JP2004504358A - 抗腫瘍薬のポリマー複合体 - Google Patents
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Abstract
式(A):P−[W2]p−S0−[W1]r−[D](式中、Pは水溶性ポリマーであり、[W1]は、式−HN−Z1−CO−(式中、Z1は線状又は分枝C2−C12アルキレン鎖又は式−C6H4−CH2−O−の残基を表わす)の残基であり、[W2]は、式−HN−Z2−CO−(式中、Z2はC2−C12の線状又は分枝アルキレン鎖を表わす)の残基であり、p及びrは0又は1であり、S0は、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼの作用によって腫瘍部位で選択的に開裂されるペプチド残基であり、[D]は抗腫瘍薬の残基である)の抗腫瘍薬の水溶性ポリマー複合体。該複合体は遊離薬剤に比べて高い抗腫瘍活性と低い毒性を有する。それらの調製のための方法、有用な中間体及びそれらを含む医薬組成物も記述する。
Description
【0001】
本発明は、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の作用によって腫瘍部位で遊離活性薬剤を放出する抗腫瘍薬のポリマー複合体に関する。この薬剤には、細胞毒性物質又は腫瘍の増殖と拡大に関わる酵素の阻害因子のような抗腫瘍性物質を含む。本発明の第一の目的は、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼの作用によって腫瘍部位において活性薬剤を選択的に放出するポリマー薬剤複合体を提供することである。マトリックスメタロプロテイナーゼ、特にMMP2又はゼラチナーゼA、の腫瘍分泌と実験的転移の間の相関が報告されている(Liotta,L.A.ら、J.Natl.Cancer Inst.,81:556、1989;Nakajima,M.ら、Cancer Res.,47:4869、1987)。MMP2は転移性腫瘍の侵襲最前部の周囲の間質細胞において高度に発現されることが認められた(Salo,T.ら、J.Biol.Chem.,258:3058,1983;Reponen,P.ら、同上、267:7856,1992)。この酵素は、皮膚(Pyke,C.ら、Cancer Res.,52:1336,1992)、肺(Kodate,M.ら、Pathol.International,47:461,1997;Nawrocki,B.ら、International J.of Cancer,72:556,1997)、胃(Endo,K.ら、Anticancer Research,17:225、3,3 1997)、直腸結腸(Liabakk,N.ら、Cancer Res.,56:190,1996;Pyke,C.ら、Am.J.Pathol.,142:359,1993)、***(Gilles,C.ら、Laboratory Invest.,76:651,1997;Davies,B.ら、Br.J.Cancer,67:1126,1993)、前立腺(Stearns,M.E.ら、Oncology Res.,8:69、1996)、卵巣(Fishman,D.ら、Invasion & Metastasis,16:150,1996)及び膀胱(Miyake H.ら、J.of Urology,157:2351,1997)を含めて、様々な腫瘍型において発現される。
【0002】
種々のクラスの抗腫瘍薬のポリマー複合体が既にPCT特許願第WO99/17805号及びWO99/17804号ならびに米国特許第5,773,522号及び5,618,790号の中で開示されている。
【0003】
本発明は、一般式(A):
【0004】
【化8】
(式中、Pは水溶性ポリマーであり、
[W1]は、式−HN−Z1−CO−(式中、Z1は線状又は分枝C2−C12アルキレン鎖又は式−C6H4−CH2−O−の残基を表わす)の残基であり、
[W2]は、式−HN−Z2−CO−(式中、Z2はC2−C12の線状又は分枝アルキレン鎖を表わす)の残基であり、
p及びrは0又は1であり、
S0は、マトリックスメタロプロテイナーゼの作用によって腫瘍部位で選択的に開裂されうるペプチド残基であり、および
[D]は抗腫瘍薬の残基である)
のポリマー薬剤複合体を提供する。
【0005】
それ故、発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、特にゼラチナーゼによって開裂されて、式S1−[W1]r−[D](式中、S1はS0から誘導されるペプチドであり、[W1]、[D]及びrは上記で定義したとおりである)の中間体を放出し、かかる中間体から抗腫瘍薬Dが自然に又は腫瘍組織中に存在する蛋白質分解酵素の作用によって放出される、一般式(A)の抗腫瘍薬のポリマー複合体を提供する。
【0006】
本発明のもう1つの局面は、一般式(A)の新規ポリマー薬剤複合体の投与を含む、固体腫瘍を治療する方法を提供することである。
【0007】
好ましくは、Pは、ポリグルタミン酸、カルボキシル化デキストラン、カルボキシル化ポリエチレングリコール又はヒドロキシプロピルメタアクリルアミドに基づくポリマーのような水溶性ポリマーである。最も好ましくは、PはN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド(HPMA)に基づくポリマーである。
【0008】
好ましくは[W1]は存在しないか、すなわちr=0であるか、又は自己犠牲性p−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーである(J.Med.Chem.vol.24、479(1991);PABC、−pHN−C6H4−CH2−O−CO−参照)。Z1及びZ2が表わしうるC2−C12アルキレン鎖は、式(CH2)3−;−CH2−C(CH3)2−CH2;及び−(CH2)5−の残基を含む。好ましくは[W2]は6−アミノヘキサン酸の残基、Z2=−(CH2)5−である。
【0009】
ペプチドS0は4から5個の天然又は合成アミノ酸からの配列を含む。
【0010】
好ましくは、ペプチドS0は、
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Leu(配列番号3)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Trp−Gly(配列番号4)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−pFP−Gly(配列番号5)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Trp(配列番号9)、Smc−GIy−Cys(Bn)−pFF(配列番号10)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Trp−Gly(配列番号12)、Smc−Gly−Cys(Bn)−pFF−Gly(配列番号13)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号15)、Smc−Gly−Leu−Trp(配列番号16)、Smc−Gly−Tha−Trp(配列番号17)、Smc−Gly−Met−Trp(配列番号18)、Smc−Gly−Tha−Trp−Gly(配列番号19)、Smc−Gly−Met−Trp−Gly(配列番号20)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)、Leu−Gly−Leu−Trp(配列番号26)、Leu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)またはLeu−Gly−Leu−Trp−Gly(配列番号28)
を表わす。
【0011】
最も好ましいペプチド配列S0は、
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−GIy(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−GIy(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)Leu−Gly(配列番号15)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)またはLeu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)である。本明細書において、Leuはロイシンであり、Trpはトリプトファンであり、Metはメチオニンであり、Met(O)はメチオニンスルホキシドであり、Cys(Bn)はS−ベンジル−システインであり、SmcはS−メチルシステインであり、Thaはチエニルアラニンであり、pFFはp−フルオロフェニルグリシンであり、Glyはグリシンである。
【0012】
薬剤残基[D]は、リンカーW1又はペプチドS0の結合のための官能基を担う抗腫瘍薬の残基である。そのような官能基は、ヒドロキシ、カルボニル、カルボキシ、第一又は第二アミノ基及びスルフィドリルを含む。好ましい抗腫瘍薬は、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン、タキサン、細胞傷害性ヌクレオシド、カンプトテシン、ポドフィロトキシン、アルキル化剤のクラスに属する細胞傷害性物質を含む。それらのクラスの成員は、例えば、4−デアセチル−ビンブラスチン、4−デアセチル−ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、4’−エピドキソルビシン、ダウノルビシン、4−デメトキシ−ダウノルビシン、4’−デオキシ−4’−ヨードドキソルビシン、3’−(2−メトキシモルホリノ)ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、5−フルオロウラシル、カンプトテシン、7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン、9−アミノカンプトテシン、エトポシド、エストラムスチンを含む。本発明の他の抗腫瘍薬は、腫瘍の増殖と拡大に関わる酵素の阻害因子を含む。
【0013】
本発明はまた、一般式(A)の薬剤複合体を調製するための方法であって、一般式(1)の化合物又は式(1’)の対応する塩誘導体:
【0014】
【化9】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、S0及び[D]は上記で定義したとおりであり、そしてRHは酸である)を、化合物(1)又は(1’)との結合のための適当な官能基を担うポリマーP1と反応させることを含む方法を提供する。化合物(1)又は(1’)への結合のためのポリマーP1上の適当な官能基は、p−ニトロフェニルエステル又はイミダゾイルエステルエステルのようなカルボキシル基又は活性化カルボキシル基を含む。好ましくは、(1’)におけるRHはHCl又はCF3COOHを表わす。
【0015】
式(1)の化合物及び対応する塩誘導体(1’)も、本発明によって提供される。それらは下記のような種々の合成方法に従って調製することができる。1つの方法は、好ましくは酸性条件下で、式(2):
【0016】
【化10】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、[D]及びS0は上記で定義したとおりであり、R2は、Boc(t−ブトキシカルボニル)、Fmoc、トリフェニルシリル、ジフェニルメチレン又はトリフェニルメチルのようなアミノ保護基を表わす)
の誘導体からN保護基を除去して、上記で定義したような一般式(1)又は一般式(1’)の化合物を生成し、任意に、弱塩基処理によって一般式(1’)の化合物を対応する遊離アミノ誘導体(1)に転換することを含む。
【0017】
式(2)の誘導体は、好ましくは、式(3)の化合物を式(4)の化合物
【0018】
【化11】
(式中、[W1]、[W2]、R2、p、rは上記で定義したとおりであり、R1はヒドロキシ基又はp−ニトロフェノキシ又はN−ヒドロキシスクシニミド基のような活性化エステルの残基又は塩素のようなハロゲンであり、そしてSx、Syは、独立して、アミノ酸であるか又は任意に縮合剤の存在下で、互いに連結されたとき上記で定義したようなペプチド残基S0を形成することを特徴とするペプチド残基である)と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を得ることを含む方法で調製される。好ましくは、SyはMet(O)−Gly、Smc−Gly又はLeu−Glyを表わし、SxはCys(Bn)−Leu、Cys(Bn)−Gly、Cys(Bn)−Gly−Leu、Cys(Bn)−Trp−Gly、−Cys(Bn)−pFF−Gly、Cys(Bn)−Gly−Gly、Cys(Bn)−Leu−Gly、Cys(Bn)−Trp、Cys(Bn)−pFF、Leu−Trp、Tha−Trp、Met−Trp、Tha−Trp−Gly、Met−Trp−Gly、Leu−Leu、Leu−Leu−Gly又はLeu−Trp−Glyを表わす。
【0019】
式(2)の誘導体はまた、リンカーW1又はペプチドS0への結合のための官能基を担う抗腫瘍薬Dを、式(5):
【0020】
【化12】
(式中、[W1]、[W2]、R2、R1、p、r及びS0は上記で定義したとおりである)のN保護された誘導体と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を生成することを含む方法でも調製しうる。
【0021】
上記で定義したような式(2)の化合物の調製のための代替的方法は、例えば:
a)薬剤Dを式(6):
【0022】
【化13】
(式中、W1、r、R1及びR2は先に定義したとおりである)
の化合物と反応させ、
b)生じた式(7):
【0023】
【化14】
(式中、W1、r、R2及び[D]は先に定義したとおりである)
の化合物から保護基を除去し、
c)生じた式(8):
【0024】
【化15】
(式中、W1、r及び[D]は先に定義したとおりである)
の誘導体を、式(9):
【0025】
【化16】
(式中、W2、R1、R2、p及びS0は先に定義したとおりである)
のN保護された誘導体と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を得ることを含む。式(2)の化合物の調製のためのもう1つの方法は、遊離塩基(10):
【0026】
【化17】
(式中、W1、[D]、r及びS0は先に定義したとおりである)
を、式(11):
【0027】
【化18】
(式中、W2、p、R1及びR2は先に定義したとおりである)
のN保護された活性化化合物と反応させて、上記で定義したような式(2)の化合物を得ることを含む。
【0028】
式(4)、(5)及び(9)の化合物の調製は、ペプチドの調製のための既知の手法に従う。例えば、N保護されたアミノ酸を段階的に加えることを通して、ワン(Wang)樹脂のような固体樹脂に結合された鎖を伸長させる固相合成法を使用することによる。好ましくはN保護基はFmocである。N保護されたアミノ酸のC末端を、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)のような有機塩基の存在下に塩化メチレンのような非プロトン性溶媒中で樹脂に結合する。標準的な脱保護/結合サイクルの反復によって鎖の伸長が達成される。好ましくは、N−メチル−2−ピロリドン中ピペリジン20%でFmoc保護基をブロック解除し、N−メチル−2−ピロリドン中TBTU、HOBt、DIPEAで結合段階を実施する。樹脂の開裂は、塩化メチレン、酢酸、トリフルオロ酢酸(3/1/1 v/v)又は塩化メチレン、トリフルオロ酢酸(99/1 v/v)の混合物によって実施しうる。
【0029】
式(3)及び(10)の化合物は、上記で定義したような化合物(8)をN保護されたアミノ酸又はペプチドと連続的に反応させることによって調製しうる。式(6)、(7)、(8)及び(11)の出発化合物の調製は既知の手順に従う。式(1)の化合物の調製は、我々の先のPCT特許願第WO99/17805号及びWO99/17804号ならびに米国特許第5,773,522号及び5,618,790号に述べられているのと同様の合成手順に従う。
【0030】
ポリマー薬剤複合体(A)の製造のための中間体である、式(1)及び式(1’)の薬剤複合体の調製を下記の合成スキームに示す。例えばスキーム1では、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシン塩誘導体(1’a)の調製が例示されている。合成方法は、7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシン(D1:12)へのN保護されたアミノ酸の連続的な結合を含む。特に、(12)を、アルゴン下に4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)のような活性化剤の存在下で、ジメチルスルホキシドのような無水非プロトン性溶媒中過剰のモル、例えば3モル当量までのN−t−ブトキシカルボニル−グリシンp−ニトロフェニルエステル(Boc−Gly−ONP)と反応させる。このようにして、保護されたアミノ酸を化合物(12)のC−10とC−20の両方のヒドロキシル化位置に導入する。反応は、典型的には8−48時間実施することができる。反応は、典型的には15−40℃の温度で実施する。モルホリン、1−アミノ−プロリノールのような第二アミンの存在下でC−10の位置の置換基を除去して、C−20位のモノ置換N−Boc−グリシル−誘導体(13)を得る。10°−30℃の温度で10分間から6時間、好ましくは室温で30分間、酢酸又は95%水性トリフルオロ酢酸中1.5N HClのような酸処理によってアミノ保護基を除去し、酸性塩の形態の20−O−グリシル−誘導体(14’)を得ることができる。第二のアミノ酸、ロイシンは、化合物(14’)を、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオボレート(TBTU)及びジイソプロピルアミン(DIPEA)のような縮合剤の存在下に、無水非プロトン性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド中過剰のモル、例えば2モル当量までのN−t−ブトキシカルボニル−ロイシン(Boc−Leu−OH)と反応させることによって導入しうる。反応は、典型的には8−48時間実施することができる。反応は、典型的には15−40℃の温度で実施する。モルホリンで処理し、次いで化合物(15)のN保護基を酸置換して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(ロイシル−グリシル)−カンプトテシン(16’)を得る。次に、トリフルオロ酢酸塩誘導体のような塩の形態で最終中間体(1’a)を生成するためのロイシンの結合に関して先に述べたのと同じ条件で、この化合物をN−t−ブトキシカルボニル−S−ベンジルシステインで処理して、化合物(17)及びN−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシルを得る。
【0031】
【化19】
【0032】
スキーム2は、配列、6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル(1c)を担う4−デアセチルビンブラスチンの複合体を調製するための方法を示す。方法は、硫酸ビンブラスチン(20)から出発し、それを最初にアルカリ処理によって遊離塩基に変換して、次に乾燥メタノール中ナトリウムメチラートを用いてC−4位で脱アシル化して化合物(21)を生成する。4−デアセチル−ビンブラスチン(21)を、塩化アシルの形態の、Fmoc誘導体のようなN保護されたロイシルの誘導体と反応させて、Fmoc−ロイシル−誘導体(22)を得る。化合物(23)を生成するためのN保護基の除去は、典型的にはジメチルホルムアミド中のピペリジンの混合物において実施する。6−アミノヘキサノイル−ロイシル−ロイシル−グリシルの連結は、典型的には、N保護基の除去と塩形成後に(1c’)を生成するために前述したように実施する。
【0033】
【化20】
【0034】
先に示したように、式(1)又は(1’)の化合物は、本発明の目的である式(A)のポリマー抗癌薬の製造のための有用な中間体である。
【0035】
本発明の範囲を限定することなく、水溶性ポリマーPがN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド(HPMA)に基づく、式(A)のポリマー薬剤複合体の例を下記に報告する。
【0036】
そのような場合、(A)として示すポリマー薬剤複合体は、
(i)85から97mol%の、式(25):
【0037】
【化21】
によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位、
(ii)3−15mol%の、式(26):
【0038】
【化22】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、[D]及びS0は上記で定義したとおりである)
によって表わされる単位、
(iii)0から12mol%の、式(27):
【0039】
【化23】
(式中、R3はヒドロキシ基又は式−NH−CH2−CH(OH)−CH3の残基を表わす)
によって表わされるN−メタアクリロイル−グリシン又はN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイル−グリシンアミド単位
から成る可溶性ポリマーP’を含む。
【0040】
このポリマー薬剤複合体(A)はまた、次のように表わすこともできる:
[(25)]x;[(26)]y;[(27)]z
(式中、(25)、(26)及び(27)は上記で定義した式の単位であり、xは85から97mol%、yは3から15mol%、そしてzは0から12mol%である)。
【0041】
好ましくは、上記で定義したようなこのポリマー薬剤複合体(A)は、式(25)によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位を90%又はそれ以上、より好ましくは90%の割合で含む。複合体はまた、3から10mol%、より好ましくは10mol%の、式(26)によって表わされるメタアクリロイル−グリシル−誘導体を含みうる。好ましくは、(A)は式(27)の残基を含まない、すなわちzは0である。
【0042】
本発明はまた、式(A)の薬剤複合体を調製するための方法であって、一般式(1)の化合物を、
(i)85から97mol%の、上記で定義したような式(25)によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位、及び
(ii)3から15mol%の、式(28):
【0043】
【化24】
(式中、R4は活性エステルの残基である)
によって表わされるN−メタアクリロイル−グリシル単位から必須として成る活性化ポリマーP1’と反応させること、および任意に残存する活性エステル基を1−アミノ−2−プロパノールで置換することを含む方法を提供する。
【0044】
式P1’のポリマーは既にMakromol.Chem.178、2159(1977)の中で記述されている。好ましくは、式(28)中のR4が活性エステルの残基を表わすポリマー(P1’)と、ポリマー薬剤複合体(A)を調製するための式(1)の化合物との間の反応は、ジメチルスルホキシドのような無水極性有機溶媒中で実施する。反応は、典型的には15から30℃の温度、好ましくは室温で15時間実施することができ、その後室温で30分間から1時間、1−アミノ−2−プロパノールの存在下に、残存する活性エステル基のアミノリシスを実施することができる。複合体を酢酸エチルで適切に沈殿させ、エタノールに溶解して、酢酸エチルで沈殿させる。
【0045】
例えば、乾燥ジメチルスルホキシド中15%(w/v)の濃度で提供される、式(28)のR4がp−ニトロフェノールのような活性エステルの残基を表わすポリマーP1’を、室温で15時間、DPEA又はトリエチルアミンのような第三アミンの存在下に、式(1’a−1’c)の化合物、3%(w/v)で処理する。次にDMF中1−アミノ−2−プロパノール、0.1%(w/v)を加え、反応混合物を室温で8時間保持する。生じたポリマー薬剤複合体(A1a−A1c)を酢酸エチルで沈殿させ、収集して、酢酸エチルで洗い、その後10%(w/v)の濃度で無水エタノールに溶解して、スルホン酸樹脂で処理し、ろ過して、再び酢酸エチルで沈殿させる。
【0046】
方法をスキーム3及び4に示す。
【0047】
【化25】
【0048】
本発明のポリマー複合体中の活性薬剤の含量は、HPLC又は吸光分光分析によって決定する。
【0049】
式(A)のポリマー薬剤複合体は、5,000から45,000、好ましくは12,000から25,000の範囲の分子量である。式(A)の化合物及び本発明の他の化合物は水溶性であり、遊離薬剤と比較して高い抗腫瘍活性と低い毒性を示す。それらは、白血病及び結腸、結腸直腸、卵巣、***、前立腺、肺、腎腫瘍のような固体腫瘍、そしてまた黒色腫の治療においても有用である。それ故、治療上有効な量の本発明のポリマー複合体を投与することを含む方法によってヒトを治療することができる。それによってヒト患者の状態を改善することができる。
【0050】
採用する用量範囲は、投与経路ならびに治療する患者の年齢、体重及び状態に依存するであろう。式(A)のポリマー薬剤複合体ならびに式(1’)の可溶性塩誘導体は、典型的には非経口経路によって、例えば筋肉内、静脈内又はボーラス注入によって投与される。適当な用量範囲は、体表面積1m2当り1から1000mg当量の活性薬剤、例えば10から500mg/m2である。
【0051】
ポリマー薬剤複合体(A)又は式(1’)の可溶性塩誘導体は、製薬上許容される担体又は希釈剤と共に製薬組成物に製剤することができる。典型的にはそれらは、例えば注射用蒸留水又は生理食塩水に溶解することにより、非経口投与用に製剤される。
【0052】
酵素アッセイ
式(A)のポリマー薬剤複合体のインビトロでの分解を、緩衝液中、及びいくつかの蛋白質分解酵素(マトリックスメタロプロテイナーゼ、MMP、セリンプロテアーゼ(エラスターゼ))の存在下で、及び血漿中で検討した。
【0053】
ポリマー薬剤複合体(A)を10mMの標準濃度で滅菌蒸留水に溶解した。濃度はポリマー充填パーセンテージ(5−10重量%薬剤)に従って薬剤の当量として算定した。0.15M NaCl、10μM CaCl2、0.01mM酢酸亜鉛及び0.05%C12E9を含む50mM Tris/HCl pH7.4緩衝液中で化合物(A)を検定した。ポリマー薬剤複合体を5から1000μMの範囲の異なる濃度で、緩衝液中37℃で5分間平衡させる。50μMの最終濃度まで酵素(MMP)を加えて反応を開始させる。0.05%TFA緩衝液(pH2.5)を加えることにより、ポリマー薬剤複合体の5%以内の加水分解で酵素反応を停止させ、その後アクアポアOD300カラムを通してRP−HPLCによって分析する。
【0054】
RP−HPLCによって反応産物の定量を行う。例えば、ISS 200自動試料採取器、Series 200LCポンプ及びLC240蛍光検出器から成るPerkin Elmer HPLC、又は代替的に、717プラス自動試料採取器、Model 600ポンプ及びModel 474蛍光分析器から成るWaters HPLCを用いる。
【0055】
我々は、本発明の式(A)及び(1’)の化合物がゼラチナーゼの存在下で抗腫瘍薬Dを選択的に放出し、血漿中及び他の蛋白質分解酵素の存在下で実質的に安定であることを認めた。
【0056】
下記の実施例は本発明を例示するものである。
【0057】
実施例1:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−グリシル−カンプトテシントリフルオロアセテート(14’)
7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシン(12)(2.1g、5.3mmol)を無水ジメチルスルホキシド(50ml)に溶解し、N−t−ブトキシカルボニル−グリシンp−ニトロフェニルエステル(4.8g、16.2mmol)及びジメチルアミノピリジン(0.8g、6.5mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間、攪拌しながらアルゴン気体中に保持した。その後モルホリン(4.6ml)を加え、反応混合物を室温で24時間攪拌した。次に塩化メチレン(200ml)と水性0.5N HClを加えた。有機相を分離し、水(3×200ml)で洗った。有機溶媒を減圧下で除去して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(t−ブトキシカルボニル−グリシル)−カンプトテシン(13)を得た。キーセルゲル(kieselgel)プレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(95/5 v/v)溶出系、Rf=0.3。
【0058】
化合物(13)をトリフルオロ酢酸(95%水溶液50ml)に溶解し、1時間後、減圧下で溶媒を除去して、トリフルオロ酢酸塩誘導体の形態で表題の化合物(14’、収量3g)を得た。
【0059】
実施例2:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(16’)
N−t−ブトキシカルボニル−ロイシン(2.49g、10mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.53g、10mmol)、O−(ベンゾトリアゾール−1イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオボレート(TBTU)(3.21g、10mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(3.5ml、20mmol)を含むジメチルホルムアミド(50ml)の溶液を、30分後に、DIPEA(1.75ml、10mmol)を含むジメチルホルムアミド(20ml)中、実施例1で述べたように調製した化合物(14’)(3g、5.28mmol)の溶液と混合した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。次にモルホリン(4.5ml、5.6mmol)を加え、混合物を6時間攪拌した。その後減圧下で溶媒を蒸発させ、残留物を塩化メチレン(200ml)で溶解し、水性0.5N HCl、水性5%NaHCO3(200ml)及び水(2×200ml)で洗った。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後減圧下で溶媒を除去して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−t−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル)−カンプトテシン(16)を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(95/5 v/v)溶出系、Rf=0.5。
【0060】
化合物(16)をトリフルオロ酢酸(95%水溶液50ml)に溶解し、1時間後、減圧下で溶媒を除去して表題の化合物(16’、収量3g)を得、それをエチルエーテルによりトリフルオロ酢酸塩誘導体の形態で収集した。
【0061】
実施例3:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(18’)
化合物(16’:3g)を、実施例2で述べたのと同じ条件に従ってN−t−ブトキシカルボニル−(S−ベンジル−システイン)と反応させ、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−t−ブトキシカルボニル−(S−ベンジル−システイニル)−(ロイシル−グリシル))−カンプトテシン(17’)を得、それを実施例2で述べたようにして表題の化合物(18’)に変換した。
【0062】
実施例4:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(1’a)
N−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシン(0.358g、0.57mmol)を含むジメチルホルムアミド(DMF、5ml)の溶液を、ジメチルホルムアミド(2ml)中の化合物(18’)(0.257g、0.76mmol)の溶液と混合し、その後Boc保護基を除去することにより、実施例2で述べたのと同じ条件に従って表題の化合物を調製した。
【0063】
実施例5:N−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−メタアクリロイル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)カンプトテシン及びN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルグリシンアミドのコポリマー(A1a)
ポリマー(P1’)(0.756g)の無水ジメチルスルホキシド(4ml)中の溶液に、実施例4で述べたように調製した7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(1’a)(0.23g、0.193mmol)及びトリエチルアミン(0.53ml、0.396mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間、攪拌しながらアルゴン気体中に保持した。次にジメチルホルムアミド(10ml)中の1−アミノ−2−プロパノール(0.3ml)の溶液0.1mlを加えて、8時間攪拌を続けた。その後酢酸エチル(200ml)を攪拌しながら反応混合物に加えた。沈殿物を採集し、酢酸エチルで洗って、エタノール(8ml)で溶解し、スルホン酸樹脂(DOWEX 50−スルホン酸)で30分間処理した。溶液をろ過し、酢酸エチルで沈殿させた。生じた固体をエチルエーテルで洗い、恒量で乾燥して、表題の化合物(A1a)を得た。収量0.8g;分子量20,800、多分散性1.48、7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシンの充填7.5%(w/w%)。
【0064】
実施例6:4−デアセチル−4−O−ロイシル−ビンブラスチン(23)
水中(15ml)の硫酸ビンブラスチン(20)(1.5g、1.65mmol)の溶液に、強く攪拌しながら塩化メチレン(15ml)と濃アンモニア(1.5ml)を加えた。5分後に混合物を傾瀉し、水相を塩化メチレン(3×15ml)で抽出した。混合有機相を水(30ml)とブライン(30ml)で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で蒸発させて遊離塩基形態のビンブラスチンを得、それをエチルエーテルとヘキサン(1:1)の混合物で沈殿させた後収集した。収量1.31g(1.61mmol、98%収率)。
【0065】
ビンブラスチン遊離塩基(60mg、0.06mmol)を乾燥メタノール(5ml)に溶解し、メトキシドナトリウム(NaOCH3、190mg;乾燥メタノール7ml)の溶液に加えて、室温で3時間攪拌した。その後反応混合物を塩化メチレンで希釈し、冷ブライン、次にNaHCO3の水溶液で2回、そして最後に再びブラインでpH7−8まで洗った。有機相を分離して取り、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で溶媒を除去して、4−デアセチルビンブラスチン(21)(46mg)のオフホワイト色の結晶性固体を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.34。
【0066】
無水ピリジン(4.5ml)中の化合物(21)(0.2g、0.26mmol)を、無水塩化メチレン(1.9ml)に溶解したFmoc−Leu−Cl(0.385g、1.04mmol)の溶液で処理した。反応混合物を室温で12時間保持した。その後水(0.5ml)を反応混合物に加えて過剰の酸性塩化物を破壊し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物を酢酸エチルと飽和NaHCO3の間で分配し、ブラインで洗った。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後減圧下で溶媒を除去した。残留物を室温でピペリジン(1.3ml)と無水DMF(2.7ml)の混合物に溶解した。30分後に減圧下で溶媒を除去し、クロロホルムとメタノール(95/5 v/v)を溶出系として使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって粗油を精製し、表題の化合物(23)(0.178g、62%収率)を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.3。
【0067】
実施例7:4−デアセチル−4−O−(6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル)−ビンブラスチントリフルオロアセテート(1’c)
N−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル(0.17g、0.32mmol)を、4−デアセチル−4−O−ロイシル−ビンブラスチン(23)(0.28g、0.32mmol)、TBTU(0.1g、0.32mmol)及びHOBt(0.05g、0.32mmol)と共に乾燥ジメチルホルムアミド(6ml)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(0.1ml、0.26mmol)を加えた後、反応混合物を48時間攪拌した。次に減圧下で溶媒を除去し、残留物を塩化メチレンと飽和NaHCO3の間で分配した。有機相を再び飽和NaHCO3で洗い、最後にブラインで洗った。無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去して粗油を得、それを、クロロホルム/メタノール(95/5 v/v)の混合物を溶出系として使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、4−デアセチル−4−O−(t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル)−ビンブラスチン(24)(0.32g、75%収率)を得た。kieselgelプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.59。
【0068】
化合物(24)を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸50%(2.5ml)で処理した。室温で2時間攪拌したあと、減圧下で溶媒を除去し、残留物をトルエンで2回処理して乾燥させ、表題の化合物(1c’)をジ−トリフルオロ酢酸塩として得た。
【0069】
実施例8:N−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド、4−O−(N−メタアクリロイル−グリシル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル)−ビンブラスチン及びN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルグリシンアミドのコポリマー(A1c)
実施例7で述べたように調製した化合物(1’c:0.3g、0.22mmol)を無水ジメチルスルホキシド(1.5ml)に溶解し、無水ジメチルスルホキシド(6ml)に溶解した(P’1)(1.5g)の溶液に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン(0.7ml、0.25mmol)を加えた。室温で24時間攪拌したあと、1−アミノ−2−プロパノール(0.1ml)を反応混合物に加え、1時間後、反応混合物を酢酸エチル(100ml)に注ぎ入れた。(A1c)を含む沈殿物をろ過し、エチルエーテルで洗って、その後水(HPLCグレード)15mlに溶解し、G−25サイズ排除カートリッジで精製した(7回、溶離液:水)。プールした分画から、凍結乾燥後に表題の化合物(A1c)(1.2g、78%収率)を得た。
【0070】
抗腫瘍活性
化合物(A1a)を、i.v.経路により遊離薬剤7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン(12)と比較して、ヌードマウスに移植したヒト結腸癌(HT29)に関して試験した。A1aは試験したすべての用量で非毒性であることが認められ、20mg/kgの最高試験用量で98%の腫瘍阻害を与えた(表1)。
【0071】
【表1】
本発明は、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の作用によって腫瘍部位で遊離活性薬剤を放出する抗腫瘍薬のポリマー複合体に関する。この薬剤には、細胞毒性物質又は腫瘍の増殖と拡大に関わる酵素の阻害因子のような抗腫瘍性物質を含む。本発明の第一の目的は、主としてマトリックスメタロプロテイナーゼ、ゼラチナーゼの作用によって腫瘍部位において活性薬剤を選択的に放出するポリマー薬剤複合体を提供することである。マトリックスメタロプロテイナーゼ、特にMMP2又はゼラチナーゼA、の腫瘍分泌と実験的転移の間の相関が報告されている(Liotta,L.A.ら、J.Natl.Cancer Inst.,81:556、1989;Nakajima,M.ら、Cancer Res.,47:4869、1987)。MMP2は転移性腫瘍の侵襲最前部の周囲の間質細胞において高度に発現されることが認められた(Salo,T.ら、J.Biol.Chem.,258:3058,1983;Reponen,P.ら、同上、267:7856,1992)。この酵素は、皮膚(Pyke,C.ら、Cancer Res.,52:1336,1992)、肺(Kodate,M.ら、Pathol.International,47:461,1997;Nawrocki,B.ら、International J.of Cancer,72:556,1997)、胃(Endo,K.ら、Anticancer Research,17:225、3,3 1997)、直腸結腸(Liabakk,N.ら、Cancer Res.,56:190,1996;Pyke,C.ら、Am.J.Pathol.,142:359,1993)、***(Gilles,C.ら、Laboratory Invest.,76:651,1997;Davies,B.ら、Br.J.Cancer,67:1126,1993)、前立腺(Stearns,M.E.ら、Oncology Res.,8:69、1996)、卵巣(Fishman,D.ら、Invasion & Metastasis,16:150,1996)及び膀胱(Miyake H.ら、J.of Urology,157:2351,1997)を含めて、様々な腫瘍型において発現される。
【0002】
種々のクラスの抗腫瘍薬のポリマー複合体が既にPCT特許願第WO99/17805号及びWO99/17804号ならびに米国特許第5,773,522号及び5,618,790号の中で開示されている。
【0003】
本発明は、一般式(A):
【0004】
【化8】
(式中、Pは水溶性ポリマーであり、
[W1]は、式−HN−Z1−CO−(式中、Z1は線状又は分枝C2−C12アルキレン鎖又は式−C6H4−CH2−O−の残基を表わす)の残基であり、
[W2]は、式−HN−Z2−CO−(式中、Z2はC2−C12の線状又は分枝アルキレン鎖を表わす)の残基であり、
p及びrは0又は1であり、
S0は、マトリックスメタロプロテイナーゼの作用によって腫瘍部位で選択的に開裂されうるペプチド残基であり、および
[D]は抗腫瘍薬の残基である)
のポリマー薬剤複合体を提供する。
【0005】
それ故、発明は、マトリックスメタロプロテイナーゼ、特にゼラチナーゼによって開裂されて、式S1−[W1]r−[D](式中、S1はS0から誘導されるペプチドであり、[W1]、[D]及びrは上記で定義したとおりである)の中間体を放出し、かかる中間体から抗腫瘍薬Dが自然に又は腫瘍組織中に存在する蛋白質分解酵素の作用によって放出される、一般式(A)の抗腫瘍薬のポリマー複合体を提供する。
【0006】
本発明のもう1つの局面は、一般式(A)の新規ポリマー薬剤複合体の投与を含む、固体腫瘍を治療する方法を提供することである。
【0007】
好ましくは、Pは、ポリグルタミン酸、カルボキシル化デキストラン、カルボキシル化ポリエチレングリコール又はヒドロキシプロピルメタアクリルアミドに基づくポリマーのような水溶性ポリマーである。最も好ましくは、PはN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド(HPMA)に基づくポリマーである。
【0008】
好ましくは[W1]は存在しないか、すなわちr=0であるか、又は自己犠牲性p−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーである(J.Med.Chem.vol.24、479(1991);PABC、−pHN−C6H4−CH2−O−CO−参照)。Z1及びZ2が表わしうるC2−C12アルキレン鎖は、式(CH2)3−;−CH2−C(CH3)2−CH2;及び−(CH2)5−の残基を含む。好ましくは[W2]は6−アミノヘキサン酸の残基、Z2=−(CH2)5−である。
【0009】
ペプチドS0は4から5個の天然又は合成アミノ酸からの配列を含む。
【0010】
好ましくは、ペプチドS0は、
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Leu(配列番号3)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Trp−Gly(配列番号4)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−pFP−Gly(配列番号5)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Trp(配列番号9)、Smc−GIy−Cys(Bn)−pFF(配列番号10)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Trp−Gly(配列番号12)、Smc−Gly−Cys(Bn)−pFF−Gly(配列番号13)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号15)、Smc−Gly−Leu−Trp(配列番号16)、Smc−Gly−Tha−Trp(配列番号17)、Smc−Gly−Met−Trp(配列番号18)、Smc−Gly−Tha−Trp−Gly(配列番号19)、Smc−Gly−Met−Trp−Gly(配列番号20)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)、Leu−Gly−Leu−Trp(配列番号26)、Leu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)またはLeu−Gly−Leu−Trp−Gly(配列番号28)
を表わす。
【0011】
最も好ましいペプチド配列S0は、
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−GIy(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−GIy(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)Leu−Gly(配列番号15)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)またはLeu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)である。本明細書において、Leuはロイシンであり、Trpはトリプトファンであり、Metはメチオニンであり、Met(O)はメチオニンスルホキシドであり、Cys(Bn)はS−ベンジル−システインであり、SmcはS−メチルシステインであり、Thaはチエニルアラニンであり、pFFはp−フルオロフェニルグリシンであり、Glyはグリシンである。
【0012】
薬剤残基[D]は、リンカーW1又はペプチドS0の結合のための官能基を担う抗腫瘍薬の残基である。そのような官能基は、ヒドロキシ、カルボニル、カルボキシ、第一又は第二アミノ基及びスルフィドリルを含む。好ましい抗腫瘍薬は、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン、タキサン、細胞傷害性ヌクレオシド、カンプトテシン、ポドフィロトキシン、アルキル化剤のクラスに属する細胞傷害性物質を含む。それらのクラスの成員は、例えば、4−デアセチル−ビンブラスチン、4−デアセチル−ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、4’−エピドキソルビシン、ダウノルビシン、4−デメトキシ−ダウノルビシン、4’−デオキシ−4’−ヨードドキソルビシン、3’−(2−メトキシモルホリノ)ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、5−フルオロウラシル、カンプトテシン、7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン、9−アミノカンプトテシン、エトポシド、エストラムスチンを含む。本発明の他の抗腫瘍薬は、腫瘍の増殖と拡大に関わる酵素の阻害因子を含む。
【0013】
本発明はまた、一般式(A)の薬剤複合体を調製するための方法であって、一般式(1)の化合物又は式(1’)の対応する塩誘導体:
【0014】
【化9】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、S0及び[D]は上記で定義したとおりであり、そしてRHは酸である)を、化合物(1)又は(1’)との結合のための適当な官能基を担うポリマーP1と反応させることを含む方法を提供する。化合物(1)又は(1’)への結合のためのポリマーP1上の適当な官能基は、p−ニトロフェニルエステル又はイミダゾイルエステルエステルのようなカルボキシル基又は活性化カルボキシル基を含む。好ましくは、(1’)におけるRHはHCl又はCF3COOHを表わす。
【0015】
式(1)の化合物及び対応する塩誘導体(1’)も、本発明によって提供される。それらは下記のような種々の合成方法に従って調製することができる。1つの方法は、好ましくは酸性条件下で、式(2):
【0016】
【化10】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、[D]及びS0は上記で定義したとおりであり、R2は、Boc(t−ブトキシカルボニル)、Fmoc、トリフェニルシリル、ジフェニルメチレン又はトリフェニルメチルのようなアミノ保護基を表わす)
の誘導体からN保護基を除去して、上記で定義したような一般式(1)又は一般式(1’)の化合物を生成し、任意に、弱塩基処理によって一般式(1’)の化合物を対応する遊離アミノ誘導体(1)に転換することを含む。
【0017】
式(2)の誘導体は、好ましくは、式(3)の化合物を式(4)の化合物
【0018】
【化11】
(式中、[W1]、[W2]、R2、p、rは上記で定義したとおりであり、R1はヒドロキシ基又はp−ニトロフェノキシ又はN−ヒドロキシスクシニミド基のような活性化エステルの残基又は塩素のようなハロゲンであり、そしてSx、Syは、独立して、アミノ酸であるか又は任意に縮合剤の存在下で、互いに連結されたとき上記で定義したようなペプチド残基S0を形成することを特徴とするペプチド残基である)と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を得ることを含む方法で調製される。好ましくは、SyはMet(O)−Gly、Smc−Gly又はLeu−Glyを表わし、SxはCys(Bn)−Leu、Cys(Bn)−Gly、Cys(Bn)−Gly−Leu、Cys(Bn)−Trp−Gly、−Cys(Bn)−pFF−Gly、Cys(Bn)−Gly−Gly、Cys(Bn)−Leu−Gly、Cys(Bn)−Trp、Cys(Bn)−pFF、Leu−Trp、Tha−Trp、Met−Trp、Tha−Trp−Gly、Met−Trp−Gly、Leu−Leu、Leu−Leu−Gly又はLeu−Trp−Glyを表わす。
【0019】
式(2)の誘導体はまた、リンカーW1又はペプチドS0への結合のための官能基を担う抗腫瘍薬Dを、式(5):
【0020】
【化12】
(式中、[W1]、[W2]、R2、R1、p、r及びS0は上記で定義したとおりである)のN保護された誘導体と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を生成することを含む方法でも調製しうる。
【0021】
上記で定義したような式(2)の化合物の調製のための代替的方法は、例えば:
a)薬剤Dを式(6):
【0022】
【化13】
(式中、W1、r、R1及びR2は先に定義したとおりである)
の化合物と反応させ、
b)生じた式(7):
【0023】
【化14】
(式中、W1、r、R2及び[D]は先に定義したとおりである)
の化合物から保護基を除去し、
c)生じた式(8):
【0024】
【化15】
(式中、W1、r及び[D]は先に定義したとおりである)
の誘導体を、式(9):
【0025】
【化16】
(式中、W2、R1、R2、p及びS0は先に定義したとおりである)
のN保護された誘導体と反応させて、上記で定義したような式(2)の誘導体を得ることを含む。式(2)の化合物の調製のためのもう1つの方法は、遊離塩基(10):
【0026】
【化17】
(式中、W1、[D]、r及びS0は先に定義したとおりである)
を、式(11):
【0027】
【化18】
(式中、W2、p、R1及びR2は先に定義したとおりである)
のN保護された活性化化合物と反応させて、上記で定義したような式(2)の化合物を得ることを含む。
【0028】
式(4)、(5)及び(9)の化合物の調製は、ペプチドの調製のための既知の手法に従う。例えば、N保護されたアミノ酸を段階的に加えることを通して、ワン(Wang)樹脂のような固体樹脂に結合された鎖を伸長させる固相合成法を使用することによる。好ましくはN保護基はFmocである。N保護されたアミノ酸のC末端を、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)のような有機塩基の存在下に塩化メチレンのような非プロトン性溶媒中で樹脂に結合する。標準的な脱保護/結合サイクルの反復によって鎖の伸長が達成される。好ましくは、N−メチル−2−ピロリドン中ピペリジン20%でFmoc保護基をブロック解除し、N−メチル−2−ピロリドン中TBTU、HOBt、DIPEAで結合段階を実施する。樹脂の開裂は、塩化メチレン、酢酸、トリフルオロ酢酸(3/1/1 v/v)又は塩化メチレン、トリフルオロ酢酸(99/1 v/v)の混合物によって実施しうる。
【0029】
式(3)及び(10)の化合物は、上記で定義したような化合物(8)をN保護されたアミノ酸又はペプチドと連続的に反応させることによって調製しうる。式(6)、(7)、(8)及び(11)の出発化合物の調製は既知の手順に従う。式(1)の化合物の調製は、我々の先のPCT特許願第WO99/17805号及びWO99/17804号ならびに米国特許第5,773,522号及び5,618,790号に述べられているのと同様の合成手順に従う。
【0030】
ポリマー薬剤複合体(A)の製造のための中間体である、式(1)及び式(1’)の薬剤複合体の調製を下記の合成スキームに示す。例えばスキーム1では、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシン塩誘導体(1’a)の調製が例示されている。合成方法は、7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシン(D1:12)へのN保護されたアミノ酸の連続的な結合を含む。特に、(12)を、アルゴン下に4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)のような活性化剤の存在下で、ジメチルスルホキシドのような無水非プロトン性溶媒中過剰のモル、例えば3モル当量までのN−t−ブトキシカルボニル−グリシンp−ニトロフェニルエステル(Boc−Gly−ONP)と反応させる。このようにして、保護されたアミノ酸を化合物(12)のC−10とC−20の両方のヒドロキシル化位置に導入する。反応は、典型的には8−48時間実施することができる。反応は、典型的には15−40℃の温度で実施する。モルホリン、1−アミノ−プロリノールのような第二アミンの存在下でC−10の位置の置換基を除去して、C−20位のモノ置換N−Boc−グリシル−誘導体(13)を得る。10°−30℃の温度で10分間から6時間、好ましくは室温で30分間、酢酸又は95%水性トリフルオロ酢酸中1.5N HClのような酸処理によってアミノ保護基を除去し、酸性塩の形態の20−O−グリシル−誘導体(14’)を得ることができる。第二のアミノ酸、ロイシンは、化合物(14’)を、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオボレート(TBTU)及びジイソプロピルアミン(DIPEA)のような縮合剤の存在下に、無水非プロトン性溶媒、好ましくはジメチルホルムアミド中過剰のモル、例えば2モル当量までのN−t−ブトキシカルボニル−ロイシン(Boc−Leu−OH)と反応させることによって導入しうる。反応は、典型的には8−48時間実施することができる。反応は、典型的には15−40℃の温度で実施する。モルホリンで処理し、次いで化合物(15)のN保護基を酸置換して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(ロイシル−グリシル)−カンプトテシン(16’)を得る。次に、トリフルオロ酢酸塩誘導体のような塩の形態で最終中間体(1’a)を生成するためのロイシンの結合に関して先に述べたのと同じ条件で、この化合物をN−t−ブトキシカルボニル−S−ベンジルシステインで処理して、化合物(17)及びN−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシルを得る。
【0031】
【化19】
【0032】
スキーム2は、配列、6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル(1c)を担う4−デアセチルビンブラスチンの複合体を調製するための方法を示す。方法は、硫酸ビンブラスチン(20)から出発し、それを最初にアルカリ処理によって遊離塩基に変換して、次に乾燥メタノール中ナトリウムメチラートを用いてC−4位で脱アシル化して化合物(21)を生成する。4−デアセチル−ビンブラスチン(21)を、塩化アシルの形態の、Fmoc誘導体のようなN保護されたロイシルの誘導体と反応させて、Fmoc−ロイシル−誘導体(22)を得る。化合物(23)を生成するためのN保護基の除去は、典型的にはジメチルホルムアミド中のピペリジンの混合物において実施する。6−アミノヘキサノイル−ロイシル−ロイシル−グリシルの連結は、典型的には、N保護基の除去と塩形成後に(1c’)を生成するために前述したように実施する。
【0033】
【化20】
【0034】
先に示したように、式(1)又は(1’)の化合物は、本発明の目的である式(A)のポリマー抗癌薬の製造のための有用な中間体である。
【0035】
本発明の範囲を限定することなく、水溶性ポリマーPがN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド(HPMA)に基づく、式(A)のポリマー薬剤複合体の例を下記に報告する。
【0036】
そのような場合、(A)として示すポリマー薬剤複合体は、
(i)85から97mol%の、式(25):
【0037】
【化21】
によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位、
(ii)3−15mol%の、式(26):
【0038】
【化22】
(式中、[W1]、[W2]、p、r、[D]及びS0は上記で定義したとおりである)
によって表わされる単位、
(iii)0から12mol%の、式(27):
【0039】
【化23】
(式中、R3はヒドロキシ基又は式−NH−CH2−CH(OH)−CH3の残基を表わす)
によって表わされるN−メタアクリロイル−グリシン又はN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイル−グリシンアミド単位
から成る可溶性ポリマーP’を含む。
【0040】
このポリマー薬剤複合体(A)はまた、次のように表わすこともできる:
[(25)]x;[(26)]y;[(27)]z
(式中、(25)、(26)及び(27)は上記で定義した式の単位であり、xは85から97mol%、yは3から15mol%、そしてzは0から12mol%である)。
【0041】
好ましくは、上記で定義したようなこのポリマー薬剤複合体(A)は、式(25)によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位を90%又はそれ以上、より好ましくは90%の割合で含む。複合体はまた、3から10mol%、より好ましくは10mol%の、式(26)によって表わされるメタアクリロイル−グリシル−誘導体を含みうる。好ましくは、(A)は式(27)の残基を含まない、すなわちzは0である。
【0042】
本発明はまた、式(A)の薬剤複合体を調製するための方法であって、一般式(1)の化合物を、
(i)85から97mol%の、上記で定義したような式(25)によって表わされるN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド単位、及び
(ii)3から15mol%の、式(28):
【0043】
【化24】
(式中、R4は活性エステルの残基である)
によって表わされるN−メタアクリロイル−グリシル単位から必須として成る活性化ポリマーP1’と反応させること、および任意に残存する活性エステル基を1−アミノ−2−プロパノールで置換することを含む方法を提供する。
【0044】
式P1’のポリマーは既にMakromol.Chem.178、2159(1977)の中で記述されている。好ましくは、式(28)中のR4が活性エステルの残基を表わすポリマー(P1’)と、ポリマー薬剤複合体(A)を調製するための式(1)の化合物との間の反応は、ジメチルスルホキシドのような無水極性有機溶媒中で実施する。反応は、典型的には15から30℃の温度、好ましくは室温で15時間実施することができ、その後室温で30分間から1時間、1−アミノ−2−プロパノールの存在下に、残存する活性エステル基のアミノリシスを実施することができる。複合体を酢酸エチルで適切に沈殿させ、エタノールに溶解して、酢酸エチルで沈殿させる。
【0045】
例えば、乾燥ジメチルスルホキシド中15%(w/v)の濃度で提供される、式(28)のR4がp−ニトロフェノールのような活性エステルの残基を表わすポリマーP1’を、室温で15時間、DPEA又はトリエチルアミンのような第三アミンの存在下に、式(1’a−1’c)の化合物、3%(w/v)で処理する。次にDMF中1−アミノ−2−プロパノール、0.1%(w/v)を加え、反応混合物を室温で8時間保持する。生じたポリマー薬剤複合体(A1a−A1c)を酢酸エチルで沈殿させ、収集して、酢酸エチルで洗い、その後10%(w/v)の濃度で無水エタノールに溶解して、スルホン酸樹脂で処理し、ろ過して、再び酢酸エチルで沈殿させる。
【0046】
方法をスキーム3及び4に示す。
【0047】
【化25】
【0048】
本発明のポリマー複合体中の活性薬剤の含量は、HPLC又は吸光分光分析によって決定する。
【0049】
式(A)のポリマー薬剤複合体は、5,000から45,000、好ましくは12,000から25,000の範囲の分子量である。式(A)の化合物及び本発明の他の化合物は水溶性であり、遊離薬剤と比較して高い抗腫瘍活性と低い毒性を示す。それらは、白血病及び結腸、結腸直腸、卵巣、***、前立腺、肺、腎腫瘍のような固体腫瘍、そしてまた黒色腫の治療においても有用である。それ故、治療上有効な量の本発明のポリマー複合体を投与することを含む方法によってヒトを治療することができる。それによってヒト患者の状態を改善することができる。
【0050】
採用する用量範囲は、投与経路ならびに治療する患者の年齢、体重及び状態に依存するであろう。式(A)のポリマー薬剤複合体ならびに式(1’)の可溶性塩誘導体は、典型的には非経口経路によって、例えば筋肉内、静脈内又はボーラス注入によって投与される。適当な用量範囲は、体表面積1m2当り1から1000mg当量の活性薬剤、例えば10から500mg/m2である。
【0051】
ポリマー薬剤複合体(A)又は式(1’)の可溶性塩誘導体は、製薬上許容される担体又は希釈剤と共に製薬組成物に製剤することができる。典型的にはそれらは、例えば注射用蒸留水又は生理食塩水に溶解することにより、非経口投与用に製剤される。
【0052】
酵素アッセイ
式(A)のポリマー薬剤複合体のインビトロでの分解を、緩衝液中、及びいくつかの蛋白質分解酵素(マトリックスメタロプロテイナーゼ、MMP、セリンプロテアーゼ(エラスターゼ))の存在下で、及び血漿中で検討した。
【0053】
ポリマー薬剤複合体(A)を10mMの標準濃度で滅菌蒸留水に溶解した。濃度はポリマー充填パーセンテージ(5−10重量%薬剤)に従って薬剤の当量として算定した。0.15M NaCl、10μM CaCl2、0.01mM酢酸亜鉛及び0.05%C12E9を含む50mM Tris/HCl pH7.4緩衝液中で化合物(A)を検定した。ポリマー薬剤複合体を5から1000μMの範囲の異なる濃度で、緩衝液中37℃で5分間平衡させる。50μMの最終濃度まで酵素(MMP)を加えて反応を開始させる。0.05%TFA緩衝液(pH2.5)を加えることにより、ポリマー薬剤複合体の5%以内の加水分解で酵素反応を停止させ、その後アクアポアOD300カラムを通してRP−HPLCによって分析する。
【0054】
RP−HPLCによって反応産物の定量を行う。例えば、ISS 200自動試料採取器、Series 200LCポンプ及びLC240蛍光検出器から成るPerkin Elmer HPLC、又は代替的に、717プラス自動試料採取器、Model 600ポンプ及びModel 474蛍光分析器から成るWaters HPLCを用いる。
【0055】
我々は、本発明の式(A)及び(1’)の化合物がゼラチナーゼの存在下で抗腫瘍薬Dを選択的に放出し、血漿中及び他の蛋白質分解酵素の存在下で実質的に安定であることを認めた。
【0056】
下記の実施例は本発明を例示するものである。
【0057】
実施例1:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−グリシル−カンプトテシントリフルオロアセテート(14’)
7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシン(12)(2.1g、5.3mmol)を無水ジメチルスルホキシド(50ml)に溶解し、N−t−ブトキシカルボニル−グリシンp−ニトロフェニルエステル(4.8g、16.2mmol)及びジメチルアミノピリジン(0.8g、6.5mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間、攪拌しながらアルゴン気体中に保持した。その後モルホリン(4.6ml)を加え、反応混合物を室温で24時間攪拌した。次に塩化メチレン(200ml)と水性0.5N HClを加えた。有機相を分離し、水(3×200ml)で洗った。有機溶媒を減圧下で除去して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(t−ブトキシカルボニル−グリシル)−カンプトテシン(13)を得た。キーセルゲル(kieselgel)プレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(95/5 v/v)溶出系、Rf=0.3。
【0058】
化合物(13)をトリフルオロ酢酸(95%水溶液50ml)に溶解し、1時間後、減圧下で溶媒を除去して、トリフルオロ酢酸塩誘導体の形態で表題の化合物(14’、収量3g)を得た。
【0059】
実施例2:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(16’)
N−t−ブトキシカルボニル−ロイシン(2.49g、10mmol)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)(1.53g、10mmol)、O−(ベンゾトリアゾール−1イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオボレート(TBTU)(3.21g、10mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(3.5ml、20mmol)を含むジメチルホルムアミド(50ml)の溶液を、30分後に、DIPEA(1.75ml、10mmol)を含むジメチルホルムアミド(20ml)中、実施例1で述べたように調製した化合物(14’)(3g、5.28mmol)の溶液と混合した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。次にモルホリン(4.5ml、5.6mmol)を加え、混合物を6時間攪拌した。その後減圧下で溶媒を蒸発させ、残留物を塩化メチレン(200ml)で溶解し、水性0.5N HCl、水性5%NaHCO3(200ml)及び水(2×200ml)で洗った。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後減圧下で溶媒を除去して、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−t−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル)−カンプトテシン(16)を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(95/5 v/v)溶出系、Rf=0.5。
【0060】
化合物(16)をトリフルオロ酢酸(95%水溶液50ml)に溶解し、1時間後、減圧下で溶媒を除去して表題の化合物(16’、収量3g)を得、それをエチルエーテルによりトリフルオロ酢酸塩誘導体の形態で収集した。
【0061】
実施例3:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(18’)
化合物(16’:3g)を、実施例2で述べたのと同じ条件に従ってN−t−ブトキシカルボニル−(S−ベンジル−システイン)と反応させ、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−t−ブトキシカルボニル−(S−ベンジル−システイニル)−(ロイシル−グリシル))−カンプトテシン(17’)を得、それを実施例2で述べたようにして表題の化合物(18’)に変換した。
【0062】
実施例4:7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(1’a)
N−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシン(0.358g、0.57mmol)を含むジメチルホルムアミド(DMF、5ml)の溶液を、ジメチルホルムアミド(2ml)中の化合物(18’)(0.257g、0.76mmol)の溶液と混合し、その後Boc保護基を除去することにより、実施例2で述べたのと同じ条件に従って表題の化合物を調製した。
【0063】
実施例5:N−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド、7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(N−メタアクリロイル−6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)カンプトテシン及びN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルグリシンアミドのコポリマー(A1a)
ポリマー(P1’)(0.756g)の無水ジメチルスルホキシド(4ml)中の溶液に、実施例4で述べたように調製した7−エチル−10−ヒドロキシ−20−O−(6−アミノヘキサノイル−(メチオニル−スルホキシド)−グリシル−(S−ベンジル−システイニル)−ロイシル−グリシル)−カンプトテシントリフルオロアセテート(1’a)(0.23g、0.193mmol)及びトリエチルアミン(0.53ml、0.396mmol)を加えた。反応混合物を室温で24時間、攪拌しながらアルゴン気体中に保持した。次にジメチルホルムアミド(10ml)中の1−アミノ−2−プロパノール(0.3ml)の溶液0.1mlを加えて、8時間攪拌を続けた。その後酢酸エチル(200ml)を攪拌しながら反応混合物に加えた。沈殿物を採集し、酢酸エチルで洗って、エタノール(8ml)で溶解し、スルホン酸樹脂(DOWEX 50−スルホン酸)で30分間処理した。溶液をろ過し、酢酸エチルで沈殿させた。生じた固体をエチルエーテルで洗い、恒量で乾燥して、表題の化合物(A1a)を得た。収量0.8g;分子量20,800、多分散性1.48、7−エチル−10−ヒドロキシ−カンプトテシンの充填7.5%(w/w%)。
【0064】
実施例6:4−デアセチル−4−O−ロイシル−ビンブラスチン(23)
水中(15ml)の硫酸ビンブラスチン(20)(1.5g、1.65mmol)の溶液に、強く攪拌しながら塩化メチレン(15ml)と濃アンモニア(1.5ml)を加えた。5分後に混合物を傾瀉し、水相を塩化メチレン(3×15ml)で抽出した。混合有機相を水(30ml)とブライン(30ml)で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で蒸発させて遊離塩基形態のビンブラスチンを得、それをエチルエーテルとヘキサン(1:1)の混合物で沈殿させた後収集した。収量1.31g(1.61mmol、98%収率)。
【0065】
ビンブラスチン遊離塩基(60mg、0.06mmol)を乾燥メタノール(5ml)に溶解し、メトキシドナトリウム(NaOCH3、190mg;乾燥メタノール7ml)の溶液に加えて、室温で3時間攪拌した。その後反応混合物を塩化メチレンで希釈し、冷ブライン、次にNaHCO3の水溶液で2回、そして最後に再びブラインでpH7−8まで洗った。有機相を分離して取り、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で溶媒を除去して、4−デアセチルビンブラスチン(21)(46mg)のオフホワイト色の結晶性固体を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.34。
【0066】
無水ピリジン(4.5ml)中の化合物(21)(0.2g、0.26mmol)を、無水塩化メチレン(1.9ml)に溶解したFmoc−Leu−Cl(0.385g、1.04mmol)の溶液で処理した。反応混合物を室温で12時間保持した。その後水(0.5ml)を反応混合物に加えて過剰の酸性塩化物を破壊し、減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物を酢酸エチルと飽和NaHCO3の間で分配し、ブラインで洗った。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、その後減圧下で溶媒を除去した。残留物を室温でピペリジン(1.3ml)と無水DMF(2.7ml)の混合物に溶解した。30分後に減圧下で溶媒を除去し、クロロホルムとメタノール(95/5 v/v)を溶出系として使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーによって粗油を精製し、表題の化合物(23)(0.178g、62%収率)を得た。キーセルゲルプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.3。
【0067】
実施例7:4−デアセチル−4−O−(6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル)−ビンブラスチントリフルオロアセテート(1’c)
N−t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル(0.17g、0.32mmol)を、4−デアセチル−4−O−ロイシル−ビンブラスチン(23)(0.28g、0.32mmol)、TBTU(0.1g、0.32mmol)及びHOBt(0.05g、0.32mmol)と共に乾燥ジメチルホルムアミド(6ml)に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン(0.1ml、0.26mmol)を加えた後、反応混合物を48時間攪拌した。次に減圧下で溶媒を除去し、残留物を塩化メチレンと飽和NaHCO3の間で分配した。有機相を再び飽和NaHCO3で洗い、最後にブラインで洗った。無水硫酸ナトリウム上で乾燥した後、減圧下で溶媒を除去して粗油を得、それを、クロロホルム/メタノール(95/5 v/v)の混合物を溶出系として使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、4−デアセチル−4−O−(t−ブトキシカルボニル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル)−ビンブラスチン(24)(0.32g、75%収率)を得た。kieselgelプレート(Merck)でのTLC、塩化メチレン/メタノール(90/10 v/v)溶出系、Rf=0.59。
【0068】
化合物(24)を、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸50%(2.5ml)で処理した。室温で2時間攪拌したあと、減圧下で溶媒を除去し、残留物をトルエンで2回処理して乾燥させ、表題の化合物(1c’)をジ−トリフルオロ酢酸塩として得た。
【0069】
実施例8:N−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミド、4−O−(N−メタアクリロイル−グリシル−6−アミノヘキサノイル−ロイシル−グリシル−ロイシル−ロイシル)−ビンブラスチン及びN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルグリシンアミドのコポリマー(A1c)
実施例7で述べたように調製した化合物(1’c:0.3g、0.22mmol)を無水ジメチルスルホキシド(1.5ml)に溶解し、無水ジメチルスルホキシド(6ml)に溶解した(P’1)(1.5g)の溶液に加え、次いでジイソプロピルエチルアミン(0.7ml、0.25mmol)を加えた。室温で24時間攪拌したあと、1−アミノ−2−プロパノール(0.1ml)を反応混合物に加え、1時間後、反応混合物を酢酸エチル(100ml)に注ぎ入れた。(A1c)を含む沈殿物をろ過し、エチルエーテルで洗って、その後水(HPLCグレード)15mlに溶解し、G−25サイズ排除カートリッジで精製した(7回、溶離液:水)。プールした分画から、凍結乾燥後に表題の化合物(A1c)(1.2g、78%収率)を得た。
【0070】
抗腫瘍活性
化合物(A1a)を、i.v.経路により遊離薬剤7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン(12)と比較して、ヌードマウスに移植したヒト結腸癌(HT29)に関して試験した。A1aは試験したすべての用量で非毒性であることが認められ、20mg/kgの最高試験用量で98%の腫瘍阻害を与えた(表1)。
【0071】
【表1】
Claims (19)
- [D]が、請求項1で定義された式(A)の複合体のリンカーW1又はペプチドS0部分の結合のための官能基を担う抗腫瘍薬の残基であり、rが0であるか又は[W1]が自己犠牲性p−アミノベンジルオキシカルボニルリンカーであり、[W2]が6−アミノヘキサン酸の残基であり、および(P)がポリグルタミン酸、カルボキシル化デキストラン、カルボキシル化ポリエチレングリコール又はN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミドに基づくポリマーである、請求項1に記載のポリマー複合体。
- ペプチドS0が4から5個の天然又は合成アミノ酸からの配列を含む、請求項1又は2に記載のポリマー複合体。
- S0が式:
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Leu(配列番号3)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Trp−Gly(配列番号4)、Met(O)−Gly−CyscBn)−pFF−GIy(配列番号5)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−GlyGly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Tip(配列番号9)、Smc−GIy−Cys(Bn)−pPF(配列番号10)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−GlyCys(Bn)−Trp−Gly(配列番号12)、Smc−Gly−Cys(Bn)−pFF−Gly(配列番号13)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号15)、Smc−Gly−Leu−Trp(配列番号16)、Smc−Gly−Tha−Trp(配列番号17)、Smc−Gly−Met−Trp(配列番号18)、Smc−Gly−Tha−Trp−Gly(配列番号19)、Smc−Gly−Met−Trp−Gly(配列番号20)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)、Leu−Gly−Leu−Trp(配列番号26)、Leu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)またはLeu−Gly−Leu−Trp−Gly(配列番号28)
の配列を表わす、請求項3に記載のポリマー複合体。 - S0が式:
Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号1)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−GIy(配列番号2)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号6)、Met(O)−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号7)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号8)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号11)、Smc−Gly−Cys(Bn)−Gly−GIy(配列番号14)、Smc−Gly−Cys(Bn)Leu−Gly(配列番号15)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu(配列番号21)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly(配列番号22)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Leu−Gly(配列番号23)、Leu−Gly−Cys(Bn)−Gly−Gly(配列番号24)、Leu−Gly−Leu−Leu(配列番号25)またはLeu−Gly−Leu−Leu−Gly(配列番号27)
の配列を表わす、請求項4に記載のポリマー複合体。 - 抗腫瘍薬[D]が、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン、タキサン、細胞傷害性ヌクレオシド、カンプトテシン、ポドフィロトキシンまたはアルキル化剤のクラスに属する細胞傷害性物質である、上記請求項のいずれか一項に記載のポリマー複合体。
- 抗腫瘍薬[D]が、4−デアセチル−ビンブラスチン、4−デアセチル−ビンクリスチン、ビンデシン、ドキソルビシン、4’−エピドキソルビシン、ダウノルビシン、4−デメトキシ−ダウノルビシン、4’−デオキシ−4’−ヨードドキソルビシン、3’−(2−メトキシモルホリノ)ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、5−フルオロウラシル、カンプトテシン、7−エチル−10−ヒドロキシカンプトテシン、9−アミノカンプトテシン、エトポシドまたはエストラムスチンである、請求項6に記載のポリマー複合体。
- (P)がN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイルアミドに基づく水溶性ポリマーである、上記請求項のいずれか一項に記載のポリマー複合体。
- 請求項9で定義された化合物(1)又は(1’)の結合のためのポリマー(P1)上の適切な官能基がカルボキシル基又は活性化カルボキシル基を含む、請求項9に記載の方法。
- 請求項9で定義された、式(1)の抗腫瘍性誘導体または式(1’)の対応する塩誘導体。
- N保護基の除去を酸性条件下で実施し、R2がBoc(t−ブトキシカルボニル)、Fmoc、トリフェニルシリル、ジフェニルメチレンまたはトリフェニルメチル基を表わす、請求項12に記載の方法。
- (i)85から97mol%の、式(25):
(ii)3から15mol%の、式(26):
によって表わされる単位、
(iv)0から12mol%の、式(27):
によって表わされるN−メタアクリロイル−グリシン又はN−(2−ヒドロキシプロピル)メタアクリロイル−グリシンアミド単位から成る水溶性ポリマー(P)を含む、請求項1に記載のポリマー薬剤複合体。 - 製薬上許容される希釈剤又は担体と、有効成分として、請求項1から8又は14のいずれか一項で定義されたポリマー複合体あるいは請求項11で定義された式(1)又は(1’)の化合物を含む製薬組成物。
- 治療によるヒト又は動物の身体の処置方法において使用するための、請求項1から8または14のいずれか一項で定義されたポリマー複合体または請求項11で定義された式(1)もしくは(1’)の化合物。
- 白血病又は固体腫瘍を治療するための薬剤の製造における、請求項1から8または14のいずれかで定義されたポリマー複合体または請求項11から13で定義された式(1)もしくは(1’)の化合物の使用。
- 固体腫瘍が、結腸、結腸直腸、卵巣、***、前立腺、肺もしくは腎腫瘍または黒色腫である、請求項18に記載の使用。
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