JP2004535358A - Nucleic acid immunity - Google Patents

Abstract

Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド並びにこれらのポリヌクレオチドの組成物および使用方法が提供される。本発明は、少なくとも１つのＴ細胞受容体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドをコートしたコア担体および被験体におけるＴ細胞介在疾患の治療方法を含む。Provided are polynucleotides encoding T cell receptors, and compositions and methods of using these polynucleotides. The invention includes polynucleotides encoding at least one T cell receptor or a fragment thereof, a core carrier coated with these polynucleotides, and methods of treating a T cell mediated disease in a subject.

Description

【０００１】
発明の分野
本発明は、一般には、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含有する組成物、およびそれらの使用方法に関する。特に、本発明は、少なくとも１種類のＴ細胞受容体分子をコードするポリヌクレオチドまたはそれらの断片、そのようなポリヌクレオチドを含有する粒子状医薬組成物、および被験体においてＴ細胞介在疾患を治療する方法であって、本発明の粒子状医薬組成物を投与してそのＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の特定の集団に対する交差反応免疫応答を誘発すること記載の方法に属する。
【０００２】
背景
近年、針およびシリンジを用いる筋肉内注射（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５：１４６８）または皮内注射（Ｒａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３）によるプラスミドＤＮＡの直接注射が報告されている。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ^Ｒと呼ばれる別のアプローチ、すなわち、粒子介在ＤＮＡ送達は、針無しデバイスを用いてＤＮＡ被覆微視的金ビーズを上皮細胞内に直接送達する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：９５６８−９５７２）。このように、核酸被覆微粒子を標的組織内に送達する粒子介在技術を含めて、免疫のために核酸を送達するのに幾つかの送達技術を用いることができる。（例えば、共同所有される、１９９９年２月２日出願の米国特許第５，８６５，７９６号を参照）。粒子介在核酸免疫技術は、ナノグラム量のＤＮＡの上皮送達の後に液性及び細胞性Ｔリンパ球免疫応答の両者を誘発することが示されている。Ｐｅｒｔｍｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１４２７−１４３０。そのような粒子介在送達技術が他のタイプの核酸接種と比較されており、顕著に優れていることが見出されている。Ｆｙｎａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７：７９．８３、Ｆｙｎａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１４７８−１１４８２、およびＲａｚ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３。
【０００３】
無傷の皮膚内に、およびそれを介して、制御された用量の固形薬物含有粒子を送達するのに針なしシリンジの使用を伴う新規経皮注射システムも記載されている。特に、共有のＢｅｌｌｈｏｕｓｅらの米国特許第５，６３０，７９６号は、超音波気流に乗せられた医薬粒子を送達する針なしシリンジを記載する。この針なしシリンジ（別名、「ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ^Ｒ 針なしシリンジ装置」）は、粉末化薬物化合物および組成物の経皮送達、生活細胞内への遺伝物質の送達（例えば、遺伝子治療）並びに皮膚、筋肉、血液またはリンパへの生物薬剤の送達に用いられる。針なしシリンジは、手術と共に、器官表面、固形腫瘍および／または外科的空洞（例えば、腫瘍床または腫瘍切除後の空洞）に薬物および生物薬剤を送達するのにも用いられる。実質的に固形の粒子形態に適切に調製することができる医薬を、そのような装置を用いて、安全かつ容易に送達することができる。
【０００４】
ある針なしシリンジは、一般には、破裂性の膜を有する伸長管状ノズルを含み、この破裂性の膜は最初はノズルを貫通する通路を閉鎖し、かつノズルの上端に実質的に隣接して配置される。送達しようとする治療薬の粒子はこの破裂性の膜に連接して配置され、膜を破裂させるのに十分な気圧を膜の上流側に印加し、かつそれらの下流端から送達するためにノズルを貫通する超音波気流（医薬粒子を含有する）を生成する加圧手段を用いて送達される。このようにして、粒子を針なしシリンジからマッハ１からマッハ８の送達速度で送達することができ、この速度は破裂性の膜の破裂によって容易に得ることができる。
【０００５】
別の針なしシリンジ構成は、一般に、超音波気流に乗せられる医薬粒子を有する代わりに休止「反転」位置（ダイアフラムが医薬粒子を収容するための凹面を下流面に提示する）と活動「外転」位置（ダイアフラムの上流面に印加されている超音波衝撃波の結果としてダイアフラムが下流面上で外に向かって凸である）との間を移動可能である双安定性ダイアフラムがノズルの下流端に設けられていることを除いて、上記と同じ構成要素を含む。このようにして、ダイアフラムの凹面内に収容される医薬粒子がそれらの経皮送達のために標的皮膚または粘膜表面に向けて高速初期速度で装置から放出される。
【０００６】
上記針なしシリンジ構成を用いる経皮注射は、一般に０．１から２５０μｍの範囲のおおよそのサイズを有する粒子を用いて行う。約２５０μｍを上回る粒子をこの装置から送達することもできるが、この上限はそのサイズの粒子が皮膚細胞に厄介な損傷を与える点である。搬送された粒子が貫入する実際の距離は粒子径（例えば、大まかな球状粒子幾何を仮定した名目上の粒子直径）、粒子密度、粒子が皮膚表面に激突する初期速度、並びに皮膚の密度および動力学的粘度に依存する。針なし注射において用いるための標的粒子密度は一般に約０．１から２５ｇ／ｃｍ^３の範囲であり、注入速度は一般に約１５０から３，０００ｍ／秒の範囲である。
【０００７】
発明の要約
本発明は、特定のＴ細胞介在疾患または障害を治療するために脊椎動物被験体の免疫に関連する方法および組成物を提供し、ここで、それらの組成物はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそれらの関連断片をコードするポリヌクレオチドを含有し、そのＴＣＲは自己免疫障害のようなＴ細胞介在障害に優先的に関与する特定のＴ細胞上に見出される（それによって発現される）。
【０００８】
したがって、本発明の主な目的は単離されたポリヌクレオチドを提供することであり、ここで、そのポリヌクレオチドは少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、そのコーティング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されて適切に折り畳まれた（例えば、リフォールドされた）ＴＣＲ分子をもたらすことができるように制御要素に作動可能に連結されている。この単離ポリヌクレオチドは、脊椎動物被験体において天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられる。この医薬は、経皮粒子注入技術を用いて被験体に投与するのに適する粒子状医薬品である。したがって、一態様においては、この医薬はコア担体をポリヌクレオチドでコートすることによって形成される。別の態様においては、この医薬はポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物である。特定の態様においては、このポリヌクレオチドはα鎖およびβ鎖を含有するＴＣＲ分子をコードする。別の態様においては、このポリヌクレオチドはγ鎖およびδ鎖を含有するＴＣＲ分子をコードする。本発明のＴＣＲコーディングポリヌクレオチドは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が、例えば多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡を含む、自己免疫障害に優先的に関与することに基づいて選択される。
【０００９】
ＴＣＲ断片のコーディング配列、例えば、ＴＣＲのＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供することも本発明の主な目的であり、ここで、ＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。この単離ポリヌクレオチドは、脊椎動物被験体において天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられる。この医薬は、経皮粒子注入技術を用いて被験体に投与するのに適する粒子状医薬品である。したがって、一態様においては、この医薬はコア担体をポリヌクレオチドでコートすることによって形成される。別の態様においては、この医薬はポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物である。特定の態様においては、第２ポリペプチドも医薬中に提供され、ここで、この第２医薬は少なくとも１つのさらなるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列、例えば、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ３ペプチドのコーディング配列を含む。好ましくは、ＴＣＲまたはそれらの断片を発現するＴ細胞は自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡）に優先的に関与する。
【００１０】
Ｔ細胞介在疾患または障害を治療するための方法を提供することが本発明のさらなる主な目的である。この方法は、本発明の粒子状医薬のうちの１つを投与し、それによりポリヌクレオチドを被験体のレシピエント細胞において発現させ、相同性ＴＣＲを発現する特定のＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴＣＲ分子またはそれらの断片（例えば、ＣＤＲ２ペプチド）を提供することを伴い、ここで、それらのＴ細胞はＴ細胞障害または疾患に関連する病理に介在する。好ましくは、ＴＣＲまたはそれらの断片は自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡）に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。特定の態様においては、ポリヌクレオチドはα鎖およびβ鎖を含むＴＣＲ分子をコードする。別の態様においては、ポリヌクレオチドはγ鎖およびδ鎖を含むＴＣＲ分子をコードする。加えて、この医薬は１つ以上のさらなるポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、これらのさらなるポリヌクレオチドは完全長ＴＣＲ分子またはそれらの断片（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３ペプチド）をコードすることができる。具体的な態様においては、これらのさらなるポリヌクレオチドをコア担体（例えば、金またはタングステン）にコートし、治療を受ける被験体における皮膚細胞または粘膜細胞にその担体を投与する。
【００１１】
疾患部位で優先的に発現するＴ細胞受容体型のヌクレオチド配列を同定する工程およびここで説明されるポリヌクレオチドに含めるために同定されたヌクレオチドのうちの１つ以上を選択する工程をさらに含む方法を提供することが本発明のさらに別の主な目的である。特定の態様においては、この同定は、疾患部位でＴＣＲにおいて優先的に発現するＣＤＲ２領域のヌクレオチド配列を同定し、ポリヌクレオチドに含めるために同定されたヌクレオチド配列の１つ以上を選択することを含む。
【００１２】
したがって、本発明の１側面においては、コア担体粒子が提供される。このコア担体は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされ、このＴ細胞受容体のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子がもたらされ得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１３】
本発明の関連側面においてはコア担体が提供され、ここで、このコア担体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされ、このＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。
【００１４】
本発明の別の側面においては、固形の粒子状医薬組成物が提供され、ここで、その組成物は少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有し、このＴ細胞受容体のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子がもたらされ得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１５】
本発明の関連側面においては、固形の粒子状医薬組成物が提供され、ここで、この組成物はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有し、このＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列はｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞においてそれが転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである。
【００１６】
本発明のさらに別の側面においては、少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターが天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられ、ここで、この医薬は被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である。このコーディング配列は、それがｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１７】
本発明の関連側面においては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含むベクターが天然形態のＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造において用いられ、ここで、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであり、かつこの医薬は被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である。このコーディング配列は、それがｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する。
【００１８】
本発明のさらに別の側面においては、Ｔ細胞介在疾患を治療するための方法が提供される。この方法は、そのような治療を必要とする脊椎動物被験体に、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、このＴ細胞受容体のコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結するコア担体；または（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、このコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであるコア担体、のいずれかの有効量を投与することを伴う。投与の後、このポリヌクレオチドは被験体の細胞において発現し、Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドをもたらす。
【００１９】
本発明の関連側面においては、Ｔ細胞介在疾患を治療するための別の方法が提供される。この方法は、そのような治療を必要とする脊椎動物被験体に、（ａ）少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物であって、このＴ細胞受容体のコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子をもたらし得るように制御要素に作動可能に連結する医薬組成物；または（ｂ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を有するポリヌクレオチドを含有する固形の粒子状医薬組成物であって、このコーディング配列はそれがｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドをもたらし得るように制御要素に作動可能に連結し、このＣＤＲ２は自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものである医薬組成物、のいずれかの有効量を投与することを伴う。投与の後、このポリヌクレオチドは被験体の細胞において発現し、Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドをもたらす。
【００２０】
本発明のこれらの、および他の目的、側面および態様は、ここに提供される開示に照らして当業者に容易に理解されるであろう。
【００２１】
発明の実施の形態
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定のＴ細胞受容体コーディング配列に限定されるものではないことが理解されるべきである。開示される方法の異なる用途を当該技術分野における特定の需要に対してあつらえることができることも理解されるべきである。ここで用いられる用語が本発明の特定の態様を説明するためだけのものであり、限定されることを意図するものでないことも理解されるべきである。
【００２２】
ここで引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、上述のものであろうと下記のものであろうと、参照することによりそれら全体がここに組み込まれる。
【００２３】
本明細書および添付の請求の範囲において用いられる場合、単数「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈がそれ以外を明瞭に述べていない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「ａ ｃｏｒｅ ｃａｒｒｉｅｒ」への参照は２つ以上のそのような粒子の混合物を含み、「ａ ｐａｒｔｉｃｌｅ」への参照は２つ以上の粒子の混合物を含み、「ａ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｃｅｌｌ」への参照は２つ以上のそのような細胞を含む、などである。
【００２４】
定義
他に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有するものが通常理解するものと同じ意味を有する。以下の用語は以下に示される通りに定義されることが意図されている。
【００２５】
「経皮」送達という用語は、皮内（例えば、真皮または表皮内）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（例えば、「経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」）および経粘膜投与、すなわち、皮膚または粘膜組織内への、またはそれらを経由しての薬剤の通過による送達を意味する。例えば、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ， Ｈａｄｇｒａｆｔ ａｎｄ Ｇｕｙ （ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ． Ｉｎｃ．， （１９８９）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ： Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌｅｅ （ｅｄｓ．）． Ｍａｒｃｅｌ ＤｅＫｋｅｒ Ｉｎｃ．， （１９８７）；およびＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ， Ｖｏｌｓ． １−３， Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ ａｎｄ Ｂｅｒｎｅｒ （ｅｄｓ．）， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， （１９８７）を参照のこと。したがって、この用語は、米国特許第５，６３０，７９６号に記載される粒子送達装置からの送達に加えて米国特許第５，８６５，７９６号に記載される粒子介在送達を包含する。
【００２６】
「コア担体」が意味するところは、粒子介在送達技術、例えば、米国特許第５，１００，７９２号に記載されるものを用いてＤＮＡを送達することができるように、定義された粒子径に加えて細胞膜透過に必要な運動量を達成するのに十分な高さの密度を付与するために核酸（例えば、ＤＮＡ）でコートされた担体粒子である。コア担体は、典型的には、タングステン、金、白金、鉄、ポリスチレンおよびラテックスのような材料を含む。例えば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， （１９９４） Ｙａｎｇ， Ｎ． ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｎｋ．ＮＹ ｐａｇｅｓ １０−１１を参照のこと。
【００２７】
「針なしシリンジ」が意味するところは、皮膚に貫入する通常の針を用いることなく粒子状組成物を経皮的に送達する機器である。本発明で用いる針なしシリンジは本明細書全体を通して考察される。したがって、この用語は粒子送達装置を含む。
【００２８】
「抗原」が意味するところは、宿主の免疫系を刺激して細胞性抗原特異的免疫応答または体液性抗体応答を生じる１つ以上のエピトープを含む分子である。したがって、抗原にはタンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質断片、オリゴ糖、多糖等が含まれる。さらに、この抗原はあらゆる公知のウイルス、細菌、寄生虫、植物、原生動物、または真菌から送達することができ、かつ微生物全体であり得る。この用語は腫瘍抗原も含む。同様に、例えばＤＮＡ免疫用途におけるもののような、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも抗原の定義に含まれる。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成で誘導される抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｅｕｒ． Ｊ， Ｉｎｖｎｕｎｏｌ． ２３：２７７７−２７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７；３２４２−３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ． Ａ． （１９９７） Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７５：４０２−４０８；Ｇａｒｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９８） ｌ２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， Ｇｅｎｅｖａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， Ｊｕｎｅ ２８−Ｊｕｌｙ ３， １９９８）。
【００２９】
「エピトープ」という用語は、一般に、特異的抗原が結合する抗原上の部位を指す。抗体応答を誘発することが可能であるエピトープの同定は、当該技術分野において公知の技術を用いて容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９８４） ８１：３９９８−４００２（ペプチドを迅速に合成して所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定する一般法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、かつ化学的に合成するための手順）；並びにＧｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９８６） ２３：７０９−７１５（所定の抗体に対する高親和性を用いてペプチドを同定するための技術）を参照のこと。Ｔ細胞エピトープは、一般に、Ｔ細胞応答を誘導することが可能なペプチド構造の特徴を有するものである。これに関して、Ｔ細胞エピトープがＭＨＣ分子のペプチド結合性間隙内の伸長立体配座を想定する直鎖ペプチド決定基を含むことが当該技術分野において受けいれられている（Ｕｎａｎｕｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９８７） ２３６：５５１−５５７）。ここで用いられる場合、エピトープは、一般には、約３−５、好ましくは５−１０もしくはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプチドである。
【００３０】
ここで「自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）」という用語と交換可能に用いられる「自己抗原（ｓｅｌｆ ａｎｔｉｇｅｎ）」という用語は、すなわち免疫応答の間に認識され得る分子を意味し、通常はその個体の一部である。これは、通常は個体の環境の一部ではない、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）の、すなわち外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）の抗原とは対称的である。各々の自己免疫障害は自己抗原を指向する免疫応答を特徴とする。通常、自己抗原に対する活発な免疫応答はなく、症状は現れない。自己抗原に対する免疫応答の発生で自己免疫障害が発症し得る。自己免疫障害は、それに対して免疫応答が生じる特定の自己抗原に応じて臨床的に異なる症状を提示する。この免疫応答は結果として自己抗原を含む構造の破壊を生じ、それはその構造の正常な機能の喪失を伴うその構造の喪失であり、これが自己免疫障害の症状を生じる。
【００３１】
「ペプチド」は、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、または他のペプチド模倣体を有する化合物を指すのにその最も広範な意味で用いられる。これらのサブユニットはペプチド結合または他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結することができる。ここで用いられる場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤもしくはＬ光学異性体の両者を含む天然および／または非天然の、または合成のアミノ酸、並びにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体のいずれかを指す。３以上のアミノ酸を有するペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合、通常オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、そのペプチドは、典型的には、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００３２】
「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は交換可能に用いられ、あらゆる長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの重合形態、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドはあらゆる三次元構造を有することができ、既知であろうと未知であろうと、あらゆる機能を発揮し得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。
【００３３】
ポリヌクレオチドは、典型的には、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にはチミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特定の配列で構成される。したがって、ポリヌクレオチド配列という用語はポリヌクレオチド分子の線形表示である。この線形表示を、中央処理ユニットを有するコンピュータ内のデータベースにインプットし、バイオインフォマッティクス用途、例えば、機能的ゲノミクスおよび相同性検索に用いることができる。
【００３４】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移送することが可能なあらゆる部分である（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状担体、およびリポソーム）。「プラスミド」ベクターは、宿主細胞において自己複製が可能である染色体外遺伝要素である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子転移ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指向することが可能であり、かつ遺伝子配列を標的細胞に移送することができるあらゆる核酸構築物を意味する。したがって、この用語にはウイルスベクターの他にクローニングおよび発現ビヒクルが含まれる。
【００３５】
「コーディング配列」、すなわち、選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節要素（または「制御要素」）の制御の下に置かれたとき、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コーディング配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コーディング配列には、これらに限定されるものではないが、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核もしくは真核生物ｍＲＮＡ、ウイルス由来のゲノムＤＮＡまたは原核生物ＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列さえ含まれる。転写終止配列はコーディング配列の３’側に位置することができる。コーディング配列の転写および翻訳は、典型的には、「制御要素」によって調節され、これには、これらに限定されるものではないが、転写プロモーター、転写エンハンサ要素、シャイン・ダルガノ配列、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンの３’側に位置する）、翻訳の開始を最適化するための配列（コーディング配列の５’側に位置する）、並びに翻訳終止配列が含まれる。
【００３６】
「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を指向するヌクレオチド配列である。プロモーターには、誘発性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチド配列の発現はアナライト、補因子、調節タンパク質等によって誘導される）、抑制性プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチド配列の発現はアナライト、補因子、調節タンパク質等によって抑制される）、構成性プロモーター、および選択的プロモーター（このプロモーターに作動可能に連結するポリヌクレオチドの発現は特定の組織型においてのみ生じる）が含まれ得る。「プロモーター」または「制御要素」という用語には全長プロモーター領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳の制御）セグメントが含まれることが意図されている。
【００３７】
「単離ポリヌクレオチド」分子は、自然状態でその分子が見出される生物全体から分離および分別された核酸分子；または自然状態で通常それに伴う配列の全体もしくは一部が欠けている核酸分子；または自然状態で存在するままであるが、それに関して異種の配列（以下に定義される）を有する配列である。配列は、それが源の分子の特定の領域、そのｃＤＮＡ、それらの相体と同じであるかもしくは実質的に同じ塩基対配列を有する場合、または以下に説明されるように配列同一性を示す場合に分子から「誘導」される。
【００３８】
「作動可能に連結する」は、そのように説明される構成要素がそれらの通常の機能を発揮するように構成される要素の配置を指す。したがって、（例えば、目的の抗原をコードする）コーディング配列に作動可能に連結する所定のプロモーターは、適切な酵素が存在するとき、そのコーディング配列の発現を達成することが可能である。プロモーターおよび他の制御要素は、それらがそれらの発現を指向するように機能する限り、コーディング配列に隣接する必要はない。例えば、翻訳されてはいないが転写されている介在配列がプロモーター配列とコーディング配列との間に存在していてもよく、そのプロモーター配列は依然としてコーディング配列に「作動可能に連結する」と考えることができる。
【００３９】
核酸分子を説明するのにここで用いられる「組換え」はゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、これらは、その起源または取り扱いのため、（１）自然状態でそれが会合するポリヌクレオチドの全てもしくは一部とは会合することがなく；および／または（２）自然状態でそれが連結するもの以外のポリヌクレオチドと連結する。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。
【００４０】
核酸およびアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術も当該技術分野において公知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定および／またはそれらによってコードされるアミノ酸配列の決定、並びにこれらの配列と第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列との比較を含む。一般には、「同一性」は、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であろうとアミノ酸配列であろうと、より短い配列の長さで除して１００倍した２つの整列化配列間の正確な一致の数である。核酸配列のおおよその整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９ （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって得られる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．， ５ ｓｕｐｐｌ． ３：３５３−３５８， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４（６）：６７４５−６７６３ （１９８６）によって規準化された採点行列を用いることによってアミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するこのアルゴリズムの例示的実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティ・アプリケーションにおいて提供されている。この方法のデフォルトのパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ （１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）に記載されている。本発明の脈絡において同一性パーセントを確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ． Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｎｅ Ｓ． Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、かつＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって販売されているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。この一組のパッケージから、デフォルトのパラメータを採点表に用いる場合にＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いることができる（例えば、ギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ ｏｐｅｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１２、ギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）１、およびギャップ６）。生成したデータから、「Ｍａｔｃｈ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出するのに適する他のプログラムが当該技術分野において一般に公知であり、例えば、他の整列プログラムはデフォルト・パラメータで用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、以下のデフォルト・パラメータを用いてＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを用いることができる：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＤＲ。これのプログラムの詳細は以下のインターネット・アドレスで見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４１】
あるいは、相同領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、それに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼ（１種類もしくは複数種類）での消化および消化された断片のサイズ決定によって相同性を決定することができる。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、それらの配列が、上記方法を用いる決定で、分子の定義された長さにわたって少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示すとき、互いに「実質的に相同」である。ここで用いられる場合、実質的に相同は指定されたＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をも指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えばそのシステムについて定義される厳密な条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。例えば、厳密なハイブリダイゼーション条件は５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡを含むことができ、かつ洗浄条件は３７℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳとそれに続く６８℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含むことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は当該技術分野の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。
【００４２】
ここで用いられる場合、「アジュバント」という用語は薬物、抗原、ポリヌクレオチド、ベクター等の作用を増強するあらゆる物質を指す。常に明瞭に述べられるものではないが、野生型または精製ペプチドアジュバント（例えば、組換えで産生されたもの、またはそれらの変異体）に類似する生物学的活性を有する分子およびこれらの分子をコードする核酸が本発明の精神および範囲内で用いられることが意図される。
【００４３】
ここで用いられる場合、「治療する」または「治療」という用語には以下のいずれもが含まれる：感染または再感染の予防；症状の低減または除去；および病原体の減少または完全な排除。治療は予防的（感染前）または治療的（感染後）になすことができる。
【００４４】
「脊椎動物被験体」が意味するところは脊索動物亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）のあらゆるメンバー、特には、制限することなく、ヒトおよび他の霊長類を含む哺乳動物である。この用語は特定の年齢を示すことがない。したがって、成体および新生個体の両者がカバーされることが意図される。
【００４５】
発明の一般的な概要
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特定の製剤またはプロセス・パラメータ（これら自体が当然、多種多様なものでありうる）に限定されるものではないことは理解されるべきである。本明細書中で用いられる専門用語は本発明の特定の態様を説明するためだけのものであり、それらに限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
【００４６】
細胞介在免疫応答においては、特定のタンパク質（例えば、抗原）が主要組織適合複合体（「ＭＨＣ」）と会合するときにそれらのタンパク質と結合することが可能であるＴリンパ球（Ｔ細胞）が介在し、典型的には、抗原提示細胞（「ＡＰＣ」、例えば、樹状細胞またはマクロファージ）が介在する。このＡＰＣは抗原をより小さいサイズの断片に消化し、それをＡＰＣのＭＨＣに結合してその表面上に提示する。
【００４７】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴ細胞の表面上に存在する二重鎖タンパク質であり、ＡＰＣによって提示されるペプチド−ＭＨＣ複合体を認識し、かつそれと結合する構造的に可変性の抗原特異的受容体を構成する。２つの公知のタイプのＴＣＲ、すなわちＴＣＲ２（「α」および「β」鎖で構成される）およびＴＣＲ１（「γ」および「δ」鎖で構成される）が存在する。αおよびγ鎖は、各々、可変（「Ｖ」）領域、連結（「Ｊ」）領域および定常（「Ｃ」）領域に分けられる。βおよびδ鎖は、各々、Ｖ、ＪおよびＣ領域を有し、かつＶおよびＪの間に配置される多様性（「Ｄ」）領域も有する。９５％を上回るＴＣＲはαβ鎖二量体であり、これに対して約５％がγδ鎖二量体である。
【００４８】
ＴＣＲは膨大な多様性をもって発現し、各々のＴＣＲは１つもしくは少数のＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的である。ＴＣＲの選択性はＶ、ＤおよびＪ領域の多くの組合せに起因し、これはＶ、ＤおよびＪ領域の遺伝子間の連結部における無作為な超可変性によって増幅される。この多様性のため、様々な数的命名法が生じている。広範に受け入れられているものはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＥＭＢＯ Ｊ． ７（１２）：３７４５−３７５５によって記載されるシステムであり、このシステムでは（本発明において特に対象とする）β鎖のＶ領域のアミノ酸（「ＡＡ」）が、ＡＡ９２位を有するものと指定される保存システインから開始してＮ末端に向けて数的に減じる方向にカウントされる。Ｖαにおける対応する保存システインは、このシステムにおいてはＡＡ９０位を有するものと指定される。ＴＣＲは３つの相補性決定領域：Ｖ領域のＮ末端に向けて位置するＣＤＲ１；Ｖ領域の幾らか中央に位置するＣＤＲ２（一般には、およそアミノ酸３５の保存ＷＹフレームワークから出発してＣ末端に向けて第１２〜第２５もしくは第２６アミノ酸を含む）；およびＶ（Ｄ）Ｊ連結にまたがって位置するＣＤＲ３を有する。
【００４９】
蓄積された証拠も、特定のタンパク質上のエピトープに特異的なＴＣＲが自己免疫障害を引き起こす一因となることを示唆する。例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＢＰ）は多発性硬化症の病因となり得る。動物においては、ＴＣＲα鎖可変遺伝子およびβ鎖可変遺伝子の限られたセットがＢＰに特異的なＴＣＲによって用いられ（例えば、Ａｃｈａ−Ｏｒｂｅａ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｃｅｌｌ ５４：２６３−２７３を参照）、これらの領域またはそれらのＴＣＲ可変領域に共通の配列を有する合成ペプチドに向けられたモノクローナル抗体は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床徴候を示す動物の防御および治療の両者が可能である。
【００５０】
加えて、細胞介在免疫応答を誘導するワクチンが自己免疫障害のようなＴ細胞介在応答に立ち向かう上で重要な戦略を代表する。自己免疫障害を治療する現在のアプローチは、免疫系全体に影響を及ぼし、したがって望ましくない副作用をもたらす治療薬の投与を含む。現行のＴ細胞ワクチン療法は、患者の病的状態の軽減をもたらす上で、限られた有用性が立証されているのみである。幾つかのグループが、（１）組換え法により産生される全Ｔ細胞受容体（例えば、ＷＯ ９９／６０１１９およびＷＯ ９９／６０１２０を参照）；（２）ＴＣＲのペプチド断片、特には、ＴＣＲの第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）を含む断片（例えば、両者ともＶａｎｄｅｒｂａｒｋの米国特許第５，６１４，１９２号および第５，７７６，４５９号を参照）；または（３）ＴＣＲの可変領域をコードする構築物のＤＮＡ−心臓毒注射（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎらの米国特許第５，９３９，４００号を参照）のいずれかを用いてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ワクチンを開発しようと試みてきた。これらの方法は一貫した免疫応答を示していない。
【００５１】
本発明は、Ｔ細胞受容体またはそれらの断片をコードするポリヌクレオチド；これらのポリヌクレオチドでコートしたコア担体；これらのポリヌクレオチドで作製した粒子状組成物；およびこれらのポリヌクレオチドを含む医薬組成物を、例えば核酸（例えば、ＤＮＡ）ワクチンとして用いるＴ細胞介在疾患の治療方法を、提供する。これらのポリヌクレオチドによってコードされるＴＣＲは、好ましくは、１つ以上の自己免疫障害に関連する特異的ＴＣＲである。
【００５２】
したがって、本発明は、特定の自己免疫障害、例えば、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、狼瘡等の効率的な治療方法であって、疾患病変部に多数存在しているか、またはそこで過剰発現されるＴ細胞（例えば、特異的なＶ−ベータ受容体型）に対する抑制性免疫応答（例えば、液性および／または細胞性）を誘導することによる方法を含む。これらの過剰発現したＴＣＲをまず同定し、これらの特異的ＴＣＲの全体またはそれらの可変領域をコードするポリヌクレオチドを次に構築する。さらに、公知のＴＣＲワクチンとは異なり、本発明のポリヌクレオチドはＴ細胞受容体全体をコードすることができ、これらのポリヌクレオチドによってコードされるＴ細胞受容体の構成鎖は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏでそれらの二量体配列にリフォールドされる。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、トランスフェクションにより、またはそれらのポリヌクレオチドを粒子上にコートしてそのコートされた粒子を細胞に投与することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで、細胞に導入することができる。あるいは、下記および国際公開ＷＯ ９８／１０７５０（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の開示においてより詳細に考察されるように、本発明のポリヌクレオチドは粒子状（例えば、粉末）形態で提供することができる。
【００５４】
本発明の利点には、以下に限定されるものではないが、（ｉ）疾患部位、またはその近傍での免疫原性ＴＣＲのｉｎ ｖｉｖｏ産生；（ｉｉ）生体外で正確に折り畳まれたＴ細胞受容体を大量に産生する必要性の排除；（ｉｉ）より小さいタンパク質よりも免疫原性であるより大きなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することによる免疫原性の増加；（ｉｉｉ）細胞介在免疫応答の一貫性の改善；（ｉｖ）Ｔ細胞受容体介在疾患、例えば、自己免疫障害に通常関与する経路の誘発および（ｖ）過剰発現したＴ細胞型に対するワクチン接種によるＴ細胞介在疾患の治療が含まれる。
【００５５】
Ｔ 細胞受容体介在疾患
本明細書中に記載される組成物および方法は広く様々なＴ細胞受容体介在疾患、例えば、自己免疫障害の治療において有用である。自己免疫障害は、罹患個体において生来見出される自己抗原上のエピトープに対する細胞傷害性免疫応答を特徴とする。その個体の免疫系は、それら特定の自己抗原を提示する細胞および組織に向けられた炎症カスケードを活性化する。個体自身の免疫系によって攻撃された抗原、組織、細胞型、または器官の破壊が、疾患の症状を生じる。
【００５６】
臨床的に重要な自己免疫障害には、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、若年型糖尿病、全身性エリテマトーデス、自己免疫ブドウ膜網膜炎、自己免疫血管炎、水疱性類天疱瘡、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎、すなわち橋本病、シェーグレン症候群、肉芽腫性***、自己免疫卵巣炎、クローン病、サルコイドーシス、リウマチ性心臓炎、強直性脊椎炎、グレーブズ病、および自己免疫血小板減少性紫斑症が含まれる。例えば、Ｐａｕｌ， Ｗ．Ｅ． （１９９３） 「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」， 第３版， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第３０章， ｐｐ． １０３３−１０９７；およびＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９４） 「自己免疫障害モデル（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ）」， Ａ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９４を参照のこと。
【００５７】
自己免疫障害は、典型的には、特異的ＴＣＲの存在量の増加に関連する。したがって、治療しようとする病的状態が、本明細書中で説明される組成物および方法において用いられるＴＣＲ配列の選択を決定する。炎症性疾患に関連するＴＣＲの同定は、そのような特定のＴＣＲを有するＴ細胞の前炎症性応答を阻害する治療の利用を可能にする。あらゆる所定の自己免疫障害において優先的に発現する他の特異的ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ全体またはＣＤＲ２領域のような可変領域）の同定は、当該技術分野において公知の方法を用いて、例えば、配列分析または一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）によって実施できることがここでの教示から明らかである。（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：１２１９；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ （１９９６） Ｈｕｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４８：２３を参照）。ＴＣＲを同定する他の方法には、試験抗原に応答するＴ細胞の可変領域高次構造を決定するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原ベースのアッセイが含まれる。これらのアッセイでは、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗原全体または選択された免疫優性ペプチドを利用することができる。
【００５８】
個別の疾患に応じて、様々な組織を関連ＴＣＲの同定に使用できることも本明細書中の教示から明らかであろう。ＭＳのような神経性疾患については、脳プラークまたは脳脊髄液をＴ細胞の供給源として用いることができる。同様に、重症筋無力症については、筋肉、胸腺組織またはアセチルコリン受容体に対して応答性のＴ細胞を用いることができる。関節リウマチについては、滑液を用いることができる。
【００５９】
さらに、自己免疫障害において過剰発現する多くの特異的ＴＣＲが従来同定されてきている。例えば、関節リウマチに罹患した被験体においては、ヒト熱ショックタンパク質６０および／またはＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）に特異的なＴＣＲが過剰発現するようである。関節リウマチは、複数の系に影響を及ぼすが主として複数の関節に影響を及ぼす炎症性自己免疫障害である。この疾患には、滑膜および他の関節構造の炎症、筋萎縮、骨の侵食および粗化、並びに関節表面上でのパンヌス（血管結合組織炎症性膜）の形成が伴う。関節リウマチは、一般には、非常に痛みを伴い、しばしば、重度に衰弱させるものである。
【００６０】
同様に、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）に対して応答性のＴ細胞が、多発性硬化症の患者の脳脊髄液および血液において見出されている。ＭＳは慢性中枢神経系疾患であり、脳および脊髄の最も一般的な脱髄性障害である。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， 「脱髄性疾患の免疫学的態様（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｄｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」 Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０：１５３−１８７ （１９９２）を参照のこと。多発性硬化症の患者から得たＴ細胞株は、残基８４〜１０６にあるＨＬＡ−ＤＲ２拘束性エピトープを認識する（Ｏｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：１８３−１８７ （１９８９））。加えて、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１９ （１９９１）は、多発性硬化症Ｔ細胞によって認識される残基８７〜１０６にあるエピトープを同定した。
【００６１】
糖尿病患者においても特定のＴ細胞受容体が過剰発現するようである。糖尿病患者由来のＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖は、３８ｋＤベータ細胞顆粒タンパク質によって刺激されるようである（Ｒｏｅｐ ｅｔ ａｌ． （ｌ９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４５：６３２−６３４）。さらに、糖尿病患者におけるＴ細胞がインシュリンを自己抗原として認識し得ることの幾つかの証拠が存在する。（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ． （２０００） Ｍａｒ；４７（３）：１５１−６８）。
【００６２】
このように、特定の疾患においては１種類以上の特異的ＴＣＲがより多数存在しているようである。これらのＴＣＲの同定は抗ＴＣＲ核酸（例えば、ＤＮＡ）ワクチンの設計および多様なＴ細胞介在疾患の治療方法を可能にする。
【００６３】
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは全ＴＣＲ分子またはそれらの断片、特には、可変領域の断片のコーディング配列を含む。好ましくは、この配列は、投与によって天然ＴＣＲを提示する（コードする）Ｔ細胞に対する抑制性の交差反応性免疫応答を誘導するのに十分なものである。これらのポリヌクレオチドは１種類以上のＴＣＲ分子またはそれらの断片を含むように製剤化することができる。したがって本発明のポリヌクレオチドは、幾つかの場合においては、各々が同じエピトープを認識するか、異なるエピトープを認識するか、または異なるエピトープ−ＭＨＣの組合せを認識するような複数のＴＣＲコーディング配列を含むことが望ましいであろう。
【００６４】
本発明において用いるために選択されるヌクレオチド配列は、公知の供給源から、例えば、所望の遺伝子またはヌクレオチド配列を含む細胞から標準技術を用いてそれを単離することによって得ることができる。同様に、ヌクレオチド配列は、当該技術分野において周知である標準的なポリヌクレオチド合成法を用いて合成により生成することができる。例えば、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６−７６２；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３．：１２９９−１３０１；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：６３１１−６３１７を参照のこと。一般には、合成オリゴヌクレオチドは、前出のＥｄｇｅらおよびＤｕｃｋｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：１６９１−１７０６によって記載されるホスホトリエステル法、またはＢｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔｓ． ２２：１８５９、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０３：３１８５によって記載されるホスホロアミダイト法のいずれかによって製造することができる。合成オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて製造することもできる。したがって、ヌクレオチド配列は特定のアミノ酸配列に適切なコドンを有するように設計することができる。一般には、目的とする宿主における発現に好ましいコドンを選択する。標準法によって製造した重複オリゴヌクレオチドから完全な配列を構築し、完全なコーディング配列に組み上げる。例えば、Ｅｄｇｅら（前出）；Ｎａｍｂａｉｒら（前出）およびＪａｙら（前出）を参照のこと。
【００６５】
本明細書で用いる核酸配列を得るための別の方法は組換え手段によるものである。すなわち所望のヌクレオチド配列を、それを担持するプラスミドから標準的な制限酵素および手順を用いて切り出すことができる。部位特異的ＤＮＡ開裂は、適切な制限酵素を用いて、当該技術分野において一般に理解されそのうちの特定のものが商業的に入手可能な制限酵素の製造者によって指定される条件下で処理することによって、実施する。所望であれば、標準技術を用いるポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって、開裂した断片のサイズ分離を行うことができる。
【００６６】
制限開裂断片は、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）大断片で標準技術を用いて処理することによって平滑化することができる。このＫｌｅｎｏｗ断片は、例え４種類のｄＮＴＰが存在するとしても、５’一本鎖オーバーハングを充填する一方で突出３’一本鎖を消化する。所望であれば、そのオーバーハングの性質によって決定付けられる制限内で１種類もしくは数種類の選択されたｄＮＴＰのみを供給することにより、選択的修復を行うことができる。Ｋｌｅｎｏｗ処理の後、その混合物を、例えばフェノール／クロロホルムで、抽出し、エタノール沈殿させることができる。適切な条件下でのＳ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１での処理はあらゆる一本鎖部分の加水分解を生じる。
【００６７】
特異的核酸分子を単離するためのさらに別の都合の良い方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるものである。Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５５：３３５−３５０。この技術は、ＤＮＡの所望の領域を複製するのにＤＮＡポリメラーゼ、通常は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いる。複製しようとするＤＮＡの領域を、所望のＤＮＡの反対の末端および反対の鎖に相補的な指定配列のオリゴヌクレオチドによって特定し、複製反応を開始させる。この第１回の複製産物はそれ自体が次の複製のテンプレートであり、したがって、繰り返される連続した複製サイクルが、用いられるプライマー対によって範囲が定められるＤＮＡ断片の幾何学的増幅を生じる。また、この方法により、ＤＮＡ産物の末端へのヌクレオチド配列の手軽な付加が、オリゴヌクレオチドプライマーにそれらの追加配列を組み込むことによって可能になる（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ） Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， ＮＹ （１９９４）を参照）。各々の増幅反応に用いられるＰＣＲ条件は経験的に決定される。幾つかのパラメータが反応の成功を左右する。それらとしては、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ^{２ ＋}およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、並びにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度が挙げられる。適切なＰＣＲ条件の一例は以下の実施例中に見出される。
【００６８】
自己免疫障害のような障害または疾患状態に関連する特異的ＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチド配列、およびそれらの分子またはペプチドをコードする核酸配列は、そのいくつもが当該技術分野において公知である。特に、適切な複数のそのようなペプチドおよび核酸配列がＨｏｗｅｌｌらの米国特許第６，２０７，６４５号に開示されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。これらの、および他の公知の、または容易に同定される配列を用いて、本発明の実施において用いられるＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドのコーディング配列を作製または抽出することができる。加えて、幾つかの場合においては、コードされたＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドの配列を変化させることが、その発現産物の免疫原性を高めるために有用であり得る。このために、異なるが実質的に相同の発現産物（タンパク質またはペプチド分子）が産生されるように、マイナーな変化を被験分子のコーディング配列に施すことができる。したがって、本発明は、天然ＴＣＲ配列に実質的に相同であるＴＣＲ分子またはＴＣＲ断片ペプチドのコーディング配列を含有するポリヌクレオチド、例えば、対象となる分子の全長にわたって標的とする天然ＴＣＲ分子に対する少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５〜９８％の配列同一性を有する分子をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６９】
したがって、ひとたび所望のＴＣＲ分子および／またはＴＣＲペプチド断片のコーディング配列が調製または単離されると、そのような配列をあらゆる適切なベクターまたはレプリコンにクローン化することができる。多くのクローニングベクターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は好みの問題である。他の配列へのライゲーションは当該技術分野において公知の標準手順を用いて行う。
【００７０】
以下に詳細に説明されるように、選択されたヌクレオチド配列をプロモーターのような調節配列の制御下に置き、それにより、所望のタンパク質をコードする配列を、この発現構築物を含むベクターで形質転換した宿主組織においてＲＮＡに転写させることができる。
【００７１】
プロモーターに加えて、送達されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質配列の発現の調節を可能にする他の調節配列を付加することが望ましい場合がある。適切なさらなる調節配列は当業者に公知であり、その例には調節化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答してコーディング配列の発現をオンまたはオフにするものが含まれる。他のタイプの調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター中に存在していてもよい。
【００７２】
発現ベクターを構築し、特定のコーディング配列を、適切な調節配列を有するベクター中に、制御配列に対するそのコーディング配列の位置および方向がその制御配列の「制御」の下で転写される（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼが制御配列にてＤＮＡ分子に結合し、コーディング配列を転写する）ように配置する。目的とする特定のタンパク質をコードする配列の改変がこの目的を達成するのに望ましいことがあり得る。例えば、幾つかの場合においては、制御配列に適切な方向で結合させ、すなわち読み取り枠が維持されるようにするために、配列を改変することが必要となる場合がある。ベクターに挿入する前に、制御配列および他の調節配列をコーディング配列にライゲートしてもよい。あるいは、制御配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクターにコーディング配列を直接クローン化することができる。
【００７３】
一般には、当該方法において用いられる核酸分子は、コーディング領域を適切な制御配列および、任意に、サイトカインまたは他の免疫増強ポリペプチドをコードする補助的ヌクレオチド配列と共に含む。この核酸分子は、一般には、レシピエント細胞における転写および翻訳を指令するのに必要な要素を含むベクターの形態で調製する。
【００７４】
ポリヌクレオチドの投与
本明細書で説明されるポリヌクレオチドおよび補助物質はあらゆる適切な方法によって投与することができる。以下に説明される好ましい態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、それらをコア担体粒子上にコートした後、そのコートされた粒子を被験体または細胞に投与することによって投与する。しかしながら、ウイルスベクターを用いて、または非ウイルス系、例えば、ネイキッド核酸送達を用いて、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを送達することもできる。
【００７５】
ウイルスベクター
幾つかのウイルスベースの系が遺伝子送達に用いられてきた。例えば、レトロウイルス系が公知であり、ウイルスの遺伝子の全てを発現するがｐｓｉ配列として知られるパッケージングシグナルの欠損のためにそれ自体のゲノムをパッケージングできない組み込まれた欠損プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッケージング株が一般に用いられる。したがって、この細胞株は空のウイルス殻を産生する。ヘルパーに加えて、末端反復配列（ＬＴＲ）として知られるウイルスの複製およびパッケージングのためにシス位で必要とする配列を含有するウイルスベクターを含むパッケージング株から産生株を誘導することができる。目的とする遺伝子をこのベクターに挿入し、レトロウイルスヘルパーによって合成されるウイルス殻にパッケージングすることができる。次に、この組換えウイルスを単離し、被験体に送達する（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照）。代表的なレトロウイルスベクターとしては、以下に限定されるものではないが、例えば米国特許第５，２１９，７４０号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ２ベクターのようなベクターの他に、ここで説明される改変Ｎ２ベクターのようなこれらのベクターの誘導体が含まれる。レトロウイルスベクターは当該技術分野において周知の技術を用いて構築することができる。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （１９８３） Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９を参照のこと。
【００７６】
アデノウイルスベースの系が遺伝子送達用に開発されており、これらはここで説明されるＴＣＲポリヌクレオチドの送達に適する。ヒトアデノウイルスは、受容体媒介型エンドサイトーシスによって細胞に侵入する二重鎖ＤＮＡウイルスである。これらのウイルスは、それらは増殖および操作が容易であり、かつｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで広範な宿主範囲を示すため、遺伝子導入に特に適する。例えば、アデノウイルスは造血、リンパ系および骨髄起源のヒト細胞に感染することができる。さらに、アデノウイルスは複製中の標的細胞に加えて静止期細胞にも感染する。宿主ゲノム内に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に存在し続け、したがって、挿入性突然変異誘発に伴う危険性が最小化される。このウイルスは高力価で容易に産生され、かつ安定であることから精製および保存が可能である。複製能を有する形態においてさえ、アデノウイルスは低レベルの罹患率のみを生じ、ヒト悪性腫瘍を伴うことがない。したがって、これらの利点を利用するアデノウイルスベクターが開発されている。アデノウイルスベクターおよびそれらの使用の説明については、例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ （１９８６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ， ６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ， Ｋ．Ｌ． （１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９；Ｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６を参照のこと。
【００７７】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）も本明細書で説明されるポリヌクレオチドの投与に用いることができる。ＡＡＶベクターは、限定するものではないがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７等を含むあらゆるＡＡＶ血清型から誘導することができる。ＡＡＶベクターは、全体的または部分的に欠損した１つ以上のＡＡＶ野生型遺伝子、好ましくはｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を有しているが、１つ以上の機能的フランキング逆末端反復（ＩＴＲ）配列を保持するものであってよい。機能的ＩＴＲ配列は、一般には、ＡＡＶビリオンの救済、複製およびパッケージングに必要であると考えられている。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製およびパッケージングのためにシス位でそれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含む。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が機能的救済、複製およびパッケージングをもたらす限り、ＩＴＲは例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、変更されていてもよい。
【００７８】
ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を用いて、転写の方向に作動的に連結した構成成分として、転写開始領域、目的とするＤＮＡおよび転写終結領域を含む制御要素を少なくとも提供するように構築される。これらの制御要素は哺乳動物細胞において機能的であるように選択される。その結果得られる、作動的に連結した構成要素を含む構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列（５’および３’で）結合されている。適切なＡＡＶ構築物は当該技術分野において周知の技術を用いて設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および第５，１３９，９４１号；国際公報ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ， Ｂ．Ｊ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ． （１９９２） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ， Ｒ．Ｍ． （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ （１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５−１６９；およびＺｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【００７９】
アジュバント
幾つかの態様においては、本発明はあらゆる適切なアジュバントまたはアジュバントの組合せと共に有効に用いられる。例えば、適切なアジュバントには、限定されるものではないが、アルミニウム塩（ミョウバン）から形成されるアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等；水中油型および油中水型エマルジョン製剤、例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；細菌細胞壁成分から形成されるアジュバント、例えば、リポ多糖を含有するアジュバント（例えば、リピドＡまたはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ２６：ｌ５４５−ｌ５４８）；トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）；熱ショックタンパク質またはそれらの誘導体；ジフテリア毒素（ＤＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌熱不安定性毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素Ａ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ｓ、バチルス・セレウス（Ｂ． ｃｅｒｅｕｓ）細胞外酵素、バチルス・スフェリクス（Ｂ． ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）毒素、クロストリディウム・ボツリナム（Ｃ． ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｃ２およびＣ３毒素、クロストリディウム・リモサム（Ｃ． ｌｉｍｏｓｕｍ）細胞外酵素に加えて、クロストリディウム・パーフリンゲンズ（Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリディウム・スピリフォルマ（Ｃ． ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａ）およびクリストリディウム・ディフィシル（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からの毒素、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＥＤＩＮ、ＣＲＭ_１９７のようなＡＤＰリボシル化細菌毒素変異体、非毒性ジフテリア毒素変異体を含むＡＤＰリボシル化細菌毒素（例えば、Ｂｉｘｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：１７５；およびＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｖａｃｃｉｎｅを参照）；サポニンアジュバント、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ（米国特許第５，０５７，５４０号）、またはサポニンから生成される粒子、例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）；ケモカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２等）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、デフェンシン１または２；ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、およびＭＩＰ−２等；ムラミルペプチド、例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＩＰ−ＰＥ）等；ＣｐＧファミリーの分子、ＣｐＧジヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチドから誘導されるアジュバント（例えば、Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９５） ３７４：５４６、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：４−９、およびＤａｖｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｎｍｕｎｏｌ． （１９９８） １６０：８７０−８７６を参照）、例えば、ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（配列番号１）およびＡＴＣ ＧＡＣ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＣＧ ＴＴＣ ＴＣ（配列番号２）；並びに合成アジュバント、例えば、ＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン）（Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅｓ （１９９８） １６：９２−９８）が含まれる。このようなアジュバントは幾つかの販売業者、例えば、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒａｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ；ＧＩＢＣＯ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯから商業的に入手可能である。
【００８０】
アジュバントは個別に送達してもよく、または２種類以上のアジュバントの組合せで送達してもよい。これに関して、組み合わせたアジュバントは免疫応答の促進において相加的または相乗的な効果を有する。相乗効果は、２種類以上のアジュバントを組み合わせることによって達成される結果が個別に投与したときに各アジュバントにより達成される結果を単に加えることで予想されるものよりも大きいことである。
【００８１】
通常の医薬調製品
アジュバント成分の添加の有無にかかわらず、本発明のポリヌクレオチドを含有する調製品の製剤化は標準的な医薬製剤化学および方法論（それらは全て当業者が容易に利用可能なものである）を用いて行うことができる。例えば、１種類以上の核酸分子（例えば、ＴＣＲコーディング配列を含むプラスミド）を含む組成物を１種類以上の薬学的に許容し得る賦形剤またはビヒクルと組み合わせて液体調製品を得ることができる。
【００８２】
補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化物質等が賦形剤またはビヒクル中に存在していてもよい。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般には、その組成物を与えられる個体において免疫応答を誘導せず、かつ過度の毒性なしに投与することができる製薬用物質である。薬学的に許容し得る賦形剤には、以下に限定されるものではないが、例えば、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノール等の液体が含まれる。薬学的に許容し得る塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等のような無機酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等のような有機酸塩が含まれていてもよい。必須ではないが、特にペプチド、タンパク質等の分子をワクチン組成物に含めようとする場合に、それらに対する安定化剤として機能する薬学的に許容し得る賦形剤を調製品が含むことも好ましい。ペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例には、限定されることなく、医薬品等級のデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が含まれる。他の適切な担体には、これも限定されることなく、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組み合わせが含まれる。薬学的に許容し得る賦形剤、ビヒクルおよび補助物質の詳細な考察はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）にみられる。
【００８３】
核酸の取込みおよび／または発現を促進する特定の物質（「トランスフェクション促進剤」）、例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロースのような促進物質、並びに核酸分子の送達に慣用されるリポソームまたは脂質調製物のようなトランスフェクション促進ビヒクルを、組成物に含めることもできる。アニオン性および中性リポソームが核酸分子の送達に広く利用可能であり、かつ公知である（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， （１９９０） ＲＰＣ Ｎｅｗ Ｅｄ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照）。カチオン性脂質調製物も核酸分子の送達に用いるための周知のビヒクルである。適切な脂質調製物には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭの商品名で入手可能なＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、およびＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）が含まれる。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ， ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６；Ｍａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１；米国特許第５，２８３，１８５号および第５，５２７，９２８号、並びに国際公報ＷＯ ９０／１１０９２、ＷＯ ９１／１５５０１およびＷＯ ９５／２６３５６を参照のこと。これらのカチオン性脂質は、中性脂質、例えば、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と共に用いることが好ましい。上記脂質またはリポソーム調製品に加えることができるさらなるトランスフェクション促進組成物には、スペルミン誘導体（例えば、国際公報ＷＯ ９３／１８７５９を参照）並びに膜透過性化合物、例えば、ＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよびカチオン性胆汁酸塩（例えば、国際公報ＷＯ ９３／１９７６８を参照）が含まれる。
【００８４】
あるいは、本発明の核酸分子を粒子状担体に封入し、それに吸着させ、またはそれと結合させることができる。適切な粒子状担体には、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるものの他に、ポリラクチドおよびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から誘導されるＰＬＧ微粒子が含まれる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １０：３６２−３６８を参照のこと。他の粒子系およびポリマー、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマーに加えてこれらの分子のコンジュゲートを用いることもできる。
【００８５】
したがって、製剤化されたワクチン組成物は、典型的には、目的のＴＣＲ分子をコードする配列を含有するポリヌクレオチドを、免疫学的応答を高めるのに十分な量で含む。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。そのような量は慣用される試験によって決定することができる比較的広範な範囲内にある。例えば、１μｇという少なさのＤＮＡを用いて免疫応答が得られているが、他の投与においては最大２ｍｇのＤＮＡが用いられている。ゲノム断片を含有するポリヌクレオチドの有効用量は約１０μｇ〜１０００μｇの範囲内にあると一般に考えられるが、この範囲を上回る用量および下回る用量も有効であることが見出される場合がある。このように、これらの組成物は約０．１％〜約９９．９％のポリヌクレオチド分子を含み得る。
【００８６】
通常の医薬調製物の投与
上記医薬調製物の投与は、治療の過程を通して継続的に、または断続的に、１用量で達成することができる。送達は、最も典型的には、液体組成物および粒子状組成物を含有する液体懸濁液用の通常の針およびシリンジによるものであろう。加えて、様々な液体ジェット・インジェクタが当該技術分野において公知であり、本発明の組成物の投与に用いることができる。最も有効な投与の手段および投与量を決定する方法は当業者に公知であり、送達ビヒクル、治療の組成物、標的細胞、および治療を受ける被験者に応じて変わるだろう。主治医によって選択される用量レベルおよびパターンで１回および複数回投与を実施することができる。送達されるポリヌクレオチド構築物が２以上のＴＣＲ配列を担持できることを理解するべきである。あるいは、また各々が１以上のＴＣＲ分子を発現する別々の構築物を本明細書で説明されるように被験者に送達することもできる。
【００８７】
さらに、本発明の方法によって送達されるポリヌクレオチドを他の適切な組成物および治療と組み合わせることも意図されている。例えば、被験者における免疫応答を増強するため、本明細書で説明される組成物および方法は補助物質（例えば、アジュバント）、例えば、薬理学的作用物質、サイトカイン等をさらに含むことができる。補助物質は、例えば、タンパク質または他の巨大分子として、本明細書で説明される核酸ワクチンの投与と同時に、その前に、またはそれに続いて投与することができる。また核酸分子組成物は、当業者に公知の方法を用いて、被験者に直接投与することもでき、または、あるいは、ｅｘ ｖｉｖｏで被験者から誘導した細胞に送達することもできる。
【００８８】
粒子
一実施形態においては、コア担体粒子を用いてポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡワクチン）および／またはアジュバントを送達する。そのような核酸調製物を送達するための粒子介在法は当該技術分野において公知である。したがって、ひとたび調製されて適切に精製されると、上記核酸分子を、当該技術分野において公知の様々な技術を用いてコア担体粒子（例えば、コア担体）にコーティングすることができる。コア担体は、適切な粒子介在送達装置からの細胞内送達に典型的に用いられる粒径の範囲の適切な密度を有する材料から選択される。最適担体粒径は、もちろん、標的細胞の直径に依存するだろう。
【００８９】
本発明の目的には、タングステン、金、白金およびイリジウム担体粒子を用いることができる。タングステンおよび金粒子が好ましい。タングステン粒子は直径０．５〜２．０μｍの平均サイズで容易に入手することができる。このような粒子は粒子加速送達法において用いるのに最適な密度を有し、かつＤＮＡでの高度に効率的なコーティングを可能にするが、タングステンは特定の細胞型に対して潜在的に毒性であり得る。金粒子または微晶性金（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｃｏｒｐ．、Ｅａｓｔ Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪから入手可能な金粉末Ａ１５７０）も本発明の方法で用途が見出されるだろう。金粒子はサイズの均一性（Ａｌｐｈａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから１〜３μｍの粒径で入手可能、またはＤｅｇｕｓｓａ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪから０．９５μｍを含む一連の粒径で入手可能）および毒性の低下をもたらす。
【００９０】
金またはタングステン粒子にＤＮＡまたはＲＮＡをコーティングまたは沈殿させるのに多数の方法が公知であり、かつ記述されている。大部分のそのような方法は、一般に、予め決定された量の金またはタングステンをプラスミドＤＮＡ、ＣａＣｌ_２およびスペルミジンと組み合わせる。生じた溶液をコーティング手順の間、連続的に攪拌し、反応混合物の均一性を確実なものとする。核酸の沈殿の後、コーティングされた粒子を適切な膜に移して使用前に乾燥させ、粒子送達装置において用いるためにサンプルモジュールもしくはカセットの表面上にコーティングするか、または送達カセット内に充填することができる。
【００９１】
ペプチドアジュバント（例えば、サイトカイン）を適切なコア担体、例えば、金またはタングステンにコーティングすることもできる。例えば、これら２つの成分を単に経験的に決定される比で混合することにより、硫酸アンモニウム沈殿もしくは当業者に馴染みのある他の溶媒沈殿法により、または担体粒子へのペプチドの化学カップリングによりペプチドをコア担体に結合させることができる。Ｌ−システイン残基の金へのカップリングが従来記述されている（Ｂｒｏｗｎら， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：２７１−３１１ （１９８０））。他の方法には、例えば、ペプチド抗原を無水エタノール、水、またはアルコール／水混合物に溶解し、その溶液をある量の担体粒子に添加した後、攪拌しながら空気または窒素流下でその混合物を乾燥させることが含まれる。あるいは、真空下で遠心分離することによってペプチド抗原をコア担体上で乾燥させることができる。ひとたび乾燥すると、コーティングされた粒子を適切な溶媒（例えば、酢酸エチルまたはアセトン）に再懸濁させ、（例えば、超音波処理によって）粉砕して実質的に均一な懸濁液を得ることができる。
【００９２】
コーティングされた粒子の投与
それらを形成した後、本発明のポリヌクレオチドでコーティングされ、かつ場合によってはアジュバントを含むコア担体粒子を、経皮注入（例えば、ペプチド介在送達）技術を用いて被験者に送達する。
【００９３】
経皮注入送達に好適な様々な粒子送達装置が当該技術分野において公知であり、その全てが本発明の実施における使用に適する。現在の装置設計は、標的細胞に向けてコーティングされた担体粒子を推進させるのに爆発性、電気的または気体放出を用いる。コーティングされたコア担体粒子は、それら自体を可動担体シートに離脱可能に付着させるか、またはそれに沿って気流が通過し、その表面から粒子を持ち上げ、かつ標的に向かってそれらを推進させる表面に除去可能に付着させることができる。気体放出装置の一例が米国特許第５，２０４，２５３号に記載されている。爆発型装置は米国特許第４，９４５，０５０号に記載されている。電気放出型粒子加速装置の一例は米国特許第５，１２０，６５７号に記載されている。ここで用いるのに好適な別の電気放出装置が米国特許第５，１４９，６５５号に記載されている。これらの特許の全ての開示は参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９４】
これらのコーティングされた粒子を、投与処方に適合する様式で、かつ所望の免疫応答を誘導するのに有効であろう量で治療しようとする被験者に投与する。核酸分子の場合には一般に１用量当たり０．００１〜１００．０μｇ、より典型的には０．０１〜１０．０μｇの核酸分子の範囲にあり、ペプチドまたはタンパク質分子の場合には１μｇ〜５ｍｇ、より典型的には１〜５０μｇのペプチドである、送達しようとする組成物の量は治療しようとする被験者に依存する。必要とされる正確な量は、免疫される個体の年齢および一般的な状態並びに選択される特定のヌクレオチド配列またはペプチドに加えて、他の要因に依存して変わるだろう。適切な有効量は、本明細書を読むことで当業者が容易に決定することができる。
【００９５】
したがって、ポリヌクレオチドの有効量は免疫される被験者において適切な免疫応答を誘導するのに十分な量であり、常套的な試行によって決定することができる比較的広範な範囲内に収まるだろう。好ましくは、コーティングされた粒子は、治療を受ける被験者において免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）を誘導するために適切なレシピエント細胞に送達される。
【００９６】
粒子状組成物
あるいは、選択された目的のＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを固体の粒子状医薬組成物として製剤化することができる。より特には、目的のＴＣＲ配列を担持する核酸分子を含有する粒子の製剤化を、全てが合理的に熟練した技術者が容易に利用可能である標準的な医薬製剤化学および方法論を用いて行うことができる。例えば、核酸分子を１種類以上の薬学的に許容し得る賦形剤またはビヒクルと組み合わせてワクチン組成物を提供することができる。補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等が賦形剤またはビヒクル中に存在していてもよい。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般には、それら自体がその組成物を摂取する個体において免疫応答を誘導することがなく、かつ過度の毒性なしに投与することができる医薬品である。
【００９７】
薬学的に許容し得る賦形剤には、これらに限定されるものではないが、液体、例えば、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタノールが含まれる。薬学的に許容し得る塩には、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩が含まれていてもよい。必須ではないが、特にはペプチド、タンパク質または他の任意の作用物質に対する、安定化剤として機能する薬学的に許容し得る担体を組成物が含みうることも好ましい。ペプチドの安定化剤としても作用する適切な担体の例には、限定されることがないが、医薬グレードのデキストロース、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストラン等が含まれる。他の適切な担体には、これも限定されることがないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはカルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せが含まれる。薬学的に許容し得る賦形剤、担体、安定化剤および他の補助物質の詳細な考察はＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂ． Ｃｏ．， Ｎ．Ｊ． １９９１）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）において入手可能である。
【００９８】
製剤化された組成物は、上記で定義されるように、免疫学的応答を誘導するのに十分な量の、目的のＴＣＲ分子をコードするポリヌクレオチド量を含むだろう。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。そのような量は比較的広範な範囲、一般には、約０．１μｇ〜２５ｍｇまたはそれ以上のＴＣＲコーディングポリヌクレオチドの範囲内に収まるだろうし、具体的な適切な量は常套的な試行によって決定することができる。これらの組成物は約０．１％〜約９９．９％のポリヌクレオチドを含むことができる。アジュバントが組成物に含まれる場合、またはこれらの方法が粒子状アジュバント組成物を提供するのに用いられる場合、アジュバントは上述の適切な量で存在するだろう。次に、標準技術を用いて、例えば、単純な蒸発（風乾）、真空乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））、噴霧−凍結乾燥、噴霧コーティング、沈殿、超臨界液体粒子形成等によって組成物を粒子として調製する。所望であれば、共通に所有される国際公開第ＷＯ ９７／４８４８５号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載される技術を用いて、生じた粒子の密度を高めることができる。
【００９９】
使用前に粒子をパッケージングすることができる１回単位投与量または多用量容器は、ＴＣＲコーディングポリヌクレオチドおよび／または選択されたアジュバントを含有する適切な量の粒子（例えば、ＴＣＲワクチン組成物）を封入する密閉容器を含むことができる。粒子状組成物は無菌製剤としてパッケージングすることができ、したがって、密閉容器は本発明の方法において使用するまでその製剤の無菌性が維持されるように設計することができる。所望であれば、容器を粒子送達装置における直接使用に適応させることができる。このような容器は、カプセル、ホイルポーチ（ｆｏｉｌ ｐｏｕｃｈｅｓ）、サシェイ（ｓａｃｈｅｔｓ）、カセット等の形態をとることができる。適切な粒子送達装置は本明細書で上述されている。
【０１００】
粒子をパッケージングする容器は、組成物を識別し、かつ関連する投与情報を提供するため、さらにラベル表示されていてもよい。加えて、容器は政府機関、例えば、食品医薬品局によって規定される形態の通告をラベル表示することができ、その通告は連邦法下でのその機関による、ヒトに投与するためのそこに収容される抗原、アジュバント（またはワクチン組成物）の製造、使用または販売の認可を示す。
【０１０１】
次いで、経皮注入技術を用いて（ＴＣＲポリヌクレオチドおよび／または選択されたアジュバントを含む）粒子状組成物を投与することができる。好ましくは、粒子状組成物は粉末注入法によって送達され、例えば、共通に所有される国際公開第ＷＯ ９４／２４２６３号、第ＷＯ ９６／０４９４７号、第ＷＯ ９６／１２５１３号、および第ＷＯ ９６／２００２２号（これらは全て参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるもののような針なしシリンジ系から送達されるだろう。
【０１０２】
そのような装置からの粒子の送達は、典型的には、一般に０．１〜２５０μｍの範囲、好ましくは約１０〜７０μｍの範囲のおおよそのサイズを有する粒子で行われる。約２５０μｍを上回る粒子もそれらの装置から送達することができ、この上限はそのサイズの粒子が望ましくない損傷を皮膚細胞に与えるであろう点である。送達される粒子が標的表面を貫入するだろう実際の距離は、粒径（例えば、大まかな球状粒子幾何を仮定した名目上の粒子直径）、粒子密度、粒子がその表面と激突する初期速度、並びに標的とされる皮膚組織の密度および運動学的速度に依存する。これに関して、針なし注入における使用に最適の粒子密度は、一般には約０．１〜２５ｇ／ｃｍ^３、好ましくは約０．９〜１．５ｇ／ｃｍ^３の範囲であり、注入速度は一般には約１００〜３，０００ｍ／秒の範囲、またはそれ以上である。適切な気圧で、１０〜７０μｍの平均直径を有する粒子をノズルを通して駆動気流の超音速に匹敵する速度で加速することができる。
【０１０３】
所望であれば、これらの粒子送達装置は、目的の抗原および／または選択されたアジュバントを含む適切な投与量の粒子を含有する、予め充填した状態で提供することができる。この充填済装置を密閉容器にパッケージングすることができ、さらにそれに上述のようにラベル表示することができる。
【０１０４】
したがって、上記方法は、約１０〜約２５０μｍ、好ましくは約１０〜約１５０μｍ、最も好ましくは約２０〜約６０μｍの範囲のサイズ；並びに約０．１〜約２５ｇ／ｃｍ^３の範囲の粒子密度、および約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ^３、もしくはそれ以上のかさ密度を有する粒子を含んでなる粒子状医薬（「粉末」）を得るのに用いることができる。「粉末」という用語は、本明細書で用いられる場合、経皮注入技術によって、例えば、針なしシリンジ装置を用いて脊椎動物被験者に送達することができる実質的に固体の粒子からなる組成物を指す。粉末を構成する粒子は、平均粒径、平均粒子密度、粒子形態（例えば、粒子の空気力学的形状および粒子の表面の特徴）および粒子貫入エネルギー（Ｐ．Ｅ．）を含むがこれらに限定されるものではない多数のパラメーターに基づいて特徴付けることができる。粒径、粒子密度および形態は、その固形粒子状医薬組成物が経皮注入に好適な粉末であるように選択される。加えて、本発明の粒子状医薬を構成する粒子は、経皮注入技術によって送達される粉末に好適な基線貫入エネルギーを示すべきである。
【０１０５】
粉末の平均粒径は広範に変化してもよく、一般には約０．１〜約２５０μｍ、例えば約１０〜約１００μｍ、より典型的には約２０〜約７０μｍの範囲であろう。しかしながら、粉末は実質的に均一な平均粒径の粒子を含むことが好ましい。これに関して、粉末の平均粒径は、通常の技術、例えば、顕微鏡技術（粒子を直接に、かつ統計的にグループ化するのではなく個別にサイズ決定する）、ガス吸着、透過率、光不明瞭化または飛行時間を用いて、質量平均空気力学的直径（ＭＭＡＤ）として測定することができる。所望であれば、平均粒径を確認するのに自動化粒径カウンターを用いることができる（例えば、Ａｅｒｏｓｉｚｅｒ、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ、ＨＩＡＣ Ｃｏｕｎｔｅｒ、またはＧｅｌｍａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒ）。
【０１０６】
本発明の固形粒子状医薬組成物（医薬）は、好ましくは、被験者への、典型的には角質層または経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を横切る、高速経皮注入に適するサイズを有する粒子を含んでなる粉末であろう。したがって、これらの粒子の平均質量空気力学的直径（ＭＭＡＤ）は約０．１〜約２５０μｍの範囲であろうが、実際には、ＭＭＡＤは約１０〜約１００μｍ、好ましくは、約１０〜約７０μｍまたは約２０〜約７０μｍであり得る。一般には、これらの粒子は非常に狭幅のサイズ分布を有し、粒子の１０重量％未満がＭＭＡＤの５μｇ＋／−範囲の外側にある直径を有し、すなわち、粒子の１０％未満がＭＭＡＤより少なくとも５μｍ上回るか、またはＭＭＡＤより少なくとも５μｍ下回る直径を有するだろう。好ましくは、粒子の５重量％以下がＭＭＡＤを５μｍ以上上回る直径を有する。また好ましくは、粒子の５重量％以下がＭＭＡＤを５μｍ以上下回る直径を有する。
【０１０７】
実際の粒子密度、すなわち、「絶対密度」は、公知の定量技術、例えば、ヘリウムピクノメトリー等を用いて容易に確認することができる。あるいは、本発明による粉末の密度を評価するのにエンベロープ（「タップ」または「バルク」）密度測定を用いることができる。本発明によって生産される粉末のエンベロープ密度は、一般には、０．５〜２５ｇ／ｃｍ^３、好ましくは、０．８〜１．５ｇ／ｃｍ^３である。
【０１０８】
エンベロープ密度情報は不規則なサイズおよび形状を有する物体の密度の特徴付けにおいて特に有用である。エンベロープ密度は物体の体積で割ったその質量であり、その体積にはその細孔および小腔のものが含まれるが隙間空間は排除される。エンベロープ密度を決定する多数の方法が当該技術分野において公知であり、これにはワックス浸漬、水銀置換、水吸収および見かけの比重技術が含まれる。多数の適切な装置、例えば、Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．から入手可能なＧｅｏＰｙｃ^ＴＭ Ｍｏｄｅｌ １３６０もエンベロープ密度の決定に利用可能である。サンプル医薬組成物の絶対密度とエンベロープ密度との差は、そのサンプルの総空隙パーセントおよび比細孔体積に関する情報を提供する。
【０１０９】
粒子の形態、特には、粒子の空気力学的形状は標準光学顕微鏡を用いて容易に評価することができる。本粉末を構成する粒子は実質的に球状の、または少なくとも実質的に楕円状の空気力学的形状を有することが好ましい。これらの粒子は、棒もしくは針状粒子の存在を回避するため、３以下の軸比を有することも好ましい。またこれらの同じ顕微鏡的技術は、粒子表面の特徴、例えば、表面空隙の量および程度または空隙率の程度を評価するのに用いることもできる。
【０１１０】
したがって、本発明の固形粒子状医薬組成物は、約０．１〜２．５ｇ／ｃｍ^３、好ましくは約０．８〜約１．５ｇ／ｃｍ^３の範囲のエンベロープ密度を有する粒子を含んでなる粉末であることが好ましい。顕微鏡下で観察するとき、個々の粒子の形状は変化し得るが、粒子は好ましくは実質的に球状である。平均アスペクト比（長軸：短軸の比）は、典型的には３：１〜１：１、例えば、２：１〜１：１である。最も好ましくはアスペクト比は１：１であり、したがって、粒子は実質的に球状である。
【０１１１】
粒子貫入エネルギーは多数の通常の技術、例えば、金属化膜Ｐ．Ｅ．試験を用いて確認することができる。金属化膜材料（例えば、アルミニウムの３５０Å層が片面に堆積されている１２５μｍポリエステルフィルム）を、粉末を針なしシリンジ（例えば、Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅらに対して付与された米国特許第５，６３０，７９６号に記載される針なしシリンジ）から約１００〜３０００ｍ／秒の初期速度で打ち込む基体として用いる。この金属化膜を、金属コーティング側を上に向けて適切な表面上に置く。
【０１１２】
粉末を充填した針なしシリンジを、そのスペーサーを膜に接触させて置いた後、発射する。適切な溶媒を用いて残留する粉末を金属化膜表面から除去する。その後、金属化膜の走査にＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ＧＳ−７００画像濃度計を用いて貫入エネルギーを評価し、ＳＣＳＩインターフェースを備え、かつＭｕｌｔｉＡｎａｌｙｓｔソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）およびＭａｔｌａｂソフトウェア（Ｒｅｌｅａｓｅ ５．１、Ｔｈｅ ＭａｔｈＷｏｒｋｓ， Ｉｎｃ．）がロードされたパーソナルコンピュータを用いて濃度計の読み取り値を評価する。濃度計の透過率または反射率法のいずれかを用いてなした濃度計走査を処理するのにプログラムを用いる。噴霧コーティング粉末の貫入エネルギーは、同じサイズの再処理マンニトール粒子と同等であるか、それよりも良好でなければならない（共通に所有される国際公開第ＷＯ ９７／４８４８５号（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の方法に従って凍結乾燥、圧縮、粉砕およびふるい分けされたマンニトール粒子）。
【０１１３】
粒子状組成物の投与
それらの形成に続き、粒子状組成物（例えば、粉末）を適切な経皮注入技術を用いて脊椎動物被験者の組織に経皮的に送達することができる。目的の物質の経皮送達に好適な様々な粒子送達装置が当該技術分野において公知であり、本発明の実施における用途が見出されるだろう。特に好ましい粒子送達技術は、固形薬物含有粒子を制御された用量で無傷の皮膚および組織内に、およびそれを通して打ち込むのに針なしシリンジを用いる。例えば、針なしシリンジ（「ｔｈｅ ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｓｙｒｉｎｇｅ ｄｅｖｉｃｅ」としても知られている）を記載するＢｅｌｌｈｏｕｓｅらに付与された米国特許第５，６３０，７９６号を参照のこと。他の針なしシリンジの構成が当該技術分野において公知であり、本明細書で説明される。
【０１１４】
治療上有効な量の、本明細書で説明される粉末化分子を含有する組成物は、上述の粒子送達装置により、あらゆる適切な標的組織に送達することができる。例えば、これらの組成物は筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織に送達することができる。核酸分子については、送達は、好ましくは、終末分化した細胞へのものであり、かつ分子がそこで発現する；しかしながら、またこれらの分子は非分化の、または部分的に分化した細胞、例えば、血液の幹細胞および皮膚線維芽細胞に送達することもできる。
【０１１５】
粉末化組成物は、その投与製剤に適合する方法で、かつ予防的および／または治療的に有効であろう量で治療しようとする被験者に投与する。送達するべき組成物の量は、一般には、治療しようとする被験者に応じて、１用量当たり０．５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの核酸分子の範囲にある。他の医薬、例えば、生理学的に活性なペプチドおよびタンパク質の用量は、一般には約０．１μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜約３ｍｇの範囲である。正確な必要量は、治療しようとする個体の年齢および一般的な状態、治療する状態の重篤性、送達しようとする特定の調製物、投与部位に加えて他の要因に応じて変わるだろう。適切な有効量は当業者が容易に決定することができる。
【０１１６】
したがって、本発明の粒子状組成物の「治療上有効な量」は、疾患または状態の症状の治療または予防を達成するのに十分であり、常套的な試行によって決定することができる比較的広い範囲内にあるだろう。
【０１１７】
以下は本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。これらの例は説明の目的だけに提供されるものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【０１１８】
実施例
用いられる数字（例えば、量、温度等）に関する精度を保証する試みがなされているが、もちろん、幾らかの実験誤差および偏差は許容されるべきである。
【０１１９】
実施例 １ ：全 ＴＣＲ または ＴＣＲ 断片をコードするポリヌクレオチドを用いる核酸免疫
ＴＣＲコーディングポリヌクレオチドを用いる核酸免疫の特異性および有効性を評価するため、以下の研究を行う。
【０１２０】
自己免疫障害において過剰発現するか、またはより優勢であるＴＣＲを同定する。ＴＣＲ全体またはミエリン塩基性タンパク質（ＢＰ）もしくはＩＩ型コラーゲンを特異的に認識する可変領域断片（例えば、ＣＤＲ−２領域）をコードする構築物を作製する。これらの構築物を、Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら （１９９３） ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：７９１−７９７に記載される技術を用いて、１〜３μｍ金粒子（Ｄｅｇｕｓｓａ Ｃｏｒｐ．、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ）上にコーティングする。簡単に述べると、ＤＮＡの金粒子への付着を、スペルミジンを含有する遠心分離管に１〜３ミクロン金粉末（Ｄｅｇｕｓｓａ）および適切な量のポリヌクレオチド（例えば、金粉末１ｍｇ当たり２μｇ）を添加することにより行う。攪拌しながらＣａＣｌ_２を滴下により添加することによってポリヌクレオチドおよび金を共沈させ、その後、沈殿物を数分間静置する。この金／ＤＮＡ沈殿物を微量遠心分離機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）における遠心分離によって濃縮し、無水エタノールで洗浄し、適切な量のエタノールおよびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）中に再懸濁させる。次に、その懸濁液をガラスバイアルに移し、それに蓋をし、超音波水浴に浸漬して凝集塊を分離させる。続いて、そのエタノール溶液をＴｅｆｚｅｌ（登録商標）管に注入し、遠心力を用いて金／ＤＮＡを管の側面に付着させる。その後、残留するエタノールを、小さな制御された窒素ガス流を用いて排出する。次に、窒素ガス流で管を乾燥させた後、切断してカートリッジとする。それらのカートリッジを、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子送達装置で用いるまで、しっかり蓋をしたガラスシンチレーションバイアル中に乾燥剤と共に４℃で保存する。ヘリウム・パルスＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子介在装置はすでに記述されており（米国特許第５，５８４，８０７号を参照）、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手される。このワクチン接種において、各々のカートリッジは、名目上、１μｇのプラスミドＤＮＡがコーティングされた０．５ｍｇの金粒子を含む。
【０１２１】
標的自己免疫疾患（例えば、ＢＰ特異的ＴＣＲについては多発性硬化症、およびＣＩＩ特異的ＴＣＲについては関節リウマチ）の症状を示す動物を、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＰ粒子送達装置から送達されるポリヌクレオチドでコーティングされた金ビーズの単一ショットを用いる粒子介在送達によって免疫する。初回免疫の４週間後、動物を追加免疫する。追加免疫時（４週間）およびその２週間後（６週間）に血清を採取する。
【０１２２】
実施例 ２ ：全 ＴＣＲ 分子または ＴＣＲ 断片ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する粒子状医薬の特徴付けおよび評価
人工膜標的に対する効果の評価
粉末注入系の多くの態様を同時に測定する機能試験は「金属化膜」または「貫入エネルギー」（ＰＥ）試験と呼ばれている。これは、プラスチックフィルム基体によって支持される精密薄金属層に対して粒子が加えることができる損傷の定量的評価に基づいている。損傷は粒子の動力学的エネルギーおよび他の特定特徴に相関する。この試験からの応答が高いほど（すなわち、膜の損傷／破壊が大きいほど）装置が粒子に加えるエネルギーが大きい。電気抵抗変化の測定または、反射率もしくは透過率モードでの画像濃度測定のいずれかが、制御可能かつ再現可能な試験において装置または製剤性能を評価する信頼性の高い方法を提供する。
【０１２３】
この膜試験ベッドは、圧力、用量、粒径分布および材料等を含む全ての主要装置パラメーターの粒子送達変動に感受性であり、かつガスに対しては非感受性であることが示されている。現在、１２５μｍポリエステル支持体上の約３５０オングストローム厚のアルミニウムが６０バールまでで作動する試験装置に用いられている。
【０１２４】
エンジニアリング・フォーム標的に対する衝撃効果の評価
経皮注入技術によって送達されるときの（例えば、針なしシリンジ装置からの送達）粒子性能を評価する別の手段は剛性ポリメチルイミド・フォーム（Ｒｏｈａｃｅｌｌ ５ＩＩＧ、密度５２ ｋｇ／ｍ^３、Ｒｏｈｍ Ｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｍａｌｄｅｎ、ＭＡ）に対する衝撃の効果を測定することである。この試験の実験の構成は金属化膜試験において用いられるものに類似する。精密カリパスを用いて貫入の深度を測定する。各々の実験について、処理されたマンニトール標準を比較として実施し、他の全てのパラメーター、例えば、装置圧力、粒径範囲等は一定に保つ。またデータは、この方法が粒径および圧力の差に感受性であることも示す。薬物の賦形剤としての処理されたマンニトール標準は前臨床実験において全身濃度を送達することが立証されており、したがってこのフォーム貫入試験における相対性能測定は実用的なｉｎ ｖｉｖｏの基盤を有する。有望な粉末は、前臨床または臨床研究における適度な性能の予測のためのマンニトールと同等か、もしくはそれより良好な貫入を示すことを期待することができる。この単純で迅速な試験は粉末の評価の相対法としての価値を有し、分離して考慮することは意図されていない。
【０１２５】
粒子摩耗試験
粒子性能のさらなる指標は、様々な候補固形粒子状医薬組成物の、高速経皮注入技術に関連する力、すなわち、静止状態の粒子を突然の高速度気流と接触させることに由来する力、粉末が針なしシリンジを通して移動するときの粒子対粒子の衝撃から生じる力、およびこれもまた粉末が装置を通して移動するときの粒子対装置の衝突から生じる力に耐える能力を試験することである。したがって、初期組成物と針なしシリンジ装置から送達された後の組成物との粒径分布の変化を測定する単純な粒子摩耗試験が考案されている。
【０１２６】
この試験は、粒子組成物を針なしシリンジに上述のように充填した後、その粒子状組成物が可溶ではない担体流体（例えば、鉱油、シリコーン油等）を含有するフラスコ内にその装置を放出することによって行う。その後、担体流体を集め、初期組成物および放出された組成物の両者における粒径分布を、適切な粒径測定装置、例えば、ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ（登録商標）ｍｏｄｅｌ ７８０ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅｒを用いて算出する。装置作動後に平均質量空気力学的直径（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ装置による測定）の約５０％未満、より好ましくは約２０％または約１０％未満の減少を示す組成物が本明細書で説明される針なしシリンジ系における使用に好適なものと判断される。
【０１２７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ でのヒト皮膚への送達および経表皮 （ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ） 水分損失
最終的な実用により密接に匹敵する組成物性能試験のため、候補粒子組成物を採皮された（ｄｅｒｍａｔｏｍｅｄ）完全厚のヒト皮膚サンプルに注入することができる。注入後の複製皮膚サンプルを、３２℃の水、生理食塩水またはバッファーを含有する改変Ｆｒａｎｚ拡散セル上に置くことができる。拡散セル構成要素への結合を防止し、かつ皮膚の状態を維持するため、界面活性剤のような添加物を用いることができる。２種類の測定を行って皮膚における製剤の性能を評価することができる。
【０１２８】
物理的効果、すなわち、皮膚の障壁機能に対する粒子注入の効果を測定するため、経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）を測定することができる。測定は、平衡時に（約１時間）、約１２ｍｍの煙突のように作用する拡散セルキャップの頂部に置かれたＴｅｗａｍｅｔｅｒ ＴＭ ２１０（登録商標）（Ｃｏｕｒａｇｅ ＆ Ｋｈａｚａｋａ、Ｋｏｌｎ、Ｇｅｒ）を用いて行う。粒子が大きいほど、および注入圧が高いほど、それに比例してｉｎ ｖｉｔｒｏで生じるＴＥＷＬ値は高くなり、これはｉｎ ｖｉｖｏでの結果と相関することが示されている。粒子注入により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＥＷＬ値は粒径およびヘリウムガス圧に応じて約７〜約２７（ｇ／ｍ^２ｈ）増加した。粉末なしのヘリウム注入には効果がない。ほとんどの粒径について約１時間で処理前の値に戻るＴＥＷＬによって示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏで皮膚障壁特性は迅速に正常に戻る。最大の粒子、５３〜７５μｍについて、皮膚サンプルは１時間で５０％の回復を、および２４時間までに完全な回復を示す。
【０１２９】
これらの、および他の定性的および定量的試験は、経皮注入において用いるための本発明の粒子状医薬の物理的および機能的適合性の評価に用いることができる。必須ではないが、粒子が以下の特徴を有することが好ましい：実質的に球状（例えば、可能な限り１：１に近いアスペクト比、例えば、１．５：１）；滑らかな表面；粒子摩耗試験を用いる粒径の減少が２０％未満；可能な限り成分の真の密度に近いエンベロープ密度（例えば、約０．８ｇ／ｍｌ超）；および狭い粒径分布を伴う約２０〜７０μｍのＭＭＡＤ。これらの組成物は自由流動粉末（例えば、５０％相対湿度で８時間の保存の後、および４０％相対湿度で２４時間の保存の後に自由流動）であり得る。これらの基準の全ては上述の方法を用いて評価することができ、かつ以下の刊行物（これらは参照することによって本明細書に組み込まれる）にさらに詳述されている。Ｅｔｚｌｅｒら（１９９５） Ｐａｒｔ． Ｐａｒｔ． Ｓｙｓｔ． Ｃｈａｒａｃｔ． １２：２１７；Ｇｈａｄｉｒｉら（１９９２） ＩＦＰＲＩ Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ， ＦＲＲ １６−０３ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｕｒｒｅｙ， ＵＫ；Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅ ら（１９９７）「Ｎｅｅｄｌｅｌｅｓｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｄｒｙ ｐｏｗｄｅｒ ｆｏｒｍ， ｕｓｉｎｇ ｓｈｏｃｋ ｗａｖｅｓ ａｎｄ ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ ｇａｓ ｆｌｏｗ」， Ｐｌｅｎａｒｙ Ｌｅｃｔｕｒｅ ６， ２１^ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｓｈｏｃｋ Ｗａｖｅｓ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ；およびＫｗｏｎら（１９９８） Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ｓｕｐｐｌ．１ （１）， １０３。
【０１３０】
したがって、免疫応答を誘発する新規組成物が説明されている。これらの組成物の使用方法も説明されている。主題発明の好ましい実施形態が幾らか詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく明白な変形をなし得ることが理解される。[0001]
Field of the invention
The present invention generally relates to polynucleotides encoding T cell receptors, compositions containing such polynucleotides, and methods of using them. In particular, the invention relates to polynucleotides or fragments thereof encoding at least one T cell receptor molecule, particulate pharmaceutical compositions containing such polynucleotides, and treating T cell mediated diseases in a subject. And administering a particulate pharmaceutical composition of the invention to elicit a cross-reactive immune response against a particular population of T cells that express the T cell receptor.
[0002]
background
Recently, direct injection of plasmid DNA by intramuscular injection (Wolff et al. (1990) Science 247: 1465: 1468) or intradermal injection (Raz et al. (1994) PNAS USA 91: 9519-9523) using a needle and syringe. Injections have been reported. Biolistic^RAnother approach, called particle-mediated DNA delivery, uses a needleless device to deliver DNA-coated microscopic gold beads directly into epithelial cells (Yang et al. (1990) PNAS USA 87: 9568-9572). ). Thus, several delivery techniques can be used to deliver nucleic acids for immunization, including particle-mediated techniques for delivering nucleic acid-coated microparticles into target tissues. (See, for example, commonly owned U.S. Patent No. 5,865,796, filed February 2, 1999). Particle-mediated nucleic acid immunization techniques have been shown to elicit both humoral and cellular T lymphocyte immune responses following epithelial delivery of nanogram quantities of DNA. Pertmer et al. (1995) Vaccine 13: 1427-1430. Such particle-mediated delivery techniques have been compared to other types of nucleic acid inoculation and have been found to be significantly superior. Fynan et al. (1995) Int. J. Immunopharmacology 17: 79.83; Fynan et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA 90: 11478-11482, and Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9519-9523.
[0003]
A novel transdermal injection system has also been described that involves the use of a needleless syringe to deliver a controlled dose of solid drug-containing particles into and through intact skin. In particular, co-owned Bellhouse et al., U.S. Patent No. 5,630,796 describes a needleless syringe that delivers drug particles entrained in an ultrasonic air stream. This syringe without needle (also known as “PowderJect”)^R Needleless syringe devices ") are for transdermal delivery of powdered drug compounds and compositions, delivery of genetic material into living cells (eg, gene therapy), and delivery of biopharmaceuticals to skin, muscle, blood or lymph. Used. Needleless syringes are also used with surgery to deliver drugs and biopharmaceuticals to organ surfaces, solid tumors and / or surgical cavities (eg, tumor beds or cavities after tumor resection). Pharmaceuticals that can be suitably prepared in substantially solid particulate form can be safely and easily delivered using such devices.
[0004]
Some needleless syringes generally include an elongate tubular nozzle having a rupturable membrane that initially closes a passage through the nozzle and is disposed substantially adjacent an upper end of the nozzle. Is done. Particles of the therapeutic agent to be delivered are placed adjacent to the rupturable membrane and a nozzle is applied to apply sufficient air pressure upstream of the membrane to rupture the membrane and deliver from its downstream end. Is delivered using a pressurized means to create an ultrasonic airflow (containing the drug particles) that passes through it. In this way, particles can be delivered from a needleless syringe at a delivery rate of Mach 1 to Mach 8, which can be easily obtained by bursting a rupturable membrane.
[0005]
Alternative needleless syringe configurations generally have a resting "reversal" position (where the diaphragm presents a concave surface for containing the drug particles on the downstream surface) and an activity "eversion" instead of having the drug particles subjected to an ultrasonic airflow. A bistable diaphragm at the downstream end of the nozzle that is movable between a position (the diaphragm is convex outward on the downstream surface as a result of an ultrasonic shock wave applied to the upstream surface of the diaphragm). Includes the same components as above, except provided. In this way, drug particles contained within the concave surface of the diaphragm are released from the device at a high initial rate towards a target skin or mucosal surface for their transdermal delivery.
[0006]
Transdermal injections using the above needleless syringe configuration are generally performed with particles having an approximate size in the range of 0.1 to 250 μm. Particles larger than about 250 μm can be delivered from the device, but the upper limit is that particles of that size can cause nuisance damage to skin cells. The actual distance the conveyed particles penetrate is the particle size (eg, nominal particle diameter assuming a rough spherical particle geometry), particle density, the initial velocity at which the particles strike the skin surface, and the density and power of the skin Depends on the chemical viscosity. Target particle densities for use in needleless injection generally range from about 0.1 to 25 g / cm³And the injection speed is generally in the range of about 150 to 3,000 m / sec.
[0007]
Summary of the Invention
The present invention provides methods and compositions related to immunization of a vertebrate subject to treat a particular T cell mediated disease or disorder, wherein the compositions comprise a T cell receptor (TCR) or They contain polynucleotides encoding their relevant fragments, and their TCRs are found on (and expressed by) certain T cells that are preferentially involved in T cell mediated disorders such as autoimmune disorders.
[0008]
Accordingly, a primary object of the present invention is to provide an isolated polynucleotide, wherein the polynucleotide comprises at least one T cell receptor (TCR) coding sequence and the coating sequence comprises It is operably linked to a control element such that it can be transcribed and translated in a recipient cell in vivo to yield a properly folded (eg, refolded) TCR molecule. The isolated polynucleotide is used in the manufacture of a medicament for inducing a cross-reactive immune response in a vertebrate subject against T cells expressing the native form of the TCR. The medicament is a particulate medicament suitable for administration to a subject using a transdermal particle injection technique. Thus, in one aspect, the medicament is formed by coating the core carrier with the polynucleotide. In another aspect, the medicament is a solid particulate pharmaceutical composition containing the polynucleotide. In certain embodiments, the polynucleotide encodes a TCR molecule containing an α-chain and a β-chain. In another aspect, the polynucleotide encodes a TCR molecule containing gamma and delta chains. The TCR-encoding polynucleotides of the present invention are selected based on the preference that T cells expressing the TCR are involved in autoimmune disorders, including, for example, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus.
[0009]
It is also a primary object of the present invention to provide an isolated polynucleotide comprising a coding sequence for a TCR fragment, eg, a coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a TCR, wherein CDR2 is preferentially involved in autoimmune disorders. Derived from T cells. The isolated polynucleotide is used in the manufacture of a medicament for eliciting a cross-immune response to a T cell expressing a native form of the TCR in a vertebrate subject. The medicament is a particulate medicament suitable for administration to a subject using a transdermal particle injection technique. Thus, in one aspect, the medicament is formed by coating the core carrier with the polynucleotide. In another aspect, the medicament is a solid particulate pharmaceutical composition containing the polynucleotide. In certain aspects, a second polypeptide is also provided in a medicament, wherein the second medicament comprises a coding sequence for at least one additional TCR hypervariable region, eg, a coding sequence for a CDR1 and / or CDR3 peptide. . Preferably, T cells expressing the TCR or a fragment thereof are preferentially involved in autoimmune disorders (eg, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus).
[0010]
It is a further main object of the present invention to provide a method for treating a T cell mediated disease or disorder. This method comprises administering one of the particulate medicaments of the invention, thereby causing the polynucleotide to be expressed in the recipient cells of the subject, and providing a cross-reactive immune response to specific T cells that express a homologous TCR. Involves providing a TCR molecule or a fragment thereof (eg, a CDR2 peptide) in an amount sufficient to induce T cells, wherein the T cells mediate a pathology associated with a T cell disorder or disease. Preferably, the TCR or fragment thereof is from a T cell that is preferentially involved in an autoimmune disorder (eg, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus). In certain embodiments, the polynucleotide encodes a TCR molecule comprising an α-chain and a β-chain. In another aspect, the polynucleotide encodes a TCR molecule comprising a gamma chain and a delta chain. In addition, the medicament can include one or more additional polynucleotides, wherein these additional polynucleotides encode a full-length TCR molecule or a fragment thereof (eg, a CDR1, CDR2 and / or CDR3 peptide). can do. In specific embodiments, these additional polynucleotides are coated on a core carrier (eg, gold or tungsten) and the carrier is administered to skin or mucosal cells in the subject to be treated.
[0011]
Identifying a T cell receptor type nucleotide sequence that is preferentially expressed at the disease site and selecting one or more of the identified nucleotides for inclusion in a polynucleotide described herein. Provision is yet another primary object of the present invention. In certain embodiments, the identification comprises identifying the nucleotide sequence of the CDR2 region that is preferentially expressed in the TCR at the site of the disease and selecting one or more of the identified nucleotide sequences for inclusion in a polynucleotide. .
[0012]
Accordingly, in one aspect of the present invention, core carrier particles are provided. The core carrier is coated with a polynucleotide comprising at least one T cell receptor (TCR) coding sequence, which is transcribed and translated in vivo in a recipient cell to refold the T cell receptor coding sequence. Operatively linked to a control element such that the resulting TCR molecule can be effected.
[0013]
In a related aspect of the invention, there is provided a core carrier, wherein the core carrier is coated with a polynucleotide comprising a coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), wherein the coding for the CDR2 hypervariable region is provided. The sequence is operably linked in vivo to a regulatory element such that it can be transcribed and translated in a recipient cell to produce a CDR2 peptide, wherein the CDR2 is derived from a T cell that is preferentially involved in an autoimmune disorder. It is.
[0014]
In another aspect of the invention, there is provided a solid particulate pharmaceutical composition, wherein the composition comprises a polynucleotide comprising a coding sequence for at least one T cell receptor (TCR). The coding sequence for the cell receptor is operably linked to control elements so that it can be transcribed and translated in vivo in the recipient cell to yield a refolded TCR molecule.
[0015]
In a related aspect of the invention, there is provided a solid particulate pharmaceutical composition, wherein the composition comprises a polynucleotide comprising the coding sequence of the CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), The coding sequence for the CDR2 hypervariable region is operably linked to regulatory elements in a recipient cell so that it can be transcribed and translated in vivo to yield a CDR2 peptide, which is predominantly involved in autoimmune disorders It is derived from T cells.
[0016]
In yet another aspect of the invention, a vector comprising a polynucleotide having at least one T cell receptor (TCR) coding sequence elicits a cross-reactive immune response against T cells that express a native form of the TCR. Used in the manufacture of a medicament, wherein the medicament is a particulate medicament suitable for transdermal injection into a subject. The coding sequence is operably linked to a control element such that it can be transcribed and translated in vivo in a subject's recipient cells to yield a refolded TCR molecule.
[0017]
In a related aspect of the invention, a vector comprising a polynucleotide having a coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR) is used to elicit a cross-reactive immune response against T cells expressing a native form of the TCR. Wherein the CDR2 is derived from a T cell that is preferentially involved in an autoimmune disorder, and the drug is a particulate drug suitable for transdermal injection into a subject . The coding sequence is operably linked to a control element such that it can be transcribed and translated in vivo in a subject's recipient cells to provide a CDR2 peptide.
[0018]
In yet another aspect of the invention, a method is provided for treating a T cell mediated disease. The method comprises providing a vertebrate subject in need of such treatment to a core carrier coated with a polynucleotide comprising (a) a coding sequence for at least one T cell receptor (TCR). A cell carrier coding sequence that is operably linked to regulatory elements such that it can be transcribed and translated in vivo in a recipient cell to yield a refolded TCR molecule; or (b) a T cell receptor A core carrier coated with a polynucleotide comprising the coding sequence of the CDR2 hypervariable region of the body (TCR), which coding sequence can be transcribed and translated in vivo in a recipient cell to provide a CDR2 peptide. Operably linked to a regulatory element, this CDR2 is superior to autoimmune disorders. It involves administering to the core carrier is derived from the T cell involved, either an effective amount of. After administration, the polynucleotide is expressed in a subject's cells and a sufficient amount of a T cell receptor to induce a cross-reactive immune response to a native TCR expressed by a T cell that mediates a T cell mediated disease ( TCR) molecule or CDR2 peptide.
[0019]
In a related aspect of the invention, another method is provided for treating a T cell mediated disease. The method comprises providing a vertebrate subject in need of such treatment with a solid particulate pharmaceutical composition comprising (a) a polynucleotide having a coding sequence for at least one T cell receptor (TCR). Thus, a pharmaceutical composition wherein the coding sequence for the T cell receptor is operably linked to a regulatory element such that it can be transcribed and translated in vivo in a recipient cell to yield a refolded TCR molecule; or b) A solid particulate pharmaceutical composition comprising a polynucleotide having a coding sequence for the CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), which coding sequence is transcribed and expressed in recipient cells in vivo. Operably linked to a control element so that it can be translated to give the CDR2 peptide, DR2 involves administering is from a T cell which preferentially involved in autoimmune disorders pharmaceutical composition, either an effective amount of. After administration, the polynucleotide is expressed in a subject's cells and a sufficient amount of a T cell receptor to induce a cross-reactive immune response to a native TCR expressed by a T cell that mediates a T cell mediated disease ( TCR) molecule or CDR2 peptide.
[0020]
These and other objects, aspects and embodiments of the present invention will be readily apparent to one of ordinary skill in the art in light of the disclosure provided herein.
[0021]
Embodiment of the Invention
Before describing the present invention in detail, it is to be understood that this invention is not limited to particular T cell receptor coding sequences. It should also be understood that different applications of the disclosed method can be tailored to the particular needs in the art. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments of the present invention only and is not intended to be limiting.
[0022]
All publications, patents and patent applications cited herein, whether described above or below, are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0023]
Note that as used in this specification and the appended claims, the singular forms "a," "an," and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. Must. Thus, for example, reference to “a core carrier” includes a mixture of two or more such particles, reference to “a particle” includes a mixture of two or more particles, and “a recipient cell”. References include two or more such cells, and the like.
[0024]
Definition
Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. The following terms are intended to be defined as indicated below.
[0025]
The term “transdermal” delivery refers to intradermal (eg, intradermal or epidermal), transdermal (eg, “percutaneous”) and transmucosal administration, ie, into the skin or mucosal tissue. Or delivery by passage of agents through them. See, eg, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker. Inc. , (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.). Marcel DeKker Inc. , (1987); and Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydoniaeus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). Thus, the term encompasses the particle mediated delivery described in US Pat. No. 5,865,796, in addition to the delivery from the particle delivery device described in US Pat. No. 5,630,796.
[0026]
By "core carrier" is meant a defined particle size such that DNA can be delivered using particle-mediated delivery techniques, such as those described in US Pat. No. 5,100,792. In addition, carrier particles coated with nucleic acids (eg, DNA) to provide a density high enough to achieve the momentum required for cell membrane penetration. The core carrier typically comprises materials such as tungsten, gold, platinum, iron, polystyrene and latex. See, for example, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N.M. ed. , Oxford University Press, New York. See NY pages 10-11.
[0027]
What is meant by a "needleless syringe" is a device that delivers the particulate composition transdermally without using a conventional needle that penetrates the skin. Needleless syringes for use with the present invention are discussed throughout this specification. Thus, the term includes particle delivery devices.
[0028]
By "antigen" is meant a molecule comprising one or more epitopes that stimulates the host immune system to produce a cellular antigen-specific immune response or a humoral antibody response. Thus, antigens include proteins, polypeptides, antigenic protein fragments, oligosaccharides, polysaccharides, and the like. Further, the antigen can be delivered from any known virus, bacterium, parasite, plant, protozoa, or fungus, and can be a whole microorganism. The term also includes tumor antigens. Similarly, oligonucleotides or polynucleotides that express an antigen, such as in DNA immunization applications, are included in the definition of antigen. Also included are synthetic antigens, such as polyepitope, flanking epitopes, and other recombinantly or synthetically derived antigens (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Invnunol.23: 2777-2781; Bergmann et al. (1996) Immunol.1573242-3249; Suhrbier. A. (1997) Immunol. and Cell Biol.75: 402-408; Gardner et al. (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998).
[0029]
The term "epitope" generally refers to a site on an antigen to which a specific antigen binds. Identification of epitopes capable of eliciting an antibody response is readily achieved using techniques known in the art. See, for example, Geysen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984)81: 3998-4002 (a general method for rapidly synthesizing peptides to locate immunogenic epitopes on a given antigen); U.S. Patent No. 4,708,871 (identifying epitopes on an antigen and chemically Procedure for synthesis); and Geysen et al. , Molecular Immunology (1986)23: 709-715 (a technique for identifying peptides using high affinity for a given antibody). T cell epitopes are generally those that are characterized by a peptide structure capable of inducing a T cell response. In this regard, it is accepted in the art that T cell epitopes include a linear peptide determinant that assumes an extended conformation within the peptide-binding cleft of the MHC molecule (Unanue et al., Science (1987)).236: 551-557). As used herein, an epitope is generally a peptide having about 3-5, preferably 5-10 or more amino acid residues.
[0030]
The term "self antigen", which is used interchangeably herein with the term "autoantigen", means a molecule that can be recognized during an immune response, usually a part of the individual. It is. This is symmetric to a foreign, or exogenous, antigen that is not normally part of the individual's environment. Each autoimmune disorder is characterized by an immune response directed against a self antigen. Usually, there is no active immune response to self antigens and no symptoms appear. An autoimmune disorder can develop with the development of an immune response to a self antigen. Autoimmune disorders present clinically different symptoms depending on the specific autoantigen against which the immune response is raised. This immune response results in the destruction of the structure containing the autoantigen, which is a loss of its structure with a loss of its normal function, which results in symptoms of an autoimmune disorder.
[0031]
"Peptide" is used in its broadest sense to refer to a compound having two or more subunit amino acids, amino acid analogs, or other peptidomimetics. These subunits can be linked by peptide bonds or other bonds, for example, esters, ethers and the like. As used herein, the term "amino acid" refers to both natural and / or unnatural or synthetic amino acids, including both glycine and D or L optical isomers, as well as amino acid analogs and peptidomimetics. Point. Peptides having three or more amino acids are usually called oligopeptides if their peptide chains are short. If the peptide chain is long, the peptide is typically called a polypeptide or protein.
[0032]
The terms "nucleic acid molecule" and "polynucleotide" are used interchangeably and refer to nucleotides of any length, polymeric forms of either deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof. A polynucleotide can have any three-dimensional structure and can perform any function, known or unknown. Non-limiting examples of polynucleotides include genes, gene fragments, exons, introns, messenger RNA (mRNA), transfer RNA, ribosomal RNA, ribozymes, cDNA, recombinant polynucleotides, branched polynucleotides, plasmids, vectors, any Includes sequence isolated DNA, isolated RNA of any sequence, nucleic acid probes, and primers.
[0033]
Polynucleotides typically comprise four nucleotide bases: adenine (A); cytosine (C); guanine (G); and thymine (T) (instead of thymine (T) if the polynucleotide is RNA). Uracil (U)). Thus, the term polynucleotide sequence is a linear representation of a polynucleotide molecule. This linear representation can be input to a database in a computer with a central processing unit and used for bioinformatics applications, such as functional genomics and homology searches.
[0034]
A “vector” is any moiety capable of transferring a gene sequence to a target cell (eg, a viral vector, a non-viral vector, a particulate carrier, and a liposome). A “plasmid” vector is an extrachromosomal genetic element capable of autonomous replication in a host cell. Typically, "vector constructs", "expression vectors", and "gene transfer vectors" are any vector capable of directing the expression of a gene of interest and capable of transferring a gene sequence to a target cell. A nucleic acid construct is meant. Thus, the term includes cloning and expression vehicles in addition to viral vectors.
[0035]
A “coding sequence”, ie, a sequence that “encodes” a selected polypeptide, is transcribed into a polypeptide in vivo (DNA) when placed under the control of appropriate regulatory elements (or “control elements”). ) And translated (for mRNA). The boundaries of the coding sequence are determined by a start codon at the 5 '(amino) terminus and a translation stop codon at the 3' (carboxy) terminus. Coding sequences include, but are not limited to, cDNA from a virus, prokaryotic or eukaryotic mRNA, genomic or prokaryotic DNA from a virus, and even synthetic DNA sequences. A transcription termination sequence can be located 3 'to the coding sequence. Transcription and translation of a coding sequence is typically regulated by "control elements," including, but not limited to, transcription promoters, transcription enhancer elements, Shine-Dalgarno sequences, transcription termination signals, , A polyadenylation sequence (located 3 'to the translation stop codon), a sequence for optimizing translation initiation (located 5' to the coding sequence), and a translation termination sequence.
[0036]
A “promoter” is a nucleotide sequence that directs the transcription of a polynucleotide encoding a polypeptide. Promoters include inducible promoters (expression of a polynucleotide sequence operably linked to this promoter is induced by an analyte, cofactor, regulatory protein, etc.), repressible promoters (polynucleotide operably linked to this promoter). Nucleotide sequence expression is repressed by analytes, cofactors, regulatory proteins, etc.), constitutive promoters, and alternative promoters (expression of a polynucleotide operably linked to this promoter occurs only in certain tissue types) May be included. The terms "promoter" or "regulatory element" are intended to include the full-length promoter regions and functional (eg, transcription or translational control) segments of these regions.
[0037]
An "isolated polynucleotide" molecule is a nucleic acid molecule that has been separated and sorted from the whole organism in which it is found in nature; or a nucleic acid molecule that lacks all or part of the sequence normally associated with it in nature; A sequence that remains present in a state but has a sequence that is heterogeneous with respect thereto (defined below). A sequence exhibits the same or substantially the same base-pair sequence as a particular region of a source molecule, its cDNA, their counterparts, or exhibits sequence identity as described below. Sometimes "derived" from a molecule.
[0038]
"Operably linked" refers to an arrangement of elements so configured that the components are configured to perform their normal functions. Thus, a given promoter operably linked to a coding sequence (eg, encoding an antigen of interest) is capable of effecting the expression of the coding sequence when the appropriate enzyme is present. Promoters and other regulatory elements need not be adjacent to coding sequences so long as they function to direct their expression. For example, an untranslated but transcribed intervening sequence may be present between the promoter sequence and the coding sequence, which promoter sequence may still be considered `` operably linked '' to the coding sequence. it can.
[0039]
"Recombinant," as used herein to describe a nucleic acid molecule, refers to a polynucleotide of genomic, cDNA, semi-synthetic, or synthetic origin, which, due to their origin or handling, (1) Does not associate with all or a portion of the polynucleotide with which it associates; and / or (2) ligates to a polynucleotide other than that to which it naturally ligates. The term "recombinant" when used in reference to a protein or polypeptide refers to a polypeptide produced by expression of a recombinant polynucleotide.
[0040]
Techniques for determining nucleic acid and amino acid "sequence identity" are also known in the art. Typically, such techniques involve determining the nucleotide sequence of the mRNA of a gene and / or determining the amino acid sequence encoded by it, and comparing these sequences to a second nucleotide or amino acid sequence. In general, "identity" refers to the exact nucleotide-to-nucleotide or amino acid-to-amino acid correspondence of two polynucleotides or polypeptide sequences, respectively. Two or more sequences (polynucleotides or amino acids) can be compared by determining their "percent identity". The percent identity between two sequences, whether a nucleic acid or amino acid sequence, is the number of exact matches between the two aligned sequences divided by the length of the shorter sequence and multiplied by 100. Approximate alignments of nucleic acid sequences can be found in Smith and Waterman,Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). This algorithm is based on Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure, M .; O. Dayhoff ed. , 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. C. , Developed by USA, Gribskov,Nucl. Acids Res. 14 (6): 6745-6763 (1986), which can be applied to amino acid sequences by using a scoring matrix. An exemplary implementation of this algorithm for determining percent sequence identity is provided in the "BestFit" utility application by the Genetics Computer Group (Madison, WI). The default parameters for this method are described in Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (available from Genetics Computer Group, Madison, Wis.). A preferred method of establishing percent identity in the context of the present invention is copyrighted by the University of Edinburg and described by John F. Collins and Shane S.C. Developed by Sturrok and manufactured by IntelliGenetics, Inc. Using the MPSRCH package of the program sold by (Mountain View, CA). From this set of packages, the Smith-Waterman algorithm can be used when default parameters are used for the scoring table (e.g., gap open penalty 12, gap extension penalty). 1) and gap 6). From the generated data, the “Match” value reflects “sequence identity”. Other programs suitable for calculating percent identity or similarity between sequences are generally known in the art, for example, another alignment program is BLAST, used with default parameters. For example, BLASTN and BLASTP can be used with the following default parameters: gene code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; expected = 10; matrix = BLOSUM62; description = 50 sequences Sort = HIGH SCORE; Database = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Supplydate + PDR. Details of these programs can be found at the following internet address: http: // www. ncbi. nlm. gov / cgi-bin / BLAST.
[0041]
Alternatively, polynucleotide hybridization under conditions that form stable duplexes between homologous regions, followed by digestion with single-strand specific nuclease (s) and size of digested fragments The homology can be determined by the determination. The two DNA or two polypeptide sequences are at least about 80% -85%, preferably at least about 90%, most preferably at least about 80%, over a defined length of the molecule, as determined using the methods described above. "Substantially homologous" to each other when they exhibit at least about 95% to 98% sequence identity. As used herein, substantially homologous also refers to sequences that exhibit complete identity to the designated DNA or polypeptide sequence. DNA sequences that are substantially homologous can be identified in, for example, Southern hybridization experiments, under stringent conditions defined for the system. For example, stringent hybridization conditions can include 50% formamide, 5 × Denhardt solution, 5 × SSC, 0.1% SDS and 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA, and washing conditions are 2 × SSC at 37 ° C. , 0.1% SDS followed by 1 × SSC at 68 ° C., 0.1% SDS. Defining appropriate hybridization conditions is within the skill of the art. See, eg, Sambrook et al, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
[0042]
As used herein, the term "adjuvant" refers to any substance that enhances the action of a drug, antigen, polynucleotide, vector, and the like. Although not always explicitly stated, molecules having biological activity similar to wild-type or purified peptide adjuvants (eg, recombinantly produced, or variants thereof) and encoding these molecules It is contemplated that nucleic acids are used within the spirit and scope of the present invention.
[0043]
As used herein, the term "treat" or "treatment" includes any of the following: prevention of infection or re-infection; reduction or elimination of symptoms; and reduction or elimination of pathogens. Treatment can be prophylactic (pre-infection) or therapeutic (post-infection).
[0044]
By "vertebrate subject" is meant any member of the subphylum subdata, particularly mammals, including but not limited to humans and other primates. The term does not indicate a particular age. Thus, both adult and newborn individuals are intended to be covered.
[0045]
General summary of the invention
Before describing the present invention in detail, it is to be understood that this invention is not limited to particular formulations or process parameters, which can, of course, vary widely. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments of the present invention only and is not intended to be limiting.
[0046]
In a cell-mediated immune response, T lymphocytes (T cells) that are capable of binding certain proteins (eg, antigens) when they associate with major histocompatibility complexes (“MHCs”) are associated with those proteins. Intervening, typically by antigen presenting cells ("APCs", eg, dendritic cells or macrophages). The APC digests the antigen into smaller sized fragments, which bind to the APC's MHC and present it on its surface.
[0047]
The T cell receptor (TCR) is a double-chain protein present on the surface of T cells and recognizes and binds to peptide-MHC complexes presented by APCs and is a structurally variable antigen-specific Make up the receptor. There are two known types of TCRs, TCR2 (consisting of “α” and “β” chains) and TCR1 (consisting of “γ” and “δ” chains). The α and γ chains are each divided into a variable (“V”) region, a joining (“J”) region, and a constant (“C”) region. The β and δ chains each have V, J, and C regions, and also have a diversity (“D”) region located between V and J. More than 95% of the TCRs are αβ chain dimers, whereas about 5% are γδ chain dimers.
[0048]
TCRs are expressed with enormous diversity, each TCR being specific for one or a few MHC-peptide complexes. The selectivity of the TCR results from many combinations of the V, D, and J regions, which are amplified by random hypervariability at the junction between the genes in the V, D, and J regions. This diversity has led to various numerical nomenclature. Widely accepted is Chothia et al. (1988) EMBO J .; 7 (12): 3745-3755, in which the amino acids ("AA") of the V region of the beta chain (of particular interest in the present invention) are designated as having position AA92. Starting from the conserved cysteine toward the N-terminus. The corresponding conserved cysteine in Vα is designated in this system as having position AA90. The TCR consists of three complementarity determining regions: CDR1 located towards the N-terminus of the V region; CDR2 located somewhat in the middle of the V region (generally starting at the C-terminus starting from a conserved WY framework of approximately amino acid 35). And the CDR3 located across the V (D) J junction.
[0049]
Accumulated evidence also suggests that TCRs specific for epitopes on particular proteins contribute to autoimmune disorders. For example, myelin basic protein (BP) can be a cause of multiple sclerosis. In animals, a limited set of TCR α and β chain variable genes are used by BP-specific TCRs (see, eg, Acha-Orbea et al. (1998) Cell 54: 263-273). Monoclonal antibodies directed against these regions, or synthetic peptides having sequences common to their TCR variable regions, would be useful in both protection and treatment of animals showing clinical signs of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). It is possible.
[0050]
In addition, vaccines that induce cell-mediated immune responses represent important strategies in combating T-cell mediated responses such as autoimmune disorders. Current approaches to treating autoimmune disorders involve the administration of therapeutics that affect the entire immune system and thus have undesirable side effects. Current T cell vaccine therapies have only demonstrated limited utility in reducing the morbidity of a patient. Some groups include: (1) whole T cell receptors produced by recombinant methods (see, eg, WO 99/60119 and WO 99/60120); (2) peptide fragments of TCR, especially A fragment containing the second complementarity determining region (CDR2) (see, for example, both US Pat. Nos. 5,614,192 and 5,776,459 to Vanderbark); or (3) encoding the variable region of the TCR Attempts have been made to develop a T cell receptor (TCR) vaccine using any of the DNA-cardiotoxin injections of the constructs described (see, for example, Steinman et al., US Pat. No. 5,939,400). These methods do not show a consistent immune response.
[0051]
The present invention relates to polynucleotides encoding T cell receptors or fragments thereof; core carriers coated with these polynucleotides; particulate compositions made with these polynucleotides; and pharmaceutical compositions containing these polynucleotides. , For example, as a nucleic acid (eg, DNA) vaccine. The TCRs encoded by these polynucleotides are preferably specific TCRs associated with one or more autoimmune disorders.
[0052]
Accordingly, the present invention is an efficient method of treating certain autoimmune disorders, for example, multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis, lupus, etc., wherein the disease is present in large numbers in diseased lesions or is overexpressed there By inducing an inhibitory immune response (e.g., humoral and / or cellular) to the T cells (e.g., specific V-beta receptor types) that are administered. These overexpressed TCRs are first identified, and polynucleotides encoding all of these specific TCRs or their variable regions are then constructed. Furthermore, unlike known TCR vaccines, the polynucleotides of the present invention can encode the entire T cell receptor, and the constituent chains of the T cell receptor encoded by these polynucleotides are preferably in vivo Refolds into their dimeric sequences.
[0053]
The polynucleotides of the present invention are introduced into cells in vitro or in vivo, for example, by transfection or by coating the polynucleotides on particles and administering the coated particles to the cells. be able to. Alternatively, the polynucleotides of the invention may be in particulate (eg, powder) form, as discussed in more detail below and in the disclosure of WO 98/10750, which is incorporated herein by reference. Can be provided.
[0054]
Advantages of the present invention include, but are not limited to, (i) in vivo production of an immunogenic TCR at or near the site of the disease; (ii) correctly folded T cells in vitro Elimination of the need to produce large quantities of the receptor; (ii) increased immunogenicity by administering a polynucleotide encoding a larger protein that is more immunogenic than the smaller protein; (iii) cell-mediated immunity Improved response consistency; (iv) T cell receptor mediated diseases, such as induction of pathways normally involved in autoimmune disorders and (v) treatment of T cell mediated diseases by vaccination against overexpressed T cell types. included.
[0055]
T Cell receptor mediated disease
The compositions and methods described herein are useful in treating a wide variety of T cell receptor mediated diseases, eg, autoimmune disorders. Autoimmune disorders are characterized by a cytotoxic immune response to epitopes on self-antigens naturally found in affected individuals. The individual's immune system activates an inflammatory cascade directed at cells and tissues that present those particular self-antigens. Destruction of antigens, tissues, cell types, or organs attacked by an individual's own immune system results in disease symptoms.
[0056]
Clinically important autoimmune disorders include, for example, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, juvenile diabetes, systemic lupus erythematosus, autoimmune uveitis retinitis, autoimmune vasculitis, bullous pemphigoid, myasthenia gravis Disease, autoimmune thyroiditis, namely Hashimoto's disease, Sjogren's syndrome, granulomatous orchitis, autoimmune ovitis, Crohn's disease, sarcoidosis, rheumatic carditis, ankylosing spondylitis, Graves' disease, and autoimmune thrombocytopenic purpura Disease is included. For example, Paul, W.M. E. FIG. (1993) "Fundamental Immunology", 3rd edition, Raven Press, New York, Chapter 30, pp. 1033-1097; and Cohen et al. (1994) See "Autoimmune Disease Models", A Guidebook, Academic Press, 1994.
[0057]
Autoimmune disorders are typically associated with increased abundance of specific TCRs. Accordingly, the pathological condition to be treated determines the choice of TCR sequence used in the compositions and methods described herein. The identification of TCRs associated with inflammatory diseases allows for the use of treatments that inhibit the pro-inflammatory response of T cells with such specific TCRs. Identification of other specific TCRs that are preferentially expressed in any given autoimmune disorder (eg, the entire TCR or a variable region such as a CDR2 region) can be determined using methods known in the art, for example, by sequence analysis. Alternatively, it is clear from the teachings herein that it can be performed by single-stranded conformation polymorphism (SSCP). (See, for example, Yamamoto et al. (1992) Int. Immunol. 4: 1219; Yamamoto et al (1996) Hum. Immunol. 48:23). Other methods of identifying a TCR include in vitro antigen-based assays that determine the variable region conformation of T cells that respond to a test antigen. These assays can utilize whole antigens or selected immunodominant peptides using methods known in the art.
[0058]
It will also be apparent from the teachings herein that various tissues can be used to identify the relevant TCR, depending on the particular disease. For neurological disorders such as MS, cerebral plaque or cerebrospinal fluid can be used as a source of T cells. Similarly, for myasthenia gravis, T cells responsive to muscle, thymic tissue or acetylcholine receptors can be used. For rheumatoid arthritis, synovial fluid can be used.
[0059]
In addition, many specific TCRs that are overexpressed in autoimmune disorders have been identified previously. For example, TCR specific for human heat shock protein 60 and / or type II collagen (CII) appears to be overexpressed in subjects suffering from rheumatoid arthritis. Rheumatoid arthritis is an inflammatory autoimmune disorder that affects multiple systems but primarily affects multiple joints. The disease involves inflammation of the synovium and other joint structures, muscle atrophy, bone erosion and coarsening, and the formation of pannus (an vascular connective tissue inflammatory membrane) on joint surfaces. Rheumatoid arthritis is generally very painful and often severely debilitating.
[0060]
Similarly, T cells responsive to myelin basic protein (MBP) and proteolipid protein (PLP) have been found in cerebrospinal fluid and blood of patients with multiple sclerosis. MS is a chronic central nervous system disease and the most common demyelinating disorder of the brain and spinal cord. Martin et al. , "Immunological Aspects of Demyelinating Diseases", Ann. Rev .. Immunol. 10: 153-187 (1992). T cell lines obtained from patients with multiple sclerosis recognize the HLA-DR2 restricted epitope at residues 84-106 (Ota et al., Nature 346: 183-187 (1989)). In addition, Martin et al. , J. et al. Exp. Med. 173: 19 (1991) identified an epitope at residues 87-106 recognized by multiple sclerosis T cells.
[0061]
Certain T cell receptors also appear to be overexpressed in diabetic patients. In vitro proliferation of T cells from diabetic patients appears to be stimulated by a 38 kD beta cell granule protein (Roep et al. (L990) Nature 345: 632-634). In addition, there is some evidence that T cells in diabetic patients can recognize insulin as an autoantigen. (McInerney et al. Diabetes Res Clin Pract. (2000) Mar; 47 (3): 151-68).
[0062]
Thus, it appears that there is a greater number of one or more specific TCRs in a particular disease. Identification of these TCRs allows for the design of anti-TCR nucleic acid (eg, DNA) vaccines and methods of treating a variety of T cell mediated diseases.
[0063]
Polynucleotide
The polynucleotides of the present invention comprise the coding sequence of a whole TCR molecule or a fragment thereof, especially a fragment of the variable region. Preferably, the sequence is sufficient to induce an inhibitory, cross-reactive immune response to T cells that present (encode) the native TCR upon administration. These polynucleotides can be formulated to include one or more TCR molecules or fragments thereof. Thus, the polynucleotides of the present invention will, in some cases, contain multiple TCR coding sequences, each of which recognizes the same epitope, different epitopes, or different epitope-MHC combinations. It would be desirable.
[0064]
The nucleotide sequence selected for use in the present invention can be obtained from known sources, for example, by isolating it from cells containing the desired gene or nucleotide sequence using standard techniques. Similarly, nucleotide sequences can be produced synthetically using standard polynucleotide synthesis techniques well known in the art. See, eg, Edge et al. (1981) Nature 292: 756-762; Nambair et al. (1994) Science 223. : 1299-1301; Jay et al. (1984) J.C. Biol. Chem. 259: 6311-6317. In general, synthetic oligonucleotides are described in Edge et al. And Duckworth et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: 1691-1706, or the phosphotriester method described by Beaucage et al. (1981) Tet. Letts. 22: 1859, and Matteucci et al. (1981) Am. Chem. Soc. 103: 3185 can be produced by any of the phosphoramidite methods. Synthetic oligonucleotides can also be produced using commercially available automated oligonucleotide synthesizers. Thus, nucleotide sequences can be designed to have the appropriate codons for a particular amino acid sequence. In general, one will select preferred codons for expression in the intended host. A complete sequence is constructed from overlapping oligonucleotides produced by standard methods and assembled into a complete coding sequence. See, for example, Edge et al., Supra; Nambair et al., Supra, and Jay et al., Supra.
[0065]
Another method for obtaining the nucleic acid sequences used herein is by recombinant means. That is, the desired nucleotide sequence can be excised from the plasmid carrying it using standard restriction enzymes and procedures. Site-specific DNA cleavage is accomplished by treating with appropriate restriction enzymes under conditions generally specified in the art, certain of which are specified by the manufacturers of commercially available restriction enzymes. ,carry out. If desired, size separation of the cleaved fragments can be performed by polyacrylamide gel or agarose gel electrophoresis using standard techniques.
[0066]
Restriction cleavage fragments can be blunted by treatment with E. coli DNA polymerase I (Klenow) large fragments using standard techniques in the presence of four deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). it can. This Klenow fragment digests the overhanging 3 'single strand while filling in the 5' single stranded overhang, even if four dNTPs are present. If desired, selective repair can be achieved by providing only one or several selected dNTPs within the limits dictated by the nature of the overhang. After Klenow treatment, the mixture can be extracted with, for example, phenol / chloroform and ethanol precipitated. Treatment with S1 nuclease or BAL-31 under appropriate conditions results in hydrolysis of any single-stranded portion.
[0067]
Yet another convenient method for isolating specific nucleic acid molecules is by the polymerase chain reaction (PCR). Mullis et al. (1987) Methods Enzymol.155: 335-350. This technique uses a DNA polymerase, usually a thermostable DNA polymerase, to replicate a desired region of DNA. The region of the DNA to be replicated is identified by the oligonucleotide of the specified sequence complementary to the opposite end and the opposite strand of the desired DNA, and the replication reaction is initiated. This first replication product is itself a template for the next replication, so that repeated successive replication cycles result in a geometric amplification of the DNA fragment delimited by the primer pair used. The method also allows the convenient addition of nucleotide sequences to the ends of DNA products by incorporating those additional sequences into oligonucleotide primers (eg, PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et. al. (eds) Harcourt Brace Jovanovich Publishers, NY (1994)). The PCR conditions used for each amplification reaction are empirically determined. Several parameters determine the success of the reaction. These include annealing temperature and time, extension time, Mg^{2 +}And ATP concentration, pH, and the relative concentrations of primers, template, and deoxyribonucleotides. One example of suitable PCR conditions is found in the examples below.
[0068]
Specific TCR molecules or TCR fragment peptide sequences associated with disorders or disease states, such as autoimmune disorders, and nucleic acid sequences encoding those molecules or peptides, many of which are known in the art. In particular, suitable such peptide and nucleic acid sequences are disclosed in Howell et al., US Pat. No. 6,207,645, which is incorporated herein by reference. These and other known or readily identified sequences can be used to generate or extract the coding sequence of a TCR molecule or TCR fragment peptide used in the practice of the present invention. In addition, in some cases, altering the sequence of the encoded TCR molecule or TCR fragment peptide may be useful to increase the immunogenicity of the expression product. To this end, minor changes can be made to the coding sequence of the test molecule such that different but substantially homologous expression products (protein or peptide molecules) are produced. Accordingly, the present invention relates to polynucleotides containing a coding sequence for a TCR molecule or a TCR fragment peptide that is substantially homologous to the native TCR sequence, for example, at least about 80 to a native TCR molecule targeted over the entire length of the molecule of interest. Polynucleotides that encode molecules having ~ 85%, preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95-98% sequence identity.
[0069]
Thus, once the coding sequence for the desired TCR molecule and / or TCR peptide fragment has been prepared or isolated, such a sequence can be cloned into any suitable vector or replicon. Many cloning vectors are known to those of skill in the art, and the selection of an appropriate cloning vector is a matter of preference. Ligation to other sequences is performed using standard procedures known in the art.
[0070]
As described in detail below, the selected nucleotide sequence was placed under the control of a regulatory sequence, such as a promoter, whereby the sequence encoding the desired protein was transformed with the vector containing the expression construct. RNA can be transcribed in host tissues.
[0071]
In addition to the promoter, it may be desirable to add other regulatory sequences that allow for regulation of the expression of the protein sequence encoded by the delivered nucleotide sequence. Suitable additional regulatory sequences are known to those of skill in the art, and include those that turn on or off the expression of the coding sequence in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Other types of regulatory elements, for example, enhancer sequences, may be present in the vector.
[0072]
An expression vector is constructed, and a particular coding sequence is transcribed into a vector with the appropriate regulatory sequences, with the position and orientation of the coding sequence relative to the control sequence under "control" of the control sequence (ie, RNA The polymerase binds to the DNA molecule at the control sequence and transcribes the coding sequence. It may be desirable to alter the sequence encoding the particular protein of interest to achieve this purpose. For example, in some cases, it may be necessary to modify the sequence in order to bind the control sequence in the proper orientation, ie, to maintain the open reading frame. Prior to insertion into the vector, control and other regulatory sequences may be ligated to the coding sequence. Alternatively, the coding sequence can be cloned directly into an expression vector that already contains the control sequences and appropriate restriction sites.
[0073]
Generally, the nucleic acid molecules used in the method include a coding region with appropriate control sequences and, optionally, ancillary nucleotide sequences encoding cytokines or other immune enhancing polypeptides. The nucleic acid molecule is generally prepared in the form of a vector containing the necessary elements to direct transcription and translation in the recipient cell.
[0074]
Administration of polynucleotide
The polynucleotides and auxiliary substances described herein can be administered by any suitable method. In preferred embodiments described below, the polynucleotides of the invention are administered by coating them on core carrier particles and then administering the coated particles to a subject or cell. However, a TCR-encoding polynucleotide can also be delivered using a viral vector or using a non-viral system, such as naked nucleic acid delivery.
[0075]
Virus vector
Several virus-based systems have been used for gene delivery. For example, retroviral systems are known in which the integrated defective provirus ("helper") expresses all of the viral genes but cannot package its own genome due to the lack of a packaging signal known as the psi sequence. ) Is commonly used. Thus, this cell line produces an empty viral shell. In addition to helpers, production strains can be derived from packaging strains containing viral vectors containing sequences required at the cis position for replication and packaging of the virus known as terminal repeats (LTRs). The gene of interest can be inserted into this vector and packaged into a viral shell synthesized by a retroviral helper. The recombinant virus is then isolated and delivered to a subject (see, for example, US Pat. No. 5,219,740). Representative retroviral vectors include, but are not limited to, those described in, for example, US Pat. No. 5,219,740, which is incorporated herein by reference in its entirety. In addition, vectors such as the LHL, N2, LNSAL, LSHL and LHL2 vectors, as well as derivatives of these vectors, such as the modified N2 vectors described herein, are included. Retroviral vectors can be constructed using techniques well known in the art. See, for example, US Pat. No. 5,219,740; Mann et al. (1983) Cell 33: 153-159.
[0076]
Adenovirus-based systems have been developed for gene delivery, which are suitable for delivery of the TCR polynucleotides described herein. Human adenoviruses are double-stranded DNA viruses that enter cells by receptor-mediated endocytosis. These viruses are particularly suitable for gene transfer because they are easy to grow and manipulate, and exhibit a wide host range in vivo and in vitro. For example, adenoviruses can infect human cells of hematopoietic, lymphoid and bone marrow origin. In addition, adenovirus infects quiescent cells in addition to replicating target cells. Unlike retroviruses, which integrate into the host genome, adenoviruses remain extrachromosomal, thus minimizing the risks associated with insertional mutagenesis. This virus is easily produced at high titers and is stable and can be purified and stored. Even in a replication competent form, adenovirus produces only low levels of morbidity and is not associated with human malignancies. Accordingly, adenovirus vectors have been developed that take advantage of these advantages. For a description of adenovirus vectors and their uses, see, eg, Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Am. Virol.57: 267-274; Bett et al. (1993) Virol. 67: 5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al. (1994) J. Am. Virol, 68: 933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, K. et al. L. (1988) BioTechniques 6: 616-629; Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476.
[0077]
Adeno-associated virus vectors (AAV) can also be used for administering the polynucleotides described herein. AAV vectors can be derived from any AAV serotype, including but not limited to AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, and the like. An AAV vector has one or more AAV wild-type genes, preferably rep and / or cap genes, that are totally or partially deleted, but have one or more functional flanking inverted terminal repeats (ITRs). It may hold an array. Functional ITR sequences are generally thought to be required for AAV virion rescue, replication and packaging. Thus, AAV vectors include at least those sequences (eg, functional ITRs) at the cis position for viral replication and packaging. The ITR need not be a wild-type nucleotide sequence; as long as the sequence provides for functional rescue, replication and packaging, the ITR may be altered, for example, by insertion, deletion or substitution of nucleotides.
[0078]
An AAV expression vector is constructed using known techniques to provide at least control elements including a transcription initiation region, a target DNA, and a transcription termination region as components operably linked in the direction of transcription. . These control elements are selected to be functional in mammalian cells. The resulting construct, comprising the operably linked components, is linked (at the 5 'and 3') functional AAV ITR sequences. Suitable AAV constructs can be designed using techniques well known in the art. For example, US Patent Nos. 5,173,414 and 5,139,941; International Publications WO 92/01070 (published January 23, 1992) and WO 93/03769 (published March 4, 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. et al. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N.M. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R .; M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; and Zhou et al. (1994) J. Am. Exp. Med. 179: 1867-1875.
[0079]
Adjuvant
In some embodiments, the invention is used effectively with any suitable adjuvant or adjuvant combination. For example, suitable adjuvants include, but are not limited to, adjuvants formed from aluminum salts (alum), such as aluminum hydroxide, aluminum phosphate, aluminum sulfate, and the like; oil-in-water and water-in-oil emulsions Formulations, such as complete Freund's adjuvant (CFA) and incomplete Freund's adjuvant (IFA); adjuvants formed from bacterial cell wall components, such as adjuvants containing lipopolysaccharide (eg, lipid A or monophosphoryl lipid A (MPL); Imoto et al. (1985) Tet. Lett.26Trehalose dimycolate (TDM), and cell wall skeleton (CWS); heat shock proteins or their derivatives; diphtheria toxin (DT), pertussis toxin (PT), cholera toxin (CT), E. coli heat instability Toxins (LT1 and LT2), Pseudomonas endotoxin A, Pseudomonas exotoxin S, B. cereus extracellular enzyme, B. sphaericus toxin, Clostridium -In addition to C. botulinum C2 and C3 toxins, C. limosum extracellular enzymes, C. perfringens, Clostridium perfringens, Toridiumu-Spyri forma toxins from (C. spiriforma) and Christo Liddy Umm difficile (C. difficile), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) EDIN, CRM₁₉₇ADP-ribosylating bacterial toxins, including non-toxic diphtheria toxin variants, such as ADP-ribosylating bacterial toxins (eg, Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 175; and Constantino et al. (1992) Vaccine); Saponin adjuvants, such as Quil A (US Pat. No. 5,057,540), or particles produced from saponins, such as ISCOMs (immunostimulatory complexes); chemokines and cytokines For example, interleukins (eg, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, etc.), interferons (eg, γ-interferon), Macrophage colony stimulating factor (M-CSF), Tumor necrosis factor (TNF), defensin 1 or 2; RANTES, MIP1-α, and MIP-2 and the like; muramyl peptides such as N-acetyl-muramil-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP); N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamyl-L-alanine-2- (1′-2′-dipalmitoyl -Sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -ethylamine (MIP-PE) and the like; adjuvants derived from CpG family molecules, CpG dinucleotides, and synthetic oligonucleotides containing CpG motifs (eg, Krieg et al. Nature). (1995) 374: 546, Medz. (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: 4-9 and Davis et al. J. Immunol. (1998) 160: 870-876), for example, TCC ATG ACG TCG CTC ATG CT ( SEQ ID NO: 1) and ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC (SEQ ID NO: 2); and synthetic adjuvants such as PCPP (poly [di (carboxylatophenoxy) phosphazene) (Payne et al. Vaccines (1998)).16: 92-98). Such adjuvants are available from several commercial sources, for example, Accurate Chemicals; Rabi Immunochemicals, Hamilton, MT; GIBCO; Sigma, St. Commercially available from Louis, MO.
[0080]
Adjuvants may be delivered individually or in a combination of two or more adjuvants. In this regard, the combined adjuvant has an additive or synergistic effect in promoting an immune response. A synergistic effect is that the results achieved by combining two or more adjuvants are greater than would be expected by simply adding the results achieved by each adjuvant when administered separately.
[0081]
Normal pharmaceutical preparation
Formulation of preparations containing the polynucleotides of the invention, with or without the addition of adjuvant components, uses standard pharmaceutical formulation chemistry and methodology, all of which are readily available to those skilled in the art. Can be done. For example, a liquid preparation can be obtained by combining a composition comprising one or more nucleic acid molecules (eg, a plasmid containing a TCR coding sequence) with one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles.
[0082]
Auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering substances and the like can be present in excipients or vehicles. These excipients, vehicles and auxiliary substances are generally pharmaceutical substances which do not induce an immune response in the individual receiving the composition and which can be administered without undue toxicity. Pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, liquids such as, for example, water, saline, polyethylene glycol, hyaluronic acid, glycerol and ethanol. Pharmaceutically acceptable salts include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, phosphate, sulfate and the like; and acetate, propionate, malonate, benzoate And the like may be contained. Although not required, it is also preferred that the preparation include a pharmaceutically acceptable excipient that acts as a stabilizing agent for the vaccine composition, particularly if molecules such as peptides, proteins, etc. are to be included. Examples of suitable carriers that also act as peptide stabilizers include, without limitation, pharmaceutical grade dextrose, sucrose, lactose, trehalose, mannitol, sorbitol, inositol, dextran, and the like. Other suitable carriers include, but are not limited to, starch, cellulose, sodium or calcium phosphate, citric acid, tartaric acid, glycine, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), and combinations thereof. A detailed discussion of pharmaceutically acceptable excipients, vehicles and auxiliary substances is provided in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ 1991), which is incorporated herein by reference. ).
[0083]
Certain substances that promote uptake and / or expression of nucleic acids ("transfection facilitating agents"), for example facilitating substances such as bupivacaine, cardiotoxin and sucrose, and liposomes or lipid preparations conventionally used for delivery of nucleic acid molecules A transfection facilitating vehicle such as can also be included in the composition. Anionic and neutral liposomes are widely available and known for the delivery of nucleic acid molecules (see, for example, Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Press). Cationic lipid preparations are also well-known vehicles for use in delivering nucleic acid molecules. Suitable lipid preparations include Lipofectin^TM(N- [1- (2,3-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride) and DOTAP (1,2-bis (oleyloxy)- 3- (trimethylammonio) propane). See, for example, Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84: 7413-7416; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081; U.S. Patent Nos. 5,283,185 and 5,527,928, and International Publications WO 90/11092, WO 91/15501 and WO 95/26356. These cationic lipids are preferably used together with neutral lipids, for example, DOPE (dioleyl phosphatidylethanolamine). Additional transfection-enhancing compositions that can be added to the lipid or liposome preparation include spermine derivatives (see, for example, International Publication WO 93/18759) and membrane-permeable compounds such as GALA, gramicidin S and cationic bile. Acid salts (see, for example, International Publication WO 93/19768).
[0084]
Alternatively, the nucleic acid molecules of the present invention can be encapsulated in, adsorbed to, or bound to a particulate carrier. Suitable particulate carriers include those derived from polymethyl methacrylate polymers, as well as PLG microparticles derived from polylactide and poly (lactide-co-glycolide). See, for example, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10: 362-368. Conjugates of these molecules can also be used in addition to other particle systems and polymers, for example, polymers such as polylysine, polyarginine, polyornithine, spermine, spermidine.
[0085]
Accordingly, formulated vaccine compositions typically include a polynucleotide containing a sequence encoding a TCR molecule of interest in an amount sufficient to enhance an immunological response. An appropriate effective amount can be readily determined by one skilled in the art. Such amounts fall within a relatively broad range that can be determined by routine tests. For example, an immune response has been obtained using as little as 1 μg of DNA, but up to 2 mg of DNA has been used in other administrations. Effective doses of polynucleotides containing genomic fragments are generally considered to be in the range of about 10 μg to 1000 μg, but doses above and below this range may be found to be effective. Thus, these compositions can include from about 0.1% to about 99.9% of the polynucleotide molecules.
[0086]
Administration of normal pharmaceutical preparations
Administration of the pharmaceutical preparations can be accomplished in one dose, continuously or intermittently throughout the course of treatment. Delivery will most typically be by conventional needles and syringes for liquid suspensions containing liquid and particulate compositions. In addition, various liquid jet injectors are known in the art and can be used to administer the compositions of the present invention. Methods for determining the most effective means of administration and dosage are known to those of skill in the art, and will vary depending on the delivery vehicle, therapeutic composition, target cells, and the subject being treated. Single and multiple administrations can be carried out with the dose level and pattern being selected by the attending physician. It should be understood that the delivered polynucleotide construct can carry more than one TCR sequence. Alternatively, separate constructs, each expressing one or more TCR molecules, can be delivered to a subject as described herein.
[0087]
It is further contemplated that the polynucleotides delivered by the methods of the present invention may be combined with other suitable compositions and treatments. For example, to enhance the immune response in a subject, the compositions and methods described herein can further include auxiliary substances (eg, adjuvants), for example, pharmacological agents, cytokines, and the like. The auxiliary substance can be administered, for example, as a protein or other macromolecule, concurrently with, prior to, or subsequent to the administration of the nucleic acid vaccines described herein. The nucleic acid molecule compositions can also be administered directly to a subject using methods known to those skilled in the art, or alternatively, can be delivered ex vivo to cells derived from the subject.
[0088]
particle
In one embodiment, the core carrier particles are used to deliver a polynucleotide (eg, a DNA vaccine) and / or an adjuvant. Particle-mediated methods for delivering such nucleic acid preparations are known in the art. Thus, once prepared and appropriately purified, the nucleic acid molecules can be coated onto core carrier particles (eg, a core carrier) using various techniques known in the art. The core carrier is selected from materials having a suitable density in the range of particle sizes typically used for intracellular delivery from a suitable particle-mediated delivery device. The optimal carrier particle size will, of course, depend on the diameter of the target cell.
[0089]
For the purposes of the present invention, tungsten, gold, platinum and iridium carrier particles can be used. Tungsten and gold particles are preferred. Tungsten particles are readily available in average sizes of 0.5-2.0 μm in diameter. While such particles have optimal density for use in particle accelerated delivery methods and allow for highly efficient coating with DNA, tungsten is potentially toxic to certain cell types. possible. Gold particles or microcrystalline gold (eg, gold powder A1570 available from Engelhard Corp., East Newark, NJ) will also find use in the methods of the present invention. Gold particles provide size uniformity (available in particle sizes of 1-3 μm from Alpha Chemicals or in a range of particle sizes including 0.95 μm from Degussa, South Plainfield, NJ) and reduced toxicity.
[0090]
Numerous methods are known and described for coating or precipitating DNA or RNA on gold or tungsten particles. Most such methods generally involve the pre-determination of gold or tungsten in a plasmid DNA, CaCl₂And combined with spermidine. The resulting solution is continuously stirred during the coating procedure to ensure uniformity of the reaction mixture. After precipitation of the nucleic acids, transferring the coated particles to a suitable membrane and drying before use, coating on the surface of a sample module or cassette for use in a particle delivery device, or filling in a delivery cassette Can be.
[0091]
Peptide adjuvants (eg, cytokines) can also be coated on a suitable core carrier, eg, gold or tungsten. For example, the peptide can be prepared by simply mixing the two components in an empirically determined ratio, by ammonium sulfate precipitation or other solvent precipitation methods familiar to those skilled in the art, or by chemical coupling of the peptide to carrier particles. It can be attached to a core carrier. The coupling of L-cysteine residues to gold has been described previously (Brown et al., Chemical Society Reviews 9: 271-311 (1980)). Other methods include, for example, dissolving the peptide antigen in absolute ethanol, water, or an alcohol / water mixture, adding the solution to an amount of carrier particles, and then drying the mixture under a stream of air or nitrogen while stirring. That is included. Alternatively, the peptide antigen can be dried on the core carrier by centrifugation under vacuum. Once dried, the coated particles can be resuspended in a suitable solvent (eg, ethyl acetate or acetone) and ground (eg, by sonication) to obtain a substantially uniform suspension. .
[0092]
Dosing of coated particles
After their formation, core carrier particles coated with a polynucleotide of the invention and optionally containing an adjuvant are delivered to the subject using a transdermal injection (eg, peptide-mediated delivery) technique.
[0093]
Various particle delivery devices suitable for transdermal infusion delivery are known in the art, all of which are suitable for use in the practice of the present invention. Current device designs use explosive, electrical or outgassing to propel the coated carrier particles toward target cells. The coated core carrier particles detachably adhere themselves to the movable carrier sheet or are removed by a surface along which airflow passes, lifting the particles off the surface and propelling them toward the target. It can be attached as much as possible. One example of a gas release device is described in U.S. Pat. No. 5,204,253. Explosive devices are described in U.S. Pat. No. 4,945,050. One example of an electron emission particle accelerator is described in U.S. Pat. No. 5,120,657. Another suitable electrical emission device for use herein is described in U.S. Patent No. 5,149,655. The disclosures of all of these patents are incorporated herein by reference in their entirety.
[0094]
These coated particles are administered to the subject to be treated in a manner compatible with the dosage formulation, and in an amount that will be effective to induce the desired immune response. In the case of nucleic acid molecules it is generally in the range of 0.001 to 100.0 μg, more typically 0.01 to 10.0 μg of nucleic acid molecule per dose, 1 μg to 5 mg for peptide or protein molecules, The amount of composition to be delivered, more typically between 1 and 50 μg of peptide, will depend on the subject to be treated. The exact amount required will vary depending on the age and general condition of the immunized individual and the particular nucleotide sequence or peptide selected, as well as other factors. An appropriate effective amount can be readily determined by one of ordinary skill in the art upon reading this specification.
[0095]
Thus, an effective amount of a polynucleotide is an amount sufficient to induce an appropriate immune response in the immunized subject, and will fall within a relatively broad range that can be determined by routine trial. Preferably, the coated particles are delivered to appropriate recipient cells to induce an immune response (eg, T cell activation) in the subject to be treated.
[0096]
Particulate composition
Alternatively, a polynucleotide encoding the selected TCR of interest can be formulated as a solid, particulate pharmaceutical composition. More particularly, the formulation of particles containing nucleic acid molecules carrying a TCR sequence of interest is performed using standard pharmaceutical formulation chemistry and methodology, all of which are readily available to reasonably skilled technicians. be able to. For example, a nucleic acid molecule can be combined with one or more pharmaceutically acceptable excipients or vehicles to provide a vaccine composition. Auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering substances and the like can be present in excipients or vehicles. These excipients, vehicles and auxiliary substances are generally medicaments that do not themselves induce an immune response in the individual receiving the composition and that can be administered without undue toxicity.
[0097]
Pharmaceutically acceptable excipients include, but are not limited to, liquids such as water, saline, polyethylene glycol, hyaluronic acid, glycerol and ethanol. Pharmaceutically acceptable salts include, for example, mineral salts such as hydrochlorides, hydrobromides, phosphates, sulfates and the like; and acetates, propionates, malonates, benzoates And salts of organic acids such as It is also preferred, but not essential, that the composition can include a pharmaceutically acceptable carrier that functions as a stabilizer, especially for peptides, proteins or any other agents. Examples of suitable carriers that also act as stabilizers for the peptide include, but are not limited to, pharmaceutical grade dextrose, sucrose, lactose, trehalose, mannitol, sorbitol, inositol, dextran and the like. Other suitable carriers include, but are not limited to, starch, cellulose, sodium or calcium phosphate, citric acid, tartaric acid, glycine, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), and combinations thereof. . For a detailed discussion of pharmaceutically acceptable excipients, carriers, stabilizers and other auxiliary substances, see REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., NJ 1991), which is incorporated by reference. (Incorporated herein).
[0098]
The formulated composition will include an amount of a polynucleotide encoding a TCR molecule of interest in an amount sufficient to induce an immunological response, as defined above. An appropriate effective amount can be readily determined by one skilled in the art. Such amounts will fall within a relatively broad range, generally from about 0.1 μg to 25 mg or more of the TCR-encoding polynucleotide, and specific suitable amounts will be determined by routine trial. be able to. These compositions can include from about 0.1% to about 99.9% polynucleotide. If an adjuvant is included in the composition, or if these methods are used to provide a particulate adjuvant composition, the adjuvant will be present in the appropriate amounts described above. Then, using standard techniques, for example, simple evaporation (air drying), vacuum drying, spray drying, freeze drying (lyophilization), spray-freeze drying, spray coating, precipitation, supercritical The composition is prepared as particles by liquid particle formation or the like. If desired, the density of the resulting particles can be increased using the techniques described in commonly owned WO 97/48485, which is incorporated herein by reference. it can.
[0099]
Single-dose or multi-dose containers, in which the particles can be packaged prior to use, contain a suitable amount of particles (eg, a TCR vaccine composition) containing the TCR-encoding polynucleotide and / or the selected adjuvant. A sealed container for enclosing can be included. The particulate composition can be packaged as a sterile formulation, so that the sealed container can be designed so that the formulation remains sterile until used in the method of the invention. If desired, the container can be adapted for direct use in a particle delivery device. Such containers may take the form of capsules, foil pouches, sachets, cassettes, and the like. Suitable particle delivery devices are described herein above.
[0100]
The container in which the particles are packaged may be further labeled to identify the composition and provide relevant dosing information. In addition, the container may be labeled with a notice in a form prescribed by a governmental agency, for example, the Food and Drug Administration, and the notice is housed therein for administration to humans by that agency under federal law. Certifies the manufacture, use or sale of an antigen, adjuvant (or vaccine composition).
[0101]
The particulate composition (including the TCR polynucleotide and / or the selected adjuvant) can then be administered using a transdermal injection technique. Preferably, the particulate composition is delivered by a powder injection method, such as commonly owned WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513, and WO 96 /. No. 20022, all of which are incorporated herein by reference, will be delivered from a needleless syringe system.
[0102]
Delivery of particles from such devices is typically performed with particles having an approximate size generally in the range of 0.1-250 μm, preferably in the range of about 10-70 μm. Particles larger than about 250 μm can also be delivered from those devices, the upper limit being that particles of that size will cause unwanted damage to skin cells. The actual distance that the delivered particles will penetrate the target surface is the particle size (e.g., the nominal particle diameter assuming a rough spherical particle geometry), the particle density, the initial velocity at which the particles impact the surface, As well as the density and kinematic velocity of the targeted skin tissue. In this regard, the optimal particle density for use in needleless injection is generally about 0.1-25 g / cm³, Preferably about 0.9-1.5 g / cm³And the injection speed is generally in the range of about 100 to 3,000 m / sec or more. At a suitable pressure, particles having an average diameter of 10 to 70 μm can be accelerated through the nozzle at a speed comparable to the supersonic speed of the driving airflow.
[0103]
If desired, these particle delivery devices can be provided pre-filled with a suitable dose of particles containing the antigen of interest and / or the selected adjuvant. The filled device can be packaged in a closed container and further labeled thereon, as described above.
[0104]
Thus, the method can be used to provide a size in the range of about 10 to about 250 μm, preferably about 10 to about 150 μm, and most preferably about 20 to about 60 μm;³And a particle density in the range of about 0.5 to about 3.0 g / cm.³Alternatively, it can be used to obtain a particulate medicament ("powder") comprising particles having a bulk density greater than or equal to. The term "powder" as used herein refers to a composition consisting of substantially solid particles that can be delivered to a vertebrate subject by a transdermal injection technique, for example, using a needleless syringe device. Point. The particles that make up the powder include, but are not limited to, average particle size, average particle density, particle morphology (eg, aerodynamic shape of the particles and surface characteristics of the particles), and particle penetration energy (PE). It can be characterized based on a number of non-specific parameters. Particle size, particle density and morphology are selected such that the solid particulate pharmaceutical composition is a powder suitable for transdermal injection. In addition, the particles making up the particulate medicament of the present invention should exhibit a baseline penetration energy suitable for powders delivered by transdermal injection techniques.
[0105]
The average particle size of the powder may vary widely and will generally range from about 0.1 to about 250 μm, for example from about 10 to about 100 μm, more typically from about 20 to about 70 μm. However, it is preferred that the powder comprises particles of substantially uniform average particle size. In this regard, the average particle size of the powder is determined by conventional techniques such as microscopy (particles are individually sized rather than directly and statistically grouped), gas adsorption, transmittance, light obscuration It can be measured as mass-average aerodynamic diameter (MMAD) using the time of flight or flight time. If desired, an automated particle size counter can be used to ascertain the average particle size (eg, Aerosizer, Coulter Counter, HIAC Counter, or Gelman Automatic Particle Counter).
[0106]
The solid particulate pharmaceutical composition (pharmaceutical) of the present invention preferably comprises particles having a size suitable for high speed transdermal injection into a subject, typically across the stratum corneum or transmucosal membrane. Powder. Thus, while the mean mass aerodynamic diameter (MMAD) of these particles will range from about 0.1 to about 250 μm, in practice the MMAD will be from about 10 to about 100 μm, preferably from about 10 to about 70 μm Or about 20 to about 70 μm. In general, these particles have a very narrow size distribution, with less than 10% by weight of the particles having a diameter outside the 5 μg +/− range of the MMAD, ie, less than 10% of the particles are less than the MMAD. It will have a diameter that is at least 5 μm above or at least 5 μm below the MMAD. Preferably, no more than 5% by weight of the particles have a diameter that exceeds the MMAD by more than 5 μm. Also preferably, less than 5% by weight of the particles have a diameter less than 5 μm below the MMAD.
[0107]
The actual particle density, that is, the “absolute density” can be easily confirmed using a known quantitative technique, for example, helium pycnometry. Alternatively, an envelope ("tap" or "bulk") density measurement can be used to assess the density of the powder according to the invention. The envelope density of the powder produced according to the invention is generally between 0.5 and 25 g / cm.³, Preferably 0.8 to 1.5 g / cm³It is.
[0108]
Envelope density information is particularly useful in characterizing the density of objects having irregular sizes and shapes. The envelope density is its mass divided by the volume of the object, which includes that of its pores and cavities, but excludes interstitial spaces. Numerous methods for determining envelope density are known in the art, including wax dipping, mercury displacement, water absorption and apparent density techniques. Many suitable devices, such as Micromeritics Instrument Corp. GeoPyc available from^TM Model 1360 can also be used to determine envelope density. The difference between the absolute density and the envelope density of a sample pharmaceutical composition provides information about the total void percentage and specific pore volume of the sample.
[0109]
The morphology of the particles, especially the aerodynamic shape of the particles, can be easily evaluated using a standard optical microscope. The particles making up the powder preferably have a substantially spherical or at least a substantially elliptical aerodynamic shape. It is also preferred that these particles have an axial ratio of 3 or less to avoid the presence of rod or needle particles. These same microscopic techniques can also be used to evaluate particle surface characteristics, such as the amount and degree of surface porosity or the degree of porosity.
[0110]
Therefore, the solid particulate pharmaceutical composition of the present invention has a concentration of about 0.1 to 2.5 g / cm.³, Preferably from about 0.8 to about 1.5 g / cm³It is preferred that the powder comprises particles having an envelope density in the range of When viewed under a microscope, the shape of the individual particles may vary, but the particles are preferably substantially spherical. The average aspect ratio (the ratio of the major axis to the minor axis) is typically 3: 1 to 1: 1, for example, 2: 1 to 1: 1. Most preferably, the aspect ratio is 1: 1 and thus the particles are substantially spherical.
[0111]
The particle penetration energy can be determined by a number of conventional techniques, for example, metallization E. FIG. It can be confirmed using a test. Metallized film material (eg, a 125 μm polyester film with a 350 ° layer of aluminum deposited on one side) was powdered into a needleless syringe (eg, US Pat. No. 5,630,796 issued to Bellhouse et al.). It is used as a substrate to be driven at an initial speed of about 100 to 3000 m / sec from the described needleless syringe). The metallized film is placed on a suitable surface with the metal coating side facing up.
[0112]
A needleless syringe filled with powder is fired after the spacer is placed in contact with the membrane. The remaining powder is removed from the metallized film surface using a suitable solvent. The penetration energy was then evaluated using a BioRad Model GS-700 image densitometer for scanning the metallized film, equipped with a SCSI interface, and with MultiAnalyst software (BioRad) and Matlab software (Release 5.1, The MathWorks, Inc.). Evaluate the densitometer reading using a personal computer loaded with). A program is used to process densitometer scans made using either the densitometer transmittance or reflectance method. The penetration energy of the spray-coated powder must be equal to or better than reprocessed mannitol particles of the same size (commonly owned WO 97/48485, which is hereby incorporated by reference). Mannitol particles lyophilized, compressed, milled and sieved according to the method of (incorporated herein)).
[0113]
Administration of the particulate composition
Following their formation, the particulate compositions (eg, powders) can be delivered transdermally to tissues of a vertebrate subject using a suitable transdermal injection technique. A variety of particle delivery devices suitable for transdermal delivery of a substance of interest are known in the art and will find use in the practice of the present invention. A particularly preferred particle delivery technique uses a needleless syringe to drive solid drug-containing particles at a controlled dose into and through intact skin and tissue. See, for example, U.S. Patent No. 5,630,796 to Bellhouse et al. Describing a needleless syringe (also known as "the PowerJect (R) needless syringe device"). Other needleless syringe configurations are known in the art and are described herein.
[0114]
A composition containing a therapeutically effective amount of a powdered molecule described herein can be delivered to any suitable target tissue by the particle delivery devices described above. For example, these compositions include muscle, skin, brain, lung, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, intestine, testis, ovary, uterus, rectum, nerve. It can be delivered to systems, eyes, glands and connective tissues. For nucleic acid molecules, the delivery is preferably to terminally differentiated cells and the molecules are expressed there; however, these molecules may also be undifferentiated or partially differentiated cells, such as blood. Can also be delivered to human stem cells and dermal fibroblasts.
[0115]
The powdered composition is administered to the subject to be treated in a manner compatible with the dosage formulation, and in such amount as will be prophylactically and / or therapeutically effective. The amount of composition to be delivered generally ranges from 0.5 μg / kg to 100 μg / kg of nucleic acid molecule per dose, depending on the subject to be treated. The dosage of other medicaments, such as physiologically active peptides and proteins, generally ranges from about 0.1 μg to about 20 mg, preferably from 10 μg to about 3 mg. The exact amount required will vary depending on the age and general condition of the individual to be treated, the severity of the condition to be treated, the particular preparation being delivered, the site of administration and other factors. . An appropriate effective amount can be readily determined by one skilled in the art.
[0116]
Accordingly, a "therapeutically effective amount" of a particulate composition of the present invention is sufficient to effect treatment or prevention of a disease or condition symptom, and can be determined by routine trials Would be in range.
[0117]
The following is an example of a specific embodiment for carrying out the present invention. These examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
[0118]
Example
Efforts have been made to ensure accuracy with respect to numbers used (eg, amounts, temperature, etc.), but some experimental error and deviation should, of course, be allowed for.
[0119]
Example 1 :all TCR Or TCR Nucleic acid immunization using polynucleotides encoding fragments
To assess the specificity and efficacy of nucleic acid immunization using TCR-encoding polynucleotides, the following studies are performed.
[0120]
TCRs that are overexpressed or more prevalent in autoimmune disorders are identified. Constructs encoding variable region fragments (eg, CDR-2 regions) that specifically recognize the entire TCR or myelin basic protein (BP) or type II collagen are generated. These constructs are described in Eisenbraun et al. (1993) DNA Cell Biol. 12: 791-797, and coated on 1-3 μm gold particles (Degussa Corp., South Plainfield, NJ). Briefly, DNA is attached to gold particles by adding 1-3 micron gold powder (Degussa) and an appropriate amount of polynucleotide (eg, 2 μg / mg gold powder) to a centrifuge tube containing spermidine. It is done by doing. CaCl while stirring₂Is added dropwise to co-precipitate the polynucleotide and gold, after which the precipitate is allowed to settle for several minutes. The gold / DNA precipitate is concentrated by centrifugation in a microcentrifuge, washed with absolute ethanol and resuspended in an appropriate amount of ethanol and polyvinylpyrrolidone (PVP). Next, the suspension is transferred to a glass vial, which is capped and immersed in an ultrasonic water bath to separate clumps. Subsequently, the ethanol solution is injected into a Tefzel® tube and the gold / DNA is attached to the side of the tube using centrifugal force. Thereafter, the remaining ethanol is vented using a small, controlled nitrogen gas flow. Next, after the tube is dried with a nitrogen gas flow, it is cut into a cartridge. The cartridges are stored at 4 ° C. with desiccant in a tightly capped glass scintillation vial until used in a PowderJect® XP Particle Delivery Device. The helium pulse PowderJect® XP particle interposer has been described previously (see US Pat. No. 5,584,807) and is available from PowderJect Vaccines, Madison, Wis. In this vaccination, each cartridge nominally contains 0.5 mg of gold particles coated with 1 μg of plasmid DNA.
[0121]
Animals showing symptoms of a targeted autoimmune disease (eg, multiple sclerosis for BP-specific TCR, and rheumatoid arthritis for CII-specific TCR) can be delivered from a PowderJect® XP particle delivery device to a polynucleotide delivered from Immunization by particle-mediated delivery using a single shot of gold beads coated with. Four weeks after the first immunization, the animals are boosted. Serum is collected at the time of boosting (4 weeks) and 2 weeks later (6 weeks).
[0122]
Example 2 :all TCR Molecule or TCR Characterization and evaluation of particulate pharmaceuticals containing polynucleotides encoding fragment peptides
Evaluation of effects on artificial membrane targets
Functional tests that measure many aspects of a powder injection system simultaneously are called "metallized films" or "penetration energy" (PE) tests. This is based on a quantitative assessment of the damage that a particle can cause to a precision thin metal layer supported by a plastic film substrate. Damage correlates to the kinetic energy of the particles and other specific characteristics. The higher the response from this test (ie, the greater the damage / destruction of the membrane), the more energy the device applies to the particles. Either measuring changes in electrical resistance or measuring image density in reflectance or transmittance mode provides a reliable way to evaluate device or formulation performance in a controllable and reproducible test.
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The membrane test bed has been shown to be sensitive to gas delivery variations in all key device parameters including pressure, dose, particle size distribution and materials, etc., and insensitive to gases. Currently, about 350 Angstroms thick aluminum on a 125 μm polyester support is used in test equipment operating at up to 60 bar.
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Evaluation of impact effects on engineering foam targets
Another means of evaluating particle performance when delivered by a transdermal injection technique (eg, delivery from a needleless syringe device) is a rigid polymethylimide foam (Rohacell 5IG, density 52 kg / m2).³, Rohm Tech Inc. , Malden, MA). The experimental setup of this test is similar to that used in the metallized film test. Measure the depth of penetration using precision calipers. For each experiment, the treated mannitol standard was performed as a comparison, and all other parameters, such as instrument pressure, particle size range, etc., were kept constant. The data also show that the method is sensitive to differences in particle size and pressure. Processed mannitol standards as drug excipients have been demonstrated to deliver systemic concentrations in preclinical experiments, and thus relative performance measurements in this foam penetration test have a practical in vivo basis. Promising powders can be expected to show penetration equal to or better than mannitol for predicting reasonable performance in preclinical or clinical research. This simple and rapid test has value as a relative method of powder evaluation and is not intended to be considered separately.
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Particle wear test
A further indicator of particle performance is the force associated with the high speed transdermal injection technique of various candidate solid particulate pharmaceutical compositions, i.e., the force resulting from contacting stationary particles with a sudden high velocity airflow, powder, Is to test the ability to withstand the forces resulting from particle-to-particle impact as it moves through a needleless syringe, and also the force resulting from particle-to-device impact as the powder moves through the device. Therefore, a simple particle abrasion test has been devised that measures the change in particle size distribution between the initial composition and the composition after being delivered from a needleless syringe device.
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In this test, after filling the particulate composition into a needleless syringe as described above, the device is placed in a flask containing a carrier fluid in which the particulate composition is not soluble (eg, mineral oil, silicone oil, etc.). Perform by releasing. Thereafter, the carrier fluid is collected and the particle size distribution in both the initial composition and the released composition is calculated using a suitable particle sizer, for example, an AccuSizer® model 780 Optical Particle Sizer. A needleless syringe system as described herein, wherein the composition exhibits a reduction of less than about 50%, more preferably less than about 20% or about 10% of the average mass aerodynamic diameter (measured by an AccuSizer device) after device operation. Is determined to be suitable for use in
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in in vitro To human skin and transepidermal (Transepidermal) Water loss
Candidate particle compositions can be injected into dermatized full thickness human skin samples for a composition performance test that more closely matches the final application. Replicated skin samples after injection can be placed on a modified Franz diffusion cell containing 32 ° C water, saline or buffer. Additives such as surfactants can be used to prevent binding to the diffusion cell components and maintain skin condition. Two types of measurements can be performed to evaluate the performance of the formulation on the skin.
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Transepidermal water loss (TEWL) can be measured to determine the physical effect, ie, the effect of particle injection on the barrier function of the skin. Measurements are taken at equilibrium (about 1 hour) using a Tewameter ™ 210® (Courage & Khazaka, Koln, Ger) placed on top of a diffusion cell cap that acts like a chimney of about 12 mm. Larger particles and higher injection pressures have proportionally higher TEWL values generated in vitro, which has been shown to correlate with in vivo results. With particle injection, in vitro TEWL values range from about 7 to about 27 (g / m2 depending on particle size and helium gas pressure).²h) increased. Helium injection without powder has no effect. In vivo, the skin barrier properties quickly return to normal, as indicated by TEWL returning to the pre-treatment value in about 1 hour for most particle sizes. For the largest particles, 53-75 μm, the skin samples show 50% recovery in 1 hour and complete recovery by 24 hours.
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These and other qualitative and quantitative tests can be used to assess the physical and functional suitability of the particulate medicament of the present invention for use in transdermal injection. Although not required, it is preferred that the particles have the following characteristics: substantially spherical (eg, an aspect ratio as close to 1: 1 as possible, eg, 1.5: 1); a smooth surface; a particle abrasion test Less than 20% particle size reduction; envelope density as close as possible to the true density of the components (eg, greater than about 0.8 g / ml); and about 20-70 μm MMAD with a narrow particle size distribution. These compositions can be free flowing powders (eg, free flowing after 8 hours storage at 50% relative humidity and 24 hours storage at 40% relative humidity). All of these criteria can be evaluated using the methods described above and are further described in the following publications, which are incorporated herein by reference. Etzler et al. (1995) Part. Part. Syst. Charact. 12: 217; Ghadiri et al. (1992) IFPRI Final Report, FRR 16-03 University of Surrey, UK; Bellhouse et al. (1997) "Needleless delivery of drugs in dry powder form, using shock waves and supersonic gas flow", Plenary Lecture 6 , 21^st International Symposium on Shock Waves, Australia; and Kwon et al. (1998) Pharm. Sci. suppl. 1 (1), 103.
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Thus, novel compositions that elicit an immune response have been described. Methods of using these compositions are also described. While the preferred embodiments of the subject invention have been described in some detail, it will be understood that obvious variations can be made without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims.

Claims (35)

ポリヌクレオチドをコートしたコア担体であって、該ポリヌクレオチドが少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結したコア担体。A polynucleotide-coated core carrier, wherein the polynucleotide comprises at least one T cell receptor (TCR) coding sequence, which is transcribed and translated and refolded in vivo in a recipient cell. Core carrier operatively linked to a control element such that a TCR molecule can be provided. ＴＣＲ分子がα鎖およびβ鎖を含む請求項１記載のコア担体。The core carrier according to claim 1, wherein the TCR molecule comprises an α chain and a β chain. ＴＣＲ分子がγ鎖およびδ鎖を含む請求項１記載のコア担体。The core carrier according to claim 1, wherein the TCR molecule contains a γ chain and a δ chain. ＴＣＲ分子を発現するＴ細胞が自己免疫障害に優先的に関与する請求項１から３のいずれか１項記載のコア担体。The core carrier according to any one of claims 1 to 3, wherein T cells expressing a TCR molecule are preferentially involved in an autoimmune disorder. 自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項４記載のコア担体。The core carrier according to claim 4, wherein the autoimmune disorder is selected from the group consisting of multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus. コア担体が金またはタングステンを含んでなる請求項１から５のいずれか１項記載のコア担体。The core carrier according to any one of claims 1 to 5, wherein the core carrier comprises gold or tungsten. 請求項１から６のいずれか１項記載のコア担体および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising a core carrier according to any one of claims 1 to 6 and a pharmaceutically acceptable excipient. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドでコートされたコア担体であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結し、該ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するコア担体。A core carrier coated with a polynucleotide comprising a coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), wherein the coding sequence is transcribed and translated in vivo in a recipient cell to provide a CDR2 peptide. A core carrier derived from a T cell operably linked to a regulatory element such that the CDR2 is preferentially involved in an autoimmune disorder. 担体が金またはタングステンを含んでなる請求項８記載のコア担体。9. The core carrier according to claim 8, wherein the carrier comprises gold or tungsten. 請求項８または９のいずれか１項記載のコートされたコア担体および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物。A pharmaceutical composition comprising a coated core carrier according to any one of claims 8 or 9 and a pharmaceutically acceptable excipient. ＣＤＲ１およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列を含有する第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８記載のコア担体。The core carrier according to claim 8, further comprising a second polynucleotide containing a TCR hypervariable region coding sequence selected from the group consisting of CDR1 and CDR3. 担体が金またはタングステンを含んでなる請求項１１記載のコア担体。The core carrier according to claim 11, wherein the carrier comprises gold or tungsten. 自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される、請求項８から１２のいずれか１項記載のコア担体。13. The core carrier according to any one of claims 8 to 12, wherein the autoimmune disorder is selected from the group consisting of multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus. 少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有する固形粒子状医薬組成物であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結した固形粒子状医薬組成物。A solid particulate pharmaceutical composition comprising a polynucleotide comprising a coding sequence for at least one T cell receptor (TCR), wherein said coding sequence is transcribed and translated and refolded in a recipient cell in vivo A solid particulate pharmaceutical composition operatively linked to a control element such that a TCR molecule can be provided. ＴＣＲ分子がα鎖およびβ鎖を含む請求項１４記載の組成物。15. The composition according to claim 14, wherein the TCR molecule comprises an α chain and a β chain. ＴＣＲ分子がγ鎖およびδ鎖を含む請求項１４記載の組成物。15. The composition according to claim 14, wherein the TCR molecule comprises a gamma chain and a delta chain. ＴＣＲ分子を発現するＴ細胞が自己免疫障害に優先的に関与する請求項１４から１６のいずれか１項記載の組成物。17. The composition according to any one of claims 14 to 16, wherein T cells expressing a TCR molecule are preferentially involved in autoimmune disorders. 自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項１７記載の組成物。18. The composition of claim 17, wherein the autoimmune disorder is selected from the group consisting of multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus. 組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ^３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項１４から１８のいずれか１項記載の組成物。Composition comprises a homogeneous population of particles having a density in the range of the mean particle diameter and about 0.1 to about 0.1 250 [mu] m of 25 g / cm ^3, of any one of claims 14 18 Composition. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含むポリヌクレオチドを含有する固形粒子状医薬組成物であって、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏでレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結し、該ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来する固形粒子状医薬組成物。A solid particulate pharmaceutical composition comprising a polynucleotide comprising a coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), wherein the coding sequence is transcribed and translated in vivo in a recipient cell to provide a CDR2 peptide. A solid particulate pharmaceutical composition derived from a T cell that is operatively linked to a regulatory element such that the CDR2 is preferentially involved in an autoimmune disorder. ＣＤＲ１およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＴＣＲ超可変領域のコーディング配列を含有する第２ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２０記載の組成物。21. The composition of claim 20, further comprising a second polynucleotide comprising a TCR hypervariable region coding sequence selected from the group consisting of CDR1 and CDR3. 自己免疫障害が多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび狼瘡からなる群より選択される請求項２０または２１のいずれか１項記載の組成物。22. The composition according to any one of claims 20 or 21, wherein the autoimmune disorder is selected from the group consisting of multiple sclerosis, psoriasis, rheumatoid arthritis and lupus. 組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ^３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項２０から２２のいずれか１項記載の組成物。Composition comprises a homogeneous population of particles having a density in the range of the mean particle diameter and about 0.1 to about 0.1 250 [mu] m of 25 g / cm ^3, of any one of claims 20 22 Composition. 少なくとも１つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてリフォールドされたＴＣＲ分子が提供され得るように制御要素に作動的に連結するポリヌクレオチドを含むベクターの、天然形態の該ＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造における使用であって、該医薬が該被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である使用。The control element comprises a coding sequence for at least one T cell receptor (TCR) such that the coding sequence can be transcribed and translated in vivo in a subject's recipient cells to provide a refolded TCR molecule. Use of a vector comprising an operably linked polynucleotide in the manufacture of a medicament for eliciting a cross-reactive immune response against a T cell that expresses the TCR in its native form, wherein the medicament is administered to the subject. Use which is a particulate medicament suitable for transdermal injection. 約０．５から５μｍの名目上のサイズを有する担体粒子が該ベクターでコートされて該粒子状医薬を提供する、請求項２４記載の使用。The use according to claim 24, wherein carrier particles having a nominal size of about 0.5 to 5 μm are coated with the vector to provide the particulate medicament. 担体粒子が金またはタングステンを含んでなる請求項２５記載の使用。The use according to claim 25, wherein the carrier particles comprise gold or tungsten. 医薬が固形粒子状医薬組成物である請求項２４記載の使用。The use according to claim 24, wherein the medicament is a solid particulate pharmaceutical composition. 該組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ^３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項２７記載の使用。The composition comprises a homogeneous population of particles having a density in the range of the mean particle diameter and about 0.1 to about 0.1 250 [mu] m of 25 g / cm ^3, use of claim 27, wherein. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤＲ２超可変領域のコーディング配列を含み、該コーディング配列がｉｎ ｖｉｖｏで被験体のレシピエント細胞において転写および翻訳されてＣＤＲ２ペプチドが提供され得るように制御要素に作動的に連結するポリヌクレオチドを含むベクターの、天然形態の該ＴＣＲを発現するＴ細胞に対する交差反応性免疫応答を誘発するための医薬の製造における使用であって、ＣＤＲ２が自己免疫障害に優先的に関与するＴ細胞に由来するものであり、かつさらに、該医薬が該被験体への経皮注入に適する粒子状医薬である使用。A coding sequence for a CDR2 hypervariable region of a T cell receptor (TCR), wherein the coding sequence is operable in a regulatory element such that the coding sequence can be transcribed and translated in vivo in a recipient cell of the subject to provide a CDR2 peptide. For use in the manufacture of a medicament for inducing a cross-reactive immune response against T cells expressing the TCR in its native form, wherein the CDR2 is preferentially involved in autoimmune disorders Use wherein the medicament is derived from a T cell that does not have the same composition, and is further a particulate medicament suitable for transdermal injection into the subject. 約０．５から５μｍの名目上のサイズを有する担体粒子が該ベクターでコートされて該粒子状医薬を提供する、請求項２９記載の使用。30. The use according to claim 29, wherein carrier particles having a nominal size of about 0.5 to 5 [mu] m are coated with the vector to provide the particulate medicament. 担体粒子が金またはタングステンを含んでなる請求項３０記載の使用。31. Use according to claim 30, wherein the carrier particles comprise gold or tungsten. 医薬が固形粒子状医薬組成物である請求項２９記載の使用。30. The use according to claim 29, wherein the medicament is a solid particulate pharmaceutical composition. 該組成物が約０．１から２５０μｍの平均粒子直径および約０．１から２５ｇ／ｃｍ^３の範囲の密度を有する粒子の均一集団を含んでなる、請求項３２記載の使用。The composition comprises a homogeneous population of particles having a density in the range of the mean particle diameter and about 0.1 to about 0.1 250 [mu] m of 25 g / cm ^3, use of claim 32, wherein. Ｔ細胞介在疾患の治療方法であって、それらを必要とする被験体に有効量の請求項１から１３のいずれか１項のコア担体を投与し、それにより該被験体の細胞においてポリヌクレオチドを発現させてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドを、該Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量提供する方法。14. A method for treating a T cell mediated disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the core carrier of any one of claims 1 to 13, whereby the polynucleotide is expressed in cells of the subject. A method of expressing a T cell receptor (TCR) molecule or CDR2 peptide in an amount sufficient to induce a cross-reactive immune response to a native TCR expressed by a T cell that mediates the T cell mediated disease. Ｔ細胞介在疾患の治療方法であって、それらを必要とする被験体に有効量の請求項１４から２３のいずれか１項の固形粒子状医薬組成物を投与し、それにより該被験体の細胞においてポリヌクレオチドを発現させてＴ細胞受容体（ＴＣＲ）分子またはＣＤＲ２ペプチドを、該Ｔ細胞介在疾患に介在するＴ細胞が発現する天然ＴＣＲに対する交差反応性免疫応答を誘導するのに十分な量提供する方法。24. A method of treating a T cell mediated disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the solid particulate pharmaceutical composition of any one of claims 14 to 23, whereby the cells of the subject are administered. Providing a T cell receptor (TCR) molecule or CDR2 peptide in an amount sufficient to induce a cross-reactive immune response to a native TCR expressed by a T cell that mediates the T cell mediated disease. how to.