JP2004527206A - Ｒｙｋタンパク質を使用する新脈管形成の調節方法 - Google Patents

Abstract

Ｒｙｋタンパク質が新脈管形成の調節において新規の活性を有することが見出された。内皮細胞の毛細管形成活性の調節において有用であった新たな変異種Ｒｙｋタンパク質を構築した。変異種Ｒｙｋタンパク質は、癌、創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性および心血管系疾患のような疾患、ならびに該疾患の原因もしくは治療に新脈管形成が関係する他の疾患もしくは臨床的病状における治療薬として使用してよい。

Description

【０００１】
（分野）
本発明は、新たに同定されたポリペプチドもしくはこうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する新脈管形成の調節方法に関する。より具体的には、該方法はヒトもしくは動物組織中の新脈管形成を調節するのにＲｙｋタンパク質もしくはそれ由来のフラグメントを使用することを含んで成る。
【０００２】
（背景）
Ｒｙｋは、損なわれた触媒活性を有しかつそのリガンド（１種もしくは複数）が未だ同定されていないレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの１メンバーである。ＲｙｋはＳｔａｃｋｅｒらによりＷＩＰＯ公開第ＷＯ ９３／２３４２９号明細書（出願番号第ＰＣＴ／ＡＵ９３／００２１０号）に記述されている。ヒトＲｙｋの読取り枠は６０７アミノ酸（ａａ）をコードし、２個の潜在的な膜貫通ドメインを有し、そして、ｍｅｔ（ＨＧＦ／ＳＦ−Ｒ）およびＩＧＦ−１ＲのようなＲＴＫに対する、その触媒（すなわち活性化およびヌクレオチド結合）ドメインの最も近い相同性を表す（Ｔａｍａｇｎｏｎｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９３；８：２００９）。Ｒｙｋの触媒領域はｖ−ｓｅａと最も近い相同性（３９％）を示す（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６；２：１８９）。Ｒｙｋは、その触媒ドメイン中の多くの保存された残基で他のＲＴＫファミリーメンバーと異なる（Ｋａｔｓｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：６４２７）。このドメイン中のアミノ酸置換が、自己リン酸化を受けるもしくは基質をリン酸化するＲｙｋの無能力の原因である。しかしながら、Ｒｙｋキメラレセプターのリガンド刺激は、***促進剤に活性化されるタンパク質キナーゼ経路の活性化をもたらす（Ｋａｔｓｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：６４２７）。
【０００３】
Ｒｙｋは他のＲＴＫファミリーに対しその細胞外ドメインにおいて有意の相同性を表さない。Ｒｙｋは比較的小さな細胞外ドメインを有する。Ｒｙｋのアミノ酸／ヌクレオチド配列の変異が数人の著者により記述されている（例えば、Ｔａｍａｇｎｏｎｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９３；８：２００９（細胞外ドメインは１９１アミノ酸よりなるアミノ酸配列を有するとして記述される）、およびＨａｌｆｏｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２４７：７３７９（細胞外ドメインはＴａｍａｇｎｏｎｅにより記述されたと同一のアミノ酸配列を有するとして記述されるが；しかしながらＣ末端の１０アミノ酸が欠けていて細胞外ドメインを１８１アミノ酸にしている）を参照されたい）。しかしながら、文献中に記述されたＲｙｋの細胞外ドメインの全部は、５個の潜在的なＮ−連結されたグリコシル化部位を含有する（Ｓｔａｃｋｅｒら、ＰＮＡＳ １９９２；８９：１１８１８）。ヒトおよびマウスのｒｙｋ配列は、ヌクレオチドレベルで９２％同一、およびアミノ酸レベルで９７％同一である（Ｓｔａｃｋｅｒら、ＰＮＡＳ １９９２；８９：１１８１８）。
【０００４】
正常組織の免疫化学的研究は、Ｒｙｋが上皮、間質および血管で発現されることを示した（Ｋａｔｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：２２６５）。ノーザンブロット分析は、心、脳、肺、胎盤、肝、筋、腎および膵を包含する多くの組織中でのＲｙｋ ｍＲＮＡの存在を示す（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６；２：１８９）。インシトゥハイブリダイゼーション分析は、Ｒｙｋ遺伝子が脳、肺、結腸、腎および***の上皮および間質区画中でほぼ独占的に発現されることを示した（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６；２：１８９）。Ｒｙｋ ＲＮＡは、皮膚の基底層および舌上皮、ならびに腸の絨毛間層および若干の陰窩基底部に、大きく増大されたレベルで存在する（Ｓｅｒｆａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９８；１７：３４３５）。Ｒｙｋは上皮細胞中で誘導され、分化した組織中でもしくは子宮内膜のリモデリングの間に最終的な場所を探し、また、それは細胞認識に関与することが仮定されている（Ｓｅｒｆａｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９８；１７：３４３５）。
【０００５】
ヒトＲｙｋは境界および悪性の卵巣腫瘍で過剰発現される（Ｋａｔｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：２２６５）。漿液性および明細胞腫瘍のサブタイプにおいて、増大された発現が上皮、間質および血管で観察される。悪性腫瘍において、増大された発現は主として上皮に限られる（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６；２：１８９）。ヒトＲｙｋ ｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用してＳＫＯＶ−３（上皮卵巣癌細胞系）の相補ＤＮＡライブラリーから単離された（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６；２：１８９）。正常な卵巣の表面上皮上でヒトＲｙｋの最小限ないし非存在の発現が存在する。マウス線維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３におけるヒトＲｙｋの過剰発現は、ヌードマウスで足場非依存性の成長および腫瘍形成性を誘導する（Ｋａｔｓｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：２２６５）。これらの観察結果は、Ｒｙｋが腫瘍の進行に関与するかもしれないことを示唆する。
【０００６】
ＲＹＫは、胚および成体において学習および記憶ならびに軸索誘導（経路選択）に関与することが決定されているドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＬｉｏタンパク質の哺乳動物の相同物である（Ｍｏｒｅａｕ−Ｆａｕｖａｒｑｕｅら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１９９８；７８：４７）。Ｌｉｏｎｅｔｔｅは、ｄｅｒａｉｌｅｄと呼ばれる胚の神経系の軸索誘導欠損についてのスクリーニングで同定された。Ｌｉｏｎｅｔｔｅ突然変異体（ｄｅｒａｉｌｅｄ）は、生存可能であるが、しかし、成体の中枢複合体（ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）中の構造的な脳の欠陥を提示し、そこでは中枢の脳軸索が中脳領域により異常に誘引されるかのように挙動する。ｄｅｒａｉｌｅｄ突然変異体の胚において、遺伝子を発現した少数の一組の介在ニューロンは、正確な経路の選択を行うことに失敗した（Ｃａｌｌａｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ １９９５；３７６：１７１）。
【０００７】
Ｒｙｋは、ＣＤ３−、ＣＤ４−およびＣＤ８−Ｔ細胞、前Ｔ細胞、胸腺上皮細胞ならびに成熟骨髄性細胞中で発現されるが、しかし骨髄前駆細胞もしくはＢ細胞前駆体では発現されない（Ｓｉｍｏｎｅａｕｘら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９５；１５４：１１５７）。Ｒｙｋ発現は分化した細胞（Ｌｉｎ＋）で観察されるがしかし前駆細動（Ｌｉｎ−）ではされず、そして、Ｒｙｋ発現は系統分化の決定および成熟の段階により造血発生の間に調節されるかもしれないと仮定された。
【０００８】
Ｒｙｋはまた、発生中の胚の筋および隣接する表皮細胞の小さな一サブセットにより、筋接着部位の選択の間にも発現される（Ｃａｌｌａｈａｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９６；１２２：２７６１）。ｄｅｒａｉｌｅｄ突然変異体において、筋はしばしば適切な場所で接着することに失敗するが、とは言えそれらの表皮接着細胞は影響を及ぼされないようである。
【０００９】
新脈管形成（前から存在する血管からの新たな毛細管の形成）は、血管の発芽、内皮細胞の移動、増殖、管分化および生存を必要とする多段階の高度に組織化された過程である。いくつかの系統の直接の証拠が、今や、新脈管形成が充実性腫瘍の生存および持続、ならびにそれらの転移に不可欠であることを示唆している（Ｆｏｌｋｍａｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３９：５８−６１；Ｈｏｒｉら（１９９１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：６１８０−８４；Ｋｉｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４；Ｍｉｌｌａｕｅｒら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６：１６１５−２０）。新脈管形成を刺激するために、腫瘍は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦおよびＢＦＧＦ）（Ｋａｎｄｅｌら（１９９１）Ｃｅｌｌ．６６：１０９５−１０４）および血管内皮細胞増殖因子／血管透過性因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）を包含する多様な血管由来因子のそれらの産生をアップレギュレートする。しかしながら、多くの悪性腫瘍は、アンジオスタチンおよびトロンボスポンジンを包含する新脈管形成の阻害剤もまた生成させる（Ｃｈｅｎら（１１９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：４２３０−３３；Ｇｏｏｄら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．８７：６６２４−２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８）。血管形成の表現型は、新生血管形成のこれらの正と負の調節物質の間の正味の均衡の結果であることが前提とされている（Ｇｏｏｄら（１９９０）、上記；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）、上記；Ｐａｒａｎｇｉら（１９９６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．９３：２００２−０７；Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：３４５−５５）。
【００１０】
新脈管形成のいくつかの他の内在性の阻害剤が同定されているが、とは言え、全部が腫瘍の存在に関連するわけでない。これらは、血小板因子４（Ｇｕｐｔａら（２０００）Ｂｌｏｏｄ ９５：１４７−５５）、インターフェロン−α、インターロイキン−１２および／もしくはインターフェロン−γ、ｇｒｏ−βにより誘導される（Ｃａｏら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：２０６９−７７）インターフェロンで誘導可能なタンパク質１０（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １０）（Ａｎｇｉｏｌｉｌｌｏら（１９９６）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９５：１５８−６７；Ｓｔｒｉｅｔｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７３４８−５７）、ならびにプロラクチンの１６ｋＤａのＮ末端フラグメント（Ｃｌａｐｐら（１９９９）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０：２４９８−５０５）を包含する。内皮細胞増殖を特異的に阻害する唯一の既知の新脈管形成阻害剤はアンジオスタチンである（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）、上記）。アンジオスタチンは内皮細胞増殖のおよそ３８キロダルトン（ｋＤａ）の特異的阻害剤である。アンジオスタチンは、プラスミノーゲンの５個のクリングルの最低３個を含有するプラスミノーゲンの内部フラグメントである。アンジオスタチンは、ある種の腫瘍モデルで腫瘍重量を減少させかつ転移を阻害することが示されている。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら（１９９４）、上記）。新脈管形成活性に対する影響を測定するのに使用されるアッセイは、角膜嚢アッセイ（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．１９９９、４０：２４９８−５０５）、漿尿膜新脈管形成アッセイ（ＣＡＭ）（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８３、１１１（３）：２８２−７）、ならびに内皮細胞の増殖および移動アッセイ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２０００、２７１：４９９−５０８）を包含する。
【００１１】
（発明の要約）
われわれは、今や、Ｒｙｋタンパク質が新脈管形成の調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）において新規の生物学的活性を所有することを発見した。この活性は、新脈管形成の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）において活性を有する分子を検出するためのインビトロおよびインビボアッセイを介して立証された。該活性は変異種Ｒｙｋタンパク質を使用して測定した。本明細書で使用されるところの「変異種Ｒｙｋタンパク質」は、下にさらに記述されるとおり、該タンパク質の膜貫通部分を欠くＲｙｋタンパク質（例えばＲｙｋタンパク質の細胞外ドメイン）もしくはそれ由来のフラグメントを包含することを意図しており、ここで、変異種Ｒｙｋタンパク質は新脈管形成の調節において活性を表す。
【００１２】
本発明は、新脈管形成を調節（ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ）もしくは調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）するための変異種Ｒｙｋタンパク質の使用を包含する。本発明はさらに、限定されるものでないが癌、創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性および心血管系疾患を挙げることができる疾患もしくは臨床的病状の原因もしくは治療に新脈管形成が関係している疾患もしくは臨床的病状の治療のための変異種Ｒｙｋタンパク質の使用を包含する。該タンパク質のさらなる用途は、胎盤の血管新生の調節を包含する生殖系における新脈管形成を伴う臨床的病状の治療、もしくは人工流産促進剤としての使用を包含する。本発明はまた、変異種Ｒｙｋタンパク質を含有する製薬学的組成物、および前述の疾患もしくは臨床的病状の治療のための該製薬学的組成物の使用も包含する。
【００１３】
本発明の一局面により、図１（配列番号１）に示されるアミノ酸配列を含んで成る新規成熟ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用なフラグメント、類似物および誘導体が提供される。本発明の第二の局面により、図２（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を含んで成る新規成熟ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用なフラグメント、類似物および誘導体が提供される。本発明の第三の局面により、図３（配列番号３）に示されるアミノ酸配列を含んで成る新規成熟ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用なフラグメント、類似物および誘導体が提供される。本発明の付加的な一局面として、本発明のポリペプチドに対する抗体、とりわけ、図１−３（配列番号１−３）に示される配列、または図１−３（配列番号１−３）に示される配列に対し最低２０、好ましくは最低３０、より好ましくは最低４０、なおより好ましくは最低５０、もしくは最も好ましくは最低１００残基にわたって最低６０％、好ましくは最低７０％、より好ましくは最低８０％、なおより好ましくは９０％、もしくは最も好ましくは最低９５％の配列の同一性を共有する配列から構成されるエピトープに特異的に結合する抗体が提供される。
【００１４】
本発明の別の局面により、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらのアンチセンス類似物、およびそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用なフラグメントを包含する本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。
【００１５】
本発明のなお別の局面により、組換えベクターの使用による組換え技術によるこうしたポリペプチドの製造方法が提供される。本発明のさらなる一局面として、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る組換え原核生物および／もしくは真核生物宿主細胞が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる一局面により、新脈管形成の調節を必要とする治療目的（例えば癌、創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、および胎盤の血管新生の調節を包含する生殖系における新脈管形成を伴う臨床的病状の治療）、もしくは人工流産促進剤としての使用のための、こうしたポリペプチドもしくはこうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの利用方法が提供される。
【００１７】
本発明の別の局面により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含んで成る核酸プローブが提供される。
【００１８】
本発明のなお別の局面により、本発明の核酸配列中の突然変異に関係する疾患もしくは疾患に対する感受性を検出するための、および、こうした配列によりコードされるポリペプチドの過剰発現もしくは過小発現を検出するための診断アッセイが提供される。
【００１９】
本発明の別の局面により、遺伝子治療の目的上のこうしたポリペプチドもしくはこうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を必要とする方法が提供される。本明細書で使用されるところの遺伝子治療は、ある個体内の疾患状態の治療のためのその個体中での外因性起源の核酸配列の発現の提供方法と定義する。
【００２０】
（詳細な記述）
本発明の変異種Ｒｙｋタンパク質は、膜貫通部分を欠き、それにより該タンパク質を可溶性にする完全長の野性型Ｒｙｋタンパク質を含んで成る。好ましくは、本発明の変異種Ｒｙｋタンパク質は、完全長の野性型Ｒｙｋタンパク質の細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）、もしくは新脈管形成を調節する能力を維持するＥＣＤのフラグメントを含んで成る。Ｒｙｋタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列のわずかな変異は、少なくとも２つの異なるグループにより文献に記述されており（例えば、Ｔａｍａｇｎｏｎｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９３；８：２００９（細胞外ドメインは１９１アミノ酸よりなるアミノ酸配列（配列番号１）を有するとして記述される）およびＨａｌｆｏｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：７３７９（細胞外ドメインは、Ｔａｍａｇｎｏｎｅにより記述されたと同一のアミノ酸配列を有するとして記述されるが；しかしながらＣ末端の１０アミノ酸が欠けていて細胞外ドメインを１８１アミノ酸にしている（配列番号２））を参照されたい；これらの参考文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）。しかしながら、本発明の目的上、新脈管形成を調節する能力を維持するＲｙｋタンパク質の細胞外ドメインのいかなるかつ全部の変異体も包含される。なおより好ましい、本発明の変異種Ｒｙｋタンパク質は、完全長の野性型Ｒｙｋタンパク質の細胞外ドメインのＷｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）ドメイン（配列番号３）、もしくは新脈管形成を調節する能力を維持するそのフラグメントを含んで成る。
【００２１】
前述に照らして、本発明のポリペプチドは配列番号１−３により示される推定アミノ酸配列を有するそれらのポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは、配列番号１−３により示される推定アミノ酸配列を有するペプチドのＮもしくはＣ末端に付属された付加的なアミノ酸配列を包含してよい。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、もしくは合成ポリペプチド、好ましくは組換えポリペプチドであってよい。本明細書で使用されるところの「タンパク質」は「ポリペプチド」と同義である。
【００２２】
本発明はさらに、配列番号１−３と、最低２０、好ましくは最低３０、より好ましくは最低４０、なおより好ましくは最低５０、さらになおより好ましくは最低１００、もしくは最も好ましくは最低１５０残基にわたって、最低６０％、好ましくは最低７０％、より好ましくは最低８０％、なおより好ましくは９０％、さらになおより好ましくは９５％、もしくは最も好ましくは最低９８％の配列の同一性を共有するポリペプチドに関する。（こうしたポリペプチドは「本発明のポリペプチド」と本明細書で称されるかもしれない）。本明細書で使用されるところの「変異種Ｒｙｋタンパク質」は、この段落で称されるところの本発明のポリペプチドもまた包含することを意図している。本発明の好ましい一態様において、本発明のポリペプチドは、最低２０、好ましくは最低３０、より好ましくは最低４０、なおより好ましくは最低５０、もしくは最も好ましくは最低１００残基長である。好ましい一態様において、本発明のペプチドは、６００未満、好ましくは５５０未満、より好ましくは５００未満、なおより好ましくは４８０残基長未満である。別の好ましい態様において、本発明のペプチドは、２５０未満、好ましくは１８５未満、より好ましくは１５０未満、なおより好ましくは１００残基長未満、もしくは最も好ましくは６０残基長未満である。本発明はまた、配列番号１−３の最低２０、好ましくは最低３０、より好ましくは最低４０、なおより好ましくは最低５０、もしくは最も好ましくは最低１００残基にわたって最低６０％、好ましくは最低７０％、より好ましくは最低８０％、なおより好ましくは９０％、もしくは最も好ましくは最低９５％の配列の同一性を共有するポリペプチドも企図する。上述されたところの配列に対するこうした同一性パーセントを表す本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知であるとおり、本明細書に記述されるところのマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスアッセイを使用することにより、もしくは、新脈管形成の調節における活性を測定することに向けられた他のアッセイを使用することにより、本明細書に記述されるところの生物学的活性についてアッセイしてよい。生物学的活性の測定方法は、本明細書の開示を与えられた当業者の範囲内である。新脈管形成の調節は、血管形成過程のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションのいずれかをもたらす過程を包含する。
【００２３】
上述されたところのポリペプチドは、（ｉ）アミノ酸残基の１個もしくはそれ以上が、保存されたもしくは保存されないアミノ酸残基（好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され（配列番号１−３に比較して）、そしてこうした置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされるものであってももしくはなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）アミノ酸残基の１個もしくはそれ以上が置換基を包含するもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが該ポリペプチドの半減期を増大させるために化合物（例えばポリエチレングリコール）のような別の化合物と融合されるもの、あるいは（ｉｖ）Ｒｙｋの細胞外ドメインの範囲を越える、リーダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列もしくは成熟タンパク質配列の精製に使用される配列のような付加的なアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されるもの、あるいは（ｖ）１個もしくはそれ以上のアミノ酸がポリペプチドの配列から欠失されるかもしくはその中に挿入されるものであってよい。ペプチド配列中の上述された型の変異の組合せは本発明の範囲内にある。こうしたポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは２０種の遺伝子でコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有してよい。該ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然の過程もしくは当該技術分野で公知である化学的改変技術のいずれかにより改変してよい。こうした改変は基礎的な教科書中に、また、より詳述された単行本ならびに多数の研究論文中に十分に記述されている。改変は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を包含するポリペプチド中のどの場所にも存在することができる。同一の型の改変が所定のポリペプチド中のいくつかの部位で同一もしくは変動する程度で存在してよいことが認識されるであろう。また、所定のポリペプチドは多くの型の改変を含有してよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝してよく、また、それらは分枝を伴うもしくは伴わない環状であってよい。環状、分枝状および分枝環状のポリペプチドは翻訳後の天然の過程から生じてよいか、もしくは合成法により作成してよい。改変は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の供給結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡに媒介される付加、およびユビキチン化を包含する。
【００２５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、また、好ましくは均一まで精製される。「単離された」という用語は、物質がその元の環境（例えばそれが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出されることを意味する。例えば、生存する動物中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは単離されていないが、しかし、天然の系中の共存する物質のいくつかもしくは全部から分離された同一のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは単離されている。こうしたポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、かつ／またはこうしたポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であることができ、そして、こうしたベクターもしくは組成物はその天然の環境の一部でないためになお単離されることができる。
【００２６】
当該技術分野で既知であるとおり、２種のポリペプチド間の「類似性」は、アミノ酸配列および１種のポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換物を第二のポリペプチドの配列と比較することにより決定する。こうした保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（１９７８）およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯ Ｊ．８：７７９−７８５（１９８９）により記述されたものを包含する。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化を表す：
−ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
−ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；
−ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；
−ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；
−ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；および
−ａｓｐ、ｇｌｕ。
（これらのグループ分けは例であることに注意されたい；他のグループ分けがより適切な選択を表すかもしれない。）
「類似性」もしくは「同一性」は、通常はパーセンテージによって表される２種もしくはそれ以上のペプチドまたは２種もしくはそれ以上の核酸分子の間の配列の保存もしくは「相同性」を指す。比較される配列中のある位置が同一の塩基もしくはアミノ酸（「残基」）により占有される場合には、該分子はその位置で同一である。２種の比較されるペプチド配列中のある位置が類似の物理的特性をもつアミノ酸により占有される場合（所定のスコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）により決定されるところの保存的置換；類似性は従って、選ばれたスコアリングマトリックスに依存する）には、該分子はその位置で類似である。同一性もしくは類似性のパーセントは、相互と並んで比較される配列を整列すること、それらを前後に滑らせること、および必要な場合は配列中にギャップを保存的に導入することにより最大にすることができる。同一性パーセントは、同一の整列する残基の数を計数すること、整列された領域の全長により割ること、双方の配列中にギャップを包含すること、および１００を掛けることにより計算する。従って、同一性は、例えば「２００アミノ酸にわたる６０％の同一性」もしくは「２５０アミノ酸にわたる５７％の同一性」として表現することができる。あるいは、こうした配列は、それぞれ、「２００アミノ酸にわたって６０％同一」もしくは「２５０アミノ酸にわたって５７％同一」であるとして記述することができる。類似性は、上の計算において同一性および類似性双方を計数することにより計算する。例えば、下の整列は５６アミノ酸にわたって３７．５％の配列の同一性を有し（（２１の同一性／５６残基）×１００％）、ここで、５６は整列された領域の全長である。本明細書で使用されるところの「同一性パーセント」および「配列の同一性パーセント」は互換性である。
【００２７】
【表１】

【００２８】
さらなる一例として、下の同一の整列は５６アミノ酸にわたって５５．４％の配列の類似性を有し（（３１の類似性／５６残基）×１００％）、ここで、５６は整列された領域の全長である。この例において、保存的置換は＋印により示され、また、全類似性は同一性および保存的置換の総計により与えられる。（上に示されたとおり、保存的置換の決定は選ばれたスコアリングマトリックスに依存する。下の同一の整列は、異なるスコアリングマトリックスを使用すれば類似性パーセントについて異なる値を生じるかもしれない。）
【００２９】
【表２】

【００３０】
整列された領域中の配列の双方は、より長い、おそらくより少なく相同な配列内に含有されるかもしれない。「無関係の」もしくは「非相同」配列は、典型的に、ペプチドレベルで４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性を共有する。
【００３１】
本発明はさらに、本発明の上述されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。これらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態もしくはＤＮＡの形態にあってよく、このＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは二本鎖もしくは一本鎖であってよい。ポリヌクレオチドは：成熟ポリペプチドのコーディング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列およびリーダーもしくは分泌配列のような付加的なコーディング配列、またはプロタンパク質配列；成熟ポリペプチドのコーディング配列（および場合によっては付加的なコーディング配列）ならびにイントロンまたは成熟ポリペプチドのコーディング配列の５’および／もしくは３’の非コーディング配列のような非コーディング配列を包含してよい。従って、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコーディング配列のみを包含するポリヌクレオチド、ならびに付加的なコーディングおよび／もしくは非コーディング配列を包含するポリヌクレオチドを包含する。
【００３２】
本発明はさらに、本明細書に上述されたポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体もしくは該ポリヌクレオチドの天然に存在しない変異体であってよい。当該技術分野で既知のとおり、対立遺伝子変異体は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変えない１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失もしくは付加を有してよい代替の一形態のポリヌクレオチド配列である。従って、本発明は、下の実施例１に記述されると同一の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにこうしたポリヌクレオチドの変異体を包含し、それらの変異体は欠失変異体、置換変異体および付加もしくは挿入変異体を包含する。
【００３３】
本発明はまた、成熟ポリペプチドのコーディング配列がポリペプチドの発現および宿主細胞からの分泌を補助するポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合されてよいポリヌクレオチドも包含する。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そしてリーダー配列を宿主細胞により切断させて成熟形態のポリペプチドを形成させてよい。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質および付加的なアミノ酸残基であるプロタンパク質をコードしてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、かつ、不活性の形態のタンパク質である。プロ配列が切断されると活性の成熟タンパク質が残る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟タンパク質、もしくはプロ配列を有するタンパク質、もしくはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）双方を有するタンパク質をコードしてよい。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの機能を見込むマーカー配列に同じ読み枠で融合されたコーディング配列も有してよい。マーカー配列は、例えば、細菌宿主の場合に該マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供するための、ｐＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジン標識であってよいか、もしくは、例えば、マーカー配列は、哺乳動物宿主、例えばＣＯＳ−７細胞が使用される場合にヘマグルチニン（ＨＡ）標識であってよい。ＨＡ標識はインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応する。Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ ３７：７６７。ＦＬＡＧ標識を包含する他の標識系は当該技術分野で公知である。ＦＬＡＧ標識はＦＬＡＧマーカーオクタペプチド（Ｎ−ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ−Ｃ）（配列番号１３）に基づく。ＦＬＡＧ配列は親水性であり、また、最後の５アミノ酸（ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓ）（配列番号１３の下位配列）はプロテアーゼ、エンテロキナーゼの標的配列を表す。
【００３５】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それはコーディング領域に先行するおよび後に続く（リーダーおよびトレーラー）領域、ならびに個々のコーディングセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を包含する。遺伝子のフラグメントは完全長の該遺伝子を単離するため、および該遺伝子に対する高い配列の類似性もしくは類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。この型のプローブは、典型的には最低２０塩基を有し、また、好ましくは最低３０塩基を有し、そして例えば５０もしくはそれ以上の残基を含有してよい。プローブはまた、完全長の転写物に対応するｃＤＮＡクローン、ならびに調節およびプロモーター領域、エキソンならびにイントロンを包含する完全な遺伝子を含有するゲノムクローン（１種もしくは複数）を同定するのにも使用してよい。スクリーニングの一例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を使用することにより遺伝子のコーディング領域を単離することを含んで成る。遺伝子のものに相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを使用して、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、該プローブがライブラリーのどのメンバーにハイブリダイズするかを決定する。
【００３６】
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し最低７０％の同一性、好ましくは最低８０％の同一性、より好ましくは最低９０％の同一性、なおより好ましくは最低９５％の同一性、および最も好ましくは最低９８％の同一性を有するポリヌクレオチド、ならびにそのフラグメント［それらのフラグメントは最低２０塩基を有し、そして好ましくは最低３０塩基を有し、また、より好ましくは最低５０塩基を有し］、ならびにこうしたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに向けられる。好ましい一態様は、配列番号１−３により示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し最低７０％の同一性、好ましくは最低８０％の同一性、より好ましくは最低９０％の同一性、なおより好ましくは最低９５％の同一性、および最も好ましくは最低９８％の同一性を有するポリヌクレオチドにより与えられる。こうしたポリヌクレオチドは、配列番号１７−２０により示される本発明の態様におけるとおり、より大きなヌクレオチド配列内に含有されてよい。好ましい態様において、本発明は、１５００未満、好ましくは１０００未満、より好ましくは６００未満、なおより好ましくは２００未満、さらになおより好ましくは１００未満、最も好ましくは３５塩基長未満であるポリヌクレオチドに向けられる。
【００３７】
本発明はまた、上述されたところの本発明のポリヌクレオチドを包含するベクター、本発明のベクターで遺伝子的に工作されている宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの製造にも関する。宿主細胞は、本発明のベクター（例えばクローニングベクターもしくは発現ベクターであってよい）で遺伝子的に工作（形質導入もしくは形質転換もしくはトランスフェクト）されてよい。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態にあってよい。工作された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、もしくは本発明のポリペプチドの遺伝子の増幅に適切なように改変された慣習的栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現に選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、そして当業者に明らかであろう。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生させるために使用してよい。
【００３８】
従って、例えば、ポリヌクレオチド配列は、多様な発現ベヒクル、とりわけポリペプチドを発現させるためのベクターもしくはプラスミドのいずれか１つ中に包含されてよい。こうしたベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド：ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せ由来のベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルスおよび仮性狂犬病のようなウイルスＤＮＡを包含する。しかしながら、いずれかの他のベクターもしくはプラスミドを、それらが宿主中で複製可能かつ生存可能である限りは使用してよい。
【００３９】
適切なＤＮＡ配列を、多様な手順によりベクターに挿入してよい。こうした手順および他者は当業者の範囲内にあると思われる。発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指図するための適切な発現制御配列（１種もしくは複数）（プロモーター）に動作可能なように連結される。こうしたプロモーターの代表的な例として：ＬＴＲもしくはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）のｌａｃもしくはｔｒｐ、ファージλＰＬプロモーター、および原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウイルス中で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げてよい。発現ベクターはまた、翻訳開始および転写終止のためのリボソーム結合部位も含有してよい。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列も包含してよい。加えて、発現ベクターは、好ましくは、真核生物細胞培養物についてジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマイシン耐性のような、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性のような、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型の特質を提供するための遺伝子を含有する。本明細書で上述されたところの適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーターもしくは制御配列を含有するベクターを、適切な宿主にタンパク質を発現させるために該宿主を形質転換するのに使用してよい。適切な宿主の代表的な例として：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳもしくはボーズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫のような動物細胞；植物細胞などを挙げてよい。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると思われる。
【００４０】
本発明はまた、広範に上述されたところの配列の１種もしくはそれ以上を含んで成る組換え構築物も包含する。該構築物は、その中に本発明の配列が順もしくは逆向きで挿入されているプラスミドもしくはウイルスベクターのようなベクターを含んで成る。本態様の好ましい一局面において、構築物は、例えば、該配列に操作可能に連結されたプロモーターを包含する調節配列をさらに含んで成る。多数の適するベクターおよびプロモーターが当業者に既知でありかつ商業的に入手可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、ｐＢＳ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＴＲＣ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ＰＲＩＴ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ＰＳＶＬ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））。しかしながら、いずれかの他のプラスミドもしくはベクターを、それらが宿主中で生存可能であるかもしくは生存可能にすることができる限りは、使用してよい。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）ベクターもしくは選択可能なマーカーをもつ他のベクターを使用して、いずれかの所望の遺伝子から選択することができる。２種の適切なベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。とりわけ挙げられる細菌プロモーターは、ｌａｃｉ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐを包含する。真核生物プロモーターは、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、前期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は当業者のレベル内に十分にある。
【００４１】
本発明はまた、上述された構築物を含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、もしくは酵母細胞のような低級真核生物細胞であることができるか、または、宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞であることができる。宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介されるトランスフェクションもしくは電気穿孔法により遂げることができる。宿主細胞中の構築物は、該組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために慣習的様式で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは慣習的ペプチド合成機により合成で製造することができる。
【００４２】
成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌もしくは他の細胞中で適切なプロモーターの制御下に発現させることができる。細胞を含まない翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用して、こうしたタンパク質を産生させるのに使用することができる。原核生物および真核生物宿主での使用のための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９；その開示はこれにより引用することにより組み込まれる）により記述される。
【００４３】
高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーは、その転写を増大させるようにプロモーターに作用する、通常は約１０から３００ｂｐまでのＤＮＡのｃｉｓに作用する要素である。例は、複製起点の後期側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを包含する。一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、ならびに宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子およびビール酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指図するための高度に発現される遺伝子由来のプロモーターを包含することができる。こうしたプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）のような解糖酵素、α因子、酸ホスファターゼもしくはとりわけ熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来することができる。異種構造配列は、適切な相に、翻訳、開始および終止配列、ならびに好ましくはペリプラズム空隙もしくは細胞外媒体中への翻訳されたタンパク質の分泌を指図することが可能なリーダー配列と集成される。場合によっては、異種配列は、発現された組換え産物の所望の特徴、例えば安定化もしくは単純化された精製を与えるＮ末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードすることができる。
【００４４】
細菌の使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適する翻訳、開始および終止シグナルと一緒に、機能的プロモーターと操作可能な読取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）に挿入することにより構築する。ベクターは、ベクターの維持を確実にしかつ所望の場合は宿主内での増幅を提供するための１個もしくはそれ以上の表現型の選択可能なマーカーおよび複製起点を含むことができる。形質転換のための適する原核生物宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な種を包含するが、とは言え他者もまた選択の問題として使用してよい。細菌の使用のための有用な発現ベクターは、選択可能なマーカー、および公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子要素を含んで成る商業的に入手可能なプラスミド由来の細菌の複製起点を含むことができる。こうした商業的ベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア ファイン ケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、スウェーデン・ウプサラ）およびＧＥＭ１（プロメガ バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）、ウィスコンシン州マディソン）を包含する。これらのｐＢＲ３２２の「バックボーン」区分を、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わせる。
【００４５】
適する宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の成長の後に、選択されたプロモーターを、必要な場合は適切な手段（例えば温度変化もしくは化学的誘導）により抑制解除してよく、そして、細胞を付加的な期間の間培養してよい。細胞は、典型的に遠心分離により収穫し、物理的もしくは化学的手段により破壊し、そして生じる粗抽出物をさらなる精製のため保持する。タンパク質の発現で使用される微生物細胞は、凍結融解循環、超音波処理、機械的破壊もしくは細胞溶解剤の使用を包含するいずれかの慣習的方法により破壊することができる。
【００４６】
多様な哺乳動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現させるのに使用することができる。哺乳動物発現系の例は、サル腎線維芽細胞（８２）のＣＯＳ−７細胞系、ならびに、適合性のベクターからタンパク質を発現させることが可能な他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を包含する。哺乳動物発現ベクターは、一般に、複製起点、適するプロモーターおよびエンハンサー、ならびにまたいずれかの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル酸化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、ならびに５’の隣接する転写されない配列を含むことができる。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル酸化部位を、必要とされる転写されない遺伝子要素を提供するのに使用してよい。
【００４７】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを包含する今までに使用された方法により、組換え細胞培養物から回収かつ精製してよい。タンパク質のリフォールディング段階を、成熟タンパク質の構造の完成において、必要とされるとおり使用してよい。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製段階に使用することができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物、あるいは化学的合成手順のまたは原核生物もしくは真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞による）から組換え技術により産生された産物であってよい。組換え産生手順に使用された宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、哺乳動物もしくは他の真核生物の炭水化物でグリコシル化されてよいか、またはグリコシル化されなくてよい。本発明のポリペプチドはまた、先頭のメチオニンアミノ酸残基を包含してもよい。
【００４９】
本発明のポリペプチド、もしくは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、遺伝子治療の過程で使用してよい。こうした遺伝子治療は、限定されるものでないが癌、創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、および胎盤の血管新生の調節を包含する生殖系における新脈管形成を伴う臨床的病状を挙げることができる疾患もしくは臨床的病状の治療、または人工流産促進剤としての使用に関与してよい。例えば、細胞を、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を用いてエクスビボで工作してよく、工作された細胞をその後、該ポリペプチドで治療されるべき患者に提供する。こうした方法は当該技術分野で公知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子の使用による当該技術分野で既知の手段により工作してよい。
【００５０】
インビトロおよびインビボ双方の遺伝子治療の方法論が企図される。規定された細胞集団への潜在的に治療的な遺伝子のいくつかの移入方法が既知である。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−３１を参照されたい。これらの方法は：
１）直接遺伝子移入。例えば、Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５−６８を参照されたい。
２）リポソームに媒介されるＤＮＡ移入。例えば、Ｃａｐｌｅｎら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：３９−４６；Ｃｒｙｓｔａｌ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：１５−１７；ＧａｏとＨｕａｎｇ（１９９１）Ｂｉｏｃｅｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：２８０−８５を参照されたい。
３）レトロウイルスに媒介されるＲＮＡ移入。例えば、Ｋａｙら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２：１１７−１９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−１３を参照されたい。上に挙げられるレトロウイルスプラスミドベクターがそれに由来してよいレトロウイルスは、限定されるものでないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスのようなレトロウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺癌ウイルスを挙げることができる。一態様において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウイルス由来である。
４）ＤＮＡウイルスに媒介されるＤＮＡ移入。こうしたＤＮＡウイルスは、アデノウイルス（好ましくはＡｄ−２もしくはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは単純疱疹ウイルスに基づくベクター）、およびパルボウイルス（好ましくは「欠損」もしくは非自律性パルボウイルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡＡＶ−２に基づくベクター）を包含する。例えば、Ａｌｉら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：３６７−８４；米国特許第４，７９７，３６８号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）、および米国特許第５，１３９，９４１号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。アデノウイルスは、それらが広範な宿主範囲を有し、ニューロンもしくは肝細胞のような静止状態のもしくは終末的に分化した細胞を感染させることができ、そして本質的に非腫瘍形成性のようであるという利点を有する。アデノウイルスは宿主ゲノム中に組込むようでない。それらは染色体外に存在するため、挿入突然変異誘発の危険は大きく低下される。アデノ随伴ウイルスはアデノウイルスに基づくベクターに類似の利点を表す。しかしながら、ＡＡＶはヒト第１９染色体への部位特異的組込みを表す。
を包含する。
【００５１】
目的の遺伝子を移入するための特定のベクター系の選択は多様な因子に依存することができる。重要な一因子は標的細胞集団の性質である。レトロウイルスベクターは広範囲に研究されかつ多数の遺伝子治療の応用で使用されているとは言え、これらのベクターは一般に、非分割細胞を感染させるのに適しない。加えて、レトロウイルスは腫瘍形成性の潜在性を有する。しかしながら、レンチウイルスベクターの分野における最近の発展は、これらの制限のいくつかを回避するかもしれない。Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−７を参照されたい。
【００５２】
本態様により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療が、それの必要な、診断を伴うもしくは診断直後の患者に提供される。当業者は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの含有するいずれかの適する遺伝子治療ベクターを本態様に従って使用してよいことを認識するであろう。こうしたベクターを構築するための技術は既知である。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３９２ ２５−３０；Ｖｅｒｍａ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ、３８９ ２３９−４２を参照されたい。標的部位へのベクターの導入は既知の技術を使用して達成してよい。
【００５３】
本発明はまた、例えば多様な組織中の本発明のポリペプチドのレベルを検出するための診断アッセイにも関する。正常の対照組織サンプルに比較された該タンパク質の過剰発現は異常な細胞増殖、例えば腫瘍の存在を検出するかもしれないからである。宿主由来のサンプル中のタンパク質のレベルを検出するのに使用されるアッセイは当業者に公知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」型アッセイを包含する。診断アッセイはまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出も包含してよい。
【００５４】
本発明のポリペプチドは、それに対する抗体を産生させるための免疫原として使用することができる。これらの抗体は、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体であることができる。本発明はまた、キメラ、一本鎖および人化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、もしくはＦａｂ発現ライブラリーの産物も包含する。当該技術分野で既知の多様な手順を、こうした抗体およびフラグメントの産生に使用してよい。
【００５５】
本発明のポリペプチドに対し生成される抗体は本発明に包含される。本明細書で使用されるところの「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）、ならびに、変異種Ｒｙｋタンパク質のエピトープへの特異的結合が可能であるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖおよびＦｖのようなそれらのフラグメントを包含する。好ましくは、変異種Ｒｙｋに特異的に結合する抗体は免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出しない。加えて、本発明の好ましい抗体はヒト抗体である。
【００５６】
より具体的には、本発明のヒト抗体は、約０．１ｎＭないし約１０μＭ、約２ｎＭないし約１μＭ、約２ｎＭないし約２００ｎＭ、約２ｎＭないし約１５０ｎＭ、もしくは約５０ｎＭないし約１００ｎＭのＫ_ｄを伴いヒト変異種Ｒｙｋタンパク質に特異的に結合する。より好ましいヒト抗体は、約２ｎＭ、約７ｎＭ、約１０ｎＭおよび約１１ｎＭよりなる群から選択されるＫ_ｄを伴いヒト変異種Ｒｙｋに特異的に結合する。好ましいＫ_ｄは約１ｎＭ、約３ｎＭ、約９ｎＭ、約１３ｎＭ、約１４ｎＭから約１５ｎＭまでの範囲にわたる。変異種Ｒｙｋへのヒト抗体結合のＫ_ｄは、実時間生体分子相互作用分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）（ＳｊｏｌａｎｄｅｒとＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３、２３３８−２３４５、１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５、６９９−７０５、１９９５）のような技術を包含する当該技術分野で既知のいずれかの方法を使用してアッセイすることができる。ＢＩＡは、反応体のいずれかを標識することなく生物特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばビアコア［ＢＩＡｃｏｒｅ］（商標））。光学的現象、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生物学的分子間の実時間反応の表示として使用することができる。
【００５７】
本発明のポリペプチドに対し生成される抗体は多様な様式で得ることができる。例えば、動物への該ポリペプチドの直接注入による、もしくは動物、好ましくは非ヒトへの該ポリペプチドの投与による抗体。そのように得られた抗体は、その場合、該ポリペプチドそれ自身を結合することができる。この様式で、該ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列さえ、天然のポリペプチド全体を結合する抗体を生成させるのに使用することができる。こうした抗体は、その後、そのポリペプチドを発現する組織から該ポリペプチドを単離するために、もしくは診断試薬として使用することができる。
【００５８】
モノクローナル抗体の製造のためには、継代性細胞系培養物により産生される抗体を提供するいかなる技術も使用することができる。一般に、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ編（１９８８）コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を参照されたい。例は、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン Ｒ．リス インク（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）中、Ｃｏｌｅら（１９８５）、ｐｐ．７７−９６）を包含する。
【００５９】
一本鎖抗体の産生について記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を産生させるために適合させることができる。また、トランスジェニックマウスを使用して、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する人化抗体を発現させてよい。人化抗体はまた、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６１号；および同第５，６９３，７６２号明細書（引用することにより本明細書に組込まれる）に記述される方法により産生させてもよい。
【００６０】
上述される変異種Ｒｙｋ結合の特徴をもつヒト抗体は、以下のとおりＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬライブラリーから同定することができる。ヒト変異種Ｒｙｋタンパク質をマイクロタイタープレート上に被覆し、そしてＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ−Ｆａｂファージライブラリーとともにインキュベートする（下の実施例９を参照されたい）。変異種Ｒｙｋに結合しないそれらのファージに連結されたＦａｂはプレートから洗い流されることができ、変異種Ｒｙｋにしっかりと結合するファージのみ残す。結合されたファージはｐＨの変化により溶出することができ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主の感染により増幅することができる。この拡張過程を１もしくは２回反復して、変異種Ｒｙｋにしっかりと結合する抗体の集団について濃縮することができる。その後、濃縮されたプールからのＦａｂを発現させ、精製し、そしてＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングする。その後、同定されたヒットを、Ｂｉｃｋｅｔｔら、１９９３およびＢｏｄｄｅｎら、１９９４に記述された酵素アッセイでスクリーニングする。
【００６１】
スクリーニング方法の詳細は下の特定の実施例に記述する。高度に活性の特異的抗体もしくは抗体フラグメントの他の選択方法は、当業者により予見されることができ、そしてヒトＴＩＭＰ−１抗体を同定するのに使用することができる。
【００６２】
上述された特徴をもつヒト抗体はまた、当業者に既知のかつタンパク質の精製に関して上述される方法を使用して、該抗体を発現するいかなる細胞からも精製することもできる。さらに、ヒト抗体は、再度、当業者に公知かつタンパク質の精製に関して上述された技術を使用する、そのアミノ酸配列の化学的合成方法を使用して製造することができる。
特定の態様
実施例１
Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の発現：Ｈａｌｆｏｒｄにより記述されたところのＲｙｋの細胞外ドメインに対応するｃＤＮＡ（配列番号２）を、その３’端でＦｃ標識をコードするｃＤＮＡ（配列番号４）に、また、その５’端でシグナルペプチド配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号５）に融合した。生じる融合遺伝子（配列番号１６に示されるポリヌクレオチド配列）を、遺伝子発現を駆動するためのｈＣＭＶプロモーターおよび選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターにクローン化し、そしてタンパク質をｈＥＫ２９３Ｅ細胞（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバード）中で発現させた。配列番号８により示される配列（分泌の間の細胞によるプロセシングの間に除去されるシグナルペプチド配列を欠く）を有するＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質を、プロテイン−Ａ−セファロースアフィニティー樹脂を使用する一段階精製により馴化培地から精製した。アフィニティー樹脂からのＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の溶出は０．２Ｍグリシン、ｐＨ２．８で実施した。溶出液を飽和重炭酸ナトリウムでｐＨ７．５〜８．０に直ちに中和し、そして透析膜（６，０００ダルトンのカットオフ）を用いて５℃で一夜リン酸緩衝生理的食塩水中に透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｆｃ抗体を用いるウェスタンブロット分析による精製されたＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の分析的分析は、２成分（単量体の期待される分子量（約６０ｋＤａ）の一方および二量体について予測される質量（約１２０ｋＤａ）の他方）の存在を示した。
Ｒｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質の発現：配列番号９により記述されるこの変異種Ｒｙｋタンパク質は、アデノウイルス発現系で調製した。Ｔａｍａｇｎｏｎｅにより記述されたところのＲｙｋ細胞外ドメインに対応するｃＤＮＡ（配列番号１）を、シグナル配列ペプチド（配列番号５）およびｍｙｃ−（６Ｘ）Ｈｉｓ配列（配列番号２１）に対応するｃＤＮＡに融合した。配列番号１７により記述される、生じるｃＤＮＡを、ＣＭＶシャトルのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。（Ｈｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９５：２５０９−１４。）このプラスミドはＰＹＫ−ｍｙｃ−ｈｉｓ６ ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶとして既知である。２９３Ａ細胞（クォンタム バイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中６穴プレート上で成長させた。細胞がコンフルエンスに達すれば、それらをＯＰＴＩ−ＭＥＭ １減血清培地（ｒｅｄｕｃｅｄ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉｕｍ）（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）で２回すすぎ、そしてリポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）トランスフェクション溶液とともにインキュベートした。トランスフェクション溶液は供給元の情報（ギブコ ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、メリーランド州ゲイタースバーグ）に従って調製した。簡潔には、３μｇのＲＹＫ−ｍｙｃ−ｈｉｓ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ ＤＮＡを０．２５ｍｌのＯＰＴＩＭＥＭ １減血清培地で希釈し、そして、０．２５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ １減血清培地で希釈された３０μｌのリポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ）トランスフェクション溶液と混合した。混合物を細胞に添加しかつ４．５時間インキュベートした。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加しかつ一夜インキュベートした。翌日、培地をＤＭＥＭ １０％ＦＢＳに変更した。別の２４時間後に、培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭ １減血清培地に変更した。トランスフェクトされていなかった２９３Ａ細胞もまた、その後アッセイでの対照としての役目をはたすために、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ １減血清培地中でインキュベートした。上清を４８時間のインキュベーション後に収集した。
実施例２
血管形成の機構の一評価方法は、ＨＵＶＥＣマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスアッセイとして同定されるインビトロアッセイの使用を必要とする。このアッセイは内皮細胞の毛細管の組織化を模倣し、かつ、血管形成の機構を評価するために使用される標準的インビトロアッセイである。
【００６３】
一般に、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、ＡＴＣＣ、バージニア州マナサスから）を、ＨＵＶＥＣ完全培地中、ウェルあたり３×１０^４個の細胞で植え付けた。ＨＵＶＥＣ完全培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌヘパリン、５０μｇ／ｍｌ内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ）および１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＦ１２Ｋ培地を含有した。マウス肺内皮細胞（ＭＬｕＥＣ）は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含有する完全培地中、ウェルあたり５×１０^４個の細胞で植え付けた。マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）基底膜マトリックス（ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）を、マトリックスの取扱いの間は予冷されたピペット、チップ、プレートおよびチューブを使用して調製した。マトリックスを氷上にて４℃で一夜融解し、０．３ｍｌ／ウェルで２４穴プレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）、ＶＷＲ、フィラデルフィア州ウェストチェスター）を被覆するのに使用し、そしてその後３７℃で２時間重合させた。試験サンプルをウェルあたり０．５ｍｌの完全培地中で添加し、そしてＨＵＶＥＣもしくはＭｌｕＥＣいずれかの細胞をウェルあたり０．５ｍｌの培地中で添加し、従ってウェルあたりの培地の総容量は１．０ｍｌであった。実験は、変動するタンパク質濃度（対数増加を伴う２．５ｆＭから２５０ｎＭまで、もしくは変異種Ｒｙｋタンパク質を含有する上清の４から４０００倍までの希釈物）を用いて三重で実施した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で一夜インキュベートし、その後固定しかつジフクイック（ＤＩＦＦ−ＱＵＩＫ）染色セット（ＶＷＲ、フィラデルフィア州ウェストチェスター）を使用して染色した。プレートを固定溶液に５秒間、溶液１に５秒間、および溶液２に５秒間浸積し、その後脱イオン水ですすぎかつ乾燥させた。その後、プレートを倒立顕微鏡下で検査しかつ毛細管様構造の量的分析を実施した。本明細書で使用されるところの「毛細管様構造」という用語は、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス上でのインビトロでの内皮細胞の挙動から生じる組織的構造を指す。「毛細管様構造」という用語はまた、相互と関連しかつ毛細管を形成する細胞をもたらす新脈管形成につながりかつそれに寄与するインビボもしくはインビトロの組織化された細胞も包含することができる。
【００６４】
変異種Ｒｙｋタンパク質の影響を、インビトロＨＵＶＥＣマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）アッセイを使用して評価した。具体的には、Ｒｙｋ−Ｆｃを、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス上の培養物中で成長されるＨＵＶＥＣに多様な濃度で添加した。２４時間後、細胞を固定し、そして毛細管様組織について評価した。各ウェル中の毛細管様組織の測定は、試験された化合物の生物学的影響の量的分析を可能にする。
【００６５】
４回の別個の実験において、Ｒｙｋ−ＦｃはＨＵＶＥＣ（図４Ａ）もしくはＭＬｕＥＣ（図４Ｂ）のいずれかで毛細管様の組織化を有意に阻害することが示されている。代表的実験からの結果を図４に提示する。これらの実験において、Ｒｙｋ−Ｆｃは実施例１に記述されるとおり調製し、そしてその後、対数増加を伴い２．５ｆＭから２５０ｎＭまでの多様な濃度で細胞に添加した。図４Ａおよび４Ｂに表される結果は、Ｒｙｋ−Ｆｃが毛細管様の組織化を用量依存性の様式で阻害したことを示す。これらの実験において、ＩＬ−８−ＴＶＲ（このアッセイで阻害効果を有することが示されているＩＬ−８ムテイン）を２５０ｎＭの濃度で添加した。ＩＬ−８−ＴＶＲは、野性型ＩＬ−８タンパク質のアミノ酸配列の位置３および４に見出される、それぞれ２アミノ酸Ｇｌｕ−Ｌｅｕの代わりに用いられる２アミノ酸Ｔｈｒ−Ｖａｌを有する。陰性対照として、緩衝液（単独）を、Ｒｙｋ−Ｆｃとともに添加された最大容量に同等な容量で細胞に添加し、有意の効果はなかった。加えて、０．１Ｅｕ／ｍＬおよび１Ｅｕ／ｍｌの濃度のエンドトキシンを、エンドトキシンが阻害効果の原因である可能性があるかどうかを決定するために試験した。Ｒｙｋ−Ｆｃ処理されたウェル中のエンドトキシンの濃度は、２．５ｆＭおよび２５０ｎＭのＲｙｋ−Ｆｃ濃度について、それぞれ０．７×１０^−８Ｅｕ／ｍｌから０．７Ｅｕ／ｍｌまで変動した。結果は、エンドトキシン単独では阻害効果の原因であり得ないことを示す（データは示されない）。
実施例３
別の変異種Ｒｙｋタンパク質の影響を、ＨＵＶＥＣマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスアッセイを使用してインビトロで評価した。Ｒｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓを、実施例１に上述されたところのＲｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ遺伝子を含有するプラスミド構築物でトランスフェクトされた２９３細胞中で作成した。実施例２のものに類似の実験条件において、Ｒｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ融合タンパク質を含有する上清を、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス上の培養物中で成長されたＨＵＶＥＣに多様な希釈で添加した。２４時間後、細胞を固定しかつ毛細管様組織について評価した。
【００６６】
Ｒｙｋ−ｍｙｃ−ＨｉｓはＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化を有意に阻害することが示されている。代表的な実験からの結果を図５に提示する。この実験において、Ｒｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ融合物を発現する細胞培養物から得られた上清を、対数増加を伴い１：４０００から１：４までの多様な希釈係数で細胞に添加した。図５に表される結果は、Ｒｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓを含有する上清が、毛細管様の組織化を用量依存性の様式で阻害したことを示す。この実験において、いかなる変異種Ｒｙｋタンパク質も発現しなかった細胞から得られた上清（２９３細胞培地）を、陰性対照として１：４の希釈係数で添加し、そしてＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対する影響を有しないことが示された。
実施例４
ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８を包含する既知の血管形成因子と共同してのＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の影響を、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス上の培養物中で成長されたＨＵＶＥＣ中で、多様な濃度で試験した。２４時間後、細胞を固定しかつ毛細管様組織について評価した。
【００６７】
３回の別個の実験において、Ｒｙｋ−Ｆｃは、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦもしくはＩＬ−８の存在に関係なく毛細管様の組織化を有意に阻害することが示された。代表的な実験からの結果を図６に提示する。この実験において、Ｒｙｋ−Ｆｃは、ｂＦＧＦ（５ｎＭで）、ＶＥＧＦ（１０ｎＭ）もしくはＩＬ−８（１０ｎＭ）のいずれかとともに２．５ｐＭ、２．５ｎＭおよび２５ｎＭで細胞に添加した。図６に表される結果は、Ｒｙｋ−Ｆｃが、用量依存性の様式で単独でまたはｂＦＧＦ、ＶＥＧＦもしくはＩＬ−８と共同して毛細管様の組織化を阻害したことを示す。この実験において、ＩＬ−８−ＴＶＲを陽性対照として２５０ｎＭの濃度で添加した。加えて、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦおよびＩＬ−８を単独で試験し、そしてＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対する影響を有しないことが示された。この結果は、ＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に必要な血管形成性の刺激が、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスもしくは培地のいずれか中に既に存在していることを示唆する。
実施例５
なお他の変異種Ｒｙｋタンパク質の影響を、ＨＵＶＥＣマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスアッセイを使用してインビトロで評価した。Ｒｙｋ−ｈｉｓ、ＷＩＦ、ＷＩＦ−Ｆｃ、Ｎ−ＷＩＦ−Ｆｃ、ＷＩＦ−ｈｉｓおよびＮ−ＷＩＦ−ｈｉｓを、実施例２のものに類似の実験条件で試験した。変異種Ｒｙｋタンパク質を含有する上清を、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス上の培養物中で成長されたＨＵＶＥＣに多様な希釈で添加した。２４時間後、細胞を固定しかつ毛細管様組織について評価した。代表的実験からの結果を図７Ａおよび７Ｂに提示する。この実験において、いかなる変異種Ｒｙｋタンパク質も発現しなかった細胞から得られた上清（２９３細胞培地）、ならびにＩＬ８を対照として試験した。
実施例６
Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の特異性もまた、ＨＵＶＥＣマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックスアッセイを使用してインビトロで評価した。簡潔には、一本鎖抗体をＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質に対し生成させた（ｓｃＦｖ１ｂ４）。この抗体の生成に関する詳細は下の実施例に記述する。しかしながら、この実験において、ＨＵＶＥＣは、２．５ｎＭ Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質および増大する濃度のｓｃＦｖ１ｂ４とともに培養した。２４時間後、細胞を固定しかつ毛細管様の組織化について評価した。代表的実験からの結果を図８に提示する。この実験において、ｓｃＦｖＢＢが陰性対照としての役目をはたした。ｓｃＦｖＢＢは、下の実施例に記述される方法を使用してヒト胎盤ビクニンに対し生成された一本鎖抗体である。
実施例７
Ｒｙｋ−Ｆｃ発現の影響を、Ｂ１６黒色腫腫瘍モデルにてインビボで評価した。一般的に言って、このモデルにおいては、マウスＢ１６．Ｆ１０黒色腫細胞（ＣＲＬ−６４７５、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、バージニア州マナサス）を、ＲＹＫ−Ｆｃ（Ａｄ−ＲＹＫ−Ｆｃ）、インターロイキン−２（Ａｄ−ＩＬ２）もしくはＶＥＧＦ（Ａｄ−ＶＥＧＦ）をコードする遺伝子を含有する非複製性アデノウイルス粒子に感染させた。感染の２４時間後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄しかつ再懸濁した。その後、細胞のアリコート（２００μｌの容量中２×１０^５個の細胞）を、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウス（チャールズ リバー ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州ウィルミントン）の尾静脈に静脈内に注入した。動物を注入後１４日に殺し、そして肺を収集し、固定しかつ重量および転移数について分析した。
【００６８】
具体的には、本実施例において、Ｂ１６−Ｆ１０細胞を、Ｒｙｋ−Ｆｃ遺伝子を含有する非複製性アデノウイルス粒子（ａｄ−Ｒｙｋ−Ｆｃ）に２４時間エクスビボで感染させ、そしてその後、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズ リバー ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州ウィルミントン）に尾静脈を通して静脈内に埋植した。われわれは、Ｂ１６細胞のエクスビボ感染が最低６日間、目的のタンパク質のインビボ発現につながったことを、多様なアデノウイルス構築物を用いて既に示した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞はまた、静脈内に注入される場合に肺にコロニーを形成しかつ転移を形成することも以前に示されている。細胞埋植後１４日にマウスを殺しかつ肺を収集した。このモデルでは、肺転移を計数することにより腫瘍負荷を評価する。この実験において、対照は、処理されないＢ１６−Ｆ１０細胞、またはＩＬ−２遺伝子（ａｄ−ＩＬ−２）もしくはＶＥＧＦ遺伝子（ａｄ−ＶＥＧＦ）を含有する非複製性アデノウイルス粒子にエクスビボで感染されていたＢ１６−Ｆ１０細胞を受領するマウスを包含した。以前の実験で、ＩＬ−２の発現は肺転移に対する阻害効果を有することが示された一方、ＶＥＧＦの発現は刺激効果を有することが示された。図９に提示される結果は、ａｄ−Ｒｙｋ−Ｆｃに感染したＢ１６−Ｆ１０細胞が、感染していないＢ１６−Ｆ１０細胞より少ない転移数を生じたことを示す。この実験において、ＩＬ−２の発現は腫瘍の成長もまた阻害した一方、ＶＥＧＦの発現は腫瘍の成長を刺激した。
実施例８
変異種Ｒｙｋタンパク質の影響をラット角膜モデルにてインビボで試験した。このモデルでは、組換えｂＦＧＦを、ｂＦＧＦの持続性放出を見込むハイドロンペレットに溶解する。ハイドロンペレットは、９５％アルコール中１％ショ糖オクタサルフェートアルミニウム錯体、１２％ハイドロンポリマータイプＮＣＣより構成される。全成分を室温で一夜混合する。その後、ｂＦＧＦを滅菌条件下で懸濁物に添加する。Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質のような可能な抗血管形成活性をもつ試験物質を、ｂＦＧＦを含むハイドロンペレット中に包含させる。
【００６９】
ペレットを生成させるために、５マイクロリットルの懸濁物を滅菌プラスチック表面上に分散させる。各ペレットは通常、４００ｎｇのｂＦＧＦおよび変動する量の試験物質を含有することができる。本実施例において、各ペレットは４００ｎｇのｂＦＧＦを含有し、そして、Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質は８０ｎｇから４００ｎｇまでの範囲にわたる用量で包含した。ペレットは室温で２時間以内に生じることができる。
【００７０】
ペレットの埋植を麻酔下にあるラットで実施する。無菌条件下で、柔軟性の虹彩スパーテルを用いて角膜の中心近くに微少ポケット（２ｍｍ×２ｍｍ）を外科的に生じさせる。ハイドロンペレットは生理的食塩水で予め湿らせ、ラット角膜に埋植かつ溶解させる。ラットを７日後に殺す。角膜の新脈管形成の可視化を、インディアンインクを用いる心灌流により高める。ラット角膜を単離し、ホルマリン中で一夜固定し、そしてスライドガラス上に固定する。新脈管形成のレベルを顕微鏡的に検査する。新脈管形成の程度を二重盲検的に評価する。すなわち、新脈管形成なしについて０；穏やかな新脈管形成について１；有意の新脈管形成について２、および広範囲の新脈管形成について３。
【００７１】
結果は、Ｒｙｋ−Ｆｃが、２４０ｎｇのＲｙｋ−Ｆｃでもしくはそれより上で明らかな新脈管形成の明瞭な低下を伴い、このモデルでｂＦＧＦに誘発される新脈管形成の用量依存性の阻害を表す（図１０）ことを示唆する。
実施例９
変異種Ｒｙｋタンパク質に対するヒト抗体を以下のとおり生成させた：
Ｆｕｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ）Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ａｎｄ ＣＤＲｓ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（Ａｃｈｉｍ Ｋｎａｐｐｉｋ、Ｌｉｍｉｎｇ Ｇｅ、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ Ｈｏｎｅｇｇｅｒ、Ｐｅｔｅｒ Ｐａｃｋ、Ｍｅｌａｎｉｅ Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｇｕｅｎｔｅｒ Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ、Ａｄｏｌｆ Ｈｏｅｓｓ、Ｊｏａｃｈｉｍ Ｗｏｅｌｌｅ、Ａｎｄｒｅａｓ Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｖｉｒｎｅｋａｅｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２９６、Ｎｏ．１、２０００年２月、ｐｐ．５７−８６）が、ＨｕＣＡＬライブラリーを詳述する参考文献であり、かつ、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
ＨｕＣＡＬファージの選択：
マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレート（Ｆ９６ マキシソープ ヌンク−イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅ））の３ウェルを、６４で４℃でインキュベートされたＰＢＳ中５０μｇ／の濃度の２００μｌのＲｙｋ−Ｆｃで被覆した。抗原溶液を除去し、そしてウェルを４００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、その後４００μｌの５％ＭＰＢＳ（５％脱脂乳、低脂肪、＜１％を含有するＰＢＳ）で、マイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで２時間ブロッキングした。この時間の間に、１００μＬのファージ調製物（１０^１１−１０^１２ｔｕ）を、ブロッキングタンパク質として３１２．５μｇ／ｍｌのＩＬ４Ｒ−Ｆｃを含有する１００μｌの５％ＭＰＢＳ−０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０と混合し、そしてＲＴで２時間穏やかに振とうしてインキュベートした。ブロッキング後、被覆されたウェルを４００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。前ブロッキングされたファージ混合物（２００μＬ）を各被覆されたウェルに移し、プレートを封止し、そしてマイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで３０分間、次いでＲＴで静置して別の３０分インキュベートした。ファージ溶液を除去し、そしてウェルを以下のとおり洗浄した：
１回目の選択：３×４００μｌ ＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有するＰＢＳ）迅速に−２×４００μｌ ＰＢＳＴ、ＲＴで振とう機上５分間；３×４００μｌ ＰＢＳ 迅速に−２×４００μｌ ＰＢＳ、ＲＴで振とう機上５分間
２回目の選択：１×４００μｌ ＰＢＳＴ 迅速に−４×４００μｌ ＰＢＳＴ、ＲＴで振とう機上５分間；１×４００μｌ ＰＢＳ 迅速に−４×４００μｌ ＰＢＳ、ＲＴで振とう機上５分間。
【００７２】
結合されたファージを、２００μｌの１００ｍＭトリエチルアミンとの１０分間のインキュベーションにより溶出した。溶出液を、１００μｌ １Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．０を含有するチューブに移すことにより迅速に中和した。選択ウェル中の残存するファージを、０．８のＯＤ_{６００ｎｍ}の２００μｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞の添加によりレスキューした。同時に、０．８のＯＤ_{６００ｎｍ}をもつ４．５ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１培養物を、中和されたファージ溶出物に添加し、そしてこのチューブおよびマイクロタイタープレート双方を、振とうを伴わずに３７℃で４５分間インキュベートした。感染した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１の２サンプルを合わせ、そして５０００ｇで２分間遠心分離した。上清を除去し、そしてペレットを再懸濁しかつ１５０ｍｍのＬＢ／Ｃｍ／Ｇｌｕ（２×ＴＹ培地、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１％ブドウ糖）アガープレート上でプレーティングし、これを３０℃で一夜インキュベートした。
選択されたファージのレスキュー：
細菌を、１５％グリセロールを含有する２ｍｌの２×ＴＹ／Ｃｍ／Ｇｌｕを含むアガープレートから掻き取った。１０ｍｌの２×ＴＹ／Ｃｍ／Ｇｌｕ培地（５０ｍｌプラスチックチューブ中）に８６μｌの細菌を接種し、そして２５０ｒｐｍの振とう中３７℃で４５分間インキュベートした。５ｍＬを培養チューブに移し、５０μｌのヘルパーファージを添加し、そして、振とうを伴わずに水浴中３７℃で３０分間、次いで２５０ｒｐｍの振とう機中３７℃で３０分、チューブをインキュベートした。４℃で５分間の４５００ｇでの遠心分離により細菌を収穫した。ペレットを、ブドウ糖を含まない２５ｍｌの２×ＴＹ／Ｃｍ／５０ｍｇ／ｍＬ Ｋａｎ／０．１ｍＭ ＩＰＴＧに再懸濁し、その後２５０ｒｐｍで振とうし３０℃で一夜インキュベートした。
選択されたファージの調製およびサブクローニング：
細菌を遠心分離によりペレットにし、そして５ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌでの沈殿によりファージを上清から回収した。ファージペレットを１ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、遠心分離により澄明にし、０．８μｍシリンジフィルターを通して濾過しかつ４℃で保存した。第２回の選択を上述されたとおり実施し、このファージ調製物をＨｕＣＡＬライブラリーの一次ファージ調製物の代わりに使用した。
【００７３】
第２回の選択後、１５％グリセロールを含有する２ｍＬの２×ＴＹ／Ｃｍ／Ｇｌｕを含む２枚のアガープレートから細菌を掻き取った。各プレートからの５００マイクロリットルの掻き取り物をミニプレップに直接使用した。ＤＮＡは標準的ミニプレップ法により調製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した。ＨｕＣＡＬ ＴＡＧ−ＣＡＬクローンの選択されたもののプールから得られたｓｃＦｖのバンドを、標準的方法により発現ベクターｐＭｘ７＿ＦＨに連結した。ライゲーション反応を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ８３に形質転換し、そしてＬＢ／Ｃｍ／Ｇｌｕアガープレート上でプレーティングした。
ｓｃＦｖの微少発現：
形質転換からの単一コロニーを拾い、そして１５０ｍｍのＬＢ／Ｃｍ／１％Ｇｌｕアガープレート上の１格子パターンおよび１００μｌの２×ＴＹ／Ｃｍ／１％Ｇｌｕ培地を含有する９６穴マイクロタイタープレートの双方に接種した。プレートを気体透過性テープで封止し、そして振とうしながら３７℃で一夜インキュベートした。微少発現のために、ウェルあたりおよそ５μｌのマスタープレートを、１００μｌの２×ＴＹ／Ｃｍ／０．１％Ｇｌｕを含有する新たな培養プレートの対応するウェルに移した。培養プレートを振とうしながら３７℃で４時間インキュベートし、その後、１ｍＭ ＩＰＴＧを含有する１００μｌ／ウェルの２×ＴＹ／Ｃｍの添加により誘導した。プレートを、振とうしながら３０℃で追加の４時間インキュベートした。プレートを遠心分離して細菌をペレットにし、上清を除去し、そして１２５／ウェルμｌの氷冷ＢＢＳ（１００ｍＭホウ酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加した。プレートを封止しかつ振とうしながら４℃で一夜インキュベートした。細菌を遠心分離によりペレットにし、そして５０μＬの上清を以下のｓｃＦｖ ＥＬＩＳＡで使用した。
ｓｃＦＶ ＥＬＩＳＡ：
マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレートを、ウェルあたり１００μｌのＰＢＳ中Ｒｙｋ−Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を用い４℃で一夜被覆した。抗原溶液を除去し、そして、４００μｌ／ウェルの５％ＭＰＢＳを用い、ＲＴでマイクロタイタープレート振とう機上で振とうしてプレートを２時間ブロッキングした。プレートを、ウェルあたり４００μｌのＴＢＳＴ（５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０）で１回すすぎ、そして５０μｌの５％ＭＴＢＳＴ（５％脱脂乳を含有するＴＢＳＴ）を各ウェルに分配した。上の微少発現プレートからの上清（５０μｌ／ウェル）を、抗原被覆されたＥＬＩＳＡプレートにの対応するウェルに移し、これをマイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで１．５時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で５回迅速に洗浄した。それぞれＴＢＳＴ＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で１００００倍希釈されたモノクローナルマウス抗ＦＬＡＧ標識抗体Ｍ１（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｆ−３０４０）およびＭ２（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｆ−３１６５）の混合物をプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、これをその後マイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で５回迅速に洗浄し、そして、ＴＢＳＴ＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で１０ ０００倍希釈された１００μｌの抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ複合物（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ａ−６７８２）を各ウェルに添加し、次いでマイクロタイタープレート振とう機上ＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ＋１ｍＭ ＣａＣｌ_２で５回迅速に洗浄し、そして、１００μｌ／ウェルのペルオキシダーゼ基質ＢＭブルーソルブル（ＢＭ ｂｌｕｅ ｓｏｌｕｂｌｅ）（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を添加し、次いでＲＴで３０分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡシグナルを３７０ｎｍで読取った。
特異性ＥＬＩＳＡ：
マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）マイクロタイタープレートを、以下の抗原で上述されたとおり被覆した。ＩＬ４Ｒ−Ｆｃ（５μｇ／ｍＬ）ＥＬＩＳＡは上述されたとおり実施した。
ＥＬＩＳＡ陽性のｓｃＦｖの配列決定：
ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、格子アガープレートからディープウェルマイクロタイタープレート中の１．２ｍＬの２×ＹＴ／Ｃｍ／１％Ｇｌｕに接種し、そして振とうしながら３７℃で２４時間インキュベートした。キアロボット（ＱｉａＲｏｂｏｔ）を使用してＤＮＡを調製し、そしてプライマーＨｕＣＡＬ ｆｏｒ（ＴＡＣＣＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＣ）およびＨｕＣＡＬ ｒｅｖ（ＴＴＴＴＴＣＡＣＴＴＣＡＣＡＧＧＴＣ）を使用して配列決定した。ＤＮＡ配列を標準的整列法により比較して独特なｓｃＦｖ配列を同定しかつ各独特のクローンの枠組み配列を決定した。
大スケール発現およびＮｉアフィニティークロマトグラフィーを用いるｓｃＦｖの精製：
ＨｕＣＡＬ ｓｃＦｖを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ８３をＬＢ／Ｃｍ／Ｇｌｕアガープレート上にプレーティングしかつ３７℃で一夜インキュベートした。２×ＴＹ／Ｃｍ／１％Ｇｌｕ培地中の１０ｍｌの培養物を、単一コロニーから接種し、そして振とう機中３０℃で一夜インキュベートした。５００ｍＬの２×ＴＹ／Ｃｍ／０．１％Ｇｌｕ培地を含有するバッフル付フラスコに２．５ｍＬの新鮮な一夜培養物を接種し、そして１８０ ＯＤ_{６００ｎｍ}＝０．５における振とう機中３０℃で６時間インキュベートした。細菌培養物を氷上で冷却してＲＴに達せさせ、そして０．５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加した。ｓｃＦｖを、１８０ｒｐｍで振とうして２２℃で一夜、０．５のＯＤ_{６００ｎｍ}まで発現させた。細菌を４℃で５０００ｇで２０分間の遠心分離により収穫した。ペレットを１００ｍｌの予冷された運転緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１００ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁し、そしてマイクロフルイディックス（ＭｉｃｒｏＦｌｕｉｄｉｃｓ）細胞破壊装置を使用して破壊した。細菌の破片を４℃で２０ ０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。上清を０．２μｍフィルター（低タンパク質結合）を通して濾過し、そしてパースペクティブ バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのポロス（Ｐｏｒｏｓ）金属キレート剤カラムに適用した。１０カラム容量の運転緩衝液で洗浄した後、ｓｃＦｖを１０カラム容量の溶出緩衝液（運転緩衝液＋２５０ｍＭイミダゾール）で溶出した。溶出された画分を標準的方法によりＰＢＳ中に透析し、アリコートにしかつ−２０℃で保存した。
実施例１０
１Ｂ４（抗Ｒｙｋ一本鎖ｓｃＦｖ抗体（配列番号２０および２１））の発現
モルホシス（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）抗体チーム（Ｍａｒｉｎａ Ｒｏｅｌｌ）からのクローン１Ｂ４の一夜培養物を、１％ブドウ糖および３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２−ＹＴ培地中３０℃で成長させた。１０ｍｌの一夜培養物を使用して、０．１％ブドウ糖および３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む２−ＹＴ培地中の１Ｌ培養物に接種した。培養物は、０．５の６００ｎｍでの吸光度が得られるまで３０℃で成長させた。温度を２５℃に低下させ、そして５００μｌの１Ｍ ＩＰＴＧの添加により１Ｂ４抗体の発現を誘導した。細胞を一夜誘導後に収穫した。
１Ｂ４（抗Ｒｙｋ一本鎖ｓｃＦｖ抗体）の精製
細胞を遠心分離（２６６０×ｇ）によりペレットにし、そして、１ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含有する２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）にペレットを再懸濁し、そして１５，０００ｐｓｉの圧でマイクロフリューダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（マイクロフルイディックス インク（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｉｎｃ））を使用して溶解した。上清を１０，６４０×ｇで遠心分離し、濾過しかつＮｉ＋で荷電されていた１ｍｌのポロス（Ｐｏｒｏｓ）ＭＣ（パースペクティブ バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））金属キレート剤カラムに、製造元の説明書に従って適用した。負荷した後、カラムを緩衝液Ａで洗浄し、そして緩衝液Ａ中３０、６０、９０および２５０ｍＭイミダゾールの段階勾配を用いてタンパク質を溶出した。１Ｂ４抗体のピークを、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５および１０ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝液（緩衝液Ｂ）中４℃で４時間透析し、濾過し、そして１ｍｌ／分の流速を使用して、緩衝液Ｂ中で平衡化されたモノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）５／５イオン交換カラムに注入した。緩衝液Ｂで洗浄して結合されない物質を除去した後、緩衝液Ｂ中０ないし０．５Ｍ ＮａＣｌの勾配を使用してタンパク質を溶出した。抗Ｒｙｋ １Ｂ４抗体を含有するピークを収集し、製造元の示唆（バイオウィッテイカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、メリーランド州ウォーカーズビル）の下にＱＣＬ−１０００試験キットを使用してエンドトキシンについて試験した。このピーク中のエンドトキシンレベルが有意であった（１６００ＥＵ／ｍｌ）ため、モノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）カラムをエンドトキシン汚染から浄化し、そして、最初にピークを緩衝液Ｂで５倍に希釈することにより抗体を再適用しかつ再注入した。生じるピークをエンドトキシンについて再アッセイした。
ビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）の方法論−ヒト変異種Ｒｙｋタンパク質に結合するヒト変異種Ｒｙｋ抗体のＫ_ｄ値
実験はビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）２０００（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して２５℃で実施した。運転緩衝液はビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）であった。抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４抗体は、最初に表面を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１Ｍ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（．２５Ｍ）の１：１混合物を用いて５μｌ／分で活性化することにより、ＣＭ５センサーチップにアミンカップリングした。抗体を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５で１．８μｇ／ｍｌに希釈し、そして２５０応答単位（ＲＵ）が得られるまで注入した。結合後、センサー表面上の残存する活性部位を、３５μｌの１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５を用いて５μｌ／分で封鎖した。運転緩衝液中の多様な濃度のＲｙｋ−Ｆｃ（３０ないし２４２ｎＭ）を表面上に注入（６０μｌ注入／３０μｌ／分流速）してＲｙｋ−Ｆｃ−抗体の会合を追跡した。Ｒｙｋ−Ｆｃ−抗体を、ラニング緩衝液の２分注入による各会合反応直後に追跡した。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）チップ表面の再生は、５０μｌの１０ｍＭグリシン ｐＨ２．５を１００μｌ／分の流速で注入することにより達成した。会合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）速度定数は、モデルＡ＋Ｂ＝ＡＢを用いるＢＩＡｅｖａｌバージョン３．１を使用してデータの全体的適合（ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔ）により決定した。ｋｏｎに対するｋｏｆｆの比からＫＤ値を計算した。
【００７４】
抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４抗体は、連続するキレートおよびイオン交換クロマトグラフィーにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ライセートから精製した。抗体の大部分は、２５０ｍＭイミダゾールでポロス（Ｐｏｒｏｓ）ＭＣキレートカラムから溶出した。抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４抗体はより早期の洗浄でもまた溶出したが、しかしこれらのピークは高イミダゾール溶出物と合わせなかった。合計１１．７のＡ２８０ｎｍ単位を最終的なプール中で検出した。最初のモノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）カラム溶出物は複数のピークを含有し、その最初の２個がｓｃＦｖ １Ｂ４抗体であると判断された（図１１）。ピーク中のエンドトキシンレベルが有意であった（１６００ＥＵ／ｍｌ）ため、その後のモノ−Ｑ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）カラムは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣ系およびイオン交換カラムからエンドトキシンを除去するための徹底的な洗浄後に実施した。ピーク２をモノ−Ｑ（Ｍｏｎｏ−Ｑ）カラムに再適用し（図１２）、そして最終エンドトキシン収量は４．０ＥＵ／ｍｌであると測定された。最終の抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４調製物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断されるとおり、高度に純粋であると判断された（図１３）。
【００７５】
ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）２０００装置は、タンパク質−タンパク質相互作用の分析における強力なツールである。適切なカップリング条件を使用すれば、抗原に対する抗体の結合の正確な会合および解離定数を決定することができる。図１４は、固定された濃度の固定された抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４抗体への多様な濃度のＲｙｋ−Ｆｃの結合について生成されたセンサー図（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を示す。これらのプロットから計算される力学的定数を下の表１に列挙する。１３．３ｎＭというＫＤ値がこの相互作用について計算され、２種の結合パートナー間の高親和性を立証した。
【００７６】
【表３】

【００７７】
結論
新脈管形成におけるＲｙｋの関与の報告は存在していない。Ｒｙｋの過剰発現が卵巣癌において立証されているとは言え、癌におけるその役割は決定されていない。われわれは、今や、新規変異種Ｒｙｋタンパク質が、極めて驚くべきことに新脈管形成の調節において活性を表すことを見出した。
【００７８】
われわれは、今や、野性型Ｒｙｋタンパク質もしくは本明細書に記述されるところの他の変異種Ｒｙｋタンパク質が、限定されるものでないが、癌、創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性および心血管系疾患を挙げることができる新脈管形成が関与するいかなる疾患に対する治療薬としても適切であるかもしれないことを発見した。本明細書に記述される変異種Ｒｙｋタンパク質はさらに、胎盤の血管新生の調節、妊娠の調節を包含する生殖系における新脈管形成を伴う臨床的病状の治療、もしくは人工流産促進剤としての使用において使用してよい。それらの潜在的な治療的使用に加え、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるかもしれないように、また、本発明のポリペプチドに対する抗体がそうであるかもしれないように、診断の応用での使用を見出すかもしれない。
【００７９】
上の実施例は本発明を具体的に説明することを意図しており、そして変動が当業者に思い浮かぶであろうと思われる。従って、本発明の範囲は下の請求の範囲によってのみ制限されるべきであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、Ｔａｍａｇｏｎｏｎｅらにより記述されたところのＲｙｋタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列、ならびに対応するヌクレオチド配列を示す。
【図２】
発明にかかる、Ｈａｌｆｏｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：７３７９により記述されたところのＲｙｋタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列、ならびに対応するヌクレオチド配列を示す。
【図３】
発明にかかる、Ｗｎｔ阻害因子（ＷＩＦ）ドメインよりなるＲｙｋタンパク質の細胞外ドメインの一部分のアミノ酸配列、ならびに対応するヌクレオチド配列を示す。
【図４Ａおよび４Ｂ】
発明にかかる、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中のＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対するＲｙｋ−Ｆｃの用量依存性の阻害効果を示す。結果は、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中の処理されないＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化を表す対照のパーセントとして表す。
【図５】
発明にかかる、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中のＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対するＲｙｋ−ｍｙｃ−Ｈｉｓを含有する上清の用量依存性の阻害効果を示す。結果は、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中の処理されないＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化を表す対照のパーセントとして表す。
【図６】
発明にかかる、外因性に添加されたｂＦＧＦ、ＶＥＧＦもしくはＩＬ−８の存在下でのマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中のＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対するＲｙｋ−Ｆｃの用量依存性の阻害効果を示す。結果は、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中の処理されないＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化を表す対照のパーセントとして表す。
【図７Ａおよび７Ｂ】
発明にかかる、外因性に添加されたＩＬ−８の存在下でのマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中のＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化に対するＷＩＦ、ＷＩＦ−Ｆｃ、ＮＷＩＦ−ｈｉｓ、ＷＩＦ−ｈｉｓおよびＲｙｋ−ｈｉｓの用量依存性の阻害効果を示す。結果は、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）マトリックス中の処理されないＨＵＶＥＣの毛細管様の組織化を表す対照のパーセントとして表す。
【図８】
発明にかかる、Ｒｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質に対し生成された一本鎖抗体（ｓｃＦｖ １ｂ４）を使用するＲｙｋ−Ｆｃ融合タンパク質の特異性を示す。
【図９】
発明にかかる、同系マウスにおけるインビボのＢ１６黒色腫の肺転移の成長に対するＲｙｋ−Ｆｃの発現の影響を示す。Ｂ１６細胞はＲｙｋ−Ｆｃ遺伝子を含有するアデノウイルスにエクスビボで感染させ、そして尾静脈注入によりマウスに埋植した。結果は肺転移の数として表す。
【図１０】
発明にかかる、ラット角膜におけるインビボの新脈管形成に対するＲｙｋ−Ｆｃの発現の影響を示す。血管形成剤、組換えｂＦＧＦおよび変動する濃度のＲｙｋ−Ｆｃを含有するハイドロンペレットをラット角膜に埋植し、そして新脈管形成を７日後に顕微鏡的に検査した。新脈管形成の等級は、参照点を使用して２個人により盲検的に評価した。
【図１１】
発明にかかる、モノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）５／５イオン交換クロマトグラフィーを使用する抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ抗体の精製を示す。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液中０ないし０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を使用して、抗体をイオン交換カラムから溶出した。画分をＡ２８０ｎｍおよび伝導度値によりモニターした。ピーク１および２が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりｓｃＦｖであることが見出された。
【図１２】
発明にかかる、モノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）５／５イオン交換クロマトグラフィーを使用しての抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ １Ｂ４の精製およびエンドトキシン除去を示す。１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液中０ないし０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を使用して、抗体をイオン交換カラムから溶出した。エンドトキシンは４．０ＥＵ／ｍｌまで見積もられた。
【図１３】
発明にかかる、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）から高度に精製された、抗Ｒｙｋ ｓｃＦｖ モノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）５／５で精製された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。モノＱ（Ｍｏｎｏ Ｑ）５／５溶出物のアリコート（レーン１）およびｋＤａの示された大きさの分子サイズマーカー（レーン２）を、４−１２％ビストリスゲル（ノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ）、カリフォルニア州カールスバード）上で分離し、そしてクマシー染色で発色させた。
【図１４】
発明にかかる、Ｒｙｋ−Ｆｃとの抗Ｒｙｋ−ｓｃＦｖ抗体の相互作用を示す。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）２０００装置を使用して、Ｒｙｋ−ＦｃとのｓｃＦｖ抗体の相互作用を特徴づけした。データは、二重で注入された最低６種の異なる濃度のＲｙｋ−Ｆｃを使用して収集した。全部の実験は、本明細書で論考されるパラメータを使用して２５℃で実施した。

Claims (27)

1. 変異種Ｒｙｋタンパク質を含んで成る有効量の組成物をある部位に供給させることを含んで成る、該部位での新脈管形成の調節方法。
2. 変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号２に同一のアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
3. 変異種Ｒｙｋタンパク質が、配列番号２に対し最低４０残基にわたって最低６０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
4. 変異種Ｒｙｋタンパク質が、配列番号２に対し最低３０残基にわたって最低７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の方法。
5. 変異種Ｒｙｋタンパク質を含んで成る有効量の組成物をある部位に供給させることを含んで成り、ここで該変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する、該部位での新脈管形成の調節方法。
6. 変異種Ｒｙｋタンパク質を含んで成る生物学的に有効な量の組成物と細胞を接触させることを含んで成り、ここで該変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する、細胞の毛細管様構造への形成の調節方法。
7. 細胞がヒト起源の内皮細胞である、請求項６記載の方法。
8. 配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列に対して４０残基にわたって最低６０％同一である推定アミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。
9. 推定アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列に対し５０残基にわたって最低８０％同一である、請求項８記載のタンパク質。
10. 変異種Ｒｙｋタンパク質［ここで該変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する］、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る、新脈管形成を調節するための製薬学的組成物。
11. 変異種Ｒｙｋタンパク質であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列に対し４０残基にわたって最低６０％同一である推定アミノ酸配列を有することを特徴とする該変異種Ｒｙｋタンパク質、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る、新脈管形成を調節するための製薬学的組成物。
12. 該部位がヒト患者内にあり、また、該タンパク質が請求項１０記載の製薬学的組成物を介して該部位に供給される、請求項６記載の方法。
13. 該部位がヒト患者内にあり、また、該タンパク質が遺伝子治療の方法を介して該部位に供給される、請求項１２記載の方法。
14. 有効量の変異種Ｒｙｋタンパク質の供給源を個体に提供することを含んで成り、ここで該変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する、個体における医学的病状の予防、治療もしくは改善方法。
15. タンパク質が、該タンパク質をコードしかつ該タンパク質をインビボで発現するポリヌクレオチドの供給源を個体に提供することにより該個体に供給される、請求項１４記載の方法。
16. 医学的病状が、癌、転移、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、創傷、妊娠、および胎盤の血管新生の調節を包含する生殖系の新脈管形成を伴う臨床的病状よりなる群から選択される、請求項１４記載の方法。
17. （ａ）変異種Ｒｙｋタンパク質であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する該変異種Ｒｙｋタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに（ｂ）（ａ）に相補的なポリヌクレオチドよりなる群から選択されるポリヌクレオチド。
18. ポリヌクレオチドが、発現ベクター内でプロモーターに操作可能に連結される、請求項１７記載のポリヌクレオチド。
19. ポリヌクレオチドが３５と１５００塩基長との間である、請求項１７記載のポリヌクレオチド。
20. （ａ）変異種Ｒｙｋタンパク質を発現することが可能な発現ベクターを、変異種Ｒｙｋタンパク質を発現することが可能な細胞に導入すること、
    （ｂ）該細胞に変異種Ｒｙｋタンパク質を発現させるのに十分な条件下で、段階（ａ）から生じる細胞を成長させること、および
    （ｃ）段階（ｂ）の結果から変異種Ｒｙｋタンパク質を回収すること
    の段階を含んで成る、変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有する、変異種Ｒｙｋタンパク質の製造方法。
21. 請求項８記載のタンパク質に対する抗体。
22. 請求項２７記載のタンパク質に対する抗体。
23. 配列番号２２に同定されるアミノ酸配列を有する抗体。
24. 請求項２７の抗体を含んで成る有効量の組成物をある部位に供給させることを含んで成る、該部位での新脈管形成の調節方法。
25. 変異種Ｒｙｋタンパク質が配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択されるアミノ酸配列を有し、段階：
    （ａ）哺乳動物から得られたサンプル中の前記タンパク質の発現のレベルを測定すること；および
    （ｂ）前記タンパク質の発現のレベルを標準に対して比較して診断を行うこと
    を含んで成る、哺乳動物における疾患もしくは医学的病状［該疾患もしくは医学的病状が変異種Ｒｙｋタンパク質の不十分なもしくは過剰な発現に関係する］または疾患もしくは医学的病状に対する感受性の診断方法。
26. 医学的病状が、癌、転移、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、創傷、妊娠、および生殖系の新脈管形成を伴う臨床的病状よりなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
27. 配列番号１、配列番号２および配列番号３より本質的になる群から選択される推定アミノ酸配列を有することを特徴とするタンパク質。

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