JP2004531230A - Gb3レセプター発現細胞を標的とする分子の一般担体 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、シガトキシン発現細胞のBサブユニットのGb3レセプターに対する標的分子の一般ポリペプチド担体と細胞内輸送のためのその使用及び前記分子のプロセシングに関する。
【0002】
シガトキシンは、志賀赤痢菌により分泌されるAB5サブユニットファミリーの細菌毒素である。Aサブユニットは、毒素部分であり、前記細胞の細胞質中に翻訳された後に高等真核標的細胞においてタンパク質合成を抑制する。Bサブユニットはホモ五量体タンパク質(5B断片)であり、標的細胞の原形質膜に見られる糖脂質Gb3と相互作用することによる標的細胞への毒素結合及び内部移行の原因である。B断片は非毒素であるが、多くのGb3発現細胞で原形質膜からサイトゾルへエンドソームを介して逆行する様式で輸送されるホロトキシンの細胞内輸送特性を保持する。
また、糖脂質Gb3レセプターは、ある種の外胚葉誘導性腫瘍(血漿)及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。CD77としても知られる。本文では、用語Gb3をCD77に相当するものとみなす。
【0003】
シガトキシンのBサブユニットに融合されるCD8ヒト腫瘍抗原がCTLに特異的なHLAクラスI拘束法で効果的に提示されうることが、既に著者によって示されている(1)。この結果は、インフルエンザウィルスから同定されたペプチドエピトープを有するシガホロトキシンがMHCクラスI細胞内経路内に抗原を供給することができることを示すもう一つの研究によって別に確認された(3)。
また、著者は志賀赤痢菌から誘導された細菌性シガトキシンのGb3レセプター結合非毒性B断片と抗原、又はモデル腫瘍抗原由来のエピトープとの間の融合タンパク質は、特異的な細胞障害性Tリンパ球応答(CTL)を誘発することができるが、前記融合タンパク質の各部分はCTL誘発を独立して導かないことを示した(1、2及びWO99/03881)。
この技術の難点は、各用途において、つまり各抗原又はその断片にとって、融合タンパク質の特定の構造である必要性があり、宿主細胞で発現されるこの融合タンパク質をコード化する配列を有する組換えベクターの特定の構造を必要とすることである。
【0004】
本発明の目的は、上述した欠点を克服し、Gb3レセプター発現細胞に分子を標的化させてGb3レセプターを発現する前記細胞中にこの分子を内部移行、プロセシング及び/又は発現させることを可能にするための、一般的なフックあるいは一般担体を提供することである。
本発明において、シガトキシンBサブユニット(STxB)誘導体、又はStxB-Cysと称される突然変異体が作成される。このタンパク質において、システインは成熟STxBのC末端に付加される。細菌から精製した場合、タンパク質は野生型STxBのように内部ジスルフィド結合を有するが、C末端Cysのスルフヒドリル基は遊離型である。それらの求核性のために、遊離スルフヒドリル基は特異的カップリングアプローチの優れたアクセプターである(4)。
【0005】
従って、本発明は、Gb3レセプター発現細胞に対して対象の分子を直接的に又は間接的に標的化するための、次の式:STxB-Z(n)-Cys、ここで
−STxBはシガトキシンBサブユニット又はその機能的等価物であり、
−Zはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、nは0、1又はアミノ酸配列であり、
−Cysはアミノ酸システインである
を有する一般ポリペプチド担体に関する。
一般担体のSTxB部分は、(8)に記載される配列又はその機能的等価物を有する。機能的等価物とは、Gb3レセプターに特異的に結合し、及び/又はその提示を抗原の内部移行及びMHCクラスI拘束経路又はMHCクラスIとクラスIIの両方においてその抗原提示細胞で誘引する能力を有するポリペプチド配列を意味する。
腫瘍抗原の発現の不均一性、腫瘍細胞の表面におけるMHCクラスI発現の対立遺伝子特異的欠損、及びMHCクラスI及びクラスIIの両方による抗原の同時提示をその抗原提示細胞で有することの必要性に鑑みて、樹状細胞に対して標的化させるためにBサブユニットに完全な大きさの抗原タンパク質を結合させることが望ましい。
【0006】
好ましい実施態様では、nが0であり、一般担体は次の配列(配列番号1):
COOH-MKKTLLIAASLSFFSASALATPDCVTGKVE
YTKYNDDDTFTVKVGDKELF
TNRWNLQSLLLSAQITGMTVTIKTNACHNGGGFSEVIFRC-NH2
を有する。
実際、Zリンカーが長すぎると、つまりnが2以上であると、内部ジスルフィド架橋が生じ、STxBのGb3レセプターへの結合を抑制し、特に対象の分子への結合を抑制する。
本発明によれば、対象の分子は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、又はその組合せからなる群から選択される。
【0007】
本発明の他の実施態様によれば、対象の分子は、抗原提示細胞に標的化される抗原である。このような細胞はTリンパ球、樹状細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞などからなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、対象の分子は、薬剤、例えばハプテン、ソラレン、又はSTxB-Cysのシステイン部分の−SH基と連結可能な化学基を有するあらゆる化合物である。
薬剤は、直接又はブロモ酢酸等の化合物での活性化の後に、あるいは反応の結果が次の式:STxB-Cys-M(Mは対象とする前記分子全てである)を有する化学実体である技術者に既知の他のあらゆる方法で連結されうる。
【0008】
STxB-Z(n)-Cysへのペプチド又はポリペプチド部分の共有結合のためのカップリングアプローチは、技術者によって記載又は実施されるあらゆる方法又は処理法でありうる。
具体化することのできる第1の方法は、Carlsson等(5)によって記載されるSPDPヘテロ二機能性架橋結合の利用である。しかしながら、SDPDは反応生成物の減少の原因である血清チオラーゼにより切断可能である。
STxB-Z(n)-Cysペプチドと対象とする他のペプチドとの共有結合のための第2の方法は、P. Schelte等(4)によって記載されるように後者にブロモアセチル又はマレイミド基を作ることである。簡略すると、対象とするペプチドを無水ブロモ酢酸で、又はマレイミド基によって化学的に活性化する。適した反応条件(pH、温度、インキュベーション時間)下で、これらの基はそれぞれ−S-S、−S-CH2-に、−S-CO-に又は−S-NH-共有結合になるシス脱離によって脱離される。
【0009】
実施例のように、一般担体のC末端システインの−SH部分にカップリングされるポリペプチド又はペプチドは、そのN末端を無水ブロモ酢酸により、次の反応式:
に従って活性化させる。
ブロモアセチル基は、ペプチドチオール基に対して高い官能基選択性を有し、活性化ペプチドを次の:
のようにSTxB-Cysと反応させることができる。
生じたチオエーテル結合は加水分解に対して安定である。
【0010】
本発明の一般担体に分子をカップリングするための他の方法は、図6に示され実施例5で説明されるようなMBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)を使用することである。このカップリングは、MHCクラスI及び/又はMHCクラスII経路によって抗原タンパク質又は糖タンパク質のような大分子の輸送及び加工を可能にする。
従って、本発明の他の態様は、−S-S-、−S-CO-、又は−S-CH2-又は−S-NH-結合による対象の分子とSTxB-Z(n)-Cysとの共有結合から生じる生成物である。
【0011】
一実施態様では、抗原提示細胞に標的化される対象の分子は、抗原又はそのエピトープ、糖ペプチド又は糖タンパク質、リポペプチド又はリポタンパク質のようなポリペプチド構造によって構築され、又はそれを含む。
好ましい実施態様では、(n)が0、1又は2、好ましくは0である、STxB-Z(n)-Cysと抗原又はその断片とのカップリングから生じる生成物は、MHCクラスI及びMHCクラスII拘束経路で提示可能である。
他の実施態様では、対象の分子は、例えばDNA又はRNA分子のようなポリヌクレオチド構造と結合する能力のあるポリペプチドである。このような分子は、標的細胞で発現される対象配列を含むベクター又はプラスミドでありうる。本発明において、標的細胞は、その膜上にGb3レセプターを有する真核細胞である。
【0012】
従って、本発明の一般担体はまた、遺伝子治療用に又は異種タンパク質を発現する組換え細胞を得るために標的細胞にヌクレオチド配列を導入するための担体である。
他の実施態様では、本発明に係る一般担体は、共有結合によって直接的に又はリンカーによって間接的に細胞障害剤に作用可能に連結させ、Gb3レセプターを発現する腫瘍細胞に対して標的化させることができる。
「間接的な結合」という用語は、一般担体がC末端システインのスルフヒドリル部分を介してリンカーに共有的に連結することを意味し、該リンカーは、薬剤又はプロドラッグに作用可能に連結されてGb3レセプター担持細胞に内部移行する。
この連結は、リンカーと薬剤(又はプロドラッグ)の間の親和性が10−9モル/lよりも高いと、共有結合又は非共有結合であり得る。
【0013】
本発明の他の実施態様は:
a)その3'末端にシステインをコード化するコドンTGT、又はコドンTGCを有するシガトキシンBサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列STxBを含むポリヌクレオチド;
b)その3'末端にコドンTGT又はTGCを有するシガトキシンBサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;及び
c)a)又はb)の配列に相補的なヌクレオチド配列
の群から選択される単離されたポリヌクレオチドである。
【0014】
好ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは次の配列番号2:
5'−atgaaaaaaacattattaatagctgcatcgctttcatttttttcagcaag
tgcgctggcgacgcctgattgtgtaactggaaaggtggagtatacaaaat
ataatgatgacgatacctttacagttaaagtgggtgataaagaattattt
accaacagatggaatcttcagtctcttcttctcagtgcgcaaattacggg
gatgactgtaaccattaaaactaatgcctgtcataatggagggggattca
gcgaagttatttttcgttgt−3'
を有する。
【0015】
また、本発明は、上記のようなポリヌクレオチド配列を有し、適した宿主細胞において一般担体STxB-Z(n)-Cys(ここで、(n)は0、1又は2、STxB及びZは上記と同じ意義を有する)を発現する能力のある組換えベクター又はプラスミドに関する。
例えば、好適なベクターは(7)に記載されるようなプラスミドpSu108である。
本発明の他の目的は:
a)STxB配列を有するプラスミドを準備する;
b)プライマーAA'及びBB'の2つの組を用いて2回のPCR増幅工程を実施する、
−A及びBは互いに相補的で、Cysコドンを有する
−A'及びB'はSTxB配列の外側にある;
c)増幅断片を単離する;
d)増幅断片をハイブリダイズする;
e)ハイブリダイズした断片にPCR増幅を実施する;
f)プラスミドに増幅断片を挿入する
ことを含むプラスミド発現STxB-Z(n)-Cysを得るための方法を提供することにある。
【0016】
好ましい実施態様では、STxB断片を含むプラスミドpSU108(7)を修飾して、B断片cDNAの3'末端にシステインコドンTGTを導入する。工程b)のプライマーは、それぞれAA'及びBB'について:
−プライマーA:5'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−3'(配列番号3)、及び
−プライマーB:5'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−3'(配列番号4)、
−プライマーA':プライマーShigaAtpE:5'−CACTACTACGTTTTAAC−3'(配列番号5)、及び
−プライマーB':プライマーShiga-fd:5'−CGGCGCAACTATCGG−3'(配列番号6)
である。
【0017】
工程e)のPCRは、pSU108のSphl及びSall制限部位にクローン化された断片を生産する。PCRによって誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認される。
技術者は、適した宿主細胞でSTxB-Z(n)-Cysを発現するポリヌクレオチド配列を有するベクターを作成するためのプラスミド、プライマーの選択を容易に行うことができ、この一連の工程は増幅断片へのCysコドンの解釈を可能にする。
また、本発明は、上記のような一般担体をコード化するポリペプチド配列を含む組換えベクターで形質転換することによって得られる組換え細胞株を提供する。好ましい実施態様では、該組換え細胞株は原核細胞、好ましくは大腸菌である。
【0018】
更に好ましい実施態様では、プラスミドは、SphlとSall制限部位の間に組み込まれた配列番号2を有するpSU108であり、相当する細胞株は2000年12月19日に登録番号l-2604でCNCMに寄託されている。
また、本発明は:
a)上記のような組換え細胞株を培養し、
b)該細胞のペリプラズム抽出物を採取し、
c)前記ポリペプチドを生成する
ことを含む、上記のような一般担体を作成する方法を提供する。
【0019】
好ましくは、細胞株は大腸菌であり、c)において精製は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの後にゲル濾過カラムクロマトグラフィーをすることによってなされる。
このような方法は、その際に対象の分子と共有的にカップリングすることによって作用可能に連結させることができる限りにおいて、一般担体の大規模生産に特に有利であり、広範な用途で使用される。
また、本発明は、一般担体のCys部分と対象とする配列との共有結合によって得られる生成物を用いて、MHCクラスI経路に対象とする前記配列を供給する方法を提供し;本方法は、生成物がMHCクラスI経路に関与する細胞に特異的である限りにおいて、得られた抗原又はそのエピトープに対するCTL応答を誘発するのに有利である。
【0020】
実際に、発明者は、卵白アルブミンタンパク質から誘導され、STxB-Cysに化学的に結合される免疫優性ペプチドを、抗原提示細胞によって特異的なハイブリドーマ細胞に提示できることを示しており、STxBはMHCクラスI経路で外因性免疫原性ペプチドを供給できることを示す。物質を汚染している遊離ペプチドの存在による偏向を排除するために固定した樹状細胞を用いる実験は、融合タンパク質の内部移行がこの工程に必要とされることを明確に示した。また、本発明はシガトキシンレセプター、Gb3も内因性MHCクラスI経路において外因性ペプチドを標的化するSTxB-Cysの能力に関係していたということを示した。
また、本発明は、Gb3レセプター発現細胞に対象の配列を含む発現ベクターを供給するための、前記発現ベクターを、一般担体のCys部分に共有的に結合されるリジンリッチペプチドに結合させることを特徴とする方法に関する。
【0021】
実施例のように、リジンリッチペプチドはあらゆるポリヌクレオチド配列、DNA又はRNAに結合する能力のある16アミノ酸長のポリリジンである。このような16アミノ酸長のリジンを有するペプチドは、そのN末端で無水ブロモ酢酸によって活性化され、STxB-Cysにカップリングする。発現プラスミドは、このカップリング生成物に結合し、標的細胞へのDNAのベクトル化は、例えば、緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼのような好適なレポーター系を用いてアッセイされる。
抗原提示細胞の核にSTxBによって発現プラスミドを標的化する能力は、i)DNAが新しい実験又は臨床的な必要性のためにさらにより容易に利用することができ、ii)相乗効果のためにDNA由来の抗原性ペプチド又はタンパク質の発現がSTxB依存性抗原提示の感度を更に向上させるので、このベクターの効力をさらに改善することが期待される。
【0022】
また、本発明は、細胞、特にGb3(又はCD77)レセプターを有する癌細胞に薬剤又はプロドラッグを供給するための方法を提供する。
糖脂質Gb3レセプターは、ある種の神経外肺葉由来腫瘍(神経膠腫)及びある種のバーキットリンパ腫で優先的に発現されることが報告されている。癌の化学療法の使用の制限の一つは、正常細胞におけるそれらの毒性による薬剤の二次的な副作用であるので、薬剤はSTxB-Cysを用いることによって腫瘍細胞で優先的に方向づけされる。薬剤は、STxB-Cysのスルフヒドリル基反応性となるように活性化される。この目的のために、マレイミド基を薬剤、例えばソラレン化合物に導入してもよい。
【0023】
また、本発明は:
−ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドの免疫原性を増強するための製薬組成物であって、該ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドにそのCys部分によって共有的に結合された一般担体を含むもの;
−Gb3レセプター(CD77)を有する腫瘍細胞を処置するための製薬組成物であって、前記腫瘍細胞にとって毒性の薬剤又はプロドラッグにそのCys部分によって共有結合した本発明に係る一般担体を含むもの
に関する。
本発明の一般担体の範囲、他の出願のその広い用途を限定するものではなく、以下の実施例と図は本発明の有利性を示す。
【実施例1】
【0024】
一般担体の調製
a)STxB - Cysを発現するプラスミドの構築:
好ましい実施態様で、プラスミドpSU108(7)を修飾してB-断片cDNAの3'末端にシステインコドンtgtを導入した。PCRプライマーA:配列番号3(5'−AGCGAAGTTATTTTTCGTTGTTGACTCAGAATAGCTC−3')及びプライマーA':配列番号4(5'−GAGCTATTCTGAGTCAACACGAAAAATAACTTC−3')を、プラスミド特定プライマーShigaAtpE:配列番号5(5'−CACTACTACGTTTTAAC−3')及びShiga-fd:配列番号6(5'−CGGCGCAACTATCGG−3')とともに使用して、プライマーShiga AtpE及びShiga-fdでの第2のPCRで、pSU108のSphl及びSal1制限部位にクローン化された断片を生成するDNA断片を作成した。PCRにより誘導される配列はジデオキシ配列決定によって確認された。
【0025】
b)タンパク質精製:
b)1.ペリプラズム抽出物の調製を次のようにして実施した:
− 30℃で増殖させた125μlの一晩培養物を含有する125mlのLB/Ampを接種し、
− 30℃で一晩増殖させ、
− 375mlのLB/Amp、50℃に移して;42℃で4時間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− 10mMのTris/HC1、pH8.0で3回、細胞を洗浄し、
− 200mlの25%スクロース、1mMのEDTA、10mMのTris/HC1、Ph8.0に細胞を再懸濁して;室温で10分間インキュベートし、
− 遠心分離して、細胞をペレットにし、
− プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する200mlの氷冷水に細胞を再懸濁して;氷上で10分間インキュベートし、
− 遠心分離し;上清を回収し;20mMのTris/HC1、Ph8.0を加える。
b)2.カラムの準備:
ペリプラズム抽出物をQFF陰イオン交換カラム(ファルマシア社)に負荷し、230mMのNaclで溶出させた。画分を含むSTxB-Cysをプールし、4倍に希釈してMono Q陰イオン交換カラム(ファルマシア社)に負荷し、続いて230mMのNaclに溶出させた。PallFiltron社からのマイクロ濃縮装置で濃縮した後、プールしておいた分画をセファデックス75ゲル濾過カラムを通した。純度は約95%であった(図1)。
b)3.生成物の特徴付け
セファデックス75ゲル濾過カラムで精製したSTxB-CysのB断片は、基本的に単量体である(図1)。これは、B断片の天然C末端から2アミノ酸を超える位置でシステインを加えられた構築物とは著しい相違がある。これらの場合、五量体で隣接するB断片はジスルフィド結合で結合される。
【実施例2】
【0026】
一般担体に活性化ペプチドをカップリングするための条件
a)担体:
3つの異なる担体を比較した。
1)STxB-Cys:CysがそのC末端に直接加えられたB断片。このタンパク質は精製カラムから単量体として溶出する。
2)STxB-Z2-Cys:野生型B断片のC末端とCysの間に短いスペーサー(クローニングカセットから生じる2アミノ酸)を有する担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のBサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
3)STxB-Glyc-Cys-KDEL:Cysが9アミノ酸長のグリコシル化カセットとC末端KDELペプチドの間にある担体。タンパク質の大部分は、精製カラムから二量体として溶出した。これらは、還元条件下で分離することができ、五量体のBサブユニット複合体の単量体の間にジスルフィド結合の形成を示す。
【0027】
b)試験ペプチド:
1)Pep1:ニワトリの卵白アルブミンから誘導されるSL8抗原ペプチドを有する16アミノ酸の合成ペプチド。
2)Pep2:C末端にHis-gagをさらに有する上記のような24アミノ酸の合成ペプチド。
3)SL8:抗原提示細胞の原形質膜においてMHCクラスI複合体のペプチドと直接変換することのできる卵白アルブミン由来の抗原ペプチド。
【0028】
c)カップリング条件:
還元条件下(タイプ1):融合タンパク質をDTTで一晩処理し、次いで、活性化ペプチド(そのN末端にブロモ酢酸基を有する)を過剰に加えた。融合タンパク質を用いた第一カップリング実験に用いられる条件は、ほとんど単量体を二量体化する(タンパク質STxB-Z2-Cys及びSTxB-Glyc-Cys-KDEL)。
非還元条件(タイプ2):融合タンパク質を活性化ペプチドと直接反応させた。
【0029】
d)生化学的及び形態学的コントロール:
Pep2はHisタグを有する。これは、抗His抗体を用いてウェスタンブロットによるBサブユニットのPep2の存在を示すこと、及びHeLa細胞のPep2のBサブユニット依存性輸送を可能にした。
図2aは、B3Z CTLハイブリドーマの用量依存性刺激(βガラクトシダーゼ活性の測定)が非固定細胞で観察されたが、固定では抗原提示が消失したことを示す。
抗原提示は非固定細胞でのみ作用し、観察された提示は汚染のないPep2から生じないことに注目される。
図2bは、固定D1細胞が遊離SL8ペプチドをまだ提示することができることを示す図2aのコントロール実験を示す。
【0030】
図3では、高用量(200−1000nM)においていくらかの提示が固定細胞で観察されたので、このタイプのプロトコールにおいては、幾つかの遊離Pep1が融合タンパク質と同時精製されるようである。SL8による提示は右に示される。
図4では、カップリングされたタンパク質(レーン1及び2)又はSL8ペプチド(レーン5及び6)を、Gb3へのBサブユニットの結合を阻害する13C4抗体から誘導される抗BサブユニットFab断片と共にインキュベートし(レーン2及び5)、あるいはしなかった(レーン1及び4)。Fab断片は、クラスI経路に抗原ペプチドを導入するBサブユニットの能力を中和したが、SL8での提示はこれらの条件下で影響されなかったことに注目される。この実験におけるバックグラウンドシグナルは0.3であった。
【0031】
図5aでは、D1細胞をPPMPで3日間前処理した((2)の図3b参照)。この処理は、細胞表面でのGb3発現の重大な減少をもたらすが、完全にそれを排除するものではない。この条件下で、STxB-Glyc-Cys-KDELとPep1とのカップリング反応からの抗原提示は有意に減少し、Gb3が提示現象に重要であることを示した。
これら全ての実験から、STxB-Cysへの非還元下でのカップリングは、驚くべき効果があると考えられる(感受性に関して;図1に示されるように、4nMのSTxB-Cys-Pep2のみ応答がある必要がある)。そのため、一般担体STxB-Cysはその提示の簡便性及びカップリングの再現能力のために望まれる。
【0032】
従って、STxB-Cysへの活性化ペプチドのカップリングの適切な条件は、次の通りであった:
−STxB-Cysを20mMホウ酸塩バッファー、pH9.0、150mMのNaClに対して透析する、
−1mg/mlに濃縮する、
−N末端活性化ペプチド(無水ブロモ酢酸で活性化した)を12mMでDMSOに溶解する、
−ペプチドを0.2mMまでタンパク質溶液に希釈する、
−室温で12時間インキュベートする、
−PBSに対して透析する。
【実施例3】
【0033】
STxBのその抗原提示能力に関する特徴付け
次の一連の実験は、抗原提示システムで機能するSTxBの能力を十分に説明するのに役立つであろう。
a)クラスI - 及びクラスII - 拘束抗原提示:
ニワトリ卵白アルブミン(Br-CH2-CO-NH-LEQLESIINFEKLTEWSLKISQAVHAAHAEINEAGR、配列257−264及び323−339由来のクラスI-及びクラスII-拘束抗原ペプチドを有するペプチドをSTxB-Cysにカップリングし、これらのペプチドのクラスI-及びクラスII-拘束提示を対応するT細胞ハイブリドーマを用いて分析した。
【0034】
b)完全な大きさのタンパク質のカップリング。
我々による先行の証拠は、ニワトリ卵白アルブミンをSTxB-Cysにカップリングすることができることを示唆する。これらの実験は、SPDPヘテロ二機能性架橋剤で実施された(Carlsson等, 1978)。
抗原提示実験の第1系列は、卵白アルブミンタンパク質をマウス樹状細胞の内因性MHCクラスI拘束抗原提示経路に導入することができることを示した。SPDPは血清チオラーゼにより切断可能であるという不都合がある。この架橋剤は、切断不可能であるMBSによってうまく代用された。他の抗原タンパク質(Mart1及びHPV16-E7から誘導されるポリペプチド及びMuc1)を試験して該手段が一般的な使用であることを示す。
【0035】
c)複合タンパク質の混合物のカップリング。
頸部癌誘導細胞株Caskiの溶菌液を用いた。この頸部癌細胞株はその膜においてHLA-A2対立遺伝子を発現し、またヒトパピローマウィルス誘導ペプチドを発現する。E7は、最初のケラチノサイトの形質転換に必要なHPV由来の初期転写ORFである。抗E7 HLA A2拘束性CTLをインビトロで誘発する。HLA-A2 E7に特異的な提示アッセイによってこのタンパク質混合物のカップリングの効果を試験した。コントロールのように、E7を発現しないHLA-A2-陽性細胞株(croft細胞又はDaudi)からの溶菌液をSTxB-lysにカップリングした。
【実施例4】
【0036】
MHCクラスI拘束抗原提示のための用途
図4の実験は、STxB-Cys依存性抗原提示はGb3との相互作用が消失した時に阻害されることを示す。ここで、SL8にカップリングされた、STxBに対するモノクローナルAbのFab断片の0.1μMのSTxB-Cysへの予備結合は、抗原提示を阻害することが分かり、Gb3へのSTxB-Cys結合は抗原提示に必要であることを示唆する。同様の結果が、Gb3-発現を薬剤で阻害した場合にも得られた(図4)。
【実施例5】
【0037】
STxB - Cysに卵白アルブミンをカップリングするための反応鎖
図6に反応式を示す。
第1の反応では、MBSのN-ヒドロキシスクシンイミドエステル部分が、抗原標的タンパク質、例えばモデルタンパク質の卵白アルブミン(Ova)の一級アミンと反応する。反応生成物を精製し、次いで第2反応ではマレイミドベンゾイル部分を介してカップリングを引き起こすSTxB-Cysとインキュベートする。
【0038】
図7は、STxB-Cys及びOvaに関与する典型的なカップリング反応のSDS-PAGE及びウェスタン分析を示す。カップリングについて、20mg/mlのOvaを含有する100mMのHEPES、pH7.4を4.5mMのMBSとともに室温で30分間インキュベートした。反応物を、PBS/EDTA10mMで平衡にしたゲル濾過カラムに通す。溶出したOvaを20mg/mlに濃縮する。1容積の3.5mg/mlでSTxB-Cysを含有するPBS/EDTAを1容積の活性化Ovaと混合し、室温で一晩インキュベートする。
【0039】
図7は、カップリング反応の中で、カップリングしていないSTxB(上部)とカップリングしていないOva(下部;カップリングしていないタンパク質はクロスで示した)に加えて、低い電気泳動度を有するバンド(矢印で示される;カップリング生成物)が検出された。反応生成物を13C4抗STxBモノクローナル抗体で作った免疫親和性カラム(レーンIPカラム)に通すことによって精製した。遊離Ovaが消失することに注意したい。次いで、溶出STxB-Cys(カップリングした及びカップリングしていない)をゲル濾過カラムに通して、カップリングしたSTxB-Cysから遊離STxB(分画15−19)を分離する(分画9−14;分画11−12は大量のカップリングしたタンパク質を含むことに注目される;下のバンドに比較して小さい上のカップリングバンドは、おそらく二量体Ovaから生じている)。
【実施例6】
【0040】
STxB - Cys - Ovaカップリング生成物の細胞内輸送の特徴付け
0.5μMのSTxB-Cys-Ovaを氷上でHeLa細胞とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、45分間で37度まで変化させ、固定し、指示抗体を染色した。図8に示されるように、STxB-Cys及びOvaをMBSによって結合した場合には、Ova免疫反応性はRab6で染色されるゴルジ体のSTxB免疫反応性と一緒に検出することができる。両タンパク質をHeLa細胞と別々の存在としてインキュベートすると、STxB-Cysのみがゴルジに輸送され、Ovaは細胞で検出することができなかった。これらのデータは、カップリングしたSTxB-CysもカップリングしていないSTxB-Cysと同じようにして輸送され、OvaはSTxB-Cysを介して方向付けされることを明確に示す。
【実施例7】
【0041】
STxB - Cysは完全な大きさの外因性抗原タンパク質から誘導されたペプチドのMHCクラスI及びII拘束性提示を可能にする
第1の実験では(図9、左)、STxB-Cys-Ovaを使用してマウス樹状細胞株D1を感作した場合、非ベクトル化OvaをパルスしたD1細胞に比較してMHCクラスII拘束Ova誘導ペプチドOva323−339の提示の明確な増加が観察されたことを示している。実際、Ova323−339ペプチドの有意な提示は、0.01nMのSTxB-Cys-Ovaと同様にほとんど検出されなかったが、10nMの完全な大きさのOvaはそのペプチドの有効な提示に必要とされた。IAb拘束Ova323−339ペプチドの提示を、このペプチドの認識後にIL-2を生成するB097.10ハイブリドーマを用いて暴露した。コントロールとして、不適切なMHCクラスII拘束ハイブリドーマをB097.10の代わりに使用した場合にIL-2分泌は観察されなかった(データは示さず)。
第2の実験では、Ovaのみ又はSTxB-Cys-Ovaと共にの何れかを同じD1樹状H2b拘束細胞株にパルスした。Kb分子の場合にSL8ペプチドを認識する特異的B3Zハイブリドーマによって暴露されるので、Ova誘導免疫優性SL8ペプチド(Ova257−264)の提示は、D1細胞を遊離Ovaで100nMまで感作した場合には観察されなかったが、1−10nMのSTxB-Cys-OvaはSL8ペプチドの提示を可能にした。コントロールとして、不適切なハイブリドーマの活性化が同様の実験条件で観察されないことを示した。
結局、これらの結果は、STxB-CysがMHCクラスIとクラスII経路の両方に高い効果を有する完全な大きさのタンパク質を標的とすることを明確に示す。
【0042】
参考文献
(1) Ren-Shiang Lee, Eric Tartour, Pierre van der Bruggen, Valerie Vantomme, Isabelle Joyeux, Bruno Goud, Wolf Herman Fridman及びLudger Johannes, 「Major histocompatibility complex class I Presentation of exogenous soluble tumor antigen fused to the B-fragment of Shiga toxin」 Eur. J. Immunol. (1998) 28: 2726-2737。
(2) Nacilla Haicheur, Emmanuelle Bismuth, Sophie Bosset, Olivier Adotevi, Guy Warnier, Valerie Lacabanne, Armelle Regnault, Catherine Desaymard, Sebastian Amigorena, Paola Ricciardi-Castagnoli, Bruno Goud, Wolf H. Fridman, Ludger Johannes及びEric Tartour, 「The BSubunit of Shiga Toxin Fused to a Tumor Antigen Elicits CTL and Targets Dendritic Cells to Allow MHC Class I-Restricted Presentation of Peptides Derived from Exogenous Antigens」 The Journal of Immunology (2000) 165: 3301-3308。
(3) Noakes, K.L., H.T. Teisseranc, J.M. Lord, P.R. Dunbar, V. Cerundolo及びL.M. Roberts 「Exploiting retrograde transport of Shiga-like toxin 1 for the delivery of exogenous antigens into the MHC class I presentation pathway」 Febs. Lett. (1999) 453:95。
(4) Philippe Schelte, Christophe Boeckler, Benoit Frisch及びFrancis Schuber 「Differential Reactivity of Maleimide and Bromoacetyl functions with Thiols: Application to the Preparation of Liposomal Diepitope Constructs」 Eur. J. Immunol. (1999) 29:2297-2308。
(5) Carlsson, J., H. Drevin,及びR. Axen. 1978. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate, a new heterobifunctional reagent. Biochem. J.173:723-737。
(6) Su, G.F., H.N. Brahmbhatt, J. Wehland, M. Rohde及びK.N. Timmis 「Construction of stable LamB-Shiga toxin B subunit hybrids: analysis of expression in Salmonella typhimurium aroA strains and stimulation of B subunit-specific mucosal and serum antibody responses」 (1992) Infect. Immun. 60:3345-3359。
(7) Johannes, L., Tenza, D., Antony, C.及びGoud, B., 「Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin」 (1997) J. Biol. Chem. 272:19554-19561。
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【図面の簡単な説明】
【0043】
【図1】図1は、最終セファデックス75カラムで生じる精製STxB-Cysのタンパク質特性を示す。分画20−25は主に単量体のSTxB-Cysを含む(単量体及び二量体STxB-Cysの位置は右側に示される)。分子量マーカーは左に示される。
【図2a】図2aは、STxB-Cysへの[実施例2に定義されるような]タイプ2のPep2の結合、それに続く(2)に説明されるようなD1樹状細胞でのインビトロ抗原提示アッセイを示す。SL8ペプチド、卵白アルブミンの免疫優性エピトープにカップリングされた2つの異なる調製のSTxB-Cysが使用された(4A及び9Aと称される)。固定では、抗原提示が消失し、細胞外プロセシングを生じないことを示す。
【図2b】図2aのコントロール実験を示し、固定したD1がまだ遊離SL8ペプチドを提示することができることを示す。
【図3】図3は[実施例2に定義されるような]STxB-SH及びPep1におけるタイプ1のカップリング反応を用いた固定及び非固定D1細胞でのもう1つの実験を示す。
【図4】図4は、B-Glyc-Cys-KDELへのPep2のカップリングから誘導される抗原ペプチドのBサブユニットに依存する提示を示す。また、Gb3に結合するSTxBを中和する抗体に由来するFab断片の使用は、抗原提示を消失させる。
【図5】図5は、Gb3合成阻害剤PPMPがBサブユニット依存性抗原提示を阻害し(5a)、SL8提示がPPMP処理細胞において減少しないことを示す。
【図6】図6は、ヘテロ二機能性架橋剤MBSを用いてSTxB-Cysへの完全な大きさのOvaカップリングの反応式を示す。上段:Ovaの一級アミンにMBSを結合する第一反応。中段:活性化OvaとSTxB-Cysとの第二反応。下段:MBSの構造。
【図7】STxB-CysへのOvaカップリングのウェスタン分析を示す。図の上部は抗STxB抗体を用いた免疫ブロット、下部は抗Ova抗体を用いた免疫ブロットを示す。精製手順の様々な段階の中間体を示す。レーン1:カップリングしていないタンパク質(クロスで示される)。レーン2:カップリング反応物(カップリング生成物は矢印で示される)。レーン3:抗STxB抗体が点在する免疫親和性カラムの溶出物。レーン4−7:ゲル濾過カラムからの分画。レーン4:分画9−10。レーン5:分画11−12。レーン6:分画13−14。レーン7:分画15−19(遊離STxB-Cys)。分画11−12は大量の単量体カップリング生成物を含む。また、低い電気泳動度を有する物質もいくらか検出することができたが、元の準備物に存在する二量体Ovaから生ずるようである。
【図8】図8はHeLa細胞におけるSTxB-Cys-Ova輸送の免疫蛍光分析を示す。カップリング生成物STxB-Cys-Ova(図の上部)又はSTxB-CysとOvaの混合物(図の下部)を氷上でHeLa細胞とともにインキュベートした。洗浄した後、細胞を37℃で45分間撹拌し、固定し、示される抗体で染色した。OvaがSTxB-Cys(上)と結合したときに、タンパク質はゴルジ体に方向付けされ、ゴルジマーカーRab6を同時染色した。OvaがStxB-Cysと混合しただけだと(下)、タンパク質を細胞で検出することはできない。
【図9】図9は、D1細胞とSTxB-Cys-Ovaとをインキュベーションすることによって誘導したMHCクラスI及びII拘束抗原提示を示す。詳細は本文を参照のこと。
Claims (24)
- Gb3レセプター発現細胞に対して分子を直接的に又は間接的に標的化するための一般ポリペプチド担体であって、次の式:STxB-Z(n)-Cys、ここで:
−STxBはシガトキシンBサブユニット又はその機能的等価物であり、
−Zはスルフヒドリル基のないアミノ酸であり、nは0、1又はポリペプチドであり、
−Cysはアミノ酸システインである
を有する一般担体。 - nが0である、請求項1に記載の一般担体。
- 分子が、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、核酸、ポリヌクレオチド、又はその組合せからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の一般担体。
- 分子が、−S-S-、又は−S-CO-、又は−S-CH2-、又は−S-NH-結合によって一般担体の−S残基に共有的に結合される、請求項1又は2に記載の一般担体。
- 分子が抗原提示細胞に標的化される抗原である、請求項4に記載の一般担体。
- 一般担体が、−S-S-、又は−S-CO-、又は−S-CH2-又は−S-NH-結合によってオリゴペプチド又はポリペプチドと共有的に結合し、標的化される分子が、前記オリゴペプチド又はポリペプチドに作用可能に結合する、請求項1又は2に記載の一般担体。
- ポリリジンオリゴペプチドに共有的に結合し、標的化される分子が前記ポリリジン部位に作用可能に結合された核酸又はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項6に記載の一般担体。
- 分子がGb3レセプターを発現する腫瘍細胞に標的化される細胞障害性の薬剤またはプロドラッグである、請求項4に記載の一般担体。
- a)その3'末端にシステインをコード化するコドンTGT、又はコドンTGCを有するシガトキシンBサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列STxBを含むポリヌクレオチド、
b)その3'末端にコドンTGT又はTGCを有するシガトキシンBサブユニット又はその機能性等価物をコード化するヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
c)a)又はb)の配列に相補的なヌクレオチド配列
からなる群から選択される単離されたポリヌクレオチド。 - 配列番号2を有する請求項9に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項9又は10に記載のポリヌクレオチド配列を有し、適した宿主細胞において請求項1の一般ベクターを発現するための組換えベクター又はプラスミド。
- 請求項11に記載の組換えベクターで形質転換することによって得られた組換え細胞株。
- 原核細胞株、好ましくは大腸菌である請求項12に記載の組換え細胞株。
- 2000年12月19日に登録番号l-2604でCNCMに寄託された請求項11、12又は13に記載の組換え細胞株。
- a)STxB配列を有するプラスミドを準備する;
b)プライマーAA'及びBB'の2つの組を用いて2回のPCR増幅工程を実施する、
−A及びBは互いに相補的で、Cysコドンを有する
−A'及びB'はSTxB配列の外側にある;
c)増幅断片を単離する;
d)増幅断片をハイブリダイズする;
e)ハイブリダイズした断片にPCR増幅を実施する;
f)プラスミドに増幅断片を挿入する
ことを含む請求項11又は12に記載の組換えベクターを構築する方法。 - 工程f)において、断片がプラスミドpSU108のSphlとSall制限部位に組み込まれる、請求項15に記載の方法。
- a)請求項12ないし14の何れか1項に記載の細胞株を培養し、
b)前記細胞のペリプラズム抽出物を採取し、
c)前記ポリペプチドを精製する
ことを含む、請求項1に記載の精製ポリペプチドを作成する方法。 - a)において、細胞株が大腸菌であり、c)において、精製が陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの後にゲル濾過カラムクロマトグラフィーをすることによってなされる、請求項17に記載の方法。
- MHCクラスI及びMHCクラスII経路に対象の配列を供給するための方法であって、一般担体のCys部分と対象とする前記配列との共有結合によって得られる生成物を用いる方法。
- Gb3レセプター発現細胞に対象の配列を含む発現ベクターを供給するための方法であって、前記発現ベクターを、一般担体のCys部分に共有的に結合されるリジンリッチペプチドに作用可能に結合させることを特徴とする方法。
- リジンリッチペプチドが16アミノ酸長のポリリジンである、請求項20に記載の方法。
- 対象の配列が:
−免疫原性ペプチドをコード化する配列、又は
−Gb3レセプター発現細胞にとって毒性となる薬剤又はプロドラッグをコード化する配列、又は
−治療活性分子をコード化する配列
の中から選択される、請求項19ないし21に記載の方法。 - ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドの免疫原性を増強するための製薬組成物であって、前記ペプチド又はタンパク質又は糖タンパク質又はリポペプチドに、そのCys部分によって共有的に結合した請求項1又は2に記載のポリペプチド担体を含む製薬組成物。
- Gb3を有する腫瘍細胞を処置するための製薬組成物であって、前記腫瘍細胞にとって毒性の薬剤又はプロドラッグに、そのCys部分によって共有的に結合した請求項1又は2に記載のポリペプチド担体を含む製薬組成物。
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