JP2004507445A - 白血病、リンパ腫、及び充実性腫瘍のための温熱療法及び免疫療法 - Google Patents
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Abstract
ゼロ死亡率を有する熱ウイルスの接種および患者から誘導された照射された腫瘍細胞の引き続いての注射によって全身高熱(whole−body hyperthermia)および増強された抗腫瘍免疫応答を誘発させる改善方法。この治療は、250倍ベースライン超までインターフェロンレベルを上昇させる前に、安全に、身体的手段(熱)によって90〜99.9%だけ腫瘍量(tumor burden)を減少させる。これらの高インターフェロンレベルによって産生された活性化リンフォカインキラー細胞は、ウイルスまたは腫瘍抗原を発現するいずれの細胞をも、免疫監視を予め回避したものでさえ、殺し得る。該方法におけるフィン最終工程(fin final step)の際、患者自身の癌細胞を破壊するようにプログラムされた細胞障害性Tリンパ球の特異的クラスは、患者から採取された樹状細胞の反復接種によって産生される。3つの方法の組み合わせが単一のレジメン(regimen)に予め統合されないが、この治療は患者から癌細胞を完全に全滅させる高い見込みを有すると述べることは論理的である。さらに、この治療は、疾患の再発に対する生涯の免疫を提供する。
Description
【0001】
背景−発明の分野
本発明は、ガン処置のための温熱療法及び免疫療法に関する。
【0002】
背景−従来技術の説明
温熱療法(hyperthermia)によりガンを治療する最古の例は、遡って紀元前3000年の日付のあるエジプトのパピルスの巻物に見られ得、温水浴による治療を受ける乳ガンの患者が描かれている。超高熱(発熱)での全身温熱療法は、発熱性バクテリアの感染後の劇的な腫瘍の退縮さらに治癒でさえ実現してきた。19世紀末期および20世紀初期には、ウィリアム・コーリー(William Coley)博士が自然発生腫瘍退縮の症例を調査し、その共通要因が摂氏39.5度または華氏103.5度以上の持続性の発熱であることを発見した。
【0003】
コーリー博士は、発熱物質であるリポ多糖(LPS)を含む化膿連鎖球菌(ストレプトコッカス・ピオゲネス:Streptococcus pyogenes)の細菌ライゼートによって発熱の再現を試みた。コーリーは、多種にわたる癌腫及び肉腫を彼の混合細菌毒素(MBT)で治療し、手術不可能な悪性黒色腫の症例について60%の5年生存率を成し遂げた。この割合は、手術、放射線、及び化学療法プログラムで得られるものに比べて著しく高い。問題は、より多量のMBTを必要とする中和抗体を、患者が大量に生産し始めたときに生じた。また、コーリーは毒素の発熱性を標準化するのに苦労していた。自分の治療の成功の鍵は、腫瘍に対してどういう訳か交差反応性である、毒素への免疫応答が増強されたことに基づくと、コーリーは依然確信していた。現在の免疫学の知識でコーリーの仮説は確認されるが、抗菌応答の機構より抗ウイルス免疫のほうが、はるかに密接に抗腫瘍免疫に関係していることが今や明らかである。
【0004】
これは、細菌感染が、主に免疫系の体液性または抗体+補体アームを刺激するという事実による。バクテリアや原生動物などの細胞外寄生体については、このことは、血流内における排出の効率良い手段を提供する。しかしながら、ウイルスは細胞内寄生体であり、ウイルス感染した宿主細胞は、通常の細胞タンパクと共に細胞表面にウイルス抗原を発現する。それゆえ、ウイルス感染細胞を認識して殺す能力を持つキラーリンパ球は、ウイルスを根絶するために必要とされる。ガン細胞もまた、「自己(self)」または正常な宿主抗原を「変化した自己(altered−self)」または突然変異腫瘍抗原と共に細胞表面に発現するため、同じエフェクター細胞が必要である。ナチュラルキラー(NK)、リンホカイン活性化キラー(LAK)、及び抗原特異的細胞障害性Tリンパ球には、抗腫瘍および抗ウイルスを監視して根絶する主要な義務がある。今までのところ、発熱性ウイルスを用いて全身の高体温を誘発する例は科学文献にみられない。
【0005】
高熱を誘発する別の技術が試みられてきた;温液浴、四肢灌流、さらにマイクロ波の放射である。これらの方法の主な不利点は、大抵のガンは組織層内部の奥深くにあり、外部からの加熱では腫瘍細胞を殺すのに十分な温度を発生させることができないという点である。こうした従来技術のアプローチのもう1つの問題は、転移したガンでは腫瘍細胞が体中に広がっており、治癒を意図した治療では、体全体もまた加熱しなければならないという点である。安全かつ発熱性のウイルスを利用した全身発熱方法が、これら2つの問題を解決する。
【0006】
ガン治療においては、事実上特異的なものも非特異的なものも、おびただしい種類の免疫療法が試されてきた。ガン治療における主要な非特異的免疫調節物質は、バチルスカルメット−ゲラン(Bacillus Calmette−Guerin)、つまりBCGである。BCGは遅延型過敏症(DTH)反応を引き起こすが、これによって局在性マクロファージが活性化され、場合によっては殺腫瘍性となる。しかしながら、これは弱い発熱因子であり、したがって体温上昇によるメリットは実現できない。また、前に詳しく述べた通り、主に免疫系の体液性アームを刺激するため、インターフェロンの産生およびNKの活性化が概して低い。
【0007】
外因性インターフェロン療法が試みられてきたが、精製と毒性の問題に悩まされている。研究者たちは、通常より10倍高いアルファ−インターフェロン濃度を達成できているが、外来性インターフェロンが強い細胞応答を誘導し得る前にこれを中和する血清遮断因子(SBF)によって、その応答は妨げられている。免疫学者の間では、内因性インターフェロンの産生を刺激する治療法のほうが組換えインターフェロン及びインターロイキンの注射に頼る方法より好ましいという点で、一般に意見が一致している。前述の免疫療法は内因性インターフェロンAの濃度を通常濃度のおよそ260倍に刺激する。
【0008】
測定可能な応答を引き起こす、サブユニットペプチド或いは細胞全体が放射線照射された製剤の両方を用いた、ガンワクチンへのアプローチが非常に多く試されてきた。悪性黒色腫の場合、一般的な黒色腫抗原であるgp100、MART−1/Melan−A、及びTRP−1(チロシナーゼ関連タンパク)を含むポリペプチドワクチンが臨床的に試験されてきた。こうした方法の主な欠点は、ポリペプチドであることであり、それらはキラー細胞応答を誘導するよりむしろ寛容化できる。さらに、全ての黒色腫細胞がこれらの抗原をインビボで発現して同定及びエフェクター細胞による溶解のためにラベルするわけではない。
【0009】
もう1つの抗原特異的方法は、抗原構造が原型を保つように殺された(通常は照射)ガン細胞全体を用いることである。これらの細胞は次に注射により体に戻され、免疫応答を誘導する。このアプローチの問題は、特異的細胞障害性Tリンパ球が誘導される前に、腫瘍の負荷量を物理的手段により減らしておかなければならないことである。3つの主要な抗ガン療法がある。手術、放射線照射、及び化学療法が腫瘍負荷量を減らすが、同時に免疫系に打撃を与える。前述の療法はこうした障壁を乗り越えるよう設計されている。
【0010】
目的および利点
従って、ウイルス剤応答性の発熱に基づく全身温熱療法の目的および利点に加えて、本発明の目的および利点が幾つかある。
【0011】
(a)免疫機能を損なわない華氏103.5度以上の物理的手段(発熱)を通じて腫瘍負荷量を減らす方法を提供すること。
【0012】
(b)非特異的殺腫瘍活性のあるリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞となるナチュラルキラーリンパ球を、無数に誘導すること。
【0013】
(c)患者の生命のために、特異的腫瘍抗原を有する腫瘍細胞を認識し殺すことができる、細胞障害性Tリンパ球(CTL)のクローンを誘導すること。
【0014】
(d)患者に深刻な害を与える危険性なく前述の活性を達成すること。
【0015】
他の目的および利点は、以下の本発明及びその実施の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【0016】
発明の概要
デングウイルスは、サブファミリーがフラビウイルスであるトガウイルスファミリーのRNAウイルスである。直径約40−45ナノメーターで2つのエンベロープタンパク質をもつ正二十面体の構成をしている。E1タンパク又はへマグルチンはアミノ酸グリシンが非常に豊富であり、分子量は約45,000ダルトンである。E2タンパク又はノイラミニダーゼはアミノ酸アラニン、セリン及びバリンに富み、分子量は約50,000ダルトンである。E3タンパクは膜貫通構造を持ち、これがE1及びE2タンパクをウイルスのコアタンパクに固定する。中和抗体は主にE1タンパクに向けられる。
【0017】
材料および方法
患者の基準
ステージI、II、III又はIVのガン、白血病あるいはリンパ腫の男性または女性被験者。
【0018】
ウイルス
デングウイルス(ワシントンDC、ウォルター・リード陸軍病院(Walter Reed Army Hospital)で入手可能)は、アフリカミドリザルの腎臓細胞中1ml当たり5より少ないプラーク形成単位まで継代したもの。DBS−FRhL−2ローラーフラスコに最小限感染またはMOI 0.0005で種ウイルスを接種する。1.5時間、35℃での吸着の後、種菌を除去してフラスコを100mlのハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄する。維持培地(ローラー当たり200ml)は、0.25%のヒト血清アルブミン、0.22%のNaHCO3、ストレプトマイシン(50マイクログラム/ml)、及びネオマイシン(100マイクログラム/ml)を含むイーグル最小必須培地からなる。全てのフラスコの培地は4日目までに取り換えられ、上澄み液を6日目に収集する。1,050×gで20分間遠心分離する前に、最終濃度2.75%になるまでヒト血清アルブミンを加える。アルブミンのpHはウイルス液への添加前に調整される。清澄の最終工程として、液体を0.45マイクロメーターのメンブランフィルター(Nalge、ロチェスター、NY)でろ過する。次に、実施許諾された弱毒化生菌ウイルス性ワクチンのための公共保健サービス規則(連邦規定規範、第21章、F節、生物製剤)に説明されているように、試料を外来性微生物剤試験する。
【0019】
試験及びプラークアッセイのために試料を除いた後、残存分量を氷浴中4℃の冷蔵室で7日間、安全性試験およびプラークアッセイの結果が出るまで放置する。ウイルスの最終プールは、39.3℃で1ml当たり5より少ないプラーク形成単位を含むフラスコの液体から得られ、検出可能な大型プラークウイルスは存在しない。バイアルの平均力価は850,000PFU/mlであり、神経毒性試験後の使用のために凍結乾燥する。雄アカゲザルにウイルス液0.5mlを脊髄内および大脳半球内に接種し、2体のコントロールはウイルスフリーの培養液を受ける。サルたちを、CNS関与または他の身体的異常の徴候について毎日20日間観察する。犠牲に引き続き、腰椎および頚椎(cervical cord)、下部および上部延髄、中脳、及び運動皮質をウイルス性病理学のため組織検査した。
【0020】
患者への接種
患者に、各肢(limb)において一回、そして一次(primary)黒色腫腫瘍部位で一回、2mlのウイルスサンプル液を皮下注射する。接種後3〜5日後、患者に、患者のクラスI HLA型に適合された腫瘍−ペプチドでパルスされた樹状細胞を、リンパ内マイクロカテーテル(intralymphatic microcatheter)によって注入する。連続注射を、患者がCAT、PET、またはMRIスキャン、または免疫組織化学技術によって検出可能な腫瘍細胞をもはや示さなくなるまで、2週間毎に行う。
【0021】
患者マネージメント
患者は、生物医学的に完全にモニターされる:(パルス、血圧、呼吸、尿量(urinary output)、および特に体温)。患者は、発熱期間の間、十分に水を与えられた状態(well−hydrated)および軟らかいまたは液体の(高蛋白質)制限食(diet)に保たれる。黒色腫の場合、外部熱(電気パッド)が、発熱期間の間、可視の腫瘍に直接適用される。本発明の初期目標として与えられる解熱鎮痛剤(antipyretic analgesics)無しは、39.5℃を超える持続された発熱(pyremia)を達成する。正常体温への回復後、患者は、外来患者基準(outpatient basis)に基づいて退院およびモニターされる。
【0022】
患者の注射
患者に、各肢(limb)において一回2mlのウイルスサンプル液を真皮中へ皮下針によって注射する。2〜3日後、患者に、パルスされた樹状細胞(pulsed Dendritics)をリンパ内マイクロカテーテルによって注入し、患者が疾患に対して陰性となるまで注射を反復する。
【0023】
ペプチド合成手順
短鎖のアミノ酸を合成する多くの方法が使用され得るが、以下の方法が記載される。
【0024】
工程1(合成)
試薬グレード(reagent grade)塩化メチレンを無水炭酸カリウムから蒸留し、試薬グレードジメチルホルムアミドを、使用の48時間前に、0.4nmモレキュラーシーブで処理する。追加の材料および供給源:(全ての材料は、特記しない限り試薬グレード)。
【0025】
【0026】
トレオニンおよびグルタミン酸の側鎖をO−ベンジル基で、チロシンをオルト−ブロモベンジル−オキシカルボニルで、およびシステインをS−パラ−メトキシベンジルで保護する。開始アミノ酸(inital amino acid)(例えば、アスパラギン酸)をブトキシカルボニル−B−ベンジルアスパラギン酸に変換し、そしてベンズヒドラルアミン(bezhydralamine)樹脂へカップリングさせる。カップリング反応を、サイクルの終わりにニンヒドリンおよび/またはピクリン酸を使用して各工程でチェックする。ダブルカップリング(double−coupling)は、アスパラギン酸、システイン、プロリン、チロシン、およびフェニルアラニンの残基に必要である。等モル量のブトキシカルボニルアスパラギニンが、シアノアラニンの形成を防止するために含まれる。
【0027】
最終アミノ酸カップリングに続いて、N−末端ブトキシカルボニル基が除去され、そして樹脂は一晩真空乾燥されて、ペプチド樹脂を生成する(95〜97%純粋)。ペプチドは、樹脂から切断され得、そして側鎖保護基は、4℃で1.0時間の20ml液体HFでの1.0gの樹脂および1.0mlアニソールの処理によって除去される。窒素流で4℃でのHFの除去後、過剰のアニソールが、無水エーテル(100)mlでの抽出によって除去され得、得られる混合物は、揮発性HFを除去するためにNaOHペレットの存在下で高真空にさらされる。粗ペプチド樹脂が、窒素−脱気した(Nitrogen−de−aerated)5%HOAc(100ml)で抽出され得、残存する試薬を除去する。得られる混合物を、水で20%HOAcまで希釈し、そして20%HOAcで平衡化したSephadex G−10カラムを通過させる。最終生成物を凍結乾燥し、最終ペプチドを得る。
【0028】
樹状細胞の調製
骨髄細胞を、CD3、CD4、およびCD8についてのモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化細胞選別(Fluorescent Activated Cell Sorting)(FACS)によって、リンパ球およびMHCクラスポジティブ細胞について枯渇させる。残存する細胞を、一晩、10%ウシ胎児血清(FCS)、2−ME、および100IU/mlペニシリン、1mMピルビン酸ナトリウム、および10μM非必須アミノ酸を補足したIscove改変Dulbecco培地(Iscove’s modified Dulbecco’’s medium)(IMDM)中で、37℃、5%CO2雰囲気中、1ml培養培地/ウェルで約百万個の細胞を有する24ウエルプレート中、培養させる。24時間後、細胞を再プレートし(replated)、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、および900U/mlの組換えIL−4の存在下で、培養する。3〜4日後、培地を、新鮮なサイトカイン培地に交換する。
【0029】
あるいは、真皮樹状細胞(dermal dendritic cells)(DDC)は、以下の方法を使用して調製され得る:健康なヒトボランティアからの角膜切開刀(keratomes)を、RPMI 1640中最終濃度1.2U/mlの細菌プロテアーゼ・ディスパーゼ2型の溶液中で、1時間、37℃でインキュベートする。インキュベーション期間後、上皮および真皮は、容易に分離され得る。上皮および真皮シートは、次いで、PBSでの数回の洗浄後に小さな(1〜10mm)断片に切断され、そして10%ウシ胎児血清(FBS)で補足されたRPMI 1640中に配置され、そして10−cm組織培養プレートに配置される。2〜3日後、組織断片を取り出し、そして培地を回収する。組織切片から培地への細胞移動(cell migrating)は、スピンダウンされ(spun down)、1〜2mlの新鮮な培地に再懸濁され、そしてトリパンブルーで染色される。更なる富化(enrichment)が、メトリザミド勾配における分離によって達成され得る。細胞が、高張14.5%メトリザミドの3−mlカラム上に層にされ、そして室温で10分間650gで沈降される(sedimented)。低密度インターフェース細胞(low density interphase cells)を回収し、そして2回連続してより低い高張の洗浄物(10%FBSおよび40mM NaClを有するRPMI 1640)において洗浄し、細胞を等張に戻す。
【0030】
樹状細胞のペプチドパルシング
遺伝子産物の予め記載した免疫優性(immunodominant)ペプチドは、種々の方法を使用して構築され得るが、1つをここで記載する。10マイクロモルスケールのAbimed422マルチプルペプチドシンセサイザーが、必要とされるペプチドを構築するために使用され得る。あるいは、ミリグラム量の所望のペプチドを生成するためにクローニングおよび発現ベクターを使用する遺伝子工学技術が使用され得る。
【0031】
所望のペプチドが十分な量で単離された後、それらを樹状細胞上にロードしなければならない。第8日目、樹状細胞が、0.5%BSAおよび10マイクログラムのペプチドで補足されたIMDM培地1ml中37℃で2時間パルスされ得る。数回の等張洗浄後、ペプチドはヒトにおける使用のための準備が出来ている。パルスされた樹状細胞は、使用のための準備が出来るまで、液体窒素中−50℃で2年間まで保存され得る。
【0032】
発明の操作
a.癌細胞の温熱療法(hyperthermia)および熱感受性(thermosensitivity)
癌細胞は、多数の因子に起因して正常な組織細胞よりも熱に敏感である:
1.腫瘍タイプ
2.腫瘍部位
3.血液供給
4.増殖速度
5.細胞内pH
6.細胞代謝レベル。
【0033】
一般的に、肉腫(sarcomas)と呼ばれる結合組織(骨、軟骨、筋肉)から生じる腫瘍は、癌腫(carcinomas)と呼ばれる裏打ち(lining)または上皮組織から生じる腫瘍よりも、温熱療法に対して敏感である。これは、組織タイプの相対的血液供給(relative blood supplies)に主として起因する。上皮組織は、結合組織よりも遥かに豊富な血液供給を有し、従って癌腫はより熱耐性(thermoresistant)である。白血病およびリンパ腫のような血液癌は、熱損傷(damage)に敏感でない。悪性黒色腫は、それが裏打ち(lining)組織から生じるが乏しい血液供給を有するので、両方の特徴を共有する。
【0034】
位置もまた、四肢腫瘍はボディコア(body core)におけるものよりも選択的加熱(selective heating)に供され易いので、重要である。大抵の先行技術の温熱療法成功(hyperthermic successes)は、肉腫の四肢灌流を伴う。小動脈の広範な網目構造附近の腫瘍は、これらの主な血管から遥かに離れたものよりもより感受性でない。
【0035】
腫瘍の相対的増殖速度もまた、重要である。攻撃的な速く増殖する(aggressive fast−growing)腫瘍は、不活発なものよりも豊富な血液供給を必要とする。速く増殖する腫瘍はまた、酸性代謝物の多量なプール(pools)を構築し、そしてこの因子は、温熱療法の間重要となる。高温で、それらの複製の間に染色体を安定化させる紡錘体器官が、変性および崩壊に供され、細胞死に至る。
【0036】
デング熱によって誘発されるような高熱の穏やかなレベル(103.5〜106oF)、または(39.5〜41℃)で、熱感受性(thermosensitivity)は、血液供給、細胞内pH、および細胞内代謝速度のような間接的因子に主に起因する。腫瘍は、単一細胞から生じるので、一般的に乏しい血液供給を有し、そして直ぐに局所血液供給(local blood supply)を追い越す。アンギオテンシノゲン(angiotensinogen)と呼ばれるホルモンの分泌は、局所血管増殖を助長し、しかし要求は灌流速度を凌ぐ。中等度から大きな腫瘍において、内部コア(interior core)は、酸素、グルコース、および他の栄養を得ることが出来ないことに起因して死滅する。外部腫瘍細胞のみが、生存のために十分なガスおよび栄養交換を行い得る。
【0037】
腫瘍はまた、毒性、酸性の代謝副産物を取り除くための低い灌流に起因して、健康な組織よりも低い細胞内pHを有する。細胞は、機能的反応(functional reactions)を行うために、アデノシン三リン酸(ATP)通用分子(currency molecules)を産生するための2つの経路を有する:好気的代謝および解糖。好気的代謝は酸素を使用し、そして少量の酸性廃棄産物を伴って1グルコース分子当たり36ATP分子を生成する。他方、解糖は、遥かに迅速であり、しかし1グルコース当たり2ATPのみを生成し、そして乳酸を生成し、これは細胞内pHを低下させる。
【0038】
腫瘍は、それらの過剰増殖のために、健康な細胞よりも高い解糖速度を有する。従って、腫瘍微小環境(microenvironment)は、低酸素症(低い酸素)、アシドーシス、および栄養欠乏(nutrient deprivation)によって特徴付けられる。ステージは、温熱療法を通してこれらの弱さを利用するために設定される。
【0039】
体温が上昇すると、細胞代謝率も上昇する。温度の関数として、酵素反応は増加するので、細胞はより多くの栄養分を取り入れ、それらの有毒廃棄物を洗い流さなければならない。正常な灌流速度を有する健全な細胞は、容易に41℃以下の温度に耐えることができる。一方、腫瘍細胞には、どちらの側にも不利なシナリオが与えられる。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させないならば、飢えるであろう。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させれば、それらの細胞内pHは6.7、つまり血流pH下のほぼフル対数点(full logarithmic point)に達するまで下がるであろう。6.0において、重要な細胞反応を担う酵素、特にNa−K ATPaseポンプシステムは機能しなくなり始める。この酵素は、細胞膜を通したナトリウム及びカリウムイオンの相対勾配を維持することを担っている。それが機能しない時、ナトリウムイオンが流れ込み、その細胞は死ぬ。リソソーム及びペルオキシソームは、プロテアーゼを含む細胞質膜結合ボディーである。6.0以下のpHにおいて、これらのボディーは破裂し、細胞を消化する。
【0040】
腫瘍感受性は、該反応によると、時間及び温度の両方に依存する:
s = S0e−kt
ここで、sはあらゆる所定時間tにおける生存であり、S0は最初の時間における生存であり、kは所定温度での不活性化速度を表す定数であり、tはインキュベーションの所要時間である。
【0041】
上記式から分かるように、細胞生存は対数的に減少する。簡単に言うと、温度が高ければ高いほど、1 logつまり90%腫瘍殺傷率、2 logつまり99%殺傷率、又は3 logつまり99.9%殺傷率に必要な時間が短くなる。
【0042】
デング熱は、生腫瘍細胞における1−2 log減少を作り出すのに充分な熱を作り出すが、もしそれらが高灌流血管付近に置かれるなら、比較的少数が生存するだろう。今、該細胞を同定し、除去するのは、免疫反応次第である。
【0043】
b.発明の活性な非特異的免疫療法操作
デング熱ウイルスは感染し、次の2種の白血球中で複製する:(マクロファージに成熟する)未熟単球、及び抗体産生血漿細胞に成熟するB−リンパ球。感染での最初の三日で、デングは60%の循環白血球を殺し、WBC数値は5300/mlから2200/mlに低下する。破裂の際、これらの細胞は莫大な量のインターフェロン、インターロイキン、及びリンパ球構造タンパク質を血流中に放つ。これらのリンフォカインは、NK細胞を刺激し、LAK細胞になり、これは、特異性に関係なく、ウイルス及び腫瘍抗原発現細胞を殺すことができる。前のインヴィトロ実験において、デング活性化LAK細胞は、高度にヒト腫瘍株K562の細胞を殺した。LAK細胞は、NK細胞に抵抗力のある腫瘍細胞を殺すことができ、これは、本発明の操作において重要な要因である。
【0044】
デングはまた、MAFつまりマクロファージ活性化因子と呼ばれるリンフォカインを通して、殺腫瘍性(tumorcidal)になるように、成熟マクロファージを誘発する。この状態で、マクロファージは、癌性細胞を殺すことのできる腫瘍浸透性白血球になる。温熱療法を通した1−2 log死に続くこの反応は、患者から十分に腫瘍細胞を全滅させ得、治癒を生じたとしても、それは結局、治まるだろう。癌細胞は全く熱及びLAK/TIL反応を生き残らないということを完全に確信するためには、第3の成分、つまり一生の抗腫瘍監視及び殺傷能力を提供する成分が必要である。
【0045】
c.発明の特異的抗腫瘍反応
LAK細胞は、圧倒的な殺腫瘍特性を有する一方で、免疫学的記憶を有さない。インターフェロンレベルが正常に戻った後、これらの非特性キラー細胞は、細胞を壊すようにそれらを仕向けた抗原構造を“記憶する”能力を有さない。該免疫系のその機能は、体液性免疫の抗体アームに、及び細胞障害性Tリンパ球に任せられている。
【0046】
細胞障害性Tリンパ球は胸腺に由来し、リンパ組織に移動する。T4ヘルパーリンパ球は、腫瘍細胞に対し細胞障害性であることができるが、これらは、限られた数の細胞タイプ上のクラスII MHCにより提示されたより長いペプチドを認識する。T8 CTLは、“特権”部位:CNS、網膜、及び生殖腺において以外、すべての細胞タイプ上に存在する、クラスI MHCにより提示されたより短い(8−11 mer)ペプチドを認識する。T8 CTLはそれらのT細胞レセプター(TCR)を使用し、HLAによりA及びB対立遺伝子にコードされたMHCタンパク質により提示されるペプチドを評価する。小胞体中で産生されるタンパク質は、周期的にプロテアーゼにより切断され、HLA結合モチーフを適合させるペプチドは、該MHC鎖間にロードされている。このように安定化され、該三量体複合体は、最終的に細胞膜にはめ込まれ、ここで該ペプチドはTCRにより“読み取られる”ことができる。もし充分な数のCTLが生成されることができるなら、ウイルス性タンパク質を製造する細胞、つまり腫瘍関連ペプチドは、このように除去されることができる。これらのCTLは記憶受容能力があり(memory−competent)、該患者の一生の間、それらのターゲット抗原を発現する細胞を同定し、殺すことができる。
【0047】
多くの癌研究者らは、大した成果もなく、腫瘍特異的CTLを作り出そうと試みてきた。その主な困難は、前もってのディバルキング(debulking)の欠如、その7つの腫瘍免疫回避法、及び自己ペプチドに対するT細胞寛容性から生じる。
【0048】
腫瘍ディバルキング
存在する腫瘍細胞の99%(2−logs)の除去は、免疫療法からの最適の結果のための必須条件である。細胞障害性薬剤を用いる化学療法、ガンマ照射及び大手術は、腫瘍を小さくすることはできるが、細胞免疫を低下させる。患者は、時々、これらの方法により彼らの癌を“治す”が、彼らの低下した免疫系のため、感染により死んでしまうだけである。温熱療法(hyperthemia)は、細胞性免疫反応を抑制しない、唯一、信頼できるディバルキング方法である。
【0049】
7つの腫瘍免疫回避法
もし、ある治療が2−logディバルキングを達成するなら、CTL及びLAK細胞はしばしば、7つの該腫瘍免疫回避法により、腫瘍細胞を除去するのに成功しない。
1.クラスI MHC発現のダウンレギュレーション。
2.CTLにより認識される腫瘍エピトープにおける点突然変異。
3.NK認識を避けるための、胎児の栄養芽層HLA−Gタンパク質の発現。
4.腫瘍微細血管はLAK及びCTL移動に対し阻害性である。
5.腫瘍細胞は、IL−10を分泌するように単球を誘導し、それはCTLをアネルギー性にする。
6.腫瘍細胞はFasリガンド(FasL)を発現し、それはFas + CTLを殺すことができる。
7.腫瘍細胞は繊維状間質性バリアーを組み立て、CTLの動きを妨害する。
【0050】
記載されている本発明は、デングウイルスにより誘発されるサイトカインの放出を通し、これらの7つ全ての機構を打ち負かすように設計されている。
【0051】
腫瘍細胞はしばしば、MHC三量体のフロアを形成するベータ−2−ミクログロビンを制限することにより、クラスI MHC発現を低下又は除去する。B−2mがなければ、MHCは不安定であり、ペプチドを結合させることはできない。腫瘍細胞もまた、MHC複合体を膜に運ぶ輸送体タンパク質TAP−1及びTAP−2を減少させる。これらのタンパク質の機能障害は、クラスI発現の不在につながり、CTLのT細胞レセプターに対し腫瘍細胞を見えなくする。
【0052】
デングウイルス感染は、大量のインターフェロンアルファ、ベータ及びガンマを誘発する。IFN−ガンマは、B−2m及びTAP遺伝子のプロモーター領域に結合することにより、腫瘍細胞中にクラスI発現を再構築することができる。IFN−アルファもまた、クラスI発現を増加させ、クラスIレベルを正常値まで上げるように、IFN−ガンマとの相乗的に作用する。
【0053】
腫瘍細胞はしばしば、欠陥遺伝子調節の結果として、高い突然変異率に苦しみ、腫瘍特異的CTLにより認識されるターゲットペプチドにおける突然変異は、腫瘍細胞が溶解を避けるのを助けることができる。もし突然変異が、ペプチドをMHC鎖にアンカーリングするために必要なアミノ酸中で起こるなら、そのペプチドはもはやHLA分子に結合できない。もし突然変異が、TCR認識に必要な残基中で起こるなら、該ペプチドはまだMHCと結合し、もはや該CTLにより認識されないであろう。
【0054】
デング感染は、結果として、高レベルの2つの重要なサイトカイン:IFN−ベータ、及びIL−2を生じる。CTLがこれらのサイトカインに一緒にさらされた時、それらはターゲット特異性を失い、LAK様の溶解能力を得る。これらの非選好性CTLは、HLA制限なしで、多くの細胞株からの腫瘍タイプを溶解することができるので、腫瘍関連ペプチドにおける突然変異は回避できないはずである。
【0055】
MHC発現を減少させてしまっている腫瘍細胞は、NK溶解を受けやすい。ナチュラルキラーは、クラスI MHCにより架橋された時、ネガティブシグナルを伝達するレセプターを使用する。もし該細胞がそのHLA発現を低下させるならば、それはNK細胞に殺されることができる。胎児栄養芽層細胞はHLA−Gと称されるタンパク質を発現し、それは母のNK溶解から保護する。クラスI MHCレベルを減少させる間、HLA−G遺伝子を活性化する腫瘍細胞は、細胞免疫系のアーム両方を避けることができる。
【0056】
デング熱感染はとても高レベルのLK−2を誘発し、それはCTL増殖を促進する。IL−2もまたNK細胞をLAKに変換させ、これは腎細胞癌株CurのようなNK耐性腫瘍株を殺すことができる。
【0057】
腫瘍血管、特に高内皮小静脈(HEV)は、しばしばP及びEセレクチンを欠いており、これらは活性化キラー細胞上に見出されるCD11インテグリンに結合する。高い流体力学ずれ率と共に、これは、LAK及びCTLが腫瘍細胞ターゲットとかみ合うために血流から出でいくことを防ぐ。
【0058】
デング感染は、高レベルの2つの炎症誘発性(proinflammatory)サイトカイン、つまりIL−1及び腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−a)を誘発する。IL−1及びTNF−aは腫瘍血管上のセレクチンをアップレギュレートし、血管内皮細胞間のギャップジャンクションを広げる。これは、治療により作り出されたキラー細胞がHEVから出て、腫瘍細胞を破壊することを可能にする。
【0059】
腫瘍細胞は、しばしばトランスフォーミング成長因子−ベータ(TGF−b)を分泌し、これは付近の単球にIL−10を分泌させる。IL−10はCTLをアネルギー性にするので、それらはもはや腫瘍細胞とかみ合う能力はない。デングウイルスは、選択的に単球中で複製し、単球を殺し、誘発された高レベルのIL−2は、腫瘍浸透性リンパ球(TIL)のアネルギー状態を反対にするだろう。
【0060】
病原体に対する反応でクローン化されたCTLは、しばしばFas、またはCD95を発現する。Fasリガンド(FasL)により架橋された時、DNA分解(アポトーシス)により該CTLは死ぬ。“特権”部位の細胞は、しばしばFasLを発現し、感応性の領域に侵入するあらゆるCTLを殺す。FasLを発現する腫瘍細胞は、反応性CTLを殺すことができ、抑制されない腫瘍成長を可能にする。
【0061】
デング感染は、高量のIL−6を誘発し、これはFLIP(Fas−リガンド抑制タンパク質)の発現を促進する。FLIPは、CTL上のFas自己破壊トリガーを覆う“安全スイッチ”として働く。IL−2レベルが高い限り、FLIPはCTLをFasLから保護するだろう。デング感染におけるIL−2レベルは、30日以上の間、高かった。
【0062】
腫瘍細胞は、ストローマと呼ばれる血管結合組織の束(fibrovascular bundle)の成長を促進する因子を分泌する。このコラーゲン束の密な網状組織は、CTL移動性を妨げることができる。デング感染により誘発される高レベルのIFN−ガンマは、CD44を発現するマクロファージを活性化し、これはヒアルロニダーゼ酵素でストローマのバリアを消化する。活性化マクロファージは、腫瘍特異性T4及びT8 CTLにより放出される走化性シグナルにより腫瘍領域に引かれるだろう。
【0063】
腫瘍関連ペプチドに対するT−細胞耐性の克服
ここで述べられる治療は、個々の腫瘍免疫回避手段を無効にする設計により、独特である。最初の2つの目的、腫瘍免疫回避メカニズムのデバルキングと破壊を達成する治療は、克服すべき1つの他の障壁:T−細胞耐性を有する。
【0064】
子宮内の最後の月において、及び、生命体の最初の18月の間、T−細胞免疫システムはクローンの選別と削除のサイクルを受ける。胸腺上皮組織によって示される自己ペプチドに対して高い親和性を有するレセプターを伴ったT4及びT8細胞は除去(削除)される。自己ペプチドに低い親和性を有するT−細胞のみが選別され、周辺リンパ組織に在住するため胸腺を離れる。これは自己免疫に対する重要なセーフガードであるが、腫瘍細胞はこの仕組みを利用する。もし腫瘍が免疫反応を起こすと、ひき起こされたCTLはペプチドに対し低い親和性を有し、そのため腫瘍細胞に対しては、低い細胞毒性を示すだろう。免疫回避手段と兼ね合って、このことは、腫瘍免疫療法における成功の低い割合を説明する。
【0065】
クローンの削除は完全なプロセスではなく、さもなければ自己免疫疾患は知られていないであろう。適当な条件において、耐性は克服し得ることを示唆する、一連の増大する証拠がある。最初の要件はT−細胞に対する抗原の効率のよい提示である。マクロファージは抗原提示細胞(APC)として機能し得るが、最も効率の良いAPCは骨髄由来の樹状細胞(DC)である。DCは抗原を捕捉し、標的ペプチドへ加工し、次いで、T−細胞にそのペプチドを提示する。CTLは次いでペプチドを認識するためにそれらのTCRを形作り、抗原特異的となる。
【0066】
DCは1:1000の割合でCTLをプライムすることができ、従って、腫瘍ペプチドでパルスされた1000万のDCは100億のCTLを生じ得る。100億の細胞の初期の腫瘍の負担から温熱療法を通して2−log縮小した後で、これは個々の残存する腫瘍細胞に100CTLという結果となろう。
【0067】
T−細胞耐性を克服するための2番目の要件は、Th−1タイプサイトカイン、即ちIFN−ガンマ、IL−2、IL−7及びIL−12の高レベルである。CTLの増大は2つの因子:APCとTh1サイトカインレベルによって制限される。デング感染は必要とされる高レベルを誘発する。
【0068】
腫瘍関連抗原(TAA)
腫瘍免疫療法の成功に対する別の主要な障害は、CTLの標的として役立つTAAの不足である。ウィルス感染細胞においてHLAによって捕捉されるペプチドと違って、TAAはより少ない量で一般に製造される。それぞれの細胞は、特異的なHLAタイプ、例えば、HLA−A2のおよそ200,000のコピーを有する。それぞれのペプチドのフラグメントはHLA結合のために10,000の他のものと競合しなければならず、ペプチドを提示する最低200のMHC複合体がCTL分解のために必要とされる。
【0069】
黒色腫は最も特徴的なTAA、即ち、他の腫瘍タイプに発現するMelan−A/MART−1、gp100、pmel7及びMAGEグループ抗原を有する。以下の腫瘍タイプが、腫瘍特異的CTLをプライムする同種異系のDCの上にロードされ得る特異的TAAと共に、列挙される。
【0070】
胸部アデノカルシノーマ(Adenocarcinoma)
乳ガンで最も頻繁に表れるTAAは、ガン胎児性抗原(CarcinoEmbryonicAntigen(CEA))と、HER−2/neu、プロトオンコジーンである。CEAは、様々なアデノカルシノーマにおいて多量に発現される大きな胎児性腫瘍蛋白であるが、ほんのわずかな量で通常の小腸上皮組織に発現される。標的ペプチドの例はYLSGANLNLで、HLA−A2によって制限される。HER−2/neuは多くの腫瘍タイプに過剰に発現し、CTLに対する多くの好適な標的を有する大きい蛋白(1255アミノ酸)である。標的ペプチドの例は、残基369−377に、KIFGSLAFLを含むE75である。HER−2/neuは、***、卵巣、及び肺組織からの腫瘍細胞において200倍まで発現する。
【0071】
頸ガン
頸ガンはヒトパピローマウィルス(HPV)17型及び19型と関連する。これらのDNAウィルスは、RNAウィルス・インフルエンザA及びHIV−1と違って遺伝子的に安定である。HLA制限HPVペプチドはCTLの標的として確認されていた。
【0072】
結腸ガン
結腸ガンは、乳ガンと同種の標的、即ち、CEAとHER−2−neuを共有する。
【0073】
胃ガン
胃ガン細胞はHER−2/neuを過剰発現することが知られている。
【0074】
頭及び首のガン
頭及び首の扁平上皮ガンはMAGE−1及びMAGE−3遺伝子から黒色腫関連ペプチドを過剰発現することが知られている。
【0075】
白血病及びリンパ腫
温熱療法による影響は受けないが、酸素に富んだ媒体に浮遊しているので、白血病及びリンパ腫の細胞はLAK細胞の攻撃を受けやすい。それらはまたオンコジーンN−rasとK−rasからのペプチドを発現し、慢性骨髄腫白血病と急性骨随白血病に関連する。T−細胞白血病はヒトT−リンパ腫白血病ウィルスHTLV−1とIIによって頻繁に引き起こされる。白血病細胞のHLAによって提示されるウィルス蛋白はCTLの標的として役立ち得る。
【0076】
エプステイン−バーウィルス(Epstein−Barr Virus)は、鼻咽頭ガンと非ホジキンリンパ腫(Non−Hodgkin’s Lymphoma)に関連した大きいDNAウィルスである。このウィルスからのペプチドはガン細胞によって発現され、CTLの標的として役立ち得る。
【0077】
肺ガン
肺ガンは、扁平上皮乳頭腫とアデノカルシノーマに分割される。Aw68によって制限される標的ペプチドは、扁平上皮肺ガンから単離され、アデノカルシノーマはHER−2/neu、MAGE、GAGE及び関連BAGE遺伝子からの蛋白を共有する。
【0078】
前立腺ガン
前立腺−特異的抗原は、前立腺ガンに対する診断マーカーとして使用し得るが、それはまたCTLエピトープも含有する。HLA−A2によって制限された例は、PSA−1、FLTPKKLQCVと、PSA−3、VISNDVCAQVである。
【0079】
卵巣ガン
卵巣ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0080】
膵臓ガン
膵臓ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0081】
腎細胞ガン
腎細胞ガンは、MAGE及びGAGEを含む、多くの黒色腫関連ペプチドを共有する。
【0082】
子宮ガン
子宮ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0083】
発ガンプロセスの一部として発現する腫瘍関連ペプチドp53腫瘍抑制蛋白
p53遺伝子の産物は発ガンプロセスの礎石である。その産物はDNAに結合する四量体蛋白である。これは、RNAポリメラーゼII結合のバリアーとして機能し、オンコジーンの転写を妨げる。UV照射によって生じる突然変異、化学発ガン物質、SV40のような腫瘍原因ウィルスの感染はp53を不活性化し得る。不活性化されたp53はもはや転写を妨げず、オンコジーンが活性化され、細胞を不死で、急速に増殖する腫瘍細胞に変換する。
【0084】
突然変異したp53遺伝子は全てのガンの50%以上にみられ、これらの遺伝子からのペプチドはHLAで制限される。突然変異されたp53、又は正常p53を過剰発現している腫瘍細胞にさえ特異的なCTLは、ネズミの腫瘍を根絶することができる。ガン患者に使用されるこのタイプのペプチドのため、クラスIMHCタイプはp53のcDNAライブラリーと比較され、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が、ガン組織サンプルにおける突然変異p53の存在を確認するために使用し得る。
【0085】
テロメラーゼ(Telomerase)
2番目の一般的なTAAは酵素テロメラーゼである。クロモソームの末端はテロメリックDNAの繰り返し単位でキャップされている。これはクロモソームの分解を妨げ、同様に、クロモソーム相互間の結合を妨げる。テロメリックDNAは細胞分割の度に失われ、DNA複製の半保存的性質のために、それらはDNAポリメラーゼIによってもとに戻されることはできない。これは細胞時計として作用し、細胞が分割できる回数を制限しているようである。テロメアが終点に到ると、細胞は拘束され、それ以上、分割できない。
【0086】
定義によると、ガン細胞は、そのような活性に対する制限を無視して急速に増殖する。テロメアを加えると、それらは、酵素テロメアーゼを大量に合成する。腫瘍細胞株の90%近くが高いテロメラーゼ発現を示し、そして触媒サブユニット(hTERT)はCTLに対する標的として作用し得るHLA−制限蛋白である。テロメラーゼは通常正常な細胞では合成されないので、それは免疫療法における広く発現されたTAAを示す。
【0087】
ほとんどのTAAが、幾つかの正常組織タイプ、特に急速に増殖するものに存在するけれども、それらは微少な量で作られる。TAAは正常蛋白に由来する10,000のペプチドと競合しなければならないので、これらのHLA提示は低い。
【0088】
結論、効果及び見通し
従って、読者は、前述した組合せ療法が、人体からガン細胞を消去するのに、安全で効果的な方法を提供することがわかるだろう。ガン患者に有効として医学で知られた3つの療法を組み合わせることによって、その療法は、現行の化学療法、放射線、及び外科手術によって提示されるジレンマを解決する。全盛で野生型のデングウィルスが様々な熱帯医学のテキストで、無、非存在、及び61,000の1という死亡率を有するように、本発明における上述の及び様々な他の目的及び利点は、患者に対する過度の危険なく達成される。どんな他の全盛のウィルスにおいてもボランティアに注射する他の例はどの文献にも見られない。
【0089】
上述の記述は多くの具体的事項を含むけれども、これらは、発明の範囲を制限するものとして解釈すべきものではなく、単に、この発明における現在の好ましい具体化の幾つかの例を提供するものである。
【0090】
従って、本発明の範囲は、提示した具体例によるよりもむしろ、添付のクレームとそれらの法的均等物によって決定されるべきである。
【0091】
別に規定していない限り、ここで用いられている全ての技術的及び科学的用語は、この発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。ここで述べたものと類似又は均等なあらゆる材料及び方法が、本発明の実施、インビトロ及びインビボテストにおいて使用し得るけれども、好ましい方法と材料を述べている。ここで述べた全ての刊行物がここに参照として援用される。別に規定していない限り、ここで用いた技術は、当該分野の当業者によく知られた標準の技術である。
【0092】
ここで用いられた「実質的に純粋(substantially pure)」という用語は、標準の精製技術によって取得し得る程度に純粋という意味である。
【0093】
発明の概要
本発明に従い、体全体の温熱療法並びに特異的及び非特異的免疫活性化を通じて人体内のガン細胞を破壊する方法は、患者の生命のため、ガン細胞を認識し殺すことのできる特異的な細胞傷害性Tリンパ細胞株のクローンを作り出すデング熱ウィルス及びペプチド−パルスされた樹状細胞を、注射することによってもたらされる。
【0094】
ここで述べられた実施例及び具体例は、単に例示目的のものであって、それに照らして種々の変更や修正が当業者に示唆され、この出願の精神と範囲および添付のクレームの範囲内において含まれると理解される。
背景−発明の分野
本発明は、ガン処置のための温熱療法及び免疫療法に関する。
【0002】
背景−従来技術の説明
温熱療法(hyperthermia)によりガンを治療する最古の例は、遡って紀元前3000年の日付のあるエジプトのパピルスの巻物に見られ得、温水浴による治療を受ける乳ガンの患者が描かれている。超高熱(発熱)での全身温熱療法は、発熱性バクテリアの感染後の劇的な腫瘍の退縮さらに治癒でさえ実現してきた。19世紀末期および20世紀初期には、ウィリアム・コーリー(William Coley)博士が自然発生腫瘍退縮の症例を調査し、その共通要因が摂氏39.5度または華氏103.5度以上の持続性の発熱であることを発見した。
【0003】
コーリー博士は、発熱物質であるリポ多糖(LPS)を含む化膿連鎖球菌(ストレプトコッカス・ピオゲネス:Streptococcus pyogenes)の細菌ライゼートによって発熱の再現を試みた。コーリーは、多種にわたる癌腫及び肉腫を彼の混合細菌毒素(MBT)で治療し、手術不可能な悪性黒色腫の症例について60%の5年生存率を成し遂げた。この割合は、手術、放射線、及び化学療法プログラムで得られるものに比べて著しく高い。問題は、より多量のMBTを必要とする中和抗体を、患者が大量に生産し始めたときに生じた。また、コーリーは毒素の発熱性を標準化するのに苦労していた。自分の治療の成功の鍵は、腫瘍に対してどういう訳か交差反応性である、毒素への免疫応答が増強されたことに基づくと、コーリーは依然確信していた。現在の免疫学の知識でコーリーの仮説は確認されるが、抗菌応答の機構より抗ウイルス免疫のほうが、はるかに密接に抗腫瘍免疫に関係していることが今や明らかである。
【0004】
これは、細菌感染が、主に免疫系の体液性または抗体+補体アームを刺激するという事実による。バクテリアや原生動物などの細胞外寄生体については、このことは、血流内における排出の効率良い手段を提供する。しかしながら、ウイルスは細胞内寄生体であり、ウイルス感染した宿主細胞は、通常の細胞タンパクと共に細胞表面にウイルス抗原を発現する。それゆえ、ウイルス感染細胞を認識して殺す能力を持つキラーリンパ球は、ウイルスを根絶するために必要とされる。ガン細胞もまた、「自己(self)」または正常な宿主抗原を「変化した自己(altered−self)」または突然変異腫瘍抗原と共に細胞表面に発現するため、同じエフェクター細胞が必要である。ナチュラルキラー(NK)、リンホカイン活性化キラー(LAK)、及び抗原特異的細胞障害性Tリンパ球には、抗腫瘍および抗ウイルスを監視して根絶する主要な義務がある。今までのところ、発熱性ウイルスを用いて全身の高体温を誘発する例は科学文献にみられない。
【0005】
高熱を誘発する別の技術が試みられてきた;温液浴、四肢灌流、さらにマイクロ波の放射である。これらの方法の主な不利点は、大抵のガンは組織層内部の奥深くにあり、外部からの加熱では腫瘍細胞を殺すのに十分な温度を発生させることができないという点である。こうした従来技術のアプローチのもう1つの問題は、転移したガンでは腫瘍細胞が体中に広がっており、治癒を意図した治療では、体全体もまた加熱しなければならないという点である。安全かつ発熱性のウイルスを利用した全身発熱方法が、これら2つの問題を解決する。
【0006】
ガン治療においては、事実上特異的なものも非特異的なものも、おびただしい種類の免疫療法が試されてきた。ガン治療における主要な非特異的免疫調節物質は、バチルスカルメット−ゲラン(Bacillus Calmette−Guerin)、つまりBCGである。BCGは遅延型過敏症(DTH)反応を引き起こすが、これによって局在性マクロファージが活性化され、場合によっては殺腫瘍性となる。しかしながら、これは弱い発熱因子であり、したがって体温上昇によるメリットは実現できない。また、前に詳しく述べた通り、主に免疫系の体液性アームを刺激するため、インターフェロンの産生およびNKの活性化が概して低い。
【0007】
外因性インターフェロン療法が試みられてきたが、精製と毒性の問題に悩まされている。研究者たちは、通常より10倍高いアルファ−インターフェロン濃度を達成できているが、外来性インターフェロンが強い細胞応答を誘導し得る前にこれを中和する血清遮断因子(SBF)によって、その応答は妨げられている。免疫学者の間では、内因性インターフェロンの産生を刺激する治療法のほうが組換えインターフェロン及びインターロイキンの注射に頼る方法より好ましいという点で、一般に意見が一致している。前述の免疫療法は内因性インターフェロンAの濃度を通常濃度のおよそ260倍に刺激する。
【0008】
測定可能な応答を引き起こす、サブユニットペプチド或いは細胞全体が放射線照射された製剤の両方を用いた、ガンワクチンへのアプローチが非常に多く試されてきた。悪性黒色腫の場合、一般的な黒色腫抗原であるgp100、MART−1/Melan−A、及びTRP−1(チロシナーゼ関連タンパク)を含むポリペプチドワクチンが臨床的に試験されてきた。こうした方法の主な欠点は、ポリペプチドであることであり、それらはキラー細胞応答を誘導するよりむしろ寛容化できる。さらに、全ての黒色腫細胞がこれらの抗原をインビボで発現して同定及びエフェクター細胞による溶解のためにラベルするわけではない。
【0009】
もう1つの抗原特異的方法は、抗原構造が原型を保つように殺された(通常は照射)ガン細胞全体を用いることである。これらの細胞は次に注射により体に戻され、免疫応答を誘導する。このアプローチの問題は、特異的細胞障害性Tリンパ球が誘導される前に、腫瘍の負荷量を物理的手段により減らしておかなければならないことである。3つの主要な抗ガン療法がある。手術、放射線照射、及び化学療法が腫瘍負荷量を減らすが、同時に免疫系に打撃を与える。前述の療法はこうした障壁を乗り越えるよう設計されている。
【0010】
目的および利点
従って、ウイルス剤応答性の発熱に基づく全身温熱療法の目的および利点に加えて、本発明の目的および利点が幾つかある。
【0011】
(a)免疫機能を損なわない華氏103.5度以上の物理的手段(発熱)を通じて腫瘍負荷量を減らす方法を提供すること。
【0012】
(b)非特異的殺腫瘍活性のあるリンホカイン活性化キラー(LAK)細胞となるナチュラルキラーリンパ球を、無数に誘導すること。
【0013】
(c)患者の生命のために、特異的腫瘍抗原を有する腫瘍細胞を認識し殺すことができる、細胞障害性Tリンパ球(CTL)のクローンを誘導すること。
【0014】
(d)患者に深刻な害を与える危険性なく前述の活性を達成すること。
【0015】
他の目的および利点は、以下の本発明及びその実施の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【0016】
発明の概要
デングウイルスは、サブファミリーがフラビウイルスであるトガウイルスファミリーのRNAウイルスである。直径約40−45ナノメーターで2つのエンベロープタンパク質をもつ正二十面体の構成をしている。E1タンパク又はへマグルチンはアミノ酸グリシンが非常に豊富であり、分子量は約45,000ダルトンである。E2タンパク又はノイラミニダーゼはアミノ酸アラニン、セリン及びバリンに富み、分子量は約50,000ダルトンである。E3タンパクは膜貫通構造を持ち、これがE1及びE2タンパクをウイルスのコアタンパクに固定する。中和抗体は主にE1タンパクに向けられる。
【0017】
材料および方法
患者の基準
ステージI、II、III又はIVのガン、白血病あるいはリンパ腫の男性または女性被験者。
【0018】
ウイルス
デングウイルス(ワシントンDC、ウォルター・リード陸軍病院(Walter Reed Army Hospital)で入手可能)は、アフリカミドリザルの腎臓細胞中1ml当たり5より少ないプラーク形成単位まで継代したもの。DBS−FRhL−2ローラーフラスコに最小限感染またはMOI 0.0005で種ウイルスを接種する。1.5時間、35℃での吸着の後、種菌を除去してフラスコを100mlのハンクス平衡塩類溶液で3回洗浄する。維持培地(ローラー当たり200ml)は、0.25%のヒト血清アルブミン、0.22%のNaHCO3、ストレプトマイシン(50マイクログラム/ml)、及びネオマイシン(100マイクログラム/ml)を含むイーグル最小必須培地からなる。全てのフラスコの培地は4日目までに取り換えられ、上澄み液を6日目に収集する。1,050×gで20分間遠心分離する前に、最終濃度2.75%になるまでヒト血清アルブミンを加える。アルブミンのpHはウイルス液への添加前に調整される。清澄の最終工程として、液体を0.45マイクロメーターのメンブランフィルター(Nalge、ロチェスター、NY)でろ過する。次に、実施許諾された弱毒化生菌ウイルス性ワクチンのための公共保健サービス規則(連邦規定規範、第21章、F節、生物製剤)に説明されているように、試料を外来性微生物剤試験する。
【0019】
試験及びプラークアッセイのために試料を除いた後、残存分量を氷浴中4℃の冷蔵室で7日間、安全性試験およびプラークアッセイの結果が出るまで放置する。ウイルスの最終プールは、39.3℃で1ml当たり5より少ないプラーク形成単位を含むフラスコの液体から得られ、検出可能な大型プラークウイルスは存在しない。バイアルの平均力価は850,000PFU/mlであり、神経毒性試験後の使用のために凍結乾燥する。雄アカゲザルにウイルス液0.5mlを脊髄内および大脳半球内に接種し、2体のコントロールはウイルスフリーの培養液を受ける。サルたちを、CNS関与または他の身体的異常の徴候について毎日20日間観察する。犠牲に引き続き、腰椎および頚椎(cervical cord)、下部および上部延髄、中脳、及び運動皮質をウイルス性病理学のため組織検査した。
【0020】
患者への接種
患者に、各肢(limb)において一回、そして一次(primary)黒色腫腫瘍部位で一回、2mlのウイルスサンプル液を皮下注射する。接種後3〜5日後、患者に、患者のクラスI HLA型に適合された腫瘍−ペプチドでパルスされた樹状細胞を、リンパ内マイクロカテーテル(intralymphatic microcatheter)によって注入する。連続注射を、患者がCAT、PET、またはMRIスキャン、または免疫組織化学技術によって検出可能な腫瘍細胞をもはや示さなくなるまで、2週間毎に行う。
【0021】
患者マネージメント
患者は、生物医学的に完全にモニターされる:(パルス、血圧、呼吸、尿量(urinary output)、および特に体温)。患者は、発熱期間の間、十分に水を与えられた状態(well−hydrated)および軟らかいまたは液体の(高蛋白質)制限食(diet)に保たれる。黒色腫の場合、外部熱(電気パッド)が、発熱期間の間、可視の腫瘍に直接適用される。本発明の初期目標として与えられる解熱鎮痛剤(antipyretic analgesics)無しは、39.5℃を超える持続された発熱(pyremia)を達成する。正常体温への回復後、患者は、外来患者基準(outpatient basis)に基づいて退院およびモニターされる。
【0022】
患者の注射
患者に、各肢(limb)において一回2mlのウイルスサンプル液を真皮中へ皮下針によって注射する。2〜3日後、患者に、パルスされた樹状細胞(pulsed Dendritics)をリンパ内マイクロカテーテルによって注入し、患者が疾患に対して陰性となるまで注射を反復する。
【0023】
ペプチド合成手順
短鎖のアミノ酸を合成する多くの方法が使用され得るが、以下の方法が記載される。
【0024】
工程1(合成)
試薬グレード(reagent grade)塩化メチレンを無水炭酸カリウムから蒸留し、試薬グレードジメチルホルムアミドを、使用の48時間前に、0.4nmモレキュラーシーブで処理する。追加の材料および供給源:(全ての材料は、特記しない限り試薬グレード)。
【0025】
【0026】
トレオニンおよびグルタミン酸の側鎖をO−ベンジル基で、チロシンをオルト−ブロモベンジル−オキシカルボニルで、およびシステインをS−パラ−メトキシベンジルで保護する。開始アミノ酸(inital amino acid)(例えば、アスパラギン酸)をブトキシカルボニル−B−ベンジルアスパラギン酸に変換し、そしてベンズヒドラルアミン(bezhydralamine)樹脂へカップリングさせる。カップリング反応を、サイクルの終わりにニンヒドリンおよび/またはピクリン酸を使用して各工程でチェックする。ダブルカップリング(double−coupling)は、アスパラギン酸、システイン、プロリン、チロシン、およびフェニルアラニンの残基に必要である。等モル量のブトキシカルボニルアスパラギニンが、シアノアラニンの形成を防止するために含まれる。
【0027】
最終アミノ酸カップリングに続いて、N−末端ブトキシカルボニル基が除去され、そして樹脂は一晩真空乾燥されて、ペプチド樹脂を生成する(95〜97%純粋)。ペプチドは、樹脂から切断され得、そして側鎖保護基は、4℃で1.0時間の20ml液体HFでの1.0gの樹脂および1.0mlアニソールの処理によって除去される。窒素流で4℃でのHFの除去後、過剰のアニソールが、無水エーテル(100)mlでの抽出によって除去され得、得られる混合物は、揮発性HFを除去するためにNaOHペレットの存在下で高真空にさらされる。粗ペプチド樹脂が、窒素−脱気した(Nitrogen−de−aerated)5%HOAc(100ml)で抽出され得、残存する試薬を除去する。得られる混合物を、水で20%HOAcまで希釈し、そして20%HOAcで平衡化したSephadex G−10カラムを通過させる。最終生成物を凍結乾燥し、最終ペプチドを得る。
【0028】
樹状細胞の調製
骨髄細胞を、CD3、CD4、およびCD8についてのモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化細胞選別(Fluorescent Activated Cell Sorting)(FACS)によって、リンパ球およびMHCクラスポジティブ細胞について枯渇させる。残存する細胞を、一晩、10%ウシ胎児血清(FCS)、2−ME、および100IU/mlペニシリン、1mMピルビン酸ナトリウム、および10μM非必須アミノ酸を補足したIscove改変Dulbecco培地(Iscove’s modified Dulbecco’’s medium)(IMDM)中で、37℃、5%CO2雰囲気中、1ml培養培地/ウェルで約百万個の細胞を有する24ウエルプレート中、培養させる。24時間後、細胞を再プレートし(replated)、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、および900U/mlの組換えIL−4の存在下で、培養する。3〜4日後、培地を、新鮮なサイトカイン培地に交換する。
【0029】
あるいは、真皮樹状細胞(dermal dendritic cells)(DDC)は、以下の方法を使用して調製され得る:健康なヒトボランティアからの角膜切開刀(keratomes)を、RPMI 1640中最終濃度1.2U/mlの細菌プロテアーゼ・ディスパーゼ2型の溶液中で、1時間、37℃でインキュベートする。インキュベーション期間後、上皮および真皮は、容易に分離され得る。上皮および真皮シートは、次いで、PBSでの数回の洗浄後に小さな(1〜10mm)断片に切断され、そして10%ウシ胎児血清(FBS)で補足されたRPMI 1640中に配置され、そして10−cm組織培養プレートに配置される。2〜3日後、組織断片を取り出し、そして培地を回収する。組織切片から培地への細胞移動(cell migrating)は、スピンダウンされ(spun down)、1〜2mlの新鮮な培地に再懸濁され、そしてトリパンブルーで染色される。更なる富化(enrichment)が、メトリザミド勾配における分離によって達成され得る。細胞が、高張14.5%メトリザミドの3−mlカラム上に層にされ、そして室温で10分間650gで沈降される(sedimented)。低密度インターフェース細胞(low density interphase cells)を回収し、そして2回連続してより低い高張の洗浄物(10%FBSおよび40mM NaClを有するRPMI 1640)において洗浄し、細胞を等張に戻す。
【0030】
樹状細胞のペプチドパルシング
遺伝子産物の予め記載した免疫優性(immunodominant)ペプチドは、種々の方法を使用して構築され得るが、1つをここで記載する。10マイクロモルスケールのAbimed422マルチプルペプチドシンセサイザーが、必要とされるペプチドを構築するために使用され得る。あるいは、ミリグラム量の所望のペプチドを生成するためにクローニングおよび発現ベクターを使用する遺伝子工学技術が使用され得る。
【0031】
所望のペプチドが十分な量で単離された後、それらを樹状細胞上にロードしなければならない。第8日目、樹状細胞が、0.5%BSAおよび10マイクログラムのペプチドで補足されたIMDM培地1ml中37℃で2時間パルスされ得る。数回の等張洗浄後、ペプチドはヒトにおける使用のための準備が出来ている。パルスされた樹状細胞は、使用のための準備が出来るまで、液体窒素中−50℃で2年間まで保存され得る。
【0032】
発明の操作
a.癌細胞の温熱療法(hyperthermia)および熱感受性(thermosensitivity)
癌細胞は、多数の因子に起因して正常な組織細胞よりも熱に敏感である:
1.腫瘍タイプ
2.腫瘍部位
3.血液供給
4.増殖速度
5.細胞内pH
6.細胞代謝レベル。
【0033】
一般的に、肉腫(sarcomas)と呼ばれる結合組織(骨、軟骨、筋肉)から生じる腫瘍は、癌腫(carcinomas)と呼ばれる裏打ち(lining)または上皮組織から生じる腫瘍よりも、温熱療法に対して敏感である。これは、組織タイプの相対的血液供給(relative blood supplies)に主として起因する。上皮組織は、結合組織よりも遥かに豊富な血液供給を有し、従って癌腫はより熱耐性(thermoresistant)である。白血病およびリンパ腫のような血液癌は、熱損傷(damage)に敏感でない。悪性黒色腫は、それが裏打ち(lining)組織から生じるが乏しい血液供給を有するので、両方の特徴を共有する。
【0034】
位置もまた、四肢腫瘍はボディコア(body core)におけるものよりも選択的加熱(selective heating)に供され易いので、重要である。大抵の先行技術の温熱療法成功(hyperthermic successes)は、肉腫の四肢灌流を伴う。小動脈の広範な網目構造附近の腫瘍は、これらの主な血管から遥かに離れたものよりもより感受性でない。
【0035】
腫瘍の相対的増殖速度もまた、重要である。攻撃的な速く増殖する(aggressive fast−growing)腫瘍は、不活発なものよりも豊富な血液供給を必要とする。速く増殖する腫瘍はまた、酸性代謝物の多量なプール(pools)を構築し、そしてこの因子は、温熱療法の間重要となる。高温で、それらの複製の間に染色体を安定化させる紡錘体器官が、変性および崩壊に供され、細胞死に至る。
【0036】
デング熱によって誘発されるような高熱の穏やかなレベル(103.5〜106oF)、または(39.5〜41℃)で、熱感受性(thermosensitivity)は、血液供給、細胞内pH、および細胞内代謝速度のような間接的因子に主に起因する。腫瘍は、単一細胞から生じるので、一般的に乏しい血液供給を有し、そして直ぐに局所血液供給(local blood supply)を追い越す。アンギオテンシノゲン(angiotensinogen)と呼ばれるホルモンの分泌は、局所血管増殖を助長し、しかし要求は灌流速度を凌ぐ。中等度から大きな腫瘍において、内部コア(interior core)は、酸素、グルコース、および他の栄養を得ることが出来ないことに起因して死滅する。外部腫瘍細胞のみが、生存のために十分なガスおよび栄養交換を行い得る。
【0037】
腫瘍はまた、毒性、酸性の代謝副産物を取り除くための低い灌流に起因して、健康な組織よりも低い細胞内pHを有する。細胞は、機能的反応(functional reactions)を行うために、アデノシン三リン酸(ATP)通用分子(currency molecules)を産生するための2つの経路を有する:好気的代謝および解糖。好気的代謝は酸素を使用し、そして少量の酸性廃棄産物を伴って1グルコース分子当たり36ATP分子を生成する。他方、解糖は、遥かに迅速であり、しかし1グルコース当たり2ATPのみを生成し、そして乳酸を生成し、これは細胞内pHを低下させる。
【0038】
腫瘍は、それらの過剰増殖のために、健康な細胞よりも高い解糖速度を有する。従って、腫瘍微小環境(microenvironment)は、低酸素症(低い酸素)、アシドーシス、および栄養欠乏(nutrient deprivation)によって特徴付けられる。ステージは、温熱療法を通してこれらの弱さを利用するために設定される。
【0039】
体温が上昇すると、細胞代謝率も上昇する。温度の関数として、酵素反応は増加するので、細胞はより多くの栄養分を取り入れ、それらの有毒廃棄物を洗い流さなければならない。正常な灌流速度を有する健全な細胞は、容易に41℃以下の温度に耐えることができる。一方、腫瘍細胞には、どちらの側にも不利なシナリオが与えられる。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させないならば、飢えるであろう。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させれば、それらの細胞内pHは6.7、つまり血流pH下のほぼフル対数点(full logarithmic point)に達するまで下がるであろう。6.0において、重要な細胞反応を担う酵素、特にNa−K ATPaseポンプシステムは機能しなくなり始める。この酵素は、細胞膜を通したナトリウム及びカリウムイオンの相対勾配を維持することを担っている。それが機能しない時、ナトリウムイオンが流れ込み、その細胞は死ぬ。リソソーム及びペルオキシソームは、プロテアーゼを含む細胞質膜結合ボディーである。6.0以下のpHにおいて、これらのボディーは破裂し、細胞を消化する。
【0040】
腫瘍感受性は、該反応によると、時間及び温度の両方に依存する:
s = S0e−kt
ここで、sはあらゆる所定時間tにおける生存であり、S0は最初の時間における生存であり、kは所定温度での不活性化速度を表す定数であり、tはインキュベーションの所要時間である。
【0041】
上記式から分かるように、細胞生存は対数的に減少する。簡単に言うと、温度が高ければ高いほど、1 logつまり90%腫瘍殺傷率、2 logつまり99%殺傷率、又は3 logつまり99.9%殺傷率に必要な時間が短くなる。
【0042】
デング熱は、生腫瘍細胞における1−2 log減少を作り出すのに充分な熱を作り出すが、もしそれらが高灌流血管付近に置かれるなら、比較的少数が生存するだろう。今、該細胞を同定し、除去するのは、免疫反応次第である。
【0043】
b.発明の活性な非特異的免疫療法操作
デング熱ウイルスは感染し、次の2種の白血球中で複製する:(マクロファージに成熟する)未熟単球、及び抗体産生血漿細胞に成熟するB−リンパ球。感染での最初の三日で、デングは60%の循環白血球を殺し、WBC数値は5300/mlから2200/mlに低下する。破裂の際、これらの細胞は莫大な量のインターフェロン、インターロイキン、及びリンパ球構造タンパク質を血流中に放つ。これらのリンフォカインは、NK細胞を刺激し、LAK細胞になり、これは、特異性に関係なく、ウイルス及び腫瘍抗原発現細胞を殺すことができる。前のインヴィトロ実験において、デング活性化LAK細胞は、高度にヒト腫瘍株K562の細胞を殺した。LAK細胞は、NK細胞に抵抗力のある腫瘍細胞を殺すことができ、これは、本発明の操作において重要な要因である。
【0044】
デングはまた、MAFつまりマクロファージ活性化因子と呼ばれるリンフォカインを通して、殺腫瘍性(tumorcidal)になるように、成熟マクロファージを誘発する。この状態で、マクロファージは、癌性細胞を殺すことのできる腫瘍浸透性白血球になる。温熱療法を通した1−2 log死に続くこの反応は、患者から十分に腫瘍細胞を全滅させ得、治癒を生じたとしても、それは結局、治まるだろう。癌細胞は全く熱及びLAK/TIL反応を生き残らないということを完全に確信するためには、第3の成分、つまり一生の抗腫瘍監視及び殺傷能力を提供する成分が必要である。
【0045】
c.発明の特異的抗腫瘍反応
LAK細胞は、圧倒的な殺腫瘍特性を有する一方で、免疫学的記憶を有さない。インターフェロンレベルが正常に戻った後、これらの非特性キラー細胞は、細胞を壊すようにそれらを仕向けた抗原構造を“記憶する”能力を有さない。該免疫系のその機能は、体液性免疫の抗体アームに、及び細胞障害性Tリンパ球に任せられている。
【0046】
細胞障害性Tリンパ球は胸腺に由来し、リンパ組織に移動する。T4ヘルパーリンパ球は、腫瘍細胞に対し細胞障害性であることができるが、これらは、限られた数の細胞タイプ上のクラスII MHCにより提示されたより長いペプチドを認識する。T8 CTLは、“特権”部位:CNS、網膜、及び生殖腺において以外、すべての細胞タイプ上に存在する、クラスI MHCにより提示されたより短い(8−11 mer)ペプチドを認識する。T8 CTLはそれらのT細胞レセプター(TCR)を使用し、HLAによりA及びB対立遺伝子にコードされたMHCタンパク質により提示されるペプチドを評価する。小胞体中で産生されるタンパク質は、周期的にプロテアーゼにより切断され、HLA結合モチーフを適合させるペプチドは、該MHC鎖間にロードされている。このように安定化され、該三量体複合体は、最終的に細胞膜にはめ込まれ、ここで該ペプチドはTCRにより“読み取られる”ことができる。もし充分な数のCTLが生成されることができるなら、ウイルス性タンパク質を製造する細胞、つまり腫瘍関連ペプチドは、このように除去されることができる。これらのCTLは記憶受容能力があり(memory−competent)、該患者の一生の間、それらのターゲット抗原を発現する細胞を同定し、殺すことができる。
【0047】
多くの癌研究者らは、大した成果もなく、腫瘍特異的CTLを作り出そうと試みてきた。その主な困難は、前もってのディバルキング(debulking)の欠如、その7つの腫瘍免疫回避法、及び自己ペプチドに対するT細胞寛容性から生じる。
【0048】
腫瘍ディバルキング
存在する腫瘍細胞の99%(2−logs)の除去は、免疫療法からの最適の結果のための必須条件である。細胞障害性薬剤を用いる化学療法、ガンマ照射及び大手術は、腫瘍を小さくすることはできるが、細胞免疫を低下させる。患者は、時々、これらの方法により彼らの癌を“治す”が、彼らの低下した免疫系のため、感染により死んでしまうだけである。温熱療法(hyperthemia)は、細胞性免疫反応を抑制しない、唯一、信頼できるディバルキング方法である。
【0049】
7つの腫瘍免疫回避法
もし、ある治療が2−logディバルキングを達成するなら、CTL及びLAK細胞はしばしば、7つの該腫瘍免疫回避法により、腫瘍細胞を除去するのに成功しない。
1.クラスI MHC発現のダウンレギュレーション。
2.CTLにより認識される腫瘍エピトープにおける点突然変異。
3.NK認識を避けるための、胎児の栄養芽層HLA−Gタンパク質の発現。
4.腫瘍微細血管はLAK及びCTL移動に対し阻害性である。
5.腫瘍細胞は、IL−10を分泌するように単球を誘導し、それはCTLをアネルギー性にする。
6.腫瘍細胞はFasリガンド(FasL)を発現し、それはFas + CTLを殺すことができる。
7.腫瘍細胞は繊維状間質性バリアーを組み立て、CTLの動きを妨害する。
【0050】
記載されている本発明は、デングウイルスにより誘発されるサイトカインの放出を通し、これらの7つ全ての機構を打ち負かすように設計されている。
【0051】
腫瘍細胞はしばしば、MHC三量体のフロアを形成するベータ−2−ミクログロビンを制限することにより、クラスI MHC発現を低下又は除去する。B−2mがなければ、MHCは不安定であり、ペプチドを結合させることはできない。腫瘍細胞もまた、MHC複合体を膜に運ぶ輸送体タンパク質TAP−1及びTAP−2を減少させる。これらのタンパク質の機能障害は、クラスI発現の不在につながり、CTLのT細胞レセプターに対し腫瘍細胞を見えなくする。
【0052】
デングウイルス感染は、大量のインターフェロンアルファ、ベータ及びガンマを誘発する。IFN−ガンマは、B−2m及びTAP遺伝子のプロモーター領域に結合することにより、腫瘍細胞中にクラスI発現を再構築することができる。IFN−アルファもまた、クラスI発現を増加させ、クラスIレベルを正常値まで上げるように、IFN−ガンマとの相乗的に作用する。
【0053】
腫瘍細胞はしばしば、欠陥遺伝子調節の結果として、高い突然変異率に苦しみ、腫瘍特異的CTLにより認識されるターゲットペプチドにおける突然変異は、腫瘍細胞が溶解を避けるのを助けることができる。もし突然変異が、ペプチドをMHC鎖にアンカーリングするために必要なアミノ酸中で起こるなら、そのペプチドはもはやHLA分子に結合できない。もし突然変異が、TCR認識に必要な残基中で起こるなら、該ペプチドはまだMHCと結合し、もはや該CTLにより認識されないであろう。
【0054】
デング感染は、結果として、高レベルの2つの重要なサイトカイン:IFN−ベータ、及びIL−2を生じる。CTLがこれらのサイトカインに一緒にさらされた時、それらはターゲット特異性を失い、LAK様の溶解能力を得る。これらの非選好性CTLは、HLA制限なしで、多くの細胞株からの腫瘍タイプを溶解することができるので、腫瘍関連ペプチドにおける突然変異は回避できないはずである。
【0055】
MHC発現を減少させてしまっている腫瘍細胞は、NK溶解を受けやすい。ナチュラルキラーは、クラスI MHCにより架橋された時、ネガティブシグナルを伝達するレセプターを使用する。もし該細胞がそのHLA発現を低下させるならば、それはNK細胞に殺されることができる。胎児栄養芽層細胞はHLA−Gと称されるタンパク質を発現し、それは母のNK溶解から保護する。クラスI MHCレベルを減少させる間、HLA−G遺伝子を活性化する腫瘍細胞は、細胞免疫系のアーム両方を避けることができる。
【0056】
デング熱感染はとても高レベルのLK−2を誘発し、それはCTL増殖を促進する。IL−2もまたNK細胞をLAKに変換させ、これは腎細胞癌株CurのようなNK耐性腫瘍株を殺すことができる。
【0057】
腫瘍血管、特に高内皮小静脈(HEV)は、しばしばP及びEセレクチンを欠いており、これらは活性化キラー細胞上に見出されるCD11インテグリンに結合する。高い流体力学ずれ率と共に、これは、LAK及びCTLが腫瘍細胞ターゲットとかみ合うために血流から出でいくことを防ぐ。
【0058】
デング感染は、高レベルの2つの炎症誘発性(proinflammatory)サイトカイン、つまりIL−1及び腫瘍壊死因子−アルファ(TNF−a)を誘発する。IL−1及びTNF−aは腫瘍血管上のセレクチンをアップレギュレートし、血管内皮細胞間のギャップジャンクションを広げる。これは、治療により作り出されたキラー細胞がHEVから出て、腫瘍細胞を破壊することを可能にする。
【0059】
腫瘍細胞は、しばしばトランスフォーミング成長因子−ベータ(TGF−b)を分泌し、これは付近の単球にIL−10を分泌させる。IL−10はCTLをアネルギー性にするので、それらはもはや腫瘍細胞とかみ合う能力はない。デングウイルスは、選択的に単球中で複製し、単球を殺し、誘発された高レベルのIL−2は、腫瘍浸透性リンパ球(TIL)のアネルギー状態を反対にするだろう。
【0060】
病原体に対する反応でクローン化されたCTLは、しばしばFas、またはCD95を発現する。Fasリガンド(FasL)により架橋された時、DNA分解(アポトーシス)により該CTLは死ぬ。“特権”部位の細胞は、しばしばFasLを発現し、感応性の領域に侵入するあらゆるCTLを殺す。FasLを発現する腫瘍細胞は、反応性CTLを殺すことができ、抑制されない腫瘍成長を可能にする。
【0061】
デング感染は、高量のIL−6を誘発し、これはFLIP(Fas−リガンド抑制タンパク質)の発現を促進する。FLIPは、CTL上のFas自己破壊トリガーを覆う“安全スイッチ”として働く。IL−2レベルが高い限り、FLIPはCTLをFasLから保護するだろう。デング感染におけるIL−2レベルは、30日以上の間、高かった。
【0062】
腫瘍細胞は、ストローマと呼ばれる血管結合組織の束(fibrovascular bundle)の成長を促進する因子を分泌する。このコラーゲン束の密な網状組織は、CTL移動性を妨げることができる。デング感染により誘発される高レベルのIFN−ガンマは、CD44を発現するマクロファージを活性化し、これはヒアルロニダーゼ酵素でストローマのバリアを消化する。活性化マクロファージは、腫瘍特異性T4及びT8 CTLにより放出される走化性シグナルにより腫瘍領域に引かれるだろう。
【0063】
腫瘍関連ペプチドに対するT−細胞耐性の克服
ここで述べられる治療は、個々の腫瘍免疫回避手段を無効にする設計により、独特である。最初の2つの目的、腫瘍免疫回避メカニズムのデバルキングと破壊を達成する治療は、克服すべき1つの他の障壁:T−細胞耐性を有する。
【0064】
子宮内の最後の月において、及び、生命体の最初の18月の間、T−細胞免疫システムはクローンの選別と削除のサイクルを受ける。胸腺上皮組織によって示される自己ペプチドに対して高い親和性を有するレセプターを伴ったT4及びT8細胞は除去(削除)される。自己ペプチドに低い親和性を有するT−細胞のみが選別され、周辺リンパ組織に在住するため胸腺を離れる。これは自己免疫に対する重要なセーフガードであるが、腫瘍細胞はこの仕組みを利用する。もし腫瘍が免疫反応を起こすと、ひき起こされたCTLはペプチドに対し低い親和性を有し、そのため腫瘍細胞に対しては、低い細胞毒性を示すだろう。免疫回避手段と兼ね合って、このことは、腫瘍免疫療法における成功の低い割合を説明する。
【0065】
クローンの削除は完全なプロセスではなく、さもなければ自己免疫疾患は知られていないであろう。適当な条件において、耐性は克服し得ることを示唆する、一連の増大する証拠がある。最初の要件はT−細胞に対する抗原の効率のよい提示である。マクロファージは抗原提示細胞(APC)として機能し得るが、最も効率の良いAPCは骨髄由来の樹状細胞(DC)である。DCは抗原を捕捉し、標的ペプチドへ加工し、次いで、T−細胞にそのペプチドを提示する。CTLは次いでペプチドを認識するためにそれらのTCRを形作り、抗原特異的となる。
【0066】
DCは1:1000の割合でCTLをプライムすることができ、従って、腫瘍ペプチドでパルスされた1000万のDCは100億のCTLを生じ得る。100億の細胞の初期の腫瘍の負担から温熱療法を通して2−log縮小した後で、これは個々の残存する腫瘍細胞に100CTLという結果となろう。
【0067】
T−細胞耐性を克服するための2番目の要件は、Th−1タイプサイトカイン、即ちIFN−ガンマ、IL−2、IL−7及びIL−12の高レベルである。CTLの増大は2つの因子:APCとTh1サイトカインレベルによって制限される。デング感染は必要とされる高レベルを誘発する。
【0068】
腫瘍関連抗原(TAA)
腫瘍免疫療法の成功に対する別の主要な障害は、CTLの標的として役立つTAAの不足である。ウィルス感染細胞においてHLAによって捕捉されるペプチドと違って、TAAはより少ない量で一般に製造される。それぞれの細胞は、特異的なHLAタイプ、例えば、HLA−A2のおよそ200,000のコピーを有する。それぞれのペプチドのフラグメントはHLA結合のために10,000の他のものと競合しなければならず、ペプチドを提示する最低200のMHC複合体がCTL分解のために必要とされる。
【0069】
黒色腫は最も特徴的なTAA、即ち、他の腫瘍タイプに発現するMelan−A/MART−1、gp100、pmel7及びMAGEグループ抗原を有する。以下の腫瘍タイプが、腫瘍特異的CTLをプライムする同種異系のDCの上にロードされ得る特異的TAAと共に、列挙される。
【0070】
胸部アデノカルシノーマ(Adenocarcinoma)
乳ガンで最も頻繁に表れるTAAは、ガン胎児性抗原(CarcinoEmbryonicAntigen(CEA))と、HER−2/neu、プロトオンコジーンである。CEAは、様々なアデノカルシノーマにおいて多量に発現される大きな胎児性腫瘍蛋白であるが、ほんのわずかな量で通常の小腸上皮組織に発現される。標的ペプチドの例はYLSGANLNLで、HLA−A2によって制限される。HER−2/neuは多くの腫瘍タイプに過剰に発現し、CTLに対する多くの好適な標的を有する大きい蛋白(1255アミノ酸)である。標的ペプチドの例は、残基369−377に、KIFGSLAFLを含むE75である。HER−2/neuは、***、卵巣、及び肺組織からの腫瘍細胞において200倍まで発現する。
【0071】
頸ガン
頸ガンはヒトパピローマウィルス(HPV)17型及び19型と関連する。これらのDNAウィルスは、RNAウィルス・インフルエンザA及びHIV−1と違って遺伝子的に安定である。HLA制限HPVペプチドはCTLの標的として確認されていた。
【0072】
結腸ガン
結腸ガンは、乳ガンと同種の標的、即ち、CEAとHER−2−neuを共有する。
【0073】
胃ガン
胃ガン細胞はHER−2/neuを過剰発現することが知られている。
【0074】
頭及び首のガン
頭及び首の扁平上皮ガンはMAGE−1及びMAGE−3遺伝子から黒色腫関連ペプチドを過剰発現することが知られている。
【0075】
白血病及びリンパ腫
温熱療法による影響は受けないが、酸素に富んだ媒体に浮遊しているので、白血病及びリンパ腫の細胞はLAK細胞の攻撃を受けやすい。それらはまたオンコジーンN−rasとK−rasからのペプチドを発現し、慢性骨髄腫白血病と急性骨随白血病に関連する。T−細胞白血病はヒトT−リンパ腫白血病ウィルスHTLV−1とIIによって頻繁に引き起こされる。白血病細胞のHLAによって提示されるウィルス蛋白はCTLの標的として役立ち得る。
【0076】
エプステイン−バーウィルス(Epstein−Barr Virus)は、鼻咽頭ガンと非ホジキンリンパ腫(Non−Hodgkin’s Lymphoma)に関連した大きいDNAウィルスである。このウィルスからのペプチドはガン細胞によって発現され、CTLの標的として役立ち得る。
【0077】
肺ガン
肺ガンは、扁平上皮乳頭腫とアデノカルシノーマに分割される。Aw68によって制限される標的ペプチドは、扁平上皮肺ガンから単離され、アデノカルシノーマはHER−2/neu、MAGE、GAGE及び関連BAGE遺伝子からの蛋白を共有する。
【0078】
前立腺ガン
前立腺−特異的抗原は、前立腺ガンに対する診断マーカーとして使用し得るが、それはまたCTLエピトープも含有する。HLA−A2によって制限された例は、PSA−1、FLTPKKLQCVと、PSA−3、VISNDVCAQVである。
【0079】
卵巣ガン
卵巣ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0080】
膵臓ガン
膵臓ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0081】
腎細胞ガン
腎細胞ガンは、MAGE及びGAGEを含む、多くの黒色腫関連ペプチドを共有する。
【0082】
子宮ガン
子宮ガン細胞は、HER−2/neuとCEAを発現することが知られている。
【0083】
発ガンプロセスの一部として発現する腫瘍関連ペプチドp53腫瘍抑制蛋白
p53遺伝子の産物は発ガンプロセスの礎石である。その産物はDNAに結合する四量体蛋白である。これは、RNAポリメラーゼII結合のバリアーとして機能し、オンコジーンの転写を妨げる。UV照射によって生じる突然変異、化学発ガン物質、SV40のような腫瘍原因ウィルスの感染はp53を不活性化し得る。不活性化されたp53はもはや転写を妨げず、オンコジーンが活性化され、細胞を不死で、急速に増殖する腫瘍細胞に変換する。
【0084】
突然変異したp53遺伝子は全てのガンの50%以上にみられ、これらの遺伝子からのペプチドはHLAで制限される。突然変異されたp53、又は正常p53を過剰発現している腫瘍細胞にさえ特異的なCTLは、ネズミの腫瘍を根絶することができる。ガン患者に使用されるこのタイプのペプチドのため、クラスIMHCタイプはp53のcDNAライブラリーと比較され、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)が、ガン組織サンプルにおける突然変異p53の存在を確認するために使用し得る。
【0085】
テロメラーゼ(Telomerase)
2番目の一般的なTAAは酵素テロメラーゼである。クロモソームの末端はテロメリックDNAの繰り返し単位でキャップされている。これはクロモソームの分解を妨げ、同様に、クロモソーム相互間の結合を妨げる。テロメリックDNAは細胞分割の度に失われ、DNA複製の半保存的性質のために、それらはDNAポリメラーゼIによってもとに戻されることはできない。これは細胞時計として作用し、細胞が分割できる回数を制限しているようである。テロメアが終点に到ると、細胞は拘束され、それ以上、分割できない。
【0086】
定義によると、ガン細胞は、そのような活性に対する制限を無視して急速に増殖する。テロメアを加えると、それらは、酵素テロメアーゼを大量に合成する。腫瘍細胞株の90%近くが高いテロメラーゼ発現を示し、そして触媒サブユニット(hTERT)はCTLに対する標的として作用し得るHLA−制限蛋白である。テロメラーゼは通常正常な細胞では合成されないので、それは免疫療法における広く発現されたTAAを示す。
【0087】
ほとんどのTAAが、幾つかの正常組織タイプ、特に急速に増殖するものに存在するけれども、それらは微少な量で作られる。TAAは正常蛋白に由来する10,000のペプチドと競合しなければならないので、これらのHLA提示は低い。
【0088】
結論、効果及び見通し
従って、読者は、前述した組合せ療法が、人体からガン細胞を消去するのに、安全で効果的な方法を提供することがわかるだろう。ガン患者に有効として医学で知られた3つの療法を組み合わせることによって、その療法は、現行の化学療法、放射線、及び外科手術によって提示されるジレンマを解決する。全盛で野生型のデングウィルスが様々な熱帯医学のテキストで、無、非存在、及び61,000の1という死亡率を有するように、本発明における上述の及び様々な他の目的及び利点は、患者に対する過度の危険なく達成される。どんな他の全盛のウィルスにおいてもボランティアに注射する他の例はどの文献にも見られない。
【0089】
上述の記述は多くの具体的事項を含むけれども、これらは、発明の範囲を制限するものとして解釈すべきものではなく、単に、この発明における現在の好ましい具体化の幾つかの例を提供するものである。
【0090】
従って、本発明の範囲は、提示した具体例によるよりもむしろ、添付のクレームとそれらの法的均等物によって決定されるべきである。
【0091】
別に規定していない限り、ここで用いられている全ての技術的及び科学的用語は、この発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。ここで述べたものと類似又は均等なあらゆる材料及び方法が、本発明の実施、インビトロ及びインビボテストにおいて使用し得るけれども、好ましい方法と材料を述べている。ここで述べた全ての刊行物がここに参照として援用される。別に規定していない限り、ここで用いた技術は、当該分野の当業者によく知られた標準の技術である。
【0092】
ここで用いられた「実質的に純粋(substantially pure)」という用語は、標準の精製技術によって取得し得る程度に純粋という意味である。
【0093】
発明の概要
本発明に従い、体全体の温熱療法並びに特異的及び非特異的免疫活性化を通じて人体内のガン細胞を破壊する方法は、患者の生命のため、ガン細胞を認識し殺すことのできる特異的な細胞傷害性Tリンパ細胞株のクローンを作り出すデング熱ウィルス及びペプチド−パルスされた樹状細胞を、注射することによってもたらされる。
【0094】
ここで述べられた実施例及び具体例は、単に例示目的のものであって、それに照らして種々の変更や修正が当業者に示唆され、この出願の精神と範囲および添付のクレームの範囲内において含まれると理解される。
Claims (24)
- ガン患者における非特異的免疫応答誘導用薬物を調製するための、腫瘍ペプチドでパルスされた同種異系樹状細胞のデングウイルスと組み合わせた使用。
- 該ガン患者が白血病、リンパ腫又は充実性腫瘍を有する、請求項1に記載の使用。
- 該ウイルスがデング1型、デング2型、デング3型、又はデング4型である、請求項1に記載の使用。
- 該デングウイルスが、類人猿を通過させることにより精製され、ニューロビルレンスの除去を確認する請求項1に記載の使用。
- 該ウイルスがアフリカミドリザルの腎臓細胞を通過する、請求項4に記載の使用。
- 該薬物の単位投与量が5pfu/mlより少ない、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が黒色腫を有し、該腫瘍ペプチドがMelan−A/MART−1、gp100、pmel7、及びMAGE群抗原からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が胸部腺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原(CEA)又はHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が子宮頚ガンを有し、該腫瘍ペプチドがヒトパピロマウイルス17型又は19型の全てのタンパクからなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が結腸ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原(CEA)又はHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が胃ガンを有し、該腫瘍ペプチドがHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が頭部又は頚部ガンを有し、該腫瘍ペプチドがMAGE−1又はMAGE−3タンパク質である、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が肺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがAw68、HER−2/neu、MAGE、GAGE、及びBAGEタンパク質からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が前立腺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがHLA−A2、PSA−1、及びPSA−3からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が卵巣ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原(CEA)又はHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が膵臓ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原(CEA)又はHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が腎細胞ガンを有し、該腫瘍ペプチドがMAGE又はGAGEタンパク質である、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が子宮ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原(CEA)又はHER−2/neuである、請求項1に記載の使用。
- 該腫瘍ペプチドがp53又はテロメラーゼである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が鼻咽頭ガンを有し、該腫瘍ペプチドがEBV由来ペプチドである、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が白血病又はリンパ腫を有し、該腫瘍ペプチドがN−ras、K−ras、HTLV−1タンパク質、HTLV−2タンパク質、及びEBVウイルス性タンパク質からなる群より選択される、請求項1に記載の使用。
- 該ガン患者が慢性骨髄性白血病又は急性骨髄芽球性白血病細胞を有し、該腫瘍ペプチドがN−ras又はK−rasである、請求項21に記載の使用。
- 該ガン患者がT細胞白血病を有し、該腫瘍ペプチドがHTLV−I又はHTLV−II由来ペプチドである、請求項21に記載の使用。
- 該ガン患者が非ホジキンリンパ腫を有し、該腫瘍ペプチドがEBV由来ペプチドである、請求項21に記載の使用。
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