JP2004503215A - Method for enriching quiescent cells in a hematopoietic cell population - Google Patents

Abstract

望ましい移植表現型を有する静止細胞を高い割合で有する造血細胞集団を得るための好ましい方法を記載する。造血細胞においてアポトーシスを誘導するための方法もまた、記載する。本発明の方法で有用な、そして本発明の方法から生じる、培地および細胞集団をさらに記載する。A preferred method for obtaining a hematopoietic cell population having a high percentage of quiescent cells with the desired transplant phenotype is described. A method for inducing apoptosis in hematopoietic cells is also described. Media and cell populations useful in and resulting from the methods of the invention are further described.

Description

【０００１】
背景
本発明は、一般的に、造血細胞に関し、そして特に、静止細胞（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）に関して造血細胞集団を濃縮するためのポリペプチドの使用を伴う方法に関する。
【０００２】
さらなる背景として、ＨＭタンパク質群の異常のために、ｉｎ　ｖｉｖｏで調節解除された造血を示す遺伝的突然変異体の研究によって、血液細胞産生の維持および制御における造血微小環境（ＨＭ）の重要性が立証される；これは、造血幹細胞（ＨＳＣ）の骨髄ホーミングが、移植後の血液細胞産生の成功に必要とされるという観察により；そしてＨＳＣのｅｘ　ｖｉｖｏ維持は、該細胞を骨髄間質または間質細胞株の存在下で培養した場合、有意に改善されることを立証したｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究による（１）（２）（３）（４）（５）（６）。生存および照射間質層両方（７）またはグルタルアルデヒドで固定した間質層（８）とＨＳＣを接触させた後、そして可溶性間質因子を含むＨＳＣの非接触培養後（６）（９）、ＨＳＣ機能の示差制御が観察されるため、ＨＭは、多数の方式で、ＨＳＣに対する制御効果を発揮するようである。これらの効果の解析によって、膜結合および可溶性両方のサイトカインの恒常的および誘導性産生（１０）（１１）（１２）、並びにグリコサミノグリカン類などの接着分子の合成（１３）、並びにフィブロネクチンおよびコラーゲン類を含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の合成（１４）が示されてきている。
【０００３】
ＨＭのＥＣＭタンパク質は、重要な構築上の役割を有し、造血細胞が制御分子と相互作用することが可能な足場を提供する。しかし、細胞がその微小環境の多様な構成要素に接着する受容体の連結が、細胞内シグナル伝達を開始し（１５）（１６）（１７）（１８）（１９）、造血細胞増殖、生存、遊走および分化に対する影響を生じる可能性があることもまた、立証されてきている。これらの観察によって、接着性相互作用が、血液細胞産生の制御に直接関与している可能性があり、そして細胞接着が、その微小環境において、細胞を単に局在させるよりも複雑な役割を果たすことが示唆される。
【０００４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、ＥＣＭタンパク質のファミリーを含んでなり、これらは、骨、中枢骨髄（ｃｅｎｔｒａｌ　ｍａｒｒｏｗ）全体に見出されるＨＭにおいて（１４）（２０）（２１）、そして重要なことに、最も原始的なＨＳＣが主に見られる、骨内膜において（２２）（２３）、偏在性に発現される。これらの選択的スプライシングされる高分子量糖タンパク質は、ヘパリン、コラーゲン、フィブリンおよびゼラチンに対する結合部位を含有し、ＦＮが重要な構築上の役割を持つことが示唆される。さらに、ＦＮはまた、最晩期抗原−４（ＶＬＡ−４；該分子の選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域内の合成ペプチドＣＳ１およびＣＳ５によって定義される部位に結合する、α_４β_１）、ＶＬＡ−５（すべて、ＦＮ分子の細胞結合ドメインに位置する、最少結合配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）と共に、２つの他の相乗結合部位を認識する、α_５β_１）、並びにコンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよびＣＤ４４の細胞表面複合体（ＦＮの高親和性Ｃ末端ヘパリン結合ドメインを認識する）に対する結合部位も含有する。これらのＦＮ受容体類はすべて、ＨＳＣによって、機能状態で発現され（２４）（２５）（２６）（２７）（２８）（２９）（３０）、幹細胞−ＦＮ相互作用もまた、幹細胞レベルでの造血制御に直接の役割を果たしている可能性が示唆される。
【０００５】
ＦＮによるインテグリン受容体類の連結は、いくつかの造血細胞および細胞株において、生理学的反応を誘起することが示されてきているが、これらの反応は多様である。ＦＮへの接着は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＨＳＣ遊走に関与する（３１）が、ｉｎ　ｖｉｖｏ　ＨＳＣホーミングおよび輸送におけるＦＮおよびその受容体の役割は明らかでない。β１−インテグリン受容体は骨髄局在に必要である（２４）（２９）（３２）；しかし、ＨＭ中の他のＥＣＭタンパク質もまた、これらの受容体のリガンドである可能性がある（３３）。
【０００６】
ＦＮへの細胞の接着はまた、いくつかの場合、増殖を刺激し（１６）（３４）、そして細胞産生を増加させる（３５）（３６）（３７）ことも示されてきている；しかし、他の研究は、インテグリン類の連結による増殖の阻害を一貫して立証する（８）（３８）。さらに、いくつかの細胞では、ＶＬＡ−５の連結後、アポトーシスの増加が示されてきている（３９）（４０）が、他のデータは、ＦＮへのＨＳＣの接着が、免疫不全マウスにおいて、造血を再構築する（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）ことが可能なヒト細胞の生存および維持に役割を果たす可能性があることを示唆する（３４）。後者の観察は、ＦＮ上での形質導入後、移植するＨＳＣへの遺伝子移入の増加を立証する多くの研究によって、さらに支持される（３４）（４１）（４２）（４３）。このように、公表された研究は、異なる、そしてときに矛盾した結果を示す。これらの相違は、標的細胞集団、培養条件の不同に、または異なる接着性相互作用および／またはサイトカインによって引き出される細胞内シグナル伝達経路間のクロストークに起因しうる。したがって、インテグリン仲介造血制御過程は、複雑で、そして多因子性であるようである。
【０００７】
その結果、造血細胞の振る舞いがインテグリン連結および活性化によって修飾される正確な機構は、解明されないままである。本明細書に記載する研究の目的は、ＦＮへのＨＳＣの精製集団の接着に続く初期事象、およびレトロウイルス形質導入プロトコルで必要とされるように、延長された期間に渡る、ＦＮ上での細胞の培養後の両方に関して、ＨＳＣインテグリン−ＦＮマトリックス相互作用の生物学的結果を調べることであった。結果は、ＦＮマトリックスへの原始的造血前駆細胞の接着が、これらの細胞のサブセットの死を生じることを立証する。しかし、長期造血再構成の能力を持つものを含む、生存細胞は、ＦＮに接着させた際、主に静止しており、この表現型は、これらの細胞のｉｎ　ｖｉｖｏホーミングおよび移植可能性を保持するのに必須である可能性がある。
発明の概要
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、Ｗ／Ｗ^Ｖマウスへの移植前に、ＶＬＡ−４結合部位を含有するフィブロネクチン（ＦＮ）の断片上で培養されてきている。移植解析によって、ＦＮへの接着が存在する培養中の再構成幹細胞が、優先的に生存することが立証された。アポトーシスおよび増殖を、ＦＮペプチド上で培養した細胞で調べた。アポトーシスの解析によって、非接着細胞に比較して、ＦＮに接着した細胞の死が増加していることが示された。増殖の解析によって、第１日では、類似の割合の接着および非接着細胞が周期中にあったが、第６日ではＦＮに接着した細胞は、主に静止であったことが立証された。このように、インテグリン類を介したＦＮマトリックスへの精製ＨＳＣの接着は、これらの細胞のサブセットの死を生じることが発見されてきている。長期造血再構成の能力を持つものを含む、生存細胞は、延長された期間、ＦＮに接着した後、主に静止しており、この表現型は、移植可能性を保持するのに重要であると考えられる。
【０００８】
したがって、１つの好ましい態様において、本発明は、静止造血細胞集団を得るための方法であって、造血細胞の数を拡大するように、該細胞をフィブロネクチンポリペプチドに接着させながら、造血細胞を培養することを含んでなり、前記接着が、増加した割合の静止造血細胞を提供する、前記方法を提供する。
【０００９】
本発明の別の好ましい態様は、静止造血細胞を含有する細胞集団を得るための方法であって、増加した割合の静止造血細胞を提供するように、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドに接着させながら、造血細胞集団を拡大することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１０】
別の形式において、本発明は、造血細胞の亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のアポトーシスを誘導するための方法であって、造血細胞の亜集団のアポトーシスを引き起こすフィブロネクチンポリペプチドと細胞を接触させることを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１１】
別の側面において、本発明は、静止造血細胞を濃縮する、造血細胞培養用の培地であって、フィブロネクチンポリペプチドを含んでなる、前記培地を提供する。
【００１２】
本発明はまた、本発明にしたがった方法によって得ることが可能な、静止造血細胞が濃縮された造血細胞集団も提供する。
本発明の方法における出発造血細胞集団は、望ましくは、幹細胞が濃縮されたヒトＣＤ３４＋造血細胞集団であり、そしてフィブロネクチンまたは他のポリペプチドは、好ましくは、ヒトポリペプチドである。
【００１３】
本発明の１つの目的は、静止細胞が濃縮された造血細胞集団を提供するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、本発明にしたがって産生可能な細胞集団を投与することを含む、被験者を治療するための方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的および特徴および利点は、本明細書の開示から明らかであろう。
好ましい態様の説明
本発明の原理の理解を促進する目的のため、ここで、その特定の態様に対する言及を行うであろうし、そして特定の言い回しを用いて、該態様を説明するであろう。にもかかわらず、それによって、本発明の範囲を限定することは意図せず、本発明が関連する技術分野の当業者に、通常、思い浮かぶであろうように、本明細書に記載するような本発明の原理の改変、さらなる修飾およびさらなる適用を意図することが理解されるであろう。
【００１５】
広い側面において、本発明は、細胞上のインテグリン類に対する結合部位を含有するポリペプチドを利用して、静止細胞を含有する造血細胞集団を得るための方法を提供する。
【００１６】
造血細胞集団は、いかなる適切な供給源から得ることも可能である。例えば、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）骨髄あるいは自己または同種異系末梢血細胞は、ヒト治療または研究用の細胞集団の潜在的な供給源である。骨髄細胞は、例えば腸骨稜、脛骨、大腿骨、胸骨、または別の骨腔から得ることが可能である。骨髄は、当該技術分野に公知であるように、骨からの吸引によって採取し、そしてプロセシングすることが可能である。骨髄は、同種異系移植の場合はドナーから、または自家移植の場合は患者から採取することが可能である。末梢血もまた、標準的技術にしたがって、患者またはドナーから収集することが可能である。これに関連して、収集前に、幹細胞を末梢血に動員するため、既知の技術を用いることが可能であり、こうした技術には患者またはドナーへのサイトカインの投与が含まれる。
【００１７】
造血細胞集団では、幹細胞および前駆細胞が濃縮されていてもよい。これらの目的のため、既知の分離技術を用いることが可能である。例えば、造血前駆細胞は、１以上の細胞表面抗原、例えばＣＤ３４、ＣＤ７１またはｃ−ｋｉｔ受容体に基づき、対応する抗体、特にモノクローナル抗体と組み合わせて、一般的な造血細胞集団から分離することが可能である。こうした分離は、成熟血液細胞を本質的に含まない細胞集団を得るように、行うことが可能である。
【００１８】
こうした細胞表面抗原に対する抗体を利用する、いくつかの分離および濃縮スキームが知られる。これらには、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、磁気に基づく分離（例えば抗体コーティング磁気ビーズを使用するもの）、細胞毒素、フローサイトメトリー、およびそれらに匹敵するものが含まれる。造血前駆細胞および幹細胞が濃縮された細胞集団を得るためのこうした方法の実施は、十分に、技術分野で実施される技術の範囲内である。
【００１９】
選択した造血細胞培養を、インテグリン結合部位、好ましくはＶＬＡ−４結合部位および／またはＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドと接触させる。これに関連し、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５抗原は、知られており、そして例えば１９９６年１２月１０日に発行された米国特許第５，５８３，２０３号に論じられる。ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を有するポリペプチドもまた知られ、そしてこれらには、例えば、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を両方含有するフィブロネクチン、並びにＶＬＡ−４結合部位を有する血管内皮細胞接着分子（ＶＥＣＡＭ）が含まれる。
【００２０】
本発明で使用するためのフィブロネクチンまたは他のポリペプチドの断片は、天然または合成起源であってもよく、そして例えば（７１）（７２）（７３）に先に記載されるように、天然存在材料から実質的に純粋に調製することが可能である。これに関連して、本明細書において、実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片への言及は、天然にフィブロネクチンと共に存在する他のタンパク質を、これらが本質的に含まないことを意味するよう意図する。本発明で使用するための実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチン断片はまた、例えば（７４）（７５）（７６）に一般的に記載されるように、組換え的に産生することも可能である。特に、成熟ヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列である配列番号３、および図６に関連して、Ｈ−２７１（ヘパリン結合ドメインの残基Ａｌａ^１６９０−Ｔｈｒ^１９６０を含む）、Ｃ２７４（Ｐｒｏ^１２４３−Ａｓｐ^１５１６を含む−ＶＬＡ−４部位含有細胞結合ドメイン）、Ｈ−２９６（Ａｌａ^１６９０−Ｔｈｒ^１９８５を含み、そしてヘパリン結合ドメインおよびＶＬＡ−４結合部位を有する）、ＣＨ−２７１（Ｐｒｏ^１２４３−Ａｓｐ^１５１６およびＡｌａ^１６９０−Ｔｈｒ^１９６０を含む−ＶＬＡ−５含有細胞結合ドメインに加えてヘパリン結合部位）、ＣＨ−２９６（Ａｌａ^１６９０−Ｔｈｒ^１９８５およびＡｓｐ^１９６１−Ｔｈｒ^１９８５を含む−ＶＬＡ−５部位含有細胞結合ドメインに加え、ヘパリン結合ドメインに加えて、ＶＬＡ−４部位）およびＣ−ＣＳ１（Ｐｒｏ^１２４３−Ａｓｐ^１５１６およびＡｓｐ^１９６１−Ｔｈｒ^１９８５を含む−細胞結合ドメインに加えてＶＬＡ−４結合部位）と同定される組換え断片は、一般的に、これらの特許に記載されるように調製し、そして単独で、または本発明の他のポリペプチドと組み合わせて用いることが可能である。これらの断片、またはこれらを日常的に得ることが可能な断片は、やはり（７４）に記載されるように、ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６）、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２７９９（メチオニンを介してＨ−２７１に結合したＣ−２７７）、ＦＥＲＭ　ＢＰ−２８００（メチオニンを介してＨ−２９６に結合したＣ−２７７）、およびＦＥＲＭ　ＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）として、日本工業技術院微生物工業技術研究所（ｔｈｅ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｇｅｎｃｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に寄託されている大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）を培養することによって入手可能である。さらに、本明細書において利用可能なフィブロネクチン断片に関する、またはこうした断片の出発材料に関する有用な情報は、上述の組換え断片に関してさらに報告する（７７）に；ヒトフィブロネクチン遺伝子の構造を報告する（７８）に；そしてヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合ドメインに関して報告する（７９）に、見出すことが可能である。例えば３０または３５ｋｄ断片（３０／３５　ＦＮ）に、そして以下の実施例に報告するような組換え断片に含まれるような、ＣＳ−１細胞接着ドメイン（ＶＬＡ−４）を含有するフィブロネクチン断片を使用することが可能である。当業者は、細胞結合活性が、機能するＶＬＡ−４結合およびＶＬＡ−５結合フィブロネクチンドメインの天然アミノ酸配列、並びに天然配列と異なるが、それでも十分に類似であり、細胞結合活性を示すアミノ酸配列両方によって、提供することが可能であると認識するであろう。これらの類似のアミノ酸配列は、対応する天然配列に実質的な配列相同性を示すであろうし、そしてアミノ酸が欠失している、置換されているおよび／または修飾されているが、それでもなお望ましい細胞結合特性を持つアミノ酸配列を提供するものを含む可能性がある。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、これらが必要な細胞結合部位（類）および活性を含有する限り、比較的短くてもまたは長くてもよい。典型的には、少なくとも約１０または２０アミノ酸残基を有するポリペプチドを使用するだろうし、一般的には、少なくとも約１００のこうした残基から約千以上の残基までであろう。
【００２２】
関連するバイオテクノロジー技術は、対象の機能ドメインにおいて、アミノ酸の欠失、置換、付加または他の修飾を、日常的に行うことが可能である状況に進歩してきている。その後、生じたアミノ酸配列を、望ましい細胞結合活性に関して日常的にスクリーニングすることが可能である。本明細書に提供する解説を考慮すると、これらの結合アッセイは、この分野の当業者には、日常的な実験にしか相当しないであろう。
【００２３】
フィブロネクチンの天然ＶＬＡ−４結合部位は、選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域の最初のほぼ２５アミノ酸によって形成される（Ａｓｐ^１９６１−Ｔｈｒ^１９８５）。天然ヒトフィブロネクチンＶＬＡ−４結合部位のアミノ酸配列は、したがって（配列番号１）：
Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
である。
【００２４】
本発明を実行するのに好ましい様式において、その中に、配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１に少なくとも約７０％同一性、より好ましくは少なくとも約８０％同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％同一性を有するアミノ酸配列を有するＶＬＡ−４結合ポリペプチドを用いるであろう。これに関連し、本明細書において、パーセントは、米国国立衛生研究所より入手可能なアドバンストＢＬＡＳＴコンピュータープログラム、バージョン２．０．８を用い、配列情報を比較することによって決定されるような、パーセント同一性を意味するよう意図する。ＢＬＡＳＴプログラムは、（８０）の並列法に基づき、そして（８１）（８２）（８３）に論じられるとおりである。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の並列シンボル（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）数を、２つの配列のより短い方のシンボル総数で割ったものとして、同一性を定義する。該プログラムを用いて、比較しているタンパク質の全長に渡って、パーセント同一性を決定することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラム、ｂｌａｓｔｐの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）５００の記述；（２）１０の期待値；（３）Ｋａｒｌｉｎ−Ａｌｔｓｃｈｕｌパラメーターλ＝０．２７０；（４）Ｋａｒｌｉｎ−ＡｌｔｓｈｕｌパラメーターＫ＝０．０４７０；（５）ギャップペナルティ：存在１１、伸長１；（６）Ｈ値＝４．９４ｅ^−３２４；（６）（８４）（８５）（８６）に記載されるようなＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスに見られる、マッチおよびミスマッチアミノ酸に関するスコアが含まれる。該プログラムはまた、（８７）のＳＥＧプログラムによって決定されるように、問い合わせ配列のマスクオフ部分に対して、ＳＥＧフィルターを用いる。
【００２５】
ヒトフィブロネクチンＶＬＡ−５結合部位のアミノ酸配列は（配列番号２）：
Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ
である。
【００２６】
こうした配列は、例えば、ヒトフィブロネクチンのＶＬＡ−５含有細胞結合ドメインのすべてまたは一部、あるいは類似の機能ポリペプチドを含むことによって、ポリペプチドに取り込むことが可能である。上記のＶＬＡ−４でのように、ＶＬＡ−５に同様に結合するアミノ酸配列を有する他のポリペプチドもまた、本発明で使用可能である。特に、細胞結合にアミノ酸Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ（ＲＧＤ）が必要であることが見出されているが、アミノ酸Ｓｅｒは、ポリペプチドにおいて、他のアミノ酸で置換されていてもよく、それでもなお、細胞結合活性を保持する。したがって、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘを有するポリペプチドを用いることが可能であり、式中、Ｘはセリンまたは配列に細胞結合活性を提供する別のアミノ酸である。
【００２７】
１種類より多い細胞結合部位を有するポリペプチドを使用する場合、望ましいもの以外の細胞結合部位への細胞の接着は、これらの結合部位または対応する細胞表面受容体を適切にマスキングするかまたはブロッキングすることによって、阻害することが可能である。例えば、細胞を、他の受容体に対する抗体の存在下で培養し、こうした受容体とこれらの対応する結合部位の相互作用を阻害するかまたはまったく排除することが可能である。したがって、例えば、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５結合部位を両方有するポリペプチドを用いる際、ＶＬＡ−５に対する抗体を用いて、ＶＬＡ−４相互作用および生物学的結果の優位性を促進することが可能である。こうした抗体は、例えば、モノクローナル抗体であってもよい。ポリペプチド上の結合部位の対応するマスキングは、受容体タンパク質またはその断片を利用して達成することが可能である。
【００２８】
本明細書に記載するようなポリペプチドの存在下での造血細胞の培養を用いて、培養において多数の接着性静止細胞の集団を得ることが可能である。好ましくは、こうした培養は、ポリペプチドの存在を伴わない、対応する培養によって提供されるものに比較した際、増加した割合または数の静止細胞を提供する。より好ましくは、培養は、静止している接着細胞の割合が、培養期間に渡って増加するか、または例えば少なくとも３％、そしてより望ましくは、少なくとも約５％増加するように行われるであろう。その後、生じた細胞培養を、誘導された（例えば毒素または癌療法における照射によって）、先天性または遺伝的障害または異常を治療するために、造血再構成を必要とする患者において、移植のために用いることが可能である。
【００２９】
多数の静止細胞の集団を維持するのに加え、本発明の好ましい培養条件はまた、特に、生じた細胞集団を用いた患者移植が望ましい状況において、培養期間に渡って、細胞集団の拡大も提供するであろう。例えば、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、そして最も好ましくは、少なくとも約３０倍の細胞数の拡大が好ましい。
【００３０】
こうした細胞培養および培養法はまた、診断アッセイにも、造血細胞に対するそれらの影響に関する薬学的剤のスクリーニングにも、そして造血細胞の増殖および／または分化の研究にも用いることが可能である。
【００３１】
基本培地は、造血細胞の培養に適したものであろう。培地は、例えば、血清不含または血清充満培地であってもよい。多くのこうした培地は、一般的に知られ、そして本発明におけるそれらの選択および使用は、この分野で働く当業者の権限内である。細胞培養はまた、細胞増殖または発生をもたらすことが知られる他の剤の存在下で行うことも可能であり、こうした剤には、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン類（例えばＩＬ−６、ＩＬ３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、およびそれらに匹敵するものなどのサイトカインが含まれる。
【００３２】
移植用に哺乳動物に投与するため、本発明の細胞培養の細胞を収集し、そして被験者に細胞を搬送するのに適した装置内に装填することが可能である。例えば、こうした装置は、シリンジ、またはそこから細胞を患者に移すことが可能な他の容器であってもよい。
【００３３】
本発明にしたがって培養する細胞はまた、例えばウイルスベクターなどの適切なベクターの使用を含む、既知の形質導入技術によって、遺伝的に修飾することが可能である。これに関連して、フィブロネクチンのヘパリンＩＩ結合ドメイン（Ａｌａ^１６９０−Ｔｈｒ^１９６０を含む、配列番号３および図６を参照されたい）およびＶＬＡ−４細胞結合ドメインまたは類似の配列を有するポリペプチドは、ウイルスベクターによる形質導入を増進することが知られる。例えば（８８）（８９）（９０）を参照されたい。したがって、本発明の方法は、同一のまたは類似のポリペプチド上での組換えウイルスベクターを用いた形質導入と組み合わせて、ＶＬＡ−４結合部位を含有するフィブロネクチンまたは他のポリペプチド上での細胞の拡大のための培養期間を含むことが可能である。細胞の遺伝的修飾を行って、治療しようとする被験者で失われているか、あるいは別の方式で欠損しているか、または不全であるタンパク質を、細胞に発現させることが可能である。
【００３４】
例えば、組換えウイルスベクターは、外因性ＤＮＡを含有することが可能であり、そして非病原性、すなわち複製不全であることが可能である。これらのベクターは、動物細胞、特に哺乳動物細胞などの宿主細胞の細胞ＤＮＡ内に、効率的に移入し、そして正確にそして安定して外因性ＤＮＡを組み込む。例えば、目的の遺伝子のコード配列由来の一続きの塩基を含むヌクレオチド配列を、遺伝子を駆動する適切なプロモーター、典型的には外因性プロモーターの調節下で、組換えレトロウイルスベクターに組み込むことが可能である。これに関連して、外因性ＤＮＡは、天然にまたは人工的に産生されているＤＮＡを含有することが可能であり、そして異種供給源に派生する部分由来であることが可能であり、この部分は、天然に存在するかまたは化学的に合成された分子であることが可能であり、そしてこの部分は、連結または当該技術分野に知られる他の手段によって、連結されている。
【００３５】
ウイルスに取り込まれる外因性ＤＮＡは、細胞に導入する、目的のＤＮＡのいずれであってもよい。例えば、外因性ＤＮＡは、既知の障害に関連する、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）などのタンパク質、またはアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは偽プライマー（例えば（９１）を参照されたい）、細胞内抗体（例えば（９２）を参照されたい）、増殖因子、あるいはそれに匹敵するものをコードすることが可能である。
【００３６】
示したように、導入するヌクレオチド配列は、プロモーターの調節下であろうし、そしてしたがって、一般的に、プロモーターの下流にあるであろう。言い換えると、プロモーター配列は、一般的に、コード配列の上流（すなわち５’端）にあるであろう。この状態で、外因性コード配列の転写を達成する、プロモーターおよび転写開始コドンと協同する、他の制御要素（例えばエンハンサー配列）があってもよいしまたはなくてもよいことが公知である。句「の調節下」は、導入された遺伝子の転写を達成するのに必要とされるような、こうした他の要素の存在を意図する。また、組換えＤＮＡは、好ましくは、導入されたコード配列下流の終結配列を含むであろう。
【００３７】
選択可能マーカーまたは他の選択可能要因を提供する外因性ＤＮＡを含むレトロウイルスベクターを用いることが可能である。例えば、ベクターは、ネオマイシンなどの抗生物質を含む、多様な選択剤に対する耐性を提供する、１以上の（ｏｎｅ　ｏｒ　ｍｏｒｅ）外因性遺伝子を含有することが可能である。
【００３８】
本発明で用いるウイルスベクターは、好ましくは、ヒトフィブロネクチンを含むフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合ドメインのアミノ酸配列に結合する能力を示す。これに関連して、ヘパリン−ＩＩ結合ドメインのアミノ酸配列に結合し、そしてしたがって、本発明の側面において有効に働くウイルスの能力は、日常的な方法を用いて、容易に確かめることが可能である。一般的に言って、これらのアッセイは、ヘパリン−ＩＩ結合ドメインを含有する、固定したポリペプチドマトリックスからの洗浄に抵抗するように、固定したポリペプチドに、ウイルス粒子が結合する度合いを測定する。簡潔には、例えば、ウイルス含有上清は、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合ドメインを含む、固定したポリペプチドを含有するウェル中で、インキュベーションすることが可能である。その後、ウェルを生理的食塩緩衝液で徹底的に洗浄し、その後、ウイルスの標的細胞をウェル中でインキュベーションして、ウェルに残った感染活性のレベルを測定する。最初のウイルス上清に比較した、感染活性または力価の減少を評価し、そして同様の対照実験のもの（例えばＢＳＡでコーティングしたウェルを用いるもの）に比較する。対照ウェルに比較した際、ヘパリン−ＩＩドメイン含有ウェル中に、有意により高い力価が残っていれば、対象のウイルスが本発明の側面で使用するのに適していることを意味する。このスクリーニング法を容易にするため、ウイルスベクターは、上に論じるように、選択可能マーカー遺伝子を含有してもよい。
【００３９】
慣用法を用いて、本発明にしたがって産生した細胞培養を、直ちに用いることが可能であるし、または必要であれば適切な凍結保護剤の存在下で凍結し、そして使用のため、後に融解することが可能である。
【００４０】
【実施例】
本発明のさらなる理解および認識を促進するため、以下の特定の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明の例であり、そして本発明を限定しないことが理解されるであろう。
【００４１】
一般的情報
組換えフィブロネクチン
ＦＮ断片、ＦＮ　３０／３５は、ヒト血漿ＦＮのキモトリプシン消化によって調製し、そしてゼラチン−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した（４４）（４５）。ＦＮ　３０／３５は、７５ｐｍｏｌ／ｃｍ^２の濃度で用いた。組換えＣＨ−２９６（宝酒造、日本・大津）は、乾燥粉末として得た。これを無菌蒸留水中に溶解し、そしてさらにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ、ニューヨーク州グランドアイランド）で希釈した。９６および６ウェル非組織培養処理プレートを、３０−１００ｎｍｏｌ／ｃｍ^２の濃度のＣＨ−２９６でコーティングした（２９）。９６ウェルプレートには５０μｌ／ウェル、６ウェルプレートには１ｍｌ／ウェルの体積で、ウェルにＣＨ−２９６またはＦＮ　３０／３５を添加することによって、プレートをコーティングし、そして室温でおよそ４時間インキュベーションした。その後、プレートを吸引し、そして非特異的結合に対して、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；フラクションＶ、プロテアーゼ不含；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）１００μｌまたは２ｍｌ（それぞれ）を用いて、３０分間ブロッキングした。その後、ＢＳＡを吸引し、そして細胞を添加する前に、ウェルを培地で洗浄した。対照ウェルは、２％ＢＳＡのみで、連続してコーティングした。
【００４２】
実施例１
原始的造血前駆細胞の単離
メスＢ_６Ｄ_２Ｆ_１（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ　Ｘ　ＤＢＡ／２）またはＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）より購入し、そして我々の施設で、層流ハウジング中で維持した。インディアナ大学医学部実験動物資源委員会（ｔｈｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，　Ｉｎｄｉａｎａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）は、すべての動物処置を認可した。骨髄細胞（ＢＭＣ）は、ＣＯ_２吸入を介した麻酔後、大腿骨、脛骨および腸骨稜を切除し、そしてこれらを乳鉢および乳棒で粉砕することによって、マウスから採取した。粉砕した骨を、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で、繰り返し洗浄し、そして生じた細胞懸濁物を、４０μｍナイロンメッシュ細胞ろ過器（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレークス）でろ過した。低密度骨髄細胞（＜１．０８３ｇ／ｃｍ３）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０８３（Ｓｉｇｍａ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ．、ミズーリ州セントルイス）を用いた不連続密度勾配分離によって単離した。成熟細胞系譜抗原を発現している細胞は、ＭＡＣＳ系（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、カリフォルニア州オーバーン）を用いた免疫磁気選択によって枯渇させた。抗体、抗Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ；クローンＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＣＤ４（Ｌ３／Ｔ４；クローンＲＭ４−５）、抗ＣＤ８ａ（Ｌｙ−２；クローン５３−６．７）、抗Ｇｒ−１（Ｌｙ−６Ｇ；クローンＲＢ６−８Ｃ５）および抗Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ；α_ｍ鎖）（すべてＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）は、全骨髄細胞または脾臓細胞を用いてあらかじめ力価決定し、最適希釈でＭＡＣＳ分離のカクテルとして用いた。簡潔には、低密度ＢＭＣを遠心分離し（１３５０ｒｐｍ、５分間、４℃）、そして上清をデカントした。上述の抗体カクテルを、５ｘ１０^６細胞あたり５０マイクロリットル添加し、そして抗体：細胞懸濁物を、氷上で３０分間インキュベーションした。その後、細胞をＰＢＳ（血清不含）中で洗浄し、そしてヤギ抗ラットＩｇＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、カリフォルニア州オーバーン）と、１０μｌビーズ＋９０μｌ　ＰＢＳ／１０^７細胞で、規則的に攪拌しながら、氷上で１５分間インキュベーションした。その後、細胞−ビーズ混合物を洗浄し、そして１ｍｌ　ＰＢＳ−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−１％　ＢＳＡ／２ｘ１０^８細胞に再懸濁した。その後、細胞懸濁物１ｍｌをカラム（Ｃカラム、最大容量２ｘ１０^８細胞）に添加し、メッシュ内に流し込み、そして磁化するため、５分間放置した。２４ｍｌ　ＰＢＳ−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−１％　ＢＳＡ溶液を用いて、２２Ｇ針を通して細胞を溶出することによって、非磁性分画（成熟細胞系譜抗原陰性細胞；Ｌｉｎ−分画）を収集した。その後、細胞をＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中で洗浄した。
【００４３】
その後、Ｓｃａ−１＋細胞（Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋）、またはＳｃａ−１＋ｃ−ｋｉｔ＋（Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋）細胞いずれかに関して、Ｌｉｎ−細胞を選別した。細胞は、抗Ｓｃａ−１−ＰＥ（Ｌｙ６Ａ／Ｅ；クローンＥ１３−１６１．７）と、単独で、またはｃ−ｋｉｔ受容体に対して向けられる、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗体（ＣＤ１１７；クローン２Ｂ８）と共に（どちらもＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴから；１０μｌの各抗体を１００μｌ　ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ／２５ｘ１０^６細胞に希釈）、４℃で３０分間、暗所でインキュベーションした。その後、これらをＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ中で洗浄し、そして選別前に氷上で保持した。細胞は、４０ｍＷ電力で駆動する、４８８ｎｍレーザー（Ｉｏｎ　Ｌａｓｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ユタ州ソルトレークシティー）を備えたＦＡＣＳｔａｒ　Ｐｌｕｓ細胞選別装置（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて選別した。未分離骨髄細胞を用いて、大部分の造血前駆体を含有することが先に示された、芽球光散乱領域を選択した（４６）。その後、この芽球細胞領域内で、Ｌｉｎ−細胞を選別して、Ｓｃａ−１抗原に関して陽性である細胞；または直線選別領域を用いて、Ｓｃａ−１抗原、およびまたｃ−ｋｉｔ受容体両方を発現する細胞（総Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋集団のおよそ５５％；純度＞９０％）いずれかを選択した。選別用の細胞は、冷却したまま維持し、およそ４，０００細胞／秒の速度で選別し、そして自動化細胞沈着装置（ＡＣＤＵ）を用いて、３０細胞／ウェルで、９６ウェルプレート内に直接選別するか、または８ｍｌ　ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡ内に収集した。その後、これらの細胞を遠心分離し（１３５０ｒｐｍ、５分間、４℃）、上清をデカントし、３００μｌ　ＰＢＳ−０．１％　ＢＳＡに細胞ペレットを再懸濁し、そして計数およびトリパンブルー（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を用いた生存度の決定を行った。
【００４４】
実施例２
選別した細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養
選別した細胞は、上述のように、ＣＨ−２９６、ＦＮ　３０／３５またはＢＳＡでコーティングした９６ウェル（３０細胞／ウェル）または６ウェル（１０，０００または５ｘ１０^４細胞／ウェル）プレートのウェル中で培養した。細胞は、１％解毒ＢＳＡ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ・バンクーバー）、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）、１％グルタミン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）、および組換えサイトカイン：ラット幹細胞因子（ｒｒＳＣＦ；１００ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ　Ｉｎｃ、カリフォルニア州サウザンドオークス）、ヒト巨核球増殖および分化因子（ｒｈＭＧＤＦ；５０ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ　Ｉｎｃ、カリフォルニア州サウザンドオークス）、ヒトインターロイキン６（ｒｈＩＬ−６；５０ｕ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ；５ｎｇ／ｍｌ；Ａｍｇｅｎ　Ｉｎｃ、カリフォルニア州サウザンドオークス）を含有する、「血清不含」培地（Ｘ−ｖｉｖｏ　１５血清不含培地、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）；または「血清充満（ｓｅｒｕｍ−ｒｅｐｌｅｔｅ）」培地（１０％ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）並びにサイトカインｒｍＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル）およびｒｒＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＩＭＤＭ）いずれか、２００μｌおよび２ｍｌ（それぞれ）中で培養した。細胞は、４から１４４時間（６日間）の期間、３７℃でインキュベーションした。９６ウェルプレート中の細胞は、倒立顕微鏡を用いて、ｉｎ　ｓｉｔｕで計数した。６ウェルプレートから、非接着および接着分画を別個に採取した。ウェルは、分画を採取する前に、２ｍｌピペットを用いて、非接着分画を含有する培地で、３回、穏やかにリンスした。その後、細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）１ｍｌをウェルに添加し、そして接着細胞を３７℃で５分間インキュベーションした。その後、細胞解離緩衝液を１ｍｌ　ＰＢＳで希釈し、そして激しくピペッティングすることによって、接着細胞を採取した。ウェルをＰＢＳでリンスし、その後、倒立顕微鏡を用いてこれらを視覚的に検査して、接着細胞がすべて収集されていることを確実にした。その後、細胞を遠心分離し（１３５０ｒｐｍ、４℃、５分間）、再懸濁し、そして計数した。
【００４５】
実施例３
機能解析
３．１　長期再構築アッセイ
ＷＢＢ６Ｆ１／Ｋｉｔ^Ｗ／Ｋｉｔ^Ｗ−Ｖ（Ｗ／Ｗ^ｖ宿主）および野生型Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（ドナー）は、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メイン州バーハーバー）より購入し、そして我々の施設で、層流ハウジング（ｌａｍｉｎａｒ　ｆｌｏｗ　ｈｏｕｓｉｎｇ）中で維持した。Ｌｉｎ−Ｓｃａ−１＋細胞は、上述のように、ドナーＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスから選別し、そして「血清充満」培地中、ＦＮ　３０／３５またはＢＳＡでコーティングしたプレート上、５ｘ１０^４細胞／ウェルで６日間インキュベーションした。この時点で、全ウェルを採取し、そして０．１％（ｖ／ｖ）１Ｍ　Ｈｅｐｅｓおよび０．１％　ＢＳＡを含有する０．５ｍｌのハンクス平衡化塩溶液中のこれらの細胞の希釈物（１／２、１／８、１／２４ウェル）を、側面尾静脈を介した静脈内注射によって、レシピエントＷ／Ｗ^Ｖマウスに移植した。動物はまず、移植後５週間で解析し、そして移植後７ヶ月まで、月間隔で解析した。実験完了時、動物を屠殺し、そしてＤＮＡ抽出用に組織を単離した。個々に印をつけたマウスから、尾静脈を介して、Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ試験管（ＥＤＴＡを含有する；Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）内に、出血させた。ドナー陽性末梢血細胞の解析は、酢酸セルロース電気泳動によって行い（４７）、ドナーヘモグロビンの増加を定量化した。総ヘモグロビン（Ｈｂｂ^ｓに加えた拡散主要および微量ヘモグロビン、Ｈｂｂ^ｄ）のパーセントとして表す、単一（Ｈｂｂ^ｓ）または拡散ヘモグロビン（Ｈｂｂ^ｄ）の濃度は、濃度計を用いて測定した。サザンブロット解析によって、骨髄、脾臓および胸腺において、ドナー由来リンパ球および骨髄球の移植が確認された（データ未提示）。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊドナーは、単一ヘモグロビンに関してホモ接合体（Ｈｂｂ^ｓ／Ｈｂｂ^ｓ）であり、そしてＷ／Ｗ^Ｖレシピエントは、単一／拡散ヘモグロビンに関してヘテロ接合体（５０％　Ｈｂｂ^ｓ／５０％　Ｈｂｂ^ｄ）である（４８）。
【００４６】
３．２　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイ
Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞（純度＞９０％）を、ドナーＢ_２Ｄ_６Ｆ_１マウスから選別し、そして「血清不含」培地中、ＣＨ−２９６でコーティングしたプレート上、１０，０００細胞／ウェルで、６日間インキュベーションした。高および低増殖性の潜在的なコロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣ）は、先に記載されるように（４９）（５０）、二重層栄養寒天培養系において、採取した細胞を低密度（３００細胞／プレート）で蒔くことによってアッセイした。組換えサイトカイン、ネズミコロニー刺激因子−１（ｒｍＣＳＦ−１；１６００単位／プレート）、ネズミインターロイキン３（ｒｍＩＬ−３；２００単位／プレート）（どちらもＧｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）およびヒトインターロイキン１α（ｒｈＩＬ−１α；１０００ｕ／プレート；Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチューセッツ州ボストン）を用いた。
【００４７】
３．３　細胞死解析
Ｂ_２Ｄ_６Ｆ_１マウスから選別したＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞は、「血清不含」培地中、ＣＨ−２９６でコーティングしたプレート上、１０，０００細胞／ウェルで、６日までインキュベーションした。いったん、採取し、そして計数したら、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離（１３５０ｒｐｍ、４℃、５分間）によってペレットにし、そして４μｌアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）および５μｇヨウ化プロピディウム（ＰＩ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラホヤ）を含有する１００μｌアネキシンＶ結合緩衝液（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＣａＣｌ_２）に再懸濁した。細胞を暗所中、室温で２０分間インキュベーションした後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）を用いて解析する前に、さらに２００μｌのアネキシンＶ結合緩衝液を添加した。培養中の細胞死は、（ｉ）ファイル中の死につつある細胞分画［アネキシンＶ＋ＰＩ＋事象（小さい破片を除く）］、および（ｉｉ）ファイル中の初期アポトーシス細胞の割合［アネキシンＶ＋ＰＩ−全細胞］を測定することによって、決定した。
【００４８】
３．４　細胞周期解析
Ｂ_２Ｄ_６Ｆ_１　Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞は、「血清不含」培地中、ＣＨ−２９６でコーティングしたプレート上、１０，０００細胞／ウェルで、３６時間または６日間インキュベーションした。採取前に、細胞は、３７℃で１時間、１０μＭブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いてパルス標識した。採取した細胞は、０．５ｍｌの０．５％パラホルムアルデヒド（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州フェアローン；ｐＨ７．４、ＰＢＳ中）中、氷上で５分間固定した。その後、細胞は、解析前に、４℃で一晩保存した。
【００４９】
固定した細胞を室温に取り出し、そしてその後、１，３５０ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、そして細胞ペレットを穏やかにボルテックスすることによってほぐした。０．５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する３モルのＨＣｌ（０．５ｍｌ、新鮮に作成）を添加し、そして細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、そして細胞を０．５ｍｌの０．１Ｍ　Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７に再懸濁し、そして再度遠心分離した。その後、細胞を１ｍｌ　ＰＢＳ中で洗浄し、そして抗体染色前に、上清をデカントした。細胞は、１％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する４０μｌ　ＰＢＳに希釈した１０μｌ　ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ＢｒｄＵ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナ州インディアナポリス）と、暗所で、３７℃で３０分間インキュベーションした。抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そしてＦＡＣＳｃａｎ上での解析前に、５μｇ／ｍｌ　ＰＩ溶液に再懸濁した。
【００５０】
３．５　統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ　ＩｎＳｔａｔを用いて、対応スチューデントＴ検定を行い、そしてＰ＜０．０５であれば、結果は異なるとみなした。表１の結果は、マン−ホイットニー検定を用いて比較した。
【００５１】
実施例の結果
ＦＮ　３０／３５への接着後の、移植可能幹細胞の優先的生存および移植
ＨＳＣが移植し、そして移植後に長期血液細胞産生に貢献する能力に対する、インテグリン−ＦＮマトリックス相互作用の影響を調べるため、ＷＢＢ６Ｆ１／Ｋｉｔ^Ｗ／Ｋｉｔ^Ｗ−Ｖ、Ｈｂｂ^ｄ／Ｈｂｂ^ｓレシピエントへの移植前に、５ｘ１０^４　Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ　Ｈｂｂ^ｓ／Ｈｂｂ^ｓ　Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋細胞を、「血清充満」培地中、ＦＮのキモトリプシン断片（ＦＮ　３０／３５、ヘパリン結合ドメインおよびＶＬＡ−４インテグリン結合部位を含有）またはＢＳＡ上で、６日間培養した。レシピエントにおける、長期血液細胞産生に対する移植細胞の貢献の解析は、末梢血のヘモグロビン電気泳動によって、毎月決定した。６ヶ月の時点で、ＦＮ　３０／３５およびＢＳＡでコーティングしたプレート両方由来の１／２ウェル／マウスの移植後、１００％のマウスでドナー細胞が完全に移植されたことが示された（データ未提示）。１／２４ウェル／マウスを移植された動物では、ドナー移植片は見られなかった。比較すると、１／８　ＦＮ　３０／３５ウェル／マウスの移植後、すべてのマウスが、完全（図１；レーン９、１０）または部分的再構成（図１；レーン７、８）いずれかを示したが、この同じ希釈で移植したＢＳＡコーティングウェル由来の細胞を投与したマウスはまったく示さなかった（図１；レーン３−６）。すべての動物の移植を解析すると、単一ヘモグロビン（ドナー移植に相当する）のパーセントは、未移植対照と異ならなかった（Ｐ＞０．０５、表１）。対照的に、ＦＮ　３０／３５上で培養した細胞を移植したマウスでは、単一ヘモグロビンのパーセントは、ＢＳＡ上で培養した細胞を移植したマウスにおけるより、有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。したがって、このデータは、ＦＮへの接着が存在する培養における、長期再構成細胞の優先的生存および／または移植を立証する。
【００５２】
ＣＨ−２９６上のＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の培養
しかし、興味深いことに、このデータは、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイを原始的造血クローン原性細胞の機能的表示として用いる、共培養実験によって得られる結果を予測しなかった。これらの研究において、長期造血移植細胞を含有すると報告される細胞の純度を増加させるため、Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋細胞を、ｃ−ｋｉｔ＋細胞に関して、さらに精製した（Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋）。さらに、多数の報告によって、組換えＦＮペプチド、ＣＨ２９６（ヘパリン結合ドメインに加え、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５インテグリン類両方に対する結合部位を含有する）へのＨＳＣの接着が、移植可能ＨＳＣへの遺伝子移入効率を改善することが実証されている（３４）（４２）（４３）ため、そして我々が先に、ＦＮ　３０／３５に比較して、この断片への再構成細胞の接着が類似のレベルであることを立証している（２９）ため、この断片を用いた。ＣＨ−２９６またはＢＳＡでコーティングしたウェル中で、１０，０００のＳｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞を６日間培養した後、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイを用いて、生じた細胞の機能的可能性を解析した。ＢＳＡ培養に対して、ＣＨ−２９６培養に存在するコロニーの頻度または大きさいずれにおいても、コロニー増殖を刺激するのに用いたサイトカインの組み合わせにかかわりなく、有意な相違は観察されなかった（ＨＰＰ−ＣＦＣ対ＬＰＰ−ＣＦＣ）（図２）。このアッセイの結果および細胞の移植可能性を測定するものの間の矛盾は、長期造血再構成が可能であるが、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイにおいて、劣ったクローニング効率を有する、原始的細胞が、ＦＮ上での培養後に優先的に生存するためである可能性があるし；あるいは、ＨＳＣにおいて、懸濁中での細胞培養後に失われる「移植表現型」を、ＦＮ接着が維持する結果である可能性がある（ｉｎ　ｖｉｖｏアッセイで測定されるが、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイで測定されないパラメーター）。
【００５３】
これらの可能性を区別するため、次に、ＣＨ−２９６への精製ＨＳＣ細胞の接着に続く事象を、より詳細に調べた。特に、ＦＮ上でのＨＳＣの優先的な生存につながる可能性がある、細胞死に対するＦＮ培養の影響；および原始的細胞の移植表現型の変化に関連すると示唆されてきている、細胞周期（５１）（５２）（５３）（５４）に対する影響を調べた。Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞が、ＦＮに接着する度合いを明らかにするため、ＣＨ−２９６またはＢＳＡでコーティングしたプレート中で、選別した細胞を４、１８および１４４時間（６日間）培養した。その後、ウェルの非接着および接着分画を別個に採取し、そして計数した。これらの細胞の５１．０±１４．０％が、培養４時間後、ＣＨ−２９６に接着したが、我々は、この相互作用が、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５インテグリン類を介して特異的に仲介されることを、遮断抗体を用いて、先に示している（２９）。興味深いことに、１８時間までに、この分画は、３３．８±７．０％に低下し、ＦＮ上での延長された培養が、接着を減少させる可能性があることが示唆された。しかし、この低下は続かず、そして６日間に渡る培養後であっても、接着は維持された（２７．４±７．５％接着細胞）。これらの培養中のＢＳＡへの非特異的接着は、研究した各時点で、８％未満にとどまった。
【００５４】
これらの培養から得た細胞計数によって、ＣＨ−２９６およびＢＳＡ培養両方において、細胞総数は、最初の１８時間に渡って減少することが立証された。しかし、細胞数の有意により大きい減少が、ＣＨ−２９６上での培養後に観察され（図３Ａ）、この断片へのＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の接着が、能動的に、これらの細胞のサブセットにおいて、死を誘導することが示唆される。培養期間全体で、ＣＨ−２９６でコーティングしたウェルでは、細胞数の減少が見られ、６日の時点であっても、ＣＨ−２９６でコーティングしたウェルには、有意により少ない細胞しかなった（図３Ｂ）。倒立顕微鏡を用い、９６ウェル平底プレートにおいて、ｉｎ　ｓｉｔｕで細胞を計数した際も、ＢＳＡに対してＣＨ−２９６でコーティングしたウェルでは、細胞数の減少がやはり観察されたため、この観察は、採取過程中の損失の結果ではなかった。後者の実験において、自動化細胞沈着装置を備えたフローサイトメーターを用いて、３０　Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞／ウェルを沈着させ、「血清不含」培地中で２４時間培養し、そしてその後、計数した。平均して、ＢＳＡでコーティングしたウェルにおける、投入細胞の６７．６±８．５％に比較して、投入細胞の５４．５±９．８％がＣＨ−２９６でコーティングしたウェルで見られた（ｎ＝５、ｐ＝０．０１１６）。
【００５５】
ＣＨ−２９６上で培養した細胞のこの損失を直接調べるため、アネキシンＶおよびヨウ化プロピディウム（ＰＩ）染色のフローサイトメトリー解析を用いて、研究を行った。１８時間の時点で、非接着分画に対してＦＮ接着分画において、より高い割合の死につつある細胞総数［アネキシンＶ＋ＰＩ＋］が観察された（図４Ａ）。さらに、この同じ時点で、ＦＮ接着分画において、増加した比率の初期アポトーシス細胞［アネキシンＶ＋ＰＩ−全細胞］があった（図４Ｂ）が、これは統計的に有意でなかった。したがって、これらの結果は、培養１８時間までに、多くの細胞がアポトーシス経路の初期段階を通過したことを示し、そしてさらにＦＮに接着した細胞の死の増加を立証する。１４４時間の時点でも、非接着分画に対してＦＮ接着分画において、死につつある細胞および初期アポトーシス細胞両方のレベルで、有意な相違が観察され（図４Ａおよび４Ｂ）、ＦＮへの接着が、これらの細胞のサブセットの死を生じることが再び示唆された。しかし、興味深いことに、ＢＳＡ培養に対して全ＣＨ２９６培養において、細胞死の総レベルに、有意な相違は観察されなかった（データ未提示）。
【００５６】
ＣＨ−２９６に接着した細胞の細胞周期解析
細胞周期状態が、ＨＳＣ移植に影響を及ぼす可能性があることが仮定されてきている（５１）（５２）（５３）（５４）。したがって、１時間のＢｒｄＵパルス標識後、ＢｒｄＵ取り込みを測定することによって、ＣＨ−２９６およびＢＳＡ培養において生存している細胞の周期解析を行った。培養３６時間後、同様の割合のＢＳＡ培養中の細胞、並びにＦＮ接着および非接着細胞が、周期中にあった（図５Ａ）。比較すると、第６日での解析は、非接着分画に比べて、ＦＮ接着分画中の有意により多い細胞が静止であることを立証した（それぞれ、３４．０±０．５％対５８．３±４．１％　Ｇ０／Ｇ１期）（図５Ｂ）。細胞死の解析で見られるように、ＢＳＡ培養に対して総ＣＨ−２９６培養では、周期中にある細胞の割合の間に、有意な相違は観察されなかった（データ未提示）。したがって、これらの結果は、培養６日の時点で、生存し、そしてＣＨ−２９６に接着している細胞は、非接着分画の細胞に比較して、静止していることを立証し、この表現型は、ｉｎ　ｖｉｖｏのＨＳＣ機能の増進と相関する（４６）（５５）（５６）。
【００５７】
実施例の考察
最近の研究は、ＦＮによる細胞接着受容体の連結が、細胞内シグナル伝達を開始することを立証してきている（１５）（１６）（１７）（１８）が、これらのシグナル伝達事象の多様な影響（造血細胞の細胞増殖、死、遊走および分化に対する刺激性および阻害性効果両方を含む）は、接着が仲介する、造血細胞機能の制御が複雑である可能性があることを示唆する。異なる反応が実証されてきているのは、部分的に、これらの研究に、細胞株、形質転換細胞、系譜拘束細胞、または不均質な初代細胞集団が使用されていることによって、説明可能である（１６）（３０）（４０）（４４）（５７）（５８）（５９）（６０）。さらに、ＦＮへの接着によって引き出される効果は、発生段階（２４）（２５）（２８）または研究している前駆体細胞集団の供給源（６１）（６２）で異なる可能性がある。異なる接着およびサイトカインが仲介するシグナル伝達経路間のクロストークおよび協同が実証されてきているため、細胞反応はまた、明らかに、関与する接着性および***促進性相互作用の特定の組み合わせにも関連し、そしてしたがって，培養条件の相違に関連する（１１）（２７）（２９）（３１）（３６）（５８）（５９）（６１）（６３）（６４）（６５）。
【００５８】
本明細書に記載した研究において、我々は、造血幹細胞および前駆細胞におけるインテグリン−ＦＮマトリックス相互作用の生物学的結果を調べた。機能的に定義されたＨＳＣの研究は、ＦＮ　３０／３５上で６日間培養した後の、移植可能細胞の生存および維持を調べた。Ｗ／Ｗ^Ｖレシピエントへの移植後６ヶ月の血液細胞産生への培養細胞の貢献を解析すると、ＦＮ　３０／３５およびＣＨ−２９６両方の上での遺伝子移入研究（３４）（４１）（４２）と一致して、ＦＮへの接着が存在する培養で、再構成幹細胞の生存が観察されることが立証された。しかし、興味深いことに、原始的造血幹細胞および前駆細胞に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏ代理アッセイであるＨＰＰ−ＣＦＣアッセイを用いた解析は、ＢＳＡに対してＣＨ−２９６上で培養した後、原始的クローン原性細胞の頻度および増殖能力（コロニーの大きさによってアッセイされるようなもの）の間に、有意な相違を示さなかった。
【００５９】
先の研究（６６）（６７）で注目された、これらの２つの異なるアッセイ系から得られる結果の間の矛盾は、（ｉ）長期造血再構成が可能であるが、ＨＰＰ−ＣＦＣ培養ではアッセイされない、原始細胞のＦＮ上での優先的な生存によって、または（ｉｉ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏクローン原性アッセイでは測定されず、そして懸濁中の培養後、これらの細胞には失われてしまう表現型である、「移植表現型」が、ＨＳＣにおいて、ＦＮ上で培養後、保持されることによって、説明可能である。これらの可能性を調べるため、我々は、ＦＮへの細胞の接着に続く初期事象を調べて、接着自体が、原始的再構成ＨＳＣの細胞死または優先的生存への影響、あるいは細胞の移植表現型に影響を与える可能性がある、細胞周期への影響を有するかどうかを決定した。いくつかの実験パラメーターが、これらの研究では重要である。ネズミＨＳＣはｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養で、３０−４０時間程度以内に***すると示唆されてきている（６８）ため、調べた初期時点は、４０時間より前であった。長期移植が可能な細胞の反応を調べるため、我々は、これらの研究に、ＨＳＣの精製集団（Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞）を利用した。さらに、我々はまた、組換えＦＮペプチドＣＨ−２９６も用いて、移植可能ＨＳＣの維持および形質導入における、その潜在的な役割をより徹底的に調べた。このＦＮ断片上でのＨＳＣの増加した形質導入の機構は、ウイルス粒子および標的細胞の共局在を伴うようである（４２）が、先に、懸濁中の細胞の培養に比較して、ＣＨ−２９６上の形質導入が、移植可能ＨＳＣの優先的維持と関連するという証拠にしたがって、この影響に対する生物学的構成要素が存在すると仮定されてきている（３４）。本明細書に記載する研究において、細胞／細胞相互作用の影響を最少にしながら、ＦＮへの前駆体細胞の接着の研究を最適化するため、細胞を低密度（〜１０，０００／３５ｍｍウェル）で植え付けた。細胞は、最適に定義された濃度でサイトカイン、ＳＣＦ、ＭＧＤＦ、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦを含む、血清不含培地（血清ＦＮによる変動を回避するため）中で培養した。「初期」作用サイトカインと称されるこれらのサイトカイン（６９）は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで原始的ＨＳＣの生存を維持する能力が報告されているため、そしてＳＣＦおよびＭＧＤＦ両方が、培養中で造血細胞のＦＮへの接着を増加させる能力を持つ（５８）（７０）ため、選択した。
【００６０】
４時間インキュベーションした後、大部分のＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞がＣＨ−２９６に接着したが、この相互作用は、我々が先に、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５を介して仲介されることを先に示したものであった（２９）。４時間に比較して、１８時間、ＦＮ上でインキュベーションした後に観察される接着細胞は、より少ないため、この接着は、ＦＮ受容体機能の下方制御を生じるようであった。しかし、１８時間で観察される接着のレベルは、培養の残りの期間を通じて維持されることから、インテグリン受容体発現／アビディティーは、可逆的に制御されるという仮説が支持される（３０）（３１）（６１）（６５）（７０）。これらの培養由来の細胞を計数することによって、最初の１８時間に渡って、ＣＨ−２９６およびＢＳＡ培養両方の細胞総数が減少したことが立証された。しかし、細胞数の低下は、ＦＮでコーティングしたウェルで有意により高く、そして細胞のアネキシンＶおよびＰＩ染色のフローサイトメトリー解析によって、これらの培養のＣＨ−２９６接着分画において、初期のアポトーシスおよび後期の死につつある細胞両方の比率がより高いことが立証された。これらの結果はまた、ＣＨ−２９６へのＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の接着が、これらの細胞のサブセットにおいて、死を誘導する可能性があることも示唆する。先の研究は、ＦＮへの接着後、特に成熟造血サブセットの、細胞死を示してきている（４０）（３９）および（ＫａｐｕｒおよびＷｉｌｌｉａｍｓ、原稿準備中）。したがって、これらの結果は、移植可能ＨＳＣが、ＦＮ上での培養後、維持されるという観察と合わせて、ＦＮへの接着が、Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋分画における比較的成熟したサブセットの選択的な死を、そしてＨＳＣの優先的な生存を生じるという仮説を支持する可能性がある。しかし、ＢＳＡに対してＦＮ上での培養において、ＬＰＰ−ＣＦＣまたはＨＰＰ−ＣＦＣ生存の頻度に、有意な相違が観察されなかったため、この解釈は可能性がより低いようである。
【００６１】
あるいは、結果は、ＦＮに接着する細胞における「移植」表現型の維持を示唆する。先の研究は、静止細胞が、活性周期中の細胞より、有意により高い移植可能性を維持することを立証している（５２）（５３）（５４）。ＦＮを含有する培養における、「移植可能」ＨＳＣ表現型の維持が、これらの細胞の静止性に関連するという仮説を調べるため、ＦＮ接着細胞の細胞周期状態を、非接着細胞のものと比較した。結果によって、ＣＨ−２９６接着および非接着細胞が、３６時間では等しく周期中にあったが、６日までには、生存し、そしてＣＨ−２９６に接着している細胞は、非接着細胞に比較して、静止していることが示された。ｉｎ　ｖｉｖｏ移植研究の状況において、これらの結果は、遺伝子移入プロトコルにＦＮを利用した際に報告された（３４）、再構築細胞の維持の機構を提供する。このように、本明細書に提示した研究、および遺伝子移入実験からのもの（３４）（４１）（４２）（４３）によって、ＦＮの存在下での長期培養後の形質導入細胞の移植は、Ｇ０／Ｇ１にある接着細胞の維持または再進入に関連する可能性があることが示唆される。ベクター配列の組込みは細胞***を必要とするため、これらのデータが意味するのは、ＦＮへの接着が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞***後、Ｇ０／Ｇ１に細胞を維持することである。
【００６２】
要約すると、本明細書に記載する結果によって、ＦＮの存在下、培養６日後に観察される移植の改善は、ＨＳＣの生存および静止の結果である可能性があり、細胞が、骨髄にホーミングし、そして移植後に移植する能力を保持するのを可能にすることが示唆される。
【００６３】
表１：電気泳動後の異なるヘモグロビンバンドの濃度計解析
【００６４】
【表１】

【００６５】
^Ａ総濃度＝単一ヘモグロビン（Ｈｂｂ^ｓ）および拡散ヘモグロビン（Ｈｂｂ^ｄ）バンドの濃度。括弧内の数は、解析した動物の数を示す。
^ＢＰ＜０．０５対３０／３５培養；ＮＳ対ＢＳＡ培養
^ＣＰ＜０．０５対ＢＳＡ培養
参考文献
以下の参考文献、および本明細書に引用される他の参考文献はいずれも、当該技術分野のレベルを示し、そして引用され、そして完全に示された箇所で、各々が個々に援用されているかのように、各々、本明細書に援用される。
【００６６】
【表２】

【００６７】
本発明は、図および前述の説明に詳細に例示され、そして記載されているが、こうした図および説明は例示であり、そして性質として限定するものでないとみなされるものとし、好ましい態様のみが示され、そして記載されてきており、そして本発明の精神内にある、すべての変更および修飾は保護されることが望ましいことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヘモグロビン電気泳動によってアッセイした、ＦＮ　３０／３５上で６日間培養した後の細胞の移植。Ｈｂｂ^ｓホモ接合体マウス（ドナー、Ｄ）由来のＬｉｎ−Ｓｃａ＋細胞を、「血清充満」培地中、５ｘ１０^４細胞／３５ｍｍ　ＦＮ　３０／３５またはＢＳＡコーティングウェルで、６日間培養した。その後、細胞を採取し、そしてウェルの希釈物を、レシピエント（Ｒ）Ｗ／Ｗ^ｖ（Ｈｂｂ^ｄ／Ｈｂｂ^ｓ）マウスに移植した。結果は、６ヶ月での末梢血中のヘモグロビン型の解析によって評価した、レシピエント中のドナー細胞移植を示す。レーン：１＝レシピエント対照；２＝ドナー対照；３−６＝ＢＳＡ、１／８ウェル／マウス；７−１０＝ＦＮ　３０／３５、１／８ウェル／マウス；Ｈｂｂ−ｄ：ヘモグロビン拡散バンド；Ｈｂｂ−ｓ：ヘモグロビン単一バンド。
【図２】ＨＰＰ−ＣＦＣおよびＬＰＰ−ＣＦＣの生存／増殖に対するＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の接着の影響。Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞を、「血清不含」培地中、１０，０００細胞／３５ｍｍ　ＣＨ−２９６またはＢＳＡコーティングウェルで、６日間培養した。その後、細胞を採取し、そして３００細胞／プレートで、ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイ中に蒔いた。コロニーアッセイで用いた増殖因子の組み合わせを示す。結果は、５実験からの細胞の平均クローニング効率（±ＳＥＭ）を示す。ＢＳＡに対してＣＨ−２９６上での培養後の、ＨＰＰ−ＣＦＣ（薄い斜線）またはＬＰＰ−ＣＦＣ（濃い斜線）いずれの平均クローニング効率の間にも、有意な相違はまったく観察されなかった（Ｐ＞０．０５）。白抜きのボックス＝ＢＳＡ培養中で蒔いた細胞；濃いボックス＝ＣＨ−２９６培養中で蒔いた細胞。
【図３】ＣＨ−２９６上のＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の培養後の細胞数の減少。「血清不含」培地中、ＣＨ−２９６またはＢＳＡでコーティングしたウェル上での１０，０００のＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の培養後の細胞数。結果は、各時点での投入の割合としての細胞数／ウェル（生存）を示す（６−１１実験／時点の、平均±ＳＥＭ）。白抜きのボックス＝ＢＳＡ培養；濃いボックス＝ＣＨ−２９６培養。Ａ）４時間、１８時間、３６時間。Ｂ）１４４時間（６日間）。ＣＨ−２９６の細胞数は、測定したすべての時点で、ＢＳＡと有意に異なる；^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．００５；^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【図４】ＣＨ−２９６への接着後のＬｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の死。Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞を、「血清不含」培地中、１０，０００細胞／３５ｍｍ　ＣＨ−２９６またはＢＳＡコーティングウェルで、１４４時間（６日間）までの期間、培養した。各時点で、ウェルの非接着および接着分画を別個に採取し、計数し、そしてフローサイトメトリー解析前に、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩで染色した。ファイルの２つのゲーティングを示す：培養中の、Ａ）死につつある細胞の割合［ファイル中のアネキシンＶ＋ＰＩ＋細胞（小さい破片を除く）］、およびＢ）初期アポトーシス細胞の割合［アネキシンＶ＋ＰＩ−全細胞］。結果は、３−６実験／時点の、平均±ＳＥＭである。白抜きのボックス＝ＢＳＡ；斜線のボックス＝ＣＨ−２９６非接着細胞；濃いボックス＝ＣＨ−２９６接着細胞。^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５】Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞の細胞周期状態に対するＣＨ−２９６への接着の影響。Ｌｉｎ−Ｓｃａ＋Ｋｉｔ＋細胞を、「血清不含」培地中、１０，０００細胞／３５ｍｍ　ＣＨ−２９６またはＢＳＡコーティングウェルで、Ａ）３６およびＢ）１４４時間（６日間）培養した。細胞は、採取１時間前に、１０μＭ　ＢｒｄＵでパルス処理した。ウェルの非接着および接着分画を別個に収集し、そして固定し、そしてウェルにおいて周期中にある細胞の比率をフローサイトメトリーで解析する前に、抗ＢｒｄＵ抗体およびＰＩで染色した。結果は、３実験／時点の、平均±ＳＥＭである。白抜きのボックス＝ＢＳＡ；斜線のボックス＝ＣＨ−２９６非接着細胞；濃いボックス＝ＣＨ−２９６接着細胞。^＊Ｐ＜０．０５。
【図６】フィブロネクチンのα鎖構造およびいくつかの組換え断片との関連の図示。フィブロネクチンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型反復を示し、そしてＩＩＩ型反復に、１から１４の番号を付ける。細胞に対する３つの結合部位は、ＶＬＡ−５結合部位を含む細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）の細胞、ヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）のヘパリン、および選択的スプライシングＩＩＩＣＳ領域の最初の２５アミノ酸によって形成されるＶＬＡ−４結合部位ＣＳ１のＣＳ１として示す。[0001]
background
The present invention relates generally to hematopoietic cells, and particularly to methods involving the use of polypeptides to enrich a hematopoietic cell population with respect to quiescent cells.
[0002]
By way of further background, the study of genetic mutants exhibiting deregulated hematopoiesis in vivo due to abnormalities in the HM proteins has led to the importance of the hematopoietic microenvironment (HM) in maintaining and controlling blood cell production. This is demonstrated by the observation that bone marrow homing of hematopoietic stem cells (HSCs) is required for successful blood cell production after transplantation; and ex そ し て vivo maintenance of HSCs results in the bone marrow stroma or interstitial (1) (2) (3) (4) (5) (6) by in vitro studies that have proven to be significantly improved when cultured in the presence of a cytoplasmic cell line. After contacting HSCs with both viable and irradiated stroma layers (7) or glutaraldehyde-fixed stroma layer (8), and after non-contact culture of HSCs containing soluble stroma factors (6) (9), Since differential control of HSC function is observed, HM appears to exert control effects on HSC in a number of ways. Analysis of these effects shows the constitutive and inducible production of both membrane-bound and soluble cytokines (10) (11) (12), and the synthesis of adhesion molecules such as glycosaminoglycans (13), and fibronectin and The synthesis of extracellular matrix (ECM) proteins, including collagens, has been demonstrated (14).
[0003]
The HM ECM protein has important architectural roles and provides a scaffold through which hematopoietic cells can interact with regulatory molecules. However, the linking of receptors, where cells adhere to various components of their microenvironment, initiates intracellular signaling (15) (16) (17) (18) (19), and hematopoietic cell proliferation, survival, It has also been established that it can produce effects on migration and differentiation. These observations suggest that adhesive interactions may be directly involved in controlling blood cell production, and that cell adhesion plays a more complex role in its microenvironment than simply localizing cells It is suggested that
[0004]
Fibronectin (FN) comprises a family of ECM proteins, which are found in bone, the HM found throughout the central bone marrow (14) (20) (21), and importantly, the most primitive. HSCs are predominantly found in the endosteum (22) (23) and are ubiquitously expressed. These alternatively spliced high molecular weight glycoproteins contain binding sites for heparin, collagen, fibrin and gelatin, suggesting that FN has an important architectural role. Furthermore, FN also binds to the site defined by synthetic peptides CS1 and CS5 in the late splicing antigen-4 (VLA-4; alternative splicing IIICS region of the molecule, α₄β₁), VLA-5 (recognizing two other synergistic binding sites with the minimal binding sequence Arg-Gly-Asp (RGD), all located in the cell binding domain of the FN molecule, α₅β₁), And binding sites for the cell surface complex of chondroitin sulfate proteoglycan and CD44, which recognizes the high affinity C-terminal heparin binding domain of FN. All of these FN receptors are functionally expressed by HSCs (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30), and stem cell-FN interactions are also at the stem cell level. May play a direct role in the control of hematopoiesis.
[0005]
Ligation of integrin receptors by FN has been shown to elicit physiological responses in some hematopoietic cells and cell lines, but these responses are diverse. Adhesion to FN is involved in HSC migration in vitro (31), but the role of FN and its receptor in in vivo VSC homing and transport is unclear. β1-integrin receptors are required for bone marrow localization (24) (29) (32); however, other ECM proteins in HM may also be ligands for these receptors (33) .
[0006]
Adhesion of cells to FN has also been shown in some cases to stimulate proliferation (16) (34) and increase cell production (35) (36) (37); however, Other studies have consistently demonstrated inhibition of proliferation by ligation of integrins (8) (38). In addition, some cells have been shown to increase apoptosis following VLA-5 ligation (39) (40), while other data indicate that HSC adhesion to FN was Suggests that it may play a role in the survival and maintenance of human cells capable of repopulating hematopoiesis (34). The latter observation is further supported by a number of studies demonstrating increased gene transfer into transplanted HSCs after transduction on FN (34) (41) (42) (43). Thus, published studies show different and sometimes conflicting results. These differences may be due to differences in target cell populations, culture conditions, or cross-talk between intracellular signaling pathways elicited by different adhesive interactions and / or cytokines. Thus, the integrin-mediated hematopoietic control process appears to be complex and multifactorial.
[0007]
As a result, the exact mechanism by which hematopoietic cell behavior is modified by integrin ligation and activation remains elusive. The objectives of the studies described here were the initial events following the attachment of the purified population of HSCs to FN, and the extended period of time on FN as required in retroviral transduction protocols. The purpose was to examine the biological consequences of the HSC integrin-FN matrix interaction, both after culturing the cells. The results demonstrate that attachment of primitive hematopoietic progenitor cells to the FN matrix results in the death of a subset of these cells. However, surviving cells, including those with the potential for long-term hematopoietic reconstitution, are largely quiescent when adhered to FN, and this phenotype preserves the in vivo homing and transplantability of these cells. May be necessary to do so.
Summary of the Invention
Hematopoietic stem cells (HSC) are W / W^VPrior to transplantation into mice, they have been cultured on fibronectin (FN) fragments containing the VLA-4 binding site. Transplantation analysis demonstrated that reconstituted stem cells in culture with adherence to FN preferentially survived. Apoptosis and proliferation were examined in cells cultured on FN peptide. Analysis of apoptosis showed increased death of cells attached to FN compared to non-adherent cells. Analysis of proliferation demonstrated that on day 1, a similar proportion of adherent and non-adherent cells were in the cycle, but on day 6, cells that adhered to FN were predominantly quiescent. Thus, it has been discovered that adhesion of purified HSCs to FN matrices via integrins results in the death of a subset of these cells. Surviving cells, including those with the potential for long-term hematopoietic reconstitution, are primarily quiescent after prolonged adherence to FN, a phenotype that is important in retaining transplantability it is conceivable that.
[0008]
Thus, in one preferred embodiment, the invention is a method for obtaining a population of quiescent hematopoietic cells, wherein the culturing of the hematopoietic cells is performed while adhering the cells to a fibronectin polypeptide so as to expand the number of hematopoietic cells. Providing the method, wherein the adhesion provides an increased percentage of quiescent hematopoietic cells.
[0009]
Another preferred embodiment of the present invention is a method for obtaining a cell population containing quiescent hematopoietic cells, wherein the method comprises attaching to a polypeptide having a VLA-4 binding site to provide an increased percentage of quiescent hematopoietic cells. Providing the above method, while expanding the population of hematopoietic cells.
[0010]
In another form, the invention provides a method for inducing apoptosis of a subpopulation of hematopoietic cells, comprising contacting a cell with a fibronectin polypeptide that causes apoptosis of a subpopulation of hematopoietic cells. The method is provided.
[0011]
In another aspect, the present invention provides a hematopoietic cell culture medium for enriching quiescent hematopoietic cells, the medium comprising a fibronectin polypeptide.
[0012]
The present invention also provides a hematopoietic cell population enriched in quiescent hematopoietic cells, obtainable by a method according to the present invention.
The starting hematopoietic cell population in the method of the invention is desirably a human CD34 + hematopoietic cell population enriched for stem cells, and the fibronectin or other polypeptide is preferably a human polypeptide.
[0013]
One object of the present invention is to provide a method for providing a hematopoietic cell population enriched for quiescent cells.
Another object of the present invention is to provide a method for treating a subject, comprising administering a cell population producible according to the present invention.
[0014]
Further objects and features and advantages of the present invention will be apparent from the disclosure herein.
Description of the preferred embodiment
For purposes of promoting an understanding of the principles of the invention, reference will now be made to particular embodiments thereof, and specific language will be used to describe the embodiments. Nevertheless, thereby, it is not intended to limit the scope of the invention, as described herein as would normally occur to one of ordinary skill in the art to which the invention pertains. It will be understood that variations, further modifications and further applications of the principles of the invention are contemplated.
[0015]
In a broad aspect, the invention provides a method for obtaining a hematopoietic cell population containing quiescent cells utilizing a polypeptide containing a binding site for integrins on a cell.
[0016]
The hematopoietic cell population can be obtained from any suitable source. For example, autologous or allogeneic bone marrow or autologous or allogeneic peripheral blood cells are potential sources of cell populations for human therapy or research. Bone marrow cells can be obtained, for example, from the iliac crest, tibia, femur, sternum, or another bone cavity. Bone marrow can be harvested and processed by aspiration from bone, as is known in the art. Bone marrow can be obtained from a donor for allogeneic transplantation or from a patient for autologous transplantation. Peripheral blood can also be collected from patients or donors according to standard techniques. In this context, prior to collection, known techniques can be used to recruit stem cells to peripheral blood, including administration of cytokines to the patient or donor.
[0017]
In a hematopoietic cell population, stem cells and progenitor cells may be enriched. For these purposes, it is possible to use known separation techniques. For example, hematopoietic progenitor cells can be separated from common hematopoietic cell populations based on one or more cell surface antigens, such as CD34, CD71 or c-kit receptor, in combination with corresponding antibodies, especially monoclonal antibodies. It is. Such a separation can be performed to obtain a cell population essentially free of mature blood cells.
[0018]
Several separation and enrichment schemes utilizing antibodies against such cell surface antigens are known. These include, for example, affinity chromatography, magnetic-based separations (eg, using antibody-coated magnetic beads), cytotoxins, flow cytometry, and the like. The practice of such methods to obtain a cell population enriched in hematopoietic progenitor and stem cells is well within the skill of the art.
[0019]
The selected hematopoietic cell culture is contacted with a polypeptide having an integrin binding site, preferably a VLA-4 binding site and / or a VLA-5 binding site. In this regard, the VLA-4 and VLA-5 antigens are known and are discussed, for example, in US Pat. No. 5,583,203, issued Dec. 10, 1996. Polypeptides having VLA-4 and VLA-5 binding sites are also known and include, for example, fibronectin containing both VLA-4 and VLA-5 binding sites, and vascular endothelium having VLA-4 binding sites Cell adhesion molecules (VECAM) are included.
[0020]
Fragments of fibronectin or other polypeptides for use in the present invention may be of natural or synthetic origin and include naturally occurring materials, for example, as described previously in (71) (72) (73). Can be prepared substantially purely. In this context, reference herein to substantially pure fibronectin or fibronectin fragments is intended to mean that they are essentially free of other proteins that naturally exist with fibronectin. . Substantially pure fibronectin or fibronectin fragments for use in the present invention can also be produced recombinantly, for example, as generally described in (74) (75) (76). . In particular, with reference to SEQ ID NO: 3, the amino acid sequence of mature human fibronectin, and FIG. 6, H-271 (residue Ala of the heparin binding domain)¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁶⁰), C274 (Pro¹²⁴³-Asp¹⁵¹⁶-VLA-4 site-containing cell binding domain), H-296 (Ala¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁸⁵And having a heparin binding domain and a VLA-4 binding site), CH-271 (Pro¹²⁴³-Asp¹⁵¹⁶And Ala¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁶⁰-VLA-5 containing cell binding domain plus heparin binding site), CH-296 (Ala¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁸⁵And Asp¹⁹⁶¹-Thr¹⁹⁸⁵In addition to the -VLA-5 site-containing cell binding domain, including the heparin binding domain, the VLA-4 site) and C-CS1 (Pro¹²⁴³-Asp¹⁵¹⁶And Asp¹⁹⁶¹-Thr¹⁹⁸⁵Recombinant fragments identified as VLA-4 binding sites in addition to the cell binding domain) are generally prepared as described in these patents, and used alone or in other forms of the invention. It can be used in combination with a polypeptide. These fragments, or the fragments from which they can be obtained on a daily basis, are also described in FERM @ P-10721 (H-296), FERM @ BP-2799 (H-mediated via methionine), as also described in (74). C-277 linked to H.271), FERM @ BP-2800 (C-277 linked to H-296 via methionine), and FERM @ BP-2264 (H-271), It can be obtained by culturing Escherichia coli (E. coli), which is deposited at (The \ Fermentation \ Research \ Institute \ of the \ Agency \ Industrial \ Science \ and \ Technology). In addition, useful information regarding the fibronectin fragments available herein or regarding the starting materials for such fragments is further reported on the above-described recombinant fragments (77); and reports the structure of the human fibronectin gene (78). And reports on the heparin-II binding domain of human fibronectin (79). Using a fibronectin fragment containing the CS-1 cell adhesion domain (VLA-4), for example, in a 30 or 35 kd fragment (30/35 ° FN) and in a recombinant fragment as reported in the Examples below. It is possible to do. One of skill in the art will appreciate that both cell binding activity is due to the natural amino acid sequences of functional VLA-4 binding and VLA-5 binding fibronectin domains, as well as amino acid sequences that differ from the native sequences but are still sufficiently similar and exhibit cell binding activity. Will be able to provide. These similar amino acid sequences will show substantial sequence homology to the corresponding native sequence, and amino acids have been deleted, substituted and / or modified, but still desirable It may include those that provide amino acid sequences with cell binding properties.
[0021]
The polypeptides of the present invention may be relatively short or long as long as they contain the necessary cell binding site (s) and activity. Typically, a polypeptide having at least about 10 or 20 amino acid residues will be used, and will generally have at least about 100 such residues up to about a thousand or more residues.
[0022]
Related biotechnology techniques have advanced to the situation where amino acid deletions, substitutions, additions or other modifications in the functional domain of interest can be made routinely. The resulting amino acid sequence can then be routinely screened for a desired cell binding activity. In view of the comments provided herein, these binding assays will represent only routine experimentation to one of ordinary skill in the art.
[0023]
The natural VLA-4 binding site of fibronectin is formed by the first approximately 25 amino acids of the alternatively spliced IIICS region (Asp¹⁹⁶¹-Thr¹⁹⁸⁵). The amino acid sequence of the native human fibronectin VLA-4 binding site is therefore (SEQ ID NO: 1):
Asp \ Glu \ Leu \ Pro \ Gln \ Leu \ Val \ Thr \ Leu \ Pro \ His \ Pro \ Asn \ Leu \ His \ Gly \ Pro \ Glu \ Ile \ Leu \ Asp \ Val \ Pro \ Ser \ Thr
It is.
[0024]
In a preferred mode for carrying out the invention, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least about 70% identity, more preferably at least about 80% identity, and most preferably at least about A VLA-4 binding polypeptide having an amino acid sequence with 90% identity will be used. In this context, the percentages herein are percentages as determined by comparing sequence information using the Advanced BLAST computer program, version 2.0.8, available from the National Institutes of Health. It is intended to mean identity. The BLAST program is based on the parallel method of (80) and is as discussed in (81), (82) and (83). Briefly, the BLAST program defines identity as the number of identical parallel symbols (ie, nucleotides or amino acids) divided by the total number of shorter symbols in two sequences. Using the program, it is possible to determine percent identity over the entire length of the proteins being compared. Preferred default parameters for the BLAST program, blastp include: (1) a description of 500; (2) an expected value of 10; (3) a Karlin-Altschul parameter λ = 0.270; (4) a Karlin-Altshul parameter K = 0. 0470; (5) Gap penalty: presence 11, extension 1; (6) H value = 4.94e^-324(6) include scores for matched and mismatched amino acids found in the BLOSUM62 matrix as described in (84) (85) (86). The program also uses an SEG filter for the mask-off portion of the query sequence, as determined by the SEG program of (87).
[0025]
The amino acid sequence of the human fibronectin VLA-5 binding site is (SEQ ID NO: 2):
Arg Gly Asp Ser
It is.
[0026]
Such sequences can be incorporated into polypeptides, for example, by including all or part of the VLA-5 containing cell binding domain of human fibronectin, or a similar functional polypeptide. Other polypeptides having an amino acid sequence that binds similarly to VLA-5, such as VLA-4 above, can also be used in the present invention. In particular, it has been found that the amino acid Arg @ Gly @ Asp (RGD) is required for cell binding, but the amino acid Ser may be substituted with other amino acids in the polypeptide and still have cell binding activity. Hold. Thus, a polypeptide having the amino acid sequence Arg-Gly-Asp-X can be used, where X is serine or another amino acid that provides cell binding activity to the sequence.
[0027]
When using polypeptides having more than one type of cell binding site, adhesion of cells to cell binding sites other than those desired is to mask or block these binding sites or corresponding cell surface receptors appropriately. By doing so, it is possible to inhibit. For example, cells can be cultured in the presence of antibodies to other receptors to inhibit or eliminate the interaction of such receptors with their corresponding binding sites. Thus, for example, when using a polypeptide having both VLA-4 and VLA-5 binding sites, an antibody against VLA-5 can be used to promote VLA-4 interaction and the superiority of biological consequences. It is. Such an antibody may be, for example, a monoclonal antibody. Corresponding masking of the binding site on the polypeptide can be achieved using the receptor protein or a fragment thereof.
[0028]
Using a culture of hematopoietic cells in the presence of a polypeptide as described herein, it is possible to obtain a large population of adherent quiescent cells in culture. Preferably, such cultures provide an increased percentage or number of quiescent cells when compared to that provided by the corresponding culture without the presence of the polypeptide. More preferably, the culturing will be such that the percentage of quiescent adherent cells increases over the culture period, or increases, for example, by at least 3%, and more desirably by at least about 5%. . The resulting cell culture can then be used for transplantation in patients in need of hematopoietic reconstitution to treat induced (eg, toxin or irradiation in cancer therapy), congenital or genetic disorders or abnormalities. It can be used.
[0029]
In addition to maintaining large populations of quiescent cells, the preferred culture conditions of the present invention also provide for expansion of the cell population over the culture period, especially in situations where patient transplantation with the resulting cell population is desired. Will do. For example, a cell number expansion of at least 10-fold, more preferably at least 20-fold, and most preferably at least about 30-fold is preferred.
[0030]
Such cell cultures and culture methods can also be used in diagnostic assays, in screening pharmaceutical agents for their effects on hematopoietic cells, and in studying proliferation and / or differentiation of hematopoietic cells.
[0031]
The basal medium will be suitable for culturing hematopoietic cells. The medium may be, for example, a serum-free or serum-filled medium. Many such media are generally known, and their selection and use in the present invention is within the purview of those skilled in the art. Cell culture can also be performed in the presence of other agents known to cause cell growth or development, including, for example, stem cell factor (SCF), interleukins (eg, IL-6 , IL3), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), and the like.
[0032]
The cells of the cell cultures of the invention can be collected and loaded into a device suitable for delivering the cells to a subject for administration to a mammal for transplantation. For example, such a device may be a syringe or other container from which cells can be transferred to a patient.
[0033]
Cells cultivated according to the present invention can also be genetically modified by known transduction techniques, including the use of suitable vectors, such as, for example, viral vectors. In this context, the heparin II binding domain of fibronectin (Ala¹⁶⁹⁰-Thr¹⁹⁶⁰And VLA-4 cell binding domains or polypeptides having similar sequences are known to enhance transduction with viral vectors. See, for example, (88), (89) and (90). Thus, the methods of the present invention can be used to combine cells with fibronectin or other polypeptides containing a VLA-4 binding site in combination with transduction with a recombinant viral vector on the same or similar polypeptide. It is possible to include a culture period for expansion. Genetic modifications of the cell can be made to cause the cell to express a protein that is missing, or otherwise defective or defective in the subject to be treated.
[0034]
For example, a recombinant viral vector can contain exogenous DNA and can be non-pathogenic, ie, replication defective. These vectors transfer efficiently, and accurately and stably integrate exogenous DNA into the cellular DNA of animal cells, particularly host cells such as mammalian cells. For example, a nucleotide sequence comprising a stretch of bases from the coding sequence of a gene of interest can be incorporated into a recombinant retroviral vector under the control of a suitable promoter driving the gene, typically an exogenous promoter. It is. In this context, exogenous DNA can include DNA that has been produced naturally or artificially, and can be derived from a moiety derived from a heterologous source. Can be a naturally occurring or chemically synthesized molecule, and the moieties are linked by linking or other means known in the art.
[0035]
The exogenous DNA incorporated into the virus may be any target DNA to be introduced into cells. For example, exogenous DNA may be a protein, such as adenosine deaminase (ADA), or an antisense RNA, ribozyme or pseudoprimer (see (91)), an intracellular antibody (eg (92) )), Growth factors, or the like.
[0036]
As indicated, the nucleotide sequence to be introduced will be under the control of the promoter, and will therefore generally be downstream of the promoter. In other words, the promoter sequence will generally be upstream (ie, at the 5 'end) of the coding sequence. In this context, it is known that there may or may not be other control elements (eg, enhancer sequences) that achieve transcription of the exogenous coding sequence, cooperate with the promoter and transcription initiation codon. The phrase "under control" contemplates the presence of such other elements, as required to achieve transcription of the introduced gene. Also, the recombinant DNA will preferably include a termination sequence downstream of the introduced coding sequence.
[0037]
Retroviral vectors containing exogenous DNA that provide a selectable marker or other selectable factor can be used. For example, a vector can contain one or more exogenous genes that provide resistance to a variety of selection agents, including antibiotics such as neomycin.
[0038]
The viral vector used in the present invention preferably exhibits the ability to bind to the amino acid sequence of the heparin-II binding domain of fibronectin, including human fibronectin. In this context, the ability of the virus to bind to the amino acid sequence of the heparin-II binding domain, and thus work effectively in aspects of the invention, can be easily ascertained using routine methods. . Generally speaking, these assays measure the extent to which virus particles bind to the immobilized polypeptide in a manner that resists washing from the immobilized polypeptide matrix containing the heparin-II binding domain. Briefly, for example, the virus-containing supernatant can be incubated in wells containing the immobilized polypeptide containing the heparin-II binding domain of fibronectin. The wells are then thoroughly washed with saline buffer, after which the viral target cells are incubated in the wells to determine the level of infectious activity remaining in the wells. The reduction in infectious activity or titer relative to the original viral supernatant is assessed and compared to that of a similar control experiment (eg, using wells coated with BSA). A significantly higher titer remaining in the heparin-II domain containing wells when compared to control wells indicates that the virus of interest is suitable for use in aspects of the invention. To facilitate this screening method, the viral vector may contain a selectable marker gene, as discussed above.
[0039]
Using conventional methods, cell cultures produced according to the present invention can be used immediately, or frozen in the presence of a suitable cryoprotectant, if necessary, and later thawed for use It is possible.
[0040]
【Example】
The following specific examples are provided to facilitate a further understanding and recognition of the present invention. It will be understood that these examples are illustrative of the invention and do not limit the invention.
[0041]
General information
Recombinant fibronectin
The FN fragment, FN # 30/35, was prepared by chymotrypsin digestion of human plasma FN and purified by gelatin-Sepharose affinity chromatography (44) (45). FN @ 30/35 is 75 pmol / cm²Used at a concentration of Recombinant CH-296 (Takara Shuzo, Otsu, Japan) was obtained as a dry powder. This was dissolved in sterile distilled water and further diluted with phosphate buffered saline (PBS; Gibco, Grand Island, NY). 96 and 6 well non-tissue culture treated plates were prepared at 30-100 nmol / cm²(29). Plates were coated by adding CH-296 or FN @ 30/35 to the wells in a volume of 50 [mu] l / well for 96 well plates and 1 ml / well for 6 well plates and incubated at room temperature for approximately 4 hours. . The plate is then aspirated and 100 μl or 2 ml (respectively) of 2% bovine serum albumin in PBS (BSA; fraction V, protease free; Boehringer @ Mannheim, Indianapolis, IN) for non-specific binding. For 30 minutes. Thereafter, the BSA was aspirated and the wells were washed with medium before adding cells. Control wells were continuously coated with 2% BSA only.
[0042]
Example 1
Isolation of primitive hematopoietic progenitor cells
Female B₆D₂F₁(C57Bl / 6J @ X @ DBA / 2) or C57B1 / 6J mice were purchased from Jackson @ Animal @ Laboratories (Bar Harbor, Me.) And maintained in a laminar flow housing at our facility. The Laboratory Animal Resources Committee of the Indiana University School of Medicine (The Laboratory Animal Resource Committee), Indiana University University School of Medicine, approved all animal treatments. Bone marrow cells (BMC)₂Following anesthesia via inhalation, the femur, tibia and iliac crest were excised and harvested from the mice by grinding them with a mortar and pestle. The ground bone was washed repeatedly in PBS-0.1% BSA, and the resulting cell suspension was filtered on a 40 μm nylon mesh cell strainer (Falcon, Becton @ Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Low-density bone marrow cells (<1.083 g / cm3) were isolated by discontinuous density gradient separation using Histopaque-1083 (Sigma, Diagnostics, Inc., St. Louis, MO). Cells expressing the mature cell lineage antigen were depleted by immunomagnetic selection using the MACS line (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Antibody, anti-B220 (CD45R; clone RA3-6B2), anti-CD4 (L3 / T4; clone RM4-5), anti-CD8a (Ly-2; clone 53-6.7), anti-Gr-1 (Ly-6G; Clone RB6-8C5) and anti-Mac-1 (CD11b; α_mChains (all BD @ PharMingen, San Diego, CA) were pre-titered with whole bone marrow cells or spleen cells and used at optimal dilution as a cocktail for MACS separation. Briefly, low density BMC was centrifuged (1350 rpm, 5 minutes, 4 ° C) and the supernatant was decanted. 5 × 10 5 antibody cocktail as described above⁶50 microliters were added per cell, and the antibody: cell suspension was incubated on ice for 30 minutes. The cells are then washed in PBS (without serum) and goat anti-rat IgG microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) plus 10 μl beads + 90 μl PBS / 10.⁷The cells were incubated on ice for 15 minutes with regular shaking. Thereafter, the cell-bead mixture was washed and 1 ml PBS-5 mM EDTA-1% BSA / 2 × 10⁸Resuspended in cells. Thereafter, 1 ml of the cell suspension was applied to a column (C column, maximum⁸Cells), poured into a mesh and left for 5 minutes to magnetize. Non-magnetic fractions (mature cell lineage antigen-negative cells; Lin-fraction) were collected by eluting the cells through a 22G needle with 24 ml {PBS-5 mM} EDTA-1%} BSA solution. Thereafter, the cells were washed in PBS-0.1%@BSA.
[0043]
Subsequently, Lin- cells were sorted for either Sca-1 + cells (Lin-Sca +) or Sca-1 + c-kit + (Lin-Sca + Kit +) cells. Cells are anti-Sca-1-PE (Ly6A / E; clone E13-161.7), alone or with a FITC-conjugated antibody (CD117; clone 2B8) directed against the c-kit receptor. (Both from BD @ PharMingen, San Diego, Calif .; 10 .mu.l of each antibody in 100 .mu.l @ PBS-0.1% @ BSA / 25.times.10.sup.3).⁶(Diluted in cells) and incubated at 4 ° C for 30 minutes in the dark. They were then washed in PBS-0.1% BSA and kept on ice before sorting. Cells were sorted using a FACStar + Plus cell sorter (Becton @ Dickinson, San Jose, Calif.) Equipped with a 488 nm laser (Ion @ Laser @ Technologies; Salt Lake City, Utah) driven at 40 mW power. Unisolated bone marrow cells were used to select blast light scattering regions previously shown to contain most hematopoietic precursors (46). Then, within this blast cell region, Lin-cells are sorted to cells that are positive for the Sca-1 antigen; or, using the linear sorting region, both the Sca-1 antigen and also the c-kit receptor. Any expressing cells (approximately 55% of the total Lin-Sca + population; purity> 90%) were selected. Sorting cells are kept cool, sorted at a rate of approximately 4,000 cells / second, and sorted directly into 96-well plates at 30 cells / well using an automated cell deposition apparatus (ACDU). Or collected in 8 ml {PBS-0.1%} BSA. The cells were then centrifuged (1350 rpm, 5 minutes, 4 ° C.), the supernatant was decanted, the cell pellet was resuspended in 300 μl {PBS-0.1%} BSA, and counted and trypan blue (Sigma, MO). Viability determination was performed using St. Louis, Oreg.
[0044]
Example 2
In vitro culture of selected cells
Sorted cells were 96 wells (30 cells / well) or 6 wells (10,000 or 5 × 10 5) coated with CH-296, FN 30/35 or BSA as described above.⁴(Cells / well) in the wells of the plate. Cells were 1% detoxified BSA (Stem @ Cell @ Technologies, Vancouver, Canada), 2% penicillin / streptomycin (Gibco @ BRL, Life @ Technologies, Rockville, MD), 1% glutamine (Gibco @ BRL, Life @ Technol, Maryland). Bill), and recombinant cytokines: rat stem cell factor (rrSCF; 100 ng / ml; Amgen @ Inc, Thousand Oaks, CA), human megakaryocyte growth and differentiation factor (rhMGDF; 50 ng / ml; Amgen @ Inc, Thousand Oaks, CA), Human Interleukin 6 (rhIL-6; 50 u / ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ) &Quot; Serum-free &quot; medium (X-vivo \ 15 serum-free medium, BioWhittaker, Walker, MD) containing and human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF; 5 ng / ml; Amgen @ Inc, Thousand Oaks, CA). Or "serum-replete" medium (10% bovine serum (Hyclone, Logan, UT) and cytokines rmIL-3 (1 ng / ml; PeproTech, Rocky Hill, NJ) and rrSCF (20 ng / ml). , 200 μl and 2 ml (respectively). Cells were incubated at 37 ° C. for a period of 4 to 144 hours (6 days). Cells in 96-well plates were counted in situ using an inverted microscope. Non-adherent and adherent fractions were collected separately from 6-well plates. The wells were gently rinsed three times with a medium containing the non-adherent fraction using a 2 ml pipette before collecting the fractions. Thereafter, 1 ml of cell dissociation buffer (Gibco @ BRL, Life @ Technologies, Rockville, MD) was added to the wells and the adherent cells were incubated at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the adherent cells were harvested by diluting the cell dissociation buffer with 1 ml PBS and pipetting vigorously. Wells were rinsed with PBS, after which they were visually inspected using an inverted microscope to ensure that all adherent cells had been collected. Thereafter, the cells were centrifuged (1350 rpm, 4 ° C., 5 minutes), resuspended and counted.
[0045]
Example 3
Functional analysis
3.1Long-term reconstitution assay
WBB6F1 / Kit^W/ Kit^W-V(W / W^vHosts) and wild-type C57B1 / 6J mice (donors) were purchased from Jackson Animal Laboratories (Bar Harbor, Me.) And maintained at our facility in laminar flow housing. Lin-Sca-1 + cells were sorted from donor C57B1 / 6J mice as described above and 5 × 10 5 on plates coated with FN３５30 / 35 or BSA in “serum-filled” medium.⁴Incubated with cells / well for 6 days. At this point, all wells are harvested and a dilution of these cells (1%) in 0.5 ml Hanks' balanced salt solution containing 0.1% (v / v) 1M Hepes and 0.1% BSA. / 2, 1/8, 1/24 wells) by intravenous injection via the lateral tail vein to recipient W / W^VImplanted in mice. Animals were initially analyzed at 5 weeks post-transplant and at monthly intervals up to 7 months post-transplant. At the completion of the experiment, animals were sacrificed and tissues were isolated for DNA extraction. Individually marked mice were bled via the tail vein into Microtainer tubes (containing EDTA; Becton @ Dickinson, San Jose, CA). Analysis of donor-positive peripheral blood cells was performed by cellulose acetate electrophoresis (47) to quantify the increase in donor hemoglobin. Total hemoglobin (Hbb^sMajor and trace hemoglobin, Hbb in addition to^d) (Hbb)^s) Or diffuse hemoglobin (Hbb)^d) Was measured using a densitometer. Southern blot analysis confirmed transplantation of donor-derived lymphocytes and myeloid cells in bone marrow, spleen and thymus (data not shown). The C57B1 / 6J donor was homozygous for single hemoglobin (Hbb^s/ Hbb^s) And W / W^VRecipients were heterozygous for single / spread hemoglobin (50% @Hbb^s/ 50% @Hbb^d) (48).
[0046]
3.2In vitro HPP-CFC assay
Lin-Sca + Kit + cells (purity> 90%) were transferred to donor B₂D₆F₁Mice were selected and incubated for 6 days at 10,000 cells / well on CH-296 coated plates in "serum free" medium. High and low proliferative potential colony forming cells (HPP-CFC and LPP-CFC) were used to reduce harvested cells in double-layer nutrient agar culture systems as previously described (49) (50). Assayed by plating at a density (300 cells / plate). Recombinant cytokines, murine colony stimulating factor-1 (rmCSF-1; 1600 units / plate), murine interleukin 3 (rmIL-3; 200 units / plate) (both Genetics @ Institute, Cambridge, Mass.) And human interleukin 1α (RhIL-1α; 1000 u / plate; Genzyme, Boston, Mass.).
[0047]
3.3Cell death analysis
B₂D₆F₁Lin-Sca + Kit + cells selected from mice were incubated at 10,000 cells / well for up to 6 days on CH-296-coated plates in "serum free" medium. Once harvested and counted, cells are washed in PBS, pelleted by centrifugation (1350 rpm, 4 ° C., 5 minutes), and 4 μl Annexin V-FITC (BD @ Pharmingen, San Diego, Calif.) And 5 μg iodide 100 μl Annexin V binding buffer (10 mM @ Hepes / NaOH, pH 7.4, 140 mM @ NaCl, 2.5 mM @ CaCl) containing propidium (PI, Calbiochem, La Jolla, CA)₂). After incubating the cells for 20 minutes at room temperature in the dark, an additional 200 μl of Annexin V binding buffer was added before analysis using a FACScan flow cytometer (Becton @ Dickinson, San Jose, Calif.). Cell death in culture was determined by (i) the dying cell fraction in the file [Annexin V + PI + events (excluding small debris)], and (ii) the percentage of early apoptotic cells in the file [Annexin V + PI-total cells]. Was determined by measuring
[0048]
3.4Cell cycle analysis
B₂D₆F₁Lin-Sca + Kit + cells were incubated for 36 hours or 6 days at 10,000 cells / well on CH-296 coated plates in “serum free” medium. Prior to harvesting, cells were pulse labeled with 10 μM bromodeoxyuridine (BrdU) for 1 hour at 37 ° C. Harvested cells were fixed in 0.5 ml of 0.5% paraformaldehyde (Fisher @ Scientific, Fairlawn, NJ; pH 7.4, in PBS) for 5 minutes on ice. Thereafter, cells were stored overnight at 4 ° C. before analysis.
[0049]
The fixed cells were removed to room temperature and then centrifuged at 1,350 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and the cell pellet was loosened by gentle vortexing. 3M HCl containing 0.5% @ Tween-20 (0.5 ml, freshly made) was added and the cells were incubated at 37 ° C for 30 minutes. After the incubation, the cells are centrifuged, the supernatant is discarded and the cells are washed with 0.5 ml of 0.1 M Na.₂B₄O₇And re-centrifuged. Thereafter, the cells were washed in 1 ml @ PBS and the supernatant was decanted before antibody staining. Cells were incubated with 10 μl FITC-conjugated anti-BrdU antibody (Boehringer @ Mannheim, Indianapolis, IN) diluted in 40 μl 1% PBS containing 1% Tween-20 at 37 ° C for 30 minutes in the dark. After incubation with the antibody, cells were washed in PBS and resuspended in a 5 μg / ml @PI solution before analysis on a FACScan.
[0050]
3.5Statistical analysis
Paired Student's T test was performed using GraphPad @ InStat, and results were considered different if P <0.05. The results in Table 1 were compared using the Mann-Whitney test.
[0051]
Example results
Preferential survival and transplantation of transplantable stem cells after adherence to FN 30/35
To examine the effect of integrin-FN matrix interaction on the ability of HSCs to transplant and contribute to long-term blood cell production post-transplantation, WBB6F1 / Kit^W/ Kit^W-V, Hbb^d/ Hbb^s5x10 before transplantation to recipient⁴C57B1 / 6J Hbb^s/ Hbb^sLin-Sca + cells were cultured for 6 days on chymotrypsin fragment of FN (FN 30/35, containing heparin binding domain and VLA-4 integrin binding site) or BSA in “serum-filled” medium. Analysis of the contribution of transplanted cells to long-term blood cell production in recipients was determined monthly by hemoglobin electrophoresis of peripheral blood. At 6 months, 100% of the mice showed complete transplantation of donor cells after transplantation of ウ ェ ル wells / mouse from both FN 30/35 and BSA-coated plates (data not shown). Presentation). In animals implanted with 1/24 wells / mouse, no donor graft was seen. By comparison, after transplantation of 1/8 {FN} 30/35 wells / mouse, all mice showed either complete (FIG. 1; lanes 9, 10) or partially reconstituted (FIG. 1; lanes 7, 8). However, none of the mice received cells from BSA-coated wells implanted at this same dilution (Figure 1; lanes 3-6). When the transplants of all animals were analyzed, the percentage of single hemoglobin (corresponding to a donor transplant) was not different from the untransplanted control (P> 0.05, Table 1). In contrast, in mice transplanted with cells cultured on FN 細胞 30/35, the percentage of single hemoglobin was significantly higher (P <0.05) than in mice transplanted with cells cultured on BSA. . Thus, this data demonstrates the preferential survival and / or engraftment of long-term reconstituted cells in cultures where there is adhesion to FN.
[0052]
Culture of Lin-Sca + Kit + cells on CH-296
Interestingly, however, this data did not predict the results obtained by co-culture experiments using the HPP-CFC assay as a functional representation of primitive hematopoietic clonogenic cells. In these studies, Lin-Sca + cells were further purified with respect to c-kit + cells (Lin-Sca + Kit +) to increase the purity of cells reported to contain long-term hematopoietic transplant cells. In addition, numerous reports indicate that adhesion of HSCs to the recombinant FN peptide, CH296, which contains a binding site for both VLA-4 and VLA-5 integrins in addition to the heparin binding domain, indicates that HSCs bind to the gene for implantable HSCs. It has been demonstrated to improve transfection efficiency (34) (42) (43), and we have previously shown that reconstituted cells adhere to this fragment at similar levels compared to FNＦ30 / 35. This fragment was used because it has been demonstrated that After culturing 10,000 Sca + Kit + cells for 6 days in wells coated with CH-296 or BSA, the functional potential of the resulting cells was analyzed using the HPP-CFC assay. No significant differences were observed in the frequency or size of the colonies present in the CH-296 culture relative to the BSA culture, regardless of the combination of cytokines used to stimulate colony growth (HPP- CFC vs. LPP-CFC) (FIG. 2). The contradiction between the results of this assay and those that measure cell transplantability is that primitive cells that are capable of long-term hematopoietic reconstitution, but have poor cloning efficiency in the HPP-CFC assay, May be the result of FN adhesion maintaining the "graft phenotype" lost after cell culture in suspension in HSCs. Yes (parameter measured in in vivo assay but not measured in in vitro assay).
[0053]
To distinguish these possibilities, the events following the adhesion of purified HSC cells to CH-296 were next examined in more detail. In particular, the effects of FN culture on cell death, which may lead to preferential survival of HSCs on FN; and cell cycle (51) have been suggested to be associated with changes in the transplantation phenotype of primitive cells. ) The effects on (52), (53) and (54) were examined. To determine the extent to which Lin-Sca + Kit + cells adhere to FN, the sorted cells were cultured in CH-296 or BSA-coated plates for 4, 18 and 144 hours (6 days). Thereafter, the non-adherent and adherent fractions of the wells were separately collected and counted. Although 51.0 ± 14.0% of these cells adhered to CH-296 after 4 hours in culture, we have determined that this interaction is specifically via VLA-4 and VLA-5 integrins. Mediation has been shown previously using blocking antibodies (29). Interestingly, by 18 hours, this fraction had dropped to 33.8 ± 7.0%, suggesting that extended culture on FN may reduce adhesion. However, this decline did not continue and adhesion was maintained even after 6 days of culture (27.4 ± 7.5% adherent cells). Non-specific adhesion to BSA in these cultures remained less than 8% at each time point studied.
[0054]
Cell counts obtained from these cultures demonstrated that in both CH-296 and BSA cultures, the total number of cells decreased over the first 18 hours. However, a significantly greater decrease in cell number was observed after culturing on CH-296 (FIG. 3A), and adhesion of Lin-Sca + Kit + cells to this fragment was active in a subset of these cells. Is suggested. During the entire culture period, the cell number was reduced in the wells coated with CH-296, and even at 6 days, the wells coated with CH-296 had significantly fewer cells (FIG. 3B). When the cells were counted in a 96-well flat bottom plate in an in situ using an inverted microscope, a decrease in the number of cells was still observed in the wells coated with CH-296 to BSA. It was not the result of a medium loss. In the latter experiment, 30 ° Lin-Sca + Kit + cells / well were deposited using a flow cytometer equipped with an automated cell deposition device, cultured in “serum free” medium for 24 hours, and then counted. On average, 54.5 ± 9.8% of the input cells were found in the CH-296 coated wells compared to 67.6 ± 8.5% of the input cells in the BSA coated wells. (N = 5, p = 0.116).
[0055]
To directly examine this loss of cells cultured on CH-296, a study was performed using flow cytometric analysis of Annexin V and propidium iodide (PI) staining. At 18 hours, a higher percentage of the total number of dying cells [Annexin V + PI +] was observed in the FN adherent fraction versus the non-adherent fraction (FIG. 4A). Furthermore, at this same time point, there was an increased proportion of early apoptotic cells [Annexin V + PI-total cells] in the FN adherent fraction (FIG. 4B), but this was not statistically significant. Thus, these results indicate that by 18 hours in culture, many cells have passed the early stages of the apoptotic pathway, and further demonstrate increased death of cells attached to FN. Even at 144 hours, significant differences were observed in the levels of both dying and early apoptotic cells in the FN-adhered fraction versus the non-adhered fraction (Figures 4A and 4B), indicating that adhesion to FN was Was again suggested to cause death of a subset of these cells. Interestingly, however, no significant differences were observed in the total level of cell death in the whole CH296 culture versus the BSA culture (data not shown).
[0056]
Cell cycle analysis of cells adhered to CH-296
It has been hypothesized that cell cycle conditions may affect HSC transplantation (51) (52) (53) (54). Therefore, cycle analysis of cells surviving in CH-296 and BSA cultures was performed by measuring BrdU incorporation after 1 hour of BrdU pulse labeling. After 36 hours in culture, a similar proportion of cells in BSA culture, as well as FN adherent and non-adherent cells, were in the cycle (FIG. 5A). By comparison, analysis at day 6 demonstrated that significantly more cells in the FN adherent fraction were quiescent compared to the non-adherent fraction (34.0 ± 0.5% vs. 58, respectively). 0.3 ± 4.1% G0 / G1 phase) (FIG. 5B). As seen in the analysis of cell death, no significant differences were observed between the proportions of cells in the cycle in total CH-296 cultures versus BSA cultures (data not shown). Thus, these results demonstrate that at day 6 of culture, cells that survived and adhered to CH-296 were quiescent compared to cells in the non-adherent fraction. The phenotype correlates with enhanced HSC function in vivo (46) (55) (56).
[0057]
Example considerations
Recent studies have demonstrated that ligation of cell adhesion receptors by FN initiates intracellular signaling (15) (16) (17) (18), but a diverse array of these signaling events has been demonstrated. Effects, including both stimulatory and inhibitory effects on cell growth, death, migration and differentiation of hematopoietic cells, suggest that adhesion-mediated regulation of hematopoietic cell function may be complex. The different responses that have been demonstrated can be explained in part by the use of cell lines, transformed cells, lineage-committed cells, or heterogeneous primary cell populations in these studies. (16) (30) (40) (44) (57) (58) (59) (60). In addition, the effects elicited by adhesion to FN may be different at developmental stages (24) (25) (28) or at the source (61) (62) of the precursor cell population being studied. As cross-talk and cooperation between different adhesion and cytokine-mediated signaling pathways has been demonstrated, cellular responses are also clearly associated with specific combinations of involved adhesive and mitogenic interactions. And therefore related to differences in culture conditions (11) (27) (29) (31) (36) (58) (59) (61) (63) (64) (65).
[0058]
In the studies described herein, we examined the biological consequences of integrin-FN matrix interaction on hematopoietic stem cells and progenitor cells. Studies of functionally defined HSCs examined the survival and maintenance of transplantable cells after culturing on FN # 30/35 for 6 days. W / W^VAnalysis of the contribution of cultured cells to blood cell production 6 months after transplantation into recipients is consistent with gene transfer studies on both FN $ 30/35 and CH-296 (34) (41) (42). Thus, it was demonstrated that survival of reconstituted stem cells was observed in cultures where there was adhesion to FN. Interestingly, however, analysis using the HPP-CFC assay, an in vitro surrogate assay for primitive hematopoietic stem cells and progenitor cells, showed that after culturing on CH-296 against BSA, There were no significant differences between frequency and growth potential (as assayed by colony size).
[0059]
The discrepancies between the results obtained from these two different assay systems, noted in previous studies (66) (67), were that (i) long-term hematopoietic reconstitution was possible, whereas HPP-CFC culture Phenotype, which is not measured by the preferential survival of primitive cells on FN or (ii) not measured in in vitro clonogenic assays, and which is lost to these cells after culture in suspension. Certain "transplant phenotypes" can be explained by being retained in HSCs after culturing on FN. To examine these possibilities, we examine the initial events following the attachment of cells to FN, where the adhesion itself has an effect on cell death or preferential survival of primitive reconstituted HSCs, or transplantation expression of cells. It was determined whether it had an effect on the cell cycle that could affect the type. Several experimental parameters are important in these studies. Murine HSCs have been suggested to divide in in vitro culture within about 30-40 hours (68), so the initial time point examined was earlier than 40 hours. To examine the response of cells capable of long-term transplantation, we utilized a purified population of HSCs (Lin-Sca + Kit + cells) in these studies. In addition, we also used the recombinant FN peptide CH-296 to more thoroughly explore its potential role in the maintenance and transduction of implantable HSCs. The mechanism of increased transduction of HSCs on this FN fragment appears to involve co-localization of virions and target cells (42), but earlier compared to culturing cells in suspension, Following the evidence that transduction on CH-296 is associated with preferential maintenance of transplantable HSCs, it has been postulated that a biological component exists for this effect (34). In the studies described herein, cells were reduced in density (（10,000 / 35 mm wells) to optimize the study of precursor cell adhesion to FN while minimizing the effects of cell / cell interactions. Planted in. Cells were cultured in serum-free medium (to avoid variability with serum FN) containing cytokines, SCF, MGDF, IL-6 and G-CSF at optimally defined concentrations. These cytokines (69), referred to as "early" acting cytokines, have been reported for their ability to maintain the survival of primitive HSCs in vitro, and both SCF and MGDF are capable of retaining the FN of hematopoietic cells in culture. (58) (70) with the ability to increase adhesion to
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After 4 hours of incubation, most of the Lin-Sca + Kit + cells adhered to CH-296, but this interaction previously showed that we were mediated through VLA-4 and VLA-5. (29). This adhesion appeared to result in down-regulation of FN receptor function, as fewer adherent cells were observed after 18 hours of incubation on FN compared to 4 hours. However, the level of adhesion observed at 18 hours is maintained throughout the rest of the culture, supporting the hypothesis that integrin receptor expression / avidity is reversibly regulated (30) ( 31) (61) (65) (70). Counting cells from these cultures demonstrated that over the first 18 hours, the total number of cells in both CH-296 and BSA cultures was reduced. However, the reduction in cell number was significantly higher in wells coated with FN, and flow cytometric analysis of Annexin V and PI staining of the cells showed that early apoptosis and late apoptosis in the CH-296 adherent fraction of these cultures. It was established that the ratio of both dying cells was higher. These results also suggest that adhesion of Lin-Sca + Kit + cells to CH-296 may induce death in a subset of these cells. Previous studies have shown cell death after attachment to FN, especially in mature hematopoietic subsets (40) (39) and (Kapur and Williams, manuscript in preparation). Thus, these results, together with the observation that transplantable HSCs are maintained after culturing on FN, indicate that adhesion to FN is due to the selective death of the relatively mature subset in the Lin-Sca + Kit + fraction. And the hypothesis that this results in preferential survival of HSCs. However, this interpretation appears less likely because no significant differences were observed in the frequency of LPP-CFC or HPP-CFC survival in culture on FN versus BSA.
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Alternatively, the results suggest the maintenance of the "transplant" phenotype in cells that adhere to FN. Previous studies have demonstrated that quiescent cells maintain significantly higher transplant potential than cells during the active cycle (52) (53) (54). To test the hypothesis that maintenance of the "transplantable" HSC phenotype in FN-containing cultures is related to the quiescence of these cells, the cell cycle status of FN adherent cells was compared to that of non-adherent cells. . The results indicate that CH-296 adherent and non-adherent cells were in the same cycle at 36 hours, but by day 6, cells that survived and adhered to CH-296 were compared to non-adherent cells. And was shown to be stationary. In the context of in vivo transplantation studies, these results provide a mechanism for the maintenance of reconstructed cells, which was reported when FN was used in gene transfer protocols (34). Thus, according to the studies presented herein and from the gene transfer experiments (34) (41) (42) (43), transplantation of transduced cells after long-term culture in the presence of FN, It is suggested that it may be related to the maintenance or re-entry of adherent cells at G0 / G1. Since integration of the vector sequence requires cell division, these data imply that adhesion to FN maintains cells in G0 / G1 after cell division in vitro.
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In summary, according to the results described herein, the improvement in transplantation observed after 6 days in culture in the presence of FN may be a consequence of HSC survival and quiescence, with cells homing into the bone marrow. And it is suggested to be able to retain the ability to transplant after transplantation.
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Table 1: Densitometer analysis of different hemoglobin bands after electrophoresis
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[Table 1]

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^ATotal concentration = single hemoglobin (Hbb^s) And diffuse hemoglobin (Hbb)^d) Band concentration. The numbers in parentheses indicate the number of animals analyzed.
^BP <0.05 vs 30/35 culture; NS vs BSA culture
^CP <0.05 vs BSA culture
References
The following references, as well as other references cited herein, are indicative of the level of skill in the art, and are each individually incorporated where cited and fully indicated. Each of which is incorporated herein by reference.
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[Table 2]

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While the invention is illustrated and described in detail in the figures and foregoing description, such figures and description are to be considered illustrative and not limiting in nature, and only preferred embodiments are set forth. It is understood that all changes and modifications that have been described and are within the spirit of the invention are desired to be protected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1. Transplantation of cells after 6 days culture on FN # 30/35, assayed by hemoglobin electrophoresis. Hbb^sLin-Sca + cells from homozygous mice (donor, D) were plated at 5 × 10 5 in “serum-filled” medium.⁴Cells were cultured for 6 days in cells / 35 mm FN 30/35 or BSA coated wells. The cells are then harvested and the dilutions of the wells are added to the recipient (R) W / W^v(Hbb^d/ Hbb^s) Transplanted into mice. The results show donor cell transplantation in recipients, as assessed by analysis of hemoglobin type in peripheral blood at 6 months. Lanes: 1 = recipient control; 2 = donor control; 3-6 = BSA, 1/8 well / mouse; 7-10 = FN 30/35, 1/8 well / mouse; Hbb-d: hemoglobin diffusion band; Hbb-s: hemoglobin single band.
FIG. 2: Effect of Lin-Sca + Kit + cell adhesion on HPP-CFC and LPP-CFC survival / proliferation. Lin-Sca + Kit + cells were cultured for 6 days in 10,000 cells / 35 mm @ CH-296 or BSA coated wells in "serum free" medium. Thereafter, cells were harvested and plated at 300 cells / plate in the HPP-CFC assay. The combinations of growth factors used in the colony assay are shown. The results show the average cloning efficiency of cells from 5 experiments (± SEM). No significant differences were observed between the average cloning efficiencies of either HPP-CFC (light hatched) or LPP-CFC (dark hatched) after culture on CH-296 versus BSA (P > 0.05). Open boxes = cells plated in BSA culture; dark boxes = cells plated in CH-296 culture.
FIG. 3. Decrease in cell number after culture of Lin-Sca + Kit + cells on CH-296. Cell number after culturing 10,000 Lin-Sca + Kit + cells on CH-296 or BSA coated wells in "serum free" medium. The results show the number of cells / well (survival) as a percentage of input at each time point (mean ± SEM of 6-11 experiments / time point). Open box = BSA culture; dark box = CH-296 culture. A) 4 hours, 18 hours, 36 hours. B) 144 hours (6 days). The cell number of CH-296 is significantly different from BSA at all time points measured;^*P <0.05;^**P <0.005;^***P <0.0005.
FIG. 4. Death of Lin-Sca + Kit + cells after adhesion to CH-296. Lin-Sca + Kit + cells were cultured in "serum free" medium in 10,000 cells / 35 mm CH-296 or BSA coated wells for up to 144 hours (6 days). At each time point, the non-adherent and adherent fractions of the wells were collected separately, counted, and stained with Annexin V-FITC and PI before flow cytometric analysis. Shown are two gating of the files: A) percentage of dying cells in culture [Annexin V + PI + cells (excluding small debris) in file] and B) percentage of early apoptotic cells [Annexin V + PI-total cells in culture] ]. Results are the mean ± SEM of 3-6 experiments / time point. Open boxes = BSA; hatched boxes = CH-296 non-adherent cells; dark boxes = CH-296 adherent cells.^*P <0.05;^**P <0.01.
FIG. 5: Effect of adhesion to CH-296 on cell cycle status of Lin-Sca + Kit + cells. Lin-Sca + Kit + cells were cultured in 10,000 serum / 35 mm @ CH-296 or BSA coated wells in A "36 and B) 144 hours (6 days) in" serum free "medium. Cells were pulsed with 10 μM @BrdU one hour before harvesting. The non-adherent and adherent fractions of the wells were collected separately and fixed, and stained with anti-BrdU antibody and PI before analyzing the percentage of cells in cycle in the wells by flow cytometry. Results are the mean ± SEM of 3 experiments / time point. Open boxes = BSA; hatched boxes = CH-296 non-adherent cells; dark boxes = CH-296 adherent cells.^*P <0.05.
FIG. 6 is an illustration of the α-chain structure of fibronectin and its association with some recombinant fragments. Fibronectin type I, II and III repeats are shown and type III repeats are numbered 1-14. The three binding sites for cells are of the cell binding domain (CBD), which contains the VLA-5 binding site.cellOf the heparin binding domain (HBD)HeparinAnd the VLA-4 binding site CS1 formed by the first 25 amino acids of the alternative splicing IIICS regionCS1As shown.

Claims (29)

静止造血細胞集団を得るための方法であって、造血細胞の数を拡大するように、該細胞をフィブロネクチンポリペプチドに接着させながら、造血細胞を培養することを含んでなり、前記接着が増加した割合の静止造血細胞を提供する、前記方法。A method for obtaining a population of quiescent hematopoietic cells, comprising culturing hematopoietic cells while adhering the cells to a fibronectin polypeptide so as to expand the number of hematopoietic cells, wherein the adhesion is increased. Such a method, wherein a proportion of quiescent hematopoietic cells is provided. 前記造血細胞で造血幹細胞が濃縮されている、請求項１の方法。2. The method of claim 1, wherein the hematopoietic cells are enriched for hematopoietic stem cells. 前記造血細胞がヒト細胞である、請求項１または２の方法。3. The method of claim 1 or 2, wherein said hematopoietic cells are human cells. 前記フィブロネクチンポリペプチドがヒトフィブロネクチンポリペプチドである、請求項１−３のいずれかの方法。4. The method of any of claims 1-3, wherein said fibronectin polypeptide is a human fibronectin polypeptide. 前記培養が、接着性静止造血細胞の割合を、少なくとも約３％増加させるのに有効である、請求項１−４のいずれかの方法。5. The method of any of claims 1-4, wherein said culturing is effective to increase the percentage of adherent quiescent hematopoietic cells by at least about 3%. 前記培養が少なくとも約３日の期間である、請求項１−５のいずれかの方法。6. The method of any of claims 1-5, wherein said culturing is for a period of at least about 3 days. 前記培養が少なくとも約４日の期間である、請求項１−５のいずれかの方法。6. The method of any of claims 1-5, wherein said culturing is for a period of at least about 4 days. 前記培養が少なくとも約６日の期間である、請求項１−７のいずれかの方法。8. The method of any of claims 1-7, wherein said culturing is for a period of at least about 6 days. フィブロネクチン断片がＶＬＡ−４結合部位を有する、請求項１−８のいずれかの方法。9. The method of any of claims 1-8, wherein the fibronectin fragment has a VLA-4 binding site. フィブロネクチン断片がヘパリン−ＩＩ結合部位もまた有する、請求項１−８のいずれかの方法。9. The method of any of claims 1-8, wherein the fibronectin fragment also has a heparin-II binding site. 静止造血細胞を含有する細胞集団を得るための方法であって、増加した割合の静止造血細胞を提供するように、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドに接着させながら、造血細胞集団を拡大することを含んでなる、前記方法。A method for obtaining a population of cells containing quiescent hematopoietic cells, wherein the population of hematopoietic cells is expanded while adhering to a polypeptide having a VLA-4 binding site to provide an increased percentage of quiescent hematopoietic cells. The above method, comprising: 前記造血細胞集団で造血幹細胞が濃縮されている、請求項１１の方法。12. The method of claim 11, wherein the hematopoietic cell population is enriched for hematopoietic stem cells. 前記造血細胞集団がヒト細胞集団である、請求項１１または１２の方法。13. The method of claim 11 or claim 12, wherein said hematopoietic cell population is a human cell population. 前記ポリペプチドがフィブロネクチンポリペプチドである、請求項１１−１３のいずれかの方法。14. The method of any of claims 11-13, wherein said polypeptide is a fibronectin polypeptide. 前記培養が、集団中の接着性静止造血細胞の割合を、少なくとも約３％増加させるのに有効である、請求項１１−１４のいずれかの方法。15. The method of any of claims 11-14, wherein the culturing is effective to increase the percentage of adherent quiescent hematopoietic cells in the population by at least about 3%. 前記培養が少なくとも約３日の期間である、請求項１１−１５のいずれかの方法。16. The method of any of claims 11-15, wherein said culturing is for a period of at least about 3 days. 前記拡大が、少なくとも約４日の期間、培養することを含んでなる、請求項１１−１５のいずれかの方法。16. The method of any of claims 11-15, wherein said expanding comprises culturing for a period of at least about 4 days. 前記造血細胞集団が腫瘍性造血細胞を含有する、請求項１１−１７のいずれかの方法。18. The method of any of claims 11-17, wherein said population of hematopoietic cells contains neoplastic hematopoietic cells. フィブロネクチン断片がＶＬＡ−４結合部位を有する、請求項１１−１８のいずれかの方法。19. The method of any of claims 11-18, wherein the fibronectin fragment has a VLA-4 binding site. フィブロネクチン断片がＶＬＡ−５結合部位を有する、請求項１１−１８のいずれかの方法。19. The method of any of claims 11-18, wherein the fibronectin fragment has a VLA-5 binding site. 造血細胞の亜集団のアポトーシスを誘導するための方法であって、造血細胞の亜集団のアポトーシスを引き起こす条件下で、ＶＬＡ−４結合部位を有するポリペプチドと細胞を接触させることを含んでなる、前記方法。A method for inducing apoptosis of a subpopulation of hematopoietic cells, comprising contacting a cell with a polypeptide having a VLA-4 binding site under conditions that cause apoptosis of a subpopulation of hematopoietic cells, The method. 前記造血細胞集団がＣＤ３４＋造血細胞集団である、請求項２１の方法。22. The method of claim 21, wherein said hematopoietic cell population is a CD34 + hematopoietic cell population. 前記造血細胞集団がヒト細胞集団である、請求項２１または２２の方法。23. The method of claim 21 or claim 22, wherein said hematopoietic cell population is a human cell population. 前記ポリペプチドがヒトフィブロネクチンポリペプチドである、請求項２１−２３のいずれかの方法。24. The method of any of claims 21-23, wherein said polypeptide is a human fibronectin polypeptide. フィブロネクチン断片がヘパリン−ＩＩ結合部位を有する、請求項２１−２４のいずれかの方法。25. The method of any of claims 21-24, wherein the fibronectin fragment has a heparin-II binding site. フィブロネクチン断片がＶＬＡ−５結合部位を有する、請求項２１−２５のいずれかの方法。26. The method of any of claims 21-25, wherein the fibronectin fragment has a VLA-5 binding site. 請求項１−２０のいずれかにしたがって産生した細胞集団を被験者に投与することを含んでなる、被験者を治療する方法。21. A method of treating a subject, comprising administering to the subject a cell population produced according to any of claims 1-20. 静止造血細胞を濃縮する、造血細胞培養用の培地であって、フィブロネクチンポリペプチドを含んでなる、前記培地。A hematopoietic cell culture medium for concentrating stationary hematopoietic cells, wherein the medium comprises a fibronectin polypeptide. 請求項１−２０のいずれかにしたがった方法によって得ることが可能な、静止造血細胞が濃縮された造血細胞集団。A hematopoietic cell population enriched in quiescent hematopoietic cells obtainable by a method according to any of claims 1-20.

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