JP2004537305A5 - - Google Patents

Description

宿主細胞の感染の後に、組換えＶＳＶは宿主細胞タンパク質合成をシャットダウンしそしてそれ自体の５つの遺伝子産物だけではなくそのゲノム中にコードされた異種タンパク質も発現する。ＶＳＶ組換え体由来の異種核酸の首尾よい発現は、ＶＳＶ遺伝子接合部の各々において見出される最小限の保存された配列を伴った全長ｃＤＮＡへの異種核酸配列の添加のみを必要とする。この配列は、ポリアデニル化／転写停止シグナル（３’ＡＵＡＣＵ_７）（配列番号１）、その後の遺伝子間ジヌクレオチド（ＧＡまたはＣＡ）およびＶＳＶ ｍＲＮＡの５’に対して相補的な転写開始配列（３’ＵＵＧＵＣＮＮＵＡＧ）（配列番号２）からなる。Ｂａｌｌら１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４７０５−４７１２；Ｌａｗｓｏｎら１９９５，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ９２：４４７７−４４８１；Ｗｈｅｌａｎら１９９５，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ ９２：８３８８−８３９２。さらに、（好ましくは、固有の）制限部位（これは、例えば、ポリリンカー中にある）が、ＶＳＶ ｃＤＮＡ（例えば、遺伝子間領域）に導入され、異種核酸（例えば、インターロイキンまたはインターフェロンをコードする核酸）の挿入を促進する。他の実施例において、このＶＳＶ ｃＤＮＡは、それに作動可能に連結したプロモーターを有するように構築されている。このプロモーターは、その組換えＶＳＶベクターを産生することが所望される動物細胞または昆虫細胞におけるそのｃＤＮＡの転写を開始することができるはずである。使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；熱ショックプロモーター（例えば、ショウジョウバエＳ２細胞での使用のためのｈｓｐ７０）；ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、ならびに以下の動物転写制御領域（これらは、組織特異性を提示しかつトランスジェニック動物中で使用されてきている）：膵臓腺房細胞おいて活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣細胞、***細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓で活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓で活性であるα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄細胞で活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の中の希突起神経膠細胞において活性なミエリンベーシックプロテイン遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；ならびに骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）。好ましくは、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、好ましくは、バクテリオファージまたはウイルスまたは昆虫のＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、これらのプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター、およびＴ３ ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーター。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが使用される場合（ここで、このＲＮＡポリメラーゼは、宿主細胞によって内因的に産生されておらず、この宿主細胞において、その組換えＶＳＶが産生されることが所望される）、ＲＮＡポリメラーゼの組換え供給源は、宿主細胞中において提供されなければならない。このようなＲＮＡポリメラーゼは、当該分野で公知である。

を使用した。

であった。

を使用して増幅した。

を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。次いで、増幅したフラグメントを、ｐＶＳＶ−ＸＮ２（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．；７６（２）：８９５−９０４）のＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入した。組換えＶＳＶを回収するための手順は、以前に記載された手順（Ｌａｗｓｏｎら、１９９５、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ、９２：４４７７−８１；Ｗｈｅｌａｎら、１９９５、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ、９２：８３８８−９２）と同様であった。種ウイルスをＢＨＫ−２１細胞中で増殖させ、そして使用まで−８０℃で保存した。ＶＳＶ−ＧＦＰおよびｒＶＳＶを、以前に記載されたように調製した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、２００２）。

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