JP2004519410A - Melanocortin metallopeptide constructs, random sequence libraries and methods of application - Google Patents

Abstract

生物学的利用、薬理学的利用並びに関連分野での利用のためのメラノコルチンレセプターに特異的なメタロペプチド及びメタロペプチド無作為配列ライブラリーが提供されている。メタロペプチドと無作為配列ライブラリーはペプチド、ペプチドミメチック及びペプチド疑似構成体で作成されており、ペプチド、ペプチドミメチック又は構成体は金属イオンとの金属イオンー結合部の複合で配列的に固定される。Melanocortin receptor specific metallopeptides and metallopeptide random sequence libraries are provided for use in biological, pharmacological and related fields. Metallopeptide and random sequence libraries are made up of peptides, peptidomimetics and peptidomimetics, where the peptide, peptidomimetic or construct is immobilized in sequence by a metal ion-bonding complex with a metal ion. You.

Description

関連出願
本願は米国仮出願第６０／１４８９９４号「メラノコルチンリセプター特殊メタロペプチド構成体、組合せライブラリー及び適用法」（１９９９年８月１３日出願）の優先権を主張する。
【０００１】
本願はＰＣＴ／ＵＳ９９／２９７４３「メタロペプチド組合せライブラリー及び適用法」（１９９９年１２月１４日出願）、米国特許第６０２７７１１号「構造的に解析されたメタロ構成体及び適用法」（２０００年２月２２日発行）並びに米国特許第５８９１４１８号「ペプチド金属イオン薬剤構成体及び適用法」（１９９９年４月６日発行）に関連する。
【０００２】
米国政府の権利
アメリカ合衆国政府は本願発明に対して一定のライセンス権を有している。
【０００３】
発明の背景
発明の分野（技術分野）
本願発明はメタロペプチド（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）、金属イオン複合ペプチドミメチック（ｍｅｔａｌ ｉｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、及びメタロ構成体（ｍｅｔａｌｌｏ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）に関連し、メラノコルチンリセプター（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）に特効（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であるメタロペプチド無作為配列ライブラリー、金属イオン複合ペプチドミメチック及びペプチド様無作為配列ライブラリー並びにメタロ構成体無作為配列ライブラリー（ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ， ｍｅｔａｌ ｉｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）が含まれており、併せてそれらの利用法と製造法にも関する。本願発明はそのようなライブラリーの合成法及び組み合わせ法にも関し、対象のメラノコルチンリセプターを結合させることができ、あるいは対象のメラノコルチン関連生体活性を調停することができるライブラリー成分の特定並びに特徴付けにの方法にも関する。
背景技術
以下の説明はいくつかの出版物を著者と発行年で特定して言及している。そのような出版物の説明は本願発明の説明に供するだけであり、必ずしも本願発明の先行技術と認めるものではない。
【０００４】
メラノコルチンリセプター：
メラノコルチンリセプタータイプ及びサブタイプ系物質は特定されており、正常なヒトのメラノサイト（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ）及びメラノーマセル（黒腫細胞：ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）で発現するメラノコルチン−１リセプター（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−１ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）（ＭＣ１−Ｒ）、副腎（ａｄｒｅｎａｌ ｇｌａｎｄ）の細胞で発現するＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ）に対するメラノコルチン−２リセプター（ＭＣ２−Ｒ）、主として視床下部、中脳及び脳幹の細胞で発現するメラノコルチン−３リセプタ（ＭＣ３−Ｒ）及びメラノコルチン−４リセプター（ＭＣ４−Ｒ）並びに周辺組織で幅広く発現するメラノコルチン−５リセプター（ＭＣ５−Ｒ）を含んでいる。
【０００５】
メラノコルチンリセプターに特異的であるペプチドは多彩な生物活性を有していると報告されている。それらにはＭＳＨ（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）とＡＣＴＨリセプターによって調停されることが知られている色素沈着（ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及びステロイドジェネシス（ｓｔｅｒｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ）に対する効果が含まれる。いくつかの研究は第一人メラノーマ細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ）に対するメラノトロピンリセプター（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の存在を報告した（Ｔａｔｒｏ ＪＢ， Ａｔｋｉｎｓ Ｍ， Ｍｉｅｒ ＪＷ， ｅｔ ａｌ．：人メラノーマで示されるメラノトロピンリセプター、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， ８５：１８２５−１８３２， １９９０）。メラノトロピンリセプターはメラノチック（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ）及びアメラノチック（ａｍｅｌａｎｏｔｉｃ）である人メラノーマ腫瘍のマーカとして報告されてきた（Ｓｈａｒｍａ ＳＤ， Ｇｒａｎｂｅｒｒｙ ＭＥ， Ｊｉａｎｇ Ｊ， ｅｔ ａｌ． 、多価メラノトロピックペプチドと蛍光巨大分子接合体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）：メラノトロピンリセプターの特徴を決定する新試薬、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ５：５９１−６０１， １９９４； Ｓｈａｒｍａ ＳＤ， Ｊｉａｎｇ Ｊ， Ｈａｄｌｅｙ ＭＥ， ｅｔ ａｌ． 、メラノーマメラノトロピンリセプター類の顕微鏡可視化及び特徴決定のためのメラノトロピックペプチド接合ビーズ、Ｐｒｏｃ Ｍａｔｌ ＡｃａｄＳｃｉ ＵＳＡ ９３（２４）：１３７１５−１３７２０， １９９６）。特に、ＭＣ１−Ｒの存在はＭＣ１−Ｒに対する抗体により人メラノーマ細胞内で示された（Ｘｉａ Ｙ， Ｓｋｏｏｇ Ｖ， Ｍｕｃｅｎｔｉｅｃｅ Ｒ， ｅｔ ａｌ．、人メラノコルチンＭＣ−１リセプターに対するポリクローナル抗体：悪性メラノーマ細胞へのメラノコルチンＭＣ−１リセプターの免疫組織化学局在（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２８８：２７７−２８３， １９９５）。ＭＣ１−Ｒは皮膚細胞で発現されるＧープロテイン結合７−膜貫通リセプター（７−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、関連リセプターＭＣ２−Ｒ、ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−Ｒ及びＭＣ５−Ｒとある程度の同族関係を有する。これらのそれぞれのリセプターは共通メラノトロピックファーマコホア（ｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｉｃ ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）である Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐを含有する様々なペプチド同族体を結合させることができる。このことはアルファメラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の６−９配列（６−９ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を説明する。
【０００６】
ＭＣリセプタの分子特徴付けに先立って、α−ＭＳＨ同族体は放射性同位体インジウム−１１１でラベル処理され、メラノーマ画像研究に使用された（Ｗｒａｉｇｈｔ ＥＰ， Ｂａｒｄ ＤＲ， Ｍａｕｇｈａｎ ＴＳ， ｅｔ ａｌ．、悪性メラノーマの臨床画像処理のためのアルファメラノサイト刺激ホルモンのキレート誘導体の利用、Ｂｒｉｔ Ｊ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ６５：１１２−１１８， １９９２；Ｂａｒｄ ＤＲ， Ｋｎｉｇｈｔ ＣＧ ａｎｄ Ｐａｇｅ−Ｔｈｏｍａｓ ＤＰ、悪性メラノーマの有望な画像処理剤としてのアルファ−メラノサイト刺激ホルモンのキレート誘導体。Ｂｒｉｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ６２：９１９−９２２， １９９０；Ｂａｒｄ ＤＲ， Ｋｎｉｇｈｔ ＣＧ， Ｐａｇｅ−Ｔｈｏｍａｓ ＤＰ、クラウドマンＳ９１メラノマへのアルファメラノサイト刺激ホルモンの短鎖同族体のキレート誘導体のターゲット処理、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ １８：８８２−８８３， １９９０）。直鎖式及び環式ジスルフィド含有ペプチドはメラノーマ画像処理のために特定されて使用されており、ＭＣリセプターで非選択的であるように思われる（Ｃｈｅｎ Ｊ ａｎｄ Ｑｕｉｎｎ ＴＰ、アルファメラノサイト刺激ホルモン同族体 Ｔｃ−９９ｍ／Ｒｅ−１８８ラベル処理並びに悪性メラノーマ保有鼠の薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３９： ２２２ｐ， １９９８；Ｇｉｂｌｉｎ ＭＦ， Ｗａｎｇ Ｎ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＴＪ， ｅｔ ａｌ．、レニウムとテクネチウム金属配位を介して環式化（ｃｙｃｌｉｚｅｄ）されたアルファメラノトロピンペプチド同族体の設計と特徴決定、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（２２）： １２８１４−１２８１８， １９９８）。後の研究で、ギブリン他によって報告された環式ペプチドは脳内で局所化（ｌｏｃａｌｉｚｅ）することも発見された（Ｗａｎｇ ＮＮ， Ｇｉｂｌｉｎ ＭＦ， Ｈｏｆｆｍａｎ ＴＪ， ｅｔ ａｌ、鼠メラノーマモデルでのＴｃ−９９ｍとＲｅ−１８８ラベル化環式メラノトロピンペプチド同族体の生体内特徴決定、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ３９： ７７Ｐ， １９９８及び１９９８年６月の第４５回放射線医学協会会議での対応するポスタープレゼンテーション）。人メラノサイトのＵＶ放射線に対する反応はＭＣ１−Ｒを通過したｃＡＭＰ通路のα−ＭＳＨ誘導活性によって仲介されることが報告された（Ｉｍ Ｓ， Ｍｏｒｏ Ｏ， Ｐｅｎｇ Ｆ， ｅｔ ａｌ．、アルファ−メラノトロピンによるサイクリックＡＭＰ通路の活性は紫外Ｂ放射線に対する人メラノサイトの反応を仲介する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： ４７−５４， １９９８）。
【０００７】
ＭＣ４−ＲもまたＧプロテインカップリングされた７−膜貫通リセプタであるが、主として脳内で発現されると信じられている。この遺伝子標的（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）によるリセプタの不活性化は、ハイパーファージア（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ）、ハイパーインスルネミア（ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ）及びハイパーグリセミア（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）に関係する成熟開始時肥満症候群（ｍａｔｕｔｉｔ−ｏｎｓｅｔ ｏｂｅｓｉｔｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を鼠に患わせた（Ｈｕｓｚａｒ Ｄ， Ｌｙｎｃｈ ＣＡ， Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ−Ｈｕｎｔｒｅｓｓ Ｖ， ｅｔ ａｌ．、メラノコルチン−４リセプターの標的妨害（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）は鼠の肥満を引き起こす、ｃｅｌｌ ８８： １３１−１４１， １９９７）。ＭＣ４−Ｒはエネルギー動的平衡（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）での治療的干渉のための分子標的（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ）である。
【０００８】
アルファ−ＭＳＨは全ての主要な形態の炎症に対する有望な抗炎症剤として解説されている（Ｓｔａｒ ＲＡ， Ｒａｊｏｒａ Ｎ， Ｈｕａｎｇ Ｊ， Ｓｔｏｃｋ ＲＣ， Ｃａｔａｎｉａ Ａ， Ｌｉｐｔｏｎ ＪＭ： アルファ−メラノサイト刺激ホルモンによるマクロファージ酸化窒素シンターゼ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）のオートクリンモジュレーション（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の証拠。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２： ８０１６−８０２０， １９９５； Ｇｅｔｔｉｎｇ ＳＪ， Ｐｅｒｅｔｔｉ Ｍ： 抗炎症治療のための新規な標的としてのＭＣ３−Ｒ。Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ １３： １９−２７， ２０００）。抗炎症治療におけるＭＣ１−ＲとＭＣ３−Ｒの有効性が強調されている。特に、これらＭＣリセプターのメラノコルチンリセプタアゴニストによる活性化は酸化窒素シンターゼの発現と続く酸化窒素生成を抑制すると報告されている。
【０００９】
メランコルチンリセプターの構造決定には多大な努力が払われた。その構造にはリセプターのエンコード処理を行う核酸配列とリセプターを構成するアミノ酸配列が含まれている。このことは、例えば、国際特許願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０９８とＰＣＴ／ＵＳ９９／１６８６２及び米国特許第５９９４０８７号に説明されている。メラノコルチンリセプターに特異的である多数のリガンド（アゴニスト及びアンタゴニスト）も開発された。このことは、例えば、国際特許願ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３２９８（ヨード基含有メラノコルチンリセプター特異的直鎖ペプチド）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１３８８（ＭＲ１−Ｒ特異的直鎖ペプチド）、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１１９５（ＭＣ３−ＥＲ、ＭＣ４−Ｒ及びＭＣ５−Ｒ特異的環式ペプチド）、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０４１１１（メラノマ治療用ＭＣ１−Ｒ特異的ペプチドアンタゴニスト）、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２１６（メラノコルチンリセプターリガンドとしてのイソキノリン化合物）、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１３２５２（メラノコルチンリセプターアゴニストとしてのスピロピペルジン誘導体）及び米国特許第６０５４５５６号（ＭＣ１−Ｒ、ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−Ｒ及びＭＣ５−Ｒアンタゴニストとしての環式ラクタムペプチド）に解説されている。さらに、多数の特許が、メラノコルチンリセプター特異的化合物の多様なスクリーニング方法と決定方法とを教示している。このことは、例えば、国際特許願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５５６５、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１２０９８及びＰＣＴ／ＵＳ９９／１６８６２並びに米国特許第５９３２７７９号と５９９４０８７号が解説する。
【００１０】
一般的に、ＭＣ１−Ｒに対して特異的な化合物はメラノマの治療に有効であると信じられている。これには、放射線治療剤または薬剤運搬剤としての利用、及び診断用造画剤（特に診断用放射性核種でラベルされているとき）としての利用が含まれている。ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−ＲまたはＭＣ５−Ｒに対して特異的な化合物はエネルギー動的平衡（ｅｎｅｒｇｙ ｈｏｍｅｓｔａｓｉｓ）の調整に有効であると信じられている。これには、食欲減退剤や体重コントロール剤、食欲欠乏治療剤、体重増加剤、肥満治療剤、並びに新陳代謝関連の治療剤としての有効性が含まれている。他のメランコルチンリセプターの中でＭＣ３−ＲとＭＣ４−Ｒに特異的である化合物は男性の***不全を含んだ性的障害の治療剤として利用できる。他のメラノコルチンリセプターの中でＭＣ３−Ｒ及びＭＣ４−Ｒに対して特異的な化合物は血圧コントロール、心拍数コントロール、並びに他の神経生理学パラメータのコントロールに利用が可能である。他のメラノコルチンリセプターペプチドはＭＣＲ−１アゴニストであるペプチドのごときメラニン生産を増加させるためのタンニング剤として利用が可能である。ＭＣＲ−１とＭＣＲ−３に特異的な化合物は炎症のコントロールに有用であろう。
【００１１】
独特なメラノコルチンリセプターに対して特異的なリガンド並びに特殊なメラノコルチンリセプターのアゴニストまたはアンタゴニストであるリガンドあるいは化合物に対する需要が存在する。メラノコルチンリセプターの高親和性であるペプチドリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストとしてメラノコルチンリセプターと関連する様々な生理学的反応を引き起こすために利用できる。さらに、メラノコルチンリセプターは様々なサイトカインの活性に対する効果を有しており、メラノコルチンリセプターの高親和性ペプチドリガンドはサイトカイン活性をコントロールするのに使用できる。
【００１２】
ペプチドライブラリー及び無作為配列化学：
無数の多彩な構造の分子を含んだペプチド及び他の小型分子のライブラリーは薬学的誘導発生（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｌｅａｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）及び誘導最良化（ｌｅａｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）に有効である。多様な分子種のライブラリーは文献において解説されており、ペプチド、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄｓ）、ペプチドミメチック（ｐｅｐｔｏｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、オリゴヌクレオチド、ベンゾジアゼピン、並びに他の小型有機分子のライブラリー等が含まれ、薬剤発見のためにスクリーニングされる。構造的に多様な化合物のライブラリーを構築するために様々な研究手法が使用されてきた。これらには化学合成及び遺伝子工学手法が含まれている。化学的に合成されるライブラリーは溶液化学手段と固体相方法で合成されてきた。ペプチドをベースとしたライブラリーのデザイン、合成、スクリーニング及び評価の従来技術は多数の文献で教示されている。
【００１３】
固体相結合ライブラリーの空間的アドレス可能平行合成：
ペプチドまたは他の小型分子のライブラリーの化学構築の種々な方法は確立されている。１方法は固体相上で化合物を空間的に分離させて平行合成するか、固体表面上の１化合物または化合物サブセットの位置が知られるように所定の手法による固体表面における化合物の空間的に分離された平行合成が関与する。ボロシリケートガラス顕微鏡スライドのごとき固体表面上でのペプチド合成におけるフォトリトグラフ技術を利用した光方向制御空間的アドレス可能な平行化学合成技術（ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｐａｔｉａｌｌｙ ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐａｒａｌｌｅｌ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）のごとき他の方法は、１０００００以上の空間的に分離された化合物を含んだライブラリーを提供する。しかし、単純ペプチドよりも構造的にさらに多様なライブラリーの合成は異なる光波長でクリーブ処理できる直交フォトラビル保護基（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）の開発を必要とする。さらに、これらライブラリーを維持する固体表面はライブラリースクリーニングアセイで結合親和性に対して明瞭な影響を引き起こすとも報告されてきた。
【００１４】
プーリング及びスプリット合成法：
化合物の大型ライブラリーは、それぞれの合成ステップでのリアクタントの等モル混合物（ｅｑｕｉｍｏｌａｒ ｍｉｘｔｕｒｅｓ）を採用するプーリング法（ｐｏｏｌｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ）によって、またはそれぞれのカップリング反応での活性に従った混合物内での種々なリアクタントの相対的濃度の調整によって構築できる。１つの方法では、等モル混合物の化合物は等部分の樹脂を分割することで得られる。それぞれの等部分は様々なモノマー試薬のそれぞれと別々に反応される。その樹脂は混合され、次のカップリングのために処理され、個々の試薬との別々の反応のために再び等部分に分割される。このプロセスは望むオリゴマ長及びサイズのライブラリーが得られるまで必要な回数で反復される。この方法は“１ビーズ−１ペプチド（ｏｎｅ−ｂｅａｄ ｏｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）”法の基礎であり、この方法はバイオアッセー内のヒットビーズ（ｈｉｔ ｂｅａｄ）上のペプチドの主構造を確認するためにアミノ酸配列を利用する。これらライブラリーのスプリット合成を実行するさらに効率が良い自動システムが開発されている。これら全ての樹脂結合ライブラリーで時折見られる共通な人工物はバイオアッセーのいくらかの固体相結合化合物による改質ターゲット特異的親和性（ｔａｒｇｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｆｆｉｎｉｔｙ）であり、全く誤解を招く結果をもたらすことがある。
【００１５】
別の方法は溶解性ライブラリーの構築が関与する。この方法は、当初にランダムな全てのアミノ酸ポジションが定義されるまで反復的再合成処理及びバイオアッセー処理のデコンボリューション処理（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）が関与する。この方法のいくつかの変形が開発された。それらには直交プール（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｏｏｌｓ）を含んだ２つのライブラリーを共合成（ｃｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）することを含んでいる。これで反復的再合成と評価の必要性が排除される。溶解ライブラリー手法の主たる限界は高親和性物質に対するその適用性である。溶液中のそれぞれの化合物の豊富さは生物学的活性に影響を及ぼすライブラリー内の化合物の全数によって影響を受けるであろう。この理由で、プール内の非常に活性が高い化合物が実際に最も有望な分子とは限らない。ライブラリーの特定の構成メンバーの妥当な溶解性欠如はこの現象にさらに影響を及ぼすであろう。
【００１６】
様々な類の小型分子ライブラリーの中で、ペプチドライブラリーは用途が広い。これは、自然発生アミノ酸の利用により提供される構造的多様性、種々な“デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）”アミノ酸の組み込み、及びペプチド合成を達成させる高効率と容易性のおかげである。さらに、ペプチドベースライブラリーの別レベルの構造的多様性はライブラリーの合成後変更によって加えられる。これら変更はペルメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、アシル化（ａｃｙｌａｔｉｏｎ）、側鎖官能基の官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）及びＮ−端部（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）の還元アミノ化（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ａｍｉｎａｔｉｏｎ）を含む。
【００１７】
発明の概要（発明の開示）
１好適実施態様においては本願発明は、金属イオンとの複合（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）のために利用できるＮ３Ｓ１リガンドを形成する複数のリンク残基（ｌｉｎｋｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）を含んだ金属イオン結合ドメイン（ｍｅｔａｌ ｉｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ） を含んだ構成体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供する。この構成体はその金属イオン結合ドメインと金属イオンとの複合でメラノコルチンリセプターに対して特異的な構造内で配列的に拘束される（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）。
【００１８】
別な実施態様においては本願発明は、複数の接近アミノ酸（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）を含んだ金属イオン結合ドメインと、メラノコルチンリセプターに対して特異的な決定された生物機能ドメイン（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含んだ製造ペプチドとその薬剤利用可能なその塩を提供する。この生物機能ドメインの少なくとも一部は金属イオン結合ドメインの少なくとも一部と共伸展性（ｃｏ−ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）であり、その生物機能ドメインは金属イオン結合ドメインと金属イオンとの複合で配列的に拘束される。
【００１９】
別好適実施態様では本願発明は固体相上で合成された異なる配列のペプチドメンバーのメラノコルチンリセプターを標的とした組合せライブラリーを提供する。それぞれの構成ライブラリーメンバーは次のものを含んでいる：
（ａ）固体相に結合された３以上のアミノ酸残基とアミノ酸残基の擬体（ｍｉｍｉｃｓ）との組み合わせのペプチドミメチック配列（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であって、（ｉ）金属イオン結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳ（直交Ｓ−保護基で保護されたもの）を含んだ少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の擬体を含んだ複数のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体あるいはそれらの組み合わせの配列、（ｉｉ）金属イオン結合ドメインのＮ−またはＣ−末端あるいはそれらの両方でのアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体またはそれらの組み合わせの配列、並びに（ｉｉｉ）固体相にペプチドミメチック配列を接着させるクリーブ可能（ｃｌｅａｖａｂｌｅ）な結合で特徴付けられたペプチドミメチック配列；及び
（ｂ）ライブラリーの構成メンバーの少なくとも１つのペプチドミメチック配列のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体またはそれらの組み合わせの独特な選択または配列。
【００２０】
この直交Ｓ−保護基は固体相からペプチドミメチック配列をクリーブ処理せずに排除できる。
【００２１】
別な好適実施態様によれば本願発明は固体相で合成された異なる配列のペプチドミメチックメンバーのメラノコルチンリセプターを標的にした組合せライブラリーを提供する。それぞれのライブラリー構成メンバーは次のものを含んでいる：
（ａ）固体相に結合された３以上のアミノ酸残基とアミノ酸残基の擬体の組み合わせのペプチドミメチック配列であって、（ｉ）金属イオン結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳ（直交Ｓ−保護基で保護されたもの）を含んだ少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の擬体を含んだ複数のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体、またはそれらの組み合わせの配列、（ｉｉ）金属イオン結合ドメインのＮ−またはＣ−末端またはそれらの両方でのアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体、またはそれらの組み合わせの配列、並びに（ｉｉｉ）固体相にペプチドミメチック配列を接着させるクリーブ可能な結合で特徴付けられてペプチドミメチック配列；及び
（ｂ）ライブラリーの少なくとも１つの構成メンバーのペプチドミメチック配列のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体、またはそれらの組み合わせの独特な選択または配列。
【００２２】
直交Ｓ−保護基は固体相からペプチドミメチック配列をクリーブ処理せずに排除できる。
【００２３】
別な好適実施態様によれば、本願発明は溶液中で合成された異なる配列のペプチドあるいはペプチドミメチック構成メンバーのメラノコルチンリセプターを標的にした組合せライブラリーを提供する。それぞれの構成ライブラリーメンバーは以下を含んでいる：
（ａ）固体相に結み合わされた３以上のアミノ酸残基とアミノ酸残基の擬体の組み合わせのペプチドミメチック配列であって、（ｉ）金属イオン結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳ（直交Ｓ−保護基で保護されたもの）を含んだ少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の擬体を含んだ複数のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体またはそれらの組み合わせの配列；（ｉｉ）金属イオン結合ドメインのＮ−またはＣ−末端でのアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体またはそれらの組み合わせの配列で特徴付けられているペプチドミメチック配列；及び
（ｂ）ライブラリーの少なくとも１つの構成メンバーのペプチドミメチック配列のアミノ酸残基、アミノ酸残基の擬体またはそれらの組み合わせの独特な選択または配列。
【００２４】
本願発明の組成物は以下の化学式の組成物を含んでいる。
【００２５】
Ｒ_１−Ｌｌｌ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２
Ｒ_１−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｃｃｃ−Ｒ_２
Ｒ_１−Ｄｄｄ−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｒ_３
Ｒ_４−Ｅｅｅ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２
Ｒ_１−Ｆｆｆ−Ａａａ−Ｇｇｇ−Ｃｃｃ−Ｒ_５
Ｒ_１−Ｈｈｈ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_５
Ｒ_１−Ｉｉｉ−Ｉｉｉ−Ｃｃｃ−Ｊｊｊ−Ｋｋｋ−Ｒ_２
Ｒ_１は、補助的または二義的リセプター接触の提供等を含んだ分子の残留体の本来的な活性を増強させる機能性を有している。１個から約４個の中性または荷電Ｌ−あるいはＤ−形態アミノ酸残基等のアミノ酸鎖を含んで、種々なアミノ酸と非ペプチド基のどれでも採用が可能である。もしＲ１が非ペプチド基であれば、直鎖あるいは枝鎖アルキル、アリル、アルケン、アルケニルまたはアラルキル鎖でもよい。
【００２６】
Ａａａは、正荷電側鎖を有したＬ−またはＤ−形態陽イオンアミノ酸である。好適なアミノ酸とは天然及び合成アミノ酸の両方のＬ−形態Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、及びそれらの誘導体、同族体、相同体等である。Ａａａは金属イオン複合体のためのＮ（窒素原子）を提供する。
【００２７】
Ｂｂｂは、芳香側鎖を有したＬ−またはＤ−形態アミノ酸である。好適なアミノ酸とはＤ−形態Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、同族体または相同体等である。Ｂｂｂの芳香環はハロゲン、アルキルまたはアリル基で官能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）されている。Ｂｂｂは金属イオン複合体のためのＮを提供する。
【００２８】
Ｃｃｃは、金属イオン複合体のためのアルファアミノ基からのＮと側鎖基からのＳ（硫黄原子）の両方を提供するアミノ酸である。好適なアミノ酸とはＬ−またはＤ−形態のＣｙｓ、ＰｅｎおよびＨｃｙｓ等である。
【００２９】
Ｌｌｌは、芳香側鎖を有したＤ−形態のアミノ酸である。好適なアミノ酸とはＤ−形態のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、同族体または相同体等である。Ｌｌｌの芳香環はハロゲン、アルキルまたはアリル基で官能化される。Ｌｌｌは金属イオン複合体にＮを提供しない。
【００３０】
Ｒ_２は、芳香側鎖を有したアミノ酸である。好適なアミノ酸とは天然及び合成アミノ酸の両方を含んだＬ−またはＤ−形態のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’、４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、類似体あるいは相同体等である。Ｃ末端は自由またはアミノ化されている。Ｒ_２は前記のアミノ酸の対応するデス（ｄｅｓ−）カルボキシルアミノ酸であってもよい。あるいはＲ_２は排除できる。
【００３１】
Ｄｄｄは金属イオン複合体のために側鎖基からＳを提供するアミノ酸である。好適なアミノ酸とはＬ−またはＤ−形態のＣｙｓ、Ｐｅｎ、及びＨｃｙｓ等である。
【００３２】
Ｒ_３は金属イオン複合体のためにＮを提供する芳香側鎖を有したアミノ酸である。好適なアミノ酸とは天然及び合成アミノ酸のＬ−またはＤ−形態のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、類似体または相同体等である。Ｃ末端は自由またはアミノ化されている。Ｒ_３はそれらアミノ酸の対応するデスカルボキシルアミノ酸でもよい。
【００３３】
Ｒ_４は陽イオン中心部を提供する機能性を有している。好適なアミノ酸とはＬ−またはＤ−形態のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然と合成アミノ酸の両方を含んでいる。アミノ酸のＮ端末は、直鎖または枝鎖アルキル、アリル、アルケン、アルケニルまたはアラルキル鎖等である多彩な中性アミノ及び非ペプチド基で官能化できる。
【００３４】
Ｅｅｅは金属イオン複合体のためのＮを提供する非荷電Ｌ−またはＤ−形態アミノ酸である。好適なアミノ酸とはＧｌｙ及びＬ−形態のＡｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、またはＴｒｐ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然と合成アミノ酸を含んだものである。好適実施態様ではＥｅｅは脂肪側鎖を有したアミノ酸である。
【００３５】
ＦｆｆはＬ−またはＤ−形態の芳香アミノ酸である。好適なアミノ酸とはＤ−形態のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）、Ｔｉｃ、ＴｉｑまたはＴｃａ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然及び合成アミノ酸を含んだものである。Ｆｆｆの芳香環はハロゲン、アルキルまたはアリル基で置換できる。Ｆｆｆは金属イオン複合物のためのＮを提供しない。
【００３６】
ＧｇｇはＬ−またはＤ−形態の芳香族アミノ酸である。好適なアミノ酸とはＬ−形態のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然及び合成アミノ酸を含んだものである。Ｇｇｇ内の芳香環はハロゲン、アルキルまたはアリル基で置換できる。Ｇｇｇは金属イオン複合物のためのＮを提供する。
【００３７】
Ｒ_５は好適には置換アミド、エステルまたはカルボキシレート基である。またＲ_５にはＬ−またはＤ−形態のアミノ酸またはアミノ酸アミドでも構わず、芳香族、脂肪族、中性あるいは荷電アミノ酸等が含まれる。
【００３８】
Ｈｈｈは正に荷電された側鎖を有したＬ−またはＤ−形態の陽イオンアミノ酸である。好適なアミノ酸とはＬ−形態のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然及び合成アミノ酸が含まれる。Ｈｈｈは金属イオン複合体のためのＮを提供しない。
【００３９】
Ｉｉｉは金属イオン複合体のためのＮを提供するＬ−またはＤ−形態のアミノ酸である。好適なアミノ酸にはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然及び合成アミノ酸が含まれる。
【００４０】
Ｊｊｊは芳香側鎖を有したＬ−またはＤ−形態のアミノ酸である。好適アミノ酸とはＤ−形態のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ２）及びそれらの誘導体、類似体または相同体等である。Ｊｊｊ内の芳香環はハロゲン、アルキルまたはアリル基で機能化できる。Ｊｊｊは金属イオン複合体のためのＮを提供しない。
【００４１】
Ｋｋｋは正に荷電された側鎖を有したＬ−またはＤ−形態のアミノ酸である。好適なアミノ酸とはＬ−形態のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｄｐｒ、またはＤｂｕ及びそれらの誘導体、類似体または相同体等であり、天然及び合成アミノ酸が含まれる。Ｋｋｋは金属イオン複合体のためのＮを提供しない。
【００４２】
本願発明の組成物において、その金属イオン結合ドメインは金属イオンで複合化でき、そのような組成物は本願発明に含まれる。本願発明は、金属イオン結合ドメインが金属イオンで複合化されているメランコルチンリセプターに対して、金属イオン結合アミノ酸配列が金属イオンと複合化されていないときの組成物に対してとりもさらに特異的である組成物をさらに含んでいる。
【００４３】
本願発明の無作為配列ライブラリーは、金属イオン結合ドメインが、直交Ｓ−保護基の除去で金属イオンと結合するために利用できる少なくとも１つのＮを含んでいるライブラリーを含んでいる。この無作為配列ライブラリーは金属イオン結合ドメインがＮ_３Ｓ_１リガンドを形成する３つの残基を含んでいる組成物を含んでいる。
【００４４】
この無作為配列ライブラリーにおいて、直交Ｓ−保護基はＳ−チオ−ブチル、アセトアミドメチル、４−メトキシトリチル、Ｓ−スルフォネートまたは３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルである。直交Ｓ−保護基は、ライブラリー構成メンバーまたはアミノ酸側鎖保護基をそれ以外に変更することなくライブラリー構成メンバーから除外することができる。この無作為配列ライブラリーにおいて、構造の多様性は金属イオン結合ドメイン内または金属イオン結合ドメインの外側で発生する。
【００４５】
無作為配列ライブラリーにおいて、構成ライブラリーメンバーは少なくとも１つのＳ（非直交Ｓ−保護基で保護されている）を含んだ金属イオン結合ドメインのＮ−またはＣ−末端での配列に少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基の擬体を含んでおり、直交Ｓ−保護基は非直交Ｓ−保護基を排除することなく取り除くことができる。
【００４６】
アミノ酸に限定された無作為配列ライブラリーに関しては、少なくとも１つのＳ（直交Ｓ保護基で保護されている）を含んだアミノ酸残基はＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸でもよく、Ｌ−またはＤ−システインまたはＬ−あるいはＤ−ペニシルアミンが含まれる。アミノ酸残基とアミノ酸残基の擬体を含んだ無作為配列ライブラリーにおいては、少なくとも１つのＳ（直交Ｓ保護基で保護されている）を含んだ残基はＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸でよく、Ｌ−またはＤ−システインあるいはＬ−またはＤ−ペニシルアミン；３−メルカプトフェニルアナニン；２−メルカプト酢酸；３−メルカプトプロピオン酸；２−メルカプトプロピオン酸；３−メルカプト−３，３−ジメチルプロピオン酸；３−メルカプト３，３−ジエチルプロピオン酸；３−メルカプト，３−メチルプロピオン酸；２−メルカプト，２−メチル酢酸；３−シクロペンタメチレン；３−メルカプトプロピオン酸；または２−シクロペンタメチレン，２−メルカプト酢酸が含まれる。
【００４７】
本願発明の１目的は、得られた複合体の側鎖のトポグラフィ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）がメラノコルチンリセプターに特異的な生物学的に活性である三次元立体構造となるような非常に特異的で配置的に限定されたペプチド、ペプトイド、関連シュードペプチド、ペプチドミメチック、及びそれらの配列を望む金属イオンと複合させることで形成された金属構成体の製造方法と利用法を考案し、有効性を証明し、解説することである。
【００４８】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに特異的であり、高レベルの安定性を有し、非複合ペプチドあるいは他の知られたペプチドよりも蛋白質分解に抵抗性が高いペプチド−金属イオン複合体を提供することである。
【００４９】
本願発明の別目的は、例えばＭＣ１−ＲあるいはＭＣ４−Ｒに対してのみ特異的であるようなメラノコルチンリセプターの異なるサブセットに対して特異的なペプチド金属イオン複合体の提供である。
【００５０】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに特異的であり、アゴニストまたはアンタゴニストであるペプチド金属複合体の提供である。
【００５１】
本願発明の別目的は、金属イオンが不在であるときに配列的に規制されないペプチド類似体の提供である。この非複合ペプチド類似体は不活性であるか、低い有効性を示すが、金属イオンとの複合で配列的に規制され、高い有効性でメラノコルチンリセプターに対して特異的となる。
【００５２】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに特異的なペプチドの金属複合を利用し、ペプチド内に特異的領域配列的規制を発生させ、金属結合サイトのペプチド配列を金属複合体で配列的に固定させることである。
【００５３】
本願発明の別目的は金属イオンにペプチドを複合化させることである。得られたメタロペプチドはメラノコルチンリセプターに対して特異的であり、哺乳動物において好適なインビボバイオディストリビューションプロフィール（ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｐｒｉｆｉｌｅ）、クリアランスの速度及びモード（ｒａｔｅ ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）、バイオアベイラビリティ（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）、並びに薬理動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）を提供する。
【００５４】
本願発明の別目的は、薬剤として病理性肥満および関連状態の治療のごときエネルギー代謝と食事慣習を改正させる等の病状の治療に使用するように安定した非放射性金属イオンを利用したメラノコルチンリセプターに対する特異性のペプチド金属複合体の提供である。
【００５５】
本願発明の別目的は、メラノーマ腫瘍やメラノーマ腫瘍転移の映像処理及びステージング処理（ｓｔａｇｉｎｇ）等を含んだ診断方法に利用するための放射性核種である金属イオンを利用してメラノコルチンリセプターに対する特異性のペプチド金属複合体を提供することである。
【００５６】
本願発明の別目的は、太陽光による皮膚のＤＮＡ損傷を含んだ紫外線によるＤＮＡ損傷に対する予防剤として使用するように安定した非放射性金属イオンを利用したメラノコルチンリセプターに特異的なペプチド金属イオン複合体を提供することである。
【００５７】
本願発明の別目的は、タンニング剤として治療目的で使用することを含んだタンニング剤として使用するための安定した非放射性金属イオンを利用したメラノコルチンリセプターに特異的であるペプチド金属イオンを提供することである。
【００５８】
本願発明の別目的は、抗炎症剤として使用するための安定非放射性金属イオンを利用したメラノコルチンリセプターに特異的なペプチド金属イオン複合体を提供することである。
【００５９】
本願発明の別目的は、診断用の映像化に使用するためにテクネチウム−９９ｍ等の放射性金属とペプチドとを複合化させることである。得られたペプチド金属イオン複合体は非複合ペプチド分子よりもメラノコルチンリセプターに対してさらに特異的であり、得られた放射能ラベル化（ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ）された種はメラノコルチンに対する特異性に関しては本質的にキャリアフリー（ｃａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ）である。
【００６０】
本願発明の別目的は、メラノマの治療のごとき標的の放射線治療（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）に使用するためにレニウム−１８６やレニウム−１８８のごときレニウムの放射性同位体等の放射性金属イオンとペプチドを複合化させることである。
【００６１】
本願発明の別目的は、酵素またはペプチダーゼ劣化現象をさほど引き起こさずに臓器−血液バリヤ（ｇｕｔ−ｂｌｏｏｄ ｂａｒｒｉｅｒ）を通過できるメラノコルチンリセプターに特異的で経口投薬できるペプチド金属イオンの提供である。
【００６２】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに向けられた配列的に拘束されたペプチド金属イオン複合体のライブラリーを提供することである。
【００６３】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに対して特異的なペプチド金属イオン複合体の組合せペプチドライブラリーを提供することである。これらペプチドは特異的配列規制が金属イオンでペプチドをラベル化して得られるように金属結合ドメインを含んでいる。
【００６４】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに対して特異的なペプチド金属イオン複合体の組合せライブラリーを提供することであり、ライブラリーがシュードペプチドとペプチドミメチックを含むように、これらペプチドを含んだアミノ酸は天然アミノ酸、イソマー及びそのようなアミノ酸の変形、非蛋白質アミノ酸、ポストトランスレーション的に改質された（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ）アミノ酸、酵素的に改質されたアミノ酸、アミノ酸と類似するようにデザインされた構造体、等々である。
【００６５】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターの種類によっては特異的なメタロペプチドライブラリーを提供することである。このメタロペプチドは金属イオン結合ドメインを含んでおり、決定される配列的限定は金属イオンでペプチドをラベル処理して得られる。これらメタロペプチドはさらに独特で異なるアミノ酸配列を含んでいる。
【００６６】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターの種類によっては特異的な溶解及び固体相メタロペプチドライブラリーの両方を提供することである。これらメタロペプチドは金属イオン結合ドメインを含んでいる。
【００６７】
本願発明の別目的は、金属イオン結合ドメインの一部を形成する反応性ＳＨ基を含み、メラノコルチンリセプターに特異的なペプチドの合成方法を提供することである。この反応性ＳＨ基は合成処理中に保護されており、金属イオンでペプチドを複合化させたときのみ脱保護される。
【００６８】
本願発明の別目的は、金属リセプターに特異的な組合せメタロペプチドライブラリーを提供することである。このライブラリーを構成するペプチドは逆転構造（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｕｒｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を金属イオン複合の結果として含んでいる。
【００６９】
本願発明の別目的は、レニウム金属イオン等の金属イオンでメラノコルチンリセプターに特異的な多様なペプチドのプールの迅速で効率的な複合方法を提供することである。
【００７０】
本願発明の別目的は、メラノコルチンリセプターに特異的な天然ペプチドとメラノコルチンに特異的なプロテインに共通して発見されるベータ回転及びガンマ回転のごとき逆回転構造のための代用薬としての配列的に規制されたペプチド金属イオン複合体のライブラリーを提供することである。金属イオン複合の結果として形成された回転は天然の回転構造よりも安定しており、バン・デル・ワールズ相互反応（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ’ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）及び水素結合のごとき弱い相互反応でのみ安定する。
【００７１】
本願発明の別目的は、組合せメタロペプチドライブラリーを提供することであり、ライブラリーを構成するそれぞれのペプチドは金属イオン複合の結果として逆転構造を含んでいる。
【００７２】
本願発明の別目的は、２単位だけ異なる固定された相対的に多量の２つの同位体を含んだレニウムの使用等である、複数の同位体ピークを具えた金属イオンの使用で得られた内部署名（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を介して特異的メタロペプチドの特定を行う方法の提供である。
【００７３】
本願発明の他の目的、利点、及び新規な特徴並びに適用性を添付の図面を利用して解説する。
【００７４】
好適実施例の解説
定義：本明細書を通じて使用される用語を以下の通り定義する。
【００７５】
“結合”及び“複合”とは全てのタイプの物理的及び化学的結合、反応、複合、引力、キレート化等々を含む。
【００７６】
本願発明の“ペプチド”とは、ａ）天然発生、ｂ）化学合成で製造、ｃ）組換えＤＮＡ技術で製造、ｄ）大型分子の生化学的または酵素的フラグメント化で製造、ｅ）以上の方法の組合せで製造、またはｆ）その他のペプチド製造法により製造されたペプチドである。
【００７７】
好適な製造法である化学合成を利用することにより、天然には発生しない様々なアミノ酸を鎖に沿って導入し、Ｎ−またはＣ−端末を変更する等で、改善された安定性及び形状性を提供し、プロセアーゼに対する抵抗性等を提供することが可能である。
【００７８】
本明細書において使用される“ペプチド”とは化学改質されたペプチド及び誘導体等の複数のアミノ酸を含んだ概念である。本願発明のほとんどのペプチドは１００個のアミノ酸よりも少なく、好適には６０のアミノ酸よりも少なく、さらに好適には約２個から２０個のアミノ酸を含んだものである。１つのペプチドの少なくとも一部を構成するアミノ酸は天然発生アミノ酸、ステレオイソマー、及びそれらの改質体、非プロテインアミノ酸、ポストトランスレーション改質アミノ酸、酵素的に改質されたアミノ酸、アミノ酸を擬似するようにデザインされた構成体等々であり、“ペプチド”とは非ペプチドバックボーン（ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｉｃ ｂａｃｋｂｏｎｅ）を有した構造を含んだシュードペプチド及びペプチドミメチックを含んでいる。“ペプチド”とはペプチドの二量体（ｄｉｍｅｒ）または多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）をも含んでいる。“製造された”ペプチドは化学合成されたもの、組換えＤＮＡ技術で製造されたもの、大型分子の生化学または酵素的フラグメント化処理で製造されたもの、それらの組合せ等々で製造されたものを含む。
【００７９】
“アミノ酸”とは、知られた天然発生プロテインアミノ酸を含んでおり、共通の３文字略号及び１文字略号で表される。（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ， ＧＡ Ｇｒａｎｔ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２参照）“アミノ酸”とはステレオイソマーと天然発生プロテインアミノ酸、非プロテインアミノ酸、ポストトランスレーション改質アミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導アミノ酸、擬似アミノ酸構成体等々をも含んでいる。Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ， Ｈｒｕｂｙ ＶＪ， Ａｌ−ｏｂｅｉｄｉ Ｆ ａｎｄ Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ Ｗ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２６８： ２４９−２６２， １９９０； Ｔｏｎｉｏｌｏ Ｃ： Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ３５： ２８−３００， １９９０参照）さらに以下の略字の意味は次の通りである。
【００８０】

天然発生プロテインアミノ酸のステレオイソマーと改質体、非プロテインアミノ酸、ポストトランスレーション改質アミノ酸、酵素合成アミノ酸、誘導アミノ酸、擬似アミノ酸等であるアミノ酸は本明細書で時に“残基”と呼称される。
【００８１】
本願発明のライブラリー構成体は金属イオンをも含んでおり、金属や類金属を含んだ金属形態の元素のイオン形態であってもよい。その金属イオンは放射性、常磁性、あるいは超常磁性であっても構わない。その金属イオンはどのような金属の酸化形態でもよい。それにはバナジウム（Ｖ）、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、銅（Ｃｕ）、亜鉛（Ｚｎ）、ガリウム（Ｇａ）、ヒ素（Ａｓ）、セレニウム（Ｓｅ）、イットリウム（Ｙ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）、銀（Ａｇ）、カドミウム（Ｃｄ）、インジウム（Ｉｎ）、錫（Ｓｎ）、タングステン（Ｗ）、レニウム（Ｒｅ）、オスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、プラチナ（Ｐｔ）、金（Ａｕ）、水銀（Ｈｇ）、タリウム（Ｇｄ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、ポロニウム（Ｐｏ）、アスタチン（Ａｔ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）及びガドリニウム（Ｇｄ）の酸化形態が含まれる。金属イオンはそれらの放射性核種でも構わない。それらにはＩｎ、Ａｕ、Ａｇ、Ｈｇ、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｓｎ、Ａｔ、Ｙ及びＣｕが含まれる。テトラデンテート座標球（ｔｅｔｒａｄｅｎｔａｔｅ ｃｏｏｄｉｎａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）の好適な金属イオンはＲｅである。放射性同位体がスクリーニング処理に望ましい放射線薬学での適用にはアルファ、ガンマまたはベータ発生放射性核種を採用することができる。
【００８２】
多様な普通の金属イオンの配位球（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｓｐｈｅｒｅ）は一般的にテトラデンテートからヘキサデンテート（ｈｅｘａｄｅｎｔａｔｅ）である。本願発明の１実施形態においては、アミノ酸またはアミノ酸ミメチック配列がそれぞれのライブラリーメンバーに含まれており、金属との複合には望む数の基（大抵は４から６）を含んでいる。分子は金属との複合で金属複合箇所あたりで逆転構造の擬体を形成するようにデザインされている。配位数４、５または６及びテトラ、ペンタまたはヘキサデンテートリガンドを形成するアミノ酸配列とそれぞれ複合する金属はそのリガンドを重複させ、拘束する。リガンドを形成するアミノ酸またはアミノ酸擬体配列はペプチドまたはペプチドミメチックの金属イオン結合ドメイン（“ＭＢＤ”）として定義されている。ペプチドのごとき非常にフレキシブルな分子は金属との複合で重複されて逆転体を形成する。これは配列形態的に非常に拘束された構造である。
【００８３】
ペプチドまたはペプチドミメチックの生物学的結合ドメイン（“ＢＢＤ”）は本明細書においてアミノ酸配列として定義されている。これは生物学的に活性な配列を構成し、ＭＣ１−Ｒ、ＭＣ２−Ｒ、ＭＣ３−Ｒ、ＭＣ４−Ｒ、及びＭＣ５−Ｒを含んだメラノコルチン関連リセプター対して結合性を示し、特異的結合ペアのメンバーとしてペプチドを構成する。ＢＢＤはどのような配列をも含む。これは連続的アミノ酸または擬体（ｓｙｃｈｎｏｌｏｌｏｇｉｃａｌ）またはメラノコルチン関連リガンドを形成する非連続アミノ酸または擬体（ｒｈｅｇｎｙｌｏｇｉｃａｌ）でもよい。このリガンドはアクセプターまたはリセプターとの特異的相互反応を形成することができる。この“リセプター”とはアクセプターとリセプターの両方を含んだ概念である。このリセプターは生物学的リセプターでもよい。配列またはＢＢＤは信号を結合後にその生物学的リセプターと関連する細胞、組織または他の物質に送ることができるが、必須ではない。ＢＢＤはアゴニストであってもアンタゴニストであっても、あるいは両者の混成でもよい。そのようなＢＢＤで金属イオンに複合したペプチドあるいはペプチドミメチックは“特異的結合ペア（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｉｒ）”のメンバーを構成する。この特異的結合ペアは少なくとも２つの異なる分子で提供されており、１つの分子は、他方の分子の特定の空間的及び極性の組織に特殊に結合する表面または窪みに領域（ａｒｅａ）を具えている。しばしば、特異的結合ペアのメンバーはリガンド（配位子）およびリセプターあるいは抗配位子（ａｎｔｉ−ｌｉｇａｎｄ）と呼称される。
【００８４】
ＢＢＤはさらに構成体のその部分を含むと定義される。この構成体はペプチドミメチック、擬似ペプチド、またはメタロ構造分子であり、構造体の金属イオンとの結合で生物学的に活性でとなり、細胞、組織、有機体及び他の生体物質に見られるメラノコルチンリセプターへの結合性を示す。ＢＢＤはこの場合、シクロロジカルあるいはレグニロジカルであり、一般的にペプチドのＢＢＤの属性と機能とを有している。ＢＢＤはＭＢＤの全て、または一部と共伸展性（ｃｏｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）であり、ＢＢＤを構成する同じアミノ酸あるいは他の残基もＢＢＤの全てあるいは一部を構成する。場合によっては、ＭＢＤのアミノ酸はＢＢＤの一部を形成するであろう。ＭＢＤの一部ではない追加アミノ酸はＢＢＤの残りを形成する。
【００８５】
配列拘束性とはペプチドあるいは他の構成体がとる立体的形状の安定性と好適配列形態のことである。配列拘束性とは、ペプチドの１残基の配列的移動性の拘束が関与する局所的拘束、二次的構造単位を形成するであろう残基群の配列形態的移動性の拘束が関与する領域的拘束、全ペプチド構造が関与する全体的拘束を含んでいる。（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ参照）
ペプチドの一次構造はアミノ酸配列である。二次構造はペプチドバックボーンの配列及びα−螺旋、β−シート、回転等の通常構造にペプチドの一部を重複させることが関与する。従って、ペプチドがとる立体的形状は直接的にその二次構造に関係する。（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ参照）全体的構造とは配列拘束された立体形状を好むペプチド構造のことである。
【００８６】
本願発明の方法で得られた製品は医療目的及び畜産目的あるいは獣医により利用できる。典型的には製品は人体に利用されるが、動物にも利用できる。本文中の“患者”とは人間と動物の両方を対象とする。本願発明の主たる利用は人間の患者を対象にするが、実験施設、農場、動物園、野生動物、ペットにおいても活用できる。本願発明の製品は放射線核種イオンをオプションで利用できる。これは診断用作像目的あるいは放射線治療に使用できる。
【００８７】
ペプチドとメタロ構成分子ライブラリー及び無作為配列化学：
本願発明の方法を使用して、ペプチドとペプチドミメチックのライブラリーがデザインされる。それぞれの構成メンバーは金属との複合のための配位部位を提供するのに必要なＭＢＤ配列を含んでいる。このような配列はライブラリーの構成メンバー間で異なるかも知れない。ＭＢＤを金属と複合させると特定特異的構造が得られ、逆転構造の擬体を形成する。この複合体の特異的ステレオ化学的特徴（ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ）は複合金属イオンの配位球のステレオ化学（ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）によるものである。よって、金属の配位球の好適配列は配列拘束の特徴と範囲を決定して定義する。
【００８８】
本願発明のライブラリーは局所的あるいは全体的に拘束された構造の構成要素を含んでいる。ライブラリーは局所的または全体的、あるいはそれらの組み合わせ的な配列的拘束の分子を含むことができる。本願発明のこの特徴はスクリーニングシステムの積極的なヒットの多彩な合成法、スクリーニング法および構造解明法を含んでいる。これらの特徴の重要性は周知であり、以下の説明からも明白になろう。
【００８９】
一般的に、本願発明に有用な金属のほとんどは配位数４から６を有しており、稀に８を有している。このことは推定上のＭＢＤが、所定の形状と配位球の金属イオンとの結合を確立するようにステレオコンパチブル（ｓｔｅｒｅｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）な形態で配置された反応基による残基で製造されなければならないことを意味している。ペプチド鎖の配位基はアミン、アミド、イミダゾールまたはグアニジノ官能体の窒素原子、チオールまたはジスルフィドの硫黄原子、及びヒドロキシ、フェノール、カルボニルまたはカルボキシ官能体の酸素原子を含んでいる。さらに、ペプチド鎖または個々のアミノ酸を化学的に変質し、オキシーム、ヒドラジノ、スルフヒドリド、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、またはモルフォリノ基のごとき配位基を含ませることができる。配位数４の金属に対しては、テトラペプチドアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ等）が採用できる。または少なくとも１つのアミノ酸が配位基との側鎖を有したトリペプチドアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ等）も採用できる。側鎖は窒素、酸素または硫黄ベースの配位基を有することができる。従って、アミノ酸配列はＮ_４、Ｎ_３Ｓ、Ｎ_２Ｓ_２、ＮＳ_３、Ｎ_２ＳＯまたは類似したリガンドを提供することができ、窒素、硫黄、及び酸素原子を利用してテトラデンテート配位の金属イオンを産出できる。
【００９０】
本願発明の別実施例においては、ＭＢＤはアミノ酸残基と誘導アミノ酸またはスペーサ配列を含む。誘導アミノ酸とスペーサ配列は金属の様々な酸化状況で複合する窒素、硫黄、または酸素原子を有している。誘導アミノ酸の例にはアミド、第１アルキルまたはアリルアミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−２−カルボキシル酸及びその対応する７−ヒドロキシ誘導体、Ｎ−カルボキシメチル化アミノ酸、２’−メルカプト−Ｔｒｐ、Ｎβ−（２−メルカプトエタン）−α，β−ジアミノプロピオン酸及び他の類似アミノ酸の類似した高類似体、Ｎβ−（２−アミノエタン）α，β−ジアミノプロピオン酸及び他の類似アミノ酸の類似した高類似体、Ｎβ−（ピコリノイル）−α，β−ジアミノプロピオン酸及び他の類似アミノ酸の類似した高類似体、β−（ピコリルアミド）−Ａｓｐ−及び他の類似アミノ酸の類似した類似体、Ｎβ−（２−アミドメチルピリジン）−α，β−ジアミノプロピオン酸及び他の類似アミノ酸の類似した高類似体、β−（２−アミノ−ベンゾイル）−α，β−ジアミノプロピオン酸及び他の類似アミノ酸の類似した高類似体、β−（２−アミドメチルピリジン）−Ａｓｐ及び他の類似アミノ酸の類似した類似体、Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ酸、Ｎ−タートブチルオキシカルボニルアミノ酸、Ｎ−フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸及び他の類似したウレタン−保護アミノ酸誘導体、及びそれらに関連した他の誘導または合成アミノ酸が含まれる。本願発明に利用できるスペーサ配列の例には、２−メルカプトエチルアミン、サクシン酸、グルタル酸、２−メルカプトサクシン酸、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、グリコール、ポリエチレングリコール、チオグリコール酸、メルカプトプロピオン酸、ピリジン−２−カルボキシレート、ピコリルアミン、２−メルカプトアニリン、２−アミノ安息香酸及び２−アミノメチルピリジンがある。一般的に、連続配列を形成するために直接的または間接的にアミノ酸にリンクされ、金属イオンの原子価で複合に利用が可能な窒素、硫黄または酸素原子を有したどの配列もＭＢＤの要素として利用が可能である。
【００９１】
メタロライブラリーのＳ−保護されたチオール基化合物：
遊離チオール（ＳＨ）基は本願発明のペプチドとペプチドミメチックへのほとんどの金属の複合に好適である。多くの場合に、ＳＨ基は金属との安定した交換不活性複合体を形成するのに必要である。しかし、遊離ＳＨ基を有したペプチド及び他の有機分子は空中及び溶液中で容易に酸化され、ジスルフィドリンクした二量体をしばしば形成する。複数のＳＨ基が分子内に存在するなら、酸化は複合ポリマーを提供するであろう。同様に、遊離ＳＨ基を有した異なるペプチドまたは有機分子の混合物が準備されると、酸化は未知の組成の複雑なポリマー混合物を提供するであろう。ＳＨ基が金属複合に使用される場合、これはメタロペプチドまたは他の有機分子のライブラリーの構築において重要な問題である。
【００９２】
多様なＳＨ保護基は放射性薬剤の製造とデザインを含んで多種多様な目的で活用される。例えば、その保護形態であるＳ−ベンゾイル−メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン（Ｂｚ−ＭＡＧ３）は^９９ｍＴｃ複合中にＳ−Ｂｚ基が***する条件下でＴｃ−９９ｍ（^９９ｍＴｃ）の複合に使用されている。Ｓ−Ｂｚ保護の利用はペプチド合成の方法とは両立しない。
【００９３】
ＳＨ基を採用する本願発明のメタロペプチドライブラリーの構築には、混合されたプール合成が利用されるならペプチドはＳ−保護誘導体でなければならない。ＳＨ保護基は、（ａ）Ｓ−保護基とのペプチド誘導体の合成が溶液と固体相のペプチド合成の方法と両立し、Ｓ−保護基が合成中に安定しており、（ｂ）金属複合ステップ時に、固体相合成の場合には樹脂からクリーブ処理されることなくＳ−保護基がその場で保護解除できるように選択される。Ｂｚ−ＭＡＧ_３等の多くの従来技術法は上記の２つの基準の一方のみを満たす（Ｂｚ−ＭＡＧ_３は（ａ）のみを満たす）。
【００９４】
直交Ｓ−保護チオール基の使用は１体のポットでのメタロ化合物の合成を提供する。それぞれ直交Ｓ−保護基（“ＯＳＰＧ”）を含んだ化合物の混合は金属イオンとの複合に使用され、Ｓ−保護基が保護解除されるのは金属イオン複合時のみであり、ポリマー化と架橋化は回避される。この手続きはメタロ化合物の均質ライブラリーを提供する。
【００９５】
前記の基準を満たし、本願発明に使用できる１つのＯＳＰＧはＳＨ基を保護するためにＳ^ｔＢｕ（Ｓ−チオ−ブチルまたはＳ−ｔ−ブチル）基を採用する。このＳ^ｔＢｕ基はペプチド合成に典型的に利用される酸及び塩基のいずれに対しても安定している。さらにＳ^ｔＢｕ基は適当なホスフィン試薬を使用して還元することでクリーブ処理が可能である。この還元ステップは金属イオンのペプチドへの複合の直前に、あるいは複合と共に実行可能である。このようなＯＳＰＧクリーブ処理は樹脂からペプチドをクリーブせず、ペプチドの構造を変更することもない。
【００９６】
前述の基準を満たし、本願発明に適した別なＯＳＰＧはＳ−Ａｃｍ（Ｓ−アセトアミドメチル）基を利用してＳＨ基を保護する。Ａｃｍ基も酸及び塩基条件で安定しており、一般的にペプチド合成中に採用される。Ｓ−Ａｃｍ基は水銀（ＩＩ）アセテートまたは銀（Ｉ）タートラフルオロボレートとのＳ−Ａｃｍ−保護ペプチドまたはペプチド樹脂の処理によって取り除くことができる。これはその水銀または銀イオン複合状態でチオールペプチドを遊離させる。遊離チオール含有ペプチドは水銀または銀イオンとチオール複合塩をベータ−メルカプトエタノールあるいはジチオトレイトール等の大量のチオール含有試薬で処理することで回収できる。得られたペプチドは金属複合に使用される。あるいは、水銀または銀イオンとチオール複合ペプチドは望むメタロペプチドを形成させるために金属イオン複合試薬で直接的に処理できる。
【００９７】
メタロペプチドのためのＯＳＰＧの別例には４−メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル（Ｎｐｙｓ）及びＳ−スルフォネート（ＳＯ_３Ｈ）が含まれる。Ｍｍｔはジクロロメタン内の１％のＴＦＡでの処理で選択的に除去される。ＮｐｙｓとＳ−スルフォネートはベータ−メルカプトエタノールのごときチオール含有試薬またはトリブチルホスフィンのごときホスフィン試薬での処理で選択的に除去される。Ｎｐｙｓ基（Ｒ．Ｇ． Ｓｉｍｍｏｎｄｓ ＲＧ ｅｔ ａｌ： Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ， ４３： ３６３， １９９４）はペプチド合成のためのＢｏｃ化学で両立し、Ｓ−スルフォネート（Ｍａｕｇｒａｓ Ｉ ｅｔ ａｌ： Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ， ４５： １５２， １９９５）はＦｍｏｃとＢｏｃ化学の両方で両立する。Ｓ−アルキル、Ｓ−アリルまたはＳ−アラルキルの同族列から誘導された類似したＯＳＰＧも本願発明に利用できる。ＯＳＰＧの主要な特徴はそれがチオール含有アミノ酸と保護基からの１硫黄原子を利用してジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合の形成をもたらすことである。さらに、得られたジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合はホスフィン試薬及びチオール含有試薬等の種々なジスルフィドクリーブ剤を使用することでクリーブ処理できる。
【００９８】
Ｓ^ｔＢｕ保護ＳＨ基または他のＯＳＰＧを採用した方法は固体相または溶解ライブラリーの発生のために適用が可能である。固体相のライブラリーに対しては、ペプチドは通常のＦｍｏｃ化学を使用して合成できる。通常のＦｍｏｃ化学の場合には、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ−（Ｓ^ｔＢｕ）は中間アミノ酸を介して適当な樹脂にカップリングされ、追加アミノ酸はその後にＬ−Ｃｙｓ−（Ｓ^ｔＢｕ）残基にカップリングされる。Ｓ^ｔＢｕはＬ−またはＤ−Ｃｙｓ、及び金属イオンに結合できるＳＨ基で特徴付けられた他のアミノ酸（デザイナーまたは非天然アミノ酸及びそれらの擬体を含む）と共に利用できる。それらには、３−メルカプトフェニルアラニン及び３−メルカプトバリン（ペニシルアミン）等の他の関連３−メルカプトアミノ酸、２−メルカプトアセチック酸、３−メルカプトプロピオニック酸、２−メルカプトプロピオニック酸、３−メルカプト−３，３−ジメチルプロピオニック酸、３−メルカプト，３−メチルプロピオニック酸、３−メルカプト−３，３，−ジエチルプロプリオニック酸、２−メルカプト，２−メチルアセチック酸、３−シクロペンタエチレン，３−メルカプトプロピオニック酸、２−シクロペンタメスレン，２−メルカプトアセチック酸、及び関連アミノ酸が含まれる。これら全ての場合に、Ｓ−保護は前述のようにＳ^ｔＢｕ、Ｓ−Ａｃｍ、Ｍｍｔ、Ｎｐｙ、Ｓ−スルフォネート及び関連基によって提供可能である。
【００９９】
ＭＢＤへの金属イオン複合化：
ライブラリーの配列、特にＭＢＤへの金属イオンの複合化はその金属イオンとの配列の混合で達成される。これは適当なバッファを含んだ溶液で行うと便利である。１方法では金属イオンはペプチドまたはペプチドミメチック構成物質と混合されるとＭＢＤへの複合に好都合な酸化状態となる。いくらかの金属イオンはカルシウム（ＩＩ）、ポタシウム（Ｉ）、インジウム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）等の最適な安定酸化状態で複合化される。別の場合には、金属はＭＢＤに複合されるには低酸化状態に還元されなければならない。このことは、第一鉄、第二鉄、第一錫、第二錫、テクネチウムオキソ［Ｖ］、パーテクネテート、レニウムオキソ［Ｖ］、パーレネート、等々で証明されている。還元は配列との混合前、同時進行的または混合後に行うことができる。知られたどのような酸化状態への金属イオン還元手段でも利用できる。
【０１００】
金属イオンでの四座配位では、レニウムが好ましいイオンである。固相樹脂結合ペプチドまたはペプチドミメティック配列は、塩基としての１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンの存在下でのレニウム導入剤ＲｅＯＣｌ_３（ＰＰｈ_３）_２での処理によってレニウムイオンで標識することができる。別法として、可溶性ライブラリーにおけるペプチドまたはペプチドミメティック配列は、同様に、塩基としての１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンの存在下でのレニウム導入剤ＲｅＯＣｌ_３（ＰＰｈ_３）_２での処理によって標識することができる。塩基としての１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下での金属複合体化では、便宜には、雰囲気室温で達成することができる。
【０１０１】
金属複合体化の別の方法において、酢酸ナトリウムのごとき温和な塩基を用いることができる。この場合、溶液中の、または固相に結合したチオール−含有配列をＤＭＦ、ＮＭＰ、ＭｅＯＨ、ＤＣＭまたはその混合物のごとき適当な溶媒中に取り、酢酸ナトリウムを存在下にてレニウム導入剤ＲｅＯＣｌ_３（ＰＰｈ_３）_２と共に６０−７０℃まで１５分加熱する。同様に、トリエチルアミン、水酸化アンモニウム等のごとき他の塩基を使用することができる。本発明によると、溶液中のＳ−脱保護ペプチドの場合には、ＭｅＯＨはレニウム複合体化のための溶媒の好ましい選択である。依然として固相に付着したＳ−脱保護ペプチドのための溶媒選択は、固相の優れた溶媒和（膨潤）の考慮によって主としてガイドされる。ＤＭＦおよびＮＭＰを用いることができる。ＭｅＯＨ、およびＤＣＭ、ＣＨＣｌ_３等と組み合わせたこれらの溶媒の種々の混合物を用いて、最適化された複合体化の結果を得ることもできる。
【０１０２】
本発明の１つの具体例において、ＤＢＵおよびトリブチルホスフィンの存在下で、Ｓ^ｔＢｕ保護ペプチドをレニウム導入剤でイン・サイチュにて処理して、ワンポットでＳ−脱保護およびレニウム複合体化を行う。別法として、過レニウム酸レニウムの存在下でのレニウムのＳ^ｔＢｕ保護ペプチドへの複合体化は、Ｓｎ［ＩＩ］Ｃｌ_２での処理によって達成することができる。この試薬は、Ｓ−脱保護ならびにイン・サイチュでのＲｅＯ_４状態からＲｅＯへの状態への変換を行って、レニウムのＳ−脱保護ペプチドへの複合体化を引き起こす。本発明における好ましい手法は、トリブチルホスフィンでの処理によるＳ−脱保護と共にＳ^ｔＢｕ保護ペプチド、および室温でのＤＢＵの存在下におけるＲｅＯＣｌ_３（ＰＰｈ_３）_２を利用する得られたペプチドの金属複合体化の使用である。
【０１０３】
本発明のライブラリーにおいて、ＭＢＤは金属イオンとの複合体化に際して逆ターン構造を形成し、構成されたライブラリーでは、ＭＢＤ内のアミノ酸の側鎖が変化し、同様に、ＭＢＤの一部を形成しないアミノ酸も変化する。メタロペプチドのライブラリーにおける種々の化合物は、金属イオンと配位する場合に、ほとんど同様の幾何学の複合体を形成するように全てが最適化されているペプチドの組においてアミノ酸の配列を変化させることによって得ることができる。この最適化は、例えば、金属イオンに複合体化する高い親和性を有するアミノ酸の適当な位置決定によって得ることができる。金属複合体化のための高親和性を持つ天然に生じるアミノ酸の例はＣｙｓおよびＨｉｓを含む。従って、そのようなペプチドのライブラリーは、配列中に適切に入れられたこれらのアミノ酸の少なくとも１つを有し、このアミノ酸はライブラリー中の全ての分子に共通し、かくして、このアミノ酸はランダム化されていない。
【０１０４】
局所的立体配座の制限を用いて構築されるメタロペプチドの固相ライブラリーの一般化された図は：

【０１０５】
であり、ここに、Ｍは金属イオンであり、Ａ_１およびＡ_２は、ＢＢＤである逆ターン構造の部分を形成するアミノ酸側鎖であって、「ペプチド鎖」は１以上のアミノ酸を示す。また、構成成分が可溶性であって、かくして、樹脂に結合しない同様のライブラリを構築することもできる。
【０１０６】
本発明のもう１つの具体例は、全体的立体配座の制限を持つライブラリーの構築を提供する。この具体例において、ＭＢＤを一定に保持し、アミノ酸またはミメティックの配列のランダム化されたまたは選択されたシリーズを変化させてライブラリーを形成することができる。このタイプのライブラリーは、ＭＢＤが、環状ペプチド中のジスルフィド、ラクタム、ラクトン、チオエーテルまたはチオエステル部位に代えての等比容置き換えであるメタロペプチドを含む。これらの構築体において、組ＭＢＤは、調査中のアミノ酸またはミメティックスの配列のランダム化されたまたは選択されたシリーズを含有する線状ペプチドまたはペプチドミメティックの２つの予め選択された端部の間に導入される。このタイプのメタロペプチドライブラリーの一般的な構造は：

であり、ここに、Ｍは金属イオンであって、Ａ_１およびＡ_２は、金属複合体化に対してさらなる安定性を供することができるか、あるいは、クリアランスの器官の決定、または成体内分布パターンまたは薬物動態の変化のごとき生物学的活性を変調することができる構造エレメントである。「ペプチド鎖」はランダムに変化させることができ、それにより、ランダムライブラリーが得られ、あるいは標的分子の公知の特徴に基づいて、所定の様式で指令することができる。
【０１０７】
全体的に−拘束されたメタルペプチドライブラリーの１つの例は、ライブラリーの全ての個々のメンバーが金属イオン−結合ドメインを含み、当該ライブラリーが特異的にメラノコルチン受容体のファミリーに向けられたペプチドのライブラリーである。金属イオンへの複合体化の前における、ペプチドのこのライブラリーの一般式は：

【０１０８】
であり、ここに、Ｘは複数のアミノ酸を含む固定されたＭＢＤであり、従って、金属イオンの原子価の全ては金属イオンとＸとの複合体化に際して満足され、Ａ_１およびＡ_２は、各々、０ないし約２０のアミノ酸を含み、Ａａ_１、Ａａ_２およびＡａ_３は、各々、アミド、チオエーテル、チオエステル、エステル、カルバメートまたはウレタン結合を通じてＸに結合した１以上のアミノ酸を含み、ここに、Ａａ_１、Ａａ_２およびＡａ_３の各々は変化する。この例において、ＭＢＤはＯＳＰＧを含むことができる。配列中の他のチオールは、所望により、配列中の他のＳ−保護基の除去なくしてＯＳＰＧを除去することができるように、直交していないＳ−保護基を含むことができる。
【０１０９】
固相ライブラリーでは、ペプチド構築体は樹脂に付着し、樹脂は可溶性ライブラリーでは省略される。各これらのペプチドライブラリーの機能的同等物は、これらのペプチドの構造的ミミックをもたらすような非−アミノ酸形成ブロックのライブラリーの開発を介して得ることもできる。ペプチド結合は、チオアミド、チオエーテル、置換されたアミン、カルバネート、ウレタン、脂肪族部位および機能的に同様の構築体のごとき偽ペプチド結合によって置き換えることができる。
【０１１０】
ペプチドライブラリーは、ペプチド合成のよく知られた方法によって、前記した配列特定および変性に従ってまず組み立てられる。これらのライブラリーは、スプリット合成アプローチを用い、または可溶性ライブラリーの脱回旋技術によって、平行合成において区別される空間的にアドレス可能な化合物として合成することができる。同様の方法を用い、偽ペプチド、ペプチドミメティックまたは非ペプチドライブラリーを得ることができる。また、非−ペプチドライブラリーは、所望により、当業者によく知られた種々のタギングアプローチの１つに組み込むこともできる。固相および可溶性両ライブラリーはこのように得ることができる。次いで、全ライブラリーを適当な金属−複合体化剤と反応させ、同様のクラスの所定の構造を含む対応する金属配位ライブラリーを得る。例えば、ペプチドライブラリーをレニウムオキソ金属イオンと複合体化させるには、酢酸ナトリウムの存在下で、ペプチドライブラリーをＲｅ（Ｏ）Ｃｌ_３（ＰＰｈ_３）_２で処理することができる。この手法の結果、ＲｅＯとペプチドとの定量的複合体化がもたらされる。Ｚｎ、Ｃｏ、Ｍｎ、ＦｅまたはＣｕイオンを複合体化させるには、ペプチドライブラリーを、これらの金属イオンの塩化物または他の適当な塩で処理して、対応する金属イオンのライブラリーを得る。本質的には、種々の金属イオンを用いて、異なるメタロペプチドライブラリーを構築することができる。適当な金属イオンの選択における１つの限定的因子は、金属−ペプチド結合定数または複数定数に大きく関連する特定の金属−ペプチド複合体の相対的安定性である。当該分野では、いくつかの金属−ペプチド構築体が特定のｐＨまたは他の特殊な条件内のみで安定であり、または容易に空気中で酸化されることは良く知られている。ＲｅＯとのもののごとき、いくつかのペプチド−金属イオン複合体は純粋な形態で安定であり、単離し、通常の貯蔵条件下で長時間貯蔵することができる。
【０１１１】
本発明に従って構築されたメタロペプチドライブラリーは、先行技術で報告されている種々の技術によって、スクリーニングして、１以上の受容体−結合または薬理学的に活性なメラノコルチン受容体−特異的候補を同定することができる。可溶性および固相ライブラリーの双方はこれらのアッセイで直接的に使用することができる。これらの技術は、Ｌａｍおよび共同研究者によって記載された直接的標的結合アプローチ（Ｌａｍ ＫＳら：Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４，１９９１：Ｌａｍ ＫＳら， Ｎａｔｕｒｅ ３６０：７６８，１９９２）、脱回旋および対話的再−合成アプローチ（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ＲＡら：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５，１９８５；Ｂｅｒｇら：Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１１：８０２４−８０２６，１９８９；Ｄｏｏｌｅｙ ＣＴら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１９−２０２２，１９９４；Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅ ＳＥ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ３８：２２８０−２２８６，１９９４；Ｐａｎｉｌｌａ Ｃ：Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ３７：２２１−２４０，１９９５）、Ｔａｒｔａｒおよび共同研究者により２つの共合成したライブラリーの直交プールを用いるアプローチ（Ｄｅｐｒｅｚ Ｂら：Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １１７：５４０５−５４０６，１９９５）、対話型再−合成を排除するＨｏｕｇｈｔｏｎおよび共同研究者によって改正された位置走査方法（Ｄｏｏｌｅｙ ＣＴら：Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５２：１５０９−１５１７，１９９３；Ｐａｎｉｌｌａ Ｃら：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：９０１−９０５，１９９２：Ｐａｎｉｌｌａ Ｃら：Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｒｅｓ ３３：１３３−１４５，１９９２）、および位置走査方法とスプリット合成方法との組合せ方法 （Ｅｒｂ Ｅら：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９１：１１４２２−１１４２６，１９９４）を含む。
【０１１２】
これらの技術の中で、脱回旋および対話型再合成アプローチ、２つの共合成されたライブラリーの直交プールを含むアプローチおよび位置走査方法を直接的に可溶性メタロペプチドライブラリーに適用して、スクリーニングプロセスにおける受容体−結合または薬理学的に活性な候補として同定された「ヒット」またはペプチドの構造を解明することができる。空間的にアドレス可能な平行合成ライブラリー以外の固相ライブラリーでは、当業者に良く知られた種々の戦略によってヒットの構造を直接的に決定することができる。これらは、マトリックス−援助レーザー収着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）技術の使用による、粒子の固相マトリックスに共有結合した化合物の直接的質量分析を含む（Ｓｉｕｚｄａｋ Ｇら：Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ６：９７９，１９９６；Ｂｒｏｗｎ ＢＢら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ １：４−１２，１９９５）。ライブラリー組立の間の合成工程の各々における部分的に端部がキャッピングされた一連の化合物を創製する技術もまた質量分析による明確な同定の助けになる（Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ ＲＳら：Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １１７：３９００−３９０６，１９９５；Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ ＲＳら：Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒ ８：７７−８１，１９９４）。これらの分析技術に加えて、非−ペプチドおよび非ヌクレオチドライブラリーを含めた、有機分子−ベースのライブラリーにおける構造解明のために工夫された種々のコーディング戦略を利用することができる。ＤＮＡコーディング、ペプチドコーディング、ハロ芳香族タグコーディング、およびラジオ周波数トランスポンダーに基づくコーディングのごとき種々のコーディング戦略は今日当該分野でよく知られており、それをメタルペプチドライブラリーとの組合せで直接的に用いることができる。これらのタギング戦略は、ライブラリーの合成の進行の間にタグの取り込みを必要とし、これはメタルペプチドライブラリーの構築の間に達成することができる。というのは、金属複合体化は最終の合成後工程だからである。
【０１１３】
メラノコルチン受容体−特異的ライブラリーメンバーの構造の多様性。本発明で使用することができる分子鋳型のいくつかの例が、四座金属イオン複合体化につき以下に示される。一般に、これらの分子鋳型は、提案された置換によって、アゴニストまたはアンタゴニスト化合物であり得るメラノコルチン受容体−特異的化合物の決定で用いられるメラノペプチドのライブラリーを生起させる本発明のメタルペプチドの群を定義する。鋳型は金属イオンなくして提供され、化合物は、金属イオン複合体化に際してのみメラノコルチン受容体に対する増強された特異性を呈することが理解される。
【０１１４】
Ｒ_１−Ｌｌｌ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２ 鋳型１
および
Ｒ_１−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｃｃｃ−Ｒ_２ 鋳型２
ここに、Ｒ_１は、補助的または第２の受容体接触を供することを含むが、それに限定されない、分子の残りの固有の活性を増強するいずれかの官能基である。１ないし約４の中性または荷電Ｌ−またはＤ−立体配置アミノ酸残基のアミノ酸を含めた、種々のアミノ酸および非−ペプチド基のいずれかを使用することができる。もしＲ_１が非−ペプチド基であれば、それは直鎖状または分岐状アルキル、アリール、アルケン、アルケニルまたはアラルキル鎖であり得る。
【０１１５】
ここに、Ａａａは、正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸である。好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸を含めた、Ｌ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｍ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含む。Ａａａは金属イオン複合体化のためのＮ（窒素原子）を供する。
【０１１６】
ここに、Ｂｂｂは、芳香族側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸である。好ましいアミノ酸は、Ｄ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含む。Ｂｂｂ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で官能性化することができる。Ｂｂｂは金属イオン複合体化のためのＮを供する。
【０１１７】
ここに、Ｃｃｃは、金属イオン複合体化のための、アルファアミノ基からのＮおよび側鎖基からのＳ（硫黄原子）双方を供するアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＣｙｓ、ＰｅｎおよびＨｃｙｓを含む。
【０１１８】
ここに、Ｌｌｌは芳香族側鎖を持つＤ−立体配置のアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含む。Ｌｌｌ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で官能性化することができる。Ｌｌｌは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１１９】
ここに、Ｒ_２は芳香族側鎖を持つアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸双方を含む。Ｃ−末端は遊離であるかまたはアミド化されていてもよい。Ｒ_２は前記したもののいずれかの対応するデス−カルボキシルアミノ酸でもあり得る。別法として、Ｒ_２は排除され得る。
【０１２０】
図１は鋳型１の構造を示し、図２は鋳型２の構造を示し、双方の場合、四座配位圏金属イオンとの配位を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合がもたらされる。
【０１２１】
Ｒ_１−Ｄｄｄ−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｒ_３ 鋳型３
ここに、Ｒ_１、ＢｂｂおよびＡａａは前記した通りである。
【０１２２】
ここに、Ｄｄｄは、金属イオン複合体化のための、側鎖基からのＳを供するアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＣｙｓ、ＰｅｎおよびＨｃｙｓを含む。
【０１２３】
ここに、Ｒ_３は、金属イオン複合体化のためのＮを供する芳香族側鎖を持つアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸を共に含む。Ｃ−末端は遊離したものであるかまたはアミド化することができる。Ｒ_３は前記したもののいずれかの対応するデス−カルボキシルアミノ酸でもあり得る。
【０１２４】
図３は鋳型３の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合がもたらされる、四座配位圏金属イオンとの配位を示す。
【０１２５】
Ｒ_４−Ｅｅｅ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２ 鋳型４
ここに、Ｒ_２、ＢｂｂおよびＣｃｃは前記した通りである。
【０１２６】
ここに、Ｒ_４はカチオン中心を供する官能基である。好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｍ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸の双方を含む。アミノ酸のＮ−末端は、直鎖状または分岐状のアルキル、アリール、アルケン、アルケニル、またはアラルキル鎖を含めた、種々の中性アミノ酸および非−ペプチド基のいずれかで官能性化することができる。
【０１２７】
ここに、Ｅｅｅは、金属イオン複合体化のためのＮを供する非荷電Ｌ−またはＤ−立体配置アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＧｌｙおよびＬ−立体配置のＡｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸を共に含む。好ましい具体例において、Ｅｅｅは脂肪族側鎖を持つアミノ酸である。
【０１２８】
図４は、鋳型４の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合をもたらす、四座配位圏金属イオンを持つ配位を示す。
【０１２９】
Ｒ_１−Ｆｆｆ−Ａａａ−Ｇｇｇ−Ｃｃｃ−Ｒ_５ 鋳型５
ここにＲ_１、ＡａａおよびＣｃｃは前記した通りである。
【０１３０】
ここにＦｆｆはＬ−またはＤ−立体配置の芳香族アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、Ｔｉｃ、ＴｉｑまたはＴｃａ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸の双方を含む。Ｆｆｆ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で置換することができる。Ｆｆｆは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１３１】
ここに、ＧｇｇはＬ−またはＤ−立体配置の芳香族アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、，Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸双方を含む。Ｇｇｇ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で置換することができる。Ｇｇｇは金属イオン複合体化のためのＮを供する。
【０１３２】
ここに、Ｒ_５は、好ましくは、アミド、置換されたアミド、エステルまたはカルボキシレート基である。Ｒ_５は、芳香族、脂肪族、中性または荷電アミノ酸を含めたＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸またはアミノ酸アミドでもあり得る。
【０１３３】
図５は鋳型５の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合をもたらす、四座配位圏金属イオンを持つ配位を示す。
【０１３４】
Ｒ_１−Ｈｈｈ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_５ 鋳型６
ここに、Ｒ_１、Ａａａ、Ｂｂｂ、ＣｃｃおよびＲ_２は前記した通りである。
【０１３５】
ここに、Ｈｈｈは正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸を共に含む。Ｈｈｈは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１３６】
図６は鋳型６の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合をもたらす四座配位圏金属イオンとの配位を示す。
【０１３７】
Ｒ_１−Ｉｉｉ−Ｉｉｉ−Ｃｃｃ−Ｊｊｊ−Ｋｋｋ−Ｒ_２ 鋳型７
ここに、Ｒ_１、ＣｃｃおよびＲ_２は前記した通りである。
【０１３８】
ここに、Ｉｉｉは、金属イオン複合体化のためのＮを供するＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびその誘導体アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸の双方を含む。
【０１３９】
ここに、Ｊｊｊは芳香族側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸である。好ましいアミノ酸はＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含む。Ｊｊｊ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で官能性化することができる。Ｊｊｊは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１４０】
ここに、Ｋｋｋは正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸の双方を含む。Ａａａは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１４１】
図７は鋳型７の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合をもたらす、四座配位圏金属イオンを持つ配位を示す。
【０１４２】
前記した鋳型は、テクネチウムおよびレニウムの種々の形態のごとき四座配位圏金属イオンと共に使用することができる。他の配位圏の金属イオンでの使用のために、対応する鋳型を構築することができる。
【０１４３】
本発明の代表的なペプチド：
本発明の代表的なペプチドはここに記載したライブラリーおよび合成方法を用いて作成され、選択されたペプチドを結合アッセイを用いてテストした。
【０１４４】
ここに、Ｋｋｋは正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸である。好ましいアミノ酸はＬ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、天然および合成アミノ酸の双方を含む。Ａａａは金属イオン複合体化のためのＮを供しない。
【０１４５】
図７は鋳型７の構造を示し、Ｎ_３Ｓ_１金属イオン結合をもたらす四座配位圏金属イオンとの配位を示す。
【０１４６】
前記した鋳型は、種々の形態のテクネチウムおよびレニウムのごとき四座配位圏金属イオンで使用することができる。他の配位圏の金属イオンで用いるために、対応する鋳型を構築することができる。
【０１４７】
本発明の代表的なペプチド：
本発明の代表的なペプチドはここに記載したライブラリーおよび合成方法を用いて作成され、結合アッセイを用いてテストした。表１は本発明のペプチド、および競合阻害結合アッセイの結果を記載する。ペプチドは、通常のペプチド合成方法を用いて合成し、ここに記載した方法を用いてレニウムと複合体化させた。
【０１４８】
競合阻害結合アッセイは、ｐＨ７．２の１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ＣａＣｌ_２および５ｍＭ ＫＣｌを含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ中の０．４ｎＭ ^１２５Ｉ−ＮＤＰ−アルファ−ＭＳＨ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて（ＭＣ１−Ｒを含有する）ｈＭＣ４−ＲおよびＢ−１６マウス・メラノーマ細胞から調製した膜を用いて行った。アッセイチューブは、^１２５Ｉ−ＮＤＰ−アルファ−ＭＳＨのその受容体への結合を阻害するにおけるその効力を測定するために、示されたレニウム金属イオンに複合体化された選択された濃度の本発明のテストペプチドを含有した。非特異的結合は、１μＭアルファ−ＭＳＨの存在下でのアッセイにおける^１２５Ｉ−ＮＤＰ−アルファ−ＭＳＨの結合の完全な阻害によって測定した。インキュベーションは室温にて９０分間であり、その後、アッセイ混合物を濾過し、膜を氷冷緩衝液で３回洗浄した。フィルターを乾燥し、膜に結合した残りの放射能につきガンマカウンターにて計数した。１００％特異的結合は、１μＭアルファ−ＭＳＨの不存在下および存在下での細胞膜に結合した放射能（ｃｐｍ）の差と定義した。テスト化合物の存在で得られたｃｐｍは１００％特異的結合に対して正規化して、^１２５Ｉ−ＮＤＰ−アルファＭＳＨ結合のパーセント阻害を測定した。各アッセイは三連で行い、現実の平均値を表１に記載する。「％阻害」下の表１中の負の数は実験偏差に由来し、阻害がないことを示し；同様に、１００％を超える値もまた実験偏差に由来し、完全な阻害を示す。
【０１４９】
【表１】

【０１５０】

【０１５１】
本願発明の選択されたペプチドに対して、ｃＡＭＰアッセイも実施された。人のＭＣ４−ＲまたはＢ−１６細胞は９６穴プレートの集合（約２５００００細胞／穴のプレート処理）に成長した。３つの同一セットの細胞は０．２ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）と、選択濃度のレニウム金属イオン複合ペプチド及び２０ｎＭα−ＭＳＨの存在下のレニウム金属イオン複合ペプチドで処理された。２０ｎＭα−ＭＳＨのみで同様に処理された細胞はポジティブコントロールとして作用した。ネガティブコントロールとしての緩衝液ブランクも含まれた。培養は２７℃で１時間実施され、その後に培養液は吸引され、細胞は１５０μリットルのＨＣｌで取り出された。１００μリットルのこの溶液内に蓄積した全ｃＡＭＰは、キット供給会社が指定する方法で低ｐＨのｃＡＭＰアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステム）を使用して定量された。表は、テスト化合物のみに露出されたもの、及び２０ｎＭα−ＭＳＨの存在下の細胞内に蓄積したｃＡＭＰの量を示す。ポジティブコントロール（α−ＭＳＨの存在下のバッファブランク）と同じ範囲であるかそれ以上のｃＡＭＰ蓄積を示すレニウム金属イオン複合ペプチドはアゴニストリガンドであると考えられる。ネガティブコントロール（α−ＭＳＨの不存在下のバッファブランク）と同じ範囲の蓄積を示すレニウム金属イオン複合ペプチドは、もし結果が、α−ＭＳＨもアッセイ中に存在するポジティブコントロールと類似したものであればテスト濃度では効果を示さない。ネガティブコントロールと同じ範囲の蓄積を示すレニウム金属イオン複合ペプチドは、α−ＭＳＨがアッセイに存在するとき、ｃＡＭＰの抑制が存在するならアンタゴニストと考えられる。ポジティブコントロール以上の値はレニウム金属イオン複合ペプチドとα−ＭＳＨの有効なアゴニズム、実験的偏差または協力アゴニスト効果によるものである。
【０１５２】
【表２】

【０１５３】
これまでの実験に基づき、潜在的なリード分子が同定され、これは以下のものを含む：
ＰＬ−１１４５ ＭＣ１−Ｒアゴニスト （鋳型２）
ＰＬ−１１４４ ＭＣ１−Ｒアゴニスト （鋳型２）
ＰＬ−１４９３ ＭＣ４−Ｒアンタゴニスト （鋳型１）
ＰＬ−１８８３ ＭＣ４−Ｒアゴニスト （鋳型１）
ＰＬ−１４８９ ＭＣ４−Ｒアンタゴニスト （鋳型５）
ＰＬ−１９５０ ＭＣ４−Ｒ特異的 （鋳型５）
ＰＬ−１９４７ ＭＣ４−Ｒ特異的 （鋳型５）
ＰＬ−１５８１ 非特異的アゴニスト （鋳型５）
ＰＬ−１７９０ 非特異的アゴニスト （鋳型５）
ＰＬ−１７９１ 非特異的アゴニスト （鋳型５）
ＰＬ−１７９２ 非特異的アゴニスト （鋳型５）
ＰＬ−１６０５ 非特異的アンタゴニスト （鋳型６）
ＰＬ−１７５８ 非特異的 （鋳型４）
ＰＬ−１８７７ ＭＣ４−Ｒ特異的 （鋳型４）
ＰＬ−１９０２ ＭＣ４−Ｒ特異的 （鋳型４）
ＰＬ−１９０９ ＭＣ４−Ｒ特異的アゴニスト （鋳型４）
ＰＬ−１８８８ ＭＣ４−Ｒ特異的 （鋳型７）
ＰＬ−１２６９ ＭＣ４−Ｒ特異的アンタゴニスト （鋳型３）
ＰＬ−１２９７ ＭＣ４−Ｒ特異的アンタゴニスト （鋳型３）
放射性医薬適用。１つの具体例において、ＭＣ１−Ｒ特異的である本発明のメタルペプチドは、メラノーマ腫瘍転移をイメージするために放射線診断剤としての^９９ｍＴｃに複合体化させた場合、およびメラノーマ腫瘍および転移性腫瘍の治療のために放射線治療剤としてのレニウム−１８８（^１８８Ｒｅ）、レニウム−１８６（^１８６Ｒｅ）または他の治療放射性核種に複合体化させた場合に用いることができる。
【０１５４】
ヒト・メラノーマは複雑な抗原プロフィールを有する。一般に悪性メラノーマはＤＯＰＡ陽性メラノサイト、メラニン（皮膚色素）生産ユニットからのＵＶ活性によって駆動されると考えられる。主な診断は、プレ−メラノソームの存在または不存在を明らかにするための電子顕微鏡調査を含む。メラニン性メラノーマは樹状、紡錘、風変わりな線模様、大きなエピセロイド、小さな母斑等に分類される。他方、無メラニン性メラノーマは頻繁に誤って診断される。なぜならば、これらの細胞の組織学は悪性リンパ種、カルシノーマまたは肉腫のそれに似ているからである。従って形態学的評価は臨床的診断で信頼できると判明していないであろう。かくして、特に、転移性メラノーマ腫瘍を同定し、位置決定するための受容体−特異的診断テストに対する要望がある。
【０１５５】
いくつかの研究は、初代ヒト・メラノーマ細胞でのメラニン細胞刺激ホルモン受容体の存在を記載している。メラニン細胞刺激ホルモン受容体はメラニン性および無メラニン性ヒトメラノーマ腫瘍に対するマーカーとして報告されている。特に、ＭＣ１−Ｒの存在は、ＭＣ１−Ｒに対する抗体によってヒト・メラノーマ細胞で示されている。
【０１５６】
メラニン細胞刺激ホルモン生物活性配列またはメッセージセグメントは、逆ターンとして存在するテトラペプチドＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐである。逆ターン内では、Ｈｉｓ、ＰｈｅおよびＴｒｐ残基は疎水性受容体結合表面を形成すると仮定されている。Ｈｉｓ残基は、最近、ＭＣ１−ＲおよびＭＣ４−Ｒの間を識別するのを助ける単一残基として同定されている。かくして、ＭＣ１−Ｒに特異的であり、高い親和性をもってＭＣ１−Ｒに結合するが、ＭＣ４−Ｒに対して特異的でないか、または低い親和性をもってＭＣ４−Ｒに結合する本発明のメタロペプチドをデザインすることが可能である。１つの結果は、ＭＣ１−Ｒに対して高い特異的親和性および選択性をもつ^９９ｍＴｃ−標識ラジオイメージング剤である。加えて、本発明のアゴニストおよびアンタゴニストの量メタロペプチドが、メラノーマ腫瘍をイメージするうえで比較評価で考えられる。
【０１５７】
該製品は、未複合体化状態のペプチド、緩衝液、および過テクネチューム酸のための還元剤中のペプチドを含有する単一バイアルの凍結乾燥された放射性標識キットとして処方することができる。メタロペプチドをもたらす放射性標識を誘導するには、過テクネチューム酸ナトリウムの添加後にバイアルをインキュベートする。
【０１５８】
^９９ｍＴｃで標識する１つの方法において、０．００１Ｎ塩酸中に取ったペプチドの５−１０μｇ試料を５ｍｌ血清バイアル中の１−３０ｍＣｉの発生器−溶出Ｎａ^９９ｍＴｃＯ_４と混合する。得られた混合物の容量を、注射用生理食塩水を用いて６００μｌに調整する。４００μｌ容量の新たに調製され窒素をパージされたフタルサン−酒石酸−Ｓｎ（ＩＩ）緩衝液（４０：１０：１ ｍＭ）を、窒素ヘッドスペース下でバイアルに添加する。バイアルをただちにシールし、遮蔽された沸騰水浴中に置く。１５分後、バイアルを水浴から取り出し、室温まで冷却させる。ＨＰＬＣプロフィールから計算された放射性化学純度は９０−９９％の範囲である。
【０１５９】
別法として、酒石酸−琥珀酸−第一スズ緩衝液、ＥＤＴＡ−琥珀酸−第一スズ緩衝液、グルコヘプトネート中に安定化された第一スズ、または放散−酒石酸−第一スズ緩衝液の使用を含めた他の手段、ならびに当該分野で知られた^９９ｍＴｃで標識する他の手段によって、本発明のペプチドを別法として^９９ｍＴｃで標識することができる。
【０１６０】
放射性医薬および他の医薬の適用では、当該分野で知られたいずれかの手段によって、本発明のメタロペプチドを対象に送達することができる。これは静脈内注射、皮下注射、粘膜を通じての投与、経口投与、皮膚投与、器官、腔または領域等への局所投与等を含む。
【０１６１】
イメージングは、ガンマカメラおよびＳＰＥＣＴイメージングを含めた当該分野で知られたいずれかの手段によることができる。イメージングは投与直後に開始することができ、時間進行放射性グラフィック実験を含むことができ、イメージを得ることができる限りイメージングを続ける事ができる。
【０１６２】
本発明のＭＣ１−Ｒ特異的メタロペプチドは、メラノーマ特異的腫瘍イメージングおよび病期分類剤として用いることができる。これらの使用は主要および散在性病巣の初期検出および位置決定、病巣を含有するリンパ節の同定、放射性免疫ガイド外科適用等を含む。ＭＣ１−Ｒに対して選択的な本発明の^９９ｍＴｃ−標識メタロペプチドを用いる腫瘍イメージングは、さらに、外科的、放射線または化学治療にかかわらず、最適な臨床的処置様式を処方するのを助けるであろう。
【０１６３】
化学的予防適用：
もう１つの具体例において、ＭＣ１−Ｒ特異的である本発明のメタロペプチドは、紫外線照射のごとき太陽誘発に対する化学予防剤、ヒト皮膚における新形成活性として用いることができる。本発明のＭＣ１−Ｒアゴニストメタロペプチドを使用して、表皮メラノサイトを刺激し、メラニンを生成し、ならびにフエオメラニンをユーメラニンに変換することができる。濃い茶色または黒色の色素沈着であるユーメラニンは、黄色または赤色色素沈着であるフエオメラニンよりも光保護的であると考えらる。
【０１６４】
一般に、より濃い色の皮膚の個体はより明るい皮膚の人々よりも皮膚癌の発生率が低い。濃い色素ユーメラニン、ドーパ−ベースの構造ユニットを取り込む茶色−黒色色素は皮膚中の主な光保護剤である。明るい色の人々はより高いレベルのフエオメラニン、種としてシステインおよび効果的でない紫外線吸収剤である関連した硫黄−ベースの構造ユニットを有する赤色／黄色色素を有する。メラニン発生のプロセスは、表皮メラノサイトにおけるＭＣ１−Ｒの刺激、それによる、これらの色素細胞内のチオシナーゼ酵素の刺激の媒介、チロシンのドーパへの変換の誘導、次いでのドーパキノンを通ってのユーメラニンへの変換を含むと考えられる。直接的な太陽への露光による日焼けもまた、表皮中のＰＯＭＣ遺伝子からのメラニン細胞刺激ホルモンペプチドの局所的な生産による同一経路に由来すると提唱されている。かくして、ユーメラニン生産の刺激およびフエオメラニンからユーメラニンへの変換は、太陽または紫外線に誘発された皮膚中での新形成活性をブロックするにおける望ましい化学予防様式で有り得る。
【０１６５】
本発明の優れた高親和性および高選択性ＭＣ１−Ｒアゴニストメタロペプチドは、従って、皮膚メラノサイト中で新形成活性を誘発する有害な太陽または紫外線への暴露と戦うために治療化学予防剤として用いることができる。
【０１６６】
特に、以前にメラノーマと診断されて、またはメラノーマに対して高度に感受性であると診断された個体では、いずれの有意な紫外線暴露の回避も医学的に必要である。現在、帽子、長いスリーブ等のごとき物理的スクリーン、および種々の太陽光線または紫外線保護クリームおよび処方の双方が利用される。しかしながら、最良の化学的太陽光線ブロックでさえ、その絶対的および時間の関数としての効率は制限され、物理的スクリーンは多くの活性で不適切である。これは、水泳、ハイキング、スキー、スポーツイベントへの参加、戸外環境での雇用のごとき許容されないほど高い紫外線用量または前記した正常な活動を受ける個体となる。
【０１６７】
表皮メラノサイトでＭＣ１−Ｒの活動を通じて行われるユーメラニンの生産は、どの太陽光ブロックよりも太陽光（紫外線）誘発突然変異およびＤＮＡ損傷に対して天然の遮蔽を提供する。ユーメラニンは商業的に入手可能などの太陽光保護クリームまたは処方よりも広い範囲にわたって良好な紫外線吸収剤である。
【０１６８】
この適用のためのメタロペプチドは、レニウム、または本明細書中で特定された他の金属の非放射性同位体で、本明細書中で特定されたまたは当該分野で公知のいずれかの手段による金属イオン複合体化で作成することができる。メタロペプチドは、限定されるものではないが、錠剤、カプセル財、カプレット、懸濁液、粉末、凍結乾燥形態およびエアロゾルを含めた当該分野で公知のいずれかの手段によって処方することができ、緩衝液、バインダー、安定化剤、抗酸化剤および当該分野で知られた他の剤と混合し、それで処方することができる。メタロペプチドは、限定されるものではないが、静脈内注射、皮下注射、粘膜を通じての投与、経口投与、皮膚投与、皮膚パッチ、エアロゾル等を含めた、当該分野で知られたいずれの全身または部分的全身手段によって投与することができる。
【０１６９】
治療的適用：
もう１つの具体例において、ＭＣ４−Ｒアゴニストである本発明のメタロペプチドは、病理的肥満および関連疾患の治療を含めた、エネルグー代謝および食事挙動を修飾するための治療剤として用いることができる。また、ＭＣ４−Ｒアンタゴニストである本発明のメタロペプチドは、食欲不振の治療のごとき、摂食障害における治療剤として用いることもできる。
【０１７０】
摂食および飽食に対する制御中心は視床下部にある。これらの応答は、視床下部における特異的受容体を介してシグナリングを行う多様なホルモンおよび可溶性因子によって決定される。ＭＣ４−Ｒは脳で発現されることが知られており、遺伝子標的化によるこの受容体の不活化の結果、多食、高インスリン血症および高血糖症に関連する成熟−開始肥満症候群を持つマウスが得られている。
【０１７１】
さらにもう１つの具体例において、本発明のメタロペプチドは、男性の***不全および女性の性的不全双方を含めた、性的不全の治療のための治療剤として用いることができる。さらにもう１つの具体例において、本発明のメタロペプチドは、具体的にはＭＣ１−ＲおよびＭＣ３−Ｒアゴニストメタロペプチドを含めた、炎症の治療のための治療剤として用いることができる。
【０１７２】
本出願のメタロペプチドは、レニウム、または本明細書中で特定された他の金属の非放射性同位体で、本明細書中で特定したまたは当該分野で知られているいずれかの手段による金属イオン複合体化で作成することができる。メタロペプチドは、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、カプレット、懸濁液、粉末、凍結乾燥形態およびエアロゾルを含めた当該分野で知られたいずれかの手段によって処方することができ、緩衝液、バインダー、安定化剤、抗酸化剤および当該分野で知られた他の剤と混合し、それで処方することができる。メタロペプチドは、限定されるものではないが、静脈内注射、皮下注射、粘膜を通じての投与、経口投与、皮膚投与、皮膚パッチ、エアロゾル等を含めた、当該分野で知られたいずれかの全身または部分的に全身手段によって投与することができる。
【０１７３】
以下の非限定的実施例によって本発明をさらに説明する。
【０１７４】
実施例１ メラノコルチン受容体のためのプロトタイプのメタロペプチドライブラリーの開発
ライブラリーデザインは、テトラペプチドメッセージ配列、αーＭＳＨのＨｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ（６−９配列）に基づいた。この配列は逆ターンとして存在し、それを、本発明のメタロペプチド様式への変換に適したものとする。このアプローチにおいて、メタロペプチドは、レニウム金属イオンのためにデザインしたトリペプチドＮ_３Ｓ_１ＭＢＤの周りにデザインした。ＭＢＤを誘導体化して、メラノコルチン（「ＭＣ」）受容体についての推定候補としてのペンタペプチドＡｃ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２を得た。構造中のさらなる改善は、アミノ酸側鎖のキラルティーを含めた他の考慮に応じてなし、鋳型構造Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２を生じた。レニウムへの結合後におけるこのペプチドの構造は：

【０１７５】
である。
【０１７６】
該鋳型構造を用いて、スプリット合成方法を利用して小さな無作為配列ライブラリーを規定した。該無作為配列ライブラリーのために選択した最終鋳型はＡｃ−Ｄ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２であり、ここに、ＸａａはＤ−（２’）ナフチルアラニン、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−ホモＰｈｅ、またはＤ−フェニルグリシンであった。このライブラリーについては、ペプチド樹脂、Ｃｙｓ（Ｓ^ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−樹脂を４つの等しい部分に切断した。各部分は４つのＸａａタイプの内の１つと反応した。カップリングの後、樹脂プールを混合し、単一プールにて合成を継続してＨｉｓ残基をカップリングした。最終の結果は単一プール中の４つの別々のペプチドであり、各ペプチドはＸａａ位置において１つのアミノ酸だけ変化している。
【０１７７】
Ｓ^ｔＢｕ ＯＳＰＧ基を用いて、合成の間、ＳＨ基を保護した。酸不安定側鎖保護基でのＦｍｏｃ化学を用いるペプチド鎖の固相組立ての後、トリブチルホスフィンを用いてＳ^ｔＢｕ ＯＳＰＧ基を切断した。塩基としての１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンの存在下で、得られた遊離ＳＨ−含有ペプチド−樹脂をレニウム導入剤Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ_３（ＰＰｈ_３）_２で処理した。次いで、得られたメタロペプチド樹脂をＴＦＡで処理して、それを樹脂から切断し、全ての側鎖保護基を脱保護した。生成物を質量分析によって分析した。ＨＰＬＣ分析を行い、個々のピークを収集し、質量分析に付した。得られたペプチドを電子スプレー質量分析によって分析し、ペプチドに複合体化したレニウムを含めた予測された質量が得られた。
【０１７８】
実施例２ メラノコルチン受容体−特異的メタロペプチドライブラリーのデザインおよび合成
該ライブラリーは、膜貫通領域４、５、６および７における受容体芳香族残基の疎水性ネットワークと相互作用する、メラニン細胞刺激ホルモン側鎖ファルマコフォアＤ−Ｐｈｅ^７およびＴｒｐ^９を含めた、メラノコルチン受容体およびメラノコルチン受容体に特異的なペプチド配列に関連するデータに基づいて合理的にデザインした。デザインの基準に基づき、メラノコルチン受容体に対するファルマコフォアを予備的に規定し、優れた受容体−選択的アゴニストの同定のために無作為配列ライブラリーをデザインした。
【０１７９】
デザイン基準に基づいて、推定構造Ｒ−Ａａａ−Ｂａａ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｃａａ−ＮＨ_２を選択し、ここに、Ａａａ、ＢａａおよびＣａａの各々は２−Ｎａｌ（１）、Ｐｈｅ（２）、Ｔｒｐ（３）、Ｔｙｒ（４）およびＡｌａ（５）のＬ−またはＤ−異性体から選択され、従って、前記のいずれか１つはＡａａ、ＢａａまたはＣａａいずれか１つに代えて置き換えることができる。ライブラリーデザインのために採用した命名法において、５つのアミノ酸は１から５で命名し、通常は異性を注記し、従って、例えば、Ｂａａ_２ＬはＢａａにおけるＬ−Ｐｈｅをいう。
【０１８０】
末端Ｒ基はＡｃ、Ｃ_６Ｈ_５ＯＯＨ、ＣＨ_３（ＣＨ_２）_５−ＣＯＯＨ、Ｃ_６Ｈ_５ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＨ（トランス）およびピリジン−３−カルボキシレートから選択した。末端Ｒ基は切形アミノ酸を表し、さらなる構造的多様性を提供する。
【０１８１】
プールおよびスプリットライブラリー合成スキームは５０００の別々の化合物が合成され、その結果、各々が２５の異なる化合物を含有する２００の最終プールが得られ、該化合物はＡａａおよびＢａａ位置におけるアミノ酸によってのみ異なるように使用した。この方法を用い、Ｃａａアミノ酸またはＲ末端基に関連する結合特徴を群間比較を通じて同定し、それにより、脱回旋を簡略化する。
【０１８２】
ライブラリー合成工程を図８に記載する。工程１の樹脂を１０の群に分けた。工程２では、Ｃａａ_１ＬからＣａａ_５Ｄまでの各々を個々の樹脂群にカップリングさせ、Ｌ−Ｃｙｓを各樹脂群にカップリングさせ、１０の群および２０のカップリングが得られた。次いで、工程２の樹脂群の各々を工程３に示した１０亜群に分けた（工程３では１つの亜群のみが示され、工程３の各亜群では、Ｂａａ_１ＬからＢａａ_５Ｄの各々を亜群内の１つの群にカップリングさせ、その結果、１０亜群中の１００群および１００カップリングが得られた）。工程３の各亜群では、５つのＢａａ_ｘＬメンバーおよび５つのＢａａ_ｘＤメンバーを工程４において別々にプールし、２０の亜群が得られ、各亜群はＢａａ_ｘメンバーによって異なる５つの異なる配列を含有する。次いで、工程５において工程４の２０の亜群の各々を１０の群に分け（図８では例示目的でただ１つを示 す）、各亜群では、Ａａａ_１ＬからＡａａ_５Ｄの各々を亜群内の１つの群にカップリングさせ、その結果、２０亜群中の２００群および２００カップリングが得られた。工程５の各亜群では、５つのＡａａ_ｘＬメンバーおよび５つのＡａａ_ｘＤメンバーを工程６において別々にプールし、その結果４０の亜群が得られ、各亜群はＢａａ_ｘおよびＡａａ_ｘメンバーによって異なる２５の異なる配列を含有する。工程７において、工程６の４０の亜群の各々を５つの群に分け、Ｒ_１ないしＲ_５の各々を亜群内の１つの群にカップリングさせ、その結果、４０群中の２００群が得られ、各々の群はＢａａ_ｘおよびＡａａ_ｘメンバーによって異なる２５の異なる配列を含有する。
【０１８３】
酸不安定基を用いて側鎖官能基を保護して、Ｆｍｏｃ化学を用いてペプチドを合成した。還元剤としてトリブチルホスフィンを用い、塩基および酸不安定基双方の存在下で切断可能なＳ^ｔＢｕ ＯＳＰＧによって、Ｃｙｓ残基のＳＨ基を保護した。カップリング剤として１−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を用いて、ペプチド鎖を固相で組み立てた。次いで、ＳＨ基を選択的に未保護とし、塩基としての１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）の存在下で、レニウム伝達剤Ｒｅ（Ｏ）Ｃｌ_３（ＰＰｈ_３）_２を用いてレニウム金属イオンを複合体化させた。このようにして、金属−ペプチド複合体を形成させ、ペプチド鎖は依然として固体支持体に連結されている。次いで、メタロペプチドをＴＦＡでの処理によって固体支持体から遊離させた。金属イオン複合体化に対するこの固相アプローチは、無作為配列ライブラリーで使用されるスプリット合成方法と十分に適合する。
【０１８４】
合成プロセスは、商業的自動シンセサイザーを用いて行った。（ＳｙｎＰｅｐ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡから商業的に入手可能なもののごとき）多重手動シンセサイザーは１０のペプチドの平行合成を同時に可能とする。
【０１８５】
必要であれば質的制御プロトコルを使用し、これはＨＰＬＣ、質量スペクトル分析、および２５の化合物の各個々のプールに対するアミノ酸分析を含む。プール構成要素の各々の存在は、分子イオン質量スペクトル分析によって確立する。負イオンモード電子スプレー（ＥＳ）およびマトリックス−支援レーザー収着（ＭＡＬＤ１）技術を使用した。質量スペクトル分析を用い、３つの異なる測定を行った：（ａ）分子イオンピーク測定による２５までの個々の化合物の存在（各化合物に対して異なる質量を仮定）、（ｂ）分子イオンピークがレニウム金属イオンに対する複合体化を示すことの確認、および（ｃ）金属イオンと複合体化していないペプチドに対応する分子質量を持つピークの不存在。レニウムは、２単位だけ質量が異なる（１８６および１８８）２つの同位体の混合物であり、これらの同位体の相対的豊富さは１：２である。メタロペプチドの分子イオンプロフィールは、積分面積比率が１：２である２質量単位だけ異なる２つのピークとして出現する。かくして、レニウムは、これらのメタロペプチドに対する内部質量スペクトル基準として働く。このクレームの方法によって合成された２５化合物の１つのそのようなプールのスペクトル分析を図９に示す。このプールにおける２つのメタロペプチドの５つの組は、異なる配列で組み立てた同一アミノ酸の存在のため同様な質量を有する。ピークの相対的強度は、プール中の個々の化合物の異なるイオン化によるものであり、混合物中の相対的量を反映しない。２の質量単位差および１：２の相対的比率のピークの各対は、レニウムの２つの安定な同位体（Ｒｅ−１８５およびＲｅ−１８７）の相対的豊富さによる。スペクトル分析は、レニウム−オキソコアの不存在のため、対応するメタロペプチド未満のほぼ１９７ないし１９９質量単位であろういずれの遊離未複合体化線状ペプチドも明らかにしなかった。
【０１８６】
２５メタロペプチドの各プールのアミノ酸分析も使用し、これを用いて、プール中の２５化合物の相対的等モル比率を決定した。スプリット合成の合成プロトコルは、等モル量のプール構成要素を保証するようにデザインされた。
【０１８７】
実施例３ メラノコルチン受容体−特異的ライブラリーのスクリーニング
高スループットスクリーニングアッセイにおいて、メタロペプチドライブラリーを、ＭＣ４−Ｒ受容体およびＭＣ１−Ｒ受容体結合活性につきスクリーニングする。ＭＣ受容体−結合アッセイは、ＭＣ受容体の源としてＢ１６−Ｆ１またはＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞からの膜調製物を用いる。ＭＣ４−Ｒ−発現２９３細胞および陰性対照、未トランスフェクト２９３細胞から調製した細胞膜は、ＭＣ４−Ｒ特異的結合アッセイにおいてＢ１６−Ｆ１またはＢ１６−Ｆ１０メラノーマ細胞膜に代えて置換される。ＭＣ受容体−結合アッセイはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉ−Ｓｃｒｅｅｎ Ｓｙｓｔｅｍを用い、これは、リン酸緩衝化生理食塩水中の０．５％ウシ血清アルブミンで予めブロックした９６−ウエルＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルタープレート （Ｄｕｒａｐｏｒｅ， ０．４５ｍｍ多孔度）中で行う。細胞膜調製物（１２．５μｇ／ウエル）を、０．２％ウシ血清アルブミンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液中の０．４ｎＭ ^１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨと共にインキュベートする。非特異的結合は、１０^−６Ｍのα−ＭＳＨまたは１０^−７ＭのＮＤＰ−ＭＳＨの添加によって決定される。テストすべきメタロペプチドを１ｍＭの最終濃度にて反応ウェルにて添加する。室温にての９０分間のインキュベーションの後、結合反応を濾過によって迅速に停止させ、膜を捕獲する。フィルターを氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、風乾する。次いで、個々のフィルターをプレートからパンチし、ガンマーカウンターチューブに分配する。膜に結合した放射能はＰａｃｋａｒｄ Ｃｏｂｒａガンマーカウンターで測定する。特異的結合は、^１２５Ｉ−ＮＤＰ−ＭＳＨ単独を含有するウエルにおける放射能から、１０^−５Ｍのα−ＭＳＨを含有するウエル中の放射能を引いたものと決定される。テスト化合物を二連ウエルでスクリーニングし、１μＭ濃度が特異的結合の＞５０％を阻害する場合に活性であると考える。未標識ＮＤＰ−ＭＳＨの標準的な曲線は、内部アッセイ対照として各プレートに含ませる。
【０１８８】
商業的に入手可能なｃＡＭＰキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＥ０３５０，低ｐＨ）を用いて、ＭＣ４−Ｒに結合するメタロペプチドのアゴニスト能力を評価する。ｈＭＣ−４受容体で安定にトランスフェクトした２９３細胞、またはＢ１６−Ｆ１メラノーマ細胞を９６−ウエル皿中で密集するまで増殖させる。細胞を洗浄し、０．２ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ｃＡＭＰホスホジエステラーゼ）および変化する濃度のメタロペプチド、または陽性対照としてのα−ＭＳＨを含有する新鮮なＦＰＭＩを添加し、細胞を３７℃にて１時間インキュベートする。培地に通気し、細胞層を１５０μｌの０．１Ｍ ＨＣｌで抽出する。１００μｌの細胞抽出物中の合計ｃＡＭＰ蓄積は、アセチル化修飾を用いるｃＡＭＰキットでの競合的免疫アッセイによって、９６−ウエルプレートで定量される。テスト化合物に対するＥＣ_５０値は、１０^−６ＭのαーＭＳＨで処理した細胞中のｃＡＭＰ蓄積に基づいて計算される。αーＭＳＨおよびＭＳＨアナログペプチドの存在下でｃＡＭＰを蓄積させるこれらの細胞型の双方の能力は科学文献に記載されている；例えば、Ｏｌｌｍａｎ ＭＭら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：１３５−１３８，１９９７参照。
【０１８９】
実施例４ メラノコルチン受容体−特異的ライブラリーの脱回旋
陽性プールの脱回旋は、対話的再合成およびスクリーニング脱回旋アプローチによってなされる。個々の２５の構成要素は別々に、あるいは化合物の５つのプール各々で合成され、各プールは受容体結合アッセイでスクリーニングされる。後者のアプローチが好ましく、ここに、予備的スクリーニングにおいて高いヒット頻度がある。（ナノモラー範囲の受容体親和性および少なくとも１００のＭＣ４−ＲないしＭＣ１−Ｒ選択性に近い）良好な結果を伴うプール中の化合物は個々に合成し、スクリーニングする。
【０１９０】
実施例５ メラノコルチン受容体−特異的ライブラリーの脱回旋の別法
この実施例では、メタロペプチドライブラリーの質量スペクトル脱回旋の別法が使用される。該方法はレニウム−複合体化ペプチドの内部シグニチャーに基づき（２質量単位だけ異なる１：２の比率の２つのアイソトピックピーク）、これは、一般に、混合溶液中でさえのメタロペプチドの同定を可能とする。陽性プールを受容体−担持細胞と共にインキュベートし、過剰の未結合化合物を制御された条件下で洗い去り、細胞を溶媒で処理して、メタロペプチド結合を破壊し、溶媒中のメタロペプチドを抽出する。溶媒の質量スペクトル分析は、受容体−担持細胞に結合しているメタロペプチドまたは複数メタロペプチドを明らかとし、質的制御データに対する比較と通して、結合している特異的メタロペプチドまたは複数メタロペプチドを確認するのが可能である。このプロセスは、高スループットのメタロペプチドライブラリースクリーニングを提供する。
【０１９１】
実施例６ 一般構造Ａｃ−Ｈｉｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２の４つのメタロペプチドのライブラリーの単一ポット合成
実施例１に記載したのと同様の合成手法をこのライブラリーを作成するのに用いた。ペプチドアミドを作成するためのＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＲ樹脂（置換０．２ｍＭ／ｇｍ）を用いた。以下のアミノ酸保護：Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｓ^ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−ＸｘｘおよびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（トリチル）を用い、Ｆｍｏｃ合成戦略を使用した。該Ｘａａアミノ酸はＴｒｐ、ホモＰｈｅ、２’−ナフチルアラニンおよびフェニルグリシンであった。ペプチド樹脂Ｃｙｓ（Ｓ’Ｂｕ）−Ｔｒｐ−ＮＨ_２を４つの等しいプールに切断し、Ｘａａアミノ酸のうちの１つを１つの個々のプールにカップリングさせた。カップリング反応の終了の後に、４つの樹脂プールを再度混合した。合成はＨｉｓのカップリング、続いてのＮ−末端のアセチル化で進行した。ペプチド鎖Ａｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｘａａ−Ｃｙｓ（Ｓ^ｔＢｕ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＮＨ_２の完成した組立の後、ＤＭＦ／トリブチルフォスフィンでの処理によってＳ’Ｂｕ基を除去し、一般的に前記したごとくレニウム−オキソ金属イオンを複合体化した。十分に保護されたメタルペプチドを脱ブロックし、３時間の切断カクテル（トリフルオロ酢酸−トリプロピルシランの９５：５混合物）での処理によって固体支持体から遊離させた。冷エーテルを用いる沈殿によって、メタロペプチドライブラリーを回収した。得られたペレットを２回洗浄し、０．５ｍｌの９５％酢酸を添加した。０．５時間後、５ｍｌの水を添加し、溶液を凍結乾燥し、固体状態の所望のライブラリーを得た。ライブラリープールの質量スペクトル分析により、ライブラリーのすべての４つのメンバーに付き、正しい質量が確認された。
【０１９２】
【表３】

【０１９３】
表３に記載したごとく、２の質量単位が異なる２つの分子イオンピークを計算し、各構造につき観察した；この差は、恐らくは、複合体化工程におけるレニウムの２つの天然同位体Ｒｅ−１８５およびＲｅ−１８７の存在によるものである。加えて、スペクトル分析における観察されたピーク下の面積は、各構造につき、面積は１：２の比率であり、これはＲｅ−１８５およびＲｅ−１８７同位体の相対的豊富さと同一であり、恐らくはそれに関連することを示した。これらの結果により、ペプチドへのレニウムの複合体化が確認された。スペクトル分析は図１０に示す。
【０１９４】
また、これらの結果は、４つの成分のこのライブラリーのＨＰＬＣ分析によっても確認され、この結果を、同一のＨＰＬＣ条件下で行った４つの個々のメンバーの各々のＨＰＬＣ分析と比較した。図１１から明らかなごとく、４つのメンバー構成要素の各々はライブラリー混合物中に存在する。ＨＰＬＣプロフィールにおいて、メタロペプチドの各々は、レニウムオキソコアの交互の配位（ｓｙｎおよびａｎｔｉ）による２つの異性体に分割された。また、ＨＰＬＣ分析は、調製物中の未複合体化線状ペプチドの欠如を明らかにした。この比較で用いたすべての４つの化合物は、ライブラリーの合成につき前記したものと同一の方法を用いて個々に調製した。ＨＰＬＣプロフィールは図１１Ａから１１Ｅに示される。
【０１９５】
実施例７ 化学防止剤として用いられるＭＣ１−Ｒ特異的メタロペプチドの合成
高能力メタロペプチドにＮ−末端修飾も施す。体系的Ｎ−末端修飾は、種々のＭＣ受容体タイプについてのペプチドアナログの受容体−結合親和性に関連する文献で入手可能な限定されたデータに基づき行う。一般に、これらの研究は、Ｈｉｓ６残基が、ＭＣ１−Ｒ（末梢）−対−ＭＣ４−Ｒ（脳）に対する受容体を選択するにおいて臨界的因子であり得ることを示す。ヒト・メラノコルチン受容体の三次元分子モデルが、バクテリオロドプシンの電子低温顕微鏡構造およびウシ・ロドプシンの電子密度フットプリントに基づいて開発されている。公知の優れたアゴニストの提唱された結合部位へのモデリングによって、特異的リガンド−受容体相互作用が同定されている。この手段によって、研究者は、一時的に、メラノトロピン側鎖ファルマコフォアＤ−Ｐｈｅ^７およびＴｒｐ^９を同定し、これらが、膜貫通領域４、５、６および７における受容体芳香族残基の疎水性ネットワークと相互作用すると提案した。これらの結果の知見を、メタロペプチドコアについてのＮ−末端修飾の選択において利用する。得られたメタロペプチドの能力およびＭＣ１−Ｒ特異性の同時アッセイイングによって、疎水性および／または水素結合ポテンシャルを持つ基を体系的かつ立体特異的に調査する。生物活性に対するＨｉｓ残基の影響も調べる。メタロペプチドの２つのシリーズを合成する。
【０１９６】
レニウムオキソ−［Ｒ−Ｈｉｓ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２］および
レニウムオキソ−［Ｒ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ_２］
ここに、Ｒは、以下の基から選択される、疎水性側鎖および水素結合ポテンシャルを持つ親水性側鎖よりなる対である。

【０１９７】
ここに、ｎは２ないし９であって、Ｘおよび／またはＹはＡ、ＯＨ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＨ_２、ＯＣＨ_３、ＬＯ_２および同様の基から選択される。
【０１９８】
実施例８ Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓにおける皮膚黒色化
皮膚黒色化実験のために予めコンディショニングしたトカゲ （Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ）に、レニウムと複合体化したＰＴ−１１４５（５０ｍＬビヒクル中に取った０．６５ｍｇ）を腹腔内注射した。予備−コンディショニングはトカゲを、よく光を供給した白色バックグラウンドに置くことを含んだ。注射後１０−１５分内に、皮膚の被覆色は明るい緑色から黒い茶色ないし黒色に変色した。皮膚被覆色は５時間の観察時間の間に暗色のままであった。ビヒクル単独（各々１％のＤＭＦおよびベータ−シクロデキストランを含有するＰＤＳ緩衝液）を注射したトカゲは、５時間の観察時間の間にその皮膚色のいずれの変化も示さなかった。
【０１９９】
前記の各々は単なる例示であり、他の同等の具体例も考えられ、可能である。
【０２００】
本発明をその好ましい具体例を引用して記載してきたが、他の具体例は同一の結果を達成できる。本発明の変形および修飾は当業者に明らかであり、添付の請求の範囲においてすべてのそのような修飾および同等物をカバーすることを意図する。前記引用のすべての出願、特許および刊行物の全開示をここに引用して明細書の一部と見なす。
【０２０１】
これまでの実施例は、記載した反応体を一般的または特異的に置き換えるおよび／またはこれまでの実施例で用いたものについての本発明の条件を操作することによって同様に成功して反復することができる。
【図面の簡単な説明】
添付の図面は本願発明の説明として利用するものであり、本願発明を限定しない。
【図１】はテンプレート１の分子構造である。
【図２】はテンプレート２の分子構造である。
【図３】はテンプレート３の分子構造である。
【図４】はテンプレート４の分子構造である。
【図５】はテンプレート５の分子構造である。
【図６】はテンプレート６の分子構造である。
【図７】はテンプレート７の分子構造である。
【図８】は実施例２のスプリットプール及び組合せ合成法（ｓｐｌｉｔ ｐｏｏｌ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ）のフローチャートである。
【図９】は実施例２に従って合成された２５のメタロメプチドのライブラリープールのマススペクトル（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）である。
【図１０】は実施例６に従って合成された４のメタロペプチドのライブラリープールのマススペクトルである。
【図１１】図１１Ａから図１１Ｅは、実施例６に従って合成された４のメタロペプチドのライブラリープールの逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅｄ）ＨＰＬＣプロフィールである。Related application
This application claims priority to US Provisional Application No. 60 / 148,994, "Melanocortin Receptor Special Metallopeptide Constructs, Combinatorial Libraries, and Applicability", filed August 13, 1999.
[0001]
This application is PCT / US99 / 29743 "Metallopeptide combinatorial library and application method" (filed on December 14, 1999), and U.S. Patent No. 6027711 "Structurally analyzed metallo construct and application method" (2000. Issued on April 22, 1999) and U.S. Patent No. 5,891,418, "Peptide Metal Ion Drug Constituents and Applicable Laws", issued April 6, 1999.
[0002]
US Government Rights
The United States government has certain license rights to the invention.
[0003]
Background of the Invention
Field of the Invention (Technical Field)
The present invention relates to metallopeptides, metal ion-complexed peptidomimetics, and metallo-structures, and is a melanocortin receptor. Peptide random sequence libraries, metal ion complex peptidomimetic and peptide-like random sequence libraries, and metallo-constructive random sequence libraries (metallopeptide combinatorial libraries, metalion-complexed peptide mimicry) atorial libraries and metallo-construct combinatorial libraries) are included, together also relates to their usage and manufacturing process. The present invention also relates to methods of synthesizing and combining such libraries, identifying and characterizing library components capable of binding a melanocortin receptor of interest or mediating a melanocortin-related bioactivity of a subject. Also relates to the method.
Background art
The following description refers to several publications, specifically by author and year of publication. The description of such publications is merely for description of the present invention and is not necessarily admitted to be prior art to the present invention.
[0004]
Melanocortin receptor:
Melanocortin receptor types and subtypes have been identified, and are expressed in normal human melanocytes and melanoma cells (MC1-R) (melanocortin-1 receptors) expressed in melanoma cells. ), Melanocortin-2 receptor (MC2-R) for ACTH (adrenocorticotropin) expressed in cells of the adrenal ground, melanocortin-3 receptor (MC3-R) mainly expressed in cells of the hypothalamus, midbrain and brainstem It contains the melanocortin-4 receptor (MC4-R) as well as the melanocortin-5 receptor (MC5-R) which is widely expressed in surrounding tissues.
[0005]
Peptides specific for the melanocortin receptor have been reported to have a variety of biological activities. They include effects on pigmentation and steroidogenesis, which are known to be mediated by MSH (melanocyte stimulating hormone) and ACTH receptors. Several studies have reported the presence of melanotropin receptors on primary human melanoma cells (Tatro JB, Atkins M, Mier JW, et al., Melan., Ed .: Melanotropin receptors). Receptor, J Clin Invest, 85: 1825-1832, 1990). Melanotropin receptors have been reported as markers for melanotic and amelanotic human melanoma tumors (Sharma SD, Granbury ME, Jiang J, et al., Multivalent melanotrophic peptides and fluorescent macromolecular conjugates). Fluorescent macromolecular conjugates: A new reagent for characterizing melanotropin receptors, Bioconjug Chem 5: 591-601, 1994; Sharma SD, Jiang J, Hadley ME, et al. Melanotropic peptide conjugated beads for determination, Proc Matl AcadSci U SA 93 (24): 13715-13720, 1996). In particular, the presence of MC1-R was demonstrated in human melanoma cells by antibodies to MC1-R (Xia Y, Skoog V, Mucenties R, et al., Polyclonal antibody to human melanocortin MC-1 receptor: to malignant melanoma cells Immunohistochemical localization of the melanocortin MC-1 receptor, European J Pharmacol 288: 277-283, 1995). MC1-R is a G-protein-coupled 7-transmembrane receptor expressed in skin cells and has some homology with related receptors MC2-R, MC3-R, MC4-R and MC5-R. Have. Each of these receptors is capable of binding various peptide homologs, including the common melanotropic pharmacophore His-Phe-Arg-Trp. This illustrates the 6-9 sequence of alpha melanocyte stimulating hormone (α-MSH).
[0006]
Prior to the molecular characterization of the MC receptor, the α-MSH homolog was labeled with the radioactive isotope indium-111 and used for melanoma imaging studies (Wraight EP, Bard DR, Maughan TS, et al., Malignant Melanoma). Of chelating derivatives of alpha-melanocyte stimulating hormone for clinical imaging of Brit J Radiology 65: 112-118, 1992; Bard DR, Knight CG and Page-Thomas DP, alpha as a promising imaging agent for malignant melanoma -Chelate derivatives of melanocyte stimulating hormone, Brit J Cancer 62: 919-922, 1990; Bard DR, Knight CG, Page-Thomas DP, Cloudman S91 melanoma. Target treatment of a chelate derivative of a short-chain homolog of alpha-melanocyte stimulating hormone to Biochem Soc Trans 18: 882-883, 1990). Linear and cyclic disulfide-containing peptides have been identified and used for melanoma imaging and appear to be non-selective at MC receptors (Chen J and Quinn TP, alpha melanocyte stimulating hormone homolog Tc -99m / Re-188 labeling and pharmacokinetics of rats with malignant melanoma, J Nucl Med 39: 222p, 1998; Giblin MF, Wang N, Hoffman TJ, et al., Rhenium and technetium metal coordination. Design and characterization of alpha melanotropin peptide homologs that have been cycled through Proc Natl Acad Sci USA 95 (22): 12814-12818, 1998). Later studies also found that the cyclic peptide reported by Gibulin et al. Was localized in the brain (Wang NN, Giblin MF, Hoffman TJ, et al, Tc-99m in a rat melanoma model). And Re-188 labeled in vivo characterization of labeled melanotropin peptide homologues, J Nucl Med 39: 77P, 1998 and corresponding poster presentation at the 45th Annual Meeting of the Society of Radiology in June 1998). It has been reported that the response of human melanocytes to UV radiation is mediated by the α-MSH-inducing activity of the cAMP pathway through the MC1-R (ImS, Moro O, Peng F, et al., Alpha-melanotropin). The activity of the cyclic AMP pathway mediates the response of human melanocytes to ultraviolet B radiation (Cancer Res 58: 47-54, 1998).
[0007]
MC4-R is also a G-protein coupled 7-transmembrane receptor, but is believed to be expressed primarily in the brain. Inactivation of the receptor by this gene targeting is associated with obesity at the onset of maturity associated with hyperphagea, hyperinsulinemia, and hyperglycemia. ) In rats (Huszar D, Lynch CA, Fairchild-Huntres V, et al., Targeted Disruption of the Melanocortin-4 Receptor Causes Rat Obesity, cell 88: 131-141, 1997). . MC4-R is a molecular target for therapeutic interference in energy homeostasis.
[0008]
Alpha-MSH has been described as a promising anti-inflammatory agent against all major forms of inflammation (Star RA, Rajora N, Huang J, Stock RC, Catania A, Lipton JM: Macrophage nitric oxide by alpha-melanocyte stimulating hormone Evidence for autocrine modulation of synthase (macrophage nitric oxide synthase) Proc Natl Acad Sci USA 92: 8016-8020, 1995; Anti-inflammation of Getting SJ; R. Drug News and Perspectives 13: 19-27, 2000). The efficacy of MC1-R and MC3-R in anti-inflammatory treatment has been emphasized. In particular, activation of these MC receptors by melanocortin receptor agonists has been reported to suppress nitric oxide synthase expression and subsequent nitric oxide production.
[0009]
Much effort has been put into determining the structure of the melancortin receptor. The structure includes a nucleic acid sequence for encoding the receptor and an amino acid sequence constituting the receptor. This is described, for example, in International Patent Applications PCT / US98 / 12098 and PCT / US99 / 16862 and US Pat. No. 5,994,087. A number of ligands (agonists and antagonists) that are specific for the melanocortin receptor have also been developed. This means that, for example, international patent applications PCT / US98 / 03298 (linear peptide specific to melanocortin receptor containing iodine group), PCT / GB99 / 01388 (linear linear peptide specific to MR1-R), PCT / GB99 / 01195 (MC3 -ER, MC4-R and MC5-R specific cyclic peptides), PCT / US99 / 04111 (MC1-R specific peptide antagonists for melanoma treatment), PCT / US99 / 09216 (isoquinoline compounds as melanocortin receptor ligands), PCT / US99 / 13252 (spiropiperdin derivatives as melanocortin receptor agonists) and US Pat. No. 6,054,556 (cyclic lactam peptides as MC1-R, MC3-R, MC4-R and MC5-R antagonists) Are commentaries on. In addition, a number of patents teach various screening and determination methods for melanocortin receptor-specific compounds. This is described, for example, in International Patent Applications PCT / US97 / 15565, PCT / US98 / 12098 and PCT / US99 / 16862, and US Pat. Nos. 5,932,779 and 5994087.
[0010]
It is generally believed that compounds specific for MC1-R are effective in treating melanoma. This includes use as a radiotherapeutic or drug delivery agent, and as a diagnostic imaging agent, especially when labeled with a diagnostic radionuclide. Compounds specific for MC3-R, MC4-R or MC5-R are believed to be effective in regulating energy homeostasis. This includes its effectiveness as an appetite-reducing or weight-controlling agent, a therapeutic agent for anorexia, a weight-gain agent, a therapeutic agent for obesity, and a therapeutic agent related to metabolism. Among other melancortin receptors, compounds specific for MC3-R and MC4-R can be used as therapeutic agents for sexual disorders including erectile dysfunction in men. Among other melanocortin receptors, compounds specific for MC3-R and MC4-R can be used to control blood pressure, heart rate, and other neurophysiological parameters. Other melanocortin receptor peptides can be used as tanning agents to increase melanin production, such as peptides that are MCR-1 agonists. Compounds specific for MCR-1 and MCR-3 may be useful in controlling inflammation.
[0011]
There is a need for unique melanocortin receptor specific ligands as well as ligands or compounds that are agonists or antagonists of specific melanocortin receptors. Peptide ligands that are high affinity melanocortin receptors can be utilized as agonists or antagonists to elicit various physiological responses associated with melanocortin receptors. In addition, melanocortin receptors have effects on the activity of various cytokines, and high affinity peptide ligands of melanocortin receptors can be used to control cytokine activity.
[0012]
Peptide libraries and random sequence chemistry:
Libraries of peptides and other small molecules containing a myriad of diversely structured molecules are useful for pharmaceutical lead generation and lead optimization. Libraries of various molecular species have been described in the literature, including libraries of peptides, peptoids, peptidomimetics, oligonucleotides, benzodiazepines, and other small organic molecules, and drug discovery. Screened for Various research approaches have been used to construct libraries of structurally diverse compounds. These include chemical synthesis and genetic engineering techniques. Chemically synthesized libraries have been synthesized by solution chemistry and solid phase methods. The prior art of designing, synthesizing, screening and evaluating peptide-based libraries is taught in numerous publications.
[0013]
Spatial addressable parallel synthesis of solid-phase coupled libraries:
Various methods of chemical construction of libraries of peptides or other small molecules have been established. One method involves the spatial synthesis of compounds on the solid phase and parallel synthesis, or the spatial separation of compounds on the solid surface by a predetermined technique such that the location of one compound or a subset of compounds on the solid surface is known. Parallel synthesis is involved. Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis techniques utilizing photolithographic techniques in peptide synthesis on solid surfaces such as borosilicate glass microscope slides and others. Provides a library containing over 100,000 spatially separated compounds. However, the synthesis of libraries that are more structurally more diverse than simple peptides requires the development of orthogonal photolabile protecting groups that can be cleaved at different light wavelengths. In addition, the solid surfaces that maintain these libraries have also been reported to cause a distinct effect on binding affinity in library screening assays.
[0014]
Pooling and split synthesis methods:
Large libraries of compounds can be prepared by pooling strategies employing equimolar mixtures of reactants at each synthesis step, or in a mixture according to the activity in each coupling reaction. Can be constructed by adjusting the relative concentrations of various reactants. In one method, an equimolar mixture of compounds is obtained by splitting an equal portion of the resin. Each aliquot is separately reacted with each of the various monomeric reagents. The resins are mixed, processed for the next coupling, and again divided into equal parts for separate reactions with the individual reagents. This process is repeated as many times as necessary until a library of the desired oligomer length and size is obtained. This method is the basis of the "one-bead one peptide" method, which utilizes an amino acid sequence to confirm the main structure of a peptide on a hit bead in a bioassay. I do. More efficient automated systems for performing split synthesis of these libraries have been developed. A common artifact sometimes seen in all these resin-bound libraries is the target-specific affinity of some of the bioassay modified solid-phase binding compounds, which can be quite misleading. is there.
[0015]
Another method involves the construction of a soluble library. The method involves iterative resynthesis and deconvolution of the bioassay until all random amino acid positions are initially defined. Several variants of this method have been developed. They include co-synthesizing two libraries containing orthogonal pools. This eliminates the need for iterative resynthesis and evaluation. A major limitation of the lysis library approach is its applicability to high affinity substances. The abundance of each compound in solution will be affected by the total number of compounds in the library that affect biological activity. For this reason, the very active compounds in the pool are not necessarily the most promising molecules. A lack of reasonable solubility of certain members of the library will further affect this phenomenon.
[0016]
Among the various classes of small molecule libraries, peptide libraries are versatile. This is due to the structural diversity provided by the use of naturally occurring amino acids, the incorporation of various "designer" amino acids, and the high efficiency and ease of achieving peptide synthesis. In addition, another level of structural diversity in peptide-based libraries is added by post-synthesis modifications of the library. These modifications include permethylation, acylation, functionalization of side chain functional groups, and reductive amination of the N-terminus.
[0017]
Summary of the Invention (Disclosure of the Invention)
In one preferred embodiment, the present invention provides a metal ion-binding domain comprising a plurality of linked residues forming an N3S1 ligand that can be used for complexing with a metal ion. ) Is provided. This construct is conformationally constrained in a structure specific for the melanocortin receptor in a complex of its metal ion binding domain and metal ion.
[0018]
In another embodiment, the present invention comprises a metal ion binding domain comprising a plurality of contiguous amino acids and a determined biological-function domain specific for a melanocortin receptor. The present invention provides a peptide for production and its pharmaceutically usable salt. At least a portion of the biofunctional domain is co-extensive with at least a portion of the metal ion binding domain, and the biofunctional domain is sequence-constrained in a complex of the metal ion binding domain and the metal ion. You.
[0019]
In another preferred embodiment, the present invention provides a combinatorial library targeting melanocortin receptors of different sequence peptide members synthesized on a solid phase. Each configuration library member includes:
(A) a peptidomimetic sequence of a combination of three or more amino acid residues and mimics of amino acid residues bound to a solid phase, and (i) forming a metal ion binding domain A plurality of amino acid residues including at least one amino acid residue containing at least one S (protected by an orthogonal S-protecting group) or a mimic of an amino acid residue, a mimic of an amino acid residue, or The sequence of their combination, (ii) the sequence of amino acid residues at the N- and / or C-terminus or both of the metal ion binding domains, the mimic of amino acid residues or their combinations, and (iii) the solid phase Peptides characterized by cleavable linkages that attach peptidomimetic sequences Mimetic sequence; and
(B) Unique selection or sequence of amino acid residues, mimics of amino acid residues or combinations thereof of at least one peptidomimetic sequence of a member of the library.
[0020]
This orthogonal S-protecting group can be removed from the solid phase without cleaving the peptidomimetic sequence.
[0021]
According to another preferred embodiment, the present invention provides a combinatorial library targeting melanocortin receptors of different sequence peptidomimetic members synthesized in the solid phase. Each library member includes:
(A) a peptidomimetic sequence of a combination of three or more amino acid residues and mimics of amino acid residues bound to a solid phase, wherein (i) a metal ion binding domain is formed and at least one S (orthogonal) A sequence of at least one amino acid residue including those protected with an S-protecting group or a plurality of amino acid residues including mimics of amino acid residues, mimics of amino acid residues, or a combination thereof; ii) adhesion of amino acid residues, mimics of amino acid residues, or combinations thereof at the N- or C-terminus or both of the metal ion binding domain, and (iii) adhesion of a peptide mimetic sequence to the solid phase A peptide mimetic sequence characterized by a cleavable bond that causes
(B) A unique selection or sequence of amino acid residues, mimics of amino acid residues, or combinations thereof of the peptidomimetic sequence of at least one member of the library.
[0022]
The orthogonal S-protecting group can be removed from the solid phase without cleaving the peptidomimetic sequence.
[0023]
According to another preferred embodiment, the present invention provides combinatorial libraries targeting melanocortin receptors of different sequence peptides or peptidomimetic members synthesized in solution. Each configuration library member includes:
(A) a peptidomimetic sequence of a combination of three or more amino acid residues and mimics of amino acid residues bound to a solid phase, wherein (i) a metal ion binding domain is formed and at least one S ( A sequence of at least one amino acid residue, including those protected by an orthogonal S-protecting group) or a plurality of amino acid residues, including mimics of amino acid residues, mimics of amino acid residues, or combinations thereof; ( ii) a peptidomimetic sequence characterized by the sequence of amino acid residues at the N- or C-terminus of the metal ion binding domain, mimics of amino acid residues or combinations thereof;
(B) Unique selection or sequence of amino acid residues, mimics of amino acid residues or combinations thereof of the peptidomimetic sequence of at least one member of the library.
[0024]
The composition of the present invention includes a composition of the following formula:
[0025]
R₁-Lll-Aaaa-Bbb-Ccc-R₂
R₁-Bbb-Aaaa-Ccc-R₂
R₁-Ddd-Bbb-Aaaa-R₃
R₄-Eee-Bbb-Ccc-R₂
R₁-Fff-Aaaa-Ggg-Ccc-R₅
R₁-Hhh-Aaaa-Bbb-Ccc-R₅
R₁-Iii-Iii-Ccc-Jjj-Kkk-R₂
R₁Has the ability to enhance the intrinsic activity of molecular residues, including providing supplemental or unambiguous receptor contact. Any of a variety of amino acids and non-peptide groups can be employed, including one to about four amino acid chains, such as neutral or charged L- or D-form amino acid residues. If R1 is a non-peptide group, it may be a straight or branched alkyl, allyl, alkene, alkenyl or aralkyl chain.
[0026]
Aaaa is an L- or D-form cationic amino acid with a positively charged side chain. Suitable amino acids are the L-forms Lys, Arg, Dpr or Dbu, both natural and synthetic amino acids, and their derivatives, homologs, homologs, and the like. Aaaa provides N (nitrogen atom) for the metal ion complex.
[0027]
Bbb is an L- or D-form amino acid with an aromatic side chain. Suitable amino acids include the D-forms Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) Or Tyr (BzlCl2) and their derivatives, homologues or homologues. The aromatic ring of Bbb is functionalized with a halogen, alkyl or allyl group. Bbb provides N for the metal ion complex.
[0028]
Ccc is an amino acid that provides both N from the alpha amino group and S (sulfur atom) from the side group for the metal ion complex. Suitable amino acids include the L- or D-form of Cys, Pen and Hcys and the like.
[0029]
Lll is a D-form amino acid with an aromatic side chain. Suitable amino acids include D-forms of Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4' -Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bzl), Thr (Bzl), Cys (Bzl) ) Or Tyr (BzlCl2) and their derivatives, homologues or homologues. The aromatic ring of Lll is functionalized with a halogen, alkyl or allyl group. Lll does not provide N to the metal ion complex.
[0030]
R₂Is an amino acid having an aromatic side chain. Suitable amino acids include L- or D-forms of Phe, Trp, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), including both natural and synthetic amino acids. ), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br) , Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl2) and their derivatives, analogs or homologues. The C-terminus is free or aminated. R₂May be the corresponding des-carboxyl amino acid of the above amino acids. Or R₂Can be eliminated.
[0031]
Ddd is an amino acid that provides S from the side chain group for the metal ion complex. Suitable amino acids include the L- or D-form of Cys, Pen, and Hcys.
[0032]
R₃Is an amino acid with an aromatic side chain that provides N for the metal ion complex. Suitable amino acids include P-, Trp, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4' Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (L- or D-form of natural and synthetic amino acids). 4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz ), Thr (Bzl), Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl2) and their derivatives, analogs or homologues. The C-terminus is free or aminated. R₃May be the corresponding descarboxyl amino acid of those amino acids.
[0033]
R₄Has the functionality of providing a cation center. Suitable amino acids include L- or D-forms of Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu and their derivatives, analogs or homologs and include both natural and synthetic amino acids. The N-terminus of an amino acid can be functionalized with a variety of neutral amino and non-peptidic groups, including straight or branched chain alkyl, allyl, alkene, alkenyl or aralkyl chains.
[0034]
Eee is an uncharged L- or D-form amino acid that provides N for the metal ion complex. Preferred amino acids include Gly and L-forms of Ala, Nle, Leu, Val, Phe, or Trp and their derivatives, analogs or homologs, including natural and synthetic amino acids. In a preferred embodiment, Eee is an amino acid with a fatty side chain.
[0035]
Fff is an aromatic amino acid in the L- or D-form. Suitable amino acids include D-forms of Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4' -Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) ), Tyr (BzlCl2), Tic, Tiq or Tca and their derivatives, analogs or homologues, including natural and synthetic amino acids. The aromatic ring of Fff can be substituted with a halogen, alkyl or allyl group. Fff does not provide N for the metal ion complex.
[0036]
Ggg is an aromatic amino acid in the L- or D-form. Suitable amino acids include L-forms of Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4' -Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) ), Tyr (BzlCl2) and their derivatives, analogs or homologues, including natural and synthetic amino acids. The aromatic ring in Ggg can be substituted with a halogen, alkyl or allyl group. Ggg provides N for the metal ion complex.
[0037]
R₅Is preferably a substituted amide, ester or carboxylate group. Also R₅May be L- or D-form amino acids or amino acid amides, including aromatic, aliphatic, neutral or charged amino acids.
[0038]
Hhh is an L- or D-form of a cationic amino acid with a positively charged side chain. Suitable amino acids include L-form Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu and their derivatives, analogs or homologs, including natural and synthetic amino acids. Hhh does not provide N for the metal ion complex.
[0039]
Iiii is an L- or D-form amino acid that provides N for a metal ion complex. Suitable amino acids include Ala, Gly, Nle, Val, Ile, His, Lys or Arg and their derivatives, analogs or homologs, and include natural and synthetic amino acids.
[0040]
Jjj is an L- or D-form amino acid having an aromatic side chain. Preferred amino acids include the D-forms Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) , Tyr (BzlCl2) and their derivatives, analogs or homologues. The aromatic ring in JJJ can be functionalized with a halogen, alkyl or allyl group. JJJ does not provide N for the metal ion complex.
[0041]
Kkk is an L- or D-form of an amino acid with a positively charged side chain. Suitable amino acids include L-form Lys, Arg, Orn, Dpr, or Dbu and their derivatives, analogs or homologs, and include natural and synthetic amino acids. Kkk does not provide N for the metal ion complex.
[0042]
In the composition of the present invention, the metal ion binding domain can be complexed with a metal ion, and such a composition is included in the present invention. The invention of the present application is more specific for a melancortin receptor whose metal ion binding domain is complexed with a metal ion, even for a composition where the metal ion binding amino acid sequence is not complexed with a metal ion. The composition further comprises:
[0043]
The random sequence libraries of the present invention include those in which the metal ion binding domain contains at least one N available for binding to a metal ion upon removal of an orthogonal S-protecting group. This random sequence library has a metal ion binding domain with N₃S₁A composition comprising three residues forming a ligand is included.
[0044]
In this random sequence library, the orthogonal S-protecting groups are S-thio-butyl, acetamidomethyl, 4-methoxytrityl, S-sulfonate or 3-nitro-2-pyridinesulfenyl. Orthogonal S-protecting groups can be excluded from library members without altering the library member or amino acid side chain protecting groups otherwise. In this random sequence library, structural diversity occurs within or outside the metal ion binding domain.
[0045]
In a random sequence library, the constituent library members have at least one sequence at the N- or C-terminus of the metal ion binding domain containing at least one S (protected by a non-orthogonal S-protecting group). It includes amino acid residues or mimics of amino acid residues, and the orthogonal S-protecting group can be removed without eliminating non-orthogonal S-protecting groups.
[0046]
For a random sequence library restricted to amino acids, the amino acid residue containing at least one S (protected by an orthogonal S protecting group) may be an L- or D-3-mercapto amino acid; Includes D-cysteine or L- or D-penicylamine. In a random sequence library containing amino acid residues and mimics of amino acid residues, residues containing at least one S (protected by an orthogonal S protecting group) may be L- or D-3-mercapto. It may be an amino acid, L- or D-cysteine or L- or D-penicylamine; 3-mercaptophenylananin; 2-mercaptoacetic acid; 3-mercaptopropionic acid; 2-mercaptopropionic acid; 3-mercapto-3,3- Dimethylpropionic acid; 3-mercapto-3,3-diethylpropionic acid; 3-mercapto, 3-methylpropionic acid; 2-mercapto, 2-methylacetic acid; 3-cyclopentamethylene; 3-mercaptopropionic acid; Pentamethylene, 2-mercaptoacetic acid is included.
[0047]
One object of the present invention is to provide a very specific and conformational such that the topography of the side chains of the resulting complex results in a biologically active three-dimensional conformation specific to the melanocortin receptor. Defining methods for producing and using limited peptides, peptoids, related pseudopeptides, peptidomimetics, and metal constructs formed by combining their sequences with desired metal ions, demonstrating efficacy, It is to explain.
[0048]
Another object of the present invention is to provide a peptide-metal ion complex that is specific for the melanocortin receptor, has a high level of stability, and is more resistant to proteolysis than uncomplexed peptides or other known peptides. To provide.
[0049]
It is another object of the present invention to provide peptide metal ion complexes specific for different subsets of the melanocortin receptors, such as those specific for only MC1-R or MC4-R.
[0050]
Another object of the present invention is to provide a peptide metal complex that is specific for a melanocortin receptor and is an agonist or antagonist.
[0051]
It is another object of the present invention to provide peptide analogs that are not sequence regulated when metal ions are absent. This uncomplexed peptide analog is inactive or shows low efficacy, but is sequence-regulated in complex with metal ions, making it highly specific for melanocortin receptors with high efficacy.
[0052]
Another object of the present invention is to utilize a metal complex of a peptide specific to the melanocortin receptor, generate a specific region sequence regulation in the peptide, and immobilize the peptide sequence of the metal binding site in the metal complex in a sequence-wise manner. That is.
[0053]
Another object of the present invention is to complex a peptide with a metal ion. The resulting metallopeptides are specific for the melanocortin receptor and are suitable in mammals for in vivo biodistribution profiles, rate and mode of clearance, bioavailability. ), As well as pharmacokinetics.
[0054]
Another object of the present invention is a specificity for a melanocortin receptor utilizing a stable non-radioactive metal ion for use as a medicament in the treatment of pathological obesity and related conditions, such as the modification of energy metabolism and dietary habits. To provide a complex peptide metal complex.
[0055]
Another object of the present invention is to provide a peptide specific for a melanocortin receptor using a metal ion that is a radionuclide for use in a diagnostic method including image processing and staging of melanoma tumors and metastasis of melanoma tumors. It is to provide a metal composite.
[0056]
Another object of the present invention is to provide a peptide metal ion complex specific for a melanocortin receptor using a stable non-radioactive metal ion to be used as a preventive agent against DNA damage due to ultraviolet light including DNA damage to skin due to sunlight. To provide.
[0057]
Another object of the present invention is to provide a peptide metal ion that is specific to a melanocortin receptor utilizing a stable non-radioactive metal ion for use as a tanning agent, including using it as a tanning agent for therapeutic purposes. is there.
[0058]
It is another object of the present invention to provide a melanocortin receptor-specific peptide metal ion complex utilizing a stable non-radioactive metal ion for use as an anti-inflammatory agent.
[0059]
Another object of the present invention is to complex a peptide with a radiometal such as technetium-99m for use in diagnostic imaging. The resulting peptide metal ion complex is more specific for the melanocortin receptor than the unconjugated peptide molecule, and the resulting radiolabeled species is essentially a carrier for its specificity for melanocortin. It is free (carrier-free).
[0060]
It is another object of the present invention to conjugate a peptide to a radiometal ion, such as a radioisotope of rhenium, such as rhenium-186 or rhenium-188, for use in targeted radiotherapy, such as in the treatment of melanoma. That is.
[0061]
Another object of the present invention is to provide an orally administrable peptide metal ion specific to a melanocortin receptor that can cross an organ-blood barrier without significantly causing degradation of the enzyme or peptidase.
[0062]
It is another object of the present invention to provide a library of sequence-restricted peptide metal ion complexes directed to the melanocortin receptor.
[0063]
Another object of the present invention is to provide a combinatorial peptide library of peptide metal ion complexes specific for the melanocortin receptor. These peptides contain a metal binding domain such that specific sequence regulation is obtained by labeling the peptide with a metal ion.
[0064]
Another object of the present invention is to provide a combinatorial library of peptide metal ion complexes specific for the melanocortin receptor, including these peptides such that the library contains pseudopeptides and peptidomimetics. Amino acids can be similar to natural amino acids, isomers and variants of such amino acids, non-protein amino acids, post-translationally modified amino acids, enzymatically modified amino acids, amino acids, and the like. Designed structures, etc.
[0065]
Another object of the present invention is to provide a specific metallopeptide library depending on the type of melanocortin receptor. The metallopeptide contains a metal ion binding domain, and the determined sequence limitation is obtained by labeling the peptide with a metal ion. These metallopeptides also contain unique and different amino acid sequences.
[0066]
It is another object of the present invention to provide both specific lysis and solid phase metallopeptide libraries, depending on the type of melanocortin receptor. These metallopeptides contain a metal ion binding domain.
[0067]
It is another object of the present invention to provide a method for synthesizing a peptide that contains a reactive SH group forming a part of a metal ion binding domain and is specific for a melanocortin receptor. This reactive SH group is protected during the synthesis process and is only deprotected when the peptide is complexed with a metal ion.
[0068]
It is another object of the present invention to provide a combinatorial metallopeptide library specific for metal receptors. The peptides that make up this library contain a reverse turn structure as a result of metal ion complexation.
[0069]
It is another object of the present invention to provide a rapid and efficient method of combining diverse pools of peptides specific for melanocortin receptors with metal ions such as rhenium metal ions.
[0070]
Another object of the present invention is to provide sequence-regulated as a surrogate for reverse-rotation structures such as beta-rotation and gamma-rotation commonly found in melanocortin receptor-specific natural peptides and melanocortin-specific proteins. To provide a library of selected peptide metal ion complexes. The rotation formed as a result of the metal ion complex is more stable than the natural rotating structure and is only stable with weak interactions such as van der Waals' interactions and hydrogen bonding.
[0071]
It is another object of the present invention to provide a combinatorial metallopeptide library, wherein each peptide comprising the library contains an inverted structure as a result of metal ion complexation.
[0072]
Another object of the present invention is the use of metal ions with multiple isotope peaks, such as the use of rhenium containing two relatively large amounts of fixed isotopes that differ by two units. The present invention provides a method for identifying a specific metallopeptide via an internal signature.
[0073]
Other objects, advantages, novel features and applicability of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
[0074]
Description of the preferred embodiment
Definitions: The terms used throughout this specification are defined as follows.
[0075]
“Binding” and “complexing” include all types of physical and chemical binding, reaction, complexation, attraction, chelation, and the like.
[0076]
"Peptides" of the present invention are defined as a) naturally occurring, b) produced by chemical synthesis, c) produced by recombinant DNA technology, d) produced by biochemical or enzymatic fragmentation of large molecules, e) Peptides produced by a combination of methods or by f) other peptide production methods.
[0077]
Utilizing chemical synthesis, which is a preferred manufacturing method, improved stability and shape by introducing various non-naturally occurring amino acids along the chain and changing the N- or C-terminal. To provide resistance to proteases and the like.
[0078]
As used herein, “peptide” is a concept that includes a plurality of amino acids, such as chemically modified peptides and derivatives. Most of the peptides of the present invention have less than 100 amino acids, preferably less than 60 amino acids, and more preferably contain about 2 to 20 amino acids. Amino acids that constitute at least a part of one peptide are naturally occurring amino acids, stereoisomers, and their modified products, non-protein amino acids, post-translation modified amino acids, enzymatically modified amino acids, and amino acids. "Peptides" include pseudopeptides and peptidomimetics containing structures with non-peptide backbones. "Peptide" also includes dimers or multimers of peptides. "Prepared" peptides include those synthesized chemically, those produced by recombinant DNA technology, those produced by biochemical or enzymatic fragmentation of large molecules, those produced by combinations thereof, and the like. Including.
[0079]
"Amino acid" includes known naturally occurring protein amino acids, represented by common three letter abbreviations and one letter abbreviations. (See Synthetic Peptides: A User's Guide, GA Grant, editor, WH Freeman & Co., New York, 1992) "Amino acid" refers to stereoisomers, naturally occurring protein amino acids, non-protein amino acids, It also includes translation-modified amino acids, enzymatically synthesized amino acids, derived amino acids, pseudo-amino acid constructs, and the like. Synthetic Peptides: A User's Guide, Hruby VJ, Al-obeidi F and Kazmierski W: Biochem J 268: 249-262, 1990; The meanings of the abbreviations are as follows.
[0080]

Amino acids that are stereoisomers and modified forms of naturally occurring protein amino acids, non-protein amino acids, post-translationally modified amino acids, enzyme-synthesized amino acids, derived amino acids, pseudo-amino acids, and the like, are sometimes referred to herein as "residues." You.
[0081]
The library construct of the present invention also contains metal ions, and may be in the form of an ion in the form of a metal containing a metal or a class of metals. The metal ions may be radioactive, paramagnetic, or superparamagnetic. The metal ion may be in the oxidized form of any metal. These include vanadium (V), manganese (Mn), iron (Fe), cobalt (Co), nickel (Ni), copper (Cu), zinc (Zn), gallium (Ga), arsenic (As), and selenium (Se). ), Yttrium (Y), molybdenum (Mo), technetium (Tc), ruthenium (Ru), rhodium (Rh), palladium (Pd), silver (Ag), cadmium (Cd), indium (In), tin (Sn) ), Tungsten (W), rhenium (Re), osmium (Os), iridium (Ir), platinum (Pt), gold (Au), mercury (Hg), thallium (Gd), lead (Pb), bismuth (Bi) ), Polonium (Po), astatine (At), samarium (Sm), europium (Eu) and oxidized forms of gadolinium (Gd). The metal ions may be their radionuclides. They include In, Au, Ag, Hg, Tc, Re, Sn, At, Y and Cu. The preferred metal ion for the tetradentate coordination sphere is Re. Alpha, gamma or beta generating radionuclides can be employed for radiopharmaceutical applications where a radioisotope is desired for the screening process.
[0082]
A variety of common metal ion coordination spheres are generally tetradentate to hexadentate. In one embodiment of the invention, an amino acid or amino acid mimetic sequence is included in each library member, and the complex with the metal includes the desired number of groups (usually 4 to 6). The molecule is designed to form an inverted structure mimic at the metal complex at the complex with the metal. Metals complexing with coordination numbers 4, 5 or 6 and amino acid sequences forming tetra, penta or hexadentate ligands, respectively, overlap and constrain the ligand. The amino acids or amino acid mimetic sequences that form a ligand are defined as the metal ion binding domain ("MBD") of a peptide or peptidomimetic. Very flexible molecules, such as peptides, are duplicated in complex with a metal to form an invert. This is a very constrained structure in terms of arrangement.
[0083]
The biological binding domain ("BBD") of a peptide or peptidomimetic is defined herein as an amino acid sequence. It constitutes a biologically active sequence and shows binding to melanocortin-related receptors, including MC1-R, MC2-R, MC3-R, MC4-R, and MC5-R, specific binding pairs Constitute a peptide as a member of BBD includes any sequence. It may be a contiguous amino acid or mimetic or a non-contiguous amino acid or rhemological that forms a melanocortin-related ligand. The ligand can form a specific interaction with the acceptor or receptor. This “receptor” is a concept that includes both an acceptor and a receptor. The receptor may be a biological receptor. The sequence or BBD can, but need not, send the signal after binding to a cell, tissue or other substance associated with the biological receptor. The BBD may be an agonist, an antagonist, or a hybrid of the two. Such a peptide or peptidomimetic complexed to a metal ion with a BBD constitutes a member of a "specific binding pair". The specific binding pair is provided with at least two different molecules, one molecule comprising an area on a surface or depression that specifically binds to a particular spatial and polar tissue of the other molecule. I have. Often, members of a specific binding pair are referred to as ligands (ligands) and receptors or anti-ligands.
[0084]
The BBD is further defined to include that portion of the construct. This construct is a peptidomimetic, pseudopeptide, or metallo-structured molecule that becomes biologically active upon binding to the structure's metal ions, and is found in melanocortin found in cells, tissues, organisms and other biological materials. Shows binding to the receptor. In this case, the BBD is cyclological or regnological, and generally has the properties and functions of the peptide BBD. BBD is coextensive with all or part of MBD, and the same amino acids or other residues that make up BBD also make up all or part of BBD. In some cases, the amino acids of the MBD will form part of the BBD. Additional amino acids that are not part of the MBD form the rest of the BBD.
[0085]
Sequence restriction refers to the stability of the three-dimensional shape taken by the peptide or other construct and the preferred arrangement form. Sequence restriction refers to local restriction involving the restriction of the sequence mobility of one residue of the peptide, and restriction of the sequence morphology of the group of residues that will form a secondary structural unit. Includes regional constraints, global constraints involving the entire peptide structure. (See Synthetic Peptides: A User's Guide)
The primary structure of a peptide is an amino acid sequence. Secondary structure involves overlapping part of the peptide with the normal structure of the peptide backbone sequence and α-helix, β-sheet, rotation, etc. Thus, the steric shape of a peptide is directly related to its secondary structure. (See Synthetic Peptides: A User's Guide.) The overall structure is a peptide structure that prefers a sequence-constrained conformation.
[0086]
The product obtained by the method of the present invention can be used for medical and livestock purposes or for veterinarians. Typically, the product is used for the human body, but can also be used for animals. "Patient" in this text refers to both humans and animals. Although the main use of the present invention is for human patients, it can also be used in experimental facilities, farms, zoos, wild animals, and pets. The product of the present invention can optionally use radionuclide ions. It can be used for diagnostic imaging purposes or for radiotherapy.
[0087]
Peptide and metallo component library and random sequence chemistry:
Using the method of the present invention, a library of peptides and peptidomimetics is designed. Each member contains the MBD sequence necessary to provide a coordination site for complexation with the metal. Such sequences may vary between members of the library. When MBD is combined with a metal, a specific specific structure is obtained, and a mimetic of an inverted structure is formed. The specific stereochemical features of this complex are due to the stereochemistry of the coordination sphere of the complex metal ion. Thus, the preferred arrangement of the metal coordination spheres is defined by determining the characteristics and range of the alignment constraints.
[0088]
The library of the present invention includes structurally or locally constrained structural components. The library can include locally or globally, or a combination thereof, sequence-constrained molecules. This feature of the present invention includes a variety of aggressive hit synthesis, screening and structure elucidation methods for the screening system. The importance of these features is well known and will be apparent from the description below.
[0089]
In general, most metals useful in the present invention have a coordination number of 4 to 6, and rarely have a coordination number of 8. This means that the putative MBD must be made up of residues with reactive groups arranged in a stereocompatible form to establish the binding of the predetermined shape to the metal ion of the coordination sphere. Means The coordinating groups of the peptide chain include the nitrogen atom of the amine, amide, imidazole or guanidino function, the sulfur atom of the thiol or disulfide, and the oxygen atom of the hydroxy, phenol, carbonyl or carboxy function. In addition, peptide chains or individual amino acids can be chemically altered to include coordinating groups such as oximes, hydrazino, sulfhydrido, phosphate, cyano, pyridino, piperidino, or morpholino groups. For a metal having a coordination number of 4, a tetrapeptide amino acid sequence (such as Gly-Gly-Gly-Gly) can be employed. Alternatively, a tripeptide amino acid sequence in which at least one amino acid has a side chain with a coordinating group (such as Gly-Gly-Gly) can also be employed. The side chains can have nitrogen, oxygen or sulfur based coordination groups. Therefore, the amino acid sequence is N₄, N₃S, N₂S₂, NS₃, N₂SO or similar ligands can be provided, and nitrogen, sulfur and oxygen atoms can be used to produce tetradentate coordinated metal ions.
[0090]
In another embodiment of the present invention, the MBD comprises an amino acid residue and a derived amino acid or spacer sequence. Derived amino acids and spacer sequences have nitrogen, sulfur, or oxygen atoms that complex in various oxidation states of the metal. Examples of derived amino acids include amide, primary alkyl or allyl amide, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-2-carboxylic acid and its corresponding 7-hydroxy derivative, N-carboxymethylated amino acid, 2'-mercapto- Trp, a highly analogous analog of Nβ- (2-mercaptoethane) -α, β-diaminopropionic acid and other similar amino acids, and a high analog of Nβ- (2-aminoethane) α, β-diaminopropionic acid and other similar amino acids. A similar high analog, a similar high analog of Nβ- (picolinoyl) -α, β-diaminopropionic acid and other similar amino acids, a similar analog of β- (picolylamide) -Asp- and other similar amino acids, Similar high analogs of Nβ- (2-amidomethylpyridine) -α, β-diaminopropionic acid and other similar amino acids Similar high analogs of β- (2-amino-benzoyl) -α, β-diaminopropionic acid and other similar amino acids, similar analogs of β- (2-amidomethylpyridine) -Asp and other similar amino acids , N-benzyloxycarbonyl amino acids, N-tert-butyloxycarbonyl amino acids, N-fluorenylmethyloxycarbonyl amino acids and other similar urethane-protected amino acid derivatives, and other derived or synthetic amino acids related thereto. . Examples of spacer sequences that can be used in the present invention include 2-mercaptoethylamine, succinic acid, glutaric acid, 2-mercaptosuccinic acid, ethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, tetraethylenepentamine, glycol, polyethylene glycol, and thioglycol. There are acids, mercaptopropionic acid, pyridine-2-carboxylate, picolylamine, 2-mercaptoaniline, 2-aminobenzoic acid and 2-aminomethylpyridine. In general, any sequence having a nitrogen, sulfur or oxygen atom that is directly or indirectly linked to an amino acid to form a contiguous sequence and that is available for multiple use at the valency of the metal ion is considered as an element of the MBD. Available.
[0091]
Metallo-library S-protected thiol-based compounds:
Free thiol (SH) groups are suitable for the conjugation of most metals to peptides and peptidomimetics of the invention. In many cases, SH groups are necessary to form a stable exchange-inactive complex with the metal. However, peptides and other organic molecules with free SH groups are easily oxidized in air and in solution, often forming disulfide linked dimers. If more than one SH group is present in the molecule, oxidation will provide a composite polymer. Similarly, when a mixture of different peptides or organic molecules with free SH groups is provided, oxidation will provide a complex polymer mixture of unknown composition. This is an important issue in the construction of libraries of metallopeptides or other organic molecules when SH groups are used in metal complexes.
[0092]
A variety of SH protecting groups are utilized for a variety of purposes, including the manufacture and design of radiopharmaceuticals. For example, its protected form, S-benzoyl-mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-glycine (Bz-MAG3),^99mUnder conditions where the S-Bz group splits during the Tc complex, Tc-99m (^99mTc). The use of S-Bz protection is incompatible with peptide synthesis methods.
[0093]
For construction of the metallopeptide library of the present invention employing SH groups, the peptide must be an S-protected derivative if mixed pool synthesis is utilized. SH protecting groups are (a) the synthesis of peptide derivatives with S-protecting groups compatible with methods of peptide synthesis in solution and solid phase, the S-protecting groups are stable during synthesis, and (b) metal complex At the time of the step, the S-protecting group is selected such that it can be unprotected in situ without being cleaved from the resin in the case of solid phase synthesis. Bz-MAG₃Many prior art methods, such as Bz-MAG, satisfy only one of the above two criteria.₃Satisfies only (a)).
[0094]
The use of orthogonal S-protected thiol groups provides for the synthesis of metallo compounds in one pot. Mixtures of compounds each containing an orthogonal S-protecting group ("OSPG") are used for conjugation with metal ions, and the S-protecting group is deprotected only when conjugating with metal ions, polymerizing and crosslinking. Is avoided. This procedure provides a homogeneous library of metallo compounds.
[0095]
One OSPG that satisfies the above criteria and can be used in the present invention is SPG to protect the SH group.^tA Bu (S-thio-butyl or St-butyl) group is employed. This S^tBu groups are stable to both acids and bases typically utilized in peptide synthesis. Further S^tThe Bu group can be cleaved by reduction using a suitable phosphine reagent. This reduction step can be performed immediately before or with the conjugation of the metal ion to the peptide. Such OSPG cleave treatment does not cleave the peptide from the resin and does not change the structure of the peptide.
[0096]
Another OSPG that meets the above criteria and is suitable for the present invention utilizes an S-Acm (S-acetamidomethyl) group to protect the SH group. The Acm group is also stable under acid and base conditions and is generally employed during peptide synthesis. The S-Acm group can be removed by treatment of the S-Acm-protected peptide or peptide resin with mercury (II) acetate or silver (I) tertrafluoroborate. This releases the thiol peptide in its mercury or silver ion complex. The free thiol-containing peptide can be recovered by treating mercury or silver ions with a thiol complex salt with a large amount of a thiol-containing reagent such as beta-mercaptoethanol or dithiothreitol. The resulting peptide is used for metal complexing. Alternatively, the thiol complex peptide with mercury or silver ions can be directly treated with a metal ion complex reagent to form the desired metallopeptide.
[0097]
Other examples of OSPGs for metallopeptides are 4-methoxytrityl (Mmt), 3-nitro-2-pyridinesulfenyl (Npys) and S-sulfonate (SO₃H). Mmt is selectively removed by treatment with 1% TFA in dichloromethane. Npys and S-sulfonate are selectively removed by treatment with a thiol-containing reagent such as beta-mercaptoethanol or a phosphine reagent such as tributylphosphine. The Npys group (RG Simmonds RG et al: Int J Peptide Protein Res, 43: 363, 1994) is compatible with Boc chemistry for peptide synthesis and S-sulfonate (Maugras I et al: Int J Peptide Pero). , 45: 152, 1995) are compatible with both Fmoc and Boc chemistry. Similar OSPGs derived from the homologous series of S-alkyl, S-allyl or S-aralkyl can also be used in the present invention. A key feature of OSPG is that it utilizes a thiol-containing amino acid and one sulfur atom from a protecting group to result in the formation of a disulfide (SS) bond. Further, the obtained disulfide (S—S) bond can be cleaved by using various disulfide cleave agents such as a phosphine reagent and a thiol-containing reagent.
[0098]
S^tMethods employing Bu protected SH groups or other OSPGs are applicable for the generation of solid phase or lysed libraries. For solid phase libraries, peptides can be synthesized using conventional Fmoc chemistry. In the case of normal Fmoc chemistry, Fmoc-L-Cys- (S^tBu) is coupled to a suitable resin via an intermediate amino acid, and additional amino acids are subsequently added to L-Cys- (S^tBu) coupled to a residue. S^tBu is available with L- or D-Cys, and other amino acids characterized by SH groups capable of binding metal ions, including designer or unnatural amino acids and mimetics thereof. They include other related 3-mercaptoamino acids such as 3-mercaptophenylalanine and 3-mercaptovaline (penicylamine), 2-mercaptoacetic acid, 3-mercaptopropionic acid, 2-mercaptopropionic acid, -Mercapto-3,3-dimethylpropionic acid, 3-mercapto, 3-methylpropionic acid, 3-mercapto-3,3,3-diethylproprionic acid, 2-mercapto, 2-methylacetic acid , 3-cyclopentaethylene, 3-mercaptopropionic acid, 2-cyclopentamesulene, 2-mercaptoacetic acid, and related amino acids. In all these cases, the S-protection is^tIt can be provided by Bu, S-Acm, Mmt, Npy, S-sulfonate and related groups.
[0099]
Metal ion complexation to MBD:
The conjugation of a metal ion to the sequence of the library, especially to the MBD, is achieved by mixing the sequence with the metal ion. This is conveniently done with a solution containing a suitable buffer. In one method, the metal ion, when mixed with the peptide or peptidomimetic constituents, is in an oxidation state that favors conjugation to MBD. Some metal ions are complexed in an optimal stable oxidation state, such as calcium (II), potassium (I), indium (III), manganese (II), copper (II), zinc (II). In other cases, the metal must be reduced to a low oxidation state to be complexed with the MBD. This has been demonstrated for ferrous, ferric, stannous, stannic, technetium oxo [V], pertechnetate, rhenium oxo [V], perlinate, and the like. The reduction can be performed before, simultaneously with, or after mixing with the sequence. Any known means of reducing metal ions to an oxidation state can be used.
[0100]
For tetradentate coordination with metal ions, rhenium is the preferred ion. The solid-phase resin-bound peptide or peptidomimetic sequence is a rhenium-introducing agent ReOCl in the presence of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene as a base.₃(PPh₃)₂Can be labeled with rhenium ions. Alternatively, the peptide or peptidomimetic sequence in the soluble library may also include the rhenium-introducing agent ReOCl in the presence of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene as the base.₃(PPh₃)₂Can be labeled. Metal complexation in the presence of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) as a base can conveniently be achieved at ambient room temperature.
[0101]
In another method of metal complexation, a mild base such as sodium acetate can be used. In this case, the thiol-containing sequence in solution or bound to the solid phase is taken up in a suitable solvent such as DMF, NMP, MeOH, DCM or a mixture thereof and the rhenium-introducing agent ReOCl is added in the presence of sodium acetate.₃(PPh₃)₂And heat to 60-70 ° C for 15 minutes. Similarly, other bases such as triethylamine, ammonium hydroxide and the like can be used. According to the present invention, in the case of S-deprotected peptides in solution, MeOH is a preferred choice of solvent for rhenium complexation. Solvent selection for the S-deprotected peptide still attached to the solid phase is guided primarily by consideration of good solvation (swelling) of the solid phase. DMF and NMP can be used. MeOH, and DCM, CHCl₃Optimized complexation results can also be obtained using various mixtures of these solvents in combination with E.g.
[0102]
In one embodiment of the present invention, in the presence of DBU and tributylphosphine,^tThe Bu-protected peptide is treated in situ with a rhenium-introducing agent to perform S-deprotection and rhenium complexation in one pot. Alternatively, the S of rhenium in the presence of rhenium perrhenate^tConjugation to the Bu-protected peptide was performed using Sn [II] Cl₂Can be achieved. This reagent provides S-deprotection as well as in situ ReO₄A transformation from the state to the ReO state occurs, causing the complexation of rhenium to the S-deprotected peptide. The preferred approach in the present invention is to use S-deprotection with treatment with tributylphosphine,^tReOCl in the presence of a Bu-protected peptide and DBU at room temperature₃(PPh₃)₂The use of metal complexation of the resulting peptide utilizing
[0103]
In the library of the present invention, MBD forms an inverse turn structure upon complexing with a metal ion, and in the constructed library, the side chains of amino acids in the MBD are changed, and similarly, a part of the MBD is converted. Amino acids that do not form also change. Various compounds in a library of metallopeptides, when coordinated with metal ions, alter the sequence of amino acids in a set of peptides that are all optimized to form a complex of almost similar geometry. Can be obtained by: This optimization can be obtained, for example, by appropriate positioning of amino acids with high affinity to complex with the metal ion. Examples of naturally occurring amino acids with high affinity for metal complexation include Cys and His. Thus, a library of such peptides has at least one of these amino acids properly placed in the sequence, which amino acid is common to all molecules in the library, and thus this amino acid is random. Not converted.
[0104]
A generalized diagram of a solid-phase library of metallopeptides constructed using local conformational constraints is:

[0105]
Where M is a metal ion and A₁And A₂Is an amino acid side chain that forms the part of the reverse turn structure that is a BBD, and the “peptide chain” indicates one or more amino acids. Similar libraries can also be constructed where the components are soluble and thus do not bind to the resin.
[0106]
Another embodiment of the present invention provides for the construction of libraries with global conformational restrictions. In this embodiment, the MBD can be kept constant and a randomized or selected series of amino acid or mimetic sequences can be varied to form a library. This type of library includes metallopeptides in which the MBD is an isosteric replacement for a disulfide, lactam, lactone, thioether or thioester site in a cyclic peptide. In these constructs, the set MBD is between the two preselected ends of a linear peptide or peptide mimetic containing a randomized or selected series of amino acid or mimetic sequences under investigation. be introduced. The general structure of this type of metallopeptide library is:

Where M is a metal ion and A₁And A₂Are structures that can provide additional stability to metal complexation or modulate biological activity, such as determining organs of clearance or altering the biodistribution pattern or pharmacokinetics Element. "Peptide chains" can be varied randomly, which results in a random library or can be directed in a predetermined manner based on known characteristics of the target molecule.
[0107]
One example of a globally-restricted metal peptide library is that all individual members of the library contain a metal ion-binding domain, which library is specifically directed to the melanocortin receptor family. It is a library of peptides. Prior to conjugation to metal ions, the general formula of this library of peptides is:

[0108]
Where X is a fixed MBD containing a plurality of amino acids, so that all of the valencies of the metal ion are satisfied upon complexing the metal ion with X;₁And A₂Each comprise from 0 to about 20 amino acids;₁, Aa₂And Aa₃Comprises one or more amino acids each linked to X through an amide, thioether, thioester, ester, carbamate or urethane bond, wherein Aa₁, Aa₂And Aa₃Each vary. In this example, the MBD may include OSPG. Other thiols in the sequence can optionally include non-orthogonal S-protecting groups so that OSPG can be removed without removal of other S-protecting groups in the sequence.
[0109]
In a solid phase library, the peptide construct attaches to the resin, and the resin is omitted in the soluble library. Functional equivalents of each of these peptide libraries may also be obtained through the development of a library of non-amino acid building blocks that results in a structural mimic of these peptides. Peptide bonds can be replaced by pseudopeptide bonds, such as thioamides, thioethers, substituted amines, carbanates, urethanes, aliphatic moieties and functionally similar constructs.
[0110]
Peptide libraries are first assembled by well-known methods of peptide synthesis according to the sequence identification and denaturation procedures described above. These libraries can be synthesized as spatially addressable compounds that are distinguished in a parallel synthesis using a split synthesis approach or by the de-rotation technique of a soluble library. Using similar methods, pseudopeptide, peptidomimetic or non-peptide libraries can be obtained. Non-peptide libraries can also be incorporated, if desired, into one of a variety of tagging approaches well known to those skilled in the art. Both solid phase and soluble libraries can be obtained in this way. The entire library is then reacted with a suitable metal-complexing agent to obtain a corresponding metal coordination library containing a similar class of predetermined structure. For example, to complex a peptide library with a rhenium oxo metal ion, the peptide library is converted to Re (O) Cl in the presence of sodium acetate.₃(PPh₃)₂Can be processed. This approach results in quantitative complexation of ReO with the peptide. To complex Zn, Co, Mn, Fe or Cu ions, the peptide library is treated with chlorides or other suitable salts of these metal ions to obtain the corresponding library of metal ions. . In essence, different metallopeptide libraries can be constructed using different metal ions. One limiting factor in selecting an appropriate metal ion is the relative stability of the particular metal-peptide complex, which is closely related to the metal-peptide binding constant or constants. It is well known in the art that some metal-peptide constructs are stable only at certain pH or other special conditions or are easily oxidized in air. Some peptide-metal ion complexes, such as those with ReO, are stable in pure form and can be isolated and stored for long periods under normal storage conditions.
[0111]
Metallopeptide libraries constructed in accordance with the present invention may be screened by various techniques reported in the prior art to identify one or more receptor-binding or pharmacologically active melanocortin receptor-specific candidates. Can be identified. Both soluble and solid phase libraries can be used directly in these assays. These techniques are based on the direct target binding approach described by Lam and co-workers (Lam KS et al .: Nature 354: 82-84, 1991: Lam KS et al., Nature 360: 768, 1992), deconvolution and interactive. Re-synthesis approach (Houghten RA et al .: Proc Natl Acad Sci USA 82: 5131-5135, 1985; Berg et al .: J Am Chem Soc 111: 8024-8026, 1989; Dooley CT et al .: Science 266: 2019-2022; Blondelle SE: Antimicrob Agents Chemother 38: 2280-2286, 1994; Panilla C: Biopolymers 37: 221-24 0, 1995), an approach using an orthogonal pool of two co-synthesized libraries by Tartar and coworkers (Deprez B et al .: J Am Chem Soc 117: 5405-5406, 1995), eliminating interactive re-synthesis. Position scanning method revised by Houghton and co-workers (Dooley CT et al .: Life Sci. 52: 1509-1517, 1993; Panilla C et al .: Biotechniques 13: 901-905, 1992: Panilla C et al .: Drug Dev Res 33: 133-145, 1992), and a combination method of a position scanning method and a split synthesizing method (Erb E et al .: Proc Natl Acad Sci USA, 91: 11422-1426, 199). ) Including the.
[0112]
Among these techniques, the deconvolution and interactive resynthesis approach, an approach involving an orthogonal pool of two co-synthesized libraries, and a position scanning method are directly applied to a soluble metallopeptide library to provide a screening process. The structure of the "hit" or peptide identified as a receptor-binding or pharmacologically active candidate in E. coli can be elucidated. For solid phase libraries other than the spatially addressable parallel synthesis library, the structure of the hit can be determined directly by various strategies well known to those skilled in the art. These include direct mass spectrometry of compounds covalently bound to a solid phase matrix of particles by use of matrix-assisted laser sorption / ionization (MALDI) technology (Siuzdak G et al .: Bioorg Med Chem Lett 6: 979, 1996; Brown BB et al .: Molecular Diversity 1: 4-12, 1995). The technique of creating a series of partially end-capped compounds at each of the synthetic steps during library assembly also aids unambiguous identification by mass spectrometry (Youngquist RS et al .: J Am Chem Soc, 117). : 3900-3906, 1995; Youngquist RS et al .: Rapid Commun Mass Spectr 8: 77-81, 1994). In addition to these analytical techniques, various coding strategies devised for structural elucidation in organic molecule-based libraries, including non-peptide and non-nucleotide libraries, can be utilized. Various coding strategies, such as DNA coding, peptide coding, halo-aromatic tag coding, and coding based on radio frequency transponders, are well known in the art today and are used directly in combination with metal peptide libraries be able to. These tagging strategies require incorporation of tags during the progress of library synthesis, which can be achieved during construction of a metal peptide library. This is because metal complexation is the final post-synthesis step.
[0113]
Melanocortin receptor-specific library member structural diversity. Some examples of molecular templates that can be used in the present invention are shown below for tetradentate metal ion complexation. In general, these molecular templates define the group of metal peptides of the present invention that, by the proposed substitution, give rise to a library of melanopeptides used in the determination of melanocortin receptor-specific compounds, which can be agonist or antagonist compounds. I do. It is understood that the template is provided without metal ions and the compound exhibits enhanced specificity for the melanocortin receptor only upon metal ion complexation.
[0114]
R₁-Lll-Aaaa-Bbb-Ccc-R₂ Mold 1
and
R₁-Bbb-Aaaa-Ccc-R₂ Mold 2
Where R₁Is any functional group that enhances the remaining intrinsic activity of the molecule, including but not limited to providing auxiliary or second receptor contact. Any of a variety of amino acids and non-peptide groups can be used, including amino acids of 1 to about 4 neutral or charged L- or D-configuration amino acid residues. If R₁If is a non-peptide group, it can be a linear or branched alkyl, aryl, alkene, alkenyl or aralkyl chain.
[0115]
Here, Aaaa is a cationic amino acid of L- or D-configuration having a positively charged side chain. Preferred amino acids include Lys, Arg, Om, Dpr or Dbu in the L-configuration, including natural and synthetic amino acids, and derivatives, analogs or homologs thereof. Aaaa provides N (nitrogen atom) for metal ion complexation.
[0116]
Here, Bbb is an L- or D-configuration amino acid having an aromatic side chain. Preferred amino acids are Dhe-configuration Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4' -Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl ) Or Tyr (BzlCl₂), And derivatives, analogs or homologs thereof. The aromatic ring in Bbb can be functionalized with a halogen, alkyl or aryl group. Bbb provides N for metal ion complexation.
[0117]
Here, Ccc is an amino acid that provides both N from the alpha amino group and S (sulfur atom) from the side chain group for metal ion complexation. Preferred amino acids include Cys, Pen and Hcys in the L- or D-configuration.
[0118]
Here, L11 is a D-configuration amino acid having an aromatic side chain. Preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) Or Tyr (BzlCl₂), And derivatives, analogs or homologs thereof. The aromatic ring in Lll can be functionalized with a halogen, alkyl or aryl group. Lll does not provide N for metal ion complexation.
[0119]
Where R₂Is an amino acid having an aromatic side chain. Preferred amino acids are Phe, Trp, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl) in the L- or D-configuration. Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl) , Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl₂), And derivatives, analogs or homologs thereof, and includes both natural and synthetic amino acids. The C-terminus may be free or amidated. R₂Can also be the corresponding des-carboxyl amino acid of any of the foregoing. Alternatively, R₂Can be eliminated.
[0120]
FIG. 1 shows the structure of template 1, FIG. 2 shows the structure of template 2, in both cases the coordination with tetradentate sphere metal ions,₃S₁A metal ion bond results.
[0121]
R₁-Ddd-Bbb-Aaaa-R₃ Mold 3
Where R₁, Bbb and Aaaa are as described above.
[0122]
Here, Ddd is an amino acid that provides S from the side chain group for metal ion complexation. Preferred amino acids include Cys, Pen and Hcys in the L- or D-configuration.
[0123]
Where R₃Is an amino acid with an aromatic side chain that provides N for metal ion complexation. Preferred amino acids are Phe, Trp, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl) in the L- or D-configuration. Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl) , Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl₂), And analogs or homologs thereof, and includes both natural and synthetic amino acids. The C-terminus can be free or amidated. R₃Can also be the corresponding des-carboxyl amino acid of any of the foregoing.
[0124]
FIG. 3 shows the structure of the mold 3,₃S₁Figure 4 shows coordination with a tetradentate sphere metal ion that results in metal ion binding.
[0125]
R₄-Eee-Bbb-Ccc-R₂ Mold 4
Where R₂, Bbb and Ccc are as described above.
[0126]
Where R₄Is a functional group that provides a cationic center. Preferred amino acids include Lys, Arg, Om, Dpr or Dbu in the L- or D-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, and include both natural and synthetic amino acids. The N-terminus of an amino acid can be functionalized with any of a variety of neutral amino acid and non-peptide groups, including straight or branched alkyl, aryl, alkene, alkenyl, or aralkyl chains. .
[0127]
Here, Eee is an uncharged L- or D-configuration amino acid that provides N for metal ion complexation. Preferred amino acids include Ala, Nle, Leu, Val, Phe or Trp in the Gly and L-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, including both natural and synthetic amino acids. In a preferred embodiment, Eee is an amino acid having an aliphatic side chain.
[0128]
FIG. 4 shows the structure of the mold 4,₃S₁Figure 3 shows a coordination with a tetradentate sphere metal ion that results in metal ion binding.
[0129]
R₁-Fff-Aaaa-Ggg-Ccc-R₅ Mold 5
Where R₁, Aaaa and Ccc are as described above.
[0130]
Here, Fff is an aromatic amino acid in the L- or D-configuration. Preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) , Tyr (BzlCl₂), Tic, Tiq or Tca, and derivatives, analogs or homologs thereof, and includes both natural and synthetic amino acids. The aromatic ring in Fff can be substituted with a halogen, alkyl or aryl group. Fff does not provide N for metal ion complexation.
[0131]
Here, Ggg is an aromatic amino acid in the L- or D-configuration. Preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4' Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) ) Or Tyr (BzlCl₂), And its derivatives analogs or homologs, and includes both natural and synthetic amino acids. The aromatic ring in Ggg can be substituted with a halogen, alkyl or aryl group. Ggg provides N for metal ion complexation.
[0132]
Where R₅Is preferably an amide, substituted amide, ester or carboxylate group. R₅Can also be amino acids or amino acid amides in the L- or D-configuration, including aromatic, aliphatic, neutral or charged amino acids.
[0133]
FIG. 5 shows the structure of the mold 5,₃S₁Figure 3 shows a coordination with a tetradentate sphere metal ion that results in metal ion binding.
[0134]
R₁-Hhh-Aaaa-Bbb-Ccc-R₅ Mold 6
Where R₁, Aaaa, Bbb, Ccc and R₂Is as described above.
[0135]
Here, Hhh is a cationic amino acid in the L- or D-configuration with a positively charged side chain. Preferred amino acids include Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu in the L-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, including both natural and synthetic amino acids. Hhh does not provide N for metal ion complexation.
[0136]
FIG. 6 shows the structure of the mold 6,₃S₁4 shows the coordination with a tetradentate sphere metal ion that causes metal ion binding.
[0137]
R₁-Iii-Iii-Ccc-Jjj-Kkk-R₂      Mold 7
Where R₁, Ccc and R₂Is as described above.
[0138]
Here, Iii is an L- or D-configuration amino acid that provides N for metal ion complexation. Preferred amino acids include Ala, Gly, Nle, Val, Leu, Ile, His, Lys or Arg, and analogs or homologues thereof, and include both natural and synthetic amino acids.
[0139]
Here, Jjj is an L- or D-configuration amino acid having an aromatic side chain. Preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'- Phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) Or Tyr (BzlCl₂), And derivatives, analogs or homologs thereof. The aromatic ring in Jjj can be functionalized with a halogen, alkyl or aryl group. JJJ does not provide N for metal ion complexation.
[0140]
Here, Kkk is a cationic amino acid of L- or D-configuration having a positively charged side chain. Preferred amino acids include Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu in the L-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, and include both natural and synthetic amino acids. Aaaa does not provide N for metal ion complexation.
[0141]
FIG. 7 shows the structure of the mold 7,₃S₁Figure 3 shows a coordination with a tetradentate sphere metal ion that results in metal ion binding.
[0142]
The templates described above can be used with tetradentate sphere metal ions, such as various forms of technetium and rhenium. Corresponding templates can be constructed for use with other coordination sphere metal ions.
[0143]
Representative peptides of the invention:
Representative peptides of the invention were made using the libraries and synthetic methods described herein, and selected peptides were tested using a binding assay.
[0144]
Here, Kkk is a cationic amino acid of L- or D-configuration having a positively charged side chain. Preferred amino acids include Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu in the L-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, and include both natural and synthetic amino acids. Aaaa does not provide N for metal ion complexation.
[0145]
FIG. 7 shows the structure of the mold 7,₃S₁4 shows the coordination with a tetradentate sphere metal ion that causes metal ion binding.
[0146]
The templates described above can be used with various forms of tetradentate sphere metal ions, such as technetium and rhenium. Corresponding templates can be constructed for use with metal ions in other coordination spheres.
[0147]
Representative peptides of the invention:
Representative peptides of the invention were made using the libraries and synthetic methods described herein and tested using binding assays. Table 1 describes the peptides of the invention and the results of the competitive inhibition binding assay. Peptides were synthesized using conventional peptide synthesis methods and complexed with rhenium using the methods described herein.
[0148]
The competitive inhibition binding assay was performed using 1 mM MgCl pH 7.2.₂, 2 mM CaCl₂And 0.4 nM in 50 mM HEPES containing 5 mM KCl¹²⁵This was performed using membranes prepared from hMC4-R (containing MC1-R) and B-16 mouse melanoma cells using I-NDP-alpha-MSH (New England Nuclear, Boston, Mass., USA). Assay tubes are¹²⁵To determine its efficacy in inhibiting the binding of I-NDP-alpha-MSH to its receptor, containing a selected concentration of a test peptide of the invention complexed to the indicated rhenium metal ion did. Non-specific binding was determined in assays in the presence of 1 μM alpha-MSH.¹²⁵It was measured by complete inhibition of I-NDP-alpha-MSH binding. Incubation was for 90 minutes at room temperature, after which the assay mixture was filtered and the membrane was washed three times with ice-cold buffer. The filters were dried and counted on a gamma counter for remaining radioactivity bound to the membrane. 100% specific binding was defined as the difference in radioactivity (cpm) bound to the cell membrane in the absence and presence of 1 μM alpha-MSH. The cpm obtained in the presence of the test compound is normalized to 100% specific binding,¹²⁵The percent inhibition of I-NDP-alpha MSH binding was measured. Each assay was performed in triplicate and the actual average values are listed in Table 1. Negative numbers in Table 1 under "% inhibition" are from experimental deviations, indicating no inhibition; similarly, values above 100% are also from experimental deviations, indicating complete inhibition.
[0149]
[Table 1]

[0150]

[0151]
A cAMP assay was also performed on selected peptides of the present invention. Human MC4-R or B-16 cells grew into a 96-well plate assembly (approximately 250,000 cells / well plating). Three identical sets of cells were treated with 0.2 mM isobutylmethylxanthine (IBMX) and rhenium metal ion conjugate peptide at the selected concentrations of rhenium metal ion conjugate peptide and 20 nM α-MSH. Cells similarly treated with only 20 nM α-MSH served as a positive control. A buffer blank as a negative control was also included. The culture was performed at 27 ° C. for 1 hour, after which the culture was aspirated and the cells were removed with 150 μl of HCl. Total cAMP accumulated in 100 μl of this solution was quantified using a low pH cAMP assay kit (R & D system) as specified by the kit supplier. The table shows those exposed only to the test compound and the amount of cAMP accumulated in the cells in the presence of 20 nM α-MSH. Rhenium metal ion conjugated peptides showing cAMP accumulation in the same range as or above the positive control (buffer blank in the presence of α-MSH) are considered to be agonist ligands. A rhenium metal ion conjugated peptide showing the same range of accumulation as the negative control (buffer blank in the absence of α-MSH), if the result is similar to the positive control where α-MSH is also present in the assay No effect at test concentration. Rhenium metal ion complexed peptides that show the same range of accumulation as the negative control are considered antagonists if suppression of cAMP is present when α-MSH is present in the assay. The values above the positive control are due to the effective agonism, experimental deviation or synergistic agonist effect of the rhenium metal ion complex peptide and α-MSH.
[0152]
[Table 2]

[0153]
Based on previous experiments, potential lead molecules were identified, including:
PL-1145 MC1-R agonist (Template 2)
PL-1144 MC1-R agonist (Template 2)
PL-1493 MC4-R antagonist (Template 1)
PL-1883 MC4-R agonist (Template 1)
PL-1489 MC4-R antagonist (template 5)
PL-1950 MC4-R specific (template 5)
PL-1947 MC4-R specific (template 5)
PL-1581 Non-specific agonist (template 5)
PL-1790 Non-specific agonist (template 5)
PL-1791 Non-specific agonist (template 5)
PL-1792 Non-specific agonist (template 5)
PL-1605 Non-specific antagonist (template 6)
PL-1758 Non-specific (template 4)
PL-1877 MC4-R specific (template 4)
PL-1902 MC4-R specific (template 4)
PL-1909 MC4-R specific agonist (template 4)
PL-1888 MC4-R specific (template 7)
PL-1269 MC4-R specific antagonist (template 3)
PL-1297 MC4-R specific antagonist (template 3)
Radiopharmaceutical application. In one embodiment, a metal peptide of the invention that is MC1-R specific is used as a radiodiagnostic agent to image melanoma tumor metastases.^99mWhen complexed to Tc, and as a radiotherapeutic agent, rhenium-188 (for the treatment of melanoma and metastatic tumors)¹⁸⁸Re), rhenium-186 (¹⁸⁶Re) or when complexed to other therapeutic radionuclides.
[0154]
Human melanoma has a complex antigenic profile. In general, malignant melanoma is thought to be driven by UV activity from DOPA-positive melanocytes, a melanin (skin pigment) production unit. Primary diagnoses include electron microscopy to determine the presence or absence of pre-melanosomes. Melaninous melanomas are classified into dendrites, spindles, quirky line patterns, large epicelloids, small nevus, and the like. On the other hand, amelanotic melanoma is frequently misdiagnosed. This is because the histology of these cells is similar to that of malignant lymphomas, carcinomas or sarcomas. Therefore, morphological evaluation may not prove to be reliable in clinical diagnosis. Thus, there is a particular need for a receptor-specific diagnostic test for identifying and locating metastatic melanoma tumors.
[0155]
Several studies have described the presence of melanocyte stimulating hormone receptors on primary human melanoma cells. Melanocyte stimulating hormone receptor has been reported as a marker for melanotic and amelanogenic human melanoma tumors. In particular, the presence of MC1-R has been demonstrated in human melanoma cells by antibodies to MC1-R.
[0156]
The melanocyte stimulating hormone bioactive sequence or message segment is the tetrapeptide His-Phe-Arg-Trp, which exists as a reverse turn. Within the reverse turn, the His, Phe and Trp residues are postulated to form a hydrophobic receptor binding surface. His residues have recently been identified as single residues that help distinguish between MC1-R and MC4-R. Thus, the metallopeptides of the invention that are specific for MC1-R and bind with high affinity to MC1-R, but are not specific for MC4-R, or bind to MC4-R with low affinity It is possible to design. One result is high specific affinity and selectivity for MC1-R^99mIt is a Tc-labeled radioimaging agent. In addition, the amounts of agonists and antagonists of the invention metallopeptides are considered in comparative evaluations in imaging melanoma tumors.
[0157]
The product can be formulated as a single vial lyophilized radiolabeling kit containing the peptide in uncomplexed state, buffer, and reducing agent for pertechnetate. To induce the radiolabel resulting in the metallopeptide, the vial is incubated after the addition of sodium pertechnetate.
[0158]
^99mIn one method of labeling with Tc, a 5-10 μg sample of peptide taken in 0.001 N hydrochloric acid was generated from 1-30 mCi of generator-eluted Na in a 5 ml serum vial.^99mTcO₄Mix with. The volume of the resulting mixture is adjusted to 600 μl with saline for injection. A 400 μl volume of freshly prepared nitrogen-purged phthalsan-tartrate-Sn (II) buffer (40: 10: 1 mM) is added to the vial under a nitrogen headspace. The vial is immediately sealed and placed in a shielded boiling water bath. After 15 minutes, the vial is removed from the water bath and allowed to cool to room temperature. Radiochemical purity calculated from the HPLC profile ranges from 90-99%.
[0159]
Alternatively, tartaric acid-succinic acid-stannous buffer, EDTA-succinic acid-stannous buffer, stannous stabilized in glucoheptonate, or emissive-tartaric acid-stannous buffer Other means, including the use of^99mAlternatively, the peptide of the invention may be alternatively labeled by Tc.^99mIt can be labeled with Tc.
[0160]
For radiopharmaceutical and other pharmaceutical applications, the metallopeptides of the invention can be delivered to a subject by any means known in the art. This includes intravenous injection, subcutaneous injection, administration through mucous membranes, oral administration, dermal administration, topical administration to organs, cavities or regions, and the like.
[0161]
Imaging can be by any means known in the art, including gamma cameras and SPECT imaging. Imaging can begin immediately after administration, can include time-marching radiographic experiments, and can continue as long as the image can be obtained.
[0162]
The MC1-R specific metallopeptides of the present invention can be used as melanoma specific tumor imaging and staging agents. These uses include early detection and localization of primary and diffuse lesions, identification of lymph nodes containing the lesions, radioimmunoguided surgical applications, and the like. MC1-R selective of the present invention^99mTumor imaging with Tc-labeled metallopeptides will further help to formulate the optimal mode of clinical treatment, whether surgical, radiation or chemotherapy.
[0163]
Chemopreventive application:
In another embodiment, the metallopeptides of the invention that are specific for MC1-R can be used as chemopreventive agents against sun induction, such as ultraviolet radiation, as neoplastic activities in human skin. The MC1-R agonist metallopeptides of the present invention can be used to stimulate epidermal melanocytes, produce melanin, and convert pheomelanin to eumelanin. Eumelanin, a dark brown or black pigmentation, is considered more photoprotective than pheomelanin, a yellow or red pigmentation.
[0164]
Generally, individuals with darker skin have a lower incidence of skin cancer than people with lighter skin. The dark pigment eumelanin, a brown-black pigment that incorporates dopa-based structural units, is the major photoprotectant in the skin. Lighter colored people have higher levels of pheomelanin, a red / yellow pigment with cysteine as a species and an associated sulfur-based structural unit that is an ineffective UV absorber. The process of melanogenesis is the stimulation of MC1-R in epidermal melanocytes, thereby mediating the stimulation of thiosinase enzymes in these pigment cells, inducing the conversion of tyrosine to dopa, and then to eumelanin through dopaquinone. It is considered to include the conversion of Sunburn due to direct sun exposure has also been proposed to derive from the same pathway by local production of melanocyte stimulating hormone peptides from the POMC gene in the epidermis. Thus, stimulation of eumelanin production and conversion of pheomelanin to eumelanin may be a desirable chemopreventive modality in blocking sun or UV-induced neoplastic activity in skin.
[0165]
The excellent high affinity and high selectivity MC1-R agonist metallopeptides of the present invention are therefore used as therapeutic chemopreventive agents to combat harmful sun or ultraviolet exposure that induces neoplastic activity in skin melanocytes be able to.
[0166]
In particular, avoidance of any significant UV exposure is medically necessary in individuals who have been previously diagnosed with melanoma or have been diagnosed as being highly susceptible to melanoma. Currently, both physical screens such as hats, long sleeves, etc., and various sun or UV protection creams and formulations are utilized. However, even the best chemical sun block is limited in its efficiency as a function of absolute and time, and physical screens are unsuitable for many activities. This results in individuals undergoing unacceptably high UV doses such as swimming, hiking, skiing, participating in sporting events, hiring in an outdoor environment or normal activities as described above.
[0167]
Eumelanin production performed through the activity of MC1-R in epidermal melanocytes provides a natural shield against solar (ultraviolet) -induced mutations and DNA damage than any solar block. Eumelanin is a better UV absorber over a wider range than any commercially available sun protection cream or formulation.
[0168]
The metallopeptide for this application is rhenium, or a non-radioactive isotope of another metal specified herein, and may be a metallopeptide by any means specified herein or known in the art. It can be made by ion complexation. Metallopeptides can be formulated by any means known in the art, including but not limited to tablets, capsules, caplets, suspensions, powders, lyophilized forms and aerosols, buffered Liquids, binders, stabilizers, antioxidants and other agents known in the art can be mixed and formulated therewith. The metallopeptide can be any systemic or partial agent known in the art, including but not limited to intravenous injection, subcutaneous injection, transmucosal administration, oral administration, dermal administration, dermal patches, aerosols, etc. It can be administered by targeted systemic means.
[0169]
Therapeutic applications:
In another embodiment, the MC4-R agonist metallopeptides of the present invention can be used as therapeutics to modify energy metabolism and dietary behavior, including the treatment of pathological obesity and related disorders. The metallopeptide of the present invention, which is an MC4-R antagonist, can also be used as a therapeutic agent for eating disorders, such as in the treatment of anorexia.
[0170]
The center of control for eating and satiety is in the hypothalamus. These responses are determined by various hormones and soluble factors that signal through specific receptors in the hypothalamus. MC4-R is known to be expressed in the brain and inactivation of this receptor by gene targeting results in maturation-onset obesity syndrome associated with polyphagia, hyperinsulinemia and hyperglycemia A mouse has been obtained.
[0171]
In yet another embodiment, the metallopeptides of the invention can be used as therapeutics for the treatment of sexual dysfunction, including both male erectile dysfunction and female sexual dysfunction. In yet another embodiment, the metallopeptides of the present invention can be used as therapeutic agents for the treatment of inflammation, specifically including MC1-R and MC3-R agonist metallopeptides.
[0172]
The metallopeptide of the present application is a non-radioactive isotope of rhenium, or another metal identified herein, and a metal ion by any means identified herein or known in the art. It can be made by complexation. The metallopeptide can be formulated by any means known in the art, including but not limited to tablets, capsules, caplets, suspensions, powders, lyophilized forms and aerosols, It can be mixed with and formulated with buffers, binders, stabilizers, antioxidants and other agents known in the art. Metallopeptides can be any systemic or known in the art, including but not limited to intravenous injection, subcutaneous injection, transmucosal administration, oral administration, dermal administration, dermal patches, aerosols, etc. It can be administered in part by systemic means.
[0173]
The invention is further illustrated by the following non-limiting examples.
[0174]
Example 1 Development of a Prototype Metallopeptide Library for Melanocortin Receptors
Library design was based on the tetrapeptide message sequence, His-Phe-Arg-Trp of α-MSH (6-9 sequence). This sequence exists as a reverse turn, making it suitable for conversion to the metallopeptide format of the present invention. In this approach, the metallopeptide is a tripeptide N designed for the rhenium metal ion.₃S₁Designed around MBD. MBD is derivatized to give the pentapeptide Ac-His-Phe-Arg-Cys-Trp-NH as a putative candidate for the melanocortin ("MC") receptor₂Got. Further improvements in the structure are subject to other considerations, including amino acid side chain chirality, and the template structure Ac-His-D-Phe-Arg-Cys-Trp-NH₂Occurred. The structure of this peptide after binding to rhenium is:

[0175]
It is.
[0176]
Using the template structure, a small random sequence library was defined using the split synthesis method. The final template selected for the random sequence library was Ac-D-His-Xaa-D-Cys-Trp-NH₂Where Xaa was D- (2 ') naphthylalanine, D-Trp, D-homoPhe, or D-phenylglycine. For this library, a peptide resin, Cys (S^tBu) -Trp (Boc) -resin was cut into four equal parts. Each part reacted with one of the four Xaa types. After coupling, the resin pools were mixed and synthesis continued in a single pool to couple His residues. The end result is four separate peptides in a single pool, each peptide changing by one amino acid at the Xaa position.
[0177]
S^tThe Bu OSPG group was used to protect the SH group during the synthesis. After solid phase assembly of the peptide chain using Fmoc chemistry at the acid labile side chain protecting group, the S^tThe Bu OSPG group was cleaved. In the presence of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene as base, the resulting free SH-containing peptide-resin is converted to the rhenium-introducing agent Re (O) Cl₃(PPh₃)₂Processed. The resulting metallopeptide resin was then treated with TFA, which was cleaved from the resin and all side chain protecting groups were deprotected. The product was analyzed by mass spectroscopy. HPLC analysis was performed and individual peaks were collected and submitted for mass spectrometry. The resulting peptide was analyzed by electrospray mass spectrometry to give the expected mass, including rhenium conjugated to the peptide.
[0178]
Example 2 Design and Synthesis of Melanocortin Receptor-Specific Metallopeptide Library
The library comprises a melanocyte stimulating hormone side chain pharmacophore D-Phe that interacts with a hydrophobic network of receptor aromatic residues in transmembrane regions 4, 5, 6 and 7.⁷And Trp⁹Were rationally designed based on data relating to the melanocortin receptor and peptide sequences specific for the melanocortin receptor. Based on design criteria, pharmacophore for the melanocortin receptor was pre-defined and a random sequence library was designed for the identification of good receptor-selective agonists.
[0179]
Based on design criteria, putative structure R-Aaa-Baa-L-Cys-Caa-NH₂Where each of Aaaa, Baa and Caa is from the L- or D-isomer of 2-Nal (1), Phe (2), Trp (3), Tyr (4) and Ala (5). Selected, and thus any one of the above can be substituted for any one of Aaaa, Baa or Caa. In the nomenclature adopted for library design, the five amino acids are numbered from 1 to 5 and are usually noted with the isomerism, thus, for example, Baa₂L refers to L-Phe in Baa.
[0180]
The terminal R group is Ac, C₆H₅OOH, CH₃(CH₂)₅-COOH, C₆H₅CH = CH-COOH (trans) and pyridine-3-carboxylate. The terminal R group represents a truncated amino acid and provides additional structural diversity.
[0181]
The pool and split library synthesis scheme synthesizes 5000 separate compounds, resulting in 200 final pools, each containing 25 different compounds, that differ only by amino acids at the Aaa and Baa positions. Used for Using this method, binding characteristics associated with Caa amino acids or R-terminal groups are identified through inter-group comparisons, thereby simplifying deconvolution.
[0182]
The library synthesis steps are described in FIG. The resin from Step 1 was divided into 10 groups. In step 2, Caa₁L to Caa₅Each up to D was coupled to an individual resin group, and L-Cys was coupled to each resin group, resulting in 10 groups and 20 couplings. Next, each of the resin groups of Step 2 was divided into the 10 subgroups shown in Step 3 (only one subgroup was shown in Step 3, and in each subgroup of Step 3, Baa₁L to Baa₅Each of D was coupled to one group within the subgroup, resulting in 100 out of 10 subgroups and 100 couplings). In each subgroup of step 3, 5 Baa_xL member and 5 Baa_xThe D members are pooled separately in step 4 to yield 20 subgroups, each subgroup consisting of Baa_xContains five different sequences that vary by member. Then, in step 5, each of the 20 subgroups of step 4 was divided into 10 groups (only one is shown in FIG. 8 for illustrative purposes), and in each subgroup, Aaaa₁L to Aaaa₅Each of D was coupled to one group within the subgroup, resulting in 200 of the 20 subgroups and 200 couplings. In each subgroup of step 5, 5 Aaaas_xL members and 5 AAAs_xThe D members were separately pooled in step 6, resulting in 40 subgroups, each subgroup comprising Baa_xAnd Aaaa_xContains 25 different sequences that vary by member. In step 7, each of the 40 subgroups of step 6 is divided into 5 groups,₁Or R₅Are coupled to one of the subgroups, resulting in 200 of the 40 groups, each group comprising Baa_xAnd Aaaa_xContains 25 different sequences that vary by member.
[0183]
The peptides were synthesized using Fmoc chemistry, protecting the side chain functional groups with acid labile groups. Using tributylphosphine as a reducing agent, a cleavable S in the presence of both a base and an acid labile group^tBu OSPG protected the SH group of the Cys residue. Using 1- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) as a coupling agent, a peptide chain was assembled on a solid phase. The SH group is then selectively unprotected and the rhenium transfer agent Re (O) Cl is added in the presence of 1,8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) as a base.₃(PPh₃)₂Was used to complex the rhenium metal ion. In this way, a metal-peptide complex is formed, with the peptide chain still attached to the solid support. The metallopeptide was then released from the solid support by treatment with TFA. This solid-phase approach to metal ion complexation is well compatible with the split synthesis method used with random sequence libraries.
[0184]
The synthesis process was performed using a commercial automated synthesizer. Multiple manual synthesizers (such as those commercially available from SynPep Corporation, Dublin, CA) allow parallel synthesis of 10 peptides simultaneously.
[0185]
If necessary, use qualitative control protocols, which include HPLC, mass spectroscopy, and amino acid analysis for each individual pool of 25 compounds. The presence of each of the pool components is established by molecular ion mass spectrometry. Negative ion mode electrospray (ES) and matrix-assisted laser sorption (MALD1) techniques were used. Three different measurements were performed using mass spectrometry: (a) the presence of up to 25 individual compounds by molecular ion peak measurement (assuming different masses for each compound), and (b) the molecular ion peak was rhenium. Confirmation of complexation with metal ions, and (c) absence of peaks with molecular masses corresponding to peptides not complexed with metal ions. Rhenium is a mixture of two isotopes that differ in mass by two units (186 and 188), and the relative abundance of these isotopes is 1: 2. The molecular ion profile of the metallopeptide appears as two peaks that differ by two mass units with an integral area ratio of 1: 2. Thus, rhenium serves as the internal mass spectral reference for these metallopeptides. The spectral analysis of one such pool of 25 compounds synthesized by the method of this claim is shown in FIG. The five sets of two metallopeptides in this pool have similar masses due to the presence of identical amino acids assembled in different sequences. The relative intensities of the peaks are due to the different ionizations of the individual compounds in the pool and do not reflect the relative amounts in the mixture. Each pair of peaks with a mass unit difference of 2 and a relative ratio of 1: 2 is due to the relative abundance of the two stable isotopes of rhenium (Re-185 and Re-187). Spectral analysis did not reveal any free uncomplexed linear peptide that would be approximately 197 to 199 mass units less than the corresponding metallopeptide due to the absence of the rhenium-oxo core.
[0186]
Amino acid analysis of each pool of 25 metallopeptides was also used and used to determine the relative equimolar ratio of the 25 compounds in the pool. The synthesis protocol for split synthesis was designed to ensure equimolar amounts of pool components.
[0187]
Example 3 Screening of Melanocortin Receptor-Specific Library
In a high-throughput screening assay, metallopeptide libraries are screened for MC4-R receptor and MC1-R receptor binding activity. The MC receptor-binding assay uses a membrane preparation from B16-F1 or B16-F10 melanoma cells as the source of the MC receptor. Cell membranes prepared from MC4-R-expressing 293 cells and negative control, untransfected 293 cells are replaced in the MC4-R specific binding assay with B16-F1 or B16-F10 melanoma cell membranes. The MC receptor-binding assay used a Millipore Multi-Screen System, which was a 96-well Millipore filter plate (Durapore, 0.45 mm porosity) previously blocked with 0.5% bovine serum albumin in phosphate buffered saline. Degree) in the middle. Cell membrane preparation (12.5 μg / well) was prepared at 0.4 nM in HEPES buffer containing 0.2% bovine serum albumin.¹²⁵Incubate with I-NDP-MSH. Non-specific binding is 10^-6Α-MSH of M or 10^-7Determined by the addition of M NDP-MSH. The metallopeptide to be tested is added at a final concentration of 1 mM in the reaction wells. After a 90 minute incubation at room temperature, the binding reaction is quickly stopped by filtration and the membrane is captured. The filters are washed three times with ice-cold PBS and air-dried. The individual filters are then punched from the plate and distributed into gamma counter tubes. Radioactivity bound to the membrane is measured on a Packard Cobra gamma counter. Specific binding is¹²⁵From the radioactivity in the wells containing I-NDP-MSH alone, 10^-5The radioactivity in wells containing M α-MSH is determined to be subtracted. Test compounds are screened in duplicate wells and considered active if the 1 μM concentration inhibits> 50% of specific binding. A standard curve of unlabeled NDP-MSH is included on each plate as an internal assay control.
[0188]
The agonistic ability of metallopeptides to bind MC4-R is evaluated using a commercially available cAMP kit (R & D Systems, DE0350, low pH). 293 cells stably transfected with the hMC-4 receptor, or B16-F1 melanoma cells, are grown to confluence in 96-well dishes. Wash cells, add 0.2 mM isobutylmethylxanthine (cAMP phosphodiesterase) and varying concentrations of metallopeptide or fresh FPGA containing alpha-MSH as positive control and incubate cells at 37 ° C. for 1 hour I do. The medium is aerated and the cell layer is extracted with 150 μl of 0.1 M HCl. Total cAMP accumulation in 100 μl of cell extract is quantified in a 96-well plate by a competitive immunoassay with a cAMP kit using acetylation modification. EC for test compound₅₀The value is 10^-6Calculated based on cAMP accumulation in cells treated with M α-MSH. The ability of both these cell types to accumulate cAMP in the presence of α-MSH and MSH analog peptides has been described in the scientific literature; see, for example, Ollman MM et al., Science 278: 135-138, 1997.
[0189]
Example 4 Deconvolution of Melanocortin Receptor-Specific Library
Deconvolution of the positive pool is done by an interactive resynthesis and screening deconvolution approach. The individual 25 components are synthesized separately or in each of five pools of compounds, and each pool is screened in a receptor binding assay. The latter approach is preferred, where there is a high hit frequency in the preliminary screen. Compounds in the pool with good results (close to the receptor affinity in the nanomolar range and an MC4-R or MC1-R selectivity of at least 100) are individually synthesized and screened.
[0190]
Example 5 Melanocortin Receptor-Alternative Method of Deconvolution of a Library
In this example, an alternative method of mass spectral deconvolution of a metallopeptide library is used. The method is based on the internal signature of the rhenium-complexed peptide (two isotopic peaks in a 1: 2 ratio differing by 2 mass units), which generally allows the identification of metallopeptides even in mixed solutions And The positive pool is incubated with the receptor-bearing cells, excess unbound compounds are washed away under controlled conditions, and the cells are treated with a solvent to break up metallopeptide bonds and extract metallopeptides in the solvent. . Mass spectrometry analysis of the solvent reveals the metallopeptide or metallopeptides bound to the receptor-bearing cells and, through comparison to qualitative control data, identifies the bound specific metallopeptide or metallopeptides. It is possible to confirm. This process provides high throughput metallopeptide library screening.
[0191]
Example 6 General structure Ac-His-Xaa-Cys-Trp-NH₂-Pot synthesis of a library of four metallopeptides
A synthesis procedure similar to that described in Example 1 was used to create this library. NovaSyn TGR resin (substitution 0.2 mM / gm) for making peptide amide was used. The following amino acid protection: Fmoc-Trp (Boc), Fmoc-Cys (S^tBu), Fmoc-XXX and Fmoc-His (Trityl) and the Fmoc synthesis strategy was used. The Xaa amino acids were Trp, Homo Phe, 2'-naphthylalanine and phenylglycine. Peptide resin Cys (S'Bu) -Trp-NH₂Was cut into four equal pools, and one of the Xaa amino acids was coupled to one individual pool. After completion of the coupling reaction, the four resin pools were mixed again. The synthesis proceeded with His coupling followed by N-terminal acetylation. The peptide chain Ac-His (Trt) -Xaa-Cys (S^tBu) -Trp (Boc) -NH₂After completion of the assembly, the S'Bu group was removed by treatment with DMF / tributylphosphine and the rhenium-oxo metal ion was complexed, generally as described above. The fully protected metal peptide was deblocked and released from the solid support by treatment with a cleavage cocktail (95: 5 mixture of trifluoroacetic acid-tripropylsilane) for 3 hours. The metallopeptide library was recovered by precipitation with cold ether. The resulting pellet was washed twice and 0.5 ml of 95% acetic acid was added. After 0.5 hour, 5 ml of water was added and the solution was lyophilized to obtain the desired library in solid state. Mass spectral analysis of the library pool confirmed the correct mass for all four members of the library.
[0192]
[Table 3]

[0193]
As described in Table 3, two molecular ion peaks differing by two mass units were calculated and observed for each structure; this difference was probably due to the two natural isotopes of rhenium, Re-185 and Re, in the complexation step. This is due to the presence of Re-187. In addition, the area under the observed peak in the spectral analysis was for each structure the area in a ratio of 1: 2, which was identical to the relative abundance of the Re-185 and Re-187 isotopes, possibly It showed that it was relevant. These results confirmed the complexation of rhenium with the peptide. The spectral analysis is shown in FIG.
[0194]
These results were also confirmed by HPLC analysis of this library of four components, which were compared to HPLC analysis of each of the four individual members performed under identical HPLC conditions. As is evident from FIG. 11, each of the four member components is present in the library mixture. In the HPLC profile, each of the metallopeptides was split into two isomers with alternating coordination (syn and anti) of the rhenium oxocore. Also, HPLC analysis revealed the absence of uncomplexed linear peptide in the preparation. All four compounds used in this comparison were individually prepared using the same method as described above for the synthesis of the library. The HPLC profiles are shown in FIGS. 11A to 11E.
[0195]
Example 7 Synthesis of MC1-R specific metallopeptide used as chemical inhibitor
N-terminal modifications are also made to the high capacity metallopeptide. Systematic N-terminal modifications are made based on limited data available in the literature relating to the receptor-binding affinity of peptide analogs for various MC receptor types. In general, these studies indicate that His6 residues may be a critical factor in selecting receptors for MC1-R (peripheral) vs. MC4-R (brain). A three-dimensional molecular model of the human melanocortin receptor has been developed based on the electron cryomicroscopy structure of bacteriorhodopsin and the electron density footprint of bovine rhodopsin. Specific ligand-receptor interactions have been identified by modeling known known agonists into proposed binding sites. By this means, researchers have temporarily obtained the melanotropin side chain pharmacophore D-Phe.⁷And Trp⁹And suggested that they interact with a hydrophobic network of receptor aromatic residues in transmembrane regions 4, 5, 6, and 7. The findings of these results are used in selecting N-terminal modifications for the metallopeptide core. The groups with hydrophobicity and / or hydrogen bonding potential are systematically and stereospecifically investigated by simultaneous assaying of the resulting metallopeptides for capacity and MC1-R specificity. The effect of His residues on biological activity is also investigated. Two series of metallopeptides are synthesized.
[0196]
Rhenium oxo- [R-His-D-Phe-Arg-Cys-Trp-NH₂]and
Rhenium oxo- [RD-Phe-Arg-Cys-Trp-NH₂]
Here, R is a pair selected from the following groups consisting of a hydrophobic side chain and a hydrophilic side chain having a hydrogen bonding potential.

[0197]
Wherein n is 2 to 9 and X and / or Y are A, OH, Cl, Br, I, NH₂, OCH₃, LO₂And similar groups.
[0198]
Example 8 Skin Blackening in Anolis carolinensis
Lizard (Anolis carolinensis) previously conditioned for skin blackening experiments was injected intraperitoneally with PT-1145 complexed with rhenium (0.65 mg in a 50 mL vehicle). Pre-conditioning involved placing the lizard on a well-lit white background. Within 10-15 minutes after injection, the skin coat color changed from light green to black brown to black. The skin coat color remained dark during the 5 hour observation period. Lizard injected with vehicle alone (PDS buffer each containing 1% DMF and beta-cyclodextran) did not show any change in its skin color during the 5 hour observation period.
[0199]
Each of the above is merely illustrative, and other equivalent embodiments are contemplated and possible.
[0200]
Although the invention has been described with reference to preferred embodiments thereof, other embodiments can achieve the same results. Variations and modifications of the present invention will be apparent to those skilled in the art and are intended to cover all such modifications and equivalents in the appended claims. The entire disclosures of all applications, patents and publications cited above are hereby incorporated by reference.
[0201]
The previous examples were similarly successfully repeated by replacing the reactants described in general or specifically and / or by manipulating the conditions of the invention for those used in the previous examples. Can be.
[Brief description of the drawings]
The accompanying drawings are used to explain the present invention and do not limit the present invention.
FIG. 1 shows the molecular structure of template 1.
FIG. 2 shows the molecular structure of template 2.
FIG. 3 shows the molecular structure of template 3.
FIG. 4 shows the molecular structure of template 4.
FIG. 5 shows the molecular structure of template 5.
FIG. 6 shows the molecular structure of template 6.
FIG. 7 shows the molecular structure of template 7.
FIG. 8 is a flow chart of a split pool and combination synthesis method of Example 2.
FIG. 9 is a mass spectrum of a library pool of 25 metallomeptides synthesized according to Example 2.
FIG. 10 is a mass spectrum of a library pool of four metallopeptides synthesized according to Example 6.
FIGS. 11A-11E are reversed phased HPLC profiles of a library pool of four metallopeptides synthesized according to Example 6. FIG.

Claims (17)

金属イオンとの複合体化で利用できるＮ_３Ｓ_１リガンドを形成する２以上の連結した残基を含む金属イオン−結合ドメインを含む構築体であって、該構築体は、金属イオン−結合ドメインと金属イオンとの複合体化に際して１以上のメラノコルチンに対して特異的な構造に立体配座的に拘束されていることを特徴とする該構築体。Metal comprises two or more linked residues of forming the N ₃ S ₁ ligand available for complexation with metal ions ions - a construct comprising a binding domain, the construct is a metal ion - binding domain Said construct is conformationally constrained to a structure specific to one or more melanocortins when complexed with a metal ion. ２以上の連続アミノ酸を含む金属イオン−結合ドメインおよび１以上のメラノコルチン受容体に対して特異的な決定された生物学的−機能ドメインを含み、ここに、該生物学的−機能ドメインの少なくとも一部は金属イオン−結合ドメインの少なくとも一部と同一の広がりを有し、ここに、該生物学的−機能ドメインは、金属イオン−結合ドメインと金属イオンとの複合体化に際して立体配座的に拘束されていることを特徴とする製造されたペプチドおよびその医薬上許容される塩。A metal ion-binding domain comprising two or more contiguous amino acids and a determined biological-functional domain specific for one or more melanocortin receptors, wherein at least one of said biological-functional domains The moiety is coextensive with at least a portion of the metal ion-binding domain, wherein the biological-functional domain conformationally becomes complex upon complexation of the metal ion-binding domain with the metal ion. A manufactured peptide characterized by being restricted, and a pharmaceutically acceptable salt thereof. 固相で合成された異なる配列のペプチドメンバーのメラノコルチン受容体に標的化された無作為配列ライブラリーであって、各構成要素ライブラリーメンバーは、
（ａ） （ｉ）金属イオン−結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳを含有する少なくとも１つのアミノ酸残基を含む２以上のアミノ酸残基の配列、ここに、該Ｓは直交Ｓ−保護基によって保護され、（ｉｉ）金属−結合ドメインのＮ−またはＣ−末端における、または金属イオン−結合ドメインのＮ−およびＣ−双方の末端における１以上のアミノ酸残基の配列、および（ｉｉｉ）固相にペプチド配列を付着させる切断可能な結合によって特徴づけられる固相に結合した３以上のアミノ酸残基のペプチド配列；および
（ｂ） ライブラリーの少なくとも１つの構成要素メンバーのペプチド配列におけるアミノ酸残基のユニークな選択または配列を含み、
ここに、該直交Ｓ−保護基は、固相からのペプチド配列を切断することなく除去できることを特徴とする該ライブラリー。A random sequence library targeted to melanocortin receptors of different sequence peptide members synthesized on a solid phase, wherein each component library member comprises:
(A) (i) a sequence of two or more amino acid residues comprising a metal ion-binding domain and comprising at least one amino acid residue containing at least one S, wherein the S is an orthogonal S-protecting group Protected by (ii) the sequence of one or more amino acid residues at the N- or C-terminus of the metal-binding domain, or at both the N- and C-terminus of the metal ion-binding domain; and (iii) A peptide sequence of three or more amino acid residues bound to a solid phase characterized by cleavable bonds attaching the peptide sequence to the phase; and (b) amino acid residues in the peptide sequence of at least one member member of the library Including a unique selection or sequence of
Wherein the orthogonal S-protecting group can be removed without cleaving the peptide sequence from the solid phase. 固相で合成された異なる配列ペプチドミメティックメンバーのメラノコルチン受容体に標的化された無作為配列ライブラリーであって、各構成要素ライブラリーメンバーは、
（ａ）（ｉ）金属イオン−結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳを含有する少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基のミミックを含む２以上のアミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せの配列、ここに、該Ｓは直交Ｓ−保護基によって保護され、（ｉｉ）金属イオン−結合ドメインのＮ−またはＣ−末端における、または金属イオン−結合ドメインのＮ−およびＣ−両末端における１以上のアミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せの配列、および （ｉｉｉ）固相にペプチドミメティック配列を付着させる切断可能な結合によって特徴づけられる固相に結合した３以上のアミノ酸残基およびアミノ酸残基のミミックの組合せのペプチドミメティック配列；
（ｂ）ライブラリーの少なくとも１つの構成要素メンバーのペプチドミメティック配列におけるアミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せのユニークな選択または配列を含み、
該直交Ｓ−保護基は、固相からのペプチドミメティック配列を切断することなく除去できることを特徴とする該ライブラリー。A random sequence library targeted to the melanocortin receptor, a different sequence peptidomimetic member synthesized on a solid phase, wherein each component library member comprises:
(A) (i) two or more amino acid residues comprising a metal ion-binding domain and comprising at least one S-containing amino acid residue or amino acid residue mimic, or an amino acid residue mimic or mimic thereof Combination sequences, wherein the S is protected by an orthogonal S-protecting group and (ii) at the N- or C-terminus of the metal ion-binding domain or at both the N- and C-termini of the metal ion-binding domain And (iii) three or more amino acids attached to a solid phase characterized by a cleavable bond that attaches the peptide mimetic sequence to the solid phase. Peptidomimetic sequences of mimic combinations of residues and amino acid residues;
(B) a unique selection or sequence of amino acid residues, amino acid residue mimics or a combination thereof in the peptidomimetic sequence of at least one member member of the library;
The library wherein the orthogonal S-protecting groups can be removed without cleaving the peptidomimetic sequence from the solid phase. 溶液中で合成された異なる配列のペプチドまたはペプチドミメティックメンバーのメラノコルチン受容体に標的化された無作為配列（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｋ）ライブラリーであって、各構成要素ライブラリーメンバーは、
（ａ）（ｉ）金属イオン−結合ドメインを形成し、少なくとも１つのＳを含有する少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基のミミックを含む２以上のアミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せの配列、ここに、該Ｓは直交Ｓ−保護基によって保護され、（ｉｉ）金属イオン−結合ドメインのＮ−またはＣ−末端における、または金属イオン−結合ドメインのＮ−およびＣ−両末端における１以上のアミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せの配列によって特徴づけられる固相に結合した３以上のアミノ酸残基およびアミノ酸残基のミミックの組合せのペプチドミメティック配列；および
（ｂ）ライブラリーの構成要素メンバーの少なくとも１つのペプチドミメティック配列における、アミノ酸残基、アミノ酸残基のミミックまたはその組合せのユニークな選択または配列を含む；
ことを特徴とする該ライブラリー。A random sequence (combinatoriak) library targeted to the melanocortin receptor of different sequence peptides or peptidomimetic members synthesized in solution, wherein each component library member comprises:
(A) (i) two or more amino acid residues comprising a metal ion-binding domain and comprising at least one S-containing amino acid residue or amino acid residue mimic, or an amino acid residue mimic or mimic thereof Combination sequences, wherein the S is protected by an orthogonal S-protecting group and (ii) at the N- or C-terminus of the metal ion-binding domain or at both the N- and C-termini of the metal ion-binding domain A peptide mimetic sequence of a combination of three or more amino acid residues and a mimic of amino acid residues bound to a solid phase, characterized by the sequence of one or more amino acid residues, a mimic of amino acid residues or a combination thereof; A) amino acid residues in at least one peptidomimetic sequence of a member member of the library; Containing the unique selection or arrangement of mimic or combination of amino acid residues;
The library characterized by that: 式：
Ｒ_１−Ｌｌｌ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２，
Ｒ_１−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｃｃｃ−Ｒ_２，
Ｒ_１−Ｄｄｄ−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｒ_３，
Ｒ_４−Ｅｅｅ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_２，
Ｒ_１−Ｆｆｆ−Ａａａ−Ｇｇｇ−Ｃｃｃ−Ｒ_５，
Ｒ_１−Ｈｈｈ−Ａａａ−Ｂｂｂ−Ｃｃｃ−Ｒ_５，または
Ｒ_１−Ｉｉｉ−Ｉｉｉ−Ｃｃｃ−Ｊｊｊ−Ｋｋｋ−Ｒ_２，
（式中、
Ｒ_１は、限定されるものではないが、補助的または二次的受容体接触の影響を含めた、分子の残りの固有の活性を増強するいずれかの官能基であり、１ないし約４の天然または荷電Ｌ−またはＤ−立体配置アミノ酸残基のアミノ酸鎖を含めた、種々のアミノ酸および非−ペプチド基を使用することができ、もしＲ_１が非−ペプチド基であれば、それは直鎖または分岐状アルキル、アリール、アルケン、アルケニルまたはアルアルキル鎖であり得る；
Ａａａは、正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸であり、好ましいアミノ酸は天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ａａａは金属イオン複合体化のためのＮ（窒素原子）を供し；
Ｂｂｂは芳香族側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸であり、好ましいアミノ酸はＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ，２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｂｂｂ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で官能性化することができ、Ｂｂｂは金属イオン複合体化のためのＮを供し；
Ｃｃｃは、金属イオン複合体化のためのアルファアミノ基からのＮ、および側鎖基からのＳ（硫黄原子）双方を供するアミノ酸であり、好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＣｙｓ、ＰｅｎおよびＨｃｙｓを含み；
Ｌｌｌは芳香族側鎖を持つＤ−立体配置のアミノ酸であり、好ましいアミノ酸はＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｌｌｌ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で官能性化することができ、Ｌｌｌは金属イオン複合体化のためのＮを供せず；
Ｒ_２は芳香族側鎖を持つアミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−またはＢ−立体配置のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｃ−末端は遊離されているかまたはアミド化することができ、Ｒ_２は前記したもののいずれかの対応するデス−カルボキシルアミノ酸であってもよく、あるいは、Ｒ_２は排除することもでき；
Ｄｄｄは、金属イオン複合体化のための側鎖基からのＳを供するアミノ酸であり、好ましいアミノ酸はＬ−またはＤ−立体配置のＣｙｓ、ＰｅｎおよびＨｃｙｓを含み；
Ｒ_３は、金属イオン複合体化のためのＮを供する芳香族側鎖を持つアミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−またはＤ−立体配置のＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｃ−末端は遊離されているかまたはアミド化することができ、Ｒ_３は前記したもののいずれかの対応するデス−カルボキシルアミノ酸であってもよく；
Ｒ_４はカチオン性中心を供する官能基であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−またはＤ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｍ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、アミノ酸のＮ−末端は、直鎖または分岐鎖のアルキル、アリール、アルケン、アルケニルまたはアルアルキル鎖を含めた、種々の中性アミノ酸および非−ペプチド基のいずれかで官能性化することができ；
Ｅｅｅは、金属イオン複合体化のためのＮを供する非荷電Ｌ−またはＤ−立体配置のアミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸双方を含めた、ＧｌｙおよびＬ−立体配置のＡｌａ、Ｎｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＰｈｅまたはＴｒｐ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、好ましい具体例においては、Ｅｅｅは脂肪族側鎖を持つアミノ酸であり；
ＦｆｆはＬ−またはＤ−立体配置の芳香族アミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸双方を含めた、Ｄ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、Ｔｉｃ、ＴｉｑまたはＴｃａ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｆｆｆ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基で置換することができ、Ｆｆｆは、金属イオン複合体化のためのＮを供さず；
Ｇｇｇは、Ｌ−またはＤ−立体配置の芳香族アミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸双方を含めた、Ｌ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｇｇｇ中の芳香族環は、ハロゲン、アルキルまたはアリール基で置換することができ、Ｇｇｇは金属イオン複合体化のためのＮを供し；
Ｒ_５は、好ましくは、アミド、置換されたアミド、エステルまたはカルボキシレート基であり、Ｒ５は、芳香族、脂肪族、中性または荷電アミノ酸を含めた、Ｌ−またはＤ−立体配置のアミノ酸またはアミノ酸アミドであってもよく；
Ｈｈｈは、正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸であり、好ましいアミノ酸は天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｈｈｈは、金属イオン複合体化のためのＮを供さず；
Ｉｉｉは、金属イオン複合体化のためのＮを供するＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、ＬｙｓまたはＡｒｇ、およびその誘導体、アナログまたはホモログであり；
Ｊｊｊは芳香族側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のアミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、Ｄ−立体配置のＰｈｅ、Ｐｈｅ（４’Ｃｌ）、Ｐｈｅ（３’，４’Ｄｉ−Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４’−ニトロ）、Ｐｈｅ（４’−メチル）、Ｐｈｅ（４’−フェニル）、Ｈｐｈｅ、Ｐｇｌ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｚ−２’Ｂｒ）、Ｌｙｓ（Ｂｚ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）、またはＴｙｒ（ＢｚｌＣｌ_２）、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ｊｊｊ中の芳香族環はハロゲン、アルキルまたはアリール基に官能性化することができ、Ｊｊｊは金属イオン複合体化のためのＮを供さず；および
Ｋｋｋは正に荷電した側鎖を持つＬ−またはＤ−立体配置のカチオン性アミノ酸であり、好ましいアミノ酸は、天然および合成アミノ酸の双方を含めた、Ｌ−立体配置のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＤｐｒまたはＤｂｕ、およびその誘導体、アナログまたはホモログを含み、Ａａａは金属イオン複合体化のためのＮを供しない）
の請求項１または２記載の組成物。formula:
R ₁ -Lll-Aaaa-Bbb-Ccc-R ₂ ,
R ₁ -Bbb-Aaaa-Ccc-R ₂ ,
R ₁ -Ddd-Bbb-Aaaa-R ₃ ,
R ₄ -Eee-Bbb-Ccc-R ₂ ,
R ₁ -Fff-Aaaa-Ggg-Ccc-R ₅ ,
R ₁ -Hhh-Aaaa-Bbb-Ccc-R ₅ , or R ₁ -Iii-Iii-Ccc-Jjj-Kkk-R ₂ ,
(Where
R ₁ is any functional group that enhances the remaining intrinsic activity of the molecule, including but not limited to the effects of auxiliary or secondary receptor contact, A variety of amino acids and non-peptide groups can be used, including amino acid chains of naturally-occurring or charged L- or D-configuration amino acid residues, and if R ₁ is a non-peptide group, it is a straight-chain. Or a branched alkyl, aryl, alkene, alkenyl or aralkyl chain;
Aaa is a cationic amino acid in the L- or D-configuration with a positively charged side chain; preferred amino acids are Lys, Arg, Orn, Dpr in the L-configuration, including both natural and synthetic amino acids. Or Dbu, and derivatives, analogs or homologs thereof, wherein Aaaa provides N (nitrogen atom) for metal ion complexation;
Bbb is an L- or D-configuration amino acid having an aromatic side chain, and preferred amino acids are D-configuration Phe, Phe (4′Cl), Phe (3 ′, 4′Di-Cl), and Phe. (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z -2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl), or Tyr (BzlCl _2), and includes derivatives, analogs or homologs, aromatic ring in Bbb is halogen, alkyl or aryl Bbb can provide N for metal ion complexation;
Ccc is an amino acid that provides both N from the alpha amino group and S (sulfur atom) from the side chain group for metal ion complexation, with the preferred amino acids being Cys, Pen in the L- or D-configuration. And Hcys;
L11 is an amino acid having a D-configuration having an aromatic side chain, and preferred amino acids are Phe, Phe (4′Cl), Phe (3 ′, 4′Di-Cl) and Phe (4 ′) having a D-configuration. -Nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2 ') br), Lys (Bzl), Thr (Bzl), Cys (Bzl), or Tyr (BzlCl _2), and includes derivatives, analogs or homologs, functional aromatic ring in Lll is halogen, alkyl or aryl group Lll does not provide N for metal ion complexation;
R ₂ is an amino acid having an aromatic side chain, preferably amino acids including both natural and synthetic amino acids, L- or B- configurations Phe, Trp, Phe (4'Cl) , Phe (3 ' , 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl) , Lys (Z), Lys include (Z-2'Br), Lys ( Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl _2),, and derivatives, analogs or homologs, C-terminus Can be free or amidated, and R ₂ can be the corresponding des-carboxyl amino acid of any of the foregoing, or R ₂ can be eliminated;
Ddd is an amino acid that provides S from the side group for metal ion complexation, preferred amino acids include Cys, Pen and Hcys in the L- or D-configuration;
R ₃ is an amino acid with an aromatic side chain that provides N for metal ion complexation; preferred amino acids are Phe, Trp in L- or D-configuration, including both natural and synthetic amino acids. , Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl), or Tyr (BzlCl _2), and may be a carboxyl amino acids - including its derivatives, analogs or homologs, C-terminus can be or amidated is free, R ₃ is the corresponding des that of any of those mentioned above;
R ₄ is a functional group that provides a cationic center; preferred amino acids are Lys, Arg, Orm, Dpr or Dbu in L- or D-configuration, including both natural and synthetic amino acids, and derivatives, analogs thereof. Or the homolog, wherein the N-terminus of the amino acid is functionalized with any of a variety of neutral amino acid and non-peptide groups, including straight or branched chain alkyl, aryl, alkene, alkenyl or aralkyl chains. Can do;
Eee is an uncharged L- or D-configuration amino acid that provides N for metal ion complexation, with preferred amino acids being Gly and L-configuration Ala, including both natural and synthetic amino acids. Including Nle, Leu, Val, Phe or Trp, and derivatives, analogs or homologs thereof, in a preferred embodiment, Eee is an amino acid having an aliphatic side chain;
Fff is an aromatic amino acid in the L- or D-configuration; preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4') in the D-configuration, including both natural and synthetic amino acids. Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys ( Z), wherein Lys (Z-2'Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl), Tyr (BzlCl 2), Tic, Tiq or Tca, and its derivatives, analogs or homologs, Fff The aromatic ring therein can be substituted with a halogen, alkyl or aryl group, and Fff does not provide N for metal ion complexation;
Ggg is an aromatic amino acid in the L- or D-configuration; preferred amino acids are Phe, Phe (4'Cl), Phe (3 ', 4) in the L-configuration, including both natural and synthetic amino acids. 'Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys (Z-2′Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl), or Tyr (BzlCl ₂ ), and derivatives, analogs or homologs thereof, including aromatics in Ggg The ring can be substituted with a halogen, alkyl or aryl group and Ggg provides N for metal ion complexation;
R ₅ is preferably an amide, a substituted amide, ester or carboxylate group, R5 is an aromatic, aliphatic, including neutral or charged amino acids, L- or D- configuration amino acids or May be an amino acid amide;
Hhh is a cationic amino acid in the L- or D-configuration with a positively charged side chain; preferred amino acids are Lys, Arg, Orn, Dpr in the L-configuration, including both natural and synthetic amino acids. Or Dbu, and derivatives, analogs or homologs thereof, wherein Hhh does not provide N for metal ion complexation;
Iiii is an amino acid in the L- or D-configuration that provides N for metal ion complexation, with preferred amino acids including Ala, Gly, Nle, Val, Leu, including both natural and synthetic amino acids. Ile, His, Lys or Arg, and derivatives, analogs or homologs thereof;
Jjj is an L- or D-configuration amino acid having an aromatic side chain, and preferred amino acids are Dhe-configuration Phe, Phe (4′Cl), Phe (3 ′, 4′Di-Cl), Phe (4'-nitro), Phe (4'-methyl), Phe (4'-phenyl), Hphe, Pgl, Trp, 1-Nal, 2-Nal, Ser (Bzl), Lys (Z), Lys ( Z-2′Br), Lys (Bz), Thr (Bzl), Cys (Bzl) or Tyr (BzlCl ₂ ), and derivatives, analogs or homologs thereof, and the aromatic ring in Jjj is halogen, alkyl or Aryl groups can be functionalized, Jjj does not provide N for metal ion complexation; and Kkk is a cationic amino acid in the L- or D-configuration with positively charged side chains. Preferred amino acids include Lys, Arg, Orn, Dpr or Dbu in the L-configuration, and derivatives, analogs or homologs thereof, including both natural and synthetic amino acids, wherein Aaaa is a metal ion complex. Not provide N)
The composition according to claim 1 or 2. 金属イオン−結合ドメインが金属イオンと複合体化している請求項１または２記載の組成物。3. The composition of claim 1 or 2, wherein the metal ion-binding domain is complexed with the metal ion. 金属イオン−結合アミノ酸配列が金属イオンと複合体化していない場合の組成物よりも、組成物が、金属イオン−結合ドメインが金属イオン−と複合体化している場合に１以上のメラノコルチン受容体に対して実質的により特異的である請求項１または２記載の組成物。Compared to compositions where the metal ion-binding amino acid sequence is not complexed with the metal ion, the composition is more able to bind to one or more melanocortin receptors when the metal ion-binding domain is complexed with the metal ion. 3. The composition according to claim 1 or 2, which is substantially more specific to said composition. 金属イオン−結合ドメインが、さらに、直交Ｓ−保護基の除去に際して、金属イオンに結合するために利用可能な少なくとも１つのＮを含む請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。6. The random sequence library of claim 3, 4 or 5, wherein the metal ion-binding domain further comprises at least one N available for binding to the metal ion upon removal of the orthogonal S-protecting group. 金属イオン−結合ドメインがＮ_３Ｓ_１リガンドを形成する３つの残基を含む請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。Metal ion - claim 3, 4 or 5 random sequence library of including three residues binding domain to form a N ₃ S ₁ ligand. 直交Ｓ−保護基がＳ−チオ−ブチル、アセトアミドメチル、４−メトキシトリチル、Ｓ−スルホネートまたは３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニルである請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。The random sequence library according to claim 3, 4 or 5, wherein the orthogonal S-protecting group is S-thio-butyl, acetamidomethyl, 4-methoxytrityl, S-sulfonate or 3-nitro-2-pyridinesulfenyl. 直交Ｓ−保護基が、構成要素ライブラリーメンバーまたはその中のいずれのアミノ酸側鎖保護基も変化させることなく、構成要素ライブラリーメンバーから除去することができる請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。6. The method of claim 3, 4 or 5, wherein the orthogonal S-protecting group can be removed from the component library member without altering the component library member or any amino acid side chain protecting groups therein. A random sequence library. 構造の多様性が金属イオン−結合ドメインで起こる請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。6. The random sequence library according to claim 3, 4 or 5, wherein the structural diversity occurs in the metal ion-binding domain. 構造の多様性が金属イオン−結合ドメインの外部で起こる請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。A random sequence library according to claim 3, 4 or 5, wherein the structural diversity occurs outside the metal ion-binding domain. １以上の構成要素ライブラリーメンバーが、少なくとも１つのＳを含有する金属イオン−結合ドメインのＮ−またはＣ−末端において配列中に少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基のミミックを含み、ここに、該Ｓは非−直交Ｓ−保護基によって保護され、それにより、非−直交Ｓ−保護基を除去することなく直交Ｓ−保護基を除去することができる請求項３、４または５記載の無作為配列ライブラリー。The one or more component library members comprise at least one amino acid residue or a mimic of amino acid residues in the sequence at the N- or C-terminus of the at least one S-containing metal ion-binding domain. , S is protected by a non-orthogonal S-protecting group, whereby the orthogonal S-protecting group can be removed without removing the non-orthogonal S-protecting group. Random sequence library. 当該Ｓが直交Ｓ−保護基によって保護された少なくとも１つのＳを含有する少なくとも１つのアミノ酸残基が、限定されるものではないが、Ｌ−またはＤ−システインまたはＬ−またはＤ−ペニシラミンを含めたＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸である請求項３記載の固相無作為配列ライブラリー。At least one amino acid residue containing at least one S wherein the S is protected by an orthogonal S-protecting group includes, but is not limited to, L- or D-cysteine or L- or D-penicillamine. The solid phase random sequence library according to claim 3, which is an L- or D-3-mercapto amino acid. 当該Ｓが直交Ｓ−保護基によって保護される少なくとも１つのＳを含有する少なくとも１つのアミノ酸残基またはアミノ酸残基のミミックが、限定されるものではないが、Ｌ−またはＤ−システインまたはＬ−またはＤ−ペニシラミン；３−メルカプトフェニルアラニン；２−メルカプト酢酸；３−メルカプトプロピオン酸；２−メルカプトプロピオン酸；３−メルカプト−３，３−ジメチルプロピオン酸；３−メルカプト−３，３−ジエチルプロピオン酸；３−メルカプト，３−メチルプロピオン酸；２−メルカプト，２，メチル酢酸；３−シクロペンタメチレン，３−メルカプトプロピオン酸；または２−シクロペンタメチレン，２−メルカプト酢酸を含めたＬ−またはＤ−３−メルカプトアミノ酸である請求項４または５記載の無作為配列ライブラリー。The mimic of at least one amino acid residue or amino acid residue containing at least one S wherein the S is protected by an orthogonal S-protecting group is not limited to L- or D-cysteine or L- Or D-penicillamine; 3-mercaptophenylalanine; 2-mercaptoacetic acid; 3-mercaptopropionic acid; 2-mercaptopropionic acid; 3-mercapto-3,3-dimethylpropionic acid; 3-mercapto-3,3-diethylpropionic acid 3-mercapto, 3-methylpropionic acid; 2-mercapto, 2, methylacetic acid; 3-cyclopentamethylene, 3-mercaptopropionic acid; or L- or D-, including 2-cyclopentamethylene, 2-mercaptoacetic acid; The random according to claim 4 or 5, which is a -3-mercapto amino acid. Column library.

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