【０００１】
（技術分野）
本発明は、ペプチドおよび蛋白質の薬剤（以下「ペプチド薬」と称する）の経口投与製剤およびそれを生産する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
遺伝子組換え技術および固相ペプチド合成技術の急速な発展にしたがって、臨床分野で使用されるペプチド薬の種類は、１９９０年代に急速な増加傾向で多くなり、バイオテクノロジーの著しい発展のために加速され、約１００種またはそれ以上の薬剤が開発され、現在世界で商品化されている。
【０００３】
しかしながら、現在開発され、商品化された大部分のペプチド薬は注射薬の形態であり、したがって、１）患者への注射には痛みが伴うこと、２）それが冷蔵庫での貯蔵の必要といった貯蔵における困難さをもっていること、および３）患者が薬を打ってもらうために病院に行かねばならないこと、において欠点を持っている。したがって、ペプチド薬の経口薬剤を開発することが緊急に求められているが、そのような開発は第１段階にあり、現在に至るまで重要でない結果を提供しているに過ぎない。
【０００４】
ペプチド薬の注射に含まれる上記の欠点を経口薬剤によって克服することができるならば、１）ペプチド薬を患者に最も適した投与形態で処方することができること、２）製剤の安定性が増して、流通や有効期間の確立などの、生産、販売および消費の条件が、今までの剤形に比較して都合よくかつ有利に変更できること、および３）患者に好まれる経口薬剤のマーケットが今までの薬剤のマーケットに急速に置き換わること、が期待される。したがって、経口薬剤を開発する技術的研究が活発になされてきた。
【０００５】
一般に、ペプチド薬の経口薬剤を開発することにおける技術的な問題点は、よく知られた論文（レイモンド Ｍ．レイリー、ロンメル・ドミンゴおよびジャスビル・サンドゥ、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３２巻（４）、３１３〜３２３頁、１９９７年；ヨセフ Ａ．フィックス、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻、Ｎｏ．１２、１９９６年；アミン Ｐ．サヤニおよびイー Ｗ．チェン、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１３巻（１および２）８５〜１８４頁、１９９６年；ジェーン Ｐ．Ｆ．バイ、リ−リン・チャンおよびジャン−ホワ・グオ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１２巻（４）、３３９〜３７１頁、１９９５年）に報告されている。
【０００６】
そのようなペプチド薬の経口薬剤を開発することにおいて解決すべき主要な問題は、１）腸管での低い吸収、２）小腸に存在するプロテイナーゼによる効力の消滅、および３）吸収後の生体内における短い半減期のために効力を維持することの困難さ、を含む。したがって、研究は、そのような問題に焦点を置いている。
【０００７】
これらの問題の中で、まず、以下の方法が腸管での低い吸収を解決するために広く使用されてきた：１）生体膜を通しての薬の透過を増すためにナノスフィア粒子またはミクロスフィア粒子中に薬を包含すること（イストヴァン・トート、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１８３巻、１９９９年、５１〜５５頁；Ｅ．ビョルク、Ｕ．イサクソン、Ｐ．エドマン、Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２、５０１〜５０７頁、１９９５年；シンジ・サクマ、ノリオ・スズキ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１４９巻、１９９７年、９３〜１０６頁）；２）吸収促進剤と一緒に薬を使用する方法（パトリック．Ｊ．シンコ、ヨン−ヒー・リー、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６巻、Ｎｏ．４、１９９９年、５２７〜５３３頁；Ｊ．Ｃ．スコット−モンクリーフ、Ｚ．シャオ、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．８３巻、１４６５〜１４６９頁、１９９４年；Ｅ．Ａ．ホスニー、Ｎ．Ｍ．カン、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．、２１巻、１５８３〜１５８９頁、１９９５年；イサオ・ササキ、ヒデユキ・トザキ、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２２巻、（６）、６１１〜６１５頁、１９９９年；アンソミーＣ．チャオ、ジョウゼフ・ヴ・ヌグエン、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１９１巻、１９９９年、１５〜２４頁）；３）ペプチド構造を改変する方法（ディーブン・シャー、ウェイ・チャン、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８５巻、Ｎｏ．１２、１９９６年、１３０６〜１３０９頁；カズノリ・イワナガ、サトシ・オノ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８８巻、Ｎｏ．２、１９９９年、２４８〜２５２頁；イストヴァン、ジョンＰ．マルキンソン、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４２巻、４０１０〜４０１３頁）；４）薬の構造を改変する、または、酵素阻害剤と一緒に薬を使用する方法（Ｐ．ビュールネイヤー、Ａ．カセリ、Ｗ．ヒューラー、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１巻、１８３９頁、１９９８年；Ａ．ヤマモト、Ｔ．タニグチ、Ｋ．リキュ、Ｔ．ツジ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１巻、１４９６〜１５００年、１９９４年）；および５）生体中の薬の安定性を増すための、ミクロスフィア中への薬の包含または薬の改変（デイヴィド．Ｆ．ラニー、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５９巻、１０５〜１１４頁、２０００年；イアン Ｍ．チャップマン、オウラ Ｈ．ペスコヴィズ、ゲイル・マーフィー、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１９９７年、８２巻、Ｎｏ．１０、３４５５〜３４６３頁）。さらに、ペプチド薬の調製を開発する研究が、多数の方法によって活発に遂行された（Ｚ．アイディン、Ｊ．アクブガ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１３１巻、１０１〜１０３頁、１９９６年；Ｋ．アレデー、Ｅ．ジアナシ、Ｉ．オリエンティおよびＶ．ゼッキ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、１９７７年、１４巻、Ｎｏ．５、５６７〜５７６頁；Ａ．ポーク、Ｂ．アムスデン、Ｋ．ド・ヤオ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、８３巻、Ｎｏ．２、１９９４年、１７８〜１８５頁）。
【０００８】
さらに、そのようなペプチド薬の経口製剤を開発する１つの方法として、リポソームが利用された。この方法は、１）薬がナノスフィア粒子またはミクロスフィア粒子に比較的容易に包含される、および２）リポソームが小腸管粘膜中に容易に吸収される、という利点を持っており、したがって近年広く研究されてきた。そのような方法に関する先行技術は、Ｌｉｐｏｔｅｃ、Ｓ．Ａ．による特許（欧州特許第０８５５１７９号 Ａ２）に開示されている技術を含む。しかしながら、この方法は、リポソームを調製する際に１）水の使用が薬の安定性に関する問題を引き起こす可能性があること、２）粉体の形でのリポソームを調製するために凍結乾燥または乾燥の工程が使用されなければならないこと、３）その水溶液中の安定性が凝集、沈降、融合、酸化反応、リン脂質加水分解などを含むリポソーム自体の特性の故に低いこと、および４）生産工程中にリプロダクティビリティと滅菌を提供することは困難であること、という、リポソームを医薬品として使用する点で数個の欠点を持っている。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
上に述べたような先行技術に関係している問題を解決するために 本発明者らは、ペプチド薬の化学修飾よりはむしろ物理的修飾に重点を置いてペプチド薬の製剤を長期間研究し、試験した。こうして本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明は上記したような先行技術に含まれている問題点を改良する方法を提供する。その方法においては、１）水溶性キトサンを使用して、リポソームの前駆体としてのプロリポソームを調製し、それによって腸管粘膜への吸収を増加させる、２）ｐＨを調整する試剤を使用して、水性の腸液中でのペプチド薬の安定性を増す、３）ペプチド薬がスムーズに腸管粘膜に吸収されるために、吸収促進剤などのような添加物を添加する、ついで４）製品を経口投与にふさわしい製剤に処方する、そして、同時に５）薬が壊れないで腸管に容易に移行し、吸収されるように、該製剤を腸溶性被膜で被覆する。
【００１１】
すなわち、本発明は、粉末の形のリポソームを調製するために凍結乾燥または蒸発の工程（これは、欧州特許第０８５５１７９号で開示されているようなリポソームを用いる経口用製剤を調製する以前の方法において発生する問題を引き起こす可能性がある）を行わないで、短時間に高收率の、リポソームの前駆体としてのプロリポソームを調製することができ、したがって、このプロセスの工程は簡単であり、ペプチド薬の湿気と温度（これが、ペプチド薬の欠点を構成する）に対する安定性が増すという利点を持っており、そして、生体有用性を増すためにプロリポソームを調製する担体としてキトサンを使用する。
【００１２】
具体的には、本発明によれば、１）水溶性キトサンの水溶解性を利用して、水溶性キトサンの上に被覆したペプチド薬を粉末形状で調製するために有機溶媒を使用する、
２）ペプチド薬を胃酸から保護するために、薬に腸溶性被膜をつける、
３）薬が腸に達すると、粉末の形をした粉状プロリポソームが、水溶性キトサンの水に溶解する物理的特性によって腸の中でリポソームとなり、薬は腸粘膜にスムーズに吸収され、同時にフリーの陽イオンをもつキトサンが腸粘膜に結合するという性質を提供する、
４）大概のペプチド薬の水溶液中での不安定性による、経口投与後の腸における薬の容易な分解を防ぐために、ｐＨレベルを制御するための試剤を添加し、大概のペプチド薬が３〜４のｐＨレベルで安定であるということを利用して、腸中の薬の安定度を増加させる、そして
５）ペプチド薬が、細胞間のパラトランスパターンにしたがって腸粘膜に容易に吸収されるために、ペプチド薬が腸粘膜に容易に吸収されるように、吸収促進剤のような添加剤が結合される。
【００１３】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
キトサンは、天然の高分子物質であり、カニ、エビなどのような甲殻類の殻および昆虫の外皮、キノコ、菌類の細胞膜に広く分布しており、それらを含む生体を維持し、保護する役割を演じている多糖類キチンから作られた物質である。
【００１４】
具体的には、キチンは、セルロースと類似している、側鎖のない非常に長い鎖構造をした高分子物質であって、２位の炭素原子が水酸基（−ＯＨ）の代わりにアセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ３）に置換されている。キトサンは、キチンの２位の炭素原子上に存在するアミノ基に結合したアセチル基の脱アセチル化によって生成する物質であり、多数のフリーの陽イオンを持つことができるので、種々の生理活性を持っている。
【００１５】
この理由のために、高品質のキトサンが開発され、食品、化粧品、医薬品および吸収剤、植物細胞の賦活剤、廃水処理用凝集剤などのような種々の産業分野において広く使用されている。特に、キトサンの脂肪を結合する能力は、植物フィブリンのそれよりはるかに優れていて、キトサンは、病気に対する免疫性および耐性を向上させ、さらに生体中で毒性を持たず、したがって、無害であることが、近年明らかにされた。
【００１６】
しかしながら、最近種々の分野で広く使用されてきているキトサンは、水またはアルコールに溶解させることができず、蟻酸、乳酸、酢酸などのような有機酸の水溶液、または希塩酸のような無機酸の水溶液だけに溶解することができるので、それは、製剤の分野の中では限られた適用性を持つ。
【００１７】
こうして、本発明者らは、水溶性のキトサンを使用するペプチド薬（ＪＫ ＦＭ−０１：Ｊａ Ｋｗａｎｇ社）の経口薬剤を調製する研究をし、そこで本発明を完成した。本発明で使用される水溶性キトサンは、１）脱アセチル化度が８５〜９９％である、２）水への溶解度が９９．９９％またはそれ以上である、３）分子量が１００，０００〜５００，０００であって、医薬製品中の賦形剤としておそらく使用することができる、そして、４）それは食品添加物に対する標準的要件を満たす、ということに特徴づけられる。
【００１８】
すなわち、本発明で使用されるキトサンの主要な特徴は、９９．９９％またはそれ以上の水溶解度である。本発明で使用されるキトサンの水溶解度が以前のキトサンのそれより高い理由は、１）キチンをアルカリ性水溶液で処理すること、およびアセチルアミノ基をアミノ基へ加水分解すること（そのあとに多段階式の分離膜法が続く）によって脱アセチル化工程を遂行することで、キトサンを調製するための方法が、キトサンの水溶性を維持しつつ、アセチル化度の８５〜９９％への増大を可能にしていること、２）キトサンは、多段階式分離膜工程を通して９０％またはそれ以上の純度で調製することができること、および、３）キトサンの２位にある炭素原子に対する脱アセチル化工程の間にアミノ基が活性化されるので、キトサンが水分子と接触すると、キトサンの特性を維持しながら、キトサンは容易に水に溶解することができる。
【００１９】
さらに、本発明の特徴は、医薬品および化粧品の分野で使用されてきたリポソームの問題点を取り除くことおよび同時にキトサンの長所を保持しながら、水溶液中に溶解することのできる水溶性キトサンを利用すること、によってペプチド薬の経口薬剤を調製することである。
【００２０】
すなわち、１９６５年にリポソームが、バムガムら （『膨潤したリン脂質の薄膜を通しての１価イオンの拡散』Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１３巻、２３８〜２５２頁、１９６５年）によって単層または多層リン脂質二重膜閉鎖小胞として報告されて以来、過去数十年の間、リポソームは、１）表面電荷、２）サイズ、および３）リポソームの使用目的および最終使用に適合するための脂質含量、を加減することによって、それを調製する多数の方法にしたがって調製され、食品、化粧品および医薬品に使用されてきた。
【００２１】
特に、近年、リポソームは、医薬品分野において、１）薬の持続的活性および目標への誘導、２）急性毒性の緩和および免疫反応の緩和または増進、３）薬の安定化、ならびに４）投薬処方の変更、という目的のために種々の薬剤を開発するために使用されている。しかしながら、薬剤の開発のために利用されてきたリポソームは、１）凝集、２）沈降、３）融合、４）酸化反応、および５）リン脂質の加水分解、を含むリポソーム自体の特性の故に、その水溶液中の安定度が低く、６）大量生産のためのプロセス中の滅菌性およびリプロダクティビリティの効率は低い、という医薬品において効果的に使用されるには不十分な欠点を持っている。
【００２２】
上の理由のために、本発明者らは、そのような以前のリポソーム製剤に含まれている問題を除くために長期間広範囲にわたって研究し、その結果、驚くべきことに、担体として水溶性キトサンを使用してリポソームの前駆体として固体粉末形状のプロリポソームを調製することによって以前のリポソーム調製の問題すべてを取り除くことができることを発見した。こうして我々は本発明を完成した。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、水溶性のキトサンを使用することによって調製されるペプチド薬のプロリポソームを提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、従来の製薬方法にしたがって水溶性のキトサンを使用して作られたペプチド薬のプロリポソームから処方される経口薬剤を提供することである。
【００２５】
本発明の更なる目的は、従来の製薬方法にしたがって水溶性キトサンを使用して作られたペプチド薬のプロリポソームから処方される経口薬剤を調製するプロセスを提供することである。
【００２６】
一般に、プロリポソームを調製するための担体は、次の特性を持たなければならない：１）プロリポソームからリポソームに変換されるためには、それが水に溶かされるので、それは水溶性でなければならない、および２）プロセスの過程において使用される有機溶媒へのその溶解度は低くなければならない。本発明において使用される水溶性のキトサンは上記したようにプロリポソームの担体特性を持つだけでなく、薬の経口投与の場合に、キトサンが腸内で水の作用によって溶解するとき、脂質と結合するためにキトサン自身に含まれているフリーの陽イオンの働きによって引き起こされる接着特性を向上させる効果のせいで、生体中でペプチド薬の吸収を増加させることができる。
【００２７】
本発明で使用することができるペプチド薬の典型的な例は、アプロチニン、ブセレリン、カルシトニン、デスモプレッシン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、免疫グロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、グリコプロテインなどを含む。さらに、もちろん、他のペプチド薬および蛋白質薬もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２８】
本発明にしたがってペプチド薬を含むプロリポソームを調製することに使用されるリン脂質は、リポソームの調製のために従来から使用されている製薬上許容できるリン脂質、たとえばホスファチジル−ＤＬ−グリセリン−ジミリストイル、Ｌ−α卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン（レシチン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール、ステアリルアミン、ジアセチルホスフェート、ホスファチジルセリン、メトキシポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどを含む。
【００２９】
アミノ酸から成るペプチド薬は、一般に、それらの構造の中にアスパラギン類またはグルタミン残基を含み、これらの残基は、アミド分解、β−脱離、ジスルフィド交換、ラセミ化、酸化反応などのような反応を起こし、それらは、最終的にペプチド薬としての活性の喪失を起こす構造上の変性を容易に誘発する可能性がある。そのような問題を防ぐための方法として、本発明は、本発明による経口薬剤が、腸内のペプチド薬を安定に保持するために、腸内で容易に溶解するとき、アスパラギン類およびグルタミン残基が化学反応を引き起こさないｐＨ３〜４にｐＨレベルを調整するための試剤を使用する。
【００３０】
本発明でｐＨレベルを制御するための試剤としては、医薬品において経口投与のために一般に使用することができるどんな試剤でも使用することができ、その典型的な例は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、アジピン酸、リン酸１水素ナトリウムなどを含む。ｐＨレベルを調整するための試剤は、総量に基づいて１．０％〜５０％の量が使用される。
【００３１】
本発明のもう一つの特徴は、薬が経口経路を通して投与されるとき、腸管の上皮細胞になんら損傷を起こさない天然物または食品に由来する吸収促進剤を使用することによって、小腸へのペプチド薬の吸収を促進することである。本発明において使用することができる吸収促進剤は、カプリン酸、オレイン酸などのような脂肪酸またはその塩、胆汁酸の塩としてのコール酸塩、デオキシコール酸、サリチル酸塩ベースの吸収促進剤、またはモノグリセリドベースの吸収促進剤を含む。本発明の実施例の部で一般に使用される吸収促進剤は、望ましくはコール酸ベースの塩としてのデオキシコレートであって、望ましくは、０．１〜１０％の量が使用される。
【００３２】
（本発明を遂行するための態様）
本発明は、以下の実施例と実験によってさらに具体的に説明される。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例および実験によって制限されない。
【００３３】
（実施例１）
プロリポソームの調製（サケカルシトニンを調製する実施例）
篩を通した水溶性キトサン粉末（１０６μｍ〜３００μｍ）４ｇを１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレータに載せ、減圧下３０分間室温で乾燥させた。リン脂質としての卵レシチン２６７ｍｇをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、ついでサケカルシトニン２７ｍｇの溶液（前もってメタノール１０ｍｌに溶解しておいた）と混合した。
【００３４】
水溶性キトサンの入った１００ｍｌの丸底フラスコの温度を２０〜３０℃に維持している間に、有機溶媒に溶かしたリポソーム成分の混合液の一定量（約１ｍｌ）を添加し、ついで、ロータリーエバポレータの回転を１２０〜１５０ ｒｐｍに保った。水溶性のキトサンが完全に乾燥して自由流動の状態になると、再び有機溶媒の混合液を加えて、繰り返し皮膜を塗った。最終的な溶液を添加し、乾燥し、ついで、有機溶媒を除去するために生成物を２４時間凍結乾燥機中で再乾燥させた（収率：９５％以上）。
【００３５】
（実施例２）
プロリポソームの調製（デスモプレシンを調製する実施例）
篩を通した水溶性キトサン粉末（１０６μｍ〜３００μｍ）３ｇを１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレータに載せて、室温、減圧下で３０分間乾燥した。リン脂質としてのホスファチジル−ＤＬ−グリセロール−ジミリストイル１６０ｍｇを、クロロホルム２４ｍｌに溶解し、ついでデスモプレッシン２０ｍｇの溶液（前もってエタノール１２ｍｌに溶解した）と混合した。
【００３６】
水溶性キトサンの入った１００ｍｌの丸底フラスコの内温を２０〜３０℃に維持している間に、有機溶媒に溶解したリポソーム成分の混合液の一定量（約１ｍｌ）を添加し、ついで、ロータリーエバポレータの回転を１２０〜１５０ ｒｐｍに保った。水溶性のキトサンが完全に乾燥して自由流動の状態になると、有機溶媒の混合液を再び加え、繰り返し皮膜を塗った。
最終溶液を添加し、乾燥し、ついで生成物を、有機溶媒を除去するために２４時間冷凍乾燥機で再乾燥した（収率：９６％以上）。
【００３７】
（実施例３〜３３）
アプロチニン、ブセレリン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレッシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、免疫グロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびグリコプロテインから成る群から選択した個々の薬品を、個々のペプチド薬を含む対応するプロリポソームを調製するために、実施例１または２に類似した方法にしたがって、使用した。
【００３８】
（実験１）
プロリポソーム中への薬の包含の確認（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ確認）
サケカルシトニンを含むプロリポソーム中への薬の包含を確かめるために、薬を含まないプロリポソームと薬を含むプロリポソームを、超低温電子顕微鏡によって比較観察した。試料の前処理のために、まず、液体試料（プロリポソームから水和させたリポソーム）の１滴（約３μｌ）を直径１ｃｍの円盤状試料テーブルに落とし、超低温−伝達システムの窒素流通チャンバー（ＣＴ １５００ Ｃｒｙｏｔｒａｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、英国）に液体窒素を充満させた。ついで、その試料をチャンバーにすばやく入れ、減圧下で１分間固化させた。
【００３９】
次に、試料を−１７０℃に調整された極低温室へ移し、減圧状態を確認した。すると、冷却した試料は自発的に壊れ、裂けた。その壊れた試料を、超低温−伝達システムに結合している走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−５４１０ＬＶ、日本電子（株）、日本）の試料テーブルに移し、温度を−７０℃に調整し、その温度で試料を５分間保持して試料表面から水分を蒸発させた。
【００４０】
昇華の完了後、試料を再び極低温室へ移し、ついで金被覆にかけた。２０ｋＶの加速電圧の下で、試料の壊れて裂けた断面を観察して、生成したままのリポソームの形および薬の包含を確認した。その写真を図１に示す。
【００４１】
（実験２）
プロリポソームの溶解の観察
水溶性のキトサンを使用して生成したプロリポソームの水和過程を光学顕微鏡によって観察するために、プロリポソーム顆粒を顕微鏡のスライド上にマウントし、焦点を調節した。４００倍の倍率で、１滴の水を顆粒の上に落とし、１分後に水和過程を観察して水中でのプロリポソームの溶解過程を確認した。その写真を図２に示す。
【００４２】
（実験３）
生成したリポソームの粒子径の分析
実験例１で調製した水溶性キトサンプロリポソーム５ｍｇに蒸留水５ｍｌを添加し、ボルテックスミキサーで振盪してプロリポソームを溶解し、ついでそれを３０分間水和した。このように調製したリポソームの粒径および分布を粒径分析器によって測定した。その結果を図３にグラフとして示す。
【００４３】
（実験４）
プロリポソーム内のサケカルシトニンの定量分析および安定性
安定性を確認し、定量分析を遂行するために、サケカルシトニン約５μｇに対応する調製されたプロリポソームの重量を正確に測り、メタノール３００μｌに溶解し、ついでボルテックスミキサーを用いて完全に溶解した。０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、４０μｌのアリコートをＨＰＬＣにかけ、プロリポソーム中のサケカルシトニン含量を定量した。室温での安定度および冷凍庫内の安定度の測定から得られた結果を図４に示す。薬の含量を分析するために利用したＨＰＬＣの条件は、次の通りである：
ＨＰＬＣ条件：カラム−Ｃ１８（Ｓｕｃｅｌｐｏ社）
流速−１ｍｌ／分
溶媒Ａ−０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ−０．１％トリフルオロ酢酸／水
【００４４】
（実験５）
経口薬剤（錠剤）の調製およびエンテリックコーティング
錠剤は、韓国薬局方の「調製のための一般的規定」の部で定められている錠剤を調製する一般的な方法による湿式プロセスではなく、乾式プロセスの方法における直接圧縮成形によって調製した。本発明の効果を検討するために調製された個々の試料の組成は、以下の表１に示し、直接圧縮成形によって調製された個々の試料は、腸溶性被膜をつけるために酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）によって被覆した。被覆の結果は、韓国薬局方で定められている一般的試験法を用いて、人工胃液（溶液１）および人工腸液（溶液２）中での分解試験を遂行することによって確認し、次の表２に記載する。
【００４５】
【表１】
【００４６】
【表２】
【００４７】
本発明の効果を確かめるために、インビボおよびインビトロ両方の試験を行うために、試料を使用した。
【００４８】
（実験６）
細胞を使用するインビトロ試験
（１）完全培地の調製
ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）１Ｌ×２、重炭酸ナトリウム７．４ｇ、およびＨＥＰＥＳ２．６ｇを、前もって滅菌し、冷却した蒸留水２Ｌに添加し、ついで、プレート撹拌機中で約１〜１．５時間撹拌した。
【００４９】
撹拌後、ｐＨメータを用いて、ｐＨレベルを１Ｎ塩酸で７．４に調節した。溶液は、フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｆｉｌｔｅｒ ４３００１５）を通して濾過し、ついで５０ｍｌのピペットを用いて、５００ｍｌの瓶に、各瓶に４５０ｍｌずつ分配した。
【００５０】
その溶液４５０ｍｌの入った５００ｍｌの瓶に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５０ｍｌ、ストレプトマイシン５ｍｌおよびｍｅｍ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）５ｍｌを添加した。調製した完全培地が汚染されているかどうかを確認するために、２５ｍｌのＴ−フラスコに完全培地約６ｍｌを入れ、顕微鏡による観察の後、汚染を確認するためにインキュベータ中で１日以上インキュベーションした。
【００５１】
（２）ＣａＣＯ２細胞の解凍
調製し、ついで冷蔵庫中に保存した完全培地を、３７℃の水浴で約２０分間暖め、ついで５ｍｌのピペットを使用して４、５回混合した。ついで、その培地５ｍｌを１５ｍｌの遠心管に入れた。ニトロタンクから細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７、ロット９４４４９５）を取り出し、瓶のキャップを少し開いて３７℃の水浴中で解凍した。細胞系が完全に解凍されたことを確認した後に、細胞系を保存している瓶のキャップを開いて、５ｍｌのピペットで５、６回混合した。瓶の全含量は、上の１５ｍｌの遠心管に入れた。
【００５２】
１５ｍｌの遠心管を１０００ｒｐｍの遠心機を用いて７分間遠心して上清を分離し、それを取り出し除去した。そこへ培地１ｍｌを加えて、ついでピペットで４、５回混合し細胞を破壊した。１５ｍｌのコニカルチューブに入っている溶液の全量を２５ｍｌのＴ−フラスコに移し、ついでそれをインキュベータ中で保存した。
【００５３】
（３）養生している細胞培地の変化
インキュベータ中に保存された２５ｍｌのＴ−フラスコをインキュベータから取出し、フラスコの底にある培地を除去して、完全培地（前もって調整し、冷蔵庫に保存してあった）を３７℃の水浴で２０分間加温することによって置き換え、ついで、培地のアリコート５ｍｌを、ピペットをフラスコの底に接触させないように注意しながら２５ｍｌのＴ−フラスコに入れた。
【００５４】
（４）継代培養
トリプシンＥＤＴＡ容器およびフリーの培地、完全培地（冷蔵庫に保存されていた）を、３７℃の水浴で約２０分間加温し、ついで、インキュベータに保存されていた２５ｍｌのＴ−フラスコに入っていた培地を除去し、トリプシンＥＤＴＡ２ｍｌを２５ｍｌのＴ−フラスコに入れた。
【００５５】
トリプシンＥＤＴＡが均一に分散するようにし、ついでそのフラスコを３７℃の水浴中で４分間保った。完全培地１０ｍｌを２５ｍｌのＴ−フラスコに添加し、そのフラスコを振盪して、細胞を分離した。分離した溶液をピペットを用いて１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去した。完全培地２ｍｌをＴ−フラスコに加えて、細胞が十分ばらばらになるようにし、ついでインキュベータ中で再インキュベーションした。（この実験では、４０回の継代を越える細胞を使用した。）
【００５６】
（５）トランスウェル膜のコラーゲンによる被覆
滅菌した０．１％酢酸１０ｍｌをラット尾部コラーゲン２５ｍｇに添加し、マグネチックバーを入れて３〜５時間攪拌することによってそれを溶解した。得られた溶液を、１：１．５の割合の６０％エタノール溶液で希釈し、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ついで、コラーゲン溶液５０μｌをトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３４０１）の上部の膜に均一に塗布し、キャップを開いたまま層流の中でＵＶ光のもとで４〜５時間放置することによって乾燥させた。
【００５７】
（６）トランスウェルプレートに細胞を播種すること
完全な培地の０．５ ｍｌと１．５ｍｌを、それぞれ、被覆したトランスウェルの上部コンパートメントと下部コンパートメントに導入し、インキュベータの中で１５分間インキュベーションした。ついで、培地を除去し、完全培地１．５ｍｌを、再被覆したトランスウェルの下部コンパートメントに再度入れた。継代培養の下で４０回の継代を越える細胞を、２．５〜３×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈し、ついで被覆したトランスウェルの上部コンパートメントに導入し、実験に使用するために２〜３週間インキュベーションした。
【００５８】
（７）ＣａＣＯ２細胞単一層の特性の確認
トランスウェル上への細胞の接種から２〜３週後に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ミリセル−ＥＲＳ抵抗システム）によって経上皮電気抵抗（ＴＥＥ）を測定して２５０Ωｃｍ２またはそれ以上の抵抗値を確認した。これは、細胞の単一層がよく確立していることを意味する。Ｃｌ４−マンニトールを使用して透過性実験を行ったとき、（＜レシーバー ｄｐｍ／＜ドナー ｄｐｍ＞）／ｈｒ／ｃｍ２は、０．４％を下回った。これは、細胞単一層がよく確立していたことを意味する。実験の特定の含量は、次の通りである。
使用した薬濃度：５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を持つＣｌ４−マンニトール２〜１０μＭ
Ｃ１４−マンニトールの定量：試料１００μｌを採取し、ＬＳＣバイアルに添加し、そこへＬＳＣ反応混液２ｍｌを添加し、１０秒間の攪拌後、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）によってｄｐｍ単位でＣ１４−マンニトールの含量を測定した。
【００５９】
（８）薬の透過試験（サルカトニンの場合）
トランスウェルの上部コンパートメントに存在する、調べた培地を、ピペットを使用して除去した。上の実施例１で調製したプロリポソームをトランスバッファーに溶解して薬の濃度（４．０μｇ／ｍｌ）にし、ついで、トランスウェルの上部コンパートメントに導入し、それを、３７℃の振盪水浴中８５ｒｐｍでゆっくり振盪しながら、薬の添加後１５分間隔で、フラッシュバッファーの入っている新しいウェルへ移した。
【００６０】
薬は、トランスウェルのドナー部分のウェルからサンプリングし、ついで、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡキット（Ｐｅｎ．Ｌａｂ．）によってサルカトニンに関する定量分析を行った。結果を図５に示す。
【００６１】
（実験７）
ラットを使用するインビボ試験
体重２５０ｇ〜３００ｇのＳＤ雄ラット（１群につきラット５匹）を、実験開始の１日前からは飲料水だけを与え、かつ実験環境に適応させた。カニューレを大腿静脈および動脈に挿入するために、麻酔薬としてのケタミンとｌｕｍｐｕｎとの１：４の比率の混合物４００μｌを筋内内に注射した、ついで、ラットを手術台に固定し、脚の大腿静脈および動脈を、鋏とピンセットを使用して見つけ、カニューレを挿入した。
【００６２】
カニューレ挿入後、血液採取を確認するために、シリンジを用いて静脈と動脈から血液を吸引した。ついで、処方１、２、３、４または５の試料を、経口用カプセルゾンデを使用してラットに経口的に投与し、一定時間の間隔で、血液５００μｌを大腿動脈から採集した。血液サンプルを採集し、その間、対応する量の食塩水を大腿静脈に注入した。
【００６３】
採集した血液は、１０，０００ｒｐｍの遠心機で１０分間遠心し、上清を分離し、そこから薬の含量を、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡキット（Ｐｅｎ． Ｌａｂ．）を使用して定量した。
【００６４】
別個に、お互いの生体有用性の増加を比較するために、経口投与した薬の同量を大腿静脈に注入し、その血液を、各処方の場合の血液採集の方法と類似した手法にしたがって前処理した。ついで、薬を定量して、生体有用性を計算した。それを次の表３に記す。
【００６５】
【表３】
【００６６】
（産業上の適用性）
こうして、本発明は、１）水溶性のキトサンを使用して、リポソームの先駆物質としてのプロリポソームを調製し、それによって腸管粘膜への吸収を増加させる、２）ｐＨ調整試剤を使用して水性の腸液中のペプチド薬の安定性を上げる、３）ペプチド薬がスムーズに腸管粘膜に吸収されるために、吸収促進剤などのような添加剤を添加する、ついで４）経口投与に適した製剤に製品を処方する、そして、同時に５）薬が分解しないで腸に移行し、吸収されるように、製剤を腸溶性被膜で被覆する、方法を提供する。
【００６７】
すなわち、本発明は、欧州特許第０８５５１７９号に開示されているようなリポソームを用いる経口用製剤を調製する以前の方法において起こる問題を引き起こす可能性がある、粉末の形のリポソームを調製するために凍結乾燥または蒸発の工程を行わないで、短時間に高收率のプロリポソーム（リポソームの前駆体として）を調製することができ、したがって、該プロセスの工程は簡単であり、ペプチド薬の湿気と温度（これがペプチド薬の欠点を構成する）に対する安定性が増し、そして、キトサンが生体有用性を増すためにプロリポソームを調製する担体として使用される、といういくつかの利点を持っている。
【図面の簡単な説明】
【図１】サケカルシトニンと水溶性キトサンから作られたプロリポソームおよび薬剤の含有物の形を示す写真である。
【図２】水溶性のキトサンを使用してプロリポソームの水和過程の観察から得られた、水への溶解のプロセスを示す顕微鏡による写真である。ここで、図２ａは、プロリポソーム粉末を示す写真であり、図２ｂは、プロリポソームからリポソームの生成を示す写真である。
【図３】プロリポソームの水和から生成したリポソームの粒度および分散を示すグラフである。
【図４】時間経過における、本発明による一態様としてのサケカルシトニンのプロリポソーム中のサケカルシトニン含量の変化を示すグラフである。
【図５】本発明による一態様としての、サケカルシトニンのプロリポソームを含む種々の処方の薬物透過性を示すグラフである。[0001]
(Technical field)
The present invention relates to an oral administration preparation of a peptide or protein drug (hereinafter referred to as “peptide drug”) and a method for producing the same.
[0002]
(Background technology)
With the rapid development of genetic recombination technology and solid-phase peptide synthesis technology, the types of peptide drugs used in the clinical field have increased rapidly in the 1990s and have been accelerated due to the remarkable development of biotechnology. , About 100 or more drugs have been developed and are currently commercialized worldwide.
[0003]
However, most of the peptide drugs currently developed and commercialized are in the form of injectables, and therefore 1) that injection into a patient is painful, and 2) it is necessary to store it in a refrigerator. And 3) that the patient has to go to the hospital to get the medicine. Thus, there is an urgent need to develop oral drugs for peptide drugs, but such development is at the first stage and has provided only insignificant results to date.
[0004]
If the above disadvantages involved in peptide drug injection can be overcome by oral drugs, 1) the peptide drug can be formulated in a dosage form that is most suitable for the patient, and 2) the stability of the formulation is increased. The conditions of production, sales and consumption, such as distribution and establishment of shelf life, can be changed more conveniently and advantageously compared to conventional dosage forms; and 3) the market for oral drugs preferred by patients has been Is expected to rapidly replace the drug market. Therefore, technical research for developing oral drugs has been actively conducted.
[0005]
In general, the technical problems in developing oral drugs for peptide drugs are discussed in well-known articles (Raymond M. Rayleigh, Rommel Domingo and Jassville Sandu, Drug Delivery Systems, 32 (4), 313-313). Joseph A. Fix, Pharmaceutical Research, Volume 13, No. 12, 1996; Amin P. Sayani and E. W. Cheng, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 13 and 85. Jane PF Bai, Li-Lin Chan and Jan-Hua Guo, Critical Reviews in Therapeutic Drug Car. rier Systems, 12 (4), 339-371, 1995).
[0006]
The major problems to be solved in developing oral drugs for such peptide drugs are: 1) low absorption in the intestinal tract, 2) loss of efficacy by proteinases present in the small intestine, and 3) in vivo after absorption. Difficulty maintaining efficacy due to short half-life. Therefore, research has focused on such issues.
[0007]
Among these problems, firstly, the following methods have been widely used to solve the low absorption in the intestinal tract: 1) In nanosphere particles or microsphere particles to increase the penetration of drugs through biological membranes. (Istvan Tote, International Journal of Pharmaceutical, 183, 1999, pp. 51-55; E. Björk, U. Issaxon, P. Edman, J. Drug Targeting 2, pp. 501-507). Shinji Sakuma, Norio Suzuki, International Journal of Pharmaceutical, 149, 1997, pp. 93-106); 2) Method of using a drug together with an absorption enhancer (Patrick J. Shinko, Yong). -Hea Lee, J. Scott-Moncreiff, Z. Xiao, J. Pharm. Sci. 83, 1465-1469, 1994; E. Harmaceutical Research, Vol. 16, No. 4, 1999, pp. 527-533; A. Hosney, NM Kang, Drug Level. Ind. Pharm., 21, 1583-1589, 1995; Isao Sasaki, Hideyuki Tozaki, Biol. Pharm. Bull., 22, (6) Ansomi C. Chao, Joseph V. Nguyen, International Journal of Pharmaceutical, 191, 1999, pp. 15-24; 3) Method of modifying peptide structure (Deven Shah, Wei Chang, own of Pharmaceutical Sciences, Vol. 85, No. 12, 1996, pp. 1306-1309; Kazunori Iwanaga, Satoshi Ono, Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. , John P. Malkinson, J. Med. Chem., 1999, 42, 4010-4013); 4) a method of modifying the structure of a drug or using a drug together with an enzyme inhibitor (P. A. Yamamoto, T. Taniguchi, K. Ricu, T. Tsuji, Pharm. Res., 11: Bühlneyer, A. Kaseri, W. Hueller, J. Med. , 1496-1500, 1994); and 5) Inclusion or modification of drugs in microspheres to increase the stability of drugs in living organisms (David. F. Lanie, Biochemical Pharmacology, 59, 105-114, 2000; Ian M. Chapman, Oura H. Peskoviz, Gail Murphy, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 1997, Vol. 10, 3455-3463). In addition, studies to develop peptide drug preparations have been actively pursued by a number of methods (Z. Aydin, J. Akbuga, International Journal of Pharmaceutics, 131, 101-103, 1996; K. Aredey, A. Pork, B. Amsden, K. de Yao, Journal of Pharmaceutical Science, E. Gianasi, I. Orienti and V. Zecchi, J. Microcapsulation, 1977, Vol. 83, No. 2, 1994, 178-185).
[0008]
In addition, liposomes have been utilized as one way to develop oral formulations of such peptide drugs. This method has the advantage that 1) the drug is relatively easily included in the nanosphere or microsphere particles, and 2) the liposomes are easily absorbed into the small intestinal mucosa, and thus have become widely used in recent years. Has been studied. Prior art on such methods is disclosed in Lipotec, S .; A. (European Patent No. 0855179 A2). However, this method is not suitable for preparing liposomes, 1) the use of water can cause problems with drug stability when preparing liposomes, and 2) lyophilization or drying to prepare liposomes in powder form. 3) that its stability in aqueous solution is low due to the properties of the liposomes themselves, including aggregation, sedimentation, fusion, oxidation reactions, phospholipid hydrolysis, and 4) during the production process. It has several disadvantages in using liposomes as pharmaceuticals, in that it is difficult to provide reproductability and sterilization.
[0009]
(Detailed description of the invention)
To solve the problems associated with the prior art as described above, we have studied the formulation of peptide drugs for a long time with an emphasis on physical rather than chemical modifications of peptide drugs. Tested. Thus, the present invention has been completed.
[0010]
Accordingly, the present invention provides a method that ameliorates the problems involved in the prior art as described above. In that method, 1) using water-soluble chitosan to prepare proliposomes as precursors of liposomes, thereby increasing absorption into the intestinal mucosa, 2) using agents to adjust pH, Increases the stability of peptide drugs in aqueous intestinal fluids 3) Adds additives such as absorption enhancers so that peptide drugs can be smoothly absorbed into intestinal mucosa, and 4) Orally administers product 5) The drug is formulated into a suitable formulation, and at the same time, 5) the formulation is coated with an enteric coating so that the drug readily migrates into the intestinal tract without breaking and is absorbed.
[0011]
That is, the present invention relates to a lyophilization or evaporation step for preparing liposomes in powder form, which is a method prior to preparing oral formulations using liposomes as disclosed in EP 0855179. , Which can cause problems that occur in), can be prepared in a short time, high yield, proliposomes as precursors of liposomes, thus the steps of this process are simple, It has the advantage of increasing the stability of peptide drugs against humidity and temperature, which constitutes a disadvantage of peptide drugs, and uses chitosan as a carrier for preparing proliposomes to increase bioavailability.
[0012]
Specifically, according to the present invention, 1) using an organic solvent to prepare a peptide drug coated on water-soluble chitosan in a powder form by utilizing the water solubility of water-soluble chitosan,
2) apply an enteric coating to the peptide drug to protect it from gastric acid,
3) When the drug reaches the intestine, powdered proliposomes in powder form become liposomes in the intestine due to the physical properties of water-soluble chitosan in water, and the drug is smoothly absorbed into the intestinal mucosa, Provides the property that chitosan with free cations binds to intestinal mucosa,
4) Add reagents to control pH levels to prevent easy degradation of the drug in the intestine after oral administration due to instability of most peptide drugs in aqueous solution, and most peptide drugs have 3-4 Increase the stability of the drug in the intestine by taking advantage of its stability at pH levels of
5) Since the peptide drug is easily absorbed into the intestinal mucosa according to the paratrans pattern between cells, an additive such as an absorption enhancer is bound so that the peptide drug is easily absorbed into the intestinal mucosa. You.
[0013]
Hereinafter, the present invention will be described more specifically.
Chitosan is a natural macromolecular substance, widely distributed in shells of crustaceans such as crabs and shrimps, and in the outer membrane of insects, mushrooms and fungi, and plays a role in maintaining and protecting living organisms containing them. Is a substance made from the polysaccharide chitin.
[0014]
Specifically, chitin is a macromolecular substance having a very long chain structure without side chains, similar to cellulose, in which the carbon atom at position 2 is an acetylamino group instead of a hydroxyl group (-OH). (-NHCOCH 3 ). Chitosan is a substance produced by deacetylation of an acetyl group bonded to an amino group present on the carbon atom at position 2 of chitin, and can have many free cations. have.
[0015]
For this reason, high quality chitosan has been developed and widely used in various industrial fields such as foods, cosmetics, pharmaceuticals and absorbents, activators of plant cells, flocculants for wastewater treatment and the like. In particular, the ability of chitosan to bind fat is much better than that of plant fibrin, which improves immunity and resistance to disease, and furthermore is non-toxic and therefore harmless in vivo Was recently revealed.
[0016]
However, chitosan, which has recently been widely used in various fields, cannot be dissolved in water or alcohol, and is an aqueous solution of an organic acid such as formic acid, lactic acid, or acetic acid, or an aqueous solution of an inorganic acid such as diluted hydrochloric acid. It has limited applicability within the field of formulation as it can only be dissolved.
[0017]
Thus, the present inventors conducted research on preparing an oral drug of a peptide drug (JK FM-01: Ja Kwang) using water-soluble chitosan, and completed the present invention. The water-soluble chitosan used in the present invention has 1) a degree of deacetylation of 85 to 99%, 2) a solubility in water of 99.99% or more, and 3) a molecular weight of 100,000 to 100%. 500,000, possibly being used as an excipient in pharmaceutical products, and 4) it is characterized by meeting standard requirements for food additives.
[0018]
That is, a key feature of chitosan used in the present invention is its water solubility of 99.99% or more. The aqueous solubility of chitosan used in the present invention is higher than that of previous chitosan because 1) treating chitin with an aqueous alkaline solution and hydrolyzing acetylamino groups to amino groups (then multi-step) The method for preparing chitosan allows the degree of acetylation to be increased to 85-99% while maintaining the water solubility of chitosan by performing the deacetylation step according to the following separation membrane method. 2) that chitosan can be prepared in 90% or higher purity through a multi-stage separation membrane process, and 3) during the deacetylation step for the carbon atom at position 2 of chitosan. When the chitosan comes into contact with water molecules, the chitosan can be easily dissolved in water while maintaining the properties of chitosan.
[0019]
In addition, a feature of the present invention is to eliminate the problems of liposomes used in the pharmaceutical and cosmetic fields and to utilize water-soluble chitosan that can be dissolved in aqueous solution while retaining the advantages of chitosan. , To prepare an oral drug drug.
[0020]
That is, in 1965, liposomes were transformed into mono- or multi-lamellar phospholipids by Bamgam et al. ("Diffusion of monovalent ions through thin films of swollen phospholipids", J. Mol. Biol. Over the past few decades, since reported as lipid bilayer closed vesicles, liposomes have been: 1) surface charge, 2) size, and 3) lipid content to suit the intended use and end use of the liposome, It has been prepared according to a number of methods of preparing it and has been used in foods, cosmetics and pharmaceuticals.
[0021]
In particular, in recent years, liposomes have recently been used in the pharmaceutical field to: 1) induce sustained activity and target drugs; 2) reduce acute toxicity and alleviate or enhance immune responses; 3) stabilize drugs; Has been used to develop various drugs for the purpose of altering the drug. However, liposomes that have been utilized for drug development have been characterized by their own properties, including 1) aggregation, 2) sedimentation, 3) fusion, 4) oxidation, and 5) hydrolysis of phospholipids. Its poor stability in aqueous solution and 6) poor sterility and reproductivity in the process for mass production, which are insufficient for effective use in pharmaceuticals. .
[0022]
For the above reasons, we have studied extensively over a long period of time to eliminate the problems involved in such previous liposome formulations, and as a result, surprisingly, water-soluble chitosan as a carrier It has been found that the preparation of solid liposomes as proliposomes as precursors of liposomes can eliminate all previous liposome preparation problems. Thus, we have completed the present invention.
[0023]
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a peptide drug proliposome prepared by using water-soluble chitosan.
[0024]
It is another object of the present invention to provide an oral drug formulated from a peptide drug proliposome made using water-soluble chitosan according to conventional pharmaceutical methods.
[0025]
It is a further object of the present invention to provide a process for preparing oral drugs formulated from peptide drug proliposomes made using water-soluble chitosan according to conventional pharmaceutical methods.
[0026]
In general, the carrier for preparing proliposomes must have the following properties: 1) In order to be converted from proliposomes to liposomes, it must be water soluble because it is dissolved in water And 2) its solubility in the organic solvents used in the course of the process must be low. The water-soluble chitosan used in the present invention not only has the carrier properties of a proliposome as described above, but also binds to lipids when chitosan is dissolved in the intestine by the action of water in the case of oral administration of drugs. The effect of the free cations contained in chitosan itself to enhance the adhesive properties of the chitosan itself can increase the absorption of peptide drugs in living organisms.
[0027]
Typical examples of peptide drugs that can be used in the present invention include aprotinin, buserelin, calcitonin, desmopressin, elcatonin, glucagon, gonadotropin, gonadrelin, goserelin, hirudin, leuprolein, lipresin, nafarelin, octreotide, oxytocin, Includes protirelin, sarcatonin, thermorelin, somatostatin, somatropin, terlipressin, tetracosacrine, thymopentin, triptrelin, vasopressin, albumin, insulin, interferon, immunoglobulin, GM-CSF, G-CSF, glycoprotein, and the like. In addition, of course, other peptide and protein drugs are also included within the scope of the present invention.
[0028]
Phospholipids used in preparing proliposomes containing peptide drugs according to the present invention may be pharmaceutically acceptable phospholipids conventionally used for preparing liposomes, such as phosphatidyl-DL-glycerin-dimyristoyl. , L-α egg phosphatidylcholine, soybean phosphatidylcholine (lecithin), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC), cholesterol, stearylamine, diacetylphosphate, phosphatidylserine, methoxypolyethylene glycol distearoylphosphatidylethanolamine and the like.
[0029]
Peptide drugs consisting of amino acids generally contain asparagines or glutamine residues in their structure, which residues may be used in such deamidation, β-elimination, disulfide exchange, racemization, oxidation reactions, etc. Reactions that can easily trigger structural alterations that eventually result in a loss of activity as a peptide drug. As a method to prevent such a problem, the present invention relates to the invention that the oral drug according to the present invention, when easily dissolved in the intestine in order to stably retain the peptide drug in the intestine, asparagine and glutamine residues. Use reagents to adjust the pH level to pH 3-4, which does not cause a chemical reaction.
[0030]
As the agent for controlling the pH level in the present invention, any agent generally available for oral administration in pharmaceuticals can be used, typical examples of which are citric acid, sodium citrate, Contains adipic acid, sodium monohydrogen phosphate and the like. Reagents for adjusting the pH level are used in amounts of 1.0% to 50%, based on the total amount.
[0031]
Another feature of the present invention is that, when the drug is administered via the oral route, the use of a natural or food derived absorption enhancer that does not cause any damage to the intestinal epithelial cells allows the peptide drug to enter the small intestine. Is to promote absorption. Absorption enhancers that can be used in the present invention include fatty acids such as capric acid, oleic acid or salts thereof, cholate as a salt of bile acid, deoxycholic acid, salicylate-based absorption enhancers, or Includes a monoglyceride based absorption enhancer. The absorption enhancer commonly used in the Examples section of the present invention is desoxycholate, preferably as a cholic acid based salt, preferably in an amount of 0.1-10%.
[0032]
(Aspects for carrying out the present invention)
The present invention is more specifically illustrated by the following examples and experiments. However, the scope of the present invention is not limited by these examples and experiments.
[0033]
(Example 1)
Preparation of proliposome (Example of preparing salmon calcitonin)
4 g of a water-soluble chitosan powder (106 μm to 300 μm) passed through a sieve was placed in a 100 ml round bottom flask, placed on a rotary evaporator, and dried at room temperature under reduced pressure for 30 minutes. 267 mg of egg lecithin as a phospholipid was dissolved in 30 ml of chloroform, and then mixed with a solution of 27 mg of salmon calcitonin (previously dissolved in 10 ml of methanol).
[0034]
While maintaining the temperature of the 100 ml round bottom flask containing the water-soluble chitosan at 20-30 ° C., an aliquot (about 1 ml) of the mixture of the liposome components dissolved in the organic solvent is added, and The rotation of the evaporator was kept at 120-150 rpm. When the water-soluble chitosan was completely dried and became free flowing, a mixed solution of an organic solvent was added again, and the film was repeatedly applied. The final solution was added and dried, and the product was re-dried in a lyophilizer for 24 hours to remove organic solvents (yield:> 95%).
[0035]
(Example 2)
Preparation of proliposome (Example of preparing desmopressin)
3 g of the water-soluble chitosan powder (106 μm to 300 μm) passed through the sieve was placed in a 100 ml round-bottom flask, placed on a rotary evaporator, and dried at room temperature under reduced pressure for 30 minutes. 160 mg of phosphatidyl-DL-glycerol-dimyristoyl as phospholipid were dissolved in 24 ml of chloroform and then mixed with a solution of 20 mg of desmopressin (previously dissolved in 12 ml of ethanol).
[0036]
While maintaining the internal temperature of a 100 ml round bottom flask containing water-soluble chitosan at 20 to 30 ° C., a fixed amount (about 1 ml) of a mixture of liposome components dissolved in an organic solvent was added. The rotation of the rotary evaporator was kept at 120-150 rpm. When the water-soluble chitosan was completely dried to a free flowing state, a mixed solution of an organic solvent was added again, and the film was repeatedly applied.
The final solution was added and dried, and the product was re-dried in a freeze dryer for 24 hours to remove organic solvents (yield: 96% or more).
[0037]
(Examples 3 to 33)
Aprotinin, buserelin, elcatonin, glucagon, gonadotropin, gonadorelin, goserelin, hirudin, leuprolein, lipresin, nafarelin, octreotide, oxytocin, protirelin, sarcatonin, thermorelin, somatostatin, somatropin, terlipressin, tetracosaprinthremin, tetracosaprin tricresin , Albumin, insulin, interferon, immunoglobulin, GM-CSF, G-CSF, and glycoproteins were used to prepare the corresponding proliposomes containing individual peptide drugs in Example 1 Or used according to a method analogous to 2.
[0038]
(Experiment 1)
Confirmation of inclusion of drug in proliposomes (Cryo-SEM confirmation)
In order to confirm the inclusion of the drug in the proliposomes containing salmon calcitonin, proliposomes containing no drug and proliposomes containing the drug were compared and observed using a cryo-electron microscope. For sample pretreatment, one drop (about 3 μl) of a liquid sample (liposomes hydrated from proliposomes) was first dropped on a 1 cm diameter disc-shaped sample table, and the nitrogen flow chamber (CT 1500 Cryotrans, Oxford Instrument, UK) was filled with liquid nitrogen. The sample was then quickly placed in the chamber and allowed to solidify under reduced pressure for one minute.
[0039]
Next, the sample was transferred to a cryogenic room adjusted to -170 ° C, and the state of reduced pressure was confirmed. The cooled sample then spontaneously broke and tore. The broken sample is transferred to a sample table of a scanning electron microscope (JSM-5410LV, JEOL Ltd., Japan) connected to a cryogenic-transmission system, and the temperature is adjusted to -70 ° C. The sample was held for 5 minutes to evaporate water from the sample surface.
[0040]
After sublimation was completed, the sample was transferred again to the cryogenic chamber and then gold coated. Under an accelerating voltage of 20 kV, a broken and torn section of the sample was observed to confirm the shape of the as-produced liposomes and the inclusion of the drug. The photograph is shown in FIG.
[0041]
(Experiment 2)
Observation of dissolution of proliposomes
To observe the hydration process of proliposomes produced using water-soluble chitosan by light microscopy, proliposomal granules were mounted on microscope slides and the focus adjusted. One drop of water was dropped on the granules at a magnification of 400 times, and one minute later, the hydration process was observed to confirm the dissolution process of the proliposome in water. The photograph is shown in FIG.
[0042]
(Experiment 3)
Analysis of particle size of formed liposome
To 5 mg of the water-soluble chitosan proliposome prepared in Experimental Example 1, 5 ml of distilled water was added, and the mixture was shaken with a vortex mixer to dissolve the proliposome, and then hydrated for 30 minutes. The particle size and distribution of the liposomes thus prepared were measured by a particle size analyzer. The result is shown as a graph in FIG.
[0043]
(Experiment 4)
Quantitative analysis and stability of salmon calcitonin in proliposomes
In order to confirm the stability and perform quantitative analysis, the prepared proliposome corresponding to about 5 μg of salmon calcitonin was accurately weighed, dissolved in 300 μl of methanol, and then completely dissolved using a vortex mixer. After filtration through a 0.45 μm filter, a 40 μl aliquot was subjected to HPLC to quantify salmon calcitonin content in proliposomes. The results obtained from the measurements of the stability at room temperature and the stability in the freezer are shown in FIG. The HPLC conditions used to analyze drug content are as follows:
HPLC conditions: column-C18 (Sucelpo)
Flow rate-1 ml / min
Solvent A-0.1% trifluoroacetic acid / acetonitrile
Solvent B-0.1% trifluoroacetic acid / water
[0044]
(Experiment 5)
Preparation of oral drugs (tablets) and enteric coating
The tablets were prepared by direct compression molding in a dry process, rather than a wet process by the general method of preparing tablets as defined in the General Rules for Preparation of the Korean Pharmacopoeia. The compositions of the individual samples prepared to study the effect of the present invention are shown in Table 1 below, and the individual samples prepared by direct compression molding were prepared using cellulose acetate phthalate ( CAP). The results of the coating were confirmed by performing a degradation test in artificial gastric juice (solution 1) and artificial intestinal juice (solution 2) using the general test method specified in the Korean Pharmacopoeia. Described in 2.
[0045]
[Table 1]
[0046]
[Table 2]
[0047]
Samples were used to perform both in vivo and in vitro tests to confirm the effects of the present invention.
[0048]
(Experiment 6)
In vitro test using cells
(1) Preparation of complete medium
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 1 L × 2, 7.4 g of sodium bicarbonate, and 2.6 g of HEPES were added to 2 L of previously sterilized, cooled, distilled water, and then placed in a plate stirrer for about 1-1. Stir for 5 hours.
[0049]
After stirring, the pH level was adjusted to 7.4 with 1N hydrochloric acid using a pH meter. The solution was filtered through a filter (Corning Filter 430015) and then distributed using a 50 ml pipette into 500 ml bottles, 450 ml per bottle.
[0050]
To a 500 ml bottle containing 450 ml of the solution, 50 ml of fetal bovine serum (FBS), 5 ml of streptomycin and 5 ml of mem non-essential amino acid solution (NEAA) were added. To confirm whether the prepared complete medium was contaminated, about 25 ml of the complete medium was placed in a 25 ml T-flask, and after microscopic observation, incubated for 1 day or more in an incubator to confirm the contamination.
[0051]
(2) CaCO 2 Cell thawing
The complete medium, which was prepared and then stored in a refrigerator, was warmed in a 37 ° C. water bath for about 20 minutes and then mixed four or five times using a 5 ml pipette. Then, 5 ml of the medium was placed in a 15 ml centrifuge tube. The cell line (ATCC HTB-37, lot 944495) was removed from the nitro tank and thawed in a 37 ° C. water bath with the bottle cap slightly opened. After confirming that the cell line was completely thawed, the bottle containing the cell line was opened and the cap was mixed 5-6 times with a 5 ml pipette. The entire content of the bottle was placed in the upper 15 ml centrifuge tube.
[0052]
The 15 ml centrifuge tube was centrifuged for 7 minutes using a centrifuge at 1000 rpm to separate the supernatant, which was removed and removed. 1 ml of the medium was added thereto, and the mixture was mixed four or five times with a pipette to destroy the cells. The entire volume of the solution contained in the 15 ml conical tube was transferred to a 25 ml T-flask, which was then stored in the incubator.
[0053]
(3) Changes in cured cell culture media
The 25 ml T-flask stored in the incubator was removed from the incubator, the medium at the bottom of the flask was removed, and the complete medium (prepared and stored in the refrigerator) was placed in a 37 ° C water bath for 20 minutes. Replaced by warming, then a 5 ml aliquot of medium was placed in a 25 ml T-flask, taking care not to touch the pipette to the bottom of the flask.
[0054]
(4) Subculture
The trypsin EDTA container and the free medium, complete medium (stored in the refrigerator) were warmed in a 37 ° C. water bath for about 20 minutes, then the medium in a 25 ml T-flask stored in the incubator. Was removed and 2 ml of trypsin EDTA was placed in a 25 ml T-flask.
[0055]
The trypsin EDTA was dispersed homogeneously, and the flask was kept in a 37 ° C. water bath for 4 minutes. 10 ml of complete medium was added to a 25 ml T-flask and the flask was shaken to separate cells. The separated solution was transferred to a 15 ml conical tube using a pipette, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. 2 ml of complete medium was added to the T-flask to allow the cells to break apart and then reincubated in the incubator. (In this experiment, cells over 40 passages were used.)
[0056]
(5) Coating of transwell membrane with collagen
10 ml of sterile 0.1% acetic acid was added to 25 mg of rat tail collagen and dissolved by stirring in a magnetic bar for 3-5 hours. The resulting solution was diluted with a 1: 1.5 60% ethanol solution to a final concentration of 0.3 mg / ml. Then, 50 μl of the collagen solution was evenly applied to the membrane on top of the Transwell (Costar 3401) and allowed to dry for 4-5 hours under laminar flow in a laminar flow with the cap open.
[0057]
(6) seeding cells in a transwell plate
0.5 ml and 1.5 ml of the complete medium were introduced into the upper and lower compartments of the coated transwell, respectively, and incubated for 15 minutes in the incubator. The medium was then removed and 1.5 ml of complete medium was re-placed in the lower compartment of the re-coated transwell. Cells over 40 passages under subculture are transferred to 2.5-3 × 10 5 5 Diluted to a concentration of cells / ml and then introduced into the upper compartment of the coated transwell and incubated for 2-3 weeks for use in experiments.
[0058]
(7) CaCO 2 Confirm cell monolayer properties
Transepithelial electrical resistance (TEE) was measured by the Millicell-ERS Resistance System (Millicell-ERS resistance system) 2-3 weeks after inoculation of cells onto the transwells and was measured to be 250 Ωcm. 2 Or a resistance value higher than that was confirmed. This means that the monolayer of cells is well established. C l4 When performing permeability experiments using mannitol, (<receiver dpm / <donor dpm>) / hr / cm 2 Was below 0.4%. This means that the cell monolayer was well established. The specific contents of the experiment are as follows.
Drug concentration used: C having a specific activity of 50 mCi / mmol l4 Mannitol 2-10 μM
C 14 -Quantification of mannitol: 100 μl of sample was taken and added to an LSC vial, 2 ml of the LSC reaction mixture was added thereto, and after stirring for 10 seconds, a liquid scintillation counter (LSC) was used to measure CPM in dpm units. 14 -The content of mannitol was determined.
[0059]
(8) Permeation test of drug (for sarcatonin)
The examined medium present in the upper compartment of the transwell was removed using a pipette. The proliposome prepared in Example 1 above was dissolved in trans-buffer to a drug concentration (4.0 μg / ml) and then introduced into the upper compartment of the transwell, which was placed in a 37 ° C. shaking water bath at 85 rpm. Transferred to new wells containing flash buffer at 15 minute intervals after drug addition, with gentle shaking at.
[0060]
Drugs were sampled from the wells of the donor portion of the transwell and then quantitatively analyzed for sarcatonin by ELISA and RIA kits (Pen.Lab.). FIG. 5 shows the results.
[0061]
(Experiment 7)
In vivo studies using rats
SD male rats weighing 250 g to 300 g (five rats per group) were given drinking water only one day before the start of the experiment and adapted to the experimental environment. In order to insert the cannula into the femoral vein and artery, 400 μl of a 1: 4 mixture of ketamine and lumpun as anesthetic was injected intramuscularly, then the rats were fixed on the operating table and the leg thighs Veins and arteries were found using scissors and forceps and cannulated.
[0062]
After cannulation, blood was drawn from veins and arteries using a syringe to confirm blood collection. Samples of Formulations 1, 2, 3, 4, or 5 were then administered orally to rats using an oral capsule sonde, and at regular time intervals, 500 μl of blood was collected from the femoral artery. Blood samples were collected during which a corresponding amount of saline was infused into the femoral vein.
[0063]
The collected blood was centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was separated, and the drug content was quantified therefrom using ELISA and RIA kits (Pen. Lab.).
[0064]
Separately, to compare the increase in bioavailability of each other, the same amount of orally administered drug is infused into the femoral vein and the blood is previously collected according to a method similar to that for blood collection for each formulation. Processed. The drug was then quantified and the bioavailability calculated. The results are shown in Table 3 below.
[0065]
[Table 3]
[0066]
(Industrial applicability)
Thus, the present invention provides 1) the use of water-soluble chitosan to prepare proliposomes as precursors of liposomes, thereby increasing absorption into the intestinal mucosa; Increases the stability of the peptide drug in the intestinal fluid of 3). Adds additives such as an absorption enhancer so that the peptide drug can be smoothly absorbed into the intestinal mucosa. 4) Formulation suitable for oral administration And 5) simultaneously coating the formulation with an enteric coating so that the drug can enter the gut without degradation and be absorbed.
[0067]
That is, the present invention provides a method for preparing liposomes in powder form, which may cause problems encountered in previous methods of preparing oral formulations using liposomes as disclosed in EP 0855179. High yields of proliposomes (as precursors of liposomes) can be prepared in a short time without the need for lyophilization or evaporation steps, thus the process steps are simple, and the moisture of peptide drugs and It has several advantages: increased stability to temperature, which constitutes a disadvantage of peptide drugs, and the use of chitosan as a carrier for preparing proliposomes to increase bioavailability.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a photograph showing the form of proliposomes and drug inclusions made from salmon calcitonin and water-soluble chitosan.
FIG. 2 is a photomicrograph showing the process of dissolution in water obtained from observation of the hydration process of proliposomes using water-soluble chitosan. Here, FIG. 2A is a photograph showing proliposome powder, and FIG. 2B is a photograph showing production of liposome from proliposome.
FIG. 3 is a graph showing the particle size and dispersion of liposomes generated from hydration of proliposomes.
FIG. 4 is a graph showing changes in salmon calcitonin content in salmon calcitonin proliposomes as one embodiment according to the present invention over time.
FIG. 5 is a graph showing drug permeability of various formulations, including salmon calcitonin proliposomes, according to one embodiment of the present invention.
