JP2004503243A - 結合剤 - Google Patents
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Abstract
Description
[発明の分野]
本発明は、細胞表面受容体に結合する薬剤;前記薬剤の製造方法;前記薬剤を含む治療組成物;および新規の薬剤を同定するためのスクリーニング法に関する。
【0002】
[発明の背景]
生化学的機構および/または分子機構の受容体媒介活性を介した細胞間シグナル伝達および/または細胞内シグナル伝達は、細胞恒常性および/または組織恒常性の維持のための基本的過程である。典型的には、適切な生化学反応を起こすために状態と相互作用するリガンドは、アゴニストと知られており、生化学反応を防止するリガンド(すなわち、妨害物質)はアンタゴニストとして知られている。例えば、限定されないが、細胞表面成長因子はアゴニストとして作用し細胞表面に存在する受容体に結合するリガンドである。リガンド特異的な結合による受容体の活性化は、細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を介した細胞増殖を促進し、特に、細胞周期特異的遺伝子を発現し、静止期の細胞を増殖するように活性化する。成長因子はまた、細胞分化を活性化することができる。
【0003】
サイトカインと呼ばれる多数の成長因子群は、多種多様にわたる細胞機能に関連する。これらには、例として、免疫系の調整、エネルギー代謝の調節、ならびに成長および発達の制御が含まれるが、これらに限定されない。リンパ球によって分泌されたサイトカインを、リンホカインという(インターロイキンとしても知られる)。単球およびマクロファージによって分泌されるサイトカインをモノカインという。サイトカインはまた、内分泌腺(例えば、下垂体による成長ホルモン(GH))および脂肪細胞(例えば、レプチン)によって分泌される。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現する受容体を介してその効果を媒介する。
【0004】
サイトカイン受容体ファミリーの受容体は、1つの膜貫通ドメインを有し、固有の酵素活性を欠く(1)。サイトカインの同族受容体への結合の際、受容体ホモ二量体またはヘテロ二量体形成またはオリゴマー形成のいずれかが起こる。受容体複合体が内在化(インターナライズ)され、Jak/StatおよびMaPk経路を含む関連シグナル伝達カスケードの活性化によってシグナル伝達が起こる。内在化の後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【0005】
受容体/リガンド相互作用研究は、受容体分子およびそのリガンドの構造の定義によって容易になった。X線結晶学およびコンピュータモデリングを含むいくつかのアプローチにより、リガンド:受容体結合の生物学の理解が非常に容易になった。
【0006】
GHおよび成長ホルモン受容体(GHR)への結合に関して、上記の例が記載されている。この例は、例示に過ぎず限定を意図するものではないが、受容体:リガンド複合体の結合、二量体形成、および内在化によるシグナル伝達カスケードを活性化するサイトカインの例である。
【0007】
1つの成長ホルモン(GH)分子は2つの受容体分子に会合することが知られている(3〜6)。これは、GH上の2つの固有の受容体結合部位および2つの受容体の細胞外ドメイン上の共通の結合ポケットによって起こる。GH分子上の部位1は、部位2よりも親和性が高く、受容体の二量体形成は、GH上の部位1への1つの受容体結合およびその後の部位2への第2の受容体の使用が連続的に起こると考えられる。
【0008】
GHRの細胞外ドメインは、2つの連結したドメインとして存在し、それぞれ約100個のアミノ酸(SD−100)、C末端SD−100ドメインは細胞表面付近に存在し、N末端SD−100ドメインは最も離れて存在する。これは、三量体GHR−GH−GHRが形成されるホルモン結合が起こるこれら2つのドメインの高次構造の変化である(図5)。リガンドにより起動される受容体二量体形成はシグナル活性化の誘導(3)、Jak2/Stat5経路を含むリン酸化カスケードを誘発する(7)重要な事象であると提案される。共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を使用して、リガンド結合後にGHRが非常に迅速に内在化され、この内在化およびシグナル伝達が独立した機能であることが知られている(16)。GHR−GH−GHR複合体の内在化後のリサイクルステップによって細胞内でさらに使用するための受容体分子が再生される。
【0009】
シグナル伝達における受容体二量体形成の重要性は、多数の実験によって示されている。単量体GH−GHR複合体を好む高濃度のGHはGHシグナルを阻害する(8)。受容体内二量体化ドメインの変異は、GH結合に影響を与えることなくシグナル伝達を阻害する(10)。最も有力な証拠は、受容体の二量体形成を防止するための部位2で変異したGH分子を使用した研究に由来する。これらのGH変異体は、GH刺激細胞増殖(8、11〜14)、受容体二量体形成に関連する高次構造変化(15)、およびJak−Statシグナル伝達(16)を遮断する。
【0010】
米国特許5,849,535号は、部位2の結合を妨害する多数のアミノ酸置換を含むヒト成長ホルモンを記載している。G120での異なるアミノ酸の置換は、部位2結合を妨害する1つの変異であり、hGH変異体はhGHアンタゴニストとして作用する。
【0011】
hGHおよびhGH変異体のインビボでの有効性を、一部はhGH受容体に対する親和性および循環由来のクリアランス速度によって同定する。腎臓は、約25%の心拍出量を受ける比較的小さな器官である。腎臓は、主に組成物および体液の体積の調節に関連するいくつかの重要な機能を担う。腎臓は、毎日約100リットルの血漿ならびに腎臓中および腎臓外の血流を濾過し、たった約1%が尿となる。腎臓を通過した約20%の血漿がネフロンに濾過される。血液の流体静力学的圧力によって駆動する糸球体で濾過される。水および小分子は濾過されるが、血球および高分子(例えば、ポリペプチド)は糸球体フィルターを通過しない。
【0012】
約70kDaの有効分子量を有するこれらのポリペプチドは、単に大きすぎて濾過されないので、糸球体濾過によってクリアランスされない。一定の低分子量のタンパク質は糸球体によって濾過され、尿中で見出される。例えば、成長ホルモン(GH)の分子量は22.1kDaであり、腎臓は、ヒトでは60〜70%まで(Baumann、1991;Haffnerら、1994)、ラットでは67%まで(Johnson & Maack、1977)のGHのクリアランスを担う。腎臓によって濾過される比較的低分子量のポリペプチドの他の例には、レプチン、エリスロポイエチン、およびIL−6が含まれる。
【0013】
Syedら(1997)は、ヒルジンとアルブミンとが融合した抗凝固融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、血漿の半減期の延長を示す一方で強力な抗トロンビン(抗凝固)活性が維持されている。これは、おそらく腎臓による糸球体濾過の減少に起因するようである。しかし、このストラテジーに関連する問題は、ヒルジンが外来タンパク質であり、強力な免疫応答を誘発することが知られていることである。ヒルジン融合タンパク質の分子量の増加により、異化半減期が0.7時間から4.6日に増加する。
【0014】
タンパク質の有効分子量を増加させ、免疫原性が減少した産物を産生するためのさらなる方法は、ポリエチレングリコール(PEG)中でタンパク質をコートすることである。GHのインビボ半減期は、「ペグ化」と呼ばれるタンパク質とポリエチレングリコールとのコンジュゲーションによって増加した(Abuchowskiら、J.Biol.Chem.、252、3582〜3586、1977を参照のこと)。PEGは、典型的には、エチレンオキシド単量体あたり3つの水分子を有する非免疫原性非荷電ポリマーと特徴付けられている。PEGは、ペグ化タンパク質の流体力学的耐性の増加により腎臓クリアランスを遅延させると考えられている(Maxfieldら、Polymer、16、505〜509、1975)。米国特許第5,849,535号はまた、1つまたは複数のポリオール(ポリ(エチレングリコール)(PEG)など)とコンジュゲートしたヒトGH(hGH)変異体を記載している。
【0015】
生物活性を保持し、且つ免疫サイレントな分子が得られるペグ化の代替法を本明細書中に開示する。受容体の細胞外ドメインまたはその一部を含むキメラタンパク質が可変可動リンカー分子を介してその同族リガンドに連結して、天然のリガンドよりも明らかに高い分子量の薬剤が得られる。提供した実施例では、約55kDaの分子量の成長ホルモン受容体(GHR)の一部にGHを融合し、グリコシル化した場合に有効分子量が約75kDaに増加する。これは、キメラの腎臓による濾過の防止に十分であり、分子が生物活性を保持していることが重要である。
【0016】
成長ホルモンの長期作用形態を、小児期および成体発症成長ホルモン欠損症の治療に使用することができる。成長ホルモンは周知の同化作用を示し、成長ホルモンの長期作用形態を、ターナー症候群における成長の促進、腎不全、骨粗鬆症、および異化患者における筋肉疲労を含む異化作用による多数の病態の治療に使用することができる。現在、ウシソマトトロピンを使用して、雌ウシのミルクの生産量を増加させている。成長ホルモンの長期作用形態は、雌ウシのミルク生産量の増加に有効な処理である(Peelら、1981)。
【0017】
このストラテジーは、リガンド−受容体組み合わせに適用可能である(例えば、レプチン、エリスロポイエチン、およびIL−6)。例えば、肥満症治療薬としてレプチンが試験されている(Mantzoros&Flier、2000)。レプチンの長期作用形態を使用して、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、および高血圧を治療することができる。エリスロポイエチンは赤血球の大きさにおいて重要である。エリスロポイエチンの長期作用形態を使用して、特に腎不全に関連する貧血を治療することができる。
【0018】
受容体の細胞質ドメインを欠く先端切断型(truncated)GH受容体は、GHシグナル伝達のドミナントネガティブインヒビターとして作用する(9、19)。先端切断型受容体は、内在化に不可欠な細胞質ドメインを欠くので、細胞表面上で高レベルで発現する(16)。GHの存在下では、先端切断型受容体は全長受容体とヘテロ二量体を形成し、細胞質ドメインを欠くのでシグナル伝達を遮断する。先端切断型受容体は内在化できないので、GH受容体複合体の内在化を防止するドミナントネガティブインヒビターとして作用する。
【0019】
過剰な成長ホルモンに起因する末端肥大症および巨人症は、通常、下垂体腫瘍による。現在試験中の薬物は、成長ホルモン受容体(GHR)の分子構造の最近得られた知識を使用してデザインしたペグ化GHアンタゴニストB2036である。不運なことに、GH作用の拮抗には内因性GHレベルよりも100倍高い薬物レベルの高レベルのB2036を必要とする。
【0020】
B2036は、変異部位2を有するにもかかわらず、受容体二量体に結合し、理想的な様式でGH中に内在化される。しかし、これはシグナル伝達に必要な高次構造の変化を誘発しない。高用量のアンタゴニストの必要性は、その内在化ならびに可溶性および膜結合受容体への結合の相違に関する。ペグ化アンタゴニストは膜結合受容体に有効に結合しないにもかかわらず、ペグ化により半減期が増加し、免疫原性が低下する。非ペグ化アンタゴニストは、迅速に内在化し、クリアランスされる。
【0021】
細胞によって内在化されず、且つより低い容量で送達することができるアンタゴニストを得る必要がある。これによりより有効且つ強力なアンタゴニストが得られ、より有効且つ経済的な治療が得られる。
【0022】
レプチン受容体(28)およびエリスロポイエチン(EPO)受容体(29、30)は、GHRと相当な構造相同性を共有し、シグナル伝達を誘発するために類似の二量体形成ステップが必要である。レプチンは食欲を抑え、レプチン耐性は肥満に関係する。レプチン受容体アンタゴニストにより、神経性食欲不振の治療法が得られる。過剰なEPOにより、二次的に低酸素症(慢性肺疾患)を発症し得る赤血球増加症または、真性一次性赤血球増加症(過剰赤血球障害)を発症する。EPOアンタゴニストにより赤血球増加症の治療法が得られる。
【0023】
受容体:リガンド結合のさらなる例は、その同族受容体のIL−6活性化によって得られる。その同族受容体の現在のIL−6活性化モデルは、IL−6が可溶性または膜結合IL−6受容体(IL−6R)に結合すると規定されている。次いで、IL−6/IL−6複合体は、2つのgp130分子およびシグナル伝達分子に関連する細胞質ドメインを含む2つのgp130分子の二量体形成による四量体シグナルを使用する(Grotzingerら、1999)。天然には、IL−6およびIL−6Rは互いに高親和性結合部位を有する個別の分子として存在し、共有結合およびジスルフィド結合の形成によってシグナル伝達分子gp130と会合する。
【0024】
本発明者らは、受容体輸送および2つのサイトカイン受容体ファミリーメンバーGHおよびレプチンの結合タンパク質生成を研究している(9、16、20、21)。これらの2つのホルモンは、成体における身体組成の決定において基本的役割を果たす。レプチンおよびGHは共にエネルギー消費、食欲、および脂肪量の調節に重要である。レプチンおよびGHの生物活性を操作する能力は、両ホルモンの過剰および欠損治療について重要な治療結果を示す。
【0025】
共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を使用して、本発明者らは、リガンド結合後にGH受容体が非常に迅速に内在化され、内在化およびシグナル伝達が独立した機能であることを示した(16)。本発明者らの最近の研究は、GHアンタゴニストであるペグビソマントは、変異部位2を有するにもかかわらず、受容体に量体に結合し、理想的な様式でGH中に内在化するが、シグナル伝達に必要な高次構造の変化を誘発しないことを示す。本発明者らは、高用量のアンタゴニストの必要性は、その内在化ならびに可溶性および膜結合受容体への結合の相違に関することを証明した。ペグ化アンタゴニストは膜結合受容体に有効に結合せず、非ペグ化アンタゴニストは、迅速に内在化およびクリアランスされる。
【0026】
本発明者らは、受容体の細胞質ドメインを欠く先端切断型GHRは、GHシグナル伝達のドミナントネガティブアンタゴニストとして作用することができることを証明した(図5)(9、20)。先端切断型受容体は、内在化に不可欠な細胞質ドメインを欠くので、細胞表面上で高レベルに発現する(16)。先端切断型受容体は全長受容体とヘテロ二量体を形成し、細胞質ドメインを欠くのでシグナル伝達を遮断し、細胞表面上に過剰に存在するのでドミナントネガティブとして作用し、GH受容体複合体の内在化を防止する。
【0027】
GHのアンタゴニストの作製における先端切断型受容体の使用に関して2つの問題が存在する。膜中の先端切断型受容体は、細胞内で作製しなければならない。GHRはまた、タンパク質分解され、その後先端切断型受容体の大部分は循環によって失われる。
【0028】
GHを、そのC末端およびリンカーを介してGHRのC末端SD−100ドメインのN末端に結合させる。リンカーの長さの変化によって、部位1によるGHの細胞表面上での全長受容体を結合させる可動性を有する分子が定義される。次いで、受容体のC末端SD−100ドメインを、三量体構造GHR−GH−GHRtr(式中、GHRtrはC末端SD−100ドメインである)を完了させるために循環させる。この複合体はシグナル伝達も内在化もせず、GH作用を有効に拮抗する。大部分のGHがGHRを介して切断されるので、低免疫原性および低クリアランスというさらなる利点を有する(22)。
【0029】
本発明者らはまた、レプチン受容体は多数のサイトカイン受容体が行うように(2)可溶性結合タンパク質(21)を生成し、レプチン受容体の支配的末梢形態は先端切断型GHRと類似の先端切断型受容体である(27、28)。本発明者らの最近の研究により、先端切断型レプチン受容体はレプチンシグナル伝達を阻害することができることが証明された。エリスロポイエチン(EPO)受容体は、GHRと非常に類似した結晶構造を共有し、EPO受容体のC末端SD100を有するEPOキメラは、アンタゴニストとして機能する。
【0030】
[発明の記述]
本発明によれば、受容体結合ドメインを含む第2の部分に連結した受容体のリガンド結合ドメインに結合することができる第1の部分を含み、前記受容体の活性を調整する結合剤が得られる。
【0031】
本発明の1つの実施形態では、結合剤が前記受容体の活性に拮抗する。
【0032】
本発明の別の実施形態では、結合剤が前記受容体の活性を作動する。
【0033】
好ましくは、第1の部分はサイトカインまたはサイトカインの結合ドメインを含む。
【0034】
さらにより好ましくは、第1の部分は、成長ホルモン;レプチン;エリスロポイエチン、プロラクチン;TNF;インターロイキン(IL)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−11;IL−12、IL−13、IL−15のp35サブユニット;顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF);毛様体神経栄養因子(CNTF);カルディオトロフィン1(CT−1);白血病抑制因子(LIF);オンコスタチンM(OSM);インターフェロン、IFNα、およびIFNγから選択されるサイトカインまたはサイトカインの結合ドメインを含む。
【0035】
好ましくは、第2の部分は少なくともサイトカインの同族受容体の一部または関連受容体の一部を含む。
【0036】
好ましくは、第1の部分はGHである。
【0037】
好ましくは、第2の部分はGHRの1つの細胞外ドメインである。より好ましくは、第2の部分はGHRのC末端SD−100ドメインである。
【0038】
別の実施形態では、前記第1の部分はIL−6またはIL−6の結合ドメインであり、前記第2の部分はgp130の一部である。
【0039】
本発明の実施形態により、その受容体に対する親和性が高く、先端切断型受容体が内在化できないのでサイトカインおよびその同族受容体のキメラである特異的受容体アンタゴニストが生成されるサイトカインが開発される。本発明の結合剤は、サイトカインのその受容体への結合により受容体−サイトカイン複合体の内在化が誘発されないという重要な利点を有する。これは、アンタゴニストの投薬量を最小にすることができることを意味する。
【0040】
本発明の1つの実施形態では、結合剤は融合タンパク質である。
【0041】
本発明の別の実施形態では、第1の部分は、リンカーによって第2の部分に連結されている。リンカーは可動性を示し得る。
【0042】
リンカーは、成長ホルモンを細胞表面で遊離した受容体に結合可能な受容体の細胞外ドメイン内の任意の残基に存在し得る。第1の部分はGHであり、第2の部分はGHRの1つの細胞外ドメインであり、GHおよびGHR中の任意のペプチド残基の間で結合可能である。好ましくは、GH分子のC末端付近の残基とGHRのN末端付近の残基との間で結合している。より好ましくは、GH分子のC末端付近の残基とC末端SD−100のN末端のN末端付近の残基との間で結合している。より好ましくは、GHRのC末端SD−100のN末端の126〜128番目の任意の残基に結合している。本発明の1つの実施形態では、C末端SD−100のN末端の127番目の残基に結合している。好ましくは、リンカーはペプチドである。
【0043】
別のリンカーを使用して第1および第2の部分を連結することができることが当業者に明らかである。適切なリンカーは核酸(例えば、オリゴヌクレオチド);ペプチド核酸;化学的架橋剤(例えば、ポリオキシエチレン)であるが、これらは例示であり、限定することを意図するものではない。
【0044】
GHR−GH−GHR複合体の結晶構造により、GHのC末端(残基191)とC末端SD−100のN末端(126〜128番目の残基)の間の距離は10Åであることが明らかとなる。これにより、リンカーデザインに関して非常に貴重な情報が得られる。
【0045】
好ましくは、リンカーは、5〜30個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである。より好ましくは、リンカーは、10〜20個のアミノ酸残基を含む。
【0046】
より好ましくは、リンカーはペプチド、
GlyGlyGlyGlySer(以後、「Gly4Ser」という)
の少なくとも1つのコピーを含む。
【0047】
本発明の1つの実施形態では、リンカーの長さは10個のアミノ酸であり、且つリンカーはGly4Serリンカーの2つのコピーを含む。本発明の別の実施形態では、リンカーの長さは15個のアミノ酸であり、且つリンカーはGly4Serリンカーの3つのコピーを含む。本発明のさらに別の実施形態では、リンカーの長さは20個のアミノ酸であり、且つリンカーはGly4Serリンカーの4つのコピーを含む。
【0048】
本発明のさらなる態様によれば、i)図4、5、8、9、および21を含む群、
ii)上記の(i)の配列とハイブリッド形成し、受容体拮抗活性を有する核酸、および
iii)上記の(i)および(ii)で定義の配列に対する遺伝コードの結果として縮重する核酸配列からなる群から選択される、本発明の結合剤をコードする核酸配列を含む核酸分子が得られる。
【0049】
本発明の好ましい実施形態では、核酸は、ストリンジェントなハイブリッド条件下で図4、5、8、9、または21に記載の配列にハイブリッド形成する。
【0050】
ストリンジェントなハイブリッド形成/洗浄条件は当該分野で周知である。例えば、60℃での0.1×SSC、0.1%SDSでの洗浄後に適切な核酸ハイブリッドである。核酸配列が既知の場合、至適ハイブリッド形成条件を計算することができることが当該分野で周知である。例えば、ハイブリッド形成条件を、ハイブリッド形成される核酸のGC含量によって決定することができる。Sambrookら、1989、「Molecular Cloning」を参照のこと。特定の相同性を示す核酸分子間のハイブリッド形成の達成に必要なストリンジェンシー条件の一般的な計算式は以下である。
Tm=81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41[%G+C]−0.63(%ホルムアミド)。
【0051】
典型的には、ハイブリッド形成条件は、4〜6×SSPE(1リットルに溶解し、pHを7.4に調整した20×SSPEは、175.3g NaCl、88.2g NaH2PO4H2O、および7.4g EDTAを含む);5〜10×デンハルト溶液(5g Ficoll(タイプ400、Pharmacia)、5gポリビニルピロリドン、および5gウシ血清アルブミン/500mlを含む50×デンハルト溶液);100μg〜1.0mg/ml超音波処理サケ/ニシンDNA;0.1〜1.0%ドデシル硫酸ナトリウム;任意選択的に40〜60%の脱イオンホルムアミドを使用する。ハイブリッド形成温度は、核酸標的配列のGC含量に依存して変化するが、典型的には42℃と65℃との間である。
【0052】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドが得られる。
【0053】
本発明の好ましい実施形態では、このようにしてコードされたポリペプチドを、少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変する。理想的には、前記改変により、受容体媒介細胞シグナル伝達の阻害または活性化に関してポリペプチドの拮抗または作動効果が増強される。
【0054】
あるいはまたは好ましくは、改変には、組換えまたは合成形態のポリペプチドの産生における改変アミノ酸の使用が含まれる。
【0055】
可変アミノ酸には、例として、4−ヒドロキシプロリン、5−ヒドロキシリジン、N6−アセチルリジン、N6−メチルリジン、N6,N6−ジメチルリジン、N6,N6,N6−トリメチルリジン、シクロヘキシアラニン、D−アミノ酸、オルニチンが含まれるが、これらに限定されないことが当業者に明らかである。改変アミノ酸の組み込みにより、図21を含むポリペプチドに対して有利な性質を付与することができる。例えば、改変アミノ酸の組み込みによりポリペプチドのその受容体に対する親和性を増加させることができるか、改変アミノ鎖により、ポリペプチドのインビボ安定性を増加させて、患者に投与するポリペプチドの有効量を減少させることが可能である。
【0056】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の任意の前記態様または実施形態による結合剤をコードするDNA分子を含むベクターが得られる。
【0057】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の結合剤の組換え製造手段によってベクターが得られる。
【0058】
本発明の好ましい実施形態では、ベクターは原核生物遺伝子発現に適応する発現ベクターである。
【0059】
原核生物発現系は当該分野で周知であり、高レベルの構成的および誘導発現に適応するベクターを含む。組換えポリペプチドが細菌細胞に有毒である場合、誘導発現系は特に有利である。発現の誘導を、種々のインデューサーに反応するプロモーターによって厳密に制御される(例えば、IPTG誘導性)。細菌細胞を、誘導前の静止期まで増殖させることができる、それにより有毒ポリペプチドの有害性を減少させることができる。
【0060】
さらに、一定のポリペプチドは、例えば、タンパク質の安定性または凝集の問題により組換え製造が困難であることも当該分野で周知である。天然および組換え細菌ポリペプチドの産生を容易にする遺伝子(例えば、細菌プロテアーゼ)が変異した遺伝子改変細菌株が利用可能であることが周知である。
【0061】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ベクターは、真核生物発現に適応した発現ベクターである。
【0062】
典型的には、適用には、例として、細胞/組織特異的発現を媒介する転写調節配列(プロモーター配列)の提供が含まれるが、これらに限定されない。これらのプロモーター配列は、細胞/組織特異的であるか、誘導可能であるか、構成的であり得る。
【0063】
プロモーターは当該分野で認識された用語であり、明白にする目的で、これには、例示のみで限定しない以下の特徴が含まれる。エンハンサーエレメントは、しばしば遺伝子の転写阻害部位の5’末端で見出されるシス作用酢酸配列である(エンハンサーを、遺伝子配列の3’末端でも見出すことができるか、イントロン配列中に存在するので位置独立性である)。エンハンサーは、エンハンサーが連結する遺伝子の転写速度を増大させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用転写因子(ポリペプチド)に反応性を示す。転写因子の結合/活性(David S LatchmanによるEukaryotic Transcription Factors,Academic Press Ltd, San Diegoを参照のこと)は、例えば、中間代謝産物(例えば、グルコース、脂質)、環境エフェクター(例えば、光、熱)が含まれるが、これらに限定されない多数の環境因子に反応性を示す。
【0064】
プロモーターエレメントはまた、いわゆるTATAボックスおよび転写開始部位を選択するように機能するRNAポリメラーゼ開始選択(RIS)配列を含む。これらの配列はまた、特に、RNAポリメラーゼによる転写開始選択を容易にするように機能するポリペプチドに結合する。
【0065】
適用には、真核細胞または原核細胞のいずれかでのベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律複製配列の提供も含まれる。自立的に維持されたベクターを、エピソームベクターという。
【0066】
ベクターコード遺伝子の発現を容易にする適用には、転写終結/ポリアデニル化配列の提供が含まれる。これにはまた、2シストロンまたは多シストロン発現カセット中に配列されたベクターコード遺伝子の発現を最大にするように機能する内部リボゾーム結合部位(IRES)の提供が含まれる。
【0067】
これらの適用は、当該分野で周知である。一般に、発現ベクター構築および組換えDNA技術の発現に関する有意数の公開文献が存在する。Sambrookら、1989、「Molecular Cloning:A Laboratory Mannual」、Cold Spring Harbour Laboratory、Cold Spring Harbour、NYおよびその参考文献;Marston,F、1987、「DNA Cloning Techniques:A Practical Approach」、第III巻、IRL Press、Oxford UK;「DNA Cloning」、F.M.Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley&Sons,Inc.、1994を参照のこと。
【0068】
本発明のなおさらなる態様では、
(i)ポリペプチドの製造のための条件下で、本発明のベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させるステップと、
ii)前記細胞またはその増殖環境から前記ポリペプチドを精製するステップとを含む、本発明の結合剤ポリペプチドの調製方法が得られる。
【0069】
本発明の好ましい方法では、ベクターは、結合剤ポリペプチドの生成を容易にするために分泌シグナルをコードするので、これを使用して組換えポリペプチドが得られる。
【0070】
本発明のなおさらなる態様では、本発明のベクターまたは核酸により形質転換またはトランスフェクトした細胞が得られる。
【0071】
好ましくは、細胞は真核細胞であり、真菌;昆虫(例えば、Spodoptera frugiperda);両生類;植物;哺乳動物から選択される。
【0072】
より好ましくは、細胞は原核細胞であり、大腸菌細胞である。
【0073】
好ましくは、本発明の結合剤を、末端肥大症、巨人症、成長ホルモン欠損症、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、糖尿病、癌、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧症(レプチンキメラ)、貧血症、自己免疫疾患および感染症、慢性関節リウマチを含む炎症性障害の治療用の薬物を製造するために使用する。
【0074】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の結合剤を含む医薬組成物が得られる。好ましくは、医薬組成物には、キャリア、賦形剤、および/または希釈剤が含まれる。
【0075】
本発明はまた、有効量の医薬組成物/薬物を被験体に投与するステップを含む、ヒトまたは動物被験体の治療法を提供する。
【0076】
組成物/薬物を経口または鼻用スプレー、エアゾール、懸濁液、乳濁液、および/または点眼液の形態で得ることができることが当業者に明白である。あるいは、薬物を、錠剤形態で得ることができる。別の送達手段には、吸入または噴霧器が含まれる。
【0077】
あるいはまたは好ましくは、薬物を直接注射によって送達させることができる。組成物/薬物を静脈内、筋肉内、皮下、または局所的に送達させることができることも考えられる。なおさらに、組成物/薬物を、経口または直腸投与することができる。
【0078】
本発明はまた、本発明の任意の実施形態の結合剤を形成するステップを含む、腎臓での分子クリアランスを減少させる方法を提供する。
【0079】
本発明の実施形態を、以下の図面を参照して例示のみを目的として記載する。
【0080】
[材料と方法]
表3は、タンパク質構築物の定義に使用した名称を説明する。
【0081】
GH:GHR融合タンパク質の産生
6つの構築物(GHRのC241を含むか含まない3つの異なる長さのリンカー)を、C末端ポリHis発現ベクターにクローン化する。従来の制限部位を使用した信頼性の高いプルーフリーディングPfuを使用してヒトGHを増幅し、ベクターにクローン化する。C末端SD−100GHRを同様に増幅し、従来の制限部位を使用してプライマー中でリンカーを構築してC末端GHにクローン化する。次いで、構築物を完全に配列決定する。
【0082】
GHR−GH−GHR複合体の結晶構造から、GHのC末端(前記191)とC末端SD−100GHRnN末端(126〜128番目の残基)との間の距離は10Aである。10〜20前記の間のリンカーをデザインし、3つの構築物を、Gly4Serリンカーの2、3、または4コピーを含む10、15、または20残基のいずれかのリンカーを使用して作製した。
【0083】
タンパク質の精製
構築物を大腸菌(JM109)中で発現させ、タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーによる第2の精製ステップを使用するInvitorogen Xpressシステムニッケルカラムで精製した。リポ多糖類は、細胞培養系で比較的短いインキュベーション時間を必要とするので、バイオアッセイを干渉しないはずである。必要ならば、キメラアンタゴニストを、ポリミキシンBカラム(Pierce)を使用してさらに精製する。
【0084】
アンタゴニスト活性のスクリーニング
確立されたバイオアッセイを使用して、アンタゴニスト活性をスクリーニングする(9)。全長GHRを発現する永久細胞株を、活性化Stat5に結合するルシフェラーゼレポーターで一過性にトランスフェクトする(9)。24時間後、アンタゴニストを含むまたはアンタゴニストを含まないGHで細胞を6時間刺激する。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した(9)。
【0085】
アゴニスト活性のスクリーニング
全長GHRを発現する永久細胞株を、活性化Stat5に結合するルシフェラーゼレポーターで一過性にトランスフェクトする(9)。24時間後、細胞をGH/GHRで6時間刺激するまたは刺激しない。次いで、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した(9)。
【0086】
GHstopを作製するための下垂体cDNA由来の下垂体GHのPCR
全長ヒト成長ホルモンを、Boehringer Expand High FidelityPCRシステムを使用してヒト下垂体cDNAから増幅した。各反応物は、以下からなる。全体赤50μlのプライマーGHS1−23(正方向)およびGHA573not(逆方向)を各10μM,200μM dNTP、5μlの伸長緩衝液+塩化マグネシウム(1.5mM)、および0.6μlの高信頼性酵素混合物。
【0087】
サンプルを以下に示す。
1.GHS1−23およびGHA573notプライマーを使用した下垂体cDNA
2.アクチン特異的プライマーを使用した下垂体cDNA
3.アクチンについてのコントロールcDNA
4.水コントロール
【0088】
PCR反応マスターミックス1
【表1】
【0089】
マスターミックス2(反応あたり)
10×伸長高信頼性緩衝液(+マグネシウム)(5μl)
滅菌蒸留水(19.4μl)
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ(0.6μl)
25μlのマスターミックス2をマスターミックス1に添加し、鉱物油で重層する。
PCRを以下の方法で行った、
94℃:2分間、
94℃:30秒間/54℃:1分間/72℃:1分間を30サイクル
72℃:10分間。
【0090】
5’ヌクレオチド(GHS1−23)は、成長ホルモン遺伝子の5’末端と配列相同性を示し、3’ヌクレオチド(GHA573not)は、2つの終止コドンと共にNotI部位を含む。PCR反応により、全長ヒト成長ホルモンを含む588bpのバンドが産生された(図2を参照のこと)。次いで、QIAquickPCR精製キット(Qiagen)を使用してフラグメントを精製し、TOPOをpTrcHis−TOPOベクター(Invitrogen、図1を参照のこと)にクローン化した。ライゲーション物を、塩化セシウム法によって大腸菌TOPOワンショット細胞(Invitrogen)に形質転換した。プラスミドミニ調製物を、陽性の形質転換体から産生し、PstI/EcoRIを使用した制限消化によってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを5’および3’がインサート領域に結合するInvitrogenが販売しているベクター特異的プライマー(Xpress正方向プライマーおよびpTrcHis逆方向プライマー、表1を参照のこと)を使用して配列決定した。この構築物をpTrcHisGHstopと命名し、その後のクローニング反応のテンプレートとして使用した。
成長ホルモンプライマー「GHS1−23」の正方向プライマー
【化1】
逆方向プライマーGHA573not
【化2】
【0091】
ヒト肝臓cDNA由来のGHRのC末端SD100ドメインのPCR
GHRのC末端SD100ドメイン(図3)を、先に記載のものと同一のPCR法を使用するが、プライマーGHRS476(正方向)おおびGHRA835H(逆方向)を使用してヒト肝臓cDNAから増幅した(表1を参照のこと)。5’ヌクレオチドは、EcoRI部位を含み、3’ヌクレオチドは2つの終止コドンおよびHindIII部位を含む。PCR反応を行い、先に記載のように明澄化した。
【0092】
サンプルは以下のとおりである。
1.GHR476およびGHRA835Hを使用する肝臓cDNA、
2.アクチン特異的プライマーを使用する肝臓cDNA、
3.コントロールcDNA,
4.水コントロール。
【0093】
PCR反応マスターミックス1
【表2】
【0094】
マスターミックス2(反応あたり)
10×伸長高信頼性緩衝液(+MgCl2)(5μl)
滅菌蒸留水(19.4μl)
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ(0.6μl)
25μlのマスターミックス2をマスターミックス1に添加し、鉱物油で重層する。
【0095】
両ベクター、pTrcHisGHstop、およびPCR産物をEcoRIおよびHindII制限酵素(Promega)を使用した二重消化物に供した。PCR産物を、QIAquick PCR精製キットを使用してきれいにし、消化pTrcHisGHstopベクターを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、QIAquickゲル抽出キットを使用して精製した。GHRのC末端SD100ドメインを含む消化PCRフラグメントを上記消化ベクターにライゲーションして、塩化カルシウム法によってTOPOワンショット細胞(Invitrogen)に形質転換した。ライゲーション物を大腸菌TOPOワンショット細胞(Invitrogen)に形質転換した。プラスミドミニ調製物を陽性の形質転換体から産生し、BamHI/EcoRI(Promega)を使用した制限消化物およびGHS1−23およびGHRA835Hプライマーを使用したPCRスクリーニングによってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを、pTrcHis逆方向プライマーおよびGHseqFプライマー(表1を参照のこと)を使用して配列決定した。このベクターをpTrcHisGHstopGHRと呼び、NotI/EcoRI部位へのGHとGHRとの間の種々の長さのリンカー領域の挿入用の伝達体として使用した。図4は、pTrcHisGHstopGHRの全インサート配列を示す。
【0096】
この構築物により、GhstopとGHlinkGHRとの間のNotI/EcoRI部位にリンカー分子を挿入可能である。
【0097】
リンカー領域の挿入
4つのグリシン残基および1つのセリン残基(全部で20残基)の4×反復配列から構成される初期リンカーを、オリゴヌクレオチドG4S4(正方向)およびG4COM4(逆方向)のアニーリングによって構築した(表1を参照のこと)。5’ヌクレオチドは、NotI部位を含み、3’ヌクレオチドはEcoRI部位を含む。ベクターpTrcHisGHstopGHRを、NotIおよびHindIII制限酵素で二重消化し、QIAquickクリーンアップキット(Qiagen)を使用してきれいにした。
【0098】
【化3】
【0099】
リンカーインサートの調製
オリゴヌクレオチドG4S4およびG4COMS4を、アニーリング緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、50mM NaCl、1mM EDTA)に最終濃度0.1pmol/μlに再懸濁した。等量の各オリゴヌクレオチドを混合し、95℃で2分間過熱し、1時間かけて冷却した。
【0100】
次いで、オリゴヌクレオチド二重らせんを、NotI/EcRI二重消化ベクターpTrcHisGHstopGHRにライゲーションし、塩化カルシウム法によってTOPOワンショット細胞(Invitrogen)に形質転換した。プラスミドミニ調製物を陽性の形質転換体から産生し、NotI/EcoRIを使用した制限消化物およびGHS1−23およびGHRA835Hプライマーを使用したPCRスクリーニングによってスクリーニングした。次いで、正確なインサートサイズのクローンを、pTrcHis逆方向プライマーおよびGHseqFプライマー(表1を参照のこと)を使用して配列決定した。このベクターをpTrcHisGHlinkGHRと呼んだ(図1を参照のこと)。
【0101】
ライゲーションプロセスにより、GHstop領域内n3’終止コドンが除去されるので、全長GHlinkGHRの転写が可能である。
【0102】
同一のストラテジーを使用して、SD100NおよびC末端ドメインを組み込んだGHRの全長細胞外ドメイン中でクローン化した。
【0103】
GHRの全長細胞外ドメイン(GHRflec)の構築
GHRの全長細胞外ドメイン(SD100NおよびC末端)を、GHstopの作製について先に記載のものと同一のPCRプロトコールにしたがって、プライマーGHRS1ECORおよびGHRA835H(表1を参照のこと)を使用して増幅させた。5’ヌクレオチド(GHRS1ECOR)は、EcoRI部位を含み、3’ヌクレオチドはHindIII部位を含む。PCR反応により全長細胞外GHRを含む726bpのバンドが産生され(図7を参照のこと)、QiaquickPCRクリーンアップキット(Qiagen)を使用して精製した。両ベクターpTrcHisGHlinkGHRおよびPCR産物をEcoRIおよびHindII制限酵素を使用した二重消化物に供した。PCR産物を、QIAquick PCRクリーンアップキットを使用してきれいにし、消化ベクターを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、QIAquickゲル抽出キットを使用して精製した。
【0104】
両ベクターpTrcHisGHlinkGHRおよびPCR産物をEcoRIおよびHindIIIで二重消化し、QIAquickクリーンアップキット(Qiagen)を使用してきれいにした。次いで、消化PCR産物を、消化pTrcHisGHlinkGHRベクターにライゲーションし、塩化カルシウム法によってTOPOワンショット細胞(Invitrogen)に形質転換した。陽性の形質転換体を、EcoRIおよびHindIIIを使用した制限消化物ならびにプライマーGHRS1ECORおよびGHRA835Hを使用したPCRによってスクリーニングした。正確なサイズのインサートを有するクローンを、GHseqFおよびベクター特異的プライマーpTrcHis(逆方向)を使用して配列決定した。新規の構築物をpTrcHisGHlinkGHRflecと呼んだ。次いで、これを任意のさらなるリンカーインサートのテンプレートとして使用することができる。
【0105】
pJONEX4へのGHstopおよびGHlinkGHRのクローニング
強力な転写リプレッサー(cI857)および熱誘導性プロモーター(PLλ)の調節下に置くことによって細胞に潜在的に有害な誘導タンパク質を発現させるためにpJONEX4ベクター(図1を参照のこと)を構築した。pJONEX4の構築は、他で記載されている(Jon R.Sayers and Fritz Eckstein;Nucleic Acid Research、第19巻、第15号、4127〜4132、1991)。
【0106】
PLλプロモーター領域を、EcoRI部位中のpUC19にクローン化し、1つのEcoRI部位がpJONEX4を産生するためのプロモーターの下流に残存するように操作した。転写を望む遺伝子をPLλプロモーターのSacI/HindIII上流領域に挿入することができる。このベクターを使用して、温度感受性λリプレッサー(cI857)を特定する細菌に形質転換することができるので、30℃未満の低温で、転写の読み取りはリプレッサータンパク質の存在によって阻止される。しかし、タンパク質発現の高温(42℃)での誘導が進行する。主な目的は、親ベクターpTrcHis−TOPO由来の全長GHstopおよびGHlinkGHRについてそれぞれPCRを行い、pJONEX4中のSacI/HindIII部位にこれらのフラグメントをサブクローン化するためのプライマーを構築することである。
【0107】
5’ヌクレオチドであるTrcRBSsacFは、操作SacI制限部位、新規のリボゾーム結合部位、およびpTrcHis−TOPOベクター中に存在するATG開始コドンを含む。2つの3’ヌクレオチドを使用して、それぞれその親ベクターpTrcHis由来のGHstopおよびGHlinkGHRについてPCRを行う。3’ヌクレオチドであるTrcHindrevはHindIII部位を含み、これを使用して全長GHstop遺伝子についてPCRを行う。他のヌクレオチドであるGHRA835Hは既に記載されており、これを使用してGHlinkGHRについてPCRを行う(表1を参照のこと)。
【0108】
TrcRBSSacIf:
【化4】
【0109】
TrcHindIIIrev:
【化5】
【0110】
PCR法
96℃で2分間、
94℃で30秒間/54℃で1分間/72℃で1分間を30サイクル
72℃で10分間
【0111】
PCR反応;マスターミックス1
【表3】
【0112】
マスターミックス2(反応あたり)
伸長高信頼性緩衝液(+マグネシウム、最終1.5mM)(5μl)
伸長高信頼性伸長ポリメラーゼ(0.6μl)
滅菌蒸留水(19.4μl)
25μlのマスターミックス2をマスターミックス1に添加し、鉱物油で重層する。
【0113】
PCRフラグメントおよびpJONEX4ベクターを共にSacI/HindIIIを使用した二重制限消化物に供し、QIAquickクリーンアップキット(Qiagen)を使用して精製した。次いで、消化PCRフラグメントを上記の消化ベクターにライゲーションし、エレクトロポレーション法によって大腸菌M72(λ)細胞中で形質転換した。プラスミドミニプレップを陽性の形質転換体から産生し、SacI/HindIIIを使用した制限消化物ならびにGhstopのヌクレオチドTrcRBSsac1およびTrcHindrevならびにGHlinkGHRのTrcRBSsacIおよびGHRA835Hを使用したPCRによってスクリーニングした。正確なサイズのクローンを、GHS1−23、GhseqF、Xpress正方向およびGHA573notを使用して配列決定した。
【0114】
pTZ18U/pTrcHis−TOPO/pJONEX4ベクターへの全長IL−6およびgp130のクローニング
種々のベクターにおいてIL−6/gp130キメラを得る。pTZ18Uへのクローニングにより、インビトロ変異誘発が促進され、pJONEX4およびpTrcHis−TOPOベクターを使用して、大腸菌中で組換えタンパク質を作製することができ、ニッケルカラムを使用してこれを精製することができる。
【0115】
クローニングは、Ghstop/GHlinkGHRについて考案されたTAクローニングストラテジーを使用してpTrcHisにて行った。従ってキメラは制限部位BamH1/HindIIIを使用してpJonexおよびpTZ18U系サブクローン化する。
【0116】
これにより、pJONEX中の上流RBSおよびHis6タグが維持され、変異誘発実験のためにpTZ18U(同一の多クローニング部位を有する)に挿入可能である。
【0117】
このストラテジーは、別の制限部位SalI(またはXhoI)と共にNotI部位を含む3’プライムヌクレオチドを使用したIL−6(全長:以下の配列を参照のこと、図1)でのTAのクローン化である。したがって、このSalI部位により、SalI/HindIII部位へのgp130遺伝子のクローニングが可能である(HindIIIはpTrcHisベクターの3’末端中に存在する)。次いで、リンカーを、NotI/SalI部位に挿入することができる。
【0118】
一旦配列決定された構築物を、BamHI/HindIIIを使用してpJonexおよびpTZ18Uベクターにサブクローン化する。
【0119】
IMAGEクローンまたはヒトリンパ球由来のcDNA由来のPCRによって、IL−6およびgp130を増幅する。
【0120】
以下のプライマーを、図11に示すIL−6配列のpTrcHisへのTAクローニングに使用する。
【0121】
pTrcHisへのIL−6のクローニング用プライマー
正方向(5’ヌクレオチド)プライマー1
【化6】
逆方向プライマー(3’ヌクレオチド:NotI/SalIおよび終止コドンを太字で示し、斜体および下線で示した配列は、配列をインフレームおよびNotI/SalI消化のオーバーハングとして保持し、終止コドンを組み込むためのインサート配列である)
【0122】
プライマー2
【化7】
【0123】
次のステップは、gp130全長細胞外ドメインをサブクローン化することである(322〜2112bp;図12を参照のこと)。gp130をSalI/HindIII部位にクローン化する。
【0124】
pTrcHis−TOPOへの全長gp130クローニング用プライマー
正方向プライマー(5’ヌクレオチド:SalI部位を太字で示す)プライマー3
【化8】
逆方向プライマー(HindIIIおよび終止コドンを太字で示す)プライマー4
【化9】
【0125】
ステップ3は5’NotI部位および3’SalI部位を含むリンカー二重らせん中でライゲーションを行うことである。
【0126】
リンカー二重らせん
G4S4Not/SalI(NotIの5’オーバーハングおよびSalIの3’オーバーハングを太字で示す)プライマー7
【化10】
G4S4rev/Not/SalI(NotIおよびSalIの5’オーバーハングを太字で示す)プライマー8
【化11】
【0127】
これにより全長構築物:IL−6/link/gp130が得られる。次のステップは、SalI/HindIII部位にgp130のドメイン欠失物をクローニングすることである。
【0128】
pTrcHis−TOPOへのgp130D1欠失用プライマー(SalI/HindIII部位)
正方向プライマー(SalI部位を太字で示す)プライマー5
【化12】
逆方向プライマー(HindIIIおよび終止コドンを太字で示す)プライマー4
【化13】
【0129】
次のステップは、922bpまでのgp130先端切断型にクローニングすることである(これは、gp130の細胞外領域由来のドメイン1および2が欠失されている)。構築物IL−6/link/gp130D1
【0130】
gp130クローニング用プライマー(922〜2112bpフラグメント)
正方向プライマー(SalI部位を太字で示す)プライマー6
【化14】
逆方向プライマー(HindIIIおよび終止コドンを太字で示す)プライマー4
【化15】
【0131】
エレクトロコンピテントM72(λ)細胞の調製
M72(λ)細胞を、50ml LB中、o/nで増殖させた。100mlのこのo/n培地を、30℃の900mlLBにOD600が0.5〜0.6の間になるまで添加した。次いで、室温、4000rpmで20分間のSorval RC−3B遠心分離機を使用して、細胞を回収した。ペレットを再懸濁し、滅菌氷冷10%(v/v)グリセロールの体積を、1000ml、500ml、250mlに段階的に減少させて、4000rpm、4℃で20分間再遠心分離した。最終的にペレットを1000μlの10%(v/v)グリセロールに再懸濁し、100μlアリコートに分割し、液体窒素中で瞬間冷凍し、−80℃で保存した。
【0132】
M72細胞の形質転換
エレクトロコンピテントM72(λ)細胞を氷上で解凍し、エレクトロポレーションキュベット(セル幅0.1cm、Invitrogen)に入れ、1.8KVでエレクトロポレーションを行った。100μg/mlアンピシリンを補足したLBプレート上で陽性の形質転換体を選択し、30℃で一晩増殖させた。
【0133】
pTrcHis−TOPOベクター由来の構築物発現の誘導
形質転換大腸菌TOP10細胞を、アンピシリン(最終100μg/ml)を補足した10mlのLB培地にて、200rpmで震盪しながら37℃で一晩増殖させた。翌日、5mlの一晩培養物を使用して、アンピシリン(最終100μg/ml)を補足した250mlのLB培地に播種し、OD600=0.6まで増殖させた。次いで、最終濃度1mMのIPTGの添加によって培養物を誘導し、細胞をさらに5時間増殖させた。次いで、誘導細胞を室温で13000rpmの遠心分離によって回収し、ペレットを凍結するか溶解した。
【0134】
pJONEXベクター由来の構築物の発現の誘導
形質転換大腸菌M72(λ)細胞を、アンピシリン(100μg/ml)を補足したLB培地にて2000rpmで撹拌しながら30℃でo/n増殖させた。翌日o/n培養物を使用して、新鮮なLBに播種し、細胞をOD600が約0.6に達するまで増殖させた。次いで、インキュベーターの温度を42℃に調整し、同体積の加温前培地を添加して培地温度を42℃にした。次いで、細胞を42℃でさらに4〜5時間増殖させた後に回収した。
【0135】
固定金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による誘導タンパク質の精製
誘導細胞ペレットを20mMリン酸ナトリウム緩衝液、500mM塩化ナトリウム(pH7.8)中に再懸濁し、最終濃度100μg/mlのニワトリ卵白リゾチームの添加によって溶解し、氷上で15分間静置した。次いで、氷上に保持しながら細胞懸濁液を中程度の設定強度での10秒で3回の破壊によって超音波処理した。次いで、不溶物質を、RC−3B遠心分離機における4000×g、4℃で20分間の遠心分離によって除去した。
【0136】
次いで、明澄化細胞溶解物を20mMリン酸ナトリウム緩衝液、500mMNaCl(pH7.8)で平衡化したProbond樹脂カラム(Invitrogen)に適用した。カラムを20mMリン酸ナトリウム緩衝液、500mM塩化ナトリウム(pH7.8)緩衝液で洗浄し、その後20mMリン酸ナトリウム緩衝液、500mM塩化ナトリウム(pH6.0)で洗浄した。結合タンパク質を、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、500mM塩化ナトリウム(pH6.0)緩衝液に作製した勾配の50mMから500mMへの増加によって溶出した。1mlの画分を回収し、ブラッドフォードタンパク質アッセイおよびSDS−PAGEによって精製をモニターした。目的のタンパク質を含む画分をプールし、1000倍体積の20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.8)に対してそれぞれ2、4、および6時間透析した。次いで、透析したタンパク質を、Amicon Centriprep Y−10を使用して遠心分離した(必要な場合)。透析および遠心分離サンプルを、4℃でまたは凍結して保存するか、成長ホルモン活性についてのバイオアッセイに直接使用した。
【0137】
rGHおよび精製成長ホルモン構築物のバイオアッセイ
Hek293細胞を、全長ヒト成長ホルモン受容体で予め安定にトランスフェクトした。細胞を、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%Lグルタミンを補足したダルベッコMEM/栄養F12培地中で日常的に培養した。バイオアッセイに使用する細胞を、最初に超音波処理し、計数し、12ウェルプレート中の成長培地に2×105細胞/mlでプレートし、37℃、5%CO2でo/n増殖させた。翌日、細胞を富化培地(2/3ダルベッコMEM/F12栄養培地、1/3ダルベッコ4.5g/Lグルコース、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%Lグルタミン)にプレートし、37℃で6時間インキュベートした。製造者の説明書に従ってリン酸カルシウムトランスフェクション系(Life Technology)を使用して、レポーター遺伝子構築物でのトランスフェクションを完了した。細胞を37℃、5%CO2で一晩静置した。翌日、細胞を、100ng/μlデキサメタゾンを補足した飢餓培地(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%Lグルタミンを補足したダルベッコMEM/F12栄養培地)中で作製した5〜5000ng/mlの組換えタンパク質で攻撃誘発した。必要であれば、競合アッセイにおいて組換え野生型GHを精製GHstopまたはキメラタンパク質と混合した。細胞を37℃、5%CO2で少なくとも5時間インキュベーション後、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ活性をアッセイした。
【0138】
ルシフェラーゼ/βガラクトシダーゼアッセイ
製造者の説明書に従ってアッセイを行った。簡単に述べれば、12ウェルプレートから培地を吸引し、細胞を150μlのレポーター溶解緩衝液にて室温で20分間溶解した。
【0139】
βガラクトシダーゼアッセイのために、25μlの各溶解物を96ウェルプレートの2連のウェルに添加し、75μlのアッセイ緩衝液と混合した。プレートを黄色に発色するまで37℃でインキュベートし、この時点でプレートを420nmで読み取った。ルシフェラーゼアッセイのために、50μlの残存溶解物を照度計キュベットに添加し、50μlのルシフェラーゼ基質を添加した。テンプレートを10秒間のボルテックスによって混合し、蛍光を、15秒および60秒間隔で測定した。
測定したルシフェラーゼ:βガラクトシダーゼ活性比の結果によってβガラクトシダーゼ発現について最終データを収集した。図17は、精製GHstopおよびGHlinkGHRを使用したレポーター遺伝子アッセイから得たデータを示す。
【0140】
ウェスタンブロッティング
精製物由来のサンプルを、還元または非還元条件下での12%(v/v)SDS−PAGEによる第1のサンプル分離およびPVDF膜への移行によって成長ホルモン発現について日常的に分析した。次いで、膜を0.05%(v/v)Tween20(PBS−T)を補足した4%(w/v)ミルクタンパク質のPBS溶液中でブロックした。次いで、膜を、1%(w/v)ミルクタンパク質のPBS−T溶液で20000倍希釈した抗成長ホルモン(10A7、マウスIgG1)で探索した。短時間の洗浄後、膜を1%(w/v)ミルクタンパク質のPBS−Tで5000倍希釈したヒツジ抗マウスHRP(Amersham)で探索した。PBS−Tでのさらなる洗浄後、特定のタンパク質バンドをECLウェスタンブロット検出試薬(Amersham)を使用して視覚化した。図16は、pJONEXベクター系のいずれかのpTrcHis−TOPOで発現した誘導タンパク質のウェスタンブロットを示す。
【0141】
成長ホルモンのラジオイムノアッセイ
ラットポリクローナル抗体および標識モノクローナル抗体を使用するNETRIAヒト成長ホルモンIRMAアッセイを使用して、ヒト成長ホルモンアッセイを行った。
【0142】
【表4】
【0143】
インビボでの代謝クリアランス速度試験
スピローグ−ドーリーラットを麻酔し、大腿動脈および頸動脈にカニューレを移植した。2日後、静脈内または皮下注射によってGHまたはキメラを投与する。大腿カニューレを介して血液サンプルを採取し、キメラレベルをラジオイムノアッセイによって測定する(表2を参照のこと)。薬物動態学パラメータを、時間に対するホルモン濃度を適合する利用可能なコンピュータプログラムを使用して評価する。
【0144】
ルシフェラーゼ活性として測定したGHによるGHシグナル伝達の活性化、ネ ガティブコントロール精製、およびChi1A2(GHRに融合したGH)
多数のキメラ構築物を作製した。部分精製キメラを、形質転換XLブルー大腸菌から調製した。非形質転換XLブルー大腸菌由来のタンパク質をニッケルカラムにて精製し、任意の非特異的アゴニストまたはアンタゴニスト作用を検出するためのネガティブコントロールとして使用した。全ての精製タンパク質を、グリセロール中で保存した。
【0145】
ネガティブコントロールおよびキメラ1A2を、GHと共にまたはGHを伴わずにインキュベートした。
【0146】
図19は、成長ホルモン(GH)、ネガティブコントロール(Xlブルー)、および部分精製アンタゴニスト(キメラ1A2)によるStatレポーター(ルシフェラーゼ活性)の誘導を比較するバイオアッセイの結果を示す。
【0147】
グラフは、予想されるGHの用量応答を示す。ネガティブコントロールとのインキュベーションにより、ルシフェラーゼ活性の誘導は認められなかったが、高濃度でバイオアッセイが部分的に阻害された(これは増加したグリセロール濃度の効果であり得る)。500ng/mlでは、のキメラ1A2が完全にGHシグナル伝達を遮断したようである。
【0148】
[文献]
【表5−1】
【表5−2】
【表5−3】
【表5−4】
【表5−5】
【表5−6】
【図面の簡単な説明】
【図1】(a)pTrcHis−TOPOおよびその誘導体;(b)pTrcHis−TOPO/GHstop;(c)pTrcHis−TOPO/Ghstop/GHR;(d)pTrcHis−TOPO/GH/link/GHR;(e)pTrcHis−TOPO/GH/link/flecGHRstop;(f)pJONEXGHstop;pJONEXGHstoplinkGHRの略図を示す。
【図2】588bpのPCR増幅GHフラグメントのcDNA配列(3’NotI部位および2つの終止コドンを、それぞれ太字および斜体で示す)を示す図である。
【図3】390bpのPCR増幅GHR SD100フラグメントのcDNA配列(5’EcoRIおよび3’HindIII制限部位を太字で示し、3’終止コドンを斜体で示す)を示す図である。
【図4】全長GHstopGHR SD100構築物の核酸配列を示す図である。
【図5】全長GHlinkGHR構築物の核酸配列を示す図である(NotI、EcoRI、およびHindIII制限部位を太字で示し、3’終止コドンを斜体で示す)。
【図6】全長GHlinkGHRのタンパク質配列(340アミノ酸)を示す図である。
【図7】GHRの762bpのPCR増幅全長細胞外ドメインの核酸配列(GHRflec)を示す図である(5’EcoRIおよびHindIII部位を太字で示し、2つの3’終止コドンを斜体で示す)。
【図8】GHlinkGHRflec構築物の全長核酸配列を示す図である(NotI、EcoRI、およびHindIII部位を太字で示し、3’終止コドンを斜体で示す)。
【図9】オリゴヌクレオチドTrcRBSsacFおよびGHRA835Hによって作製された1157bpのPCRフラグメントGHlinkGHRの核酸配列を示す図である(SacI、NotI、EcoRI、およびHindIIIを太字で示し、新規のリボゾーム結合部位を太字および下線で示し、開始/終止コドンを斜体で示す)。
【図10】ヌクレオチドpTrcRBSsacIおよびTrcHindrevによって作製された740bpのPCRフラグメントGHstopの核酸配列を示す図である(SacI、NotI、EcoRI、およびHindIIIを太字で示し、新規のリボゾーム結合部位を太字および下線で示し、開始/終止コドンを斜体で示す)。
【図11】GH/GHR受容体キメラの完全なアミノ酸配列を示す図である(GH残基1〜191/リンカー/GHR残基127〜246)。
【図12A】IL−6の全長核酸配列を示す図である。
【図12B】IL−6のアミノ酸配列を示す図である。
【図12】gp130の全長核酸配列を示す図である。
【図13】IL−6/gp130融合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【図14】gp130ドメインI欠失の核酸配列を示す図である(616〜2112bp)。
【図15】gp130ドメイン922〜2112bpの核酸配列を示す図である。
【図16】種々のベクターで形質転換された大腸菌によって発現した誘導タンパク質のウェスタンブロットを示す図である。
【図17】(a)はGhstopおよびGHlinkGHRについてのレポーター遺伝子アッセイのグラフであり、(b)は(a)で示されたデータの定量を示す。
【図18】GH:GHR相互作用およびGHRとのGH:GHRキメラの相互作用を示す図である。
【図19】GH/GHRキメラのインビトロアゴニスト活性を示す図である。
【図20】成長ホルモン(GH)、ネガティブコントロール(XLブルー)、および部分精製アンタゴニスト(キメラ1A2)によるStat5受容体の誘導(ルシフェラーゼ活性)を比較するバイオアッセイの結果を示す図である。
【図21】Chi1A2キメラのヌクレオチド配列を示す図である。
【図22】Chi1A2キメラのタンパク質配列(311アミノ酸)を示す図である。
Claims (53)
- 受容体結合ドメインを含む第2の部分に連結した受容体のリガンド結合ドメインに結合することができる第1の部分を含み、前記受容体の活性を調整する、結合剤。
- 前記結合剤が前記受容体の活性に拮抗する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記結合剤が前記受容体の活性を作動する、請求項1に記載の結合剤。
- 前記第1の部分がサイトカインまたはサイトカインの結合ドメインを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記サイトカインまたはサイトカインの結合ドメインが、成長ホルモン;レプチン;エリスロポイエチン、プロラクチン;TNF;インターロイキン(IL)、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−11;IL−12、IL−13、IL−15のp35サブユニット;顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF);顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF);毛様体神経栄養因子(CNTF);カルディオトロフィン1(CT−1);白血病抑制因子(LIF);オンコスタチンM(OSM);インターフェロン、IFNα、およびIFNγから選択される、請求項4に記載の結合剤。
- 前記第2の部分が少なくともサイトカインの同族受容体の一部または関連受容体の一部を含む、請求項4または請求項5に記載の結合剤。
- 前記第1の部分がGHである、請求項5または請求項6に記載の結合剤。
- 前記第2の部分がGHRの1つの細胞外ドメインである、請求項4〜7のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記第2の部分がGHRのC末端SD−100ドメインである、請求項8に記載の結合剤。
- 前記第1の部分がIL−6またはIL−6の結合ドメインであり、前記第2の部分がIL−6受容体の一部またはgp130である、請求項5または請求項6に記載の結合剤。
- 前記結合剤が融合タンパク質である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記第1の部分がリンカーによって前記第2の部分に連結している、請求項1〜11のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記第1の部分がGHであり、GH分子のC末端付近の残基とGHRのN末端付近の残基との間で連結している、請求項12に記載の結合剤。
- GH分子のC末端付近の残基とC末端SD−100のN末端のN末端付近の残基との間で連結している、請求項13に記載の結合剤。
- GHRのC末端SD−100のN末端の126〜128番目の任意の残基で連結している、請求項14に記載の結合剤。
- C末端SD−100のN末端の127番目の残基で連結している、請求項15に記載の結合剤。
- 前記リンカーが核酸、ペプチド核酸、または化学的架橋剤である、請求項12〜16のいずれか1項に記載の結合剤。
- 前記リンカーがペプチドである、請求項17に記載の結合剤。
- 前記リンカーが5〜30個のアミノ酸残基を含むポリペプチドである、請求項18に記載の結合剤。
- 前記リンカーが10〜20個のアミノ酸残基を含む、請求項19に記載の結合剤。
- 前記リンカーがペプチド、
GlyGlyGlyGlySer(以後、「Gly4Ser」という)
の少なくとも1つのコピーを含む、請求項18〜20のいずれか1項に記載の結合剤。 - 前記リンカーがGly4Serリンカーの2つのコピーを含む、請求項21に記載の結合剤。
- 前記リンカーがGly4Serリンカーの3つのコピーを含む、請求項21に記載の結合剤。
- 前記リンカーがGly4Serリンカーの4つのコピーを含む、請求項21に記載の結合剤。
- i)図4、5、8、9、および21を含む群、
ii)上記の(i)の配列とハイブリッド形成し、受容体拮抗活性を有する核酸、および
iii)上記の(i)および(ii)において定義された配列に対する遺伝コードの結果として縮重する核酸配列からなる群から選択される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の結合剤をコードする核酸配列を含む核酸分子。 - ストリンジェントなハイブリッド条件下で図4、5、8、9、または21に記載の配列にハイブリッド形成する、請求項25に記載の核酸。
- 請求項25または請求項26に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
- 少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変された、請求項27に記載のポリペプチド。
- 請求項25または請求項26のいずれか1項に記載のDNA分子を含むベクター。
- 前記ベクターが組換え発現に適応している、請求項29に記載のベクター。
- 前記ベクターが原核生物遺伝子発現に適応している発現ベクターである、請求項29または請求項30に記載のベクター。
- 前記ベクターが真核生物遺伝子発現に適応している発現ベクターである、請求項29または請求項30に記載のベクター。
- 前記ベクターが得られ、それにより前記結合剤が前記結合剤の精製を容易にするための分泌シグナルを含む、請求項29〜32のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項25または請求項26のいずれか1項に記載の核酸または請求項29〜33のいずれか1項に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
- 前記細胞が真核細胞である、請求項34に記載の細胞。
- 前記細胞が、真菌細胞、昆虫細胞、両生類細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項35に記載の細胞。
- 前記細胞が原核細胞である、請求項34に記載の細胞。
- 前記細胞が大腸菌である、請求項37に記載の細胞。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の結合剤を含む、医薬組成物。
- 前記組成物がキャリア、賦形剤、および/または希釈剤をさらに含む、請求項39に記載の医薬組成物。
- 末端肥大症、巨人症、GH欠損症、ターナー症候群、腎不全、骨粗鬆症、糖尿病、癌、肥満症、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧、貧血症、自己免疫疾患および感染症、慢性関節リウマチを含む炎症性障害(IL−6キメラ)の治療用の薬物を製造するための請求項1〜24のいずれか1項に記載の結合剤の使用。
- i)ポリペプチドの製造のための条件下で、請求項25〜26のいずれか1項に記載の核酸または請求項29〜33のいずれか1項に記載のベクターにより形質転換またはトランスフェクトされた細胞を増殖させるステップと、
ii)前記細胞またはその増殖環境から前記ポリペプチドを精製するステップと
を含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載の結合剤ポリペプチドの調製方法。 - 有効量の請求項1〜24のいずれか1項に記載の薬剤または請求項39または請求項40のいずれか1項に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む、ヒトまたは動物被験体の治療方法。
- 図4に記載の核酸配列を含む核酸。
- 図5に記載の核酸配列を含む核酸。
- 図8に記載の核酸配列を含む核酸。
- 図9に記載の核酸配列を含む核酸。
- 図21に記載の核酸配列を含む核酸。
- 請求項6、請求項11、請求項13、または請求項22のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
- 受容体のリガンド結合ドメインを受容体結合ドメインに連結するステップを含む、全身性クリアランスが減少した結合剤が得られる、請求項1〜24のいずれか1項に記載の結合剤の製造方法。
- 前記結合剤が少なくとも70kDaである、請求項50に記載の方法。
- 前記結合剤が70kDaと80kDaとの間である、請求項51に記載の方法。
- 前記結合剤が80kDaよりも大きい、請求項52に記載の方法。
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