JP2004532002A - PCR plate easy to use for robots - Google Patents

Abstract

本発明は、自動システムで使用するためのマイクロタイタープレートに関する。具体的には、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験に必要とされる条件下で熱的に安定であると同時にまた、自動システムにおける機械的な操作に必要な剛性および寸法を維持するマイクロタイタープレートに関する。The present invention relates to a microtiter plate for use in an automated system. Specifically, the present invention is thermally stable under the conditions required for polymerase chain reaction (PCR) experiments while also maintaining the stiffness and dimensions required for mechanical operation in automated systems. For microtiter plates.

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、自動システムで使用するためのマイクロタイタープレート、具体的にはポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ）用途に設計されたプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、広範に使用されるｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学プロトコルである。ＰＣＲは、遺伝学、分子生物学、細胞生物学、臨床化学、法医科学、および分析生化学を含む多くの科学分野での診断および研究用の驚くべきツールであることが証明されている。ＰＣＲ中に反応温度を慎重に制御および循環させることにより実施される反応としては、核酸配列の化学的増幅、リガーゼ連鎖反応、および核酸シーケンシングが挙げられるが、これらに限定されれない。ＰＣＲは通常、サーマルサイクラーに接触させて配置させた小さなチューブまたはマルチウェルマイクロタイタープレート中で実行される。研究者等は、比較的効率的に、かつ非常に低容積で、数多くのＰＣＲ実験を潜在的に実施するマイクロタイタープレートを使用する。非常に小さな比容積の多くのウェルからのＰＣＲ試薬および産物の添加ならびに除去は、好ましくは、具体的には自動コンピュータプログラム式ロボットにより実機械的に施される。
【０００３】
自動システムは、サンプルのハイスループットスクリーニングのために、生化学分野で使用されている。自動検出システムは、フルオルイメージャーおよび他の生化学検出システムを包含し得る。これらのシステムとしては、Applied Biosystem'sのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ ＨＴ配列検出システム、Ｎｏｒｔｈｓｔａｒ（商標）ＨＴＳワークステーション、ＣＯＢＲＡ（商標）ロボットサンプルハンドリングシステム、およびＦＭＡＴ（商標）８１００ ＨＴＳシステムが挙げられるが、これらに限定されない機械であり得る。自動システムは、例えば、各種スクリーニングプロトコルで使用されるマイクロタイタープレートのような製品を取り扱うためのロボットアームを使用し得る。これらの製品は通常、硬質ポリスチレン材料から作製され、これによりロボットアームは製品を容易につかむことが可能である。しかしながら、ポリスチレンは、熱安定性を示さないため、例えばＰＣＲ実験中に加熱しなくてはならない製品では、ポリプロピレンが使用される。しかしながら、ポリスチレンは、軟質であり、取り扱い時に変形する傾向にあるため、自動システムでの使用には適さない。
【０００４】
ＰＣＲ用途で使用するためのマイクロタイタープレートは、ポリプロピレン、ポリエチレン、およびポリカーボネートのような熱安定性プラスチック材料から作製される。ロボットが複数のプレートをつかみ、正確な位置まで複数のプレートを移動し、または複数のプレートをともに重ね合わせるのに十分な剛性を提供する、ロボットと相性がいいポリスチレンとは異なり、熱安定性プラスチック材料は、かかる剛性および操作性に欠ける。さらに、ポリプロピレンは、部分的に不透明な材料であり、すなわち、曇って見えるか、または完全には透明ではない。したがって、いったんサンプルをウェルに入れてしまうとサンプルを見ることが困難である。また、熱安定性材料から構成されるプレートは、材料が光路の変化を引き起こすため、蛍光エンドポイント測定およびリアルタイムＰＣＲには適さない。
【０００５】
ＰＣＲは、９４〜９５℃での処理の複数回のサイクルを必要とし、そこでは、ポリプロピレン製のプレートは、例えば、収縮、ねじれ、および反りにより変形することが多い。マイクロタイタープレートのこの寸法の変化は重大な問題を引き起こす。プレートに加えられる熱の範囲は決まっていて、マイクロタイタープレートの変更した形状に順応するように設計されていないため、マイクロタイタープレートの複数のウェル間の熱伝導は、変形したプレート上では一様でない。さらに、熱的に安定ではないマイクロタイタープレートが、ＰＣＲ後に自動液体ハンドラーで操作される場合、プレートのねじれまたは反りにより引き起こされる寸法の変化が問題である。この状況では、ディスペンサーノズルは、プレートの各ウェルの底部に到達するのが困難であり得る。場合によっては、ディスペンサーノズルは、ウェルの側面に触れて、ウェルの底部に到達しない場合もある。ディスペンサーノズルがウェルの底部に接触できない場合、溶液がウェルに分取される際に気泡がウェル中に形成される場合があり、あるいは溶液をマイクロタイタープレートから取り出す際にかなりの量の溶液がウェル中に残ってしまう場合がある。これは、ＰＣＲ実験の準備と実施において自動システムを使用することを望む研究者等にとって大きな懸念である。ウェルに溶液を分取する際、およびＰＣＲ後に産物を取り出す際の不正確さは、濃度のような測定、および所定の分子の検出においてかなりの誤差をもたらし得る。
【０００６】
さらに、変形したマイクロタイタープレートのウェルにシーリングキャップを適用する場合、ウェル中の溶液は、ＰＣＲ中にシーリングキャップとプレートとの間の空間から蒸発および漏出し得る。さらに、いったんプレートの寸法がＰＣＲ後に変化すると、ロボットは、サーマルサイクラーからプレートを効率的に操作および移動することができない。自動システムは、特定パラメータにしたがって、プレートおよび個々のウェルを配置するようにコンピュータ上でプログラムされており、そこで機械は、変形が生ずると、プレートおよびウェルの寸法または位置の変化を識別することが不可能である。したがって、マイクロタイタープレートの変形により引き起こされるＰＣＲ実験の行程にわたるウェルの位置の変化のため、自動システムにおいてロボットの使用を導入できない。ＰＣＲ中のプレートの変形により引き起こされる問題は、より小さなウェルおよび液体容量を使用することから３８４ウェルおよび１５３６ウェルプレートの使用で特に重要になってくる。
【０００７】
使用するプラスチック材料の厚さを増加させることにより、ある程度まで変形を防ぎ得るが、ＰＣＲ実験における重要な要因は、熱伝導性である。ＰＣＲプレートウェルの壁を通してサーマルサイクラーから迅速な熱伝導性を維持するためには、壁の厚さは、薄くすべきであり、通常約０．３ｍである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、シンジオタクチックポリスチレンを含む組成物から作製される、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。本発明のマイクロタイタープレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートであり得る。
【０００９】
本発明は、環状オレフィンポリマーを含む組成物から作製される、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。上記環状オレフィンプレートは、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、または１５３６ウェルプレートであり得る。
【００１０】
本発明はさらに、環状オレフィンポリマーを含む組成物からなるマイクロタイタープレートであって、上記ポリマーは、ノルボレンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合によって生産される、マイクロタイタープレートに関する。本発明はまた、環状オレフィンポリマーを含む組成物から作製されるマイクロタイタープレートであって、上記ポリマーは、シクロペンタジエンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合によって生産される、マイクロタイタープレートに関する。
【００１１】
本発明はまた、本質的にシンジオタクチックポリスチレンまたは環状オレフィンポリマ
ーからなる、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
自動ＰＣＲ用途で使用するための理想的なプラスチック材料は、以下の特徴を示す：
１．ポリスチレンの剛性に少なくとも類似した剛性、
２．９４〜９５℃の熱安定性、
３．湿潤条件下での９４〜９５℃の処理後の最低限の変形（収縮、ねじれ、反り等）、
４．射出成形技術による大量生産能、
５．ポリプロピレンに少なくとも類似した速い熱伝導性、
６．タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびヌクレオチドの最低限の非特異的吸収、および
７．射出成形に関する最低限のまたは少なくとも予測可能な収縮要因。
【００１３】
シンジオタクチックポリスチレンおよび環状オレフィンポリマーは、熱安定性を示し、ポリスチレンと同じ硬度を有し、ともに射出成形に適している。さらに、本発明者等は、これらの材料から作製された製品、具体的にはＰＣＲプレートで非特異的ＤＮＡまたはタンパク質の付着が観察されないことを、実験から見出した。本発明者等は、ＰＣＲおよび自動システムにおける操作に必要とされる基準を満たすのに十分な熱安定性および剛性を維持することが可能な、シンジオタクチックポリスチレンおよび環状オレフィンポリマーから主に作製されたマイクロタイタープレートを創り出した。
【００１４】
環状オレフィンポリマーは、日本ゼオン（商品名Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）およびＺｅｏｎｏｒ（登録商標））、三井化学（商品名Ａｐｅｌ）、およびＪＳＲ株式会社（商品名Ａｒｔｏｎ（登録商標））から入手し得る。本発明のマイクロタイタープレートは、様々な等級の環状オレフィン、例えば１４１０Ｒ等級の環状オレフィン（日本ゼオン、日本）から構築されてもよい。シクロオレフィンポリマーとも称される環状オレフィンポリマーは、ジシクロペンタジエン（ＤＣＰＤ）およびエチレンから作製される、環状ノルボレン分子に由来する人工熱可塑性プラスチックである。脂環式オレフィン樹脂は、モノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、または開環メタセシス共重合により作製され得る。上記樹脂は、熱安定性、低水分吸収、寸法安定性、および高溶融流量を示す。特に、Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）およびＺｅｏｎｏｒ（登録商標）はまた、化学的耐性、および極めて低い蛍光を示す。本発明の環状オレフィンマイクロタイタープレートは、最大１４０℃まで熱的に安定である。
【００１５】
シンジオタクチックポリスチレン（ＳＰＳ）はメタロセン触媒重合により作製される。Ｘａｒｅｃ（登録商標）という商品名のシンジオタクチックポリスチレンは、出光石油化学株式会社（東京、日本）から得られ得る。本発明のマイクロタイタープレートは、様々な等級のＳＰＳ、例えばＳ１００等級から構築され得る。本発明のシンジオタクチックポリスチレンマイクロタイタープレートは、最大２５０℃まで安定である。
【００１６】
本発明のマイクロタイタープレートは、好ましくは、プラスチック材料の射出成型の一般的な既知の方法により形成されるが、当業者に既知の他の手段により形成されてもよい。マイクロタイタープレートの組成物は、ポリマー、着色剤、潤滑剤、または当業者に既知の他の添加剤を含有してもよい。
【００１７】
マイクロタイタープレートのウェルは、帯状形式すなわち一列形式で配列させることができるか、あるいは行列形式で配列させることができる。マイクロタイタープレート配置の１つは、総計９６個のウェルに関して、ウェル中心間に９ｍｍ離れて空間がある８×１２個のウェルを有する。ハイスループットスクリーニングに関して、ウェルプレートの全体の大きさを同じに維持しながらウェルの総数を増加することにより他の構造、例えば、ウェル中心間に４．５ｍｍ離れて空間がある１６×２４個のウェルを有するように設計した３８４ウェルプレート、およびウェル中心間に２．２５ｍｍ離れて空間がある３２×４８個のウェルを有するように設計した１５３６ウェルプレート、を創出してもよい。これらのウェルプレートの全体の大きさは、９６ウェルプレートと同じであるため、３８４および１５３６ウェルプレート中のウェルの大きさは、必然的に９６ウェルプレート中の大きさよりも小さくなるが、ウェルの深さは依然として同じである。マイクロタイタープレートの全体の寸法は、the Society for Biomolecular Screening（ＳＢＳ）により決定される国際基準により設定される。
【００１８】
ＰＣＲ用途のために、生化学分野で現在使用中のマイクロタイタープレートと対比して、本発明のマイクロタイタープレートは、図３に示すように、かつ実施例２に記載するように、ＰＣＲ実験前、ＰＣＲ実験中、またはＰＣＲ実験後に、反りをほとんど示さないか、または反りを全く示さない。これは、マイクロタイタープレートとサーマルサイクラーとの間での一様な接触を可能にし、プレートの正確な寸法が自動システムにおいて容易な操作を可能とするように維持されるため、ＰＣＲ実験が実施され得る一貫した環境を提供する。これらの条件は、ハイスループットスクリーニング手順、特に３８４ウェルプレートのような多くのウェルを有するプレートが使用されるハイスループットスクリーニングに理想的である。
【００１９】
さらに、従来技術のマイクロタイタープレートは、プレート上のウェルの底部で形成され得る気泡の識別を妨げる曇った外観を有する。本発明で使用されるプラスチック材料の透明性により、本発明のマイクロタイタープレートのウェル中の溶液を容易に眺めることが可能である。本発明で使用される材料はまた、従来技術で使用される材料と比較して非常に低い自己蛍光を示し、図１および図２に示すように、かつ実施例１に記載するように、本発明をリアルタイムＰＣＲ用途で使用するのに適切なものとしている。
【実施例１】
【００２０】
環状オレフィン（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）、日本ゼオン、日本）から構成される３８４ウェルマイクロタイタープレートを、リアルタイムＰＣＲを実施することで、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）３８４ウェル透明光反応プレート(Applied Biosystems)、およびＡＢｇｅｎｅ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ−ｆａｓｔプレートと比較した。本発明の３８４ウェルプレートの幾つかを１１０℃で３時間アニーリングした。
【００２１】
ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ配列検出システム(Applied Biosystems)を用いて、−アクチンプラスミドＤＮＡの１０倍希釈物とともに、ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）−アクチンを用いてＰＣＲを実施した。ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、−アクチンプライマー、および１つの蛍光色素を組み込んだ二重標識蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブを含有する。ＦＡＭがレポーターとして作用し、その発光スペクトルは、第２の色素であるＴＡＭＲＡにより消失した。−アクチン順方向プライマー２．５μｌ（３Ｍ）、−アクチン逆方向プライマー２．５μｌ（３Ｍ）、および上述のプローブ２．５μｌ（２Ｍ）を、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ’ｓ、および最適緩衝成分を含有するＡＢＩ ２×マスターミックス１２．５μｌと混合した。
【００２２】
様々な濃度のプラスミドＤＮＡを、１０ｎｇ／サンプル〜０．１ｆｇ／サンプルの範囲で、ＤＥＰＣ処理水５μｌ中に、１０倍希釈で、各希釈について二重で調製した。次に、プラスミドＤＮＡの各段階希釈物５μｌを、上述のＴａｑ−Ｍａｎ（登録商標）−アクチンＰＣＲミックス溶液２０μｌと混合した。
【００２３】
ＰＣＲを以下の通りに実施した：５０℃で２分、９５℃で１０分、ならびに９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクル。サンプルそれぞれに関して、６０℃工程で蛍光データを収集した。このデータを図２に示す。グラフは、段階希釈物それぞれに関して各サイクルにて二重で測定した蛍光を示す。
【００２４】
ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００でＰＣＲを行った後、ＡＢＩプレートおよびＺｅｏｎｏｒのプレアニーリングしたプレート中のエンドポイントＰＣＲ産物を、励起波長４８８ｎｍおよび発光波長５０５ｎｍで、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光イメージャー（日立）によりスキャンした。強度を２つの方法で算出した。第１に、ウェルおよび周辺区域２１．６８ｍｍを含む広い強度区域に基づいて強度を算出した。次に、ウェルの中心である狭い強度区域（１．０３ｍｍ）を選定することにより強度を算出した。これらの算出結果は図１で見ることができる。
【実施例２】
【００２５】
本発明の６つの環状オレフィン３８４マイクロタイタープレート（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標））を、それぞれ以下の条件：１１０℃で０．５時間、１．０時間および１．５時間、ならびに１２５℃で０．５時間および１．０時間にさらした。次に、これらの処理プレートを、３８４ウェルそれぞれ中に水２０μｌを入れたＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００(Applied Biosystems)上で、９４℃で１５秒、および６０℃で６０秒（サーマルサイクラーのふたは、１０５℃に加熱）の５０ＰＣＲサイクルに付した。各プレートの幅、長さ、高さ、および反りを、キャリパにより、ＰＣＲ前および後に測定し、図３は、これらの寸法の変化のグラフ表示である。比較のために、ＡＢＩ ３８４ウェル透明光反応プレートもまた、同じＰＣＲ条件下で試験した。
【実施例３】
【００２６】
ＡＢＩ ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）光学９６ウェル反応プレート、本発明のブラックシンジオタクチックポリスチレン（ＳＰＳ）９６ウェルプレート、本発明のホワイトＳＰＳ９６ウェルプレート、および本発明の環状オレフィン（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標））９６ウェルプレートで、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応混合物は、−アクチン特異的プライマー０．２５μｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液、およびＴａｑポリメラーゼ(Promega)１ユニットを含有していた。個々の混合物はそれぞれ、ヒトゲノムＤＮＡ１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、または０ｎｇの入った２０μｌも含んでいた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：ＰＴＣ−１００（商標）サーマルサイクラー(MJ Research)、またはＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）２７００サーマルサイクラー(Applied Biocyctems)上で、９４℃で４５秒、６０℃で１分、および７２℃で１分を２５サイクル。ＰＣＲ産物を、２．０％アガロースゲル電気泳動により分析し、結果を図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ＡＢＩ３８４ウェルＰＣＲプレート、およびプレアリーニングした本発明の３８４ウェルプレートで実施したＰＣＲ後に測定したエンドポイント蛍光強度のグラフ表示である。強度は、−アクチンプラスミドＤＮＡ濃度に関して示してある。データは、、実施例１で詳述している。
【図２】図２は、それぞれ、本発明のアニーリングした３８４ウェルプレート、本発明の未処理３８４ウェルプレート、ＡＢＩ３８４ウェルプレート、およびＡＢｇｅｎｅ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ−ｆａｓｔ３８４ウェルプレートで実施したＰＣＲの各サイクルで測定した蛍光の変化のグラフ表示である。蛍光は、４０回のＰＣＲサイクルそれぞれで測定した。データおよびＰＣＲ条件は実施１に詳述している。
【図３】図３は、本発明のＰＣＲプレートの寸法の変化のグラフ表示である。幅、長さ、高さ、および反りの変化を、様々な条件下でプレートを処理した後に測定した。本発明のプレートに対する変化を、標準的なＡＢＩプレートで観察される変形と比較することができる。
【図４】図４は、アガロースゲル中の電気泳動によるＰＣＲ産物の分析を示す。ＰＣＲ実験は、同条件下であるが、４つの異なるＰＣＲプレート上で実施した。ＰＣＲ条件およびプレートの詳細は、実施例３に記載している。【Technical field】
[0001]
The present invention relates to microtiter plates for use in automated systems, and specifically to plates designed for polymerase chain reaction (PCR) applications.
[Background Art]
[0002]
The polymerase chain reaction (PCR) is a widely used in vitro biochemical protocol. PCR has proven to be a surprising tool for diagnosis and research in many scientific disciplines, including genetics, molecular biology, cell biology, clinical chemistry, forensic science, and analytical biochemistry. Reactions performed by carefully controlling and cycling the reaction temperature during PCR include, but are not limited to, chemical amplification of nucleic acid sequences, ligase chain reactions, and nucleic acid sequencing. PCR is usually performed in small tubes or multiwell microtiter plates placed in contact with a thermal cycler. Researchers use microtiter plates that are relatively efficient and in very low volumes, potentially performing many PCR experiments. The addition and removal of PCR reagents and products from many wells of very small specific volume is preferably performed mechanically, specifically by automated computer programmed robots.
[0003]
Automated systems are used in the biochemistry field for high-throughput screening of samples. Automated detection systems can include fluoroimagers and other biochemical detection systems. These systems include Applied Biosystem's ABI PRISM® 7900 HT Sequence Detection System, Northstar ™ HTS Workstation, COBRA ™ Robotic Sample Handling System, and FMAT ™ 8100 HTS System. , But not limited thereto. Automated systems may use, for example, robotic arms to handle products such as microtiter plates used in various screening protocols. These products are usually made from rigid polystyrene material, which allows the robot arm to easily grip the product. However, polypropylene is used in products that must be heated, for example, during PCR experiments, because polystyrene does not exhibit thermal stability. However, polystyrene is not suitable for use in automated systems because it is soft and tends to deform during handling.
[0004]
Microtiter plates for use in PCR applications are made from thermostable plastic materials such as polypropylene, polyethylene, and polycarbonate. A thermostable plastic, unlike polystyrene, which is compatible with robots, where the robot grips multiple plates and provides enough stiffness to move multiple plates to the correct position or to stack multiple plates together Materials lack such rigidity and operability. In addition, polypropylene is a partially opaque material, that is, it appears cloudy or not completely transparent. Therefore, once the sample has been placed in the well, it is difficult to view the sample. Also, plates composed of thermostable materials are not suitable for fluorescence endpoint measurements and real-time PCR, as the materials cause changes in the optical path.
[0005]
PCR requires multiple cycles of treatment at 94-95 ° C., where plates made of polypropylene are often deformed, for example, by shrinking, twisting, and warping. This dimensional change of the microtiter plate causes significant problems. Since the range of heat applied to the plate is fixed and not designed to adapt to the altered shape of the microtiter plate, the heat transfer between the microtiter plate wells is uniform on the deformed plate. Not. Furthermore, when microtiter plates that are not thermally stable are operated in an automatic liquid handler after PCR, dimensional changes caused by plate twisting or warping are problematic. In this situation, the dispenser nozzle can be difficult to reach the bottom of each well of the plate. In some cases, the dispenser nozzle touches the side of the well and does not reach the bottom of the well. If the dispenser nozzle cannot contact the bottom of the well, bubbles may form in the well as the solution is dispensed into the well, or a significant amount of solution may be removed when removing the solution from the microtiter plate. It may be left inside. This is a major concern for researchers wishing to use an automated system in the preparation and performance of PCR experiments. Inaccuracies in dispensing solutions into wells and removing products after PCR can lead to considerable errors in measurements such as concentration and detection of certain molecules.
[0006]
Furthermore, if a sealing cap is applied to the wells of a deformed microtiter plate, the solution in the wells can evaporate and leak out of the space between the sealing cap and the plate during PCR. Further, once the plate dimensions change after PCR, the robot cannot efficiently manipulate and move the plate from the thermal cycler. The automated system is programmed on a computer to place plates and individual wells according to specific parameters, where the machine can identify changes in plate or well dimensions or position when deformation occurs. Impossible. Therefore, the use of robots in automated systems cannot be introduced due to the change in well position over the course of the PCR experiment caused by the deformation of the microtiter plate. The problems caused by plate deformation during PCR become particularly important with the use of 384-well and 1536-well plates due to the use of smaller wells and liquid volumes.
[0007]
Although increasing the thickness of the plastic material used can prevent deformation to some extent, an important factor in PCR experiments is thermal conductivity. In order to maintain rapid thermal conductivity from the thermal cycler through the walls of the PCR plate wells, the wall thickness should be small, typically about 0.3 m.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0008]
The present invention relates to microtiter plates made from compositions comprising syndiotactic polystyrene for use in polymerase chain reaction applications. A microtiter plate of the invention can be a 96-well plate, a 384-well plate, or a 1536-well plate.
[0009]
The present invention relates to a microtiter plate made from a composition comprising a cyclic olefin polymer for use in a polymerase chain reaction application. The cyclic olefin plate can be a 96-well plate, a 384-well plate, or a 1536-well plate.
[0010]
The present invention is further directed to a microtiter plate comprising a composition comprising a cyclic olefin polymer, wherein the polymer is produced by addition polymerization, addition copolymerization, ring-opening metathesis polymerization, and ring-opening metathesis copolymerization of a norborene monomer. Related to the microtiter plate. The present invention is also a microtiter plate made from a composition comprising a cyclic olefin polymer, wherein the polymer is obtained by addition polymerization, addition copolymerization, ring-opening metathesis polymerization, and ring-opening metathesis copolymerization of cyclopentadiene monomer. It relates to the microtiter plate produced.
[0011]
The invention also relates to a microtiter plate for use in a polymerase chain reaction application consisting essentially of syndiotactic polystyrene or a cyclic olefin polymer.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0012]
Ideal plastic materials for use in automated PCR applications exhibit the following features:
1. Rigidity at least similar to that of polystyrene,
2. thermal stability of 94-95 ° C,
3. Minimal deformation (shrinkage, twisting, warping, etc.) after treatment at 94-95 ° C under wet conditions,
4. Mass production capacity by injection molding technology,
5. Fast thermal conductivity, at least similar to polypropylene,
6. 6. minimal non-specific absorption of proteins, DNA, RNA, oligonucleotides and nucleotides, and Minimum or at least predictable shrinkage factors for injection molding.
[0013]
Syndiotactic polystyrene and cyclic olefin polymers exhibit thermal stability, have the same hardness as polystyrene, and are both suitable for injection molding. In addition, the inventors have found from experiments that no attachment of non-specific DNA or protein is observed on products made from these materials, specifically on PCR plates. We have primarily made from syndiotactic polystyrene and cyclic olefin polymers, which are capable of maintaining sufficient thermal stability and rigidity to meet the standards required for PCR and operation in automated systems. Microtiter plates were created.
[0014]
Cyclic olefin polymers can be obtained from Nippon Zeon (trade names Zeonex® and Zeonor®), Mitsui Chemicals (trade name Apel), and JSR Corporation (trade name Arton®). The microtiter plate of the present invention may be constructed from various grades of cyclic olefins, for example, 1410R grade cyclic olefins (Zeon, Japan). Cyclic olefin polymers, also referred to as cycloolefin polymers, are artificial thermoplastics derived from cyclic norborene molecules made from dicyclopentadiene (DCPD) and ethylene. The alicyclic olefin resin can be produced by addition polymerization, addition copolymerization, ring-opening metathesis polymerization, or ring-opening metathesis copolymerization of a monomer. The resins exhibit thermal stability, low moisture absorption, dimensional stability, and high melt flow rates. In particular, Zeonex® and Zeonor® also show chemical resistance and very low fluorescence. The cyclic olefin microtiter plate of the present invention is thermally stable up to 140 ° C.
[0015]
Syndiotactic polystyrene (SPS) is made by metallocene catalyzed polymerization. Syndiotactic polystyrene under the trade name Xarec® can be obtained from Idemitsu Petrochemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan). The microtiter plates of the present invention can be constructed from various grades of SPS, eg, S100 grade. The syndiotactic polystyrene microtiter plate of the present invention is stable up to 250 ° C.
[0016]
The microtiter plate of the present invention is preferably formed by the commonly known methods of injection molding of plastic materials, but may be formed by other means known to those skilled in the art. The composition of the microtiter plate may contain polymers, colorants, lubricants, or other additives known to those skilled in the art.
[0017]
The wells of the microtiter plate can be arranged in a strip or single row format, or in a matrix format. One microtiter plate arrangement has 8 × 12 wells with 9 mm space between well centers for a total of 96 wells. For high-throughput screening, other structures by increasing the total number of wells while maintaining the same overall size of the well plate, eg, 16 × 24 wells with 4.5 mm space between well centers And a 1536 well plate designed to have 32 × 48 wells with 2.25 mm space between well centers. Since the overall size of these well plates is the same as the 96 well plates, the size of the wells in the 384 and 1536 well plates will necessarily be smaller than the size in the 96 well plates, but The depth is still the same. The overall dimensions of the microtiter plate are set by international standards determined by the Society for Biomolecular Screening (SBS).
[0018]
For PCR applications, in contrast to microtiter plates currently in use in the biochemistry field, the microtiter plates of the present invention are available before PCR experiments as shown in FIG. 3 and as described in Example 2. Shows little or no warpage during or after the PCR experiment. This allows for uniform contact between the microtiter plate and the thermal cycler, and PCR experiments are performed because the exact dimensions of the plate are maintained to allow easy operation in automated systems. Provide a consistent environment to gain. These conditions are ideal for high-throughput screening procedures, especially high-throughput screening where plates with many wells, such as 384-well plates, are used.
[0019]
In addition, prior art microtiter plates have a cloudy appearance that prevents the identification of air bubbles that may form at the bottom of the wells on the plate. The transparency of the plastic material used in the present invention allows the solution in the wells of the microtiter plate of the present invention to be easily viewed. The materials used in the present invention also show very low autofluorescence compared to the materials used in the prior art, and as shown in FIGS. 1 and 2 and as described in Example 1, It makes the invention suitable for use in real-time PCR applications.
Embodiment 1
[0020]
384-well microtiter plates composed of cyclic olefins (Zeonor®, Zeon, Japan) were subjected to ABI PRISM ™ 384-well transparent photoreaction plates (Applied Biosystems) by performing real-time PCR, and Compared to ABgene® Thermo-fast plate. Some of the 384-well plates of the invention were annealed at 110 ° C. for 3 hours.
[0021]
PCR was performed with ABI TaqMan®-actin using the ABI PRISM® 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) with a 10-fold dilution of actin plasmid DNA. ABI TaqMan® contains a -labeled fluorogenic hybridization probe that incorporates an -actin primer and one fluorescent dye. FAM acted as a reporter and its emission spectrum was abolished by the second dye, TAMRA. 2.5 μl (3 M) of the actin forward primer, 2.5 μl (3 M) of the actin reverse primer, and 2.5 μl (2 M) of the probe described above, containing DNA polymerase, dNTP's and optimal buffer components Mixed with 12.5 μl of ABI 2 × master mix.
[0022]
Various concentrations of plasmid DNA were prepared in 10 μl dilutions in 5 μl of DEPC-treated water, ranging from 10 ng / sample to 0.1 fg / sample, in duplicate for each dilution. Next, 5 μl of each serial dilution of plasmid DNA was mixed with 20 μl of the Taq-Man®-actin PCR mix solution described above.
[0023]
The PCR was performed as follows: 2 minutes at 50 ° C, 10 minutes at 95 ° C, and 40 cycles of 15 seconds at 95 ° C and 1 minute at 60 ° C. Fluorescence data was collected at the 60 ° C. step for each sample. This data is shown in FIG. The graph shows the fluorescence measured in duplicate for each cycle for each serial dilution.
[0024]
After PCR on PRISM® 7900, the endpoint PCR products in ABI plates and Zeonor pre-annealed plates were analyzed at an excitation wavelength of 488 nm and an emission wavelength of 505 nm using the FMBIO® Fluorescence Imager (Hitachi). Was scanned. Intensity was calculated in two ways. First, the intensity was calculated based on a large intensity area including the well and peripheral area 21.68 mm. Next, the intensity was calculated by selecting a narrow intensity area (1.03 mm) at the center of the well. These calculation results can be seen in FIG.
Embodiment 2
[0025]
Six cyclic olefin 384 microtiter plates of the invention (Zeonor®) were prepared using the following conditions: 0.5 hours, 1.0 hours and 1.5 hours at 110 ° C. and 0.5 hours at 125 ° C. Time and 1.0 hour. The treated plates were then placed on an ABI PRISM® 7900 (Applied Biosystems) containing 20 μl of water in each of 384 wells for 15 seconds at 94 ° C. and 60 seconds at 60 ° C. (thermal cycler lid). Was heated to 105 ° C.) for 50 PCR cycles. The width, length, height, and warpage of each plate were measured by caliper before and after PCR, and FIG. 3 is a graphical representation of these dimensional changes. For comparison, ABI 384-well clear light reaction plates were also tested under the same PCR conditions.
Embodiment 3
[0026]
ABI MicroAmp® optical 96-well reaction plate, black syndiotactic polystyrene (SPS) 96-well plate of the invention, white SPS 96-well plate of the invention, and cyclic olefin (Zeonor®) 96-well of the invention PCR was performed on the plates. The PCR reaction mixture contained 0.25 μl of -actin specific primer, 2.5 mM MgCl ₂ , 100 mM dNTPs, 1 × PCR buffer, and 1 unit of Taq polymerase (Promega). Each individual mixture also contained 20 μl containing 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, or 0 ng of human genomic DNA. The PCR conditions were as follows: PTC-100 ™ thermal cycler (MJ Research) or GeneAmp® 2700 thermal cycler (Applied Biocyctems) at 94 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 1 minute. , And 25 cycles of 1 minute at 72 ° C. The PCR products were analyzed by 2.0% agarose gel electrophoresis and the results are shown in FIG.
[Brief description of the drawings]
[0027]
FIG. 1 is a graphical representation of endpoint fluorescence intensities measured after PCR performed on ABI 384-well PCR plates and pre-aligned 384-well plates of the invention. Intensities are given in terms of -actin plasmid DNA concentration. The data is detailed in Example 1.
FIG. 2 shows each cycle of PCR performed on an annealed 384-well plate of the invention, an untreated 384-well plate of the invention, an ABI 384-well plate, and an ABgene® Thermo-fast 384-well plate, respectively. 5 is a graphical representation of the change in fluorescence measured in. Fluorescence was measured at each of the 40 PCR cycles. Data and PCR conditions are detailed in Example 1.
FIG. 3 is a graphical representation of the dimensional change of the PCR plate of the present invention. Changes in width, length, height, and warpage were measured after treating the plate under various conditions. Changes to the plates of the present invention can be compared to the deformation observed with standard ABI plates.
FIG. 4 shows analysis of PCR products by electrophoresis in agarose gel. PCR experiments were performed under the same conditions but on four different PCR plates. Details of PCR conditions and plates are described in Example 3.

Claims (16)

複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、シンジオタクチックポリスチレンからなる前記プレート。A microtiter plate having a plurality of wells for use in a polymerase chain reaction application, said plate comprising syndiotactic polystyrene. 前記プレートは９６ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 1, wherein the plate is a 96-well plate. 前記プレートは３８４ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 1, wherein the plate is a 384 well plate. 前記プレートは１５３６ウェルプレートである、請求項１に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 1, wherein the plate is a 1536 well plate. 複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、環状オレフィンポリマーからなる前記プレート。A microtiter plate having a plurality of wells for use in a polymerase chain reaction application, said plate comprising a cyclic olefin polymer. 前記プレートは９６ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 5, wherein the plate is a 96-well plate. 前記プレートは３８４ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 5, wherein the plate is a 384 well plate. 前記プレートは１５３６ウェルプレートである、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate according to claim 5, wherein the plate is a 1536 well plate. 前記環状オレフィンポリマーは、ノルボレンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合からなる群から選択されるプロセスによって生産される、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter of claim 5, wherein the cyclic olefin polymer is produced by a process selected from the group consisting of addition polymerization, addition copolymerization, ring-opening metathesis polymerization, and ring-opening metathesis copolymerization of a norborene monomer. plate. 前記環状オレフィンポリマーは、シクロペンタジエンモノマーの付加重合、付加共重合、開環メタセシス重合、および開環メタセシス共重合からなる群から選択されるプロセスによって生産される、請求項５に記載のマイクロタイタープレート。The microtiter plate of claim 5, wherein the cyclic olefin polymer is produced by a process selected from the group consisting of addition polymerization, addition copolymerization, ring-opening metathesis polymerization, and ring-opening metathesis copolymerization of cyclopentadiene monomer. . 複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、本質的にシンジオタクチックポリスチレンからなる材料から構築される前記プレート。A microtiter plate having a plurality of wells for use in a polymerase chain reaction application, wherein said plate is constructed from a material consisting essentially of syndiotactic polystyrene. 複数のウェルを有する、ポリメラーゼ連鎖反応用途で使用するためのマイクロタイタープレートであって、本質的に環状オレフィンポリマーからなる材料から構築される前記プレート。A microtiter plate having a plurality of wells for use in a polymerase chain reaction application, wherein said plate is constructed from a material consisting essentially of a cyclic olefin polymer. 請求項１、５、１１、または１２のいずれか１項に記載のプレートの使用方法であって：
前記ウェルの少なくとも１つに核酸を配置させること、そして、
前記核酸の温度の上昇および低下を含む様式で、前記核酸を増幅すること
を含む方法。Use of a plate according to any one of claims 1, 5, 11, or 12, comprising:
Placing a nucleic acid in at least one of the wells;
A method comprising amplifying said nucleic acid in a manner comprising increasing and decreasing the temperature of said nucleic acid. 前記ウェルにおいて増幅した核酸の存在を検出することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。14. The method of claim 13, further comprising detecting the presence of the amplified nucleic acid in the well. 前記検出することは、前記増幅した核酸の量を定量化することを含む、請求項１４に記載の方法。15. The method of claim 14, wherein said detecting comprises quantifying the amount of said amplified nucleic acid. 前記検出が行われる自動検出システムに、前記プレートを配置することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。15. The method of claim 14, further comprising placing the plate in an automatic detection system where the detection is performed.

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