【０００１】
発明の属する分野
本出願は、１９９８年１０月７日に出願されたＵ．Ｓ．出願シリアル番号０９／１６７，９２１の、一部係属出願である。
【０００２】
本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセッシングのアンチセンスモジュレーションによる細胞行動の調節のための、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、または細胞の行動に影響を及ぼすための安定性をモジュレートする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。
【０００３】
発明の背景
一次転写物、またはプレ−ｍＲＮＡとして知られ、核内で生成される、新規に合成された真核細胞のｍＲＮＡ分子は、翻訳のために細胞質に移行する前にまたはその間に、プロセッシングされる。末端ヌクレオチド、７−メチルグアニレートからなる、メチル化キャップ構造を、ｍＲＮＡ配列の最初のヌクレオチドとの５’−５’結合において、ｍＲＮＡの５’末端に対して付加される。
【０００４】
ポリ（Ａ）とも呼ばれるおよそ２００−２５０−塩基のアデニレート残基の配列を、ｍＲＮＡの３’末端となるであろう部位に対して、後転写的に付加し、その後ｍＲＮＡが細胞質に導入される。これは、複数工程のプロセスであり、プロセッシング複合体の組み立てが関連し、その後前駆転写物の部位特異的エンドヌクレアーゼ性切断およびポリ（Ａ）“尾部”の付加が起こる。ほとんどのｍＲＮＡにおいて、ポリアデニル化シグナル配列は、ヘキサマー、ＡＡＵＡＡＡであり、これは、切断部位（５’−ＣＡ−３’）から５’方向（上流）に１０〜３０ヌクレオチドに、切断部位の３’側にＵまたはＧ−Ｕリッチな要素と共に位置していた。複数のポリ（Ａ）部位は、所定の転写物上に存在し、転写物につきただ一つを使用するが、しかし異なるポリ（Ａ）部位を使用することにより、成熟ｍＲＮＡ転写物の複数種が所定のプレ−ｍＲＮＡから生成される場合がある。安定なｍＲＮＡ二次構造が、トランスフェクトされた細胞中で、ＲＮＡ構築物のポリアデニル化部位に影響を与える場合があることが、最近示された（Ｋｌａｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９８， ２６， １８７０−１８７６）。複数ポリアデニル化部位のいずれを使用するかが、転写物の安定性に影響を与える場合があることもまた、見出された（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９４， １５３， ４１７９−４１８９）。ｍＲＮＡポリアデニル化のアンチセンスモジュレーションは、今まで報告されていなかった。
【０００５】
ｍＲＮＡプロセッシングの次の工程は、ｍＲＮＡのスプライシングであり、これは９０〜９５％の哺乳動物ｍＲＮＡの成熟において生じる。イントロン（あるいは介在性配列）は、一次転写物（またはそれをコードするＤＮＡ）の領域であり、完成されたｍＲＮＡ中には含まれない。エクソンは、一次転写物の領域であり、成熟したｍＲＮＡが細胞質に到達する際にその成熟したｍＲＮＡ中に残っている。エクソンは、共に“スプライシングされ”、成熟ｍＲＮＡ配列を形成する。イントロン−エクソン結合部は、“スプライス部位”とも呼ばれ、結合部の５’側はしばしば“５’スプライス部位”あるいは“スプライスドナー部位”と呼ばれ、および３’側は“３’スプライス部位”または“スプライスアクセプター部位”と呼ばれる。“隠れた”（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライス部位は、あまりしばしばは使用されないものであるが、“通常の”スプライス部位がブロックされているかまたは利用不可能である場合に、使用することができるものである。選択的スプライシング、すなわち、様々なエクソンの組み合わせを使用すること、は、しばしば、一遺伝子から複数のｍＲＮＡ転写物を結果として生じる。
【０００６】
ＲＮＡプロセッシングの最終工程は、ｍＲＮＡの代謝回転または分解である。ディファレンシャルなｍＲＮＡ安定化は、いずれかのタンパク質の合成速度における、いくつかの因子のうちの一つである。ｍＲＮＡ分解速度は、ポリ（Ａ）尾部の有無に関連しているようであり、そしてｍＲＮＡの３’末端における特定の配列の存在にも関連するようである。例えば、短い半減期を有する多くのｍＲＮＡは、いくつかのＡ（Ｕ）ｎＡ配列をその３’−非翻訳領域中に含有する。一連のＡＵＵＵＡ配列を、通常はそれを含有しない遺伝子中に挿入すると、得られたｍＲＮＡの半減期が８０％まで減少した（Ｓｈａｗ ａｎｄ Ｋａｍｅｎ， Ｃｅｌｌ， １９８６， ４６， ６５９）。このことは、これらのＡ（Ｕ）ｎＡ配列を含有する配列中における、核酸溶解性攻撃の増大と関連している可能性がある。例えば、ホルモン、翻訳生成物（自己調節／フィードバック）、および低−分子量リガンドなどのｍＲＮＡ安定性のその他の媒介物質もまた、既知である。
【０００７】
アンチセンス化合物は、一般的には、標的分子の翻訳を直接的に妨害すること、または、より頻繁には、標的ｍＲＮＡをＲＮＡｓｅ−Ｈ−媒介性に分解すること、のいずれかにより、タンパク質発現を妨害するために使用される。ｍＲＮＡの５’キャッピングによるアンチセンス妨害および５’キャップのオリゴヌクレオチドマスキングによるｍＲＮＡに対して結合する翻訳因子の妨害が、Ｂａｋｅｒらにより開示された（ＷＯ ９１／１７７５５）。
【０００８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、しばしば、無細胞レポーターシステムにおいて、スプライシング、特に異常なスプライシングまたは変異転写物のスプライシングを、モジュレートした。ルシフェラーゼレポータープラスミドシステムを使用して、５’スプライス部位、３’スプライス部位、または分岐点を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、変異アデノウィルスプレ−ｍＲＮＡ配列または野生型アデノウィルスプレ−ｍＲＮＡ配列の、レポータープラスミド中へのスプライシングを阻害する能力を、試験した。ＲＮＡｓｅ Ｈ切断をサポートすることができるホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドが、野生型アデノウィルス構築物の発現の、ＲＮａｓｅ Ｈをサポートできない２’−メトキシホスホロチオエートよりも、優れた阻害剤であることが見出されたが、その逆が、ヒトβ−グロブリンスプライス部位配列を含有するアデノウィルス構築物を標的とするオリゴヌクレオチドについて真であった（Ｈｏｄｇｅｓ ａｎｄ Ｃｒｏｏｋｅ， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９５， ４８， ９０５−９１８）。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、いくつかの遺伝子疾患において異常なスプライシングを引き起こす変異を標的とした。アンチセンス化合物を使用して、変異したｍＲＮＡ配列の異常なプロセッシングを修正することは、本発明により包含されない。“野生型”あるいは天然ｍＲＮＡプロセッシングのアンチセンスモジュレーションにより、本発明の主題である、細胞の行動、特に細胞の刺激に対する応答、を改変すること、すなわち調節することは、これまで記載されていない。
【００１０】
ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを使用して、遺伝的血液症状であるβ−サラセミアを有する患者において見出された変異β−グロビン遺伝子の異常な５’スプライス部位を標的とした。変異β−グロビンｍＲＮＡの異常なスプライシングを、サラセミア性ヒトβ−グロビンプレ−ｍＲＮＡを含有するベクター構築物中において、変異ヒトβ−グロビンプレｍＲＮＡの第一イントロン中の分岐点配列を標的とする２’−Ｏ−メチル−リボ−オリゴヌクレオチドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでブロックした。ＲＮＡｓｅに対して安定であり、ＲＮＡｓｅ Ｈにより分解されないＲＮＡと安定なハイブリッドを形成することから、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドを使用する（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｋｏｌｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０， ８６７３−８６７７）。Ｋｏｌｅによるレビュー記事は、β−サラセミアまたは嚢胞性繊維症などの遺伝子変異により形成された異常なスプライス部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することについて検討している。スプライス部位をアンチセンスオリゴヌクレオチドによりブロッキングすることは、スプライス部位の変異、すなわちスプライシングに対して、同様の作用を向け直すこと、を有するだろう、と仮定された（Ｋｏｌｅ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ， １９９７， ４４， ２３１−２３８）。異常なβ−グロビンスプライス部位を標的とするオリゴヌクレオチドが、変異転写物を発現するＨｅＬａ細胞において、異常なスプライシングおよび少なくとも部分的には回復させた正しいスプライシングを抑制した（Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９７， １６，１１７３−１１８２； Ｓｉｅｒａｋｏｗｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９６， ９３， １２８４０−４４）。ＲＮＡｓｅ Ｈを活性化しないアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、変異を含有するプレ−ｍＲＮＡ分子中の異常なスプライシングと戦う組成物および方法が、Ｕ．Ｓ．特許５，６２７，２７４により開示され、そしてＷＯ ９４／２６８８７により開示されそして特許請求の範囲に記載された。
【００１１】
変異ジストロフィンスプライシングの、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドによるモジュレーションが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で報告された。ジストロフィンＫｏｂｅにおいて、５２−塩基対の削除変異が、エクソン１９がスプライシングにおいてスキップされる原因となる。ｉｎ ｖｉｔｒｏミニジーンスプライシングシステムを使用して、ジストロフィンＫｏｂｅのエクソン１９中での削除された配列の５’半分に対して相補的な３１−ｍｅｒの２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドが、野生型プレ−ｍＲＮＡのスプライシングを阻害したことを示した（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １９９５， ９５， ５１５−５２０）。同一のオリゴヌクレオチドを使用して、ヒト培養リンパ芽球細胞における天然ジストロフィン遺伝子転写からのエクソンスキッピングを誘導した。
【００１２】
Ｄｕｎｃｋｌｅｙら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９７， １６， １６６５−１６６８）は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーについてのモデルであるｍｄｘマウス変異体における、変異ジストロフィンのエクソン２３周辺のスプライシングを解析するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ構築物を記載する。標的部位または配列が何ら与えられていないが、これらの構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏで、マウスジストロフィンエクソン２３内のそしてそれに隣接するスプライス部位を標的とした２’修飾オリゴを用いて解析するという計画が検討されている。
【００１３】
引き続いて２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドを使用して、ｍｄｘマウス由来の筋原細胞中のジストロフィン欠損を修正した。マウスジストロフィンイントロン２２の３’スプライス部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、変異エクソンのスキッピングを引き起こし、そして新規な内部削除を有する新規のインフレームジストロフィン転写物を形成した。この変異ジストロフィンを、１〜２％のアンチセンス処理ｍｄｘ筋管中で発現させた。２’−Ｏ−メトキシエチルホスホジエステルなどのその他のオリゴヌクレオチド修飾を使用することが、Ｄｕｎｃｋｌｅｙらに開示された（Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９８， ５， １０８３−９０）。
【００１４】
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを使用して、スプライスドナー部位における点変異がエクソン１６が削除されたｍＲＮＡ を生成する、骨形成不完全症を有する患者に由来する線維芽細胞中で、変異α２（Ｉ）コラーゲンアリルの発現を選択的に抑制した。オリゴヌクレオチドを、プレ−ｍＲＮＡ中の点変異、または不完全にスプライシングされた転写物のいずれかに対して標的化された。両方のケースにおいて、変異ｍＲＮＡを半分まで減少させたが、正常の転写物もまた、２０％まで減少する。このことは、完全にＲＮＡｓｅ Ｈ−依存性メカニズムによるものであると結論づけられた（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｉ， Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．， １９９６， ９７， ４４８−４５４）。
【００１５】
マイクロインジェクションアッセイを使用して、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＴＡｇ）発現に対する、標的のＲＮＡｓｅ Ｈ切断を引き起こさない２’−Ｏ−アリルホスホジエステルオリゴヌクレオチドとしての、または実際にＲＮＡｓｅ Ｈ切断を引き起こす２’−デオキシホスホロチオエートとしての、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドのアンチセンス作用を、試験した。ＴＡｇ転写物の５’非翻訳領域、翻訳開始部位、５’スプライス結合またはポリアデニル化シグナルを標的とするオリゴヌクレオチドを、培養細胞の核または細胞質中に注入した。Ｔ−抗原を阻害する際に有効であった２’−Ｏ−アリル（非−ＲＮＡｓｅ Ｈ）オリゴヌクレオチドのみが、５’非翻訳領域および５’スプライス結合部を標的としたものであった。ＲＮＡｓｅ Ｈを引き起こさない２’−Ｏ−アリルホスホジエステル／Ｃ−５プロピニルピリミジンオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅ Ｈを増強する能力を有したオリゴデオキシヌクレオチドよりも、１／２０の強さであった。著者らは、ＲＮＡ標的と２’−Ｏ−アリルホスホジエステル／Ｃ−５プロピニルピリミジンオリゴヌクレオチドとの間で形成される二重鎖が、細胞中で急速に解離すると結論づけた（Ｍｏｕｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３４， ５０４４−５３）。２−アミノアデニン塩基を取り込むビオチニル化２’−Ｏ−アリルオリゴリボヌクレオチドは、ＨｅＬａ核抽出物中で、スプライセオソーム（ｓｐｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）の構成要素であるＵ２小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）を標的とした。これらは、スプライシング中間体の付随した蓄積により、ｍＲＮＡ産生を阻害した。本発明は、ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物に対するものである。
【００１６】
アンチセンス化合物を使用して、ｍＲＮＡポリアデニル化をブロックしまたは制御することは、以前には記載されていなかった。ＲＮＡ代謝回転または分解に関与するＲＮＡ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用してｍＲＮＡの安定性を制御することは、以前には記載されていなかった。
【００１７】
したがって、細胞の行動、特に刺激に対する細胞の反応を、正常なｍＲＮＡプロセッシングをモジュレーションすることにより改変する組成物および方法を求める必要性は存在し続けている。本発明は、そのようなモジュレーションのためのアンチセンス化合物を提供する。本発明の組成物および方法を、予防を含む治療および研究用ツールとして使用することができる。
【００１８】
発明の概要
本発明は、細胞内の選択された野生型ｍＲＮＡ標的のプロセッシングをモジュレーションすることを通じて、ｍＲＮＡ標的に対して特異的にハイブリダイズ可能でありかつ結合に際してｍＲＮＡ標的の切断をサポートしないアンチセンス化合物を、ｍＲＮＡ標的に結合させることにより、細胞の行動を調節する方法を提供する。組成物および治療方法もまた、提供される。好ましい態様においては、ｍＲＮＡプロセッシングは、スプライシング、ポリアデニル化、またはｍＲＮＡの分解であってもよい。いくつかの態様においては、調節すべき細胞の行動は、刺激に対する細胞のアポトーシスおよび／または反応であってもよい。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞内でのｍＲＮＡプロセッシングをモジュレートする際に、究極的には細胞の行動、特に外的または内的な刺激に対する細胞の応答、を調節する際に、使用するために、オリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用する。細胞の行動の例としては、有糸***、アポトーシスまたはプログラム細胞死、静止、および分化が含まれる。外的刺激の例としては、ストレス（化学的ストレッサーを含む）、ホルモン、サイトカイン、およびその他のシグナル伝達分子が含まれる。
【００２０】
ｍＲＮＡプロセッシングのモジュレーションは、１またはそれ以上のｍＲＮＡプロセッシング事象、例えばＲＮＡスプライシング、ポリアデニル化、キャッピング、および分解を、特異的にモジュレートするアンチセンス化合物を提供することにより達成される。様々な分子的標的に由来するデータは、本発明を説明するものとして提供される。本明細書中で使用する場合、“標的核酸”および“標的をコードする核酸”という用語は、所定の分子標的（すなわち、タンパク質、またはポリペプチド）をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、そしてまたそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。アンチセンス化合物のその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、核酸の正常な機能を妨害する。標的核酸の機能の、それに特異的にハイブリダイズする核酸によるこのモジュレーションは、一般的に“アンチセンス”として言及される。妨害されるべきＤＮＡの機能には、複製および転写が含まれる。標的核酸機能のそのような妨害の全体的効果は、標的分子の発現のモジュレーションである。本発明の文脈において、“モジュレーション”とは、例えば、プロセッシング事象の頻度または遺伝子の発現における、量的な変化、すなわち増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。この文脈において、モジュレーションは、“向け直すこと”、例えば、標的ＲＮＡの一つのスプライス産物の増加および全標的ＲＮＡレベルに有意な変化を有さない別のスプライス産物の付随的な減少を結果として引き起こすスプライシングを向け直すこと、もまた意味している。
【００２１】
アンチセンスに関し、特異的な核酸を標的とするのが好ましい。本発明の文脈において、特定の核酸へのアンチセンス化合物の“標的化”は、多段階過程である。該過程は、通常、その機能をモジュレートすべき核酸配列の同定で始まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺伝子（または該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、または感染性病原体由来の核酸分子であってもよい。標的化のプロセスには、所望の効果、例えばＲＮＡプロセッシングの発現のモジュレーション、が結果として得られるように生じるために、アンチセンス相互作用に対するこの遺伝子内の１または複数の部位を決定することもまた含まれる。本発明の文脈内では、好ましい（１または複数の）標的部位は、モジュレートされるべきＲＮＡプロセッシングの性質（ａｓｐｅｃｔ）に依存している。ｍＲＮＡスプライシングのモジュレーションのため、併せてイントロン−エクソン結合部としても知られる、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位が、好ましい標的部位である。スプライシング分岐点およびエクソン（境界（ｄｅｆｉｎｅ））は、ｍＲＮＡスプライシングのモジュレーションのための好ましい標的部位でもある。ポリアデニル化のモジュレーションのため、ポリアデニル化シグナルまたはポリアデニル化部位は、好ましい標的部位である。ｍＲＮＡ安定性または分解のモジュレーションのため、安定化配列または脱安定性配列は、好ましい標的部位である。
【００２２】
ひとたび１つまたはそれ以上の標的部位が同定されてきたら、標的に十分に相補的な、すなわち十分によく、そして十分な特異的にハイブリダイズし、望ましい影響を与える、オリゴヌクレオチドを選択する。
【００２３】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する、相補的核塩基である。“相補的”は、本明細書において、２つのヌクレオチド間での正確な対形成の能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することが可能である場合、該オリゴヌクレオチドおよび該ＤＮＡまたはＲＮＡは、その位置で互いに相補的であるとみなされる。各分子において、十分な数の対応する位置が、互いに水素結合することが可能なヌクレオチドで占められている場合、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは互いに相補的である。したがって、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定で、そして特異的な結合が、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ標的間で起こるような、十分な度合いの相補性または正確な対形成を示すのに用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と１００％相補的である必要はないことが、当該技術分野において理解されている。アンチセンス化合物は、該化合物の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合が、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能に干渉して有用性の損失を引き起こし、そして特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイまたは療法処置の場合には生理学的条件下、およびｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な度合いの相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２４】
アンチセンス化合物は、一般的に、研究試薬および診断剤として用いられる。例えば、完全な特異性で遺伝子発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するために、一般の当業者に用いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の多様なメンバーの機能を区別するのにも用いられる。アンチセンスモジュレーションは、したがって、研究使用に利用されてきている。
【００２５】
アンチセンスの特異性および感受性はまた、療法的使用のため、当業者に利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける疾患状態の治療において、療法部分として使用されてきている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全にそして効果的に投与されてきており、そして多くの臨床試験が現在、進行中である。アンチセンス薬物であるビトラベンＴＭ（ＶｉｔｒａｖｅｎｅＴＭ）は、米国食品薬品局により、エイズ患者において失明を引き起こすサイトメガロウィルス網膜症（ＣＭＶＲ）の治療のために認可された。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織および動物、特にヒトの治療のための治療措置において、有用に設計することが可能な、有用な療法様式（ｍｏｄａｌｉｔｙ）である可能性があることが立証されている。
【００２６】
本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、天然に存在する核塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バックボーン）結合で構成されるオリゴヌクレオチドと共に、同様に機能する非天然存在部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。こうした修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込み増進、核酸標的に対する親和性の増進、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば、天然型より好ましい。
【００２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい型であるが、本発明は、限定されるわけではないが、以下に記載されるものなどのオリゴヌクレオチド擬似体を含む、他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。本発明にしたがったアンチセンス化合物は、好ましくは、約８から約３０核塩基を含む。特に好ましいのは、約８から約３０核塩基（すなわち約８から約３０の結合されたヌクレオシド）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。当該技術分野において知られるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、該糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれに結合してもよい。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。次に、この直鎖ポリマー構造のそれぞれの端を結合させて、さらに環状構造を形成してもよいが、しかし、開いた直鎖構造が、一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常の結合またはバックボーンは、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【００２８】
本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾バックボーンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバックボーン内にリン原子を持たないものが含まれる。本明細書の目的のための、そして当該技術分野に時に引用されるような、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドとみなすことが可能である。
【００２９】
好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、３’−アルキレンホスホネート類およびキラルホスホネート類を含む、メチルおよび他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホロアミデート類およびアミノアルキルホスホロアミデート類を含む、ホスホロアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、並びにボラノホスフェート類であって、通常の３’−５’結合を有する前記修飾オリゴヌクレオチド、これらの２’−５’結合類似体（ａｎａｌｏｇ）、およびヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’へ、または２’−５’から５’−２’へ結合される逆の極性を有するものが含まれる。様々な塩、混合塩および遊離酸型もまた、含まれる。
【００３０】
上記のリン含有結合の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；および５，６２５，０５０が含まれ、前記特許の各々は、参考文献として本明細書に援用される。
【００３１】
リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；並びに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【００３２】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；および５，６７７，４３９が含まれ、前記特許の各々は、参考文献として本明細書に援用される。
【００３３】
他の好ましいオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合両方、すなわちバックボーンが、新規の基と置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、維持される。こうしたオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されてきているオリゴヌクレオチド擬似体であって、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと置き換えられる。核塩基は保持され、そしてバックボーンのアミド部分のアザ窒素原子と、直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれ、前記特許の各々は、本明細書に援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる解説は、Ｎｉｅｌｓｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， ２５４， １４９７−１５００）に見出すことが可能である。
【００３４】
本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴヌクレオチド、並びにヘテロ原子バックボーン、および特に上に引用される米国特許５，４８９，６７７の−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステルバックボーンは−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として示される）、および上に引用される米国特許５，６０２，２４０のアミドバックボーンを持つオリゴヌクレオシドである。やはり好ましいのは、上に引用される米国特許５，０３４，５０６のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。
【００３５】
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つまたはそれ以上の置換糖部分も含んでもよい。好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであって、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニルおよびアルキニルで置換されていてもまたは未置換でもよいもの。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２であって、ｎおよびｍが１から約１０であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、アセトアミド、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基、が含まれる。さらなる好ましい修飾には、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノ−エトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
【００３６】
他の好ましい修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上のまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でも行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬似体も有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；および５，７００，９２０が含まれ、前記特許の各々は、その全体を参考文献として本明細書に援用される。
【００３７】
オリゴヌクレオチドはまた、核塩基（当該技術分野において、しばしば単に“塩基”と称される）修飾または置換も含んでもよい。本明細書において使用する場合、“未修飾”または“天然”核塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核塩基には、他の合成および天然核塩基が含まれ、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンがある。さらなる核塩基には、米国特許３，６８７，８０８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ８５８−８５９ページ， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ．Ｉ．監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第１５章， ｐａｇｅｓ ２８９−３０２， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ， Ｂ．編集， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９３に開示されるものが含まれる。これらの核塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、並びにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類が含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を、０．６−１．２℃増加させることが示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉ， Ｙ．Ｓ．， Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ， Ｂ．監修， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９９３， ｐｐ．２７６−２７８）、そして現在好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、さらにより好ましい。
【００３８】
上記の修飾核塩基の特定のものと共に他の修飾核塩基の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、上記の米国特許３，６８７，８０８と共に、米国特許４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，６８１，９４１；および５，７５０，６９２が含まれ、前記特許の各々は、参考文献として本明細書に援用される。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、該オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを増進させる、１つまたはそれ以上の部分またはコンジュゲートを化学的に結合させることを伴う。こうした部分には、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８６， ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９４， ４， １０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９９２， ６６０， ３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔ．， １９９３， ３， ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９２， ２０， ５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９１， １０， １１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２５９， ３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， １９９３， ７５， ４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセリンまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９０， １８， ３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９５， １４， ９６９−９７３）、あるいはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， １９９５， ３６， ３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９５， １２６４， ２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら， Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９６， ２７７， ９２３−９３７）が含まれる。
【００４０】
こうしたオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７；５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１；５，３９１，７２３；５，４１６，２０３；５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８および５，６８８，９４１が含まれ、前記特許の各々は、参考文献として本明細書に援用される。
【００４１】
所定の化合物のすべての位置が均質に修飾されていることは必要ではなく、そして実際、上述の修飾の１つ以上が、単一の化合物に、またはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにも取り込まれていてもよい。本発明はまた、キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、“キメラ”アンチセンス化合物または“キメラ”は、各々少なくとも１つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチドで構成される、２つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を含む、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、該オリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を与えるように、該オリゴヌクレオチドが修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。
【００４２】
本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つまたはそれ以上の上述のようなオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド擬似体の混成構造として形成されてもよい。こうした化合物はまた、当該技術分野において、ハイブリッド、ギャップ化オリゴヌクレオチドまたはギャップマーと称されてきている。こうしたハイブリッド構造の調製を解説する、代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；および５，７００，９２２が含まれ、前記特許の各々は、その全体を参考文献として本明細書に完全に援用される。均質な２’−修飾オリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡ分子のＲＮＡｓｅ Ｈ切断をサポートしないため、２’−デオキシヌクレオチドの領域、通常は５つあるいはそれ以上の連続するヌクレオチド、しばしば１０個の連続するデオキシヌクレオチド、が２’−修飾オリゴ１または２つの領域とともに存在するギャップ化オリゴヌクレオチドは、アンチセンス技術においてしばしば使用される。結合親和性の増大が、２’修飾により提供され、そしてデオキシギャップ領域により、標的のＲＮＡｓｅ Ｈ切断が可能になる。しかしながら、本発明において記載される様なＲＮＡプロセッシングのモジュレーションなどのいくつかの場合においては、標的ＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ切断は所望されない。切断されたＲＮＡ産物ではなく、機能的なＲＮＡ産物が、変更した機能を有するにもかかわらず、本発明の目的である。したがって、本発明は、ＲＮＡｓｅ Ｈまたはその他の方法を介したＲＮＡ標的の切断を引き起こさないオリゴヌクレオチドを使用することに限定される。結果的には、均質に修飾されたオリゴヌクレオチド、すなわち、それぞれのヌクレオチド位置またはヌクレオシド位置において同一に修飾されたオリゴヌクレオチド、が好ましい態様である。特に好ましい態様は、ヌクレオチド糖の２’位で均質に修飾されているオリゴヌクレオチド、例えば２’ ＭＯＥ、２’ ＤＭＡＯＥ、または２’アセトアミド修飾をそれぞれの位置に有するもの、またはこれらの組み合わせである。その他の好ましい修飾は、ＭＭＩ、モルホリノおよびＰＮＡ修飾を含む、バックボーン修飾であり、これらは均質なものであってもまたは他の結合と交互なものであってもよく、ＲＮＡｓｅ Ｈ切断をサポートしない限りにおいて、特にホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合である。
【００４３】
本発明にしたがって用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術を通じ、好適にそして日常的に、作製することが可能である。こうした合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を含む、いくつかの業者により、販売されている。こうした合成のための、当該技術分野において知られるいかなる他の手段を、さらに、または別に、使用してもよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を用いることが周知である。
【００４４】
本発明のアンチセンス化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成され、そして生物学的起源のアンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のｉｎ ｖｉｖｏ合成を指示するよう設計された遺伝子ベクター構築物を含まない。
【００４５】
本発明の化合物は、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤のように、取り込み、分布および／または吸収を補助するため、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、これらに被包し、これらとコンジュゲート化し、または別の方法で関連させてもよい。こうした取り込み、分布および／または吸収補助製剤の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、米国特許５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；および５，５９５，７５６が含まれ、前記特許の各々は参考文献として本明細書に援用される。
【００４６】
本発明のアンチセンス化合物は、いかなる薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際、生物学的に活性がある代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）提供することが可能な、いかなる他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示はまた、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、こうしたプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、並びに他の生物学的等価物にも関する。
【００４７】
“プロドラッグ”という用語は、内因性酵素または他の化学薬品および／または状態の作用により、体内または体の細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換される、不活性型で調製されている療法剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、１９９３年１２月９日に公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ ９３／２４５１０またはＩｍｂａｃｈらに対するＷＯ ９４／２６７６４に開示される方法にしたがったＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸）誘導体として調製される。
【００４８】
“薬学的に許容しうる塩”という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬学的に許容しうる塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そしてその望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。
【００４９】
薬学的に許容しうる塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンで形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロへキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ” Ｊ． ｏｆ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉ．， １９７７， ６６， １−１９を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、慣用的な方式で、十分な量の望ましい塩基と、遊離酸型を接触させ、塩を生じさせることにより、調製する。遊離酸型は、慣用的な方式で、酸と塩型を接触させ、そして遊離酸を単離することにより、再生してもよい。遊離酸型は、それぞれの塩型と、極性溶媒における可溶性などの特定の物理的特性において、幾分異なるが、それ以外は、本発明の目的には、該塩は、それぞれの遊離酸と同等である。本明細書において使用する場合、“薬学的付加塩”は、本発明の組成物の構成要素の１つの酸型の薬学的に許容しうる塩を含む。これらには、アミンの有機または無機酸塩が含まれる。好ましい酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩などである。他の適切な薬学的に許容しうる塩は、当業者に周知であり、そして様々な無機および有機酸の塩基性塩であって、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などの無機塩を用い；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸またはホスホ酸またはＮ−置換スルファミン酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸を用い；そして天然のタンパク質合成に関与する２０のアルファ−アミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸を用い、そしてまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−または３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートの形成と共に）を用い、あるいはアスコルビン酸などの他の酸性有機化合物を用いる、前記塩基性塩が含まれる。化合物の薬学的に許容しうる塩はまた、薬学的に許容しうる陽イオンで調製してもよい。適切な薬学的に許容しうる陽イオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四級アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩または炭酸水素塩もまた、使用可能である。
【００５０】
オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、限定されるわけではないが、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成される酸付加塩；（ｃ）例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、などの有機酸で形成される塩；並びに（ｄ）塩素、臭素、およびヨードなど元素陰イオンから形成される塩が含まれる。
【００５１】
本発明のアンチセンス化合物は、診断剤、療法剤、予防剤のため、そして研究試薬およびキットとして、利用してもよい。療法剤では、細胞の行動をモジュレートすることによって治療することが可能な疾患または障害を有すると疑われる動物、好ましくはヒトを、本発明にしたがったアンチセンス化合物を投与することによって治療することができる。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を、適切な薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーに添加することにより、医薬組成物に利用することが可能である。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はまた、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防するまたは遅延させるために、予防的に有用である可能性もある。
【００５２】
本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物が選択したｍＲＮＡ標的をコードする核酸にハイブリダイズし、サンドイッチおよび他のアッセイが、この事実を利用して容易に構築されることを可能にするため、研究および診断剤に有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、選択したｍＲＮＡ標的をコードする核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野に知られる手段によって検出することが可能である。こうした手段は、オリゴヌクレオチドに対する酵素のコンジュゲート化、オリゴヌクレオチドの放射標識または他のいずれかの適切な検出手段を含んでもよい。試料中の標的のレベルを検出するための、こうした検出手段を用いたキットもまた、調製してもよい。
【００５３】
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうかに応じ、そして治療しようとする領域に応じ、いくつかの方式で投与してもよい。投与は、局所（眼、並びに膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、例えば、噴霧器によるものを含む、粉末またはエアロゾル吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ、ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による、肺；気管内、鼻内、上皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入；あるいは頭蓋内、例えば鞘内または脳室内、投与を含む。あらゆるヌクレオチド糖の２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有する場合があるキメラ分子または分子を含む、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００５４】
局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。慣用的な薬学的キャリアー、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要であるか、または望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用である可能性がある。
【００５５】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、サシェー剤（ｓａｃｈｅｔ）または錠剤が含まれる。粘稠化剤、フレーバー剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい可能性もある。
【００５６】
非経口、鞘内または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物、例えば限定されるわけではないが、浸透増進剤、キャリアー化合物および他の薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）もまた含んでもよい、無菌水性溶液を含んでもよい。
【００５７】
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソーム含有製剤が含まれるが、これらには限定されない。これらの組成物は、既成液体、自己乳化性固体そして自己乳化性半固体が含まれる、様々な構成要素から生成することができるが、これらには限定されない。
【００５８】
単位用量剤形中に容易に提供ことができる本発明の医薬製剤は、医薬業界において周知の従来技術にしたがって調製することができる。このような技術には、活性有効成分と１または複数の医薬的担体または１または複数の医薬的賦形剤とを組み合わせる工程が含まれる。一般的には、均質にそして緊密に、活性有効成分と液体担体または正確に分割した固体担体またはその両方と組み合わせ、その後必要とされる場合には生成物を成型することにより、製剤を調製する。
【００５９】
本発明の組成物は、たとえば錠剤、カプセル、液体シロップ、軟ゲル、坐剤、および浣腸剤などの、しかしこれらには限定されない、多くの可能性のある用量剤形のいずれか中に製剤化することができる。本発明の組成物はまた、水性媒体、非水性媒体または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤はさらに、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含有してもよい。懸濁剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。
【００６０】
本発明の一態様において、医薬組成物を製剤化し、そして泡状物として使用することができる。医薬的な泡状物には、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム剤、ジェリー剤、およびリポソーム剤などの製剤を含むが、これらのものには限定されない。その性質において基本的に同様である一方、これらの製剤は、最終生成物の構成要素および密度において変化する。このような組成物および製剤の調製は、一般的に医薬および製剤の分野における当業者に知られており、そして本発明の組成物の製剤に対して適用することができる。
【００６１】
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製しそして製剤化することができる。エマルジョンは、通常は直径０．１μｍを超える液滴の形状で、一つの液体を別の液体中に分散させた典型的には不均質の系である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９；Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｐ． ３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに十分に混合され分散された２種の不混和性の液体相を含む二相システムである。一般的には、エマルジョンは、油中水型の種（ｗ／ｏ）または水中油型の種（ｏ／ｗ）のいずれかでありうる。液体相がバルクな油相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ぶ。あるいは、油相がバルクな液体相中によく分離され微小滴として分散されている場合、得られた組成物を水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ぶ。エマルジョンは、分散相と、液体相、油相のいずれか中に溶液としてあるいは別々の相としてそれ自体として存在していてもよい活性な薬物と、に加えて、さらに要素を包含していてもよい。乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤などの医薬的な賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在していてもよい。医薬的なエマルジョンは、たとえば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のような、２種以上の相を含む、マルチエマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単なる２成分のエマルジョンでは得られない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を含むマルチエマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、油性の連続相中に安定化された水の小球中に含まれる油滴のシステムは、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンを提供する。
【００６２】
エマルジョンは、熱力学的安定性をほとんど有さないかまたはまったく有さないことにより特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外部相または連続相中に十分に分散され、そして乳化剤の手段または製剤の粘性を介してこの形態に維持される。エマルジョンの相のいずれかは、エマルジョン−型軟膏基材およびクリームの場合の様に、半固体または個体であってもよい。エマルジョンを安定化するその他の手段には、エマルジョンのいずれかの相中に含まれてもよい、乳化剤を使用することが含まれる。乳化剤は、大きく４つのカテゴリーに分類される場合がある：合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基材、そして精密に分散された固体、である（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００６３】
合成サーファクタントは、界面活性剤としても知られているが、エマルジョンの製剤化において幅広い有用性が見出されており、そして文献においてもレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５； Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８８， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。サーファクタントは、典型的には、両親媒性であり、そして親水性部分と疎水性部分とを含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の性質の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、そして製剤の調製においてサーファクタントを分類しそして選択する際の貴重なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて別のクラスに分類される場合がある：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５）。
【００６４】
エマルジョン製剤中で使用される天然に存在する乳化剤には、ラノリン、密ロウ、ホスファチド類、レシチンおよびアカシアが含まれる。吸着基材は、水を吸収して、ｗ／ｏエマルジョンを形成するが、それでもそれらの半固体の硬さを維持するような、親水性特性を有し、たとえば無水ラノリンおよび親水性ワセリンがある。精密に分散された固体もまた、よい乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、そして粘着性の調製物中で使用された。これらには、重金属水酸化物；ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト（ｈｅｃｔｏｒｉｔｅ）、カオリン、モンモリロン石、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨張性クレー；色素；および炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどの非極性固体；などの極性の無機固体が含まれる。
【００６５】
非常に様々な非−乳化性物質もまた、エマルジョン製剤中に含まれ、そしてエマルジョンの特性に寄与する。これらには、脂質、油、ロウ、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。
【００６６】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（たとえば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアルガム（ｇｕａｒ ｇｕｍ）、インドゴム（ｋａｒａｙａ ｇｕｍ）、そしてトラガカント）、セルロース誘導体（たとえば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、そして合成ポリマー（たとえば、カルボマー（ｃａｒｂｏｍｅｒｓ）、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの、天然に存在するガムおよび合成のポリマーが含まれる。これらは、水中で分散しあるいは膨張して、強力な界面フィルムを分散相の滴の周囲に形成し、そして外部相の粘性を増大させることにより、エマルジョンを安定化させるコロイド溶液を形成する。
【００６７】
エマルジョンはしばしば、微生物の増殖をすぐにサポートすることができる、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどの多数の活性物質を含有するため、これらの製剤はしばしば保存剤を含む。エマルジョン製剤中に含まれる一般的に使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第４アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、そしてホウ酸が含まれる。抗酸化剤もまた、一般的にエマルジョン製剤に添加して、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル（ａｌｋｙｌ ｇａｌｌａｔｅｓ）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などのフリーラジカルスカベンジャー、およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤シナージストであってもよい。
【００６８】
外皮経路、経口経路、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の使用およびそれらの製造のための方法は、文献中でレビューされてきた（Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。経口送達のためのエマルジョン製剤は、製剤化が容易であり吸収および生物学的適合性の観点から効率的であるため、非常に幅広く使用されてきた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｉｄｓｏｎ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． １９９）。ミネラル油−ベースの緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、一般的に、ｏ／ｗエマルジョンとして経口的に投与される物質に含まれる。
【００６９】
本発明の一態様において、オリゴヌクレオチドと核酸の組成物は、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および単一の、光学的に等方性な、そして熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質、のシステムとして定義されうる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を水溶性サーファクタント溶液中に分散させ、そしてついで一般的には中間鎖長アルコールである十分量の第４の構成要素を添加して、透明なシステムを形成することにより、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンは、界面活性分子の界面フィルムにより安定化される２種の不混和性の液体の、熱力学的に安定で、等方性な、透明の分散物質としても記載された（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ， ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｒｏｓｏｆｆ， Ｍ．， Ｅｄ．， １９８９， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む、３〜５種の構成要素を組み合わせることにより調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）であるかあるいは水中油型（ｏ／ｗ）であるかは、使用される油およびサーファクタントの特性に依存し、そしてサーファクタント分子の構造のその極性頭部と炭化水素尾部の幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ， ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９８５， ｐ． ２７１）。
【００７０】
相ダイアグラムを使用した現象学的アプローチが広く研究され、そしてマイクロエマルジョンを製剤化するための方法についての、当業者に対する、包括的な知識が得られた（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５；Ｂｌｏｃｋ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤において、水−不溶性薬物を可溶化するという利点を提供する。
【００７１】
マイクロエマルジョンの調製に使用されるサーファクタントには、イオン性サーファクタント、非−イオン性サーファクタント、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉ ｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）、が、単独であるいはコサーファクタントと組み合わせて含まれるが、これらには限定されない。コサーファクタントは、通常はエタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールであるが、サーファクタントフィルム中に浸透し、そして結果的にはサーファクタント分子のあいだで生成される空隙スペースのために不規則なフィルムを作製することにより、界面流動度を増大させるために働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは、コサーファクタントを使用することなく調製することができ、そしてアルコールフリーの自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該技術分野において知られている。水相は、典型的には、水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいが、これらのものには限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中間鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化（ｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油などの物質が含まれうるが、これらのものには限定されない。
【００７２】
マイクロエマルジョンは、薬物溶解性および薬物の吸収亢進の観点から、特に興味深いものである。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口生物学的適合性を亢進させると提唱された（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ， Ｍｅｔｈ． Ｆｉｎｄ． Ｅｘｐ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９３， １３， ２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物溶解性の向上、酵素的加水分解からの薬物の保護、膜流動度および膜透過性におけるサーファクタント−誘導性変化による薬物吸収の亢進の可能性、調製の容易性、固体用量剤形を超える経口投与の容易性、臨床的可能性の向上、および毒性の低減といった利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９４， １１， １３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９６， ８５， １３８−１４３）。それらの構成要素を周囲温度において一緒にしておくと、しばしば、マイクロエマルジョンが自発的に形成される場合がある。このことは、易熱性（熱不安定性）薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを製剤化する際に、特に利点でありうる。マイクロエマルジョンは、美容用途および医薬用との両方において、活性構成要素の経皮的送達においても有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸の全身性吸収の増加を促進し、および胃腸管、膣、口腔（ｂｕｃｃａｌ ｃａｖｉｔｙ）およびその他の投与領域中で、オリゴヌクレオチドおよび核酸の局所的細胞取り込みを向上させることができる。
【００７３】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾル（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透亢進剤などの追加の構成要素および添加剤を含有して、製剤の特性を向上させ、そして本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸収を亢進させることもできる。本発明のマイクロエマルジョン中で使用される浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリーのうちの一つに属するものとして分類することができる：サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、および非−キレート非−サーファクタント（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ． ９２）。これらのクラスのそれぞれは、上述した。
【００７４】
リポソーム
マイクロエマルジョン以外に、薬物の製剤化のために研究されそして使用された、多くの有機（ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）サーファクタント構造が存在する。これらには、単層、ミセル、二重層および小胞が含まれる。小胞、たとえばリポソーム、は、薬物送達の観点からそれらが提供する、その特異性および作用期間により、大きな興味をひきつけた。本明細書中で使用される場合、“リポソーム”という用語は、球状の１または複数の二重層中に配置された、両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【００７５】
リポソームは、親油性物質から形成される膜および水性の内部を有する、単一ラメラ小胞またはマルチラメラ小胞である。水性部分には、送達すべき組成物が含有される。カチオン性リポソームは、細胞壁と融合することができるという利点を有する。非−カチオン性リポソームは、細胞壁とは効率的に融合することができないものの、マクロファージによりｉｎ ｖｉｖｏにおいて取り込まれる。
【００７６】
無傷のほ乳動物皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響のもと、それぞれが直径５０ ｎｍ未満であるような一連の微細な孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形しやすくそしてそのような微細な孔を通過することができるリポソームを使用することが好ましい。
【００７７】
リポソームのさらなる利点には、以下のものが含まれる；天然のリン脂質から得られたリポソームは、生物学的適合性であり、そして生体分解性なものである；リポソームは、幅広い水溶性薬物および脂質可溶性薬物を含むことができる；リポソームは、その内部コンパートメント中のカプセル化した薬物を代謝および分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要事項は、脂質表面荷電、小胞サイズ、そしてリポソームの水容積である。
【００７８】
リポソームは、活性成分を作用部位に移送および送達するために有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と類似しているため、リポソームを組織に使用する場合には、リポソームを細胞膜に溶け込ませるようにはじめる。リポソームと細胞の溶融が進行するにつれて、リポソーム内容物は、活性剤が作用することができる細胞中へ移る。
【００７９】
リポソーム製剤は、多くの薬物についての送達様式として、幅広い研究の焦点である。局所投与のために、リポソームは、他の製剤を超えるいくつかの利点を提供するという証拠がますます多くなっている。このような利点には、投与された薬物の高い全身性吸収に関連した副作用の減少、所望される標的での投与された薬物の蓄積の増加、そして親水性および疎水性の両方の様々な薬物を皮膚中に投与する能力、が含まれる。
【００８０】
いくつかの報告は、リポソームが高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚中に送達する能力について詳細に説明した。鎮痛剤、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物を、皮膚に投与した。投与の多くは、結果として外皮の上部を標的とした。
【００８１】
リポソームは、２つの幅広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、マイナス（−）に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する、プラス（＋）に荷電したリポソームである。プラスに荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、マイナスに荷電した細胞表面に結合し、そしてエンドソーム中に内部化される。エンドソーム中の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８７， １４７， ９８０−９８５）。
【００８２】
ｐＨ−感受性あるいはマイナスに荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するというよりは、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質の両方が同様に荷電するため、複合体の形成ではなく反発（ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ）が生じる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部中に捕捉される。ｐＨ−感受性リポソームを使用して、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養中の細胞単層に送達させた。外来性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９９２， １９， ２６９−２７４）。
【００８３】
リポソーム組成物の１つの主要な型には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、たとえば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般的に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、一方でアニオン性フソジェニックな（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の型は、たとえば、ダイズホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびタマゴＰＣなどのＰＣから形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【００８４】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤製剤の局所投与が評価された。インターフェロンを含有するリポソームをモルモット皮膚に対して使用すると、結果として皮膚のヘルペス潰瘍が減少したが、その他の手段（たとえば溶液またはエマルジョン）を介してインターフェロンの送達をしても有効ではなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， １９９２， ２， ４０５−４１０）。さらに、別の研究は、水性システムを用いたインターフェロンの投与に対する、リポソーム製剤の一部として投与したインターフェロンの効率を試験し、そしてリポソーム製剤は水性投与よりも優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９２， １８， ２５９−２６５）．
薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために、非−イオン性リポソームシステム、特に、非−イオン性サーファクタントおよびコレステロールを含むシステムを調べた。ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅＴＭ ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非−イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮中に送達した。結果から、このような非−イオン性リポソームシステムは、シクロスポリン−Ａが皮膚の別の層中に沈着することを促進する際に効果的であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ． Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．， １９９４， ４， ６， ４６６）。
【００８５】
リポソームには、“立体化学的に安定な”リポソームも含まれるが、この用語は本明細書中で使用される場合、１またはそれ以上の特殊な（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）脂質であって、リポソーム中に取り込まれた場合、そのような特殊な脂質を含まないリポソームと比較して、循環血中での寿命が長くなる脂質、を含むリポソームのことをいう。立体化学的に安定なリポソームの例は、リポソームの小胞−形成性脂質部分の一部分が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１またはそれ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化されている、ものがある。いずれかの具体的な理論に縛られることを望むわけではないが、当該技術分野においては、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ−誘導体化脂質を含有する少なくとも立体化学的に安定なリポソームについて、これらの立体化学的に安定なリポソームの循環系での半減期が増加しているのは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への取り込みが減少したことに由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７， ２２３， ４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ５３， ３７６５）。１またはそれ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９８７， ５０７， ６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシドおよびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を向上させる能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９８８， ８５， ６９４９）により述べられた。米国特許Ｎｏ． ４，８３７，０２８およびＷＯ ８８／０４９２４は、両方ともＡｌｌｅｎらによるものであるが、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１または硫酸ガラクトセレブロシドエステル、を含むリポソームを開示する。米国特許Ｎｏ． ５，５４３，１５２（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ ９７／１３４９９（Ｌｉｍら）中に開示されている。
【００８６】
１またはそれ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその製造方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｊｐｎ．， １９８０， ５３， ２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇ、を含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９８４， １６７， ７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の顕著な増加を引き起こすことに注目した。ポリアルキレングリコール（たとえば、ＰＥＧ）のカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ）基の結合により修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓにより記載されている（米国特許Ｎｏｓ． ４，４２６，３３０および４，５３４，８９９）。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， １９９０， ２６８， ２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームは、血液循環中での半減期が顕著に増加することを示す実験を記載した。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９０， １０２９， ９１）は、そのような知見をその他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質、たとえば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ、に拡張した。共有結合したＰＥＧ部分をその外側表面に有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒに対する欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４４５ １３１ Ｂ１およびＷＯ ９０／０４３８４中に記載される。ＰＥＧにより誘導体化された１〜２０モル％のＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許Ｎｏｓ． ５，０１３，５５６および５，３５６，６３３）およびＭａｒｔｉｎら（米国特許Ｎｏ． ５，２１３，８０４および欧州特許Ｎｏ． ＥＰ ０ ４９６ ８１３ Ｂ１）により記載される。多数のその他の脂質−ポリマー複合体を含むリポソームは、ＷＯ ９１／０５５４５および米国特許Ｎｏ． ５，２２５，２１２（両方ともＭａｒｔｉｎら）およびＷＯ ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）において記載される。ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許Ｎｏｓ． ５，５４０，９３５（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および５，５５６，９４８（Ｔａｇａｗａら）は、その表面に対して官能基部分をさらに誘導体化することができる、ＰＥＧ−含有リポソームを記載する。
【００８７】
核酸を含む限定的な数のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらに対するＷＯ ９６／４００６２は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示する。Ｔａｇａｗａらに対する米国特許Ｎｏ． ５，２６４，２２１は、タンパク質−結合リポソームを開示し、そしてそのようなリポソームの内容物にはアンチセンスＲＮＡが含まれうることを明らかにしている。Ｒａｈｍａｎらに対する米国特許Ｎｏ． ５，６６５，７１０は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法を記載する。Ｌｏｖｅらに対するＷＯ ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示する。
【００８８】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、リポソームのさらに別の型であり、そして非常に変形可能な脂質集合物であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補物である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、小滴よりも小さな孔を介して容易に浸透することができる、脂質小滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらを使用する環境に適応することができ、たとえばそれらは、自己−最適性（皮膚の孔の形状に適応する）であり、自己−修復性であり、しばしば断片化されることなくそれらの標的に到達し、そしてしばしば自己−負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するため、標準的なリポソーム組成物に対して、表面強力アクチベーター（ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）、通常はサーファクタント、を添加することができる。トランスファーソームを使用して、皮膚に対して血清アルブミンを送達した。血清アルブミンのトランスファーソーム−媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液を皮下に注入する方法と同様に効率的であることが示された。
【００８９】
サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームなどの製剤において、幅広い用途が見いだされる。多くの様々なタイプのサーファクタントの特性を、天然のサーファクタントおよび合成のサーファクタントの両方ともについて分類しそしてランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（“ヘッド”としても知られる）の性質は、製剤に使用する様々なサーファクタントをカテゴリー化に対して最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【００９０】
サーファクタント分子がイオン化されていない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、医薬生成物および化粧用生成物において幅広い用途を見いだされ、そして幅広いｐＨ値にわたって使用することができる。一般的には、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲にわたる。非イオン性サーファクタントには、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、そしてエトキシ化（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ）エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｓ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的な構成物質である。
【００９１】
サーファクタント分子が、水中に溶解しまたは分散させる場合に負（−）の荷電を有する場合、サーファクタントはアニオン性と分類される。アニオン性サーファクタントには、石けんなどのカルボン酸エステル、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅｓ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩などの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステル、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅｓ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅｓ）およびスルホコハク酸塩などのスルホン酸エステル、およびホスフェートが含まれる。アニオン性サーファクタントのクラスの最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石けんである。
【００９２】
サーファクタント分子が、水中に溶解されまたは分散される場合に正（＋）の荷電を有する場合、サーファクタントはカチオン性と分類される。カチオン性サーファクタントには、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される構成物質である。
【００９３】
サーファクタント分子が正（＋）の荷電または負（−）の荷電のいずれをも有する能力を有する場合、サーファクタントは両性として分類される。両性サーファクタントには、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド類、Ｎ−アルキルベタイン類およびホスファチド類が含まれる。
【００９４】
薬剤生成物、製剤およびエマルジョン中でのサーファクタントの使用は、以下にレビューされている（Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， １９８８， ｐ． ２８５）。
【００９５】
浸透亢進剤
一態様において、本発明は、様々な浸透亢進剤を使用して、核酸、特にオリゴヌクレオチドの、動物の皮膚に対する効率的な送達を達成する。ほとんどの薬剤は、イオン化型および非イオン化型の両方において溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂質可溶性あるいは親油性薬物のみが容易に細胞膜を通過する。非−親油性薬物でさえも、通過すべき膜を浸透亢進剤により処理される場合には、細胞膜を通過することができることを見出した。非−親油性薬物の細胞膜を通じた拡散を補助することに加えて、浸透亢進剤はまた、親油性薬物の透過性も向上させる。
【００９６】
浸透亢進剤は、５つの幅広いカテゴリー、すなわち、サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、そして非−キレート非−サーファクタント、の一つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）。浸透亢進剤の上述したクラスのそれぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【００９７】
サーファクタント：本発明に関連して、サーファクタント（あるいは“表面−活性剤”）は、水溶液中に溶解した場合に、溶液の表面張力または水溶液と別の液体とのあいだの界面張力を減少する化学的単位であり、粘膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が亢進されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透亢進剤には、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２）；およびＦＣ−４３などのパーフルオロ化学物質エマルジョン（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８８， ４０， ２５２）が含まれる。
【００９８】
脂肪酸：浸透亢進剤として機能する様々な脂肪酸およびその誘導体には、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（たとえば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、およびそれらのモノ−およびジ−グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９９２， ４４， ６５１−６５４）。
【００９９】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂肪可溶性ビタミンの分散および吸収を促進することが含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．， Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｅｄｓ．， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９６， ｐｐ． ９３４−９３５）。様々な天然の胆汁酸塩、およびその合成誘導体は、浸透亢進剤として機能する。このように、用語“胆汁酸塩”には、胆汁の天然に存在する構成成分のいずれかだけでなく、それらの合成誘導体のいずれかが含まれる。本発明の胆汁酸塩には、たとえば、コール酸（あるいはその医薬的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルココール酸（ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ）ナトリウム）、グリココール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ， Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， Ｇｅｎｎａｒｏ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９９０， ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．， １９９２， ２６３， ２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， １９９０， ７９， ５７９−５８３）。
【０１００】
キレート剤：本発明と関連して使用される場合、キレート剤は、それとともに複合体を形成することにより、金属イオンを溶液から取り除く化合物として定義することができ、粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を向上させるという結果を伴う。本発明における浸透亢進剤としてのその使用に関して、キレート剤は、最も特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼがその触媒のために二価の金属イオンを必要としそしてしたがってキレート剤により阻害されることから、ＤＮａｓｅ阻害剤としても機能するという追加の利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．， １９９３， ６１８， ３１５−３３９）。本発明のキレート剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（たとえば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらには限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．， １９９０， １４， ４３−５１）。
【０１０１】
非−キレート非−サーファクタント：本明細書中で使用する場合、非−キレート非−サーファクタント浸透亢進性化合物は、キレート剤としてあるいはサーファクタントとしてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず栄養粘膜を介してオリゴヌクレオチドの吸収を亢進する、化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９０， ７， １−３３）。浸透亢進剤のこのクラスには、たとえば、不飽和環状ウレア、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， １９９１， ｐａｇｅ ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非−ステロイド性抗炎症性薬剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １９８７， ３９， ６２１−６２６）が含まれる。
【０１０２】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進する薬剤を、本発明の医薬組成物およびその他の組成物に添加することもできる。たとえば、リポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ， 米国特許Ｎｏ． ５，７０５，１８８）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／３０７３１）も、オリゴヌクレオチドの細胞性取り込みを亢進することが知られている。
【０１０３】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン（ａｚｏｎｅ）、およびリモネンおよびメントンなどのテルペンを含むその他の薬剤を使用して、投与される核酸の浸透を亢進することができる。
【０１０４】
担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込む。本明細書中で使用する場合、“担体化合物”または“担体”は、不活性である（すなわち、それ自体生物学的活性を有さない）が、しかし、たとえば、生物学的に活性な核酸を分解しまたはその循環からの除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸の生物学的利用性を減少するｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより、核酸として認識される、核酸、またはその類似体のことをいうことができる。核酸と担体化合物（典型的には担体化合物を過剰量）の共投与により、おそらくは担体化合物と核酸との、一般的な受容体に対する競合により、結果として、肝臓、腎臓、またはその他の循環外レゼルボア中で回収される核酸の量の実質的な減少が引き起こされる。たとえば、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸あるいは４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸とともに共投与する場合、肝臓組織中での部分的ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの回収を減少することができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ．， １９９５， ５， １１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．， １９９６， ６， １７７−１８３）。
【０１０５】
賦形剤
担体化合物と対照的に、“医薬的な担体”または“賦形剤”は、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤または動物に対して１またはそれ以上の核酸を送達するためのいずれかその他の医薬的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体であってもあるいは固体であってもよく、そして、想定した計画された様式の投与により、所定の医薬組成物の核酸およびその他の構成要素と組み合わせた場合、所望のバルク、粘度などを提供するように選択される。典型的な医薬的な担体には、結合剤（たとえば、α化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（たとえば、ラクトースおよびその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリル酸またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状シリコンジオキシド、ステアリン酸、金属性ステアリン酸、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（たとえば、スターチ、スターチグリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が含まれるが、これらには限定されない。
【０１０６】
核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を製剤化することもできる。適した医薬的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０７】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌水溶液および非−滅菌水溶液、アルコールなどの一般的溶媒中での非−水溶液、または液体または固体油状基剤中の核酸の溶液が含まれてもよい。溶液には、バッファー、希釈剤およびその他の適した添加剤を含有してもよい。核酸と心身に有害には反応しない非−非経口性投与に適した医薬的に許容可能な有機賦形剤あるいは無機賦形剤を使用することができる。
【０１０８】
適した医薬的に許容可能な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらには限定されない。
【０１０９】
その他の構成要素
本発明の組成物にはさらに、医薬組成物中に従来から見出されるその他の補助剤構成要素を、当該技術分野で確立した使用レベルで含有することができる。このように、たとえば、組成物には、たとえば鎮痒薬、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的で適合性な医薬的に活性な物質を含有することができ、または本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の物質、たとえば色素、着香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤など、を含有することができる。しかしながら、このような物質は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。製剤を滅菌することができ、そして所望の場合には、製剤の（１またはそれ以上の）核酸と心身に有害に相互作用しない補助剤、たとえば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、オスモル圧に影響を与える塩、バッファー、着色剤、着香料および／または芳香性物質などと混合することができる。
【０１１０】
水性懸濁液には、たとえば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む、懸濁疫の粘度を増加する物質を含有することができる。懸濁疫には、安定化剤を含有してもよい。
【０１１１】
本発明の特定の態様は、（ａ）１またはそれ以上のアンチセンス化合物、および（ｂ）非−アンチセンスメカニズムにより機能する１またはそれ以上のその他の化学療法剤、を含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法剤の例には、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン（ＣＡ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの抗ガン薬物を含むが、これらには限定されない（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐａｇｅｓ １２０６−１２２８を参照）。非ステロイド性抗炎症性薬物およびコルチコステロイドを含む抗炎症性薬物（しかしこれらには限定されない）、およびリビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン（ｖｉｄａｒａｂｉｎｅ）、アシクロビルおよびガンシクロバーを含む抗ウィルス性薬物（しかしこれらには限定されない）を、本発明の組成物中に組み合わせることができる（一般的には、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ， １５ｔｈ Ｅｄ．， Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７， Ｒａｈｗａｙ， Ｎ．Ｊ．， ｐａｇｅｓ ２４９９−２５０６ ａｎｄ ４６−４９， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙを参照）。その他の非−アンチセンス化学療法剤も、本発明の範囲に含まれる。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１１２】
別の関連する態様において、本発明の組成物には第一の核酸を標的とする、１またはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする１またはそれ以上の追加のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを含有することができる。数多くのアンチセンス化合物の例が当該技術分野で知られている。２つまたはそれ以上の組み合わせ化合物を、一緒にあるいは連続的に使用することができる。
【０１１３】
治療用組成物の製剤化およびそれに引き続く投与は、当該技術分野の範囲内のものであると考えられる。用量は、治療すべき疾患状態の重症度および反応性に依存し、数日間から数ヶ月間持続する治療経過、あるいは治癒が得られるかまたは疾患の減退が得られるまでの治療経過を伴う。最適な用量スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積を測定することから算出することができる。当業者であれば、最適用量、投与方法、および反復頻度を容易に決定することができる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの比効力に依存して変更することができ、そして一般的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいて効果的であることが見いだされるＥＣ５０に基づいて見積もることができる。一般的には、用量は、０．０１μｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重であり、そして１日、１週間、１ヶ月、あるいは１年に一度またはそれ以上与えることができ、あるいは２〜２０年ごとに１度であってもよい。当業者は、体液あるいは組織における薬物の滞留時間および濃度に基づいて、投与のための反復頻度を容易に見積もることができる。継続的な治療により、患者に維持療法を受けさせて、疾患状態の再発を防止することが好ましく、ここでオリゴヌクレオチドは、１日に１回またはそれ以上〜２０年間ごとに１回で、０．０１μｇ〜１００ ｇ／ｋｇ体重の範囲で、維持用量で投与する。
【０１１４】
本発明特定のその好ましい態様にしたがって、具体的に記載されるが、以下の実施例は、本発明の説明のためにのみ提供し、そして本発明を限定することを意図するものではない。
【０１１５】
【実施例】
実施例１
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイト
デオキシ及び２’−アルコキシアミダイト
２’−デオキシ及び２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトを販売元（例えば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ またはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）より購入した。他の２’−Ｏ−アルコキシ置換ヌクレオシドアミダイトは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０６，３５１に記載の通り調製する。２’−アルコキシアミダイトを用いてオリゴヌクレオチドを合成するために、テトラゾール及び塩基のパルスデリバリー後の待機段階を３６０秒に増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サイクルを使用した。
【０１１６】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、市販のホスホールアミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡまたはＣｈｅｍＧｅｎｅｓ， Ｎｅｅｄｈａｍ ＭＡ）を用いて公表された方法〔Ｓａｎｇｈｖｉ ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９３， ２１， ３１９７−３２０３〕に従って合成した。
【０１１７】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト
２’−フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される以前に記載の通り〔Ｋａｗａｓａｋｉら、 Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９３， ３６， ８３１−８４１〕、及び、アメリカ合衆国特許５，６７０，６３３に記載の通り合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドであるＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンは、市販の９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、そして文献手法を修正して、２’−α−フルオロ原子を２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換により導入することより、合成した。このようにＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンは中程度の収量で３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として選択的に保護した。ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は標準的な手法論を用いて成され、そして標準手法を用いて５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイト中間体を得た。
【０１１８】
２’−フルオロデオキシグアノシン
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成はテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）で保護した９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として用い、そして、中間体であるジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換により成された。ＴＰＤＳ基の脱保護に続いて水酸基のＴＨＰによる保護によりジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフラート化に続き、フルオリドによる粗生成物の処理をし、その後ＴＨＰ基の脱保護をした。標準的な方法論を使用し、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホールアミダイトを得た。
【０１１９】
２’−フルオロウリジン
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％フッ化水素−ピリジン（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で処理する、文献手法の修正により成された。標準的な手法を用いて５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１２０】
２’−フルオロデオキシシチジン
２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化を介して合成され、次に選択的な保護によりＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な手法を用いて、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホールアミダイトを得た。
【０１２１】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト
２’−Ｏ−メトキシエチル−置換ヌクレオシドアミダイトは、次の通り、あるいは、Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ．（Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４）の方法に従って調製した。
【０１２２】
２，２’−アンヒドロ〔１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン〕
５−メチルウリジン（Ｙａｍａｓａ， Ｃｈｏｓｈｉ， Ｊａｐａｎにより市販され入手可能な、リボシルチミン）（７２．０ ｇ、０．２７９ Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ ｇ、０．４２０ Ｍ）及び炭酸水素ナトリウム（２．０ ｇ、０．０２４ Ｍ）をＤＭＦ（３００ ｍＬ）に加えた。混合物を熱して攪拌しながら還流し、発生する二酸化炭素ガスを制御された方法で放出させた。１時間後、わずかに黒ずんだ溶液を、低圧下、濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（２．５ Ｌ）中に注いだ。産物はガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして、残渣を最小量のメタノール（約４００ ｍＬ）に溶解した。溶液をフレッシュなエーテル（２．５ Ｌ）に注ぎ入れ、硬いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブンで乾燥させ（６０℃、１ ｍｍ Ｈｇで２４時間）、得られた固体を砕いて淡い黄褐色の粉末にした（５７ ｇ、８５％粗収率）。ＮＭＲスペクトルは、そのナトリウム塩としてフェノールが混じった（約５％）構造と一致した。その物質はさらに続く反応に用いられた（あるいはに酢酸エチル中のメタノールの勾配（１０−２５％）を利用したカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製して融点２２２−４℃の白色の固体を得ることができる）。
【０１２３】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン
２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ ｇ、０．８１ Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸（２３１ ｇ、０．９８ Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２ Ｌ）を、２ Ｌステンレススチール圧力容器に加え、１６０℃に予熱した油浴中に設置した。１５５−１６０℃で４８時間熱した後、容器を開き、そして、溶液を蒸発させて乾燥させ、次にメタノール（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣を熱したアセトン（１ Ｌ）中に懸濁した。不溶の塩を濾過し、アセトン（１５０ ｍＬ）で洗浄し、そして、濾過物を蒸発させた。残渣を（２８０ ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ ｍＬ）に溶解させ、次に、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ ｋｇ）を０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中に充填した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ ｍＬ）中に溶解し、そして、シリカ（１５０ ｇ）に吸着させた後、カラムにロードした。生成物は充填溶媒とともに溶出され、１６０ ｇ（６３％）の産物を得た。不純な分画をやり直すことにより、追加の物質を得た。
【０１２４】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ ｇ、０．５０６ Ｍ）をピリジン（２５０ ｍＬ）と共に蒸発させ、次に、乾燥させた残渣をピリジン（１．３ Ｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの一番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、混合液を室温で１時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート（９４．３ ｇ、０．２７８ Ｍ）を加え、そして、反応液をさらに１時間攪拌した。メタノール（１７０ ｍＬ）を次に加え、反応を停止した。ＨＰＬＣにより、約７０％の産物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、そして、ＣＨ３ＣＮ（２００ ｍＬ）中で磨砕した。残渣をＣＨＣｌ３（１．５ Ｌ）に溶解し、次に、２×５００ ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び２×５００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして、蒸発させた。２７５ ｇの残渣が得られた。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、充填し、そして、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出した。純粋な分画を蒸発させ、１６４ ｇの生成物を得た。さらに約２０ ｇが不純な分画より得られ、全収量１８３ ｇ（５７％）を得た。
【０１２５】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ ｇ、０．１６７ Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ ｍＬのＤＭＦと１８８ ｍＬのピリジンから調製された３：１の混合液７５０ ｍＬ）、及び、無水酢酸（２４．３８ ｍＬ、０．２５８ Ｍ）を混合し、そして、室温で２４時間攪拌した。反応は、ＴＬＣ試料にＭｅＯＨを添加し初めに急冷すること（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）によりＴＬＣによりモニターした。ＴＬＣにより判断した反応の終了時に、ＭｅＯＨ（５０ ｍＬ）を加え、混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ３（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、２×２００ ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム及び２×２００ ｍＬの飽和ＮａＣｌにより抽出した。水層を２００ ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させ、１２２ ｇ（約９０％生成物）の残渣を得た。残渣を３．５ ｋｇシリカゲルカラムで精製し、そして、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出した。純粋な生成物分画を蒸発させ、９６ ｇ（８４％）を得た。後の分画より追加の１．５ ｇを回収した。
【０１２６】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
はじめの溶液は、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ ｇ、０．１４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ ｍＬ）に溶かすことにより調製し、そして、とり置いた。トリエチルアミン（１８９ ｍＬ、１．４４ Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（１ Ｌ）中トリアゾール（９０ ｇ、１．３ Ｍ）溶液に加えて、−５℃に冷却し、そして、オーバーヘッドスターラーを使用して０．５時間攪拌した。０−１０℃に維持した攪拌溶液に、３０分間、ＰＯＣｌ３を滴下して加え、そして得られた混合液をさらに２時間攪拌した。はじめの溶液を後者の溶液に、４５分間をかけて滴下して加えた。得られた反応混合物をコールドルームに一晩保存した。反応混合物から塩を濾過し、そして、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１ Ｌ）に溶解し、次に、不溶の固体を濾過により除去した。濾過物を１×３００ ｍＬのＮａＨＣＯ３及び２×３００ ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中で磨砕し、表題の化合物を得た。
【０１２７】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
ジオキサン（５００ ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（３０ ｍＬ）中３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ ｇ、０．１４１ Ｍ）溶液を、室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２×２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００ ｍＬ）に溶解し、２リットルステンレススチール圧力容器に移した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ ｍＬ）を加え、その容器を１００℃、２時間熱した（完全な変換がＴＬＣにより示された）。容器の内容物を蒸発させて乾燥し、そして、残渣をＥｔＯＡｃ（５００ ｍＬ）に溶解し、次に、飽和ＮａＣｌ（２００ ｍＬ）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、溶媒を蒸発させて８５ ｇ（９５％）の表題の化合物を得た。
【０１２８】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ ｇ、０．１３４ Ｍ）をＤＭＦ（８００ ｍＬ）に溶解し、次に、無水安息香酸（３７．２ ｇ、０．１６５ Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌後、反応が約９５％終了したことをＴＬＣが示した。溶媒を蒸発させ、そして、残渣をＭｅＯＨ（２００ ｍＬ）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ３（７００ ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２×３００ ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて残渣（９６ ｇ）を得た。残渣を、溶出溶媒として０．５％Ｅｔ３ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ ｇ（９０％）の表題化合物を得た。
【０１２９】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ ｇ、０．１０ Ｍ）をＣＨ２Ｃｌ２（１ Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ−（イソプロピル）亜リン酸塩（４０．５ ｍＬ、０．１２３ Ｍ）を窒素気体条件下、攪拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時間攪拌した（反応が９５％終了したことをＴＬＣが示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１×３００ ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３×３００ ｍＬ）で抽出した。水層洗浄液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ ｍＬ）で逆抽出し、次に抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させそして濃縮した。得られた残渣は、溶出溶媒としてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を使用して、１．５ ｋｇシリカカラムでクロマトグラフィーにより分離した。純粋な分画を合わせて、９０．６ ｇ（８７％）の表題化合物を得た。
【０１３０】
２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト及び２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野において２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］は次の段落で記載される通り、調製される。アデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトは、環外のアミンがアデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル基により保護され、また、グアノシンの場合はイソブチリルにより保護されることを除いては、チミジン（５−メチルウリジン）と同様に調製される。
【０１３１】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ． Ｂｉｏ． Ｓｉｎｔ．， Ｖａｒｅｓｅ， Ｉｔａｌｙ， １００．０ ｇ、０．４１６ ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ ｇ、０．０１３ ｅｑ、０．００５４ ｍｍｏｌ）を、アルゴン気体条件下、周囲温度で、また、機械的に攪拌しながら、無水ピリジン（５００ ｍｌ）に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ ｇ、１１９．０ ｍＬ、１．１ ｅｑ、０．４５８ ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物は周囲温度で１６時間攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ ０．２２、酢酸エチル）により反応が終了したことが示された。溶液を減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。これを、ジクロロメタン（１ Ｌ）、及び、飽和炭酸水素ナトリウム（２×１ Ｌ）及びブライン（１ Ｌ）間で分配させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして、減圧下、濃縮して濃厚な油状物にした。油を酢酸エチルとエチルエーテルの１：１の混合液（６００ ｍＬ）に溶解し、次に、溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶生成物は、濾過により集めて、エチルエーテル（３×２００ ｍＬ）で洗浄し、さらに、乾燥して（４０℃、１ ｍｍ Ｈｇ，、２４ 時間）、１４９ ｇ（７４．８％）の白色の固体にした。ＴＬＣ及びＮＭＲは純粋な生成物と一致した。
【０１３２】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２ Ｌステンレススチール、非攪拌圧力反応器にテトラヒドロフラン中のボラン（１．０ Ｍ、２．０ ｅｑ、６２２ ｍＬ）を加えた。換気フード内で、手動で攪拌しながらエチレングリコール（３５０ ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生がおさまるまで、はじめは注意深く加えた。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ ｇ、０．３１１ ｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（０．０７４ ｇ、０．００３ ｅｑ）を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密閉し、そして、内部温度が１６０℃に達するまで油浴中で熱し、そして次に１６時間維持した（圧力＜ １００ ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度まで冷却し、そして、開けた。ＴＬＣ（望ましい生成物はＲｆ ０．６７ 及びａｒａ−Ｔ副生成物はＲｆ ０．８２、酢酸エチル）は約７０％が生成物に変換したことを示した。さらに副生成物ができるのを避けるため、反応を停止し、減圧下（１０から１ ｍｍ Ｈｇ）、湯浴中（４０−１００℃）で、エチレングリコールを除くために使われるより極度の条件で、濃縮した。［あるいは、一度低沸点溶媒がなくなったら、残りの溶液を酢酸エチルと水の間で分配し得る。生成物は有機相にあるだろう。］残渣をカラムクロマトグラフィー（２ ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１から４：１）により精製した。適切な分画を合わせ、除き、そして、乾燥させて、白色のカリカリ（ｃｒｉｓｐ）した泡状物（８４ ｇ、５０％）、混在した出発物質（１７．４ ｇ）、及び、純粋な再利用できる出発物質２０ ｇを得た。出発物質、純度の低い回収した出発物質をもとにした収率は５８％だった。ＴＬＣ及びＮＭＲは、９９％の純度の生成物と一致した。
【０１３３】
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ ｇ、３６．９８ ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ ｇ、４４．３６ ｍｍｏｌ）と混ぜた。その後、強い減圧条件下、４０℃、２日間、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。反応混合液をアルゴンをフラッシュし（ｆｌｕｓｈｅｄ）そして、無水ＴＨＦ（３６９．８ ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、確実に密閉させた瓶）を加えて、透明な液体を得た。ジエチルーアゾジカルボン酸塩（６．９８ ｍＬ、４４．３６ ｍｍｏｌ）を反応混合液に滴下して加えた。添加する速度は、生じる深い赤い色が次の滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が終了した後、反応物を４時間攪拌した。その頃までに、ＴＬＣにより反応の終了が示された（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。減圧下、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出し、２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色の泡状物（２１．８１９ ｇ、８６％）として得た。
【０１３４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（〔２−フタルイミドオキシ）エチル〕−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ ｇ、４．５ ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ ｍＬ）に溶解し、そして、メチルヒドラジン（３００ ｍＬ、４．６４ ｍｍｏｌ）を−１０℃から０℃において滴下して加えた。１時間後、混合物を濾過し、濾過物を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、そして、合わせた有機相を水、ブラインで洗浄して、次に、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶液を濃縮して２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得て、それを次にＭｅＯＨ（６７．５ ｍＬ）に溶解した。これにホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１ ｅｑ．）を加え、そして、得られた混合物を１時間攪拌した。溶媒を減圧下で除き；残渣をクロマトグラフィーで分離して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡（１．９５ ｇ、７８％）として得た。
【０１３５】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル〕−５−メチルウリジン（１．７７ ｇ、３．１２ ｍｍｏｌ）を１ Ｍ ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）の溶液に溶解した。シアノホウ化水素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を、１０℃、不活性気体条件下で、この溶液に加えた。反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取り出し、室温で２時間攪拌し、反応をＴＬＣでモニターした（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ ｍＬ）を加え、そして、酢酸エチルで抽出した（２×２０ ｍＬ）。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて乾燥状態にした。残渣を、ＭｅＯＨ（３０．６ ｍＬ）中の１ Ｍ ＰＰＴＳ溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ、３０ ｍＬ、３．３７ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合液を氷浴中で１０℃に冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（０．３９ ｇ、６．１３ ｍｍｏｌ）を加え、そして、反応混合物を１０℃、１０分間攪拌した。１０分後、反応混合液を氷浴から取り出し、そして、室温で２時間攪拌した。反応混合液に５％ＮａＨＣＯ３（２５ ｍＬ）溶液を加え、そして、酢酸エチル（２×２５ ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、次に、蒸発させて乾燥状態にした。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨで溶出し、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジンを白色の泡状物（１４．６ ｇ、８０％）として得た。
【０１３６】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオリド（３．９１ ｍＬ、２４．０ ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ ｍＬ、１２ ｍｍｏｌ、無水ＫＯＨで維持）に溶解した。このトリエチルアミン−２ＨＦの混合物を、次に、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−〔Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル〕−５−メチルウリジン（１．４０ ｇ、２．４ ｍｍｏｌ）に加えて、そして、室温で２４時間攪拌した。反応をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中５％ＭｅＯＨ）によりモニターした。溶媒を減圧下、取り除き、そして、残渣をフラッシュカラムにのせ、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで溶出して、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ ｍｇ、９２．５％）を得た。
【０１３７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ ｍｇ、２．１７ ｍｍｏｌ）を、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、無水ピリジン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させた。得られた残渣をアルゴン気体条件下、ピリジン（１１ ｍＬ）に溶解した。４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ ｍｇ、２．６０ ｍｍｏｌ）を混合液に加え、そして、反応混合物を室温で、出発物質の全量がなくなるまで攪拌した。ピリジンを減圧下取り除き、次に、残渣をクロマトグラフィーで分離し、そして、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ（ピリジンを数滴含む）で溶出し、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ ｇ、８０％）を得た。
【０１３８】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）をトルエン（２０ ｍＬ）と共に蒸発させる。残渣にＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラゾニド（０．２９ ｇ、１．６７ ｍｍｏｌ）を加えて、次に、強い減圧条件下、４０℃で一晩、Ｐ２Ｏ５で乾燥させた。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ ｍＬ）に溶解し、そして、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトライソプロピルホスホールアミダイト（２．１２ ｍＬ、６．０８ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を周囲温度で４時間、不活性気体条件下で攪拌した。反応の進行を、ＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル １：１）でモニターした。溶媒を蒸発させ、次に、残渣を酢酸エチル（７０ ｍＬ）に溶解し、そして、５％ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、また、濃縮した。得られた残渣をクロマトグラフィーにより分離し（溶出溶媒としては酢酸エチル）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕（１．０４ ｇ、７４．９％）を泡状物として得た。
【０１３９】
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト
２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト〔当該技術分野において、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる〕は、次の段落で記載される通り、調製する。アデノシン、シチジン及びチミジンヌクレオシドアミダイトは同様に調製する。
【０１４０】
Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕
２’−Ｏ−アミノオキシエチルグアノシン類似体は、ジアミノプリンリボシドの選択的２’−Ｏ−アルキル化により得ることができる。多様な重量のジアミノプリンリボシドは、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ（Ｂｅｒｌｉｎ）から購入することが可能であり、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを、少量の３’−Ｏ−異性体と共に提供する。２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドは、アデノシンデアミナーゼ処理により分解され、そして、２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）グアノシンに変換され得る（ＭｃＧｅｅ， Ｄ． Ｐ． Ｃ．， Ｃｏｏｋ， Ｐ． Ｄ．， Ｇｕｉｎｏｓｓｏ， Ｃ． Ｊ．， ＷＯ ９４／０２５０１ Ａ１ ９４０２０３．）。標準的な保護の手法は２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン及び２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを与えるに違いなく、それは、還元され、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを提供し得る。前のように、水酸基はＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応によってＮ−ヒドロキシフタルイミドにより置換することができ、そして、保護されたヌクレオシドは通常通り、ホスフィチル（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌ）化して、２−Ｎ−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−〔（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホールアミダイト〕を得ることができる。
【０１４１】
実施例２
オリゴヌクレオチド合成
未置換及び置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを、自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｍｏｄｅｌ ３８０Ｂ）で、ヨウ素による酸化を用いる標準的なホスホールアミダイト化学を使用して、合成する。
【０１４２】
亜リン酸塩結合の段階的チア化のため、標準的な酸化瓶を、アセトニトリル中０．２ Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド溶液に置き換えた以外は、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドのためと同様に合成される。チア化待機段階を６８秒に増加し、そして、引き続いてキャッピング段階を行った。ＣＰＧカラムからの分離、及び、５５℃で（１８時間）濃縮された水酸化アンモニウム中の脱ブロック化した後、２．５倍量のエタノールで２回沈殿することにより、オリゴヌクレオチドを０．５ Ｍ ＮａＣｌ溶液から精製した。
【０１４３】
ホスフィネートオリゴヌクレオチドを、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５０８，２７０に記載の通り、調製する。
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許４，４６９，８６３に記載の通り、調製する。
【０１４４】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，６１０，２８９あるいは５，６２５，０５０に記載の通り、調製する。
【０１４５】
ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２５６，７７５あるいはアメリカ合衆国特許５，３６６，８７８に記載の通り、調製する。
【０１４６】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ ９４／１７０９３及びＷＯ ９４／０２４９９として公開）に記載の通り、調製する。
【０１４７】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホールアミデートオリゴヌクレオチドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，４７６，９２５に記載の通り、調製する。
【０１４８】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用されるアメリカ合衆国特許５，０２３，２３４に記載の通り、調製する。
ボランリン酸オリゴヌクレオチドは、共に本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，１３０，３０２及び５，１７７，１９８に記載の通り、調製する。
【０１４９】
実施例３
オリゴヌクレオシド合成
ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−３結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、及び、アミド−４結合オリゴヌクレオシドとも同一であるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド、そして、例えば、ＭＭＩとＰ＝ＯあるいはＰ＝Ｓ結合とを換えたものを有する混合バックボーン化合物は、そのすべてが本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０及び５，６１０，２８９，に記載の通り、調製する。
【０１５０】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２６４，５６２及び５，２６４，５６４に記載の通り、調製する。
【０１５１】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，２２３，６１８に記載の通り、調製する。
実施例４
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する様々な方法：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ４， ５−２３のいずれかに従って、調製される。それらはまた、本明細書中で参考文献として援用される、アメリカ合衆国特許５，５３９，０８２、５，７００，９２２，、及び、５，７１９，２６２に従ってもまた、調製され得る。
【０１５２】
実施例５
オリゴヌクレオチドの単離
制御孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から分離し、そして、濃縮された水酸化アンモニウム中、５５℃、１８時間、脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、０．５ Ｍ ＮａＣｌから２．５倍量のエタノールを用いた２回の沈殿により精製する。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析され、そして、少なくとも８５％の全長物質であると判断された。合成により得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対的な量は、定期的に３１Ｐ核磁気共鳴分光器により検査され、そして、いくつかの研究のため、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９１， ２６６， １８１６２−１８１７１）により記載の通り、ＨＰＬＣで精製した。ＨＰＬＣ精製産物を用いて得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製産物から得られたものと同様だった。
【０１５３】
実施例６
ポリアデニル化のアンチセンスモジュレーション
接着分子であるＥ−セレクチンは、炎症性サイトカインに反応して内皮細胞上に一過性に発現され、そして白血球の接着を媒介する。ヒトＥ−セレクチンのゲノム構造には、複数のＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルおよび多数のＡＵＵＵＡ転写物不安定化要素が３’非翻訳領域中に含まれる。すべての３種のポリアデニル化シグナルが機能していることが示されており、このことからこれらのシグナルを区別して使用することにより生成される３タイプのＥ−セレクチン転写物が得られる。３種の転写物（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型）は、特定の疾患状態において区別して発現される。Ｉ型転写物は、６個の転写物不安定化要素を欠き、そして完全長ＩＩＩ型転写物よりも安定であることが示された（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：４１７９−４１８９）。
【０１５４】
３種のＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナルは、３’非翻訳配列中のヌクレオチド２８２３、２９８１および３８１６に位置する（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３， １１６０−１１６５の番号付けスキームに従う；ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ． Ｍ２４７３６）。実際のポリアデニル化部位は、それぞれのＡＡＴＡＡＡシグナルの１３〜２０塩基下流である。
【０１５５】
２０核塩基の長さのオリゴヌクレオチドを、これらの３種のポリアデニル化部位の領域および／またはそのすぐ下流の領域を標的とする様に設計した。オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）またはホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）バックボーンのいずれかを有する、均質な２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）化合物として作製された。
【０１５６】
これらのアンチセンス化合物のポリアデニル化に対する作用、およびしたがって、転写物のサイズおよび安定性に対する作用を、測定した。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯血管内皮細胞）を、Ｅ−セレクチンポリアデニル化部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理する。ヒトＥ−セレクチンｍＲＮＡ ３’末端のアンカー−ＰＣＲ増幅を、Ｃｈｕら（１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３： ４１７９−４１８９）にしたがって行い、どのポリアデニル化部位が依然として機能しているのか、そしてどの程度の量で機能しているのかを決定する。
【０１５７】
オリゴヌクレオチド処理の後に存在する様々な転写物の安定性を直接的に測定することは、Ｃｈｕら（１９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３： ４１７９−４１８９）中に記載されたウサギ網状赤血球溶解物システムを使用して行うことができる。
【０１５８】
実施例７
マウスＩＬ−５受容体αｍＲＮＡにおけるスプライシングのアンチセンスモジュレーション
マウスＩＬ−受容体αの膜型をコードするｍＲＮＡは、１１個のエクソンを含有する。受容体の膜貫通ドメインは、エクソン９にコードされる。可溶化型（分泌型）の受容体をコートする２つのｍＲＮＡは、差別的なスプライシング事象から生じる。受容体の可溶化型１をコードするｍＲＮＡは、エクソン９を喪失しており（エクソン８がエクソン１０とスプライシングしている）、そして可溶化型２をコードするｍＲＮＡは、エクソン９およびエクソン１０を喪失している（エクソン８はエクソン１１とスプライシングする）（Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２８３−２９２）。
【０１５９】
一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスＩＬ−５受容体αｍＲＮＡのコード領域のエクソン９の全体を“ウォーキング”するように設計した。オリゴヌクレオチドは、およそ１０核塩基ごとに、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッションｎｏ． Ｄ９０２０５として規定の配列上で、ヌクレオチド１２８８〜１３８１まで伸び、本明細書中ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９として提供されるエクソン９配列に沿って開始する領域を標的とした。
【０１６０】
マウスＢＣＬ１細胞を、マウスＩＬ−５受容体αを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするために選択した。これらは、ＢＡＬＢ／ｃを起源とする自然発生的に生じた腫瘍に由来するＢ−細胞白血病細胞であり、そしてマウスまたはヒトＩＬ−５に反応して増殖する。これは、ＣＤ５＋株であり、ヒト慢性リンパ球性白血病腫瘍のサブセットに似ており、そしてリポ多糖刺激に際してＩｇＭを分泌する。細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得し、そして１０％加熱−非働化ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、１０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．２、５０μＭ ２−ＭＥ、２ ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。
【０１６１】
これらの化合物の、膜型および可溶化型のマウスＩＬ−５受容体αの両方に対する作用を測定し、表１に示す。オリゴヌクレオチドを、ＢＣＬ１細胞中で、１０μＭ の濃度でスクリーニングし、そしてＩＬ−５受容体αｍＲＮＡを、ノーザンブロットにより測定した。％阻害を、非処理（オリゴなし）対照と比較する。
【０１６２】
全ＢＣＬ１細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＴＭキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を使用して単離した。ノーザンブロッティングを、標準的な方法を使用して行った。ｃＤＮＡプローブを、エクソン２、エクソン８、エクソン９またはエクソン１０のいずれかのエクソン配列とマッチするオリゴヌクレオチドから作製した。シグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを使用して定量した。
【０１６３】
【表１】
【０１６４】
【表２】
【０１６５】
これらのギャップマーは、膜型および可溶化型の両方を減少させることができ、それぞれのオリゴヌクレオチドは２つの型をほぼ同等に減少させた。
実施例８
マウスＩＬ−５受容体αｍＲＮＡエクソン９を標的とする完全に２’−ＭＯＥであるオリゴヌクレオチドの、膜型および可溶化型ＩＬ−５受容体αｍＲＮＡ発現に対する作用
追加のオリゴヌクレオチドを、エクソン９およびイントロン／エクソン境界部を標的とするように設計した；これらは、均質的に２’−メトキシエトキシ修飾されており、ホスホロチオエートバックボーンを全体にわたり有していた。これらは、以下の表３に示す。
【０１６６】
【表３】
【０１６７】
ＢＣＬ１細胞を、１０μＭの完全−２’−メトキシエトキシ、完全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドにより、２４時間処理し、全ＲＮＡを抽出し、解析した。結果は表４に示す。
【０１６８】
【表４】
【０１６９】
マウスＩＬ−５受容体αｍＲＮＡエクソンを標的とする完全に修飾された２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドのすべては、ＩＬ−５受容体αの膜型の発現を減少させ、そして受容体の可溶化型の発現を増大させる。これらの同時的作用の有効性は、エクソンの３’末端に移動したアンチセンス標的部位として同等に減少した。ＩＬ−５受容体α転写の全体量は、影響されない。このことは、イントロン性３’スプライスアクセプター部位のちょうど末端であるエクソン９を標的とする完全２’−メトキシエトキシ−修飾オリゴヌクレオチドは、スプライス産物中にエクソン９が含まれることを防止し、そしてスプライシング装置を次の下流スプライスアクセプター部位（イントロン９中のもの）に向け直すことを示している。詳細には可溶化型の減少を伴わず、またはより詳細には可溶化型の増加を伴う、膜型のＩＬ−５受容体αの減少は、ＩＬ−５シグナル伝達と関連する疾患、特にぜんそくにおいて治療的有用性を有すると考えられる。これらの結果は、スプライシングがエクソン９を標的とする均質な２’−メトキシエトキシオリゴヌクレオチドを使用することにより向け直されて、スプライシングｍＲＮＡ産物からのエクソン９の排除（スキッピング）を引き起こし、結果として産生される可溶化型／膜型ＩＬ−５受容体の比率の調節された変化を引き起こすことを、示す。
【０１７０】
ＲＮＡｓｅ Ｈ−依存性化合物（２’ ＭＯＥギャップマー、ＩＳＩＳ １８００２）をＲＮＡｓｅ Ｈ−非依存性化合物（完全−２’ ＭＯＥ化合物、２１７５２）に変換することにより、このオリゴヌクレオチド配列を、ＩＬ−５受容体αの両方の型の阻害剤から、スプライシングの向け直しを介して、膜型を選択的に阻害するものに変換することもまた、示された。
【０１７１】
実施例９
様々な型のマウスＩＬ−５受容体αｍＲＮＡのエクソン−エクソン境界部を標的とするオリゴヌクレオチド
２’ ＭＯＥギャップマーまたは均質２’ ＭＯＥのいずれかであるオリゴヌクレオチドを、成熟ＩＬ−５受容体αｍＲＮＡのエクソン−エクソン境界部を標的とするように設計した。受容体の膜型をコードするｍＲＮＡは、エクソン１〜１１を有する。受容体の可溶化型をコードするｍＲＮＡは、エクソン９を喪失するか（可溶化型１）またはエクソン９およびエクソン１０を喪失する（可溶化型２）。表５において、“Ｅ７−Ｅ８”と呼ばれる標的領域は、エクソン７〜８境界部を標的とすることを意味する、などである。
【０１７２】
【表５】
【０１７３】
これらの化合物は、１０μＭの用量で、膜型または可溶化型ＩＬ−５受容体αｍＲＮＡを減少させる能力について試験した。試験した化合物についての結果を表６に示す。
【０１７４】
【表６】
【０１７５】
表６に示すように、可溶化型ＩＬ−５受容体αの発現の選択的な減少は、エクソン８〜エクソン１０境界部を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはエクソン８〜エクソン１１境界部を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによりより低い程度で、達成することができ、これらの両方の結合部は、可溶化型受容体ｍＲＮＡ中にのみ見出されるものである。膜型ＩＬ−５受容体αの発現の選択的減少は、エクソン８〜エクソン９境界部またはエクソン９〜エクソン１０境界部を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより達成することができ、これらの両方は、膜型のＩＬ−５受容体αを標的とするｍＲＮＡ中にのみ存在している。エクソン９のイントロン／エクソン境界部をまたぐ完全な−２’ ＭＯＥオリゴヌクレオチドの配置により、結果としてエクソン９の内部に配置した完全な−修飾オリゴヌクレオチドにより得られたと同様の効果を得られた。
【０１７６】
実施例１０
ヒトＩＬ−５受容体αｍＲＮＡ中のスプライス部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
膜型のヒトＩＬ−５受容体αをコードするｍＲＮＡ転写物は、エクソン１〜１０および１２〜１４を含有する。エクソン１１は、スプライス除去されている。したがって、可溶化型および膜型の受容体の両方ともに共通するエクソン１〜１０中の配列を標的とするか、または膜型においてのみ存在する配列（エクソン１２〜１４）を選択的に標的とすることができる。オリゴヌクレオチドは、エクソン１１の下流の様々なイントロン／エクソン境界部を標的とするように設計し、エクソン１１の成功したスプライス除去を強力に防止し、そしてしたがって、スプライス産物を、膜型から遠ざけそして可溶化型ＩＬ−５受容体αの方を選んで向け直した。
【０１７７】
一連のオリゴヌクレオチドを、様々なスプライス部位またはＩＬ−５受容体ｍＲＮＡ中の（イントロン−エクソン境界部）を標的とする様に設計した。これらは、表７中に示され、そしてＩＬ−５受容体ｍＲＮＡおよび細胞表面タンパク質レベルに対するそれらの効果は表８および９中に示される。
【０１７８】
【表７】
【０１７９】
【表８】
【０１８０】
ＩＳＩＳ １６７４６、１６７４８および１６７５５は、ＩＬ−５受容体ｍＲＮＡ発現を、５０％以上阻害し、そしてしたがって、このアッセイにおいて好ましい。ノザンブロット解析は、ＩＳＩＳ １６７５５が、膜受容体転写物を、可溶化型を顕著に阻害することなく、阻害したことが示された。このように、ＩＳＩＳ １６７５５は、スプライス部位を標的とするその他の非−ＲＮＡｓｅ Ｈ（例えば、均質な２’−メトキシエトキシ）オリゴヌクレオチドから得られたデータに付随するように、膜型の方を選んでスプライシングを向け直すと考えられる。
【０１８１】
【表９】
【０１８２】
ＩＳＩＳ １６７４６、１６７４８、１６７５５および１６７５８は、このアッセイにおいてヒトＩＬ−５受容体αタンパク質を、５０％以上阻害し、そしてしたがって好ましい。ＩＳＩＳ １６７５８および１６７５５は、さらなる研究のために選択された。ＩＳＩＳ １６７５８は、ＴＦ−１細胞中のＩＬ−５受容体α細胞表面タンパク質の減少に関して、約５μＭのＩＣ５０を有することが見いだされた。１−ミスマッチ対照は、１０μＭのＩＣ５０を有し、そして３−および５−ミスマッチ対照は、ＩＬ−５受容体α発現を阻害しなかった。ＩＳＩＳ １６７５８は、ＩＬ−５受容体αタンパク質発現を、ｍＲＮＡレベルを減少させることなく阻害し、これは均質な２’−メトキシエトキシ修飾オリゴヌクレオチドについて予想されるようなＲＮＡｓｅ Ｈ−非依存性メカニズムと一致した。
【０１８３】
実施例１１
ＩＬ−５受容体αオリゴヌクレオチドにより処理したＴＦ−１細胞中でのアポトーシスの誘導
ＩＬ−５（０．５ ｎｇ／ｍｌ）中で培養した１×１０６ ＴＦ−１細胞を、オリゴヌクレオチド処理の４８時間後に回収し（トランスフェクションは、先の実施例に記載されたようにエレクトロポレーションによった）、そしてホスファチジルセリン発現を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用して、アポトーシスの測定値として検出した。簡単に述べれば、細胞を、０．２ ｍｌの染色バッファー（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４、１４０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＣａＣｌ２）中に再懸濁し、そして１０μＭのヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）および５μｌのＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ試薬を４℃にて１０分間添加した。サンプルをＦａｃｓＦｌｏｗ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ ＮＪ）バッファーにより希釈し、そしてＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎ上で解析した。結果を以下の表１０に示す。
【０１８４】
【表１０】
【０１８５】
アポトーシスは、ＩＳＩＳ １６７５８により誘導されることが示された。
実施例１２
ＩＬ−５受容体オリゴヌクレオチドの、細胞増殖に対する効果
２．５×１０４ ＴＦ−１細胞を、ＩＬ−５不存在下の２００μｌの完全ＲＰＭＩ中、９６−ウェルプレート中で、エレクトロポレーションの後１６時間の間、インキュベートした。ＩＬ−５（０．５ ｎｇ／ｍｌ）を添加し、そして培養物を１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンにより、４８−時間の培養期間の最後の８時間、パルスした。細胞をグラスファイバーフィルター上で回収し、そしてチミジン取り込み（細胞増殖に比例する）について、液体シンチレーションカウンターにより解析した。結果を表１１に示す。結果は、非処理対照におけるチミジン取り込みと比較する。
【０１８６】
【表１１】
【０１８７】
これらのデータは、ＩＬ−５受容体αのアンチセンス阻害剤であるＩＳＩＳ １６７５８が、ｔｏ ＩＬ−５に対する細胞性応答、すなわちＩＬ−５に反応した細胞増殖を、非常に減少させることを示す。
【０１８８】
実施例１３
ｂｃｌ−ｘ ｍＲＮＡにおけるスプライシングのアンチセンスモジュレーション
Ｂｃｌ−ｘは、アポトーシスのｂｃｌ−２−非依存性制御因子である（Ｂｏｉｓｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７４，５９７−６０８）。ｂｃｌ−ｘの２種の異性体が、ヒトで報告された。Ｂｃｌ−ｘｌ（ロング）は、非常に保存されたＢＨ１およびＢＨ２ドメインを含有する。ＩＬ−３依存性細胞株中にトランスフェクトした場合、ｂｃｌ−ｘｌは、ｂｃｌ−２と同様な様式で、成長因子除去の間のアポトーシスを阻害した。対照的に、ｂｃｌ−ｘの短い異性体であるｂｃｌ−ｘｓは、選択的スプライシングにより産生され、ＢＨ１およびＢＨ２ドメインを含有するエクソン１の６３−アミノ酸領域を欠損するが、ｂｃｌ−２またはｂｃｌ−ｘｌいずれかの抗−アポトーシス性作用に拮抗的に作用する。
【０１８９】
Ｂｏｉｓｅら（Ｃｅｌｌ， １９９３， ６０８）において番号付けされたように、ｂｃｌ−ｘ転写物は、以下の様に当業者により記載された領域中に、分類することができる：ヌクレオチド１〜１３４、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）；ヌクレオチド１３５〜１３７、翻訳開始コドン（ＡＵＧ）；ヌクレオチド１３５〜８３６、コード領域、ここで、１３５〜５０９は、ｂｃｌ−ｘｓ転写物のより短いエクソン１であり、そして１３５〜６９８はｂｃｌ−ｘｌ転写物のより長いエクソン１であり；ヌクレオチド６９９〜８３６は、エクソン２である；ヌクレオチド８３４〜８３６、停止コドン；ヌクレオチド８３７〜９２６、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）。成熟ｂｃｌ−ｘｌ（ロング）ｍＲＮＡ転写物が産生される場合、エクソン１および２の間（ヌクレオチド６９８および６９９の間）において、イントロンは、プレ−ｍＲＮＡからスプライス除去される。位置５０９から位置６９９までの選択的スプライシングは、ロングの転写物よりも１８９ヌクレオチド短く、ｂｃｌ−ｘｌよりも６３アミノ酸短いタンパク質産物（ｂｃｌ−ｘｓ）をコードする、ｂｃｌ−ｘｓ（ショート）ｍＲＮＡ転写物を産生する。
【０１９０】
ｂｃｌ−ｘＬのタンパク質は、抗−アポトーシス性タンパク質であるｂｃｌ−２と、サイズおよび構造において同様であり、そして同様の抗−アポトーシス性機能を有し、成長因子除去に際しての細胞死の阻害する。対照的に、ｂｃｌ−ｘｓのタンパク質は、ｂｃｌ−２機能を阻害すると考えられ、したがって、プログラム細胞死（アポトーシス）を促進する。
【０１９１】
実施例１４
ｂｃｌ−ｘｓおよびｂｃｌ−ｘｌ転写物の発現に対する、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用
本発明にしたがって、刊行物に記載された配列（Ｂｏｉｓｅ，Ｌ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃｅｌｌ ７４， ５９７−６０８； ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ． Ｌ２０１２１、座位名“ＨＳＢＣＬＸＬ”、本明細書中では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９として援用される）を使用して、ヒトｂｃｌ−ｘ ＲＮＡの異なる領域を標的とする様な一連のオリゴヌクレオチドを設計した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトｂｃｌ−ｘのエクソン１およびエクソン２の領域、具体的にはエクソン１／エクソン２スプライス部位の周辺およびｂｃｌ−ｘｌ中には存在するがｂｃｌ−ｘｓ中には存在しない配列、を標的とするように、設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、表１２中に示す。すべてのバックボーン結合は、ホスホロチオエートである；すべての２’ＭＯＥシトシンは、５−メチルシトシンである。
【０１９２】
【表１２】
【０１９３】
ＲＩＢＯＱＵＡＮＴＴＭ ＲＮａｓｅ保護キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用して、オリゴヌクレオチドを、Ａ５４９細胞中でのｂｃｌ−ｘｓおよびｂｃｌ−ｘｌ ｍＲＮＡレベルに対する作用とともに、全ｂｃｌ−ｘ ｍＲＮＡレベルに対するそれらのそれぞれの作用に関して評価した。すべてのアッセイは、製造者のプロトコルにしたがって行った。結果は、表１３中に示す。
【０１９４】
【表１３】
【０１９５】
ｂｃｌ−ｘｌ転写物（ｂｃｌ−ｘｓ転写物ではなく）のエクソン１を標的とする、完全に２’−ＭＯＥで、完全に−ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ２２７８３は、Ａ５４９細胞中での全ｂｃｌ−ｘ ｍＲＮＡレベルを減少させることなく、ｂｃｌ−ｘｌに対するｂｃｌ−ｘｓの比を、１７％から２９３％まで変化させることができる。すなわち、それは、ｂｃｌ−ｘｌ型（ｂｃｌ−ｘの抗−アポトーシス型）を減少したが、しかしｂｘｌ−ｘｓ型（プロ−アポトーシス型）を劇的に増加させた。この結果から、アポトーシスの促進を引き起こすことが期待される。
【０１９６】
ＩＳＩＳ ２２７８３を、ＲＮＡｓｅ保護アッセイにより、もう一つのアポトーシス遺伝子であるｂａｘを阻害する能力について試験した。それは、ｂａｘ ｍＲＮＡレベルに対して、何の作用も有さなかった
ＩＳＩＳ ２２７８３はまた、マウスｂｃｌ−ｘ ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、このことから、それが動物の研究についても有用である。マウス細胞株ｂＥＮＤ、ＡＭＬ１２およびＨｅｐａの処理は、すべて、ＩＳＩＳ ２２７８３による処理の後に、ｂｃｌ−ｘｓ ｍＲＮＡの誘導を示したが、ミスマッチ対照ＩＳＩＳ ２６０８０（ＣＴＧＧＴＴＡＣＡＣＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３）では示されなかった。ＩＳＩＳ ２２７８３はまた、予備的実験において、マウス肝臓においてｉｎ ｖｉｖｏで、ｂｃｌ−ｘｓ ｍＲＮＡ発現の若干の誘導を引き起こすことも示された。
【０１９７】
実施例１５
ｂｃｌ−ｘｌの５’スプライス部位を標的とする２’−ＭＯＥオリゴヌクレオチドの最適化
スプライシングの向け直しに対して最も活性なオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ ２２７８３は、ｂｃｌ−ｘｌの５’スプライス部位の１６〜３５ヌクレオチド上流（ヌクレオチド６９９）の領域を標的とする。５’末端がスプライス部位の２４、２６、２９、３１、３３、３７、３９、４１、４３、４４、４５および４７塩基上流であるような配列を標的とする、２０ ｍｅｒの２’−ＭＯＥホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用して、この領域において“ウォーキング”を行った。これらのオリゴヌクレオチドを、短いおよび長いｂｃｌ−ｘ転写物に対する作用について、２００ ｎＭの用量のオリゴヌクレオチドで以前に行ったようにスクリーニングした。オリゴヌクレオチドを表１４に示し、そして結果を表１５に示す。
【０１９８】
【表１４】
【０１９９】
【表１５】
【０２００】
ここに見ることができるように、この領域におけるすべてのオリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−ｘｓを選んでスプライス産物を向け直すことができた。５’スプライス部位の４７ヌクレオチド上流におけるいずれかの場所を標的とするアンチセンス化合物（すなわち、したがって、Ｇｅｎｂａｎｋ座位名“ＨＳＢＣＬＸＬ”、アクセッションＮｏ． Ｌ２０１２１（Ｚ２３１１５とも呼ばれる）において使用されるナンバリングスキームに従うヌクレオチド６５２〜６９９）が、好ましい。それらの化合物の多くは、ＩＳＩＳ ２２７８３よりもずっと効果的であった（すなわち、本実験において、５．２５以上のｂｃｌ−ｘｓ／ｘｌ比を与えた）。これらの化合物は、非常に好ましい。
【０２０１】
用量反応性は、スプライス産物のオリゴヌクレオチド向け直しについて得ることができる。このことは、表１６中に示される。ＩＳＩＳ ２６０８０は、ＩＳＩＳ ２２７８３の５−塩基ミスマッチである。
【０２０２】
【表１６】
【０２０３】
ＩＳＩＳ ２２７８３は、Ａ５４９細胞において、時間にわたって、ｂｃｌ−ｘｓ ｍＲＮＡ発現を誘導し、オリゴヌクレオチドによる処理後はじめの２〜４時間にｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡの同時的減少を伴ったことを示すことができる。これらの転写物の能力を、ヌクレオチド配列決定により確認した。
【０２０４】
実施例１６
ＵＶ−誘導性細胞死に対する、細胞のアンチセンス感作
Ａ５４９細胞を、１００ ｎＭのＩＳＩＳ ２２７８３または５−ミスマッチＩＳＩＳ ２６０８０により処理し、そして紫外線（ＵＶ）照射に曝露した。％アポトーシス細胞は、標準的な方法にしたがって、ヨウ化プロピジウム染色により定量化した。結果は表１７中に示す。
【０２０５】
【表１７】
【０２０６】
このように、細胞の行動、すなわちＵＶストレスに対する反応、は、アンチセンス処理の後に変化し、結果としてアポトーシスの増加が引き起こされた。
実施例１７
シスプラチン−誘導性細胞死に対する細胞のアンチセンス感作
Ａ５４９細胞を、１００ ｎＭのＩＳＩＳ ２２７８３または５−ミスマッチＩＳＩＳ ２６０８０により処理し、そして様々な濃度のシスプラチンにより処理した。％アポトーシス細胞は、標準的な方法にしたがって、ヨウ化プロピジウム染色により定量化した。結果は、表１８中に示す。
【０２０７】
【表１８】
【０２０８】
このように、細胞の行動、すなわち、細胞傷害性化学物質ストレスに対する反応、は、アンチセンス処理の後に変化し、結果としてアポトーシスの増加が引き起こされた。
【０２０９】
実施例１８
タキソール−誘導性細胞死に対する、細胞のアンチセンス感作
Ａ５４９細胞を、１００ ｎＭのＩＳＩＳ ２２７８３または５−ミスマッチＩＳＩＳ ２６０８０により処理し、そして様々な濃度のタキソールにより処理した。％アポトーシス細胞は、標準的な方法にしたがって、ヨウ化プロピジウム染色により定量化した。結果を、表１９中に示す。
【０２１０】
【表１９】
【０２１１】
このように、細胞の行動、すなわち、細胞傷害性化学物質ストレスに対する反応、は、アンチセンス処理の後に変化し、結果としてアポトーシスの増加が引き起こされる。
【０２１２】
実施例１９
ＩＳＩＳ ２２７８３配列の追加的な修飾
２’−メトキシエトキシに加えて、アンチセンス化合物の標的に対する緊密な結合およびヌクレアーゼに対する耐性を提供する修飾もまた、スプライス部位を標的とする際に特に有用であると考えられる。このような修飾の例としては、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ（２’−ＤＭＡＯＥ）および２’−アセトアミドを含む糖修飾；モルホリノ、ＭＭＩおよびＰＮＡバックボーンなどのバックボーン修飾、およびＣ−５プロピンなどの塩基修飾が含まれるが、これらのものには限定されない。
【０２１３】
ＩＳＩＳ ２２７８３配列および２’−ＤＭＡＯＥ修飾をそれぞれの糖に有するアンチセンス化合物を、その２’−ＭＯＥ類似体と、ｂｃｌ−ｘスプライス産物の比を変化させる能力に関して比較した。結果は、表２０中に示される。
【０２１４】
【表２０】
【０２１５】
このように、２’−ＭＯＥ化合物と比較した場合、２’−ＤＭＡＯＥ化合物は、量的には若干少ないものの、ｂｃｌ−ｘｌスプライス産物に対するｂｃｌ−ｘｓの比を変化させる能力については質的には同様な能力が示された。したがって、２’−ＤＭＡＯＥ化合物が好ましい。
【０２１６】
２２７８３配列を有するモルホリノ−バックボーン化合物を用いた予備的実験により、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）を使用して、十分な活性が示された。[0001]
Field of the Invention
This application is related to U.S. Pat. S. This is a partially pending application Ser. No. 09 / 167,921.
[0002]
The present invention provides compositions and methods for regulating cell behavior by antisense modulation of messenger RNA (mRNA) processing. In particular, the invention relates to antisense compounds, especially oligonucleotides, that modulate RNA splicing, polyadenylation, or stability to affect cell behavior.
[0003]
Background of the Invention
Newly synthesized eukaryotic mRNA molecules, known as primary transcripts, or pre-mRNAs and produced in the nucleus, are processed before or during transit to the cytoplasm for translation. A methylated cap structure consisting of the terminal nucleotide, 7-methylguanylate, is added to the 5 'end of the mRNA at the 5'-5' linkage with the first nucleotide of the mRNA sequence.
[0004]
A sequence of approximately 200-250-base adenylate residues, also called poly (A), is post-transcribed added to the site that will be the 3 'end of the mRNA, after which the mRNA is introduced into the cytoplasm. . This is a multi-step process that involves the assembly of the processing complex, followed by the site-specific endonuclease cleavage of the precursor transcript and the addition of a poly (A) "tail". In most mRNAs, the polyadenylation signal sequence is the hexamer, AAUAAAA, which is 10-30 nucleotides in the 5 'direction (upstream) from the cleavage site (5'-CA-3'), 3 'of the cleavage site. Located on the side with U or GU rich elements. Multiple poly (A) sites are present on a given transcript, and only one per transcript is used, but by using different poly (A) sites, multiple types of mature mRNA transcripts can be used. It may be produced from a given pre-mRNA. It has recently been shown that stable mRNA secondary structure can affect the polyadenylation site of RNA constructs in transfected cells (Klasens et al., Nuc. Acids Res., 1998, 26, 1870-1876). It has also been found that which of the multiple polyadenylation sites is used may affect the transcript stability (Chu et al., J. Immunol., 1994, 153, 4179-4189). ). Antisense modulation of mRNA polyadenylation has not been previously reported.
[0005]
The next step in mRNA processing is mRNA splicing, which occurs in 90-95% of mammalian mRNA maturation. Introns (or intervening sequences) are regions of the primary transcript (or the DNA that encodes it) and are not included in the completed mRNA. Exons are regions of the primary transcript that remain in the mature mRNA as it reaches the cytoplasm. Exons are "spliced together" to form the mature mRNA sequence. The intron-exon junction is also called the "splice site", the 5 'side of the junction is often called the "5' splice site" or "splice donor site", and the 3 'side is the "3' splice site". Alternatively, it is called a "splice acceptor site.""Cryptic" splice sites are those that are used less often, but can be used if the "normal" splice site is blocked or unavailable. Alternative splicing, ie, using various combinations of exons, often results in multiple mRNA transcripts from a single gene.
[0006]
The final step in RNA processing is the turnover or degradation of mRNA. Differential mRNA stabilization is one of several factors in the rate of synthesis of any protein. The rate of mRNA degradation appears to be related to the presence or absence of the poly (A) tail, and to the presence of specific sequences at the 3 'end of the mRNA. For example, many mRNAs with short half-lives have some A (U) n The A sequence is contained in its 3'-untranslated region. Insertion of a series of AUUUA sequences into genes that normally do not contain it reduced the half-life of the resulting mRNA by 80% (Shaw and Kamen, Cell, 1986, 46, 659). This means that these A (U) n It may be associated with increased nucleolytic attack in sequences containing the A sequence. Other mediators of mRNA stability, such as, for example, hormones, translation products (self-regulation / feedback), and low-molecular weight ligands are also known.
[0007]
Antisense compounds generally result in protein expression, either by directly interfering with the translation of the target molecule or, more often, by degrading the target mRNA in an RNAse-H-mediated manner. Used to interfere. Antisense interference by 5 'capping of mRNA and interference of translation factors binding to mRNA by oligonucleotide masking of 5' cap was disclosed by Baker et al. (WO 91/17755).
[0008]
Antisense oligonucleotides have often been used to modulate splicing, particularly aberrant splicing or splicing of mutant transcripts, in a cell-free reporter system. Using a luciferase reporter plasmid system, an antisense oligonucleotide targeting a 5 'splice site, 3' splice site, or branch point is a reporter plasmid of a mutant or wild-type adenovirus pre-mRNA sequence. The ability to inhibit splicing into was tested. Phosphorothioate oligodeoxynucleotides that can support RNAse H cleavage have been found to be better inhibitors of the expression of wild-type adenovirus constructs than 2'-methoxy phosphorothioate, which cannot support RNase H, The converse was true for oligonucleotides targeting adenovirus constructs containing the human β-globulin splice site sequence (Hodges and Crooke, Mol. Pharmacol., 1995, 48, 905-918).
[0009]
Antisense oligonucleotides were used to target mutations that caused aberrant splicing in some genetic disorders. Correcting abnormal processing of mutated mRNA sequences using antisense compounds is not encompassed by the present invention. The alteration, ie the modulation of the behavior of cells, especially the response of cells to stimuli, which is the subject of the present invention, by means of antisense modulation of "wild-type" or natural mRNA processing has not been described before.
[0010]
Phosphorothioate 2'-O-methyl oligoribonucleotides were used to target the abnormal 5 'splice site of the mutant β-globin gene found in patients with the genetic blood condition β-thalassemia. Aberrant splicing of the mutant β-globin mRNA was demonstrated in a vector construct containing thalassemia human β-globin pre-mRNA in a 2′-O targeting the branch point sequence in the first intron of the mutant human β-globin pre-mRNA. -Blocked in vitro using -methyl-ribo-oligonucleotide. A 2′-O-methyl oligonucleotide is used because it forms a stable hybrid with RNAse and is stable with RNA that is not degraded by RNAse H (Dominski and Kole, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 8673-8677). A review article by Kole discusses the use of antisense oligonucleotides that target abnormal splice sites formed by genetic mutations such as β-thalassemia or cystic fibrosis. It was hypothesized that blocking a splice site with an antisense oligonucleotide would have a similar effect on splice site mutation, ie, splicing (Kole, Acta Biochimica Polonica, 1997, 44, 231-238). Oligonucleotides targeting the aberrant β-globin splice site suppressed aberrant and at least partially restored correct splicing in HeLa cells expressing mutant transcripts (Sierakowska et al., Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1173-1182; Sierakowska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 12840-44). Compositions and methods for combating aberrant splicing in pre-mRNA molecules containing mutations using antisense oligonucleotides that do not activate RNAse H are disclosed in US Pat. S. Disclosed by patents 5,627,274 and disclosed by WO 94/26887 and claimed.
[0011]
Modulation of mutant dystrophin splicing by 2'-O-methyl oligoribonucleotides has been reported both in vitro and in vivo. In dystrophin Kobe, a 52-base pair deletion mutation causes exon 19 to be skipped in splicing. Using an in vitro mini-splicing system, a 31-mer 2'-O-methyl oligoribonucleotide complementary to the 5 'half of the deleted sequence in exon 19 of dystrophin Kove was expressed as wild-type. It was shown to inhibit splicing of pre-mRNA (Takeshima et al., J. Clin. Invest., 1995, 95, 515-520). The same oligonucleotide was used to induce exon skipping from native dystrophin gene transcription in cultured human lymphoblastoid cells.
[0012]
Dunkley et al. (Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, 1665-1668) describe an in vitro construct for analyzing splicing around exon 23 of mutant dystrophin in the mdx mouse mutant, a model for Duchenne muscular dystrophy. I do. Although no target site or sequence is provided, plans are underway to analyze these constructs in vitro using 2 'modified oligos targeting the splice site within and adjacent to mouse dystrophin exon 23. ing.
[0013]
Subsequently, 2'-O-methyl oligoribonucleotides were used to correct dystrophin deficiency in myogenic cells from mdx mice. Antisense oligonucleotides targeting the 3 'splice site of mouse dystrophin intron 22 caused skipping of the mutated exons and formed new in-frame dystrophin transcripts with new internal deletions. The mutant dystrophin was expressed in 1-2% antisense-treated mdx myotubes. The use of other oligonucleotide modifications, such as 2'-O-methoxyethyl phosphodiester, was disclosed by Dunckley et al. (Human Mol. Genetics, 1998, 5, 1083-90).
[0014]
Using phosphorothioate oligodeoxynucleotides, mutated α2 (I) collagen in fibroblasts from patients with osteogenesis imperfecta where a point mutation at the splice donor site produces mRNA with exon 16 deleted. Allyl expression was selectively suppressed. Oligonucleotides were targeted to either point mutations in pre-mRNA or to incompletely spliced transcripts. In both cases, the mutant mRNA was reduced by half, but the normal transcript was also reduced by 20%. It was concluded that this was entirely due to the RNAse H-dependent mechanism (Wang and Marini, J. Clin Invest., 1996, 97, 448-454).
[0015]
Using a microinjection assay, 2'-O-allyl phosphodiester oligonucleotides that do not cause RNAse H cleavage of the target, or that actually cause RNAse H cleavage, for SV40 large T antigen (TAg) expression The antisense effect of oligonucleotides containing C-5 propynylpyrimidine as deoxyphosphorothioate was tested. Oligonucleotides targeting the 5 'untranslated region of the TAg transcript, the translation initiation site, the 5' splice junction or the polyadenylation signal were injected into the nucleus or cytoplasm of cultured cells. Only 2'-O-allyl (non-RNAse H) oligonucleotides that were effective in inhibiting T-antigen targeted the 5 'untranslated region and the 5' splice junction. 2'-O-allyl phosphodiester / C-5 propynyl pyrimidine oligonucleotides that do not cause RNAse H were 1/20 more potent than oligodeoxynucleotides that had the ability to enhance RNAse H. The authors concluded that the duplex formed between the RNA target and the 2'-O-allyl phosphodiester / C-5 propynyl pyrimidine oligonucleotide dissociated rapidly in cells (Moulds et al., 1995, Biochem., 34, 5044-53). Biotinylated 2'-O-allyl oligoribonucleotides incorporating a 2-aminoadenine base targeted U2 small nuclear RNA (snRNA), a component of spliceosomes, in HeLa nuclear extracts. These inhibited mRNA production by concomitant accumulation of splicing intermediates. The present invention is directed to antisense compounds that target mRNA.
[0016]
Using antisense compounds to block or control mRNA polyadenylation has not previously been described. Controlling mRNA stability using antisense oligonucleotides targeting RNA sequences involved in RNA turnover or degradation has not previously been described.
[0017]
Thus, there continues to be a need for compositions and methods that modify the behavior of cells, particularly the response of cells to stimuli, by modulating normal mRNA processing. The present invention provides antisense compounds for such modulation. The compositions and methods of the present invention can be used as therapeutic and research tools, including prophylaxis.
[0018]
Summary of the Invention
The present invention provides antisense compounds that are capable of specifically hybridizing to an mRNA target and that do not support cleavage of the mRNA target upon binding, by modulating the processing of a selected wild-type mRNA target in a cell, A method is provided for modulating cell behavior by binding to an mRNA target. Compositions and methods of treatment are also provided. In a preferred embodiment, the mRNA processing may be splicing, polyadenylation, or mRNA degradation. In some embodiments, the behavior of the cell to be modulated may be apoptosis and / or response of the cell to the stimulus.
[0019]
Detailed description of the invention
The present invention relates to oligomers for use in modulating mRNA processing in cells, and ultimately in modulating cell behavior, particularly the response of cells to external or internal stimuli. Utilize antisense compounds, especially oligonucleotides. Examples of cell behavior include mitosis, apoptosis or programmed cell death, quiescence, and differentiation. Examples of external stimuli include stress (including chemical stressors), hormones, cytokines, and other signaling molecules.
[0020]
Modulation of mRNA processing is achieved by providing an antisense compound that specifically modulates one or more mRNA processing events, such as RNA splicing, polyadenylation, capping, and degradation. Data from various molecular targets is provided as an illustration of the invention. As used herein, the terms "target nucleic acid" and "target-encoding nucleic acid" refer to DNA encoding a given molecular target (ie, protein or polypeptide), transcribed from such DNA. RNA, including pre-mRNA and mRNA, and also cDNA derived from such RNA. Specific hybridization of the antisense compound with its target nucleic acid interferes with the normal function of the nucleic acid. This modulation of the function of a target nucleic acid by a nucleic acid that specifically hybridizes thereto is commonly referred to as "antisense". DNA functions to be disturbed include replication and transcription. The overall effect of such interference with target nucleic acid function is the modulation of target molecule expression. In the context of the present invention, "modulation" means, for example, either a quantitative change, either an increase (stimulation) or a decrease (inhibition), in the frequency of processing events or in the expression of genes. In this context, modulation results in "redirection", eg, an increase in one splice product of the target RNA and a concomitant decrease in another splice product that has no significant change in total target RNA levels. Redirecting splicing also means.
[0021]
For antisense, it is preferred to target specific nucleic acids. In the context of the present invention, "targeting" an antisense compound to a particular nucleic acid is a multistep process. The process usually begins with the identification of a nucleic acid sequence whose function is to be modulated. This may be, for example, a cellular gene (or mRNA transcribed from the gene) whose expression is associated with a particular disorder or disease state, or a nucleic acid molecule from an infectious agent. The process of targeting also involves determining one or more sites within this gene for antisense interactions to produce the desired effect, such as modulation of the expression of RNA processing. included. Within the context of the present invention, the preferred target site (s) depends on the nature of the RNA processing to be modulated. For modulation of mRNA splicing, a splice donor or acceptor site, also known as an intron-exon junction, is a preferred target site. Splicing breakpoints and exons (defines) are also preferred target sites for modulation of mRNA splicing. For modulation of polyadenylation, a polyadenylation signal or site is a preferred target site. For modulation of mRNA stability or degradation, stabilizing or destabilizing sequences are preferred target sites.
[0022]
Once one or more target sites have been identified, oligonucleotides are selected that are sufficiently complementary to the target, ie, well enough, to hybridize sufficiently specifically and have the desired effect.
[0023]
In the context of the present invention, "hybridization" means a hydrogen bond between complementary nucleosides or nucleotide bases, which may be a Watson-Crick, Hoogsteen or reverse Hoogsteen hydrogen bond. For example, adenine and thymine are complementary nucleobases that pair through the formation of hydrogen bonds. "Complementary," as used herein, refers to the ability of exact pairing between two nucleotides. For example, if a nucleotide at a particular position of an oligonucleotide is capable of hydrogen bonding to a nucleotide at the same position in a DNA or RNA molecule, the oligonucleotide and the DNA or RNA are complementary to each other at that position Will be considered. Oligonucleotides and DNA or RNA are complementary to each other if, in each molecule, a sufficient number of corresponding positions are occupied by nucleotides capable of hydrogen bonding to each other. Thus, "specifically hybridizable" and "complementary" are stable and have a sufficient degree of complementarity or exact pairing such that specific binding occurs between the oligonucleotide and the DNA or RNA target. A term used to indicate formation. It is understood in the art that the sequence of an antisense compound need not be 100% complementary to its target nucleic acid to be specifically hybridizable. Antisense compounds are characterized in that the binding of the compound to a target DNA or RNA molecule interferes with the normal function of the target DNA or RNA, causing a loss of utility, and under conditions where specific binding is desired, ie, in an in vivo assay or A sufficient degree of complementarity to avoid non-specific binding of the antisense compound to non-target sequences under physiological conditions in the case of therapeutic treatment and under conditions in which the assay is performed in the case of in vitro assays If there is, specific hybridization is possible.
[0024]
Antisense compounds are commonly used as research reagents and diagnostics. For example, antisense oligonucleotides capable of inhibiting gene expression with full specificity are often used by those of ordinary skill in the art to elucidate the function of a particular gene. Antisense compounds are also used, for example, to distinguish the function of various members of a biological pathway. Antisense modulation has therefore been exploited for research use.
[0025]
The specificity and sensitivity of antisense is also harnessed by those skilled in the art for therapeutic use. Antisense oligonucleotides have been used as therapeutic moieties in the treatment of disease states in animals and humans. Antisense oligonucleotides have been safely and effectively administered to humans, and many clinical trials are currently ongoing. Vitraben, an antisense drug TM (Vitravene TM ) Was approved by the US Food and Drug Administration for the treatment of cytomegalovirus retinopathy (CMVR), which causes blindness in AIDS patients. Thus, it has been established that oligonucleotides may be a useful modality that can be usefully designed in therapeutic regimens for the treatment of cells, tissues and animals, especially humans. I have.
[0026]
In the context of the present invention, the term "oligonucleotide" refers to an oligomer or polymer of ribonucleic acid (RNA) or deoxyribonucleic acid (DNA) or mimetics thereof. The term includes oligonucleotides with non-naturally occurring portions that function similarly, as well as oligonucleotides composed of naturally occurring nucleobases, sugars, and covalent internucleoside (backbone) linkages. Such modified or substituted oligonucleotides are often preferred over native because of desirable properties, such as, for example, enhanced cellular uptake, increased affinity for nucleic acid targets, and increased stability in the presence of nucleases.
[0027]
Although antisense oligonucleotides are a preferred form of antisense compound, the present invention includes other oligomeric antisense compounds, including but not limited to oligonucleotide mimetics such as those described below. . Antisense compounds according to the present invention preferably contain about 8 to about 30 nucleobases. Particularly preferred are antisense oligonucleotides containing about 8 to about 30 nucleobases (ie, about 8 to about 30 linked nucleosides). As is known in the art, a nucleoside is a base-sugar combination. The base portion of the nucleoside is usually a heterocyclic base. The two most common types of such heterocyclic bases are purines and pyrimidines. Nucleotides are nucleosides that further include a phosphate group covalently linked to the sugar portion of the nucleoside. For those nucleosides that include a pentofuranosyl sugar, the phosphate group may be attached to any of the 2 ', 3' or 5 'hydroxyl moieties of the sugar. In forming oligonucleotides, the phosphate groups covalently link adjacent nucleosides to one another to form a linear polymer compound. The ends of the linear polymer structure may then be joined to form a further cyclic structure, however, open linear structures are generally preferred. Within the oligonucleotide structure, the phosphate groups are commonly referred to as forming the internucleoside backbone of the oligonucleotide. The normal linkage or backbone of RNA and DNA is a 3'-5 'phosphodiester linkage.
[0028]
Particular examples of preferred antisense compounds useful in the present invention include oligonucleotides containing modified backbones or unnatural internucleoside linkages. As defined herein, oligonucleotides having a modified backbone include those that retain a phosphorus atom in the backbone and those that do not have a phosphorus atom in the backbone. Modified oligonucleotides that do not have a phosphorus atom in the internucleoside backbone, for the purposes of the present specification and as sometimes referred to in the art, can also be considered oligonucleosides.
[0029]
Preferred modified oligonucleotide backbones include, for example, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkyl phosphotriesters, 3'-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, including methyl and Phosphoramidates, thionophosphoramidates, thionoalkylphosphonates, thionoalkylphosphonates, including other alkylphosphonates, phosphinates, 3'-amino phosphoramidates and aminoalkyl phosphoramidates Noalkyl phosphotriesters, and boranophosphates, wherein the modified oligonucleotides have a conventional 3'-5 'linkage, their 2'-5' linked analogs, and the flanking nucleoside units. You Pairs include those having an opposite polarity coupled to the, or 5'-2 from '2'-5'5'-3'3'-5. Various salts, mixed salts and free acid forms are also included.
[0030]
Representative U.S. patents that describe the preparation of the above phosphorus-containing linkages include, but are not limited to, U.S. Patents 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023. 5, 177, 196; 5,188, 897; 5,264,423; 5,276,19; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,455,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,571,799; 5,587,361; and 5,625,050, each of which is incorporated herein by reference.
[0031]
Preferred modified oligonucleotide backbones that do not contain a phosphorus atom include short alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, mixed heteroatoms and alkyl or cycloalkyl internucleoside linkages, or one or more short heteroatom or heterocyclic nucleoside linkages. It has a backbone formed by bonding. These include morpholino linkages (partially formed from the sugar moiety of the nucleoside); siloxane backbone; sulfide, sulfoxide and sulfone backbone; formacetyl and thioformacetyl backbone; methyleneformacetyl and thioformacetyl backbone; alkene-containing backbone. Sulfonate backbone; methyleneimino and methylenehydrazino backbones; sulfonate and sulfonamide backbones; with amide backbones; and mixed N, O, S and CH 2 Others having component parts are included.
[0032]
Representative U.S. patents describing the preparation of the above-described oligonucleosides include, but are not limited to, U.S. Patents 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134. 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610. 5,629,070; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; and 5,677,439; Which is incorporated herein by reference.
[0033]
In other preferred oligonucleotide mimetics, both the sugar and the internucleoside linkage of the nucleotide units, ie, the backbone, are replaced with new groups. Base units are maintained for hybridization with the appropriate nucleic acid target compound. One such oligomeric compound is an oligonucleotide mimetic that has been shown to have excellent hybridization properties and is referred to as peptide nucleic acid (PNA). In PNA compounds, the sugar-backbone of the oligonucleotide is replaced with an amide-containing backbone, especially an aminoethylglycine backbone. The nucleobase is retained and attached, directly or indirectly, to the aza nitrogen atom of the amide portion of the backbone. Representative U.S. patents describing the preparation of PNA compounds include, but are not limited to, U.S. Patents 5,539,082; 5,714,331; and 5,719,262; Each is incorporated herein by reference. A further description of PNA compounds can be found in Nielsen et al. (Science, 1991, 254, 1497-1500).
[0034]
The most preferred embodiments of the present invention are oligonucleotides with phosphorothioate backbones, and heteroatom backbones, and especially -CH of US Patent No. 5,489,677, cited above. 2 -NH-O-CH 2 -, -CH 2 -N (CH 3 ) -O-CH 2 -(Known as methylene (methylimino) or MMI backbone), -CH 2 -ON (CH 3 ) -CH 2 -, -CH 2 -N (CH 3 ) -N (CH 3 ) -CH 2 -And -ON (CH 3 ) -CH 2 -CH 2 -(Natural phosphodiester backbone is -OPO-CH 2 And an oligonucleoside with an amide backbone of US Pat. No. 5,602,240, cited above. Also preferred are the oligonucleotides having the morpholino backbone structure of US Pat. No. 5,034,506, cited above.
[0035]
Modified oligonucleotides may also include one or more substituted sugar moieties. Preferred oligonucleotides include at the 2 'position one of the following: OH; F; O-, S-, or N-alkyl; O-, S-, or N-alkenyl; O-, S-, or N Alkynyl; or O-alkyl-O-alkyl, wherein the alkyl, alkenyl and alkynyl are 1 To C 10 Alkyl or C 2 To C 10 Those which may be substituted or unsubstituted with alkenyl and alkynyl. Particularly preferred is O [(CH 2 ) n O] m CH 3 , O (CH 2 ) n OCH 3 , O (CH 2 ) n NH 2 , O (CH 2 ) n CH 3 , O (CH 2 ) n ONH 2 , And O (CH 2 ) n ON [(CH 2 ) n CH 3 )] 2 Wherein n and m are from 1 to about 10. Other preferred oligonucleotides include one at the 2 'position: C 1 To C 10 Lower alkyl, substituted lower alkyl, alkaryl, aralkyl, O-alkaryl or O-aralkyl, SH, SCH 3 , OCN, Cl, Br, CN, CF 3 , OCF 3 , SOCH 3 , SO 2 CH 3 , ONO 2 , NO 2 , N 3 , NH 2 A heterocycloalkyl, heterocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, acetamido, substituted silyl, RNA cleaving group, reporter group, intercalator, group for improving the pharmacokinetic properties of the oligonucleotide, or Groups for improving the pharmacodynamic properties of the oligonucleotide, and other substituents having similar properties. Preferred modifications include 2'-methoxyethoxy (2'-O-CH 2 CH 2 OCH 3 (Also known as 2'-O- (2-methoxyethyl) or 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), ie, an alkoxyalkoxy group. . A further preferred modification is 2'-dimethylaminooxyethoxy, also known as 2'-DMAOE, ie, O (CH 2 ) 2 ON (CH 3 ) 2 And 2'-dimethylamino-ethoxyethoxy (2'-DMAEOE), ie, 2'-O-CH 2 -O-CH 2 -N (CH 2 ) 2 Is included.
[0036]
Other preferred modifications include 2'-methoxy (2'-O-CH 3 ), 2'-aminopropoxy (2'-OCH 2 CH 2 CH 2 NH 2 ), And 2'-fluoro (2'-F). Similar modifications may also be made at other positions on the oligonucleotide, especially at the 3 'position of the sugar on the 3' terminal nucleotide or in the 2'-5 'linked oligonucleotide, and at the 5' position of the 5 'terminal nucleotide. Is also good. Oligonucleotides may also have sugar mimetics such as cyclobutyl moieties in place of the pentofuranosyl sugar. Representative U.S. patents that describe the preparation of such modified sugar structures include, but are not limited to, U.S. Patents 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044. 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5. 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; and 5,700,920. , Each of the foregoing patents is incorporated herein by reference in its entirety.
[0037]
Oligonucleotides may also contain nucleobase (often referred to in the art simply as "base") modifications or substitutions. As used herein, "unmodified" or "natural" nucleobases include purine bases, adenine (A) and guanine (G), and pyrimidine bases, thymine (T), cytosine (C) and uracil ( U) is included. Modified nucleobases include other synthetic and natural nucleobases, such as 5-methylcytosine (5-me-C), 5-hydroxymethylcytosine, xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, adenine and guanine. 6-methyl and other alkyl derivatives, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-thiouracil, 2-thiothymine and 2-thiocytosine, 5-halouracil and cytosine, 5-propynyluracil and cytosine, 6-azouracil , Cytosine and thymine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl and other 8-substituted adenines and guanines, 5-halo Especially 5-bromo, 5-trifluoro Methyl and other 5-substituted uracils and cytosines, 7-methylguanine and 7-methyladenine, 8-azaguanine and 8-azaadenine, there are 7-deazaguanine and 7-deazaadenine, and 3- deazaguanine and 3-deazaadenine. Additional nucleobases include those disclosed in U.S. Pat. No. 3,687,808, The Conference Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pp. 858-859, Kroschwitz, J. Am. I. Supervision, disclosed in John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S. , Antisense Research and Applications, Chapter 15, pages 289-302, Crooke, S .; T. And Lebleu, B .; Edit, CRC Press, 1993. Certain of these nucleobases are particularly useful for increasing the binding affinity of the oligomeric compounds of the invention. These include 5-substituted pyrimidines, 6-azapyrimidines, and N-2, N-6 and O-6 substituted purines, 2-aminopropyladenine, 5-propynyluracil and 5-propynylcytosine. Is included. 5-Methylcytosine substitution has been shown to increase nucleic acid duplex stability by 0.6-1.2 ° C (Sanghvi, YS, Crooke, ST and Lebleu, B Supervision, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), and are presently preferred base substitutions, even more preferred when combined with 2'-O-methoxyethyl sugar modifications.
[0038]
Representative U.S. patents that describe the preparation of other modified nucleobases with certain of the above modified nucleobases include, but are not limited to, U.S. Pat. No. 4,687,808, as well as U.S. Pat. 5,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,552,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941. And 5,750,692, each of which is incorporated herein by reference.
[0039]
Another modification of the oligonucleotide of the invention involves chemically attaching the oligonucleotide to one or more moieties or conjugates that enhance the activity, cellular distribution or cellular uptake of the oligonucleotide. Such moieties include, but are not limited to, lipid moieties such as cholesterol moieties (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), cholic acid (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), thioethers such as hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan). Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), thiocholesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-5). 8), aliphatic chains such as dodecanediol or undecyl residues (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al. Biochimie, 1993, 75, 49-54), phospholipids such as di-hexadecyl-rac-glycerin or triethylammonium 1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate (Manoharan et al., Tetrahedron Lett. Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), polyamines or polyethylene glycos. Or a chain of adamantane acetic acid (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-365i, Mi et al. Biom, Biochemistry, etc.), or a chain (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973). Or octadecylamine or hexylamino-carbonyl-oxycholesterol moieties (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
[0040]
Representative U.S. patents describing the preparation of such oligonucleotide conjugates include, but are not limited to, U.S. Patents 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525, 5,465,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4, 667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,5. 5,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 and 5,688,941, each of which is incorporated herein by reference. Which is incorporated herein Te.
[0041]
It is not necessary that all positions of a given compound be homogeneously modified, and in fact, one or more of the above-described modifications may be incorporated into a single compound or even into a single nucleoside within an oligonucleotide. It may be. The present invention also includes antisense compounds that are chimeric compounds. In the context of the present invention, a "chimeric" antisense compound or "chimera" is two or more chemically distinct, each composed of at least one monomer unit, ie a nucleotide in the case of an oligonucleotide compound. Antisense compounds, especially oligonucleotides, comprising regions. These oligonucleotides are typically modified such that they impart increased resistance to nuclease degradation, increased cellular uptake, and / or increased binding affinity for the target nucleic acid. Containing at least one region.
[0042]
The chimeric antisense compounds of the present invention may be formed as a hybrid of two or more oligonucleotides, modified oligonucleotides, oligonucleosides, and / or oligonucleotide mimetics as described above. Such compounds have also been referred to in the art as hybrids, gapped oligonucleotides or gapmers. Representative U.S. patents that describe the preparation of such hybrid structures include, but are not limited to, U.S. Patents 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775. 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; and 5,700,922. Each of said patents, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Since homogeneous 2'-modified oligonucleotides do not support RNAse H cleavage of the target RNA molecule, regions of 2'-deoxynucleotides, usually 5 or more contiguous nucleotides, often 10 contiguous deoxynucleotides, Gapped oligonucleotides in which is present with 2'-modified oligo 1 or two regions are often used in antisense technology. Increased binding affinity is provided by the 2 'modification, and the deoxygap region allows for RNAse H cleavage of the target. However, in some cases, such as modulation of RNA processing as described in the present invention, RNAse H cleavage of the target RNA is not desired. It is an object of the present invention that a functional RNA product, but not a truncated RNA product, has an altered function. Thus, the present invention is limited to using oligonucleotides that do not cause cleavage of the RNA target via RNAse H or other methods. Consequently, homogeneously modified oligonucleotides, ie, oligonucleotides that are identically modified at each nucleotide position or nucleoside position, are a preferred embodiment. Particularly preferred embodiments are oligonucleotides that are homogeneously modified at the 2 'position of the nucleotide sugar, such as those having a 2' MOE, 2 'DMAOE, or 2' acetamide modification at each position, or a combination thereof. Other preferred modifications are backbone modifications, including MMI, morpholino and PNA modifications, which may be homogenous or alternating with other bonds, as long as they do not support RNAse H cleavage. And especially a phosphodiester bond or a phosphorothioate bond.
[0043]
The antisense compounds used in accordance with the present invention can be conveniently and routinely made through the well-known technique of solid phase synthesis. Equipment for such synthesis is sold by several vendors, including, for example, Applied Biosystems (Foster City, CA). Any other means known in the art for such synthesis may additionally or alternatively be used. It is well known to use similar techniques for preparing oligonucleotides such as phosphorothioates and alkylated derivatives.
[0044]
The antisense compounds of the present invention are synthesized in vitro and do not include antisense compositions of biological origin or gene vector constructs designed to direct in vivo synthesis of antisense molecules.
[0045]
The compounds of the invention may be used to assist in uptake, distribution and / or absorption, for example, as liposomes, receptor targeting molecules, oral, rectal, topical or other formulations, and mixtures of other molecules, molecular structures or compounds. With, encapsulated, conjugated to, or otherwise associated with them. Representative U.S. patents that describe the preparation of such uptake, distribution and / or absorption aid formulations include, but are not limited to, U.S. Patents 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016. 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5. 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417. 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 0,575; and 5,595,756 contain, each of said patents are incorporated herein by reference.
[0046]
The antisense compounds of the present invention can provide any pharmaceutically acceptable salt, ester, or salt of such ester, or a biologically active metabolite or residue thereof when administered to an animal, including a human. Includes any other compounds that can be provided (directly or indirectly). Thus, for example, the present disclosure also relates to prodrugs and pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention, pharmaceutically acceptable salts of such prodrugs, and other bioequivalents.
[0047]
The term “prodrug” is prepared in an inactive form that is converted to an active form (ie, drug) in the body or in cells of the body by the action of endogenous enzymes or other chemicals and / or conditions. Indicates a therapeutic agent. In particular, the prodrug forms of the oligonucleotides of the invention may be prepared according to the method disclosed in WO 93/24510 to Gosselin et al. Or WO 94/26764 to Imbach et al. Published on Dec. 9, 1993 (SATE ((S -Acetyl-2-thioethyl) phosphoric acid) derivative.
[0048]
The term "pharmaceutically acceptable salts" refers to physiologically and pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention: that is, which retains the desired biological activity of the parent compound and provides its undesired toxicological effects. No salt.
[0049]
Pharmaceutically acceptable base addition salts are formed with metals or amines, such as alkali and alkaline earth metals or organic amines. Examples of metals used as cations are sodium, potassium, magnesium, calcium, and the like. Examples of suitable amines are N, N'-dibenzylethylenediamine, chloroprocaine, choline, diethanolamine, dicyclohexylamine, ethylenediamine, N-methylglucamine, and procaine (see, for example, Berge et al., "Pharmaceutical Salts" J. Of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19). The base addition salts of said acidic compounds are prepared in conventional manner by contacting the free acid form with a sufficient amount of the desired base to produce the salt. The free acid form may be regenerated by contacting the acid with the salt form in a conventional manner and isolating the free acid. The free acid forms differ somewhat from the respective salt forms in certain physical properties, such as solubility in polar solvents, but otherwise, for the purposes of the present invention, the salts are equivalent to the respective free acids. It is. As used herein, "pharmaceutical addition salts" include pharmaceutically acceptable salts of one acid form of the components of the compositions of the present invention. These include organic or inorganic acid salts of amines. Preferred acid salts include hydrochloride, acetate, salicylate, nitrate and phosphate. Other suitable pharmaceutically acceptable salts are well known to those skilled in the art, and are basic salts of various inorganic and organic acids, such as, for example, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid or phosphoric acid. Use of inorganic salts; organic carboxylic, sulfonic, sulphonic or phosphonic or N-substituted sulphamic acids such as acetic acid, propionic acid, glycolic acid, succinic acid, maleic acid, hydroxymaleic acid, methylmaleic acid, fumaric acid, Malic acid, tartaric acid, lactic acid, oxalic acid, gluconic acid, glucaric acid, glucuronic acid, citric acid, benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, salicylic acid, 4-aminosalicylic acid, 2-phenoxybenzoic acid, 2-acetoxybenzoic acid , Using embonic acid, nicotinic acid or isonicotinic acid; and involved in natural protein synthesis 2 Zero alpha-amino acids are used, for example amino acids such as glutamic acid or aspartic acid, and also phenylacetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, ethane-1,2-disulfonic acid, benzenesulfonic acid, 4-methylbenzenesulfonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, naphthalene-1,5-disulfonic acid, 2- or 3-phosphoglycerate, glucose-6-phosphate, N-cyclohexylsulfamic acid (with formation of cyclamate) Or other acidic organic compounds such as ascorbic acid. Pharmaceutically acceptable salts of the compounds may also be prepared with pharmaceutically acceptable cations. Suitable pharmaceutically acceptable cations are well known to those skilled in the art and include alkali, alkaline earth, ammonium and quaternary ammonium cations. Carbonates or bicarbonates can also be used.
[0050]
For oligonucleotides, preferred examples of pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, (a) a cation such as a polyamine such as sodium, potassium, ammonium, magnesium, calcium, spermine and spermidine; Salts formed; (b) acid addition salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid and the like; (c) acetic acid, oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid , Fumaric acid, gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, palmitic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, polygalacturonic acid Salts formed with organic acids such as acids; and (d) chlorine, bromine, and Salts formed from elemental anions such as over de.
[0051]
The antisense compounds of the present invention may be utilized for diagnostics, therapeutics, prophylactics, and as research reagents and kits. In a therapeutic agent, treating an animal, preferably a human, suspected of having a disease or disorder that can be treated by modulating cell behavior, by administering an antisense compound according to the present invention. Can be. The compounds of the present invention can be utilized in pharmaceutical compositions by adding an effective amount of an antisense compound to a suitable pharmaceutically acceptable diluent or carrier. Use of the antisense compounds and methods of the invention may also be useful prophylactically, for example, to prevent or delay infection, inflammation or tumorigenesis.
[0052]
The antisense compounds of the present invention hybridize to nucleic acids encoding the selected mRNA targets, allowing sandwiches and other assays to be easily constructed utilizing this fact. Useful for research and diagnostics. Hybridization of an antisense oligonucleotide of the invention with a nucleic acid encoding a selected mRNA target can be detected by means known in the art. Such means may include conjugation of the enzyme to the oligonucleotide, radiolabeling of the oligonucleotide or any other suitable detection means. Kits using such detection means for detecting the level of a target in a sample may also be prepared.
[0053]
The present invention also includes pharmaceutical compositions and formulations that include the antisense compounds of the present invention. The pharmaceutical compositions of the present invention may be administered in a number of ways depending on whether local or systemic treatment is desired, and on the area to be treated. Administration is topical (including to the eye and to mucous membranes including vaginal and rectal delivery), for example, by powder or aerosol inhalation (inhalation, insufflation), including by nebulizer, lung, intratracheal, intranasal, epithelial and It may be transdermal, oral or parenteral. Parenteral administration includes intravenous, intraarterial, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular injection or infusion; or intracranial, eg, intrathecal or intraventricular, administration. Oligonucleotides having at least one 2'-O-methoxyethyl modification, including chimeric molecules or molecules that may have a 2'-O-methoxyethyl modification of any nucleotide sugar, are believed to be particularly useful for oral administration. Can be
[0054]
Pharmaceutical compositions and formulations for topical administration may include transdermal patches, ointments, lotions, creams, gels, drops, suppositories, sprays, liquids and powders. Conventional pharmaceutical carriers, aqueous, powder or oily bases, thickeners and the like may be necessary or desirable. Coated condoms, gloves, etc. may also be useful.
[0055]
Compositions and formulations for oral administration include powders or granules, suspensions or solutions in water or non-aqueous media, capsules, sachets or tablets. Thickening agents, flavoring agents, diluents, emulsifiers, dispersing aids or binders may be desirable.
[0056]
Compositions and formulations for parenteral, intrathecal or intraventricular administration include buffers, diluents and other suitable additives such as, but not limited to, penetration enhancers, carrier compounds and other pharmaceutical agents. It may comprise a sterile aqueous solution which may also contain chemically acceptable carriers or excipients.
[0057]
Pharmaceutical compositions of the present invention include, but are not limited to, solutions, emulsions, and liposome-containing formulations. These compositions can be made from a variety of components, including, but not limited to, pre-formed liquids, self-emulsifying solids, and self-emulsifying semi-solids.
[0058]
Pharmaceutical formulations of the present invention, which can be readily provided in unit dosage form, can be prepared according to conventional techniques well-known in the pharmaceutical arts. Such techniques include the step of bringing into association the active ingredient with one or more pharmaceutical carriers or one or more pharmaceutical excipients. In general, the formulations are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active ingredient with liquid carriers or finely divided solid carriers or both, and then, if necessary, shaping the product. .
[0059]
The compositions of the present invention may be formulated in any of a number of possible dosage forms, such as, but not limited to, tablets, capsules, liquid syrups, soft gels, suppositories, and enemas. can do. The compositions of the present invention can also be formulated as suspensions in aqueous, non-aqueous or mixed media. Aqueous suspensions may further contain substances which increase the viscosity of the suspension including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol and / or dextran. Suspensions may also contain stabilizers.
[0060]
In one embodiment of the invention, the pharmaceutical composition can be formulated and used as a foam. Pharmaceutical foams include, but are not limited to, formulations such as emulsions, microemulsions, creams, jellies, and liposomes. While basically similar in nature, these formulations vary in the components and density of the final product. The preparation of such compositions and preparations is generally known to those skilled in the pharmaceutical and formulation arts and can be applied to the formulation of the compositions of the present invention.
[0061]
Emulsion
The compositions of the present invention can be prepared and formulated as an emulsion. Emulsions are typically heterogeneous systems in which one liquid is dispersed in another, usually in the form of droplets larger than 0.1 μm in diameter (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger). and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals and Pharmaceuticals Block in Pharmaceutical Dosage, Dekker, Inc., New York, NY, Volume 1, p. Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 2, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Pharmaceuticals, Inc. , Easton, PA, 1985, p. 301). Emulsions are often two-phase systems that include two immiscible liquid phases that are well mixed and dispersed with one another. In general, emulsions can be either water-in-oil (w / o) or oil-in-water (o / w) species. If the liquid phase is well separated and dispersed as microdroplets in the bulk oil phase, the resulting composition is called a water-in-oil (w / o) emulsion. Alternatively, if the oil phase is well separated and dispersed as microdroplets in the bulk liquid phase, the resulting composition is called an oil-in-water (o / w) emulsion. Emulsions may contain additional elements in addition to the dispersed phase and the active drug, which may be present as a solution in either the liquid or oil phase or as a separate phase itself. Good. Pharmaceutical excipients such as emulsifiers, stabilizers, dyes, and antioxidants may be present in the emulsion, if desired. Pharmaceutical emulsions include multi-emulsions comprising two or more phases, such as, for example, oil-in-water-in-oil (o / w / o) and water-in-oil-in-water (w / o / w) emulsions. It may be. Such complex formulations often offer certain advantages not available with mere two-component emulsions. Multiemulsions in which the individual oil droplets of the o / w emulsion contain small water droplets constitute a w / o / w emulsion. Similarly, a system of oil droplets contained in globules of water stabilized in an oily continuous phase provides an o / w / o emulsion.
[0062]
Emulsions are characterized by having little or no thermodynamic stability. Often, the dispersed or discontinuous phase of the emulsion is well dispersed in the external or continuous phase and is maintained in this form through the means of an emulsifier or the viscosity of the formulation. Any of the phases of the emulsion may be semi-solid or solid, as in the case of emulsion-type ointment bases and creams. Other means of stabilizing the emulsion include using an emulsifier, which may be included in either phase of the emulsion. Emulsifiers can be divided into four broad categories: synthetic surfactants, naturally occurring emulsifiers, adsorbent bases, and finely dispersed solids (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and). Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 199).
[0063]
Synthetic surfactants, also known as surfactants, have found wide utility in the formulation of emulsions and have been reviewed in the literature (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and). Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceuticals, Electronic Medicine, Liberty, RD , New York, NY, 1988, volume 1, p. Surfactants are typically amphiphilic and include a hydrophilic portion and a hydrophobic portion. The ratio of hydrophilic to hydrophobic properties of a surfactant is called the hydrophilic / lipophilic balance (HLB) and is a valuable tool in classifying and selecting surfactants in the preparation of formulations. Surfactants may be divided into different classes based on the nature of the hydrophilic group: nonionic, anionic, cationic, and amphoteric (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds. ), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p.
[0064]
Naturally occurring emulsifiers used in emulsion formulations include lanolin, beeswax, phosphatides, lecithin and acacia. Adsorbent substrates have hydrophilic properties such as absorb water and form w / o emulsions but still maintain their semi-solid hardness, such as anhydrous lanolin and hydrophilic petrolatum . Precisely dispersed solids have also been used as good emulsifiers, especially in combination with surfactants, and in sticky preparations. These include heavy metal hydroxides; non-expandable clays such as bentonite, attapulgite, hectorite, kaolin, montmorillonite, colloidal aluminum silicate and colloidal aluminum magnesium silicate; pigments; and carbon or tristearin Non-polar solids such as acid glycerin; and polar inorganic solids such as.
[0065]
A wide variety of non-emulsifiable substances are also included in emulsion formulations and contribute to the properties of the emulsion. These include lipids, oils, waxes, fatty acids, fatty alcohols, fatty esters, humectants, hydrophilic colloids, preservatives and antioxidants (Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker). (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 335; Inc., New York, NY, volume 1, p. 199).
[0066]
Hydrocolloids or hydrocolloids include polysaccharides (eg, acacia, agar, alginic acid, carrageenan, guar gum, karaya gum, and tragacanth), cellulose derivatives (eg, carboxymethylcellulose and carboxypropylcellulose) And naturally occurring gums and synthetic polymers, such as synthetic polymers (eg, carbomers, cellulose ethers, and carboxyvinyl polymers). They disperse or swell in water to form a strong interfacial film around the droplets of the dispersed phase, and to form a colloidal solution that stabilizes the emulsion by increasing the viscosity of the external phase.
[0067]
Because emulsions often contain numerous active substances, such as carbohydrates, proteins, sterols, and phosphatides, that can readily support the growth of microorganisms, these formulations often include a preservative. Commonly used preservatives included in emulsion formulations include methyl paraben, propyl paraben, quaternary ammonium salts, benzalkonium chloride, esters of p-hydroxybenzoic acid, and boric acid. Antioxidants are also commonly added to emulsion formulations to prevent formulation degradation. Antioxidants used include free radical scavengers such as tocopherol, alkyl gallates, butylated hydroxyanisole, butylated hydroxytoluene, or reducing agents such as ascorbic acid and sodium metabisulfite, and citric acid, It may be an antioxidant synergist such as tartaric acid and lecithin.
[0068]
The use of emulsion formulations via the transdermal, oral, and parenteral routes and methods for their manufacture have been reviewed in the literature (Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.)). , 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. Emulsion formulations for oral delivery have been used very widely because they are easy to formulate and efficient in terms of absorption and biocompatibility (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and) Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Medicine, Germany, 1988, Riebe, Germany. , Inc., New York, NY, volume 1, p. Mineral oil-based laxatives, oil-soluble vitamins and high fat nutritional preparations are generally included in materials that are administered orally as o / w emulsions.
[0069]
In one aspect of the invention, the composition of oligonucleotide and nucleic acid is formulated as a microemulsion. Microemulsions can be defined as a system of water, oil and amphiphile, which is a single, optically isotropic and thermodynamically stable liquid solution (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245). Typically, microemulsions are prepared by first dispersing the oil in a water-soluble surfactant solution and then adding a sufficient amount of a fourth component, typically a medium chain alcohol, to provide a clear system. A system that is prepared by forming. Thus, microemulsions have also been described as thermodynamically stable, isotropic, transparent dispersions of two immiscible liquids stabilized by an interfacial film of surfactant molecules (Leung). and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, New York, New York. Microemulsions are generally prepared by combining three to five components, including oils, water, surfactants, cosurfactants and electrolytes. Whether a microemulsion is water-in-oil (w / o) or oil-in-water (o / w) depends on the properties of the oil and surfactant used and its polar head of the structure of the surfactant molecule. And the tail of the hydrocarbon tail (Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985, p. 271).
[0070]
The phenomenological approach using phase diagrams has been extensively studied and comprehensive knowledge has been obtained for those skilled in the art on methods for formulating microemulsions (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger). and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceuticals, Inc., Pharmaceuticals, Inc., 1988. Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. 335). Compared to conventional emulsions, microemulsions offer the advantage of solubilizing water-insoluble drugs in the formulation of spontaneously formed thermodynamically stable droplets.
[0071]
Surfactants used in the preparation of microemulsions include ionic surfactants, non-ionic surfactants, Brij 96, polyoxyethylene oleyl ether, polyglycerol fatty acid esters, tetraglycerol monolaurate (ML310), tetraglycerol monooleate (MO310), hexaglycerol monooleate (PO310), hexaglycerol pentaoleate (PO500), decaglycerol monocaprate (MCA750), decaglycerol monooleate (MO750), decaglycerol sequioleate (SO750) ), Decaglycerol decaoleate (DAO750), alone or in combination with cosurfactants But, but it is not limited to. Cosurfactants are usually short-chain alcohols such as ethanol, 1-propanol, and 1-butanol, but penetrate into the surfactant film and, consequently, because of the void space created between the surfactant molecules. Making irregular films serves to increase interfacial flow. However, microemulsions can be prepared without the use of cosurfactants, and alcohol-free self-emulsifying microemulsion systems are known in the art. The aqueous phase may typically be, but is not limited to, water, an aqueous solution of the drug, glycerol, PEG300, PEG400, polyglycerol, derivatives of propylene glycol and ethylene glycol. The oil phase includes Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, fatty acid ester, intermediate chain (C 8 -C 12 ) Materials such as mono-, di- and tri-glycerides, polyoxyethylated glyceryl fatty acid esters, fatty alcohols, glycated glycerides, saturated glycated C8-C10 glycerides, vegetable oils and silicone oils may be included. However, it is not limited to these.
[0072]
Microemulsions are of particular interest in terms of drug solubility and enhanced drug absorption. Lipid-based microemulsions (both o / w and w / o) have been proposed to enhance oral biocompatibility of drugs, including peptides (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385). Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Microemulsions provide improved drug solubility, protection of the drug from enzymatic hydrolysis, potential for enhanced drug absorption due to surfactant-induced changes in membrane fluidity and permeability, ease of preparation, solid dosage forms Offers advantages such as ease of oral administration over the form, increased clinical potential, and reduced toxicity (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci.). , 1996, 85, 138-143). When the components are kept together at ambient temperature, a microemulsion can often form spontaneously. This can be a particular advantage when formulating thermolabile (thermolabile) drugs, peptides or oligonucleotides. Microemulsions have also been effective in transdermal delivery of active ingredients, both for cosmetic and pharmaceutical uses. The microemulsion compositions and formulations of the present invention promote increased systemic absorption of oligonucleotides and nucleic acids from the gastrointestinal tract and are useful in the gastrointestinal tract, vagina, buccal cavity and other areas of administration. In addition, local cellular uptake of nucleic acids can be improved.
[0073]
The microemulsions of the present invention also contain additional components and additives, such as sorbitan monostearate (Grill 3), labrasol, and penetration enhancers, to improve the properties of the formulation, and Of oligonucleotides and nucleic acids can be enhanced. The penetration enhancers used in the microemulsions of the present invention can be classified as belonging to one of five broad categories: surfactants, fatty acids, bile acids, chelating agents, and non-chelating non- Surfactants (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Each of these classes has been described above.
[0074]
Liposome
In addition to microemulsions, there are many organized surfactant structures that have been studied and used for drug formulation. These include monolayers, micelles, bilayers and vesicles. Vesicles, such as liposomes, have attracted great interest due to their specificity and duration of action provided from the point of view of drug delivery. As used herein, the term "liposome" means a vesicle composed of amphipathic lipids arranged in one or more spherical bilayers.
[0075]
Liposomes are unilamellar or multilamellar vesicles with a membrane formed from lipophilic substances and an aqueous interior. The aqueous portion contains the composition to be delivered. Cationic liposomes have the advantage that they can fuse with the cell wall. Non-cationic liposomes, although unable to fuse efficiently with the cell wall, are taken up by macrophages in vivo.
[0076]
To pass through intact mammalian skin, lipid vesicles must pass through a series of microscopic pores, each less than 50 nm in diameter, under the influence of a suitable transcutaneous gradient. Therefore, it is preferable to use liposomes that are highly deformable and can pass through such micropores.
[0077]
Additional advantages of liposomes include the following: liposomes obtained from natural phospholipids are biocompatible and biodegradable; liposomes have a wide range of water-soluble drugs and Liposomes can contain lipid soluble drugs; liposomes can protect the encapsulated drug in its internal compartment from metabolism and degradation (Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988). , Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, p. Important considerations in preparing liposome formulations are lipid surface charge, vesicle size, and liposome water volume.
[0078]
Liposomes are useful for transporting and delivering active ingredients to the site of action. Since a liposome membrane is structurally similar to a biological membrane, when the liposome is used in a tissue, the liposome begins to dissolve into the cell membrane. As the melting of the liposome and the cell progresses, the liposome content moves into the cell where the active agent can act.
[0079]
Liposomal formulations have been the focus of extensive research as a mode of delivery for many drugs. For topical administration, there is increasing evidence that liposomes offer several advantages over other formulations. Such advantages include reduced side effects associated with high systemic absorption of the administered drug, increased accumulation of the administered drug at the desired target, and a variety of drugs, both hydrophilic and hydrophobic , Into the skin.
[0080]
Several reports have elaborated on the ability of liposomes to deliver drugs, including high molecular weight DNA, into the skin. Compounds including analgesics, antibodies, hormones and high molecular weight DNA were administered to the skin. Many of the doses resulted targeted to the upper part of the integument.
[0081]
Liposomes fall into two broad classes. Cationic liposomes are positively (+) charged liposomes that interact with negatively (-) charged DNA molecules to form a stable complex. The positively charged DNA / liposome complex binds to the negatively charged cell surface and is internalized in endosomes. Due to the acidic pH in the endosome, the liposome ruptures and releases its contents into the cytoplasm (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
[0082]
Liposomes that are pH-sensitive or negatively charged capture DNA rather than complex with it. Both DNA and lipids are similarly charged, resulting in repulsion rather than complex formation. Nevertheless, some DNA is trapped in the aqueous interior of these liposomes. DNA encoding the thymidine kinase gene was delivered to cell monolayers in culture using pH-sensitive liposomes. Exogenous gene expression was detected in target cells (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
[0083]
One major type of liposome composition includes phospholipids other than naturally occurring phosphatidylcholine. Natural liposome compositions can be formed, for example, from dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) or dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC). Anionic liposome compositions are generally formed from dimyristoylphosphatidylglycerol, while anionic fusogenic liposomes are formed primarily from dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE). Another type of liposome composition is formed from, for example, PC, such as soy phosphatidylcholine (PC), and egg PC. Another type is formed from a mixture of phospholipids and / or phosphatidylcholines and / or cholesterol.
[0084]
Several studies have evaluated the topical administration of liposomal drug formulations to the skin. The use of liposomes containing interferon on guinea pig skin resulted in a reduction in herpes ulcers on the skin, but delivery of interferon via other means, such as solutions or emulsions, was not effective (Weiner) et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Furthermore, another study tested the efficiency of interferon administered as part of a liposome formulation for administration of interferon using an aqueous system, and concluded that liposome formulations were superior to aqueous administration (du Pressissis). et al., Antibiotic Research, 1992, 18, 259-265).
To determine its utility in delivering the drug to the skin, non-ionic liposome systems were investigated, particularly systems containing non-ionic surfactants and cholesterol. Novasome TM I (glyceryl dilaurate / cholesterol / polyoxyethylene-10-stearyl ether) and Novasome TM Cyclosporin-A was delivered into the dermis of mouse skin using a non-ionic liposome formulation containing II (glyceryl distearate / cholesterol / polyoxyethylene-10-stearyl ether). The results showed that such non-ionic liposome systems were effective in promoting cyclosporin-A deposition in another layer of skin (Hu et al. ST). P. Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
[0085]
Liposomes also include "stereochemically stable" liposomes, although the term as used herein is one or more specialized lipids that are incorporated into liposomes. Liposomes containing lipids that have a longer lifespan in circulating blood than liposomes not containing such special lipids. Examples of stereochemically stable liposomes include those in which a portion of the vesicle-forming lipid portion of the liposome is (A) monosialoganglioside G M1 And (B) has been derivatized with one or more hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) moieties. Without wishing to be bound by any particular theory, the art is directed to these liposomes containing gangliosides, sphingomyelin, or PEG-derivatized lipids for at least stereochemically stable liposomes. The increased circulating half-life of stereochemically stable liposomes is believed to be due to reduced uptake of reticuloendothelial system (RES) into cells (Allen et al.). , FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765). Various liposomes containing one or more glycolipids are known in the art. Papahadjopoulos et al. (Ann. NY Acad. Sci., 1987, 507, 64) describe monosialoganglioside G. M1 Reported the ability of galactocerebroside sulfate and phosphatidylinositol to enhance the blood half-life of liposomes. These findings were described by Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 6949). U.S. Pat. Nos. 4,837,028 and WO 88/04924, both by Allen et al., Include (1) sphingomyelin and (2) ganglioside G. M1 Alternatively, a liposome containing galactocerebroside sulfate is disclosed. U.S. Pat. 5,543,152 (Webb et al.) Disclose liposomes comprising sphingomyelin. Liposomes containing 1,2-sn-dimyristoyl phosphatidylcholine are disclosed in WO 97/13499 (Lim et al.).
[0086]
Many liposomes, including lipids derivatized with one or more hydrophilic polymers, and methods for their production are known in the art. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describe nonionic surfactants containing PEG moieties, 2C 12 Liposomes containing 15G. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) noted that hydrophilic coating of polystyrene particles with polymer glycol causes a significant increase in blood half-life. Synthetic phospholipids modified by the attachment of carboxylic groups of polyalkylene glycols (eg, PEG) have been described by Sears (US Patent Nos. 4,426,330 and 4,534,899). (FEBS Lett., 1990, 268, 235) show that liposomes containing phosphatidylethanolamine (PE) derivatized with PEG or PEG stearate have a marked increase in half-life in the blood circulation. The experiments shown are described. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) describe such findings in other PEG-derivatized phospholipids, such as DSPE- formed from a combination of distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE) and PEG. Expanded to PEG. Liposomes having a covalently attached PEG moiety on their outer surface are described in European Patent No. to Fisher. It is described in EP 0 445 131 B1 and WO 90/04384. Liposome compositions containing 1-20 mol% PE derivatized with PEG, and methods of using them, are described in Woodle et al. (US Patent Nos. 5,013,556 and 5,356,633) and Martin et al. Patent No. 5,213,804 and European Patent No. EP 0 496 813 B1). Liposomes containing a number of other lipid-polymer complexes are described in WO 91/05545 and U.S. Pat. 5,225,212 (both Martin et al.) And WO 94/20073 (Zalipsky et al.). Liposomes containing PEG-modified ceramide lipids are described in WO 96/10391 (Choi et al.). U.S. Patent No. 5,540,935 (Miyazaki et al.) And 5,556,948 (Tagawa et al.) Describe PEG-containing liposomes that can further derivatize functional moieties to their surface.
[0087]
A limited number of liposomes containing nucleic acids are known in the art. WO 96/40062 to Thierry et al. Discloses a method for encapsulating high molecular weight nucleic acids in liposomes. U.S. Patent No. to Tagawa et al. No. 5,264,221 discloses protein-bound liposomes and discloses that the contents of such liposomes can include antisense RNA. U.S. Patent No. to Rahman et al. No. 5,665,710 describes a particular method of encapsulating oligodeoxynucleotides in liposomes. WO 97/04787 to Love et al. Discloses liposomes containing antisense oligonucleotides targeting the raf gene.
[0088]
Transfersomes are yet another type of liposome, and are highly deformable lipid aggregates, and are attractive candidates for drug delivery vehicles. Transfersomes can be described as lipid droplets, which are so deformable that they can easily penetrate through smaller pores than droplets. Transfersomes can adapt to the environment in which they are used, eg, they are self-optimizing (adapting to the shape of the pores in the skin), self-healing, and often fragmented Without reaching their targets, and are often self-loading. To make transfersomes, surface-active activators, usually surfactants, can be added to the standard liposome composition. Serum albumin was delivered to the skin using transfersomes. Transfersome-mediated delivery of serum albumin has been shown to be as efficient as subcutaneous injection of a solution containing serum albumin.
[0089]
Surfactants find wide application in formulations such as emulsions (including microemulsions) and liposomes. The most common way to classify and rank the properties of many different types of surfactants, both for natural and synthetic surfactants, is through the use of a hydrophilic / lipophilic balance (HLB). . The nature of the hydrophilic groups (also known as "heads") provides the most useful means for categorizing the various surfactants used in the formulation (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
[0090]
If the surfactant molecule is not ionized, it is classified as a non-ionic surfactant. Nonionic surfactants find wide application in pharmaceutical and cosmetic products and can be used over a wide range of pH values. Generally, their HLB values range from 2 to about 18 depending on their structure. Nonionic surfactants include nonionic esters such as ethylene glycol esters, propylene glycol esters, glyceryl esters, polyglyceryl esters, sorbitan esters, sucrose esters, and ethoxylated esters. Non-ionic alkanolamides and ethers such as fatty alcohol ethoxylates, propoxylated alcohols, and ethoxylated / propoxylated block polymers are also included in this class. Polyoxyethylene surfactants are the most common members of the class of non-ionic surfactants.
[0091]
Surfactants are classified as anionic if the surfactant molecule has a negative (-) charge when dissolved or dispersed in water. Anionic surfactants include carboxylic esters such as soaps, acyl lactylates, acyl amides of amino acids, esters of sulfuric acids such as alkyl sulfates and ethoxylated alkyl sulfates, alkyl benzene sulfonates, acyl isethionates. ), Sulfonates such as acyl taurates and sulfosuccinates, and phosphates. The most important members of the anionic surfactant class are the alkyl sulfates and soaps.
[0092]
Surfactants are classified as cationic if the surfactant molecule has a positive (+) charge when dissolved or dispersed in water. Cationic surfactants include quaternary ammonium salts and ethoxylated amines. Quaternary ammonium salts are the most used constituents of this class.
[0093]
A surfactant is classified as amphoteric if the surfactant molecule has the ability to have either a positive (+) charge or a negative (-) charge. Amphoteric surfactants include acrylic acid derivatives, substituted alkyl amides, N-alkyl betaines and phosphatides.
[0094]
The use of surfactants in drug products, formulations and emulsions is reviewed below (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, p. 285).
[0095]
Penetration enhancer
In one aspect, the present invention uses various penetration enhancers to achieve efficient delivery of nucleic acids, particularly oligonucleotides, to animal skin. Most drugs are in solution in both ionized and non-ionized forms. However, usually only lipid-soluble or lipophilic drugs readily cross cell membranes. It has been found that even non-lipophilic drugs can cross cell membranes if the membrane to be crossed is treated with a penetration enhancer. In addition to assisting the diffusion of non-lipophilic drugs through cell membranes, penetration enhancers also increase the permeability of lipophilic drugs.
[0096]
Penetration enhancers can be classified as belonging to one of five broad categories: surfactants, fatty acids, bile salts, chelators, and non-chelating non-surfactants (Lee et al., Critical). Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Each of the above classes of penetration enhancers is described in further detail below.
[0097]
Surfactant: In the context of the present invention, a surfactant (or "surface-active agent") is a chemical that, when dissolved in an aqueous solution, reduces the surface tension of the solution or the interfacial tension between the aqueous solution and another liquid. Unit, with the consequence that the absorption of the oligonucleotide through the mucosa is enhanced. In addition to bile salts and fatty acids, these penetration enhancers include, for example, sodium lauryl sulfate, polyoxyethylene-9-lauryl ether and polyoxyethylene-20-cetyl ether (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutics). Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); and perfluorochemical emulsions such as FC-43 (Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[0098]
Fatty acids: Various fatty acids and their derivatives that function as penetration enhancers include, for example, oleic acid, lauric acid, capric acid (n-decanoic acid), myristic acid, palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, dica Plate, tricaplate, monoolein (1-monooleyl-rac-glycerol), dilaurin, caprylic acid, arachidonic acid, glycerol 1-monocaprate, 1-dodecylazacycloheptan-2-one, acylcarnitine, acylcholine, their C 1-10 Includes alkyl esters (eg, methyl, isopropyl and t-butyl), and their mono- and di-glycerides (ie, oleate, laurate, caprate, myristate, palmitate, stearate, linoleate, etc.) (Lee et al). , Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Pharmaceuticals, Thermal Pharmaceuticals, Inc., 1992. , 651-654).
[0099]
Bile salts: The physiological role of bile includes promoting the dispersal and absorption of lipids and fat-soluble vitamins (Brunton, Chapter 38 in: Goodman &Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th. Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Various natural bile salts, and their synthetic derivatives, function as penetration enhancers. Thus, the term "bile salt" includes any of the naturally occurring components of bile as well as any of their synthetic derivatives. The bile salts of the present invention include, for example, cholic acid (or its pharmaceutically acceptable sodium salt, sodium cholate), dehydrocholic acid (sodium dehydrocholate), deoxycholic acid (sodium deoxycholate), Glucolic acid (glucocholate sodium), glycocholate (sodium glycocholate), glycodeoxycholic acid (sodium glycodeoxycholate), taurocholic acid (sodium taurocholate), taurodeoxychol Acid (sodium taurodeoxycholate), chenodeoxycholic acid (sodium chenodeoxycholic acid), ursodeoxycholic acid (UDCA), sodium tauro-24,25-dihydro-fusidate (STDHF) , Sodium glycodihydrofusidate, and polyoxyethylene-9-lauryl ether (POE) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92, Spain; Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews, Therapeutics, Therapeutics, Therapeutics, Pharmaceuticals, Therapeutics al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
[0100]
Chelating agents: As used in connection with the present invention, a chelating agent can be defined as a compound that removes metal ions from solution by forming a complex therewith, and the absorption of oligonucleotides through the mucosa With the consequence of improving. With respect to its use as a permeation enhancer in the present invention, chelators are DNase inhibitors because the most characterized DNA nucleases require a divalent metal ion for their catalysis and are therefore inhibited by the chelator. It has the additional advantage of also functioning as an agent (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). The chelating agents of the present invention include disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA), citric acid, salicylates (eg, sodium salicylate, 5-methoxysalicylate and homovanillate), N-acyl derivatives of collagen, laureth-9 and Includes, but is not limited to, N-aminoacyl derivatives of β-diketones (enamines) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, drugstore, Drugstore, Drugstore, Drugstore, Digital 92 1990, 7, 1-33; Bur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
[0101]
Non-chelating non-surfactant: As used herein, a non-chelating non-surfactant permeation-enhancing compound has little activity as a chelator or as a surfactant, but nevertheless via the trophic mucosa. (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). This class of penetration enhancers includes, for example, unsaturated cyclic ureas, 1-alkyl- and 1-alkenylazacyclo-alkanone derivatives (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); Non-steroidal anti-inflammatory drugs such as diclofenac sodium, indomethacin and phenylbutazone (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
[0102]
Agents that enhance oligonucleotide uptake at the cellular level can also be added to the pharmaceutical and other compositions of the present invention. For example, cationic lipids such as lipofectin (Junichi et al, US Patent No. 5,705,188), cationic glycerol derivatives, and polycationic molecules such as polylysine (Lollo et al., PCT Application WO 97/30731). Are also known to enhance cellular uptake of oligonucleotides.
[0103]
Glycols such as ethylene glycol and propylene glycol, pyrroles such as 2-pyrrole, azone, and other agents including terpenes such as limonene and menthone can be used to enhance the penetration of administered nucleic acids. .
[0104]
Carrier
Certain compositions of the present invention also incorporate a carrier compound into the formulation. As used herein, a “carrier compound” or “carrier” is inert (ie, has no biological activity itself), but is, for example, a biologically active nucleic acid. A nucleic acid, or analog thereof, that is recognized as a nucleic acid by an in vivo process that reduces the bioavailability of the biologically active nucleic acid by degrading or promoting its removal from the circulation I can say. Co-administration of the nucleic acid and the carrier compound (typically in excess of the carrier compound), possibly due to competition of the carrier compound and the nucleic acid for common receptors, resulting in liver, kidney, or other extracirculating reservoirs. This causes a substantial reduction in the amount of nucleic acid recovered in it. For example, co-administration with polyinosinic acid, dextran sulfate, polycytidic acid or 4-acetamido-4'isothiocyano-stilbene-2,2'-disulfonic acid reduces the recovery of partial phosphorothioate oligonucleotides in liver tissue. (Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).
[0105]
Excipient
In contrast to a carrier compound, a "pharmaceutical carrier" or "excipient" is a pharmaceutically acceptable solvent, suspension, or any one for delivering one or more nucleic acids to an animal. Other pharmaceutically inert vehicles. Excipients may be liquid or solid, and, when combined with the nucleic acids and other components of a given pharmaceutical composition, by the envisioned planned mode of administration, It is selected to provide viscosity and the like. Typical pharmaceutical carriers include binders such as pregelatinized corn starch, polyvinylpyrrolidone or hydroxypropylmethylcellulose; fillers such as lactose and other sugars, microcrystalline cellulose, pectin, gelatin, calcium sulfate, Lubricants (eg, magnesium stearate, talc, silica, colloidal silicon dioxide, stearic acid, metallic stearic acid, hydrogenated vegetable oil, corn starch, polyethylene glycol, benzoic acid) Disintegrants (eg, starch, sodium starch glycolate); and wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate). There.
[0106]
The compositions of the present invention may also be formulated using pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for parenteral administration that do not deleteriously react with nucleic acids. . Suitable pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, alcohol, polyethylene glycol, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone and the like. , But are not limited to these.
[0107]
Formulations for topical administration of nucleic acids may include sterile aqueous and non-sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions in common solvents such as alcohols, or solutions of the nucleic acids in liquid or solid oily bases. . The solution may contain buffers, diluents and other suitable additives. Pharmaceutically acceptable organic or inorganic excipients suitable for parenteral administration that do not deleteriously react with nucleic acids both physically and mentally can be used.
[0108]
Suitable pharmaceutically acceptable excipients include water, saline, alcohol, polyethylene glycol, gelatin, lactose, amylose, magnesium stearate, talc, silicic acid, viscous paraffin, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and the like. But not limited to these.
[0109]
Other components
The compositions of the present invention may further contain other adjuvant components conventionally found in pharmaceutical compositions at established use levels in the art. Thus, for example, the composition may contain additional, compatible pharmaceutically active substances, such as, for example, antipruritics, astringents, local anesthetics or anti-inflammatory agents, or the compositions of the present invention. Additional substances useful in physically formulating the various dosage forms of the composition, such as pigments, flavoring agents, preservatives, antioxidants, opacifiers, thickeners and stabilizers, etc. Can be contained. However, such materials, when added, should not unduly interfere with the biological activity of the components of the compositions of the present invention. The formulation can be sterilized and, if desired, adjuvants which do not deleteriously interact with the formulation's (one or more) nucleic acids, eg, lubricants, preservatives, stabilizers, wetting agents. , Can be mixed with emulsifiers, salts that affect osmolarity, buffers, colorants, flavors and / or fragrances and the like.
[0110]
Aqueous suspensions can contain substances that increase the viscosity of the suspension, including, for example, sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, and / or dextran. Suspension may contain a stabilizer.
[0111]
Certain aspects of the present invention provide a pharmaceutical composition comprising (a) one or more antisense compounds, and (b) one or more other chemotherapeutic agents that function by a non-antisense mechanism. provide. Examples of such chemotherapeutic agents include daunorubicin, dactinomycin, doxorubicin, bleomycin, mitomycin, nitrogen mustard, chlorambucil, melphalan, cyclophosphamide, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine (CA) , 5-fluorouracil (5-FU), floxyuridine (5-FUdR), methotrexate (MTX), colchicine, vincristine, vinblastine, etoposide, teniposide, cisplatin and diethylstilbestrol (DES), It is not limited to these (in general, The Merck Manual of Diagnostics and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., Eds., 1987. , Rahway, NJ, pages 1206-1228). Non-steroidal anti-inflammatory drugs and anti-inflammatory drugs including but not limited to corticosteroids, and anti-viral drugs including, but not limited to, ribibirin, vidarabine, acyclovir and ganciclovar Can be combined in the compositions of the present invention (generally, The Merck Manual of Diagnostics and Therapy, 15th Ed., Berkov et al., Eds., 1987, Rahway, NJ). , Pages 2499-2506 and 46-49, respectively). Other non-antisense chemotherapeutic agents are also within the scope of the invention. Two or more combined compounds can be used together or sequentially.
[0112]
In another related aspect, a composition of the invention includes one or more antisense compounds, particularly oligonucleotides, targeting a first nucleic acid, and one or more targeting a second nucleic acid target. May contain additional antisense compounds, especially oligonucleotides. Numerous examples of antisense compounds are known in the art. Two or more combined compounds can be used together or sequentially.
[0113]
Formulation of the therapeutic composition and its subsequent administration is considered to be within the skill of the art. The dose will depend on the severity and responsiveness of the disease state to be treated, with a course of treatment lasting several days to several months, or with a course of cure until cure or disease reduction. Optimal dosing schedules can be calculated from measuring drug accumulation in the patient. Persons of ordinary skill can easily determine optimum dosages, dosing methodologies and repetition rates. Optimum doses can vary depending on the specific potency of the particular oligonucleotide, and generally are those ECs that are found to be effective in in vitro and in vivo animal models. 50 Can be estimated based on Generally, doses will be from 0.01 μg to 100 g / kg body weight and can be given once or more daily, weekly, monthly or yearly, or every 2 to 20 years It may be once. One skilled in the art can easily estimate repetition frequency for administration based on the residence time and concentration of the drug in bodily fluids or tissues. Preferably, continuous treatment will cause the patient to receive maintenance therapy to prevent the recurrence of the disease state, wherein the oligonucleotide is administered once a day or more, once every 20 years, once a day. It is administered at a maintenance dose in the range of 0.01 μg to 100 g / kg body weight.
[0114]
While specifically described in accordance with certain preferred embodiments of the invention, the following examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the invention.
[0115]
【Example】
Example 1
Nucleoside phosphoramidites for oligonucleotide synthesis
Deoxy and 2'-alkoxyamidite
2′-deoxy and 2′-methoxy β-cyanoethyldiisopropylphosphoramidite were purchased from commercial sources (eg, Chemgenes, Needham MA or Glen Research, Inc. Sterling VA). Other 2′-O-alkoxy substituted nucleoside amidites are prepared as described in US Pat. No. 5,506,351, which is incorporated herein by reference. To synthesize oligonucleotides using 2'-alkoxyamidite, a standard cycle for unmodified oligonucleotides was used, except that the wait step after pulse delivery of tetrazole and base was increased to 360 seconds.
[0116]
Oligonucleotides containing 5-methyl-2'-deoxycytidine (5-Me-C) nucleotides were prepared using commercially available phosphoramidites (Glen Research, Sterling VA or ChemGenes, Needham MA) [Sangvivi et al. Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203].
[0117]
2'-fluoroamidite
2'-Fluorodeoxyadenosine amidite
2'-Fluoro oligonucleotides are described as previously described [Kawasaki et al., J. Am. Med. Chem. , 1993, 36, 831-841] and U.S. Patent No. 5,670,633. Briefly, the protected nucleoside, N6-benzoyl-2′-deoxy-2′-fluoroadenosine, uses commercially available 9-β-D-arabinofuranosyl adenine as a starting material and uses literature procedures. With modification, the 2'-α-fluoro atom is replaced by the S ' N It was synthesized by introducing by 2-substitution. Thus, N6-benzoyl-9-β-D-arabinofuranosyladenine was selectively protected in moderate yields as the 3 ′, 5′-ditetrahydropyranyl (THP) intermediate. Deprotection of the THP and N6-benzoyl groups was accomplished using standard methodology, and using standard techniques, the 5'-dimethoxytrityl- (DMT) and 5'-DMT-3'-phosphoramidite intermediates Got.
[0118]
2'-fluorodeoxyguanosine
The synthesis of 2'-deoxy-2'-fluoroguanosine uses tetraisopropyldisiloxanyl (TPDS) protected 9-β-D-arabinofuranosylguanine as a starting material and the intermediate diisobutylyl Made by conversion to luarabinofuranosylguanosine. Deprotection of the TPDS group followed by protection of the hydroxyl group with THP provided diisobutyryldi-THP protected arabinofuranosylguanine. Following selective O-deacylation and triflatation, treatment of the crude product with fluoride followed by deprotection of the THP group. Using standard methodology, 5'-DMT- and 5'-DMT-3'-phosphoramidite were obtained.
[0119]
2'-fluorouridine
The synthesis of 2′-deoxy-2′-fluorouridine involves treating 2,2′-anhydro-1-β-D-arabinofuranosyluracil with 70% hydrogenfluoride-pyridine. This was done by modifying the literature method. 5'-DMT and 5'-DMT-3'phosphoramidite were obtained using standard techniques.
[0120]
2'-fluorodeoxycytidine
2'-Deoxy-2'-fluorocytidine is synthesized via the amination of 2'-deoxy-2'-fluorouridine and then selectively protected with N4-benzoyl-2'-deoxy-2'-fluoro. Cytidine was obtained. 5'-DMT and 5'-DMT-3'phosphoramidite were obtained using standard techniques.
[0121]
2'-O- (2-methoxyethyl) -modified amidite
2'-O-methoxyethyl-substituted nucleoside amidites can be prepared as follows or as described in Martin, P .; (Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504).
[0122]
2,2′-anhydro [1- (β-D-arabinofuranosyl) -5-methyluridine]
5-methyluridine (ribosyl thymine, commercially available from Yamasa, Choshi, Japan) (72.0 g, 0.279 M), diphenyl carbonate (90.0 g, 0.420 M) and sodium bicarbonate (2 0.0 g, 0.024 M) was added to DMF (300 mL). The mixture was heated to reflux with stirring and the evolved carbon dioxide gas was released in a controlled manner. After 1 hour, the slightly darkened solution was concentrated under low pressure. The resulting syrup was poured into diethyl ether (2.5 L) with stirring. The product formed a gum. The ether was decanted and the residue was dissolved in a minimum amount of methanol (about 400 mL). The solution was poured into fresh ether (2.5 L) to give a hard gum. The ether was decanted, the gum dried in a vacuum oven (60 ° C., 1 mm Hg for 24 hours), and the resulting solid crushed to a pale tan powder (57 g, 85% crude yield). . The NMR spectrum was consistent with the structure with phenol as the sodium salt (about 5%). The material was further purified by column chromatography used in the subsequent reaction (or alternatively using a gradient of methanol in ethyl acetate (10-25%) to give a white solid, mp 222-4 ° C. Can be).
[0123]
2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine
2,2'-anhydro-5-methyluridine (195 g, 0.81 M), tris (2-methoxyethyl) boric acid (231 g, 0.98 M) and 2-methoxyethanol (1.2 L) Was added to a 2 L stainless steel pressure vessel and placed in an oil bath preheated to 160 ° C. After heating at 155-160 ° C. for 48 hours, the vessel was opened and the solution was evaporated to dryness, then triturated in methanol (200 mL). The residue was suspended in hot acetone (1 L). The insoluble salts were filtered, washed with acetone (150 mL) and the filtrate was evaporated. The residue (280 g) was CH 3 Dissolved in CN (600 mL) and then evaporated. Silica gel column (3 kg) was added to 0.5% Et 3 CH containing NH 2 Cl 2 / Acetone / MeOH (20: 5: 3). CH residue 2 Cl 2 (250 mL) and adsorbed on silica (150 g) before loading onto the column. The product eluted with the loading solvent to give 160 g (63%) of the product. Additional material was obtained by reworking the impure fraction.
[0124]
2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridine
2'-O-methoxyethyl-5-methyluridine (160 g, 0.506 M) was co-evaporated with pyridine (250 mL), then the dried residue was dissolved in pyridine (1.3 L). A first aliquot of dimethoxytrityl chloride (94.3 g, 0.278 M) was added and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. A second aliquot of dimethoxytrityl chloride (94.3 g, 0.278 M) was added and the reaction was stirred for another hour. Methanol (170 mL) was then added to stop the reaction. HPLC indicated the presence of about 70% product. The solvent is evaporated and CH 3 Triturated in CN (200 mL). The residue is CHCl 3 (1.5 L), then 2 × 500 mL of saturated NaHCO 3 3 And extracted with 2 × 500 mL of saturated NaCl. Organic layer 2 SO 4 Dry over, filter and evaporate. 275 g of residue were obtained. The residue was purified on a 3.5 kg silica gel column, packed and charged with 0.5% Et. 3 Elution was carried out with EtOAc / hexane / acetone (5: 5: 1) containing NH. The pure fraction was evaporated, yielding 164 g of product. An additional 20 g was obtained from the impure fraction, giving a total yield of 183 g (57%).
[0125]
3'-O-acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridine
2′-O-methoxyethyl-5′-O-dimethoxytrityl-5-methyluridine (106 g, 0.167 M), DMF / pyridine (3: 1 prepared from 562 mL DMF and 188 mL pyridine) (750 mL) and acetic anhydride (24.38 mL, 0.258 M) were mixed and stirred at room temperature for 24 hours. The reaction was monitored by TLC by adding MeOH to the TLC sample and quenching first. At the end of the reaction as judged by TLC, MeOH (50 mL) was added and the mixture was evaporated at 35 ° C. The residue is CHCl 3 (800 mL) and then extracted with 2 × 200 mL of saturated sodium bicarbonate and 2 × 200 mL of saturated NaCl. The aqueous layer was washed with 200 mL CHCl 3 Was back extracted. The combined organic layers were dried over sodium sulfate and evaporated to give 122 g (about 90% product) of a residue. The residue was purified on a 3.5 kg silica gel column and eluted with EtOAc / hexane (4: 1). Evaporation of the pure product fractions gave 96 g (84%). An additional 1.5 g was recovered from later fractions.
[0126]
3'-O-acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoleuridine
The first solution was 3'-O-acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridine (96 g, 0.144 M) in CH. 3 Prepared by dissolving in CN (700 mL) and set aside. Triethylamine (189 mL, 1.44 M) was added to CH 3 To a solution of the triazole (90 g, 1.3 M) in CN (1 L) was added, cooled to −5 ° C. and stirred using an overhead stirrer for 0.5 h. POCl was added to the stirred solution maintained at 0-10 ° C for 30 minutes. 3 Was added dropwise and the resulting mixture was stirred for a further 2 hours. The first solution was added dropwise to the latter solution over 45 minutes. The resulting reaction mixture was stored in a cold room overnight. The salts were filtered from the reaction mixture and the solution was evaporated. The residue was dissolved in EtOAc (1 L), then the insoluble solid was removed by filtration. Filter the filtrate with 1 x 300 mL of NaHCO 3 And 2 × 300 mL of saturated NaCl, dried over sodium sulfate and evaporated. The residue was triturated in EtOAc to give the title compound.
[0127]
2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidine
Dioxane (500 mL) and NH 4 A solution of 3'-O-acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoleuridine (103 g, 0.141 M) in OH (30 mL) was added at room temperature. For 2 hours. The dioxane solution was evaporated and the residue was azeotroped with MeOH (2 × 200 mL). The residue was dissolved in MeOH (300 mL) and transferred to a 2 liter stainless steel pressure vessel. NH 3 Gas-saturated MeOH (400 mL) was added and the vessel was heated at 100 ° C. for 2 hours (complete conversion indicated by TLC). The contents of the vessel were evaporated to dryness and the residue was dissolved in EtOAc (500 mL) and then washed once with saturated NaCl (200 mL). The organics were dried over sodium sulfate and the solvent was evaporated, yielding 85 g (95%) of the title compound.
[0128]
N4-benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidine
2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-cytidine (85 g, 0.134 M) was dissolved in DMF (800 mL) and then benzoic anhydride (37.2). g, 0.165 M) was added with stirring. After stirring for 3 hours, TLC showed that the reaction was approximately 95% complete. The solvent was evaporated and the residue was azeotroped with MeOH (200 mL). The residue is CHCl 3 (700 mL) and saturated NaHCO 3 (2 × 300 mL) and saturated NaCl (2 × 300 mL), extracted with MgSO 4 And then evaporated to give a residue (96 g). The residue was eluted with 0.5% Et 3 Separation by chromatography on a 1.5 kg silica column using EtOAc / hexane (1: 1) with NH. Evaporation of the pure product fractions gave 90 g (90%) of the title compound.
[0129]
N4-benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidine-3'-amidite
N4-benzoyl-2′-O-methoxyethyl-5′-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidine (74 g, 0.10 M) was added to CH 2 Cl 2 (1 L). Tetrazole diisopropylamine (7.1 g) and 2-cyanoethoxy-tetra- (isopropyl) phosphite (40.5 mL, 0.123 M) were added with stirring under nitrogen gas. The resulting mixture was stirred at room temperature for 20 hours (TLC indicated that the reaction was 95% complete). The reaction mixture is washed with saturated NaHCO 3 (1 × 300 mL) and saturated NaCl (3 × 300 mL). CH2 2 Cl 2 (300 mL), then combine the extracts and extract 4 And concentrated. The resulting residue was chromatographed on a 1.5 kg silica column using EtOAc / hexane (3: 1) as the elution solvent. The pure fractions were combined to give 90.6 g (87%) of the title compound.
[0130]
2'-O- (aminooxyethyl) nucleoside amidite and 2'-O- (dimethylaminooxyethyl) nucleoside amidite
2 '-(dimethylaminooxyethoxy) nucleoside amidite
2 '-(Dimethylaminooxyethoxy) nucleoside amidites [also known in the art as 2'-O- (dimethylaminooxyethyl) nucleoside amidites] are prepared as described in the next paragraph. Adenosine, cytidine and guanosine nucleoside amidites are thymidine (5-methyluridine) except that the exocyclic amine is protected by a benzoyl group in the case of adenosine and cytidine and in the case of guanosine by isobutyryl. It is prepared similarly to
[0131]
5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-O 2 -2'-anhydro-5-methyluridine
O 2 -2'-anhydro-5-methyluridine (Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g, 0.416 mmol), dimethylaminopyridine (0.66 g, 0.013 eq, 0.0054) mmol) was dissolved in anhydrous pyridine (500 ml) under argon gas conditions at ambient temperature and with mechanical stirring. tert-Butyldiphenylchlorosilane (125.8 g, 119.0 mL, 1.1 eq, 0.458 mmol) was added in one portion. The reaction was stirred at ambient temperature for 16 hours. TLC (Rf 0.22, ethyl acetate) indicated that the reaction was complete. The solution was concentrated under reduced pressure to a thick oil. This was partitioned between dichloromethane (1 L) and saturated sodium bicarbonate (2 × 1 L) and brine (1 L). The organic layer was dried over sodium sulfate and concentrated under reduced pressure to a thick oil. The oil was dissolved in a 1: 1 mixture of ethyl acetate and ethyl ether (600 mL), then the solution was cooled to -10C. The resulting crystalline product was collected by filtration, washed with ethyl ether (3 × 200 mL), dried (40 ° C., 1 mm Hg, 24 hours), 149 g (74.8% ) As a white solid. TLC and NMR were consistent with the pure product.
[0132]
5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O- (2-hydroxyethyl) -5-methyluridine
Borane in tetrahydrofuran (1.0 M, 2.0 eq, 622 mL) was added to a 2 L stainless steel, non-stirred pressure reactor. In a fume hood, ethylene glycol (350 mL, excess) was carefully added initially with manual stirring until hydrogen gas evolution subsided. 5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-O 2 -2'-Anhydro-5-methyluridine (149 g, 0.311 mol) and sodium bicarbonate (0.074 g, 0.003 eq) were added with manual stirring. The reactor was sealed and heated in an oil bath until the internal temperature reached 160 ° C., and then maintained for 16 hours (pressure <100 psig). The reaction vessel was cooled to ambient temperature and opened. TLC (Rf 0.67 for the desired product and Rf 0.82 for the ara-T byproduct, ethyl acetate) indicated about 70% conversion to the product. To avoid further by-product formation, the reaction is stopped and under reduced pressure (10-1 mm Hg) in a hot water bath (40-100 ° C) under the more extreme conditions used to remove ethylene glycol. And concentrated. [Alternatively, once the low boiling solvent is gone, the remaining solution may be partitioned between ethyl acetate and water. The product will be in the organic phase. The residue was purified by column chromatography (2 kg silica gel, ethyl acetate-hexane gradient 1: 1 to 4: 1). The appropriate fractions were combined, discarded and dried to give a white crisp foam (84 g, 50%), mixed starting material (17.4 g) and pure recycle 20 g of possible starting material were obtained. The yield based on the starting material, less pure recovered starting material, was 58%. TLC and NMR were consistent with the product at 99% purity.
[0133]
2'-O-([2-phthalimidooxy) ethyl] -5'-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridine
5′-O-tert-butyldiphenylsilyl-2′-O- (2-hydroxyethyl) -5-methyluridine (20 g, 36.98 mmol) was added to triphenylphosphine (11.63 g, 44.36). mmol) and N-hydroxyphthalimide (7.24 g, 44.36 mmol). Then, at 40 ° C. for 2 days under strong vacuum conditions, 2 O 5 And dried. The reaction mixture was flushed with argon and anhydrous THF (369.8 mL, Aldrich, a tightly closed bottle) was added to give a clear liquid. Diethyl-azodicarboxylate (6.98 mL, 44.36 mmol) was added dropwise to the reaction mixture. The rate of addition was maintained such that the resulting deep red color just disappeared before adding the next drop. After the addition was completed, the reaction was stirred for 4 hours. By that time, TLC showed the reaction was complete (ethyl acetate: hexane, 60:40). The solvent was evaporated under reduced pressure. The residue obtained is loaded on a flash column and eluted with ethyl acetate: hexane (60:40), eluted with 2'-O-([2-phthalimidooxy) ethyl] -5'-t-butyldiphenylsilyl-5. -Methyluridine was obtained as a white foam (21.819 g, 86%).
[0134]
5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy) ethyl] -5-methyluridine
2′-O-([2-phthalimidooxy) ethyl] -5′-t-butyldiphenylsilyl-5-methyluridine (3.1 g, 4.5 mmol) was added to anhydrous CH. 2 Cl 2 (4.5 mL) and methyl hydrazine (300 mL, 4.64 mmol) was added dropwise at -10 ° C to 0 ° C. After 1 hour, the mixture was filtered and the filtrate was cooled with ice-cold CH. 2 Cl 2 And the combined organic phases are washed with water, brine and then anhydrous Na. 2 SO 4 And dried. The solution was concentrated to give 2′-O- (aminooxyethyl) thymidine, which was then dissolved in MeOH (67.5 mL). To this was added formaldehyde (20% aqueous solution, w / w, 1.1 eq.) And the resulting mixture was stirred for 1 hour. The solvent is removed under reduced pressure; the residue is separated by chromatography and 5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy) ethyl] -5-methyluridine is removed. Obtained as a white foam (1.95 g, 78%).
[0135]
5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O- [N, N-ditylaminooxyethyl] -5-methyluridine
5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O-[(2-formadoximinooxy) ethyl] -5-methyluridine (1.77 g, 3.12 mmol) was added to 1 M p-toluene. Dissolved in a solution of pyridinium sulfonate (PPTS). Sodium cyanoborohydride (0.39 g, 6.13 mmol) was added to this solution at 10 ° C. under inert gas conditions. The reaction mixture was stirred at 10 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the reaction vessel was removed from the ice bath, stirred at room temperature for 2 hours, and the reaction was monitored by TLC (CH 2 Cl 2 5% MeOH in). NaHCO 3 Aqueous solution (5%, 10 mL) was added and extracted with ethyl acetate (2 × 20 mL). The ethyl acetate phase is dried over anhydrous Na 2 SO 4 And evaporated to dryness. The residue was dissolved in a 1 M PPTS solution in MeOH (30.6 mL). Formaldehyde (20% w / w, 30 mL, 3.37 mmol) was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. The reaction mixture was cooled to 10 ° C. in an ice bath, sodium cyanoborohydride (0.39 g, 6.13 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at 10 ° C. for 10 minutes. After 10 minutes, the reaction mixture was removed from the ice bath and stirred at room temperature for 2 hours. 5% NaHCO in the reaction mixture 3 (25 mL) solution was added and extracted with ethyl acetate (2 × 25 mL). The ethyl acetate layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 And then evaporated to dryness. The residue obtained is purified by flash column chromatography and 2 Cl 2 5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O- [N, N-dimethylaminooxyethyl] -5-methyluridine was eluted with 5% MeOH in white foam (14.6 g). , 80%).
[0136]
2'-O- (dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine
Triethylamine trihydrofluoride (3.91 mL, 24.0 mmol) was dissolved in anhydrous THF and triethylamine (1.67 mL, 12 mmol, maintained in anhydrous KOH). This mixture of triethylamine-2HF was then charged with 5'-O-tert-butyldiphenylsilyl-2'-O- [N, N-dimethylaminooxyethyl] -5-methyluridine (1.40 g, 2. 4 mmol) and stirred at room temperature for 24 hours. The reaction was performed by TLC (CH 2 Cl 2 (5% MeOH in MeOH). The solvent was removed under reduced pressure and the residue was loaded on a flash column and CH 2 Cl 2 Elution with 10% MeOH in water gave 2'-O- (dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine (766 mg, 92.5%).
[0137]
5'-O-DMT-2'-O- (dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine
2′-O- (dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine (750 mg, 2.17 mmol) was added under strong vacuum conditions at 40 ° C. overnight with P 2 O 5 And dried. It was then co-evaporated with anhydrous pyridine (20 mL). The obtained residue was dissolved in pyridine (11 mL) under argon gas conditions. 4-Dimethylaminopyridine (26.5 mg, 2.60 mmol), 4,4'-dimethoxytrityl chloride (880 mg, 2.60 mmol) was added to the mixture, and the reaction mixture was added at room temperature to the starting material. Was stirred until the entire amount of was lost. The pyridine is removed under reduced pressure, then the residue is separated by chromatography and 2 Cl 2 Elution with 10% MeOH in MeOH (containing several drops of pyridine) gave 5'-O-DMT-2'-O- (dimethylamino-oxyethyl) -5-methyluridine (1.13 g, 80%). .
[0138]
5'-O-DMT-2'-O- (2-N, N-dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine-3 '-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite]
5′-O-DMT-2′-O- (dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine (1.08 g, 1.67 mmol) is co-evaporated with toluene (20 mL). N, N-Diisopropylaminetetrazonide (0.29 g, 1.67 mmol) was added to the residue, and then the solution was added under strong vacuum at 40 ° C. overnight, 2 O 5 And dried. Thereafter, the reaction mixture was dissolved in anhydrous acetonitrile (8.4 mL) and 2-cyanoethyl-N, N, N 1 , N 1 -Tetraisopropylphosphoramidite (2.12 mL, 6.08 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at ambient temperature for 4 hours under inert gas conditions. The progress of the reaction was monitored by TLC (hexane: ethyl acetate 1: 1). The solvent was evaporated, then the residue was dissolved in ethyl acetate (70 mL) and 5% NaHCO 3 Washed with an aqueous solution (40 mL). The ethyl acetate layer was dried over anhydrous Na 2 SO 4 And concentrated. The obtained residue was separated by chromatography (ethyl acetate as an elution solvent), and 5′-O-DMT-2′-O- (2-N, N-dimethylaminooxyethyl) -5-methyluridine-3. '-[(2-Cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] (1.04 g, 74.9%) was obtained as a foam.
[0139]
2 '-(aminooxyethoxy) nucleoside amidite
2 ′-(Aminooxyethoxy) nucleoside amidites (also known in the art as 2′-O- (aminooxyethyl) nucleoside amidites) are prepared as described in the next paragraph. Adenosine, cytidine and thymidine nucleoside amidites are prepared similarly.
[0140]
N2-isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2'-O- (2-ethylacetyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine-3 '-[(2-cyanoethyl) -N , N-diisopropylphosphoramidite]
2'-O-aminooxyethyl guanosine analogs can be obtained by selective 2'-O-alkylation of diaminopurine riboside. Diaminopurine ribosides of various weights can be purchased from Schering AG (Berlin), where 2'-O- (2-ethylacetyl) diaminopurine riboside is converted to a small amount of the 3'-O-isomer. Provide with. 2'-O- (2-ethylacetyl) diaminopurine riboside can be degraded by adenosine deaminase treatment and converted to 2'-O- (2-ethylacetyl) guanosine (McGee, D.P.C.). , Cook, PD, Guinosso, CJ, WO 94/02501 A1 940203.). Standard protection techniques are 2'-O- (2-ethylacetyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine and 2-N-isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2 '. Must give -O- (2-ethylacetyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine, which is reduced to 2-N-isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl-2 '-O- (2-ethylacetyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine can be provided. As before, the hydroxyl group can be replaced by N-hydroxyphthalimide by a Mitsunobu reaction, and the protected nucleoside can be phosphitylated as usual to give 2-N-isobutyryl-6-O-diphenylcarbamoyl. -2'-O- (2-ethylacetyl) -5'-O- (4,4'-dimethoxytrityl) guanosine-3 '-[(2-cyanoethyl) -N, N-diisopropylphosphoramidite] is obtained. be able to.
[0141]
Example 2
Oligonucleotide synthesis
Unsubstituted and substituted phosphodiester (P = O) oligonucleotides are synthesized on an automated DNA synthesizer (Applied Biosystems model 380B) using standard phosphoramidite chemistry with oxidation by iodine.
[0142]
For the stepwise thiation of the phosphite bond, except that the standard oxidation bottle was replaced with a 0.2 M solution of 3H-1,2-benzodithiol-3-one 1,1-dioxide in acetonitrile. Phosphorothioates (P = S) are synthesized as for phosphodiester oligonucleotides. The thia wait phase was increased to 68 seconds, followed by a capping phase. After separation from the CPG column and deblocking in ammonium hydroxide concentrated at 55 ° C. (18 hours), the oligonucleotide was precipitated by 0.5 precipitation twice with 2.5 volumes of ethanol. Purified from M NaCl solution.
[0143]
The phosphinate oligonucleotide is prepared as described in US Pat. No. 5,508,270, which is incorporated herein by reference.
Alkyl phosphonate oligonucleotides are prepared as described in US Pat. No. 4,469,863, which is incorporated herein by reference.
[0144]
3'-deoxy-3'-methylene phosphonate oligonucleotides are prepared as described in U.S. Patent Nos. 5,610,289 or 5,625,050, which are incorporated herein by reference.
[0145]
Phosphoramidite oligonucleotides are prepared as described in US Pat. No. 5,256,775 or US Pat. No. 5,366,878, which is incorporated herein by reference.
[0146]
Alkyl phosphonothioate oligonucleotides are disclosed in published PCT applications PCT / US94 / 00902 and PCT / US93 / 06976, published as WO 94/17093 and WO 94/02499, respectively, incorporated herein by reference. Prepared as described in
[0147]
3'-deoxy-3'-aminophosphoramidate oligonucleotides are prepared as described in U.S. Patent No. 5,476,925, which is incorporated herein by reference.
[0148]
Phosphotriester oligonucleotides are prepared as described in US Pat. No. 5,023,234, incorporated herein by reference.
Borane phosphate oligonucleotides are prepared as described in US Patents 5,130,302 and 5,177,198, both of which are incorporated herein by reference.
[0149]
Example 3
Oligonucleoside synthesis
Methylene methyl imino-linked oligonucleosides that are also identical to MMI-linked oligonucleosides, methylene dimethylhydrazo-linked oligonucleosides that are identical to MDH-linked oligonucleosides, and methylene carbonyl amino-linked oligonucleosides that are also identical to amide-3-linked oligonucleosides; And methyleneaminocarbonyl-linked oligonucleosides, which are also identical to amide-4 linked oligonucleosides, and mixed backbone compounds having, for example, MMI and a P = O or P = S bond, are all described herein. It is prepared as described in US Patents 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677, 5,602,240 and 5,610,289, which are incorporated herein by reference.
[0150]
Formacetal and thioformacetal linked oligonucleosides are prepared as described in US Patents 5,264,562 and 5,264,564, which are incorporated herein by reference.
[0151]
Ethylene oxide linked oligonucleosides are prepared as described in US Pat. No. 5,223,618, which is incorporated herein by reference.
Example 4
PNA synthesis
Peptide nucleic acids (PNAs) are prepared according to any of a variety of methods for peptide nucleic acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. They can also be prepared according to U.S. Patents 5,539,082, 5,700,922, and 5,719,262, which are incorporated herein by reference.
[0152]
Example 5
Oligonucleotide isolation
After separation from a controlled-pore glass column (Applied Biosystems) and deblocking in concentrated ammonium hydroxide at 55 ° C. for 18 hours, the oligonucleotide or oligonucleoside was converted from 0.5 M NaCl to 2.5 M NaCl. Purify by two precipitations with twice the volume of ethanol. The synthesized oligonucleotides were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis on a denaturing gel and determined to be at least 85% full-length material. The relative amount of phosphorothioate and phosphodiester linkages obtained from the synthesis 31 Inspected by P nuclear magnetic resonance spectroscopy, and for some studies the oligonucleotides were purified by HPLC as described by Chiang et al. (J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171). The results obtained with the HPLC purified product were similar to those obtained with the non-HPLC purified product.
[0153]
Example 6
Antisense modulation of polyadenylation
The adhesion molecule, E-selectin, is transiently expressed on endothelial cells in response to inflammatory cytokines and mediates leukocyte adhesion. The genomic structure of human E-selectin contains multiple AATAAA polyadenylation signals and a number of AUUUA transcript destabilizing elements in the 3 'untranslated region. It has been shown that all three polyadenylation signals are functional, which results in three types of E-selectin transcripts produced by the distinct use of these signals. The three transcripts (types I, II, and III) are differentially expressed in certain disease states. Type I transcripts lack six transcript destabilizing elements and have been shown to be more stable than full-length type III transcripts (Chu et al., 1994, J. Immunol. 153: 4179). -4189).
[0154]
The three AATAAA polyadenylation signals are located at nucleotides 2823, 2981 and 3816 in the 3 'untranslated sequence (according to the numbering scheme of Bevilacqua et al., 1989, Science 243, 1160-1165; GenBank Accession No. M24736). The actual polyadenylation site is 13-20 bases downstream of the respective AATAAA signal.
[0155]
Oligonucleotides 20 nucleobases in length were designed to target the region of these three polyadenylation sites and / or the region immediately downstream thereof. Oligonucleotides were made as homogeneous 2'-methoxyethoxy (2'-MOE) compounds with either a phosphorothioate (P = S) or phosphodiester (P = O) backbone.
[0156]
The effect of these antisense compounds on polyadenylation, and thus on the size and stability of the transcript, was measured. HUVECs (human umbilical cord vascular endothelial cells) are treated with antisense oligonucleotides targeting the E-selectin polyadenylation site. Anchor-PCR amplification of the human E-selectin mRNA 3 'end was performed according to Chu et al. (1994, J. Immunol. 153: 4179-4189) to determine which polyadenylation sites are still functioning and how much. Determine what works in quantity.
[0157]
Directly measuring the stability of the various transcripts present after oligonucleotide treatment was performed using the rabbit reticulocyte lysate system described in Chu et al. (1994, J. Immunol. 153: 4179-4189). Can be done using
[0158]
Example 7
Antisense modulation of splicing in mouse IL-5 receptor α mRNA
The mRNA encoding the membrane form of mouse IL-receptor α contains 11 exons. The transmembrane domain of the receptor is encoded by exon 9. The two mRNAs that coat the soluble (secreted) form of the receptor result from differential splicing events. The mRNA encoding soluble form 1 of the receptor has lost exon 9 (exon 8 is splicing with exon 10), and the mRNA encoding soluble form 2 has exon 9 and exon 10. It is missing (exon 8 splices with exon 11) (Imamura et al., DNA and Cell Biology 13: 283-292).
[0159]
A series of antisense oligonucleotides were designed to "walk" the entire exon 9 of the mouse IL-5 receptor α mRNA coding region. Oligonucleotides are prepared approximately every 10 nucleobases by Genbank Accession no. The region extending from nucleotides 1288 to 1381 on the sequence defined as D90205 and targeting along the exon 9 sequence provided herein as SEQ ID NO: 9 was targeted.
[0160]
Mouse BCL 1 Cells were selected for screening for antisense oligonucleotides targeting mouse IL-5 receptor α. These are B-cell leukemia cells from naturally occurring tumors originating in BALB / c and proliferate in response to mouse or human IL-5. It is a CD5 + strain, resembling a subset of human chronic lymphocytic leukemia tumors, and secretes IgM upon lipopolysaccharide stimulation. Cells were obtained from the American Type Culture Collection and 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 10 mM Hepes, pH 7.2, 50 μM 2-ME, 2 mM. The cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with L-glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin (Gibco, Grand Island, NY).
[0161]
The effects of these compounds on both membrane and solubilized mouse IL-5 receptor α were measured and are shown in Table 1. Oligonucleotides, BCL 1 Cells were screened at a concentration of 10 μM and IL-5 receptor α mRNA was measured by Northern blot. The% inhibition is compared to an untreated (no oligo) control.
[0162]
All BCL 1 Cell RNA is converted to RNeasy TM It was isolated using a kit (Qiagen, Santa Clara CA). Northern blotting was performed using standard methods. cDNA probes were generated from oligonucleotides that matched the exon sequence of either exon 2, exon 8, exon 9, or exon 10. The signal was quantified using a Molecular Dynamics PhosphorImager.
[0163]
[Table 1]
[0164]
[Table 2]
[0165]
These gapmers were able to reduce both membrane and solubilized forms, and each oligonucleotide reduced the two forms almost equally.
Example 8
Effect of oligonucleotides that are completely 2'-MOEs targeting mouse IL-5 receptor α mRNA exon 9 on membrane and solubilized IL-5 receptor α mRNA expression
Additional oligonucleotides were designed to target exon 9 and the intron / exon border; they were homogeneously 2'-methoxyethoxy modified and had a phosphorothioate backbone throughout. These are shown in Table 3 below.
[0166]
[Table 3]
[0167]
BCL 1 Cells were treated with 10 μM complete-2′-methoxyethoxy, complete phosphorothioate oligonucleotide for 24 hours to extract and analyze total RNA. The results are shown in Table 4.
[0168]
[Table 4]
[0169]
All of the fully modified 2'-methoxyethoxy oligonucleotides targeting the murine IL-5 receptor α mRNA exon reduce the expression of the membrane form of IL-5 receptor α and the solubilized form of the receptor Increase the expression of The effectiveness of these simultaneous actions was equally reduced as an antisense target site moved to the 3 'end of the exon. The overall amount of IL-5 receptor alpha transcript is not affected. This indicates that a complete 2'-methoxyethoxy-modified oligonucleotide targeting exon 9 just at the end of the intronic 3 'splice acceptor site prevents exon 9 from being included in the splice product, and It shows that the splicing device is redirected to the next downstream splice acceptor site (in intron 9). Decreased membrane-type IL-5 receptor α, specifically without, or more particularly with increased solubilized form, is a disease associated with IL-5 signaling, particularly asthma Are considered to have therapeutic utility. These results indicate that splicing is redirected by using a homogeneous 2'-methoxyethoxy oligonucleotide targeting exon 9, resulting in the exclusion (skipping) of exon 9 from the spliced mRNA product, resulting in production FIG. 5 shows that a controlled change in the ratio of solubilized / membrane IL-5 receptor is effected.
[0170]
By converting the RNAse H-dependent compound (2 'MOE gapmer, ISIS 18002) to an RNAse H-independent compound (complete-2' MOE compound, 21755), this oligonucleotide sequence was converted to IL-5 receptor. It has also been shown to convert from both types of inhibitors of body α to those that selectively inhibit the membrane type via redirecting splicing.
[0171]
Example 9
Oligonucleotides targeting exon-exon boundaries of various types of mouse IL-5 receptor α mRNA
Oligonucleotides that were either 2 'MOE gapmers or homogeneous 2' MOEs were designed to target exon-exon boundaries of mature IL-5 receptor α mRNA. The mRNA encoding the membrane type of the receptor has exons 1-11. The mRNA encoding the solubilized form of the receptor will either lose exon 9 (solubilized form 1) or exon 9 and exon 10 (solubilized form 2). In Table 5, the target region called "E7-E8" means targeting exon 7-8 boundaries, and so on.
[0172]
[Table 5]
[0173]
These compounds were tested for their ability to reduce membrane or solubilized IL-5 receptor α mRNA at a dose of 10 μM. The results for the compounds tested are shown in Table 6.
[0174]
[Table 6]
[0175]
As shown in Table 6, the selective decrease in the expression of the soluble IL-5 receptor α is due to the antisense oligonucleotide targeting exon 8 to exon 10 or targeting the exon 8 to exon 11 To a lesser extent with antisense oligonucleotides, both of these binding sites are those found only in the solubilized receptor mRNA. Selective reduction of expression of membrane-type IL-5 receptor α can be achieved by antisense oligonucleotides targeting exon 8 to exon 9 or exon 9 to exon 10 boundaries, both of which are Is present only in mRNAs targeting the membrane-type IL-5 receptor α. Placing the complete -2 'MOE oligonucleotide across the intron / exon boundary of exon 9 resulted in the same effect as that obtained with the complete -modified oligonucleotide placed inside exon 9.
[0176]
Example 10
Antisense oligonucleotide targeting a splice site in human IL-5 receptor α mRNA
The mRNA transcript encoding human IL-5 receptor α in membrane form contains exons 1-10 and 12-14. Exon 11 has been spliced out. Thus, either solubilized and membrane-type receptors target sequences in exons 1-10 that are common, or selectively target sequences that are only present in the membrane form (exons 12-14). be able to. Oligonucleotides are designed to target various intron / exon boundaries downstream of exon 11 and strongly prevent successful splicing of exon 11 and thus keep splice products away from membrane forms and The solubilized IL-5 receptor α was selected and redirected.
[0177]
A series of oligonucleotides were designed to target various splice sites or (intron-exon boundaries) in IL-5 receptor mRNA. These are shown in Table 7, and their effects on IL-5 receptor mRNA and cell surface protein levels are shown in Tables 8 and 9.
[0178]
[Table 7]
[0179]
[Table 8]
[0180]
ISIS 16746, 16748 and 16755 inhibit IL-5 receptor mRNA expression by more than 50% and are therefore preferred in this assay. Northern blot analysis showed that ISIS 16755 inhibited the membrane receptor transcript without significantly inhibiting the solubilized form. Thus, ISIS 16755 prefers the membrane type to accompany the data obtained from other non-RNAse H (eg, homogeneous 2'-methoxyethoxy) oligonucleotides targeting splice sites. It is thought that the splicing will be redirected.
[0181]
[Table 9]
[0182]
ISIS 16746, 16748, 16755 and 16758 inhibit human IL-5 receptor alpha protein by more than 50% in this assay and are therefore preferred. ISIS 16758 and 16755 were selected for further study. ISIS 16758 was found to have an IC50 of about 5 μM with respect to the reduction of IL-5 receptor α cell surface protein in TF-1 cells. The 1-mismatch control had an IC50 of 10 μM, and the 3- and 5-mismatch controls did not inhibit IL-5 receptor α expression. ISIS 16758 inhibits IL-5 receptor α protein expression without decreasing mRNA levels, which is an RNAse H-independent mechanism as expected for a homogeneous 2′-methoxyethoxy-modified oligonucleotide. Matched.
[0183]
Example 11
Induction of apoptosis in TF-1 cells treated with IL-5 receptor alpha oligonucleotide
1 × 10 5 cultured in IL-5 (0.5 ng / ml) 6 TF-1 cells were harvested 48 hours after oligonucleotide treatment (transfection was by electroporation as described in the previous example), and phosphatidylserine expression was determined using an Annexin-V staining kit ( (Clontech, Palo Alto, Calif.) Was used as a measure of apoptosis using the manufacturer's instructions. Briefly, cells were treated with 0.2 ml of staining buffer (10 mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl2). 2 ) And 10 μM propidium iodide (50 μg / ml) and 5 μl Annexin V reagent were added at 4 ° C. for 10 minutes. Samples were diluted with FacsFlow (Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ) buffer and analyzed on a Becton Dickinson FACScan. The results are shown in Table 10 below.
[0184]
[Table 10]
[0185]
Apoptosis was shown to be induced by ISIS 16758.
Example 12
Effect of IL-5 receptor oligonucleotide on cell proliferation
2.5 × 10 4 TF-1 cells were incubated in 200 μl complete RPMI in the absence of IL-5 in 96-well plates for 16 hours after electroporation. IL-5 (0.5 ng / ml) was added, and the cultures were incubated with 1 μCi of [ 3 [H] -thymidine was pulsed for the last 8 hours of a 48-hour culture period. Cells were harvested on glass fiber filters and analyzed for thymidine incorporation (proportional to cell growth) by liquid scintillation counter. Table 11 shows the results. The results are compared to thymidine incorporation in untreated controls.
[0186]
[Table 11]
[0187]
These data indicate that ISIS 16758, an antisense inhibitor of IL-5 receptor α, greatly reduces the cellular response to to IL-5, ie, cell proliferation in response to IL-5.
[0188]
Example 13
Antisense modulation of splicing in bcl-x mRNA
Bcl-x is a bcl-2-independent regulator of apoptosis (Boise et al., 1993, Cell 74, 597-608). Two isomers of bcl-x have been reported in humans. Bcl-xl (long) contains the highly conserved BH1 and BH2 domains. When transfected into an IL-3-dependent cell line, bcl-xl inhibited apoptosis during growth factor removal in a manner similar to bcl-2. In contrast, bcl-xs, the short isomer of bcl-x, is produced by alternative splicing and lacks the 63-amino acid region of exon 1 containing the BH1 and BH2 domains, but lacks bcl-2 or bcl-x. xl antagonizes any anti-apoptotic effect.
[0189]
As numbered in Boise et al. (Cell, 1993, 608), bcl-x transcripts can be grouped into the regions described by those skilled in the art as follows: nucleotides 1-134,5; 'Untranslated region (5'-UTR); nucleotides 135 to 137, translation initiation codon (AUG); nucleotides 135 to 836, coding region, where 135 to 509 are shorter exons 1 of the bcl-xs transcript. And 135-698 are the longer exon 1 of the bcl-xl transcript; nucleotides 699-836 are exon 2; nucleotides 834-836, a stop codon; nucleotides 837-926, the 3 'untranslated region ( 3'-UTR). When a mature bcl-xl (long) mRNA transcript is produced, between exons 1 and 2 (between nucleotides 698 and 699), introns are spliced out of the pre-mRNA. Alternative splicing from position 509 to position 699 is a bcl-xs (short) mRNA transcript that encodes a protein product (bcl-xs) that is 189 nucleotides shorter than the long transcript and 63 amino acids shorter than bcl-xl To produce
[0190]
The protein of bcl-xL is similar in size and structure to bcl-2, an anti-apoptotic protein, and has a similar anti-apoptotic function, inhibiting cell death upon growth factor removal. In contrast, the bcl-xs protein is thought to inhibit bcl-2 function, thus promoting programmed cell death (apoptosis).
[0191]
Example 14
Effect of antisense oligonucleotides on expression of bcl-xs and bcl-xl transcripts
In accordance with the present invention, the sequences described in the publications (Boise, LH, et al., 1993, Cell 74, 597-608; Genbank Accession No. L20121, locus name "HSBCLXL", herein (Incorporated as SEQ ID NO: 39) was used to design a series of oligonucleotides to target different regions of human bcl-x RNA. The antisense oligonucleotide is present in the region of exon 1 and exon 2 of human bcl-x, specifically around the exon1 / exon 2 splice site and in bcl-xl but not in bcl-xs Sequence was designed to be targeted. These oligonucleotides are shown in Table 12. All backbone linkages are phosphorothioates; all 2 'MOE cytosines are 5-methylcytosines.
[0192]
[Table 12]
[0193]
RIBOQUANT TM Using the RNase protection kit (Pharmingen, San Diego CA), the oligonucleotides were analyzed for their respective effects on total bcl-x mRNA levels, as well as effects on bcl-xs and bcl-xl mRNA levels in A549 cells. evaluated. All assays were performed according to the manufacturer's protocol. The results are shown in Table 13.
[0194]
[Table 13]
[0195]
A completely 2'-MOE, fully-phosphorothioate oligonucleotide, ISIS 22783, which targets exon 1 of the bcl-xl transcript (but not the bcl-xs transcript), is capable of all bcl- in A549 cells. The ratio of bcl-xs to bcl-xl can be varied from 17% to 293% without reducing x mRNA levels. That is, it reduced bcl-xl type (the anti-apoptotic form of bcl-x), but dramatically increased bxl-xs type (pro-apoptotic form). From these results, it is expected that promotion of apoptosis is caused.
[0196]
ISIS 22783 was tested for its ability to inhibit another apoptotic gene, bax, by an RNAse protection assay. It had no effect on bax mRNA levels
ISIS 22783 is also sufficiently complementary to mouse bcl-x mRNA, which makes it useful for animal studies. Treatment of the mouse cell lines bEND, AML12 and Hepa all showed induction of bcl-xs mRNA after treatment with ISIS 22783, but not the mismatch control ISIS 26080 (CTGGTTTACACGACTCCAGGT; SEQ ID NO: 53). . ISIS 22783 was also shown in preliminary experiments to cause some induction of bcl-xs mRNA expression in mouse liver in vivo.
[0197]
Example 15
Optimization of 2'-MOE oligonucleotide targeting the 5 'splice site of bcl-xl
The most active oligonucleotide for re-splicing, ISIS 22783, targets a region 16 to 35 nucleotides upstream (nucleotide 699) of the 5 'splice site of bcl-xl. 20-mer 2'-MOE phosphorothioate targeting a sequence whose 5 'end is 24, 26, 29, 31, 33, 37, 39, 41, 43, 44, 45 and 47 bases upstream of the splice site “Walking” was performed in this region using oligonucleotides. These oligonucleotides were screened for effects on short and long bcl-x transcripts as previously done with oligonucleotides at a dose of 200 nM. The oligonucleotides are shown in Table 14 and the results are shown in Table 15.
[0198]
[Table 14]
[0199]
[Table 15]
[0200]
As can be seen, all oligonucleotides in this region were able to redirect the splice product by choosing bcl-xs. Antisense compounds targeting anywhere 47 nucleotides upstream of the 5 'splice site (ie, therefore, the nucleotides according to the numbering scheme used in Genbank locus name "HSBCLXL", Accession No. L20121 (also referred to as Z23115)). 652-699) are preferred. Many of these compounds were much more effective than ISIS 22783 (i.e., gave a bcl-xs / xl ratio of 5.25 or greater in this experiment). These compounds are very preferred.
[0201]
Dose responsiveness can be obtained for reorientation of the splice product to oligonucleotides. This is shown in Table 16. ISIS 26080 is a 5-base mismatch of ISIS 22783.
[0202]
[Table 16]
[0203]
ISIS 22783 can be shown to induce bcl-xs mRNA expression over time in A549 cells, with a concomitant decrease in bcl-xL mRNA during the first 2-4 hours after treatment with the oligonucleotide. The performance of these transcripts was confirmed by nucleotide sequencing.
[0204]
Example 16
Antisense sensitization of cells to UV-induced cell death
A549 cells were treated with 100 nM ISIS 22783 or 5-mismatched ISIS 26080 and exposed to ultraviolet (UV) radiation. % Apoptotic cells were quantified by propidium iodide staining according to standard methods. The results are shown in Table 17.
[0205]
[Table 17]
[0206]
Thus, cell behavior, ie, response to UV stress, was altered after antisense treatment, resulting in increased apoptosis.
Example 17
Antisense sensitization of cells to cisplatin-induced cell death
A549 cells were treated with 100 nM ISIS 22783 or 5-mismatched ISIS 26080 and with various concentrations of cisplatin. % Apoptotic cells were quantified by propidium iodide staining according to standard methods. The results are shown in Table 18.
[0207]
[Table 18]
[0208]
Thus, cell behavior, ie, response to cytotoxic chemical stress, was altered after antisense treatment, resulting in increased apoptosis.
[0209]
Example 18
Antisense sensitization of cells to taxol-induced cell death
A549 cells were treated with 100 nM ISIS 22783 or 5-mismatched ISIS 26080 and with various concentrations of taxol. % Apoptotic cells were quantified by propidium iodide staining according to standard methods. The results are shown in Table 19.
[0210]
[Table 19]
[0211]
Thus, cell behavior, ie, the response to cytotoxic chemical stress, is altered after antisense treatment, resulting in increased apoptosis.
[0212]
Example 19
Additional modifications of ISIS 22783 sequence
In addition to 2'-methoxyethoxy, modifications that provide for tight binding of the antisense compound to the target and resistance to nucleases are also believed to be particularly useful in targeting splice sites. Examples of such modifications include sugar modifications, including 2'-dimethylaminooxyethoxy (2'-DMAOE) and 2'-acetamide; backbone modifications such as morpholino, MMI and PNA backbones, and C-5 propyne and the like. Includes, but is not limited to, base modifications.
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Antisense compounds having the ISIS 22783 sequence and a 2'-DMAOE modification on each sugar were compared to their 2'-MOE analogs for their ability to alter the ratio of bcl-x splice products. The results are shown in Table 20.
[0214]
[Table 20]
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Thus, when compared to the 2'-MOE compound, the 2'-DMAOE compound, although slightly less in quantity, is qualitative in its ability to change the ratio of bcl-xs to bcl-xl splice product. Similar abilities were demonstrated. Therefore, 2'-DMAOE compounds are preferred.
[0216]
Preliminary experiments with a morpholino-backbone compound having the 22783 sequence have shown sufficient activity using scrape loading.
