JP2004521880A - 口腔組成物及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、感覚刺激適合性の担体、並びに該担体に分散されたう蝕、歯苔形成、歯肉炎、カンジタ症、歯口内炎、アフタ性口内炎、若しくは真菌感染を予防または処置するのに有効な量のテルペノイド及びフラボノイドを含む口腔組成物に関する。本発明はまた、テルペノイド、フラボノイドまたはその両方を含む口腔組成物の種々の使用に関する。このような使用には次のものが含まれる：表面結合グルコシルトランスフェラーゼの活性阻害；う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎の処置若しくは阻害；口腔表面への微生物蓄積の阻害；及び／または、口腔表面におけるアフタ性口内炎の処置若しくは阻害。

Description

【技術分野】
【０００１】
本出願は、2001年12月13日に出願された米国仮出願第60/255,304号について優先権を主張するものであり、該仮出願の内容は本明細書の一部を構成する。
本発明の少なくとも一部は、国立衛生研究所(NIH)NIDCR承認番号R37 DE07907の財政的支援を受けて成されたものである。米国政府は本発明について或る権利を有するかもしれない。
【０００２】
発明の属する技術分野
本発明は、口腔組成物、並びに、表面結合グルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害、う蝕、歯肉炎、カンジタ症及び/若しくは義歯口内炎の処置または阻害、口腔表面の微生物集積の阻害、及び、口腔表面のアフタ性口内炎の処置または阻害におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ミュータンス連鎖球菌（mutans streptococci）の歯表面における集落形成は、動物及び人間におけるう蝕の原因及び病因と関連している(Fitzgerald及びKeyes、1960；Loesche、1986)。ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)により産生されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素(glucosyltransferase enzyme (GTF))は、う蝕の病因であるビルレンス因子として認識されてきた(DeStoppelaarら、1971；Tanzerら、1985；Yamashitaら、1993)。GTFは、ショ糖からの可溶性及び不溶性α結合グルカンの形成を触媒し、歯苔マトリックスの多糖組成に明らかに寄与している(Rollaら、1983)。歯苔は本質的には、生物膜(biofilm)である。グルカンは、う蝕原性連鎖球菌の歯表面への付着及び集積を促進し、う蝕活動に関わる病原性の歯苔の発生に欠くことのできない役割を果たしている(Hamada及びSlade、1980；Schilling及びBowen、1992；Yamashitaら、1993)。ストレプトコッカス・ミュータンスは少なくとも3種類のGTFを産生する：ほぼ不溶性のα1,3-結合グルカンのポリマーを合成するGTF B、不溶性α1,3-結合グルカン及び可溶性α1,6-結合グルカンの混合物を合成するGTF C、並びに、α1,6-結合可溶性グルカンを合成するGTF D(Aokiら、1986；Hanada及びKuramitsu、1988；Hanada及びKuramitsu、1989)。さらに別の酵素であるエス・サンギニス(S.sanguinis)由来GTF(GTF Ss)もまた、歯苔の発生に関与しているかもしれない(Nyvad及びKilian、1987；Vacca-Smithら、2000)。S.sanguinisは、プラーク形成の初期に歯表面に集落形成し、そのGTFは主にα1,6-結合可溶性グルカンを触媒する(Ceskaら、1972)。全ヒト唾液の可溶性画分に酵素的に活性なGTFが存在し、さらに歯表面上に形成される唾液薄膜に組込まれる(Rollaら、1983；Scheieら、1987)。さらに、実験的な薄膜中に組込まれたGTFは、同じ酵素が溶液中に存在する場合と比べて異なった物理的及び動力学的特性を示す。即ち、GTF C及びDは増幅された酵素活性を示す (Schilling及びBowen、1988；Vacca-Smithら、1996；Venkitaramanら、1995)。これらの表面吸着GTFにより合成されるグルカンの多くが薄膜上に保持され、ミュータンス連鎖球菌の結合部位となり得、歯苔のインサイチュー形成に寄与する(Schilling及びBowen、1988；Schilling及びBowen、1992；Vacca-Smith及びBowen、1998)。そのため、溶液中及び歯表面の薄膜に吸着したGTFの阻害は、う蝕及びその他のプラーク関連疾病を予防するための手法の一つである。
【０００４】
アピス・メリフェラ(Apis mellifera)ミツバチにより種々の植物源より集められ、分泌される蜜蝋と混合された樹脂物質であるプロポリスは、ミツバチにより巣箱の構築、維持及び防護に使用される多機能性材料である(Burdock、1998；Ghisalberti、1979)。プロポリスは、多様な薬理学的効果、及び複雑な化学組成を有する非毒性の天然産物である(Burdock、1998；Ghisalberti、1979)。プロポリス中の幾つかの化合物が同定されており、これまで3種類の別個の化学的グループが報告されている：1)フラボノイドアグリコン；2)桂皮酸誘導体；及び3)テルペノイド(Bankovaら、1995；Banskotaら、1998；Parkら、1998；Tazawaら、1998)。それらのうちフラボノイドがプロポリス中の主要な生物学的に活性な化合物であると考えられている(Amorosら、1992；Bonheviら、1994；Ghisalberti、1979)。プロポリスは、抗微生物、抗炎症、麻酔様及び細胞増殖抑制性特性を含む広範囲にわたる生物学的活性を示す(Burdock、1998；Ghisalberti、1979)。ブラジル産の2つの化学的異なる型のプロポリスがインビトロにおいて、GTFの活性及びミュータンス連鎖球菌の生育を阻害することが以前より立証されている(Kooら、2000a；Kooら、2000b；Kooら、2000c)。さらに、プロポリスを日に2回の局所的適用する(Kooら、1999)か、または、随意に飲むことができる水中に加えること(Ikenoら、1991)によりラットにおけるう蝕の発生が減少した。それにもかかわらず、口腔の疾病の予防に有用であり得る特定の化合物の生物学的特性についての情報は乏しい。従って、プロポリスの個々の成分、及びプロポリスに含まれない同様の活性を有するその他の化合物を同定することは望ましいと考えられる。
【０００５】
本発明は、これら及びその他の当分野における欠点を克服することを目的とする。
【０００６】
発明の概要
本発明の第一の態様は、感覚刺激適合性の担体、並びに、該担体に分散されたう蝕、歯苔形成、歯肉炎、カンジタ症、歯口内炎(dental stomatitis)、アフタ性口内炎及び真菌感染を予防または処置するのに有効な量のテルペノイド及びフラボノイドを含む口腔組成物に関する。
【０００７】
本発明の第二の態様は、表面結合グルコシルトランスフェラーゼのグルカン形成活性を阻害するのに有効な条件下で、表面結合グルコシルトランスフェラーゼを有効量のフラボノイド、またはフラボノイド及びテルペノイドの組合せと接触させることを含む、表面結合グルコシルトランスフェラーゼの活性を阻害する方法に関する。
【０００８】
本発明の第三の態様は、(1)本発明の口腔組成物を提供し、(2)う蝕、歯肉炎、カンジタ症、若しくは義歯口内炎を処置または阻害するのに有効な条件下で、口腔表面を該口腔組成物の有効量と接触させることを含む、う蝕、歯肉炎、カンジタ症、若しくは義歯口内炎を処置または阻害する方法に関する。
【０００９】
本発明の第四の態様は、(1)本発明の口腔組成物を提供し、(2)う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎若しくは歯苔マトリックス形成を促進する微生物の集積を阻害するのに有効な条件下で、口腔表面を該口腔組成物の有効量と接触させることを含む、口腔表面の微生物集積を阻害する方法に関する。
【００１０】
本発明の第五の態様は、口腔表面をアフタ性口内炎を処置するか、または、アフタ性口内炎の形成を阻害するのに有効な条件下でテルペノイド、フラボノイド、またはそれらの組合せの有効量と接触させることを含むアフタ性口内炎を処置または阻害する方法に関する。
【００１１】
本発明の口腔組成物は、特にう蝕、歯肉炎、カンジタ症、及び義歯口内炎を処置または阻害するのに適していると考えられている。何故なら、テルペノイド及びフラボノイドを含む組成物は、溶液中及び/または固体表面に結合したグルコシルトランスフェラーゼの活性を妨げると共に、グルコシルトランスフェラーゼを産生する微生物を破壊することができるためである。同様に、本発明の口腔組成物はう蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎または歯苔マトリックス形成を促進する微生物の集積を阻害するのに適している。付加的な利点には、歯の着色及び口腔の悪臭を最小限にすることが含まれる。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、口腔組成物、並びに、表面結合グルコシルトランスフェラーゼの活性の阻害、う蝕、歯肉炎、カンジタ症及び/若しくは義歯口内炎の処置または阻害、口腔表面における微生物集積の阻害、及び口腔表面におけるアフタ性口内炎の処置または阻害におけるその使用に関する。
【００１３】
本発明に従って使用することができる口腔組成物は、感覚刺激適合性の担体、並びに、該担体に分散されたテルペノイド及び/またはフラボノイド、好ましくは担体に分散されたテルペノイド及びフラボノイドの両者を含む。
【００１４】
適当なテルペノイドには、これらに限定されることなく、テルペン、テルピノール、ジテルペン酸、ジテルペン、トリテルペン、及びそれらの誘導体が含まれる。例示的なテルペノイドには、これらに限定されることなく、ｔｔ-ファルネソール、並びにその立体異性体及び誘導体、β-カリオフィレン、テルピネオール、ネロリドール、ビサボロール、サンタロール、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、β-アミリン、アミリンのトリテルペンアルコール、ラノステロール、クプレス酸(cupressic acid)またはその誘導体、アカセチン酸(agathic acid)またはその誘導体、アカタリック酸(agathalic acid)、ベツレトール(betuletol)、メリフェロン(melliferone)、モロン酸(moronic acid)、アンブベゾン酸(anwuweizonic acid)、ベツロン酸(betulonic acid)、シリンガアルデヒド、インブリカトロイック酸(imbricatoloic acid)、コムニック酸(communic acid)、イソクプレス酸メチル(methyl isocupressate)、トレメトン(tremetone)、ビスシドン(viscidone)またはその誘導体、δ-カジネン、レドール、グアイオール、α-コパエン、β-セリネン、α-エレメン、カラメネン、α-ムウロレン、γ-ムウロレン、β-オイデスモール、フムレン、ブルネソール、並びに、それらの組合せが含まれる。これらのテルペノイドの多くが販売されており入手可能であるか、または公知の手法に従って容易に合成される。
【００１５】
テルペノイドは、う蝕、歯苔形成、歯肉炎、カンジタ症、歯口内炎、アフタ性口内炎、及び／若しくは真菌感染を予防または処置するのに有効な量で存在する。典型的には、これに限定されないが、口腔組成物中に存在するテルペノイドの有効量は、重量／容量で約5％より少ない量である。テルペノイドは、好ましくは重量／容量で約0.01〜約2％の間の量、より好ましくは重量／容量で約0.01〜約1.5％の間の量で存在する。
【００１６】
適当なフラボノイドには、フラボン、フラボノール、ジヒドロフラボノール、フラボノン、及びそれらの誘導体が含まれる。例示的なフラボノイドには、これらに限定されることなく、アピゲニン及びその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン-３-アセテート、ピノバンクシン-７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン及びその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン(ermanin)、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せが含まれる。これらのフラボノイドの多くが販売され入手可能であるか、または公知の手法に従って容易に合成される。
【００１７】
フラボノイドは、可溶性または表面結合グルコシルトランスフェラーゼ活性を阻害するか、または、う蝕、歯苔形成、歯肉炎、カンジタ症、歯口内炎、アフタ性口内炎、及び／若しくは真菌感染を予防または処理するのに有効な量で存在する。典型的には、これに限定されないが、口腔組成物中に存在するフラボノイドの有効量は、重量／容量で約5％より少ない量である。フラボノイドは、好ましくは重量／容量で約0.01〜約1％の間の量、より好ましくは重量／容量で約0.01〜約0.5％の間の量で存在する。
【００１８】
口腔組成物は、練り歯磨、ゲル、粉末、溶液(例えば、口内洗浄剤、若しくは、歯用リンス液)、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムの形体をとることができる。また、本発明の組成物を含浸したデンタルフロスのように、組成物をデリバリービヒクル上に存在させることもできる。
【００１９】
個々の担体の選択の少なくとも一部は、口腔組成物が取る所望の形体に依存する。適当な担体は、口腔投与のために、感覚刺激適合性であると共に医薬的に許容され得るものである。典型的には、担体には次の物質の1または複数を主要成分として含むであろう：水、グリセリン、エタノール、ソルビトール及びプロピレングリコール等のアルコール、DMSO、治療用ポリマー、並びに澱粉等の粉末。
【００２０】
水を使用する場合、脱イオン化水が好ましい。典型的には、製剤に依存するが、水は約10〜約85重量％の口腔組成物を含むことができる。
【００２１】
ポリマー性デリバリービヒクルは、ポリビニルメチルエーテル及び無水マレイン酸の共重合体、並びにその他の類似のデリバリーを促進させるポリマーを含み得る。
【００２２】
口腔組成物の好ましい態様によると、該口腔組成物は、感覚刺激適合性非ポリマー性担体に分散されたテルペノイド及びフラボノイドの両者の有効量を含む(即ち、実質的にその他のプロポリス成分を含まない)。テルペノイド、フラボノイド、及び非ポリマー性担体は上述の型のものであることができ、上述の量で存在し得る。テルペノイド:フラボノイドのモル比は、約0.1〜約10:1、好ましくは約0.5〜約5:1である。
【００２３】
さらに、本口腔組成物は多数の添加物を含むことができる。添加物には、これらに限定されることなく、研磨剤、ゲル化剤、湿潤剤、抗う蝕性剤、調味剤若しくは甘味料、除痛剤、抗結石剤、美白剤、界面活性剤、結合剤、保存剤、不透明化剤、着色剤、緩衝剤、またはそれらの組合せが含まれる。
【００２４】
歯磨き組成物の場合、典型的には研磨剤が用いられる。適当な研磨剤には、これらに限定されることなく、酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム、リン酸水素カルシウム二水和物または無水物、シリカゲル、ケイ酸ジルコニウム、無水ケイ酸、アルミノケイ酸塩、炭酸カルシウム、ピロリン酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、第三級リン酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸カルシウム、合成樹脂、及びそれらの組合せが含まれる。研磨剤は一般的に、約20〜約90重量％、より典型的には約20〜約60重量％で歯磨き剤に用いることができる。
【００２５】
加工を助けるため、ゲル化剤（即ち、濃縮剤）を種々の組成物に用いることができる。適当なゲル化剤には、これらに限定されることなく、カラギーナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸アルカリ金属、ゴム、ポリビニルアルコール、及びvee gum等が含まれる。典型的には、これらのゲル化剤は約0.3〜約5重量％の量で用いられる。
【００２６】
また、湿潤剤を本口腔組成物、特に練り歯磨き及びゲル、並びに口内リンス液に用いることができる。適当な湿潤剤には、ソルビトール、グリセリン、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール等が含まれる。湿潤剤はまた多くの場合、バルクキャリアーとして用いることができ、その場合、約5〜約90重量％、より典型的には約10〜約60重量％の量で存在させることができる。
【００２７】
抗う蝕性剤（即ち、非フラボノイド抗う蝕性剤）を各形体の口腔組成物において用いることができる。適当な抗う蝕性剤には、これらに限定されることなく、フッ化ナトリウム、フッ化第一スズ、フッ化アミン類、モノフルオロリン酸ナトリウム、トリメタリン酸ナトリウム、トリクロサン、カゼイン、またはそれらの組合せが含まれる。必要であれば、抗う蝕性剤を約0.01〜約3重量％の間、より典型的には約0.02〜約1重量％の間の量で存在させることができる。
【００２８】
調味剤は、口腔組成物の味と嗜好性を増すためにほとんどの口腔組成物において望ましく、よって、使用される可能性がある。適当な調味剤は、調味油(例えば、スペアミント、ペパーミント、ヒメコウジ、サッサフラス、クローブ、セージ、ユーカリノキ、シナモン、レモン及びオレンジの油、サリチル酸メチル等)または甘味剤(例えば、ショ糖、スクラロース、ラクトース、マルトース、キシリトール、サイクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン、アスパラチルフェニルアラニンメチルエステル、サッカリン等)であり得る。調味剤は、個別またはまとめて、約0.1〜約10重量％、より典型的には約0.1〜約5重量％の量で存在させることができる。
【００２９】
除痛剤は、温度刺激、化学物質等に対して感受性の歯を持つ個体を処置するための口腔組成物の或る態様において採用することができる。適当な除痛剤には、これらに限定されることなく、クエン酸カリウム、塩化カリウム、酒石酸カリウム、重炭酸カリウム、蓚酸カリウム、硝酸カリウム、及びストロンチウム塩が含まれる。除痛剤は、個別またはまとめて、約0.1〜約5重量％、より典型的には約0.1〜約3重量％の量で存在させることができる。
【００３０】
抗結石剤は歯石形成を処置するための口腔組成物の或る態様において採用することができる。適当な抗結石剤には、これらに限定されることなく、ピロリン酸アルカリ金属類、次亜リン酸塩含有ポリマー、有機ホスホン酸塩、クエン酸リン酸、及びそれらの組合せが含まれる。抗結石剤は、個別またはまとめて、約0.1〜約5重量％、より典型的には約0.1〜約3重量％の量で存在させることができる。
【００３１】
美白剤を或る形体の口腔組成物において採用することができる。適当な美白剤には、過酸化尿素、過酸化カルシウム及び過酸化水素が含まれる。美白剤は、約0.5〜約5重量％の量で使用することができる。
【００３２】
界面活性剤もまた種々の口腔組成物において使用することができる。アニオン性、非イオン性、カチオン性、及び双極性若しくは両性界面活性剤、またはそれらの組合せを含む多様な型の界面活性剤のいずれを用いることもできる。例示的なアニオン性界面活性剤には、これらに限定されないが、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、スルホン酸α-オレフィン、タウレート、硫酸ラウリルモノグリセリド、スルホン酸ラウリルモノグリセリド、及びそれらの組合せが含まれる。例示的な非イオン性界面活性剤には、これらに限定されないが、TWEEN(登録商標)、ラウロイルジエタノールアミド、ステアリルモノグリセリド、スクロース脂肪酸エステル類、ラクトース脂肪酸エステル類、ラクチトール脂肪酸エステル類、マルチトール脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、及びそれらの組合せが含まれる。例示的な双極性界面活性剤には、これらに限定されないが、ベタイン及びアミノ酸型界面活性剤が含まれる。界面活性剤は、約0.5〜約15重量％、より典型的には約0.5〜約10重量％の量で存在させることができる。
【００３３】
結合剤を、典型的には錠剤またはロゼンジ形体において用いることができる。このような結合剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、アラビアゴム等、並びにポリアクリル酸エステル及びカルボキシビニルポリマー等の合成ポリマーが含まれる。結合剤は、口腔組成物の形体に依存して、約0.5〜約50重量％の量で存在させることができる。
【００３４】
保存剤を口腔組成物の貯蔵特性を高めるために使用することができる。1つの適当な保存剤は安息香酸塩(例えば、安息香酸ナトリウム)であり、安息香酸塩はまた、ある程度のう蝕発生抑制活性を有している。
【００３５】
不透明化剤もまた本発明の種々の口腔組成物において添加することができる。二酸化チタンは、組成物を不透明化する白色粉末である。二酸化チタンは、約0.25〜約5重量％の量で存在させることができる。
【００３６】
また、着色剤を本発明の口腔組成物に添加することができる。着色剤は水性溶液の形体、即ち、およそ1％着色剤を含む水溶液とすることができる。着色剤は約0.01〜約5重量％の量で存在させることができる。
【００３７】
本発明の口腔組成物にはまた、口腔組成物のｐＨアニオン効果を緩衝させて安定性を増すために、緩衝剤及び塩を含んでもよい。このような本発明の口腔組成物のｐＨは、一般的には、約4.5〜約9または10、好ましくは約6.5〜約7.5または8の範囲内にある。ｐＨは酸(例えば、クエン酸若しくは安息香酸)または塩基(例えば、水酸化ナトリウム)で調節するか、または緩衝剤処理（クエン酸ナトリウム、安息香酸、炭酸または重炭酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等により処理）することができる。
【００３８】
本発明の口腔組成物の製剤化は、用いるビヒクルの個々の型に応じて、公知の技術及び手法に従って行うことができる。溶解性が問題となる場合、選択された担体中での活性成分の溶解を増大させるために適当な界面活性剤を採用することができる。口腔組成物の製剤化についての議論は、J.B.Wilkinson及びR.J.Moore編『Harry’s Cosmeticology第7版』(Chemical Publishing of New York, 1982)第609〜617頁に示されており、該文献は本明細書の一部を構成する。
【００３９】
本口腔組成物は、慣例であるように、慣用の手法に従って包装されることが理解される。よって、歯用ゲルと同様に練り歯磨き、歯用クリーム、またはゲル歯磨き剤は、通常、中身を計量しながら供給できるような、実質的には練り歯磨き、歯用クリーム等として説明されるラベルを付けた折りたためるチューブ、または圧搾型、ポンプ型若しくは加圧型ディスペンサーに入っているであろう。口内リンス液は、一般的に、ガラスまたはプラスチック製の瓶に入っているであろう。ロゼンジ及びガムは、当分野において知られるように、個別包装されるか、または透明材により小型包装されるであろう。
【００４０】
本発明の口腔組成物の好ましい使用においては、該組成物は好ましくは定期的（毎日、1若しくは2日おき、または好ましくは日に2〜3回等）に、少なくとも2週間から最大8週間、またはそれ以上、最大生涯にわたって口腔表面に適用される。
【００４１】
本発明の種々の口腔組成物中で用いられているフラボノイド及び／またはテルペノイドの性質により、該口腔組成物は口腔の健康を増進するため、または口腔の健康の減退を抑制するための多数の利用法がある。特に、本発明のこれらの態様では、口腔表面上の微生物集積を阻害するのと同様に、う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎及び／若しくはアフタ性口内炎を処置または阻害することが包含される。基本的に、これらの本発明の態様は、所望の効果(即ち、上記症状の処置または阻害)を達成するために有効な条件下で、口腔表面(例えば、歯、歯肉またはその他の粘膜性表面、舌表面、完全な若しくは部分的な義歯表面等)を本発明の口腔組成物の有効量と接触させることにより行われる。
【００４２】
う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎、及びアフタ性口内炎を含む多数の口腔症状を処置することができる。
【００４３】
う蝕は最も一般的で重要な口腔疾病の形態の一つであり、治療学の発達にも拘らず歯の喪失に到りかねない。歯の表面に形成された歯苔によって生じたう蝕は、歯苔に含まれるプラーク細菌の天然代謝物であり、局所的に徐々に歯の硬い組織から石灰質を除く有機酸により歯の喪失に到る。フッ化物処理は、公衆衛生学をいくらか進展させはしたが、う蝕の予防法をさらに改善することが望まれている。う蝕の原因であるミュータンス連鎖球菌等の微生物の集積を阻害することにより、本発明の口腔組成物を用いてう蝕を阻害または処置することができる。
【００４４】
歯表面上の細菌プラークはまた、歯肉炎及び歯周炎の主要な原因でもある。最近、プラーク中の或る口腔微生物が慢性の歯周病に関連付けられた。歯肉炎と歯周炎の進展を緩和する一つの方法は、プラーク形成を予防または弱めることである。本発明は、本発明の口腔組成物により口腔表面を処置することにより歯肉炎を処置及び阻害する改良法を提供するものである。
【００４５】
カンジタ症と義歯口内炎の2つの症状は、カンジタ菌の侵入と特に関連した症状である。口腔カンジタ症は、義歯を入れた患者、及び免疫抑制を受けているまたはAIDSの患者の2つの集団で頻繁に見受けられる。
【００４６】
AIDS患者の場合、口腔へのカンジタ菌の侵入は通常重症であり、日和見感染の進展及びAIDSが完全に発症する(full blown AIDS)前に起こり、ヒト免疫不全ウイルス感染の最初の徴候の一つである(Kleinら、1984)。現在、この局所的口腔カンジタ症は説明がつかず、また口腔カンジタ症自体が全身性感染の進展に役割をなしているかどうかも知られていない。AIDS患者の粘膜表面における感染の重篤さの為、抗真菌剤は通常、高い用量レベルで処方される。一般的にこのような高用量の抗真菌剤はその毒性の副作用の為望ましいものではない。さらに、処置の失敗がしばしば観察される。
【００４７】
義歯口内炎の患者の場合、抗真菌の処方薬による処置における主な問題点の一つは、市販の抗真菌剤による処置が終了すると直に疾病が再発することである。この再発は、義歯のアクリル樹脂表面に付着し、そこで生長するシー・アルビカンス(C.albicans)を破壊できないことによる(Budtz-Jorgensen、1974)。その結果、義歯は簡単に上顎骨口蓋粘膜表面に再感染し、患者の口腔カンジタ菌感染を開始、維持、及び継続的に悪化させる。
【００４８】
従って、本発明の口腔組成物はカンジタ症及び義歯口内炎を処置または阻害する魅力的な選択肢を提供する。
【００４９】
一般的に口内糜爛とも呼ばれるアフタ性口内炎は、舌、唇、頬、軟及び硬口蓋、歯肉、口内底面、または咽頭の粘膜上に生じる痛みを伴う口腔病変である。アフタ性潰瘍の形成により顕在化するアフタ性口内炎として知られる疾病の可能な病因として幾つかの要因が示唆されている。しかしながら、この疾病は未だに完全には理解されておらず、アフタ性口内炎を生じる要因はまだ探索中である。その原因に拘らず、潰瘍は典型的には5〜21日間維持される。潰瘍はしばしば群れをなして形成され、一つの広範囲にわたる潰瘍化領域へと移り変わる。この病変は、特に疲労時、または、病変により不可能でないにしろ困難になり得る食事の間に極度に痛くなり得る。本発明の口腔組成物の口腔表面における微生物の集積を阻害する能力により、第一にアフタ性潰瘍を処置またはその形成を阻害することによりアフタ性潰瘍の部位における感染の度合いを減少させることができる。
【００５０】
本発明の口腔組成物は、う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎及び／若しくはアフタ性口内炎を処置または阻害するのに特に適していると考えられている。何故なら、テルペノイド及びフラボノイドは、特に組合せて使用された場合に、溶液中または固体表面上に結合されたグルコシルトランスフェラーゼの活性を妨害することができ、さらにグルコシルトランスフェラーゼを産生する微生物を破壊することができる為である。
【００５１】
本発明の口腔組成物はまた、う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎、または歯苔マトリックス形成を促進する微生物の集積を阻害するのに良く適している。集積が阻害される微生物の例としては、これらに限定されないが、乳酸桿菌、アクチノミセス属放線菌、レプトトリキア属細菌、非‐β‐溶血性連鎖球菌、腸球菌、雑多なグラム陽性球菌、ナイセリア属菌、類ジフテリア桿菌、紡錘菌、バクテロイデス、スピロヘータ、酵母(カンジタ属)、及びそれらの組合せが含まれる。
【００５２】
本発明の口腔組成物の別の使用法は、表面結合グルコシルトランスフェラーゼの阻害に関連する。本発明により初めて、可溶性グルコシルトランスフェラーゼと比べて異なる性質を示す表面結合グルコシルトランスフェラーゼ活性の阻害におけるフラボノイドの新規使用法が開示されたと考える。この本発明の目的は、表面結合グルコシルトランスフェラーゼのグルカン形成活性を阻害するのに有効な条件下で、表面結合グルコシルトランスフェラーゼを有効量のフラボノイド、またはフラボノイド及びテルペノイドの組合せと接触させることにより達成され得る。阻害され得るグルコシルトランスフェラーゼには、これらに限定されることなく、エス・ミュータンス（S.mutans） GTF B、エス・ミュータンス GTF C、エス・ミュータンス GTF D、エス・ソブリヌス（S.sobrinus） GTF、及びエス・サンギニス（S.sanguinis） GTFが含まれる。
【００５３】
実施例
以下、本発明の具体例を示すために実施例が記載されるが、これらは本発明の範囲を制限することをいかなる意味でも目的とするものではない。
【００５４】
材料、及び、方法
試験化合物
本研究において使用される化合物は3つのグループに分類される：
1)フラボノイド(フラボノール、フラボン、フラバノン及びジヒドロフラボノール)、2)桂皮酸誘導体、並びに3)テルペノイド。
フラボノール(ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン)、フラボン(アピゲニン、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン)、フラバノン(ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン)、桂皮酸誘導体(フェルラ酸、ｐ-クマル酸、コーヒー酸)、及びテルペノイド(tt-ファルネソール、β-カリオフィレン、テルピネオール、シリンガアルデヒド)の全てはExtrasynthese Co.（Genay-Sedex,フランス）より入手した。プロトカテク酸、バニリン、クロルヘキシジン(CHX)、フッ化ナトリウム、及び安息香酸はSigma-Aldrich Co.（マサチューセッツ）より得た。ジヒドロフラボノール、ピノバンクシン、ピノバンクシン-7-メチルエーテル、及びピノバンクシン-3-アセテートはE.Wollenweber博士（ダルムシュタット、ドイツ）より親切にも提供された。
【００５５】
動物実験(下記、実施例2参照)では、単一の濃度として1.33mM(0.035%アピゲニン及び0.028％tt-ファルネソール、重量/容量)について、陽性コントロール0.12％CHX(1.33mMに相当)と共に試験した。
【００５６】
全ての化学物質は、分析を行う直前にDMSO:エタノール(1:4、容量/容量)またはエタノール(99.9％、HPLCグレード)に溶解した。常に、適当な溶媒コントロールを設けた。表1に本試験において用いた全ての試験化合物及びその化学構造をまとめる。
【００５７】
（表１）研究に使用した化合物の化学構造

^aこれらの化合物は、Apis melliferaプロポリス中には同定されなかった。
【００５８】
細菌株
GTFの産生に用いられた細菌株は次のものであった：
1)Streptococcus mutans GS-5のgtfB遺伝子を含むエス・ミレリ(S.milleri)KSB8（GTF B産生用）、
2)S.mutans GS-5のgtfD遺伝子を含むS.milleri NH5（GTF D用）、
3)GTF B、D及びフルクトシルトランスフェラーゼの遺伝子が欠失されたS.mutans WHB410（Wunder及びBowen、1999）（GTF C用）、並びに
4)S.sanguinis 10904。
感受性及び時間-殺菌分析には次の細菌株を用いた：
1)S.mutans GS-5、2)S.mutans UA159、及び3)S.sobrinus 6715。
抗細菌分析には次の細菌株を用いた：
1)S.mutans UA159、及び2)S.sobrinus 6715。
培養物は、20%グリセロールを含む脳-心臓浸出物(BHI)またはトリプシン大豆ブロス(TSB)中、-80℃で貯蔵された。S.milleri構築物は、Howard K.Kuramitsu博士(SUNY、バッファロー、NY)からの親切な贈り物であり、S.mutans UA159はRobert E.Marquis博士（ロチェスター大学、ロチェスター、NY）より得た。
【００５９】
GTF 酵素
全ての精製手順は、プロテアーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオライド-PMSF(1mM、最終濃度)、及び保存剤としてNaN₃(0.02%、最終濃度)を含むバッファーを用いて行った。どちらの試薬も酵素活性または安定性にいかなる有害な効果を有さなかった。
【００６０】
Venkitaramanら(1995)及びVacca-Smithら(2000)により記載されるように、GTF B、D及びSsを培養上清より得、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーによりほぼ均質に精製した。S.mutans WHB410からのGTF C単離のため(Wunder及びBowen、1999)、透析管中で生育させたS.mutans WHB410(S.mutans UA130のftf- gtfD- gtfB-誘導体)の低分子ブロス(分子量10kdのカットオフ膜により限外濾過された2.5％トリプトン、1.5%酵母エキス、0.3%グルコース、0.1%フルクトース、及び0.1%ソルビトール)培養物より細胞ペレットを回収した(Schilling及びBowen、1988)。1mM PMSF及び0.02%アジ化ナトリウムを含む20mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)中で細胞を2度洗浄した。その後、0.1％TritonX-100、2M尿素、500mM NaCl、0.02%アジ化ナトリウム、及び1mM PMSFを含む30mlの50mMリン酸カリウムバッファー(pH7.5)中に再懸濁し、25℃でゆっくりと振盪しながら2時間インキュベートとした。細胞懸濁液を、4℃において10,000gで15分間遠心した。上清をGTF Cの供給源として慎重に回収し、1mM PMSF及び0.02％アジ化ナトリウムを含む50mMカリウムバッファー(pH7.5)に対して透析した。透析した調製物を、Venkitaramanら(1995)に詳述されるように、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００６１】
酵素調製物の純度は、Hoefer Mighty Small SE245システム(Hoefer Scientific Instruments、サンフランシスコ、CA、USA)中でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、及び銀染色(Morrisey、1981)により分析した。染色前スタンダードは、BioRad Laboratoriesより購入した。蛋白質濃度は、Lowryら(1951)の方法に従って、ウシ血清アルブミン(Sigma Chemical Co.,セントルイス、MO)を標準曲線を描くために用いて決定した。
【００６２】
グルコシルトランスフェラーゼ活性は、標識ショ糖(NEN Research Products、ボストン、Mass.)からグルカンへの[¹⁴C-グルコース]の取り込みによって測定した(Germaineら、1974；Venkitaramanら、1995)。分析のために各試料中に加えたGTF酵素は、1.0〜1.5μmolのグルコースを4時間の反応で取り込むのに必要とされる量(1.0〜1.5ユニット)と同等であった。
【００６３】
[ 実施例１ ] 溶液中及び唾液被覆ヒドロキシアパタイト表面分析物上に吸着された GTF 活性に対するテルペノイド及びフラボノイドの効果
溶液分析のため、精製GTF B、C、D及びSsを試験化合物の一連の2倍希釈物(125〜500μMの濃度)と混合し、[¹⁴C-グルコース]-ショ糖基質(0.2μCi/ml)(吸着バッファー50mM KCl、1.0ｍM KPO₄、1.0mM CaCl₂、0.1mM MgCl₂-pH=6.5中、200.0mmol/lショ糖、40μmol/lデキストラン9000、0.02％アジ化ナトリウム)と共に100mmol/lショ糖(最終容量200μl)の最終濃度に達するまでインキュベートした。コントロールとして、試験薬溶液をエタノール：DMSO(最終濃度7.5％及び1.25％、容量/容量)、またはエタノール(最終濃度5％、容量/容量)に代えて同じ反応を行った。試料を37℃で振動させながら4時間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷エタノール(1.0ml)を添加し、グルカンが沈澱するよう試料を18時間、4℃で保存した。放射性同位元素により標識されたグルカンはシンチレーション計数により測定した(Germaineら、1974；Venkitaramanら、1995)。
【００６４】
表面分析のため、GTFは浄化全唾液(GTF活性無し)により被覆されたヒドロキシアパタイトビーズ上に、他の文献に詳述されるように(Kooら、2000c；Schilling及びBowen、1988；Venkitaramanら、1995)吸着させた。唾液被覆ヒドロキシアパタイト(sHA)ビーズは、実験的に決定された表面を飽和させるのに十分な酵素に曝露された。酵素の吸着に続いて、ゆるく結合された材料を除くためビーズを3回バッファーにより洗浄し、上述した同じ濃度の300μlの試験化合物の一連の2倍希釈物(またはコントロール)に対して30分間曝露した。ビーズを洗浄し、300μl[¹⁴C-グルコース]-ショ糖基質(100.0mmol/lショ糖、最終濃度)に曝露した。形成された放射性同位元素により標識されたグルカンを回収し、シンチレーション計数により定量した(Germaineら、1974；Venkitaramanら、1995)。全ての溶液及び表面分析は、少なくとも3回の異なる4連実験により行った。
【００６５】
最も活性な化合物のGTF活性に対する効果を以下、表2及び3に示す。一般的に、フラボノール及びフラボンは500μMの濃度において、溶液中(40〜95％阻害)及び表面上(15〜60％阻害)の全ての酵素の活性を減少させた。中でも、アピゲニン(5,7,4’-トリヒドロキシフラボン)は、最も強いGTF活性阻害を示した。500μM(135μg/ml)という低い濃度で、アピゲニンは溶液中の全ての種類のGTFの活性を90.5〜95％阻害した。表面吸着酵素に対するアピゲニンの阻害効果は、同じ酵素が溶液中に存在した場合に観察された場合程強くはなかった。それにもかかわらず、アピゲニンは効果的な阻害剤であった(500μMの濃度で30〜60％阻害)。アピゲニンのGTFに対する阻害効果を図1に示す。アピゲニンは、溶液中に存在する全ての種類の酵素活性を、反応試験中に添加された量に正比例して減少させた（r²値は0.92〜0.99の範囲であった）。溶液中のGTFに対するアピゲニンのIC₅₀(酵素活性を50％阻害するのに必要とされる試験化合物濃度)は、58(16μg/ml)〜98μM(26μg/ml)の間であった。表面吸着酵素に対するIC₅₀の方が著しく高く、GTF B及びCに対するIC₅₀値は478μM(128μg/ml)及び458μM(122μg/ml)であり、GTF D及びSSに対するそれは＞1mMであった。この薬剤については、表面吸着GTF D及びSsに対するIC₅₀は到達できないと考えられる。表面吸着されたGTF B及びCは、試験された全ての濃度において、GTF D及びSsよりも有意に多く阻害された(p＜0.05)。また、フラボンであるバイカレイン、並びに、フラボノールであるミリセチン及びラムネチンも、溶液中のGTF(500μMで70〜90％)、及び、唾液被覆ヒドロキシアパタイト表面上に吸着されたGTF(500μMで19〜40％)の効果的な阻害剤であることが示された。
【００６６】
最も高い活性の化合物(アピゲニン)について、全てのGTFに対する阻害曲線(濃度‐活性；62.5μM〜1mMの範囲の濃度)をプロットし、回帰曲線よりIC₅₀値(酵素活性を50％阻害するのに必要とされる試験化合物濃度)を計算した(Copeland、2000)。この分析では、4×2×7要因図(factorial scheme)（酵素×状態×用量）に一方向配置実験的様式(one-way layout experimental design)を用いた。分散分析を行い、Tukey試験により5％のレベルを有意とし(p＜0.05)、質的処置を比較した。異なる濃度における効果を評価するために非線形回帰を適用した。結果を図2A〜Bにまとめる。
【００６７】
（表２）溶液中及びsHA表面に吸着した連鎖球菌GTF活性に対する選択されたフラボン及びフラボノールの効果^ａ

^ａデータは平均値(±ＳＤ)で示される。％阻害はコントロールを最大ＧＴＦ活性(100％)として計算した。
【００６８】
（表３）溶液中及びsHA表面に吸着した連鎖球菌GTF活性に対する選択されたフラバノン及びジヒドロフラボノールの効果^ａ

^ａデータは平均値(±ＳＤ)で示される。％阻害はコントロールを最大ＧＴＦ活性(100％)として計算した。
【００６９】
[ 実施例 2] 抗細菌活性の決定
臨床実験室基準連邦委員会(National Committee for Clinical Laboratory Standard)ガイドライン（試案標準M26-T、1992；NCCLS Publication No. M7-A5、2000）及びKooら（2000b）に従って、各試験化合物についての最小阻害濃度(ＭＩＣ)及び最小殺菌濃度(ＭＢＣ)を決定した。抗細菌試験には、ブイヨンマイクロ希釈及びマクロ希釈法（TSB中）を用いた。最初の接種物は5×10⁵CFU/mlであり、試験化合物濃度は15.6〜500μMの範囲であった(2倍希釈)。MIC及びMBCは、少なくとも3回の異なる4連試験により決定された。
【００７０】
この研究で試験されたフラバノン、ジヒドロフラボノール、並びに、幾つかのテルペノイド(tt-ファルネソール及びβ-カリオフィレン)は、穏やかな阻害効果(500μMの濃度で、溶液中GTFについて8〜45％、そして表面GTFについて7〜24％)を示した。桂皮酸誘導体は、GTF酵素に対してごくわずかな効果を示した。場合により、例えば、桂皮酸誘導体及び幾つかのテルペノイド(例えば、プロトカテク酸、テルピネオール) によりGTF活性は増幅された。
【００７１】
試験化合物のS.mutans(GS-5及びUA159)並びにS.sobrinus 6715に対するMIC及びMBC値を以下の表４に示す。tt-ファルネソール(テルペノイド)と同様にフラバノン及びジヒドロフラボノールのうちの或る物は、抗細菌活性を示した。全てのフラバノンが細菌の生育を阻害した。中でも、ピノセンブリンが、全ての試験された株に対し250μM(64μg/ml)のMIC値を示し最も効果的であった。ピノセンブリンは、S.sobrinus 6715に対して500μM(128μg/ml)で殺菌効果を示した。ジヒドロフラボノールのピノバンクシン-3-アセテートもまた、S.sobrinus 6715及びS.mutans株の生育を阻害した(MIC値500μMまたは157μg/ml)。全ての試験化合物中、tt-ファルネソールが最も効果的な抗細菌剤であった。S.mutans株に対するMIC値は125μM(28μg/ml)であり、S.sobrinus 6715に対するMIC値は62.5μM(14μg/ml)であった。MBC値は、S.mutans株に対し500μM(112μg/ml)、S.sobrinus 6715に対し250μM(56μg/ml)であった。クロルヘキシジン(陽性コントロール)は、1.1〜2.2μM(1〜2μg/ml)のMIC値、8.9μM(8μg/ml)のMBC値となった。フラボノール、フラボン及び桂皮酸誘導体は、バイカレイン(MIC値500μM)を除いて、本分析で用いた濃度ではいかなる抗細菌活性も示さなかった。
【００７２】
（表４）ミュータンス連鎖球菌株に対する抗細菌化合物のMIC値及びMBC値^ａ

^ａ値はμM。
クロルヘキシジン(陽性コントロール)は、1.1〜2.2μM(1〜2μg/ml)の間のMIC値、8.9μM(8μg/ml)のMBC値を示した。
ケンフェライド、ケンフェロール、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、フィセチン、ルチン、アピゲニン、アカセチン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、フェルラ酸、p-クマル酸、コーヒー酸、β-カリオフィレン、テルピネオール、シリンガアルデヒド、プロトカテク酸、バニリン、安息香酸、ピノバンクシン、ピノバンクシン-7-メチルエーテルは500μMより大きいMICであった。
【００７３】
最も高い抗細菌活性の化合物について、時間-殺菌研究をブイヨンマクロ希釈法(National Committee for Clinical Laboratory Standards、試案標準M26-T、1992)により行った。S.mutans GS-5及びUA159、並びにS.sobrinus 6715の最初の接種物は1〜5×10⁶CFU/mlであった。抗細菌剤の最終濃度は、MIC(またはMBC値)の4倍であった。TSB中の微生物及び試験化合物を含む試験管を5％CO₂中37℃でインキュベートした。生存数を調べるために、0及び30分、並びに1、2、4、8及び24時間目に試料をに採取した。連続希釈物(10^-1〜10^-4)を滅菌0.9％塩化ナトリウム溶液で調製した。希釈した試料(50μl)をトリプシン大豆寒天上に、スパイラルプレーター(Autoplate model 3000、Spiral Biotech, Inc.、ベセズダ、Md.)を用いて植菌した。プレートを5％CO₂中37℃で、48時間インキュベートし、コロニー数を数えた。致死曲線は、log₁₀CFU/mlに対して24時間にわたる時間をプロットすることにより作成した。全ての分析は、少なくとも3回の4連実験で行った。CFU/mlについて、元の接種量からの≧3log₁₀の減少を殺菌効果として定義した。誤った低い生存数をもたらす薬剤の持ち越しは、接種物の希釈、及び少量(50μｌ)の希釈試料を植菌することにより最小限にした。さらに、薬剤の持ち越しを示す証拠は植菌した最も低い希釈(10^-1)でも検出されなかった。
【００７４】
時間-殺菌反応速度研究の結果を図１にまとめる。MIC(またはMBC)の4倍量のtt-ファルネソールは、ミュータンス連鎖球菌の生存数を30分以内から1時間のインキュベーションによりに迅速に減少させた（１log CFU/mlの減少）。tt-ファルネソールは、4〜8時間の間のインキュベーションにより、S.sobrinus 6715及びS.mutans株に対して殺菌効果を発揮した(CFU/mlで、≧3logの減少)。8.9μM(MBC)でクロルヘキシジンは、8時間のインキュベーション後、試験されたミュータンス連鎖球菌株に対して殺菌効果を示した。
【００７５】
実施例１及び２についての議論
う蝕は、薄膜中に酵素的に活性なGTFが存在する歯薄膜-プラーク界面において生じる事象に起因するため、表面吸着GTFに対する潜在的阻害剤の効果を決定することは明らかに望ましいことである。
【００７６】
以前、プロポリスが唾液腺を除去したラットにおけるう蝕を減らすことが証明された(Kooら、1999)。そこで本発明では、単独及び／または組合せにより、う蝕及びその他の口腔症状の病因に関連するう蝕原生細菌の生育及びGTF活性を阻害できるプロポリス中の特定の化合物を同定することを目的とした。これが、GTF酵素及びミュータンス連鎖球菌の生長の新規阻害剤を同定するための最初の段階であった。本研究により得られた結果では、GTF及び細菌の生育に対する以前報告されているプロポリスの効果の原因であるかもしれない化合物のうちの幾つかが同定された(Kooら、2000a；Kooら、2000b；Kooら、2000c；Parkら、1998)。一般に、フラボノイドが最も活性な化合物であり、独特な生物学的特性を示した。フラボン及びフラボノールは、効果的なGTF阻害剤であったのに対し、フラバノン及びジヒドロフラボノールであるピノバンクシン-3-アセテートは抗細菌活性を示した。
【００７７】
4’,5,7-トリヒドロキシフラボンであるアピゲニンは、最も効果的なGTF、特にGTF B及びCの阻害剤であった。現在、市販されている口内リンス液を含むこれまで試験された公知のGTF阻害剤の多くは、表面吸着GTFの活性を効果的に阻害することができなかった(Vacca-Smith及びBowen、1997；Wunder及びBowen、1999)。それに対して、500μMもの低い濃度においてアピゲニンは、酵素を表面に吸着前または吸着後に曝露するかには拘りなくGTF、特にGTF B及びCを強く阻害した。このようなレベルの阻害は以前には観察されていないものである(Vacca-Smith及びBowen、1997；Wunder及びBowen、1999)。アピゲニンによるGTF B及びCの効果的な阻害は、どちらか一方または両方のGTF産生が欠如するミュータンス連鎖球菌の変異体において観察される平滑面う蝕の減少と一致して、う蝕に関連する歯苔の潜在的病原性に影響するかもしれない(Yamashitaら、1993)。
【００７８】
アピゲニンは、多様な抗腫瘍及び抗炎症効果を発揮する非突然変異誘発性のフラボノイドである(Liangら、1999；McVeanら、2000)。しかしながら、上記のデータは、アピゲニンがGTF活性の潜在的阻害剤であることを示す最初のデータであると思われる。アピゲニン及び関連するフラボノイドがGTF活性を阻害する正確な機構は現在のところ不明であるが、本研究で報告されるデータにより阻害作用の様式を理解するための幾ばくかの洞察力が与えられる。この理論に縛られる訳ではないが、GTFの阻害はフラボノイドの分子構造及び酵素の物理的状態に依存していると考えられている。C2位及びC3位の間に不飽和二重結合を有するフラボン及びフラボノール(表１参照)は、GTF活性の著しい阻害を示した。それに対して、C2-C3に二重結合を欠くフラバノン及びジヒドロフラボノールは、控えめな阻害活性しか示さなかった。以前の研究の結果から、フラボン及びフラボノールは、幾つかの哺乳動物酵素の阻害に関連する主要なフラボノイドであることが示されている。これは、C2-C3二重結合が最大阻害効果に必須であるかも知れないことを示唆している(Eatonら、1996；Wheeler及びBerry、1986)。C2-C3二重結合の存在は、GTF中の側鎖アミノ酸からの求核付加のための部位を提供するのかもしれない。幾つかのアミノ酸残基、特にアスパラギン酸がGTFの触媒活性の発現に必須であると同定されている(Katoら、1992；Mooserら、1991)。アスパラギン酸の側鎖(CH₂COOH)が求核基として作用してフラボン及びフラボノールと反応し、GTF阻害が起こる可能性もある。表面吸着GTF酵素の示す耐性は、吸着酵素及び可溶性形態の酵素の間の物理的／動力学的特性及び合成される産物の違いと一致する、吸着工程により受けるGTFの構造的変化と関連しているのかも知れない(Kopecら、1997；Schilling及びBowen、1988；Venkitaramanら、1995)。
【００７９】
プロポリス由来の幾つかの化合物がミュータンス連鎖球菌の生育を阻害した。しかしながら、それらの化合物のどれも、臨床的に立証された抗菌薬であるクロルへキシジンほど強力では無かった。試験された化合物のうち、tt-ファルネソールが最も効果的な抗細菌剤であり、ミュータンス連鎖球菌の生存数を迅速に減少させた。この観察結果は、ファルネソール及び他の分類に属する多様な関連化合物の抗菌活性についての従来の報告と一致する(Bardら、1988；Dionigiら、1991)。ファルネソール等のテルペンは、膜機能を阻害し、最終的に細胞の生存力を減少させる(Bardら、1988)。高濃度(＞10mM)のtt-ファルネソールで処理された連鎖球菌が、位相差顕微鏡で見ることができる細胞膜の破壊を示すことは注目すべきことである。より低い濃度(例えば、0.5mM)のtt-ファルネソールでも、分子レベルにおいて連鎖球菌の膜が影響を受けるかどうかについてはさらに解明する必要がある。最近、ファルネソールは、定足数検出分子(quorum-sensing molecule;QSM)活性を示す抗真菌剤であることが示された(Hornbyら、2001)。
【００８０】
上述のデータは、う蝕予防(Kooら、1999)等のプロポリスの生物学的活性が、Amorosら(1992)及びBonheviら(1994)により示唆されるように、単一化合物というよりも幾つかの化合物の効果によるという仮説を支持するものである。アピゲニン及びtt-ファルネソールは、プロポリス中の活性化合物である。本研究で使用される濃度は、局所適用により口内で容易に達成できるかもしれない。これらの化合物の毒理学はここでは詳細に研究されなかったが、アピゲニンまたはtt-ファルネソールが潜在的な細胞毒性または溶血効果を有するとの報告は存在しない。
【００８１】
[ 実施例３ ] 生物膜中での抗細菌分析
実施例1及び2に示されたデータを補うため、S.mutans UA159及びS.sobrinus 6715の生物膜を時間‐殺菌研究に使用した。生物膜は標準的な顕微鏡用ガラススライド上に5日間のバッチ培養中で形成させた(Curranら、1998)。ミュータンス連鎖球菌の細胞を1％(重量/容量)ショ糖を添加したトリプトン‐酵母エキス培養液中、37℃及び5％CO₂下で生育させた。典型的には、5日齢の生物膜は各スライド当たりおよそ10⁹コロニー形成単位(CFU)となった。致死分析はPhanら(2000)の方法によって行った。簡単にいうと、5日齢の生物膜は、DMSO：エタノール(10％及び0.625％、容量／容量)を含む塩溶液(50mM KCl、1mM MgCl₂、pH7.0)中の試験薬剤(最終濃度1.33mM)に、25℃で曝露された。一定の間隔で生物膜を採取し、0.89％NaCl溶液に懸濁し、Branson Sonifier450による超音波処理に付した(5秒の間を置いた各3回の50ワットの10秒間パルスを2回)。実験的に決定された最大回収数をこの超音波処理により得ることができた。ホモジェナイズした懸濁液を連続的に希釈し（10¹〜10⁴）、トリプシン大豆寒天または血液寒天培地上にスパイラルプレーター(Autoplate model 3000、Spiral Biotech, Inc.、ベセスダ、Md.)を用いて植菌した。プレートを5％CO₂下、37℃で48時間培養し、コロニー数を計測した。致死曲線は、4時間にわたる時間に対してlog₁₀CFU/mlをプロットすることにより描いた。全ての分析は、少なくとも3つの異なる4連実験により行った。殺菌効果は、0時間における最初の生存数からの≧3log₁₀CFU/mlの減少と定義した。誤った低い生存数をもたらす薬剤の持ち越しの可能性は、接種物の希釈、及び少量(50μｌ)の希釈試料を植菌することにより最小限にした。さらに、植菌に用いた最も低い希釈(10^１)でも薬剤の持ち越しは検出されなかった。
【００８２】
アピゲニンのグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)活性に対する効果を図３に示す。1.33mM(0.035％)のアピゲニンは、酵素が溶液中(90〜95％阻害)にあるか、または表面上(60〜70％)に存在するかに拘らずGTFの強力な阻害剤であった。tt-ファルネソールの酵素活性に対する効果は無視できる程度であった(10〜20％)。クロルヘキシジン(CHX)は、穏やかな効果しか示さなかった(溶液中で30〜45％阻害、表面上で10〜20％阻害)。それに対して、tt-ファルネソール及びCHXの両方が、図4に表されるようにS.mutans及びS.sobrinusの生物膜に対して抗細菌活性を示した。1.33mM(0.028％)のtt-ファルネソールは、ミュータンス連鎖球菌の生存数を減少させ、2〜4時間の培養後に1log₁₀CFU/mlの減少を示した。1.33mM(0.12％)のCHXは、tt-ファルネソールよりも生物膜の生存を減少させるのにより効果的であった(同じ培養時間で2〜3log₁₀CFU/mL)。試験した抗細菌剤のうちミュータンス連鎖球菌生物膜に対して完全に殺菌性のものはなかった。アピゲニンは、ミュータンス連鎖球菌に対する抗細菌効果を欠いていた。
【００８３】
[ 実施例４ ] 動物のう蝕阻害
以前記載されたように動物実験を行った(Bowenら、1988)。10匹の雌Sprague Dawleyラットの14日齢の7腹子を母畜と共にCharles River(キングストン、NY、USA)より購入した。S.sobrinus 6715の活発に生長するオーバーナイトカルチャーを用いて母畜を感染させた。離乳後、21日齢の仔を無作為に6つの群に分け、以下のようにラクダ毛ブラシを用いて日に2回、歯を局所的に処理した：
1)0.028％tt-ファルネソール(1.33mM)；
2)0.035％アピゲニン(1.33mM)；
3)ビヒクルコントロール(1.25％DMSO含有25％エタノール)；
4)250ppm F；
5)tt-ファルネソール＋アピゲニン(1.33mM)；及び
6)0.12％クロルヘキシジン(1.33mM)。
11または12匹の動物からなる各群に、随意、NIHdiet2000（56％ショ糖を含む）(Keyes、1959)及び5％ショ糖水を与えた。実験は5週間にわたり、5週間後、動物をCO₂窒息により殺した。左下顎を無菌的に切開し、5.0mLの滅菌塩溶液に懸濁し、超音波処理(5秒の間隔を置いて30ワットの10秒間パルスを3回；Branson Sonifier 450)した。S.sobrinus個体数を評価するためにストレプトマイシンを加えたMitis Salivarius寒天上に、そして、全培養可能なフロラ(TCF)を計測するために血液寒天上に懸濁液を播いた。う蝕は、カイズシステム（Keyes’s system）のLarson改良法(Larson、1981)に従って評価した。う蝕数の計測は、顎を符号付けし、一人の検定試験員によりブラインドで行われた。データはJMPバージョン3.1(SAS Institute Inc., 1989)の統計的視覚化のためのソフトウェアを用いてANOVA、全ての対についてのTukey-Kramer HSD試験に付した。平滑面及び溝う蝕数は、可能な最大値(124及び56)に対する割合として表した。5％を有意なレベルとした。
【００８４】
（表５）ラットにおけるストレプトコッカス・ソブリヌス6715の割合に対する処理効果

【００８５】
5週間にわたる実験の間、ラットは見かけ上健康であった。処理群間で、体重増加は有意に相違しなかった(p＞0.05)。平滑面う蝕の発生及び重篤さに対する処理の効果を図５に示す。tt-ファルネソール＋アピゲニン(60％減少、カイズ値:3.3±3.7)、フッ化物(72％、2.3±3.0)、及びクロルヘキシジン(75％、2.0±1.9)群では、コントロール群に比べて有意に平滑面う蝕の発生が抑制された(p＜0.05)。平滑面う蝕の重篤度は、コントロールと比べ、アピゲニン、アピゲニン＋tt-ファルネソール、フッ化物、クロルヘキシジン(Ds及びDmレベル)、並びにtt-ファルネソール(Dm)で処理された群において有意に低かった(p＜0.05)。溝表面う蝕の発生及び重篤さは、図６に示されるように、フッ化物及びクロルヘキシジン処理のみにより抑制された(p＜0.05)。アピゲニン及びtt-ファルネソールの組合せは、コントロールと比べた場合、各化合物単独よりも有意に良い結果を示した(p＜0.05)。ラットの顎より回収されたS.sobrinusの割合は、全培養可能なフローラおよびS.sobrinus個体数より計算した。tt-ファルネソール＋アピゲニン、またはクロルヘキシジンで処理した群は、コントロール群と統計的には相違しなかったものの(p＞0.05)、最も低いレベルのS.sobrinusによる感染を示した(表５)。
【００８６】
グルコシルトランスフェラーゼは、例えばファルネソールのような抗細菌または抗真菌剤等の有害作用から微生物を守ることができるカプセル様の物質であるグルカンを合成する。グルカン形成を妨げることにより、ファルネソール等の抗細菌または抗真菌剤の、これら薬剤が作用することが意図された微生物との接触しやすさが増幅され、それによりそれらの効力が増幅されると考えられている。
【００８７】
データは、アピゲニン(0.035％、重量／容量)、及び、より低い度合いではあるがtt-ファルネソール(0.028％)が、低濃度でも平滑う蝕に対してう蝕発生抑制効果を奏することを明らかに示している。しかしながら、臨床的に立証されている抗う蝕剤であるクロルヘキシジン(0.12％、容量／容量)及びフッ化物(250ppm)ほどどちらも強力ではなかった。アピゲニン及びtt-ファルネソールは、特異な生物学的特性を示した。アピゲニンの抗う蝕機構は、異例の、溶液中及びsHA上に吸着されたGTF活性の両方への阻害効果に関係しているのかもしれない(図３)。以前の研究により、GTF、特にGtf B及びCの産生を調節する遺伝子の欠失により、S.mutansの毒性が劇的に減少することが示されている(Yamashitaら、1992)。アピゲニンは、GtfB及びC酵素の活性を効果的に阻害し、さらに動物を用いた実験でもう蝕の発生を抑制する特性を示した(図5)。この観察は、1つまたは両GTFの産生に欠陥を有するミュータンス連鎖球菌の変異体を用いて観察された平滑面う蝕の減少(Yamashitaら、1992)と一致している。アピゲニンは、ミュータンス連鎖球菌に対して抗細菌活性を有さないので、細胞外グルカン合成を減らすことによりう蝕に関連するう蝕の潜在的病原性に作用したのかもしれない。
【００８８】
以前の研究の結果から、tt-ファルネソールがインビトロにおいてS.sobrinus及びS.mutansの浮遊細胞に対して殺菌活性を奏することが示された(Kooら、2001)。しかしながら、ミュータンス連鎖球菌細胞膜に対するその効果は、それほど明らかではなかった(図４)。Gilbertら(1997)及びLewis(2001)により最近概説されているように、懸濁液中の細胞(浮遊状態)と比較して、生物膜の方が抗菌剤に対してより耐性であることが示されている。tt-ファルネソール(1.33mMで)の穏やかな生物膜への効果により、ラットにおけるS.sobrinus感染の割合を減らす効果の欠如を説明できるかも知れない。それにもかかわらず、tt-ファルネソールはDsレベルにおいて平滑面う蝕の重篤さを減らすことができた。ファルネソール等のテルペンは、膜機能を妨げ、結果的に細胞の生存力を減らすと報告されてきた(Bardら、1988)。しかしながら、連鎖球菌細胞膜を壊すには高濃度のtt−ファルネソール(＜10mM)が必要とされる(Kooら、2001)。
【００８９】
アピゲニン及びtt-ファルネソールの組合せは、これらの化合物単独よりも強くう蝕の発生を抑制した。う蝕の発生抑制における、アピゲニン及びtt-ファルネソールの相互作用の動力学は現在のところ調べられていないが、本研究において報告されたデータはこれらの阻害活性の様式を理解する上で多少の洞察を与える。アピゲニンによるグルカン合成の阻害は、プラークにおける生物量を減少させ、さらに、tt-ファルネソールに対する細胞膜の感受性にも影響するようである。この観察は、アピゲニン及びtt-ファルネソールの組合せで処理されたラットにおける、tt−ファルネソールのみで処理されたものと比べて低いレベルでのS.sobrinus感染の説明となるかも知れない(p＜0.05)(表5)。続いての研究により、アピゲニン、tt-ファルネソール、並びにアピゲニン及びtt-ファルネソールの組合せが生物膜の形成を阻害することが証明された。上記に報告される結果と一致して、アピゲニン及びtt-ファルネソールの組合せは、アピゲニンまたはtt-ファルネソール単独よりも効果的であった。
【００９０】
陽性コントロールであるCHX及びフッ化物は、平滑面及び溝表面う蝕の発生を効果的に抑制し、それにより選択した方法の正当性を裏付ける。CHXの抗プラーク効果は、その抗菌活性及び口腔独立性に大いに依存すると考えられている。CHXは、細菌の細胞壁と同様に口腔の軟及び硬組織と結合する陽イオン性物質である(Rolla及びMelsen、1975；Jones、1997)。本研究において、CHXは、殺菌性ではないにも拘らず、ミュータンス連鎖球菌生物膜の生存力を減少させた(図４)。このデータは、CHXより処理された群においてより低いレベルのS.sobrinus感染が検出された動物実験の結果を裏付ける。フッ化物(250ppm)は、S.mutansの酸耐性及び酸産生を抑制するかもしれないが(Marquis、1990、Belliら、1995)、ここで測定されたように検出可能な抗菌活性及び抗GTF活性を有さない。それにもかかわらず、フッ化物は今日知られている最も有効な抗う蝕剤である(Rollaら、1991；Clarksonら、2000)。フッ化物の主要な効果は、歯のエナメル質の脱灰の抑制及び再石灰化の増幅によりう蝕の発達を物理化学的に妨害することであるとのコンセンサスがある(Dawes及びtenCate、1990)。よって、毒性因子及び／またはう蝕を発生させる細菌の代謝に作用する物質は、フッ化物の抗う蝕発生効果を増加させるかもしれない。アピゲニンはそのような薬剤であり得る。
【００９１】
上述のデータは、プロポリス由来の2つの天然化合物が、低濃度でも動物モデルにおいてう蝕発生を抑制することを明らかに示す。アピゲニンは、GTFを阻害する能力を基礎とした最初の天然のう蝕発生抑制剤であることが示された。アピゲニンは、他の臨床的に立証された薬剤と比べて特異な作用機構を有する有望な抗う蝕化合物である。
【００９２】
参考文献一覧表
以下に列挙される参考文献は、その全内容が本明細書の一部を構成する。
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【００９３】
実例を示すために本発明の詳細に説明したが、これらの詳細は実例を示すという目的の為のみに記載されたものであり、当業者であれば、特許請求の範囲に定義される本発明の意図及び範囲から外れることなくこれらの詳細に変更を加えることができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、MIC(またはMBC)の4倍のtt-ファルネソールによるミュータンス連鎖球菌株についての時間-殺菌曲線を示すグラフである。ミュータンス連鎖球菌(Streptococcus mutans) GS-5（▲/△）、ミュータンス連鎖球菌(S. mutans) UA 159（●/○）、ミュータンスレンサ球菌 (S. sobrinus) 6715（黒ぬり四角/白ぬり四角）。
【図２】図２A-Bは、溶液中(２A)、及び唾液被覆ヒドロキシアパタイト(sHA)表面に吸着された(２B)連鎖球菌GTFの活性に対するアピゲニンの効果を示すグラフである。GTF B(◆)、GTF C(黒ぬり四角)、GTF D(△)、GTF Ss(○)。データは平均値(±SD)で示される。コントロール(DMSO:EtOH、最終濃度7.5％及び1.25％ (容量／容量))を最大GTF活性として、阻害率を計算した。アピゲニンの各濃度において、印(＊またはδ)の付された平均値は互いに有意差を有しない(P＜0.05)。
【図３】図３は、溶液中、及び唾液被覆ヒドロキシアパタイト表面に吸着されたGTFの活性に対するアピゲニン(1.33mM)の効果を示すグラフである。白い棒は溶液分析を、印をつけた棒は表面分析を示す。コントロール(溶質)を100％GTF活性として、阻害率を計算した。tt-ファルネソール(1.33mM)、クロルヘキシジン(1.33mM)、及びフッ化物(250ppm)は、無視できるまたは穏やかな阻害効果を示した。
【図４】Streptococcus mutans UA159生物膜の生存力に対する1.33mMのtt-ファルネソール及び0.12％CHX(1.33mM)の効果を示すグラフである。同様のグラフをS.sobrinus6715についても得た。細菌の致死について測定した場合、アピゲニン(1.33mM)及びフッ化物(250ppm)は、無視できる程度の抗細菌活性を示した。
【図５】平滑面う蝕に対する処置の効果及び重度を示すグラフである。印を上に付した値はコントロールに対して統計的に有意差を有する(p＜0.05)。ANOVA、全てのペアについての比較はTukey-Kramer HSDを用いた。
【図６】溝う蝕に対する処置の効果及び重度を示すグラフである。印を上に付した値はコントロールに対して統計的に有意差を有する(p＜0.05)。ANOVA、全てのペアについての比較はTukey-Kramer HSDを用いた。

Claims (50)

1. (1)感覚刺激適合性の担体、並びに、
   (2)該担体に分散されたう蝕、歯苔形成、歯肉炎、カンジタ症、歯口内炎、アフタ性口内炎、若しくは真菌感染を予防または処置するのに有効な量のテルペノイド及びフラボノイド
   を含む口腔組成物。
2. 担体が、水、グリセリン、アルコール、DMSO、治療用ポリマー、澱粉、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１記載の口腔組成物。
3. テルペノイドが、ｔｔ-ファルネソールまたはその立体異性体若しくは誘導体、β-カリオフィレン、テルピネオール、ネロリドール、ビサボロール、サンタロール、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、β-アミリン、アミリンのトリテルペンアルコール、ラノステロール、クプレス酸またはその誘導体、アカセチン酸またはその誘導体、アカタリック酸、ベツレトール、メリフェロン、モロン酸、アンブベゾン酸、ベツロン酸、シリンガアルデヒド、インブリカトロイック酸、コムニック酸、イソクプレス酸メチル、トレメトン、ビスシドンまたはその誘導体、δ-カジネン、レドール、グアイオール、α-コパエン、β-セリネン、α-エレメン、カラメネン、α-ムウロレン、γ-ムウロレン、β-オイデスモール、フムレン、ブルネソール、またはそれらの組合せである、請求項１記載の口腔組成物。
4. フラボノイドが、アピゲニン若しくはその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン３-アセテート、ピノバンクシン７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン若しくはその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せである、請求項１記載の口腔組成物。
5. テルペノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項１記載の口腔組成物。
6. フラボノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項１記載の口腔組成物。
7. テルペノイド対フラボノイドのモル比が約0.1から約10:1の範囲である、請求項１記載の口腔組成物。
8. さらに抗う蝕性剤を含む、請求項1記載の口腔組成物。
9. さらに研磨剤、ゲル化剤、湿潤剤、抗う蝕性剤、調味剤若しくは甘味料、除痛剤、抗結石剤、美白剤、界面活性剤、結合剤、保存剤、不透明化剤、着色剤、緩衝剤、またはそれらの組合せを含む、請求項1記載の口腔組成物。
10. 練り歯磨、ゲル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムである、請求項１記載の口腔組成物。
11. 表面結合グルコシルトランスフェラーゼのグルカン形成活性を阻害するのに有効な条件下で、表面結合グルコシルトランスフェラーゼを有効量のフラボノイド、またはフラボノイド及びテルペノイドの組合せと接触させることを含む、表面結合グルコシルトランスフェラーゼの活性を阻害する方法。
12. 表面結合グルコシルトランスフェラーゼが、エス・ミュータンスグルコシルトランスフェラーゼ、エス・ソブリヌスグルコシルトランスフェラーゼ、またはエス・サンギニスグルコシルトランスフェラーゼである、請求項１１記載の方法。
13. フラボノイドが、アピゲニン若しくはその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン-3-アセテート、ピノバンクシン-７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン若しくはその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せである、請求項１１記載の方法。
14. 該接触が口腔表面上で行われる、請求項１１記載の方法。
15. 口腔表面が歯、粘膜表面、舌表面、完全な若しくは部分的な義歯表面、またはそれらの組合せである、請求項１４記載の方法。
16. 該接触が少なくとも日に２回行われる、請求項１１記載の方法。
17. フラボノイド、またはフラボノイド及びテルペノイドの組合せが口腔組成物中に存在する、請求項１１記載の方法。
18. 口腔組成物が練り歯磨、ゲル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムの形体である、請求項１７記載の方法。
19. フラボノイドの有効量が、約５％（重量／容量）より少ない、請求項１１記載の方法。
20. (1)請求項１記載の口腔組成物を提供する工程、及び、
    (2)う蝕、歯肉炎、カンジタ症若しくは義歯口内炎を処置または阻害するのに有効な条件下で有効量の口腔組成物を口腔表面と接触させる工程、
    を含む、う蝕、歯肉炎、カンジタ症若しくは義歯口内炎を処置または阻害する方法。
21. 口腔表面が歯、粘膜表面、舌表面、完全な若しくは部分的な義歯表面、またはそれらの組合せである、請求項２０記載の方法。
22. 該接触が少なくとも日に２回行われる、請求項２０記載の方法。
23. テルペノイドが、ｔｔ-ファルネソールまたはその立体異性体若しくは誘導体、β-カリオフィレン、テルピネオール、ネロリドール、ビサボロール、サンタロール、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、β-アミリン、アミリンのトリテルペンアルコール、ラノステロール、クプレス酸またはその誘導体、アカセチン酸またはその誘導体、アカタリック酸、ベツレトール、メリフェロン、モロン酸、アンブベゾン酸、ベツロン酸、シリンガアルデヒド、インブリカトロイック酸、コムニック酸、イソクプレス酸メチル、トレメトン、ビスシドンまたはその誘導体、δ-カジネン、レドール、グアイオール、α-コパエン、β-セリネン、α-エレメン、カラメネン、α-ムウロレン、γ-ムウロレン、β-オイデスモール、フムレン、ブルネソール、またはそれらの組合せである、請求項２０記載の方法。
24. フラボノイドが、アピゲニン若しくはその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン３-アセテート、ピノバンクシン７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン若しくはその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せである、請求項２０記載の方法。
25. テルペノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項２０記載の方法。
26. フラボノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項２０記載の方法。
27. テルペノイド対フラボノイドのモル比が約0.1から約10:1の範囲である、請求項２０記載の方法。
28. 口腔組成物が練り歯磨、ゲル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムの形体である、請求項２０記載の方法。
29. 口腔組成物がさらに抗う蝕性剤を含む、請求項２０記載の方法。
30. (1)請求項１記載の口腔組成物を提供する工程、及び
    (2)う蝕、歯肉炎、カンジタ症、義歯口内炎または歯苔マトリックス形成を促進する微生物の蓄積を阻害するのに有効な条件下で有効量の口腔組成物を口腔表面と接触させる工程、
    を含む口腔表面における微生物蓄積を阻害する方法。
31. 口腔表面が歯、粘膜表面、舌表面、完全な若しくは部分的な義歯表面、またはそれらの組合せである、請求項３０記載の方法。
32. 該接触が少なくとも日に２回行われる、請求項３０記載の方法。
33. テルペノイドが、ｔｔ-ファルネソールまたはその立体異性体若しくは誘導体、β-カリオフィレン、テルピネオール、ネロリドール、ビサボロール、サンタロール、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、β-アミリン、アミリンのトリテルペンアルコール、ラノステロール、クプレス酸またはその誘導体、アカセチン酸またはその誘導体、アカタリック酸、ベツレトール、メリフェロン、モロン酸、アンブベゾン酸、ベツロン酸、シリンガアルデヒド、インブリカトロイック酸、コムニック酸、イソクプレス酸メチル、トレメトン、ビスシドンまたはその誘導体、δ-カジネン、レドール、グアイオール、α-コパエン、β-セリネン、α-エレメン、カラメネン、α-ムウロレン、γ-ムウロレン、β-オイデスモール、フムレン、ブルネソール、またはそれらの組合せである、請求項３０記載の方法。
34. フラボノイドが、アピゲニン若しくはその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン３-アセテート、ピノバンクシン７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン若しくはその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せである、請求項３０記載の方法。
35. テルペノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項３０記載の方法。
36. フラボノイドが、約５％（重量／容量）より少ない有効量で存在する、請求項３０記載の方法。
37. テルペノイド対フラボノイドのモル比が約0.1から約10:1の範囲である、請求項３０記載の方法。
38. 口腔組成物が練り歯磨、ゲル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムの形体である、請求項３０記載の方法。
39. 口腔組成物がさらに抗う蝕性剤を含む、請求項３０記載の方法。
40. 微生物が乳酸桿菌、アクチノマイセス属放線菌、レプトトリキア属細菌、非β-溶血連鎖球菌、腸球菌、種々のグラム陽性球菌、ナイセリア属細菌、類ジフテリア細菌、紡錘菌、バクテロイデス、スピロヘータ属細菌、酵母、及びそれらの組合せからなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
41. 現存するアフタ性口内炎を処置するのに、または、アフタ性口内炎の形成を阻害するのに有効な条件下で、有効量のテルペン、フラボノイドまたはそれらの組合せを口腔表面と接触させることを含む、アフタ性口内炎を処置または阻害する方法。
42. 口腔表面が歯、粘膜表面、舌表面、完全な若しくは部分的な義歯表面、またはそれらの組合せである、請求項４１記載の方法。
43. 該接触が少なくとも日に２回行われる、請求項４１記載の方法。
44. テルペノイドが、tt-ファルネソールまたはその立体異性体若しくは誘導体、β-カリオフィレン、テルピネオール、ネロリドール、ビサボロール、サンタロール、デヒドロアビエチン酸、アビエチン酸、β-アミリン、アミリンのトリテルペンアルコール、ラノステロール、クプレス酸またはその誘導体、アカセチン酸またはその誘導体、アカタリック酸、ベツレトール、メリフェロン、モロン酸、アンブベゾン酸、ベツロン酸、シリンガアルデヒド、インブリカトロイック酸、コムニック酸、イソクプレス酸メチル、トレメトン、ビスシドンまたはその誘導体、δ-カジネン、レドール、グアイオール、α-コパエン、β-セリネン、α-エレメン、カラメネン、α-ムウロレン、γ-ムウロレン、β-オイデスモール、フムレン、ブルネソール、またはそれらの組合せである、請求項４１記載の方法。
45. テルペノイドの有効量が、約５％（重量／容量）より少ない、請求項４１記載の方法。
46. フラボノイドが、アピゲニン若しくはその誘導体、アカセチン、バイカレイン、クリシン、ルテオリン、テクトクリシン、ケンフェロール、ケンフェライド、ガランギン、イソラムネチン、ラムネチン、ミリセチン、フィセチン、ルチン、ピノバンクシン、ピノバンクシン３-アセテート、ピノバンクシン７-メチルエーテル、ピノセンブリン、サクラネチン、イソサクラネチン、ケルセチン、ヘスペリチン、ナリンギン、ピノストロビン若しくはその誘導体、トリヒドロキシメトキシフラバノン、テトラヒドロキシフラバノン、テトラヒドロキシフラボン、エルマニン、3,5,7-トリヒドロキシ-4’-メトキシフラバノール、5,6,7-トリヒドロキシ-3,4’-ジメトキシフラボン、3,7-ジヒドロキシ-5-メトキシフラバノン、2,5-ジヒドロキシ-7-メトキシフラバノン、3-メチルケルセチン、8-メチルケンフェロール、またはそれらの組合せである、請求項４１記載の方法。
47. フラボノイドの有効量が、約５％（重量／容量）より少ない、請求項４１記載の方法。
48. テルペノイドとフラボノイドの組合せが提供され、該組合せが口腔組成物の形体である、請求項４１記載の方法。
49. テルペノイド対フラボノイドのモル比が約0.1から約10:1の範囲である、請求項４８記載の方法。
50. 口腔組成物が練り歯磨、ゲル、粉末、溶液、懸濁液、乳液、ロゼンジ、粘膜吸着性ビヒクル、錠剤、またはガムの形体である、請求項４８記載の方法。

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