JP2004505649A - 新規なカリクレイン遺伝子 - Google Patents

Abstract

本発明は核酸分子、かかる核酸分子によりコードされる蛋白、およびその蛋白および核酸分子の使用に関する。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は核酸分子、かかる核酸分子によりコードされる蛋白、および該蛋白および核酸分子の使用に関する。
【０００２】
（従来技術）
カリクレインは、多種の組織および生体液に見られる、一群のセリンプロテアーゼである。「カリクレイン」なる語は、膵臓（ギリシャ語で「カリクレアス」）にて高濃度のそのオリジナルの単離体を見つけた、バールらによって初めて導入された（１、２）。カリクレインは２つの主要な群；シングル遺伝子である、血漿カリクレイン（３）と、齧歯動物にてラージマルチ遺伝子によりコードされる、組織カリクレイン（４、５）に分けられる。現在まで、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーはわずか３つのメンバーで構成されていると考えられていた（６）。しかし、カリクレイン遺伝子ファミリーの１１種の新たなメンバーが同定された（７−１８）。最近になって、この分野における研究の進行状況が報告された（７）。
前立腺癌を診断およびモニターリングするのに、現在、最も有用な腫瘍マーカーである前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、セリンプロテアーゼのヒトカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーである（１９、２０）。ＰＳＡに加えて、前立腺癌に対するアジュバント性診断用マーカーとして、ヒト腺カリクレイン２（ＫＬＫ２遺伝子によりコードされる、ｈＫ２）が提案されている（２１、２２）。さらには、広範囲に及ぶカリクレイン遺伝子ファミリーの他のメンバーが悪性腫瘍と関連している可能性のあることを示す証拠も累積している（７）。正常な上皮細胞特異的１遺伝子（ＮＥＳ１）（ヒト組織カリクレイン遺伝子命名法によれば、ＫＬＫ１０）が、肺癌の進行の間にダウンレギュレートする、新規な腫瘍抑制物質であることが判明した（２３）。ザイム（ＫＬＫ６）、ニューロプシン（ＫＬＫ８）およびヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ；ＫＬＫ７）を含む、遺伝子ファミリーの他のメンバーもまた、特定の型の悪性腫瘍において特異的に発現されることが判明した（２４−２６）。
【０００３】
（発明の開示）
本発明者らは新規なカリクレインをコードする核酸分子を同定した。その核酸分子を染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４にマッピングし、ｋｌｋ１とｋｌｋ３遺伝子の間に位置付ける。「ｋｌｋ１５」と称される新規な核酸分子は３つの別個にスプライスされた形態を有し、それは主に甲状腺にて発現され、それよりも僅かであるが、前立腺、唾液腺および副腎、結腸、精巣および腎臓にて発現される。その核酸の発現は前立腺癌にてアップレギュレートされ、ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系にてステロイドホルモンの制御下にある。ｋｌｋ１５の高発現は、より悪性（高期および高等級）の前立腺癌と関連している。
本明細書に記載の新規なカリクレインを、「カリクレイン１５」、「ＫＬＫ１５」または「ＫＬＫ１５蛋白」という。該蛋白をコードする遺伝子を「ｋｌｋ１５」という。
概して言えば、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４に、あるいは１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の補体に、ハイブリダイズする、少なくとも３０個のヌクレオチドの単離されたＫＬＫ１５核酸分子に関する。
【０００４】
本発明はまた、ＫＬＫ１５蛋白のトランケーション、ＫＬＫ１５蛋白またはそのトランケーションのアナログもしくは同族体をコードする配列を含む、核酸分子を意図する。（ＫＬＫ１５蛋白ならびにＫＬＫ１５蛋白のトランケーション、アナログおよび同族体をまた、包括的に、「ＫＬＫ１５関連蛋白」という。）
本発明の核酸分子は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード化配列を転写および翻訳するための必須の因子を含有するベクター、の中に挿入することもできる。したがって、本発明の核酸分子ならびに該核酸分子に連結した１またはそれ以上の転写および翻訳因子を含む、宿主細胞の形質転換に適する組換え発現ベクターを構築することもできる。
組換え発現ベクターを用いてＫＬＫ１５関連蛋白を発現する形質転換された宿主細胞を調製することができる。したがって、本発明はさらに本発明の組換え分子を含有する宿主細胞を提供する。本発明はまた、その生殖細胞および体細胞が本発明の核酸分子、特にＫＬＫ１５蛋白のアナログまたはＫＬＫ１５蛋白のトランケーションをコードする分子を含む組換え分子を含有する、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を意図する。
【０００５】
本発明はさらに本発明の精製かつ単離された核酸分子を用いてＫＬＫ１５関連蛋白を調製する方法を提供する。一の具体例において、（ａ）本発明の組換え発現ベクターを宿主細胞に移し；（ｂ）形質転換されていない宿主細胞から形質転換されている宿主細胞を選択し；（ｃ）ＫＬＫ１５関連蛋白の発現を可能とする条件下で選択された形質転換されている宿主細胞を培養し；（ｄ）ＫＬＫ１５関連蛋白を単離する；ことを含む、ＫＬＫ１５関連蛋白を調製する方法が提供される。
本発明は、さらに広範囲に、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む、単離されたＫＬＫ１５蛋白も意図する。
本発明のＫＬＫ１５関連蛋白は、他の分子、例えば蛋白と接合し、融合蛋白を調製することもできる。このことは、例えば、Ｎ−末端またはＣ−末端融合蛋白を合成することにより達成することができる。
【０００６】
本発明はさらに、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白のエピトープに対して特異性を有する抗体を意図する。抗体を検出可能な物質で標識化し、それを用いて組織または細胞中にある本発明の蛋白を検出することができる。抗体は、例えば、腫瘍細胞と、コンジュゲートおよびイムノトキシンにて反応させる療法にて、化学療法薬、トキシン、免疫学的応答修飾因子、酵素および放射性同位元素を含む、抗腫瘍作用を有する種々の薬剤の標的とする選択的担体としての用途を有する。
本発明はまた、本発明の核酸分子に独特な、および／または本発明の蛋白に独特な、ヌクレオチドプローブの構築を可能とする。したがって、本発明はまた、本発明の核酸配列、または本発明の蛋白もしくはその一部をコードする核酸配列を含むプローブに関する。プローブを検出可能な物質で標識化し、それを用いてヌクレオチド配列の混合物から、本発明の蛋白の１またはそれ以上の特性を表示する蛋白をコードする核酸分子を含む、本発明の核酸分子を選択することができる。プローブを用いて腫瘍を識別してもよい。
【０００７】
本発明はまた、例えば、センス分子に逆向きにてｍＲＮＡまたはＤＮＡ鎖を産生することによって得られるアンチセンス核酸分子を提供する。アンチセンス核酸分子を用いてＫＬＫ１５発現（例えば、癌性）細胞の増殖を抑制することができる。
本発明はさらに、本発明の蛋白に結合する物質を同定する方法であって、その物質と蛋白との間で複合体を形成することができる条件下、蛋白と、その蛋白と潜在的に結合しうる少なくとも１つの物質とを反応させ、結合を検出することを含む、方法を提供する。結合は、複合体を、遊離物質を、または非複合蛋白を検定することにより検出することができる。本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白と相互作用する他の細胞内蛋白と結合する物質を同定する方法を意図する。ＫＬＫ遺伝子制御配列（例えば、プロモーター配列）と結合する化合物を同定する方法を利用することもできる。
【０００８】
その上さらに、本発明は、化合物の、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節する能力について評価する方法を提供する。例えば、蛋白と、該蛋白と結合する物質の相互作用を阻害または亢進する物質を評価することもできる。一の具体例において、該方法は、物質と蛋白の間で複合体を形成することができる条件下、既知の濃度のＫＬＫ１５関連蛋白を、該蛋白と結合する物質および試験化合物と一緒にし、複合体を取り出しおよび／または検出する、ことを含む。
本発明の蛋白の生物学的活性を調節する化合物はまた、本発明の方法を用い、該化合物の存在、および不存在の下で、本発明の蛋白の組織および細胞中での発現のパターンおよびレベルを比較することによって同定することもできる。
【０００９】
本発明の蛋白、抗体、アンチセンス核酸分子、および本発明の方法を用いて同定される物質および化合物、ならびに本発明のペプチドを用いて、本発明のＫＬＫ関連蛋白の生物学的活性を調節してもよく、それらは対象における癌（特に、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、精巣癌）などの障害および甲状腺障害の治療にて用いることもできる。したがって、該物質および化合物は、一の対象にて、癌（特に、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、精巣癌）などの障害および甲状腺障害を患っている個体に投与するための組成物に処方することができる。特に、この抗体、アンチセンス核酸分子、物質および化合物を用いて、癌細胞中に、または癌細胞上にＫＬＫ１５関連蛋白を有する患者を治療することができる。
したがって、本発明はまた、１またはそれ以上の本発明の蛋白、あるいは本発明の方法を用いて同定される物質または化合物と、医薬上許容される担体、賦形剤または希釈体とを含む組成物に関する。対象における癌（特に、前立腺癌、甲状腺癌、直腸癌、腎臓癌、精巣癌）などの障害および甲状腺障害を治療または予防する方法であって、その治療または予防を必要とする患者に、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白、本発明の方法を用いて同定される物質または化合物、あるいは本発明の組成物を投与することを含む方法もまた提供される。
【００１０】
本発明のもう一つ別の態様は、癌を予防し、および／または癌を治療する、特にその細胞にて検出されるＫＬＫ１５関連蛋白を有する患者にて癌を予防および／または治療するためのワクチンの調製にて用いるための、ＫＬＫ１５関連蛋白、その蛋白より誘導されるペプチドまたは化学的に産生された（合成）ペプチド、あるいはこれらの分子を組み合わせて用いることである。また、これらのワクチン調製物を用いて、患者が腫瘍を発病する前に予防することもできる。
本発明は、概して、ワクチンを投与する対象にて、ＫＬＫ１５関連蛋白に拮抗する抗体の産生を刺激または亢進するためのワクチンを意図する。
本発明はまた、対象においてＫＬＫ１５関連蛋白に拮抗する抗体の産生を刺激または亢進するための方法を提供する。該方法は本発明のワクチンを抗体の産生を刺激または亢進する有効な用量にて対象に投与することを含む。
【００１１】
さらには、本発明は、癌の治療、予防または再発遅延の方法を提供する。この方法はその対象に本発明のワクチンを癌の治療、予防または再発遅延に有効な用量にて投与することを含む。
他の具体例において、本発明は、ＫＬＫ１５関連蛋白の相互作用の阻害剤を同定する方法であって、
（ａ）ＫＬＫ１５関連蛋白、およびＫＬＫ１５関連蛋白と結合する物質、またはその各々が相互作用する少なくとも一部分を含む反応混合物を得；
（ｂ）その反応混合物を１またはそれ以上の試験化合物と接触させ；
（ｃ）ＫＬＫ１５関連蛋白と物質との相互作用を阻害する化合物を同定する、ことを含む方法を提供する。
【００１２】
ある種の好ましい具体例において、その反応混合物は全細胞である。他の具体例において、その反応混合物は細胞溶菌液または精製された蛋白組成物である。本発明の方法は試験化合物のライブラリーを用いて行うことができる。かかる作用物質は蛋白、ペプチド、核酸、炭水化物、有機小分子ならびに動物、植物、真菌および／または微生物から単離された抽出物などの天然産物抽出物ライブラリーとすることができる。本発明のもう一つ別の態様は、創薬事業を実施する方法であって、
（ａ）ＫＬＫ１５関連蛋白と、その蛋白と結合する物質との相互作用を阻害または強化するその能力により作用物質を同定するための１またはそれ以上の検出システムを準備し；
（ｂ）工程（ａ）にて同定された作用物質、またはそのさらなる類似体の、動物における効能および毒性について治療的プロファイリングを行い；そして
（ｃ）許容される治療的プロファイルを有するものとして、工程（ｂ）にて同定された１またはそれ以上の作用物質を含む、医薬調製物を処方する
ことを含む方法を提供する。
ある種の具体例において、本発明の方法は、販売用の医薬調製物を分配するシステムを確立する工程を含むことができ、所望により医薬調製物を売買するための販売グループを確立することを含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内にある種々の変形および修飾はこの詳細な記載から当業者に明らかになるであろうから、本発明の好ましい具体例を示唆する詳細な記載および具体的な実施例は例示として記載されているにすぎないということを認識すべきである。
【００１４】
（図面の簡単な記載）
本発明を図面との関連において説明する。
図１はＫＬＫ１５遺伝子のゲノム機構および部分的ゲノム配列を示す。スプライシング部位の領域を除いてイントロン配列は図示されていない。イントロンを小文字で示し、エクソンを大文字で示す。コーディングヌクレオチドを太文字で示し、３’非翻訳領域がＴＧＡ停止コドン（丸で囲んだ）の後に続く。コーディング領域の翻訳されたアミノ酸を１文字標記を用いて下段に示す。開始および停止コドンを丸で囲み、エクソン−イントロン部位に下線を付す。触媒残基を四角で囲む。推定ポリアデニル化シグナルに下線を付す。第１のコーディングエクソンの正確な開始コドンは決定されなかった。
【００１５】
図２は、ＫＬＫ１５の推定アミノ酸配列と、カリクレインマルチ遺伝子ファミリーのメンバー（配列番号２５−３８）との位置合わせを示す。ダッシュ記号は配列の位置がよりよく合致するようにギャップを設けたことを意味する。触媒トリアドの残基（Ｈ、Ｄ、Ｓ）をイタリックで示す。同じアミノ酸を黒色で強調し、類似する残基を灰色で浮き彫りにする。２９個の不変セリンプロテアーゼ残基を各ブロックの底部に（・）で印を付け、システイン残基を各ブロックの頭部に（＋）で印を付ける。シグナルおよび活性化ペプチドの推定される切断部位を矢印で示す。点線の領域はカリクレインループ配列を示す。「Ｄ」残基の存在により推定されるトリプシン様切断パターンを（＊）で示す。ＫＬＫ１５はこの位置に「Ｅ」を有する。独特な８個のアミノ酸の配列、ＨＮＥＰＧＴＡＧ（配列番号１０）がＫＬＫ１５遺伝子の１４８−１５５位置にある。
【００１６】
図３は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と比較した場合の、ＫＬＫ１５蛋白の疎水性および親水性をプロットしたものである。アミノ末端の疎水性領域がシグナルペプチドの存在を示唆していることに注意すること。
【００１７】
図４は、１５種のカリクレインと他のセリンプロテアーゼについて、推定される系統樹を示す。隣接結合法を用いてＫＬＫ１５を他のセリンプロテアーゼおよびカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーと並べた。その系統樹は古典的カリクレイン（ｈＫ１、ｈＫ２およびＰＳＡ）を一緒にグループ分けし、ＫＬＫ１５をＴＬＳＰおよびＫＬＫ−Ｌ３遺伝子と一緒に一のグループに並べた。他のセリンプロテアーゼを図示するように異なるグループに並べた。ＫＬＫはカリクレインを示し；ＫＬＫ−Ｌはカリクレイン様を示し；ＴＬＳＰはトリプシン様セリンプロテアーゼを示し；ＮＥＳ１は正常な上皮細胞特異的遺伝子を示し；ＰＳＡは前立腺特異的抗原を示し；ｈＫ１およびｈＫ２は、各々、ヒト甲状腺カリクレイン１および２を示し；ＨＳＣＣＥはヒトキモトリプシン酵素をいう。
【００１８】
図５は、ＫＬＫ１５遺伝子の種々のスプライス変種の模式図である。エクソンをボックスで示し、イントロンを連結腺で示す。ボックス内の数字はエクソンの長さを塩基対で示す。矢印は共通開始コドン位置を示し、星印は停止コドン位置を示す。推定されるポリペプチド産物の長さを、各変種の横にアミノ酸（ＡＡ）の数にて示す。スプライシングおよび／またはエクソンスキップにより、フレームシフトが生じ、それにより成熟前の終結がもたらされる。
【００１９】
図６は、染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上のＫＬＫ１、ＫＬＫ１５およびＫＬＫ３遺伝子の相対的位置を示す。２つのオーバーラップＢＡＣクローンを同定し、そのオーバーラップ領域に平行線を付す。遺伝子をコーディング配列の方向を意味する横方向の矢印で示す。遺伝子の間の距離は塩基対で示す。図は尺度で表されていない。
【００２０】
図７は、ＲＴ−ＰＣＲで測定した、ＫＬＫ１５遺伝子の組織発現を示す。ＫＬＫ１５は主に甲状腺で発現され、それより少ない量にて前立腺、唾液腺および副腎、結腸、精巣および腎臓で発現される。Ｍは分子量マーカーである。マルチプルＰＣＲバンド（別途、スプライスされた形態）を説明するために、実施例を参照のこと。ＰＣＲはプライマーＫＬＫ１５−Ｆ２およびＫＬＫ１５−Ｒ１を用いて行った。
【００２１】
図８はＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系におけるＫＬＫ１５遺伝子のホルモン調節を示す。ＤＨＴはジヒドロテストステロンである。ステロイドを１０^−８Ｍの最終濃度で加えた。（−ｖｅ）は負の対照である。アクチンを対照遺伝子として用いた。
【００２２】
図９は１５種のカリクレイン遺伝子のコーディング領域を比較した模式図である。エクソンを充実線で示し、イントロンを連結線で示す。ボックスの上にある文字はすべての遺伝子に保存されていることが判明した触媒トリアドの相対的位置を示す；Ｈはヒスチジンを示し、Ｄはアスパラギン酸を示し、Ｓはセリンを意味する。ローマ数字はイントロン位相を示す。イントロン位相とはコドン内にあるイントロンの位置をいい；Ｉはイントロンが第１ヌクレオチドのコドンの後に生じることを意味し、ＩＩはイントロンが第２ヌクレオチドの後に生じることを意味し、０はイントロンがコドンの間に生じることを意味する。イントロン位相はすべての遺伝子において保持されている。ボックス内の数字はエクソンの長さを塩基対で示すものである。括弧内の名称はヒト遺伝子学名委員会により承認されている正式な名称である。非翻訳３’および５’領域および５’非翻訳エクソンは図示せず。
【００２３】
（発明を実施するための形態）
本発明によれば、当該分野の技術の範囲内にある、通常の分子生物学的技法、微生物学的技法および組換えＤＮＡ技法を利用することができる。かかる技法は刊行物に詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｉｎｓ編（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；およびＢ．Ｐｅｒｂａｌ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００２４】
１．本発明の核酸分子
前記したように、本発明はＫＬＫ１５蛋白をコードする配列を有する単離された核酸分子を提供する。「単離された」なる語は、核酸が、組換えＤＮＡ技法により産生される場合に、実質的に細胞物質または培地のない、あるいは化学的に合成される場合に、実質的に化学反応物または他の化合物のないことをいう。「単離された」核酸はまた、天然において核酸が側面に付加されていない配列（すなわち、核酸分子が５’および３’末端に位置する配列）であって、それから核酸が誘導されるものであってもよい。「核酸」なる語は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものであり、二本鎖または一本鎖のいずれとすることもできる。一の具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白をコードし、好ましくは、本発明の核酸分子は、１またはそれ以上の配列番号１ないし５、または１０ないし２４の核酸配列を含む。
【００２５】
一の具体例において、本発明は、単離された核酸分子であって、
（ｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する蛋白をコードする核酸配列；
（ｉｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白をコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と相補的な核酸配列；
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列の縮重形；
（ｖ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列とのハイブリッド形成能を有する核酸配列；
（ｖｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白の、トランケーション、アナログ、アレリックまたは種バリエーションをコードする核酸配列；または
（ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメントまたはアレリックもしくは種バリエーション
を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００２６】
好ましくは、本発明の精製かつ単離された核酸分子は、
（ｉ）１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の配列を含む核酸配列（ここで、ＴはＵとすることもできる）；
（ｉｉ）（ｉ）に相補的な核酸配列、好ましくは１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の全長核酸配列に相補的な核酸配列；
（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）または（ｉｉ）の核酸とのハイブリッド形成能を有する、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチドを有する核酸；または
（ｉｖ）遺伝コードの縮重により、コドン配列にて（ｉ）ないし（ｉｉｉ）の核酸のいずれとも異なる核酸分子
を含む。
本発明は、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白をコードする核酸に相補的な核酸配列、好ましくは１またはそれ以上の配列番号１ないし５、または１０ないし２４の全長核酸配列に相補的な核酸配列を含む。
【００２７】
本発明は、本発明の核酸配列と実質的に同一のまたは相同的な配列を有する核酸分子、あるいは配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列と実質的に同一または類似の蛋白をコードする配列を有する核酸分子を包含する。好ましくは、この核酸は実質的に配列が同一であること、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の核酸同一性、より好ましくは９０％の核酸同一性；および最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。当該分野にて公知であり、本明細書で使用する「同一性」なる語は、配列を比較することにより測定される、２またはそれ以上のアミノ酸配列または２またはそれ以上の核酸配列の間の関係である。場合によっては、かかる配列の鎖を対合することにより測定されるような、アミノ酸または核酸配列の間の配列の関係の程度をいうこともある。同一性および類似性は当業者に周知の用語であり、慣用的方法により計算することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編， Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１， Ｃａｒｉｌｌｏ， Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ， Ｄ．， ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ． ４８：１０７３， １９８８を参照のこと）。配列間で最大の対合が得られるように設計された方法が、一般に、好ましい。同一性および類似性を決定する方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７、１９８４）；ＢＬＡＳＴ　Ｐ、ＢＬＡＳＴ　ＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）を含む、公に入手可能なコンピュータープログラムにて体系化されている。ＢＬＡＳＴ　ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給会社（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０）から公に入手可能である。
【００２８】
ＫＬＫ１５蛋白をコードし、遺伝的コードにおける縮重のために本発明の核酸配列と異なる配列を有する、単離された核酸分子もまた、本発明の範囲内にある。かかる核酸は機能的に等価な蛋白（例えば、ＫＬＫ１５蛋白）をコードするが、その配列は遺伝的コードにおける縮重のためにＫＬＫ１５蛋白の配列と異なる。一例として、ＫＬＫ１５蛋白のヌクレオチド配列の範囲内にあるＤＮＡ配列多型はアミノ酸配列に影響を及ぼさないサイレント変異をもたらす可能性がある。１またはそれ以上のヌクレオチドにおける変形が、天然の対立遺伝子変形のために、一の集団にある個々の間で存在してもよい。いずれの、そしてすべての核酸変形は本発明の範囲内にある。ＫＬＫ１５蛋白のアミノ酸配列にて変化をもたらすＤＮＡ配列多型が起るかもしれない。これらのアミノ酸多型もまた本発明の範囲内にある。
【００２９】
本発明のもう一つ別の態様は、ストリンジェントな条件下で、好ましくは高ストリンジェントな条件下で、配列番号６、７、８または９に示されるアミノ酸配列を有するＫＬＫ１５蛋白をコードする配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子を提供することである。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当にストリンジェントな条件は当業者に公知であり、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．（１９８９）６．３．１−６．３．６に見ることができる。例えば、約４５℃で６．０ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の、つづいて５０℃で２．０ｘＳＳＣの洗浄を利用することができる。ストリンジェンシーは洗浄工程にて用いる条件に応じて選択することができる。一例として、洗浄工程の塩濃度は５０℃で約２．０ｘＳＳＣの高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄工程の温度は約６５℃の高ストリンジェントな条件とすることもできる。
【００３０】
本発明は、本明細書に記載されている、ＫＬＫ１５蛋白のトランケーション、およびＫＬＫ１５蛋白のアナログを含め、ＫＬＫ関連蛋白をコードする核酸分子を包含する。トランケートされている核酸または核酸フラグメントは、配列番号１のヌクレオチド１５８１−１６２３、１５２４−５２５８、５２５９−５４１２、５４１３−５９１２、５９１３−６０７８、６１９７−６３１６、６０７９−６３１６、６３１７−６４５３、６４５４−７１２６、６０７９−７１２６、７１２７−７７８６、５９１３−６１９６、７１２７−７１３１または７１２７−７２７９あるいは配列番号３９、４７、４８、４９または５０からなる、またはのみからなる配列に対応させることができる。本発明のｃＤＮＡに対応するｍＲＮＡを可変スプライシングに付すことにより得られる本発明の核酸分子の変異形態も本発明により保護される（例えば、配列番号３、４および５を参照のこと）。
【００３１】
ＤＮＡを含む、本発明の単離された核酸分子は、本発明の核酸配列のすべてまたは一部を基礎として標識された核酸プローブを調製することにより単離することができる。その標識された核酸プローブを用いて適当なＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー）をスクリーンする。例えば、ｃＤＮＡライブラリーを用い、そのライブラリーを標準的技法を用いて標識されたプローブでスクリーニングに付すことによりＫＬＫ１５関連蛋白をコードするｃＤＮＡを単離することができる。また、ゲノムライブラリーを同様にしてスクリーニングに付し、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする遺伝子を含むゲノムクローンを単離することができる。ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離された核酸は標準的技法により配列決定することができる。
【００３２】
ＤＮＡである本発明の単離された核酸分子はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法およびｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用い、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする核酸を選択的に増幅することによって単離することもできる。ＰＣＲにて用いるために本発明のヌクレオチド配列から合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することも可能である。核酸はこれらのオリゴヌクレオチドプライマーおよび標準的ＰＣＲ増幅技法を用いてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから増幅させることができる。こうして増幅された核酸を適当なベクターにクローンし、ＤＮＡ配列分析により特徴付けることができる。ｃＤＮＡは、種々の方法により、例えば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １８， ５２９４−５２９９（１９７９）のグアニジニウム−チオシアナート抽出操作を用いることで、細胞ｍＲＮＡ全体を単離することにより、ｍＲＮＡから調製することができる。ついで、逆転写酵素（例えば、ＭＤ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬから入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ　ＭＬＶ逆転写酵素、またはＦＬ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ， Ｉｎｃ．から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。
【００３３】
ＲＮＡである本発明の単離された核酸分子は、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードするｃＤＮＡを、そのｃＤＮＡの転写を可能とし、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードするＲＮＡ分子を産生する、適当なベクターにクローンすることにより単離することができる。例えば、ｃＤＮＡをベクターのバクテリオファージプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）の下流にクローン化させ、ｃＤＮＡをＴ７ポリメラーゼでインビトロにて転写させ、得られたＲＮＡを慣用的技法により単離することができる。
本発明の核酸分子は標準的技法を用いて化学的に合成することができる。限定するものではないが、ペプチド合成と同様に、市販のＤＮＡシンセサイザーで完全に自動化されている、固相合成を含め、ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する方法が知られている（例えば、Ｉｔａｋｕｒａら、米国特許第４５９８０４９号；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４４５８０６６号；およびＩｔａｋｕｒａ、米国特許第４４０１７９６号および第４３７３０７１号を参照のこと）。
【００３４】
特定の核酸分子がＫＬＫ１５関連蛋白をコードするかどうかの決定は、そのｃＤＮＡを標準的技法により適当な宿主細胞にて発現させ、その発現された蛋白を本明細書に記載の方法にて試験することで行うことができる。ＫＬＫ１５関連蛋白をコードするｃＤＮＡは、ジデオキシヌクレオチド鎖末端配列決定法またはマキサム−ギルバート化学的配列決定法などの標準的方法により配列決定され、コードされた蛋白の核酸配列および推定アミノ酸配列を決定することができる。
ＫＬＫ関連蛋白の開始コドンおよび非翻訳配列は、ＰＣ／ジン（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｃａｌｉｆ）などの、一定の目的のために設計されたコンピューターソフトウェアを用いて決定することができる。ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする遺伝子のイントロン−エクソン構造および転写制御配列は、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする本発明の核酸分子を用いてゲノムＤＮＡクローンライブラリーをプローブすることにより確認することができる。制御因子は標準的技法を用いて同定することができる。該因子の機能は、これらの因子を用いて該因子に作動的に連結するｌａｃＺ遺伝子などのレポーター遺伝子を発現させることにより確認することができる。これらの構築物を慣用的操作により培養細胞中に、またはヒト以外のトランスジェニック動物モデルに導入してもよい。ＤＮＡ中の制御因子を同定することに加えて、かかる構築物を用い、当該分野にて知られている技法を利用してかかる因子と相互作用する核蛋白を同定することもできる。一の具体例において、本発明の核酸分子の制御配列は配列番号１１の配列を含む。
【００３５】
本発明の特定の具体例において、本明細書に記載の方法を用いて単離した核酸はＫＬＫ１５変異対立遺伝子である。その変異対立遺伝子は、ＫＬＫ１５関連蛋白に関連する障害の徴候に起因する遺伝子型を有することが既知の、あるいは提案されているいずれかの個体から単離することができる。変異対立遺伝子および変異対立遺伝子産物は本明細書に記載の治療および診断方法にて用いることができる。例えば、ＫＬＫ１５変異体の遺伝子を本明細書に記載のＰＣＲを用いて単離し、その変異対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常な対立遺伝子と比較し、変異体の遺伝子産物の機能の喪失または変更の原因となる変異を解明することができる。変異対立遺伝子を有すると思われる、あるいは有することが分っている個体からのＤＮＡを用いてゲノムライブラリーを構築することもでき、あるいは変異対立遺伝子を発現することが分っている、あるいは発現すると思われる組織からのＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築することもできる。ついで、正常なＫＬＫ１５遺伝子をコードする核酸またはその適当なフラグメントを標識し、プローブとして使用してかかるライブラリー中の対応する変異対立遺伝子を同定してもよい。変異配列を含有するクローンを精製し、配列解析に付すことができる。加えて、ＫＬＫ１５変異対立遺伝子を発現することが既知の、あるいは発現すると思われる個体の組織から単離したＲＮＡから由来のｃＤＮＡを用いて発現ライブラリーを構築することもできる。推定変異体組織により産生された遺伝子産物を発現させ、例えば、本明細書に記載されるＫＬＫ１５関連蛋白に特異的な抗体を用いてスクリーニングすることもできる。この抗体を用いて同定されたライブラリークローンを精製し、配列解析に付すこともできる。
【００３６】
本発明の核酸分子または該分子のフラグメントの配列をその正常な転写表示と逆にし、アンチセンス核酸分子を産生することもできる。アンチセンス核酸分子は、当該分野にて公知の操作を用いる化学的合成および酵素的ライゲーション反応を使用して構築することができる。
【００３７】
２．本発明の蛋白
ＫＬＫ１５蛋白のアミノ酸配列は、配列番号６、７、８または９に示される配列を含む。該蛋白は主に甲状腺で発現され、さらに少ない程度で前立腺、唾液線および副腎、結腸、精巣および腎臓にて発現される。
配列番号６、７、８または９に示されるアミノ酸配列を含む蛋白に加えて、本発明の蛋白は、ＫＬＫ１５蛋白のトランケーション、ＫＬＫ１５蛋白のアナログおよびＫＬＫ１５蛋白と配列同一性または類似性を有する蛋白、ならびに本明細書に記載されるそのトランケーション（すなわち、ＫＬＫ１５関連蛋白）を包含する。
【００３８】
トランケートされた蛋白は、大きさがトリペプチドから７０量体のポリペプチドまでの範囲の、３および７０個の間のアミノ酸残基のペプチドを含む。好ましい具体例において、このペプチドはＨＮＥＰＧＴＡＧ（配列番号１０）を包含する。トランケートされた蛋白は、アミノ末端にて、限定されるものではないが、脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含む、アミノ基（−ＮＨ_２）、疎水基（例えば、カルボベンゾイル、ダンシルまたはＴ−ブチルオキシカルボニル）、アセチル基、９−フルオレニルメトキシ−カルボニル（ＰＭＯＣ）基または巨大分子を有していてもよい。トランケートされた蛋白は、カルボキシ末端にて、限定されるものではないが、脂質−脂肪酸コンジュゲート、ポリエチレングリコールまたは炭水化物を含む、カルボキシル基、アミド基、Ｔ−ブチルオキシカルボニル基または巨大分子を有していてもよい。
【００３９】
本発明の蛋白はまた、本明細書に記載の、ＫＬＫ１５蛋白のアナログおよび／またはそのトランケーションを含んでいてもよく、限定されるものではないが、１またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含有するＫＬＫ１５蛋白を包含しうる。アミノ酸置換は保存または非保存特性のものであってもよい。保存アミノ酸置換は、ＫＬＫ１５蛋白の１またはそれ以上のアミノ酸を同様の電荷、大きさおよび／または疎水性を有するアミノ酸で置換することを含む。保存置換しかなされない場合、得られるアナログは、好ましくは、ＫＬＫ１５蛋白に機能的に均等である。非保存置換は、ＫＬＫ１５蛋白のアミノ酸配列の１またはそれ以上のアミノ酸を異なる電荷、大きさおよび／または疎水性を有する１またはそれ以上のアミノ酸で置換することを含む。
１またはそれ以上のアミノ酸挿入をＫＬＫ１５蛋白に導入してもよい。アミノ酸挿入は単一のアミノ酸残基または長さが２ないし１５個のアミノ酸の連続的なアミノ酸からなっていてもよい。
【００４０】
欠失は１またはそれ以上のアミノ酸または不連続な部分をＫＬＫ１５蛋白配列から除去することからなる。欠失されるアミノ酸は連続的であってもなくてもよい。欠失変異を有する得られたアナログの下限の長さは約１０個のアミノ酸、好ましくは２０ないし４０個のアミノ酸である。
本発明の蛋白はＫＬＫ１５蛋白と配列同一性または類似性を有する蛋白および／または本明細書に記載のそのトランケーションを包含する。かかるＫＬＫ１５蛋白は、そのアミノ酸配列が選択されたハイブリダイゼーション条件（本明細書中のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の記載を参照のこと）下でＫＬＫ蛋白を得るのに用いられるプローブとハイブリッド形成する他の種からのＫＬＫ１５蛋白領域のアミノ酸配列を含む。これらの蛋白は、一般に、ＫＬＫ１５蛋白の特徴である、同じ領域を有するであろう。好ましくは、蛋白は、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列と、実質的な配列同一性を有する、例えば、約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の同一性、好ましくは９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性、最も好ましくは９８％の同一性を有するであろう。アミノ酸配列の相同性、類似性または同一性の％は、本明細書に記載される既知の方法を用いて対照となる配列と対合する、位置合わせしたアミノ酸の％として計算される。
【００４１】
本発明はまた本発明の蛋白のイソ形態を意図する。イソ形態は本発明の蛋白と同じ数および種のアミノ酸を含有するが、異なる分子構造を有する。本発明により意図されるイソ形態は本明細書に記載の本発明の蛋白と同じ特性を有することが好ましい。
本発明はまた、融合蛋白を産生するのに、選択された蛋白、またはマーカー蛋白（以下を参照のこと）と接合したＫＬＫ１５関連蛋白を包含する。加えて、ＫＬＫ１５蛋白およびＫＬＫ１５関連蛋白の免疫原性部分も本発明の範囲内である。
本発明のＫＬＫ１５関連蛋白は組換えＤＮＡ法を用いて調製することができる。したがって、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白をコードする配列を有する本発明の核酸分子を、蛋白を良好に発現させる適当な発現ベクター中に既知の方法にて組み込むことができる。可能な発現ベクターは、限定されるものではないが、用いる宿主細胞と適合する限り、コスミド、プラスミドまたは修飾ウイルス（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含する。
【００４２】
従って、本発明は、本発明の核酸分子、および挿入された蛋白−配列の転写および翻訳に不可欠な調節配列を含有する、本発明の組換え発現ベクターを意図する。適当な調節配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫遺伝子を含む、種々の供給源から誘導される［例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載の調節配列を参照のこと］。適当な調節配列の選択は以下に記載されるように選択される宿主細胞に依存し、当業者であれば容易に行うことができる。必要不可欠な調節配列は固有のＫＬＫ１５蛋白および／またはそのフランキング領域から供給され得る。
【００４３】
本発明はさらにアンチセンス方向にて発現ベクターにクローンされた本発明のＤＮＡ核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子を、本発明の蛋白またはそのフラグメントの核酸配列に対してアンチセンスであるＤＮＡ分子の、ＲＮＡ分子の転写によって発現を可能とするように調節配列に連結させる。種々の細胞型にてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指令する、アンチセンス核酸と連結する調節配列を選択することができる；例えば、アンチセンスＲＮＡの組織または細胞型特異的発現を指令するウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー、または調節配列を選択することができる。
【００４４】
本発明の組換え発現ベクターはまた、本発明の組換え分子で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含有することもできる。マーカー遺伝子として、例えば、特定の薬物、β−ガラクトシダーゼ、クロルアンフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたはイムノグロブリンあるいはイムノグロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃ部などのその一部に対して耐性を付与する、Ｇ４１８およびヒグロマイシンなどの蛋白をコードする遺伝子が挙げられる。そのマーカーは目的とする核酸と異なるベクターに導入することができる。
【００４５】
組換え発現ベクターはまた、組換え蛋白の発現を増加させ、組換え蛋白の溶解性を増加させ；およびアフィニティー精製にてリガンドとして作用することにより標的組換え蛋白の精製を助成する、融合部分をコードする遺伝子を含有していてもよい。例えば、蛋白溶解切断部位を標的組換え蛋白に加え、その組換え蛋白を融合蛋白部分から分離し、つづいて融合蛋白を精製してもよい。典型的な融合発現ベクターは、各々、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白または蛋白Ａと融合し、組換え蛋白となる、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を包含する。
【００４６】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、形質転換宿主細胞を産生することができる。「形質転換宿主細胞」は本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を包含する。「形質転換された」、「トランスフェクトされた」、「トランスフォーメーション」および「トランスフェクション」なる語は、多くの標準的方法のうちの一つ方法で核酸（例えば、ベクター）を細胞に導入することを包含する。原核細胞を、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム介在トランスフォーメーションにより、核酸で形質転換させることができる。核酸はリン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクチン、エレクトロポレーションまたはミクロインジェクションなどの慣用的技法を介して哺乳動物細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトする適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９））および他のラボラトリーテキストブックに見ることができる。
【００４７】
適当な宿主細胞は多種の原核生物および真核生物宿主細胞を包含する。例えば、本発明の蛋白は、イー・コリなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞にて発現させることができる。他の適当な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９１）に見ることができる。
挿入された核酸配列の発現を調節し、所望の方法にて蛋白を修飾（例えば、糖鎖形成またはリン酸化）および処理（例えば、切断）する宿主細胞を選択することもできる。蛋白の翻訳後処理および修飾の特異的かつ特徴的な機構を有する宿主系または細胞系を選択することもできる。例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８を含む真核生物の宿主細胞を用いることもできる。長期にわたって、蛋白を高収率で安定して発現させるために、細胞系および宿主系を遺伝子操作し、遺伝子産物を安定して発現させてもよい。
【００４８】
宿主細胞、およびとりわけ本明細書に記載の方法を用いて産生される細胞系は、ＫＬＫ１５関連蛋白の活性を調節する化合物をスクリーニングし、評価するのに特に有用である。
本発明の蛋白はまた、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ヒト以外の霊長類（例えば、ヒヒ、サルおよびチンパンジー）を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物にて発現させることもできる［Ｈａｍｍｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０−６８３、１９８５）、Ｐａｌｍｉｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：４４３８−４４４２、１９８５）、ＰａｌｍｉｔｅｒおよびＢｒｉｎｓｔｅｒ（Ｃｅｌｌ． ４１：３４３−３４５、１９８５）および米国特許第４７３６８６６号を参照のこと］。当該分野にて知られている方法を用いてＫＬＫ１５関連蛋白をコードする本発明の核酸分子を動物に導入し、トランスジェニック動物の創始細胞系を産生してもよい。かかる操作は前核マイクロインジェクション、レトロウイルス介在遺伝子の生殖細胞系への移動、真核細胞幹細胞における遺伝子標的操作、胚のエレクトロポレーションおよび***介在遺伝子移動を包含する。
【００４９】
本発明はそのすべての細胞中にＫＬＫ１５遺伝子を有するトランスジェニック動物、およびすべてではないがいくらかの細胞にて導入遺伝子を有する動物を意図するものである。導入遺伝子は単一の導入遺伝子としてまたはコンカテマーにて組み込むことができる。導入遺伝子は選択的に導入され、特定の細胞型を活性化させることができる（例えば、Ｌａｓｋｏら、１９９２ Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３６を参照のこと）。導入遺伝子は遺伝子標的操作により内因的遺伝子の染色体部位に組み込むことができる。導入遺伝子を特定の細胞型に導入し、その細胞型での内因的遺伝子を不活性化させてもよい（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６を参照のこと）。
トランスジェニック動物での組換えＫＬＫ１５関連蛋白の発現を標準的技法を用いて検定する。最初のスクリーニングをサザンブロット分析により行うか、またはＰＣＲ法により行い、導入遺伝子が組み込まれているかどうかを解析する。トランスジェニック動物の組織中のｍＲＮＡ発現のレベルをまた、組織サンプルのノーザンブロット解析、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションおよびＲＴ−ＰＣＲを含む、方法を用いて評価する。組織はまた、ＫＬＫ１５蛋白に拮抗する抗体を用いて免疫細胞化学的に評価することもできる。
【００５０】
本発明の蛋白はまた、固相合成などの蛋白の化学にて周知の技法を用いる化学合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ａｓｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４）または均質溶液合成（Ｈｏｕｂｅｎｗｅｙｌ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｅ． Ｗａｎｓｃｈ編、Ｖｏｌ．１５ ＩおよびＩＩ、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）により調製することができる。
蛋白などの他の分子と接合した本発明のＫＬＫ１５関連蛋白を含むＮ−末端またはＣ−末端融合蛋白は、組換え技法を介して、ＫＬＫ関連蛋白のＮ−末端またはＣ−末端を、所望の生物学的機能を有する選択された蛋白またはマーカー蛋白の配列と融合させることにより調製することができる。得られた融合蛋白は本明細書に記載の選択された蛋白またはマーカー蛋白と融合したＫＬＫ１５蛋白を含有する。融合蛋白を調製するのに用いることができる蛋白として、例えば、イムノグロブリン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびトランケートされたｍｙｃが挙げられる。
【００５１】
３．抗体
本発明のＫＬＫ１５関連蛋白を用いて該蛋白に特異的な抗体を調製することができる。該蛋白の非保存領域にある別個のエピトープに結合する抗体を調製することができる。この蛋白の非保存領域は他の蛋白に対して実質的な配列相同性を有しないものである。十分に特徴付けられたドメインなどの保存領域から由来の領域を用いてＫＬＫ１５関連蛋白の保存領域に対する抗体を調製することもできる。ＫＬＫ１５関連蛋白に対して特異性を有する抗体はまた、本明細書に記載されるように細菌にて融合蛋白を発現させることにより生成された融合蛋白から産生することもできる。
本発明は、無傷のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、および免疫学的に活性なフラグメント（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）_２フラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリーフラグメントおよびそのエピトープ結合フラグメント）、抗体重鎖および抗体軽鎖、遺伝子操作された一本鎖Ｆｖ分子（Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４９４６７７８号）、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、例えば、ヒト起源である部分を残しているが、ネズミ抗体の結合特異性を含有する抗体を用いることができる。モノクローナルおよびポリクローナル抗体、フラグメントおよびキメラを含む抗体は、当業者に公知の方法を用いて調製することができる。
【００５２】
４．本発明の核酸分子、ＫＬＫ１５関連蛋白および抗体の適用
本発明の核酸分子、ＫＬＫ関連蛋白および抗体は、ＫＬＫ１５関連蛋白に関係する障害（例えば、癌または甲状腺障害）の予後および診断評価に、およびかかる障害の素因のある対象を同定するのに用いることができる（セクション４．１．１および４．１．２）。
本発明の具体例においては、患者において、癌マーカーであるＫＬＫ１５の発現を検出する方法であって；
（ａ）患者から由来のサンプルを採取し；
（ｂ）そのサンプル中の、ＫＬＫ１５をコードする核酸配列またはＫＬＫ１５核酸配列によりコードされる蛋白産物を検出する
ことを含む方法が提供される。
本発明の具体例において、本発明の核酸分子、ＫＬＫ関連蛋白および抗体は、癌、特に前立腺癌の診断およびステージングに用いることができる。ＫＬＫ１５関連蛋白が高レベルにあることは、前立腺癌のより悪性の形態と関連しており、予後不良の徴候因子とすることができる。
【００５３】
ＫＬＫ１５関連蛋白およびＫＬＫ１５関連蛋白をコードする核酸分子を検出することによる、本発明の核酸分子およびＫＬＫ１５関連蛋白の検出方法を用いてＫＬＫ１５関連蛋白と関与する障害をモニターすることができる。本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節する化合物を同定する方法（セクション４．２）を包含する。これらの化合物、抗体などは、ＫＬＫ１５関連蛋白が関与する障害の治療に用いることができる（セクション４．３）。本明細書に記載の方法を用いてＫＬＫ１５関連蛋白の発現の発生について研究することができ、したがって、ＫＬＫ１５関連蛋白の役割についてさらなる見解が得られるであろう。
【００５４】
４．１　診断方法
ＫＬＫ１５関連蛋白が関与する障害を診断および予後評価するのに、およびかかる障害の素因のある対象を同定するのに、種々の方法を利用することができる。かかる方法は、例えば、本発明の核酸分子、そのフラグメントおよびＫＬＫ１５関連蛋白に拮抗する、ペプチドフラグメントを含む、抗体を利用するものであってもよい。特に、例えば：（１）ＫＬＫ１５変異の存在の検出、または非障害状態と関連するＫＬＫ１５ｍＲＮＡの発現過剰または発現不足の検出、あるいは特定の症状またはかかる症状に対する感受性と相関関係にある可変スプライシング形態のＫＬＫ１５転写物の定性または定量的検出；および（２）非障害状態と関連するＫＬＫ１５関連蛋白が過多または不足しているかの検出、あるいは障害または障害に向かう進行と相関している修飾（例えば、全長よりも短い）ＫＬＫ１５蛋白の存在の検出のために、該核酸および抗体を用いることができる。
【００５５】
本明細書に記載の方法を用いて、例えば、宿主から新たに取り出された一群の細胞中の、悪性細胞または前癌状態細胞の存在の可能性を評価することができる。かかる方法を用いて腫瘍を検出し、その増殖を定量し、疾患の診断および予後を補助することができる。該方法を用いて癌転移の存在を検出することができ、ならびに手術、癌化学療法および／または放射線療法の後にすべての腫瘍組織が存在しないことまたは除去されていることを確認することができる。さらにそれらの方法を用いて、癌化学療法および腫瘍の再発をモニター観察することもできる。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の、例えば、臨床条件にて汎用することができる、少なくとも１つの特異的ＫＬＫ１５核酸または抗体を含む、予めパックされている診断キットを使用し、患者をスクリーンかつ診断し、障害の発病の素因を示す個体をスクリーンかつ同定することにより行うことができる。
【００５６】
核酸を基礎とする検出方法を以下のセクション４．１．１に記載する。ペプチド検出方法を以下のセクション４．１．２に記載する。本発明の方法を用いて分析することができる試料は、ＫＬＫ１５を発現することがわかっているかまたはＫＬＫ１５を発現すると思われるもの、あるいはＫＬＫ１５関連蛋白を含有するものを包含する。試料は患者または細胞培養基から由来するものであってもよく、限定されるものではないが、生体液、組織抽出物、新たに収穫した細胞および培地にてインキュベートした細胞の溶菌液を包含する。
本発明のいずれかの核酸分子から由来のオリゴヌクレオチドまたはさらに長いフラグメントをマイクロアレイにて標的として用いることができる。そのマイクロアレイを用いて多数の遺伝子の発現レベルを同時にモニターし、遺伝的変種、変異および多形性を同定することができる。そのマイクロアレイから由来の情報を用いて遺伝子機能を調べ、障害の遺伝的根拠を理解し、障害を診断し、治療剤の活性を開発かつモニターすることができる。
マイクロアレイの調製、使用および分析は当業者に周知である。（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９５）米国特許第５４７４７９６号；Ｓｃｈｅｎａら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９；Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（１９９５）ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２５１１１６；Ｓｈａｌｏｎ，Ｄ．ら（１９９５）ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５；Ｈｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．ら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５；およびＨｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９７）米国特許第５６０５６６２号を参照のこと。）
【００５７】
４．１．１　本発明の核酸分子の検出方法
本発明の核酸分子により、当業者は試料中の核酸配列を検出するのに用いるためのヌクレオチドプローブを構築することができる。適当なプローブは、ＫＬＫ１５蛋白の領域からの少なくとも５個の連続したアミノ酸をコードする核酸配列に基づく核酸分子を含む。それらは１５ないし３０個のヌクレオチド（配列番号４７−５０を参照のこと）を含むことが好ましい。ヌクレオチドプローブは、適当なシグナルを提供し、^３２Ｐ、^３Ｈ、^１４Ｃなどの十分な半減期を有する放射性活性な標識などの検出可能な物質で標識することができる。使用することができる他の検出可能な物質は、特異的に標識可能な抗体により認識される抗原、蛍光化合物、酵素、標識された抗原に特異的な抗体および発光化合物を包含する。プローブと検出されるヌクレオチドとのハイブリダイゼーションおよび結合速度ならびにハイブリダイゼーションについて利用可能なヌクレオチドの量と関連する適当な標識を選択することができる。標識されたプローブを、サンブルックら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）に概説されるように、ニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜などの固体支持体上にある核酸とハイブリッド形成させることができる。核酸プローブを用いて、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする、好ましくはヒト細胞中の遺伝子を検出することもできる。ヌクレオチドプローブもまた、ＫＬＫ関連蛋白の関連する障害を診断するにおいて；かかる障害の進行をモニター観察するにおいて；または治療的処置をモニター観察するにおいて有用である。
【００５８】
ハイブリダイゼーション技法においてプローブを用い、ＫＬＫ１５関連蛋白をコードする遺伝子を検出することもできる。該技法は、一般に、患者または他の細胞源からの試料より得られた核酸（例えば、組換えＤＮＡ分子、クローン化遺伝子）を、プローブの核酸の相補的配列に対する特異的アニーリングに好ましい条件下で、本発明のプローブと接触させてインキュベートすることを包含する。インキュベーションの後、アニールされていない核酸を除去し、もしあれば該プローブとハイブリダイズした核酸の存在を検出する。
本発明の核酸分子の検出は、ＰＣＲなどの増幅方法を用いて特異的遺伝子配列を増幅し、つづいて当業者に公知の技法を用いて増幅された分子を分析することを包含する。適当なプライマーは当業者であれば慣用的に設計することができる。
【００５９】
ゲノムＤＮＡを生体試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用い、点突然変異、挿入、欠失および染色体転位を含む、ＫＬＫ１５構造に関与する異常を検出してもよい。例えば、直接的配列決定、一本鎖配座多形性分析、ヘテロ二本鎖分析、変性勾配ゲル電気泳動、化学的不対合切断、およびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを利用することができる。
当該分野にて公知の遺伝子型技法を用いて、ｋｌｋ１５遺伝子の変異と密接に関係している多型性を分類することができる。その多形性を用いて、変異を担持する可能性のあるファミリーの個体を同定することができる。多形性がＫＬＫ遺伝子の変異の連鎖不均衡を示す場合、それを用いて変異のある可能性のある一般的集団の個体をスクリーンすることもできる。用いることができる多形性は、制限フラグメント長多形性（ＲＥＬＰｓ）、単塩基多形性および単純配列反復多形性（ＳＳＬＰｓ）を包含する。
【００６０】
本発明のプローブを用いてＲＦＬＰｓを直接同定してもよい。本発明のプローブまたはプライマーを付加的に使用して、ＹＡＣｓ、ＢＡＣｓ、ＰＡＣｓ、コスミド、ファージまたはプラスミドを単離することができる。クローンのＤＮＡをハイブリダイゼーションまたは配列決定操作を用いてＳＳＬＰｓについてスクリーンすることができる。
本明細書に記載のハイブリダイゼーションおよび増幅技法を用いてｋｌｋ１５発現の定性的および定量的態様を検定してもよい。例えば、ｋｌｋ１５を発現することがわかっている細胞型または組織からＲＮＡを単離し、本明細書にて言及するハイブリダイゼーション（例えば、標準的ノーザン分析）またはＰＣＲ技法を利用して試験してもよい。該技法を用い、正常なまたは異常な可変スプライシングによる可能性のある、転写サイズの違いを検出することもできる。該技法を用いて全長のレベルおよび／またはＫＬＫ１５関連蛋白と関連する障害の徴候を示す個体に関連する正常な個体にて検出される可変スプライシング転写物のレベルの間の定量的違いを検出することができる。
プライマーおよびプローブを、生検から得られた患者の（固定および／または凍結させた）組織断面上、イン・サイチュにて、すなわち、直接的に、上記した方法にて、あるいは切除術にて用いることもできる。
【００６１】
４．１．２　ＫＬＫ１５関連蛋白を検出する方法
ＫＬＫ１５関連蛋白と特異的に反応する抗体、あるいは酵素接合体などの誘導体または標識誘導体を用いて種々な試料（例えば、生体物質）中のＫＬＫ１５関連蛋白を検出することができる。それらを診断または予後試薬として用いてもよく、かつそれらをＫＬＫ１５関連蛋白発現のレベルの異常性、またはＫＬＫ１５関連蛋白の構造における、および／または時間的、組織的、細胞的または亜細胞的位置における異常を検出するのに用いてもよい。さらに抗体を用いてインビトロにて治療用化合物の可能性のある化合物をスクリーニングし、ＫＬＫ１５関連蛋白に関連する障害および他の状態に対するその効果を測定することもできる。また、インビトロイムノアッセイを用いて特定の療法の効能を評価またはモニターすることもできる。さらに本発明の抗体をインビトロにて用い、ＫＬＫ１５関連蛋白を産生するように遺伝子操作した細胞におけるＫＬＫ１５発現のレベルを測定することもできる。
【００６２】
抗体は、ＫＬＫ１５関連蛋白の抗原決定因子と抗体の間の結合相互作用に応じて、いずれか既知のイムノアッセイにて用いることができる。かかるアッセイの一例が、放射性免疫検定法、酵素免疫検定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、免疫沈降法、ラテックス凝集反応、赤血球凝集反応および組織化学試験である。特定の細胞事象または病的症状における役割を測定し、かかる病的症状を診断し、かつ治療するために、抗体を用いて試料中のＫＬＫ１５関連蛋白を検出および定量することができる。
特に、本発明の抗体を、例えば、細胞および細胞以下レベルで、免疫−組織化学的分析に使用し、ＫＬＫ１５関連蛋白を検出し、それを特定の細胞または組織に、および特定の細胞以下の配置に位置付け、そして発現のレベルを定量することができる。
【００６３】
光学および電子顕微鏡を用いて抗体を位置付ける当該分野に公知の細胞化学技法を用いてＫＬＫ１５関連蛋白を検出してもよい。一般に、本発明の抗体を検出可能な物質で標識し、その検出可能な物質の存在に基づいて、ＫＬＫ１５関連蛋白を組織および細胞にて位置付けることができる。検出可能な物質の一例として、限定されるものではないが、以下の物質：放射性同位体（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）；蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）；ルミノールなどの発光標識；酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ）；ビオチニル基（標識されたアビジン、例えば、光学または熱量測定法により検出することができる蛍光標識または酵素活性を含有するストレプトアビジンにより検出され得る基）；第２受容体により認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、第２抗体用の結合部位、金属結合領域、エピトープタグ）が挙げられる。ある場合には、標識を種々の長さのスペーサーアームを介して結合させ、立体障害の強さを減少させる。また、抗体を、電子顕微鏡で容易に可視化される、フェリチンまたはコロイド状金などの、高電子密度物質にカップリングさせることもできる。
【００６４】
抗体または試料を、細胞、抗体などの固定能を有する、担体または固体支持体上に固定してもよい。例えば、担体または支持体は、ニトロセルロースまたはガラス、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、磁鉄鉱とすることができる。支持体は、球面（例えば、ビーズ）、円筒面（例えば、試験管またはウェルの内面、あるいはロッドの外面）あるいは平面を含む、どのような構成を有していてもよい。ＫＬＫ１５関連蛋白と反応する抗体に特異的な第２抗体を導入することにより、一次的抗原−抗体反応を増幅するところの、間接的な方法を利用することもできる。一例として、ＫＬＫ１５関連蛋白との特異性を有する抗体がウサギＩｇＧ抗体であるならば、第２抗体は本明細書に記載されるような検出可能な物質で標識されたヤギ抗−ウサギγ−グロブリンとすることができる。
検出可能な物質として放射性活性な標識を用いる場合、ＫＬＫ１５関連蛋白はラジオオートグラフィーにより位置付けることができる。種々の光学的方法により、または粒子を計数することによって、ラジオオートグラフにおける粒子の密度を測定することで、ラジオオートグラフィーの結果を定量することができる。
【００６５】
一の具体例において、本発明は、個体における癌（例えば、前立腺癌）の進行をモニター観察する方法であって、
（ａ）ＫＬＫ１５関連蛋白に結合する一定量の抗体と、個体から由来の試料とを接触させ、試料中に抗体とＫＬＫ１５関連蛋白とを含む二元複合体を形成させ；
（ｂ）試料中での複合体の形成の存在またはその量を測定または検出し；
（ｃ）その後、適切な時点で、工程（ａ）および（ｂ）を繰返し；
（ｄ）工程（ｂ）の結果と、工程（ｃ）の結果を比較する、ここで複合体の形成量の違いはその個体における癌の進行を意味する、
ことを含む方法を意図する。
複合体の量を、癌（例えば、前立腺癌）の危険のない、あるいは癌を患っている個体からの複合体の量の代表的な値と比較することもできる。
【００６６】
４．２　物質／化合物を同定または評価する方法
本明細書に記載の方法は、ＫＬＫ１５関連蛋白に結合するか、またはＫＬＫ１５関連蛋白と相互作用する他の蛋白に、ＫＬＫ１５関連蛋白とＫＬＫ１５関連蛋白もしくはＫＬＫ１５関連蛋白と相互作用する他の蛋白に結合する物質の間の相互作用を干渉し、または強化する化合物に結合する物質を含む、ＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節する物質を同定するように設計される。
本発明の方法を用いて同定される物質および化合物は、限定されるものではないが、Ｉｇ−尾部融合ペプチドを含む可溶性ペプチド、ランダムペプチドライブラリーのメンバーおよびＤ−および／またはＬ−配置アミノ酸でできているコンビナトリアルケミストリー誘導の分子ライブラリー、ホスホペプチド（ランダムにまたは部分的に縮重して方向付けられるホスホペプチドライブラリーのメンバーを包含する）、抗体［例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗−イディオタイプ、キメラ、一本鎖抗体、フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２ならびにそのＦａｂ発現ライブラリーフラグメントおよびエピトープ結合フラグメント）］および小型有機または無機分子などのペプチドを包含する。この物質または化合物は内因的な生理学的化合物であってもよく、あるいは天然または合成化合物であってもよい。
【００６７】
ＫＬＫ関連蛋白を調節する物質は、そのＫＬＫ１５関連蛋白との結合能に基づいて同定することができる。したがって、本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白に結合する物質を同定する方法を提供する。本発明の方法を用いて同定される物質は、慣用的操作により単離され、クローンされ、かつ配列決定され得る。本発明のポリペプチドと結合する物質は、本発明のポリペプチドの生物学的または免疫学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。
「アゴニスト」なる語は、蛋白の活性の量を増加させるか、またはその期間を長くする分子をいう。「アンタゴニスト」なる語は、蛋白の生物学的または免疫学的活性を減少させる分子をいう。アゴニストまたはアンタゴニストは、蛋白、核酸、炭水化物または本発明の蛋白と結合するいずれか他の分子を包含する。
【００６８】
ＫＬＫ関連蛋白と結合しうる物質は、ＫＬＫ１５関連蛋白を、物質−ＫＬＫ１５関連蛋白の複合体の形成を可能とする条件下で、ＫＬＫ１５関連蛋白と結合する可能性のある試験物質と反応させ、その複合体を除去および／または検出することにより同定することができる。該複合体は、物質−ＫＬＫ関連蛋白複合体について、遊離物質について、または複合化していないＫＬＫ関連蛋白について検定することにより検出することができる。物質−ＫＬＫ１５関連蛋白の複合体の形成を可能とする条件は、物質および蛋白の特性および量などの因子を考慮して選択することができる。
物質−蛋白の複合体、遊離物質または複合化されていない蛋白は、慣用的な単離技法、例えば、塩析、クロマトグラフィー、電気泳動、ゲル濾過、分画、吸着、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、凝集またはそれらの組み合わせにより単離することができる。その成分の検定を容易にするために、ＫＬＫ１５関連蛋白または物質に対する抗体、標識されたＫＬＫ１５関連蛋白、または標識された物質を利用することもできる。抗体、蛋白または物質を上記したように検出可能な物質で標識してもよい。
【００６９】
本発明の方法に用いられるＫＬＫ１５関連蛋白または物質は不溶化させることができる。例えば、ＫＬＫ１５関連蛋白または物質を、アガロース、セルロース、デキストリン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロースポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ガラスビーズ、ポリアミン−メチルビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などの適当な担体に結合させてもよい。担体は、例えば、チューブ、試験板、ビーズ、ディスク、球体などの形態とすることができる。既知の化学的または物理的方法、例えば、臭化シアンカップリング法を用いて、その材料を適当な不溶性担体と反応させることにより、不溶化蛋白または物質を調製してもよい。
【００７０】
本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白と、ＫＬＫ１５関連蛋白と結合する物質との結合のアゴニストまたはアンタゴニスト（すなわち、エンハンサーまたはインヒビター）について検定することにより、化合物を本発明のＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節するその能力について評価する方法を提供する。化合物がＫＬＫ１５関連蛋白と該蛋白に結合する物質との結合のアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを評価するための基本的な方法は、物質−ＫＬＫ１５関連蛋白の複合体を形成させる条件下、試験化合物の存在の下、ＫＬＫ１５関連蛋白と該物質を含有する反応混合物を調製することである。試験化合物を最初に添加してもよく、あるいはＫＬＫ１５関連蛋白と物質の添加の後に加えてもよい。試験化合物を含まない、またはプラセボを含む対照となる反応混合物もまた調製する。複合体の形成を検出し、反応混合物中ではなく、対照反応物中での複合体の形成は、試験化合物がＫＬＫ１５関連蛋白と物質との相互作用を干渉していることを示す。反応は液相にて行ってもよく、あるいはＫＬＫ１５関連蛋白、物質または試験化合物を本明細書に記載するように固定してもよい。化合物が本発明のＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節するその能力は、細胞における生物学的作用を測定することにより試験することができる。
【００７１】
アゴニストおよびアンタゴニスト、すなわち、本発明の方法を用いて検定することができるインヒビターおよびエンハンサーは、アゴニスト結合部位、競合アンタゴニスト結合部位、非競合アンタゴニスト結合部位またはアロステリック部位を含め、蛋白または物質上の１またはそれ以上の結合部位で作用することができる。
本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白とＫＬＫ１５関連蛋白に結合する能力を有する物質との相互作用のアゴニストの効果を阻害するアンタゴニストについてスクリーニングすることも可能とする。かくして、本発明を用いてＫＬＫ１５関連蛋白の同じ結合部位と競合する化合物について検定することができる。
本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白と相互作用する蛋白に結合する化合物を同定する方法を提供する。蛋白−蛋白の相互作用は、同時免疫沈降法、交差結合法および勾配またはクロマトグラフィーカラムを介する同時精製法などの慣用的操作を用いて同定することができる。ＫＬＫ１５関連蛋白と相互作用する蛋白をコードする遺伝子を同時に同定する方法を利用することもできる。これらの方法は標識されたＫＬＫ１５関連蛋白で発現ライブラリーをプローブすることを含む。
【００７２】
インビボにおける蛋白の相互作用を検出するのに二ハイブリッドシステムを用いることもできる。二ハイブリッド蛋白をコードするプラスミドを構築するのが一般である。第１のハイブリッド蛋白はＫＬＫ１５関連蛋白に融合する転写アクチベーター蛋白のＤＮＡ結合ドメインからなり、第２のハイブリッド蛋白はｃＤＮＡライブラリーの一部としてプラスミドに組み換えられるｃＤＮＡによってコードされる未知の蛋白に融合する転写アクチベーター蛋白のアクチベータードメインからなる。プラスミドを、その調節領域が転写アクチベーターの結合部位を含有する、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）を含有する一の菌株の酵母（例えば、エス・セレビシエ）に形質転換させる。そのハイブリッド蛋白単独ではレポーター遺伝子の転写を活性化することができない。しかしながら、二ハイブリッド蛋白の相互作用は機能的アクチベーター蛋白を再構築し、レポーター遺伝子の産物について検定することにより検出される、レポーター遺伝子の発現をもたらす。
【００７３】
融合蛋白を上記した方法に用いることもできる。特に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに融合したＫＬＫ１５関連蛋白を該方法にて用いることができる。
本発明のＫＬＫ１５関連蛋白のモジュレーターもまた、蛋白の触媒活性を阻害または亢進するその能力に基づいて同定することができる。
本発明の方法を用いてＫＬＫ１５関連蛋白を調節する化合物を評価するのに適する試薬を、必要不可欠な材料が適当な容器に詰め込まれている、使い易いキットに充填してもよい。
【００７４】
４．３　組成物および治療
本発明の蛋白、本明細書に記載の方法により同定される物質または化合物、本発明の抗体および核酸分子は、ＫＬＫ１５関連蛋白の生物学的活性を調節するために用いてもよく、患者における癌（特に、甲状腺、前立腺、結腸、腎臓、精巣癌）および甲状腺障害などの症状の治療に用いることができる。
したがって、該物質、抗体、ペプチドおよび化合物は、インビボでの投与に適する生物学的に適合する形態にて対象に投与する医薬組成物に処方してもよい。「インビボでの投与に適する生物学的に適合する形態」とは、治療作用がいずれの毒性作用をも上回るところの、投与される活性物質の形態を意味する。活性物質は、ヒトおよび動物を含む、生物に投与することができる。本発明の医薬組成物を投与する治療的に活性な量とは、所望の結果を得るのに必要な用量および期間の効果的な量として定義される。例えば、物質の治療的に活性な量は、個体の病態、年齢、性別および体重などの因子、および個体のおいて所望の応答を惹起する抗体の能力によって変化する。最適な治療応答を付与するように投与計画を調節してもよい。例えば、一日に数回に分割した用量を投与してもよく、あるいは治療状況の緊急性による指標に比例してその用量を減少させることもできる。
【００７５】
活性物質を注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮投与、または経直腸投与などの一般的方法により投与してもよい。投与経路に応じて、物質を不活性化しうる、酵素、酸および他の天然条件の作用から該物質を保護するために一の材料で該物質を被覆してもよい。
本明細書に記載の組成物は、有効量の活性物質を医薬上許容されるビヒクルと混合して組み合わせる、対象に投与することができる医薬上許容される組成物を調製する自体公知の方法により調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、ＵＳＡ １９８５）に、適当なビヒクルが記載されている。この記載に基づいて、組成物は、たとえ排他的でないとしても、適当なｐＨで、生理学的流体の等浸透性の緩衝溶液に含有させた、１またはそれ以上の医薬上許容されるビヒクルまたは希釈体と組み合わせた活性物質の溶液を包含する。
【００７６】
該組成物は、単独で、あるいは他の治療薬または他の治療形態（例えば、化学療法または放射線療法）と組み合わせた、治療薬として適用される。例えば、該組成物は抗増殖薬、抗菌薬、免疫刺激剤または抗炎症剤と組み合わせて用いることができる。特に、該化合物は抗ウイルスおよび／または抗増殖薬と組み合わせて用いることができる。本発明の組成物は、他の治療薬または療法と同時に、別々に、または逐次的に投与することができる。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニアウイルスから、あるいは種々の細菌プラスミドから由来のベクターを用いて核酸分子を標的とする器官または細胞集団にデリバリーすることができる。当業者に周知の方法を用い、本発明のアンチセンス核酸分子を発現するであろう組換えベクターを構築することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）およびＡｕｓｕｂｅｌら（前掲）を参照のこと）。
【００７７】
全長のｃＤＮＡ配列および／またはその調節因子を含む核酸分子は、当業者が遺伝子の機能のセンス（Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉａｎ ＨおよびＨ Ｆ Ｌｏｄｉｓｈ １９９３ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：９８−１０４）またはアンチセンス（Ｅｇｕｃｈｉら（１９９１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０：６３１−６５２）調節における調査手段として本発明の蛋白をコードする配列を用いることができるようにする。かかる技法は当該分野にて周知であり、センスまたはアンチセンスオリゴマーあるいはさらに長いフラグメントをコーディングまたは対照領域に沿った種々のロケーションから設計することができる。
本発明の蛋白をコードする遺伝子は、細胞または組織を、高レベルの所望のＫＬＫ１５−コード化フラグメントを発現する、ベクターでトランスフェクトすることによりターンオフされ得る。かかる構築物は細胞を翻訳され得ないセンスまたはアンチセンス配列で一杯にすることができる。ＤＮＡへの組み込みのない場合であっても、すべてのコピーが内因的ヌクレアーゼにより無効とされるまで、かかるベクターはＲＮＡ分子を転写し続ける。
【００７８】
遺伝子発現の修飾は、本発明の蛋白をコードする遺伝子の調節領域に、すなわち、プロモーター、エンハンサーおよびイントロンに、アンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計することにより得ることができる。オリゴヌクレオチドは、転写開始部位、例えば、リーダー配列の−１０と＋１０領域の間から誘導されることが好ましい。アンチセンス分子が転写物とリボソームとの結合を妨げることによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するように、該分子を設計することもできる。阻害は「三重螺旋」塩基対合方法を用いてもなされ得る。三重螺旋対合は二重螺旋の、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子との結合のために十分に切断する能力を傷つける。三重螺旋ＤＮＡを用いる治療的進歩は、Ｇｅｅ Ｌ Ｅら（Ｉｎ：Ｈｕｂｅｒ Ｂ ＥおよびＢ Ｉ Ｃａｒｒ（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｍｔ Ｋｉｓｃｏ Ｎ．Ｙ．）により報告されている。
【００７９】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒する酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムはリボザイム分子が相補的標的ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイズし、つづいて内ヌクレオチド結合分解性切断に供するように作用する。したがって、本発明は、本発明の蛋白をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性切断を特異的かつ十分に触媒し得る、遺伝子操作されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子をも提供する。
以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含む、リボザイム切断部位について標的分子をスキャンすることにより、まず、潜在的ＲＮＡ標的内にある特異的リボザイム切断部位を同定することができる。その部位が同定されれば、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する、１５と２０個の間のリボヌクレオチドショートＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドを作動不能にする、第２の構造的特徴について評価することができる。リボヌクレオチド保護検定法を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するアクセス性を試験することにより、候補標的の適性を決定することもできる。
【００８０】
ベクターを細胞または組織に導入する方法は、本明細書に開示されており、インビボ、インビトロおよびエクスビボ療法に適する、方法を包含する。エクスビボ療法の場合、ベクターを患者から得られた幹細胞に導入し、自己移植片をその同一患者内でクローン操作により増殖させる（米国特許第５３９９４９３号および第５４３７９９４号を参照のこと）。形質導入による、またリポソームによるデリバリーは当該分野にて周知である。
ＫＬＫ関連蛋白に対する抗体を、化学療法薬、トキシン、免疫学的応答修飾剤、造血剤、酵素および放射性同位元素と結合させて、癌（例えば、甲状腺、前立腺、結腸、腎臓、精巣癌）の予防および治療に用いることができる。例えば、ＫＬＫ１５関連蛋白に対する抗体を、限定されるものではないが、リシンＡ、ジフテリアトキシン、アブリン、モデシン、またはシュードモナスまたはシゲラから由来の細菌性トキシンを含む、トキシン部分に結合させてもよい。トキシンおよびその誘導体は、特異的に標的された細胞毒性を得るために、癌または腫瘍細胞などの特定の標的組織に特異的な抗体と結合体を形成すると報告されている（Ｍｏｏｌｔｅｎ Ｆ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎ． Ｒｅｖ． ６２：４７−７２、１９８２；およびＢｅｒｎｈａｒｄ， Ｍ．Ｉ． ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４３：４４２０、１９８３）。
【００８１】
結合体は、当該分野にて知られている標準的手段により調製され得る。多くの二機能性連結剤（例えば、ヘテロ二機能性リンカー、例えば、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）が、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから市販されている。
治療的使用のための抗体またはイムノトキシンの投与は、腹腔内、経口または経皮投与などの適当な処方での投与経路を用いることもできるが、静脈内投与によるものであってもよい。
ＫＬＫ１５関連蛋白は、当該分野にて既知の方法を用い、化学療法薬、トキシン、免疫学的応答修飾薬、酵素および放射性同位元素に結合させてもよい。
【００８２】
本発明はまた、癌を予防するか、またはその重篤度を軽減するための免疫療法を提供する。対象における癌の臨床的徴候または症状は、対象の癌に対する免疫応答を刺激するため、患者に対する有益な効果を表す。免疫応答を刺激することは、免疫応答を誘発すること、あるいは本発明のワクチン調製物の投与に応答して免疫エフェクター細胞の活性を亢進することである。癌の予防は、例えば、遺伝的素因または発癌性物質に対する曝露により癌を発生しやすくさせた患者にて癌が発症するまでの時間を増加させることにより表すことができる。癌の重篤度の軽減は、腫瘍の大きさおよび成長速度の減少により表すことができる。
【００８３】
ワクチンは、ＫＬＫ関連蛋白、それから誘導されるペプチド、または化学的に産生される合成ペプチド、あるいはこれらの分子の組み合わせ、またはその融合蛋白もしくはペプチドから誘導することができる。この蛋白、ペプチド等は、組換え操作により、あるいは生物学的に、腫瘍関連蛋白の１またはそれ以上のエピトープに対応する１またはそれ以上のアミノ酸配列を含むように合成または調製することができる。腫瘍関連蛋白のエピトープは、ある場合には、天然に存する蛋白またはポリペプチドのアミノ酸配列の変形が抗原的であってもよく、癌に対して保護免疫性または抗腫瘍発生効果を付与しうる可能性を含むことが理解されよう。配列の変形は、限定するものではなく、アミノ酸置換、拡張、欠失、切断、挿入およびその組み合わせを包含し得る。かかる変形は本発明の範囲内にある；ただし、その変形を含有する蛋白は免疫原性であり、かかるポリペプチドに対する抗体は、ワクチンとして投与した場合に、保護免疫および／または抗腫瘍形成活性を付与するのに十分な程度まで天然に存在するＫＬＫ１５関連蛋白と交差反応する。
【００８４】
蛋白、ペプチドなどは、当該分野にて公知の方法を用いて、免疫応答の誘発能を有するワクチンに組み込むことができる。蛋白、ペプチドなどの抗原性を亢進する方法は当該分野にて知られており、多重結合の構造物に組み込み、高免疫原蛋白担体、例えば、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはジフテリアトキソイドに結合させ、免疫応答のアジュバントまたは他のエンハンサーと組み合わせて投与することを含む。
ワクチンを、免疫学的に許容される希釈体および担体ならびに完全フロインドアジュバント、サポニン、アラムなどを含む、生理学的に許容される媒体と組み合わせてもよい。
さらに、本明細書に記載のＫＬＫ関連蛋白に対する抗体の抗−イディオタイプ抗体もまた、ワクチンとして有用であり、同様に処方しうることが認識されるであろう。
【００８５】
本発明に係るワクチンの投与は、一般に、甲状腺、前立腺、結腸、腎臓および精巣癌を含む、癌の予防または治療に用いることができる。
癌の予防および／または治療のための本発明に係るワクチンの投与は、癌の摘出手術の前後、癌の治療のための化学療法の前後、および癌の治療のための放射線療法の前後、およびそれらの組み合わせの前後にて開始することができる。本発明に係る癌の免疫療法は、利用可能な他の治療法、例えば、手術、化学療法、放射線療法と比べて、関係する副作用は実質的に最小であるため、癌の予防および／または治療のための好ましい治療法であろう。このワクチンは、癌を患っていないが、癌を発病する危険性のある対象において癌を予防する可能性または能力を有する。
【００８６】
本発明の蛋白、物質、化合物、抗体、核酸分子、薬物および組成物の活性は動物実験モデル系において確認することができる。細胞培養における標準的な医薬的操作により、あるいは例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％にて治療的に効果的な用量）またはＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）統計値を算定することによる実験用動物を用いることにより、治療的効能および毒性を測定することができる。治療指数は治療の毒性作用に対する用量比であり、ＥＤ_５０／ＬＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。
【００８７】
４．４　他の用途
本明細書に開示されている核酸を、未だ開発されていない、分子生物学方法にて用いてもよい；ただし、その新規な方法は、限定するものではないが、三重遺伝的コードおよび特異的塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られているヌクレオチド配列の特性に依存する。
本発明はまた、本発明のポリペプチドの機能を研究する方法を提供する。本発明の核酸分子または遺伝子の発現を欠く、またはその発現を部分的に欠く細胞、組織およびヒト以外の動物は、遺伝子にて特異的欠失または挿入変異を有する本発明の組換え発現ベクターを用いて開発することもできる。組換え発現ベクターを用い、相同的組換えにより内因的遺伝子を不活性化または改変してもよく、それにより不完全な細胞、組織または動物を創造することができる。
【００８８】
無効対立遺伝子は、欠失変異により胚幹細胞などの細胞にて生成され得る。組換え遺伝子はまた、該遺伝子を不活性化する挿入変異を含有するように遺伝子操作してもよい。ついで、かかる構築物を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インジェクションなどの技法により胚幹細胞などの細胞に導入してもよい。ついで、完全な遺伝子を欠く細胞を、例えば、サザンブロット、ノーザンブロットにより同定し、あるいは本明細書に記載の方法を用いてコードされたポリペプチドの発現について検定することにより同定してもよい。ついで、かかる細胞を胚幹細胞に融合させ、本発明のポリペプチドを欠く、ヒト以外のトランスジェニックな動物を生成してもよい。その変異の生殖細胞系列伝達は、例えば、インビトロにて胚幹細胞を８分割細胞胚などの初期段階の胚と一緒にし；その得られた胚芽細胞を雌の受容者に移し；得られた凝集キメラ細胞の生殖細胞系列伝達を得ることにより達成される。かかる変異体の動物を用いて特異的な細胞集団、発育パターンおよび通常、遺伝子発現に依存するインビボ工程を限定することができる。
【００８９】
かくして、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのすべての生殖細胞および体細胞がＫＬＫ１５関連蛋白をコードする遺伝子を不活性化または改変する組換え発現ベクターを含有する動物を提供する。一の具体例において、本発明はそのすべての生殖細胞および体細胞がＫＬＫ１５関連蛋白をコードし、ＫＬＫ１５関連蛋白と関係する病変をもたらす、遺伝子を不活性化または改変する組換え発現ベクターを含有するヒト以外の哺乳動物のトランスジェニック動物を提供する。さらには、本発明は、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白を発現せず、あるいはその発現を改変する（例えば、減少させる）ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。一の具体例において、本発明は、ＫＬＫ１５関連蛋白と関係する病変をもたらす、本発明のＫＬＫ１５関連蛋白を発現せず、あるいはその発現を減少させるヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を提供する。ＫＬＫ１５関連蛋白の病変はＫＬＫ１５関連蛋白の同型接合または異型接合変異体について観察される表現型に言及する。
【００９０】
ヒト以外のトランスジェニック動物は、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、イヌ、ネコ、ヤギ、およびサル、好ましくはマウスを包含する。
本発明はまた、ＫＬＫ１５関連蛋白に付随する病変、好ましくはＫＬＫ１５関連蛋白と関係する病変を軽減または阻害する薬物について試験するための実験システムを条件とする、ヒト以外のトランスジェニックな動物の検定システムであって、
（ａ）その薬物を本発明のヒト以外のトランスジェニックな動物に投与し；
（ｂ）該薬物が投与されていない工程（ａ）のヒト以外のトランスジェニックな動物と比べて、そのヒト以外のトランスジェニックな動物における病変（例えば、ＫＬＫ１５関連蛋白と関係する病変）を軽減するかまたは阻害するかを測定する、
ことを含む検定システムを提供する。
該薬物は本明細書に記載の癌などの症状の治療および予防に有用である。該薬物はまた、本明細書に記載の医薬組成物に配合することもできる。
【００９１】
（実施例）
材料および方法
新たな遺伝子の同定
ＫＬＫ１遺伝子（セントロメア）からＫＬＫ１４遺伝子（テロメア）（７、８、１１、１２、２７）に伸びるヒトカリクレイン遺伝子座のついての連続地図を構築した。この領域に及ぶ重複している細菌性人工染色体（ＢＡＣ）クローンは、種々の放射線標識した遺伝子特異的プローブを用いてヒトＢＡＣライブラリーをスクリーニングすることにより同定された。約３００ｋｂのゲノム配列の領域を以前に記載されている（１１、２７）種々の技法を用いて確立した。ＥｃｏＲ１制限分析を行うことで、Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ＬＬＮＬ）から入手した染色体１９ｑ１３のＥｃｏＲ１制限地図に沿ってカリクレイン遺伝子座を配向させた。つぎに、より動原体的に広がるＢＡＣクローン（ＢＣ７８１１３４）を同定した。このクローンからの線状ゲノム配列のコンティグはＬＬＮＬから入手可能である。まず、これらのコンティグ配列を用い、以前に記載される生物情報操作（８、１２）を使用して新規な遺伝子の存在を予測し、新規な推定セリンプロテアーゼを同定した。ついで以下に記載するように、組織を配列決定、ＥＳＴデータベースサーチ、ＰＣＲスクリーニングを含む、種々の方法に付して、その推定遺伝子の配列を確認した。
【００９２】
発現配列タグ（ＥＳＴ）の調査
新しい推定遺伝子の予測エクソンを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）上のＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（２８）を用い、ヒトＥＳＴデータベース（ｄｂＥＳＴ）に対する相同性の調査に付した。９５％よりも大きな相同性を有するクローンをＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム（２９）からＲｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬを通して入手した。このクローンを、別に記載されるように（３０）増殖させ、精製して、インサート−フランキングベクタープライマーを用いて自動配列決定装置で両方向から配列決定した。
【００９３】
前立腺癌細胞系およびホルモン刺激実験
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から獲得した。グルタミン（２００ミリモル／Ｌ）、ウシインスリン（１０ｍｇ／Ｌ）、ウシ胎児血清（１０％）、抗体および抗かび剤を補足した、プラスチックフラスコのＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）にて略集密に達するまで細胞を培養した。ついで、該細胞を２４−ウェルの組織培養プレートにアリコートし、５０％集密まで培養した。実験を行う２４時間前に、培地を１０％チャコール−ストリップ処理に付したウシ胎児血清を含有するフェノールレッド不含の培地に変更した。刺激実験の場合、１００％エタノールに溶かした種々のステロイドホルモンを１０^−８Ｍの最終濃度で培地に添加した。１００％エタノールで刺激した細胞を対照として包含する。細胞を２４時間培養し、ついでｍＲＮＡ抽出で収穫した。
【００９４】
ＫＬＫ１５遺伝子についての逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
全ＲＮＡを、ＬＮＣａＰ細胞系から、あるいは前立腺組織からトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬を用い、その製造業者の指示に従って抽出した。ＲＮＡ濃度を分光光度法により測定した。２μｇの全ＲＮＡをスーパースクリプト（登録商標）（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ^ＴＭ）プレ増幅系（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡに逆転写した。最終容量は２０μｌであった。新規な遺伝子の推定されるゲノム構造およびＥＳＴ配列（後記参照）から得られる組み合わせ情報に基づいて、２つの遺伝子特異的プライマーを設計し（ＫＬＫ１５−Ｆ１−配列番号４７およびＫＬＫ１５−Ｒ１−配列番号４８）（表１）、１μｌのｃＤＮＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、２００μＭ　ｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド・トリホスフェート）、１５０ｎｇのプライマーおよび２．５単位のホットスター（登録商標）（ＨｏｔＳｔａｒ^ＴＭ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を含有する反応混合物中、パーキン−エルマー９６００サーマル・サイクラー上でＰＣＲを行った。サイクリング条件はＴａｇＤＮＡポリメラーゼを活性化するのに９５℃で１５分間であり、つづいて９４℃で３０秒、６４℃で３０秒、７２℃で１分間を３５サイクルであって、最終の拡張工程は７２℃で１０分間であった。等量のＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動に付し、臭化エチジウム染色により可視化させた。ＲＴ−ＰＣＲのすべてのプライマーは少なくとも２つのエクソンに及び、ゲノムＤＮＡによる汚染を回避した。ＰＣＲ産物の同一性を確認するために、それらを製造業者の指示に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローンした。挿入物をベクター特異的プライマーを用い、自動ＤＮＡシーケンサーにて両方向から配列決定した。
【００９５】
組織発現
２６種のヒト組織より単離した全ＲＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡから購入した。ｃＤＮＡを組織培養実験について前記したように調製し、ＰＣＲ反応に使用した。組織ｃＤＮＡを２つの遺伝子特異的プライマー（ＫＬＫ１５−Ｆ２−配列番号４９およびＫＬＫ１５−Ｒ１−配列番号４８）（表１）を用いて種々の希釈度で増幅させた。カリクレイン間の高度の相同性に起因して、非特異的増幅を除くため、ＰＣＲ産物をクローンし、配列決定した。
【００９６】
前立腺癌組織
前立腺組織試料を、ドイツ、ベルリン、Ｃｈａｒｉｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌで前立腺腺癌の恥骨後前立腺全摘出術を受けた２９人の患者から手に入れた。患者は手術前にホルモン療法を受けていなかった。研究を目的としてこれらの組織を使用するのに、Ｃｈａｒｉｔｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの倫理委員会の承諾を得た。新たな前立腺組織試料を摘出した同じ前立腺の癌性および非癌性部分から得た。前立腺を除去した直後に組織の小片を切り裂き、分析するまで液体窒素中で貯蔵した。すべての組織片を以前に記載されるように組織学的分析に付し（３１）、その組織が悪性または良性のいずれかであることを裏付けた。組織を液体窒素下で粉砕し、トリゾール試薬を用いて上記したようにＲＮＡを抽出した。
【００９７】
統計分析
ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて統計分析を行った。同じ患者からの非癌性組織と癌性組織におけるＫＬＫ１５発現の間の違いの分析を非パラメータ性ＭｃＮｅｍａｒ試験を用いて行った。２項分布を用いて有意水準をコンピューターで計算した。前立腺腫瘍ＫＬＫ１５ｍＲＮＡレベルを定量的に２つの範疇（ＫＬＫ１５−低レベル群、およびＫＬＫ１５−高レベル群）に分類し、ＫＬＫ１５ステータスと他の変数の間の関係をフィッシャー精密試験を用いて分析した。
【００９８】
構造分析
「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」ソフトウェアパッケージおよびマルチプルアライメントプログラム（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いてマルチプルアライメントを行った。系統発生の研究を「Ｐｈｙｌｉｐ」ソフトウェアパッケージを用いて行った。距離マトリックスの研究を「Ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ／ＵＰＧＭＡ」プログラムを用いて行い、パルシモニー（ｐａｒｓｉｍｏｎｙ）分析を「Ｐｒｏｔｐａｒｓ」プログラムを用いて行った。疎水性の研究をＢａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌａｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｓｅａｒｃｈ ｌａｕｎｃｈｅｒを用いて行った。シグナルペプチドを「ＳｉｇｎａｌＰ」サーバーを用いて予測した。蛋白構造分析を「ＳＡＰＳ」（蛋白配列の構造分析）プログラムで行った。
【００９９】
結果
ＫＬＫ１５遺伝子のクローニング
ＫＬＫ１遺伝子（セントロメア）からＫＬＫ１４遺伝子（テロメア）（７、８、１１、１２、２７）に伸びるヒトカリクレイン遺伝子座のついての連続地図は既に確立されている（７、８、１１、１２、２７）。ＫＬＫ１にセントロメックである他のカリクレイン様遺伝子の存在を調査するために、ＢＡＣクローン（ＢＣ７８１１３４）を「材料および方法」の記載に従って得た。前立腺特異的抗体（ＰＳＡ）およびヒト腎臓カリクレイン（ＫＬＫ１）遺伝子の公開されているゲノム配列によれば、遺伝子特異的プライマーをこれらの各遺伝子について設計し（表１、配列番号４７−５０）、鋳型としてのゲノムＤＮＡを有する特異的ＰＣＲ産物の産生を可能とする、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく増幅プロトコルを開発した。ＢＡＣクローンをこれらの遺伝子特異的プライマーでＰＣＲスクリーニングに付し、このクローンがＰＳＡに対しては陰性であるが、ＫＬＫ１に対しては陽性であること、すなわち、ＰＳＡに対してセントロメックである位置を確認した。
【０１００】
以前に記載されているコンピュータープログラム（１２）によりこのクローンの配列から新規な推定セリンプロテアーゼを予測した。このクローンを消化し、膜上にブロットし、（配列の予測による）推定ＫＬＫ１５遺伝子についての遺伝子特異的プライマーとハイブリダイズし、正のフラグメントをサブクローンし、配列決定してその推定遺伝子の構造を確認した。この推定遺伝子配列をヒトＥＳＴデータベースに対してブラストし、２つのＥＳＴクローンを同定した（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＷ２７４２７０およびＡＷ２０５４２０）。これらの２つのクローンは最後のエクソンおよび遺伝子の３’非翻訳領域ならびにゲノム構造では認められない１７アデニン（Ａ）ヌクレオチドの鎖を有する第２ＥＳＴ末端と９９％同一であり、すなわち遺伝子の３’末端とポリＡ尾部の位置を確認した。
【０１０１】
遺伝子の完全なｍＲＮＡ構造を同定し、エクソン／イントロンの境界を決定するために、異なるコンピューター予測のエクソンにて位置付けられたプライマーを用い、鋳型として２６個の一連のヒト組織ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ産物を配列決定した。これらのプライマーのうち２つ（ＫＬＫ１５−Ｆ１−配列番号４７およびＫＬＫ１５−Ｒ１−配列番号４８）（表１）は異なる組織からの遺伝子の完全なコード化領域を増幅することができた。ｍＲＮＡとゲノム構造との比較は、５個のコード化エクソンと４個の介在イントロンで形成される遺伝子の存在を示した。可能性のあるすべてのリーディングフレームでのｍＲＮＡ配列の翻訳は、干渉されていないポリペプチド鎖を付与する、さらに以下に記載されるように、カリクレインの高度に保存されている構造モチーフも含有する、たった１つのフレームの存在を示した。
【０１０２】
ＫＬＫ１５遺伝子の構造の特徴化
図１に示されるように、ＫＬＫ１５遺伝子は５個のコード化エクソンと４個の介在イントロンで形成されるが、他のカリクレイン遺伝子では、さらに上流の翻訳されていないエクソンの存在を度外視することができなかった（１７、３２、３３）。エクソン／イントロンのスプライス部位はすべて真核動物細胞スプライス部位（３４）のコンセンサス配列と一致する。該遺伝子はさらに、以下に記載されるように、ヒトカリクレイン多重遺伝子族の他のメンバーに共通の構造的特徴と厳格に一致する。遺伝子の予測される蛋白コード化領域は、予測される分子量が２８．１ｋＤａの、推定２５６個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、７７１ｂｐで形成される。潜在的な翻訳開始コドンはコンセンサスコザック配列と対合し（３５）、その上、位置（−３）にプリンがあり、それは脊椎動物のｍＲＮＡの９７％で生じる（３６）。他の大部分のカリクレイン様遺伝子と同様に、ＫＬＫ１５は位置（＋４）にコンセンサスＧヌクレオチドを有しないことは注目に値するであろう。
【０１０３】
ヌクレオチド７７６４−７７６９（ＡＴＴＡＡＡ）（配列番号４０）は、コンセンサスポリアデニル化シグナル（３７）と密接に似ており、１７ヌクレオチドの後に、ポリＡ尾部が続いている。他の潜在的なポリアデニル化シグナルは３’非翻訳領域にて識別できず、上記した配列は実際のポリアデニル化シグナルであることを示唆する。ＡＡＴＡＡＡ（配列番号４０）は高度に保存されるが、天然の変種が発生し、ＡＴＴＡＡＡ（配列番号４０）配列は脊椎動物のｍＲＮＡ配列の１２％にて天然のポリアデニル化変種として発生すると報告されている（３８）。位置２０３のグルタミン酸の存在はＫＬＫ１５が独特な基質特性を有することを示唆する。ＰＳＡはその対応する領域にセリン（Ｓ）残基を有し、キモトリプシン様活性を有する。多くの他のカリクレインは、一般に、この位置にアスパラギン酸（Ｄ）を有し、トリプシン様活性を示す（図２）（６）。
【０１０４】
ＫＬＫ１５蛋白配列は独特であるが、比較分析により、カリクレイン多重遺伝子族の他のメンバーとかなりの程度で相同性を有することが明らかになった。ＫＬＫ１５はトリプシン様セリンプロテアーゼ（ＴＬＳＰ）と５１％の蛋白同一性および６６％の類似性を示し、ニューロプシンおよびＫＬＫ１３蛋白と、各々、４９、４８％の同一性を示す。疎水性分析により、アミノ末端が完全に疎水性であり（図３）、この領域がシグナル配列を受け入れる可能性のあることと矛盾することなく、他のセリンプロテアーゼと類似することが明らかにされた。ＫＬＫ１５蛋白配列のコンピュータ分析はアミノ酸１６と１７の間に切断部位（ＴＡＡ−ＱＤ）を予測した。配列アライメント（図２）はまた、他のセリンプロテアーゼの活性化部位に相同的な部位にて、別の潜在的な切断部位（Ｌｙｓ^２１）を明らかにした［リシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）が大部分のケースで存在する］（３９）。ＫＬＫ１５ポリペプチド全体に均一に数カ所で分配されている疎水性領域は、球状蛋白と一致し、他のカリクレインおよびセリンプロテアーゼと類似する。かくして、他のカリクレインのケースと同様に、ＫＬＫ１５は、おそらく、不活性な２５６アミノ酸のプレプロ酵素先駆体として翻訳されている。プレプロ−ＫＬＫ１５は、プレ領域（１６個で形成されるシグナルペプチド）およびプロペプチド（５個の残基）を構成する２１個の付加的な残基を有する。
【０１０５】
図２に点線で示される領域は、ＫＬＫ１５または他の多重遺伝子族の他のメンバーでは見られない（１０、１１、１３、１４）が、古典的なカリクレイン（ＰＳＡ、ＫＬＫ１およびＫＬＫ２）にある１１−アミノ酸ループ特性を示す。しかしながら、ＫＬＫ１５は、他のカリクレインには見られない、１４８−１５５の位置に独特な８個のアミノ酸ループ（ＨＮＥＰＧＴＡＧ）（配列番号１０）を有する（図２）。セリンプロテアーゼの活性部位を取り巻く２９個の「不変」アミノ酸が記載されている（４０）。もちろん、ＫＬＫ１５でも２９個は保存されている。さらに、非保存アミノ酸の一つ（Ｐｒｏに代わるＳｅｒ^１７３）がプロテアーゼ、ＫＬＫ−Ｌ２およびＫＬＫ−Ｌ５蛋白に見られ、蛋白の進化の研究によれば、同じ基の蛋白に保存して進化的に変更されていることを示す（４１）。１２個システイン残基が推定成熟ＫＬＫ１５蛋白に存在しており；そのうちの１０個がすべてのカリクレインに保存されており、ジスルフィド結合を形成すると考えられる。他の２つ（Ｃ１３１およびＣ２４３）はＰＳＡ、ＫＬＫ１、ＫＬＫ２またはＫＬＫ−Ｌ４には見られないが、他のすべてのカリクレイン遺伝子の同様の位置に見られ、付加的なジスルフィド結合を形成していると考えられる。
【０１０６】
ＫＬＫ１５蛋白と他のセリンプロテアーゼとの系統発生の関連性を推測するために、アミノ酸配列をＵｎｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｐａｉｒ Ｇｒｏｕｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ（ＵＰＧＭＡ）手段およびＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ距離マトリックス法、および「Ｐｒｏｔｐａｒｓ」パルシモニー法を用いて一緒に並べた。得られた系統発生樹はすべて、他のセリンプロテアーゼ（非カリクレイン）が別の群として分類され、それはカリクレインがセリンプロテアーゼの進化における別の工程を示すことを意味するものである。ＫＬＫ１５はＫＬＫ−Ｌ３およびＴＬＳＰと一緒に分類され（図４）、古典的なカリクレイン（ｈＫ１、ｈＫ２およびＰＳＡ）はすべての系図において一緒に分類され、古典的カリクレインとカリクレイン様遺伝子の間の分離は進化の間の初期に生じたことを示唆し、これまでの研究の示唆と一致している（１３）。
【０１０７】
ＫＬＫ１５遺伝子のスプライス変異体
遺伝子特異的プライマー（ＫＬＫ１５−Ｆ２−配列番号４９およびＫＬＫ１５−Ｒ２−配列番号５０）（表１）を用いてＫＬＫ１５転写物をスクリーニングするＰＣＲは、試験した組織ｃＤＮＡの大部分において３本のバンドの存在を明らかにした（図６）。これらのバンドをゲル精製し、クローンし、そして配列決定した。上のバンドは古典的な形態の遺伝子を示し、下のバンドはスプライス変種３である（図７）。真中のバンドは２つの他のスプライス変種を示す。真中のバンドのＰＣＲ産物をＳｔｕＩで制限消化に付し、つづいてゲル分離、せいせいおよび配列決定に付し、それが略同じ長さ（スプライス変種１はエクソン３の１１８ｂｐを欠いているが、エクソン４（１３７ｂｐ）を有しており、その一方で、スプライス変種２はエクソン４を欠いているが、エクソン３の付加的な１１８ｂｐを有する）のスプライス変種１および２からなることを明らかにした。スプライス変種はすべて末端切断された蛋白産物をコードすると考えられる（図５）。
【０１０８】
ＫＬＫ１５遺伝子の染色体局在化
ヒトカリクレイン遺伝子座に及ぶ多くの重複ＢＡＣクローンを制限分析実験に付し、つづいてその領域のＥｃｏＲ１制限地図（ＬＬＮＬウェブサイトから入手可能である）と比較することで、（ＫＬＫ１５遺伝子をハーバーする）ＢＣ７８１１３４にテロメリックに隣接するＢＡＣクローン（ＢＣ２５４７９）の同定が可能となった。２つのクローンの配列をブラストすることでこれらのクローンの末端が重なっていることが明らかにされた。これらのクローンと共にＫＬＫ１、ＫＬＫ３およびＫＬＫ１５遺伝子の位置を同定することにより、これら３つの遺伝子の相対的位置および転写の方向が正確に定められた。ＫＬＫ１が最もセントロメリックであり、その転写の方向はテロメアからセントロメアであって、つづいてＫＬＫ１５がテロメリックであり、同じ方向に転写される。２つの遺伝子の間の距離は１５０１ｂｐの長さである。ＫＬＫ３遺伝子はさらにテロメリックであり、ＫＬＫ１５から２３３３５の距離にあり、逆方向に転写される（図６）。これらの結果は、ＫＬＫ３とＫＬＫ１の間の距離がおよそ約３１Ｋｂであると予測する、これまでの報告と一致している（６、２７）。
【０１０９】
ＫＬＫ１５遺伝子の組織発現およびホルモン制御
図７に示されるように、ＫＬＫ１５遺伝子は甲状腺で高レベルで発現される。前立腺、唾液腺および副腎、結腸、精巣および腎臓においても低レベルの発現が見られる。ＲＴ−ＰＣＲ特異性を確認するために、代表的なＰＣＲ産物をクローンし、配列決定した。図８はＫＬＫ１５遺伝子がヒトＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系においてステロイドホルモンによりアップレギュレートされることを示す。
【０１１０】
前立腺癌におけるＫＬＫ１５発現
正常および癌性前立腺組織でのＫＬＫ１５遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲで試験した。使用するｃＤＮＡの特性および量を裏付けるため、アクチンを対照となる遺伝子として含める。悪性組織と比較した正常組織におけるＫＬＫ１５遺伝子の相対的発現を試験するために、２９対の前立腺組織を試験した。各対は同じ患者より得られる正常および癌性組織を示す。結果を表２に要約する。２９人の患者のうち１３人はＫＬＫ１５発現が癌組織において有意に高く、３人だけが癌組織よりも非癌組織にてＫＬＫ１５の発現が高かった。ＭｃＭｅｍａｒ試験による分析は、正常組織と癌性組織の間の差異が統計的に有意である（Ｐ＝０．０２１）ことを示した。ケースの数が少ないため、２項分布を用いて有意水準をコンピューター処理した。前立腺癌の患者をさらに２つの群：（ａ）ＫＬＫ１５発現−陽性（Ｎ＝２１）と、（ｂ）ＫＬＫ１５発現−陰性（または極めて低い）（Ｎ＝８）に分類した。ＫＬＫ１５発現との関連性を臨床病理学的予後変数と比較した場合、ＫＬＫ１５発現が高いほど、疾患が末期で、腫瘍の等級が高い患者の頻度が高くなることが判明した（表３）。
【０１１１】
論考
カリクレインはセリンプロテアーゼの部分集合である。「カリクレイン」なる語は、一般に、前駆体分子（キニノゲン）に作用し、生物活性なペプチド（キニン）を放出する酵素を記載するために利用される（３、４２）。しかしながら、「組織カリクレイン」なる一般名称は、この酵素の機能的な定義に限定されるものではない。この語は、現在、遺伝子が高度に保存されており、同じ染色体遺伝子座に同時に局在化する蛋白構造を有する一群の酵素を記載するのに使用される。３つの古典的なヒトカリクレイン遺伝子のうち、ＫＬＫ１だけが強力なキニノゲナーゼ活性を有する蛋白をコードする。ＫＬＫ２およびＫＬＫ３遺伝子によりコードされる酵素はキニノゲナーゼ活性が極めて小さい。すでにクローンされている、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの１４のメンバーは、以下に示すような、多くの類似点を有する（７、１１）。
・すべての遺伝子は同じ染色体領域に局在化する（１９ｑ１３．３−ｑ１３．４）。
・すべての遺伝子は適当な位置に触媒性トライアッドが保存されている、すなわち、第２コード化エクソンの末端付近にヒスチジン、第３エクソンの真中にアスパラギン酸、および第５（最終）エクソンの先頭にセリンを有する、推定セリンプロテアーゼをコードする。
・すべての遺伝子は５個のコード化エクソン（いくつかは１またはそれ以上の５／−非翻訳エクソンを含有する）を有する。
・コード化エクソンの大きさは類似しているかまたは同一である。
・イントロン相は完全に保存されている。
・すべての遺伝子はＤＮＡおよびアミノ酸レベルで有意な配列相同性（３０−８０％）を有する。
・これらの多くの遺伝子はステロイドホルモンにより調節される。
【０１１２】
図２および８は新たに同定されたＫＬＫ１５遺伝子が上記した類似性を共有し、かくしてヒトカリクレイン多重遺伝子族の新たなメンバーであることを示す。この遺伝子をＫＬＫ１５と称する。
多くのカリクレイン遺伝子が、その主に発現する組織に応じて、ヒト疾患の病因に関与している。ＫＬＫ１遺伝子は、炎症（３）、高血圧（４４）、腎炎および糖尿病性腎疾患（４５、４６）を含む、多くの疾患プロセスに関係している。ＨＳＣＣＥ（ＫＬＫ７）と、病理学的角質化および乾癬を含む、皮膚疾患との関係が、これまでに報告されている（４７、４８）。Ｌｉｔｔｌｅらは、酵素（ＫＬＫ６）がアミロイド生成性であり、アルツハイマー病の進行に一の役割を果たしていることを示唆している。ニューロプシン（ＫＬＫ８）発現と、癲癇を含む、中枢神経系の疾患との関係を記載する他の報告もある（４９、５０）。ＫＬＫ１５は甲状腺で主に発現するため、この腺を生理学および病理生理学的に正常をするにおいて重要な役割を果たしているかもしれない。発見されている他のカリクレインもすべて調べても、多くは甲状腺で発現するが、この組織で最高に高いレベルで発現するものは他に存在しない（７、１１）。
【０１１３】
ＫＬＫ１５遺伝子は、前立腺癌の部分集合を、ｍＲＮＡレベルでアップレギュレートする。疾患の段階、腫瘍等級およびグリーソン評点で種々の患者の部分集合をＫＬＫ１５の定性発現状態（高いまたは低い）で分けた場合、等級３の腫瘍で、ならびにＩＩＩ期の、グリーソン評点が６より大きい患者の頻度が大きいことが判明した。これらの知見はＫＬＫ１５の過剰発現が該疾患のより悪性の形態と関連しており、予後不良の徴候因子とすることができる（表３）。
【０１１４】
現在では、多くのカリクレインおよびカリクレイン様遺伝子が悪性腫瘍に関係しているという多くの証拠がある。ＰＳＡは今までのところ最も優れた前立腺癌のマーカーである。最近の報告は（ＫＬＫ２遺伝子でコードされた）ｈＫ２が前立腺癌のもう一つ別の有用な診断用マーカーであり得ると示唆している（２１、５１）。ＮＥＳ１（ＫＬＫ１０）は新規な腫瘍抑制剤遺伝子であるようである（２３）。酵素（ＫＬＫ６）遺伝子が主に乳癌および卵巣癌にて特異的に発現され（２４）、ヒト角質層キモトリプシン酵素（ＨＳＣＣＥ；ＫＬＫ７）が卵巣癌にて異常に高いレベルで発現される（２５）ことがわかった。もう一つ別の最近になって同定された、暫定的に腫瘍−関連の特異的に発現される遺伝子−１４と称される、カリクレイン様遺伝子（ＴＡＤＧ−１４／ニューロプシン）（ＫＬＫ８）が、卵巣癌組織の約６０％で過剰発現されていることが判明した（２６）。前立腺／ＫＬＫ−Ｌ１（ＫＬＫ４）、もう一つ別の新たに見出されたカリクレイン様遺伝子が前立腺癌に結合するようである（１３）。２種の新たに見出されたカリクレイン、ＫＬＫ−Ｌ４（ＫＬＫ１３）およびＫＬＫ−Ｌ５（ＫＬＫ１２）もまた、乳癌にてダウンレギュレートされることが判明した（１０）。かくして、広範囲に及ぶ新たな文献は、種々のカリクレイン遺伝子が多くの形態のヒトの癌と複数の関係のあることを示唆する。
【０１１５】
複数の選択的にスプライスされた形態のｍＲＮＡが存在することはカリクレインではよくあることである。主たる１．６ｋｂの転写物に加えて、別個のＲＮＡ種をＰＳＡ遺伝子から転写する（１９、５２、５３）。また、Ｒｅｉｇｍａｎらは選択的にスプライスされた形態のヒト腺カリクレイン２（ＫＬＫ２）遺伝子を同定したことを報告した（５４）。組織カリクレイン遺伝子（ＫＬＫ１）の新たな転写物をさらに結腸から単離した（５５）。ニューロプシン、最近になって同定されたカリクレイン様遺伝子は、主たる形態に加えて、２つの選択的にスプライシングされた形態を有することが判明した（２６、５６）。ＫＬＫ−Ｌ４はまた、異なる選択的にスプライシングされた形態を有することが判明した（１０）。ＫＬＫ１５のスプライス変種は翻訳、分泌および活性化に必要な同一の５’配列を有するため、その変種が分泌蛋白をコードすると仮定することも可能である（５３）。
【０１１６】
最後に、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーの新規なメンバー、ＫＬＫ１５を特徴付け、ヒトカリクレイン遺伝子座（染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４）までの地図を作成する。この遺伝子は古典的形態に加えて３つの関連するスプライス形態を有する。ＫＬＫ１５は、甲状腺において優勢的であるが、種々の組織にて発現され、より悪性の形態の前立腺癌にてアップレギュレートされるようであり、その発現はステロイドホルモンにより影響を受ける。２、３の他のカリクレインは有益な腫瘍マーカーとして既に用いられているため、ＫＬＫ１５にも同様に臨床的な用途を見出すことができる。
【０１１７】
好ましい具体例において、本発明の原理を説明かつ記載したが、当業者であれば、かかる原理から逸脱することなく、本発明を整然と、細部にわたって修飾できることが認識できるであろう。特許請求の範囲内にあるすべての修飾を特許請求するものである。
本明細書に言及されているすべての刊行物、特許および特許出願は、たとえ、個々の刊行物、特許または特許出願が出典明示によりそっくりそのまま本明細書の一部とすることを具体的かつ個別的に意図するものであったとしても、その同じ程度までそっくりそのまま出典を明示することにより本明細書の一部とされる。
【０１１８】
表１
ゲノムＰＣＲ増幅に用いるプライマー

＊すべてのプライマーは５’から３’への方向で表されている。
【０１１９】
表２
２９対の癌性および非癌性前立腺組織におけるＫＬＫ１５発現
ＫＬＫ１５発現　　　　　　　　　　　　　　　　　　患者数　　Ｐ値＊
正常細胞に対して癌細胞にて高い発現　　　　　　　　１３
正常細胞に対して癌細胞にて低い発現　　　　　　　　　３
両細胞にて、略等しいが、高い発現　　　　　　　　　　８
両細胞にて、略等しいが、低い発現（または無し）　　　５　　　０．０２１
＊Ｐ値は２項分布を用いてＭｃＮｅｍａｒ試験により算定した。
【０１２０】
表３
一次性前立腺癌の２９人の患者におけるＫＬＫ１５発現と他の臨床病理学的変数との間の関係

＊フィッシャーの直接確率検定
【０１２１】
明細書に言及されている参考文献の列記
１．　Ｋｒａｕｔ， Ｈ．， Ｋ．， Ｆ． Ｅ．， ａｎｄ Ｗｅｒｌｅ， Ｅ． （１９３０） Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １８９， ９７−１０６
２．　Ｗｅｒｌｅ， Ｅ． （１９３４） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｚ ２６９， ４１５−４３４
３．　Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｊ． （１９９７） ｉｎ Ｔｈｅ Ｋｉｎｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｆａｒｍｅｒ， Ｓ．， ｅｄ）， ｐｐ． ７１−９７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
４．　Ｅｖａｎｓ， Ｂ． Ａ．， Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ， Ｃ． Ｃ．， ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｒ． Ｉ． （１９８７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ８０２７−３４
５．　Ａｓｈｌｅｙ， Ｐ． Ｌ．， ａｎｄ ＭａｃＤｏｎａｌｄ， Ｒ． Ｊ． （１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４， ４５２０−７
６．　Ｒｉｅｇｍａｎ， Ｐ． Ｈ．， Ｖｌｉｅｔｓｔｒａ， Ｒ． Ｊ．， Ｓｕｕｒｍｅｉｊｅｒ， Ｌ．， Ｃｌｅｕｔｊｅｎｓ， Ｃ． Ｂ．， ａｎｄ Ｔｒａｐｍａｎ， Ｊ． （１９９２） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １４， ６−１１
７．　Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ．， Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｌｕｏ， Ｌ． Ｙ．， Ｍａｇｋｌａｒａ， Ａ．， ａｎｄ Ｏｂｉｅｚｕ， Ｃ． Ｖ． （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． １１， ５４−６０
８．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｏｂｉｅｚｕ， Ｃ． Ｖ．， Ｌｕｏ， Ｌ． Ｙ．， Ｂｌａｃｋ， Ｍ． Ｈ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９， ４２５２−６
９．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ３７５１１−６
１０．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｃｈａｎｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （２０００） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５， １１８９１−８．
１１．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （２０００） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６５， １８４−１９４
１２．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｌｕｏ， Ｌ． Ｙ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ．Ｐ． （１９９９） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９， ２８４３−５２
１３．　Ｎｅｌｓｏｎ， Ｐ． Ｓ．， Ｇａｎ， Ｌ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｃ．， Ｍｏｓｓ， Ｐ．， Ｇｅｌｉｎａｓ， Ｒ．， Ｈｏｏｄ， Ｌ．， ａｎｄ Ｗａｎｇ， Ｋ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ９６， ３１１４−９
１４．　Ｌｉｔｔｌｅ， Ｓ． Ｐ．， Ｄｉｘｏｎ， Ｅ． Ｐ．， Ｎｏｒｒｉｓ， Ｆ．， Ｂｕｃｋｌｅｙ， Ｗ．， Ｂｅｃｋｅｒ， Ｇ． Ｗ．， Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｍ．， Ｄｏｂｂｉｎｓ， Ｊ． Ｒ．， Ｗｙｒｉｃｋ， Ｔ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ． Ｒ．， ＭａｃＫｅｌｌａｒ， Ｗ．， Ｈｅｐｂｕｒｎ， Ｄ．， Ｃｏｒｖａｌａｎ， Ｊ．， ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｄ．， Ｌｉｕ， Ｘ．， Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ， Ｄ．， Ｃｌｅｍｅｎｓ， Ｊ．， ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ， Ｅ． Ｍ． （１９９７） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２５１３５−４２
１５．　Ｌｉｕ， Ｘ． Ｌ．， Ｗａｚｅｒ， Ｄ． Ｅ．， Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｋ．， ａｎｄ Ｂａｎｄ， Ｖ． （１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６， ３３７１−９
１６．　Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｌ．， Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ， Ｍ．， Ｂａｃｋｍａｎ， Ａ．， Ｗａｌｌｂｒａｎｄｔ， Ｐ．， Ｃａｒｌｓｔｅｉｎ， Ａ．， ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ， Ｔ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １９４２０−６
１７．　Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｈｉｒａｔａ， Ａ．， ａｎｄ Ｓｈｉｏｓａｋａ， Ｓ． （１９９８） Ｇｅｎｅ ２１３（１−２）， ９−１６
１８．　Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ， Ｓ． Ａ．， Ｖｅｒｉｔｙ， Ｋ．， Ａｓｈｗｏｒｔｈ， Ｌ． Ｋ．， ａｎｄ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｊ． Ａ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ２３２１０−４
１９．　Ｒｉｅｇｍａｎ， Ｐ． Ｈ．， Ｖｌｉｅｔｓｔｒａ， Ｒ． Ｊ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｒｐｕｔ， Ｊ． Ａ．， Ｒｏｍｉｊｎ， Ｊ． Ｃ．， ａｎｄ Ｔｒａｐｍａｎ， Ｊ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５９， ９５−１０２
２０．　Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９８） Ｔｒｅｎｄｓ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．　Ｍｅｔａｂ． ９， ３１０−３１６
２１．　Ｓｔｅｎｍａｎ， Ｕ． Ｈ． （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４５， ７５３−４
２２．　Ｐａｒｔｉｎ， Ａ． Ｗ．， Ｃａｔａｌｏｎａ， Ｗ． Ｊ．， Ｆｉｎｌａｙ， Ｊ． Ａ．， Ｄａｒｔｅ， Ｃ．， Ｔｉｎｄａｌｌ， Ｄ． Ｊ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｃ． Ｙ．， Ｋｌｅｅ， Ｇ． Ｇ．， Ｃｈａｎ， Ｄ． Ｗ．， Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ， Ｈ． Ｇ．， Ｗｏｌｆｅｒｔ， Ｒ． Ｌ．， ａｎｄ Ｗｏｏｄｒｕｍ， Ｄ． Ｌ． （１９９９） Ｕｒｏｌｏｇｙ ５４， ８３９−４５
２３．　Ｇｏｙａｌ， Ｊ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｋ． Ｍ．， Ｃｏｗａｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｗａｚｅｒ， Ｄ． Ｅ．， Ｌｅｅ， Ｓ． Ｗ．， ａｎｄ Ｂａｎｄ， Ｖ． （１９９８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８， ４７８２−６
２４．　Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ， Ａ．， Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ， Ｇ．， Ｓｔｅｎｍａｎ， Ｇ．， Ｍｏｋ， Ｓ． Ｃ．， ａｎｄ Ｓａｇｅｒ， Ｒ． （１９９６） Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ２， ６２４−３６
２５．　Ｔａｎｉｍｏｔｏ， Ｈ．， Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｌ． Ｊ．， Ｓｈｉｇｅｍａｓａ， Ｋ．， Ｙａｎ Ｙａｎ， Ｍ． Ｓ．， Ｃｌａｒｋｅ， Ｊ．， Ｐａｒｍｌｅｙ， Ｔ． Ｈ．， ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｔ． Ｊ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ ８６， ２０７４−８２
２６．　Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ， Ｌ． Ｊ．， Ｔａｎｉｍｏｔｏ， Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｓｈｉｇｅｍａｓａ， Ｋ．， Ｐａｒｍｌｅｙ， Ｔ． Ｈ．， ａｎｄ Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｔ． Ｊ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９（１７）， ４４３５−９
２７．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｃｈａｎｇ， Ａ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （２０００） ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ
２８．　Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ． Ｌ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ． Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ．， ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ． Ｊ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）， ３３８９−４０２
２９．　Ｌｅｎｎｏｎ， Ｇ．， Ａｕｆｆｒａｙ， Ｃ．， Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ， Ｍ．， ａｎｄ Ｓｏａｒｅｓ， Ｍ． Ｂ． （１９９６） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３， １５１−２
３０．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ
３１．　Ｍｅｙｅｒ， Ａ．， Ｊｕｎｇ， Ｋ．， Ｌｅｉｎ， Ｍ．， Ｒｕｄｏｌｐｈ， Ｂ．， Ｓｃｈｎｏｒｒ， Ｄ．， ａｎｄ Ｌｏｅｎｉｎｇ， Ｓ． Ａ． （１９９７） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７４， ６３０−６
３２．　Ｌｕｏ， Ｌ．， Ｈｅｒｂｒｉｃｋ， Ｊ． Ａ．， Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ｓ． Ｗ．， Ｂｅａｔｔｙ， Ｂ．， Ｓｑｕｉｒｅ， Ｊ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４７（３）， ５８０−６
３３．　Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ． Ｍ．， Ｌｕｏ， Ｌ． Ｙ．， Ｓｃｈｅｒｅｒ， Ｓ． Ｗ．， Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ， Ｇ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６２（２）， ２５１−９
３４．　Ｉｉｄａ， Ｙ． （１９９０） Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ． １４５（４）， ５２３−３３
３５．　Ｋｏｚａｋ， Ｍ． （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１５（４）， ８８７−９０３
３６．　Ｋｏｚａｋ， Ｍ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５（２０）， ８１２５−４８
３７．　Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｎ． Ｊ．， ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ， Ｇ． Ｇ． （１９７６） Ｎａｔｕｒｅ ２６３， ２１１−４
３８．　Ｓｈｅｅｔｓ， Ｍ． Ｄ．， Ｏｇｇ， Ｓ． Ｃ．， ａｎｄ Ｗｉｃｋｅｎｓ， Ｍ． Ｐ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８（１９）， ５７９９−８０５
３９．　Ｋｅｉｌ， Ｂ． （１９７１） ｉｎ Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ （Ｐ．Ｄ． Ｂｏｙｅｒ， Ｅ．， ｅｄ） Ｖｏｌ． ３， ３ｒｄ　Ｅｄ．， ｐｐ． ２４９−２７５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
４０．　Ｄａｙｈｏｆｆ， Ｍ． Ｏ． （１９７８） Ｎａｔｌ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｆｏｕｎｄ． ５， ７９−８１
４１．　Ｍｉｙａｔａ， Ｔ．， Ｍｉｙａｚａｗａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｙａｓｕｎａｇａ， Ｔ． （１９７９） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． １２（３）， ２１９−３６
４２．　Ｂｈｏｏｌａ， Ｋ． Ｄ．， Ｆｉｇｕｅｒｏａ， Ｃ． Ｄ．， ａｎｄ Ｗｏｒｔｈｙ， Ｋ． （１９９２） Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ． ４４（１）， １−８０
４３．　Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ．， Ｙｏｕｓｅｆ， Ｇ．， Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎ ｐｒｅｓｓ
４４．　Ｍａｒｇｏｌｉｕｓ， Ｈ． Ｓ．， Ｈｏｒｗｉｔｚ， Ｄ．， Ｐｉｓａｎｏ， Ｊ． Ｊ．， ａｎｄ Ｋｅｉｓｅｒ， Ｈ． Ｒ． （１９７４） Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ３５（６）， ８２０−５
４５．　Ｊａｆｆａ， Ａ． Ａ．， Ｃｈａｉ， Ｋ． Ｘ．， Ｃｈａｏ， Ｊ．， Ｃｈａｏ， Ｌ．， ａｎｄ Ｍａｙｆｉｅｌｄ， Ｒ． Ｋ． （１９９２） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ４１（４）， ７８９−９５
４６．　Ｃｕｍｍｉｎｇ， Ａ． Ｄ．， Ｗａｌｓｈ， Ｔ．， Ｗｏｊｔａｃｈａ， Ｄ．， Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｓ．， Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｄ．， ａｎｄ Ｊｅｎｋｉｎｓ， Ｄ． Ａ． （１９９４） Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ． ８７（１）， ５−１１
４７．　Ｓｏｎｄｅｌｌ， Ｂ．， Ｄｙｂｅｒｇ， Ｐ．， Ａｎｎｅｒｏｔｈ， Ｇ． Ｋ．， Ｏｓｔｍａｎ， Ｐ． Ｏ．， ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ， Ｔ． （１９９６） Ａｃｔａ． Ｄｅｒｍ． Ｖｅｎｅｒｅｏｌ． ７６（３）， １７７−８１
４８．　Ｅｋｈｏｌｍ， Ｅ．， ａｎｄ Ｅｇｅｌｒｕｄ， Ｔ． （１９９９） Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｒｅｓ． ２９１（４）， １９５−２００
４９．　Ｍｏｍｏｔａ， Ｙ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｉｔｏ， Ｊ．， Ｓｈｉｂａｔａ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｋ．， Ｓａｋｕｒａｉ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｋ．， ａｎｄ Ｓｈｉｏｓａｋａ， Ｓ． （１９９８） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０（２）， ７６０−４
５０．　Ｋｉｓｈｉ， Ｔ．， Ｋａｔｏ， Ｍ．， Ｓｈｉｍｉｚｕ， Ｔ．， Ｋａｔｏ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｋ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｓｈｉｏｓａｋａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｈａｋｏｓｈｉｍａ， Ｔ． （１９９９） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ４２２０−４
５１．　Ｂｌａｃｋ， Ｍ． Ｈ．， Ｍａｇｋｌａｒａ， Ａ．， Ｏｂｉｅｚｕ， Ｃ． Ｖ．， Ｍｅｌｅｇｏｓ， Ｄ． Ｎ．， ａｎｄ Ｄｉａｍａｎｄｉｓ， Ｅ． Ｐ． （１９９９） Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４５（６ Ｐｔ １）， ７９０−９
５２．　Ｒｉｅｇｍａｎ， Ｐ． Ｈ．， Ｋｌａａｓｓｅｎ， Ｐ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｒｐｕｔ， Ｊ． Ａ．， Ｒｏｍｉｊｎ， Ｊ． Ｃ．， ａｎｄ Ｔｒａｐｍａｎ， Ｊ． （１９８８） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １５５（１）， １８１−８
５３．　Ｈｅｕｚｅ， Ｎ．， Ｏｌａｙａｔ， Ｓ．， Ｇｕｔｍａｎ， Ｎ．， Ｚａｎｉ， Ｍ． Ｌ．， ａｎｄ Ｃｏｕｒｔｙ， Ｙ． （１９９９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５９， ２８２０−４
５４．　Ｒｉｅｇｍａｎ， Ｐ． Ｈ．， Ｖｌｉｅｔｓｔｒａ， Ｒ． Ｊ．， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｏｒｐｕｔ， Ｈ． Ａ．， Ｒｏｍｉｊｎ， Ｊ． Ｃ．， ａｎｄ Ｔｒａｐｍａｎ， Ｊ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ７６（１−３）， １８１−９０
５５．　Ｃｈｅｎ， Ｌ． Ｍ．， Ｍｕｒｒａｙ， Ｓ． Ｒ．， Ｃｈａｉ， Ｋ． Ｘ．， Ｃｈａｏ， Ｌ．， ａｎｄ Ｃｈａｏ， Ｊ． （１９９４） Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２７（８）， １８２９−３８
５６．　Ｍｉｔｓｕｉ， Ｓ．， Ｔｓｕｒｕｏｋａ， Ｎ．， Ｙａｍａｓｈｉｒｏ， Ｋ．， Ｎａｋａｚａｔｏ， Ｈ．， ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｎ． （１９９９） Ｅｕｒ． Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６０（３）， ６２７−３４

【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＬＫ１５遺伝子のゲノム機構および部分的ゲノム配列を示す。
【図２】ＫＬＫ１５の推定アミノ酸配列と、カリクレインマルチ遺伝子ファミリーのメンバー（配列番号２５−３８）との位置合わせを示す。
【図３】前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）と比較した場合の、ＫＬＫ１５蛋白の疎水性および親水性をプロットした図を示す。
【図４】１５種のカリクレインと他のセリンプロテアーゼについて、推定される系統樹を示す。
【図５】ＫＬＫ１５遺伝子の種々のスプライス変種の模式図である。
【図６】染色体１９ｑ１３．３−ｑ１３．４上のＫＬＫ１、ＫＬＫ１５およびＫＬＫ３遺伝子の相対的位置を示す。
【図７】ＲＴ−ＰＣＲで測定した、ＫＬＫ１５遺伝子の組織発現を示す。
【図８】ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系におけるＫＬＫ１５遺伝子のホルモン調節を示す。
【図９】１５種のカリクレイン遺伝子のコーディング領域を比較した模式図である。

Claims (28)

1. ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４に、あるいは１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の補体に、ハイブリダイズする、少なくとも３０個のヌクレオチドの単離されたＫＬＫ１５核酸分子。
2. （ｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列と実質的な配列同一性を有する蛋白をコードする核酸配列；
   （ｉｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白をコードする核酸配列；
   （ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）と相補的な核酸配列；
   （ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列の縮重形；
   （ｖ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の核酸配列とのハイブリッド形成能を有する核酸配列；
   （ｖｉ）配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白の、トランケーション、アナログ、アレリックまたは種バリエーションをコードする核酸配列；または
   （ｖｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のフラグメントまたはアレリックもしくは種バリエーション
   を含む、単離された核酸分子。
3. （ｉ）１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の配列を含む核酸配列（ここで、ＴはＵとすることもできる）；
   （ｉｉ）（ｉ）に相補的な、好ましくは１またはそれ以上の配列番号１ないし５または１０ないし２４の完全な核酸配列に相補的な核酸配列；
   （ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）または（ｉｉ）の核酸とのハイブリッド形成能を有する、好ましくは少なくとも１８個のヌクレオチドを有する核酸；または
   （ｉｖ）遺伝コードの縮重により、コドン配列にて（ｉ）ないし（ｉｉｉ）の核酸のいずれとも異なる核酸分子
   を含む、単離された核酸分子。
4. 前記した請求項のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
5. 前記した請求項のいずれかに記載の核酸分子を含む宿主細胞。
6. 配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む単離された蛋白。
7. （ａ）請求項４に記載のベクターを宿主細胞に移し；
   （ｂ）形質転換されていない宿主細胞から形質転換されている宿主細胞を選択し；
   （ｃ）蛋白の発現を可能とする条件下で選択された形質転換されている宿主細胞を培養し；
   （ｄ）蛋白を単離する；
   ことを含む、請求項６に記載の蛋白の製法。
8. 請求項７の方法に従って調製される蛋白。
9. 請求項６に記載の蛋白のエピトープに対して特異性を有する抗体。
10. 検出可能な物質で標識されており、生物学的試料、組織または細胞中のポリペプチドを検出するために用いられる、請求項９記載の抗体。
11. 請求項６に記載の蛋白をコードする配列またはその一部を含む、プローブ。
12. 前記した請求項のいずれかに記載の核酸分子または前記した請求項のいずれかに記載の蛋白の存在を測定することにより、請求項６に記載の蛋白と関連する症状を診断し、かつモニター観察する方法。
13. 症状が癌であるところの、請求項１２記載の方法。
14. 請求項６に記載の蛋白と結合する物質を同定する方法であって、
    （ａ）その物質と蛋白とが結合しうる条件下、蛋白と、その蛋白と潜在的に結合しうる少なくとも１つの物質とを反応させ、
    （ｂ）その物質と結合した蛋白を取り出すかまたは検出し、ここで蛋白と物質の結合の検出はその物質がその蛋白と結合することを意味する、
    ことを含む、方法。
15. 化合物の、請求項６に記載の蛋白の生物学的活性を調節する能力を評価する方法であって、物質と蛋白の間で複合体を形成することができる条件下、蛋白を、その蛋白と結合する物質および試験化合物と一緒にし、複合体を取り出しおよび／または検出する、ことを含む方法。
16. ＫＬＫ１５関連蛋白の相互作用の阻害剤の同定方法であって、
    （ａ）ＫＬＫ１５関連蛋白、およびＫＬＫ１５関連蛋白と結合する物質、またはその各々が相互作用する少なくとも一部分を含む反応混合物を得；
    （ｂ）その反応混合物を１またはそれ以上の試験化合物と接触させ；
    （ｃ）ＫＬＫ１５関連蛋白と物質との相互作用を阻害する化合物を同定する、
    ことを含む方法。
17. 生物学的試料中の、配列番号６、７、８または９のアミノ酸配列を含む蛋白をコードする核酸分子を検出する方法であって、
    （ａ）請求項１の核酸分子を生物学的試料の核酸にハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；および
    （ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出し、ここでハイブリダイゼーション複合体の存在は該蛋白をコードする核酸分子が生物学的試料中に存在することと相関している、
    ことを含む方法。
18. ハイブリダイゼーション工程に付す前に、生物学的試料の核酸をポリメラーゼ連鎖反応により増幅させるところの、請求項１７記載の方法。
19. 個体での癌の進行をモニター観察する方法であって、
    （ａ）ＫＬＫ１５関連蛋白に結合する一定量の抗体を、個体由来の試料と接触させ、抗体とＫＬＫ１５関連蛋白を含む二元複合体を試料中で形成させ；
    （ｂ）試料中での複合体の形成の存在またはその量を測定または検出し；
    （ｃ）その後、適切な時点で、工程（ａ）および（ｂ）を繰返し；
    （ｄ）工程（ｂ）の結果と、工程（ｃ）の結果を比較する、ここで複合体の形成量の違いは個体における癌の進行を意味する、
    ことを含む方法。
20. 請求項６に記載の蛋白により媒介される症状の治療方法であって、請求項１５または１６に記載の方法により同定される有効量の化合物を投与することを含む、方法。
21. 症状が癌であるところの、請求項２０記載の方法。
22. １またはそれ以上の、前記した請求項のいずれかに記載の核酸分子または蛋白、あるいは前記した請求項のいずれかに記載の方法を用いて同定される物質または化合物、および医薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む、組成物。
23. １またはそれ以上の、前記した請求項のいずれかに記載の核酸分子または蛋白、あるいは前記した請求項のいずれかに記載の方法を用いて同定される物質または化合物の、請求項６に記載の蛋白または請求項１に記載の核酸分子が媒介する症状を治療するための医薬組成物の調製における使用。
24. 創薬事業を行う方法であって、
    （ａ）１またはそれ以上の検定システムを用いて、ＫＬＫ１５関連蛋白とＫＬＫ１５関連蛋白に結合する物質の相互作用を阻害または亢進するその能力により薬剤を同定し；
    （ｂ）工程（ａ）にて同定された薬剤、またはそのさらなるアナログを、動物における効能および毒性について薬物学的プロファイリングに付し；および
    （ｃ）許容される薬物学的プロファイリングを有するものとして、工程（ｂ）にて同定された１またはそれ以上の薬剤を含む医薬調製物を処方する
    ことを含む、方法。
25. ワクチンを投与した対象にて請求項６に記載の蛋白と拮抗する抗体の産生を刺激または亢進するためのワクチン。
26. 請求項６に記載の蛋白と拮抗する抗体の産生を対象にて刺激または亢進するための方法。
27. 抗体の産生を刺激または亢進するのに効果的な用量にて請求項２５に記載のワクチンを対象に投与することを含む、請求項２６記載の方法。
28. 癌の治療、予防または再発の遅延に効果的な用量にて、請求項２５に記載のワクチンを対象に投与することを含む、癌の治療、予防または再発の遅延方法。

Images