JP2004532640A - 肺機能および障害の評価のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の障害を発症する素因、または肺機能の障害を発症する素因、ならびに閉塞性肺疾患の関連のリスク、ならびにＣＡＤ、発作、および肺癌のような関連の疾患のリスクを評価するために用いることができる方法を提供する。
【解決手段】本発明は、肺の機能、および／または障害の評価のための方法、そして詳細には、喫煙者および非喫煙者における慢性閉塞性肺疾患の素因および／または重篤度に対する診断のための方法であって、特に、細胞間質再構築、抗酸化防御、および炎症性応答に関与した遺伝子に関する、遺伝的多形性および変更された遺伝子発現の解析を用いる方法、に関連する。
【解決手段】本発明は、肺の機能、および／または障害の評価のための方法、そして詳細には、喫煙者および非喫煙者における慢性閉塞性肺疾患の素因および／または重篤度に対する診断のための方法であって、特に、細胞間質再構築、抗酸化防御、および炎症性応答に関与した遺伝子に関する、遺伝的多形性および変更された遺伝子発現の解析を用いる方法、に関連する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺の機能、および／または障害の評価のための、そして詳細には、喫煙者および非喫煙者における慢性閉塞性肺疾患の素因および／または重篤度を診断するための方法であって、遺伝的多形性および変更された遺伝子発現の解析を用いる方法、に関連する。本発明はまた、肺機能の障害を診断するための方法、そして詳細には、障害された肺の機能の素因、および／または重篤度、ならびに他の疾患の関連の罹患／死亡リスクを診断する方法に関する。本発明はまた、この方法における使用のための組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、先進国における死亡の４番目に主な死亡原因であって、世界中の病院入院の主な原因である。慢性閉塞性肺疾患は、潜伏性の炎症および進行性の肺の破壊によって特徴付けられる。慢性閉塞性肺疾患は、罹患した喫煙者によって労作性の息切れが気付かれた後に、臨床的に明白になるが、その時、肺機能の５０％以上が既に不可逆的に損われている。肺の機能のこの損失は、呼気流量（特に、１秒間努力呼気容量、すなわちＦＥＶ１）の低下によって臨床的に検出される。９５％を上回るＣＯＰＤが、巻きタバコ（cigarette）喫煙に起因するが、ＣＯＰＤを発症する喫煙者（感受性の喫煙者）は、わずか２０％程度である。驚くべきことに、喫煙は、肺機能の障害のわずか約１６％の原因としかならないことが、研究によって示される。兄弟姉妹（双子もそれ以外も）における一致を比較する多数の家族研究によって、強力な家族性の傾向が一貫して示され、ＣＯＰＤ疾患感受性（または疾患改変）遺伝子の研究は進行中である。
【０００３】
気道疾患の処置における進歩にもかかわらず、現在の治療は、呼吸の不全および死亡を生じる肺機能の進行性の損失を伴うＣＯＰＤの自然歴を有意に変更することはない。喫煙の中止は、肺機能における低下を軽減することが示されているが、喫煙の中止が、感受性の喫煙者にとって、喫煙の最初の２０年程度のうちに達成されなければ、その損失は、無視できないものであり、息切れの悪化の症状は、避けられないものになる。喫煙者を補助する技術はまったく限られた成功しか有さないことが、喫煙中止研究によって示される。血清コレステロールの発見およびその冠動脈疾患に対する関連と同様に、リスクのある喫煙者を特定する試験を開発することができて、そして、喫煙の有害作用を低下させる新しい処置法を発見することができるように、ＣＯＰＤに寄与する要因をさらによく理解する必要がある。
【０００４】
多数の疫学的研究によって、総喫煙量年数（pack year）２０年以上の曝露用量で、肺機能における分布が、三峰性の傾向であることが一貫して示された。この三峰性とは、６０年＋の総喫煙量年数の後でさえ、正常な肺機能を維持する喫煙者（抵抗性喫煙者）の割合と、症状を決して発症しそうにない肺機能のおだやかな低下を示す割合と、必ずＣＯＰＤを発症する、肺機能の加速的な損失を示す割合とであった。このことは、喫煙者の中で３つの集団、すなわち、ＣＯＰＤの発症に抵抗性の集団、リスクのおだやかな集団、およびより高リスクの集団（感受性喫煙者と命名される）が存在することを示唆する。
【０００５】
ＣＯＰＤの背景にある病態生理学は、まだ理解されていない。肺において巻きタバコの煙に対して曝されることによって、炎症性応答および酸化負荷の両方が生じ、これが少なくとも４つの過程を開始する。多数のサイトカインが局所的に放出されて、好中球およびマクロファージの両方が、肺に補充される。
【０００６】
ＣＯＰＤは、異種の疾患であって、種々の程度まで、気腫および慢性気管支炎を包含するが、これらは、慢性のタバコの煙への曝露および他の空気汚染に由来する炎症性侵襲後の再構築過程の一部として発症する。多くの遺伝子が、ＣＯＰＤの発生に関与するようである。
【０００７】
さらに、スパイロメーター（肺活量計）法によって測定された、肺機能の障害によって、閉塞性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、および細気管支炎）の存在、および／またはこのような閉塞性肺疾患に向かう傾向を診断する直接法（Subramanian Dら、1994）、ならびに冠動脈疾患、発作、および肺癌のような他の疾患からの罹患／死亡のリスクを評価する直接方法（Hole DJら、1996、Knuiman MWら、1999、Sorlie PDら、1989、Bang KMら、1993、Rodriguez BLら、1994、およびWeiss STら、1995）が提供されることが、疫学的研究によって示された。
スパイロメーター法によって現在測定されるような肺機能の障害は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、および細気管支炎のような閉塞性肺疾患の存在および重篤度を評価する臨床的基礎であると長らく認識されている。慢性の喫煙の存在において、これらの障害は、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）の低さ、推定の１秒間努力呼気容量パーセントの低さ、および努力肺活量を上回る１秒間努力呼気容量の比の低下によって反映されるような可逆性が最小の気道閉塞によって特徴付けられ得る（一般の参考文献）。
【０００８】
過去２０年間にわたる疫学的研究によって、ＣＯＰＤ以外の死因（とりわけ、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、発作、および肺癌）による死亡リスクを有する、肺機能の障害（ほとんどの場合ＦＥＶ１）の間の関連を検討した。これらは、慢性的に巻きタバコの煙に対して曝されたことの結果として十分に認識されるが、これらの合併症によって死亡する喫煙者はわずかな割合でしかないことが疫学的研究から明白である。しかし、逆に、ＣＯＰＤおよび肺癌の９０％より多くが、慢性の巻きタバコの煙に対する曝露に起因する。喫煙は、冠動脈疾患の死亡に寄与する、最も重要なライフスタイルのリスクファクターと考えられる。疫学的研究によって多様な群の被験体を募集したが、彼らは、ＣＯＰＤだけでなく、ＣＡＤ、発作、および肺癌による死亡についても、重大かつ独立したリスクファクターとして、ＦＥＶ１（または関連の指標）の低下を、一貫して特定している（Hole DJら、1996、Kuniman MWら、1999、Sorlie PDら、1989、Athonisen NR、1989、Bang KMら、1993、Rodriguez BLら、1994、およびWeiss STら、1995）。これらの研究のうち最大のものでは、肺機能の障害に起因するＣＡＤによる死亡のリスクは、血清コレステロールについてのリスクと同じ程度大きかった（Hole DJら、1996）。ＣＡＤについてのＦＥＶ１の低下と関連した死亡リスクは、喫煙者および非喫煙者の両方について見られるが、前者（喫煙者）において約２倍強力である（Hole DJら、1996）。
【０００９】
慢性閉塞性肺疾患、肺癌、発作、および冠動脈疾患は全て家族性であること、ならびに慢性の巻きタバコの煙への曝露は、これらの疾患の発症に対する重要な環境上の寄与因子であることが、長らく認識されている。前向き研究によって、ＦＥＶ１の低下は、これらの疾患全てに対するリスクの増大の確実な予測因子であることが示されたが、この感受性のために肺が、臨床的に十分、検出可能（肺機能試験の低下によって）であるほど損なわれるには、３０年以上の慢性の喫煙を要するかもしれない。
【００１０】
被験体が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の障害を発症する素因、または肺機能の障害を発症する素因、ならびに閉塞性肺疾患の関連のリスク、ならびにＣＡＤ、発作、および肺癌のような関連の疾患のリスクを評価するために用いることができる方法を有することは、特に、被験体が喫煙者であるか、そして／または酸化的ストレスに対する感受性の増強を有する場合に、所望され、かつ有利である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特定の遺伝子および遺伝子の群のプロモーター多形性、特に、細胞間質再構築、抗酸化的防御、炎症性応答、およびそれらのインヒビターに関与するプロモーター多形性が、コントロール被験体よりもＣＯＰＤを有する患者でしばしば見出されるという驚くべき知見に一部基づく。別の部分では、本発明は、これらの遺伝子、および／またはそれらの調節領域における多形性が、喫煙者における肺機能の障害の重篤度と関連するというさらなる驚くべき知見に基づく。
【００１２】
今までのところ、ＣＯＰＤ／気腫、または肺機能障害に対する寄与において、いくつかの「感受性」遺伝子改変体の集合効果（相加的、防御的、または相乗的）を評価することはできなかった。従って、ＣＯＰＤ／気腫感受性遺伝子のいくつかの改変体（変異体、および／または多形性）の存在は、ＣＯＰＤ／気腫、および／または肺機能障害を有するという、より大きいリスクを、単純な相加的モデルにおいて、付与するようである。
【００１３】
従って、１つの局面によれば、慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００１４】
別の局面によれば、喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子のこの調節領域および／またはプロモーター領域中の変異体の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００１５】
別の局面によれば、慢性閉塞性肺疾患の発症の可能性を被験体において診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼのこのプロモーター領域における変異の存在は、この疾患の発症の可能性または重篤度の指標である。
【００１６】
別の局面によれば、喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発現の可能性を診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼのこのプロモーター領域中の変異体の存在は、この疾患の発現の可能性または重篤度の指標である。
【００１７】
好ましくは、このメタロプロテイナーゼは、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）から選択される。好ましい多形性（変異）は、間質性コラゲナーゼのプロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢのプロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性である。
【００１８】
調節性および／またはプロモーター多形性の上記決定が、メタロプロテイナーゼ遺伝子の１つまたは組み合わせで実行され得ることが、当業者に理解される。従って、ＣＯＰＤを発症する被験体の素因の評価は、例えば、間質性コラゲナーゼのプロモーター領域、またはゼラチナーゼＢのプロモーター領域、またはマクロファージエスラスターゼのプロモーター領域のみの解析に基づいてもよい。しかし、これらの遺伝子の組み合わせの調節および／またはプロモーター多形性の組み合わせは、任意の組み合わせの２つまたは３つ全てが、本発明の方法において用いられることが好ましい。
【００１９】
なお別の局面によれば、慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築に関与するか、またはそれに関連する遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の組み合わせの解析を包含し、ここで、これらの領域中の多形性の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００２０】
好ましくは、３つの細胞間質メタロプロテイナーゼ遺伝子の全て、すなわち、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）における多形性が、本発明の方法において用いられる。
【００２１】
しかし、メタロプロテイナーゼ遺伝子における多形性と組み合わせて、他の公知の遺伝子（例えば、α１アンチトリプシン、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）における多形性は、本発明の方法において用いることができる。２つ以上の遺伝子多形性の任意の組み合わせは、本発明の方法において用いることができるが、必要に応じて、本明細書に記載される遺伝子の全てにおける多形性が用いられる。
【００２２】
別の局面によれば、先の局面のいずれか１つの方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットが提供される。
【００２３】
この好ましいプライマー、および／またはプローブは、本明細書に記載される関連遺伝子のプロモーターおよび調節領域の多形性領域にまたがるか、またはまたがるために用いることができる、ヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットである。
【００２４】
本発明の文脈においては、「多形性（polymorphism）」という用語は、任意の改変体および変異体（遺伝子が全く存在しないか、または部分的に存在しない（例えば、ヌル（null）変異）ことを含む）を記載するために用いられることが理解される。
【００２５】
慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の潜在的なリスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
【００２６】
喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する潜在的リスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
【００２７】
好ましくは、このメタロプロテイナーゼは、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）である。この好ましい多形性（変異）は、間質性コラゲナーゼの上記プロモーターにおける１Ｇ／２Ｇである。好ましい炎症性サイトカインは、トランスフォーミング成長因子β１であり、この好ましい多形性（変異）は、トランスフォーミング成長因子β１のコドン１０におけるヌクレオチドＴからＣの置換である。この細胞間質メタロプロテイナーゼの好ましいインヒビターは、メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（Tissue Inhibitor）であり、この好ましい多形性は、−１２９６位でのＴからＣの置換である。酸化体代謝に関与する好ましい酵素は、スーパーオキシドディスムターゼ３であり、そしてこの好ましい多形性（変異）は、７６０位でのＣからＧへの置換である。
【００２８】
なお別の局面において、被験体の慢性閉塞性肺疾患の発症の潜在的リスクを決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形成の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在は、ＣＯＰＤに感受性の遺伝子型の指標である。
【００２９】
さらなる局面において、喫煙者であるか、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する潜在的リスクを決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して感受性の遺伝子型の指標である。
【００３０】
好ましくは、メタロプロテイナーゼは、マクロファージエラスターゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１２、すなわちＭＭＰ−１２）であり、そして好ましい多形性は、−８２位でのＡからＧの置換である。好ましいグルタチオントランスフェラーゼは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ１であり、そしてこの好ましい多形性は、Ｍ１ヌル多形性である。この好ましいプロテアーゼインヒビターは、α１アンチトリプシンであり、そしてこの好ましい多形性は、３’Ｔａｑ１多形性である。
【００３１】
別の局面によれば、肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこの遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因およびそれに関連する健康上のリスクの指標である。
【００３２】
別の局面によれば、喫煙者である被験体か、または高レベルの酸化的ストレスに曝された被験体において、肺機能の障害を発症する素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこのタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である。
【００３３】
別の局面によれば、肺機能の障害の発現の可能性を被験体において診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害の発症の可能性、または重篤度の指標である。
【００３４】
別の局面によれば、喫煙者である被験体か、または酸化的ストレスに曝された被験体において、肺機能の障害の発現の可能性を診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこのタンパク質における変異の存在は、肺機能の障害の発現の可能性または重篤度の指標である。
【００３５】
なお別の局面によれば、肺の障害に関連する疾患の罹患／死亡のリスクを発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで、この遺伝子の１つ以上における変異の存在は、この疾患の罹患／死亡のリスクを発症する素因の指標である。
【００３６】
好ましくは、この疾患は、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、発作、および肺癌からなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、この細胞間質再構築タンパク質は、α１−アンチトリプシン、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）から選択される。好ましくは、酸化的ストレスタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼである。この好ましい多形性（変異）は、α１−アンチトリプシンの３’領域における１２３７のＧからＡ、間質性コラゲナーゼのプロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢのプロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２の多形性、および／またはこれらの多形性と連鎖不均衡である多形性である。好ましくは、酸化的ストレスタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼから選択される。
【００３８】
感受性の多形性の決定が、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の組み合わせにおいて実行され得ることが当業者によって理解される。従って、肺機能の障害を発症する、被験体の素因の評価は、例えば、間質性コラゲナーゼのプロモーター領域、またはゼラチナーゼＢのプロモーター領域、またはマクロファージエラスターゼのプロモーター領域のみの解析に基づいてもよい。しかし、これらの遺伝子の組み合わせの多形性は、任意の組み合わせの２つまたは３つ全てが、本発明の方法において用いられることが好ましい。
【００３９】
なお別の局面によれば、肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における２つ以上の多形性の解析を包含し、ここでこの遺伝子における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である。
【００４０】
好ましくは、５つの遺伝子全てにおける多形性、すなわち、α１−アンチトリプシン、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）、およびグルタチオンＳトランスフェラーゼにおける多形性が、本発明の方法において用いられる。
【００４１】
別の局面によれば、先の局面のいずれか１つの方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットが提供される。
【００４２】
この好ましいプライマー、および／またはプローブは、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子、ならびに本発明の方法において用いられる他の遺伝子の多形性領域にまたがるか、またはまたがるために用いることができる、プライマー、および／またはプローブである。
【００４３】
本明細書において「喫煙者（smokers）」という場合、その用語はまた、元喫煙者（ex-smokers）を包含することが意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
症例コントロール研究を用いて、本発明者らは、喫煙者および血液ドナーにおいて候補遺伝子のいくつかの遺伝的改変体（多形性）の頻度を比較した。これらの候補遺伝子のほとんどで、遺伝子発現またはタンパク質機能に対する機能的影響を確認した（またはそのようである）。詳細には、本発明者らは、血液ドナーコントロールと、抵抗性喫煙者と、ＣＯＰＤを有する者（早期発現を有する者と、正常な発現を有する者に小分割される）との間の多形性の頻度を比較した。本発明は、選択された候補遺伝子多形性に由来する防御性遺伝子型および感受性遺伝子型の両方が存在することを実証する。ＣＯＰＤは、多遺伝子の障害であり、多くの遺伝子型が、任意の１例の感受性の喫煙者におけるＣＯＰＤの発症に関与しているようであると考えれば、単なる単純な遺伝的モデルを調査してもよい（すなわち、感受性遺伝子型および防御的遺伝子型の正味の影響は未知である）。本明細書に記載される１つの実施形態においては、３つの感受性遺伝子多形性、および４つの防御的遺伝子多形性が同定される。これらの多形性の組み合わせ効果の統計学的解析によって、本発明の遺伝的アッセイは、ＣＯＰＤを発症するリスクが、より大きい喫煙者を同定するために用いることができることが示される。
【００４５】
従って、本明細書に記載されるような、喫煙者および非喫煙者の十分規定された群におけるこれらの多形性の頻度の系統的解析によって、予測的な目的で、ＣＯＰＤの発症に特定のタンパク質を結び付けて、どの喫煙者が、肺機能の障害およびＣＯＰＤを発症するリスクが増大したかを特定する能力を改善することが可能である。
【００４６】
これらの疾患の１つまたは組み合わせを罹患するのは、喫煙者のごく少数のみであるので、遺伝子機構の組み合わせ効果、および高い酸化体曝露を通じて、肺疾患（ＣＯＰＤおよび肺癌）に関連する喫煙のリスクが最高である「感受性喫煙者（susceptible smokers）」が存在し得る。現在までの疫学的知見を考えれば、この遺伝的感受性はまた、他の喫煙関連障害（例えば、ＣＡＤ、および発作）に対する素因に伸展する可能性が高い。
【００４７】
さらに、本発明者らは、ＦＥＶ１の低下が、慢性の喫煙、および酸化的ストレスの有害な影響に対する一般的感受性のバイオマーカーであると考える。すなわち、慢性の酸化的ストレスの条件（慢性の巻きタバコの煙に対する曝露で見られるような）下で、細胞間質再構築、炎症、および／または酸化的ストレスに関与するタンパク質の活性において変化が存在する。長期間におよぶ、これらのタンパク質（代表的には酵素）の活性の変化によって、慢性閉塞性肺疾患を生じる、肺の炎症、線維症、および実質性の障害の促進がもたらされ、そして肺癌に寄与する。これらの同じプロセスが、動脈壁において生じ、それによって粥状斑の進行、および／または不安定性を促進し、冠動脈疾患および発作の発生がなければ、粥状斑の血栓形成への進行が生じる（Waltenberger J.2001）。次に、血栓形成が不安定狭心症（アンギナ）、急性心筋梗塞、および発作（その全てが高い死亡率を有する）の臨床的実態をもたらす。炎症、細胞間質再構築、および／または酸化的ストレスに対する応答の過程は、これらの臨床実態を特徴付ける斑の不安定性に寄与し得ることが提唱される。この状況では、ＦＥＶ１の低下は、有害な細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスによる障害の増強に対する感受性を有する者の間接的なバイオマーカーである。従って、これらの機構はＦＥＶ１を低下させ、そしてこれらの疾患についての死亡リスクは、細胞間質再構築タンパク質、炎症性タンパク質、および酸化的ストレスに対する個々の固有の応答の活性を通じて関連付けられ得る。ＦＥＶ１の低下は、これらの疾患全てに対するリスクの増大の信頼性のある予測因子であるが、この感受性のために肺が臨床的に検出可能である（低下した肺機能試験による）のに十分であるほど障害されるまでには、３０年以上の慢性の喫煙を要し得る。本発明の方法は、この不利な点を克服する。
【実施例】
【００４８】
本発明は、非限定的な実施例を参照して、ここで、より詳細に記載される。
【００４９】
（実施例１）
（予備的研究）
（１．１ 被験体の募集）
ＣＯＰＤの悪化によって病院に入院した欧州人の家系の患者を、継続的に募集した。最小２０年間の総喫煙量年数の間、喫煙して、７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ１比（１秒間努力呼気容量／努力肺活量）、および７０％未満のＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有する被験体として、ＣＯＰＤを規定した。専門の医師によってＣＯＰＤと診断された、上記の肺機能試験を有する患者を募集したが、その募集条件は、それらの患者が、５０歳を超えており、かつ４０歳を超えてから息切れの症状を発症した場合とした。喘息、気管支拡張症、または肺手術の病歴を有する患者は除外した。８４例の患者を募集したが、その５６％が男性であり、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．４４（０．１２）、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３３（１３）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（９）、および４５年（２９）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１−アンチトリプシン変異（Ｓ改変体およびＺ改変体）についてＣＯＰＤ群を遺伝子型特定したが、どれもＺ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有さなかった。本発明者らはまた、地域的な血液ドナーサービスを通じて継続的に募集した１７８例の欧州人の血液ドナー（喫煙状況不明）を研究した。５５％が男性で、その平均年齢は、４５歳であった。
【００５０】
（１．２ ＭＭＰ１プロモーター多形性遺伝子型特定）
ゲノムＤＮＡを全血サンプルから抽出した（Maniatis,T、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法（Dunleaveyら、2000、その全体が参考として本明細書に援用される）のわずかな変法によって、ＭＭＰ１プロモーター多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’-ＴＣＧ−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＴＧＴ−ＣＴＴ−ＣＣＣ−ＡＴＴ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＴＣＴ−ＴＧＧ−ＡＴＴ−ＧＡＴ−ＴＴＧ−ＡＧＡ−ＴＡＡ−ＧＴＧ−ＡＡＡ−ＴＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応は、総容積２５μｌ中で実行し、これには、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃２分間のインキュベーション、その後の９２℃４５秒、６０℃５０秒、および７２℃５０秒の３５サイクルであった。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物（１１８ｂｐ）を可視化した。残りを１０単位のＡｓｐ７００（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で４時間消化した。ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで２．５時間泳動した３％アガロースゲル上で、消化した産物を分離した。このＰＣＲ産物は、２Ｇ対立遺伝子の存在下で未切断のまま（すなわち、１１８ｂｐ）であるか、または１Ｇ対立遺伝子の存在下で、１００ｂｐおよび１７ｂｐのバンドに切断された。上記の方法によって、遺伝子型１Ｇ１Ｇ、１Ｇ２Ｇ、または２Ｇ２Ｇを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、１Ｇまたは２Ｇ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００５１】
（１．３ ＭＭＰ９プロモーター多形性遺伝子型）
実施例３に記載された同じ方法によって、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｇｅｌｂ１（５’−ＧＣＣ−ＴＧＧ−ＣＡＣ−ＡＴＡ−ＧＴＡ−ＧＧＣ−ＣＣ−３’）、およびｇｅｌｂ２（５−ＣＴＴ−ＣＣＴ−ＡＧＣ−ＣＡＧ−ＣＣＧ−ＧＣＡ−ＴＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ（その全体が参考として本明細書において援用される、Zhang Bら、1999によって公開された方法の改変）によって、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ９）Ｃ−１５６２Ｔプロモーター多形性の遺伝子型特定を実施した。ＰＣＲ増幅を、ＰＴＣ−１００サーモサイクラー（MJ Research、Inc.）において、２５μｌの反応混合物中で実施した。この反応混合物は、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマー５０ｎｇ、２０μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５単位Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、および０．００１％ゼラチンであった。ＰＣＲサイクル条件は以下であった：初期変性段階、９５℃、３分間、３５サイクルのＰＣＲ（９２℃、５０秒間の変性、６６℃４８秒間のアニーリング、および７２℃５８秒間の伸長）、その後の７２℃５分間の１サイクルの伸長。ＰＣＲ産物の４μｌのアリコートを、推奨される緩衝系において１０Ｕの制限酵素ＳｐｈＩ（LifeTech）を用いて、３７℃で５時間消化した。全ての消化物を３％アガロースゲル上で分析した。上記の方法によって、遺伝子型ＣＣ、ＣＴ、またはＴＴを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＣおよびＴの対立遺伝子を正確に特定したことを確認した。
【００５２】
（１．４ ＭＭＰ１２プロモーター多形性遺伝子型）
実施例３に記載された同じ方法によって、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｈｍｅｐ１（５’−ＡＧＡ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＡＧＧ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＡＴＣ−ＡＧＣ−Ｔ−３’）、およびｈｍｅｐ２（５−ＧＧＣ−ＴＴＧ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＴＧＴ−ＴＣＡ−ＧＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ（その全体が参考として本明細書において援用される、Jormsjo Sら、2000によって公開された方法の改変）によって、ヒトマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ１２）Ａ−８２Ｇプロモーター多形性の遺伝子型特定を実施した。ＰＣＲ増幅を、ＰＴＣ−１００サーモサイクラー（MJ Research、Inc.）において、２５μｌの反応混合物中で実施した。この反応混合物は、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマー５０ｎｇ、２０μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５単位Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、および０．００１％ゼラチンであった。ＰＣＲサイクル条件は以下であった：初期変性段階、９５℃、２分間、３５サイクルのＰＣＲ（９２℃、５０秒間の変性、６６℃４８秒間のアニーリング、および７２℃５８秒間の伸長）、その後の７２℃５分間の１サイクルの伸長。ＰＣＲ産物の４μｌのアリコートを、推奨される緩衝系において１０Ｕの制限酵素ＰｖｕＩＩ（LifeTech）を用いて、３７℃で５時間消化した。全ての消化物を３％アガロースゲル上で分析した。上記の方法によって、遺伝子型ＡＡ，ＡＧ、またはＧＧを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＡおよびＧの対立遺伝子を正確に特定したことを確認した。
【００５３】
遺伝子型は、２名の研究者によって独立して割り当てられ、表現型（ＣＯＰＤ、およびコントロール）の状態は伏せられていた。対立遺伝子および遺伝子型の頻度における相違を、コーンフィールド９５％信頼限界（ｐ≦０．０５として採用した有意差によるイェーツ補正χ２二乗検定）を用いて、オッズ比によって比較した。
【００５４】
（１．５ ＭＭＰ１／ＭＭＰ９／ＭＭＰ１２プロモーター対立遺伝子、および遺伝子型頻度）
本発明者らの遺伝子型特定データの解析によって、ハーディ・ワインバーグ平衡が、両方のコホートにおいて満たされたこと、および有意差が見出されたことが示された（表１、２、および３に要約される）。
【表１】
【表２】
【表３】
【００５５】
上記のデータによって、ＭＭＰ１ １Ｇ／２Ｇ、ＭＭＰ９Ｃ−１５６２Ｔ、およびＭＭＰ１２Ａ−８２Ｇのプロモーター多形性が、独立して、ＣＯＰＤの発症に対する感受性についての候補の遺伝子座であることが示される。ＭＭＰ１の場合、２Ｇ対立遺伝子頻度、および２Ｇ２Ｇ遺伝子型頻度の両方が、健康なコントロール集団においてよりも、ＣＯＰＤ患者において有意に多く広がっていた（それぞれ、６０％対４５％、および３９％対２１％）。同様に、ＭＭＰ９の場合、Ｔ対立遺伝子頻度およびＣＴ／ＴＴ遺伝子型頻度の両方が、健康なコントロール集団においてよりもＣＯＰＤ患者において、有意に多く広がっていた（それぞれ、２６％対１５％、および４７％対２９％）。最後に、ＭＭＰ１２の場合、Ａ対立遺伝子頻度、およびＡＡ遺伝子型頻度の両方が、健常なコントロール集団よりもＣＯＰＤ患者において有意に多く広がっていた（それぞれ、９０％対８０％、および８０％対６４％）。
【００５６】
（１．６ α１−アンチトリプシン３’Ｔａｑ１多形性の遺伝子型特定）
ゲノムＤＮＡを、先の実施例のように、全血から抽出した。以前に公開されたプライマー（Sandford AJら、1997b）を用いて、以下の方法によって、α１−アンチトリプシン３’Ｔａｑ１多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＴＡ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＴＣＣ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＧＧＴ−ＣＴＧ-ＴＧＴ−ＴＣＡ−ＴＣＣ−３’（リバースプライマー）であった。総容積２５μｌ中で、ＰＣＲ反応を実行し、この反応には、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ，１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃２分間のインキュベーション、その後の９４℃４５秒、６２℃４０秒、および７２℃４５秒の３５サイクル、ならびに７２℃５分の最終サイクルであった。臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物（２０５ｂｐ）を可視化した。ＰＣＲ産物の残りを１０単位のＴａｑ１制限酵素（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、６５℃で４時間消化した。ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで２．５時間泳動した２％アガロースゲル上で、消化した産物を分離した。このＰＣＲ産物は、ｔ（変異）対立遺伝子の存在下で、未切断のままであった（すなわち、２０５ｂｐ）が、Ｔ（野生型）対立遺伝子の存在下では、１３０ｂｐおよび７５ｂｐのバンドに切断された。
【００５７】
（１．７．グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｍ１ヌル多形性の遺伝子型特定）
先の実施例のように、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。以前に公開された（Cantlay AMら、1994）プライマーを用いて、以下の方法によって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｍ１ヌル欠失多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＴＡＣ−ＴＴＧ−ＡＴＴ−ＧＡＴ−ＧＧ−３’；５’-ＡＴＣ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−ＧＴＣ−ＴＣ−３’、および５’−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＡＴＴ−ＧＴＡ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−ＣＡ−３’であった。総容積２５μｌ中で、ＰＣＲ反応を実行し、この反応には、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマーの５０ｎｇ、２０μＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃４５秒、５６℃４８秒、および７２℃４８秒の３５サイクル、ならびに７２℃３分の最終サイクルであった。臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルの紫外透光によって、６μｌのＰＣＲ産物を可視化した。ＰＣＲ産物は、２０２ｂｐのバンド（増幅のためのＧＳＴＭ４内部コントロール）、および正常なＧＳＴＭ１（ホモ接合体、またはヘテロ接合体）の２７５ｂｐのバンド、または２７５ｂｐのバンドがない（ＧＳＴＭ１ヌル欠失についてのホモ接合性を示す）かのいずれかであった。
【表４】
【表５】
【００５８】
この多形性は、調節性エレメントを含む領域に位置するが、インビトロ研究では、この遺伝子改変体からの重要な機能的効果を示すことができなかった（Sandfordら、1997）。ＧＳＴＭ１変異に関して、本発明者らは、コントロールにおいて４２％、およびＣＯＰＤ患者において６５％の頻度を見出した。
【００５９】
これらの遺伝的改変体の複合効果を、本発明者らのコントロールとして健常な喫煙者における類似の頻度を推測したロジスティック式（オッズ比推定）で評価した場合、ＣＯＰＤに対する傾向の約４２％（９５％、ＣＩ＝３１〜５６％）が、５つ遺伝子型改変体の各々によって独立して説明できた。グラフ的に検討した場合、感受性の遺伝子改変体の数に対してプロットした、ＣＯＰＤを有する人の割合は、線形の関係であって、４つ以上の感受性の改変体を有する人においては、ＣＯＰＤを有する推定の尤度（可能性）が８０％程度の高さを伴う線形であることが示された（図１を参照のこと）。
【００６０】
本発明者らのＣＯＰＤコホートは、種々の程度の気腫、気管支炎、および可逆性気道閉塞（ＣＯＰＤの喘息成分）を有する患者の異種の群である可能性が高い。
【００６１】
本研究によって、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、および／またはＭＭＰ１２過剰発現が、若干の喫煙者におけるＣＯＰＤの発症の背景であり得るという証拠が得られ、そして、この過程の遺伝的基礎として、２Ｇ対立遺伝子（ＭＭＰ１における）、Ｔ対立遺伝子（ＭＭＰ９における）、およびＧ対立遺伝子（ＭＭＰ１２における）のプロモーター多形性が、初めて直接結び付けられる。
【００６２】
上記のように、本研究において用いられるＣＯＰＤコホートは、ＣＯＰＤの一部として種々の重篤度の気腫を有する患者の異種の群である可能性が高い。本発明者らは、ＭＭＰ １２Ｇ対立遺伝子、および／またはＭＭＰ９ Ｔ対立遺伝子、および／またはＭＭＰ１２ Ａ対立遺伝子の１つ、および／または組み合わせが、関連の細胞間質メタロプロテイナーゼの過剰発現、および気腫の引き続く発症を通じて、ＣＯＰＤの発症に対してそれらの影響を発揮するということを提唱する。しかし、慢性の巻きタバコへの曝露の炎症性刺激がＭＭＰ過剰発現を生じる方法は明確ではない。これに関して、巻きタバコの煙に応答して放出された炎症性サイトカインである（そしてＣＯＰＤの再構築に係わる）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が、Ｅｔｓ転写因子結合部位のコア配列に結合することが示されているということは興味深い（von der Aheら、1993）。いかなる特定の作用機序によって拘束されることも望まないが、上記の多形性は、ＴＮＦ−αのような炎症性刺激に対する応答性を増強し得るＥｔｓ転写結合部位に関連し（その近位で見出されるかまたは生成する）、このことは、そのような喫煙者が気腫を発症するリスクをもたらすことが注目される。
【００６３】
（実施例２）
（拡大研究）
ＣＯＰＤの発症に対して感受性の候補遺伝子座としてＭＭＰ１、９、および１２のプロモーター多形性の予備的評価の後に、第二のさらに広範な研究が続いた。この研究は、ＴＧＦβ、ＳＯＤ３、およびＴＩＭＰ３の遺伝子の候補多形性の遺伝子型特定を含んだ。この研究は、防御的遺伝子型、および感受性遺伝子型の両方が、遺伝子のこのサブセット由来であり得るか否かを検討するためにデザインされた。
【００６４】
（２．１ 被験体の募集）
最小１５年の総喫煙量年数、喫煙した、そして慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有すると医師によって診断された欧州の家系の被験体を、２つの母集団から募集した。最初の群は、ＣＯＰＤの悪化によって入院した患者であって、以下の基準を満たした：５０歳を超えており、かつ４０歳以降に息切れの症状を発症しており、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ２比（１秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。１１１例の被験体を募集し、その５８％が男性であり、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±四分位範囲（ＩＲＱ））は、４４％（３７〜５０）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３２（２４〜４７）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（６６〜７７）、および４３年（３０〜５７）であった。募集した第二群は、息切れによって胸部外来診療科を訪れた群であって、その群は、臨床的およびスパイロメーターによるアセスメント後に、ＣＯＰＤを有すると診断され（胸部医師によって）、そして以下の基準を満たした：６５歳未満で、かつ４０歳以降に息切れの症状を発症しており、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ３比（1秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。６１例の被験体を募集し、それらの４３％が男性であって、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±四分位範囲（ＩＲＱ））は、４４％（３８〜５５）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３７（２４〜４７）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５８歳（５３〜６２）、および４１年（３１〜５２）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１アンチトリプシン変異体（ＳおよびＺ改変体）について両方のＣＯＰＤ群を遺伝子型特定して、Ｚ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有するものを除外した。本発明者らは、また、８５例の欧州人の被験体であって、最低２０総喫煙量年数、喫煙し、かつ過去に息切れを被ったことも、閉塞性肺疾患（詳細には、喘息または慢性閉塞性肺疾患）と診断されたこともない被験体を研究した。このコントロール群は、老人クラブを通して募集したが、５８％の男性から構成され、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±ＩＱＲ）は、８２％（７６〜８８）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、９４（８７〜１０１）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５２歳（４６〜６１）、および３８年（２５〜５９）であった。本発明者らはまた、１７８例の欧州人の血液ドナー（喫煙状態不明）を募集したが、これは、地域の血液ドナーサービスを通じて継続的に募集した。５５％が男性で、その中央年齢は４５歳であった。
【００６５】
コントロールに比べて、ＣＯＰＤ患者において大きい頻度で見出された多形性は、肺機能障害、およびＣＯＰＤの発症に対する感受性の増大を反映し得ることが、本研究によって示される。同様に、感受性の喫煙者（ＣＯＰＤ患者）に比べて、耐性の喫煙者で大きい頻度で見出される多形性は、防御的役割を反映し得る。
【表１２】
【００６６】
（２．２ トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）コドン１０多形性の遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。この（ＴＧＦβ）コドン１０多形性を以前に公開された方法のわずかな変法によって決定した（参考として本明細書に援用される、Syrrisら、1998）。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＣ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＡＧＴ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を、総容積２５μｌで実行したが、これには、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、５００ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃５０秒、６６℃６０秒、および７２℃６０秒の３３サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増殖産物の３μｌのアリコートを４単位のＰｓｔＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で１時間消化した。消化した産物を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０ｍＶで２．０時間泳動した２．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。ロイシン（Ｌ）対立遺伝子の存在において、この１１０ｐｂの産物のサイズは８６ｂｐ、および２４ｂｐの産物に切断されたが、プロリン（Ｐ）対立遺伝子の存在下では、この増幅産物は未切断のまま残った。上記の方法によって、遺伝子型ＬＬ、ＬＰ、およびＰＰを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＬまたはＰ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６７】
（２．３ スーパーオキサイドディスムターゼ３（ＳＯＤ３）Ｃ＋７６０Ｇ（Ａｒｇ２１３Ｇｌｙ）多形性の遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法のわずかな変法によって、ＳＯＤ ３Ｃ＋７６０Ｇ多形性を決定した（参考として、本明細書において援用されたUkkolaら、2001）。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＡＣＧ ＧＧＡ Ａ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＡ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を２５μｌの総容積中で実行したが、これには、１７５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１ｎｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５単位Ｔａｑ ポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃５０秒、６６℃６０秒、および７２℃６０秒の３３サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増幅産物の３μｌのアリコートを１０単位のＭｗｏＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、６０℃で１時間消化した。消化した産物（２２１ｂｐ）を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで１．０時間泳動した３．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。Ｇｌｙ−２１３（またはＧ）対立遺伝子の存在において、この２２１ｐｂの産物のサイズは切断されなかったが、野生型Ａｒｇ２１３（またはＣ）対立遺伝子の存在下では、この産物は２つのバンドに切断される。上記の方法によって、遺伝子型ＣＣ、およびＣＧを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＣまたはＧ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６８】
（２．４ メタロプロテイナーゼ３（ＴＩＭＰ３）Ｔ−１２９６Ｃプロモーター多形性の組織インヒビターの遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法（参考として、本明細書において援用されたBeranek、2000）のわずかな変法によって、ＴＩＭＰ ３Ｔ−１２９６Ｃプロモーター多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＡＴ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＡＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＧＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を２５μｌの総容積中で実行したが、これには、１μｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．７単位Ｔａｑ ポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃５分間のインキュベーション、その後の９５℃３０秒、６１℃６０秒、７２℃３０秒の３０サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増幅産物の１０μｌのアリコートを５単位のＡｌｕＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で一晩消化した。消化した産物（２２１ｂｐ）を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで１．０時間泳動した３．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。Ｔ対立遺伝子の存在において、この消化されたバンドは、２０１、１２８、６９、５３、および３２であったが、Ｃ対立遺伝子の存在下では、この消化されたバンドは、２０１、１６０、６９、および５５バンドであった。上記の方法によって、遺伝子型ＴＴ、ＴＣ、およびＣＣを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＴまたはＣ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６９】
（ＣＯＰＤ遺伝子関連研究の複合した結果（表９にまとめた））
表３、４、および５に示した比較によって、ＭＭＰ１２Ａ対立遺伝子／ＡＡ遺伝子型（−８２プロモーター）、α１−アンチトリプシンｔ対立遺伝子Ｔｔ／ｔｔ遺伝子型（１２３７ ３’領域）、およびＧＳＴＭ１ｎｎ（ヌル）遺伝子型は、コントロールに比べてＣＯＰＤ患者において、有意に頻度が増大されることが示される。表１、６、７、および８に示される結果によって、ＭＭＰ１２Ｇ対立遺伝子／２Ｇ２Ｇ遺伝子型（−１６０７プロモーター）、Ｐ対立遺伝子／ＰＰ遺伝子型（コドン１０）、Ｇ対立遺伝子／ＣＧ遺伝子型（＋７６０エキソン）、およびＴＴ遺伝子型（−１２９６プロモーター）は、ＣＯＰＤ患者に比べて、耐性喫煙者において有意に頻度が増大されることが示される。
【表１ａ】
【表１ｂ】
【表２ａ】
【表２ｂ】
【表３ａ】
【表３ｂ】
【表４ａ】
【表４ｂ】
【表５ａ】
【表５ｂ】
【表６ａ】
【表６ｂ】
【表７ａ】
【表７ｂ】
【表８ａ】
【表８ｂ】
【表９】
【００７０】
（複合解析のまとめ）
表１０および１１は、ＣＯＰＤ患者と、耐性喫煙者と、コントロールとの間の０、１、および≧２の頻度の防御的遺伝子型または感受性遺伝子型を比較する結果をまとめる。ＣＯＰＤを有する喫煙者では、耐性喫煙者に比べて、０の防御的遺伝子型を有する人数が有意に多かった。反対に、耐性喫煙者では、ＣＯＰＤを有する喫煙者に比べて、≧２の防御的遺伝子型を有する人数が有意に多かった。０．１および≧２の頻度の感受性遺伝子型を比べた場合、ＣＯＰＤを有する喫煙者では、血液ドナーコントロールに比べて、≧２の感受性遺伝子型を有する人数が有意に多かった。コントロールでは、ＣＯＰＤを有する喫煙者に比べて、０の感受性遺伝子型を有する人数が、有意に多かった。
【表１０ａ】
【表１０ｂ】
【表１１ａ】
【表１１ｂ】
図２は、表１０のデータをグラフで示す。このリスク推定（標準化された比によって定量した）によって、本研究における防御的遺伝子型が０であることは、ＣＯＰＤを有する喫煙者のリスクを１６７％まで有意に増大することが示される。逆に、この解析によって、２つ以上の防御的遺伝子型を有する喫煙者が、ＣＯＰＤを有するリスクは６７％低下されることが示される。遺伝的試験の前に喫煙者においてＣＯＰＤの背景リスクが約２０％であるとすると、防御的遺伝子型が０であることは、このリスクを有意に増大する。図３は、表１１のデータをグラフで示す。このリスク推定解析によって、リスクの有意な相違は示されなかったが、２つ以上の感受性遺伝子型がある場合、喫煙者がＣＯＰＤを有するリスクが大きいことを示す傾向が明らかであった。図４〜６は、防御的遺伝子型の数が多いほど、喫煙者においては肺機能がより大きい傾向であることを示す。
【００７１】
（拡大研究の考察）
本研究によって、慢性の喫煙から、肺機能障害およびＣＯＰＤを被るリスクの増大を、単独で、または組み合わせて予測する、遺伝子多形性を同定する、新規な有用性が示される。このリスクの増大の基礎は、以下に起因する可能性が高い：（１）遺伝子発現またはタンパク質機能を変更することが見出された多形性の直接効果、または（２）これらの多形性が、これらの直接効果を有する他の変異と連鎖不均衡（一緒に一貫して遺伝された遺伝的改変体）である、間接的効果。ＣＯＰＤが、喫煙者における多くの多形性の複合効果から生じるという本発明者らの仮説と一致して、本研究は、いくつかの相関する病態生理学的過程に関与するタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が、関与することを示した。詳細には、本研究の結果は、炎症性応答（ＴＧＦβ１）、抗酸化防御、（ＳＯＤ３、ＧＳＴＭ１）、および細胞間質再構築（プロテアーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ１２）、およびそれらのインヒビター（α１アンチトリプシン、ＴＩＭＰ３）を含む）に関与するタンパク質をコードする遺伝子における遺伝的改変が、ＣＯＰＤの発症に寄与する可能性が高いことを示す。本明細書に記載される遺伝的改変体は、喫煙者におけるＣＯＰＤの（ただしそれら自体の）発症に寄与する上記の病態生理学的過程からの遺伝的改変体の総計のサンプルしか示さないようであり、肺機能障害について平均よりもリスクが高い喫煙者を同定する能力を有意に増大する。これに関して、血清コレステロールのような他の生物学的アッセイと同様、本発明の方法は、将来の疾患が、病態生理学的にまたは臨床的に発現する前に、その疾患に対する素因を診断するために用いることができる。肺機能の障害を生じる過程は、ＣＯＰＤを発症するリスクを越えて伸展する（ただし、冠動脈疾患、発作、および肺癌を含む）ことが、疫学的研究によって示される。実際、本研究において記載された多くのタンパク質は、血管の疾患（冠動脈疾患、および発作）および癌に係わっており、このことは、巻きタバコの煙に曝された、血管の疾患および癌について平均よりもリスクが大きい者を同定するのにおいて、本明細書に記載の発明における有用性を示唆する。
【００７２】
（実施例３）
（肺機能障害の研究）
（３．１ 被験体の募集）
最低２０年の総喫煙量年数喫煙していた、欧州の家系の被験体を、２つの供給源から募集した。最初の群は、肺機能の有意な障害を有すると医師によって診断された患者（この場合、慢性閉塞性肺疾患と呼ばれた）であって、以下の基準を満たした：５０歳を超えており、かつ４０歳を超えてから息切れの症状を発症し、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ比（1秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。８４例の被験体を募集し、その５６％が男性であり、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．４４（０．１２）であって、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３３（１３）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（９）、および４５年（２９）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１アンチトリプシン変異体（ＳおよびＺ改変体）についてＣＯＰＤ群を遺伝子型特定したが、どれもＺ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有さなかった。本発明者らは、また、５８例の欧州人の被験体であって、最低２０年の総喫煙量年数、喫煙し、かつ過去に息切れを被ったことも、閉塞性肺疾患（詳細には、喘息または慢性閉塞性肺疾患）と診断されたこともない被験体を研究した。このコントロール群は、老人クラブを通して募集したが、５７％の男性から構成され、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．８２（０．０８）であって、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、９７（１１）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５４歳（１１）、および４６年（２８）であった。
【００７３】
遺伝子型特定法、および候補遺伝子は、前の実施例に記載のとおりである。
【００７４】
（３．２ 正常な肺機能、および肺機能の障害を有する喫煙者における、５つの遺伝的改変体を、個々に、および集団として比較する結果）
喫煙者を肺機能の３分位（tertiles）（ＦＥＶ１予測パーセント、絶対的ＦＥＶ１、およびＦＥＶ１／ＦＶＣ）に小分割したとき、本発明者らは、最低の３分位群において、過剰の感受性の遺伝的改変体へ向かうという有意な傾向を見出す（以下の表１〜３を参照のこと）。
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【００７５】
肺機能に対する１つ以上の感受性改変体を有することの全体的な効果を以下のボックスプロットで検討する。遺伝子感受性改変体の数の増大につれて、徐々に肺機能（ＦＥＶ１予測パーセント、絶対ＦＥＶ１、およびＦＥＶ１／ＦＶＣ）の悪化が生じるという一貫した傾向がある（図１〜３を参照のこと）。
【００７６】
ロジスティック回帰分析（全ての変数について調節した後）において、ステップワイズ変数選択によって、肺機能の各々のパラメーターについて、有意に関連したいくつかの遺伝的要因、および非遺伝的要因を見出した（以下の表４にまとめた）。
【表１６】
【００７７】
（結果の考察）
本発明者らの研究の結果によって、本発明者らの感受性改変体は、喫煙者の群において、肺機能の障害と関連することが示される。これは、ボックスプロットに示される、肺機能に対する遺伝子型の影響を本発明者らが分析する場合である（図１〜３）。詳細には、ボックスプロットの結果は、感受性改変体の数によって被験体を分割するとき、肺機能障害との強力な逆線形関係（後者が、絶対的ＦＥＶ１、ＦＥＶ１予測パーセント、またはＦＥＶ１／ＦＶＣのいずれによって評価されようと）が示されることを示す。逆に、被験体をその肺機能によって３分位に分割する場合、その結果によって、最も障害された肺機能を有する被験体が、本発明者らの感受性遺伝子改変体の最大の頻度を有することが一貫して示される（表１〜３を参照のこと）。最後に、ステップワイズロジスティック回帰において、ほとんどの共分散について調整した後、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子の感受性改変体は、肺機能障害に寄与する（表４を参照のこと）。
【００７８】
本発明の方法およびその応用に対して直接関連するのは、連鎖不均衡である。これは、遺伝的な現象であって、２つ以上の変異体または多形性が、かなり密接な遺伝的近接性であって、それらが実質的に常に同時遺伝される、現象である。このことは、１つの多形性についての遺伝子型特定において、連鎖不均衡において別の多形性の存在が推測され得ることを意味する。従って、本明細書に記載の遺伝的改変体との連鎖不均衡にある任意の遺伝的改変体（変異体、または多形性）はまた、本明細書に記載の本発明の概念に包含される。このような改変体は、本明細書に含まれる刊行物において、および確立された文献において記載される。
【００７９】
上記のデータは、肺機能の障害が、慢性呼吸疾患（ＣＯＰＤ、喘息、気管支拡張症、細気管支炎）に対する素因、およびそれによる死亡だけではなく、心臓血管疾患（冠動脈疾患、および発作）、および特定の癌（肺癌）のための有用な診断試験であるという疫学的知見の背景にある新規な生物学的関連性を提供する。本発明は、特定の遺伝的感受性改変体であって、肺機能の障害を決定するだけでなく、アテローム発生／血栓症、および癌を生じる病態生理学的過程の背景にも関与する、遺伝的な感受性改変体を特定する。
【００８０】
本発明は、特定の実施例および好ましい実施形態を参照して記載されたが、本明細書に記載される本発明の概念の原理および趣旨を組み込む改変および変更がまた、本発明の範囲内であることは、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】感受性の遺伝子改変体の数に対してプロットした、ＣＯＰＤを有する人の割合であって、これは、線形の関係を示し、この関係は、４つ以上の感受性の改変体を有する人においては、ＣＯＰＤを有する推定の尤度が８０％程度の高さである。
【図２】表１０におけるデータのグラフ表示。このリスク推定（標準化された比によって定量される）によって、この研究における防御的遺伝子型の存在が０であれば、喫煙者がＣＯＰＤを有するリスクは１６７％まで有意に増大することが示される。逆に、この解析によって、喫煙者（２つ以上の防御的遺伝子型を有する）がＣＯＰＤを有するリスクは、６７％低下することが示される。遺伝子試験の前に、喫煙者におけるＣＯＰＤの背景的リスクが約２０％であることを考慮すれば、防御的遺伝子型の存在が０であれば、このリスクは有意に増大する。
【図３】表１１におけるデータのグラフ表示。リスク推定解析によって、リスクには有意な相違はないことが示されたが、傾向としては、２つ以上の感受性遺伝子型の存在において喫煙者がＣＯＰＤを有するリスクがより大きいことが明らかに示された。
【図４】図４は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図５】図５は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図６】図６は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図７】図７は、喫煙者における予測ＦＥＶ１パーセントと遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、喫煙者における絶対ＦＥＶ１と遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、喫煙者におけるＦＥＶ１／ＦＶＣと遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【引用文献】
【００８２】
【文１】
【００８３】
【文２】
【００８４】
【文３】
【００８５】
【文４】
【００８６】
【文５】
【００８７】
【文６】
【００８８】
【文７】
【００８９】
【０００１】
本発明は、肺の機能、および／または障害の評価のための、そして詳細には、喫煙者および非喫煙者における慢性閉塞性肺疾患の素因および／または重篤度を診断するための方法であって、遺伝的多形性および変更された遺伝子発現の解析を用いる方法、に関連する。本発明はまた、肺機能の障害を診断するための方法、そして詳細には、障害された肺の機能の素因、および／または重篤度、ならびに他の疾患の関連の罹患／死亡リスクを診断する方法に関する。本発明はまた、この方法における使用のための組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、先進国における死亡の４番目に主な死亡原因であって、世界中の病院入院の主な原因である。慢性閉塞性肺疾患は、潜伏性の炎症および進行性の肺の破壊によって特徴付けられる。慢性閉塞性肺疾患は、罹患した喫煙者によって労作性の息切れが気付かれた後に、臨床的に明白になるが、その時、肺機能の５０％以上が既に不可逆的に損われている。肺の機能のこの損失は、呼気流量（特に、１秒間努力呼気容量、すなわちＦＥＶ１）の低下によって臨床的に検出される。９５％を上回るＣＯＰＤが、巻きタバコ（cigarette）喫煙に起因するが、ＣＯＰＤを発症する喫煙者（感受性の喫煙者）は、わずか２０％程度である。驚くべきことに、喫煙は、肺機能の障害のわずか約１６％の原因としかならないことが、研究によって示される。兄弟姉妹（双子もそれ以外も）における一致を比較する多数の家族研究によって、強力な家族性の傾向が一貫して示され、ＣＯＰＤ疾患感受性（または疾患改変）遺伝子の研究は進行中である。
【０００３】
気道疾患の処置における進歩にもかかわらず、現在の治療は、呼吸の不全および死亡を生じる肺機能の進行性の損失を伴うＣＯＰＤの自然歴を有意に変更することはない。喫煙の中止は、肺機能における低下を軽減することが示されているが、喫煙の中止が、感受性の喫煙者にとって、喫煙の最初の２０年程度のうちに達成されなければ、その損失は、無視できないものであり、息切れの悪化の症状は、避けられないものになる。喫煙者を補助する技術はまったく限られた成功しか有さないことが、喫煙中止研究によって示される。血清コレステロールの発見およびその冠動脈疾患に対する関連と同様に、リスクのある喫煙者を特定する試験を開発することができて、そして、喫煙の有害作用を低下させる新しい処置法を発見することができるように、ＣＯＰＤに寄与する要因をさらによく理解する必要がある。
【０００４】
多数の疫学的研究によって、総喫煙量年数（pack year）２０年以上の曝露用量で、肺機能における分布が、三峰性の傾向であることが一貫して示された。この三峰性とは、６０年＋の総喫煙量年数の後でさえ、正常な肺機能を維持する喫煙者（抵抗性喫煙者）の割合と、症状を決して発症しそうにない肺機能のおだやかな低下を示す割合と、必ずＣＯＰＤを発症する、肺機能の加速的な損失を示す割合とであった。このことは、喫煙者の中で３つの集団、すなわち、ＣＯＰＤの発症に抵抗性の集団、リスクのおだやかな集団、およびより高リスクの集団（感受性喫煙者と命名される）が存在することを示唆する。
【０００５】
ＣＯＰＤの背景にある病態生理学は、まだ理解されていない。肺において巻きタバコの煙に対して曝されることによって、炎症性応答および酸化負荷の両方が生じ、これが少なくとも４つの過程を開始する。多数のサイトカインが局所的に放出されて、好中球およびマクロファージの両方が、肺に補充される。
【０００６】
ＣＯＰＤは、異種の疾患であって、種々の程度まで、気腫および慢性気管支炎を包含するが、これらは、慢性のタバコの煙への曝露および他の空気汚染に由来する炎症性侵襲後の再構築過程の一部として発症する。多くの遺伝子が、ＣＯＰＤの発生に関与するようである。
【０００７】
さらに、スパイロメーター（肺活量計）法によって測定された、肺機能の障害によって、閉塞性肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、および細気管支炎）の存在、および／またはこのような閉塞性肺疾患に向かう傾向を診断する直接法（Subramanian Dら、1994）、ならびに冠動脈疾患、発作、および肺癌のような他の疾患からの罹患／死亡のリスクを評価する直接方法（Hole DJら、1996、Knuiman MWら、1999、Sorlie PDら、1989、Bang KMら、1993、Rodriguez BLら、1994、およびWeiss STら、1995）が提供されることが、疫学的研究によって示された。
スパイロメーター法によって現在測定されるような肺機能の障害は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気管支拡張症、および細気管支炎のような閉塞性肺疾患の存在および重篤度を評価する臨床的基礎であると長らく認識されている。慢性の喫煙の存在において、これらの障害は、１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）の低さ、推定の１秒間努力呼気容量パーセントの低さ、および努力肺活量を上回る１秒間努力呼気容量の比の低下によって反映されるような可逆性が最小の気道閉塞によって特徴付けられ得る（一般の参考文献）。
【０００８】
過去２０年間にわたる疫学的研究によって、ＣＯＰＤ以外の死因（とりわけ、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、発作、および肺癌）による死亡リスクを有する、肺機能の障害（ほとんどの場合ＦＥＶ１）の間の関連を検討した。これらは、慢性的に巻きタバコの煙に対して曝されたことの結果として十分に認識されるが、これらの合併症によって死亡する喫煙者はわずかな割合でしかないことが疫学的研究から明白である。しかし、逆に、ＣＯＰＤおよび肺癌の９０％より多くが、慢性の巻きタバコの煙に対する曝露に起因する。喫煙は、冠動脈疾患の死亡に寄与する、最も重要なライフスタイルのリスクファクターと考えられる。疫学的研究によって多様な群の被験体を募集したが、彼らは、ＣＯＰＤだけでなく、ＣＡＤ、発作、および肺癌による死亡についても、重大かつ独立したリスクファクターとして、ＦＥＶ１（または関連の指標）の低下を、一貫して特定している（Hole DJら、1996、Kuniman MWら、1999、Sorlie PDら、1989、Athonisen NR、1989、Bang KMら、1993、Rodriguez BLら、1994、およびWeiss STら、1995）。これらの研究のうち最大のものでは、肺機能の障害に起因するＣＡＤによる死亡のリスクは、血清コレステロールについてのリスクと同じ程度大きかった（Hole DJら、1996）。ＣＡＤについてのＦＥＶ１の低下と関連した死亡リスクは、喫煙者および非喫煙者の両方について見られるが、前者（喫煙者）において約２倍強力である（Hole DJら、1996）。
【０００９】
慢性閉塞性肺疾患、肺癌、発作、および冠動脈疾患は全て家族性であること、ならびに慢性の巻きタバコの煙への曝露は、これらの疾患の発症に対する重要な環境上の寄与因子であることが、長らく認識されている。前向き研究によって、ＦＥＶ１の低下は、これらの疾患全てに対するリスクの増大の確実な予測因子であることが示されたが、この感受性のために肺が、臨床的に十分、検出可能（肺機能試験の低下によって）であるほど損なわれるには、３０年以上の慢性の喫煙を要するかもしれない。
【００１０】
被験体が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）のような肺の障害を発症する素因、または肺機能の障害を発症する素因、ならびに閉塞性肺疾患の関連のリスク、ならびにＣＡＤ、発作、および肺癌のような関連の疾患のリスクを評価するために用いることができる方法を有することは、特に、被験体が喫煙者であるか、そして／または酸化的ストレスに対する感受性の増強を有する場合に、所望され、かつ有利である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、特定の遺伝子および遺伝子の群のプロモーター多形性、特に、細胞間質再構築、抗酸化的防御、炎症性応答、およびそれらのインヒビターに関与するプロモーター多形性が、コントロール被験体よりもＣＯＰＤを有する患者でしばしば見出されるという驚くべき知見に一部基づく。別の部分では、本発明は、これらの遺伝子、および／またはそれらの調節領域における多形性が、喫煙者における肺機能の障害の重篤度と関連するというさらなる驚くべき知見に基づく。
【００１２】
今までのところ、ＣＯＰＤ／気腫、または肺機能障害に対する寄与において、いくつかの「感受性」遺伝子改変体の集合効果（相加的、防御的、または相乗的）を評価することはできなかった。従って、ＣＯＰＤ／気腫感受性遺伝子のいくつかの改変体（変異体、および／または多形性）の存在は、ＣＯＰＤ／気腫、および／または肺機能障害を有するという、より大きいリスクを、単純な相加的モデルにおいて、付与するようである。
【００１３】
従って、１つの局面によれば、慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００１４】
別の局面によれば、喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子のこの調節領域および／またはプロモーター領域中の変異体の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００１５】
別の局面によれば、慢性閉塞性肺疾患の発症の可能性を被験体において診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼのこのプロモーター領域における変異の存在は、この疾患の発症の可能性または重篤度の指標である。
【００１６】
別の局面によれば、喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発現の可能性を診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼのこのプロモーター領域中の変異体の存在は、この疾患の発現の可能性または重篤度の指標である。
【００１７】
好ましくは、このメタロプロテイナーゼは、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）から選択される。好ましい多形性（変異）は、間質性コラゲナーゼのプロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢのプロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性である。
【００１８】
調節性および／またはプロモーター多形性の上記決定が、メタロプロテイナーゼ遺伝子の１つまたは組み合わせで実行され得ることが、当業者に理解される。従って、ＣＯＰＤを発症する被験体の素因の評価は、例えば、間質性コラゲナーゼのプロモーター領域、またはゼラチナーゼＢのプロモーター領域、またはマクロファージエスラスターゼのプロモーター領域のみの解析に基づいてもよい。しかし、これらの遺伝子の組み合わせの調節および／またはプロモーター多形性の組み合わせは、任意の組み合わせの２つまたは３つ全てが、本発明の方法において用いられることが好ましい。
【００１９】
なお別の局面によれば、慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築に関与するか、またはそれに関連する遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の組み合わせの解析を包含し、ここで、これらの領域中の多形性の存在は、この疾患を発症する素因の指標である。
【００２０】
好ましくは、３つの細胞間質メタロプロテイナーゼ遺伝子の全て、すなわち、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）における多形性が、本発明の方法において用いられる。
【００２１】
しかし、メタロプロテイナーゼ遺伝子における多形性と組み合わせて、他の公知の遺伝子（例えば、α１アンチトリプシン、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）における多形性は、本発明の方法において用いることができる。２つ以上の遺伝子多形性の任意の組み合わせは、本発明の方法において用いることができるが、必要に応じて、本明細書に記載される遺伝子の全てにおける多形性が用いられる。
【００２２】
別の局面によれば、先の局面のいずれか１つの方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットが提供される。
【００２３】
この好ましいプライマー、および／またはプローブは、本明細書に記載される関連遺伝子のプロモーターおよび調節領域の多形性領域にまたがるか、またはまたがるために用いることができる、ヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットである。
【００２４】
本発明の文脈においては、「多形性（polymorphism）」という用語は、任意の改変体および変異体（遺伝子が全く存在しないか、または部分的に存在しない（例えば、ヌル（null）変異）ことを含む）を記載するために用いられることが理解される。
【００２５】
慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の潜在的なリスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
【００２６】
喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する潜在的リスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
【００２７】
好ましくは、このメタロプロテイナーゼは、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）である。この好ましい多形性（変異）は、間質性コラゲナーゼの上記プロモーターにおける１Ｇ／２Ｇである。好ましい炎症性サイトカインは、トランスフォーミング成長因子β１であり、この好ましい多形性（変異）は、トランスフォーミング成長因子β１のコドン１０におけるヌクレオチドＴからＣの置換である。この細胞間質メタロプロテイナーゼの好ましいインヒビターは、メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（Tissue Inhibitor）であり、この好ましい多形性は、−１２９６位でのＴからＣの置換である。酸化体代謝に関与する好ましい酵素は、スーパーオキシドディスムターゼ３であり、そしてこの好ましい多形性（変異）は、７６０位でのＣからＧへの置換である。
【００２８】
なお別の局面において、被験体の慢性閉塞性肺疾患の発症の潜在的リスクを決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形成の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在は、ＣＯＰＤに感受性の遺伝子型の指標である。
【００２９】
さらなる局面において、喫煙者であるか、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する潜在的リスクを決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して感受性の遺伝子型の指標である。
【００３０】
好ましくは、メタロプロテイナーゼは、マクロファージエラスターゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１２、すなわちＭＭＰ−１２）であり、そして好ましい多形性は、−８２位でのＡからＧの置換である。好ましいグルタチオントランスフェラーゼは、グルタチオンＳトランスフェラーゼ１であり、そしてこの好ましい多形性は、Ｍ１ヌル多形性である。この好ましいプロテアーゼインヒビターは、α１アンチトリプシンであり、そしてこの好ましい多形性は、３’Ｔａｑ１多形性である。
【００３１】
別の局面によれば、肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこの遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因およびそれに関連する健康上のリスクの指標である。
【００３２】
別の局面によれば、喫煙者である被験体か、または高レベルの酸化的ストレスに曝された被験体において、肺機能の障害を発症する素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこのタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である。
【００３３】
別の局面によれば、肺機能の障害の発現の可能性を被験体において診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害の発症の可能性、または重篤度の指標である。
【００３４】
別の局面によれば、喫煙者である被験体か、または酸化的ストレスに曝された被験体において、肺機能の障害の発現の可能性を診断する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここでこのタンパク質における変異の存在は、肺機能の障害の発現の可能性または重篤度の指標である。
【００３５】
なお別の局面によれば、肺の障害に関連する疾患の罹患／死亡のリスクを発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで、この遺伝子の１つ以上における変異の存在は、この疾患の罹患／死亡のリスクを発症する素因の指標である。
【００３６】
好ましくは、この疾患は、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、発作、および肺癌からなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、この細胞間質再構築タンパク質は、α１−アンチトリプシン、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）から選択される。好ましくは、酸化的ストレスタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼである。この好ましい多形性（変異）は、α１−アンチトリプシンの３’領域における１２３７のＧからＡ、間質性コラゲナーゼのプロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢのプロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２の多形性、および／またはこれらの多形性と連鎖不均衡である多形性である。好ましくは、酸化的ストレスタンパク質は、グルタチオンＳトランスフェラーゼから選択される。
【００３８】
感受性の多形性の決定が、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の組み合わせにおいて実行され得ることが当業者によって理解される。従って、肺機能の障害を発症する、被験体の素因の評価は、例えば、間質性コラゲナーゼのプロモーター領域、またはゼラチナーゼＢのプロモーター領域、またはマクロファージエラスターゼのプロモーター領域のみの解析に基づいてもよい。しかし、これらの遺伝子の組み合わせの多形性は、任意の組み合わせの２つまたは３つ全てが、本発明の方法において用いられることが好ましい。
【００３９】
なお別の局面によれば、肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定する方法が提供され、この方法は、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子における２つ以上の多形性の解析を包含し、ここでこの遺伝子における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である。
【００４０】
好ましくは、５つの遺伝子全てにおける多形性、すなわち、α１−アンチトリプシン、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）、およびグルタチオンＳトランスフェラーゼにおける多形性が、本発明の方法において用いられる。
【００４１】
別の局面によれば、先の局面のいずれか１つの方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセットが提供される。
【００４２】
この好ましいプライマー、および／またはプローブは、細胞間質再構築タンパク質（プロテアーゼ、および／またはそれらのインヒビターを含む）、炎症性タンパク質、および酸化的ストレス応答性タンパク質をコードする遺伝子、ならびに本発明の方法において用いられる他の遺伝子の多形性領域にまたがるか、またはまたがるために用いることができる、プライマー、および／またはプローブである。
【００４３】
本明細書において「喫煙者（smokers）」という場合、その用語はまた、元喫煙者（ex-smokers）を包含することが意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
症例コントロール研究を用いて、本発明者らは、喫煙者および血液ドナーにおいて候補遺伝子のいくつかの遺伝的改変体（多形性）の頻度を比較した。これらの候補遺伝子のほとんどで、遺伝子発現またはタンパク質機能に対する機能的影響を確認した（またはそのようである）。詳細には、本発明者らは、血液ドナーコントロールと、抵抗性喫煙者と、ＣＯＰＤを有する者（早期発現を有する者と、正常な発現を有する者に小分割される）との間の多形性の頻度を比較した。本発明は、選択された候補遺伝子多形性に由来する防御性遺伝子型および感受性遺伝子型の両方が存在することを実証する。ＣＯＰＤは、多遺伝子の障害であり、多くの遺伝子型が、任意の１例の感受性の喫煙者におけるＣＯＰＤの発症に関与しているようであると考えれば、単なる単純な遺伝的モデルを調査してもよい（すなわち、感受性遺伝子型および防御的遺伝子型の正味の影響は未知である）。本明細書に記載される１つの実施形態においては、３つの感受性遺伝子多形性、および４つの防御的遺伝子多形性が同定される。これらの多形性の組み合わせ効果の統計学的解析によって、本発明の遺伝的アッセイは、ＣＯＰＤを発症するリスクが、より大きい喫煙者を同定するために用いることができることが示される。
【００４５】
従って、本明細書に記載されるような、喫煙者および非喫煙者の十分規定された群におけるこれらの多形性の頻度の系統的解析によって、予測的な目的で、ＣＯＰＤの発症に特定のタンパク質を結び付けて、どの喫煙者が、肺機能の障害およびＣＯＰＤを発症するリスクが増大したかを特定する能力を改善することが可能である。
【００４６】
これらの疾患の１つまたは組み合わせを罹患するのは、喫煙者のごく少数のみであるので、遺伝子機構の組み合わせ効果、および高い酸化体曝露を通じて、肺疾患（ＣＯＰＤおよび肺癌）に関連する喫煙のリスクが最高である「感受性喫煙者（susceptible smokers）」が存在し得る。現在までの疫学的知見を考えれば、この遺伝的感受性はまた、他の喫煙関連障害（例えば、ＣＡＤ、および発作）に対する素因に伸展する可能性が高い。
【００４７】
さらに、本発明者らは、ＦＥＶ１の低下が、慢性の喫煙、および酸化的ストレスの有害な影響に対する一般的感受性のバイオマーカーであると考える。すなわち、慢性の酸化的ストレスの条件（慢性の巻きタバコの煙に対する曝露で見られるような）下で、細胞間質再構築、炎症、および／または酸化的ストレスに関与するタンパク質の活性において変化が存在する。長期間におよぶ、これらのタンパク質（代表的には酵素）の活性の変化によって、慢性閉塞性肺疾患を生じる、肺の炎症、線維症、および実質性の障害の促進がもたらされ、そして肺癌に寄与する。これらの同じプロセスが、動脈壁において生じ、それによって粥状斑の進行、および／または不安定性を促進し、冠動脈疾患および発作の発生がなければ、粥状斑の血栓形成への進行が生じる（Waltenberger J.2001）。次に、血栓形成が不安定狭心症（アンギナ）、急性心筋梗塞、および発作（その全てが高い死亡率を有する）の臨床的実態をもたらす。炎症、細胞間質再構築、および／または酸化的ストレスに対する応答の過程は、これらの臨床実態を特徴付ける斑の不安定性に寄与し得ることが提唱される。この状況では、ＦＥＶ１の低下は、有害な細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスによる障害の増強に対する感受性を有する者の間接的なバイオマーカーである。従って、これらの機構はＦＥＶ１を低下させ、そしてこれらの疾患についての死亡リスクは、細胞間質再構築タンパク質、炎症性タンパク質、および酸化的ストレスに対する個々の固有の応答の活性を通じて関連付けられ得る。ＦＥＶ１の低下は、これらの疾患全てに対するリスクの増大の信頼性のある予測因子であるが、この感受性のために肺が臨床的に検出可能である（低下した肺機能試験による）のに十分であるほど障害されるまでには、３０年以上の慢性の喫煙を要し得る。本発明の方法は、この不利な点を克服する。
【実施例】
【００４８】
本発明は、非限定的な実施例を参照して、ここで、より詳細に記載される。
【００４９】
（実施例１）
（予備的研究）
（１．１ 被験体の募集）
ＣＯＰＤの悪化によって病院に入院した欧州人の家系の患者を、継続的に募集した。最小２０年間の総喫煙量年数の間、喫煙して、７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ１比（１秒間努力呼気容量／努力肺活量）、および７０％未満のＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有する被験体として、ＣＯＰＤを規定した。専門の医師によってＣＯＰＤと診断された、上記の肺機能試験を有する患者を募集したが、その募集条件は、それらの患者が、５０歳を超えており、かつ４０歳を超えてから息切れの症状を発症した場合とした。喘息、気管支拡張症、または肺手術の病歴を有する患者は除外した。８４例の患者を募集したが、その５６％が男性であり、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．４４（０．１２）、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３３（１３）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（９）、および４５年（２９）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１−アンチトリプシン変異（Ｓ改変体およびＺ改変体）についてＣＯＰＤ群を遺伝子型特定したが、どれもＺ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有さなかった。本発明者らはまた、地域的な血液ドナーサービスを通じて継続的に募集した１７８例の欧州人の血液ドナー（喫煙状況不明）を研究した。５５％が男性で、その平均年齢は、４５歳であった。
【００５０】
（１．２ ＭＭＰ１プロモーター多形性遺伝子型特定）
ゲノムＤＮＡを全血サンプルから抽出した（Maniatis,T、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法（Dunleaveyら、2000、その全体が参考として本明細書に援用される）のわずかな変法によって、ＭＭＰ１プロモーター多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’-ＴＣＧ−ＴＧＡ−ＧＡＡ−ＴＧＴ−ＣＴＴ−ＣＣＣ−ＡＴＴ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＴＣＴ−ＴＧＧ−ＡＴＴ−ＧＡＴ−ＴＴＧ−ＡＧＡ−ＴＡＡ−ＧＴＧ−ＡＡＡ−ＴＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応は、総容積２５μｌ中で実行し、これには、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃２分間のインキュベーション、その後の９２℃４５秒、６０℃５０秒、および７２℃５０秒の３５サイクルであった。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物（１１８ｂｐ）を可視化した。残りを１０単位のＡｓｐ７００（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で４時間消化した。ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで２．５時間泳動した３％アガロースゲル上で、消化した産物を分離した。このＰＣＲ産物は、２Ｇ対立遺伝子の存在下で未切断のまま（すなわち、１１８ｂｐ）であるか、または１Ｇ対立遺伝子の存在下で、１００ｂｐおよび１７ｂｐのバンドに切断された。上記の方法によって、遺伝子型１Ｇ１Ｇ、１Ｇ２Ｇ、または２Ｇ２Ｇを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、１Ｇまたは２Ｇ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００５１】
（１．３ ＭＭＰ９プロモーター多形性遺伝子型）
実施例３に記載された同じ方法によって、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｇｅｌｂ１（５’−ＧＣＣ−ＴＧＧ−ＣＡＣ−ＡＴＡ−ＧＴＡ−ＧＧＣ−ＣＣ−３’）、およびｇｅｌｂ２（５−ＣＴＴ−ＣＣＴ−ＡＧＣ−ＣＡＧ−ＣＣＧ−ＧＣＡ−ＴＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ（その全体が参考として本明細書において援用される、Zhang Bら、1999によって公開された方法の改変）によって、ゼラチナーゼＢ（ＭＭＰ９）Ｃ−１５６２Ｔプロモーター多形性の遺伝子型特定を実施した。ＰＣＲ増幅を、ＰＴＣ−１００サーモサイクラー（MJ Research、Inc.）において、２５μｌの反応混合物中で実施した。この反応混合物は、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマー５０ｎｇ、２０μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５単位Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、および０．００１％ゼラチンであった。ＰＣＲサイクル条件は以下であった：初期変性段階、９５℃、３分間、３５サイクルのＰＣＲ（９２℃、５０秒間の変性、６６℃４８秒間のアニーリング、および７２℃５８秒間の伸長）、その後の７２℃５分間の１サイクルの伸長。ＰＣＲ産物の４μｌのアリコートを、推奨される緩衝系において１０Ｕの制限酵素ＳｐｈＩ（LifeTech）を用いて、３７℃で５時間消化した。全ての消化物を３％アガロースゲル上で分析した。上記の方法によって、遺伝子型ＣＣ、ＣＴ、またはＴＴを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＣおよびＴの対立遺伝子を正確に特定したことを確認した。
【００５２】
（１．４ ＭＭＰ１２プロモーター多形性遺伝子型）
実施例３に記載された同じ方法によって、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｈｍｅｐ１（５’−ＡＧＡ−ＴＡＧ−ＴＣＡ−ＡＧＧ−ＧＡＴ−ＧＡＴ−ＡＴＣ−ＡＧＣ−Ｔ−３’）、およびｈｍｅｐ２（５−ＧＧＣ−ＴＴＧ−ＴＡＧ−ＡＧＣ−ＴＧＴ−ＴＣＡ−ＧＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ（その全体が参考として本明細書において援用される、Jormsjo Sら、2000によって公開された方法の改変）によって、ヒトマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ１２）Ａ−８２Ｇプロモーター多形性の遺伝子型特定を実施した。ＰＣＲ増幅を、ＰＴＣ−１００サーモサイクラー（MJ Research、Inc.）において、２５μｌの反応混合物中で実施した。この反応混合物は、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマー５０ｎｇ、２０μＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５単位Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、および０．００１％ゼラチンであった。ＰＣＲサイクル条件は以下であった：初期変性段階、９５℃、２分間、３５サイクルのＰＣＲ（９２℃、５０秒間の変性、６６℃４８秒間のアニーリング、および７２℃５８秒間の伸長）、その後の７２℃５分間の１サイクルの伸長。ＰＣＲ産物の４μｌのアリコートを、推奨される緩衝系において１０Ｕの制限酵素ＰｖｕＩＩ（LifeTech）を用いて、３７℃で５時間消化した。全ての消化物を３％アガロースゲル上で分析した。上記の方法によって、遺伝子型ＡＡ，ＡＧ、またはＧＧを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＡおよびＧの対立遺伝子を正確に特定したことを確認した。
【００５３】
遺伝子型は、２名の研究者によって独立して割り当てられ、表現型（ＣＯＰＤ、およびコントロール）の状態は伏せられていた。対立遺伝子および遺伝子型の頻度における相違を、コーンフィールド９５％信頼限界（ｐ≦０．０５として採用した有意差によるイェーツ補正χ２二乗検定）を用いて、オッズ比によって比較した。
【００５４】
（１．５ ＭＭＰ１／ＭＭＰ９／ＭＭＰ１２プロモーター対立遺伝子、および遺伝子型頻度）
本発明者らの遺伝子型特定データの解析によって、ハーディ・ワインバーグ平衡が、両方のコホートにおいて満たされたこと、および有意差が見出されたことが示された（表１、２、および３に要約される）。
【表１】
上記のデータによって、ＭＭＰ１ １Ｇ／２Ｇ、ＭＭＰ９Ｃ−１５６２Ｔ、およびＭＭＰ１２Ａ−８２Ｇのプロモーター多形性が、独立して、ＣＯＰＤの発症に対する感受性についての候補の遺伝子座であることが示される。ＭＭＰ１の場合、２Ｇ対立遺伝子頻度、および２Ｇ２Ｇ遺伝子型頻度の両方が、健康なコントロール集団においてよりも、ＣＯＰＤ患者において有意に多く広がっていた（それぞれ、６０％対４５％、および３９％対２１％）。同様に、ＭＭＰ９の場合、Ｔ対立遺伝子頻度およびＣＴ／ＴＴ遺伝子型頻度の両方が、健康なコントロール集団においてよりもＣＯＰＤ患者において、有意に多く広がっていた（それぞれ、２６％対１５％、および４７％対２９％）。最後に、ＭＭＰ１２の場合、Ａ対立遺伝子頻度、およびＡＡ遺伝子型頻度の両方が、健常なコントロール集団よりもＣＯＰＤ患者において有意に多く広がっていた（それぞれ、９０％対８０％、および８０％対６４％）。
【００５６】
（１．６ α１−アンチトリプシン３’Ｔａｑ１多形性の遺伝子型特定）
ゲノムＤＮＡを、先の実施例のように、全血から抽出した。以前に公開されたプライマー（Sandford AJら、1997b）を用いて、以下の方法によって、α１−アンチトリプシン３’Ｔａｑ１多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＴＡ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＡＴＧ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＴＣＣ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＧＧＴ−ＣＴＧ-ＴＧＴ−ＴＣＡ−ＴＣＣ−３’（リバースプライマー）であった。総容積２５μｌ中で、ＰＣＲ反応を実行し、この反応には、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ，１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃２分間のインキュベーション、その後の９４℃４５秒、６２℃４０秒、および７２℃４５秒の３５サイクル、ならびに７２℃５分の最終サイクルであった。臭化エチジウムで染色した１．５％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物（２０５ｂｐ）を可視化した。ＰＣＲ産物の残りを１０単位のＴａｑ１制限酵素（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、６５℃で４時間消化した。ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで２．５時間泳動した２％アガロースゲル上で、消化した産物を分離した。このＰＣＲ産物は、ｔ（変異）対立遺伝子の存在下で、未切断のままであった（すなわち、２０５ｂｐ）が、Ｔ（野生型）対立遺伝子の存在下では、１３０ｂｐおよび７５ｂｐのバンドに切断された。
【００５７】
（１．７．グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｍ１ヌル多形性の遺伝子型特定）
先の実施例のように、全血からゲノムＤＮＡを抽出した。以前に公開された（Cantlay AMら、1994）プライマーを用いて、以下の方法によって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｍ１ヌル欠失多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＴＧ−ＣＣＣ−ＴＡＣ−ＴＴＧ−ＡＴＴ−ＧＡＴ−ＧＧ−３’；５’-ＡＴＣ−ＴＴＣ−ＴＣＣ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−ＧＴＣ−ＴＣ−３’、および５’−ＴＴＣ−ＴＧＧ−ＡＴＴ−ＧＴＡ−ＧＣＡ−ＧＡＴ−ＣＡ−３’であった。総容積２５μｌ中で、ＰＣＲ反応を実行し、この反応には、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、各々のプライマーの５０ｎｇ、２０μＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５単位のＴａｑポリメラーゼを含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃４５秒、５６℃４８秒、および７２℃４８秒の３５サイクル、ならびに７２℃３分の最終サイクルであった。臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲルの紫外透光によって、６μｌのＰＣＲ産物を可視化した。ＰＣＲ産物は、２０２ｂｐのバンド（増幅のためのＧＳＴＭ４内部コントロール）、および正常なＧＳＴＭ１（ホモ接合体、またはヘテロ接合体）の２７５ｂｐのバンド、または２７５ｂｐのバンドがない（ＧＳＴＭ１ヌル欠失についてのホモ接合性を示す）かのいずれかであった。
【表４】
この多形性は、調節性エレメントを含む領域に位置するが、インビトロ研究では、この遺伝子改変体からの重要な機能的効果を示すことができなかった（Sandfordら、1997）。ＧＳＴＭ１変異に関して、本発明者らは、コントロールにおいて４２％、およびＣＯＰＤ患者において６５％の頻度を見出した。
【００５９】
これらの遺伝的改変体の複合効果を、本発明者らのコントロールとして健常な喫煙者における類似の頻度を推測したロジスティック式（オッズ比推定）で評価した場合、ＣＯＰＤに対する傾向の約４２％（９５％、ＣＩ＝３１〜５６％）が、５つ遺伝子型改変体の各々によって独立して説明できた。グラフ的に検討した場合、感受性の遺伝子改変体の数に対してプロットした、ＣＯＰＤを有する人の割合は、線形の関係であって、４つ以上の感受性の改変体を有する人においては、ＣＯＰＤを有する推定の尤度（可能性）が８０％程度の高さを伴う線形であることが示された（図１を参照のこと）。
【００６０】
本発明者らのＣＯＰＤコホートは、種々の程度の気腫、気管支炎、および可逆性気道閉塞（ＣＯＰＤの喘息成分）を有する患者の異種の群である可能性が高い。
【００６１】
本研究によって、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、および／またはＭＭＰ１２過剰発現が、若干の喫煙者におけるＣＯＰＤの発症の背景であり得るという証拠が得られ、そして、この過程の遺伝的基礎として、２Ｇ対立遺伝子（ＭＭＰ１における）、Ｔ対立遺伝子（ＭＭＰ９における）、およびＧ対立遺伝子（ＭＭＰ１２における）のプロモーター多形性が、初めて直接結び付けられる。
【００６２】
上記のように、本研究において用いられるＣＯＰＤコホートは、ＣＯＰＤの一部として種々の重篤度の気腫を有する患者の異種の群である可能性が高い。本発明者らは、ＭＭＰ １２Ｇ対立遺伝子、および／またはＭＭＰ９ Ｔ対立遺伝子、および／またはＭＭＰ１２ Ａ対立遺伝子の１つ、および／または組み合わせが、関連の細胞間質メタロプロテイナーゼの過剰発現、および気腫の引き続く発症を通じて、ＣＯＰＤの発症に対してそれらの影響を発揮するということを提唱する。しかし、慢性の巻きタバコへの曝露の炎症性刺激がＭＭＰ過剰発現を生じる方法は明確ではない。これに関して、巻きタバコの煙に応答して放出された炎症性サイトカインである（そしてＣＯＰＤの再構築に係わる）腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）が、Ｅｔｓ転写因子結合部位のコア配列に結合することが示されているということは興味深い（von der Aheら、1993）。いかなる特定の作用機序によって拘束されることも望まないが、上記の多形性は、ＴＮＦ−αのような炎症性刺激に対する応答性を増強し得るＥｔｓ転写結合部位に関連し（その近位で見出されるかまたは生成する）、このことは、そのような喫煙者が気腫を発症するリスクをもたらすことが注目される。
【００６３】
（実施例２）
（拡大研究）
ＣＯＰＤの発症に対して感受性の候補遺伝子座としてＭＭＰ１、９、および１２のプロモーター多形性の予備的評価の後に、第二のさらに広範な研究が続いた。この研究は、ＴＧＦβ、ＳＯＤ３、およびＴＩＭＰ３の遺伝子の候補多形性の遺伝子型特定を含んだ。この研究は、防御的遺伝子型、および感受性遺伝子型の両方が、遺伝子のこのサブセット由来であり得るか否かを検討するためにデザインされた。
【００６４】
（２．１ 被験体の募集）
最小１５年の総喫煙量年数、喫煙した、そして慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有すると医師によって診断された欧州の家系の被験体を、２つの母集団から募集した。最初の群は、ＣＯＰＤの悪化によって入院した患者であって、以下の基準を満たした：５０歳を超えており、かつ４０歳以降に息切れの症状を発症しており、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ２比（１秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。１１１例の被験体を募集し、その５８％が男性であり、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±四分位範囲（ＩＲＱ））は、４４％（３７〜５０）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３２（２４〜４７）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（６６〜７７）、および４３年（３０〜５７）であった。募集した第二群は、息切れによって胸部外来診療科を訪れた群であって、その群は、臨床的およびスパイロメーターによるアセスメント後に、ＣＯＰＤを有すると診断され（胸部医師によって）、そして以下の基準を満たした：６５歳未満で、かつ４０歳以降に息切れの症状を発症しており、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ３比（1秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。６１例の被験体を募集し、それらの４３％が男性であって、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±四分位範囲（ＩＲＱ））は、４４％（３８〜５５）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３７（２４〜４７）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５８歳（５３〜６２）、および４１年（３１〜５２）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１アンチトリプシン変異体（ＳおよびＺ改変体）について両方のＣＯＰＤ群を遺伝子型特定して、Ｚ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有するものを除外した。本発明者らは、また、８５例の欧州人の被験体であって、最低２０総喫煙量年数、喫煙し、かつ過去に息切れを被ったことも、閉塞性肺疾患（詳細には、喘息または慢性閉塞性肺疾患）と診断されたこともない被験体を研究した。このコントロール群は、老人クラブを通して募集したが、５８％の男性から構成され、メジアンＦＥＶ１／ＦＶＣ（±ＩＱＲ）は、８２％（７６〜８８）であって、メジアンＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、９４（８７〜１０１）であった。メジアン年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５２歳（４６〜６１）、および３８年（２５〜５９）であった。本発明者らはまた、１７８例の欧州人の血液ドナー（喫煙状態不明）を募集したが、これは、地域の血液ドナーサービスを通じて継続的に募集した。５５％が男性で、その中央年齢は４５歳であった。
【００６５】
コントロールに比べて、ＣＯＰＤ患者において大きい頻度で見出された多形性は、肺機能障害、およびＣＯＰＤの発症に対する感受性の増大を反映し得ることが、本研究によって示される。同様に、感受性の喫煙者（ＣＯＰＤ患者）に比べて、耐性の喫煙者で大きい頻度で見出される多形性は、防御的役割を反映し得る。
【表１２】
（２．２ トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）コドン１０多形性の遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。この（ＴＧＦβ）コドン１０多形性を以前に公開された方法のわずかな変法によって決定した（参考として本明細書に援用される、Syrrisら、1998）。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＡＣＣ ＡＣＡ ＣＣＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＴＣ ＧＣ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＡＧＴ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＡＧＣ ＴＧＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を、総容積２５μｌで実行したが、これには、２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、５００ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１単位のＴａｑポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃５０秒、６６℃６０秒、および７２℃６０秒の３３サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増殖産物の３μｌのアリコートを４単位のＰｓｔＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で１時間消化した。消化した産物を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０ｍＶで２．０時間泳動した２．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。ロイシン（Ｌ）対立遺伝子の存在において、この１１０ｐｂの産物のサイズは８６ｂｐ、および２４ｂｐの産物に切断されたが、プロリン（Ｐ）対立遺伝子の存在下では、この増幅産物は未切断のまま残った。上記の方法によって、遺伝子型ＬＬ、ＬＰ、およびＰＰを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＬまたはＰ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６７】
（２．３ スーパーオキサイドディスムターゼ３（ＳＯＤ３）Ｃ＋７６０Ｇ（Ａｒｇ２１３Ｇｌｙ）多形性の遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法のわずかな変法によって、ＳＯＤ ３Ｃ＋７６０Ｇ多形性を決定した（参考として、本明細書において援用されたUkkolaら、2001）。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＣＣＡ ＧＣＧ ＴＧＧ ＡＧＡ ＡＣＧ ＧＧＡ Ａ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＣＡ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＡ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を２５μｌの総容積中で実行したが、これには、１７５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１ｎｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．５単位Ｔａｑ ポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃３分間のインキュベーション、その後の９４℃５０秒、６６℃６０秒、および７２℃６０秒の３３サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増幅産物の３μｌのアリコートを１０単位のＭｗｏＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、６０℃で１時間消化した。消化した産物（２２１ｂｐ）を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで１．０時間泳動した３．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。Ｇｌｙ−２１３（またはＧ）対立遺伝子の存在において、この２２１ｐｂの産物のサイズは切断されなかったが、野生型Ａｒｇ２１３（またはＣ）対立遺伝子の存在下では、この産物は２つのバンドに切断される。上記の方法によって、遺伝子型ＣＣ、およびＣＧを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＣまたはＧ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６８】
（２．４ メタロプロテイナーゼ３（ＴＩＭＰ３）Ｔ−１２９６Ｃプロモーター多形性の組織インヒビターの遺伝子型特定）
全血サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した（Maniatis,T.、Fritsch,E.F.、およびSambrook,J.,Molecular Cloning Manual.1989）。以前に公開された方法（参考として、本明細書において援用されたBeranek、2000）のわずかな変法によって、ＴＩＭＰ ３Ｔ−１２９６Ｃプロモーター多形性を決定した。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、５’−ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＴＧ ＴＣＡ ＡＴ−３’（フォワードプライマー）、および５’−ＣＴＧ ＧＧＴ ＴＡＡ ＧＣＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＧＣ−３’（リバースプライマー）であった。ＰＣＲ反応を２５μｌの総容積中で実行したが、これには、１μｇのゲノムＤＮＡ、１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー、およびリバースプライマー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．７単位Ｔａｑ ポリメラーゼ（Life Technologies）を含んだ。サイクル時間は、９５℃５分間のインキュベーション、その後の９５℃３０秒、６１℃６０秒、７２℃３０秒の３０サイクルであった。次に、７２℃１０分の最終伸長を続けた。臭化エチジウムで染色した３％アガロースゲルの紫外透光によって、４μｌのＰＣＲ産物を可視化した。増幅産物の１０μｌのアリコートを５単位のＡｌｕＩ（Roche Diagnostics,New Zealand）を用いて、３７℃で一晩消化した。消化した産物（２２１ｂｐ）を、ＴＢＥ緩衝液を用いて８０Ｖで１．０時間泳動した３．５％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウム染色後に紫外透光を用いて、この産物を１２３ｂｐのラダーに対して可視化した。Ｔ対立遺伝子の存在において、この消化されたバンドは、２０１、１２８、６９、５３、および３２であったが、Ｃ対立遺伝子の存在下では、この消化されたバンドは、２０１、１６０、６９、および５５バンドであった。上記の方法によって、遺伝子型ＴＴ、ＴＣ、およびＣＣを割り当てられた３つの被験体において、直接配列決定を実施して、後者が、ＴまたはＣ対立遺伝子の有無を正確に特定したことを確認した。
【００６９】
（ＣＯＰＤ遺伝子関連研究の複合した結果（表９にまとめた））
表３、４、および５に示した比較によって、ＭＭＰ１２Ａ対立遺伝子／ＡＡ遺伝子型（−８２プロモーター）、α１−アンチトリプシンｔ対立遺伝子Ｔｔ／ｔｔ遺伝子型（１２３７ ３’領域）、およびＧＳＴＭ１ｎｎ（ヌル）遺伝子型は、コントロールに比べてＣＯＰＤ患者において、有意に頻度が増大されることが示される。表１、６、７、および８に示される結果によって、ＭＭＰ１２Ｇ対立遺伝子／２Ｇ２Ｇ遺伝子型（−１６０７プロモーター）、Ｐ対立遺伝子／ＰＰ遺伝子型（コドン１０）、Ｇ対立遺伝子／ＣＧ遺伝子型（＋７６０エキソン）、およびＴＴ遺伝子型（−１２９６プロモーター）は、ＣＯＰＤ患者に比べて、耐性喫煙者において有意に頻度が増大されることが示される。
【表１ａ】
（複合解析のまとめ）
表１０および１１は、ＣＯＰＤ患者と、耐性喫煙者と、コントロールとの間の０、１、および≧２の頻度の防御的遺伝子型または感受性遺伝子型を比較する結果をまとめる。ＣＯＰＤを有する喫煙者では、耐性喫煙者に比べて、０の防御的遺伝子型を有する人数が有意に多かった。反対に、耐性喫煙者では、ＣＯＰＤを有する喫煙者に比べて、≧２の防御的遺伝子型を有する人数が有意に多かった。０．１および≧２の頻度の感受性遺伝子型を比べた場合、ＣＯＰＤを有する喫煙者では、血液ドナーコントロールに比べて、≧２の感受性遺伝子型を有する人数が有意に多かった。コントロールでは、ＣＯＰＤを有する喫煙者に比べて、０の感受性遺伝子型を有する人数が、有意に多かった。
【表１０ａ】
【００７１】
（拡大研究の考察）
本研究によって、慢性の喫煙から、肺機能障害およびＣＯＰＤを被るリスクの増大を、単独で、または組み合わせて予測する、遺伝子多形性を同定する、新規な有用性が示される。このリスクの増大の基礎は、以下に起因する可能性が高い：（１）遺伝子発現またはタンパク質機能を変更することが見出された多形性の直接効果、または（２）これらの多形性が、これらの直接効果を有する他の変異と連鎖不均衡（一緒に一貫して遺伝された遺伝的改変体）である、間接的効果。ＣＯＰＤが、喫煙者における多くの多形性の複合効果から生じるという本発明者らの仮説と一致して、本研究は、いくつかの相関する病態生理学的過程に関与するタンパク質をコードするいくつかの遺伝子が、関与することを示した。詳細には、本研究の結果は、炎症性応答（ＴＧＦβ１）、抗酸化防御、（ＳＯＤ３、ＧＳＴＭ１）、および細胞間質再構築（プロテアーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ１２）、およびそれらのインヒビター（α１アンチトリプシン、ＴＩＭＰ３）を含む）に関与するタンパク質をコードする遺伝子における遺伝的改変が、ＣＯＰＤの発症に寄与する可能性が高いことを示す。本明細書に記載される遺伝的改変体は、喫煙者におけるＣＯＰＤの（ただしそれら自体の）発症に寄与する上記の病態生理学的過程からの遺伝的改変体の総計のサンプルしか示さないようであり、肺機能障害について平均よりもリスクが高い喫煙者を同定する能力を有意に増大する。これに関して、血清コレステロールのような他の生物学的アッセイと同様、本発明の方法は、将来の疾患が、病態生理学的にまたは臨床的に発現する前に、その疾患に対する素因を診断するために用いることができる。肺機能の障害を生じる過程は、ＣＯＰＤを発症するリスクを越えて伸展する（ただし、冠動脈疾患、発作、および肺癌を含む）ことが、疫学的研究によって示される。実際、本研究において記載された多くのタンパク質は、血管の疾患（冠動脈疾患、および発作）および癌に係わっており、このことは、巻きタバコの煙に曝された、血管の疾患および癌について平均よりもリスクが大きい者を同定するのにおいて、本明細書に記載の発明における有用性を示唆する。
【００７２】
（実施例３）
（肺機能障害の研究）
（３．１ 被験体の募集）
最低２０年の総喫煙量年数喫煙していた、欧州の家系の被験体を、２つの供給源から募集した。最初の群は、肺機能の有意な障害を有すると医師によって診断された患者（この場合、慢性閉塞性肺疾患と呼ばれた）であって、以下の基準を満たした：５０歳を超えており、かつ４０歳を超えてから息切れの症状を発症し、予測パーセンテージとして７０％未満の１秒間努力呼気容量（ＦＥＶ１）、および７０％未満のＦＥＶ１／ＦＶＣ比（1秒間努力呼気容量／努力肺活量）（アメリカ胸部学会基準を用いて測定した）を有した。８４例の被験体を募集し、その５６％が男性であり、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．４４（０．１２）であって、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、３３（１３）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ７３歳（９）、および４５年（２９）であった。ＰＣＲに基づく方法（Sandfordら、1999）を用いて、本発明者らは、α１アンチトリプシン変異体（ＳおよびＺ改変体）についてＣＯＰＤ群を遺伝子型特定したが、どれもＺ対立遺伝子（ＭＺ、ＳＺ、ＺＺ遺伝子型）を有さなかった。本発明者らは、また、５８例の欧州人の被験体であって、最低２０年の総喫煙量年数、喫煙し、かつ過去に息切れを被ったことも、閉塞性肺疾患（詳細には、喘息または慢性閉塞性肺疾患）と診断されたこともない被験体を研究した。このコントロール群は、老人クラブを通して募集したが、５７％の男性から構成され、平均ＦＥＶ１／ＦＶＣ（±標準偏差）は、０．８２（０．０８）であって、平均ＦＥＶ１（予測パーセンテージとして）は、９７（１１）であった。平均年齢および総喫煙量年数歴は、それぞれ５４歳（１１）、および４６年（２８）であった。
【００７３】
遺伝子型特定法、および候補遺伝子は、前の実施例に記載のとおりである。
【００７４】
（３．２ 正常な肺機能、および肺機能の障害を有する喫煙者における、５つの遺伝的改変体を、個々に、および集団として比較する結果）
喫煙者を肺機能の３分位（tertiles）（ＦＥＶ１予測パーセント、絶対的ＦＥＶ１、およびＦＥＶ１／ＦＶＣ）に小分割したとき、本発明者らは、最低の３分位群において、過剰の感受性の遺伝的改変体へ向かうという有意な傾向を見出す（以下の表１〜３を参照のこと）。
【表１３】
肺機能に対する１つ以上の感受性改変体を有することの全体的な効果を以下のボックスプロットで検討する。遺伝子感受性改変体の数の増大につれて、徐々に肺機能（ＦＥＶ１予測パーセント、絶対ＦＥＶ１、およびＦＥＶ１／ＦＶＣ）の悪化が生じるという一貫した傾向がある（図１〜３を参照のこと）。
【００７６】
ロジスティック回帰分析（全ての変数について調節した後）において、ステップワイズ変数選択によって、肺機能の各々のパラメーターについて、有意に関連したいくつかの遺伝的要因、および非遺伝的要因を見出した（以下の表４にまとめた）。
【表１６】
（結果の考察）
本発明者らの研究の結果によって、本発明者らの感受性改変体は、喫煙者の群において、肺機能の障害と関連することが示される。これは、ボックスプロットに示される、肺機能に対する遺伝子型の影響を本発明者らが分析する場合である（図１〜３）。詳細には、ボックスプロットの結果は、感受性改変体の数によって被験体を分割するとき、肺機能障害との強力な逆線形関係（後者が、絶対的ＦＥＶ１、ＦＥＶ１予測パーセント、またはＦＥＶ１／ＦＶＣのいずれによって評価されようと）が示されることを示す。逆に、被験体をその肺機能によって３分位に分割する場合、その結果によって、最も障害された肺機能を有する被験体が、本発明者らの感受性遺伝子改変体の最大の頻度を有することが一貫して示される（表１〜３を参照のこと）。最後に、ステップワイズロジスティック回帰において、ほとんどの共分散について調整した後、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子およびグルタチオンＳトランスフェラーゼ遺伝子の感受性改変体は、肺機能障害に寄与する（表４を参照のこと）。
【００７８】
本発明の方法およびその応用に対して直接関連するのは、連鎖不均衡である。これは、遺伝的な現象であって、２つ以上の変異体または多形性が、かなり密接な遺伝的近接性であって、それらが実質的に常に同時遺伝される、現象である。このことは、１つの多形性についての遺伝子型特定において、連鎖不均衡において別の多形性の存在が推測され得ることを意味する。従って、本明細書に記載の遺伝的改変体との連鎖不均衡にある任意の遺伝的改変体（変異体、または多形性）はまた、本明細書に記載の本発明の概念に包含される。このような改変体は、本明細書に含まれる刊行物において、および確立された文献において記載される。
【００７９】
上記のデータは、肺機能の障害が、慢性呼吸疾患（ＣＯＰＤ、喘息、気管支拡張症、細気管支炎）に対する素因、およびそれによる死亡だけではなく、心臓血管疾患（冠動脈疾患、および発作）、および特定の癌（肺癌）のための有用な診断試験であるという疫学的知見の背景にある新規な生物学的関連性を提供する。本発明は、特定の遺伝的感受性改変体であって、肺機能の障害を決定するだけでなく、アテローム発生／血栓症、および癌を生じる病態生理学的過程の背景にも関与する、遺伝的な感受性改変体を特定する。
【００８０】
本発明は、特定の実施例および好ましい実施形態を参照して記載されたが、本明細書に記載される本発明の概念の原理および趣旨を組み込む改変および変更がまた、本発明の範囲内であることは、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】感受性の遺伝子改変体の数に対してプロットした、ＣＯＰＤを有する人の割合であって、これは、線形の関係を示し、この関係は、４つ以上の感受性の改変体を有する人においては、ＣＯＰＤを有する推定の尤度が８０％程度の高さである。
【図２】表１０におけるデータのグラフ表示。このリスク推定（標準化された比によって定量される）によって、この研究における防御的遺伝子型の存在が０であれば、喫煙者がＣＯＰＤを有するリスクは１６７％まで有意に増大することが示される。逆に、この解析によって、喫煙者（２つ以上の防御的遺伝子型を有する）がＣＯＰＤを有するリスクは、６７％低下することが示される。遺伝子試験の前に、喫煙者におけるＣＯＰＤの背景的リスクが約２０％であることを考慮すれば、防御的遺伝子型の存在が０であれば、このリスクは有意に増大する。
【図３】表１１におけるデータのグラフ表示。リスク推定解析によって、リスクには有意な相違はないことが示されたが、傾向としては、２つ以上の感受性遺伝子型の存在において喫煙者がＣＯＰＤを有するリスクがより大きいことが明らかに示された。
【図４】図４は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図５】図５は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図６】図６は、防御的遺伝子型の数が増大している喫煙者において、肺機能が、より大きいという傾向を示す。
【図７】図７は、喫煙者における予測ＦＥＶ１パーセントと遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、喫煙者における絶対ＦＥＶ１と遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【図９】図９は、喫煙者におけるＦＥＶ１／ＦＶＣと遺伝的感受性改変体の数との関係を示すグラフである。
【引用文献】
【００８２】
【文１】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【００８７】
【００８８】
【００８９】
Claims (52)
- 慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、これらの領域中の変異体の存在は、該疾患を発症する素因の指標である、方法。
- 喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する素因を決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼをコードする遺伝子の該調節領域および／またはプロモーター領域中の変異体の存在は、該疾患を発症する素因の指標である、方法。
- 慢性閉塞性肺疾患の発症の可能性を被験体において診断する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼの該プロモーター領域における変異の存在は、該疾患の発症の可能性または重篤度の指標である、方法。
- 喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症の可能性を診断する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼの調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の解析を包含し、ここで、細胞間質メタロプロテイナーゼの該プロモーター領域中の変異の存在は、該疾患の発症の可能性または重篤度の指標である、方法。
- 前記メタロプロテイナーゼが、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記多形性（変異）が、間質性コラゲナーゼの前記プロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢの前記プロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性である、請求項１〜５にいずれか１項に記載の方法。
- 調節性および／またはプロモーター多形性の前記決定が、二個以上のメタロプロテイナーゼ遺伝子で実行される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の素因を決定する方法であって、細胞間質再構築に関与するか、または関連する遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形性の組み合わせの解析を包含し、ここで、これらの領域中の多形性の存在は、該疾患を発症する素因の指標である、方法。
- 前記決定が、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）における多形性で実行される、請求項８に記載の方法。
- α１アンチトリプシン、および／またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子における多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性の決定をさらに包含する、請求項８または９に記載の方法。
- 請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセット。
- 該ヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーが、前記遺伝子のプロモーターおよび調節領域の多形性領域にまたがるか、またはまたがるために用いることができる、請求項１１に記載のヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセット。
- 肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定するための方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで該遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である、方法。
- 喫煙者である被験体、または高レベルの空気汚染に曝された被験体において、肺機能の障害を発症する素因を決定する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで該遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である、方法。
- 被験体において、肺機能の障害の発現の可能性を診断する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで該遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害の発現の可能性の指標である、方法。
- 喫煙者である被験体、または高レベルの空気汚染に曝された被験体において、肺機能の障害の発現の可能性を診断する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで該遺伝子の１つ以上における変異の存在は、肺機能の障害を発症する素因の指標である、方法。
- ここで前記細胞間質再構築、または炎症性タンパク質が、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）、α１−アンチトリプシン遺伝子、および酸化的ストレス応答性タンパク質グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から選択される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- ここで前記多形性（変異）が、間質性コラゲナーゼの前記プロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢの前記プロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２多形性、Ｇ１２３７Ａ３’α１アンチトリプシン多形性、ＧＳＴＭ１ヌル多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
- 機能性多形性の前記決定が、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子において実行される請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
- 肺機能の障害を発症する、被験体の素因を決定する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するか、または関連する遺伝子の多形性の組み合わせの解析を包含し、ここでこれらの領域における多形性の存在は、肺機能の障害の発症の素因の指標である、方法。
- 請求項２０に記載の方法であって、前記決定が、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）、α１−アンチトリプシン遺伝子、および酸化的ストレス応答性タンパク質グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から選択される細胞間質再構築、または炎症性タンパク質における多形性において実行される、方法。
- 請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法における使用のためのヌクレオチドプローブ、および／またはプライマーのセット。
- 障害された肺に関連する疾患の罹患／死亡のリスクを発症する、被験体の素因を決定するための方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子における多形性の解析を包含し、ここで該遺伝子の１つ以上における変異の存在は、該疾患の罹患／死亡のリスクを発症する素因の指標である、方法。
- 前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、発作、および肺癌からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
- ここで前記細胞間質再構築または炎症性タンパク質が、間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）、ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）、およびヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子（ＭＭＰ−１２）、α１−アンチトリプシン遺伝子、および酸化的ストレス応答性タンパク質グルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）から選択される、請求項２３、または請求項２４に記載の方法。
- ここで前記多形性（変異体）が、間質性コラゲナーゼのプロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、ゼラチナーゼＢのプロモーターにおけるＣ−１５６２Ｔ、ヒトマクロファージエラスターゼ遺伝子のプロモーターにおけるＡ〜Ｇ−８２多形性、Ｇ１２３７Ａ３’α１アンチトリプシン多形性、ＧＳＴＭ１ヌル多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
- 機能性多形性の前記決定が、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与するタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子において実行される、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
- 慢性閉塞性肺疾患を発症する、被験体の潜在的なリスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性、および／またはこれらの多形性との連鎖不均衡である多形性／変異の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
- 喫煙者、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症の潜在的リスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、炎症性サイトカイン、および抗炎症性サイトカイン、細胞間質メタロプロテイナーゼのインヒビター、および酸化体の代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形性、ならびに／あるいはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して防御的な遺伝子型の指標である、方法。
- 前記メタロプロテイナーゼが、細胞間質コラゲナーゼである、請求項２８、または請求項２９に記載の方法。
- 前記多形性が、間質性コラゲナーゼの前記プロモーターにおける１Ｇ／２Ｇ、および／またはこの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異である、請求項３０に記載の方法。
- 前記炎症性サイトカインが、トランスフォーミング成長因子β１である、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
- 前記多形性が、トランスフォーミング成長因子β１のコドン１０におけるヌクレオチドＴからＣの置換、および／またはこの多形性と連鎖不均衡である多形性／変異である、請求項３２に記載の方法。
- メタロプロテイナーゼの前記インヒビターが、メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビターである、請求項２８、または請求項２９に記載の方法。
- 前記多形性が、−１２９６位でのＴからＣの置換、および／またはこの多形性と連鎖不均衡である多形性／変異である、請求項３４に記載の方法。
- 被験体の慢性閉塞性肺疾患の発症の潜在的リスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域および／またはプロモーター領域における多形成、ならびに／あるいは、これらの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在は、ＣＯＰＤに感受性の遺伝子型の指標である、方法。
- 喫煙者であるか、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である被験体において、慢性閉塞性肺疾患を発症する潜在的リスクを決定する方法であって、細胞間質メタロプロテイナーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、およびプロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の調節領域、および／またはプロモーター領域における多形性、ならびに／あるいはこれらの多形性との連鎖不均衡における多形性／変異の解析を包含し、ここでこれらの領域における変異の存在が、ＣＯＰＤに対して感受性の遺伝子の指標である、方法。
- ここで前記メタロプロテイナーゼは、マクロファージエラスターゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１２、すなわちＭＭＰ−１２）である、請求項３６、または請求項３７に記載の方法。
- 請求項３８に記載の方法であって、前記多形性が、−８２位でのＡからＧの置換、および／またはこの多形性と連鎖不均衡である多形性／変異である、方法。
- 前記グルタチオントランスフェラーゼが、グルタチオンＳトランスフェラーゼ１である、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
- 請求項４０に記載の方法であって、前記多形性が、Ｍ１ヌル多形性、および／またはこの多形性と連鎖不均衡である多形性／変異である、方法。
- 前記プロテアーゼインヒビターが、α１アンチトリプシンである、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
- 前記好ましい多形性が、３’Ｔａｑ１多形性、および／またはこの多形性と連鎖不均衡である多形性／変異である、請求項４２に記載の方法。
- 肺機能の障害、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発症する、被験体の素因を決定する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与する１つ以上のタンパク質のレベルを被験体において検出する工程を少なくとも包含し、ここで正常に対して比較した該タンパク質のレベルの変更は、肺機能の障害、またはＣＯＰＤの潜在的なリスクの指標である、方法。
- 肺機能の障害、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の発症の可能性を被験体において診断する方法であって、細胞間質再構築、炎症、および酸化的ストレスに対する応答に関与する１つ以上のタンパク質のレベルを被験体において検出する工程を少なくとも包含し、ここで正常に対して比較した該タンパク質のレベルの変更は、肺機能の障害、またはＣＯＰＤを発症する潜在的なリスクの指標である、方法。
- 肺機能の障害、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発症する被験体の潜在的なリスクを決定する方法であって、以下：
間質性コラゲナーゼ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−１、すなわちＭＭＰ−１）；
ゼラチナーゼＢ（細胞間質メタロプロテイナーゼ−９、すなわちＭＭＰ−９）；または
ヒトマクロファージエラスターゼ（ＭＭＰ−１２）、
メタロプロテイナーゼ３の組織インヒビター（ＴＩＭＰ３）
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴＭ１）；
α１−アンチトリプシン；
スーパーオキシドディスムターゼ３（ＳＯＤ３）；
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）；または
からなる群より選択されるタンパク質の１つ以上のレベルを被験体において検出する工程を少なくとも包含し、
ここで、正常に対して比較した該タンパク質のレベルの変更が、肺機能の障害またはＣＯＰＤを発症する潜在的なリスクの指標である、方法。 - 肺機能の障害または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を発症する被験体の潜在的なリスクを決定する方法であって、以下：
グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴＭ１）；
α１−アンチトリプシン；
スーパーオキシドディスムターゼ３（ＳＯＰＤ３）；または
トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）；
からなる群より選択されるタンパク質の１つ以上における変更もしくは多形性、および／または該タンパク質の過剰発現もしくは過少発現の存在を検出する工程を少なくとも包含し、
ここで、変更または多形性の存在が、肺機能の障害を発症する潜在的なリスクの指標である、方法。 - 前記タンパク質が、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴＭ１）であり、そしてここでＧＳＴＭ１の非存在またはレベルの低下は、肺機能の障害またはＣＯＰＤを発症する潜在的なリスクの指標である、請求項４７に記載の方法。
- 前記タンパク質が、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）であり、そしてここで該タンパク質（ＴＧＦβをコードする遺伝子のコドン１０にマッピングする）内の所定の位置でのロイシンの存在が、ＣＯＰＤを発症する潜在的なリスクの指標であり、そしてこの位置におけるプロリンの存在が、肺機能の障害またはＣＯＰＤを発症するリスクの低下の指標である、請求項４７に記載の方法。
- 前記タンパク質が、スーパーオキシドディスムターゼ３（ＳＯＤ３）であり、ＳＯＤ３の２１３位におけるグリシンの存在が、ＣＯＰＤを発症する潜在的なリスクの指標であり、そしてこの位置におけるアルギニンの存在が、肺機能の障害またはＣＯＰＤを発症するリスクの低下の指標である、請求項４７に記載の方法。
- 前記被験体が、喫煙者であるか、または環境上のタバコの煙のような高レベルの空気汚染に曝された者である、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法が、肺機能の障害の発症の可能性またはＣＯＰＤの発現の可能性を、被験体において診断する目的のために実行される、請求項４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
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