン酸（０．５％）、またはその他適切な媒体で洗浄し、過剰な放射標識ＡＴＰを除去する。シンチレーションカクテルをフィルタプレートに添加し、シンチレーションカウンティングにより取り込まれた放射能を定量する（Wallac/Perkin Elmer）。活性は、ネガティブコントロール反応値（ＥＤＴＡクエンチ）の差引き後に検出される放射能の量と定義する。
【０１０５】
ＶＩ．発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織および腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、ＵＣ Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、およびＡｍｂｉｏｎから得た。
【０１０６】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ分析を使用した。
【０１０７】
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ ｋｉｔを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムの六量体および各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１０８】
ＴａｑＭａｎプロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、およびｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。
【０１０９】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマーおよび２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを使用し、９６ウェルプレートで２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で、Ｔａｑｍａｎ反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｏｏｌ）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織および細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。
【０１１０】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての試料））の２倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【０１１１】
ｈＰＲＰ４（ＧＩ＃１４５７１５０５、配列番号１）が卵巣腫瘍７つのうち２つで過剰発現した。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（または複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析で、遺伝子標的に対する抗体によって、または任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。

Claims (25)

  1. （ａ）精製したｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸、あるいは機能的に活性のあるその断片または誘導体を含んでなるアッセイ系を提供する工程と、
    （ｂ）試験剤が存在しない場合に系により基準活性がもたらされる条件下で、アッセイ系を試験剤と接触させる工程と、
    （ｃ）アッセイ系の試験剤偏向活性を検出し、試験剤偏向活性と基準活性との差により試験剤を候補ｐ５３経路調節剤として同定する工程と
    を含む、候補ｐ５３経路調節剤を同定する方法。
  2. アッセイ系がｈＰＲＰ４ポリペプチドを発現する培養細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 培養細胞がさらに欠陥ｐ５３機能を有する、請求項２に記載の方法。
  4. アッセイ系がｈＰＲＰ４ポリペプチドを含むスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
  5. アッセイがキナーゼアッセイである、請求項４に記載の方法。
  6. アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、および低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. アッセイ系がｈＰＲＰ４ポリペプチドを含んでなる結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１に記載の方法。
  8. アッセイ系がｈＰＲＰ４核酸を含んでなる発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１に記載の方法。
  9. 核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項８に記載の方法。
  10. 核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項８に記載の方法。
  11. （ｄ）（ｃ）で同定された候補ｐ５３経路調節剤を、ｐ５３機能に欠陥がある細胞を含んでなるモデル系に投与し、ｐ５３機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出する工程
    をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
  12. モデル系が欠陥ｐ５３機能を有するマウスモデルである、請求項１１に記載の方法。
  13. ｐ５３機能に欠陥がある細胞を、配列番号７に規定されるアミノ酸配列を含むｈＰＲＰ４ポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含んでなり、それによりｐ５３機能が修復される、細胞のｐ５３経路を調節する方法。
  14. ｐ５３機能の欠陥に起因する疾病または疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項１３に記載の方法。
  15. 候補モジュレーターが抗体および小分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  16. （ｄ）ｈＰＲＰ４を発現している非ヒト動物または培養細胞を含む二次アッセイ系を提供する工程と、
    （ｅ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤またはそれから誘導した作用剤と、試験剤またはそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させる工程と、
    （ｆ）二次アッセイ系の試験剤偏向活性を検出する工程のさらなる工程を含んでなり、
    二次アッセイ系の作用剤偏向活性と基準活性との差により試験剤またはそれから誘導した作用剤が候補ｐ５３経路調節剤であることが同定され、
    ここで第２アッセイが作用剤の影響を受けたｐ５３経路における変化を検出する、請求項１に記載の方法。
  17. 二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 非ヒト動物がｐ５３経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項１８に記載の方法。
  20. 哺乳動物の細胞をｈＰＲＰ４ポリペプチドまたは核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含む、哺乳動物細胞内のｐ５３経路を調節する方法。
  21. ｐ５３経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項２０に記載の方法。
  22. 作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、または抗体である、請求項２０に記載の方法。
  23. （ａ）患者から生体試料を得ること、
    （ｂ）試料をｈＰＲＰ４発現用のプローブと接触させること、
    （ｃ）工程（ｂ）からの結果を対照と比較すること、
    （ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定すること
    を含む、患者の疾病を診断する方法。
  24. 前記疾病が癌である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記癌が卵巣癌である、請求項２４に記載の方法。
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