JP2004510147A - 高密度アレイ - Google Patents

Abstract

本発明は、さまざまな密度のアレイ、中でも高密度アレイの製造法を提供する。一般に、この方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。印刷ステップでは、受容体分子を含む所定体積の試薬溶液を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一実施態様では、受容体分子を光反応剤で誘導体化する。別の実施態様では、固体支持体が光反応剤を備える。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である。照射ステップでは、光反応基に照射を行なって受容体分子を固体支持体に固定化する。一実施態様では、中心間距離（すなわち“ピッチ”）は印刷されたスポットと同じだが直径がスポットの直径よりも小さい開口部を有するマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。マスクは、印刷されたスポットよりも小さな直径の領域を照射できるようなものが好ましい。したがって本発明によれば、固定化される試薬スポットは、印刷された元のスポットよりも直径が小さくなる。別の実施態様では、照射ステップを、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。望むのであれば、このプロセス全体を複数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。

Description

【０００１】
本出願は、サーモディックス社（アメリカ合衆国の会社）を出願人とし、２００１年９月６日にＰＣＴ国際特許出願としてアメリカ合衆国を除くすべての国を指定して出願されたものである。
【０００２】
発明が属する技術分野
本発明は、固体支持体表面への核酸の固定化に関する。さらに詳細には、本発明は高密度核酸アレイに関する。
【０００３】
発明の背景
マイクロアレイは、さまざまな核酸配列を表面に固定化した小面積の物体（一般に２〜３ｃｍ^２のシリコン・ウエファーまたはガラス・スライド）である。一般に、核酸は、核酸のインサイチュ固相合成または共有結合固定化により、表面上の正確な位置に固定化される。核酸は、相補的な核酸配列を検出するためのプローブとして機能する。アレイは、固定化された核酸を数百〜数千個備えることができる。密なアレイは、１平方センチメートル当たり１０００個を超える核酸配列を有する。
【０００４】
マイクロアレイを使用するときには、蛍光標識したＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（合成されたもの、または興味の対象となる細胞から得られたもの）をそのアレイと接触させる。蛍光標識した断片のハイブリダイゼーション・パターンから、豊富な情報が得られる。
【０００５】
マイクロアレイは、１つの細胞に含まれる多数の遺伝子の発現を一度に追跡する能力を有するため、研究者は数千個の遺伝子の挙動を同時に見ることができる。したがって、アレイは診断に役立つ。独特な遺伝子発現パターンが検出されると、ガン、アルツハイマー病、骨粗鬆症、心臓病などの疾患にかかったことを医師が指摘する際の助けになる。アレイは、どの遺伝子が特定の疾患において活性化しているかを理解するのにも役立つ。アレイは、病因の同定、法医学への応用、ｍＲＮＡの発現の観察、新規なシークエンシングにも役立つ。例えば、ＬｉｐｓｈｕｔｚらのＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１９巻（３）、４４２〜４４７ページ、１９９５年を参照のこと。
【０００６】
マイクロアレイは、さまざまな方法で製造することができる。例えば、さまざまなオリゴヌクレオチドを固相合成によってアレイ表面に作り出すことができる。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／１００９２号（アフィマックス・テクノロジーズＮ．Ｖ．社）を参照のこと。固相合成によって比較的高密度のアレイを製造できるとはいえ、核酸配列の長さは限られている。現在の技術では、核酸の合成を行なうすべての付加ステップにおいて配列の間違いや配列の切断がいくつか発生するのが一般的である。しかしインサイチュ固相合成によって製造したオリゴヌクレオチド・マイクロチップでは、合成後の精製（例えばＨＰＬＣ）は不可能である。したがって、このようなアレイは、エラーの量が制限されるよう、一般に比較的短い核酸配列（約２０マー）にする。
【０００７】
別の方法として、マイクロアレイは、既存の核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物）をアレイ表面に固定化することによって製造できる。例えばシンテニ社（パロアルト、カリフォルニア州）は、ポリリシンをガラス・スライドに付着させることによってｃＤＮＡアレイを製造している。ｃＤＮＡアレイは、コーティングされたスライドの表面に印刷される。次に、印刷されたスライドをＵＶ光に曝露してＤＮＡをポリリシンと架橋させ、そのことによってｃＤＮＡをアレイに固定化する。
【０００８】
発明のまとめ
本発明は、さまざまな密度のアレイ、中でも高密度アレイ（例えば密度が１平方センチメートル当たり約１０，０００〜１００，０００スポット、またはスポット間のピッチが約３０〜約１００ミクロン）の製造法を提供する。
【０００９】
一般に、この方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。印刷ステップでは、受容体分子を含む所定体積（約０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）の試薬溶液を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一実施態様では、受容体分子を光反応剤で誘導体化する。別の実施態様では、固体支持体が光反応剤を備えている。一般に、パターンになったスポット相互の中心間距離は約２００μｍ〜１ｍｍであり、スポットの直径は一般に約１００μｍ〜５００μｍである。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物）。
【００１０】
照射ステップでは、光反応基に照射を行なって受容体分子を固体支持体に固定化する。一実施態様では、中心間距離（すなわち“ピッチ”）は印刷されたスポットと同じだが直径がスポットの直径よりも小さい開口部を有するマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。マスクは、印刷されたスポットよりも小さな直径の領域を照射できるようなものが好ましい。したがって本発明によれば、固定化される試薬スポットは、印刷された元のスポットよりも直径が小さくなる。別の実施態様では、照射ステップを、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。
【００１１】
一般に、照射ステップの後には、固定化されなかった試薬（例えば受容体分子）を洗浄ステップによって除去する。このプロセス全体は、元のパターンとずらして（オフセットさせて）繰り返すことができる。望むのであれば、このプロセス全体を複数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。
【００１２】
詳細な説明
“フォトリソグラフィ”という用語は、所定のパターンになった表面を電磁放射に曝露し、その表面にそのパターン（またはそのパターンのネガ）を生成させるプロセスのことを意味する。一般に、パターンは、結合の形成または破壊によって生成される。“フォトリソグラフィ”には、マスク技術や、それ以外にレーザーをミラーで反射させる技術などを含めることができる。
【００１３】
この明細書で用いる“試薬溶液”とは、受容体分子を含む溶液のことを意味する。試薬溶液は、緩衝液も含んでいるのが普通である。一般に、アレイは、少なくとも１つの、より一般的には複数の“試薬溶液”を用いて製造する。個々の試薬溶液には異なる受容体分子が含まれているため、異なる位置に異なる受容体分子が位置したアレイが形成される。
【００１４】
この明細書で用いる“受容体分子”とは、固体支持体に固定化される結合対の１つの構成要素を意味する。好ましい一実施態様では、受容体分子は核酸である。しかし受容体分子としては、リガンドと特異的に結合する他の任意の分子が可能である。受容体分子としては、例えば免疫グロブリンや細胞受容体などのタンパク質（レクチンなど）、またはこれらの断片（例えばＦ_ａｂ断片、Ｆ_ａｂ’断片など）が可能である。
【００１５】
この明細書で用いる“標的リガンド”または“標的”とは、リガンドのことを意味する。具体的には、サンプル中に存在していると考えられ、本発明の方法またはシステムで検出および／または定量する核酸配列が挙げられる。一実施態様では、核酸は、サンプルから検出されることになる遺伝子または遺伝子断片を含んでいる。“サンプル”という用語は、最も広い意味で用いられる。この用語には、標的リガンドを含むと考えられる試料または培養物が含まれる。
【００１６】
この明細書で用いる“相補的”または“相補性”という用語は、核酸（すなわち、核酸または標的核酸などのヌクレオチド配列）に関して使用するときには、ワトソンとクリックが発見した塩基対規則によって関係づけられた配列を意味する。例えば配列“Ｔ−Ｇ−Ａ”に対する相補的配列は、“Ａ−Ｃ−Ｔ”である。相補性は“部分的”であってもよい。その場合、核酸を構成する塩基のほんのいくつかだけが塩基対規則に従ってマッチしている。また、核酸相互の間に“完全な”相補性または“全体的”相補性が存在していてもよい。核酸の鎖相互間の相補性の程度は、核酸の鎖相互間のハイブリダイゼーションの効率と強さに影響する。
【００１７】
“相補的”または“相補性”という用語は、核酸以外の分子と組み合わせて使用するときには、結合のパートナーと結合できる分子を意味する。具体的には、特定の結合対の構成要素である分子が挙げられる。
【００１８】
“ハイブリダイゼーション”という用語は、互いに相補的な核酸がペアになることに関して使用する。ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの強さ（すなわち核酸同士の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関係する条件の厳しさ、形成されたハイブリッドの融点（Ｔ_ｍ）、核酸中のＧ：ＣとＡ：Ｔの比などの因子によって影響される。
【００１９】
この明細書で用いる“核酸”という用語は、プリンおよびピリミジンに由来する塩基を含む一群のポリヌクレオチド化合物のうちの任意のものを意味する。“核酸”という用語は、核酸の個々の塩基、またはオリゴヌクレオチド（例えば、少なくとも２つのヌクレオチドが共有結合によって互いに結合した短鎖の核酸配列。その典型的な長さは、約５００ヌクレオチド未満、より一般的には２０〜１００ヌクレオチドである）を指すのに用いることもできる。“核酸”という用語は、ｃＤＮＡやＰＣＲ産物に見られるような長い核酸配列（例えば長さが数百〜数千ヌクレオチド）を指すのに用いることもできる。核酸配列の正確なサイズは多くの因子に依存することになろう。これら因子はさらに、核酸の最終的な機能または用途に依存している。
【００２０】
核酸は、固体支持体核酸合成、ＤＮＡ複製、逆転写など、現在利用可能な技術を用いて調製することができる。別の方法として、核酸を天然の供給源から単離することもできる。核酸は、適切な任意の形態にすることができる。例えば一本鎖、二本鎖、核タンパク質にすることが可能である。核酸は、一般にホスホジエステル結合を含んでいるが、場合によっては、ヌクレオチドが同様の骨格、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）を備えていてもよい。核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ））、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などが挙げられる。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、あるいはその両方を含んでいてよい。その場合、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせを含む。さらに、核酸としては、ウラシル、アデニン、グアニン、チミン、シトシンのほか、イノシン、キサンテン、ヒポキサンチンや、他の標準的でない塩基または人工塩基を任意に組み合わせたものが挙げられる。
【００２１】
ＰＮＡは、元の糖リン酸ＤＮＡ骨格がポリペプチドで置き換えられたＤＮＡ類似物である。この置換によって分子の安定性が増大するとともに、アフィニティと特異性の両方が大きくなると言われている。
【００２２】
概要
本発明は、全体として、マイクロアレイの製造方法を提供する。マイクロアレイは、一般に、異なる複数の受容体分子が付着した固体支持体を備えている。それぞれの受容体分子は、他の領域とは物理的に離れた所定の領域に位置している。
【００２３】
特に核酸（と核酸がハイブリダイゼーションを通じて特異的に“結合する”能力）について本発明を説明するが、本発明は他の特異的結合剤（例えば、免疫における結合対、他のリガンド／抗リガンド結合対や、さらには、リガンドがまだ見つかっておらず、ドラッグ・デリバリーの標的となっているようなタンパク質）にも適用できる。
【００２４】
本発明の方法はさまざまな密度のアレイを製造するのに適しているが、中でも高密度アレイの製造に適している。この明細書で用いる“高密度アレイ”という用語は、１平方センチメートル当たり受容体分子が１，０００スポットを超える密度のマイクロアレイを意味する。この密度は、一般に１平方センチメートル当たり５，０００スポットを超え、より一般的なのは、１平方センチメートル当たり１０，０００〜１００，０００スポットである。一般に、“高密度アレイ”では、スポットを約３０〜約１００ミクロンの“ピッチ”（例えば、中心間の距離が約３０〜約１００ミクロン）にして固定化する。これとは対照的に、印刷技術によって製造された市販のマイクロアレイは、密度が１平方センチメートル当たり約１００〜１０００スポットである。一般に、市販されているほとんどのアレイでは、スポットは、中心間のピッチが約１００〜約２００ミクロンとなるようにして固定化される。
【００２５】
この明細書で用いる“スポット”とは、特定の受容体分子を少なくとも１個、より一般的には複数個含む局在領域を意味する。それぞれの“スポット”が異なる受容体分子を含んでいることが好ましい。“スポット・パターン”とは、固体支持体の表面におけるスポットの配置を意味する。場合によっては、各スポットが隣接するすべてのスポットから所定の距離離れた一様なスポット・パターンになっていることが望ましい。しかし必ずしも一様なスポット・パターンである必要はない（例えば、１つのスポットと隣接するすべてのスポットの間の距離は同じでなくてもよい）。
【００２６】
一般に、本発明の方法は、印刷ステップと照射ステップを含んでいる。この方法を図１と図２に図示してある。印刷ステップ（図１のステップＡと図２Ａのステップ１）では、所定体積の試薬溶液（約０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）を望むパターンになるようにして固体支持体に付着させる。一般に、印刷されたスポットの中心間距離（Ｐ）は約２００μｍ〜１０００μｍであり、印刷されたスポットの直径（Ｄ）は一般に約１００μｍ〜５００μｍである。
【００２７】
一実施態様では、受容体分子を少なくとも１種類の光反応基で誘導体化する。この明細書で用いる“種類”という用語は、光反応基に関して使用する。例えば、光反応基の１つの“種類”はアジドであり、別の“種類”の光反応基はアリールケトンである。したがって１つの受容体分子は、１種類の光反応基の複数コピーを用いて誘導体化することができる。別の方法として、さまざまな種類の光反応基の１つ以上のコピーを用いてその受容体分子を誘導体化することもできる。（同じ考え方を以下の別法に適用することができる。）別の実施態様では、固体支持体が少なくとも１種類の光反応基を備えている。これら以外の方法も考えられる。例えば、受容体分子と固体支持体の両方が少なくとも１種類の光反応基を備えるようにすることができる。別の実施態様では、受容体分子と固体支持体がそれぞれ光反応基の互いに相補的な要素を備え、照射時にその要素が相互作用して安定な結合、好ましくは共有結合を形成するようにできる。さらに別の実施態様では、照射前に固体支持体に付着させる試薬溶液が、少なくとも１種類の光反応基を含むようにすることができる。
【００２８】
照射ステップ（図１のステップＢと図２Ａのステップ２）では、光反応基に照射を行なうことで反応を開始させ、受容体分子を固体支持体に固定化させる。一実施態様では、中心間の距離、すなわち“ピッチ”（Ｐ）が印刷されたスポットと同じマスクを印刷されたパターンの上に被せ、照射を行なう。この明細書で用いる“同じ”という用語は、スポットのピッチが、使用する装置の精度内で同じであることを意味する。したがって、中心間距離にはわずかな分散があってもよいが、その分散は一般に無視できる。
【００２９】
マスクは、印刷されたスポットに対し、その印刷されたスポットそのものの直径（Ｄ）よりも小さい直径（Ｄ’）に対して照射線を照射できるようになっていて、その結果として固定化された受容体分子のスポットが、印刷されたスポットの直径（Ｄ）よりも小さい直径（Ｄ’）になることが好ましい。別の方法として、照射ステップは、レーザーをミラーで反射させる技術を利用して実行することができる。
【００３０】
一般に、照射ステップの後、固定化されなかった受容体分子を洗浄ステップで除去する（図１のステップＣと図２Ａのステップ３）。次に、すでに存在しているスポット・パターンからずらしてこのプロセス全体を繰り返すことができる（図１のステップＤと図２Ｂ）。この明細書で用いる“ずらす”（オフセット）という用語は、固定化されたスポットの位置に関して使用する。印刷されたスポットは、互いに重なっていてもいなくてもよい。この明細書で用いる“すでに存在しているスポット”という用語は、表面に固定化されている任意のスポット・パターンを意味する。望むのであれば、このプロセス全体を多数回繰り返して高密度アレイを製造することができる。
【００３１】
例えば、印刷されたスポットの直径が１００μｍでピッチ（中心間距離）が２００μｍであり、光によって活性化されたスポットの直径が２０μｍで（ピッチが印刷されたスポットと同じで）あるならば、マスクをずらすことで同じスペースに２５個のアレイを収容することができる。するとアレイの密度が２５倍になる。したがって、印刷によって１ｃｍ^２当たり２５００個のスポットを有するアレイを製造する能力があるならば、本発明の方法を利用して１ｃｍ^２当たり６２，５００個のスポットを有するアレイを製造することができる。
【００３２】
本発明の方法に必要なマスクは１つだけであることが望ましい（望むのであれば、２つ以上のマスクを使用することもできる）。ミラーで反射させたレーザーを照射する場合には、マスクは不要である。したがって、本発明の方法により、高密度アレイの製造コストが、多数のマスクを必要とするフォトリソグラフィによるインサイチュ固相合成と比べて大きく低下する。さらに、インサイチュ固相合成の場合よりも長い核酸配列（ｃＤＮＡさえも）を固定化することや、固定化前に配列を精製することもできる。
【００３３】
アレイ１つ当たりのスポット数は、アレイのサイズと構成、ならびにアレイの最終用途によって異なる可能性がある。ある種の診断用アレイでは、異なる数種類のスポットだけが必要とされる。それに対して発現分析などの別の用途では、望む情報を収集するのにより多数のスポットが必要となる可能性がある。
【００３４】
核酸
本発明の方法によれば、受容体分子を含む試薬溶液を固体支持体の表面に印刷する。受容体分子は、天然の供給源から得られた核酸、または適切な任意の方法を用いて合成した核酸であることが好ましい。核酸の合成法は公知である。核酸は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または生化学的合成などの従来からある方法で調製した後、精製することができる。
【００３５】
核酸の長さ（すなわちヌクレオチド塩基の数）は、５塩基〜数千塩基までの広い範囲が可能である。核酸は、長さが少なくとも１０塩基あって特異的ハイブリダイゼーションが可能であることが好ましい。約１０〜５００塩基の配列（例えば約２０〜２００塩基の配列や、４０〜１００塩基の配列）を有する核酸が一般的である。本発明の方法を利用して、フォトリソグラフィによるインサイチュ固相合成によって容易に得られる核酸配列よりも長い核酸配列を基板表面に有するアレイを製造できることが望ましい。例えば、３０塩基を超える核酸（例えば４０塩基を超える配列や５０塩基を超える配列、さらには１００塩基を超える配列）を利用することができる。すなわち、本発明の方法を利用すると、ｃＤＮＡやＰＣＲ産物を固体支持体の表面に固定化することができる。一般に、より長い配列（例えば２５塩基超）を有する核酸が好ましい。というのも、高めのストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件と洗浄条件を利用することにより、非特異的ハイブリダイゼーションを減らすこと、または排除することができるからである。しかし望むのであれば、より短い核酸も用いることができる。
【００３６】
基板
本発明によれば、受容体分子を固体支持体（この明細書では、今後は基板とも呼ぶ）の表面に固定化する。一般に、“固体支持体”または“基板”という用語は、使用する溶媒に溶けず、核酸を表面に固定化できる２次元または３次元の表面を提供する材料を意味する。固体支持体の構成は、受容体分子を好ましくは共有結合によって付着させうる任意のものが可能である。固体支持体は、受容体分子を付着させる方法に応じてさまざまな構成にすることが可能である。
【００３７】
支持体の表面は、受容体−リガンド間の結合と相互作用せず、大量の非特異的結合の影響を受けないことが好ましい。適切な材料としては、生物または非生物に由来する有機または無機の材料が挙げられる。適切な固体支持体としては、プラスチック、機能性セラミック、樹脂、多糖、機能化されたシリカ、シリカをベースとした材料、機能性ガラス、機能性金属、フィルム、ゲル、膜、ナイロン、天然繊維（例えば絹、羊毛、木綿）、ポリマーなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。この明細書では、“機能性”という用語は、無機表面に公知の方法で有機的変更を施し、光反応基が反応できるような結合を設けたことを意味する。ポリマー表面が好ましい。適切なポリマーとしては、ポリスチレン、ポリエチレン、テレフタル酸ポリエチレン、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、ポリアクリルニトリル、メタクリル酸ポリメチル、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテンなどが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００３８】
すでに説明したように、固体支持体は、２次元または３次元の表面を提供することができる。３次元表面は、望む長さ、幅、厚さがあって、核酸が透過して孔またはマトリックスの中に移動できる固体支持体を利用して提供することができる。核酸は固体支持体の長さ、幅、高さ（厚さ）の方向に沿って固定化できるため、３次元表面だと２次元表面よりも所定の領域に高密度の核酸を固定化することができる。
【００３９】
表面は、固体支持体に対する核酸の非特異的吸着が減るようなものを選択することが望ましい。一般に、親水性表面だと、非特異的吸着が減るであろう。
【００４０】
この明細書では、“親水性”および“疎水性”という用語は、水を好む組成物および水を嫌う組成物をそれぞれ記述するのに用いる。一般に、親水性化合物は、比較的極性があり、イオン化可能であることがしばしばある。このような化合物は、通常、水分子と強く結合する。疎水性化合物は、通常、比較的極性がなく、イオン化しない。疎水性表面は、一般に、表面またはその近傍で水分子を氷のような構造にする。疎水性と親水性は相対的な用語であり、この明細書では、さまざまな組成物、液体、表面が、互いに比較して疎水性であるか親水性であるかという意味で用いる。
【００４１】
固体支持体の大きさはさまざまであり、望むアレイの大きさ、望む多様性の程度などの因子によって決めることができる。一実施態様では、シートまたはフィルムの形態になった基板の表面に核酸を固定化し、その基板を個別のアレイに切断する。別の方法として、個々のアレイを独立に製造することもできる。１個または多数個の固体支持体を顕微鏡用スライドなどの他の支持体の上に載せることも可能である。
【００４２】
印刷
本発明によれば、受容体を含む所定体積の試薬溶液を固体支持体上の選択した領域に付着させる。試薬溶液は、公知の技術である例えば市販の印刷装置を改造したものを利用して基板に付着させる。例えば、市販の印刷装置は、本発明の照射ステップが可能なように改造する必要があろう。自動ｘ−ｙ−ｚ位置決め装置を利用し、試薬を固体支持体の表面に正確に繰り返して付着させてスポットを形成することが好ましい。ｘ−ｙ−ｚ位置決め装置は、３つの方向（ｘ、ｙ、ｚ）すべてで精度が少なくとも１０μｍになっていることが好ましい。一般に、スポット形成ロボットは、センサーまたは視認可能な参照物を必要としない。
【００４３】
一般に、印刷段階では、望む受容体分子を含む少体積（例えば０．１ピコリットル〜１ナノリットル、より一般的には０．５ピコリットル〜５００ピコリットル）の試薬溶液を基板表面に付着させる。印刷されるスポットの直径は、基板表面、付着させる溶液の体積や粘度などに応じてさまざまである。一般に、印刷されるスポットの直径（Ｄ）は約１００〜５００μｍである。ピッチ（Ｐ）は、一般にスポットの直径に影響される。一般に、ピッチ（Ｐ）はスポットの直径の２倍以上である（例えば、ピッチは一般に２００μｍ〜１０００μｍである）。
【００４４】
基板表面の光反応基
一実施態様では、固体支持体は、少なくとも１種類の光反応基でコーティングされた表面を備えている。この明細書では、“光反応基”として、特別な外部エネルギー源（例えば放射線）に応答して活性な種（例えばフリーラジカルであるニトレン、カルベン、励起したケトン状態など）を発生させ、隣接する化学構造と共有結合する少なくとも１つの反応部分などが挙げられる。光反応基は、電磁スペクトルのさまざまな部分（典型的にはスペクトルの紫外部、可視部、赤外部）に応答するように選択するとよい。“照射”とは、表面に電磁照射を当てることを意味する。
【００４５】
一実施態様によれば、表面に固定化する受容体分子は、光反応基を用いて修飾してもしなくてもよい。
【００４６】
例えば固体支持体として、ポリカチオン性ポリマー・コーティングを有するガラス基板が挙げられる。この実施態様では、ポリマー・コーティングとして、カチオン性ポリペプチド（例えばポリリシンやポリアルギニン）が挙げられる。このような固体支持体は、公知の方法で製造することができる。例えば、スライドの表面にポリカチオン性ポリマーからなる均一なフィルムを被せた後、このフィルムを乾燥させてコーティングを形成すると、スライドができる。添加するポリカチオン性ポリマーは、固体支持体の表面に少なくとも１つの単層ポリマーを形成するのに十分な量であることが好ましい。フィルムは、一般に、表面にある負のシリル−ＯＨ基と、ポリマー中の荷電したアミノ基の間に静電結合が形成されることによって表面に結合する。ポリ−１−リシンでコーティングされたガラス製スライドも、例えばシグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズーリ州）から入手可能である。核酸配列はこのような表面に印刷することが可能であり、印刷後に照射を行なって核酸をカチオン性ポリマーと架橋させる。
【００４７】
受容体分子に付着した光反応基
別の実施態様では、少なくとも１種類以上の光反応基を用いて受容体分子を誘導体化し、その光反応基を活性化させることにより、支持体表面に受容体分子を固定化することができる。この実施態様によれば、光で誘導体化する受容体分子は、適切な照射を行なうことで、支持体表面に共有結合によって固定化させる。
【００４８】
光反応基は、受容体分子に沿った１つ以上の位置で直接または間接に受容体分子と共有結合することが好ましい。１つ以上の光反応基を適切な任意の方法で受容体分子と結合させることができる。例えば、受容体分子が核酸である場合には、その核酸を、誘導体化した少なくとも１つの核酸塩基を用いて合成することができる。別の方法として、天然の核酸または以前に合成した核酸を誘導体化し、光反応基が、３’末端に、または５’末端に、または核酸そのものの長さ方向に沿って、またはこれらを任意に組み合わせた位置に存在するようにすることもできる。
【００４９】
光反応基によって受容体分子を誘導体化し、この受容体分子を選択的かつ特異的に活性化できるようにすることで、この受容体分子を支持体に付着させたときにこの受容体分子の化学的および／または生物学的機能が実質的に保持されるようにする。この実施態様によれば、光反応基の“直接的な”付着とは、光反応性化合物が受容体分子に直接付着することを意味する。他方、“間接的な”付着とは、光反応性化合物と受容体分子が、合成ポリマーや天然ポリマーなどの共通の構造体に付着することを意味する。光によって誘導体化される受容体分子は、適切な照射により、しかも通常は表面の予備処理を必要とすることなく、共有結合を通じてさまざまな基板表面に固体化される。この実施態様の方法には、１つ以上の光反応基が受容体分子に熱化学的に付着させる方法と、この受容体分子の誘導体を基板表面に光化学的に固定化する方法の両方が含まれる。
【００５０】
受容体分子は、任意の固体支持体に付着させることができるが、好ましい固体支持体は、炭素−水素結合を有する固体支持体である。この結合と光反応基が反応するため、核酸が表面に固定化される。適切な基板の具体例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリ（メタクリル酸メチル）、パリレンのほか、ガラスその他の無機表面を予備処理するのに用いられる多数の有機シランのうちの任意のものが挙げられるが、これだけに限定されるわけではない。
【００５１】
光で誘導体化した受容体分子を用いて高密度アレイを製造する方法は、一般に、固体支持体の表面に光反応基を用いる方法よりも好ましい。というのも、核酸（または他の化合物）の非特異的吸着を減らす表面を用いることができるからである。
【００５２】
光で誘導体化した核酸ならびにその製造方法は、共同して譲渡された「光活性化可能な核酸誘導体」という名称のアメリカ合衆国特許出願第０９／０２８，８０６号に詳細に開示されている。この出願は、本出願の譲受人によって共有されており、その開示内容のすべてがここに参考として組み込まれているものとする。
【００５３】
光反応基
一実施態様によれば、受容体分子は、光反応基を用いて誘導体化する。好ましいのは、光反応性アリールケトンであるアセトフェノン、ベンゾフェノン、アントラキノン、アントロン、アントロン様複素環（すなわちアントロンの複素環類似体で、例えば１０位にＮ、Ｏ、Ｓのいずれかを有するもの）、あるいはこれらに関する置換された誘導体（例えば、環が置換された誘導体）である。好ましいアリールケトンの具体例としては、アントロンの複素環誘導体である例えばアクリドン、キサントン、チオキサントンや、これらに関して環が置換された誘導体が挙げられる。特に好ましいのは、励起波長が約３６０ｎｍよりも長いチオキサントンとその誘導体である。
【００５４】
アジドも適切な光反応基のグループであり、具体的には、アリールアジド（Ｃ_６Ｒ_５Ｎ_３）（例えばフェニルアジドや４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、中でも４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド）、アシルアジド（−ＣＯ−Ｎ_３）（例えばアジドギ酸エチルやアジドギ酸フェニル）、スルホニルアジド（−ＳＯ_２−Ｎ_３）（例えばベンゼンスルホニルアジド）、ホスホリルアジド（（ＲＯ） _２ＰＯＮ_３）（例えばジフェニルホスホリルアジドやジエチルホスホリルアジド）などが挙げられる。ジアゾ化合物は光反応基の別のグループであり、具体的には、ジアゾアルカン（−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾメタンやジフェニルジアゾメタン）、ジアゾケトン（−ＣＯ−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾアセトフェノンや１−トリフルオロメチル−１−ジアゾ−２−ペンタノン）、ジアゾ酢酸塩（−Ｏ−ＣＯ−ＣＨＮ_２）（例えばジアゾ酢酸ｔ−ブチルやジアゾ酢酸フェニル）、β−ケト−α−ジアゾ酢酸塩（−ＣＯ−ＣＮ_２−ＣＯ−Ｏ−）（例えば３−トリフルオロメチル−３−フェニルジアジリン）、ケテン（−ＣＨ＝Ｃ＝Ｏ）（例えばジフェニルケテン）などが挙げられる。
【００５５】
光反応基を活性化させると、受容体分子が、光反応基の残基を通じて共有結合によって互いに、および／または材料の表面に共有結合する。活性化される光反応基の具体例とその残基を以下に示す。
【表１】

【００５６】
照射
本発明によれば、試薬溶液を固体支持体に印刷した後、照射ステップにおいて受容体分子の少なくとも一部を固体支持体に固定化する。
【００５７】
一実施態様では、すでに説明したように、照射ステップを利用して、印刷されたスポットの直径よりも小さい直径を持つ実質的に円形の構成になるように核酸を固定化する。この明細書では、“実質的に円形”とは、形が全体的に円形であるが、幾分かの不規則性は存在していてもよいことを意味する。例えば、形がわずかに楕円形であるとか、形を規定している縁部が完全には滑らかでない状態ことが可能である。さらに、照射ステップを利用して、円形でない構成になった固定化された核酸の“スポット”を生成させることができる。例えば核酸を、正方形、三角形、十字形、長い線などの形に固定化することができる。特別な形の“スポット”になっていると、ハイブリダイゼーション・パターンが検出しやすくなろう。一般に、照射されたスポットによって規定される面積は、印刷されたスポットの直径によって規定される面積よりも狭い。実質的に円形である印刷されたスポットの直径（Ｄ）によって規定される面積（Ａ）とは、公式：面積＝π（Ｄ／２）^２によって計算される面積を意味する。
【００５８】
別の実施態様では、形が異なる“スポット”を互いに重ねることができる（図３）。例えば、第１の核酸配列を固体支持体の表面に印刷し（図３（１）（Ａ））、（核酸が正方形の形状に固定化されるよう）正方形の形をした光パターンで照射を行なうことができよう（図３（１）（Ｂ））。固定化されなかった核酸を除去した（図３（１）（Ｃ））後、第２の核酸を固体支持体の表面に印刷する（図３（２）（Ａ））。今度は、核酸に対して三角形の光パターンで照射を行なう（図３（２）（Ｂ））。再び過剰な核酸を除去する。この方法を利用すると、１種類目の標的リガンドの存在下で正方形のスポットが検出され、異なるリガンドの存在下で三角形のスポットが検出されるアレイを製造することができる。別の実施態様では、異なる構成のスポットを互いにずらすことができる。
【００５９】
マスクを利用した照射
一実施態様では、マスクを利用して照射を行ない、受容体分子を固体支持体に固定化する。この明細書では、“固定化”という用語は、受容体分子が支持体表面に安定に付着していることを意味する。このような付着は共有結合であることが好ましいが、適切な他の安定な付着も可能である。
【００６０】
一般に、マスクを用いて照射を制御することにより受容体分子を固体支持体に固定化する方法が知られている。簡単に説明すると、本発明では、マスク（例えばクロム・マスクまたはガラス・マスク）を用いて受容体分子を固体支持体の表面に固定化する。本発明によれば、印刷されたスポットに対し、印刷されたスポットと同じピッチ（中心間の距離）の位置に開口部を有するマスクを通じて照射を行なう。しかし印刷された各スポットにおける照射光の直径は、印刷されたスポット自身の直径よりも小さいことが好ましい。したがって、固定化される受容体分子の直径は、印刷されたスポットの直径よりも小さくなる。
【００６１】
マスクはスポットの中心間距離であるピッチが約１００μｍ〜約５００μｍであることが好ましい。ピッチのさらに好ましい値は、約１００μｍ〜約２００μｍである。各スポットに当てる照射光の直径は、１００μｍ未満であることが好ましく、５０μｍ未満であることがさらに好ましい。照射光の直径は、約１０μｍ〜５０μｍが可能であるが、より一般的なのは２０μｍ〜４０μｍである。場合によっては、照射光の直径を１０μｍ未満にすることが望ましい。制限因子は、使用する光の波長および／または検出システムの解像度になろう。
【００６２】
波長は、受容体分子を固定化するのに用いる光反応基を少なくとも判断材料の一部として決定することになろう。すなわち、所定の光反応基には、特定の波長の光を照射することが好ましい。
【００６３】
ミラーで反射したレーザーの照射
フォトリソグラフィの代替法として、ミラーで反射したレーザーを用いて受容体分子を固体支持体に固体化することができる。この実施態様によれば、ディジタル・マイクロメータを用いて照射光を印刷されたスポットの特定の領域に向け、受容体分子を固体支持体の表面に固体化する。例えば適切なディジタル・マイクロメータ・アレイは、コンピュータ・ディスプレイの投影システムとして一般に用いられているテキサス・インスツルメント社（ダラス、テキサス州）のディジタル・マイクロメータ・デバイス（ＤＭＤ）である。複数のミラーを個別に配置すると、これらのミラーを用いて所定のどのようなパターンまたは画像でも幅広い波長で生成させることができる。
【００６４】
ミラーで反射したレーザーを照射することの利点として、核酸をフォトリソグラフィによってインサイチュ固相合成する場合と比べてコストが少ないことが挙げられる（例えば、マイクロメータ・デバイス内でミラーを調節するのは、多数のマスクを製造することに比べると安上がりである）。
【００６５】
使用法
本発明のマイクロアレイは、複雑な混合物をハイスループット（大規模ハイブリダイゼーション・アッセイ）かつコスト効率よく分析するのに用いることができる。このアレイは、例えば、ＤＮＡシークエンシング、遺伝子診断、生物の遺伝子型決定といった遺伝子分野への応用に適している。
【００６６】
このアレイを調節して生物サンプル中のさまざまな核酸を検出できるようにすることができる。このアレイを使用する際には、１つ以上の標的リガンドを含んでいると考えられるサンプルに対し、この標的リガンドをアレイ上の対応する相補配列とハイブリダイズさせるのに適した条件下でアレイを接触させるとよい。標的とする核酸がアレイ上に存在しているかいないかは、検出システムを用い、選択した信号が生成したかどうかを調べることによって明らかにすることができる。このような検出法は従来技術において公知である。
【００６７】
遺伝子マッピングを行なうためには、遺伝子またはクローニングしたＤＮＡ断片を、ＤＮＡ配列が秩序正しく並んだアレイとハイブリダイズさせる。そしてこのアレイに付着させたＤＮＡ要素を、このアレイ上で検出したパターンによって同定する。ゲノムの物理的地図を構成する際には、クローニングしたＤＮＡ断片からなるアレイを、クローニングした別のＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ、プローブ混合物中のクローニングした断片が重なっているかどうか、したがってアレイ上の固定化したクローンと連続しているかどうかを明らかにする。
【００６８】
固定化されたＤＮＡ配列からなるアレイは、遺伝子診断にも用いることができる。例えば、突然変異した１つまたは複数の遺伝子の多彩な形態を含むアレイは、患者のＤＮＡに標識した混合物を用いて調べることができる。この標識混合物は、固定化した遺伝子のうちのたった１つとだけ選択的に相互作用することになる。
【００６９】
固定化されたＤＮＡ配列からなるアレイは、ＤＮＡプローブ診断にも用いることができる。例えば、病原性微生物は、未知の病原体についてのＤＮＡサンプルを、既知の病原性ＤＮＡを多数含むアレイとハイブリダイズさせることによって同定することができる。同様の方法を用いて生物の遺伝子型を明らかにすることもできる。遺伝子として興味深い他の分子（例えばｃＤＮＡやＲＮＡ）をアレイに固定化したり、アレイに付着させる標識したプローブとして使用したりすることができる。
【００７０】
一実施態様では、標的となる核酸（この明細書では“リガンド”と呼ぶ）に検出可能な標識を付けることができる。標識は、５’末端部位、３’末端部位、長い核酸の内部部位のいずれかに組み込むことができる。別の方法として、“サンドイッチ”アッセイを利用することもできる。サンドイッチ・アッセイでは、捕獲プローブを基板表面に固定化し、標的リガンドと接触させて付着複合体を形成する。この捕獲プローブは、リガンドの特定の一部と結合するように設計されている。次に、付着複合体を、このリガンドの別の一部と結合する標識した検出プローブと接触させる。検出可能な好ましい標識としては、放射性同位体、安定な同位体、酵素（発色性基板と組み合わせて使用するのが一般的である）、蛍光性化学物質、発光性化学物質、色素化学物質などが挙げられる。検出可能な標識を核酸に組み込むための方法は多数知られている。
【００７１】
以上、本発明を説明してきた。当業者には、説明した実施態様に対し、本発明の範囲をはずれることなく多くの変更をなしうることが明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、この明細書で説明した実施態様に限定されてはならず、請求の範囲における用語で説明した実施態様や、これら実施態様と同等な態様だけに限定されてもならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明による方法のフローチャートである。
【図２】
図２Ａと図２Ｂは、本発明による方法の概略図である。
【図３】
図３は、本発明による別の方法の概略図である。

Claims (33)

1. マイクロアレイの製造方法であって、
   （ａ）受容体分子を含む少なくとも１つの試薬溶液を固体支持体に付着させて第１の付着スポット・パターンを形成し、そのとき、この第１の付着スポット・パターン内でスポット群が所定の面積を占めるようにするとともに、試薬溶液、受容体分子、固体支持体のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせが、少なくとも１つの光反応基を含むようにするステップと；
   （ｂ）上記第１の付着スポット・パターンに照射を行なって第１の固定化されたスポット・パターン内で受容体分子を固体支持体に固定化し、そのとき、この第１の固定化されたスポット・パターン内のスポットが所定の面積を占めるようにするとともに、この第１の固定化されたスポット・パターン内のスポットの面積が、上記第１の付着スポット・パターン内のスポットの面積よりも狭くなるようにするステップとを含む方法。
2. 上記付着ステップが、印刷操作を含む、請求項１に記載の方法。
3. 上記照射ステップが、マスクを用いた照射操作を含む、請求項１に記載の方法。
4. 上記照射ステップが、ミラーで反射させたレーザー照射操作を含む、請求項１に記載の方法。
5. 上記受容体分子が、少なくとも１つの光反応基を含む、請求項１に記載の方法。
6. 上記固体支持体が、少なくとも１つの光反応基を含む、請求項１に記載の方法。
7. 上記第１の付着スポット・パターン内のスポット群が所定の中心間距離を持ち、上記第１の固定化されたスポット・パターン内のスポット群が所定の中心間距離を持ち、上記第１の付着スポット・パターンの中心間距離と上記第１の固定化されたスポット・パターンの中心間距離が等しい、請求項１に記載の方法。
8. 上記照射ステップの後に洗浄ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
9. （ａ）受容体分子を含む少なくとも１つの試薬溶液を上記固体支持体に付着させて第２の付着スポット・パターンを形成し、そのとき、この第２の付着スポット・パターン内でスポット群が所定の面積を占めるようにするとともに、試薬溶液、受容体分子、固体支持体のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせが、少なくとも１つの光反応基を含むようにするステップと；
   （ｂ）上記第２の付着スポット・パターンに照射を行ない、受容体分子を上記固体支持体に固定化して第２の固定化されたスポット・パターンを形成し、そのとき、この第２の固定化されたスポット・パターン内のスポットが所定の面積を占めるようにするとともに、この第２の固定化されたスポット・パターン内のスポットの面積が、上記第２の付着スポット・パターン内のスポットの面積よりも狭くなるようにし、しかもこの第２の固定化されたスポット・パターン内のスポットが、上記第１の固定化されたスポット・パターンのスポットからずれているようにするステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
10. （ａ）受容体分子を含む少なくとも１つの試薬溶液を上記固体支持体に付着させて付着スポット・パターンを形成し、そのとき、この付着スポット・パターン内でスポット群が所定の面積を占めるようにするとともに、試薬溶液、受容体分子、固体支持体のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせが、少なくとも１つの光反応基を含むようにするステップと；
    （ｂ）上記付着スポット・パターンに照射を行なって固定化されたスポット・パターン内で受容体分子を上記固体支持体に固定化し、この固定化されたスポット・パターン内のスポットが所定の面積を占めるようにするとともに、この固定化されたスポット・パターン内のスポットの面積が、上記付着スポット・パターン内のスポットの面積よりも狭くなるようにし、しかもこの固定化されたスポット・パターン内のスポットが、存在している固定化されたスポット・パターンからずれているようにするステップの繰り返しをさらに含み、
    ステップ（ａ）とステップ（ｂ）の繰り返しを利用して高密度アレイを形成する、請求項９に記載の方法。
11. 上記第１の固定化されたスポット・パターンが所定のピッチを持ち、上記第２の固定化されたスポット・パターンが所定のピッチを持ち、この第２の固定化されたスポット・パターンのピッチが、この第１の固定化されたスポット・パターンのピッチと等しい、請求項９に記載の方法。
12. 上記照射ステップが、円形配置になった上記第１の付着スポット・パターンに照射を行なう操作を含む、請求項１に記載の方法。
13. 上記照射ステップが、非円形配置になった上記第１の付着スポット・パターンに照射を行なう操作を含む、請求項１に記載の方法。
14. （ａ）受容体分子を含む少なくとも１つの試薬溶液を上記固体支持体に付着させて第２の付着スポット・パターンを形成し、そのとき、この第２の付着スポット・パターン内でスポット群が所定の面積を占めるようにするとともに、試薬溶液、受容体分子、固体支持体のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせが、少なくとも１つの光反応基を含むようにするステップと；
    （ｂ）上記第１の固定化されたスポット・パターンとは異なる配置になっている上記第２の付着スポット・パターンに照射を行ない、上記第１の固定化されたスポット・パターンとは異なった配置である第２の固定化されたスポット・パターンにおいて上記固体支持体に受容体分子を固定化し、そのとき、この第２の固定化されたスポット・パターン内のスポットが所定の面積を占めるようにするとともに、この第２の固定化されたスポット・パターン内のスポットの面積が、上記第２の付着スポット・パターン内のスポットの面積よりも狭くなるようにするステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 上記第２の固定化されたスポット・パターンが、上記第１の固定化されたスポット・パターンからずれている、請求項１４に記載の方法。
16. 上記第２の固定化されたスポット・パターンが、上記第１の固定化されたスポット・パターンの上に重なっている、請求項１４に記載の方法。
17. 請求項１に記載の方法によって製造したマイクロアレイ。
18. 請求項１０に記載の方法によって製造したマイクロアレイ。
19. 請求項１４に記載の方法によって製造したマイクロアレイ。
20. 核酸スポットのパターンを有する固体支持体を備え、この核酸スポットは、直径が１００μｍ未満であり、少なくとも３０塩基からなる配列を有する核酸を含んでいる、マイクロアレイ。
21. 上記核酸が、少なくとも４０塩基からなる配列を有する、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
22. 上記核酸が、少なくとも５０塩基からなる配列を有する、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
23. 上記核酸がｃＤＮＡを含む、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
24. 上記核酸スポットの直径が５０μｍ未満である、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
25. 上記核酸スポットのパターンが、１平方センチメートル当たり５，０００スポットを超える密度である、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
26. 上記核酸スポットのパターンが、１平方センチメートル当たり１０，０００〜１００，０００スポットの密度である、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
27. 上記核酸スポットが、実質的に円形配置である、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
28. 上記核酸スポットが、非円形配置である、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
29. 異なる配置のスポットを含む、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
30. 異なる配置の上記スポットが互いにずれている、請求項２９に記載のマイクロアレイ。
31. 異なる配置の上記スポットが互いに重なっている、請求項２９に記載のマイクロアレイ。
32. 上記固体支持体が、２次元の固体支持体を備える、請求項２０に記載のマイクロアレイ。
33. 上記固体支持体が、３次元の固体支持体を備える、請求項２０に記載のマイクロアレイ。

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