JP2004512275A - 膜透過性ペプチドおよびその使用 - Google Patents
膜透過性ペプチドおよびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004512275A JP2004512275A JP2002524075A JP2002524075A JP2004512275A JP 2004512275 A JP2004512275 A JP 2004512275A JP 2002524075 A JP2002524075 A JP 2002524075A JP 2002524075 A JP2002524075 A JP 2002524075A JP 2004512275 A JP2004512275 A JP 2004512275A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- peptide
- fusion protein
- sequence
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 153
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 82
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 126
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 114
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 55
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 154
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 45
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 45
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims description 35
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 22
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 18
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 17
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 17
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 17
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 14
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 14
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 12
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims 6
- 102000007001 Period Circadian Proteins Human genes 0.000 claims 4
- 108010047728 Period Circadian Proteins Proteins 0.000 claims 4
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 25
- 238000001167 microscope projection photolithography Methods 0.000 description 107
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 107
- 210000001357 hemopoietic progenitor cell Anatomy 0.000 description 53
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 33
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 33
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 29
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 23
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 23
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 22
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 19
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 19
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 19
- 230000012223 nuclear import Effects 0.000 description 18
- 101710085003 Alpha-tubulin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 16
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 16
- 101710175714 Tyrosine aminotransferase Proteins 0.000 description 16
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 15
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 14
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 230000008676 import Effects 0.000 description 13
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 12
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 12
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 12
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 11
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 10
- 210000003412 trans-golgi network Anatomy 0.000 description 10
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 10
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 7
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 7
- -1 electroporation Chemical class 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 7
- 108010072564 5-HT2A Serotonin Receptor Proteins 0.000 description 6
- 102000049773 5-HT2A Serotonin Receptor Human genes 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000579484 Homo sapiens Period circadian protein homolog 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000011781 Karyopherins Human genes 0.000 description 6
- 108010062228 Karyopherins Proteins 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 6
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 6
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000897691 Homo sapiens Helix-loop-helix protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 5
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000007374 Smad Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010007945 Smad Proteins Proteins 0.000 description 5
- 108010077099 alpha Karyopherins Proteins 0.000 description 5
- 102000009899 alpha Karyopherins Human genes 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000030147 nuclear export Effects 0.000 description 5
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 5
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 5
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 5
- 108010005597 ran GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 5
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 101000897700 Homo sapiens Helix-loop-helix protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101001126582 Homo sapiens Post-GPI attachment to proteins factor 3 Proteins 0.000 description 4
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 102100028293 Period circadian protein homolog 1 Human genes 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108010075890 beta Karyopherins Proteins 0.000 description 4
- 102000012012 beta Karyopherins Human genes 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 3
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100024977 Glutamine-tRNA ligase Human genes 0.000 description 3
- 101001001473 Homo sapiens Importin subunit alpha-4 Proteins 0.000 description 3
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 3
- 101000668416 Homo sapiens Regulator of chromosome condensation Proteins 0.000 description 3
- 102100035692 Importin subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 3
- 102100036187 Importin subunit alpha-4 Human genes 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 3
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 3
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 3
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 102100039977 Regulator of chromosome condensation Human genes 0.000 description 3
- 102000049939 Smad3 Human genes 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 3
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 3
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 108010051239 glutaminyl-tRNA synthetase Proteins 0.000 description 3
- 102000045697 human NHLH1 Human genes 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N pibenzimol Chemical compound C1CN(C)CCN1C1=CC=C(N=C(N2)C=3C=C4NC(=NC4=CC=3)C=3C=CC(O)=CC=3)C2=C1 INAAIJLSXJJHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 102100027833 14-3-3 protein sigma Human genes 0.000 description 2
- QRYXYRQPMWQIDM-UHFFFAOYSA-N 3-benzoyl-3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)-1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1(C(=O)C=1C=CC=CC=1)N1C(=O)C=CC1=O QRYXYRQPMWQIDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102100021888 Helix-loop-helix protein 1 Human genes 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001081126 Homo sapiens Homeobox protein engrailed-1 Proteins 0.000 description 2
- 101001073216 Homo sapiens Period circadian protein homolog 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001072338 Homo sapiens Proliferating cell nuclear antigen Proteins 0.000 description 2
- 101100107350 Homo sapiens SFN gene Proteins 0.000 description 2
- 101000837849 Homo sapiens Trans-Golgi network integral membrane protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100036188 Importin subunit alpha-3 Human genes 0.000 description 2
- 102100036186 Importin subunit alpha-5 Human genes 0.000 description 2
- 101710118220 Importin subunit alpha-5 Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical group CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 2
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 2
- 101710143111 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101150097297 Nedd4 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102100035787 Period circadian protein homolog 2 Human genes 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 2
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 2
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical class IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 102100028621 Trans-Golgi network integral membrane protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 102100022596 Tyrosine-protein kinase ABL1 Human genes 0.000 description 2
- 101710098624 Tyrosine-protein kinase ABL1 Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001294 alanine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002060 circadian Effects 0.000 description 2
- 230000008632 circadian clock Effects 0.000 description 2
- 238000010226 confocal imaging Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical group O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 102000056963 human EN1 Human genes 0.000 description 2
- 102000045698 human NHLH2 Human genes 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 108010011989 karyopherin alpha 2 Proteins 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- BMGWZHWESYHXHC-TYHJCQIPSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O BMGWZHWESYHXHC-TYHJCQIPSA-N 0.000 description 1
- IRFSXVIRXMYULF-UHFFFAOYSA-N 1,2-dihydroquinoline Chemical compound C1=CC=C2C=CCNC2=C1 IRFSXVIRXMYULF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 1
- LPBHYOYZZIFCQT-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl 2-(2-methylpropoxy)-2h-quinoline-1-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OCC(C)C)C(OCC(C)C)C=CC2=C1 LPBHYOYZZIFCQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036321 5-hydroxytryptamine receptor 2A Human genes 0.000 description 1
- 101710138091 5-hydroxytryptamine receptor 2A Proteins 0.000 description 1
- 102000040125 5-hydroxytryptamine receptor family Human genes 0.000 description 1
- 108091032151 5-hydroxytryptamine receptor family Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 101100004408 Arabidopsis thaliana BIG gene Proteins 0.000 description 1
- 101100009027 Arabidopsis thaliana HEME1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000384062 Armadillo Species 0.000 description 1
- 102000016904 Armadillo Domain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010014223 Armadillo Domain Proteins Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- DFOCUWZXJBAUSQ-UHFFFAOYSA-N Berbamine Natural products O1C(C(=CC=2)O)=CC=2CC(C=23)N(C)CCC3=CC(OC)=C(OC)C=2OC(=CC=23)C(OC)=CC=2CCN(C)C3CC2=CC=C1C=C2 DFOCUWZXJBAUSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 108700013908 Drosophila PER Proteins 0.000 description 1
- 101100322030 Drosophila melanogaster Abl gene Proteins 0.000 description 1
- 101100485279 Drosophila melanogaster emb gene Proteins 0.000 description 1
- 101100378121 Drosophila melanogaster nAChRalpha1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102100029095 Exportin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100023374 Forkhead box protein M1 Human genes 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 description 1
- 102100035716 Glycophorin-A Human genes 0.000 description 1
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 1
- 102100021889 Helix-loop-helix protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000907578 Homo sapiens Forkhead box protein M1 Proteins 0.000 description 1
- 101001001478 Homo sapiens Importin subunit alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001001462 Homo sapiens Importin subunit alpha-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001054807 Homo sapiens Importin subunit alpha-6 Proteins 0.000 description 1
- 101001124017 Homo sapiens Nuclear transport factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000601274 Homo sapiens Period circadian protein homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001069810 Homo sapiens Psoriasis susceptibility 1 candidate gene 2 protein Proteins 0.000 description 1
- 101000897669 Homo sapiens Small RNA 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 108700003968 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (49-57) Proteins 0.000 description 1
- 101710118252 Importin subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710118224 Importin subunit alpha-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100027007 Importin subunit alpha-6 Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 230000004163 JAK-STAT signaling pathway Effects 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 125000000998 L-alanino group Chemical group [H]N([*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(=O)O[H] 0.000 description 1
- 229930195714 L-glutamate Natural products 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical group C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 125000000205 L-threonino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])O[H] 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000219745 Lupinus Species 0.000 description 1
- 244000045959 Lupinus luteus Species 0.000 description 1
- 235000010648 Lupinus luteus Nutrition 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 101100082892 Mus musculus Per1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000002041 N(2)-L-arginino group Chemical group [H]OC(=O)[C@@]([H])(N([H])[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010018525 NFATC Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000002673 NFATC Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 102100028418 Nuclear transport factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100037630 Period circadian protein homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100034249 Psoriasis susceptibility 1 candidate gene 2 protein Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100485284 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CRM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700031297 Smad3 Proteins 0.000 description 1
- 102000005610 Thyroid Hormone Receptors alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010045070 Thyroid Hormone Receptors alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000014172 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010011702 Transforming Growth Factor-beta Type I Receptor Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASCBRLGHWVZBMG-UHFFFAOYSA-N UNPD71813 Natural products COC=1C(=O)C=2C(O)=C(OC)C(OC)=CC=2OC=1C(C=C1)=CC=C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O ASCBRLGHWVZBMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102100020696 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 K Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 101150094313 XPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001800 adrenalinergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000008549 beta adrenergic activation Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000000782 cerebellar granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000027288 circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000001614 effect on membrane Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003754 ethoxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC)* 0.000 description 1
- 108700002148 exportin 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 1
- 102000044565 human PER1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 108010066743 interferon-gamma (95-133) Proteins 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004942 nuclear accumulation Effects 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108010034040 pendulin Proteins 0.000 description 1
- XDKNUCQYHGFFFE-UHFFFAOYSA-N pendulin Natural products COc1cc2ccc3c(OC)c(OC)c(OC)cc3c2c(OC)c1O XDKNUCQYHGFFFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007903 penetration ability Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000034158 regulation of cellular localization Effects 0.000 description 1
- 230000021907 regulation of circadian rhythm Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000004314 regulation of intracellular transport Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
- C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【関連出願】
本出願は2000年8月25日の出願に係る米国特許仮出願60/227,647号および2001年2月7日の出願に係る英国特許出願0103110.3号の利益を享受する。
【0002】
【技術分野】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するためのインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチド、それらからなる組成物およびそれらを使用する方法に関する。本発明はまたさらに、所定の化合物をインビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて細胞に細胞内送達するための送達デバイスとして有用な膜透過性ペプチドの同定に関する。
【0003】
【背景技術】
生物学的な膜を通過しての小分子、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質の送達は、治療および確認規範のチャレンジが直面する大きな課題である。最近ではアンテナペディア、TAT−HIVおよびVP22に由来する形質導入ペプチドが生物学的膜を透過し、カーゴビークルとして働いて、特異的な細胞下コンパートメント(subcellular compartment)に標的化されることが確立されている。本発明者らは形質導入ペプチドとして機能するヒトPeriod 1(hPER1)概日周期タンパク質の核局在配列(NLS)の同定をここに示す。さらに重要な点は、データベースの探索を用いて、本発明者らは他のタンパク質のNLS内に包埋されている知られていない付加的な形質導入ペプチドを明らかにし、遺伝子によりコードされた形質導入ペプチドの数を3から14に拡大したことである。本発明者らのデータによれば、形質導入ペプチドはNLS内に見出され、普遍的かつ多様性であり、ゲノムを通じて広く分布することが示唆されている。ある種の細胞外および細胞内タンパク質は細胞内の特異的なオルガネラに標的化され、膜を内外に横切り、または細胞から分泌されることは十分に確立されている。細胞内タンパク質の標的化を生じる生物学的機構はその特徴を持続し続けるが、局在の一つの機構は所定のタンパク質内に含まれる特異的リーダー配列またはタンパク質内配列によって生じることが十分認識される。細胞内の選ばれたオルガネラ内におけるタンパク質の局在は特異的な標的化配列によって補助される。多数の核局在配列(NLS)が、タンパク質の輸送、または他の場合には、細胞質から核膜内部への通過を可能にするものとしてタンパク質内に同定されている。
【0004】
標的化配列、およびさもなければ他の場合には非標的化配列を含む融合タンパク質は、選択された標的化配列に依存して選択される細胞オルガネラ中に局在する。たとえば、Ferullo JM & Paget E:フランス特許279695には、酵素をサイトゾル以外の細胞内コンパートメントたとえば小胞対向性のシグナル配列に融合したヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ(HPPD)の選択的コンパートメンタリゼーションが開示されている。同様に、WO 0147950(Wehrle−Haller, Bernhard M: Imhof, Beat A)には基底外側に対する標的化および細胞表面に繋留された成長因子の細胞表面に対する長期間暴露に関与する新しい決定基が同定されている。シグナルは、アミノ酸配列X1h2X3h4Lp5p6(式中、X1は極性アミノ酸残基またはアラニンを表し、h2は任意の疎水性アミノ酸残基を表し、X3は任意のアミノ酸残基を表し、h4はロイシンおよびイソロイシンを除く任意の疎水性アミノ酸残基を表し、Lはロイシン残基を表し、p5は任意の極性アミノ酸残基を表し、p6は任意の極性アミノ酸残基を表す)から構成されるモノロイシン依存性基底外側ソーティングシグナルである。Richardson, A.E.ら, Plant J. (2001), 25 (6), 641−649にはキャロット伸長遺伝子からのシグナルペプチドを含む酵素アスペルギルスフィターゼの操作が記載されている。得られた融合タンパク質は、隣接する土壌に細胞外酵素として分泌された場合にのみ有効であって、トランスジェニック系列における根の総フィターゼ活性は20倍に上昇し、以後のリン栄養は、植物の成長およびリン含量が無機リンを供給された対照植物と同等に改善された。WO 0132894(Lok, S.)には、組換えタンパク質をトランスフェクト細胞の表面に繋留させる目的でのII型細胞表面タンパク質シグナル繋留ドメイン配列の使用が開示されている。II型細胞表面タンパク質の特徴的性質は、それらが単一の疎水性膜貫通ドメインによって細胞膜内に保持され、それらのC−末端は細胞の外側に向けられていることである。
【0005】
さらに最近になって、能動的な輸送機構もしくは「ポア」を必要とせずに細胞膜を通過できる数種のタンパク質が同定された。アンテナペディア、TATおよびVP22に由来する膜透過性ペプチド(MPP, タンパク質形質導入ドメイン、「PTD」としても知られる)が生物学的膜を貫通し、特異的な細胞下コンパートメントを標的化できることが最近分かった。以前に開示されたこれらのタンパク質には哺乳動物タンパク質に由来するものはない。本発明の目的は哺乳動物または酵母タンパク質の核局在化配列(NLS)に由来するポリペプチドまたはNLSと重複するポリペプチドがMPPとして作用可能であることの発見、および大きなタンパク質たとえば生物学的に活性なタンパク質または他の有機化合物と結合していても、細胞膜を透過することができる特異的ポリペプチド配列の同定に向けられている。
【0006】
核輸送は、遺伝子の発現および細胞***、ならびにウイルスの複製、腫瘍形成および腫瘍細胞の増殖を含む多くの生物学的過程に必須である。核輸送の機構は最近その特徴の詳細が明らかにされたばかりで、多数の別個の工程を含むことが示されている。核内への輸送が予定されるタンパク質は、それらのアミノ酸配列内に核局在化配列(「NLS」)と呼ばれる短いアミノ酸のストレッチを含有する。これらの配列はそのアミノ酸配列内の任意場所に存在して、通常4〜約8個のアミノ酸からなる。これらの配列は、一般に本質は塩基性(すなわち、陽性に荷電している)が、コンセンサス配列は同定されていない。すなわち、これらの広範囲の配列が特定のタンパク質に特異的であるように思われる。
【0007】
細胞内においては、これらのNLSは補助的タンパク質によって、またはNLS含有タンパク質内のコンフォーメーション変化によってマスクされていても、マスクされていなくてもよい。NLSはタンパク質のコア中に埋没しており、タンパク質の表面に露出されないのでマスクされているであろう。NLSのマスクをはずすことおよび細胞質タンパク質の核トランスロケーションは、リン酸化、脱リン酸化、蛋白分解消化、阻害サブユニットのサブユニット会合もしくは解離等により誘発される。したがって、NLSのマスキングおよびアンマスキングは、これらの細胞質タンパク質の核への輸送を調節する機構を提供する。たとえば、転写因子NF−ATは、細胞内カルシウムの存在下にNF−ATの核へのトランスロケートを可能にする核局在化配列を含有するが、カルシウムの不存在下にはNF−ATポリペプチド内の他のドメインとの分子内会合の形成によりシールドされる。
【0008】
Lee H.C. & Bernstein H.D.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001), 98 (6), 3471−3476)は分泌前タンパク質たとえばマルトース結合タンパク質(MBP)および、シグナル認識粒子(SRP)によるシャペロン分子SecBによって大腸菌内膜に標的化される、膜内在性タンパク質の標的化とは異なる外膜タンパク質A(OmpA)の関与する機構を検討した。その著者らはMBPまたはOmpAシグナルペプチドをAcrBの最初の膜貫通セグメントで置換すると、輸送に対するSecBへの依存性は消失し、両タンパク質はSRP標的化経路に経路変更されることを見出した。
【0009】
一部のタンパク質は細胞質局在化配列(CLS)または核エキスポート配列を含有し、これがタンパク質の細胞質中における優先的な残留を保証する。たとえば、Hamilton MHら, J. Biol. Chem. (2001), 276 (28), 26324−26331は、ユビキチン−タンパク質リガーゼ (E3), hRPF1/Nedd4, すなわち基質認識および基質特異性に関与するユビキタン−プロテアーゼ経路の成分は核に進入できるが、hRPF1/Nedd4における機能性Rev−様核エキスポート配列の存在下では優先的な細胞質局在化を確実にすることを示している。多くの膜タンパク質の細胞質ドメインは形質膜からのそれらのエンドサイトーシスを仲介するソーティングシグナルを含有する。
【0010】
Heineman T.C. & Hall SV(Virology (2001), 285 (1), 42−49)はVZV gBの細胞質ドメイン内の3種のコンセンサス内在化モチーフを検討し、VZV gBの内在化およびそれに続くゴルジへの局在はその細胞質ドメイン内の2つのチロシンベース配列モチーフにより仲介されることを決定した。哺乳動物細胞および酵母細胞においては、膜貫通タンパク質の細胞質テールにおけるアミノ酸モチーフが、小胞体(ER)からの迅速なエキスポートによる局在を仲介することによって初期分泌経路におけるタンパク質の標的化に顕著な役割を果たしている(Hoppe HC & Joiner KA, Cell Microbiol. (2000), 2 (6), 569−578)。
【0011】
哺乳動物のエンドペプチダーゼのフューリンは定常状態においてはトランス−ゴルジネットワーク(TGN)に著明に局在する。このコンパートメントに対するフューリンの局在はタンパク質がTGNと形質膜の間で環形成を受ける動的過程の結果であると思われる。TGNの局在と形質膜からの内在化の両者はフューリンの形質膜ドメイン内に含まれる標的化情報によって仲介される。Voorhees Pら, EMBO J. (1955), 14 (20), 4961−75には、フユーリンの定常状態における局在および交換に寄与する細胞質決定基に少なくとも2種があることが報告されている。第一の決定基は主として内在化シグナルとして機能する標準的なチロシンベースのモチーフ、YKGL(残基758−761)に相当する。第二の決定基は、酸性残基(EおよびD)の大きなクラスターを含み、チロシンベースまたはジロイシンベースのモチーフを欠く強力な疎水性配列(残基766−783)から構成される。この第二の決定基はTGNへの局在性の付与と同時に形質膜からの内在化を仲介することができる。
【0012】
トランス−ゴルジネットワーク(TGN)はタンパク質のソーティング/ターゲッティングに中心的な役割を果たし、配列SXYQRLはそれ自体有意なTGN局在性を付与することができる。Wong, S.H. & Hong, W., J. Biol. Chem. (1993). 268 (30), 22853−62には、TGN38の32−残基配列の詳細な突然変異誘発源としてTGNに封じ込まれた内在性膜タンパク質が報告され、TGNの局在にはそれぞれ位置23、25および28におけるSer、TyrおよびLeuが必須であることが決定された。TGN38の細胞質32−残基配列がグリコフォリンA(表面タンパク質)の外部および膜貫通ドメインに融合している場合、生じるキメラタンパク質はTGNに局在した。
【0013】
ある種のタンパク質が特異的なオルガネラ内でのみ活性であるか、またはそれらの局在に応じて別異に機能できることは十分に認識されている。たとえば適当な細胞下局在はNF−κB機能の調節にきわめて重要である。Huang, T.T.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97(3), 1014−1019には、潜在的NF−κB複合体がプレインダクション状態において核を出入させることができることを示し、不活性複合体の細胞質局在に要求されるIκBαの残基45−54中の、以前には特性が明らかにされていなかった核エキスポート配列が決定されている。NF−κB/IκBα複合体は、核局在シグナル依存性インポートおよびCRM1−依存性核エキスポートによって細胞質と核の間を折り返し輸送され、核インポートを越える支配的な核エキスポートが不活性複合体の細胞質局在に大きく寄与し、細胞外シグナルによる効果的なNF−κB活性化が達成されるものと思われる。
【0014】
古典的核局在化配列含有タンパク質の核インポートには、核膜孔複合体(NPC)の細胞質表面におけるインポート複合体のアッセンブリーが関与し、ついでこの複合体のNPCの貫通移動および核内部へのインポート基質の放出が起こる。Ranとの組み合わせで、他の2つの溶解因子が核への古典的または基本的なNLSを含有するタンパク質の核へのインポートを仲介するために絶対的に要求される。第一のものはカリオフェリン/インポーティンα(Kap α)であり、これは古典的NLSとを結合し、ついでカリオフェリン/インポーティンβ1(Kap β1)と複合体を形成する(Adam, S.A. & Gerace, L., (1991) Cell 66, 837−847; Goerlich, D.ら (1994) Cell 79, 767−778; Moroianu, J.ら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2008−2011; Radu, A.ら (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1769−1773; Goerlich, D.ら (1995) Curr. Biol. 5, 383−392; Chi, N.C.ら, J. Cell Biol. 130, 265−274)。Kap β1は核膜孔複合体(NPC)タンパク質と相互作用し、これらの相互作用を介してNPCを通過するインポート複合体の移動が仲介されるものと思われる(Rexach, M. & Blobel, G. (1955) Cell 83, 683−692; Radu, A., Blobel, G. & Moore, M.S. (1955) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1769−1773; Iovine, M.K., Watkins, J.L. & Wente, S.R. (1995) J. Cell Biol. 131, 1699−1713; Radu, A., Moore, M.S. & Blobel, G. (1955) Cell 81, 215−222)。他のタンパク質、p10/NTF2も核インポートに関連しているが、その機能はRanを核内に取り込むのみで、入ったインポート複合体をついで分解する必要がある(Moore, M.S. & Blobel, G., (1994) Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10212−10216; Paschal, B.M. & Gerace, L., (1995) J. Cell Biol. 129, 925−937; Ribbeck, K., Lipowsky, G., Kent, H.M., Stewart, M. & Goerlich, D., (1998) EMBO J. 17, 6587−6598; Smith, A., Brownawell, A. & Macara, I.G., (1998) Curr. Biol. 8, 1403−1406)。
【0015】
酵母(SPR1またはKap 60)には唯1個のKapαホモローグが存在するが、脊椎動物細胞は、古典的NLSを結合可能であり、配列ホモロジーを有する多くのタンパク質を含有する(Nachury, M.V., Ryder, U.W., Lamond, A.I, & Weis, K. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582−587およびそこに引用された文献参照)。これらのタンパク質には様々な名称が与えられているが、3つの主要なファミリーに分類することができる。Kapα1ファミリーはヒトタンパク質NPI−1/インポーティンα1/カリオフェリンα1/Rch2/hSRP1およびマウスS2タンパク質に加えて第二の関連タンパク質、インポーティンα6を含有する(Moroianu, J.ら (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2008−2011; Cortes, P.ら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7633−7637; O’Neill, R.E.ら (1995) J. Biol. Chem. 270, 22701−22704; Kohler, M.ら (1997) FEBS Lett. 417, 104−108; Tsuji, L.ら (1997) FEBS Lett. 416, 30−34)。第二のファミリー、Kapα2には、ヒトRch1/hSRP1/インポーティンα2/カリオフェリンα2およびマウスタンパク質のペンジュリン/PTAC58が含有される(Goerlich, D., Prehn, S., Laskey, R.A. & Hartmann, E. (1994) Cell 79, 767−778; Cuomo, C.A., Kirch, S.A., Gyuris, J., Brent, R. & Oettinger, M.A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6156−6160; Kussel, P. & Frasch, M. (1995) Mol. Gen. Genet. 248, 351−363; Imamoto, N., Shimamoto, T., Takao, T., Tachibana, T., Kose, S., Matsuubae, M., Sekimoto, T., Shimonishi, Y. & Yoneda, Y. (1995) EMBO J. 14, 3617−3626; K., Mattaj, I.W. & Lamond, A.I. (1995) Science 268, 1049−53)。第三のファミリー、Kapα3は、2種のヒトタンパク質、QIP1/インポーティンα3およびKPNA3/hSPR1γ/hSRP4、ならびにマウスタンパク質Q1およびQ2から構成される(Nachury, M.V.ら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582−587; Kohler, M.ら(1997) FEBS Lett. 417, 104−108; Tsuji, L.ら (1997) FEBS Lett. 416, 30−34; Takeda, S.ら (1997) Cytogenet. Cell Genet. 76, 87−93; Seki Tら (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 48−53; Miyamoto, Y.ら (1997) J. Biol. Chem. 272, 26375−26381)。これらのクラスのそれぞれは互いにおよび酵素SRP1と約50%のホモロジーを有し、これらの哺乳動物タンパク質のそれぞれは1またはそれ以上の古典的NLS−含有タンパク質のインポートを仲介できることが示されている(Nachury, M.V.ら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 582−587; Sekimoto, T. ら (1997) EMBO J. 16, 7067−7077; Nadler, S.G.ら (1997) J. Biol. Chem. 272, 4310−4315; Prieve, M.G.ら (1998) Mol. Cell Biol. 18, 4819−4832)。
【0016】
Stat−1のインポートはKapα1/NPI−1によって仲介されるが、Kapα2/Rch1によっては仲介されない。しかしながら、活性化Stat−1はNLS結合Armadilloリピートから離れたKapα1のCOOH−末端領域に結合するものと思われる。RCC1に対し観察される、異なるKapαの結合の差は単にRCC1上のNLSによるものであり、したがって多分、Kapα3のNLS結合領域によるものと思われる(Sekimoto, T.ら(1997) EMBO J. 16, 7067−7077)。Kamei, Y.ら (1999) J. Histochem. Cytochem. 47, 363−373は、マウスにおいて、Kapα3ホモローグは多くの組織で発現されることを示し、Kapα3が「限られた数のユニークなカリオフィリックなタンパク質たとえばヘリカーゼQ1」のインポートにある役割を果たしていることを理論化した。Talcott, B. & Moore, M.S. (2000) J. Biol. Chem. 275 (14) 10099−10104によって提供された結果はRCC1がKapα3をそれらの核インポートに用いるタンパク質のグループに含まれることを示唆するものである。
【0017】
米国特許6,191,269号には、核局在化配列(NLS)の特徴を有し、プロピースの核局在を仲介ができる(Stevensonら, (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 508−13)N−末端IL−αプロピースT76−NGKVLKKRRLのcDNA配列内に含まれる核局在配列の存在が教示されている。N−末端IL−αプロピースをコードするcDNAの培養糸球体間質細胞への導入は核の蓄積を生じた(Stevensonら, 前出)。
【0018】
米国特許5,877,282号は、アンテナペディア ホメオドメインシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKKであり、線維芽細胞成長因子シグナル配列ペプチドはAAVALLPAVLLALLAであり、HIV Tatシグナル配列ペプチドはアミノ酸配列CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHであることを教示している。
【0019】
Schwartze, S.R.ら, Science 285: 1569−1572 (1999) は, TAT融合タンパク質として組織にip注射したレポータータンパク質, 116 kD β−ガラクトシダーゼが脳血管関門を通過して送達されることを報告している。Schwartzeは、HIV tatタンパク質に由来する11アミノ酸タンパク質形質導入ドメイン(PTD)をN−末端フルオレセインイソチオシアナート (FITC)−Gly−Gly−Gly−Glyモチーフとともに使用した。この著者らはTAT PTDに化学的に架橋されたβ−Galを形質導入する初期の試みが、限られた数の組織において、散在性の弱いβ−Gal活性を生じたことを報告している。彼らは、改善された形質導入は、用いられたインフレーム融合と精製戦略によるものと推論している。
【0020】
IFNγの核局在化は多重塩基性NLSによってそのC末端において仲介され、細胞外および細胞内両者におけるIFNγの生物学的活性の完全な発現が要求される(Subramaniam, Prem S.ら, J. Cell Sci. (2000), 113 (15), 2771−2781)。このNLSは、IFNγによって活性化される転写因子、STAT1αの核トランスロケーションに内在性の細胞内の役割を果たしていると考えられる。なぜならば、NLSを含むC−末端領域(95−133)に対する抗体によるIFNγの処理はSTAT1α核トランスロケーションの誘導を遮断するが、これらの抗体IFNα処理細胞におけるSTAT1αの核トランスロケーションには何らの作用も示さないからである。C−末端NLS領域を欠くヒトIFNγの欠失突然変異体、IFNγ(1−123)は生物学的に不活性であるが、細胞上のIFNγ受容体複合体に、野生型タンパク質の場合と類似のKdにおいてなお結合することができる。NLSの欠失はIFNγ受容体複合体に結合したのちのIFNγの生物学的活性に要求されるSTAT1α核トランスロケーションを開始させるIFNγの能力を、特異的に消失させる。NLSモチーフを含むマウスIFNγのC−末端ペプチド、IFNγ(95−133) は、マウスマクロファージ細胞系によって細胞内に取り込まれた場合に、STAT1αの核トランスロケーションを誘導した。NLSモチーフの欠失では、この細胞内ペプチドの核トランスロケーション能力が特異的に阻害される。IFNγで活性化された細胞では、IFNγはSTAT1αおよびインポーティン−αアナログ、Npi−1を含む複合体の部分として見出され、これはSTAT1αの核インポートを仲介する。STAT1αのチロシンリン酸化、複合体IFNγ/Npi−1/STAT1α複合体の形成およびそれに続くSTAT1αの核トランスロケーションはすべてIFNγ NLSの存在に依存した。
【0021】
多重塩基性配列、126RKRKRSR132を含有するIFN−γのアミノ酸95−132を表すペプチドはATPおよびGTPの両者を要求するエネルギー依存性様式で自己蛍光タンパク質、APCの核取り込みを特異化する。上述の多重塩基性配列を欠失させた場合は、核インポートは消失した(Subramaniam Pら (1999), J. Biol. Chem. 274 (1), 403−407)。SV40の大T−抗原のプロト型多重塩基性NLS配列を含むペプチドもまた、IFNγ(95−132) によって仲介される核インポートを阻害することが可能であり、これはIFNγ中のNLSがSV40 T−NLSによって利用されるRan/インポーティン経路の成分を介して機能することを示唆している。無傷のIFNγがAPCにカップリングした場合にもその核インポートを仲介することが可能であり、この核インポートはペプチドIFNγ(95−132)およびSV40 T−NLSペプチドによって遮断され、無傷のIFNγもRan/インポーティン経路を介して核内に輸送されることを示唆している。
【0022】
核タンパク質は、核膜孔複合体(NPC)と呼ばれる核エンベロープに広がる水性チャンネルを通ってインポートされる。約20〜40Da未満のイオンおよび分子は核膜孔複合体を通過して受動的に拡散することができるが、より大きいタンパク質はエネルギーおよびシグナル依存性の飽和経路によって輸送される。核タンパク質のインポートを特定するシグナル(NLS)1は通常、塩基性アミノ酸残基に富んだ短いアミノ酸のストレッチであるが、最近では他のクラスのNLSも報告されている。塩基性アミノ酸型のNLSを含有するタンパク質のインポートにおける開始工程はNLS含有タンパク質が受容体(NLS受容体、インポーティンαおよびカリオフェリンと様々に呼ばれる)に結合している細胞質で起こる(13)。基質−受容体複合体はついで、核膜孔複合体の細胞質表面と会合し、これに細胞質型因子が関与して、核膜孔複合体中の開口チャンネルを通って核内に輸送される。NLS−仲介核インポートのインビボ現象は、細胞質抽出物およびATPを補充されたジギトニン透過性細胞を用いたインビトロ系において再現することができる。このインビトロアッセイにおける輸送は、インビボインポートを遮断する同一の阻害剤で遮断され、迅速かつ容易に定量される。
【0023】
線維芽細胞成長因子(FGF)−1のN−末端におけるNLS、配列NYKKPKL、酸性FGFのプレカーサーは、核トランスロケーションシグナルとしてのその機能によるFGF−1の長期活性化または膜貫通受容体キナーゼの結合および活性化の維持に必要な構造の安定化におけるその役割に影響することが提案されている(Luo, Y.ら, J. Biol. Chem. (1996) 271 (43), 26876−26883)。たとえば、至適活性における外因性ヘパリン依存性の著しい増大とともに、FGF−1の残基NYKKPKLの逐次欠失は熱安定性、プロテアーゼに対する抵抗性、マイトジェン活性および膜貫通受容体に対する親和性を漸進的に消失させる。最大の変化はリジン−ロイシン残基を通じての全配列の欠失から生じた。十分高濃度のヘパリンの存在下には欠失突然変異体は野生型FGF−1に等しいマイトジェン活性を示した。
【0024】
FGF−1はNTSを含有するが、核トランスロケーションには外因性の、内因性ではない経路が必要とされる。FGF−1のNTS、NYKKPKLはトランスフェクトされたNIH 3T3細胞の核に細菌性β−ガラクトシダーゼ(βgal)遺伝子の発現を指図することができるが、このNTSはFGF−1それ自体またはFGF−1−βgal融合タンパク質のいずれも核へ標的化することはできず、FGF−1には、内因的に発現されたFGF−1の核へのトランスロケーションを妨げる付加的配列が包含されることを示唆している(Zhan, X.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992) 188 (3), 982−91)。
【0025】
インターフェロン−γ(IFN−γ)は、シグナル伝達にJak−Stat経路を使用するタンパク質であって、サイトカインで細胞外処理した細胞においては核に急速にトランスロケートする。NLSはヒトおよびマウスIFN−γのC−末端に同定され、特性が明らかにされている。Larkin Jら, J. Interferon Cytokine Res. (2001) 21 (6), 341−348は、ヒトIFN−γ(Hu IFN−γ)が上流部位に第二のNLSを含有することを報告している。HuIFN−γのアミノ酸122−132を表すマウスIFN−γ中に同定されたNLS配列と同族の一次配列は自己蛍光タンパク質アロフィコシアニン(APC)の核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができた。Hu IFN−γのアミノ酸78−92を表す第二の配列もAPCの核インポートをエネルギー依存的様式で仲介することができたが、その程度は著しく低かった。APCに複合した両配列の核インポートは複合していないHuIFN−γ(122−132)との競合によって強力に遮断された。配列HuIFN−γ(78−82)による競合は、APC−複合HuIFN−γ(78−92)のインポートを効果的に遮断したが、同じ濃度でもAPC−複合HuIFN−γ(122−132)の核インポートは阻害することができず、HuIFN−γ(78−92)はHuIFN−γ(122−132)よりNLSとしての効率が低いことを示唆している。これはNLSの122−132における下流を欠くHuIFN−γの抗ウイルス活性の>90%喪失に一致する。APC複合HuIFN−γ(122−132)の核インポートはSV40 T NLSのプロトタイプ多重塩基性NLSを含むペプチドにより阻害され、これは両場合において同じRan/インポーティン細胞性機構が使用されていることを示唆する。
【0026】
核局在化の機構としては、NLSモチーフの強力な保存があるものと思われる。DNA結合タンパク質を核内に封入する場合には、存在するDNA結合機構の部分が進化に用いられたように思われる。Cokol, M.ら(EMBO Rep. (2000), 1(5), 411−415)は真核タンパク質の17%以上が核にインポートされるものと推定して、文献から実験的に確証されたNLSの91のセットを分析後、このセットを「インシリコ突然変異」によって繰り返した214のセットの可能性のあるNLSに拡大した。この最終セットは、すべての既知核タンパク質の43%にマッチし、非核タンパク質はなかった。CokelらNLSおよびDNA結合領域両者が知られているタンパク質の90%についてNLSとDNA結合領域の間に重複を見出したが、214のNLSモチーフ中56のみがDNA結合領域に重複した。これらの56のNLSによって、ヒト、ハエ、蠕虫および酵母における約800種の部分的DNA結合領域が新たに予測された。
【0027】
さらに最近になって、NLSシグナルペプチドはDNAの構造変化を誘導できることが報告されている。Lupinus luteusからの植物酵素であるグルタミニル−tRNAシンテターゼGlnRSはN−末端にリジンに富んだポリペプチド、KPKKKKEKとしてNLSを含有する(Krzyzanik, A.ら, Mol. Biol. Rep. (2000), 27 (1), 51−54)。ルピンGlnRSのNLS配列に由来する2つの合成ペプチド(20および8アミノ酸長)はDNAと相互作用する。さらに、短い8アミノ酸のペプチドは、B型からZ型へのDNAのコンフォーメーション変化を引き起こす。この観察はGlnRSのリーダー配列中におけるNLSポリペプチドの存在がタンパク質の輸送のみならず、遺伝子発現の調節に必要なことを明らかに示唆している。これは、DNAの構造変化におけるNLSシグナルペプチドの役割を最初に示唆した報告である。
【0028】
通常、種の中のNLS配列には強力な保存が認められる。たとえば、TGF−βシグナル伝達に関与する主要なSmadタンパク質であるSmad 3タンパク質のNLSはN−末端領域に塩基性モチーフ、Lys40−Lys−Leu−Lys−Lys44を有し、これは、経路特異的なすべてのSmadタンパク質中で保存され、そのリガンドに対する応答においてSmadの核インポートを必要とする。Smadタンパク質はトランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)および関連サイトカインの細胞内メディエーターである。Xiao, Z.ら(J. Biol. Chem. (2000), 275 (31), 23425−23428)は核局在化においてNLSが果たす役割を同定した。この著者らは単離Smad 3 MH1ドメインがインポーティンβへの有意に特異的な結合を示し、これはNLSにおける突然変異により減弱または消失すことを証明した。完全長のSmad3はインポーティンβに弱いが特異的な結合を示し、これはI型TGF−β受容体によるリン酸化後に増強される。これに反し、インポーティンαとSmad3またはそのMH1ドメインの間には相互作用は観察されず、Smadタンパク質の核トランスロケーションはインポーティンβへの直接結合によることが示される。この著者らは、経路特異的なSmadすべてのタンパク質(Smad 1、2、3、5、8および9)の活性化が保存されたNLSモチーフを露出させ、ついで直接インポーティンβに結合し、核のトランスロケーションを誘導すると結論した。
【0029】
すべて細胞において、細胞の脂質二重層細胞膜は荷電分子通過の選択的障害として作用し、それとともに疎水性巨大分子の内在化は古典的輸送経路により達成される(Hawiger, J., Curr Opin. Chem. Biol. 3, 89−94, 1999; Schwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology, 10, 290−295, 2000)。これらの古典的内在化機構には、受容体仲介エンドサイトーシスまたはトランスポート依存性取り込みが関与する(Cleves, A.E., Current Biology, 7, R318−R320 (1997))。これに反し、古典的インポートおよび/またはエキスポートシグナルを欠く分子数の増加が見出された(Cleves, A.E., Current Biology, 7, R318−R320 (1997))。これらの分子は、慣用的ではなくその機構はほとんど分かっていないプロセスを用いて直接、細胞質または核コンパートメントにアクセスすることができる。これらの新規な機構は、一般的に「非古典的」と呼ばれ、使用される輸送経路は非定型的である。後者に関連する例はHIV−1 TAT(Frankel, A.D. & Pabo, C.O., Cell, 55, 1189−1193 (1988))、ヘルペスウイルスVP22(Elliott, G. & O’Hare, P., Cell, 88, 223−233 (1997))およびアンテナペディア, Antp(Derossi, D.ら, J. Biol. Chem. 269, 10444−10450 (1994))の遺伝子コードタンパク質中に見出される。HIV−I TAT(Helland, D.E.ら, J. Virol. 65, 4547−4549 (1991))およびVP22(Pomeranz, L.E. & Blaho, J.A., J. Virol. 73, 6769− 6781 (1999))の完全長タンパク質が迅速に細胞膜内外にトランスロケートされることは現在では十分確立されている。実際別個のペプチド領域が、単独でまたはキメラカーゴペプチドとの組み合わせおよびタンパク質を細胞コンパートメント内にトランスロケートすることができるこれらのタンパク質両者内に同定されている(Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol. Sci. 3, 99−103 (2000), Derossi, D.ら Trends Cell Biol., 8, 84−87(1998), Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400−406 (2000), Steven, R. Scnwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology 10, 290−295 (2000))。これに反して、完全長Antpタンパク質が生物学的膜を横断することは示されなかったが、そのコード領域内に由来する16アミノ酸の合成ペプチドは強力な膜透過性能力を有する(Derossi, D.ら, Trends Cell Biol. 8, 84−87 (1998))。これらの核によって使用される非定型的輸送の受け入れられた概要は「伝達」(transduction)と呼ばれたが(Schwarze, S.R.ら, Trends in Cell Biology 10, 290−295 (2000))、現在は受容体およびエネルギー依存性ですべての細胞型においてC4で生じる著しく迅速な膜透過性経路として定義されている(Schwarz, S.R. & Dowdy, S.F., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45−48 (2000))。所定のことに、これらの3つのタンパク質はすべて転写調節に関与する核タンパク質であり、それぞれの形質導入ペプチドはアルギニンおよびリジンに富んだアミノ酸のストリングである(Schwarz, S.R. & Dowdy, S.F., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45−48 (2000))。しかしながらこれらの類似性とは無関係に、これらの形質導入ペプチドは多くの異なる特性たとえばアミノ酸配列、配列の長さ、細胞性局在、および膜透過の活性を有する。すなわち、それぞれの形質導入配列は細胞および組織を透過することができるが、それらが同じ非定型的輸送機構を使用しているか否かはまだ確立されていない。
【0030】
最後に、米国特許6,022,950号は、動物の細胞に上記ハイブリドタンパク質を結合させるのに有効な細胞結合ポリペプチドリガンドの結合ドメイン部分のハイブリド分子、細胞のサイトゾールへ細胞質膜を横切って、上記第三の部分をトランスロケートする天然に存在するタンパク質のトランスロケーションドメイン、および細胞に導入される化学物質の使用が教示されている。しかしながらその特許はトキシンのトランスロケーションドメインを教示するものである。トランスロケーションドメインを有することが知られている天然に存在するタンパク質には、ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンAが包含され、また他のトキシンおよび非トキシン分子が同様に包含される。ジフテリアトキシンおよびシュウドモナスエキソトキシンAのトランスロケーションドメインは十分特徴づけられていて(たとえば、Hochら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1692−1696, 1985; Colombattiら, J. Biol. Chem. 261: 3030−3035, 1986 およびDeleersら, FEBS Lett. 160: 82−86, 1983参照)、ならびに他の分子におけるこのようなドメインの存在および位置がHwangら, Cell 48: 129−136, 1987およびGrayら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2645−2649, 1984に採用された方法を用いて決定することができる。
【0031】
細胞性局在の制御機構、細胞内輸送の調節に関与するタンパク質、細胞質膜および核エンベロープについての様々な性質および制御機構を教示するかなり大量の文献があることを考慮すれば、哺乳動物タンパク質に由来するポリペプチドが非古典的機構を使用する細胞質膜を通じて形質導入され、それによって所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボにおける送達デバイスとして役立つ膜透過性ペプチドとして有用であることは予期されなかった。また所定の化合物の細胞内送達のための非タンパク質由来の方法、たとえば、エレクトロポレーション、リポソームによる膜融合、DNAコーティングマイクロプロジェクタイルによる高速ボンバードメント、リン酸カルシウム−DNA共沈物とのインキュベーション、DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション、修飾ウイルス核酸によるインフェクション、および単一細胞、通常は卵子による直接マイクロインジェクション等を教示するかなりの論文がある。これらの方法は比較的非効率的で、送達された所定の化合物を含む細胞は比較的低率にしか得られず、大部分の方法は明らかに現実的なインビボ送達が可能なものではない。多くの方法は細胞に対して毒性があり、比較的高率にアポトーシスを生じる。したがって、所定の化合物の簡単な、より効率的な細胞への送達方法には大きい必要性がある。
【0032】
【発明の開示】
本発明は所定の化合物のインビトロ、エキソビボおよびインビボ送達のための担体として有用な、哺乳動物および酵母由来のポリペプチドに関する。本発明はまた、それらを含有する組成物、ならびに、所定の化合物を、インビトロ、エキソビボおよびインビボにおいて送達する方法を提供する。
【0033】
添付の図面において:
図1.(A)PASの位置、細胞質の局在、および核局在配列(NLS、ただし図中には核局在ドメイン(NLD) として示した)を示すhPER1融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はhPER1タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。(n)核、(no)核小体、(c)細胞質、(diff)散在性。すべての構築体はN−末端にEYFPをタグした。ヒトおよびマウスPER1−NLSのアラインメントは最下部に示す。
【0034】
図1.(B)上記図1Aに記載のhPER1融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。CHO細胞は各パネルの最上部に指示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、EYFPレポーター(緑)細胞下の局在をトランスフェクト10時間後に蛍光顕微鏡により可視化した。対照としてはEYFPベクター単独を用いた(5. EYFPベクター参照)。
【0035】
図2.(A)CHO細胞における膜透過性アッセイ。N−末端をビオチン化した合成ペプチド、hPER1−PTD、Flag−hPER1−PTD、Flag−TAT−PTD(陽性対照)およびFlag−Flag(陰性対照)を、培養液中の生存CHO細胞における細胞膜の透過能力についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Alexa 594(赤)または抗−flag mAb(緑)のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ(黄色)である。さらに細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【0036】
図2.(B)ビオチン化ペプチド, hPER1−NLD(hPER1−PTDとしても知られる)の標的核を、ストレプトアビジン−Alexa 594蛍光(緑)を用いてTAT−PTDおよび Flag−Flag(陰性対照)と比較した。核の染色には5ng/mLのHoechst 33258(青、中央のカラム)を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【0037】
図3.hPER1−PDTのアラニン走査。ビオチン化hPER1−NPDは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、CHO細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度10μM, 37℃において10分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Alexa−594(赤, 2μg/mL)によりRTで15分間検出した。対照ペプチドはhPER1 N−末端アミノ酸残基486−500とした。
【0038】
図4.セロトニン5HT2A受容体のhPER−MPP融合ペプチドによる活性化。
(A)hPER1−MPPおよびTAT−PTDペプチドは単独で、または第一の細胞内ループI1(SLEKKLQNATN)もしくは5HT2A受容体、遺伝子アクセス番号 M86841)由来のC−末端膜貫通7ドメインTM7(KTYRSAFSRYIQYKENKKPLQLI)のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準FLIPR分析を用いて、外因性および内因性Ca+2レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである:T(TAT−PTD)、P(hPER1−MPP)、I1(細胞内ループ 1)、T−I1(TAT−PTD−II)、P−I1(hPER1−MPP−II)、TM7 (C−末端ドメイン)、TTM7 (TAT−PTD−TM7)、PTM7 (hPER1−MPP−TM7)、およびS (セロトニン)。
【0039】
図4.(B)PTM7(黒丸)およびTTM7(黒菱形)ペプチドの用量反応。セロトニン(対照、白三角)は10μMの最大受容体刺激濃度で使用した。
【0040】
図5.更なるPTDの同定。PTDの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、SwissPro, PRF, PIR−Protein info Resourceを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初、すべて既知または候補のNLSについて探索した。第二に、本発明者らは変性パターンの発生 [R/H/K]−[R/H/K]−[R/H/K]−[R/H/K]を探索するためPHI−BLAST(Pattern−Hit Initiate BLAST)、(X)n(式中、nは4またはそれ以上の整数であり、Xは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される)を採用した。7374の候補PTD配列が見出された。2つの探索から、本発明者らは(A)これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または(B)GFPとのインフレーム融合タンパク質を創製し、CHO細胞にトランスフェクトした。12のペプチド中の9は形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。hPER1−PTD、hPER3−PTDおよびTAT−PTDペプチドを陽性対照として使用した。6つの陽性配列と2つの陰性配列が見られる。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に指示するように表す。すなわち (M24899, ヒト甲状腺ホルモンα−1;L12699, ヒトHomeoboxタンパク質Engrailed 1 HME1;X16416, ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼABL1;Q02575 ヒトHEN1/NSLC1;Q02577, ヒトHEN2/NSLC2;AAA74561, ラットHNF3;CAB65887, ショウジョウバエcAMP依存性転写因子)。3つの陰性ペプチドは(V01512, c−Fos;AAD53184, ヒト cyclin L ania−6a;CAB66914, Arabindopsis β−zip転写因子)である。
【0041】
図6.hPER−PTDはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する:HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはhPER1形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには、本発明者らはFrankelら(1989, (19): 7397−401)によるプロトコールに従い、hPER1−PTDまたはhPER−PTD R7Aを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図6左側に示すように、hPER−PTDβ−ガラクトシダーゼの融合は、X−galの添加後の細胞に青色によって指示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼ(中央)もβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独(右側)もX−gal添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。これらのデータはTATペプチドのようなhPER1−PTDは細胞の中に多量のタンパク質(120kD)を運搬することができるということを示している。
【0042】
【発明の詳述】
本発明はヒトPeriod1(hPER1)タンパク質が、現在ではMPPとしても同定され、所定の化合物の細胞内送達のためのデバイスとして有用なNLSを含むことの発見に基づくものである。hPER1は概日リズムの調節に関与し、hPER1が隣接する細胞に局在する能力は概日リズムを調節するその全体的生物学的機能にきわめて重要である。hPER1内に同定されたNLSは、以前に同定されたNLS配列内にフィットせず、その同定は、MPPとしても機能する他のNLS配列の探索のためのアルゴリズムの同定を生じる。
【0043】
Period1(hPER1)は、転写調節に関与する核タンパク質である。それは生物時計の「ギア」における必須の成分であり(Brown SA & Schibler U, Current Opinion in Genetics & Development 9, 588−594 (1999), Dunlap JC, Cell 96, 271−290 (1999))、マウスでの研究によりPER1の核への移入がCLOCK/BMAL転写複合体のダウンレキュレーションに必須であることを示した(Gekakis Nら, Science 280, 1564−1569 (1998), Yagita Kら, Genes Dev 14, 1353−1363 (2000), Lowrey PLら, Science 288, 483−492 (2000))。しかしながら、今日までヒトPER1の機能性NLSは明らかにされていなかった。本発明者らは、hPER1内にNLSを同定し、16アミノ酸および13アミノ酸配列(図3.HPER1−NLSペプチド参照)が強力な膜透過能力を有することを証明した。この研究ではさらに同じく核タンパク質に由来する4つのMPPの同定がなされた。
【0044】
PER1は概日時計における中心成分であり、その核への移入は毎日の振動の調節に重要な役割を果たしている(Jin, X.ら, Cell 96, 57−68 (1999);Sangoram, A.M.ら, Neuron 21, 1101−13, (1998))。欠失および融合タンパク質分析を用いて、本発明者らはhPER1の核局在に必要かつ十分なNLSを同定した。hPER1のNLSが古典的な核局在コンセンサスモチーフに一致せず、したがって、標準的なNLS探索操作を使用しては同定されなかったので、この機能分析が必要であった。本発明者らは、レポータータンパク質およびタグされたhPER1フラグメント(P1−F2〜P1−F7)の核局在をトランスフェクト細胞に導入するためには、hPER1−NLSの単一コピーで十分であることを示す。HPER1−NLS は、hPER1のアミノ酸(830〜845)の間に位置し、利用可能なデータベース中の他のPERまたは他の核タンパク質には見出されない、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンに富んだ13個のアミノ酸のストリング(表1参照)内に包埋されている。したがって、PER2およびPER3は核タンパク質ではあるが(Jin, X.ら, Cell 96, 57−68 (1999))、それらは、それらの核インポートのために別の配列および/または機構を使用することが明らかである。
【0045】
塩基性残基に富む核タンパク質の限られた数のペプチドフラグメントは、受容体なしでの、エネルギー依存性様式で細胞膜内に透過することが示されている。このような3種のタンパク質からの配列、TAT、AntpおよびVP22は細胞および組織内に未確定の機構により透過し、融合分子を運搬する能力をもつことが証明されている。たとえば、Frankelらに発行された米国特許5,804,604、5,747,641、5,674,980、5,670,617および5,652,122号参照。これにはカーゴ分子の細胞内送達のための、9アミノ酸のHIV TAT由来のポリペプチド(Arg−Lys−Lys−Arg−Arg−Gln−Arg−Arg−Arg)の使用が教示されている。
【0046】
hPER1、hPER1−NLSおよび他のMPP間の類似性は、本発明者らにhPER1−MPPが膜透過能力を有するか否かの検討を急がせることになった。ここに示す免疫組織化学的および細胞学的データはhPER1−MPPが様々な細胞型においてMPPとして機能することを指示している。HPER1−MPPは核細胞質ならびに核小体において強力なフォーカル染色を示し、hPER1−MPPの核下におけるアドレスは、核内に分散し、核に濃縮されていないhPER1(P1−FL)タンパク質とは異なることを示唆する。hPER1−MPPの核透過は、負に荷電した残基の添加または細胞の4%PFAによる前固定ではその配列が逆転する条件下(逆hPER1−MPP)にも遮断されず(未公表の観察)、後者は透過が受容体および膜依存性であるとの考え方を支持する。これらの結果は、遅い、温度、エネルギーおよび受容体依存性機構を使用して細胞膜に結合し、それを横切る、シグナルペプチド配列由来と記載されている他のペプチドクラス(Hawiger, J., Curr Opin Immunol. 9, 189−94 (1997))、DNA抗体(Deng, S.X.ら, Int Immunol. 12, 415−423 (2000))、および他のタンパク質ドメイン(Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99−103 (2000))とは対照的である。
【0047】
他のMPPの同定は、膜ペプチド透過に必要な機構および構造的要求の理解の欠如により限られていた。特異的なペプチド構造および/または電荷が膜透過に重要と思われることはアラニン走査実験で証明され、アルギニン7における単一アミノ酸の変化がMPPの可能性に重要であるように思われる。野生型hPER1−MPPを生存細胞または前固定および透過化細胞中、修飾P1−R7Aと比較すると(データは示していない)、P1−R7Aのみが透過性を欠いたが、核標的化において細胞をいったん透過性にすれば透過性を示す。この所見はアルギニン7が構造に基づく透過に主要な役割を有し、したがって将来の構造−機能の研究に有用なモデルを提供する。TATペプチドに対する構造決定基は報告されていないが、Antpの場合2つのトリプトファン残基を2つのフェニルアラニンで置換すると透過性は消失する(Le Roux Iら, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 9120−9124 (1993))。hPER1−MPPはトリプトファン残基を含有しないので、これら2つのペプチドの間の膜透過は異なる機構により起こるものと思われる。
【0048】
完全長のHIV TATおよびVP22は、いずれも古典的分泌シグナル配列を欠き、したがって非古典的機構によってエキスポートされるもので、また非古典的様式で細胞内に「形質導入」によるインポートされうるものである(Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400−406 (2000))。したがって多分、hPER1が概日時計情報を、隣接するSCNニューロンまたは概日アウトプット経路に完全長TATおよびVP22タンパク質の場合と同様な「形質導入」機構によって配布すると推測することは興味がある。しかしながら単にタンパク質の本体内に膜透過性配列を有することでは、完全長Antpタンパク質が細胞からのエキスポートも、また細胞内へのインポートもされないように、膜透過能力は必ずしも付与されない。すなわち、Antpペプチドの細胞内への非古典的透過が生理学的な関連をもつとは考え難く、Antp同様、完全長hPER1が細胞膜透過タンパク質であることを示唆する証拠もない。しかしながら、これらの所見は、本発明者に他のMPP含有タンパク質を探索する元気を与えることになった。タンパク質データベースを核タンパク質内に塩基性残基のストリングを同定するために設計されたアルゴリズムで探索することによって、本発明者らは、膜透過性ペプチドの可能性がある何百もの領域を明らかにし、幾つかの種から4つの付加的MPPを見出したのである(図5参照)。これらのおよび付加的なデータベースの採掘探索により、MPP様の配列が共通であり、広い様々なタンパク質中に存在することが示唆される。しかしながら、レポーター配列に融合した場合、常に核の局在を付与するとは限らない多くのNLS候補と同様に(Moroianu, J., J Cell Biochem 32−33, 76−83 (1999))、MPPの可能性は実験により機能的に決定しなければならない。形質導入または非形質導入いずれのタンパク質もMPP領域をコードできることは明らかであるように思われるが、MPP様配列を含有するタンパク質が正常な生理学的過程を活性化し、急速に細胞ドメイン内に細胞内局在するためにこれらのドメインを使用するかどうかという所定の問題が残る。形質導入現象に伴う効率は、とくに細胞内情報の急速な送達が重要な場合に細胞の同調、発生および分化の規範の場合と同様に重要である。
【0049】
MPPが細胞内コンパートメントに分子を運搬する能力は十分に確かめられつつある(Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99−103 (2000);Derossi, D.ら, Trends Cell Biol. 8, 84−87 (1988))。他のMPPと同様に、hPER1−MPPおよびここに同定された他のMPPは所定の化合物たとえば大きな分子、すなわちペプチド、タンパク質、脂質、ポリサッカライド、他の有機分子を迅速かつ効率的に細胞内に送達することができる。ここに示すデータは、セロトニンおよび/またはアドレナリン7TM作動性受容体由来のペプチドと融合したhPER1−MPPがリガンド活性化受容体の作用を模倣することを示し、hPER1−MPPが所定の化合物を細胞内コンパートメントに局在させることを確認し、生理学的に関連するシグナリングが所定の化合物に連結したMPPによって開始できるとの考え方を支持する。ここに記載の方法を用い、本発明は標的に連結したMPPを使用する標的の有効性および/または特異的な酵素もしくは酵素に連結したMPPの使用を、酵素機能不全の結果または経路内における改変、補正もしくは補償方法としての治療戦略に拡大することができる。さらに、特異的受容体に連結したMPPを用いる治療戦略は、機能不全受容体または正常もしくは異常受容体の発現の改変、補正または補償方法として使用することができる。
【0050】
ここに提供された結果を考え合わせると、哺乳動物タンパク質、さらに特定すればヒト核タンパク質によってコードされたMPPはその細胞透過が膜依存性であり、おそらくペプチド構造に依存することを示している。hPER1−MPPは特異的な細胞下部位に標的化されるが、他の巨大分子を細胞内標的に効率的に送達する可能性がある。
【0051】
さらに重要な点は、本発明はまたNLSドメインに基づく新規なMPPマッピングの最初の例を提供し、多くのMPP様の領域が、広く多様なタンパク質を含むことを示唆している。ここに提供されたデータはMPPがNLSの部分に基づくかもしくはNLSの部分と重複するか、または新規なペプチドであることを示している。
【0052】
NLS配列を同定する方法は本技術分野では周知であり、ネイティブなタンパク質が核内に移行する能力の付与として以前に同定されたNLSを包含するか、または以前に同定されたNLSとの実質的な配列ホモロジーに基づいている。また、NLSは配列欠失実験によって同定されてもよい。たとえば、Luo, J.C., Shibuya, M., A variant of nuclear localization signal of bipartite−type is required for the nuclear translocation of hypoxia inducible factors (1α, 2α and 3α), Oncogene 2001 Mar 22; 20 (12): 1435−44またはHodel, M.R., Corbett, A.H., Hodel, A.E., Dissection of a nuclear localization signal. J Biol Chem. 2001 Jan 12; 276 (2): 1317−25 参照)。
【0053】
本発明の好ましい膜透過ペプチド(MPP, ペプチド形質導入ドメインまたは「PTD」としても知られる)は小さなポリペプチドであり、哺乳動物または酵母タンパク質のNLSに由来するか、またはそのNLSと重複してもよい。好ましい哺乳動物タンパク質は、ヒト、霊長類、マウスまたはラットである種のタンパク質である。一般にNLSが由来するタンパク質と処置される細胞は同じ種のものであることが好ましい。ヒトの細胞を処置する場合には、とくにヒト種の細胞の使用が好ましい。NLSは広範なクラスの酵素内に見出され、核タンパク質、転写因子、サイトカインおよびキナーゼに限定されるものではない。好ましいMPPは核タンパク質または転写因子に由来するものである。また本発明のMPPは配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)からなる小さなペプチドである。小さなMPPを使用するのが好ましく、したがってnは1〜5の整数であることが好ましく、1〜3の整数であることがさらに好ましい。適当なMPPが選択された実施態様を表1および実施例5に示す。
【0054】
MPPおよび/または所定の化合物は別個に、たとえば化学合成経路によって化学的に合成し、市販されている試薬が利用できる。別法として、MPPおよび/または所定の化合物がポリペプチドである場合には、組換え技術によって合成し、既知の方法によって精製してもよい。宿主細胞、クローニングベクター、プロモーターおよびオリゴヌクレオチドリンカーは周知であり、市販品を利用することができる。組換え技術を使用する方法論および精製方法も周知である(Current Protocols in Molecular Biology, 4 Vols. Wiley参照)。一般に、組換え技術は大規模な製造に適していて、大量生産が経済的である。また、MPPは特異的なプロテアーゼによる前駆体の分解によっても得ることができる。
【0055】
所定の化合物は、MPPのN−末端またはC−末端に化学的架橋を介してMPPに結合または連結させて、MPPと所定の化合物とを、たとえばジスルフィドまたはエステル結合させた複合(また融合ともいう)体とされる。別の実施態様において興味ある化合物がペプチドである場合は、MPPの融合配列と所定の化合物をコードするベクターを、そのベクターの発現を可能にする条件下に、ペプチドを宿主細胞により組換え技術で合成してMPPと所定の化合物の融合体とされる。
【0056】
他の実施態様においては、MPPと所定の化合物は化学リンカーを介して結合または連結させてもよい。化学リンカーは本技術分野において周知であり、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、マレイミドベンゾイル−N−ヒドロキシスクシンイミド(MBS)、N−エチルオキシカルボニル−2−エチルオキシ−1,2−ジヒドロキノリン(EEDQ)、N−イソブチルオキシ−カルボニル−2−イソブチルオキシ−1,2−ジヒドロキノリン(IIDQ)が包含されるがそれらに限定されるものではない。好ましいリンカーはまた、単量体化合物たとえば単一アミノ酸とくに好ましくは側鎖の小さいアミノ酸、または小さなポリペプチドもしくは数個のアミノ酸のポリマー化合物である。好ましいポリペプチドリンカーは15個のアミノ酸またはそれ未満、さらに好ましくは10個のアミノ酸またはそれ未満である。さらに好ましいポリペプチドリンカーは5個またはそれ未満のアミノ酸である。別の実施態様においては、リンカーは小さなポリペプチド鎖をコードする核酸、好ましくは15個のアミノ酸またはそれ未満をコードする核酸である。さらに好ましいリンカーは10個のアミノ酸またはそれ未満の小さなポリペプチド鎖をコードする核酸である。なおさらに好ましいリンカーは5個またはそれ未満のアミノ酸の小さなポリペプチド鎖、たとえばGly−Phe−Leu−Gly、Gly−Gly、Gly−LeuまたはGly等をコードする核酸である。
【0057】
組換え技術は上述のように、融合MPP、リンカーおよび所定の化合物の発現に使用することが可能であり、本技術分野において周知である。
【0058】
他の実施態様においては、リンカーは切断可能なリンカーとすることが可能であり、選択された組織または細胞に送達されたならば、MPPと所定の化合物の切断が起こる。このような実施態様においては、細胞または組織は、切断可能なリンカーを切断することができる内因性(天然に存在する酵素または組換え操作によって発現する酵素)、または外因性(たとえば、注射、吸収等)酵素である。切断に適当な酵素の使用には、たとえばKEX2プロテアーゼ認識部位(Lys, Arg)を、グルコアミラーゼと所望のポリペプチドの間に挿入して、ネイティブなアスペルギルスKEX2様プロテアーゼの活性の結果として融合タンパク質から所望のポリペプチドのインビボ放出を可能にする例が包含される(Contrerasら, 1991; Broekhuijsenら, 1993; Wardら, 1995)。切断可能なリンカーペプチドの他の例には認識配列Asp−Asp−Asp−Asp−Lysからなり、その融合タンパク質はエンテロキナーゼで切断することができる。
【0059】
別法として、リンカーは生物分解性とすることも可能であり、所定の化合物はMPPと所定の化合物の融合体から、加水分解および/または細胞内部における酵素的切断によって脱着される。たとえば、腫瘍は特異的なプロテアーゼを発現することが多く、細胞毒素物質のプロドラッグの送達に使用される。リンカーはライソソームプロテアーゼたとえばカテプシンB、CまたはDに対し選択的でありうる。プロドラッグの送達と引き続くそれらの活性化は良く知られたところで、このようなアプローチは早過ぎるリンカーの血中での加水分解により有意に低い全身毒性をもたらし、結果として大量の所定の化合物、すなわちドラッグまたは細胞毒性物質が腫瘍部位に送達される。たとえば、Higuchi, T. & Stella, V.によりプロドラッグについての完全な考察が提供されている(Pro−drug as Novel Delivery Systems, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society のVol. 14, 1975参照)。容易に切断可能な基の例にはアセチル、トリメチルアセチル、ブタノイル、メチルスクシノイル、t−ブチルスクシノイル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、ベンゾイル、3−アミノシクロヘキシリデニル等が包含される。
【0060】
所定の化合物は任意の有機分子であり、小有機分子、ペプチド、リポタンパク質および他の修飾タンパク質、ポリサッカライド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドならびに医薬的、予防的、診断的および/または研究的に興味があると考えられる任意の他の化合物が包含される。所定の化合物は医薬的に既知の性質を有する小さい有機分子であってよく、したがって本発明は患者を所定の化合物で処置する方法として使用することができる。また、所定の化合物は機能未知の新規なタンパク質であってもよく、したがって本発明は所定の化合物の機能を同定する方法として使用することができる。他の実施態様においては、所定の化合物はアンチセンス分子であり、したがって本発明は転写を変化させる方法として使用することができる。さらに他の実施態様においては、所定の化合物はプロドラッグであり、たとえば不活性型であるが細胞内で活性化することができる。他の実施態様においては所定の化合物は細胞毒性物質であり、したがって本発明は細胞毒性物質を細胞に送達する方法として使用することができる。所定の化合物にはまた、複合MMPを発生させるのに有用であり、新しいMMPの同定のためのタンパク質を検出できる検出可能なタンパク質が包含される。検出可能なタンパク質には、GFP、β−ガラクトシダーゼ、放射標識タンパク質およびビオチン化タンパク質、細胞に検出可能な表現型を付与できるタンパク質が包含される。
【0061】
本発明は、所定の化合物をインビトロ、エキソビボまたはインビボにおいて細胞内に送達するために使用できる。たとえば送達は、インビトロにおいては、複合したMPPと所定の化合物を細胞に細胞外添加することによって行われる。送達は、エキソビボにおいては、複合したMPPと所定の化合物を、患者から取り出した培養サンプルたとえば血液、組織または骨髄に細胞外または外因的に添加し、この処置されたサンプルを患者に戻すことによって行われる。インビボにおいては、送達は複合したMPPと所定の化合物を患者への経皮的投与、吸入、または注射によって行われる。
【0062】
本発明においては任意の型の細胞が使用できる。細胞は哺乳動物、細菌、ウイルスまたは酵母の起源とすることができる。細胞は腫瘍のスクリーニングに一般的に使用される培養細胞とすることができる。培養細胞の例にはCHO、HEK293T、HeLa およびNIH3T3が包含される。細胞はMPP複合体によるエキソビボ処置に適当な患者からの培養細胞で、患者に再導入される細胞とすることができる。細胞は処置される患者と同じ患者またはそれ以外の患者からの細胞であっても良い。
【0063】
MPPと所定の化合物との複合体からなる本発明の組成物は治療、予防、診断または研究の目的で使用される。組成物にはさらに、アジュバント、安定剤等、組成物の取り扱い、安定性および保存性を改良する添加物からなる。
【0064】
新規なMPPを同定する方法も本発明の一部である。膜透過性ペプチドを同定するための一方法は、配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)および検出可能なタンパク質たとえばGFP、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、このペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および/または細胞核内に局在するか否かを決定する。膜透過性ペプチドを同定する他の方法では、哺乳動物または酵母タンパク質の核局在配列に由来するか、またはそれと重複するペプチドと、検出可能なタンパク質たとえばGFP、β−ガラクトシダーゼ等からなるペプチド接合体を作り出し、ペプチド接合体を細胞に添加し、ペプチド接合体が細胞質および/または細胞核内に局在するか否かを決定する。
【0065】
アミノ酸に対しては次の略号を使用する。
AはAlaまたはアラニンを示す。
CはCysまたはシステインを示す。
DはAspまたはアスパラギン酸を示す。
EはGluまたはグルタミン酸を示す。
FはPheまたはフェニルアラニンを示す。
GはGlyまたはグリシンを示す。
HはHisまたはヒスチジンを示す。
IはIleまたはイソロイシンを示す。
KはLysまたはリジンを示す。
LはLeuまたはロイシンを示す。
MはMetまたはメチオニンを示す。
NはAsnまたはアスパラギンを示す。
PはProまたはプロリンを示す。
QはGlnまたはグルタミンを示す。
RはArgまたはアルギニンを示す。
SはSerまたはセリンを示す。
TはThrまたはスレオニンを示す。
VはValまたはバリンを示す。
WはTrpまたはトリプトファンを示す。
YはTyrまたはチロシンを示す。
タンパク質は左側にN−末端がくるように記載する。
【0066】
以下の略号を使用する。
「v/v」:容量対容量
「EYFP」:配列Glu−Tyr−Phe−Proのペプチドフラグメント
「ORF」:オープンリーディングフレーム
「PCR」:ポリメラーゼ連鎖反応
「CHO」:チャイニーズハムスター卵巣細胞
「HEK293T」:ヒト胚腎臓細胞
「HeLa」:上皮腺癌細胞
「NIH3T3」:スイスマウス胚線維芽細胞
「DMSO」:ジメチルスルホキシド
「FCS」:ウシ胎児血清
「DMEM」:ダルベッコの改良イーグル培地
「PBS」:リン酸緩衝食塩溶液
「BSA」:ウシ血清アルブミン
「C−末端」:カルボキシ末端
「N−末端」:アミノ末端
「PTD」:ペプチド形質導入ドメイン
「GPCR」:G蛋白共役受容体
「TM」:GPCRの膜貫通ドメイン
「T」:GPCRの細胞内ループ
「5HT2A」:セロトニン受容体2A
「mAb」:モノクローナル抗体
【0067】
【実施例】
実施例1 hPer1内のNLSの同定
プラスミドの構築
ここに記載するすべてのhPer1フラグメントは、EYFPへのインフレームC−末端融合体としてクローン化する。EYFP−hPer1 ORF、P1−NおよびP1−NX(図1A)はEcoRIおよびXhoI消化フラグメントをEYFP−C1ベクター(Clontech)に挿入して作り出される。他のフラグメントは完全長hPer1cDNAからPCR増幅し、EYFP−C1ベクターにサブクローニングした。各フラグメントの最初および最後の残基は図1Aに示す。すべての構築体は自動DNA配列決定によって確認した。
【0068】
細胞培養およびDNAトランスフェクション
CHO、HeLaおよび293T細胞を、10%ウシ胎児血清(FCS)、50単位/mLのペニシリン、50μgのストレプトマイシンおよび4mMのL−グルタミン酸を補充したダルベッコの改良イーグル培地(以下、完全DMEMと呼ぶ)中に37℃、5%CO2で維持する。細胞のトランスフェクションは2−ウエルのLab−Tekカバーグラス(Nunc Inc.)中でLIPOFECT−AMINETM(登録商標)試薬(Life Technologies)を用いて製造業者の説明書に従って行った。
【0069】
ペプチドおよびペプチドの内在化
ペプチドは商業ベースの業者(Bio Synthesis)によって合成された。ペプチドの内在化には、細胞を2−ウエルLab−Tekカバーグラス中2×105細胞/ウエルの濃度に取り一夜培養する。ペプチドをPBSで指示された濃度に希釈したDMSO中に溶解する。単層の細胞を適当なペプチド/PBS溶液と1μMの標準濃度において、とくにほかに指示がなければ室温(RT)で10分間インキュベートする。4℃の実験では、プロトコールはすべてのインキュベーションを4℃で固定操作が終了するまで実施した以外はすべて同一とした。
【0070】
免疫蛍光および顕微鏡検査
EYFP融合タンパク質の発現および細胞下局在の直接検出には、トランスフェクトされた細胞を直接固定しないで、またはPBS中4%(v/v)のホルムアルデヒドにより4℃で20分間固定し、ついで洗浄したのちに直接検査した。ビオチン化ペプチドの間接的な免疫検出には、固定した細胞をPBSで2回洗浄し、PBS中0.3%Triton X−100により4℃で20分間浸透させたのち、PBS中2%BSAで室温においてブロックした。ついで細胞をPBSで洗浄し、0.2% Tween 20に1:400で希釈し、PBS中室温で1時間、ストレプトアビジン−FITC(登録商標, Sigma)またはAlex 499(分子プローブ)とインキュベートした。2×5分間PBSで、ついで1回PBS中0.3% Triton X−100により室温で20分間洗浄した。一部の実験では、核をPBS中50ng/mLのHoechst 33258 (Sigma) または3μg/mLのプロピジウムヨウ化物で染色した。蛍光の細胞下局在をOlympus顕微鏡上で分析した。共焦点像はZeiss共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM phoibos 1000)で撮影した。
【0071】
PER1の核内移入がその重要な機能であることは周知であるが、標準的なプロフィル走査プログラムを用いたのではNLS候補は同定されなかった(Shearman, L.P.ら, Neutron 19, 1261−1269 (1997), Yagita, K.ら, Genes Dev. 14, 1353−1363 (2000))。hPER1のNLSを実験的に決定するためには、3つの完全長hPER1(P1−FL)を構築し、P1−N、P1−NMおよびP1−Cと命名した(図1A)。ついでこれらの構築体がCHO中の核に局在する能力を分析した。生存細胞中のhPER1の検出を促進するためにはEYEPタグを使用したが、N−末端Flagタグで作成されたhPER1構築体は同一の細胞学的分布パターン提供するのでhPER1融合タンパク質の局在には見かけ上寄与しなかった(データは示していない)。一過性のトランスフェクション後、P1−FLおよびP1−NMタンパク質の両者は、トランスフェクトした細胞の核にトランスフェクション後10時間までに発現したが、P1−NおよびP1−Cは細胞質中のみに蓄積した(図1B)。EYFPベクターの対照は核および細胞質の両者に分散した。これらの結果はhPER1中の機能性NLSが本発明者らにより領域Mと名づけられたP1−NおよびP1−Cの間に局在することを示すものである。
【0072】
さらにNLSを領域M(アミノ酸481−890)に局在化させるため、一連の8つの欠失構築体、P1−F1〜P1−F8を作り出し、各突然変異体の細胞下分布を、図1AおよびBに示すようにしてアッセイした。領域Mのアミノ酸581(P1−F2)から位置821(P1−F7)までの順次欠失によって核の局在化を生じた。更なるアミノ酸821から841(P1−F8)までの欠失は、トランスフェクトされた細胞内にEYFPベクターの対照の場合と類似の局在化パターンを有する分散性の蛍光パターンを生じた。これらのデータはNLSがアミノ酸821と890の間に存在し、M領域のC−末端に位置することを示している。この観察はhPER1アミノ酸830−845を含有する付加的なEYFP融合タンパク質P1−NLSの構築によって確認された。この領域はNLSとして機能すると思われる塩基性残基のストリングを含有する(Weis, K., Trends Biochem. Sci. 23, 185−189 (1998), Truant, R. & Cullen, B.R., Mol Cell Biol. 19, 1210−1217 (1999))。予想通り、P1−NLSはトランスフェクトされた細胞の100%に核局在を示した(図1B)。付加的な融合構築体における他のPER1領域では核の局在化は起こらなかった(データは示していない)。したがって本発明者らはhPER1のNLS(hPER1−NLS)はアミノ酸830−845内に局在すると結論した。興味深いことには構築体P1−F1はそれがNLSを含有するかどうかとは無関係に、密に細胞質への局在パターンを示し、この領域も細胞質局在ドメインを含んでまだ同定されていないという公表所見を支持している(Vielhaver, E.ら, Mol Cell Biol. 20, 4888−4899 (2000))。配列のアラインメントは、hPER1−NLSはヒトおよびマウスPER1タンパク質の間で保存されていることを示すが(図1A)、他のNLS候補または他のヒト、マウスもしくはショウジョウバエのPERでは保存されていなかった。本発明者らの研究の完了後に、Vielhaverら (2000) は本発明者らが同定した16アミノ酸配列を含有するさらに長いマウスPER1−NLSを同定し(Vielhaver, E.ら, Mol Cell Biol. 20, 4888−4899 (2000))、すなわち本発明者らの発見を支持している。
【0073】
実施例2 hPER1−NLSはMPPをコードする
3つの同定された遺伝子によりコードされたMPP(TAT, AntpおよびVP22)に共通な2つの特徴は、それらが核タンパク質に由来すること、およびそれらが塩基性アミノ酸残基から構成されることである(Lindgren, M.ら, Trends Pharmacol Sci. 3, 99−103 (2000))。hPER1も、そのNLSが塩基性アミノ酸に富んでいる核タンパク質である(SRRHHCRSKAKRSRHH, 図1参照)。これらの類似性が、本発明者らをhPER−NLSもMPPとして機能するか否かの決定に導くことになった。この仮説を試験するため、本発明者らは数種のN−末端ビオチン化ペプチド;hPER1−MPP、Flagに標的化したhPER1−MPP、Flagに標的化したTAT−PTD、Flag−Flag単独を合成した(下記表1参照)。
【0074】
【表1】
【0075】
ペプチドはそれらの細胞膜を透過する能力についてアッセイした。細胞内の局在を、ストレプトアビジンで標識したALEXA試薬による直接染色または抗−Flag mAbによる間接染色、ついで標識した二次抗体の添加によりアッセイした。培養細胞に10μMのhPER1−MPP、Flag−hPER1−MPPおよびFlag TAT−PTDペプチドを添加した場合、100%の細胞に迅速な透過が見出された(図2Aおよび図5)。いずれの検出法によっても、hPER1−MPP、Flag−タグ hPER1−MPPおよびFlagタグTAT−PTDは細胞質全体に分散性に分布しているのが観察されたが、核および核小体内に分離した焦点のようにみえる細胞下ドメイン内に濃縮されていた。これに反して、ビオチン化陰性対照ペプチド、Flag−FlagおよびhPER1領域に由来するいくつかの他のペプチドは、背景の染色とほとんど識別不可能であり、高濃度でも、核または核小体は染色されなかった(データは示していない)。共焦点顕微鏡検査を用いてFlag−タグhPER1−MPPの細胞内および核内染色、および陰性対照ペプチドは内在化されないことを確認した(図2A)。
【0076】
hPER1−MPPは細胞膜を迅速に透過し、TAT−PTDペプチドと類似の効率で核領域内に局在した(図2B)。同一の結果がCHO、HEK293T、HeLa、NIH3T3およびラットの一次表層ニューロンを用いて得られ(データは示していない)、細胞型依存性の透過を示した。
【0077】
hPER1−MPPの内在化は迅速に(5分以内に)、4℃および37℃においてもまた細胞膜を固定したのちにも、同じ効力で起こる(データは示していない)。すなわち、hPER1のアミノ酸配列830−845は融合タンパク質における核/核小体局在シグナルタンパク質として、ならびにMPPとして機能し、膜透過は旧来の受容体−仲介エンドサイトーシス機構に依存しない。
【0078】
実施例3 アルギニン7はhPER1−MPP活性に必須である
今日まで、MPPが細胞膜を横切る機構ならびに基本構造は明らかにされていなかった。したがって本発明者らは、膜透過の可能性に必須の性質を維持するために重要な鍵となる残基がhPER1−MPP内にあるか否かを探索することとした。本発明者らは、hPER1−MPP中の各アミノ酸を別個にアラニンに置換し(表2)、これらの突然変異ペプチドが、野生型hPER1−MPPに比較して、生存細胞を透過する能力についてアッセイした。
【0079】
【表2】
【0080】
図3に示すように、大部分の単一アラニン置換は野生型ペプチドに比べて、膜透過能にほとんど影響を示さない。しかしながら、アルギニン7をアラニンに変えると(R7A)、検出可能な細胞学的シグナルは、陰性対照ペプチドで観察される程度まで低下した。すなわち、アルギニン7のアラニンへの突然変異はhPER1−MPPの膜透過性を有意に低下させた。アルギニン7をグルタミン酸に変えたのちにも(R7E)同じことが観察された(データは示していない)。さらに、hPER1−MPPからN−末端セリンおよび2個のC−末端ヒスチジンを同時に欠失させると(hPER1−MPP13)、ペプチドの陽性膜透過の可能性に対してはほとんど全体的に作用を示さなかった(図3)。
【0081】
アルギニン7残基はhPER1−MPPの細胞透過能に重要な役割を果たしている。したがって、本発明者らはR7A突然変異が融合タンパク質P1−NLSの核局在に影響するかどうかを決定することを探索した。融合タンパク質、P1−R7A(アルギニン7がアラニンに突然変異)でトランスフェクトされたCHO細胞は、野生型P1−NLSに類似の強力な核染色を示した(データは示していない)。P1−R7A突然変異融合タンパク質においては、核局在は正常のようにみえるが、核小体への細胞下での標的化は破壊されている(データは示していない)。これらのデータは、膜透過性および核小体への標的化が単一のR7アミノ酸残基によって影響されることを示し、またhPER1−NLSの核転座は別個の異なる決定基を有することを示す。
【0082】
実施例4 hHPER1−MPPによる機能性分子の送達
MPPの特徴の一つはタンパク質およびペプチドを細胞内に運搬する能力である。本発明者らは、Fawellら 1994(Fawell, S.ら, Proc Natl Acad Sci USA 91, 664−668 (1994))に記載されたように、hPER1−MPPのβ−ガラクトシダーゼへのカップリングおよび培養液中の細胞への融合タンパク質の送達に成功した。しかしながら、MPPの機能的有用性をさらに拡大するため、本発明者らはhPER1−MPPを生理学的に関連する生物学的に活性なペプチドとの融合体について試験した。Wessおよび共同研究者(1993)らはGタンパク質共役型受容体(GPCR)スーパーファミリーの保存された膜貫通セグメント7(TM7)の機能的役割を提示している。TM7とともに、第三の細胞内ループ(I3)がGPCRカルシウムシグナリングにおいて重要な役割を果たしている(Wess, J.M.ら, EMBO J. 12, 331−338 (1993))が、細胞内ループ1および2(I1およびI2)は重要でなないように思われる。セロトニン受容体、5HT2Aを用いて、本発明者らはhPER1−MPPおよびTAT−PTDのI1およびTM7ドメインから設計されたペプチドとの融合での受容体を活性化する能力について実験的に試験した。ビオチン化ペプチドhPER1−MPP TM7、TAT−PTD TM7、hPER1−MPP I1、TAT−PTD I1、hPER−MPP、TAT−PTD、TM7またはI1を10μMの濃度で、5HT2A受容体CHO安定細胞系とインキュベートした、ペプチドの膜透過をストレプトアビジン−Alexa 594を用いて上述のようにアッセイした。図4Aに示すように、受容体シグナリングは、カルシウム応答のレベルで測定して、外因性セロトニン、hPER1−MPP TM7およびTAT−PTD TM7の添加により活性化された。しかしながら、TM7単独または他のいずれのペプチドもカルシウム応答を発生できなかった。さらに、hPER1−MPP TM7およびTAT−PTD TM7による受容体の活性化はペプチドの濃度に依存する(図4B)。活性化ペプチド、TM7、hPER1−MPPまたはTAT−PTDとの融合体の添加濃度を増大させると、用量依存的様式でカルシウム応答を生じる。TAT−PTD TM7は hPER1−MPP TM7よりも強力な5HT2A受容体のアクティベーターであるように思われる。この結果の簡単な説明は、TAT−PTD TM7が細胞質に hPER1−MPP TM7より多く局在している、またはhPER1−MPP TM7より大きな細胞透過能力を有するものであるが、本発明者らはそのようなことは観察しなかった。本研究室において、また hPER1−MPP をβ−アドレナリン性活性化ペプチドと融合させて使用して同様の結果を得た(データは公表していない)。これらのデータは hPER1−MPPが細胞膜を透過することを支持するのみでなく、それはタンパク質を細胞内コンパートメントに運搬し、生物学的なシグナル伝達現象を開始することを示すものである。
【0083】
実施例5 他の遺伝子コードされたMPPの同定
hPER1は転写調節に関与することを計画した核タンパク質であり、またこれまで天然に存在するタンパク質に由来するすべてのPTDは転写因子である(TAT, AntpおよびVP22)ことから、本発明者らは、ゲノム内に他のPTD配列が存在するか否かを探索した。この目的では、本発明者らは2つのアプローチを使用した。最初に本発明者らは、すべて既知のおよび可能性のあるNLSについてNCBIの非重複タンパク質データベースを探索した(表1, 10−17)。本発明者らはNLSアミノ酸配列に相当するペプチドを合成し、ペプチド形質導入についてアッセイした。表1および図5に示すように、合成した7つのペプチドの6つは、hPER1−PTDおよびTAT−PTDと類似の膜透過特性を示した。これらのタンパク質は、甲状腺ホルモン受容体α−1、ホメオボックスタンパク質HME1およびプロト癌遺伝子タンパク質ABL−1のヒトタンパク質に包含された。さらに(表1および図5)本発明者らは、これらのペプチド配列とGFPの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでCHOまたはHEK293T細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。
【0084】
本発明者らのPTDを同定する第二のアプローチは、NCBIの非重複タンパク質データベースコレクションを変性アルゴリズムによる探索を包含した(図5の脚注参照)。これらの探索パラメーターを用いて、本発明者らは533,291の配列を見出し、アルゴリズムの条件は129,169回(24%)満足された。本発明者らの探索を「転写因子、サイトカインまたはチロシンキナーゼ」のいずれかを包含するように限定すると、8280の転写因子タンパク質配列が同定され、そのアルゴリズムパターンは7374回(89%)生じ、2333のサイトカインタンパク質配列内にはそのパターンは450回(19%)生じ、2513のチロシンキナーゼタンパク質内ではそのパターンは843回(36%)生じた。アルゴリズムは核タンパク質内で最も頻繁に起こるので本発明者らは6つの「転写因子」配列についてPTDと推定されるペプチドを合成して、細胞内に透過するそれらの能力をアッセイした。表1の結果18−23行および図3Aに示すように、試験した6ペプチドの4つがhPER1−PTDおよびTAT−PTDに類似の膜透過性を示した。これらのタンパク質には2種のヒトタンパク質、HEN1/NSLC−1およびHEN2/NSLC−2が含まれ、ニューロンの分化および発達に関与すると報告されている(Uittenbogaad, M., Peavy, D.R. & Chiaramello, A., 1999)。bHLH遺伝子NSCL1の発現は小脳顆粒細胞の成長および分化の役割が示唆されている(J. Neurosci. Res. 57: 770−781; Lipkowitz, S.ら, 1992)。ヒトNSCL−1およびNSCL−2遺伝子の比較構造特性。2つの塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス遺伝子は発達中の神経系(J. Biol. Chem. 267: 21065−21071)、ラットHNF−3(17)およびショウジョウバエcAMP依存性転写因子(18)で発現した。さらに、本発明者らこれらのペプチドとこれらのペプチドとGFPの間にインフレームな融合タンパク質を創製し、ついでCHOまたはHEK293T細胞にトランスフェクトした場合、すべての配列は融合タンパク質に核局在性を付与した。これらの結果はPTD配列がNLS内にまたはそれと重複して見出されることを示している。しかしながら、すべてのNLSは、SV40、hPER2、C−FOS、Cyclin L ania−6およびβZip転写因子NLSにおいて明らかなようにPTDではない(表1)。これらの結果はまたPTD配列がゲノムを通じて広く、とくに核タンパク質において使用されていることを示唆するものである。
【0085】
実施例6 β−ガラクトシダーゼを有するhPER−PTD
HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞または組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らは、hPER1形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを探索した。この実験を行うためには、本発明者らはFrankelら(PNAS 1989 (19): 7397−401)のプロトコールに従い、hPER1−PTDまたはhPER−PTD R7A(Arg7をAlaで置換)を完全長β−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体およびβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独をCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図6のパネル1に示すように、hPER−PTDとβ−ガラクトシダーゼの融合体とインキュベートした細胞はX−galの添加後青色の着色によって示されるように、β−ガラクトシダーゼに対し陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼもβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独も、X−galの添加後に青色に染色される反応性により示されないように、細胞を入れることができなかった(パネル2および3)。これらのデータは、TATペプチドと同様、hPER1−PTDは大きな(120kD)タンパク質を細胞内に運搬できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【図1A】
PASの位置、細胞質の局在、および核局在配列(NLS, ただし図中には核局在ドメイン(NLD)として示した) を示すhPER1融合構築体の模式図。融合構築体の名称および位置は左側に示す。数はhPER1タンパク質の最初および最後のアミノ酸残基である。各融合タンパク質の主要な蓄積部位は右側にまとめる。(n)核、(no)核小体、(c)細胞質、(diff)散在性。すべての構築体はN−末端にEYFPをタグした。ヒトおよびマウスPER1−NLSのアラインメントは最下部に示す。
【図1B】
図1Aに記載のhPER1融合タンパク質の生存細胞における細胞性局在。CHO細胞は各パネルの最上部に示した融合構築体によって一過性にトランスフェクトし、EYFPレポーター(緑)細胞下局在をトランスフェクト10時間後に蛍光顕微鏡法により可視化した。対照としてはEYFPベクター単独を用いた(5. EYFPベクター参照)。
【図2A】
CHO細胞における膜透過性アッセイ。N−末端をビオチン化した合成ペプチド、hPER1−PTD、Flag−hPER−PED、Flag−TAT−PTD(陽性対照)およびFlag−Flag(陰性対照)を、培養液中の生存CHO細胞における細胞膜の透過能についてアッセイした。内在化したペプチドの細胞下局在はストレプトアビジン−Alexa 594(赤)または抗−flag mAb(緑)のいずれかによる二色染色法を用いて決定した。第三のカラムはオーバーレイ(黄色)である。さらに、細胞内および核内局在を確認するためには共焦点顕微鏡を用いた。共焦点造影の単一セクションを示す。
【図2B】
ビオチン化ペプチド, hPER1−NLD(hPER1−PTDとしても知られる)の核標的化を、ストレプトアビジン−Alexa 594蛍光(緑)を用いてTAT−PTDおよび Flag−Flag(陰性対照)と比較した。核の染色には5ng/mLのHoechst 33258(青、中央のカラム)を用いた。第三カラムは共焦点造影のオーバーレイである。
【図3】
hPER1−PDTのアラニン走査。ビオチン化hPER1−NPDは指示した位置をアラニンの単一アミノ酸残基置換により合成し、CHO細胞における膜透過をアッセイした。細胞はペプチド濃度10μM, 37℃において10分間インキュベートしたのち、洗浄、固定し、透過性にして、標識ストレプトアビジン Alexa−594(赤, 2μg/mL)によりRTで15分間検出した。対照ペプチドはhPER1 N−末端アミノ酸残基486−500とした。
【図4A】
セロトニン5HT2A受容体とhPER1−MPP融合ペプチドによる活性化のhPER1−MPPおよびTAT−PTDペプチドは単独でまたは第一の細胞内ループI1(SLEKKLQNATN)もしくは5HT2A受容体、遺伝子アクセス番号 M86841)由来のC−末端膜貫通7ドメインTM7(KTYRSAFSRYIQYKENKKPLQLI)のいずれかと融合させて合成した。受容体の活性は標準FLIPR分析を用いて、外因性および内因性Ca+2レベルをアッセイした。ペプチドの名称は次の通りである:T(TAT−PTD)、P(hPER−MPP)、I1(細胞内ループ1)、T−I1(TAT−PTD−II)、P−I1(hPER1−MPP−I1)、TM7 (C−末端ドメイン)、TTM7 (TAT−PTD−TM7)、PTM7(hPER1−MPP−TM7)およびS (セロトニン)。
【図4B】
PTM7(黒丸)およびTTM7(黒菱形)ペプチドの用量反応。セロトニン(対照、白三角)は10μMの最大受容体刺激濃度で使用した。
【図5A】
付加的PTDの同定。PTDの候補配列は、キーワードとして「転写因子」と注釈された遺伝子バンク中のタンパク質コード領域から翻訳されたペプチド配列で、SwissPro, PRF, PIR−Protein info Resource, PDBを含む複合バイオインフォーマティクス法を用いて探索した。本発明者らは最初はすべて既知または候補NLSについて探索した。第二に本発明者らは変性パターンの発生 [R/H/K]−[R/H/K]−[R/H/K]−[R/H/K]を探索するためPHI−BLAST(Pattern−Hit Initiate BLAST)、(X)n(式中、nは4またはそれ以上の整数であり、Xは常に独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される)を採用した。7374の候補PTD配列が見出された。2つの探索から本発明者らは(A)これらの配列に対するビオチン化ペプチドを合成し、または(B)GFPとのインフレーム融合タンパク質を創製し、CHO細胞にトランスフェクトした。12のペプチド中の9つは形質導入され、すべての配列がトランスフェクトされた細胞中の核に局在することが見出された。hPER1−PTD、hPER3−PTDおよびTAT−PTDペプチドを陽性対照として使用した。6つの陽性配列と2つの陰性配列が示された。数は母体タンパク質配列内のアミノ酸残基数、およびこれらのタンパク質についての遺伝子バンク受入番号を以下に示すように表す。すなわち (M24899, ヒト甲状腺ホルモンα−1;L12699, ヒトHomeoboxタンパク質Engrailed 1 HEME1;X16416, ヒトプロト癌遺伝子チロシンプロテインキナーゼABL1;Q02575 ヒトHEN1/NSLC1;Q02577, ヒトHEN2/NSLC2;AAA74561, ラットHNF3;CAB65887, ショウジョウバエcAMP依存性転写因子)。3つの陰性ペプチドは(V01512, c−Fos;AAD53184, ヒト cyclin L ania−6a;CAB66914, Arabindopsis β−zip転写因子)である。
【図5B】
図5Aの続きである。
【図6】
hPER−PTDはβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬する。HIV TAT形質導入ペプチドの少なくとも一つの特徴は細胞および組織にタンパク質を運搬するその能力である。したがって、本発明者らはhPER1形質導入ペプチドがβ−ガラクトシダーゼを細胞内に運搬できるか否かを決定すること追求した。この実験を実施するためには本発明者らはFrankelら(1989, (19): 7397−401)によるプロトコールに従い、hPER1−PTDまたはhPER−PTD R7Aを完全長のβ−ガラクトシダーゼに化学的に連結し、これらの接合体またはβ−ガラクトシダーゼ単独がCHO細胞に形質導入する能力をアッセイした。図6の左側に示すように、hPER−PTDβ−ガラクトシダーゼの融合は、X−galの添加後の細胞に青色によって示されるようにβ−ガラクトシダーゼについて陽性の酵素活性を示した。しかしながら、hPER−MPP R7Aβ−ガラクトシダーゼ(中央)のみならずβ−ガラクトシダーゼタンパク質単独(右側)でもX−gal添加後に青色の染色反応を示さないように、細胞内に入ることはできなかった。
Claims (21)
- 所定の化合物に結合した膜透過性ペプチドからなる所定の化合物を細胞内に送達するための融合タンパク質。
- 膜透過性ペプチドは、核局在化配列ペプチドに由来するか、哺乳動物もしくは酵母タンパク質の核局在化配列と重複するか、または配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、それぞれの場合Xは独立にアルギニン、ヒスチジンもしくはリジンからなる群より選択される)からなる請求項1記載の融合タンパク質。
- 核局在化配列は核タンパク質または転写因子に由来する請求項2記載の融合タンパク質。
- 転写因子はPeriodタンパク質である請求項3記載の融合タンパク質。
- Periodタンパク質はヒトPeriodタンパク質である請求項4記載の融合タンパク質。
- 哺乳動物Periodタンパク質はヒトPeriod1タンパク質である請求項5記載の融合タンパク質。
- 膜透過性ペプチドは配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、それぞれの場合Xは独立にアルギニン、ヒスチジンもしくはリジンからなる群より選択される)からなる、請求項2記載の融合タンパク質。
- nは1〜4の整数である請求項7記載の融合タンパク質。
- nは1〜2の整数である請求項8記載の融合タンパク質。
- 所定の化合物はペプチド、タンパク質、化学物質、核酸またはそれらの任意の修飾された形態である請求項1記載の融合タンパク質。
- 請求項1記載の融合タンパク質を細胞と接触させることからなる、所定の化合物を細胞内に送達する方法。
- 請求項1記載の融合タンパク質を培養細胞と接触させることからなる、所定の化合物をインビトロで細胞内に送達する方法。
- 請求項1記載の融合タンパク質を細胞と接触させ、この細胞を患者生体内の細胞に導入することからなる、所定の化合物をエキソビボで細胞内に送達する方法。
- 請求項1記載の融合タンパク質を患者に投与することからなる、所定の化合物をインビボで細胞内に送達する方法。
- 配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)と検出可能なタンパク質からなる複合ペプチドを作成し、その複合ペプチドを細胞に外因的に加え、その複合ペプチドが細胞の細胞質および/または核に局在するか否かを決定することからなる、配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)からなる膜透過性ペプチドを同定する方法。
- 核局在化配列の部分またはすべてと検出可能なタンパク質からなる複合ペプチドを作成し、その複合ペプチドを細胞に外因的に加え、その複合ペプチドが細胞の細胞質および/または核に局在するか否かを決定することからなる、哺乳動物または酵母タンパク質の核局在化配列に由来またはそれと重複する配列からなる膜透過性ペプチドを同定する方法。
- 請求項1記載の融合タンパク質を細胞に投与することからなり、ここで、膜透過性ペプチドは配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)からなる、所定の化合物を細胞内に送達する方法。
- 融合タンパク質が配列−(X−X−X−X)n−(式中、nは1〜7の整数であり、Xはそれぞれ独立にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンからなる群より選択される)からなる膜透過性ペプチドと所定の化合物とからなる、所定の化合物を細胞内に送達するための融合タンパク質。
- 所定の化合物は、膜透過性ペプチドに直接化学的にまたはリンカーにより結合させたものである請求項18記載の融合タンパク質。
- リンカーはアミノ酸リンカーまたはポリペプチドリンカーである請求項19記載の融合タンパク質。
- 膜透過性タンパク質は組換え技術、化学合成または前駆体タンパク質の分解により産生されたものである請求項18記載の融合タンパク質。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22764700P | 2000-08-25 | 2000-08-25 | |
US60/227,647 | 2000-08-25 | ||
GBGB0103110.3A GB0103110D0 (en) | 2000-08-25 | 2001-02-07 | A membrane penetrating peptide encoded by a nuclear localization sequence from human period 1 |
GB0103110.3 | 2001-02-07 | ||
PCT/US2001/026421 WO2002018572A2 (en) | 2000-08-25 | 2001-08-23 | Membrane penetrating peptides and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004512275A true JP2004512275A (ja) | 2004-04-22 |
JP4896356B2 JP4896356B2 (ja) | 2012-03-14 |
Family
ID=22853919
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002524075A Expired - Lifetime JP4896356B2 (ja) | 2000-08-25 | 2001-08-23 | 膜透過性ペプチドおよびその使用 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20030229202A1 (ja) |
JP (1) | JP4896356B2 (ja) |
KR (1) | KR100810927B1 (ja) |
AR (1) | AR033834A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0113477B8 (ja) |
DE (1) | DE60133585T2 (ja) |
GB (1) | GB0103110D0 (ja) |
IL (1) | IL154589A (ja) |
TW (1) | TWI317737B (ja) |
ZA (1) | ZA200301476B (ja) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009544688A (ja) * | 2006-07-24 | 2009-12-17 | フォーヒューマンテック カンパニー リミテッド | 虚血性疾患の緩和及び治療のための医薬組成物並びにそれを伝達するための方法 |
JP2009545312A (ja) * | 2006-08-03 | 2009-12-24 | インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション,ヨンセイ ユニバーシティ | 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 |
JP2011514160A (ja) * | 2008-02-21 | 2011-05-06 | バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ | C末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質に関する方法および組成物 |
JP2011229495A (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-17 | Adeka Corp | 細胞への水溶性高分子量物質の導入方法及び導入剤 |
WO2011148996A1 (ja) * | 2010-05-25 | 2011-12-01 | 国立大学法人熊本大学 | 物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法 |
JP2012530787A (ja) * | 2009-06-22 | 2012-12-06 | バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ | C末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質を使用する方法および組成物 |
JP2013100273A (ja) * | 2011-10-13 | 2013-05-23 | Tottori Univ | 新規細胞膜透過ペプチド |
JP5858283B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
JP5858284B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメントとその利用 |
JP5858285B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8128922B2 (en) * | 1999-10-20 | 2012-03-06 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen |
KR20030062788A (ko) * | 2002-01-19 | 2003-07-28 | 포휴먼텍(주) | 생체분자 전달 펩타이드 mph1-btm 및 이것을포함하는 생명공학제품 |
AU2003214625A1 (en) * | 2002-04-08 | 2003-10-27 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Histone conjugates and uses thereof |
WO2004098526A2 (en) | 2003-05-05 | 2004-11-18 | Johns Hopkins University | Anti-cancer dna vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein |
CA2526490C (en) * | 2003-05-19 | 2014-03-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compositions and methods for treating and preventing heart tissue degeneration, and uses thereof |
JP2007505621A (ja) * | 2004-04-13 | 2007-03-15 | メドトロニック・ソファモア・ダネック | 骨誘導タンパク質及びペプチドの細胞内送達 |
CA2660661A1 (en) * | 2005-09-26 | 2007-04-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Side population cells in cardiac repair |
US7723299B2 (en) * | 2005-11-04 | 2010-05-25 | Forhumantech. Co., Ltd. | Methods for treating rheumatoid arthritis using a CTLA-4 fusion protein |
KR20090045940A (ko) * | 2006-08-29 | 2009-05-08 | 포휴먼텍(주) | 세포자멸사의 억제를 위한 약학 조성물, 및 이를 전달하는 방법 |
US7981446B2 (en) * | 2007-11-26 | 2011-07-19 | Forhumantech. Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods for delivering nucleic acids into cells |
EP2236514B1 (en) * | 2008-01-25 | 2013-04-03 | Toagosei Co., Ltd | Artificial peptide and use thereof |
WO2010117079A1 (ja) | 2009-04-10 | 2010-10-14 | 東亞合成株式会社 | 神経分化誘導ペプチド及びその利用 |
US20110033389A1 (en) * | 2009-04-29 | 2011-02-10 | Zhifeng Chen | Modified antibodies for passive immunotherapy |
EP2497784B1 (en) | 2009-11-02 | 2016-01-06 | Toagosei Co., Ltd | Peptide capable of promoting cell proliferation, and use thereof |
US8822408B2 (en) | 2010-06-04 | 2014-09-02 | Toagosei Co., Ltd. | Cell growth-promoting peptide and use thereof |
US9238796B2 (en) | 2010-06-04 | 2016-01-19 | Toagosei Co. Ltd. | Cell growth-promoting peptide and use thereof |
JP6066222B2 (ja) | 2012-05-28 | 2017-01-25 | 東亞合成株式会社 | 抗菌ペプチド及びその利用 |
US20140072961A1 (en) * | 2012-07-11 | 2014-03-13 | University of Nevada, Las Vegas | Method of Genome Surgery with Paired, Permeant Endonuclease Excision |
US9480727B2 (en) | 2012-10-18 | 2016-11-01 | Toagosei Co. Ltd. | Synthetic peptide for inhibiting expression of type 2 TNF receptor and use thereof |
EP2945964A2 (en) * | 2013-01-18 | 2015-11-25 | Glycotope GmbH | Fusion peptides for enhancing protein expression |
CA2933561A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | Life Technologies Corporation | Membrane-penetrating peptides to enhanced transfection and compositions and methods for using same |
US10456475B2 (en) | 2015-02-03 | 2019-10-29 | Kennsaw State University Research and Service Foundation, Inc. | Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine |
WO2016136708A1 (ja) | 2015-02-27 | 2016-09-01 | 学校法人常翔学園 | 膜透過性ペプチドを側鎖に有する高分子化合物 |
CN107207627B (zh) | 2015-02-27 | 2022-05-24 | 学校法人常翔学园 | 具有膜透过性肽链的多糖衍生物 |
US10435446B2 (en) | 2015-06-03 | 2019-10-08 | Kennesaw State University Research and Service Foundation Inc. | Cell penetrating protein adaptor molecules and their application in research and medicine |
WO2017136534A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Kennesaw State University Researcha And Service Foundation, Inc. | Signal molecules as cell penetration agents |
KR20200030063A (ko) | 2017-06-22 | 2020-03-19 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 변형된 막 유형 세린 프로테아제 1(mtsp-1) 폴리펩티드 및 사용 방법 |
US20210087231A1 (en) * | 2018-02-06 | 2021-03-25 | University Of Maryland, Baltimore | Tlr9 inhibitors to suppress inflammatory response to pathogens |
US20220009968A1 (en) * | 2018-12-27 | 2022-01-13 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University | Crispr-cas-based composition for gene correction |
KR102386498B1 (ko) * | 2018-12-27 | 2022-04-15 | 한양대학교 산학협력단 | Crispr-cas를 기반으로 하는 유전자 교정용 조성물 |
US11613744B2 (en) | 2018-12-28 | 2023-03-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use |
MX2021007843A (es) | 2018-12-28 | 2021-08-11 | Vertex Pharma | Polipeptidos de activador de plasminogeno, tipo urocinasa, modificados y metodos de uso. |
CN110441156A (zh) * | 2019-07-20 | 2019-11-12 | 大连理工大学 | 一种基于土体稳定状态特性测量三轴试样膜嵌入量的方法 |
CN114716569B (zh) * | 2022-04-13 | 2023-11-10 | 浙江大学 | 一种携带目标蛋白自主进入真核细胞的重组蛋白、重组表达载体和重组菌及应用 |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5804604A (en) | 1989-12-21 | 1998-09-08 | Biogen, Inc. | Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins |
US5674980A (en) | 1989-12-21 | 1997-10-07 | Biogen Inc | Fusion protein comprising tat-derived transport moiety |
US6316003B1 (en) | 1989-12-21 | 2001-11-13 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Tat-derived transport polypeptides |
US6197925B1 (en) * | 1991-08-22 | 2001-03-06 | Sara Lee Corporation | NF-AT polypeptides and polynucleotides |
US5843643A (en) * | 1992-02-21 | 1998-12-01 | Ratner; Paul L. | Site-specific transfection of eukaryotic cells using polypeptide-linked recombinant nucleic acid |
US5766903A (en) | 1995-08-23 | 1998-06-16 | University Technology Corporation | Circular RNA and uses thereof |
WO1998006828A1 (fr) * | 1996-08-09 | 1998-02-19 | Dnavec Research Inc. | Phage lie au signal de localisation nucleaire |
US5877282A (en) | 1996-09-20 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Peptide inhibitors of nuclear protein translocation having nuclear localization sequences and methods of use thereof |
US5962415A (en) | 1996-09-20 | 1999-10-05 | Bristol-Myers Squibb Co. | Compositions comprising a peptide inhibitor of nuclear protein translocation and an immunosuppressant and methods of use thereof |
US5929042A (en) | 1997-03-03 | 1999-07-27 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Antisense compounds which prevent cell death and uses thereof |
WO1998049325A1 (en) | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Mcgill University | Reporter fusion proteins, expression vectors and transfected cell lines thereof for the analysis of nuclear transport |
FR2767323B1 (fr) | 1997-08-12 | 2001-01-05 | Synt Em | Peptides lineaires derives de peptides antibiotiques, leur preparation et leur utilisation pour vectoriser des substances actives |
US6258774B1 (en) | 1998-03-19 | 2001-07-10 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Carrier for in vivo delivery of a therapeutic agent |
SE9801055D0 (sv) * | 1998-03-25 | 1998-03-25 | Inst Of Molecul & Cell Biology | Use of growth hormone binding protein (GHBP) |
US6248558B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-06-19 | Vanderbilt University | Sequence and method for genetic engineering of proteins with cell membrane translocating activity |
US6436628B1 (en) * | 1998-06-19 | 2002-08-20 | The Rockefeller University | Methods of identifying an agent which modulates period and doubletime protein interaction |
CA2337680A1 (en) | 1998-07-13 | 2000-01-20 | Expression Genetics, Inc. | Polyester analogue of poly-l-lysine as a soluble, biodegradable gene delivery carrier |
US6246558B1 (en) * | 1998-08-24 | 2001-06-12 | Leviton Manufacturing Company | Circuit interrupting device with reverse wiring protection |
FR2786397B1 (fr) | 1998-11-30 | 2003-01-10 | Synt Em | Vecteurs peptidiques de substances a travers la barriere hematoencephalique pour etre utilises dans le diagnostic ou la therapie d'une affection du snc |
FR2786398B1 (fr) | 1998-11-30 | 2002-12-27 | Synt Em | Composition pharmaceutique anti-cancereuse et anti-chimioresistance comprenant un agent anticancereux et au moins un peptide |
WO2000075669A1 (en) * | 1999-06-08 | 2000-12-14 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Screening methods for altering circadian rhythm proteins |
AU785007B2 (en) | 1999-11-24 | 2006-08-24 | Mcs Micro Carrier Systems Gmbh | Polypeptides comprising multimers of nuclear localization signals or of protein transduction domains and their use for transferring molecules into cells |
JP3908425B2 (ja) * | 1999-12-24 | 2007-04-25 | アルパイン株式会社 | ナビゲーション装置 |
WO2001093836A2 (en) | 2000-06-09 | 2001-12-13 | Teni Boulikas | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes |
JP3686961B2 (ja) * | 2000-08-04 | 2005-08-24 | シャープ株式会社 | 液晶表示装置及びそれを用いた電子機器 |
JP2002304088A (ja) * | 2001-04-09 | 2002-10-18 | Ricoh Co Ltd | 画像形成装置 |
WO2003064609A2 (en) * | 2002-01-29 | 2003-08-07 | Aventis Pasteur, Ltd. | Targeted immunogens |
US6877262B2 (en) * | 2003-07-10 | 2005-04-12 | Ronald Bianco | Perpetual calendar |
DE10341112A1 (de) * | 2003-09-05 | 2005-03-31 | Li-Li Yehhsu | Behälter mit separaten Speicherkammern |
KR20060129353A (ko) * | 2003-12-31 | 2006-12-15 | 사노피 파스퇴르 인크 | 표적화된 면역원 |
-
2001
- 2001-02-07 GB GBGB0103110.3A patent/GB0103110D0/en not_active Ceased
- 2001-08-21 US US09/933,780 patent/US20030229202A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-23 KR KR1020037002754A patent/KR100810927B1/ko active IP Right Grant
- 2001-08-23 DE DE60133585T patent/DE60133585T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-23 BR BRPI0113477 patent/BRPI0113477B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-08-23 JP JP2002524075A patent/JP4896356B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-24 AR ARP010104056A patent/AR033834A1/es not_active Application Discontinuation
- 2001-08-24 TW TW090120788A patent/TWI317737B/zh not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-02-23 IL IL154589A patent/IL154589A/en active IP Right Grant
- 2003-02-24 ZA ZA200301476A patent/ZA200301476B/en unknown
-
2005
- 2005-10-17 US US11/251,734 patent/US7754678B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
JPN6011000973, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1994) vol.91, no.2, p.664−668 * |
JPN6011000975, Trends Cell Biol. (Jul 2000) vol.10, no.7, p.290−295 * |
JPN6011000987, Curr. Opin. Chem. Biol. (1999) vol.3, no.1, p.89−94 * |
JPN6011000988, Mol. Cell. Biol. (Jul 2000) vol.20, no.13, p.4888−4899 * |
JPN6011000989, 第14回生体機能関連化学シンポジウム講演要旨集 (1999) p.168−169(1P530) * |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009544688A (ja) * | 2006-07-24 | 2009-12-17 | フォーヒューマンテック カンパニー リミテッド | 虚血性疾患の緩和及び治療のための医薬組成物並びにそれを伝達するための方法 |
JP2009545312A (ja) * | 2006-08-03 | 2009-12-24 | インダストリー−アカデミック コーポレーション ファウンデーション,ヨンセイ ユニバーシティ | 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 |
JP2011514160A (ja) * | 2008-02-21 | 2011-05-06 | バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ | C末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質に関する方法および組成物 |
US11260133B2 (en) | 2008-02-21 | 2022-03-01 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Methods and compositions related to peptides and proteins with C-terminal elements |
JP2012530787A (ja) * | 2009-06-22 | 2012-12-06 | バーナム インスティテュート フォー メディカル リサーチ | C末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質を使用する方法および組成物 |
JP5858283B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
JP5858285B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメント及びその利用 |
JP5858284B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2016-02-10 | 東亞合成株式会社 | キャリアペプチドフラグメントとその利用 |
JP2011229495A (ja) * | 2010-04-30 | 2011-11-17 | Adeka Corp | 細胞への水溶性高分子量物質の導入方法及び導入剤 |
JPWO2011148996A1 (ja) * | 2010-05-25 | 2013-07-25 | 国立大学法人 熊本大学 | 物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法 |
US9394535B2 (en) | 2010-05-25 | 2016-07-19 | National University Corporation Kumamoto University | Plasma irradiation device for substance introduction and substance introduction method using plasma irradiation device |
JP6044032B2 (ja) * | 2010-05-25 | 2016-12-14 | 国立大学法人 熊本大学 | 物質導入用プラズマ照射装置を用いた物質導入方法 |
WO2011148996A1 (ja) * | 2010-05-25 | 2011-12-01 | 国立大学法人熊本大学 | 物質導入用液体培地及び細胞内への物質導入方法 |
JP2013100273A (ja) * | 2011-10-13 | 2013-05-23 | Tottori Univ | 新規細胞膜透過ペプチド |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR0113477A (pt) | 2004-04-20 |
BRPI0113477B1 (pt) | 2019-10-22 |
GB0103110D0 (en) | 2001-03-28 |
IL154589A (en) | 2011-08-31 |
TWI317737B (en) | 2009-12-01 |
US20060100134A1 (en) | 2006-05-11 |
DE60133585T2 (de) | 2009-06-04 |
DE60133585D1 (de) | 2008-05-21 |
KR20030034156A (ko) | 2003-05-01 |
KR100810927B1 (ko) | 2008-03-10 |
AR033834A1 (es) | 2004-01-07 |
JP4896356B2 (ja) | 2012-03-14 |
US7754678B2 (en) | 2010-07-13 |
BRPI0113477B8 (pt) | 2021-05-25 |
US20030229202A1 (en) | 2003-12-11 |
ZA200301476B (en) | 2004-06-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4896356B2 (ja) | 膜透過性ペプチドおよびその使用 | |
EP1360311B1 (en) | Membrane penetrating peptides and uses thereof | |
Lindgren et al. | Cell-penetrating peptides | |
Wen et al. | Identification of a signal for rapid export of proteins from the nucleus | |
KR100608558B1 (ko) | 세포질 잔류성 세포막 투과 펩타이드 및 이의 용도 | |
US10131888B2 (en) | Intracellular protein delivery | |
Yang et al. | HIV‐1 TAT‐mediated protein transduction and subcellular localization using novel expression vectors1 | |
KR101964863B1 (ko) | 세포막 투과 펩티드 및 이를 포함하는 세포내 전달체 | |
WO2021004539A1 (zh) | 用于胞内递送分子的复合物 | |
US7709606B2 (en) | Interacting polypeptide comprising a heptapeptide pattern and a cellular penetration domain | |
KR101636538B1 (ko) | 인간 NLBP 유래의 NP2 폴리펩티드 또는 dNP2 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 | |
AU2001285249B2 (en) | Membrane penetrating peptides and uses thereof | |
US20210253655A1 (en) | Polypeptides, nucleic acid molecules, compositions, and related methods | |
CA3122428A1 (en) | Transmembrane domain derived from human lrrc24 protein | |
AU2001285249A1 (en) | Membrane penetrating peptides and uses thereof | |
KR20080012437A (ko) | 세포막투과 전달 펩타이드 및 이를 포함하는 생물제제 | |
KR100374050B1 (ko) | 세포침투성 융합단백질, 이를 코딩하는 재조합폴리뉴클레오타이드 및 발현벡터 | |
Lin et al. | The J-Domain of heat shock protein 40 can enhance the transduction efficiency of arginine-rich cell-penetrating peptides | |
Stankiewicz | Protein semi-synthesis in vivo | |
KR20140046996A (ko) | 인간 nlbp 유래의 np12 폴리펩티드 또는 np21 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 | |
Glodowski | Characterization of the nuclear import of the matrix protein from vesicular stomatitis virus | |
Henry | Characterization of biological targets of Nedd4: ENaC and commissureless | |
Rayala | Understanding the role of hGle1 in mRNA export | |
Beerens | Intercellular spread of the transgene product to improve the efficiency of cancer gene therapy | |
KR20140046995A (ko) | 인간 nlbp 단백질 유래의 np1 폴리펩티드를 포함하는 세포 투과 펩티드 및 이를 이용한 카고 전달 시스템 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080619 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20090225 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20090729 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100604 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110118 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110418 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110628 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110922 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111213 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20111221 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4896356 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150106 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |