JP2004536607A - 標的化されたヒト癌細胞において選択的に複製するウイルス変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
(発明の分野)
本明細書中に記載される発明は、一般に分子生物学の分野に関し、より特定には、予防適用または治療適用を有するアデノウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
条件付きで複製するウイルスは、有望な新たなクラスの抗癌剤を示す[参考文献1〜5:Martuza,2000;Alemany,2000;Curiel,1997;Kirn,1996;Kirn,2000]。癌細胞中で選択的に複製しそして癌細胞を選択的に殺傷するヒトアデノウイルス5型(Ad5)の誘導体が、開発された。このようなウイルスの表現型ONYX−015は、再発性の頭頚部癌を有する患者および肝代謝疾患を有する患者を用いたいくつかの第1相臨床試験および第2相臨床試験において有望な結果を実証した[参考文献6〜12:Bischoff,1996;Heise,2000;Kirn,2001;Kirn,1998;McCormick,2000;Nemunaitis,2001;Nemunaitis,2000]。
【0003】
進行中の臨床試験から学んだ教訓は、アデノウイルスの毒性よりもその効力がその治療的利点を制限するようであるということである[参考文献7〜9および11〜14:Ganly,2000;Heise,2000;Kirn,1998;Kirn,2001;Nemunaitis,2001;Nemunaitis,2000;Nemunaitis,2001]。現在までに、用量を制限する毒性は、観察されていない。
【0004】
腫瘍崩壊性ウイルスの臨床的効力を増強するための1つのストラテジーは、これらを他の治療(例えば、標準的化学療法)と組合わせること[参考文献7〜8:Kirn,2001;Heise,2000]、またはこれらを抗癌遺伝子(例えば、抗血管形成因子、細胞傷害性因子、プロドラッグ変換酵素、またはサイトカインなど)と組合わせること[参考文献15:Hermiston,2000]である。化学療法および抗癌遺伝子と組合わせられ得る別のアプローチは、ウイルスをより強力にするように遺伝的に変更することである(すなわち、より早く複製する、より多くのウイルス子孫を産生する、そして組織特異性および/または細胞型特異性を増強するなど)。ここでの目標は、癌細胞をより迅速に、選択的に殺傷し、そしてその癌をついには撲滅する治療的ウイルスを作製することである。
【0005】
一般的な2つの遺伝的アプローチが、増強した抗癌特性を有する腫瘍崩壊性ウイルスを開発するためになされた。第1は、標的化された遺伝子操作である。ここで、特定のウイルス遺伝子、または調節エレメント(すなわち、プロモーター)が欠失されているか、または外来遺伝子が挿入されているなどである。このアプローチは、多くの新規ウイルスを構築するために首尾よく利用されてきた(例えば、[参考文献16〜20:Yu,2001;Fueyo,2000;Howe,2000;Maxwell,2001;Samoto,2001])が、その適用は,そのウイルスの生物学の全体的な理解が要求されることによって制限される。最も広範に研究されたウイルスの1つであるAd5の場合でさえ、このような情報は、必ずしも利用可能でも完全でもない。よって、標的化された遺伝子操作は、多くの場合において作製困難である。第2のアプローチは、注意深く制御された条件下での遺伝的選択である。この様式で選択されたウイルスは、その特定の条件下で選択的に増殖する(例えば、[参考文献21〜26:Beck,1995;Berkhout,1993;Berkhout,1999;Domingo,1995;Polyak,1998;Soong,2000]を参照のこと)。本質的には、これは、研究室において注意深く制御された条件下でのみ生じる天然の評価プロセスである。
【0006】
ウイルスが癌を処置するための強力な手段を提供することは、明らかである。よって、選択的に腫瘍性細胞中で複製しそして腫瘍性細胞を殺傷するウイルスは、癌に対する戦いにおける医師の兵器の中で非常に貴重な武器である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0007】
(発明の要旨)
本発明の第1の目的は、有望な抗癌活性を有する遺伝的に変更されたウイルスを記載することである。
【0008】
本発明の第2の目的は、ランダム変異誘発および引き続く癌細胞に対する選択を使用して産生された、有望な抗癌活性を有する遺伝的に変更されたウイルスを記載することであり、ここで、この変異誘発は、癌細胞中で複製しそして癌細胞を殺傷する変異ウイルスの能力を増強するウイルス転写単位中に少なくとも1つの変異を生じる。
【0009】
本発明の第3の目的は、ランダム変異誘発および引き続く癌細胞に対する選択を使用して産生された、有望な抗癌活性を有する遺伝的に変更されたアデノウイルスを記載することであり、ここで、この変異誘発は、癌細胞中で複製しそして癌細胞を殺傷する変異ウイルスの能力を増強するウイルス転写単位中に少なくとも1つの変異を生じる。
【0010】
本発明の第4の目的は、ランダム変異誘発および引き続く癌細胞に対する選択を使用して産生された、有望な抗癌活性を有する遺伝的に変更されたアデノウイルス(好ましくは、Ad5)を記載することであり、ここで、この変異誘発は、ウイルス主要後期転写単位のi−リーダー配列中に少なくとも1つの変異を生じる。
【0011】
本発明の第5の目的は、ウイルス主要後期転写単位のi−リーダー配列中に1つ以上の変異、および必要に応じて、医学的に有益なタンパク質をコードする選択遺伝子のウイルスに対する付加を有する変異誘発したアデノウイルスを使用する、癌を処置するための方法および組成物の記載することである。このような遺伝子としては、好ましくは、ネガティブ選択遺伝子および/またはサイトカインをコードする遺伝子を含む非相同遺伝子が挙げられる。
【0012】
本発明の第6の目的は、ランダム変異誘発および引き続く癌細胞に対する生物選択を使用して産生された、有望な抗癌活性を有する改変されたアデノウイルス、好ましくは、Ad5を記載することであり、ここで、この変異誘発は、ウイルス主要後期転写単位のi−リーダー配列中に少なくとも1つの変異を生じ、そしてこのような変異は、他の腫瘍崩壊性ウイルスに関連する変異と組み合わされる。
【0013】
本発明のこれらの目的および他の目的は、以下の詳細な本明細書中の本発明の種々の局面の記載を読んだ際に当業者に明らかとなる。本発明の前述の局面および他の局面は、図面、発明の詳細な説明および以下に示される実施例により詳細に説明される。
【0014】
(発明の詳細な説明)
本明細書中で言及する特許および特許出願を含む全ての刊行物は、各個々の刊行物が、その全体が参考として援用されると具体的および個々に示されたのと同じ程度に本明細書中に参考として援用される。
【0015】
(定義)
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書中で用いられる術語および以下に記載される実験手順は、当該分野で周知であり、そして通常用いられる。
【0016】
標準技術は、組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物の培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション(lipofection))のために用いられる。一般に、酵素反応および精製工程は、製造業者の仕様書に従って実施される。これらの技術および手順は一般に、本明細書の全体にわたって提供される、当該分野および種々の一般的参考文献における従来法に従って実施される(一般に、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照のこと)。この術語は、本明細書において、ならびに分析化学、有機合成化学、ならびに薬学的処方および薬学的送達における実験手順において、ならびに患者の処置において用いられる。
【0017】
用語「アデノウイルス」は、本明細書中で言及される場合、ヒトから単離された40を超えるアデノウイルスサブタイプ、ならびに他の哺乳動物および鳥類由来の同数のアデノウイルスサブタイプを示す。Strauss,「Adenovirus infections in humans」,The Adenoviruses,Ginsberg編,Plenum Press,New York,NY,451−596頁(1984)を参照のこと。この用語は好ましくは、2つのヒトサブタイプAd2およびAd5に適用される。
【0018】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で言及される場合、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたは改変形態のいずれかの型のヌクレオチドの、少なくとも10塩基長のポリマー形態のヌクレオチドを意味する。この用語は、1本鎖形態のDNAおよび2本鎖形態のDNAを包含する。
【0019】
本明細書で言及される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド結合および天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合によって一緒に連結された、天然に存在するヌクレオチドおよび改変されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、長さが200塩基以下のポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブに関して、通常1本鎖である;しかし、オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築における使用のためには、2本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかであり得る。本明細書中で言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書中で言及される用語「改変されたヌクレオチド」は、当該分野で公知の糖基などが改変されたかまたは置換されたヌクレオチドを包含する。
【0020】
本明細書中で使用する場合、用語「標識」または「標識された」とは、例えば、放射標識アミノ酸の取込み、またはマークされたアビジン(例えば、光学的方法または比色的方法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン)によって検出され得るビオチニル部分の、ポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの取込みを言及する。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、そして用いられ得る。ポリペプチドに関する標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:放射性同位体(例えば、3H、14C、35S、125I、131I)、蛍光標識(例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体)、酵素標識(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ)、化学発光、ビオチニル基、二次レポーター(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメインエピトープタグ)によって認識される所定のポリペプチドエピトープ。
【0021】
本明細書中で言及される用語「配列相同性」は、2つの核酸配列間の塩基の一致の比率または2つのアミノ酸配列間のアミノ酸一致の比率を記載する。配列相同性が百分率(例えば、50%)として表される場合、この百分率は、何らかの他の配列に対して比較される配列の長さ全体にわたる一致の比率を示す。(これらの2つの配列のうちのいずれかにおける)ギャップは、一致が最大にするように許可される;15塩基以下のギャップ長が通常用いられ、6塩基以下が好ましく、2塩基以下がより好ましい。
【0022】
DNA領域は、これらが互いに機能的に関連している場合、作動可能に連結されている。例えば:プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、このプロモーターは、このコード配列に作動可能に連結されている;リボソーム結合部位が翻訳を可能にするように配置されている場合、このリボソーム結合部位はコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたは、連続することを意味し、そしてリーダー配列の場合、連続し、そしてリーディングフレーム内にあることを意味する。
【0023】
本明細書中で言及される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能にそして特異的に結合することを意味する。本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびフラグメントは、非特異的核酸への評価可能な量の検出可能な結合を最少にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を用いて、当該分野で公知のように、そして本明細書中で考察されるように、選択的ハイブリダイゼーション条件を達成し得る。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列相同性は、少なくとも80%、より代表的には好ましくは、少なくとも85%、90%、95%、99%、および100%の漸増する相同性である。
【0024】
2つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的または完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、85%相同性は、これらの2つの配列を最大に一致するように整列した場合、アミノ酸のうちの85%が同一であることを意味する。(一致させられる2つの配列のうちのいずれかにおける)ギャップは、一致を最大にする際に許可される;5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、2つのタンパク質配列(またはこれらに由来する少なくとも30アミノ酸長のポリペプチド配列)は、この用語が本明細書中で用いられる場合、これらが変異データマトリクスおよび6以上のギャップペナルティを用いたプログラムALIGNを用いて、5を超えるアライメントスコア(標準偏差単位において)を有するならば、相同である。Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein Sequence and Structure,1972,第5巻,National Biomedical Research Foundation,101−110頁およびこの巻に対する補遺2,110頁を参照のこと。2つの配列またはそれらの一部は、ALIGNプログラムを用いて最適に整列した場合にそれらのアミノ酸が50%以上の同一性ならば、より好ましくは、相同である。
【0025】
用語「対応する」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てもしくは一部に対して相同である(すなわち、厳密には進化的に関連していないが、同一である)こと、またはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するように本明細書中で用いられる。対照的に、用語「に相補的」は、その相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部に対して相同であることを意味するように本明細書中で用いられる。例示のために、ヌクレオチド配列「TATAC」は、参照配列「TATAC」に対応し、そして参照配列「GTATA」に相補的である。
【0026】
アデノウイルス変異体の構築のための方法は一般に、当該分野で公知である。Mittal,S.K.,Virus Res.,1993,第28巻,67−90頁;およびHermiston,T.ら,Methods in Molecular Medicine:Adenovirus Methods and Protocols,W.S.M.Wold編,Humana Press,1999を参照のこと。さらに、アデノウイルス5ゲノムは、Genbank登録番号M73260として登録されており、そしてこのウイルスは、登録番号VR−5の下でAmerican Type Culture Collection,Rockville,Maryland,U.S.A.から入手可能である。
【0027】
一般に、アデノウイルスベクター構築は、標準技術を用いた、プラスミドカセットにおけるアデノウイルスゲノム(好ましくは、Ad5ゲノム)の所望の領域の最初の欠失または改変を含む。
【0028】
本発明は、癌細胞において親ウイルスよりも有意に良好に複製する、アデノウイルス変異体(好ましくは、Ad5)を提示し、ここで、この変異体のそれらの有益な抗癌活性は、ウイルス転写単位(これは好ましくは、ウイルスの主要後期転写のi−リーダー配列である)における少なくとも1つの変異に由来する。
【0029】
ウイルスを産生するために好ましい方法は、ランダム変異誘発および癌細胞でのその後の継代、または選択による。本発明を実現するために用いられる好ましい材料および方法は以下の通りである:
(細胞およびウイルス)
全てのヒト癌細胞株を、American Type Culture Collection(ATCC)から入手し、そして10%ウシ胎仔血清(FBS)、2mM L−グルタミン、100μg/ml非必須アミノ酸(NEAA)、10U/mlペニシリンおよび10μg/mlストレプトマイシンを補充したDulbecco改変Eagle培地(DMEM)中で単層培養物として増殖させた。一次ヒト正常細胞を、Clonetics,Inc.から入手し、そして製造業者によって推奨された条件下で増殖させた。野生型アデノウイルス5型(Ad5)を、ATCCから入手し、そして293細胞において増殖させた。ONYX−201およびONYX−203、ならびにそれらの誘導体を、最後の増殖工程までHT29細胞中で増殖させ、最後の増殖工程においては、これらを293細胞中で増殖させた。全てのウイルスをCsCl勾配バンド形成法によって精製し、そして293細胞でのプラークアッセイによって力価測定した。いくつかの場合には、プラークアッセイを、HT29細胞および293細胞で実施し、そして両方からの結果は一致した。癌細胞の感染を、2% FBS、2mM L−グルタミン、100μg/ml NEAA、10U/mlペニシリンおよび10μg/mlストレプトマイシンを補充したDMEM中で実施した。正常細胞の感染を、それらの推奨される増殖培地において実施した。
【0030】
(ランダム変異誘発)
亜硝酸を用いたAd5のランダム変異誘発を、以前[参考文献27−30:Fried,1965;Williams,1971;Praszkier,1987;Klessig,1977]に記載された通りに実施した。手短に述べると、野生型Ad5を、1M酢酸緩衝液(pH4.6)中の0.7M NaNO2で処理した。この反応を、4容量の氷冷1M Tris−Cl(pH7.9)の添加によって、種々の時点で終結させた。次いで、このウイルスを、20mM PBS(pH7.2)/10%グリセロールに対して一晩透析し、そして−80℃で保存した。処理したウイルスの感染性を、293細胞でのプラークアッセイによって調べた。
【0031】
(生物選択(Bio−selection))
変異誘発したAd5を、種々のヒト癌を代表する選択されたヒト癌細胞株で繰返し継代した。全ての場合において、感染を、25mlの培養培地(2% FBS)中に約107個の付着細胞を含むT−185組織培養フラスコにおいて実施した。1回目の継代に関して、細胞を、1という感染多重度(MOI)で感染させた。組織培養培地を、可視の細胞変性効果(CPE)の非常に最初の徴候のときに収集した。その後の継代では、以前の継代由来の収集培地1ml、0.1ml、または0.01mlを、摂取物として用いた。接種後3日後〜5日後にCPEを示し始めた培養物を有効とみなし、そして培地をCPEの最初の徴候のときに収集した。このストラテジーによって本発明者らは、過度に多くのウイルス粒子による感染(これは、生物選択の有効性を低減し得る)も過度に少ないウイルスによる感染(これは、ウイルス集団の複雑さを低減した)も回避することが可能になった。継代を、細胞株に依存して、6回〜20回実施した。
【0032】
(細胞溶解アッセイ)
ウイルスの細胞溶解活性を、記載されるとおりのMTTアッセイ[参考文献31:Shen,2001]を用いて調べた。手短に述べると、細胞を、適切な増殖培地中で、1ウェルあたり3,000個の細胞密度で96ウェルプレートに播種した。感染を、種々のウイルスを用いた播種の24時間後に実施した。大部分の場合には、感染を、これらのウイルスの連続3倍希釈物を用いて4連で実施した。30というMOIで開始して1.5×10−3というMOIで終わる、合計10個の希釈物を各ウイルスに関して用いた。初代ヒト細胞を用いたMTTアッセイのうちのいくつか(図6)は、10という出発MOIおよび5×10−4という終点を有した。図3に記載される細胞溶解アッセイを、10、1、0.1および0.01というMOIで三連で行った。感染した細胞を37℃でインキュベートし、そして比色反応を、CellTiter 96(登録商標)Non−Radioactive Cell Proliferation Assay(Promega)を製造業者の指示に従って用いて、示した時点で実施した。偽感染した細胞を、ネガティブコントロールとして用い、そして参照(100%生存)として設定した。
【0033】
(バーストアッセイ)
HT29細胞を、1ウェルあたり4×104個の細胞で24ウェルディッシュに播種した。これらがプレートに付着した後、細胞を、示したMOIにて、Ad5、ONYX−201およびONYX−203で感染させた。90分間のインキュベーション期間の後、付着していないウイルスを除去し、そして細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で1回洗浄した。次いで、感染した細胞を、2mM L−グルタミン、100μg/ml NEAA、10U/mlペニシリン、10μg/mlストレプトマイシンおよび2% FBSを補充したDMEM中で37℃でインキュベートした。感染後の示した時点で、細胞および培養培地を別個に収集した。細胞画分を3回凍結融解して、ウイルス粒子を遊離させ、溶解産物を遠心分離によって透明にした。総ウイルス収量(細胞および培地を合わせて)を、293細胞単層でのプラークアッセイによって決定した。
【0034】
(ウイルスDNA複製)
HT29細胞を、Ad5、ONYX−201およびONYX203に種々のMOIにて感染させた。感染後の示した時間で、細胞および培養培地を収集し、そしてDNAを、QiagenのBoold DNA Extraction Kitを用いて、合わせた細胞および培地画分から抽出した。DNAをHind IIIを用いて完全に消化し、そして消化したDNAを0.8%アガロースゲルで分離した。サザントランスファーの後、DNAブロットを、DIG High Prime DNA標識キット(Roche Biochemicals)を用いて調製したプローブとハイブリダイズした。精製したAd5ゲノムDNAを、プローブ合成についてのテンプレートとして用いた。
【0035】
(ウェスタンブロット分析)
HT29細胞を、偽感染させたかまたはAd5、ONYX−201およびONYX−203で種々のMOIにて感染させた。感染後の示した時間で、細胞を収集し、そしてSDSゲルローディング緩衝液(100mM Tris−Cl[pH6.8]、5mM EDTA、1% SDS、5% β−メルカプトエタノール)中で溶解させた。タンパク質を、4%〜20%タンパク質ゲル(Bio−Rad)での電気泳動によって分画した。電気泳動後、タンパク質を電気泳動によってナイロンメンブレンにトランスファーした。次いで、ブロットを、1%脱脂粉乳および0.1% Tween−20を含有するPBS中に希釈した抗体とともにインキュベートし、そしてECL(Amersham)によって可視化した。抗ElA抗体M73(Calbiochem)を、1:500希釈した;ポリクローナルウサギ抗Ad5(構造タンパク質)抗体を、1:10,000で用いた。
【0036】
(DNA配列決定)
ONYX−201およびONYX−203のゲノムDNAを、CsCl勾配の縞状のウイルス粒子から精製した。簡単には、ウイルス粒子を、10mM Tris−HCl(pH8.0)、5mM EDTA、0.6% SDSおよび1mlあたり1.5mgのプロナーゼ(Sigma)中で37℃でのインキュベーションにより溶解した。溶解した粒子を、フェノール/クロロホルムで2回抽出し、そしてDNAは、エタノールで沈殿した。ONYX−201のゲノムを、Lark Technologies,Inc.,Texasにより配列決定した。ONYX−203のゲノムDNAを、Onyx Pharmaceuticals,Inc.で配列決定した。
【0037】
(組換えウイルスの構築)
Ad5、ONYX−201およびONYX−203のゲノムDNAをCsCl勾配の縞状のウイルス粒子から精製した。ONYX−211およびONYX−212の構築のために、Ad5およびONYX−201由来のゲノムDNAを、両方、Spe I(これは、ウイルスゲノム内で一回だけ切断する)を用いて消化して完了した。消化したDNAを、当量混合し、そしてT4 DNAリガーゼの存在下で、室温で一晩連結した。次いで、この連結混合物を、FuGene試薬(Promega)を使用して293細胞中へトランスフェクトした。このトランスフェクションに由来するプラークを単離し、そしてDNA配列決定によりスクリーニングした。適切なクローンを、更なる回のプラークアッセイにより精製した。ONYX−231〜ONYX−236を、Ad5およびONYX−203由来のDNAを、それぞれ、Pme I、BamH I、またはSpe Iで消化した以外、類似の様式で構築した(図7を参照のこと)。全ての組換えウイルスを、ONYX−201およびONYX−203中の7つの変異部位の周りの領域を配列決定することにより確認した。
【0038】
(好ましい実施形態の説明)
(変異頻度の評価)
生物選択の効率を最大にするために、野生型Ad5を、亜硝酸(NaNO2)(化学変異誘発剤)で処理した。NaNO2での処理は、ウイルスの生存度を劇的に低下させた(図1A)。室温での6分間の処理は、2×103の因子までAd5の生存度を低下させ、このことは、以前の研究と一致した。この処置したウイルス集団(6分間処理)における変異頻度を評価するために、本発明者らは、このウイルス集団により、A549細胞単層上に形成された22個の別個のプラークを採集し、ウイルスDNAを単離し、そしてPCRによりこれらのE1A領域中の340塩基対フラグメントを増幅した。このPCR産物を、DNA配列決定により分析した。分析した22個の別個のウイルス単離物の内、2つが一塩基対変異を有していた。従って、本発明者らは、変異が2.7×10−4の頻度で生じたと評価し、このことは、平均で、各ウイルスゲノム(36キロベースの大きさ)が約10個の単一の点変異を有することを意味する。このことは、本発明者らが分析した2つのウイルスゲノムにおける変異の実際の数(以下を参照のこと)に非常に近似している。
【0039】
(生物選択)
変異したAd5を、独立して、種々のヒト癌を表す多数のヒト癌細胞株において継代した。継代手順は、材料および方法に記載される。重要なことには、組織培養培地を、細胞変性効果(CPE)の非常に初期の徴候で収集し、そして次の継代を接種するために用いた。この手順を、細胞株に依存して、6〜20回実行した。この生物選択プロトコルの有効性を試験するために、以下の実験を行った。2つのウイルス(野生型Ad5およびLGM(E1B−55K遺伝子の代わりに緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を含むAd5の誘導体))を、1:1の比率で混合した。この混合物を、上記のプロトコルを用いてU2OS細胞上で継代した。E1B−55K遺伝子が不完全であるアデノウイルス変異体は、U2OS細胞においてあまり増殖しないことが以前に示されている。各継代の後、培養培地を収集し、そして2つのウイルスの相対的存在比を、サザンブロット分析により試験した。U2OS細胞における3代の継代の後、Ad5は、明らかに、総ウイルスの95%より多くを構成する優性種となった。5代目からの培養培地において検出可能なLGMは存在しなかった。この実験は、本発明者らがこの研究において使用した継代プロトコルの選択能力を実証した。
【0040】
(生物選択ウイルスの特徴付け)
連続継代の過程の間、本発明者らは、ヒト結腸癌細胞株であるHT29において継代され、この細胞株に対するその細胞溶解能力の漸進的改善を示したウイルスプールに注目した。HT29は、通常、10のMOIであっても有意なCPEを示すのに4日より長くかかる、Ad5による感染に対して、非常に回復力に富んだ。従って、本発明者らは、このウイルス集団を、HT29において19代の間継代した後に特徴付けた。このウイルス集団を、「VHT29」という。VHT29を、初めに、9つの細胞株(HT29、293、A549およびH2009(肺癌)、DU145およびPC−3(前立腺)、MB231(***)、Panc−1(膵臓)、およびHlac(頭部および頚部))におけるプラークアッセイにより分析した。野生型Ad5をコントロールとして用いた。本発明者らは、HT29細胞単層上でVHT29により形成されたプラークのサブセット(総プラークの約50%)は、Ad5により形成されたプラーク(2mm未満の直径)と比較して例外的に大きい(7日後に3〜5mmの直径)ことに注目した。興味深いことに、VHT29は、他の細胞株において並外れて大きなプラークを形成しなかった。
【0041】
20個の大きなプラークを、さらなる研究のために単離した。これらのプラークからのウイルスを、HT29細胞中で増殖し、そしてHT29細胞におけるプラークアッセイにより再度試験した。とりわけ、3つのウイルス単離物(ONYX−201、ONYX−202およびONYX−203)は、Ad5と比較した場合、HT29細胞単層上で均一な大きなプラークを生じた(図1B)。ONYX−201およびONYX−203を、さらなる分析のために選択した。これらのウイルスの能力を実証するために、HT29細胞を、10のMOIで、ONYX−201、ONYX−203、およびAd5と感染させた。ONYX−201およびONYX−203に感染した細胞は、Ad5に感染した細胞よりも、かなり速くCPEを示した(図2A)。2つの変異ウイルスの間で、ONYX−201は、細胞溶解においてONYX−203よりも、より強力であった。さらに、本発明者らはまた、ONYX−201およびONYX−203に感染した細胞の形態は、Ad5に感染した細胞とは異なることに注目した。Ad5感染細胞は、互いに付着する傾向があり、アデノウイルス感染に特徴的な、典型的な「ブドウの木(grape vine)」様の形態を表し、一方、ONYX−201およびONYX−203に感染した細胞は、互いに十分に離れており、そして細胞は、滑らかな表面を伴って膨張した。
【0042】
MTTアッセイを用いて、本発明者らは、ONYX−201、ONYX−203、Ad5の細胞溶解活性を比較した。細胞溶解活性の順序は、ONYX−201>ONYX−203>Ad5である(図2B)。この結果を、多数の独立した実験において繰り返した。殆どの場合、ONYX−201は、Ad5よりも、約500〜1000倍高い活性であり、一方、ONYX−203は、Ad5よりも、約30〜50倍高い活性であった。興味深いことに、VHT29(HT29細胞における継代からのウイルスプール)の細胞傷害性は、VHT29が種々の細胞傷害性を有するウイルス個体の混合物であるという事実と一致して、ONYX−201とONYX−203との間にあった(図2B)。
【0043】
細胞溶解におけるこの差異が、ウイルス力価の不正確な評価に起因して起こる見込みがなかったことに注目すべきである。Ad5、ONYX−201、ONYX−203およびVHT29を、全て、HT29細胞および293細胞において力価測定し、そしてこれらの結果は一貫していた。非常に低い0.01のMOIで感染させた細胞を用いるFACS分析および免疫蛍光染色研究において、ウイルス初期タンパク質E1Aについて陽性であった細胞の割合は、Ad5、ONYX−201およびONYX−203について類似していた。このことはまた、これらのウイルスの力価が正確であったことを証明した。これらのウイルスについての、粒子:感染単位(粒子:pfu)の比率は、全て10と50の間であり、有意な差はなかった。
【0044】
(細胞溶解およびウイルス複製の速度論)
次いで、本発明者らは、時間およびMOIの関数としてHT29細胞溶解の進行を試験した。10のMOIで、ONYX−201は、Ad5よりも効率的に細胞を殺傷したONYX−203よりも迅速に細胞を溶解した(図3)。このMOIでの差異は幾分小さかった。しかし、本発明者らがMOIを低下させるにつれて、この差異は、ますます顕著になった。0.1および0.01のMOIで、Ad5に感染した細胞は、この実験の過程の間、CPEの明確な徴候を示さず、そして細胞生存度のみがわずかに低下した。しかし、これらの低いMOIでONYX−201およびONYX−203に感染した細胞は、3日目と4日目の間に明確なCPEを表し、そして細胞生存度は劇的に低下した(図3)。
【0045】
効率的な細胞溶解は、多数の可能な機構(例えば、より高い感染性、より速い複製の速度、1細胞あたりの子孫のより高い収量など)から生じ得る。この機構を調査するために、本発明者らは、ウイルス子孫産生、DNA複製、ならびに初期および後期の遺伝子発現の速度論を、全て、0.01〜10の種々のMOIで試験した。免疫蛍光染色研究は、E1A発現が全ての場合において等しい場合、Ad5、ONYX−201およびONYX−203が感染性に関して差がなかったことを示した。90%を超える細胞が感染されている10のMOIでは、ウイルス子孫の最終収量は、ONYX−201、ONYX−203、およびAd5について類似していた(図4A)。しかし、Ad5は、最大の産生レベルに達するまでかなり長い時間がかかった(5日対3日、図4A)。この結果は、1細胞あたりのウイルス収量は類似するが、産生の速度は、有意に異なっていることを示唆した。実際に、ウイルスDNA複製は、より迅速に生じ(図4B)、そしてウイルス遺伝子産物は、Ad5と比較して、ONYX−201およびONYX−203についてより速く蓄積された(図4C)。これらの観察はまた、本発明者らの仮説と一致した。本発明者らがMOIを低下させた場合、ONYX−201と、ONYX−203と、Ad5との間の子孫産生、DNA複製、およびタンパク質蓄積の差異は、細胞溶解の結果と一致して、より実質的になった。低いMOI(1以下のMOI)で、複数回の感染が起こり、そしてウイルス複製の速度における差異は、各複製サイクルを通して「増幅」されたようである。
【0046】
(他のヒト癌細胞における細胞傷害性)
本発明者らは、ONYX−201およびONYX−203のより高い細胞溶解活性がHT29細胞に対してのみ制限されるか否かを試験するために、多数の他のヒト癌細胞株におけるONYX−201およびONYX−203の細胞傷害性を試験した。12個の癌細胞株(ヒト結腸直腸癌由来の6個(HT29、HCT116、CCL221、RKO、SW480、およびSW620)、ならびに6個の異なる起源の他のヒト腫瘍細胞株(A549(肺)、DU145(前立腺)、MB231(***)、Panc−1(膵臓)、U2OS(骨肉腫)、および293(形質転換されたヒト腎臓細胞))を含む)を、MTTアッセイにおいて試験した。代表的なMTTアッセイからの結果を図5に示した。ONYX−201、ONYX−203およびVHT29は、図2の結果と一致して、HT29細胞におけるAd5よりも、有意に高い細胞溶解活性を表した。有意に、これらのウイルスは、多くの他の癌細胞株におけるAd5よりも実質的に高い細胞溶解活性を示した。例えば、A549細胞およびHCT116細胞において、ONYX−201およびONYX−203は、Ad5よりも細胞殺傷において、有意により強力である一方で、DU145細胞およびPanc−1細胞において、この差異は最低限であった(図5)。試験した全ての細胞株において、ONYX−201は、Ad5よりも、より活性であった。本発明者らは、HT29細胞において選択されたウイルスは、HT29細胞おいて、および多くの他の癌細胞においても、これらのウイルスを、特異的に非常に効率的に複製させることを可能にする、蓄積された変異を有していると結論付ける。
【0047】
(正常細胞における細胞溶解活性)
初代ヒト正常細胞におけるONYX−201およびONYX−203の細胞傷害性を、MTTアッセイにおいて試験した。本発明者らが、今日まで試験した全ての細胞型(SAEC、PrEC、MEC、REC、HuVECおよびMVEC)において、これらが増殖していようと、増殖していなかろうと、ONYX−201およびONYX−203は、Ad5にかなり等しかった。ONYX−201は、通常、Ad5よりも、わずかにより活性であり、一方、ONYX−203は、Ad5よりも、わずかにより弱かった。SAEC、MEC,およびMVECからの代表的な結果を図6に示す。同じ組織、乳癌細胞株MB468、および初代正常乳腺上皮細胞(MEC)からの「一致した」細胞の対を用いて、本発明者らは、各々のウイルスの人工的「治療指数」を評価した。各々のウイルスのMB468およびMECにおける細胞溶解活性を、Ad5に対して正規化し、そして図6Dにおいてプロットした。従って、バーの高さは、Ad5と比較した場合の細胞傷害性を表し;青いバーと紫のバーとの間の差異は、正常細胞における活性で除算した腫瘍細胞における相対活性として規定される治療指数を示す。ONYX−201およびONYX−203は、ONYX−015と同じ、正常に対する腫瘍の特異性を示すが、ONYX−015またはAd5のいずれかよりも、実質的により強力であった。これらのデータは、ONYX−201およびONYX−203がHT29および多くの他の腫瘍細胞を効率的に感染および溶解する能力を蓄積した一方で、初代ヒト正常細胞における細胞溶解活性は、有意に変化しなかったという示唆をもたらす。組合わせにおいて、これらの特徴は、これらの腫瘍溶解剤の腫瘍細胞選択性の増大を提供した。
【0048】
(変異マッピング)
ONYX−201およびONYX−203の分子機構の理解に向かって進み、本発明者らは、これらのゲノム全体を配列決定した。これらの変異は、その可能なコンセンサスとともに、表1に列挙した。ONYX−201およびONYX−203は両方とも、単一点変異を7つ含み、これは、ゲノム1つあたり10個の変異という本発明者らの推測と一致した。4つの変異が、両方のウイルスにより共有された一方で、その変異の残りは、各ウイルスにとって独特であった。
【0049】
どの変異が上記の表現型を担うのかを表すために、本発明者らは、ONYX−201およびONYX−203において同定された種々の変異を保有する、一連の組換えウイルスを構築した。これらの組換えウイルスおよび構築ストラテジーの図示を、図7Aに示す。これらの組換えウイルスの細胞傷害性活性を、HT29細胞に対するMTTアッセイによって比較した。このMTTアッセイからの結果(図7B)は、感染したHT29細胞の形態学的調査と組み合わせて、ヌクレオチド8350での変異(C→T)を含むすべてのウイルスが、スーパー殺傷表現型を提示したことを示した。ONYX−212、ONYX−232、ONYX−234、およびONYX−236はすべて、ONYX−203の活性(感染した細胞の形態を含む)と類似する活性を有した。一方、ONYX−231、ONYX−233およびONYX−235は、野生型Ad5と同じように挙動した。従って、本発明者らは、ヌクレオチド8350でのC→T変異が、ONYX−203の細胞傷害性活性を増加させるために必要かつ十分であると、結論付けた。この変異はまた、ONYX−201の優れた細胞傷害性活性を説明するために必要であった。
【0050】
本発明のウイルスの抗癌活性を説明するために如何なる特定の理論によって拘束されることも意図しないが、本発明者らは、ヌクレオチド8350でのC→T変異が、ONYX−203の細胞傷害性活性を完全に説明し、そしてONYX−201の活性に必要であることに、着目する。この変異は、Ad5の主要後期転写単位のi−リーダー中に位置する[参考文献:32〜36:Falvey,1983;Symington,1986;Virtanen,1982;Lewis,1983;Akusjarvi,1981]。このi−リーダー配列は、L1 mRNA(このL1 mRNAは、52/55Kタンパク質を主にコードする)のサブセットへとスプラインシングされ、そして52/55Kタンパク質の発現を調節し得る[参考文献:36〜39:Soloway,1990;Akusjarvi,1981;Persson,1981;Lucher,1986]。i−リーダー自体は、145アミノ酸のタンパク質であるi−リーダータンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む[参考文献:32〜36:Falvey,1983;Symington,1986;Virtanen,1982;Lewis,1983;Akusjarvi,1981]。アデノウイルス複製における52/55Kタンパク質およびi−リーダータンパク質の正確な役割は、明らかではない。これらは、ウイルスDNA複製の前に発現される主要後期転写単位中にコードされる、無比のタンパク質である[参考文献:33、36、39〜40:Lewis,1985;Akusjarvi,1981;Lucher,1986;Symington,1986]。このことは、これらの2つのタンパク質が、ウイルスDNA複製の開始において重要な役割を有し得ることを示唆する。ヌクレオチド8350におけるC→T変更は、アミノ酸125におけるGlnのコドンを、終止コドンUAGへと変更し、それにより、i−リーダータンパク質の最後の21アミノ酸を除去する。従って、このことは、i−リーダータンパク質および52/55Kタンパク質の発現を変更し、従って、有利な抗癌活性を生成するようにウイルス複製に影響すると、考えられる。
【0051】
本発明のウイルスは、他の腫瘍崩壊ウイルスの遺伝的背景に基づいて、さらに増強された抗癌活性を有するウイルスを生じるように構築され得ることに注目することが重要である。好ましいウイルスは、p53に結合する能力を実質的に欠くアデノウイルス変異体であり、この変異体は、E1B−55Kタンパク質をコードする遺伝子における変異から生じる。そのようなウイルスは、一般的には、E1B−55K領域のうちのいくらかまたはすべてが、欠失されている。米国特許第5,677,178号の発明者であるMcCormickは、とりわけ、ウイルス癌タンパク質(E1B−55Kタンパク質またはE4 orf6)を欠く、アデノウイルス変異体を記載する。また、米国特許第6,080,578号は、とりわけ、p53に結合することを担うE1b−55Kタンパク質の領域において欠失を有する、アデノウイルス変異体を記載する。別の好ましい腫瘍崩壊アデノウイルスは、E1A領域中に変異を有するアデノウイルスであり、米国特許第5,801,029号および同第5,972,706号に記載される。従って、アデノウイルスのE1B−55K領域および/またはE1A領域中での変異は、本発明のアデノウイルスの変異と組み合わされ得、好ましくは、上記のようなi−リーダー配列中に変異を有するアデノウイルスの変異と組合され得る。
【0052】
さらに、本発明のウイルスは、米国特許第5,998,205号中に記載されるような組織特異的プロモーターの制御下にウイルス複製を置くことによって、組織特異性の程度の増加が付与され得る。また、本発明のウイルスの複製は、米国特許出願番号09/714,409に記載されるように、E2F応答性エレメントの制御下に置かれ得る。後者は、E2Fの存在に基づくウイルス複製制御機構を提供し、従って、組織特異的プロモーターにより実現される制御とは異なる。組織特異的プロモーターまたはE2F応答性エレメントの両方が、アデノウイルスの複製に必須であるアデノウイルス遺伝子に、作動可能に連結される。
【0053】
(治療方法)
疾患(好ましくは、癌)の治療が、本発明のアデノウイルスを含み、本発明のウイルスの癌殺傷活性を増強するために、異種遺伝子(例えば、ネガティブ選択遺伝子または他の遺伝子(例えば、サイトカイン))をさらに含む、組成物を患者に投与することによって提供され得る。例としては、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、およびgm−csfが、それぞれ挙げられる。そのような遺伝子は、当該分野で公知であるアデノウイルスの種々の領域(好ましくは、E1領域および/またはE3領域)中に挿入され得る。
【0054】
本発明のウイルスは、癌を処置するために、化学療法またはX線療法と組合され得る。好ましい化学療法剤は、シスプラチンであり、そして好ましい用量は、処置されるべき癌の性質、およびシスプラチンを投与する際に慣用的に考慮される他の因子に基づいて、開業医により選択され得る。好ましくは、シスプラチンは、用量50〜120mg/m2で、3〜6時間にわたって静脈内投与される。より好ましくは、シスプラチンは、用量80mg/m2で、4時間にわたって静脈内投与される。第2の化学療法剤(これは、好ましくは、シスプラチンと組み合わせて投与される)は、5−フルオロウラシルである。好ましい5−フルオロウラシル用量は、連続5日間の間、1日あたり800〜1200mg/m2である。
【0055】
本発明のアデノウイルスを使用するアデノウイルス治療は、他の抗腫瘍性プロトコル(たとえば、遺伝子治療)と組み合わされ得る。米国特許第5,648,478号を参照のこと。上記のように、本発明における使用のためのアデノウイルス構築物は、特異的癌細胞殺傷を示す。そのような構築物はまた、上記のように、プロドラッグアクチベーター(チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼなどを含む)遺伝子を有し得、プロドラッグアクチベーターは、適切なプロドラッグの存在下で、本発明のアデノウイルスベクターの抗腫瘍効果を増強する。米国特許第5,631,236号を参照のこと。
【0056】
また、本発明のアデノウイルス変異体が、宿主動物におけるその効果を削ぐ免疫応答を惹起する場合、そのアデノウイルス変異体は、その効果を最大するために、適切な免疫抑制剤とともに投与され得る。あるいは、より免疫原性が小さいウイルスを生じるようにアデノウイルスの外部タンパク質コートが改変され得る、種々の方法が存在する。PCT/US98/0503を参照のこと。PCT/US98/0503において、アデノウイルスの外部コートであるヘキソンタンパク質の主要免疫原性成分が、より免疫原性が小さくなるように遺伝子操作され得る。これは、通常のウイルスヘキソンタンパク質エピトープを、ヘキソンタンパク質中に通常は見出されないアミノ酸配列で置換することによって、キメラヘキソンタンパク質を作製することによって行われる。そのようなアデノウイルス構築物は、野生型ウイルスよりも免疫原性が小さい。
【0057】
本発明の別の局面は、異種遺伝子を、好ましくは、このウイルスのE1領域および/またはE3領域中に組み込むことである。そのような異種遺伝子はまた生理活性ペプチドをコードするそのフラグメントの例としては、免疫調節タンパク質をコードする遺伝子、および上記のような、プロドラッグアクチベーターをコードする遺伝子(すなわち、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ(米国特許第5,358,866号および同第5,677,178号))が挙げられる。前者の例としては、インターロイキン2(米国特許第4,738,927号または同第5,641,665号;インターロイキン7(米国特許第4,965,195号または同第5,328,988号);およびインターロイキン12(米国特許第5,457,038号);腫瘍壊死因子α(米国特許第4,677,063号または同第5,773,582号);インターフェロンγ(米国特許第4,727,138号または同第4,762,791号);あるいはGM−CSF(米国特許第5,393,870号または同第5,391,485号)が挙げられる。さらなる免疫調節タンパク質としては、さらに、マクロファージ炎症タンパク質(MIP−3を包含する)が挙げられる。単球走化性タンパク質(MCP−3α)もまた、使用され得る。異種遺伝子の好ましい実施形態は、好ましくは癌細胞に対して毒性であるが正常細胞に対しては毒性ではないタンパク質をコードする遺伝子に融合した、細胞膜を通るタンパク質(例えば、VP22またはTAT)をコードする遺伝子からなる、キメラ遺伝子である。
【0058】
本発明のアデノウイルスE1A変異体構築物の効力を増加させるために、本発明のアデノウイルスE1A変異体構築物は、特定の腫瘍細胞型について親和性の増強を示すように改変され得る。例えば、PCT/US98/04964に示されるように、アデノウイルスの外部コート上のタンパク質は、正常細胞よりも高い程度に腫瘍細胞上に存在するレセプターに結合する、化学物質(好ましくはポリペプチド)を提示するように改変され得る。また、米国特許第5,770,442号および同第5,712,136号を参照のこと。そのポリペプチドは、抗体であり得、好ましくは、単鎖抗体である。
【0059】
気管支原生癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、肺腺癌、悪性肝癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、またはリンパ性白血病を有する、ヒト患者もしくは非ヒト哺乳動物が、適切なアデノウイルスの有効抗腫瘍性投与量を投与することによって処置され得る。感染性アデノウイルス粒子の懸濁物が、種々の経路(静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、および局所経路を含む)により腫瘍性組織に適用され得る。1mlあたり約103〜1012個以上のビリオン粒子を含むアデノウイルス懸濁物が、(例えば、気管支原生癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、または喉頭癌を処置するための肺送達のために)ミストとして吸入され得るか、あるいは腫瘍(例えば、気管支原生癌、鼻咽頭癌、咽頭癌、子宮頸部癌)を処置するために腫瘍部位に直接塗布され得るか、あるいは吸入によって(例えば、卵巣癌を処置するために腹腔に、悪性肝癌もしくは他の原発性非肝臓腫瘍からの肝転移を処置するために門脈に)か、または他の適切な経路(腫瘍塊(例えば、胸部腫瘍)への直接注射、浣腸(例えば、結腸癌)、もしくはカテーテル(例えば、膀胱癌)を含む)によって投与され得る。
【0060】
本発明は、ここに十分に記載されており、添付の特許請求の範囲の趣旨からも範囲からも逸脱することなく、本発明に対して多くの変更および改変がなされ得ることは、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【図1】図1Aは、NaNO2での処理によって野生型Ad5が変異されたことを示す。処理されたウイルスの感染性を、293細胞でのプラークアッセイによって試験し、そしてインキュベーション時間の関数としてプロットした。図1Bは、野生型Ad5ウイルスまたは生物選択ウイルスでの感染後5日目のHT29細胞に対するプラークアッセイを示す。図1Cは、Ad5またはONYX−201によってHT29細胞上に形成された例示的プラークの顕微鏡野(40倍)を示す。
【図2】図2Aは、モック感染(Mock)したかまたは野生型Ad5、ONYX−201およびONYX−203で(感染多重度10にて)感染したかのいずれかのHT29細胞の細胞障害効果を示す。写真を、感染3日後に撮影した。図2Bは、MTTアッセイを使用して試験したHT29細胞における細胞障害活性を示す。HT29細胞を、MOI30〜MOI1.5×10−3の範囲の種々のウイルスの3倍段階希釈で感染させた。MTTアッセイを、記載したように感染5日後に行った。
【図3】図3は、HT29細胞障害の動態を示す。HT29細胞を、Ad5、ONYX−201およびONYX−203で種々のMOIにて感染した。感染後種々の時点で、生存細胞のパーセントを、MTTアッセイで評価し、対時間でプロットした。
【図4A】図4Aは、10、1、0.1および0.01のMOIで感染させたHT29細胞を示す。感染後種々の時点で、細胞および培養培地を回収した。ウイルス収率を示す。4×104HT29細胞を感染させた。総ウイルス収率(細胞および培養培地を含む)を、293細胞に対するプラークアッセイによって決定した。
【図4B】図4Bは、10、1、0.1および0.01のMOIで感染させたHT29細胞を示す。感染後種々の時点で、細胞および培養培地を回収した。ウイルスDNA複製を示す。DNAを、Boold DNA Extraction Kit(Qiagen)を使用して抽出し、HindIIIで消化し、そして0.8%アガロースゲルで分離した。サザントランスファーの後に、ブロットを、DIG High Prime DNA標識キット(Roche Biochemicals)を使用して調製したプローブでハイブリダイズした。Ad5ゲノムDNAは、プローブ合成のテンプレートとして働いた。
【図4C】図4Cは、10、1、0.1および0.01のMOIで感染させたHT29細胞を示す。感染後種々の時点で、細胞および培養培地を回収した。ウイルスゲノム発現を示す。細胞抽出物を、感染後種々の日(dpi)において調製し,そしてSDS−PAGEによって分離した。E1Aおよびウイルス後期タンパク質(構造タンパク質)の発現を、ウェスタンブロット分析によって試験した。Mは、モック感染を示す。
【図5】図5は、種々の腫瘍細胞における細胞障害活性を示す。腫瘍細胞を、96ウェルプレートに3000個の細胞/ウェルの密度で播いた。播種の24時間後に、この細胞を、Ad5、ONYX−201、ONYX−203またはHT29細胞において継代したウイルスプール(VHT29)で感染させた。感染を、各ウイルスの、MOI30で開始する3倍段階希釈を使用して行った。
【図6】図6は、正常なヒト初代細胞における細胞障害の活性を示す。細胞を、96ウェルディッシュ中で増殖させ、そしてAd5、ONYX−201およびONYX−203で3倍段階希釈にて感染させた。(A)静止期の哺乳動物上皮細胞MEC。(B)静止期の小気道上皮細胞SAEC。(C)増殖する微小脈管上皮細胞MVEC。同様の実験を、種々の正常なヒト初代細胞(増殖するかまたは増殖しない)において複数回行った。同様の結果を得た。ここで、例示的実験を3つのみ示す。(D)「マッチした」腫瘍細胞および正常細胞における相対的細胞傷害性。初代MECおよび乳癌細胞株MB468で、Ad5、ONYX−201、ONYX−203およびONYX−015を使用してMTTアッセイを行った。IC50値を、50%の細胞殺傷を生じたMOIとして規定した。次いで、これらの値を、以下のようなウイルスの各々に対するAd5の値に関してプロットした:IC50(Ad5)/IC50(試験ウイルス)。よって、正常細胞と腫瘍細胞とにおけるAd5の比活性は、1である。
【図7A】図7Aは、組換えスキームを示す。種々の組換えウイルスを、上記のように構築した。感嘆符は、各組換えウイルス中に存在する変異を示す。PmeI、BamHIおよびSpeIの制限部位を、ウイルスゲノム上に示す。
【図7B】図7Bは、HT29細胞にてMTTアッセイを使用して試験した組換えウイルスの細胞傷害性活性を示す。
Claims (13)
- ウイルス主要後期転写単位のi−リーダー配列中に少なくとも1つの変異を含む、アデノウイルス。
- Ad5である、請求項1に記載のアデノウイルス。
- 前記変異が、8350ヌクレオチドでのCからTへの変異である、請求項2に記載のアデノウイルス。
- Onyx201またはOnyx203からなる群より選択される、請求項3に記載のアデノウイルス。
- 請求項2に記載のアデノウイルスであって、腫瘍抑制タンパク質を機能的に欠く癌細胞における該アデノウイルスの複製を容易にする変異をさらに含む、アデノウイルス。
- 前記腫瘍抑制タンパク質がp53および/またはpRbを含む、請求項5に記載のアデノウイルス。
- 請求項6に記載のアデノウイルスであって、腫瘍抑制タンパク質p53および/またはpRbを機能的に欠く癌細胞における該アデノウイルスの複製を容易にする前記変異が、それぞれ該アデノウイルスのE1B領域および/またはE1A領域中に変異を含む、アデノウイルス。
- 非相同遺伝子をさらに含む、請求項2に記載のアデノウイルス。
- 前記非相同遺伝子が、ネガティブ選択遺伝子またはサイトカインをコードする、請求項8に記載のアデノウイルス。
- 請求項2に記載のアデノウイルスであって、組織特異的プロモーター、または該アデノウイルスの複製に必須であるアデノウイルス配列に作動可能に連結されているE2F応答エレメントをさらに含む、アデノウイルス。
- 癌細胞を殺傷する方法であって、該癌細胞を、ウイルス主要後期転写単位のi−リーダー配列中に少なくとも1つの変異を含むアデノウイルスと、該癌細胞を殺傷するに十分な時間にわたって接触させる工程を包含する、方法。
- 前記変異が、8350ヌクレオチドでのCからTへの変異である、請求項11に記載の方法。
- 前記アデノウイルスが、Onyx201またはOnyx203からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
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