JP2004502426A - 平滑筋の発現を制御するキメラプロモーター - Google Patents
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Abstract
本発明は、筋特異的エンハンサーに作動可能に連結したSMC特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関する。本発明は、このようなキメラ構築物を含んでなり、治療遺伝子の発現を制御するための発現カセットも提供する。最後に、本発明は、上記発現カセットを含んでなる組み換えベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、組成物、およびSMC中での特異的発現および治療または予防目的のためのそれらの使用、本発明のキメラ構築物、発現カセットまたはベクターをゲノムに組込んでなる、ヒトまたは動物生体、並びにヒト以外のトランスジェニック動物の治療方法に関する。
Description
【0001】
本発明は、筋特異的エンハンサーに操作可能に結合した平滑筋細胞(SMC)特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関する。本発明は、このようなキメラ構築物を含んでなり、治療遺伝子の発現を制御するための発現カセットも提供する。最後に、本発明は、上記発現カセットを含んでなる組み換えベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、医薬組成物、およびSMC中での特異的発現および治療または予防目的のためのそれらの使用、ゲノムに上記発現カセットを組込んだトランスジェニック動物に関する。本発明は、組織特異的遺伝子発現の分野に関し、培養細胞系における組み換えポリペプチドの産生、トランスジェニック動物モデルの構築、遺伝子調節の研究、および血管ターゲッティング技術の開発など多くの用途に用いられる。本発明は、遺伝子治療、特に循環器分野における遺伝子治療に関して極めて興味深いものである。
【0002】
遺伝子治療は、遺伝子材料の細胞または生体への導入と定義することができる。遺伝子治療によるヒト疾患の治療の可能性は、数年間で理論的考察の段階から臨床的応用の段階へと変化してきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ(ADA)をコードする遺伝子に影響を与える突然変異の結果としての遺伝的に免疫不全である患者について1990年9月にアメリカ合衆国で開始され、この最初の実験の相対的な成功により様々な遺伝的および後天的疾患についての技術開発が促進された。遺伝子治療に基づく有望な臨床試験が、現在進行中である(例えば、http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/に記載されている臨床試験を参照されたい)。
【0003】
循環器疾患は、先進工業国の大半における死亡率の主な原因であるので、遺伝子治療の主要なターゲットである。平滑筋(SMC)の表現型を増殖および調節する能力は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および喘息など多くの疾患の病因に関係してきた。例えば、動脈壁の損傷により、サイトカインおよびSMC移動および増殖を促進する他の生長調節分子の合成が誘発され、血管内膜の過形成が生じ(Ross, 1993, Nature 362, 801−809)、アテローム性動脈硬化症などの幾つかの循環器疾患の発症の一因となる。このような損傷に対する普通の臨床的に重要な設定は、閉塞した動脈をカテーテル上のバルーンで機械的に拡張して血流を回復するバルーン血管形成術である。しかしながら、症例の30〜50%では、反応性の細胞増殖応答により局部的に平滑筋が再増殖し、血液循環に欠陥を生じる(Schwartz et al., 1996, Int. J. Cardiol. 53, 71−80)。再狭窄と呼ばれるこの工程は、通常の方法では治療し難いものであった。従って、SMCへの遺伝子導入により、これらの循環器疾患の病因の解明および遺伝子治療によるそれらの治療が保証される。
【0004】
遺伝子治療の成功は、主として生体の細胞への治療遺伝子の効率的送達と遺伝情報の発現によって左右される。機能的遺伝子は、様々な手法によって細胞に導入して、上記遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みにより宿主細胞の一過性発現または恒久的形質転換を生じることができる。裸の核酸(すなわち、プラスミドDNA)を用いて目的の遺伝子をターゲット細胞中に運ぶことができるが(Wolff et al., 1990, Science 247, 1465−1468)、遺伝子治療プロトコールの大半はウイルスまたは合成ベクターを使用している。
【0005】
ウイルスは、細胞膜を通って輸送を行い、リソソーム分解を免れてそれらのゲノムを核に送達するための多様で極めて複雑な機構を発現させており、従って、多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。レトロウイルスおよびアデノウイルス由来のものが広汎に使用されているが(総説については、Crystal, 1995, Science 270, 404−410; Kovesdi et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol 8, 583−589 ; Miller, 1997, ヒト遺伝子Ther. 8, 803−815を参照されたい)、ポックスウイルス由来のベクターのような他のウイルスベクターはイン・ビボでの遺伝子導入の有望な候補として出てきている。
【0006】
合成ベクターは、核酸(例えば、プラスミドDNA)と脂質またはポリマーとの特別な組合せであって、その細胞摂取を促進するものを表す。様々な脂質およびポリマーを基材としたベクターが、現在入手できる(総説については、例えば、Rolland, 1998, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143−198を参照されたい)。ウイルスベクターより効率は劣るが、合成ベクターは大規模生産、安全性、低免疫原性およびクローニング能に関して潜在的な利点を示す。
【0007】
しかしながら、本発明の遺伝子治療ベクターの宿主範囲が広汎にわたることが、それらの使用の主要な制限となる可能性がある。この特異性の欠如により、広汎に治療遺伝子が発現し、これが特に細胞傷害性遺伝子を導入するときには患者にとって有害となることがある。従って、遺伝子発現を標的設定した範囲の細胞に限定する手段が遺伝子治療に有用であろう。
【0008】
数名の研究者らは、ターゲットの細胞表面ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを結合させることによるベクター特異性の変更を提案している(Roux et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079−9083; WO94/10323号明細書)。例えば、Goud et al. (1988, Virol. 163, 251−254)はアンチ−トランスフェリン受容体抗体をレトロウイルスエンベロープタンパク質に連結させて、レトロウイルス粒子をトランスフェリン受容体を有するヒト細胞に送達した。しかしながら、結合およびインターナリゼーションは生じたが、感染および複製は起こらなかった。更に、この手法は複雑であり、特にベクターとその天然に存在する細胞受容体との間に存在する相互作用を排除する必要がある。
【0009】
もう一つの代替法は、組織特異的転写調節要素を用いて遺伝子発現を所望な細胞個体数に限定することである。哺乳類細胞での遺伝子転写を完全且つ効率的に調節するには、2個の主要なDNA配列、すなわちプロモーターおよびエンハンサーが必要である。プロモーターは転写の開始部位(キャップ部位または+1)のすぐ上流(5′)に位置し、開始部位から転写を正確且つ効率的に開始するのに必要である。大多数の真核プロモーターは、特異的なシス作用配列、例えば、(i) キャップ部位に約30塩基対5′を提供し、キャップ部位を決定して遺伝子転写を開始するのに必要なTATAボックスと呼ばれるATリッチ領域(Breathnachおよび Chambon, 1981, Ann. Rev. Biochem. 50, 349−380)、および(ii) 転写開始効率を増加させ、プロモーターが適正なレベルで機能するのに必要な1個以上の上流プロモーター要素(UPE)(GeneVI, 1997, Initiation of transcription), p 810−846, B. Lewin監修, Oxford University Press)を包含する。これらのシス作用配列は遍在しており(任意の細胞の種類で見出される)または調節の役割を有する(特異的な時間にまたは特異的な組織で合成または活性化される)核転写因子によって認識され、結合される。
【0010】
プロモーターの活性は、「エンハンサー」と呼ばれ、プロモーターからの転写速度を増加させることができる他の配列によっても調節される。エンハンサーの成分は、転写因子によって認識される幾つかのシス作用配列も含んでいるが、これらの配列は更に緊密に充填された配列に組織されるので、プロモーターの成分に似ている。これらのエンハンサーのシス作用配列は、遍在している(例えば、ウイルスエンハンサー)または調節の役割を有する(組織特異的または一時的に調節される転写因子のターゲット)核転写因子によっても認識され、結合される。エンハンサーは、プロモーターの上流または下流の数キロ塩基対(bp)までの距離に、いずれの配向でも配置することができる(GeneVI, 1997, Initiation of transcription), p 810−846, B. Lewin監修, Oxford University Press)。
【0011】
様々な組織において遺伝子を特異的且つ選択的に発現させる多数の組織特異的プロモーター/エンハンサーが、文献に記載されている(総説については、Maniatis et al., 1987, Science 236, 1237−1245; Fickett et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11, 19−24を参照されたい)。しかしながら、これまでに、数種類のSMC特異的プロモーター/エンハンサーしか同定されていない。例は、平滑筋α−アクチン(Foster et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 11995−12003 ; Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 7631−7643)、平滑筋ミオシン重鎖(SM−MHC)(Katoh et al., 1994, J. Biol. Chem 269, 30538−30545)、デスミン(欧州特許出願第EP0 999 278号明細書; Mericskay et al., 1999, Current Topics in Pathology Vol 93 p 7−17, Desmouliereおよび Tuchweber監修, Springer−Verlag Berlin, Heidelberg)、およびSM22α遺伝子(Duband et al., 1993, Differentiation 55, 1−11)のものに限定されている。
【0012】
SM22αプロモーターは、総ての平滑筋組織(内臓並びに血管SMC)で機能する。転写開始部位のすぐ上流の445塩基対(bp)は、培養したSMC(Solway et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 13460−13469; Kim et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 1006−1018; 米国特許第6,015,711号明細書)で示されるように内臓および血管SMCでSMC系に限定されたやり方で、並びにイン・ビボでのトランスジェニックマウスで(Li et al., 1996, J. Cell Biol. 132, 849−859; Moessler et al., 1996, Development 122, 2415−2425)、および動脈内投与(Kim et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 1006−1018)によって遺伝子発現をプログラムするのに十分である。更に、SM22α遺伝子の更に上流領域は、動脈SMC、更に具体的には、大動脈に限定された発現の特異性を示す他の転写調節したシス作用配列を含むことが示されており(WO97/35974号明細書)、SM22α遺伝子の転写活性の複雑性を示している。
【0013】
しかしながら、前に引用した転写要素がSMCに限定されたやり方で適正に調節される場合には、それらは通常は弱く、サイトメガロウイルス(CMV; Boshart et al., 1985, Cell 41, 521−530)または他のウイルスのような「強い」プロモーター/エンハンサーで得られるものよりずっと低い発現レベル(10〜200分の1)を提供する。しかしながら、このようなウイルス転写要素は通常は非特異的であり、多くの種由来の多種多様な細胞型で活性である。
【0014】
CMVまたは骨格筋特異的エンハンサーを骨格筋特異的プロモーターと結合させるキメラ構築物は、文献に記載されている(Barnhart et al., 1998, ヒト遺伝子Ther. 9, 2545−2553)。幾つかの会合は(エンハンサーを欠いた構築物と比較して)培養した分化骨格筋細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベル有意に増強させるが、強い発現は筋肉以外のBHK細胞でも観察され、CMVプロモーター/エンハンサーを用いて得た発現レベルの100%まで到達する。更に、イン・ビトロで強い増強を示す幾つかのキメラ構築物は、骨格筋に投与するときにはイン・ビボではこのような増加を再現しない。Barnhart et al.によって記載されているように、遺伝子発現を定義する臨床パラメーターは複雑であり、プロモーター配列並びに配列環境に関してエンハンサーの性質、数、配向および位置によって変化する。
【0015】
CMVエンハンサーをSM22αプロモーターなどのSMC特異的プロモーターと会合させるキメラ構築物は、近年WO00/18908号明細書に記載されている。様々な培養細胞系のトランスフェクション研究は、CMVエンハンサーが存在するときのSMCにおける遺伝子発現の活性化を示している。しかしながら、キメラ構築物は非SMCでも強い誘導性を保持しており、コントロールとして用いた強力なCMVプロモーター/エンハンサーを用いて得た発現レベルの26%まで達する。非標的設定細胞におけるこのようなバックグラウンド発現は、特に細胞傷害性遺伝子の送達を考えるときには、ヒト遺伝子治療と両立しないことがある。
【0016】
要するに、これらの研究は、ターゲット細胞、好ましくはSMCに対する限定された特異性を保持したまま有意なレベルで遺伝子を発現させる適当なプロモーター/エンハンサーの組合せをデザインすることが困難であることを明らかにしている。
【0017】
従って、当該技術分野では、SMC、特に血管構造のSMCにおいて遺伝子を高レベルおよび特異的に発現させる転写要素をデザインして、治療レベルのタンパク質発現を達成し、広汎な遺伝子発現に固有の潜在的な副作用を回避する必要がある。
【0018】
この技術的問題は、特許請求の範囲に定義した態様を提供することによって解決される。
【0019】
従って、本発明は、少なくとも1個の(ii)筋特異的エンハンサーに作動可能に連結した少なくとも1個の(i)平滑筋(SMC)特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物を提供する。
【0020】
本明細書で用いられる「キメラ構築物」という用語は、種、遺伝子などにあてはまる各種起源の少なくとも2個の配列を含んでなる核酸構築物を表す。好ましくは、これらの2個の配列、すなわちSMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは互いに非相同性であり、すなわちそれらは異なる遺伝子または異なる種から生じ、更に好ましくは、それらは異なる遺伝子および異なる種から生じるという意味において非相同性である。本発明の範囲内では、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態またはその類似体を定義している。「ポリヌクレオチド」としては、任意の可能な核酸、特に一本鎖または二本鎖、線状または環状、天然または合成であることができるDNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含んでなることができる(米国特許第5,525,711号明細書、米国特許第4,711,955号明細書、またはEPA302 175号明細書を修飾の例として参照されたい)。このようなポリヌクレオチドは既成の核酸供給源(例えば、ゲノムcDNA)から得ることができるが、合成的なもの(例えば、オリゴヌクレオチド合成によって製造される)であることもできる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド要素によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合の後にらに修飾してもよい。
【0021】
SMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーについて本出願明細書に引用されたヌクレオチド位置に、転写開始部位またはキャップ部位(位置+1を表す)に対して負の番号を付ける。転写開始部位のすぐ上流の最初のヌクレオチドは、−1と番号を付ける。転写開始部位は、S1マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる(Sambrook et al., 1989, 実験室便覧(Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)。
【0022】
「平滑筋細胞(SMC)」という用語は、内臓および血管SMC、更に具体的には動脈SMCなど任意の種類の平滑筋細胞を表し、大動脈、冠、***、大腿および頸動脈の並びに伏在静脈の血管内膜(neointimal)および中間部(medial)SMCが特に好ましい。
【0023】
本明細書で用いられる「SMC特異的プロモーター」は、平滑筋細胞に含まれる(複数の)転写因子および/またはRNAポリメラーゼによって認識されることによって、隣接遺伝子の発現を促進する任意の核酸配列を意味する。「隣接遺伝子」という用語は、転写が上記プロモーターおよび/または本発明のキメラ構築物によって制御される遺伝子を表す。特に、「特異的」という用語は、本発明で用いられるプロモーターおよび/または本発明のキメラ構築物がSMCでの遺伝子発現を指示するが非SMCでは全くまたは余り活性ではない(少なくとも5、好ましくは少なくとも10のファクターの減少した活性)傾向を示すことを意味する。
【0024】
本発明で用いられるSMC特異的プロモーターは、SMCにおいて低レベルであっても遺伝子発現を促進するのに必要な少なくとも総ての要素を包含する。このようなプロモーターは、RNAポリメラーゼ結合部位を可能にし、且つ好ましくはキャップ部位の25〜35bpに配置されたTATAボックス(コンセンサス配列TATAAAA)またはTATAボックス様要素(TATAボックス機能を有するATリッチ配列)のようなキャップ部位で転写を開始するのに必要なシス作用配列を含むいわゆる「最小プロモーター」であることができる。TATAボックスの存在は配列分析によって決定することができ、また転写の開始部位はS1マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる。最小SMC特異的プロモーターは、通常は転写開始部位の(上流)200塩基対(bp)の断片に含まれ、有利には100塩基対(bp)の断片に含まれる。
【0025】
第二の好ましい代替態様によれば、本発明のキメラ構築物は、SMCにおける最小プロモーターによって指示される遺伝子発現を実質的に増加させる追加のシス作用配列を含むSMC特異的プロモーターを用いる。このようなシス作用配列は、遍在しているかまたは調節の役割(一時的または組織特異的)を有する転写因子、特にSMCに特異的な因子を結合させることができる。代表例としては、NF−1因子が結合したCAATボックス(コンセンサスGGCCAATCT)、SP1因子が結合したGCボックス(コンセンサス GGGCGG)、Oct因子が結合したオクタマーATTTGCAT、NF6Bが結合した6B(コンセンサスGGGACTTTCC)、ATF因子が結合したATF(コンセンサスGTGACGT)、Ap2、Sp1、Egr1、YY1、TGT3−3、Eボックス(CANNTG)、CarGボックス(CC(A/T)6GG)、および/またはMEF−2(YTAWAAATAR)配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのシス作用配列は単独でまたは様々な組合せで用いることができ、相同性(本発明で用いられるSMC特異的プロモーターから単離)または非相同性(別のプロモーター領域から単離)であってもよい。これに関連して、数種類のSMC特異的プロモーターの異なる部分を融合させ、SMCでの遺伝子発現を最適にするのが有利であることがある。
【0026】
この好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、転写開始部位の上流の4000bpの断片内、有利には2000bpの断片内、好ましくは1000bpの断片内、更に好ましくは500bpの断片内に含まれる。
【0027】
更に、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、隣接遺伝子に含まれていないときには、標的設定したSMCで機能する転写開始部位を含んでなることがある。
【0028】
好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、平滑筋α−アクチン(Foster et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 11995−12003; Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 7631−7643)、平滑筋ミオシン重鎖(SM−MHC)(Katoh et al., 1994, J. Biol. Chem 269, 30538−30545)、平滑筋カルポニン(マウス遺伝子についてMiano et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 7095−7103、ラット遺伝子についてNobrega et al., 2000, Mamm Genome 11, 115−119、およびヒト遺伝子についてKitami et al., 1999, Hypertens. Res. 22, 187−193)、デスミン(欧州特許出願第EP 0 999 278号明細書;Mericskay et al., 1999, Current Topics in Pathology Vol 93, p 7−17, Desmouliereおよび Tuchweber監修, Springer−Verlag Berlin, Heidelberg)およびSM22α遺伝子 (Duband et al., 1993, Differentiation 55, 1−11)のプロモーターからなる群から選択される。SM22αプロモーターを用いるのが好ましい。この好ましい態様の範囲内には、SMC特異的発現を伝達することもできるこれらのプロモーターの5′欠失断片がある。
【0029】
本発明のキメラ構築物は、任意の種、特にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ由来のSM22αプロモーターを用いることができる。様々な種のSM22αプロモーターの配列は、文献または専門のデーターバンク(ヒト配列については受託番号AH006172.1、マウス配列についてはZ.68618.1、およびラット配列についてはZ48607.1のGenebankなど)から当業者が入手することができる。基本的なシス作用配列の位置は、公表されたデーターに基づいて決定することができる。
【0030】
マウス遺伝子のSM22αプロモーター、特に転写開始部位の上流の445bp断片(すなわち、配列番号:1、1〜445位)内に含まれるマウスSM22αプロモーターの部分が、本発明に関して特に好ましい。このネズミSM22αプロモーターは、Moessler et al.に記載の方法で単離することができる(1996, Development 122,2415−2425)。ヒト遺伝子のSM22αプロモーター、特に約−445位まで伸張する部分(配列番号:14の1〜445位)も、本発明に関して適当である。他の哺乳類形態のSM22αプロモーターは、通常の分子生物学の手法を用いてまたはPCRによって適当なマトリックス(例えば、前に引用した文献記載の従来の技術によるプラスミド)から得ることができる。例えば、 ネズミ遺伝子の断片を用いて、相同配列をハイブリダイズさせる条件下で他の種の哺乳類から作製したゲノムライブラリーをプローブすることができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、標準的マニュアル(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)を参照して決定することができる。
【0031】
本明細書で用いられる「筋」という用語は、(上記で定義した通りの)骨格、心および平滑筋など任意の種類の筋細胞を表そうとするものである。骨格および平滑筋が、本発明に関して好ましい。
【0032】
本明細書で用いられる「筋特異的エンハンサー」は、(複数の)因子が直接または間接的に(すなわち、他の細胞因子との相互作用によって)結合することによって、本発明のキメラ構築物、特に標的設定したSMCに含まれるSMC特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増進するポリヌクレオチド配列を表す。このような増進は、例えばイン・ビトロ(例えば、培養SMC中)またはイン・ビボ(例えば、トランスジェニック動物中でまたは動物モデルに直接投与することによって)でも、同一実験条件下で筋特異的エンハンサーの存在下または非存在下においてSMC特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子の発現を比較することによって決定することができる。このような遺伝子発現分析の例は、本明細書の例3、4および6において提供されるが、当業者に周知の他の方法を本発明に関連して用いることもできる。
【0033】
多種多様な異なる供給源由来の多数の筋特異的エンハンサーは当該技術分野で周知であり、クローニングしたポリヌクレオチド配列としてまたはの範囲内で(例えば、ATCCのような寄託機関、または商業的および個人的供給源から)利用可能である。従って、好ましい態様では、筋特異的エンハンサーは
a) 哺乳類α−アクチン(Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,7631−7643)、特に心臓、骨格または平滑筋α−アクチン(Genbank受託番号D00618)、
b) 哺乳類トロポニン、特にトロポニンC(Genbank受託番号M37984)、I(Genbank受託番号X90780)またはT(Genbank受託番号AJ011712)、
c) 哺乳類ミオゲニン(Genbank受託番号X62155)、
d) 哺乳類ミオシン。数種類のミオシンエンハンサーが、これまでにミオシン軽鎖およびミオシン重鎖遺伝子(例えば、Donoghue et al., 1988, Genes and Development 2, 1779−1790)のいずれに由来するものも同定されている。好ましいものは、ミオシン重鎖エンハンサーであり、更に好ましくはウサギのエンハンサーであり、遺伝子をコードするウサギミオシン重鎖の転写開始部位の上流約−1332〜約−1225位(配列番号:2)に配置されたエンハンサーが特に好ましい(Kallmeier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,30949−30957)、
e) 哺乳類クレアチンキナーゼ、特にヒト(Trask et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 17142−17149 ; Genbank受託番号AH003460)またはマウス(Jaynes et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 62−70)クレアチンキナーゼ。好ましい筋特異的エンハンサーは、好ましくはヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位の上流の約−919〜約−711位に配置された配列(配列番号:3)を用いる、
f) 哺乳類APEG−1(大動脈で優先的に発現される遺伝子−1; Hsieh et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 14344−14351)、
g) 哺乳類スムーセリン(smoothelin)(Genbank受託番号AH007691)、
h) 哺乳類SM20遺伝子産物、特にヒト由来のもの(Wax et al., 1996, Lab. Invest. 74, 797−808)、
i) 哺乳類Timp4(メタロプロテイナーゼ組織インヒビター4(Tissue−inhibitor of metalloproteinase 4))、特にヒト由来のもの(Genbank受託番号U76456)、および
j) 哺乳類カルポニンであって、ネズミカルポニン遺伝子の最初のイントロン内の約+138〜+1875位に配置された配列が特に好ましい(Miano et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 9814−9822)、
をコードする遺伝子のエンハンサーの群から選択される。
【0034】
「作動可能に連結」とは、核酸配列(i)および(ii)の並置であって、筋特異的エンハンサーおよびSMC特異的プロモーターがそれらを所期の方法で機能させる関係にあるものを表す。筋特異的エンハンサーがSMC特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増加させるときには、このエンハンサーはプロモーターに作動可能に連結している。作動可能に連結したエンハンサーは、プロモーターの上流、下流または遺伝子配列内のキメラ構築物に置くことができ、近い距離または数kbまでの距離を介して隣接することができる。有利には、筋特異的エンハンサーは、SMC特異的プロモーターの上流にプロモーターとエンハンサーを分離する距離が500bp未満、好ましくは200bp未満で、更に好ましくはプロモーターのすぐ上流に配置される。更に、筋特異的エンハンサーの配向は、SMC特異的プロモーターによって付与される転写方向に対してセンス(5′→3′)またはアンチセンス(3′→5′)であることができる。本発明に関しては、キメラ構築物は、好ましくはSMC特異的プロモーターに対してアンチセンス配向で位置するクレアチンキナーゼエンハンサーまたはセンス配向で位置するミオシン重鎖エンハンサーを含んでなる。カルポニンエンハンサーは、好ましくはSMC特異的プロモーター の下流に(すなわち、イントロンとしてまたはイントロン内に)挿入されている。上記で定義した2種類以上の筋特異的エンハンサーを含むキメラ構築物も包含される。
【0035】
本発明のキメラ構築物の作動可能性は、イン・ビトロで適当な培養細胞中でまたはイン・ビボで(トランスジェニック動物中または動物モデルに直接投与することによって)SMCにおいて遺伝子(例えば、細菌性酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはeGFPなどをコードするレポーター遺伝子)を発現させる能力を測定することによって容易に決定することができる。 遺伝子発現は、フローサイトメトリー、ELISA、免疫蛍光、ウェスタンブロット法、生物活性測定などの標準的方法によって決定することができる。
【0036】
更に、本発明のキメラ構築物の遺伝子発現活性を、現在最も活性であることが知られているものの一つと考えられているが非特異的(遍在発現)であるCMVのような強力なプロモーター/エンハンサーと比較することができる。本発明のキメラ構築物は、類似の実験条件下で、特にネズミSMC特異的プロモーター(例えば、キャップ部位に対して約−445〜約+65のネズミSM22αプロモーターの部分)を用いるときには、CMVプロモーター/エンハンサーを用いて得たものの少なくとも10%、有利には少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%であり、更に具体的には約20〜35%のSMCにおけるレポーター遺伝子の発現レベルを提供する。発現レベルは、ヒトSMC特異的プロモーター(キャップ部位に対して約−445〜約+63のヒトSM22αプロモーターの部分)を補充したキメラ構築物を用いるときには、リファレンスCMVプロモーター/エンハンサーを用いて得たものの少なくとも15%、好ましくは20〜200%に達することができる。非SMCでは、本発明のキメラ構築物によって行われる遺伝子発現は低いか(CMV構築物で用いたものの5%未満、有利には2%未満、好ましくは1%未満)、または検出されない。
【0037】
キメラ構築物は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学の手法によって構築することができる。SMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは、例えばDNAライブラリーからのクローニングの手法または適当なプローブを用いる増幅法(PCR)によって単離することができる。あるいは、それらは、当該技術分野で理由できる配列データーに基づいて化学合成によって製造することができる。プロモーターおよびエンハンサーを有する断片は、制限酵素およびリガーゼを用いて結合させ、本発明のキメラ構築物を生成させることができる。
【0038】
本発明に関連して、プロモーターまたはエンハンサーはそれぞれ、または両方とも、それぞれの上記の活性が実質的に(本来の配列の活性の少なくとも80%)保存されるという条件で、1または数個のヌクレオチドの欠失、付加および/または置換によって修飾することができる。このような修飾は、(i)SMC以外の細胞の種類で発現を制御する正のシス作用配列(SMC特異性の改良)または(ii)発現レベルを減少させるシス作用配列(「サイレンサー」)を除去することを目的とすることができる。位置指定突然変異誘発を用いて、本来の配列を修飾することができる。
【0039】
本発明は、本質的にSMC結合を制限したやり方で遺伝子発現を行うのに十分なヒトSM22αプロモーターの部分を含んでなるSMC特異的プロモーターにも関する(内臓および/または血管SMC)。SMCの特異性は、上記のような培養細胞、トランスジェニック動物またはイン・ビボ投与を用いる方法などの任意の通常の手法によって明らかにすることができる。好ましくは、本発明のSMC特異的プロモーターは、配列番号:14に記載の配列の総てまたは部分、更に好ましくは約ヌクレオチド1から約ヌクレオチド445まで(キャップ部位に対してヒトSM22α遺伝子の約−445〜−1位に相当する)伸張しているもの、またはそれらの任意の機能的に同等なもの(本来の配列に対して1個以上のヌクレオチドの付加、欠失および/または置換によって修飾され且つSMC特異性および/または発現レベルに関して本来の配列の活性の少なくとも80%を保存している)を含んでなり、または好ましくはからなる。
【0040】
本発明は、本発明によるキメラ構築物またはSMC特異的プロモーターによって制御される目的の遺伝子を含んでなり、ターゲット細胞で発現させる発現カセットも提供する。
【0041】
「目的の遺伝子」という用語は、任意の起源のものであり、且つゲノムDNA、cDNA、またはゲノムRNA、mRNA、アンチセンスRNA、リボソームRNA、リボチームまたはトランスファーRNAのようなRNAをコードする任意のDNAから単離することができる核酸を表す。目的の遺伝子は、オリゴヌクレオチド(すなわち、100bp未満の短いサイズの核酸)であることもできる。
【0042】
好ましい態様では、本発明で用いられる目的の遺伝子は、治療上関心のある遺伝子産物をコードする。「治療上関心のある遺伝子産物」とは、患者、特に疾患または疾病状態のあるまたはこの疾患または状態から防御すべき患者に適当に投与するとき、治療または防御活性を有するものである。このような治療または防御活性は、上記疾患または上記状態の症状の経過に対する有益な効果に相関させることができる。治療を行う疾患または状態によって治療上関心のある適当な遺伝子産物をコードする遺伝子を選択することは、当業者の能力範囲内にある。一般的には、当業者の選択は以前に得られた結果基づくことがあり、過度の実験を行うことなく、特許請求の範囲に記載の発明を実施すること以外は、このような治療特性を得ることを合理的に期待することができる。
【0043】
本発明に関連して、目的の遺伝子は、これを導入するターゲット細胞に対して相同性または非相同性であることができる。有利には、この遺伝子は、ポリペプチド、リボチームまたはアンチセンスRNAをコードする。「ポリペプチド」という用語は、サイズがどのようなものであれ、ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物と理解すべきであり、7個程度の残基(ペプチド)を有するポリペプチドを包含するが、更に典型的にはタンパク質を包含する。更に、これは、任意の起源(原核生物、下等または高等真核生物、植物、ウイルスなど)であることができる。これは、本来のポリペプチド、変異体、性質の対応部を持たないキメラポリペプチド、またはその断片であってもよい。有利には、本発明で用いられる目的の遺伝子は、動物またはヒト生体で1個以上の欠陥または不完全な細胞性タンパク質を相殺できるまたは体内から有害な細胞を限定しまたは除去するための毒性効果を介して作用する少なくとも1個のポリペプチドをコードする。適当なポリペプチドは、免疫付与性であり且つ体液性または細胞性応答または両方を刺激するための抗原として作用することもできる。
【0044】
本発明の発現カセットで用いられる目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドの例としては、
p21、p16、網膜芽細胞腫(Rb)遺伝子、キナーゼインヒビター(好ましくは、サイクリン依存型)、GAX、GAS−1、GAS−3、GAS−6、Gadd45、およびサイクリンA、BおよびDのような細胞サイクルに関与するポリペプチド、
p53、Bas、Bcl2、BclX、Bad、およびそれらのアンタゴニストのようなアポトーシス誘導物質、
血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF、特にTGFαおよびβ)、上皮増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF、特にFGFαおよびβ)、腫瘍壊死因子(TNF、特にTNFαおよびβ)、CCN(CTGF、Cyr61、Nov、Elm−1、Cop−1、およびWisp−3など)、散乱因子/肝細胞増殖因子(SH/HGF)、アンギオゲニン、アンギオポエチン(特に、1および2)、アンギオテンシン−2、サイトカイン(インターロイキン、特にIL−2、IL−8;GM−CSF、G−CSF、M−CSFのようなコロニー刺激因子)、プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)およびウロキナーゼ(uPA)、のファミリーの一員などのアンギオゲニンポリペプチド、
抗体、毒素、イムノトキシン、腫瘍遺伝子発現産物を阻害するポリペプチド(例えば、ras、mapキナーゼ、チロシンキナーゼ受容体、増殖因子)、Fasリガンド、自殺遺伝子産物などの細胞増殖を減少または阻害することができるポリペプチド、
細胞遺伝子の発現を調節または調整することができるポリペプチド、
凝固因子(FVIII、FIXなど)、
B7.1、B7.2、ICAMなどの免疫刺激ポリペプチド、
ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼeNOSまたはiNOS、SOD、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、リポタンパク質リパーゼファミリーなどの酵素、
酸素ラジカルスカベンジャー、
α1−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターPAI−1、メタロプロテイナーゼ1〜4の組織インヒビターのような酵素インヒビター、
ジストロフィン、
アンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、IL−12、IFNβまたはγのようなサイトカインなどの血管新生インヒビター、
DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写を活性化または阻害するドメインを含んでなる核受容体のような転写因子(例えば、エストロゲン、ステロイドおよびプロゲステロン受容体由来の融合産物)、
マーカー(β−ガラクトシダーゼ、CAT、ルシフェラーゼ、GFPなど)、および
臨床状態の治療または予防に有用であると当該技術分野で認められている任意のポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
目的の遺伝子が本来の配列に関して1個以上のヌクレオチドの付加、欠失および/または修飾を含むことがあることは、本発明の範囲内にある。
【0046】
本発明に関連して、自殺遺伝子産物は、不活性物質(プロドラッグ)を細胞傷害性物質に転換することによって細胞死をもたらすことができる。HSV−1のチミジンキナーゼをコードする遺伝子は、自殺遺伝子ファミリーのプロトタイプを構成し(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024−7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550−1552)、アシクロビールまたはガンシクロビールのようなヌクレオシド類似体(プロドラッグ)の、新たに形成されたDNA鎖に組込まれる毒性ヌクレオシドへの変換を触媒し、細胞分割を阻害する。多数の自殺遺伝子/プロドラッグの組合せが、現在利用可能である。更に具体的に記載することができるものは、シトシンデアミナーゼ(Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1−6; WO93/01281号明細書; 欧州特許第402 108号明細書)およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51−56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149−157)をコードする細菌および真菌性遺伝子であって、プロドラッグ5−フルオロシトシン(5−FC)と共に用いることができる。本発明は、WO96/16183号明細書およびWO99/54481号明細書に記載されているような突然変異自殺遺伝子の使用も包含する。
【0047】
もう一つの好ましい態様は、目的の遺伝子がSMCに対する増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードする発現カセットに関する。従って、もう一つの好ましい態様では、ポリペプチドは、IFNβ(Genbank受託番号M25460)、IFNγ(Genbank受託番号M29383)、酸化窒素シンターゼeNOS(Genbank受託番号M95296)、Fasリガンド(Genbank受託番号U08137)、ヘムオキシゲナーゼ(Genbank受託番号X06985)、インターロイキン−10(Genbank受託番号U16720)、およびヘパリン結合VEGF(Genbank受託番号M32977)からなる群から選択され、好ましくはそれぞれはヒト起源のものである。
【0048】
上記のように、目的の遺伝子は、特異的細胞RNAと結合と不活性化することができるアンチセンス配列およびリボチームをコードする遺伝子も包含し、好ましくは癌遺伝子およびプロト癌遺伝子(c−myc、c−fos、c−jun、c−myb、c−ras、KcおよびJE)のような選択されたポジティブ作用性増殖調節遺伝子を包含する。
【0049】
本発明の発現カセットは、1個以上の目的の遺伝子を含んでなることができる。これに関して、自殺遺伝子産物とサイトカイン(IL−2、IL−8、IFNγ、GM−CSFなど)または免疫刺激ポリペプチド(B7.1、B7.2、ICAMなど)をコードする遺伝子の組合せが本発明に関連して有利なことがある。別の目的の遺伝子は、本発明のキメラ構築物またはSMC特異的プロモーター(ポリシストロン性カセット)または独立プロモーターであって、少なくとも一方が同一または反対方向に配置されている上記に定義したキメラ構築物またはSMC特異的プロモーターであるものによって制御することができる。更に、それらは、同一ベクターまたは独立ベクターによって運ぶことができる。
【0050】
本発明の発現構築物は、追加の機能的要素、例えばエキソン/イントロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在化シグナル配列、IRES、ポリA転写終結配列、トリパルタイトリーダー配列、複製または組み込みに関与する配列を含んでなることもできる。上記配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に得ることができる。
【0051】
好ましい態様では、本発明の発現カセットは、更に1個以上のエキソンまたはその部分、好ましくは非コードエキソン、および場合によっては1個以上のイントロンを含んでなる。このようなエキソンおよび/またはイントロン配列は、発現の安定化に有利であることがあり、例えば、SMC特異的プロモーターが生じる遺伝子(例えば、SM22α)または任意の他の起源(例えば、真核生物、ウイルス、合成)から得ることができる。当該技術分野の状態で記載されている多種多様なエキソン/イントロン配列は、本発明に関して適当である。それらは、好ましくは転写開始部位の後および目的の遺伝子の前に挿入される。
【0052】
マウスSM22αプロモーターを含んでなるキメラ構築物の好ましい態様に関しては、適当なエキソン配列は、マウスSM22α遺伝子の+1位から約+65位まで(すなわち、配列番号:1、446〜510位)またはヒトSM22α遺伝子の+1位から約+63位まで(すなわち、配列番号:14、446〜508位)伸張する第一の非コードエキソンの部分を含んでなる。
【0053】
本発明の発現カセットは、(複数の)目的の遺伝子に操作可能に結合したポリアデニル化シグナルを含むこともある。ポリアデニル化配列は、転写を終結させるときには、転写を行う遺伝子に操作可能に結合する。これは、好ましくは目的の遺伝子の3′位(下流)に位置している。
【0054】
本発明は、本発明による発現カセットを含んでなるベクターも提供する。熟練者であれば、広汎なベクターから適当なベクターを選択することができる。例えば、ベクターは、裸のDNA分子、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターの形態の最終的に(複数の)合成ベクターと複合体形成または混合するものであることができる。「プラスミド」という用語は、所定の細胞で自律複製を行うことができる染色体外の環状DNAを表す。適当なプラスミドの範囲は、極めて大きい。好ましくは、プラスミドは、細菌中で増幅し、真核ターゲット細胞で発現するようにデザインされる。このようなプラスミドは、様々な製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、およびpPoly(Lathe et al., Gene 57 (1987), 193−201)が挙げられるが、これらに限定されない。これは、標準的な分子生物学の手法(Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー(1989), ニューヨーク)によって得ることもできる。これは、選択遺伝子を含んでなり、トランスフェクション細胞(例えば、細胞栄養要求性の補足または抗生物質耐性による)安定化要素(例えば、cer配列; Summers and Sherrat, Cell 36 (1984), 1097−1103)または 組込み要素(例えば、LTRウイルス配列 およびトランスポゾン)を選択しまたは同定することもできる。
【0055】
本発明のベクターの好ましい態様は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、ポックスウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルス由来のウイルスベクターに関する。このようなウイルス ベクターは、当該技術分野で周知である。「由来する」とは、ウイルスゲノムのコードまたは非コード部分に含まれる1または数個のヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1個以上の修飾を導入することによって本来のウイルスゲノムから遺伝子工学的に作製することを意味する。
【0056】
本発明に特に適当なウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完成するのに必要な約30個を上回る遺伝子を有する約36kbの線状の二本鎖DNA分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられるE3を除いてウイルス複製に本質的な4つの領域(E1〜E4)に分割される。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムの転写の調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域遺伝子(E2AおよびE2B)の発現により、ウイルス複製に必要なポリペプチドが合成される(Pettersson and Roberts, 1986, 癌細胞(Cancer Cells)(第4巻): DNA腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses), Botchan and Glodzicker Sharp監修, pp 37−47, Cold Spring Harbor Laboratory, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)E3領域によってコードされるタンパク質は、細胞傷害性T細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する(Wold and Gooding, 1991, Virology 184, 1−8)。E4領域によってコードされるタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、およびスプライシングおよび宿主細胞シャットオフ(Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250−257)に関与する。後期遺伝子は、大半がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードする。更に、アデノウイルスゲノムは、両端にシス作用性の5′および3′ITR(逆方向末端反復配列)およびDNA複製に本質的なパッケージング配列を有する。ITRはDNA複製の起源を有し、キャプシド化領域がアデノウイルスDNAの感染性粒子へのパッケージングに必要である。
【0057】
一態様では、本発明のアデノウイルスベクターを条件付きで複製するようにし(CRAdベクター)、Heise and Kirnに記載されているように特定の細胞(例えば、増殖細胞)で選択的に複製するようにする(2000, J. Clin. Invest. 105,847−851)。
【0058】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスベクターは、E1領域を構成する1個以上の遺伝子の全部または部分的欠失および/または突然変異により少なくともE1機能について複製欠陥を有する。有利には、E1欠失は、Genebankデーターベースに受託番号M73260で開示されているヒトアデノウイルス5型の配列を参照すればヌクレオチド(nt)458〜3328または458〜3510を包含する。
【0059】
更に、ベクターのアデノウイルス主鎖ベクターは、追加の修飾(1個以上のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異)を含んでなることがある。E2修飾の一例は、遺伝子をコードするDBP(DNA結合タンパク質)に局在した熱感受性突然変異によって明示される(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328−339)。アデノウイルス配列は、E4領域の全部または一部を欠失することもできる。ORF3および4またはORF3および6/7が有利なことがある(例えば、欧州特許出願EP974 668号明細書; Christ et al., 2000, ヒトGene Ther. 11, 415−427; Lusky et al., 1999, J. Virol. 73, 8308−8319)。非本質的E3領域内の追加の欠失はクローニング能を増加することができるが(総説については、例えばYeh et al. FASEB Journal 11 (1997) 615−623を参照されたい)、ポリペプチド(例えば、gpl9k)をコードするE3配列の総てまたは一部を保持して、宿主免疫系(Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53−71)または炎症反応(欧州特許EP00440267.3号明細書)を回避するのが有利であることがある。ITRおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残余合成を廃止することを目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第二世代ベクターを考えて、形質導入した細胞における発現遺伝子の長期発現を改良することもできる(WO94/28152号明細書; Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022−2032)。
【0060】
本発明の発現カセットは、シス作用配列を除きアデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。好ましくは、これは、欠失領域(E1、E3および/またはE4)の代わりに、特に優先的には欠失したE1領域の代わりに挿入される。更に、発現カセットは、問題の領域の転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。
【0061】
本発明による使用に適合させることができるアデノウイルスは、任意のヒトまたは動物供給源、特にイヌ(例えば、CAV−1またはCAV−2; それぞれ、Genbank参照番号CAVIGENOMおよびCAV77082)、トリ(Genbank参照番号AAVEDSDNA)、ウシ(例えば、BAV3; Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol. 72, 1394−1402)、ネズミ(Genbank参照番号ADRMUSMAV1)、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルアデノウイルス、あるいはそれらの雑種から誘導することができる。任意の血清型を用いることができる。しかしながら、Cサブグループのヒトアデノウイルスが好ましく、特にアデノウイルス2(Ad2)および5(Ad5)が好ましい。一般的には、引用したウイルスはATCCのようなコレクションで利用でき、それらの配列、構成および生物学を記載している多数の公表文献の主題となっており、熟練者であればそれらを応用することができる。
【0062】
更に、アデノウイルス粒子または中空アデノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第5,928,944号明細書に記載のウイルス依存性コインターナリゼーション法によって核酸(例えば、プラスミドベクター)を導入することもできる。この方法は、ポリカルベンまたは1以上の脂質層を含んでなる脂質小胞の存在下にて行うことができる。
【0063】
レトロウイルスベクターも、適当である。レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を用いて複製し、ウイルスRNAゲノムを二本鎖DNAに複製し、これを感染細胞の染色体DNAに組込む組込みウイルスのクラスである。文献記載の多数のベクター、特にネズミ白血病ウイルス、特にMoloney株(Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29)またはFriends FB29株(WO95/01447号明細書)由来のものを本発明の枠内で用いることができる。一般的に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子gag、polおよびenvの全部または一部を欠失しており、5′および3′LTRおよびキャプシド化配列を保持している。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させることができる。このような修飾としては、レトロウイルスキャプシド化配列のVL30のようなレトロトランスポゾンの一つによる置換が挙げられる(米国特許第5,747,323号明細書)。本発明の発現カセットは、キャプシド化配列の下流、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して逆方向で挿入される。
【0064】
ポックスウイルスは、それらの大きなDNAゲノムおよびそれらの複製の細胞質部位によって上記ウイルスから識別される複雑なエンベロープ付きウイルスの群である。ポックスウイルス科の数種類のゲノムはマッピングされ、配列決定されている。これは、約200種類のタンパク質(その中の約100種類がウイルス組立に関与している)をコードする約200kbの二本鎖DNAである。本発明に関連して、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意の一員、特にカナリヤポックス、鶏痘およびワクシニアウイルスから得ることができ、後者のものが好ましい。適当なワクシニアウイルスとしては、Copenhagen株(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247−266 および517−563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381−401)、Wyeth株、および改良Ankara(MVA)株(Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365−396)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による発現カセットを含んでなるワクシニアウイルスを構築する一般的条件は、当該技術分野で周知である(例えば、Copenhagenワクシニアウイルスについては欧州特許第83 286号明細書および欧州出願第206 920号明細書、およびMVAウイルスについてはMayr et al., 1975, Infection 3, 6−14 およびSutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847−10851を参照されたい)。
【0065】
本発明の発現カセットは、好ましくは非コード遺伝子間領域、または不活性化または欠失がウイルス増殖および複製を著しく損なわない任意の遺伝子のような非本質的座におけるポックスウイルスゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、Copenhagenワクシニアウイルスでの挿入に特に適している(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411−3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530−537)。MVAに関する限り、発現カセットの挿入は切除I〜VIIのいずれかで、好ましくは切除IIまたはIIIで(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031−1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12,1032−1040)またはD4R座で行うことができる。鶏痘ウイルスについては、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入が考えられるが、発現カセットは非コード遺伝子間領域に導入するのが好ましい(例えば、欧州特許第314 569号明細書および米国特許第5,180,675号明細書を参照されたい)。欠陥機能がヘルパーウイルスを介してイン・トランスでまたは生産者細胞系での発現によって供給されるという条件では、本質的ウイルス座での挿入を考えることもできる。
【0066】
有利な別態様によれば、本発明のベクターは、脂質および/またはポリマー (合成ベクター)に複合体形成することができる。好ましい脂質は、核酸に高親和性を有し且つ細胞膜と相互作用するカチオン性脂質である(Felgner et al. Nature 337 (1989) 387−388)。結果として、それらは、核酸を複合体形成することができ、従って、細胞にはいることができるコンパクトな粒子を生成することができる。適当な脂質としては、DOTMA(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413−7417)、DOGSまたはTransfectam(商品名)(Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982−6986)、DMRIEまたはDORIE(Felgner et al., Methods 5 (1993), 67−75)、DC−CHOL(Gao and Huang, BBRC 179 (1991), 280−285)、DOTAP(商品名)(McLachlan et al., Gene Therapy 2 (1995), 674−622)、Lipofectamine(商品名)、およびグリセロ糖脂質化合物(欧州特許第901463号明細書およびWO98/37916号明細書を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
適当なポリマーは、好ましくはポリアミドアミン(Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372−379)、樹枝状ポリマー(WO95/24221号明細書)、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン(WO96/02655号明細書)、ポリリシン(US−A−5 595 897号明細書またはフランス国特許第2 719 316号明細書)、キトサン(米国特許第5,744,166号明細書)、またはDEAEデキストラン(Lopata et al. Nucleic Acid Res. 12 (1984) 5707−5717)のようなカチオン性である。
【0068】
もう一つの態様では、本発明は、ターゲット細胞中で目的の遺伝子のSMC特異的に発現させるウイルス粒子の製造方法であって、
a) 本発明のウイルスベクターを許容細胞系に導入し、
b) 工程a)で得た許容細胞系を適当な時間適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子を産生させ、
c) 細胞培養物から上記ウイルス粒子を回収し、
d) 場合によっては、回収したウイルス粒子を精製する
工程を含んでなる、方法に関する。
【0069】
好ましい態様では、許容細胞系は、感染性ビリオンを産生するのに必要な総ての遺伝子産物をイン・トランスで提供する相補性細胞系である。
【0070】
本発明は、本発明によるベクター、好ましくはウイルスベクターを含んでなる、またはこのようなウイルス粒子の製造方法によって得ることができるウイルス粒子も提供する。
【0071】
アデノウイルス粒子は、相補性細胞系またはヘルパーウイルスであって、本発明のアデノウイルスベクターが欠陥を有するウイルス遺伝子をイン・トランスで供給するものを用いて、当該技術分野で任意の通常の手法によって調製し、増殖させることができる(例えば、Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols; E. J. Murray監修, The Human Press Inc, クリントン, ニュージャージー、またはWO96/17070号明細書に記載の方法)。細胞系293(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59−72)およびPERC6(Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 1909−1917)は、E1機能を補足するのに普通に用いられる。他の細胞系を作製して、二重に欠陥を有するベクターを補足した(Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559−565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6, 1575−1586; Wang et al., 1995, Gene Ther. 2, 775−783; Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2033; 欧州特許第919627号明細書およびWO97/04119号明細書)。アデノウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、リーシス後に細胞からも回収することができ、場合によっては標準的手法(例えば、WO96/27677号明細書、WO98/00524号明細書、WO98/26048号明細書、およびWO00/50573号明細書に記載のクロマトグラフィー、超遠心)によって更に精製することができる。
【0072】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下でまたはレトロウイルスベクターが欠陥を有するレトロウイルス遺伝子(例えば、gag/polおよびenv)をそのゲノム中に組込んで含む適当な相補性(パッケージング)細胞系で調製される。このような細胞系は、従来の技術に記載されている(Miller and Rosman, 1989, BioTechniques 7, 980; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6460; Markowitz et al., 1988, Virol. 167, 400)。env遺伝子の産物は、ターゲット細胞の表面上に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与しており、従って、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明に関連して、PA317細胞(ATCC CRL 9078)または両種指向性エンベロープタンパク質を含み、ヒトおよび他の種のターゲット細胞を感染させる293E16(WO97/35996号明細書)のようなパッケージング細胞系を用いるのが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましくは培養上清から回収され、場合によっては標準的手法(例えば、クロマトグラフィー、超遠心)によって更に精製することができる。
【0073】
ポックスウイルス粒子は、当業者が入手することができる多数の文献に記載されている方法で調製される(Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545−563;米国特許第4,769,330号明細書;米国特許第4,772,848号明細書;米国特許第4,603,112号明細書;米国特許第5,100,587号明細書および米国特許第5,179,993号明細書)。開発された主な手法は、poxDNA配列(所望な挿入部位を包含する)によって両側にフランクした本発明の発現カセットを含むドナープラスミドと野生型ポックスウイルスゲノムとの間の相同性組み換えを用いている。一般的に、ドナープラスミドは、E. coliで構築され、増殖によって増幅され、通常の手続きによって単離される。次いで、これはポックスウイルスゲノムと共に適当な細胞培養物(例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞)に導入され、相同組み換えによって本発明のポックスウイル粒子を産生する。それらは、培養上清またはリーシス工程(化学物質、凍結/融解、浸透圧衝撃、機械的衝撃、超音波処理など)後の培養細胞から回収することができ、必要ならば、連続的なプラーク精製処理によって野生型混入物質から単離し、当該技術分野の手法(クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたはスクロースグラディエント上での超遠心)を用いて精製することができる。
【0074】
本発明は、特定のターゲット細胞を優先的にターゲッティングする目的で修飾したベクターまたは粒子も包含する。(ポリマーおよび脂質と複合体形成したベクターのようなウイルスおよび非ウイルス性の)本発明の標的設定ベクター/粒子の特徴は、細胞および表面露出成分またはコラーゲンのような細胞外マトリックス(ECM)を認識し且つ結合することができるターゲッティング残基がその表面に存在することである(Hall et al., 2000, Human Gene Therapy 11, 983−993)。このようなターゲッティング残基としては、化学的接合体、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー(例えば、PEG、ポリリシン、PEIなど)、ペプチド、ポリペプチド(例えば、WO94/40958号明細書に記載のJTS1)、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。それらは、好ましくは細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識し且つ結合することができる。
【0075】
細胞型特異的ターゲッティングは、ウイルス表面タンパク質の修飾によって広汎な宿主範囲を有するウイルス由来のベクターを用いて行うことができる。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面にある細胞受容体への付着によって決定される。これに関して、アデノウイルスキャプシドの表面に存在する繊維およびペントンが、細胞付着に重要な役割を果たす(Defer et al. J. Virol. 64 (1990) 3661−3673)。従って、アデノウイルスの細胞ターゲッティングは、繊維および/またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝子修飾によって行い、ユニークな細胞表面受容体と特異的に相互作用できる修飾した繊維および/またはペントンを生成することができる。このような修飾の例は、文献に記載されている(例えば、Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221−8229 ; Amberg et al., 1997, Virol. 227, 239−244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660−668; WO94/10323号明細書)。例えば、アデノウイルス繊維をコードする配列中にEGFをコードする配列を挿入することによって、EGF受容体発現細胞をターゲッティングする。
【0076】
他の細胞特異的なターゲッティングの方法は、抗体または抗体断片をレトロウイルスエンベロープタンパク質に接合(Michael et al., 1993, J. Biol. Chem 268, 6866−6869; Roux et al., 1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 9079−9083; Miller and Vile, 1995, FASEB J. 9, 190−199, およびWO93/09221号明細書)、および核酸結合ドメインとターゲッティング残基を有するポリペプチドの接合(WO95/28494号明細書)によって行われている。
【0077】
本発明は、本発明による発現カセットまたはベクターを含んでなる、または本発明によるウイルス粒子によって感染した真核宿主細胞も提供する。本発明に関連して、「真核宿主細胞」という用語は、本発明で用いられるSMC特異的プロモーターおよび/または筋特異的エンハンサーに含まれるシス作用配列と相互作用できる1または数個の転写因子を含んでなる任意の細胞を表す。このような細胞は、ユニークな種類の細胞または異なる種類の細胞であってもよく、哺乳類由来の培養細胞系、一次細胞および増殖細胞を包含するが、ヒト由来のものが特に好ましい。好ましい真核宿主細胞としては、繊維芽細胞および筋細胞(例えば、心筋細胞、筋繊維芽細胞およびSMC、特に血管SMCが挙げられる。後者の中では、動脈SMCが特に好ましく、特に中間部および血管内膜SMCが好ましい。
【0078】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞、および場合によっては、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。特別な場合には、この組成物は、2種類以上の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞であって、(i)筋特異的エンハンサーおよび/または(ii)SMC特異的プロモーターおよび/または(iii)治療遺伝子および/または(iv)ベクター主鎖の性質が異なることがあるものを含んでなることができる。
【0079】
本発明による組成物は、全身、局所および局部化投与などの様々な投与用式のために通常の方法で製造することができる。全身投与には、注射、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、鞘内、心臓内(例えば、経心臓内(transendocardial)および心膜)、筋肉内、腫瘍内、肺内、気管内、冠動脈内または脳室内、および更に具体的には、血管内または動脈内注射が好ましい。投与は、単回投与または一定間隔を置いた1または数回の繰り返し投与で行うことができる。適当な投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば、治療を行う状態または疾患、疾患が進行した段階、予防または治療の必要性、および導入される治療遺伝子によって変化することができる。目安としては、ウイルス粒子を基剤とする組成物は、104〜1014iu(感染単位)の用量形態に処方することができ、有利には105〜1013iu、好ましくは106〜1012iuに処方することができる。力価は、通常の手法によって決定することができる。DNAベクターの用量は、好ましくは0.01〜10mg/kgであり、更に具体的には、0.1〜2mg/kgである。本発明の組成物は、例えば固形物(例えば、粉末、凍結乾燥形態)、液体(例えば、水溶液)などの様々な形態であることができる。
【0080】
好ましい態様では、本発明の組成物は、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなり、ヒトまたは動物の治療法に用いられる。この特別な場合には、キャリヤーは、好ましくは薬学上適当な注射可能なキャリヤーまたは希釈剤であって、用いられる投薬量および濃度ではヒトまたは動物体に毒性を持たないものである(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版 1980年, Mack Publishing Coを参照)。これは、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるように比較的低いイオン強度を有する。更に、これは任意の関連溶媒、滅菌した発熱物質不含水、分散媒、コーティング物質、および同等なものを含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤー、または希釈剤(例えば、Tris−HCl、酢酸塩、リン酸塩)、乳化剤、可溶化剤、またはアジュバントを含むことができる。医薬製剤のpHは、ヒトまたは動物での使用に適当なように適当に調整し、緩衝する。注射可能な組成物用のキャリヤーまたは希釈剤の代表例としては、水、等張食塩溶液であって、好ましくは生理学的pHで緩衝したもの(例えば、リン酸緩衝食塩水、Tris緩衝食塩水、マンニトール、デキストロース、ヒト血清アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質を含むまたは含まないグリセロール)が挙げられる。例えば、このような組成物は、10mg/mlのマンニトール、1mg/mlのHSA、20mMのTris,pH7.2、および150mMのNaClを含んでなることができる。
【0081】
更に、本発明の組成物は、脂質(例えば、カチオン性脂質、リポソーム、WO98/44143号明細書に記載の脂質)、ヌクレアーゼインヒビター、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ(WO98/53853号明細書)、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート化剤(欧州特許第890362号明細書)などの1個以上の安定化物質を含み、動物/ヒト体内での分解を保存し、および/またはベクターの宿主細胞へのトランスフェクション/感染を改良することができる。このような物質は、単独でまたは組み合わせて(例えば、カチオン性 および中性脂質)用いることができる。これは、ポリリシンとラクトース(Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871−878)またはポロキサマー407(Pastore, 1994, Circulation 90, I−517)とのゲル複合体などの動脈細胞での遺伝子導入を促進する傾向のある物質を含んでなることもできる。アデノウイルスタンパク質はエンドソームを不安定化し、DNAの細胞中への摂取を増進することができることも示されている。アデノウイルスを脂質と複合体形成したDNAベクターを含む溶液に混合すること、またはアデノウイルスに共有結合したポリリシンへのタンパク質架橋剤を用いるDNAの結合は、組み換え遺伝子の摂取および発現を実質的に改良することができる(Curiel et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247−252)。
【0082】
本発明の組成物は、特に、高血圧、アテローム発生、内膜過形成、血管形成術またはステント配置後の(再)狭窄、虚血、腫瘍性疾患(例えば、腫瘍および腫瘍転移)、良性腫瘍、結合組織疾患(例えば、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症)、目の血管形成疾患(例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障)、循環器疾患、脳血管疾患、糖尿病関連疾患および免疫不全症(例えば、慢性炎症または自己免疫)など、これらに限定されない血管(好ましくは動脈)および/または循環器に関連した障害、症状または疾患の予防または治療を目的とするものである。
【0083】
好ましい応用は、虚血性心疾患(急性または慢性)の予防または治療である。バルーン血管形成術は、閉塞した血管でバルーンを膨張させて、塞がった血管を開くことを伴う主要な治療法である。ステント配置を用いて、血流を回復させることも行われる。不運なことには、これらの治療法は、血管内壁を覆っている内皮細胞を傷つけ、SMCが再開通した血管に浸潤して二次的閉塞を引き起こすことが多い(再狭窄と呼ばれる過程)。ウイルス性の遺伝子治療を、この症例で応用して、バルーン血管形成術またはステント配置法によって生じた損傷にSMC増殖を阻害する産物をコードする治療遺伝子を送達することができる。
【0084】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核宿主細胞を用いる、遺伝子治療によるヒトまたは動物体の疾患の治療または予防のための薬剤の調製をも提供する。
【0085】
本発明の範囲内では、「遺伝子治療」とは、任意の発現可能な配列を細胞に導入する方法と理解すべきである。従って、これは、潜在的に抗原性を有するエピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性、または両方であることができる免疫応答を誘導することに関する免疫治療をも包含する。
【0086】
好ましい態様では、このような使用は、循環器疾患の治療または予防を目的とする。このために、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、カテーテル、ステントなどのこの病理学に適合した特定の送達手段によってヒトまたは動物体にイン・ビボで送達することができる。例えば、本発明の発現カセット、 ベクターまたはウイルス粒子をコーティングしたバルーンカテーテルまたはステントを用いることができる(Riessen et al., 1993, Hum Gene Ther. 4, 749−758; Feldman and Steg, 1996, Medecine/Science 12, 47−55)。本発明に関する使用に適するカテーテルは、Advanced Cardiovascular Systems (ACS)、Boston Scientific、IVT、Target TherapeuticsまたはCordisのような商業的供給業者から入手可能であり、またはフランス国特許第00 08751号明細書に記載されている。例えば、カテーテルを好都合に大腿動脈に導入し、腸骨動脈および腹部大動脈中を逆方向に冠動脈に通すことができる。これらの手法の詳細な説明は、文献に見出すことができる(例えば、Rutherford, Vascular Surgery, 第3版(Saunders Co 1989))。本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、外科手術後の動脈に直接送達することもできる。もう一つの代替法は、罹患した動脈に沿って治療薬を浸漬したグリッドフレームを導入する方法である(Feldman et al., 1995, J. Clin. Invest. 95, 2662−2671)。
【0087】
あるいは、本発明による発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を含むようにエクス・ビボで作製した真核宿主細胞を用いることもできる。このような要素の真核細胞への導入法は当業者に周知であり、微量のDNAの細胞核への微量投与(Capechi et al., 1980, Cell 22, 479−488)、CaPO4を用いるトランスフェクション(Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 27452752)、電気穿孔(Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311−1326)、リポフェクション/リポソーム融合(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413−7417)、および粒子衝撃(Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568−9572)が挙げられる。作製したSMCの移植を、本発明に関して行うこともできる(Lynch et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1138−1142)。
【0088】
本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法であって、上記生体に治療上有効量の本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核細胞を投与することを含んでなる方法にも関する。
【0089】
「治療上有効量」とは、治療が所望な疾患または状態に普通に関連した1以上の症状の緩和に十分な容量である。予防的使用に関するときには、この用語は、疾患または状態の発症を予防または遅延させるのに十分な容量を意味する。
【0090】
本発明の方法は、上記疾患または状態の予防目的および治療応用に用いることができる。本発明の方法は、本明細書に記載の方法と類似の方法を用いて再狭窄の発症を防止しまたは血管形成術またはステント配置手続きの後の再狭窄を後退させる上で特に有用である。本発明の方法は、多種多様な方法のいずれによって行うこともできるものと理解すべきである。有利には、本発明の発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、任意の通常の生理学的に許容可能な投与経路によって、例えば、動脈内注射によってまたは血管系への適当なカテーテルなどによってイン・ビボで直接投与することができる。あるいは、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を細胞中に導入し、トランスフェクション/感染細胞をイン・ビトロで増殖させた後、それらを治療を行う患者に再導入することからなるエクス・ビボ法を採用することもできる。
【0091】
トランスフェクション率を改良するために、患者はマクロファージ枯渇治療を行った後に本発明の組成物を投与することができる。このような手法は、文献に記載されている(例えば、Van Reopen et al., 1997, TibTech, 15, 178−184)。
【0092】
本発明の方法で自殺遺伝子を発現する発現カセットを含んでなる医薬組成物を用いるときには、発現した自殺遺伝子産物に特異的なプロドラッグの薬学上許容可能な量を追加的に投与するのが有利であろう。2回の投与を同時にまたは連続的に行うことができるが、好ましくはプロドラッグは本発明の組成物の後に投与する。例えば、50〜500mg/kg/日のプロドラッグ用量を用いることができるが、200mg/kg/日の用量が好ましい。プロドラッグは、標準的実施法に従って投与される。経口投与が好ましい。単回用量のプロドラッグ、または宿主生体またはターゲット細胞内に毒性代謝物を産生させるのに十分な時間反復される用量を投与することができる。上記のように、プロドラッグであるガンシクロビールまたはアシクロビールをTK HSV−1遺伝子産物と組み合わせて、および5−FCをシトシンデアミナーゼおよび/またはウラシルホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物と組み合わせて用いることができる。
【0093】
疾患または状態の予防または治療は、本発明の方法を単独でまたは所望ならば現在利用可能な方法(例えば、放射線、化学療法、および血管形成術のような外科手術)と組み合わせて用いて行うことができる。
【0094】
本発明は、本発明によるキメラ構築物、SMC特異的プロモーター、発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を用いる、SMC、好ましくは動脈SMC、特に中間部および/または血管内膜由来のSMCでの特異的発現をも提供する。
【0095】
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスであって、本発明による発現カセットまたはベクターをそのゲノムに組込んで含んでなるものも提供する。このような動物は、通常のトランスジェネシス(transgenesis)法によって生成させることができ、且つ治療遺伝子の潜在的効果または活性、または本発明の発現カセットに含まれるSMC特異的プロモーターおよび/または筋特異的エンハンサーの調節を検討するためのモデルとして用いることができる。
【0096】
本発明を例示的に説明してきたが、用いてきた用語は単語に性質が制限よりはむしろ説明を目的とするものであることを理解すべきである。明らかに、本発明の多くの修飾および変更が、上記教示の観点で可能である。従って、特許請求の範囲内では、本発明は、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で実施することができることを理解すべきである。
【0097】
上記で引用した特許明細書、公表文献およびデーターベースの記載事項の総ての内容は、それらの個々の特許明細書、公表文献または記載事項が具体的且つ個別的に引用されるのと同程度にその開示の一部として本明細書に引用される。
【0098】
下記の例により、本発明を説明する。
例
発現カセット
下記の様々な構築物に用いるアデノウイルスゲノム断片は、Chroboczek et al. (1992, Virol. 186, 280−285)に開示されているAd5ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれらの位置に従って正確に得られる。
【0099】
標準的クローニング法(Sambrook et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)を用いて、下記の発現カセットを生成させた。
【0100】
AdCMVeGFPを、ヒトCMV前初期エンハンサー/プロモーター (Boshart et al., 1985, Cell 41, 521−530)に続いてeGFP配列をE1欠失領域に挿入することによって構築した(Cormack et al., 1996, Gene 173, 33−38)。
【0101】
AdSM22eGFP、AdSM−MHC/SM22eGFP、AdCK/SM22eGFPは、p445nlzから単離したCMVプロモーターを510bpのネズミSM22αプロモーター(転写開始部位に対して−445〜+65)で置換することによって得た(Moessler et al., 1996, Development 122,2415−2425)。次に、ネズミSM22αプロモーターを、ヒト筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー(CKenh;−919〜−711)(配列番号:3; Trask et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 17142−17149)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(SM−MHCenh−1332〜−1225;配列番号:2)(Kallmeier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 30949−30957)と組み合わせた。これらのエンハンサーをPCRによって単離し、プロモーターのすぐ上流にクローニングした。PCR増幅法は、当業者には知られている(例えば、PCRプロトコール−方法および応用の指針(PCR protocols − A guide to methods and applications), 1990, Innis, Gelfand, Sninsky and White著, Academic Pressを参照されたい)。簡略に説明すれば、PCR反応は、鋳型として1μgのヒト(CKenh)またはウサギ(SM−MHCenh)ゲノムDNA、50pmolの下記の特異的プライマー:CKenhフォワード5’−AACCGCTCGAGGGCCACCCAGGGCCCCGTG−3’(配列番号:4)、CKenhリバース5’−TTCCGCTCGAGCTCGGTCGCCGGGAAAGGAG−3’(配列番号:5)、SM−MHCenhフォワード5’−AACCGCTCGAGGCGCGGGGTGCAGGGTGC−3’(配列番号:6)、SM−MHCenhリバース5’−TTCCGCTCGAGAATTCCCAGCG CCGCATACCA−3’(配列番号:7)、250μMのdNTP(Sigma,サン・ケンチン・ファラビェール,フランス)および2.5UのTaq−DNAポリメラーゼ(Qiagen, クルタベーフ, フランス)を用いて行った。増幅は、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間で50サイクル行った。
【0102】
AdSM22IFNγ、AdSM−MHC/SM22IFNγ、AdCK/SM22IFNγは、eGFP配列をRT−PCRによって単離したラットIFNγ配列(Genebank受託番号AF010466)で置換することによって得た。簡単に説明すれば、総RNAは、TRIZOL Reagentを用いて製造業者(Sigma)の指示に従ってラット脾臓から抽出した。2μgの総RNAを、ランダムプライマーp(dN)6(Roche−Diagnostics, メイラン, フランス)100pmolの存在下で70℃で10分間変性した後、逆転写酵素(SuperScript II, Life Technologies)200UおよびそれぞれのdNTP0.1mMの存在下にて、37℃で90分間20μlの最終容積で逆転写した。反応は、混合物を95℃で5分間加熱することによって停止した。増幅は、上記と同様にして2種類の特異的プライマー(IFNγ フォワード: 5’−AACCGGAATTCCGGATGAGTGCTACACGCCGCGT3’(配列番号:8)、IFNγリバース 5’−TTCCGGAATTCCGGTCAGCACCGACTCCTTTTCC3’(配列番号:9)(Genebank受託番号AF10466)を用いて行った。
【0103】
ラウス肉腫ウイルス(RSV)3′の長い末端反復プロモーターによって操作されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むAdRSVLacZは、以前に報告された(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。AdSM22LacZは、RSVプロモーターを510bpのSM22αプロモーターで置換することによって得た。
【0104】
AdAPEG−lenh/SM22eGFPは、ヒトAPEG−1遺伝子のエンハンサーをネズミSM22αプロモーターと組み合わせることによって得た。プライマー1(配列番号:10; 5’TCGAGCTTCCCCTCCCCCCAGGGCTGGCTC 3’)およびプライマー2(配列番号:11; 5’CAGCTGAGGCCCCGCACTGAGCCAGCCCTGGGGGGAGGG−GAAGC3’)25pmolを30μlの最終容積で混合した。温度を5分間で95℃まで増加し、溶液をゆっくり室温に戻した。同時に、この操作をプライマー3(配列番号:12, 5’AGTGCGGGGCCTCAGCTGGGTCAGCGAGTGAGTGGGGCTGGCCAGG−CTGAG3’)および4(配列番号:13; 5’TCGACTCAGCCTGGCCAGCCCCAC−TCACTCGCT GACC 3’)について行った。次に、これらの対1/2および3/4を、同じプロトコールを用いてハイブリダイゼーションした。最終生成物は、5′末端に開いたXhoI制限部位と3′末端に開いたSalI部位を示す。それらを用いて、ユニークSalI部位においてSM22αプロモーターに対してすぐ5′のAPEG−1エンハンサーをクローニングした。
【0105】
ヒトSM22αプロモーターは、上記のように鋳型としてヒトゲノムDNAおよび配列番号:15(フォワード)および16(リバース)に記載のプライマーを用いてPCRによって単離した。SalIおよびEcoRVによって消化された増幅断片を、ネズミプロモーターの代わりにSalIおよびEcoRVによって制限されたAdSM22eGFPでクローニングした。CKおよびMHCエンハンサーを、上記のようにヒトSM22αプロモーターに組み合わせた。
【0106】
エンハンサー配列を含むネズミカルポニン遺伝子のイントロンIは、鋳型としてマウスゲノムDNAおよび配列番号:17(フォワード)および18(リバース)に記載のプライマーを用いて、前に記載した実験条件下で行ったPCRによって単離した。ネズミカルポニンエンハンサーを、ヒトSM22αプロモーターの下流(3′)に挿入して、目的のレポーターeGFP遺伝子または治療遺伝子を発現させることができる。
【0107】
ウイルスの構築、産生および滴定
総てのウイルスベクターを、以前に報告されているように(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805−4810)、Escherichia coli BJ5183(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557−580)中で相同組み換えによって感染性プラスミドとして構築した。それらは、総てE1領域(ヌクレオチド459〜ヌクレオチド3327)およびE3領域(ヌクレオチド28593〜ヌクレオチド30469)において欠失を有した。筋特異的エンハンサーを有するまたは持たないプロモーター配列に続いてレポーターまたは治療遺伝子およびSV40ポリアデニル化シグナルを含む発現カセットは、E1に位置した。幾つかのベクター(表1参照)は、プロモーターとコード領域との間に挿入されたキメライントロンを含んでいた。このイントロンは、ヒトβ−グロブリンイントロン1由来のスプライスドナーとpCIプラスミド (Promega, シャルボンニェール, フランス)から得たIgG介在配列由来のスプライス受容体とを組み合わせることによって生成した。アデノウイルス主鎖に対する発現カセットの2つの配向を評価した。アデノウイルスプラスミドを最初にPacIで消化して、アデノウイルスゲノムを放出した後、293相補性細胞系(ATCC CRL1573)でトランスフェクションした。ウイルス増殖、精製、およびウイルスDNA結合タンパク質の間接免疫蛍光による感染単位(iu)の滴定は、以前に報告されている方法で行った(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。精製したウイルスは、ウイルス保管緩衝液(1Mスクロース、10mM Tris−HCl[pH=8.5]、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.005%[容積/容積]Tween 80)中に保管した。
【0108】
細胞および培養条件
一次ラット胸部大動脈SMCおよび一次ブタ冠動脈SMCを、SMC細胞として用いた。ヒト肺上皮 A549およびネズミ筋原細胞C2C12細胞系を、非SMCコントロールとして用いた。ラット胸部大動脈SMCは、正常ラット(ラットAo)およびバルーンカテーテルによる内皮除去(deendothelialization)から15日経過した損傷ラット(ratIT15)から以前に報告されている酵素消化によって単離した(Orlandi at al., 1994, Arterioscler. Thromb. 14, 982−989)。ブタ冠動脈SMCは、正常ブタ(pigCo)およびステント配置から15または30日経過した損傷動物から以前に報告されている酵素消化によって単離した(Christen et al., 1999, Circ. Res. 85, 99−107)。A549およびC2C12細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection; ATCC CCL−185およびCRL−1772, マナサス, バージニア)から購入した。細胞は、感染中および後であって、それらを2%FCS含有培地(C2C12を10%FCS中に保持して融合を防止した)で増殖させたことを除き、10%FCS含有DMEM(Life Technologies, セルジュ−ポントワーズ, フランス)中で培養した。ヒトSM細胞 (Hu CoおよびHu Ao)およびHUVECはBiowhittaker Inc(ウォーカーズビル, メリーランド21793, アメリカ合衆国)から得て、製造業者の指示に従って培養する。
【0109】
イン・ビトロ実験
様々な細胞型のアデノウイルス感染の感染性を、AdCMVeGFPの様々な感染多重度(MOI)を用いて決定した。2×105個の細胞/ウェル(C2C12: 細胞数を5×104個にして融合を防止)をD0に6ウェルプレート(Falcon, Becton Dickinson, ポン・ドゥ・クレス, フランス)に播種し、D1で感染させ、D2で収穫した。それらを、4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)で5分間固定し、PBSで2回洗浄し、293gで5分間遠心分離し、1mlPBSに再懸濁した。細胞の発現率を、フローサイトメトリー (FACSCalibur, Becton Dickinson)によって決定した。更に、eGFPを用いるイン・ビトロ実験を、最適MOI(例えば、有意な毒性のない感染細胞の比率を最高にするMOI)で行った。感染細胞100%に相当するMOIでも、ラット、ネズミおよびヒト細胞について、毒性効果は見られなかった(ラットAo: MOI300;ラットIT15:MOI10;A549:MOI50;およびC2C12:MOI100)。ブタSMCについては、細胞の50%だけが感染したが、毒性はなかった(ブタCo:MOI200;ブタIT15:MOI500)。
【0110】
eGFP発現の定量分析は、フローサイトメトリーによって行った。簡単に説明すれば、細胞を、D4で回収したことを除き上記と同様に感染させ、eGFPを蓄積した。様々な調節配列の強度を、GFP陽性細胞の百分率と平均蛍光値との積として計算した総蛍光係数(GFI)を用いて測定した(Massie et al., 1998, Cytotechnology 28, 53−64)。細胞増殖阻害実験については、D0に細胞を6ウェルプレート(Falcon, Becton Dickinson)に3×104個の細胞/ウェルの密度で播種し、D1にAdSM22IFNγ、,AdSM−MHC/SM22IFNγ、AdCMVIFNγに感染させた。培養物を10%FCS含有培地に保持し、細胞をD4に計数した。培地の試料をD3に回収し、ELISAキット(Quantikine MラットIFNγ, R & D systems, アビングドン, 英国)を用いて分泌されたラットIFNγを定量した。
【0111】
イン・ビトロでのマウスへの遺伝子導入
9週齢の雌の免疫適格マウス(C57BL/6, Iffa−Credo, ルアーブル, フランス)を用いて、SM−特異的発現カセットの発現パターンを検討した。D0で、アデノウイルスベクターを2×109iu/100μl保管緩衝液の用量で静脈内投与し、臓器(肝臓、肺、脾臓および心臓)を取り出し、2%ホルムアルデヒドを含有するPBS中で固定した。eGFP発現を、蛍光顕微鏡によって評価した。
【0112】
イン・ビボでのラット頸動脈への遺伝子導入
成熟した雄のWistarラット(体重>400g)を実験に用いた(Iffa−Credo)。麻酔は、ケタミン(Imalgene, RhoneMerieux, リヨン, フランス)およびアセプロマジン(Vetranquil 0.5%, Sanofi, Libourne, フランス)をそれぞれ23.1および3.84mg/kgの用量で腹腔内投与して行った。ヒトヘパリン(Choay, Sanofi Winthrop, Gentilly, フランス)200U/kgを静脈内投与して、動物の血液凝固を阻害した。左総頸動脈を外科手術により露出させ、左外頸動脈について動脈切開を行った。内皮除去(deendothelialization)は、0.2mlの空気を満たした2F Fogartyバルーンカテーテル(Baxter, Maurepas, フランス)を3回通すことによって行った。1cmの長さの頸動脈の切片をマイクロサージャリークランプで単離し、24ケージ度のカテーテルを動脈切開によって通した。切片を0.2mlの0.9%NaClで洗浄し、アデノウイルス溶液(2×109iu)を注入した。この溶液を頸動脈で5分間停止させ、その間に頸動脈切片は膨張したままであった。溶液を抜き取り、外頸動脈を結紮し、総および内頸動脈中に血流を回復させた。ラットを、異なる実験に従って様々な時点で塗擦した。致死量のペントバルビタールを投与し、心挿管の後、血管に1×PBS溶液を灌流させ、2%または4%ホルムアルデヒド/PBSで正常血圧で灌流を固定した。次いで、頸動脈を摘出し、様々な組織学的分析のために処理した。
【0113】
組織学および免疫細胞化学分析
SM22αの免疫組織化学染色は、4%ホルムアルデヒドで固定しパラフィン埋設した頸動脈の4μmの厚みの切片について行った。切片からパラフィンを除去し、3%H2O2を含む蒸留水に10分間浸漬した。次に、切片を、E−1I SM22αマウスモノクローナル抗体(Dr. S. Sartoreより厚意により提供を受けた; Faggin et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19, 1393−1404)を1:100の希釈倍率で用いて、室温にて1時間インキュベーションした。二次抗体は、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体であり、1:100の希釈倍率で用いた。SM22αの存在は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体ペルオキシダーゼ法によって確かめた(LSABキット, Dako, トラプス, フランス)。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色した。β−ガラクトシダーゼ活性については、2%ホルムアルデヒドで固定した血管をPBSで洗浄し、5mM K3Fe(CN6)、5mM K4Fe(CN6)、2 mM MgCl2、1mg/ml 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)中で37℃にて24時間インキュベーションした。次に、頸動脈をPBSで洗浄し、5%ホルムアルデヒド/PBS中で4℃にて24時間後固定し、脱水して、パラフィンに埋設した。5μm切片を、青色核染色について検討した。形態学的分析については、4%ホルムアルデヒドで固定した動脈をパラフィンに埋設した。5μm切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。中間部および血管内膜面積並びに細胞数を、画像分析によって評価した(Scion Image)。
【0114】
ウイルスDNA分析
総DNAを、以前に報告されている方法で臓器から抽出した(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。DNA(10μg)をSalIによって消化し、総eGFPcDNAに相当する32Pを標識した制限断片を用いてサザンブロット法によって分析した。DNAの性質および量は、導入の前にケージを臭化エチジウムで染色することによって観察した。
【0115】
統計分析
総ての結果は、平均値±SEMとして表した。統計学的評価のため、これらの結果をt−検定によって分析した。差は、P<0.05の値で統計学的に有意であると考えた。
【0116】
例1:アデノウイルスに関するネズミSM22αプロモーターの機能性および特異性
表1にまとめたように、4種類のアデノウイルス構築物を、ヒトアデノウイルス節制型5のE1欠失領域におけるSM22αプロモーターによってのみ発現するeGFP発現カセットを挿入することによって生成した。アデノウイルスの内調節要素との相互作用を防止および/または検出するため、カセットを2つの配向のそれぞれでクローニングした。mRNAを安定化させるイントロンの効果も試験した。
【0117】
【表1】
【0118】
A.SMCおよび非SMC細胞系のアデノウイルスへの感染性
ラット大動脈およびブタ冠動脈由来のSMCおよびA549コントロール細胞のアデノウイルスへの感染性を、1〜1000の範囲のMOIでAd−CMV/eGFPを用いて感染させることによって決定した。非毒性MOIでは、50%のブタ細胞しか感染しなかった。例えば、MOI500〜MOI700では、それぞれ50±2%および56±2%のブタIT15に感染した細胞の数には有意な変化は見られなかった。最適感染(ラット細胞について100%、およびブタ細胞について50%)に相当するMOIはラット血管内膜細胞についての10からブタIT15細胞についての500まで変動したので、SMC感染に大きな変動が見られた。
【0119】
感染性が異なることにより、細胞を4種類のアデノウイルスベクターに感染させ、eGFP発現を蛍光顕微鏡によって評価した。マウスSM22αプロモーターによって発現される4種類の構築物を比較したとき、発現レベルは強度および特異性に関して有意差は見られなかった。実際に、発現は総てのSMCで検出されたが、A549では発現はほとんどまたは全く見られなかった。次に、AdSM22eGFPを選択して、更にイン・ビボ実験を行った。これは、アデノウイルス主鎖に対してセンス配向でSM22αプロモーターによって行われ且つイントロンを備えたeGFP発現カセットを含んでいる。
【0120】
B.SM22αプロモーター活性に対する細胞分化の効果
A549、ラットAoおよびラットIT15に、50%および100%感染細胞に相当するMOIでAdSM22eGFPまたはコントロールAd−CMV/eGFPを0日目に感染させた。次に、これらの細胞を、2%(分化状態)または10%(増殖状態)FCSを含む培地で3日間培養し、SM22αによって行われるeGFP発現に対する細胞分化の効果を検討した。予想されたように、eGFP発現が強度は異なったがAd−CMV/eGFPに感染した総ての細胞型で見られた。AdSM22eGFPに感染すると、非SM細胞系(A549)はeGFP蛍光を欠いた。一方、ラットAoでは、特に低血清条件で強い蛍光が見られたが、高濃度の血清を含む培地では減少した。ラットIT15では、蛍光は低血清条件にのみ見られた。これらのデーターは、SM22αによって行われる発現がアデノウイルスベクターに関してSMC特異的のままであることを示している。高濃度の血清の存在下で蛍光がないかまたは減少することは、SMCにおいて、SM22αプロモーターが少なくとも細胞分化状態に関して示差的に調節されることを示している。
【0121】
C.SM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
マウスSM22αプロモーターによって駆動されるeGFP発現を、2種(ブタおよびラット)であって、正常(大動脈Aoおよび冠Co)または再狭窄(IT15)のSMC、および非SMC(A549)における強力なCMVプロモーター/エンハンサーで得たeGFP発現レベルと定量的に比較した。細胞を高密度で播種し、最適感染(ブタ50%、ラット100%)に相当するMOIで翌日感染させた。eGFP発現のレベル(eGFPを発現する細胞の画分およびその蛍光強度)を、3日後にフローサイトメトリーによって分析した。CMVおよびSM22αプロモーターの相対強度を総蛍光係数を用いて比較し、図1に示す。
【0122】
CMVによって行われる発現の総蛍光係数は、試験したそれぞれの細胞型で100%で任意に設定した。SM22αプロモーターに関しては、弱いeGFP発現がA549細胞(CMVによる発現の2.0%)で見られた。総てのラットおよびブタSMCでは、マウスSM22αプロモーターは、一層高いeGFP発現を生じ、ラットAoでの5.7%、ブタCoでの6%、ラットIT15での8.8%からブタIT15での15.3%までの範囲であった。
【0123】
D.MOIのSM22αによって行われる発現への影響
NKκB因子の刺激により、ヒトVSMC(Cleesham et al., 1998, Gene Ther. 5, 174−180)またはHepG2のような確立した細胞系(Loser et al., 1998, J. Virol. 72, 180−190)で示されるように、ウイルス荷重が細胞生理学およびプロモーター活性に影響を与えることがあることが示唆されている。従って、CMVプロモーターは多くの他のプロモーターと同様に、完全に活性なNFκBの存在によって変化する。
【0124】
高ウイルス荷重の導入遺伝子発現に対する影響を決定するため、ラットAo、ラットIT15、ブタCoおよびブタIT15を、最適感染を行うウイルス用量(ラットIT15ではそれぞれMOI10、50および100、ラットAoではMOI300および500、ブタCoではMOI200、300および400、およびブタIT15では500、600および700)から開始する異なるMOIで感染させた。
【0125】
ラットAoおよびブタCoでは、ウイルス用量を増加したところ(それぞれMOI300〜500およびMOI200〜400)、SM22αプロモーター によって行われる発現は5倍に増加したが、CMVによって行われる発現は変化しないままであった。ラットIT15では、eGFP発現はCMVおよびSM22αプロモーターのいずれでもウイルス用量と共に異なる比率であるが増加した。ウイルス濃度の10倍の増加(MOI10から100)により、SM22αプロモーターを用いる蛍光では3倍の利得があり、CMVでは8倍になった。同様に、ブタIT15では、eGFPをSM22αプロモーターよりはCMVプロモーターによって制御するときに、蛍光は一層速やかに増加した。MOIを500から700へ増加しても、SM22α関連発現には有意な変化はなく、このときCMVプロモーターでは発現は2倍の強さであった。
【0126】
中間部細胞(AoおよびCo)と比較して血管内膜細胞(IT15細胞)の増殖状態が高いことにより、ウイルスおよび細胞プロモーターの調節に影響すると思われる。これは、必要な転写因子の存在下での主要な差によることがある。従って、SM22αとCMVプロモーターの厳密な比較には、最適感染に相当するMOIおよび重複感染が回避される条件下での分析が必要である。
【0127】
例2:SM22αプロモーターイン・ビボ評価
A.マウスにおけるSM22αプロモーター特異性の評価
静脈内または動脈内投与の後の血液循環におけるアデノウイルスベクターの散在は、特にそれらを潜在的に有害な治療遺伝子(例えば、細胞傷害性)を送達するのに用いるときには、重要な問題である。SM22αによって駆動される発現が主要なアデノウイルスの天然のターゲット臓器(例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓)の一つでは起こらないことを立証するため、SM22αプロモーターを含む4種類のアデノウイルス構築物(表1参照)をC57B16免疫適格マウスに投与した。Ad−CMVeGFPベクターおよびTris−HCl注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。4匹のマウスにそれぞれの構築物2×109iuを静脈内投与し、eGFP発現を様々な臓器の蛍光顕微鏡検査によって3日後に決定した。サザンブロット法分析を、アデノウイルス特異的プローブを用いて上記臓器から抽出したDNAで行った。総てのマウスで同様なウイルスDNA量が認められ、正確な感染を示していた。
【0128】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、SM22αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、マウスSM22αプロモーターの組織特異性が確かめられる。この特異性は発現カセット配向から独立しており、アデノウイルス配列はイン・ビボでプロモーター特異性を妨げないことを示していた。
【0129】
B.ラット頸動脈損傷モデルでのSM22αプロモーターの評価
アデノウイルスベクターの治療能を評価するため、RSV(Ad−RSV/LacZ)またはSM22α(Ad−SM22/LacZ)プロモーターの制御下でLacZ細菌性遺伝子を含む2種類のアデノウイルスベクターを、例1に記載の通りに生成させ、ウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈を損傷したラットモデルの頸動脈から単離した切片に2・109iuを5分間点滴した。7日後、Ad−RSV/LacZ およびAd−SM22/LacZに感染した頸動脈を、β−ガラクトシダーゼについて染色した。
【0130】
これらのウイルスに感染した総ての検討した血管は、中間部に青色染色を示し、発生期の血管内膜には青色細胞はほとんど見られなかった。感染中間部細胞は、一般的に血管内膜構成によって取り囲まれている。これらの結果から、Ad−SM22/LacZは病的条件においてもSMCターゲット細胞に感染することができることが確かめられる。
【0131】
要するに、これらのデーターは、SM22αプロモーターはアデノウイルスに関連してイン・ビトロおよびイン・ビボでレポーター遺伝子(eGFPおよびβ−ガラクトシダーゼコード遺伝子)のSMC特異的発現を生じることを示している。中間部および血管内膜起源のラットおよびブタSM細胞で試験したところ、このプロモーターは、強力なウイルスCMVエンハンサー/プロモーターの6〜15%の発現レベルを示した。
【0132】
例3:アデノウイルスに関連したキメラSM22αプロモーターの機能性および 特異性
A.キメラSM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
SM22αプロモーターをCKまたはMHCエンハンサーと結合するキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にレポーター遺伝子としてのeGFPコード遺伝子を用いてイン・ビトロで試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、次にそれらを正常(ラットAo)、再狭窄(ラットIT15)SM細胞および非SM細胞(A549)での強力なCMVエンハンサー/プロモーターと比較した。比較を容易にするため、CMVによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に100%に設定した。比較データーを、図2に示す。
【0133】
A549での非特異的発現レベルは、いずれのキメラ構築物でもマウスSM22αプロモーターのみと比較して減少する(A549では、それぞれ0.5%対2%)CKエンハンサーの存在により、ラットAoおよびラットIT15ではeGFP発現が約3倍だけ増加し、それぞれCMV関連発現の15.8%および21.3%となった。MHCエンハンサーを組込んだベクターは、いずれの型のSMCでも一層高い発現レベルを生じ、ラットAoではCMV発現の16.9%となり、ラットIT15では23.5%となった。
【0134】
CKエンハンサーが骨格筋に由来するため、キメラベクターをネズミ筋原細胞中でC2C12細胞系を用いても試験した。意外なことには、eGFP蛍光の強度は試験した総ての構築物(SM22αプロモーター単独またはCKまたはMHCエンハンサーと組み合わせたもの)で同じであり、A549細胞系で観察された強度と同じ範囲であった(CMVプロモーターの約1.7%)。コントロールとして、CMVエンハンサー/プロモーターによって行われるeGFP発現が、高レベルで観察される。従って、CKenhをマウスSM22αプロモーターと組み合わせてSMC特異性に有利になるようにすると、骨格特異性は失われる。これらのデーターから、MHCenh/SM22αおよびCKenh/SM22α キメラベクターのSMC特異性が立証される。
【0135】
B.キメラベクター関連発現に対する細胞分化の効果
SM22αを単独でまたはCKまたはMECエンハンサーと組み合わせて含む構築物を、2または10%FCSの存在下で培養したラットAo中で試験し、発現に対する細胞増殖/分化の効果を測定した。総ての構築物を、CMVプロモーター/エンハンサーのような高濃度の血清の存在下でダウンレギュレーションした。従って、筋特異的エンハンサーCKおよびMHCをマウスSM22αプロモーターと結合するキメラ構築物は、分化マーカー(SM22α、SM−MHC、α−アクチン)の自然なレギュレーションに続き、分化した細胞で一層活性である。
【0136】
C.ラットIFNγを発現するアデノウイルスベクターのイン・ビトロ評価
MHCエンハンサーに結合したSM22αプロモーターによって行われるラットIFNγ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを、(それらの増殖を高めるため)10%FCSを含む培地で培養したラットIT15細胞でSMC増殖を防止する能力について試験した。ラットIT15感染も、CMVpro/アデノウイルスベクター(正のコントロール)およびCMVpro/eGFPアデノウイルスベクター(負のコントロール)を用いて行った。図3に示される結果は、観戦後のD4における増殖阻害率として表される。
【0137】
これらのキメラプロモーターの制御下でIFNγを発現するアデノウイルスを用いて得たラット細胞の増殖阻害は、CMVプロモーター/エンハンサーを含むウイルスで生じたものと同じ範囲であるかまたは若干高い(54%対59%)。負のコントロール(CMVpro/eGFP)で感染すると、感染していない細胞と比較して統計的には有意ではない弱い増殖阻害を生じた。
【0138】
感染細胞の上清を3日目に回収し、ELISAによって試験し、ラットIFNγ濃度を測定した。キメラMHCenb/SM22αプロモーターで得たIFNγ濃度を9ng/mlと評価し、CMVプロモーター/エンハンサーでは31ng/mlであった。
【0139】
例4:マウスでのキメラベクターのイン・ビボ評価
A.マウスにおけるSM22αプロモーター特異性の評価
肝臓、肺、脾臓および心臓でのeGFP発現は、例2に記載した通りにC57B16免疫適格マウスの尾静脈にSM22αを単独でまたはCKまたはMHCエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス2×109iu、Ad−CMV/eGFP(正のコントロール)またはTris−HCl(負のコントロール)を投与することによってチェックした。4匹の動物全部を、構築物に対して試験した。
【0140】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは、試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、SM22α含有ベクターを投与した総てのマウスは蛍光を全く示さなかった。
【0141】
SM22αに結合したCKエンハンサーのキメラ構築物を含むアデノウイルスの非平滑筋で遺伝子発現を指示する能力も検討した。AdCKenh/SM22eGFP 2×109iuを、C57B16免疫適格マウスに筋肉内経路(前頸骨筋)で投与した。AdCMVeGFPを、正のコントロールとして用いた。eGFP発現によって誘導された蛍光を、筋肉切片の顕微鏡観察によって評価した。AdCKenh/SM22eGFPを投与したマウスは蛍光を示さなかったが、Ad−CMV/eGFPを投与した総ての動物は骨格繊維の強い蛍光を示した。
【0142】
これらの結果により、本発明のキメラ構築物のSMCに限定された特異性が確認される。
【0143】
B.ラット損傷モデルでのキメラプロモーター/エンハンサーの評価
MHCエンハンサーに結合したSM22αプロモーターによって行われるラットIFNγの増殖抑制効果を、上記の例2で記載した通りにラット頸動脈バルーン損傷モデルで評価した。アデノウイルス2×109iuを、ラットの損傷頸動脈に局所投与した。コントロールラットには、CMVpro/IFNγ含有アデノウイルスを投与した。
【0144】
MHCenh/SM22αプロモーターまたはCMVプロモーターによって行うと、ラットIFNγはラット頸動脈モデルにおける血管内膜の肥厚化を部分的に阻害した。この阻害は、中間部面積が総ての群で同じままで、発現カセットを欠くコントロールアデノウイルスを注入したコントロールと比較して損傷が35%になって14日後に分析した。
【0145】
これらのデーターは、マウスSM22αプロモーターに結合した特異的なエンハンサー(MHCまたはCK)を有するキメラ構築物により、イン・ビトロでのCMVプロモーター/エンハンサー発現の25%まで到達する有意な一層強い特異的発現を生じた。イン・ビボでは、発現は動脈SMCに限定され、肝臓、脾臓、肺、心臓および骨格筋には検出可能なシグナルは見られなかった。ラットIFNを有するキメラベクターは、イン・ビトロでのラット大動脈およびIT15細胞の増殖を阻害するのに有効であった。更に、この増殖阻害は、CMVエンハンサー/プロモーターと同程度の強さであった。総合すると、これらのデーターは、本発明のキメラエンハンサー/プロモーター構築物が血管増殖疾患における治療遺伝子の特異的な発現に有用であることを示唆している。
【0146】
例5:アデノウイルスに関連してヒトSM22αプロモーターを供給した発現カセットの機能性および特異性
A.キメラヒトSM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
ヒトSM22αプロモーター、またはヒトSM22αプロモーターをCKまたはMHCエンハンサーと結合したキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にイン・ビトロでeGFPコード遺伝子をレポーター遺伝子として用いて試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、正常(ラットAo、ブタCo、huAo、huCo)、再狭窄(ブタIT15、ブタIT30)SM細胞および非SMHUVEC細胞中で強いCMVエンハンサー/プロモーターと比較した。比較を容易にするため、CMVによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に100%に設定した。ラットおよびブタ細胞に関する比較データーを、図4に示す。
【0147】
ラットAoでのヒトSM22α(hSM22α)プロモーターによって行われる発現は強く、CMV関連発現の約71%に達した。この発現はMHCエンハンサーまたはCKエンハンサーを添加することによってごくわずかであるが増加し、それぞれCMV関連発現の80%および97%となった。同様の結果がブタCoで見られ、eGFP発現をそれぞれhSM22αプロモーター、SM−MHC/hSM22αプロモーターおよびCK/hSM22αプロモーターで行った時には、CMV関連発現の110%、114%および170%となった。ブタIT15およびブタIT30では、hSM22αプロモーターによって行われる発現は、それぞれCMVプロモーター/エンハンサーで得られるものの約50%(ブタIT15)および70%(ブタIT30)である。発現レベルは、hSM22αプロモーターをMHCエンハンサーと関連させるときにはいずれの細胞でも同じ範囲のままであり、CKエンハンサーと関連させると若干増加する。
【0148】
予想されるように、総てのhSM22αプロモーター含有構築物を有する非SMHUVEC細胞では、eGFP発現のバックグラウンドしか検出されなかった(CMV関連発現の0.05%未満)。
【0149】
ヒト細胞(HuAoおよびHuCo)では、3種類の hSM22α含有ベクターによって行われるeGFP発現は、低レベルのものが得られたが、SMC特異的として決定した(CMV関連発現の約5%)。
【0150】
B. h SM22αプロモーター活性に対する細胞培養条件の影響
細胞培養条件がヒト細胞中でヒトSM22αプロモーター活性に影響を及ぼすことができるかどうかについての問題を検討した。従って、細胞集密性および血清濃度のこれらの細胞および引き続くhSM22αプロモーター活性化に対する影響を評価した。ヒト冠細胞を、2%または10%FCS含有培地に6ウェル/プレートにウェル当たり5×104または2×105個の細胞で播種した。
【0151】
2×105個の細胞密度で感染して2%血清の存在下で培養したヒト冠細胞で、eGFP遺伝子をそれぞれhSM22αプロモーター、MHC/hSM22αプロモーターおよびCK/hSM22αプロモーターの制御下に置いたとき、eGFP発現レベルをCMV関連発現の1.5%、2.5%、および4%として決定した。同様の結果は5×104の密度で感染したhuCoでも見られ、それぞれCMV関連発現の2%、5.5%および5.5%であった。ヒト冠細胞を10%血清含有培地で培養したときには、一層高い発現レベル(2.5〜4のファクターだけ増加)が得られた。2×105の密度での細胞感染では、それぞれhSM22α、MHC/hSM22αおよびCK/hSM22αプロモーターではeGFPの4%、6%および11%となり、一方同じ構築物を用いて、感染を低細胞密度(5×104)で行ったときには、発現はそれぞれ7.5%、17.5%および22%に達した。
【0152】
要約すると、hSM22αプロモーター含有ベクターによって行われるeGFP発現は、低細胞濃度(5×104)でのものより常に強かった。更に、血清画布くまれていると、3種類のhSM22α含有プロモーターによって行われる発現が有意に増加した。その結果、hSM22αキメラプロモーターで得られる発現レベルは、ヒトSM細胞を低集密性で感染させ且つ高血清濃度で培養したときには、CMVの約20%に達した。
【0153】
例6:ヒトSM22αプロモーターイン・ビトロ評価
A.マウスでのヒトSM22αプロモーター特異性の評価
hSM22αで行われる発現は主要なアデノウイルスの天然ターゲット臓器(例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓)では見られないことを明らかにするために、hSM22αプロモーターを単独でまたはMHCまたはCKエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス構築物を、C57B1/6免疫適格マウスに投与した。Ad−CMVeGFPベクターおよびTris−HCl注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。4匹のマウスにそれぞれの構築物2・109iuを静脈内投与し、eGFP発現を、上記のように3日後に様々な臓器の蛍光顕微鏡での検討によって決定した。
【0154】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、hSM22αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、これによりヒトSM22αプロモーターのSMC特異性が確認される。
【0155】
B.ラット頸動脈損傷モデルでのMHC/ h SM22αプロモーターの評価
イン・ビボでのSMCでのMHC/hSM22α含有アデノウイルスベクターの能力を評価するため、CMV(AdCMVeGFP)またはMHC/hSM22α(AdMHC/hSM22eGFP)プロモーターによって制御されているeGFPを含むベクターを生成させ、上記のようにウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈損傷を誘発させたラットモデルの頸動脈から単離した切片に、2・109iuを5分間点滴注入した。3日後、AdCMVeGFPおよびAdMHC/hSM22eGFPに感染した頸動脈を回収し、PBS/2%ホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡法によって分析した。AdCMVeGFPおよびAdMHC/hSM22eGFPに感染した血管は、有意な蛍光を示した。これらの結果から、MHC/hSM22αプロモーターはSMCでeGFP発現を行うことができるが、非SMCでは発現しないことが確かめられる。
【0156】
要するに、これらのデーターは、アデノウイルスに関連するhSM22α含有プロモーターは、レポーター遺伝子をイン・ビトロおよびイン・ビボでSMC特異的発現することを示唆している。中間部および血管内膜起源に由来するラット、ブタおよびヒトSM細胞で試験すると、これらのプロモーターは強力なウイルスCMVエンハンサー/プロモーターの5〜170%の範囲の発現レベルを示した。
【図面の簡単な説明】
【図1】
SMC(ラットAo、ラットIT15、ブタCoおよびブタIT15)およびA 549細胞でのSM22αプロモーター強度。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示される。それぞれの細胞型を、最適感染に相当するMOIでAdSM22eGFPまたはAdCMVeGFPに暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
【図2】
SM対非SM細胞でのネズミSM22αプロモーターを含むベクターの比較。SM22αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー(CK)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(MHC)と共に用いた。発現は、ラットIT15(黒棒線)、ラットAo(灰色棒線)、およびA549(白棒線)で分析した。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をSM22αプロモーター含有ベクターおよびAdCMVeGFPに適当なMOIで暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
【図3】
ラットIT15増殖に対するラットγIFNの効果。細胞をAdCMVIFN(AdSM−MHCenh/SM22IFN)、またはAdCMVeGFP (コントロール)に暴露し、4日後に計数した。IFNの増殖抑制効果を、感染していない細胞に対して評価した。
【図4】
SM細胞でのヒトSM22αプロモーターを含むベクターの比較。SM22αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー(CK)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(MHC)と共に用いた。発現は、ラットAo(黒棒線)、ブタCo(濃い灰色棒線)、ブタIT15(明るい灰色棒線)、およびブタIT30(白棒線)で分析した。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をSM22αプロモーター含有ベクターおよびAdCMVeGFPに適当なMOIで暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
本発明は、筋特異的エンハンサーに操作可能に結合した平滑筋細胞(SMC)特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物に関する。本発明は、このようなキメラ構築物を含んでなり、治療遺伝子の発現を制御するための発現カセットも提供する。最後に、本発明は、上記発現カセットを含んでなる組み換えベクター、ウイルス粒子、真核宿主細胞、医薬組成物、およびSMC中での特異的発現および治療または予防目的のためのそれらの使用、ゲノムに上記発現カセットを組込んだトランスジェニック動物に関する。本発明は、組織特異的遺伝子発現の分野に関し、培養細胞系における組み換えポリペプチドの産生、トランスジェニック動物モデルの構築、遺伝子調節の研究、および血管ターゲッティング技術の開発など多くの用途に用いられる。本発明は、遺伝子治療、特に循環器分野における遺伝子治療に関して極めて興味深いものである。
【0002】
遺伝子治療は、遺伝子材料の細胞または生体への導入と定義することができる。遺伝子治療によるヒト疾患の治療の可能性は、数年間で理論的考察の段階から臨床的応用の段階へと変化してきた。ヒトに適用された最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ(ADA)をコードする遺伝子に影響を与える突然変異の結果としての遺伝的に免疫不全である患者について1990年9月にアメリカ合衆国で開始され、この最初の実験の相対的な成功により様々な遺伝的および後天的疾患についての技術開発が促進された。遺伝子治療に基づく有望な臨床試験が、現在進行中である(例えば、http://www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical/に記載されている臨床試験を参照されたい)。
【0003】
循環器疾患は、先進工業国の大半における死亡率の主な原因であるので、遺伝子治療の主要なターゲットである。平滑筋(SMC)の表現型を増殖および調節する能力は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および喘息など多くの疾患の病因に関係してきた。例えば、動脈壁の損傷により、サイトカインおよびSMC移動および増殖を促進する他の生長調節分子の合成が誘発され、血管内膜の過形成が生じ(Ross, 1993, Nature 362, 801−809)、アテローム性動脈硬化症などの幾つかの循環器疾患の発症の一因となる。このような損傷に対する普通の臨床的に重要な設定は、閉塞した動脈をカテーテル上のバルーンで機械的に拡張して血流を回復するバルーン血管形成術である。しかしながら、症例の30〜50%では、反応性の細胞増殖応答により局部的に平滑筋が再増殖し、血液循環に欠陥を生じる(Schwartz et al., 1996, Int. J. Cardiol. 53, 71−80)。再狭窄と呼ばれるこの工程は、通常の方法では治療し難いものであった。従って、SMCへの遺伝子導入により、これらの循環器疾患の病因の解明および遺伝子治療によるそれらの治療が保証される。
【0004】
遺伝子治療の成功は、主として生体の細胞への治療遺伝子の効率的送達と遺伝情報の発現によって左右される。機能的遺伝子は、様々な手法によって細胞に導入して、上記遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みにより宿主細胞の一過性発現または恒久的形質転換を生じることができる。裸の核酸(すなわち、プラスミドDNA)を用いて目的の遺伝子をターゲット細胞中に運ぶことができるが(Wolff et al., 1990, Science 247, 1465−1468)、遺伝子治療プロトコールの大半はウイルスまたは合成ベクターを使用している。
【0005】
ウイルスは、細胞膜を通って輸送を行い、リソソーム分解を免れてそれらのゲノムを核に送達するための多様で極めて複雑な機構を発現させており、従って、多くの遺伝子送達用途に用いられてきた。レトロウイルスおよびアデノウイルス由来のものが広汎に使用されているが(総説については、Crystal, 1995, Science 270, 404−410; Kovesdi et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol 8, 583−589 ; Miller, 1997, ヒト遺伝子Ther. 8, 803−815を参照されたい)、ポックスウイルス由来のベクターのような他のウイルスベクターはイン・ビボでの遺伝子導入の有望な候補として出てきている。
【0006】
合成ベクターは、核酸(例えば、プラスミドDNA)と脂質またはポリマーとの特別な組合せであって、その細胞摂取を促進するものを表す。様々な脂質およびポリマーを基材としたベクターが、現在入手できる(総説については、例えば、Rolland, 1998, Critical reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15, 143−198を参照されたい)。ウイルスベクターより効率は劣るが、合成ベクターは大規模生産、安全性、低免疫原性およびクローニング能に関して潜在的な利点を示す。
【0007】
しかしながら、本発明の遺伝子治療ベクターの宿主範囲が広汎にわたることが、それらの使用の主要な制限となる可能性がある。この特異性の欠如により、広汎に治療遺伝子が発現し、これが特に細胞傷害性遺伝子を導入するときには患者にとって有害となることがある。従って、遺伝子発現を標的設定した範囲の細胞に限定する手段が遺伝子治療に有用であろう。
【0008】
数名の研究者らは、ターゲットの細胞表面ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを結合させることによるベクター特異性の変更を提案している(Roux et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9079−9083; WO94/10323号明細書)。例えば、Goud et al. (1988, Virol. 163, 251−254)はアンチ−トランスフェリン受容体抗体をレトロウイルスエンベロープタンパク質に連結させて、レトロウイルス粒子をトランスフェリン受容体を有するヒト細胞に送達した。しかしながら、結合およびインターナリゼーションは生じたが、感染および複製は起こらなかった。更に、この手法は複雑であり、特にベクターとその天然に存在する細胞受容体との間に存在する相互作用を排除する必要がある。
【0009】
もう一つの代替法は、組織特異的転写調節要素を用いて遺伝子発現を所望な細胞個体数に限定することである。哺乳類細胞での遺伝子転写を完全且つ効率的に調節するには、2個の主要なDNA配列、すなわちプロモーターおよびエンハンサーが必要である。プロモーターは転写の開始部位(キャップ部位または+1)のすぐ上流(5′)に位置し、開始部位から転写を正確且つ効率的に開始するのに必要である。大多数の真核プロモーターは、特異的なシス作用配列、例えば、(i) キャップ部位に約30塩基対5′を提供し、キャップ部位を決定して遺伝子転写を開始するのに必要なTATAボックスと呼ばれるATリッチ領域(Breathnachおよび Chambon, 1981, Ann. Rev. Biochem. 50, 349−380)、および(ii) 転写開始効率を増加させ、プロモーターが適正なレベルで機能するのに必要な1個以上の上流プロモーター要素(UPE)(GeneVI, 1997, Initiation of transcription), p 810−846, B. Lewin監修, Oxford University Press)を包含する。これらのシス作用配列は遍在しており(任意の細胞の種類で見出される)または調節の役割を有する(特異的な時間にまたは特異的な組織で合成または活性化される)核転写因子によって認識され、結合される。
【0010】
プロモーターの活性は、「エンハンサー」と呼ばれ、プロモーターからの転写速度を増加させることができる他の配列によっても調節される。エンハンサーの成分は、転写因子によって認識される幾つかのシス作用配列も含んでいるが、これらの配列は更に緊密に充填された配列に組織されるので、プロモーターの成分に似ている。これらのエンハンサーのシス作用配列は、遍在している(例えば、ウイルスエンハンサー)または調節の役割を有する(組織特異的または一時的に調節される転写因子のターゲット)核転写因子によっても認識され、結合される。エンハンサーは、プロモーターの上流または下流の数キロ塩基対(bp)までの距離に、いずれの配向でも配置することができる(GeneVI, 1997, Initiation of transcription), p 810−846, B. Lewin監修, Oxford University Press)。
【0011】
様々な組織において遺伝子を特異的且つ選択的に発現させる多数の組織特異的プロモーター/エンハンサーが、文献に記載されている(総説については、Maniatis et al., 1987, Science 236, 1237−1245; Fickett et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11, 19−24を参照されたい)。しかしながら、これまでに、数種類のSMC特異的プロモーター/エンハンサーしか同定されていない。例は、平滑筋α−アクチン(Foster et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 11995−12003 ; Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 7631−7643)、平滑筋ミオシン重鎖(SM−MHC)(Katoh et al., 1994, J. Biol. Chem 269, 30538−30545)、デスミン(欧州特許出願第EP0 999 278号明細書; Mericskay et al., 1999, Current Topics in Pathology Vol 93 p 7−17, Desmouliereおよび Tuchweber監修, Springer−Verlag Berlin, Heidelberg)、およびSM22α遺伝子(Duband et al., 1993, Differentiation 55, 1−11)のものに限定されている。
【0012】
SM22αプロモーターは、総ての平滑筋組織(内臓並びに血管SMC)で機能する。転写開始部位のすぐ上流の445塩基対(bp)は、培養したSMC(Solway et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 13460−13469; Kim et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 1006−1018; 米国特許第6,015,711号明細書)で示されるように内臓および血管SMCでSMC系に限定されたやり方で、並びにイン・ビボでのトランスジェニックマウスで(Li et al., 1996, J. Cell Biol. 132, 849−859; Moessler et al., 1996, Development 122, 2415−2425)、および動脈内投与(Kim et al., 1997, J. Clin. Invest. 100, 1006−1018)によって遺伝子発現をプログラムするのに十分である。更に、SM22α遺伝子の更に上流領域は、動脈SMC、更に具体的には、大動脈に限定された発現の特異性を示す他の転写調節したシス作用配列を含むことが示されており(WO97/35974号明細書)、SM22α遺伝子の転写活性の複雑性を示している。
【0013】
しかしながら、前に引用した転写要素がSMCに限定されたやり方で適正に調節される場合には、それらは通常は弱く、サイトメガロウイルス(CMV; Boshart et al., 1985, Cell 41, 521−530)または他のウイルスのような「強い」プロモーター/エンハンサーで得られるものよりずっと低い発現レベル(10〜200分の1)を提供する。しかしながら、このようなウイルス転写要素は通常は非特異的であり、多くの種由来の多種多様な細胞型で活性である。
【0014】
CMVまたは骨格筋特異的エンハンサーを骨格筋特異的プロモーターと結合させるキメラ構築物は、文献に記載されている(Barnhart et al., 1998, ヒト遺伝子Ther. 9, 2545−2553)。幾つかの会合は(エンハンサーを欠いた構築物と比較して)培養した分化骨格筋細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベル有意に増強させるが、強い発現は筋肉以外のBHK細胞でも観察され、CMVプロモーター/エンハンサーを用いて得た発現レベルの100%まで到達する。更に、イン・ビトロで強い増強を示す幾つかのキメラ構築物は、骨格筋に投与するときにはイン・ビボではこのような増加を再現しない。Barnhart et al.によって記載されているように、遺伝子発現を定義する臨床パラメーターは複雑であり、プロモーター配列並びに配列環境に関してエンハンサーの性質、数、配向および位置によって変化する。
【0015】
CMVエンハンサーをSM22αプロモーターなどのSMC特異的プロモーターと会合させるキメラ構築物は、近年WO00/18908号明細書に記載されている。様々な培養細胞系のトランスフェクション研究は、CMVエンハンサーが存在するときのSMCにおける遺伝子発現の活性化を示している。しかしながら、キメラ構築物は非SMCでも強い誘導性を保持しており、コントロールとして用いた強力なCMVプロモーター/エンハンサーを用いて得た発現レベルの26%まで達する。非標的設定細胞におけるこのようなバックグラウンド発現は、特に細胞傷害性遺伝子の送達を考えるときには、ヒト遺伝子治療と両立しないことがある。
【0016】
要するに、これらの研究は、ターゲット細胞、好ましくはSMCに対する限定された特異性を保持したまま有意なレベルで遺伝子を発現させる適当なプロモーター/エンハンサーの組合せをデザインすることが困難であることを明らかにしている。
【0017】
従って、当該技術分野では、SMC、特に血管構造のSMCにおいて遺伝子を高レベルおよび特異的に発現させる転写要素をデザインして、治療レベルのタンパク質発現を達成し、広汎な遺伝子発現に固有の潜在的な副作用を回避する必要がある。
【0018】
この技術的問題は、特許請求の範囲に定義した態様を提供することによって解決される。
【0019】
従って、本発明は、少なくとも1個の(ii)筋特異的エンハンサーに作動可能に連結した少なくとも1個の(i)平滑筋(SMC)特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物を提供する。
【0020】
本明細書で用いられる「キメラ構築物」という用語は、種、遺伝子などにあてはまる各種起源の少なくとも2個の配列を含んでなる核酸構築物を表す。好ましくは、これらの2個の配列、すなわちSMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは互いに非相同性であり、すなわちそれらは異なる遺伝子または異なる種から生じ、更に好ましくは、それらは異なる遺伝子および異なる種から生じるという意味において非相同性である。本発明の範囲内では、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態またはその類似体を定義している。「ポリヌクレオチド」としては、任意の可能な核酸、特に一本鎖または二本鎖、線状または環状、天然または合成であることができるDNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾ヌクレオチドを含んでなることができる(米国特許第5,525,711号明細書、米国特許第4,711,955号明細書、またはEPA302 175号明細書を修飾の例として参照されたい)。このようなポリヌクレオチドは既成の核酸供給源(例えば、ゲノムcDNA)から得ることができるが、合成的なもの(例えば、オリゴヌクレオチド合成によって製造される)であることもできる。ヌクレオチドの配列を非ヌクレオチド要素によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、重合の後にらに修飾してもよい。
【0021】
SMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーについて本出願明細書に引用されたヌクレオチド位置に、転写開始部位またはキャップ部位(位置+1を表す)に対して負の番号を付ける。転写開始部位のすぐ上流の最初のヌクレオチドは、−1と番号を付ける。転写開始部位は、S1マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる(Sambrook et al., 1989, 実験室便覧(Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)。
【0022】
「平滑筋細胞(SMC)」という用語は、内臓および血管SMC、更に具体的には動脈SMCなど任意の種類の平滑筋細胞を表し、大動脈、冠、***、大腿および頸動脈の並びに伏在静脈の血管内膜(neointimal)および中間部(medial)SMCが特に好ましい。
【0023】
本明細書で用いられる「SMC特異的プロモーター」は、平滑筋細胞に含まれる(複数の)転写因子および/またはRNAポリメラーゼによって認識されることによって、隣接遺伝子の発現を促進する任意の核酸配列を意味する。「隣接遺伝子」という用語は、転写が上記プロモーターおよび/または本発明のキメラ構築物によって制御される遺伝子を表す。特に、「特異的」という用語は、本発明で用いられるプロモーターおよび/または本発明のキメラ構築物がSMCでの遺伝子発現を指示するが非SMCでは全くまたは余り活性ではない(少なくとも5、好ましくは少なくとも10のファクターの減少した活性)傾向を示すことを意味する。
【0024】
本発明で用いられるSMC特異的プロモーターは、SMCにおいて低レベルであっても遺伝子発現を促進するのに必要な少なくとも総ての要素を包含する。このようなプロモーターは、RNAポリメラーゼ結合部位を可能にし、且つ好ましくはキャップ部位の25〜35bpに配置されたTATAボックス(コンセンサス配列TATAAAA)またはTATAボックス様要素(TATAボックス機能を有するATリッチ配列)のようなキャップ部位で転写を開始するのに必要なシス作用配列を含むいわゆる「最小プロモーター」であることができる。TATAボックスの存在は配列分析によって決定することができ、また転写の開始部位はS1マッピングまたはプライマー伸張のような標準的手法によって決定することができる。最小SMC特異的プロモーターは、通常は転写開始部位の(上流)200塩基対(bp)の断片に含まれ、有利には100塩基対(bp)の断片に含まれる。
【0025】
第二の好ましい代替態様によれば、本発明のキメラ構築物は、SMCにおける最小プロモーターによって指示される遺伝子発現を実質的に増加させる追加のシス作用配列を含むSMC特異的プロモーターを用いる。このようなシス作用配列は、遍在しているかまたは調節の役割(一時的または組織特異的)を有する転写因子、特にSMCに特異的な因子を結合させることができる。代表例としては、NF−1因子が結合したCAATボックス(コンセンサスGGCCAATCT)、SP1因子が結合したGCボックス(コンセンサス GGGCGG)、Oct因子が結合したオクタマーATTTGCAT、NF6Bが結合した6B(コンセンサスGGGACTTTCC)、ATF因子が結合したATF(コンセンサスGTGACGT)、Ap2、Sp1、Egr1、YY1、TGT3−3、Eボックス(CANNTG)、CarGボックス(CC(A/T)6GG)、および/またはMEF−2(YTAWAAATAR)配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらのシス作用配列は単独でまたは様々な組合せで用いることができ、相同性(本発明で用いられるSMC特異的プロモーターから単離)または非相同性(別のプロモーター領域から単離)であってもよい。これに関連して、数種類のSMC特異的プロモーターの異なる部分を融合させ、SMCでの遺伝子発現を最適にするのが有利であることがある。
【0026】
この好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、転写開始部位の上流の4000bpの断片内、有利には2000bpの断片内、好ましくは1000bpの断片内、更に好ましくは500bpの断片内に含まれる。
【0027】
更に、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、隣接遺伝子に含まれていないときには、標的設定したSMCで機能する転写開始部位を含んでなることがある。
【0028】
好ましい態様によれば、本発明のキメラ構築物で用いられるSMC特異的プロモーターは、平滑筋α−アクチン(Foster et al., 1992, J. Biol. Chem. 267, 11995−12003; Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem 270, 7631−7643)、平滑筋ミオシン重鎖(SM−MHC)(Katoh et al., 1994, J. Biol. Chem 269, 30538−30545)、平滑筋カルポニン(マウス遺伝子についてMiano et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, 7095−7103、ラット遺伝子についてNobrega et al., 2000, Mamm Genome 11, 115−119、およびヒト遺伝子についてKitami et al., 1999, Hypertens. Res. 22, 187−193)、デスミン(欧州特許出願第EP 0 999 278号明細書;Mericskay et al., 1999, Current Topics in Pathology Vol 93, p 7−17, Desmouliereおよび Tuchweber監修, Springer−Verlag Berlin, Heidelberg)およびSM22α遺伝子 (Duband et al., 1993, Differentiation 55, 1−11)のプロモーターからなる群から選択される。SM22αプロモーターを用いるのが好ましい。この好ましい態様の範囲内には、SMC特異的発現を伝達することもできるこれらのプロモーターの5′欠失断片がある。
【0029】
本発明のキメラ構築物は、任意の種、特にヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ由来のSM22αプロモーターを用いることができる。様々な種のSM22αプロモーターの配列は、文献または専門のデーターバンク(ヒト配列については受託番号AH006172.1、マウス配列についてはZ.68618.1、およびラット配列についてはZ48607.1のGenebankなど)から当業者が入手することができる。基本的なシス作用配列の位置は、公表されたデーターに基づいて決定することができる。
【0030】
マウス遺伝子のSM22αプロモーター、特に転写開始部位の上流の445bp断片(すなわち、配列番号:1、1〜445位)内に含まれるマウスSM22αプロモーターの部分が、本発明に関して特に好ましい。このネズミSM22αプロモーターは、Moessler et al.に記載の方法で単離することができる(1996, Development 122,2415−2425)。ヒト遺伝子のSM22αプロモーター、特に約−445位まで伸張する部分(配列番号:14の1〜445位)も、本発明に関して適当である。他の哺乳類形態のSM22αプロモーターは、通常の分子生物学の手法を用いてまたはPCRによって適当なマトリックス(例えば、前に引用した文献記載の従来の技術によるプラスミド)から得ることができる。例えば、 ネズミ遺伝子の断片を用いて、相同配列をハイブリダイズさせる条件下で他の種の哺乳類から作製したゲノムライブラリーをプローブすることができる。適当なハイブリダイゼーション条件は、標準的マニュアル(例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)を参照して決定することができる。
【0031】
本明細書で用いられる「筋」という用語は、(上記で定義した通りの)骨格、心および平滑筋など任意の種類の筋細胞を表そうとするものである。骨格および平滑筋が、本発明に関して好ましい。
【0032】
本明細書で用いられる「筋特異的エンハンサー」は、(複数の)因子が直接または間接的に(すなわち、他の細胞因子との相互作用によって)結合することによって、本発明のキメラ構築物、特に標的設定したSMCに含まれるSMC特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増進するポリヌクレオチド配列を表す。このような増進は、例えばイン・ビトロ(例えば、培養SMC中)またはイン・ビボ(例えば、トランスジェニック動物中でまたは動物モデルに直接投与することによって)でも、同一実験条件下で筋特異的エンハンサーの存在下または非存在下においてSMC特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子の発現を比較することによって決定することができる。このような遺伝子発現分析の例は、本明細書の例3、4および6において提供されるが、当業者に周知の他の方法を本発明に関連して用いることもできる。
【0033】
多種多様な異なる供給源由来の多数の筋特異的エンハンサーは当該技術分野で周知であり、クローニングしたポリヌクレオチド配列としてまたはの範囲内で(例えば、ATCCのような寄託機関、または商業的および個人的供給源から)利用可能である。従って、好ましい態様では、筋特異的エンハンサーは
a) 哺乳類α−アクチン(Shimizu et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,7631−7643)、特に心臓、骨格または平滑筋α−アクチン(Genbank受託番号D00618)、
b) 哺乳類トロポニン、特にトロポニンC(Genbank受託番号M37984)、I(Genbank受託番号X90780)またはT(Genbank受託番号AJ011712)、
c) 哺乳類ミオゲニン(Genbank受託番号X62155)、
d) 哺乳類ミオシン。数種類のミオシンエンハンサーが、これまでにミオシン軽鎖およびミオシン重鎖遺伝子(例えば、Donoghue et al., 1988, Genes and Development 2, 1779−1790)のいずれに由来するものも同定されている。好ましいものは、ミオシン重鎖エンハンサーであり、更に好ましくはウサギのエンハンサーであり、遺伝子をコードするウサギミオシン重鎖の転写開始部位の上流約−1332〜約−1225位(配列番号:2)に配置されたエンハンサーが特に好ましい(Kallmeier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,30949−30957)、
e) 哺乳類クレアチンキナーゼ、特にヒト(Trask et al., 1988, J. Biol. Chem., 263, 17142−17149 ; Genbank受託番号AH003460)またはマウス(Jaynes et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8, 62−70)クレアチンキナーゼ。好ましい筋特異的エンハンサーは、好ましくはヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位の上流の約−919〜約−711位に配置された配列(配列番号:3)を用いる、
f) 哺乳類APEG−1(大動脈で優先的に発現される遺伝子−1; Hsieh et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 14344−14351)、
g) 哺乳類スムーセリン(smoothelin)(Genbank受託番号AH007691)、
h) 哺乳類SM20遺伝子産物、特にヒト由来のもの(Wax et al., 1996, Lab. Invest. 74, 797−808)、
i) 哺乳類Timp4(メタロプロテイナーゼ組織インヒビター4(Tissue−inhibitor of metalloproteinase 4))、特にヒト由来のもの(Genbank受託番号U76456)、および
j) 哺乳類カルポニンであって、ネズミカルポニン遺伝子の最初のイントロン内の約+138〜+1875位に配置された配列が特に好ましい(Miano et al., 2000, J. Biol. Chem. 275, 9814−9822)、
をコードする遺伝子のエンハンサーの群から選択される。
【0034】
「作動可能に連結」とは、核酸配列(i)および(ii)の並置であって、筋特異的エンハンサーおよびSMC特異的プロモーターがそれらを所期の方法で機能させる関係にあるものを表す。筋特異的エンハンサーがSMC特異的プロモーターによって行われる遺伝子発現を増加させるときには、このエンハンサーはプロモーターに作動可能に連結している。作動可能に連結したエンハンサーは、プロモーターの上流、下流または遺伝子配列内のキメラ構築物に置くことができ、近い距離または数kbまでの距離を介して隣接することができる。有利には、筋特異的エンハンサーは、SMC特異的プロモーターの上流にプロモーターとエンハンサーを分離する距離が500bp未満、好ましくは200bp未満で、更に好ましくはプロモーターのすぐ上流に配置される。更に、筋特異的エンハンサーの配向は、SMC特異的プロモーターによって付与される転写方向に対してセンス(5′→3′)またはアンチセンス(3′→5′)であることができる。本発明に関しては、キメラ構築物は、好ましくはSMC特異的プロモーターに対してアンチセンス配向で位置するクレアチンキナーゼエンハンサーまたはセンス配向で位置するミオシン重鎖エンハンサーを含んでなる。カルポニンエンハンサーは、好ましくはSMC特異的プロモーター の下流に(すなわち、イントロンとしてまたはイントロン内に)挿入されている。上記で定義した2種類以上の筋特異的エンハンサーを含むキメラ構築物も包含される。
【0035】
本発明のキメラ構築物の作動可能性は、イン・ビトロで適当な培養細胞中でまたはイン・ビボで(トランスジェニック動物中または動物モデルに直接投与することによって)SMCにおいて遺伝子(例えば、細菌性酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたはeGFPなどをコードするレポーター遺伝子)を発現させる能力を測定することによって容易に決定することができる。 遺伝子発現は、フローサイトメトリー、ELISA、免疫蛍光、ウェスタンブロット法、生物活性測定などの標準的方法によって決定することができる。
【0036】
更に、本発明のキメラ構築物の遺伝子発現活性を、現在最も活性であることが知られているものの一つと考えられているが非特異的(遍在発現)であるCMVのような強力なプロモーター/エンハンサーと比較することができる。本発明のキメラ構築物は、類似の実験条件下で、特にネズミSMC特異的プロモーター(例えば、キャップ部位に対して約−445〜約+65のネズミSM22αプロモーターの部分)を用いるときには、CMVプロモーター/エンハンサーを用いて得たものの少なくとも10%、有利には少なくとも15%、好ましくは少なくとも20%であり、更に具体的には約20〜35%のSMCにおけるレポーター遺伝子の発現レベルを提供する。発現レベルは、ヒトSMC特異的プロモーター(キャップ部位に対して約−445〜約+63のヒトSM22αプロモーターの部分)を補充したキメラ構築物を用いるときには、リファレンスCMVプロモーター/エンハンサーを用いて得たものの少なくとも15%、好ましくは20〜200%に達することができる。非SMCでは、本発明のキメラ構築物によって行われる遺伝子発現は低いか(CMV構築物で用いたものの5%未満、有利には2%未満、好ましくは1%未満)、または検出されない。
【0037】
キメラ構築物は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学の手法によって構築することができる。SMC特異的プロモーターおよび筋特異的エンハンサーは、例えばDNAライブラリーからのクローニングの手法または適当なプローブを用いる増幅法(PCR)によって単離することができる。あるいは、それらは、当該技術分野で理由できる配列データーに基づいて化学合成によって製造することができる。プロモーターおよびエンハンサーを有する断片は、制限酵素およびリガーゼを用いて結合させ、本発明のキメラ構築物を生成させることができる。
【0038】
本発明に関連して、プロモーターまたはエンハンサーはそれぞれ、または両方とも、それぞれの上記の活性が実質的に(本来の配列の活性の少なくとも80%)保存されるという条件で、1または数個のヌクレオチドの欠失、付加および/または置換によって修飾することができる。このような修飾は、(i)SMC以外の細胞の種類で発現を制御する正のシス作用配列(SMC特異性の改良)または(ii)発現レベルを減少させるシス作用配列(「サイレンサー」)を除去することを目的とすることができる。位置指定突然変異誘発を用いて、本来の配列を修飾することができる。
【0039】
本発明は、本質的にSMC結合を制限したやり方で遺伝子発現を行うのに十分なヒトSM22αプロモーターの部分を含んでなるSMC特異的プロモーターにも関する(内臓および/または血管SMC)。SMCの特異性は、上記のような培養細胞、トランスジェニック動物またはイン・ビボ投与を用いる方法などの任意の通常の手法によって明らかにすることができる。好ましくは、本発明のSMC特異的プロモーターは、配列番号:14に記載の配列の総てまたは部分、更に好ましくは約ヌクレオチド1から約ヌクレオチド445まで(キャップ部位に対してヒトSM22α遺伝子の約−445〜−1位に相当する)伸張しているもの、またはそれらの任意の機能的に同等なもの(本来の配列に対して1個以上のヌクレオチドの付加、欠失および/または置換によって修飾され且つSMC特異性および/または発現レベルに関して本来の配列の活性の少なくとも80%を保存している)を含んでなり、または好ましくはからなる。
【0040】
本発明は、本発明によるキメラ構築物またはSMC特異的プロモーターによって制御される目的の遺伝子を含んでなり、ターゲット細胞で発現させる発現カセットも提供する。
【0041】
「目的の遺伝子」という用語は、任意の起源のものであり、且つゲノムDNA、cDNA、またはゲノムRNA、mRNA、アンチセンスRNA、リボソームRNA、リボチームまたはトランスファーRNAのようなRNAをコードする任意のDNAから単離することができる核酸を表す。目的の遺伝子は、オリゴヌクレオチド(すなわち、100bp未満の短いサイズの核酸)であることもできる。
【0042】
好ましい態様では、本発明で用いられる目的の遺伝子は、治療上関心のある遺伝子産物をコードする。「治療上関心のある遺伝子産物」とは、患者、特に疾患または疾病状態のあるまたはこの疾患または状態から防御すべき患者に適当に投与するとき、治療または防御活性を有するものである。このような治療または防御活性は、上記疾患または上記状態の症状の経過に対する有益な効果に相関させることができる。治療を行う疾患または状態によって治療上関心のある適当な遺伝子産物をコードする遺伝子を選択することは、当業者の能力範囲内にある。一般的には、当業者の選択は以前に得られた結果基づくことがあり、過度の実験を行うことなく、特許請求の範囲に記載の発明を実施すること以外は、このような治療特性を得ることを合理的に期待することができる。
【0043】
本発明に関連して、目的の遺伝子は、これを導入するターゲット細胞に対して相同性または非相同性であることができる。有利には、この遺伝子は、ポリペプチド、リボチームまたはアンチセンスRNAをコードする。「ポリペプチド」という用語は、サイズがどのようなものであれ、ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物と理解すべきであり、7個程度の残基(ペプチド)を有するポリペプチドを包含するが、更に典型的にはタンパク質を包含する。更に、これは、任意の起源(原核生物、下等または高等真核生物、植物、ウイルスなど)であることができる。これは、本来のポリペプチド、変異体、性質の対応部を持たないキメラポリペプチド、またはその断片であってもよい。有利には、本発明で用いられる目的の遺伝子は、動物またはヒト生体で1個以上の欠陥または不完全な細胞性タンパク質を相殺できるまたは体内から有害な細胞を限定しまたは除去するための毒性効果を介して作用する少なくとも1個のポリペプチドをコードする。適当なポリペプチドは、免疫付与性であり且つ体液性または細胞性応答または両方を刺激するための抗原として作用することもできる。
【0044】
本発明の発現カセットで用いられる目的の遺伝子によってコードされるポリペプチドの例としては、
p21、p16、網膜芽細胞腫(Rb)遺伝子、キナーゼインヒビター(好ましくは、サイクリン依存型)、GAX、GAS−1、GAS−3、GAS−6、Gadd45、およびサイクリンA、BおよびDのような細胞サイクルに関与するポリペプチド、
p53、Bas、Bcl2、BclX、Bad、およびそれらのアンタゴニストのようなアポトーシス誘導物質、
血管内皮増殖因子(VEGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF、特にTGFαおよびβ)、上皮増殖因子(EGF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF、特にFGFαおよびβ)、腫瘍壊死因子(TNF、特にTNFαおよびβ)、CCN(CTGF、Cyr61、Nov、Elm−1、Cop−1、およびWisp−3など)、散乱因子/肝細胞増殖因子(SH/HGF)、アンギオゲニン、アンギオポエチン(特に、1および2)、アンギオテンシン−2、サイトカイン(インターロイキン、特にIL−2、IL−8;GM−CSF、G−CSF、M−CSFのようなコロニー刺激因子)、プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)およびウロキナーゼ(uPA)、のファミリーの一員などのアンギオゲニンポリペプチド、
抗体、毒素、イムノトキシン、腫瘍遺伝子発現産物を阻害するポリペプチド(例えば、ras、mapキナーゼ、チロシンキナーゼ受容体、増殖因子)、Fasリガンド、自殺遺伝子産物などの細胞増殖を減少または阻害することができるポリペプチド、
細胞遺伝子の発現を調節または調整することができるポリペプチド、
凝固因子(FVIII、FIXなど)、
B7.1、B7.2、ICAMなどの免疫刺激ポリペプチド、
ウレアーゼ、レニン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素シンターゼeNOSまたはiNOS、SOD、カタラーゼ、ヘムオキシゲナーゼ、リポタンパク質リパーゼファミリーなどの酵素、
酸素ラジカルスカベンジャー、
α1−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターPAI−1、メタロプロテイナーゼ1〜4の組織インヒビターのような酵素インヒビター、
ジストロフィン、
アンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子−4、IL−12、IFNβまたはγのようなサイトカインなどの血管新生インヒビター、
DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメインおよび転写を活性化または阻害するドメインを含んでなる核受容体のような転写因子(例えば、エストロゲン、ステロイドおよびプロゲステロン受容体由来の融合産物)、
マーカー(β−ガラクトシダーゼ、CAT、ルシフェラーゼ、GFPなど)、および
臨床状態の治療または予防に有用であると当該技術分野で認められている任意のポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0045】
目的の遺伝子が本来の配列に関して1個以上のヌクレオチドの付加、欠失および/または修飾を含むことがあることは、本発明の範囲内にある。
【0046】
本発明に関連して、自殺遺伝子産物は、不活性物質(プロドラッグ)を細胞傷害性物質に転換することによって細胞死をもたらすことができる。HSV−1のチミジンキナーゼをコードする遺伝子は、自殺遺伝子ファミリーのプロトタイプを構成し(Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024−7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550−1552)、アシクロビールまたはガンシクロビールのようなヌクレオシド類似体(プロドラッグ)の、新たに形成されたDNA鎖に組込まれる毒性ヌクレオシドへの変換を触媒し、細胞分割を阻害する。多数の自殺遺伝子/プロドラッグの組合せが、現在利用可能である。更に具体的に記載することができるものは、シトシンデアミナーゼ(Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1−6; WO93/01281号明細書; 欧州特許第402 108号明細書)およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51−56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149−157)をコードする細菌および真菌性遺伝子であって、プロドラッグ5−フルオロシトシン(5−FC)と共に用いることができる。本発明は、WO96/16183号明細書およびWO99/54481号明細書に記載されているような突然変異自殺遺伝子の使用も包含する。
【0047】
もう一つの好ましい態様は、目的の遺伝子がSMCに対する増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードする発現カセットに関する。従って、もう一つの好ましい態様では、ポリペプチドは、IFNβ(Genbank受託番号M25460)、IFNγ(Genbank受託番号M29383)、酸化窒素シンターゼeNOS(Genbank受託番号M95296)、Fasリガンド(Genbank受託番号U08137)、ヘムオキシゲナーゼ(Genbank受託番号X06985)、インターロイキン−10(Genbank受託番号U16720)、およびヘパリン結合VEGF(Genbank受託番号M32977)からなる群から選択され、好ましくはそれぞれはヒト起源のものである。
【0048】
上記のように、目的の遺伝子は、特異的細胞RNAと結合と不活性化することができるアンチセンス配列およびリボチームをコードする遺伝子も包含し、好ましくは癌遺伝子およびプロト癌遺伝子(c−myc、c−fos、c−jun、c−myb、c−ras、KcおよびJE)のような選択されたポジティブ作用性増殖調節遺伝子を包含する。
【0049】
本発明の発現カセットは、1個以上の目的の遺伝子を含んでなることができる。これに関して、自殺遺伝子産物とサイトカイン(IL−2、IL−8、IFNγ、GM−CSFなど)または免疫刺激ポリペプチド(B7.1、B7.2、ICAMなど)をコードする遺伝子の組合せが本発明に関連して有利なことがある。別の目的の遺伝子は、本発明のキメラ構築物またはSMC特異的プロモーター(ポリシストロン性カセット)または独立プロモーターであって、少なくとも一方が同一または反対方向に配置されている上記に定義したキメラ構築物またはSMC特異的プロモーターであるものによって制御することができる。更に、それらは、同一ベクターまたは独立ベクターによって運ぶことができる。
【0050】
本発明の発現構築物は、追加の機能的要素、例えばエキソン/イントロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、分泌シグナル配列、核局在化シグナル配列、IRES、ポリA転写終結配列、トリパルタイトリーダー配列、複製または組み込みに関与する配列を含んでなることもできる。上記配列は文献に報告されており、当業者であれば容易に得ることができる。
【0051】
好ましい態様では、本発明の発現カセットは、更に1個以上のエキソンまたはその部分、好ましくは非コードエキソン、および場合によっては1個以上のイントロンを含んでなる。このようなエキソンおよび/またはイントロン配列は、発現の安定化に有利であることがあり、例えば、SMC特異的プロモーターが生じる遺伝子(例えば、SM22α)または任意の他の起源(例えば、真核生物、ウイルス、合成)から得ることができる。当該技術分野の状態で記載されている多種多様なエキソン/イントロン配列は、本発明に関して適当である。それらは、好ましくは転写開始部位の後および目的の遺伝子の前に挿入される。
【0052】
マウスSM22αプロモーターを含んでなるキメラ構築物の好ましい態様に関しては、適当なエキソン配列は、マウスSM22α遺伝子の+1位から約+65位まで(すなわち、配列番号:1、446〜510位)またはヒトSM22α遺伝子の+1位から約+63位まで(すなわち、配列番号:14、446〜508位)伸張する第一の非コードエキソンの部分を含んでなる。
【0053】
本発明の発現カセットは、(複数の)目的の遺伝子に操作可能に結合したポリアデニル化シグナルを含むこともある。ポリアデニル化配列は、転写を終結させるときには、転写を行う遺伝子に操作可能に結合する。これは、好ましくは目的の遺伝子の3′位(下流)に位置している。
【0054】
本発明は、本発明による発現カセットを含んでなるベクターも提供する。熟練者であれば、広汎なベクターから適当なベクターを選択することができる。例えば、ベクターは、裸のDNA分子、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターの形態の最終的に(複数の)合成ベクターと複合体形成または混合するものであることができる。「プラスミド」という用語は、所定の細胞で自律複製を行うことができる染色体外の環状DNAを表す。適当なプラスミドの範囲は、極めて大きい。好ましくは、プラスミドは、細菌中で増幅し、真核ターゲット細胞で発現するようにデザインされる。このようなプラスミドは、様々な製造業者から購入することができる。適当なプラスミドとしては、pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、pREP4、pCEP4(Invitrogene)、pCI(Promega)、およびpPoly(Lathe et al., Gene 57 (1987), 193−201)が挙げられるが、これらに限定されない。これは、標準的な分子生物学の手法(Sambrook et al., Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー(1989), ニューヨーク)によって得ることもできる。これは、選択遺伝子を含んでなり、トランスフェクション細胞(例えば、細胞栄養要求性の補足または抗生物質耐性による)安定化要素(例えば、cer配列; Summers and Sherrat, Cell 36 (1984), 1097−1103)または 組込み要素(例えば、LTRウイルス配列 およびトランスポゾン)を選択しまたは同定することもできる。
【0055】
本発明のベクターの好ましい態様は、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、ポックスウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルス由来のウイルスベクターに関する。このようなウイルス ベクターは、当該技術分野で周知である。「由来する」とは、ウイルスゲノムのコードまたは非コード部分に含まれる1または数個のヌクレオチドの欠失、付加、および/または置換などの1個以上の修飾を導入することによって本来のウイルスゲノムから遺伝子工学的に作製することを意味する。
【0056】
本発明に特に適当なウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルスサイクルを完成するのに必要な約30個を上回る遺伝子を有する約36kbの線状の二本鎖DNA分子からなる。初期遺伝子は、抗ウイルス宿主免疫応答を調節すると考えられるE3を除いてウイルス複製に本質的な4つの領域(E1〜E4)に分割される。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムの転写の調節に関与するタンパク質をコードする。E2領域遺伝子(E2AおよびE2B)の発現により、ウイルス複製に必要なポリペプチドが合成される(Pettersson and Roberts, 1986, 癌細胞(Cancer Cells)(第4巻): DNA腫瘍ウイルス(DNA Tumor Viruses), Botchan and Glodzicker Sharp監修, pp 37−47, Cold Spring Harbor Laboratory, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)E3領域によってコードされるタンパク質は、細胞傷害性T細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防止する(Wold and Gooding, 1991, Virology 184, 1−8)。E4領域によってコードされるタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、およびスプライシングおよび宿主細胞シャットオフ(Halbert et al., 1985, J. Virol. 56, 250−257)に関与する。後期遺伝子は、大半がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコードする。更に、アデノウイルスゲノムは、両端にシス作用性の5′および3′ITR(逆方向末端反復配列)およびDNA複製に本質的なパッケージング配列を有する。ITRはDNA複製の起源を有し、キャプシド化領域がアデノウイルスDNAの感染性粒子へのパッケージングに必要である。
【0057】
一態様では、本発明のアデノウイルスベクターを条件付きで複製するようにし(CRAdベクター)、Heise and Kirnに記載されているように特定の細胞(例えば、増殖細胞)で選択的に複製するようにする(2000, J. Clin. Invest. 105,847−851)。
【0058】
もう一つの好ましい態様によれば、本発明のアデノウイルスベクターは、E1領域を構成する1個以上の遺伝子の全部または部分的欠失および/または突然変異により少なくともE1機能について複製欠陥を有する。有利には、E1欠失は、Genebankデーターベースに受託番号M73260で開示されているヒトアデノウイルス5型の配列を参照すればヌクレオチド(nt)458〜3328または458〜3510を包含する。
【0059】
更に、ベクターのアデノウイルス主鎖ベクターは、追加の修飾(1個以上のウイルス遺伝子の欠失、挿入または突然変異)を含んでなることがある。E2修飾の一例は、遺伝子をコードするDBP(DNA結合タンパク質)に局在した熱感受性突然変異によって明示される(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328−339)。アデノウイルス配列は、E4領域の全部または一部を欠失することもできる。ORF3および4またはORF3および6/7が有利なことがある(例えば、欧州特許出願EP974 668号明細書; Christ et al., 2000, ヒトGene Ther. 11, 415−427; Lusky et al., 1999, J. Virol. 73, 8308−8319)。非本質的E3領域内の追加の欠失はクローニング能を増加することができるが(総説については、例えばYeh et al. FASEB Journal 11 (1997) 615−623を参照されたい)、ポリペプチド(例えば、gpl9k)をコードするE3配列の総てまたは一部を保持して、宿主免疫系(Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53−71)または炎症反応(欧州特許EP00440267.3号明細書)を回避するのが有利であることがある。ITRおよびパッケージング配列を保持し、ウイルス抗原の残余合成を廃止することを目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第二世代ベクターを考えて、形質導入した細胞における発現遺伝子の長期発現を改良することもできる(WO94/28152号明細書; Lusky et al., 1998, J. Virol 72, 2022−2032)。
【0060】
本発明の発現カセットは、シス作用配列を除きアデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができる。好ましくは、これは、欠失領域(E1、E3および/またはE4)の代わりに、特に優先的には欠失したE1領域の代わりに挿入される。更に、発現カセットは、問題の領域の転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。
【0061】
本発明による使用に適合させることができるアデノウイルスは、任意のヒトまたは動物供給源、特にイヌ(例えば、CAV−1またはCAV−2; それぞれ、Genbank参照番号CAVIGENOMおよびCAV77082)、トリ(Genbank参照番号AAVEDSDNA)、ウシ(例えば、BAV3; Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol. 72, 1394−1402)、ネズミ(Genbank参照番号ADRMUSMAV1)、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサルアデノウイルス、あるいはそれらの雑種から誘導することができる。任意の血清型を用いることができる。しかしながら、Cサブグループのヒトアデノウイルスが好ましく、特にアデノウイルス2(Ad2)および5(Ad5)が好ましい。一般的には、引用したウイルスはATCCのようなコレクションで利用でき、それらの配列、構成および生物学を記載している多数の公表文献の主題となっており、熟練者であればそれらを応用することができる。
【0062】
更に、アデノウイルス粒子または中空アデノウイルスキャプシドを用いて、米国特許第5,928,944号明細書に記載のウイルス依存性コインターナリゼーション法によって核酸(例えば、プラスミドベクター)を導入することもできる。この方法は、ポリカルベンまたは1以上の脂質層を含んでなる脂質小胞の存在下にて行うことができる。
【0063】
レトロウイルスベクターも、適当である。レトロウイルスは、ウイルスによってコードされる逆転写酵素を用いて複製し、ウイルスRNAゲノムを二本鎖DNAに複製し、これを感染細胞の染色体DNAに組込む組込みウイルスのクラスである。文献記載の多数のベクター、特にネズミ白血病ウイルス、特にMoloney株(Gilboa et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241, 29)またはFriends FB29株(WO95/01447号明細書)由来のものを本発明の枠内で用いることができる。一般的に、レトロウイルスベクターはウイルス遺伝子gag、polおよびenvの全部または一部を欠失しており、5′および3′LTRおよびキャプシド化配列を保持している。これらの要素を修飾して、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性を増加させることができる。このような修飾としては、レトロウイルスキャプシド化配列のVL30のようなレトロトランスポゾンの一つによる置換が挙げられる(米国特許第5,747,323号明細書)。本発明の発現カセットは、キャプシド化配列の下流、好ましくはレトロウイルスゲノムに対して逆方向で挿入される。
【0064】
ポックスウイルスは、それらの大きなDNAゲノムおよびそれらの複製の細胞質部位によって上記ウイルスから識別される複雑なエンベロープ付きウイルスの群である。ポックスウイルス科の数種類のゲノムはマッピングされ、配列決定されている。これは、約200種類のタンパク質(その中の約100種類がウイルス組立に関与している)をコードする約200kbの二本鎖DNAである。本発明に関連して、ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意の一員、特にカナリヤポックス、鶏痘およびワクシニアウイルスから得ることができ、後者のものが好ましい。適当なワクシニアウイルスとしては、Copenhagen株(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247−266 および517−563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381−401)、Wyeth株、および改良Ankara(MVA)株(Antoine et al., 1998, Virol. 244, 365−396)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明による発現カセットを含んでなるワクシニアウイルスを構築する一般的条件は、当該技術分野で周知である(例えば、Copenhagenワクシニアウイルスについては欧州特許第83 286号明細書および欧州出願第206 920号明細書、およびMVAウイルスについてはMayr et al., 1975, Infection 3, 6−14 およびSutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847−10851を参照されたい)。
【0065】
本発明の発現カセットは、好ましくは非コード遺伝子間領域、または不活性化または欠失がウイルス増殖および複製を著しく損なわない任意の遺伝子のような非本質的座におけるポックスウイルスゲノム内に挿入される。チミジンキナーゼ遺伝子は、Copenhagenワクシニアウイルスでの挿入に特に適している(Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411−3415; Weir et al., 1983, J. Virol. 46, 530−537)。MVAに関する限り、発現カセットの挿入は切除I〜VIIのいずれかで、好ましくは切除IIまたはIIIで(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031−1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12,1032−1040)またはD4R座で行うことができる。鶏痘ウイルスについては、チミジンキナーゼ遺伝子内への挿入が考えられるが、発現カセットは非コード遺伝子間領域に導入するのが好ましい(例えば、欧州特許第314 569号明細書および米国特許第5,180,675号明細書を参照されたい)。欠陥機能がヘルパーウイルスを介してイン・トランスでまたは生産者細胞系での発現によって供給されるという条件では、本質的ウイルス座での挿入を考えることもできる。
【0066】
有利な別態様によれば、本発明のベクターは、脂質および/またはポリマー (合成ベクター)に複合体形成することができる。好ましい脂質は、核酸に高親和性を有し且つ細胞膜と相互作用するカチオン性脂質である(Felgner et al. Nature 337 (1989) 387−388)。結果として、それらは、核酸を複合体形成することができ、従って、細胞にはいることができるコンパクトな粒子を生成することができる。適当な脂質としては、DOTMA(Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7413−7417)、DOGSまたはTransfectam(商品名)(Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982−6986)、DMRIEまたはDORIE(Felgner et al., Methods 5 (1993), 67−75)、DC−CHOL(Gao and Huang, BBRC 179 (1991), 280−285)、DOTAP(商品名)(McLachlan et al., Gene Therapy 2 (1995), 674−622)、Lipofectamine(商品名)、およびグリセロ糖脂質化合物(欧州特許第901463号明細書およびWO98/37916号明細書を参照)が挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
適当なポリマーは、好ましくはポリアミドアミン(Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372−379)、樹枝状ポリマー(WO95/24221号明細書)、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン(WO96/02655号明細書)、ポリリシン(US−A−5 595 897号明細書またはフランス国特許第2 719 316号明細書)、キトサン(米国特許第5,744,166号明細書)、またはDEAEデキストラン(Lopata et al. Nucleic Acid Res. 12 (1984) 5707−5717)のようなカチオン性である。
【0068】
もう一つの態様では、本発明は、ターゲット細胞中で目的の遺伝子のSMC特異的に発現させるウイルス粒子の製造方法であって、
a) 本発明のウイルスベクターを許容細胞系に導入し、
b) 工程a)で得た許容細胞系を適当な時間適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子を産生させ、
c) 細胞培養物から上記ウイルス粒子を回収し、
d) 場合によっては、回収したウイルス粒子を精製する
工程を含んでなる、方法に関する。
【0069】
好ましい態様では、許容細胞系は、感染性ビリオンを産生するのに必要な総ての遺伝子産物をイン・トランスで提供する相補性細胞系である。
【0070】
本発明は、本発明によるベクター、好ましくはウイルスベクターを含んでなる、またはこのようなウイルス粒子の製造方法によって得ることができるウイルス粒子も提供する。
【0071】
アデノウイルス粒子は、相補性細胞系またはヘルパーウイルスであって、本発明のアデノウイルスベクターが欠陥を有するウイルス遺伝子をイン・トランスで供給するものを用いて、当該技術分野で任意の通常の手法によって調製し、増殖させることができる(例えば、Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols; E. J. Murray監修, The Human Press Inc, クリントン, ニュージャージー、またはWO96/17070号明細書に記載の方法)。細胞系293(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59−72)およびPERC6(Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy 9, 1909−1917)は、E1機能を補足するのに普通に用いられる。他の細胞系を作製して、二重に欠陥を有するベクターを補足した(Yeh et al., 1996, J. Virol. 70, 559−565; Krougliak and Graham, 1995, Human Gene Ther. 6, 1575−1586; Wang et al., 1995, Gene Ther. 2, 775−783; Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2033; 欧州特許第919627号明細書およびWO97/04119号明細書)。アデノウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、リーシス後に細胞からも回収することができ、場合によっては標準的手法(例えば、WO96/27677号明細書、WO98/00524号明細書、WO98/26048号明細書、およびWO00/50573号明細書に記載のクロマトグラフィー、超遠心)によって更に精製することができる。
【0072】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下でまたはレトロウイルスベクターが欠陥を有するレトロウイルス遺伝子(例えば、gag/polおよびenv)をそのゲノム中に組込んで含む適当な相補性(パッケージング)細胞系で調製される。このような細胞系は、従来の技術に記載されている(Miller and Rosman, 1989, BioTechniques 7, 980; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6460; Markowitz et al., 1988, Virol. 167, 400)。env遺伝子の産物は、ターゲット細胞の表面上に存在するウイルス受容体へのウイルス粒子の結合に関与しており、従って、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明に関連して、PA317細胞(ATCC CRL 9078)または両種指向性エンベロープタンパク質を含み、ヒトおよび他の種のターゲット細胞を感染させる293E16(WO97/35996号明細書)のようなパッケージング細胞系を用いるのが有利である。レトロウイルス粒子は、好ましくは培養上清から回収され、場合によっては標準的手法(例えば、クロマトグラフィー、超遠心)によって更に精製することができる。
【0073】
ポックスウイルス粒子は、当業者が入手することができる多数の文献に記載されている方法で調製される(Piccini et al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545−563;米国特許第4,769,330号明細書;米国特許第4,772,848号明細書;米国特許第4,603,112号明細書;米国特許第5,100,587号明細書および米国特許第5,179,993号明細書)。開発された主な手法は、poxDNA配列(所望な挿入部位を包含する)によって両側にフランクした本発明の発現カセットを含むドナープラスミドと野生型ポックスウイルスゲノムとの間の相同性組み換えを用いている。一般的に、ドナープラスミドは、E. coliで構築され、増殖によって増幅され、通常の手続きによって単離される。次いで、これはポックスウイルスゲノムと共に適当な細胞培養物(例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞)に導入され、相同組み換えによって本発明のポックスウイル粒子を産生する。それらは、培養上清またはリーシス工程(化学物質、凍結/融解、浸透圧衝撃、機械的衝撃、超音波処理など)後の培養細胞から回収することができ、必要ならば、連続的なプラーク精製処理によって野生型混入物質から単離し、当該技術分野の手法(クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたはスクロースグラディエント上での超遠心)を用いて精製することができる。
【0074】
本発明は、特定のターゲット細胞を優先的にターゲッティングする目的で修飾したベクターまたは粒子も包含する。(ポリマーおよび脂質と複合体形成したベクターのようなウイルスおよび非ウイルス性の)本発明の標的設定ベクター/粒子の特徴は、細胞および表面露出成分またはコラーゲンのような細胞外マトリックス(ECM)を認識し且つ結合することができるターゲッティング残基がその表面に存在することである(Hall et al., 2000, Human Gene Therapy 11, 983−993)。このようなターゲッティング残基としては、化学的接合体、脂質、糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー(例えば、PEG、ポリリシン、PEIなど)、ペプチド、ポリペプチド(例えば、WO94/40958号明細書に記載のJTS1)、オリゴヌクレオチド、ビタミン、抗原、レクチン、抗体、およびそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。それらは、好ましくは細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原性エピトープ、または腫瘍関連マーカーを認識し且つ結合することができる。
【0075】
細胞型特異的ターゲッティングは、ウイルス表面タンパク質の修飾によって広汎な宿主範囲を有するウイルス由来のベクターを用いて行うことができる。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容細胞の表面にある細胞受容体への付着によって決定される。これに関して、アデノウイルスキャプシドの表面に存在する繊維およびペントンが、細胞付着に重要な役割を果たす(Defer et al. J. Virol. 64 (1990) 3661−3673)。従って、アデノウイルスの細胞ターゲッティングは、繊維および/またはペントンをコードするウイルス遺伝子の遺伝子修飾によって行い、ユニークな細胞表面受容体と特異的に相互作用できる修飾した繊維および/またはペントンを生成することができる。このような修飾の例は、文献に記載されている(例えば、Wickam et al., 1997, J. Virol. 71, 8221−8229 ; Amberg et al., 1997, Virol. 227, 239−244; Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660−668; WO94/10323号明細書)。例えば、アデノウイルス繊維をコードする配列中にEGFをコードする配列を挿入することによって、EGF受容体発現細胞をターゲッティングする。
【0076】
他の細胞特異的なターゲッティングの方法は、抗体または抗体断片をレトロウイルスエンベロープタンパク質に接合(Michael et al., 1993, J. Biol. Chem 268, 6866−6869; Roux et al., 1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 9079−9083; Miller and Vile, 1995, FASEB J. 9, 190−199, およびWO93/09221号明細書)、および核酸結合ドメインとターゲッティング残基を有するポリペプチドの接合(WO95/28494号明細書)によって行われている。
【0077】
本発明は、本発明による発現カセットまたはベクターを含んでなる、または本発明によるウイルス粒子によって感染した真核宿主細胞も提供する。本発明に関連して、「真核宿主細胞」という用語は、本発明で用いられるSMC特異的プロモーターおよび/または筋特異的エンハンサーに含まれるシス作用配列と相互作用できる1または数個の転写因子を含んでなる任意の細胞を表す。このような細胞は、ユニークな種類の細胞または異なる種類の細胞であってもよく、哺乳類由来の培養細胞系、一次細胞および増殖細胞を包含するが、ヒト由来のものが特に好ましい。好ましい真核宿主細胞としては、繊維芽細胞および筋細胞(例えば、心筋細胞、筋繊維芽細胞およびSMC、特に血管SMCが挙げられる。後者の中では、動脈SMCが特に好ましく、特に中間部および血管内膜SMCが好ましい。
【0078】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞、および場合によっては、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる医薬組成物も提供する。特別な場合には、この組成物は、2種類以上の発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核宿主細胞であって、(i)筋特異的エンハンサーおよび/または(ii)SMC特異的プロモーターおよび/または(iii)治療遺伝子および/または(iv)ベクター主鎖の性質が異なることがあるものを含んでなることができる。
【0079】
本発明による組成物は、全身、局所および局部化投与などの様々な投与用式のために通常の方法で製造することができる。全身投与には、注射、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、鞘内、心臓内(例えば、経心臓内(transendocardial)および心膜)、筋肉内、腫瘍内、肺内、気管内、冠動脈内または脳室内、および更に具体的には、血管内または動脈内注射が好ましい。投与は、単回投与または一定間隔を置いた1または数回の繰り返し投与で行うことができる。適当な投与経路および投薬量は、様々なパラメーター、例えば、治療を行う状態または疾患、疾患が進行した段階、予防または治療の必要性、および導入される治療遺伝子によって変化することができる。目安としては、ウイルス粒子を基剤とする組成物は、104〜1014iu(感染単位)の用量形態に処方することができ、有利には105〜1013iu、好ましくは106〜1012iuに処方することができる。力価は、通常の手法によって決定することができる。DNAベクターの用量は、好ましくは0.01〜10mg/kgであり、更に具体的には、0.1〜2mg/kgである。本発明の組成物は、例えば固形物(例えば、粉末、凍結乾燥形態)、液体(例えば、水溶液)などの様々な形態であることができる。
【0080】
好ましい態様では、本発明の組成物は、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなり、ヒトまたは動物の治療法に用いられる。この特別な場合には、キャリヤーは、好ましくは薬学上適当な注射可能なキャリヤーまたは希釈剤であって、用いられる投薬量および濃度ではヒトまたは動物体に毒性を持たないものである(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版 1980年, Mack Publishing Coを参照)。これは、好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、スクロース溶液によって提供されるように比較的低いイオン強度を有する。更に、これは任意の関連溶媒、滅菌した発熱物質不含水、分散媒、コーティング物質、および同等なものを含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤー、または希釈剤(例えば、Tris−HCl、酢酸塩、リン酸塩)、乳化剤、可溶化剤、またはアジュバントを含むことができる。医薬製剤のpHは、ヒトまたは動物での使用に適当なように適当に調整し、緩衝する。注射可能な組成物用のキャリヤーまたは希釈剤の代表例としては、水、等張食塩溶液であって、好ましくは生理学的pHで緩衝したもの(例えば、リン酸緩衝食塩水、Tris緩衝食塩水、マンニトール、デキストロース、ヒト血清アルブミンなどのポリペプチドまたはタンパク質を含むまたは含まないグリセロール)が挙げられる。例えば、このような組成物は、10mg/mlのマンニトール、1mg/mlのHSA、20mMのTris,pH7.2、および150mMのNaClを含んでなることができる。
【0081】
更に、本発明の組成物は、脂質(例えば、カチオン性脂質、リポソーム、WO98/44143号明細書に記載の脂質)、ヌクレアーゼインヒビター、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ(WO98/53853号明細書)、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート化剤(欧州特許第890362号明細書)などの1個以上の安定化物質を含み、動物/ヒト体内での分解を保存し、および/またはベクターの宿主細胞へのトランスフェクション/感染を改良することができる。このような物質は、単独でまたは組み合わせて(例えば、カチオン性 および中性脂質)用いることができる。これは、ポリリシンとラクトース(Midoux et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21, 871−878)またはポロキサマー407(Pastore, 1994, Circulation 90, I−517)とのゲル複合体などの動脈細胞での遺伝子導入を促進する傾向のある物質を含んでなることもできる。アデノウイルスタンパク質はエンドソームを不安定化し、DNAの細胞中への摂取を増進することができることも示されている。アデノウイルスを脂質と複合体形成したDNAベクターを含む溶液に混合すること、またはアデノウイルスに共有結合したポリリシンへのタンパク質架橋剤を用いるDNAの結合は、組み換え遺伝子の摂取および発現を実質的に改良することができる(Curiel et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 6, 247−252)。
【0082】
本発明の組成物は、特に、高血圧、アテローム発生、内膜過形成、血管形成術またはステント配置後の(再)狭窄、虚血、腫瘍性疾患(例えば、腫瘍および腫瘍転移)、良性腫瘍、結合組織疾患(例えば、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症)、目の血管形成疾患(例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障)、循環器疾患、脳血管疾患、糖尿病関連疾患および免疫不全症(例えば、慢性炎症または自己免疫)など、これらに限定されない血管(好ましくは動脈)および/または循環器に関連した障害、症状または疾患の予防または治療を目的とするものである。
【0083】
好ましい応用は、虚血性心疾患(急性または慢性)の予防または治療である。バルーン血管形成術は、閉塞した血管でバルーンを膨張させて、塞がった血管を開くことを伴う主要な治療法である。ステント配置を用いて、血流を回復させることも行われる。不運なことには、これらの治療法は、血管内壁を覆っている内皮細胞を傷つけ、SMCが再開通した血管に浸潤して二次的閉塞を引き起こすことが多い(再狭窄と呼ばれる過程)。ウイルス性の遺伝子治療を、この症例で応用して、バルーン血管形成術またはステント配置法によって生じた損傷にSMC増殖を阻害する産物をコードする治療遺伝子を送達することができる。
【0084】
本発明は、本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子、または真核宿主細胞を用いる、遺伝子治療によるヒトまたは動物体の疾患の治療または予防のための薬剤の調製をも提供する。
【0085】
本発明の範囲内では、「遺伝子治療」とは、任意の発現可能な配列を細胞に導入する方法と理解すべきである。従って、これは、潜在的に抗原性を有するエピトープを細胞に導入して、細胞性または体液性、または両方であることができる免疫応答を誘導することに関する免疫治療をも包含する。
【0086】
好ましい態様では、このような使用は、循環器疾患の治療または予防を目的とする。このために、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、カテーテル、ステントなどのこの病理学に適合した特定の送達手段によってヒトまたは動物体にイン・ビボで送達することができる。例えば、本発明の発現カセット、 ベクターまたはウイルス粒子をコーティングしたバルーンカテーテルまたはステントを用いることができる(Riessen et al., 1993, Hum Gene Ther. 4, 749−758; Feldman and Steg, 1996, Medecine/Science 12, 47−55)。本発明に関する使用に適するカテーテルは、Advanced Cardiovascular Systems (ACS)、Boston Scientific、IVT、Target TherapeuticsまたはCordisのような商業的供給業者から入手可能であり、またはフランス国特許第00 08751号明細書に記載されている。例えば、カテーテルを好都合に大腿動脈に導入し、腸骨動脈および腹部大動脈中を逆方向に冠動脈に通すことができる。これらの手法の詳細な説明は、文献に見出すことができる(例えば、Rutherford, Vascular Surgery, 第3版(Saunders Co 1989))。本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を、外科手術後の動脈に直接送達することもできる。もう一つの代替法は、罹患した動脈に沿って治療薬を浸漬したグリッドフレームを導入する方法である(Feldman et al., 1995, J. Clin. Invest. 95, 2662−2671)。
【0087】
あるいは、本発明による発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を含むようにエクス・ビボで作製した真核宿主細胞を用いることもできる。このような要素の真核細胞への導入法は当業者に周知であり、微量のDNAの細胞核への微量投与(Capechi et al., 1980, Cell 22, 479−488)、CaPO4を用いるトランスフェクション(Chen and Okayama, 1987, Mol. Cell Biol. 7, 27452752)、電気穿孔(Chu et al., 1987, Nucleic Acid Res. 15, 1311−1326)、リポフェクション/リポソーム融合(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413−7417)、および粒子衝撃(Yang et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568−9572)が挙げられる。作製したSMCの移植を、本発明に関して行うこともできる(Lynch et al, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1138−1142)。
【0088】
本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法であって、上記生体に治療上有効量の本発明による発現カセット、ベクター、ウイルス粒子または真核細胞を投与することを含んでなる方法にも関する。
【0089】
「治療上有効量」とは、治療が所望な疾患または状態に普通に関連した1以上の症状の緩和に十分な容量である。予防的使用に関するときには、この用語は、疾患または状態の発症を予防または遅延させるのに十分な容量を意味する。
【0090】
本発明の方法は、上記疾患または状態の予防目的および治療応用に用いることができる。本発明の方法は、本明細書に記載の方法と類似の方法を用いて再狭窄の発症を防止しまたは血管形成術またはステント配置手続きの後の再狭窄を後退させる上で特に有用である。本発明の方法は、多種多様な方法のいずれによって行うこともできるものと理解すべきである。有利には、本発明の発現カセット、ベクターまたは医薬組成物は、任意の通常の生理学的に許容可能な投与経路によって、例えば、動脈内注射によってまたは血管系への適当なカテーテルなどによってイン・ビボで直接投与することができる。あるいは、本発明の発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を細胞中に導入し、トランスフェクション/感染細胞をイン・ビトロで増殖させた後、それらを治療を行う患者に再導入することからなるエクス・ビボ法を採用することもできる。
【0091】
トランスフェクション率を改良するために、患者はマクロファージ枯渇治療を行った後に本発明の組成物を投与することができる。このような手法は、文献に記載されている(例えば、Van Reopen et al., 1997, TibTech, 15, 178−184)。
【0092】
本発明の方法で自殺遺伝子を発現する発現カセットを含んでなる医薬組成物を用いるときには、発現した自殺遺伝子産物に特異的なプロドラッグの薬学上許容可能な量を追加的に投与するのが有利であろう。2回の投与を同時にまたは連続的に行うことができるが、好ましくはプロドラッグは本発明の組成物の後に投与する。例えば、50〜500mg/kg/日のプロドラッグ用量を用いることができるが、200mg/kg/日の用量が好ましい。プロドラッグは、標準的実施法に従って投与される。経口投与が好ましい。単回用量のプロドラッグ、または宿主生体またはターゲット細胞内に毒性代謝物を産生させるのに十分な時間反復される用量を投与することができる。上記のように、プロドラッグであるガンシクロビールまたはアシクロビールをTK HSV−1遺伝子産物と組み合わせて、および5−FCをシトシンデアミナーゼおよび/またはウラシルホスホトランスフェラーゼ遺伝子産物と組み合わせて用いることができる。
【0093】
疾患または状態の予防または治療は、本発明の方法を単独でまたは所望ならば現在利用可能な方法(例えば、放射線、化学療法、および血管形成術のような外科手術)と組み合わせて用いて行うことができる。
【0094】
本発明は、本発明によるキメラ構築物、SMC特異的プロモーター、発現カセット、ベクターまたはウイルス粒子を用いる、SMC、好ましくは動脈SMC、特に中間部および/または血管内膜由来のSMCでの特異的発現をも提供する。
【0095】
本発明は、非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスであって、本発明による発現カセットまたはベクターをそのゲノムに組込んで含んでなるものも提供する。このような動物は、通常のトランスジェネシス(transgenesis)法によって生成させることができ、且つ治療遺伝子の潜在的効果または活性、または本発明の発現カセットに含まれるSMC特異的プロモーターおよび/または筋特異的エンハンサーの調節を検討するためのモデルとして用いることができる。
【0096】
本発明を例示的に説明してきたが、用いてきた用語は単語に性質が制限よりはむしろ説明を目的とするものであることを理解すべきである。明らかに、本発明の多くの修飾および変更が、上記教示の観点で可能である。従って、特許請求の範囲内では、本発明は、本明細書に具体的に記載されているものとは異なる方法で実施することができることを理解すべきである。
【0097】
上記で引用した特許明細書、公表文献およびデーターベースの記載事項の総ての内容は、それらの個々の特許明細書、公表文献または記載事項が具体的且つ個別的に引用されるのと同程度にその開示の一部として本明細書に引用される。
【0098】
下記の例により、本発明を説明する。
例
発現カセット
下記の様々な構築物に用いるアデノウイルスゲノム断片は、Chroboczek et al. (1992, Virol. 186, 280−285)に開示されているAd5ゲノムのヌクレオチド配列におけるそれらの位置に従って正確に得られる。
【0099】
標準的クローニング法(Sambrook et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー, ニューヨーク)を用いて、下記の発現カセットを生成させた。
【0100】
AdCMVeGFPを、ヒトCMV前初期エンハンサー/プロモーター (Boshart et al., 1985, Cell 41, 521−530)に続いてeGFP配列をE1欠失領域に挿入することによって構築した(Cormack et al., 1996, Gene 173, 33−38)。
【0101】
AdSM22eGFP、AdSM−MHC/SM22eGFP、AdCK/SM22eGFPは、p445nlzから単離したCMVプロモーターを510bpのネズミSM22αプロモーター(転写開始部位に対して−445〜+65)で置換することによって得た(Moessler et al., 1996, Development 122,2415−2425)。次に、ネズミSM22αプロモーターを、ヒト筋肉クレアチンキナーゼエンハンサー(CKenh;−919〜−711)(配列番号:3; Trask et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 17142−17149)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(SM−MHCenh−1332〜−1225;配列番号:2)(Kallmeier et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 30949−30957)と組み合わせた。これらのエンハンサーをPCRによって単離し、プロモーターのすぐ上流にクローニングした。PCR増幅法は、当業者には知られている(例えば、PCRプロトコール−方法および応用の指針(PCR protocols − A guide to methods and applications), 1990, Innis, Gelfand, Sninsky and White著, Academic Pressを参照されたい)。簡略に説明すれば、PCR反応は、鋳型として1μgのヒト(CKenh)またはウサギ(SM−MHCenh)ゲノムDNA、50pmolの下記の特異的プライマー:CKenhフォワード5’−AACCGCTCGAGGGCCACCCAGGGCCCCGTG−3’(配列番号:4)、CKenhリバース5’−TTCCGCTCGAGCTCGGTCGCCGGGAAAGGAG−3’(配列番号:5)、SM−MHCenhフォワード5’−AACCGCTCGAGGCGCGGGGTGCAGGGTGC−3’(配列番号:6)、SM−MHCenhリバース5’−TTCCGCTCGAGAATTCCCAGCG CCGCATACCA−3’(配列番号:7)、250μMのdNTP(Sigma,サン・ケンチン・ファラビェール,フランス)および2.5UのTaq−DNAポリメラーゼ(Qiagen, クルタベーフ, フランス)を用いて行った。増幅は、94℃で1分間、60℃で1分間、72℃で1分間で50サイクル行った。
【0102】
AdSM22IFNγ、AdSM−MHC/SM22IFNγ、AdCK/SM22IFNγは、eGFP配列をRT−PCRによって単離したラットIFNγ配列(Genebank受託番号AF010466)で置換することによって得た。簡単に説明すれば、総RNAは、TRIZOL Reagentを用いて製造業者(Sigma)の指示に従ってラット脾臓から抽出した。2μgの総RNAを、ランダムプライマーp(dN)6(Roche−Diagnostics, メイラン, フランス)100pmolの存在下で70℃で10分間変性した後、逆転写酵素(SuperScript II, Life Technologies)200UおよびそれぞれのdNTP0.1mMの存在下にて、37℃で90分間20μlの最終容積で逆転写した。反応は、混合物を95℃で5分間加熱することによって停止した。増幅は、上記と同様にして2種類の特異的プライマー(IFNγ フォワード: 5’−AACCGGAATTCCGGATGAGTGCTACACGCCGCGT3’(配列番号:8)、IFNγリバース 5’−TTCCGGAATTCCGGTCAGCACCGACTCCTTTTCC3’(配列番号:9)(Genebank受託番号AF10466)を用いて行った。
【0103】
ラウス肉腫ウイルス(RSV)3′の長い末端反復プロモーターによって操作されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を含むAdRSVLacZは、以前に報告された(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。AdSM22LacZは、RSVプロモーターを510bpのSM22αプロモーターで置換することによって得た。
【0104】
AdAPEG−lenh/SM22eGFPは、ヒトAPEG−1遺伝子のエンハンサーをネズミSM22αプロモーターと組み合わせることによって得た。プライマー1(配列番号:10; 5’TCGAGCTTCCCCTCCCCCCAGGGCTGGCTC 3’)およびプライマー2(配列番号:11; 5’CAGCTGAGGCCCCGCACTGAGCCAGCCCTGGGGGGAGGG−GAAGC3’)25pmolを30μlの最終容積で混合した。温度を5分間で95℃まで増加し、溶液をゆっくり室温に戻した。同時に、この操作をプライマー3(配列番号:12, 5’AGTGCGGGGCCTCAGCTGGGTCAGCGAGTGAGTGGGGCTGGCCAGG−CTGAG3’)および4(配列番号:13; 5’TCGACTCAGCCTGGCCAGCCCCAC−TCACTCGCT GACC 3’)について行った。次に、これらの対1/2および3/4を、同じプロトコールを用いてハイブリダイゼーションした。最終生成物は、5′末端に開いたXhoI制限部位と3′末端に開いたSalI部位を示す。それらを用いて、ユニークSalI部位においてSM22αプロモーターに対してすぐ5′のAPEG−1エンハンサーをクローニングした。
【0105】
ヒトSM22αプロモーターは、上記のように鋳型としてヒトゲノムDNAおよび配列番号:15(フォワード)および16(リバース)に記載のプライマーを用いてPCRによって単離した。SalIおよびEcoRVによって消化された増幅断片を、ネズミプロモーターの代わりにSalIおよびEcoRVによって制限されたAdSM22eGFPでクローニングした。CKおよびMHCエンハンサーを、上記のようにヒトSM22αプロモーターに組み合わせた。
【0106】
エンハンサー配列を含むネズミカルポニン遺伝子のイントロンIは、鋳型としてマウスゲノムDNAおよび配列番号:17(フォワード)および18(リバース)に記載のプライマーを用いて、前に記載した実験条件下で行ったPCRによって単離した。ネズミカルポニンエンハンサーを、ヒトSM22αプロモーターの下流(3′)に挿入して、目的のレポーターeGFP遺伝子または治療遺伝子を発現させることができる。
【0107】
ウイルスの構築、産生および滴定
総てのウイルスベクターを、以前に報告されているように(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805−4810)、Escherichia coli BJ5183(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557−580)中で相同組み換えによって感染性プラスミドとして構築した。それらは、総てE1領域(ヌクレオチド459〜ヌクレオチド3327)およびE3領域(ヌクレオチド28593〜ヌクレオチド30469)において欠失を有した。筋特異的エンハンサーを有するまたは持たないプロモーター配列に続いてレポーターまたは治療遺伝子およびSV40ポリアデニル化シグナルを含む発現カセットは、E1に位置した。幾つかのベクター(表1参照)は、プロモーターとコード領域との間に挿入されたキメライントロンを含んでいた。このイントロンは、ヒトβ−グロブリンイントロン1由来のスプライスドナーとpCIプラスミド (Promega, シャルボンニェール, フランス)から得たIgG介在配列由来のスプライス受容体とを組み合わせることによって生成した。アデノウイルス主鎖に対する発現カセットの2つの配向を評価した。アデノウイルスプラスミドを最初にPacIで消化して、アデノウイルスゲノムを放出した後、293相補性細胞系(ATCC CRL1573)でトランスフェクションした。ウイルス増殖、精製、およびウイルスDNA結合タンパク質の間接免疫蛍光による感染単位(iu)の滴定は、以前に報告されている方法で行った(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。精製したウイルスは、ウイルス保管緩衝液(1Mスクロース、10mM Tris−HCl[pH=8.5]、1mM MgCl2、150mM NaCl、0.005%[容積/容積]Tween 80)中に保管した。
【0108】
細胞および培養条件
一次ラット胸部大動脈SMCおよび一次ブタ冠動脈SMCを、SMC細胞として用いた。ヒト肺上皮 A549およびネズミ筋原細胞C2C12細胞系を、非SMCコントロールとして用いた。ラット胸部大動脈SMCは、正常ラット(ラットAo)およびバルーンカテーテルによる内皮除去(deendothelialization)から15日経過した損傷ラット(ratIT15)から以前に報告されている酵素消化によって単離した(Orlandi at al., 1994, Arterioscler. Thromb. 14, 982−989)。ブタ冠動脈SMCは、正常ブタ(pigCo)およびステント配置から15または30日経過した損傷動物から以前に報告されている酵素消化によって単離した(Christen et al., 1999, Circ. Res. 85, 99−107)。A549およびC2C12細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection; ATCC CCL−185およびCRL−1772, マナサス, バージニア)から購入した。細胞は、感染中および後であって、それらを2%FCS含有培地(C2C12を10%FCS中に保持して融合を防止した)で増殖させたことを除き、10%FCS含有DMEM(Life Technologies, セルジュ−ポントワーズ, フランス)中で培養した。ヒトSM細胞 (Hu CoおよびHu Ao)およびHUVECはBiowhittaker Inc(ウォーカーズビル, メリーランド21793, アメリカ合衆国)から得て、製造業者の指示に従って培養する。
【0109】
イン・ビトロ実験
様々な細胞型のアデノウイルス感染の感染性を、AdCMVeGFPの様々な感染多重度(MOI)を用いて決定した。2×105個の細胞/ウェル(C2C12: 細胞数を5×104個にして融合を防止)をD0に6ウェルプレート(Falcon, Becton Dickinson, ポン・ドゥ・クレス, フランス)に播種し、D1で感染させ、D2で収穫した。それらを、4%ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝食塩水(PBS)で5分間固定し、PBSで2回洗浄し、293gで5分間遠心分離し、1mlPBSに再懸濁した。細胞の発現率を、フローサイトメトリー (FACSCalibur, Becton Dickinson)によって決定した。更に、eGFPを用いるイン・ビトロ実験を、最適MOI(例えば、有意な毒性のない感染細胞の比率を最高にするMOI)で行った。感染細胞100%に相当するMOIでも、ラット、ネズミおよびヒト細胞について、毒性効果は見られなかった(ラットAo: MOI300;ラットIT15:MOI10;A549:MOI50;およびC2C12:MOI100)。ブタSMCについては、細胞の50%だけが感染したが、毒性はなかった(ブタCo:MOI200;ブタIT15:MOI500)。
【0110】
eGFP発現の定量分析は、フローサイトメトリーによって行った。簡単に説明すれば、細胞を、D4で回収したことを除き上記と同様に感染させ、eGFPを蓄積した。様々な調節配列の強度を、GFP陽性細胞の百分率と平均蛍光値との積として計算した総蛍光係数(GFI)を用いて測定した(Massie et al., 1998, Cytotechnology 28, 53−64)。細胞増殖阻害実験については、D0に細胞を6ウェルプレート(Falcon, Becton Dickinson)に3×104個の細胞/ウェルの密度で播種し、D1にAdSM22IFNγ、,AdSM−MHC/SM22IFNγ、AdCMVIFNγに感染させた。培養物を10%FCS含有培地に保持し、細胞をD4に計数した。培地の試料をD3に回収し、ELISAキット(Quantikine MラットIFNγ, R & D systems, アビングドン, 英国)を用いて分泌されたラットIFNγを定量した。
【0111】
イン・ビトロでのマウスへの遺伝子導入
9週齢の雌の免疫適格マウス(C57BL/6, Iffa−Credo, ルアーブル, フランス)を用いて、SM−特異的発現カセットの発現パターンを検討した。D0で、アデノウイルスベクターを2×109iu/100μl保管緩衝液の用量で静脈内投与し、臓器(肝臓、肺、脾臓および心臓)を取り出し、2%ホルムアルデヒドを含有するPBS中で固定した。eGFP発現を、蛍光顕微鏡によって評価した。
【0112】
イン・ビボでのラット頸動脈への遺伝子導入
成熟した雄のWistarラット(体重>400g)を実験に用いた(Iffa−Credo)。麻酔は、ケタミン(Imalgene, RhoneMerieux, リヨン, フランス)およびアセプロマジン(Vetranquil 0.5%, Sanofi, Libourne, フランス)をそれぞれ23.1および3.84mg/kgの用量で腹腔内投与して行った。ヒトヘパリン(Choay, Sanofi Winthrop, Gentilly, フランス)200U/kgを静脈内投与して、動物の血液凝固を阻害した。左総頸動脈を外科手術により露出させ、左外頸動脈について動脈切開を行った。内皮除去(deendothelialization)は、0.2mlの空気を満たした2F Fogartyバルーンカテーテル(Baxter, Maurepas, フランス)を3回通すことによって行った。1cmの長さの頸動脈の切片をマイクロサージャリークランプで単離し、24ケージ度のカテーテルを動脈切開によって通した。切片を0.2mlの0.9%NaClで洗浄し、アデノウイルス溶液(2×109iu)を注入した。この溶液を頸動脈で5分間停止させ、その間に頸動脈切片は膨張したままであった。溶液を抜き取り、外頸動脈を結紮し、総および内頸動脈中に血流を回復させた。ラットを、異なる実験に従って様々な時点で塗擦した。致死量のペントバルビタールを投与し、心挿管の後、血管に1×PBS溶液を灌流させ、2%または4%ホルムアルデヒド/PBSで正常血圧で灌流を固定した。次いで、頸動脈を摘出し、様々な組織学的分析のために処理した。
【0113】
組織学および免疫細胞化学分析
SM22αの免疫組織化学染色は、4%ホルムアルデヒドで固定しパラフィン埋設した頸動脈の4μmの厚みの切片について行った。切片からパラフィンを除去し、3%H2O2を含む蒸留水に10分間浸漬した。次に、切片を、E−1I SM22αマウスモノクローナル抗体(Dr. S. Sartoreより厚意により提供を受けた; Faggin et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19, 1393−1404)を1:100の希釈倍率で用いて、室温にて1時間インキュベーションした。二次抗体は、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体であり、1:100の希釈倍率で用いた。SM22αの存在は、ストレプトアビジン−ビオチン複合体ペルオキシダーゼ法によって確かめた(LSABキット, Dako, トラプス, フランス)。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色した。β−ガラクトシダーゼ活性については、2%ホルムアルデヒドで固定した血管をPBSで洗浄し、5mM K3Fe(CN6)、5mM K4Fe(CN6)、2 mM MgCl2、1mg/ml 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal)中で37℃にて24時間インキュベーションした。次に、頸動脈をPBSで洗浄し、5%ホルムアルデヒド/PBS中で4℃にて24時間後固定し、脱水して、パラフィンに埋設した。5μm切片を、青色核染色について検討した。形態学的分析については、4%ホルムアルデヒドで固定した動脈をパラフィンに埋設した。5μm切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。中間部および血管内膜面積並びに細胞数を、画像分析によって評価した(Scion Image)。
【0114】
ウイルスDNA分析
総DNAを、以前に報告されている方法で臓器から抽出した(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022−2032)。DNA(10μg)をSalIによって消化し、総eGFPcDNAに相当する32Pを標識した制限断片を用いてサザンブロット法によって分析した。DNAの性質および量は、導入の前にケージを臭化エチジウムで染色することによって観察した。
【0115】
統計分析
総ての結果は、平均値±SEMとして表した。統計学的評価のため、これらの結果をt−検定によって分析した。差は、P<0.05の値で統計学的に有意であると考えた。
【0116】
例1:アデノウイルスに関するネズミSM22αプロモーターの機能性および特異性
表1にまとめたように、4種類のアデノウイルス構築物を、ヒトアデノウイルス節制型5のE1欠失領域におけるSM22αプロモーターによってのみ発現するeGFP発現カセットを挿入することによって生成した。アデノウイルスの内調節要素との相互作用を防止および/または検出するため、カセットを2つの配向のそれぞれでクローニングした。mRNAを安定化させるイントロンの効果も試験した。
【0117】
【表1】
【0118】
A.SMCおよび非SMC細胞系のアデノウイルスへの感染性
ラット大動脈およびブタ冠動脈由来のSMCおよびA549コントロール細胞のアデノウイルスへの感染性を、1〜1000の範囲のMOIでAd−CMV/eGFPを用いて感染させることによって決定した。非毒性MOIでは、50%のブタ細胞しか感染しなかった。例えば、MOI500〜MOI700では、それぞれ50±2%および56±2%のブタIT15に感染した細胞の数には有意な変化は見られなかった。最適感染(ラット細胞について100%、およびブタ細胞について50%)に相当するMOIはラット血管内膜細胞についての10からブタIT15細胞についての500まで変動したので、SMC感染に大きな変動が見られた。
【0119】
感染性が異なることにより、細胞を4種類のアデノウイルスベクターに感染させ、eGFP発現を蛍光顕微鏡によって評価した。マウスSM22αプロモーターによって発現される4種類の構築物を比較したとき、発現レベルは強度および特異性に関して有意差は見られなかった。実際に、発現は総てのSMCで検出されたが、A549では発現はほとんどまたは全く見られなかった。次に、AdSM22eGFPを選択して、更にイン・ビボ実験を行った。これは、アデノウイルス主鎖に対してセンス配向でSM22αプロモーターによって行われ且つイントロンを備えたeGFP発現カセットを含んでいる。
【0120】
B.SM22αプロモーター活性に対する細胞分化の効果
A549、ラットAoおよびラットIT15に、50%および100%感染細胞に相当するMOIでAdSM22eGFPまたはコントロールAd−CMV/eGFPを0日目に感染させた。次に、これらの細胞を、2%(分化状態)または10%(増殖状態)FCSを含む培地で3日間培養し、SM22αによって行われるeGFP発現に対する細胞分化の効果を検討した。予想されたように、eGFP発現が強度は異なったがAd−CMV/eGFPに感染した総ての細胞型で見られた。AdSM22eGFPに感染すると、非SM細胞系(A549)はeGFP蛍光を欠いた。一方、ラットAoでは、特に低血清条件で強い蛍光が見られたが、高濃度の血清を含む培地では減少した。ラットIT15では、蛍光は低血清条件にのみ見られた。これらのデーターは、SM22αによって行われる発現がアデノウイルスベクターに関してSMC特異的のままであることを示している。高濃度の血清の存在下で蛍光がないかまたは減少することは、SMCにおいて、SM22αプロモーターが少なくとも細胞分化状態に関して示差的に調節されることを示している。
【0121】
C.SM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
マウスSM22αプロモーターによって駆動されるeGFP発現を、2種(ブタおよびラット)であって、正常(大動脈Aoおよび冠Co)または再狭窄(IT15)のSMC、および非SMC(A549)における強力なCMVプロモーター/エンハンサーで得たeGFP発現レベルと定量的に比較した。細胞を高密度で播種し、最適感染(ブタ50%、ラット100%)に相当するMOIで翌日感染させた。eGFP発現のレベル(eGFPを発現する細胞の画分およびその蛍光強度)を、3日後にフローサイトメトリーによって分析した。CMVおよびSM22αプロモーターの相対強度を総蛍光係数を用いて比較し、図1に示す。
【0122】
CMVによって行われる発現の総蛍光係数は、試験したそれぞれの細胞型で100%で任意に設定した。SM22αプロモーターに関しては、弱いeGFP発現がA549細胞(CMVによる発現の2.0%)で見られた。総てのラットおよびブタSMCでは、マウスSM22αプロモーターは、一層高いeGFP発現を生じ、ラットAoでの5.7%、ブタCoでの6%、ラットIT15での8.8%からブタIT15での15.3%までの範囲であった。
【0123】
D.MOIのSM22αによって行われる発現への影響
NKκB因子の刺激により、ヒトVSMC(Cleesham et al., 1998, Gene Ther. 5, 174−180)またはHepG2のような確立した細胞系(Loser et al., 1998, J. Virol. 72, 180−190)で示されるように、ウイルス荷重が細胞生理学およびプロモーター活性に影響を与えることがあることが示唆されている。従って、CMVプロモーターは多くの他のプロモーターと同様に、完全に活性なNFκBの存在によって変化する。
【0124】
高ウイルス荷重の導入遺伝子発現に対する影響を決定するため、ラットAo、ラットIT15、ブタCoおよびブタIT15を、最適感染を行うウイルス用量(ラットIT15ではそれぞれMOI10、50および100、ラットAoではMOI300および500、ブタCoではMOI200、300および400、およびブタIT15では500、600および700)から開始する異なるMOIで感染させた。
【0125】
ラットAoおよびブタCoでは、ウイルス用量を増加したところ(それぞれMOI300〜500およびMOI200〜400)、SM22αプロモーター によって行われる発現は5倍に増加したが、CMVによって行われる発現は変化しないままであった。ラットIT15では、eGFP発現はCMVおよびSM22αプロモーターのいずれでもウイルス用量と共に異なる比率であるが増加した。ウイルス濃度の10倍の増加(MOI10から100)により、SM22αプロモーターを用いる蛍光では3倍の利得があり、CMVでは8倍になった。同様に、ブタIT15では、eGFPをSM22αプロモーターよりはCMVプロモーターによって制御するときに、蛍光は一層速やかに増加した。MOIを500から700へ増加しても、SM22α関連発現には有意な変化はなく、このときCMVプロモーターでは発現は2倍の強さであった。
【0126】
中間部細胞(AoおよびCo)と比較して血管内膜細胞(IT15細胞)の増殖状態が高いことにより、ウイルスおよび細胞プロモーターの調節に影響すると思われる。これは、必要な転写因子の存在下での主要な差によることがある。従って、SM22αとCMVプロモーターの厳密な比較には、最適感染に相当するMOIおよび重複感染が回避される条件下での分析が必要である。
【0127】
例2:SM22αプロモーターイン・ビボ評価
A.マウスにおけるSM22αプロモーター特異性の評価
静脈内または動脈内投与の後の血液循環におけるアデノウイルスベクターの散在は、特にそれらを潜在的に有害な治療遺伝子(例えば、細胞傷害性)を送達するのに用いるときには、重要な問題である。SM22αによって駆動される発現が主要なアデノウイルスの天然のターゲット臓器(例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓)の一つでは起こらないことを立証するため、SM22αプロモーターを含む4種類のアデノウイルス構築物(表1参照)をC57B16免疫適格マウスに投与した。Ad−CMVeGFPベクターおよびTris−HCl注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。4匹のマウスにそれぞれの構築物2×109iuを静脈内投与し、eGFP発現を様々な臓器の蛍光顕微鏡検査によって3日後に決定した。サザンブロット法分析を、アデノウイルス特異的プローブを用いて上記臓器から抽出したDNAで行った。総てのマウスで同様なウイルスDNA量が認められ、正確な感染を示していた。
【0128】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、SM22αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、マウスSM22αプロモーターの組織特異性が確かめられる。この特異性は発現カセット配向から独立しており、アデノウイルス配列はイン・ビボでプロモーター特異性を妨げないことを示していた。
【0129】
B.ラット頸動脈損傷モデルでのSM22αプロモーターの評価
アデノウイルスベクターの治療能を評価するため、RSV(Ad−RSV/LacZ)またはSM22α(Ad−SM22/LacZ)プロモーターの制御下でLacZ細菌性遺伝子を含む2種類のアデノウイルスベクターを、例1に記載の通りに生成させ、ウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈を損傷したラットモデルの頸動脈から単離した切片に2・109iuを5分間点滴した。7日後、Ad−RSV/LacZ およびAd−SM22/LacZに感染した頸動脈を、β−ガラクトシダーゼについて染色した。
【0130】
これらのウイルスに感染した総ての検討した血管は、中間部に青色染色を示し、発生期の血管内膜には青色細胞はほとんど見られなかった。感染中間部細胞は、一般的に血管内膜構成によって取り囲まれている。これらの結果から、Ad−SM22/LacZは病的条件においてもSMCターゲット細胞に感染することができることが確かめられる。
【0131】
要するに、これらのデーターは、SM22αプロモーターはアデノウイルスに関連してイン・ビトロおよびイン・ビボでレポーター遺伝子(eGFPおよびβ−ガラクトシダーゼコード遺伝子)のSMC特異的発現を生じることを示している。中間部および血管内膜起源のラットおよびブタSM細胞で試験したところ、このプロモーターは、強力なウイルスCMVエンハンサー/プロモーターの6〜15%の発現レベルを示した。
【0132】
例3:アデノウイルスに関連したキメラSM22αプロモーターの機能性および 特異性
A.キメラSM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
SM22αプロモーターをCKまたはMHCエンハンサーと結合するキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にレポーター遺伝子としてのeGFPコード遺伝子を用いてイン・ビトロで試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、次にそれらを正常(ラットAo)、再狭窄(ラットIT15)SM細胞および非SM細胞(A549)での強力なCMVエンハンサー/プロモーターと比較した。比較を容易にするため、CMVによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に100%に設定した。比較データーを、図2に示す。
【0133】
A549での非特異的発現レベルは、いずれのキメラ構築物でもマウスSM22αプロモーターのみと比較して減少する(A549では、それぞれ0.5%対2%)CKエンハンサーの存在により、ラットAoおよびラットIT15ではeGFP発現が約3倍だけ増加し、それぞれCMV関連発現の15.8%および21.3%となった。MHCエンハンサーを組込んだベクターは、いずれの型のSMCでも一層高い発現レベルを生じ、ラットAoではCMV発現の16.9%となり、ラットIT15では23.5%となった。
【0134】
CKエンハンサーが骨格筋に由来するため、キメラベクターをネズミ筋原細胞中でC2C12細胞系を用いても試験した。意外なことには、eGFP蛍光の強度は試験した総ての構築物(SM22αプロモーター単独またはCKまたはMHCエンハンサーと組み合わせたもの)で同じであり、A549細胞系で観察された強度と同じ範囲であった(CMVプロモーターの約1.7%)。コントロールとして、CMVエンハンサー/プロモーターによって行われるeGFP発現が、高レベルで観察される。従って、CKenhをマウスSM22αプロモーターと組み合わせてSMC特異性に有利になるようにすると、骨格特異性は失われる。これらのデーターから、MHCenh/SM22αおよびCKenh/SM22α キメラベクターのSMC特異性が立証される。
【0135】
B.キメラベクター関連発現に対する細胞分化の効果
SM22αを単独でまたはCKまたはMECエンハンサーと組み合わせて含む構築物を、2または10%FCSの存在下で培養したラットAo中で試験し、発現に対する細胞増殖/分化の効果を測定した。総ての構築物を、CMVプロモーター/エンハンサーのような高濃度の血清の存在下でダウンレギュレーションした。従って、筋特異的エンハンサーCKおよびMHCをマウスSM22αプロモーターと結合するキメラ構築物は、分化マーカー(SM22α、SM−MHC、α−アクチン)の自然なレギュレーションに続き、分化した細胞で一層活性である。
【0136】
C.ラットIFNγを発現するアデノウイルスベクターのイン・ビトロ評価
MHCエンハンサーに結合したSM22αプロモーターによって行われるラットIFNγ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを、(それらの増殖を高めるため)10%FCSを含む培地で培養したラットIT15細胞でSMC増殖を防止する能力について試験した。ラットIT15感染も、CMVpro/アデノウイルスベクター(正のコントロール)およびCMVpro/eGFPアデノウイルスベクター(負のコントロール)を用いて行った。図3に示される結果は、観戦後のD4における増殖阻害率として表される。
【0137】
これらのキメラプロモーターの制御下でIFNγを発現するアデノウイルスを用いて得たラット細胞の増殖阻害は、CMVプロモーター/エンハンサーを含むウイルスで生じたものと同じ範囲であるかまたは若干高い(54%対59%)。負のコントロール(CMVpro/eGFP)で感染すると、感染していない細胞と比較して統計的には有意ではない弱い増殖阻害を生じた。
【0138】
感染細胞の上清を3日目に回収し、ELISAによって試験し、ラットIFNγ濃度を測定した。キメラMHCenb/SM22αプロモーターで得たIFNγ濃度を9ng/mlと評価し、CMVプロモーター/エンハンサーでは31ng/mlであった。
【0139】
例4:マウスでのキメラベクターのイン・ビボ評価
A.マウスにおけるSM22αプロモーター特異性の評価
肝臓、肺、脾臓および心臓でのeGFP発現は、例2に記載した通りにC57B16免疫適格マウスの尾静脈にSM22αを単独でまたはCKまたはMHCエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス2×109iu、Ad−CMV/eGFP(正のコントロール)またはTris−HCl(負のコントロール)を投与することによってチェックした。4匹の動物全部を、構築物に対して試験した。
【0140】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは、試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、SM22α含有ベクターを投与した総てのマウスは蛍光を全く示さなかった。
【0141】
SM22αに結合したCKエンハンサーのキメラ構築物を含むアデノウイルスの非平滑筋で遺伝子発現を指示する能力も検討した。AdCKenh/SM22eGFP 2×109iuを、C57B16免疫適格マウスに筋肉内経路(前頸骨筋)で投与した。AdCMVeGFPを、正のコントロールとして用いた。eGFP発現によって誘導された蛍光を、筋肉切片の顕微鏡観察によって評価した。AdCKenh/SM22eGFPを投与したマウスは蛍光を示さなかったが、Ad−CMV/eGFPを投与した総ての動物は骨格繊維の強い蛍光を示した。
【0142】
これらの結果により、本発明のキメラ構築物のSMCに限定された特異性が確認される。
【0143】
B.ラット損傷モデルでのキメラプロモーター/エンハンサーの評価
MHCエンハンサーに結合したSM22αプロモーターによって行われるラットIFNγの増殖抑制効果を、上記の例2で記載した通りにラット頸動脈バルーン損傷モデルで評価した。アデノウイルス2×109iuを、ラットの損傷頸動脈に局所投与した。コントロールラットには、CMVpro/IFNγ含有アデノウイルスを投与した。
【0144】
MHCenh/SM22αプロモーターまたはCMVプロモーターによって行うと、ラットIFNγはラット頸動脈モデルにおける血管内膜の肥厚化を部分的に阻害した。この阻害は、中間部面積が総ての群で同じままで、発現カセットを欠くコントロールアデノウイルスを注入したコントロールと比較して損傷が35%になって14日後に分析した。
【0145】
これらのデーターは、マウスSM22αプロモーターに結合した特異的なエンハンサー(MHCまたはCK)を有するキメラ構築物により、イン・ビトロでのCMVプロモーター/エンハンサー発現の25%まで到達する有意な一層強い特異的発現を生じた。イン・ビボでは、発現は動脈SMCに限定され、肝臓、脾臓、肺、心臓および骨格筋には検出可能なシグナルは見られなかった。ラットIFNを有するキメラベクターは、イン・ビトロでのラット大動脈およびIT15細胞の増殖を阻害するのに有効であった。更に、この増殖阻害は、CMVエンハンサー/プロモーターと同程度の強さであった。総合すると、これらのデーターは、本発明のキメラエンハンサー/プロモーター構築物が血管増殖疾患における治療遺伝子の特異的な発現に有用であることを示唆している。
【0146】
例5:アデノウイルスに関連してヒトSM22αプロモーターを供給した発現カセットの機能性および特異性
A.キメラヒトSM22αプロモーター活性のイン・ビトロ定量
ヒトSM22αプロモーター、またはヒトSM22αプロモーターをCKまたはMHCエンハンサーと結合したキメラプロモーターの発現の強度および特異性を、最初にイン・ビトロでeGFPコード遺伝子をレポーター遺伝子として用いて試験した。総蛍光係数の分析は上記と同様に行い、構築物の特異性を評価し、正常(ラットAo、ブタCo、huAo、huCo)、再狭窄(ブタIT15、ブタIT30)SM細胞および非SMHUVEC細胞中で強いCMVエンハンサー/プロモーターと比較した。比較を容易にするため、CMVによって行われる発現の総蛍光係数を、試験した総ての細胞型で任意に100%に設定した。ラットおよびブタ細胞に関する比較データーを、図4に示す。
【0147】
ラットAoでのヒトSM22α(hSM22α)プロモーターによって行われる発現は強く、CMV関連発現の約71%に達した。この発現はMHCエンハンサーまたはCKエンハンサーを添加することによってごくわずかであるが増加し、それぞれCMV関連発現の80%および97%となった。同様の結果がブタCoで見られ、eGFP発現をそれぞれhSM22αプロモーター、SM−MHC/hSM22αプロモーターおよびCK/hSM22αプロモーターで行った時には、CMV関連発現の110%、114%および170%となった。ブタIT15およびブタIT30では、hSM22αプロモーターによって行われる発現は、それぞれCMVプロモーター/エンハンサーで得られるものの約50%(ブタIT15)および70%(ブタIT30)である。発現レベルは、hSM22αプロモーターをMHCエンハンサーと関連させるときにはいずれの細胞でも同じ範囲のままであり、CKエンハンサーと関連させると若干増加する。
【0148】
予想されるように、総てのhSM22αプロモーター含有構築物を有する非SMHUVEC細胞では、eGFP発現のバックグラウンドしか検出されなかった(CMV関連発現の0.05%未満)。
【0149】
ヒト細胞(HuAoおよびHuCo)では、3種類の hSM22α含有ベクターによって行われるeGFP発現は、低レベルのものが得られたが、SMC特異的として決定した(CMV関連発現の約5%)。
【0150】
B. h SM22αプロモーター活性に対する細胞培養条件の影響
細胞培養条件がヒト細胞中でヒトSM22αプロモーター活性に影響を及ぼすことができるかどうかについての問題を検討した。従って、細胞集密性および血清濃度のこれらの細胞および引き続くhSM22αプロモーター活性化に対する影響を評価した。ヒト冠細胞を、2%または10%FCS含有培地に6ウェル/プレートにウェル当たり5×104または2×105個の細胞で播種した。
【0151】
2×105個の細胞密度で感染して2%血清の存在下で培養したヒト冠細胞で、eGFP遺伝子をそれぞれhSM22αプロモーター、MHC/hSM22αプロモーターおよびCK/hSM22αプロモーターの制御下に置いたとき、eGFP発現レベルをCMV関連発現の1.5%、2.5%、および4%として決定した。同様の結果は5×104の密度で感染したhuCoでも見られ、それぞれCMV関連発現の2%、5.5%および5.5%であった。ヒト冠細胞を10%血清含有培地で培養したときには、一層高い発現レベル(2.5〜4のファクターだけ増加)が得られた。2×105の密度での細胞感染では、それぞれhSM22α、MHC/hSM22αおよびCK/hSM22αプロモーターではeGFPの4%、6%および11%となり、一方同じ構築物を用いて、感染を低細胞密度(5×104)で行ったときには、発現はそれぞれ7.5%、17.5%および22%に達した。
【0152】
要約すると、hSM22αプロモーター含有ベクターによって行われるeGFP発現は、低細胞濃度(5×104)でのものより常に強かった。更に、血清画布くまれていると、3種類のhSM22α含有プロモーターによって行われる発現が有意に増加した。その結果、hSM22αキメラプロモーターで得られる発現レベルは、ヒトSM細胞を低集密性で感染させ且つ高血清濃度で培養したときには、CMVの約20%に達した。
【0153】
例6:ヒトSM22αプロモーターイン・ビトロ評価
A.マウスでのヒトSM22αプロモーター特異性の評価
hSM22αで行われる発現は主要なアデノウイルスの天然ターゲット臓器(例えば、肝臓、肺、脾臓および心臓)では見られないことを明らかにするために、hSM22αプロモーターを単独でまたはMHCまたはCKエンハンサーと組み合わせて含むアデノウイルス構築物を、C57B1/6免疫適格マウスに投与した。Ad−CMVeGFPベクターおよびTris−HCl注射を、それぞれ正および負のコントロールとして用いた。4匹のマウスにそれぞれの構築物2・109iuを静脈内投与し、eGFP発現を、上記のように3日後に様々な臓器の蛍光顕微鏡での検討によって決定した。
【0154】
Ad−CMV/eGFPを投与した4匹のマウスは試験した総ての臓器で有意な蛍光を示したが、hSM22αプロモーターを含むビリオンを投与した動物は蛍光を全く示さず、これによりヒトSM22αプロモーターのSMC特異性が確認される。
【0155】
B.ラット頸動脈損傷モデルでのMHC/ h SM22αプロモーターの評価
イン・ビボでのSMCでのMHC/hSM22α含有アデノウイルスベクターの能力を評価するため、CMV(AdCMVeGFP)またはMHC/hSM22α(AdMHC/hSM22eGFP)プロモーターによって制御されているeGFPを含むベクターを生成させ、上記のようにウイルス粒子にパッケージングした。頸動脈損傷を誘発させたラットモデルの頸動脈から単離した切片に、2・109iuを5分間点滴注入した。3日後、AdCMVeGFPおよびAdMHC/hSM22eGFPに感染した頸動脈を回収し、PBS/2%ホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡法によって分析した。AdCMVeGFPおよびAdMHC/hSM22eGFPに感染した血管は、有意な蛍光を示した。これらの結果から、MHC/hSM22αプロモーターはSMCでeGFP発現を行うことができるが、非SMCでは発現しないことが確かめられる。
【0156】
要するに、これらのデーターは、アデノウイルスに関連するhSM22α含有プロモーターは、レポーター遺伝子をイン・ビトロおよびイン・ビボでSMC特異的発現することを示唆している。中間部および血管内膜起源に由来するラット、ブタおよびヒトSM細胞で試験すると、これらのプロモーターは強力なウイルスCMVエンハンサー/プロモーターの5〜170%の範囲の発現レベルを示した。
【図面の簡単な説明】
【図1】
SMC(ラットAo、ラットIT15、ブタCoおよびブタIT15)およびA 549細胞でのSM22αプロモーター強度。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示される。それぞれの細胞型を、最適感染に相当するMOIでAdSM22eGFPまたはAdCMVeGFPに暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
【図2】
SM対非SM細胞でのネズミSM22αプロモーターを含むベクターの比較。SM22αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー(CK)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(MHC)と共に用いた。発現は、ラットIT15(黒棒線)、ラットAo(灰色棒線)、およびA549(白棒線)で分析した。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をSM22αプロモーター含有ベクターおよびAdCMVeGFPに適当なMOIで暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
【図3】
ラットIT15増殖に対するラットγIFNの効果。細胞をAdCMVIFN(AdSM−MHCenh/SM22IFN)、またはAdCMVeGFP (コントロール)に暴露し、4日後に計数した。IFNの増殖抑制効果を、感染していない細胞に対して評価した。
【図4】
SM細胞でのヒトSM22αプロモーターを含むベクターの比較。SM22αプロモーターは、単独でまたはヒトクレアチンキナーゼエンハンサー(CK)またはウサギSM−ミオシン重鎖エンハンサー(MHC)と共に用いた。発現は、ラットAo(黒棒線)、ブタCo(濃い灰色棒線)、ブタIT15(明るい灰色棒線)、およびブタIT30(白棒線)で分析した。結果は、CMV総蛍光係数の百分率として示す。それぞれの細胞型をSM22αプロモーター含有ベクターおよびAdCMVeGFPに適当なMOIで暴露した。総蛍光係数は、D3でフローサイトメトリーによって決定した。
Claims (28)
- 少なくとも1個の(ii)筋特異的エンハンサーに作動可能に連結した少なくとも1個の(i)平滑筋(SMC)特異的プロモーターを含んでなるキメラ構築物。
- 上記SMC特異的プロモーターが平滑筋α−アクチン、平滑筋ミオシン重鎖(SM−MHC)、平滑筋カルポニン、デスミンおよびSM22α遺伝子のプロモーターからなる群から選択される、請求項1に記載のキメラ構築物。
- 上記SMC特異的プロモーターがマウスSM22α遺伝子に由来する、請求項2に記載のキメラ構築物。
- 上記SMC特異的プロモーターがマウスSM22αプロモーターの転写開始部位の上流の445bp断片(すなわち、配列番号:1、1〜445位)内に包含される、請求項3に記載のキメラ構築物。
- 上記SMC特異的プロモーターがヒトSM22α遺伝子に由来する、請求項2に記載のキメラ構築物。
- 上記SMC特異的プロモーターがヒトSM22αプロモーターの転写開始部位の上流の445bp断片(すなわち、配列番号:14、1〜445位)内に包含される、請求項5に記載のキメラ構築物。
- 上記筋特異的エンハンサーが
a) 哺乳類α−アクチン、特に心臓、骨格または平滑筋α−アクチン、
b) 哺乳類トロポニン、特にトロポニンC、IまたはT、
c) 哺乳類 ミオゲニン、
d) 哺乳類ミオシン、
e) 哺乳類クレアチンキナーゼ、特にヒトまたはマウスクレアチンキナーゼ、
h) 哺乳類SM20遺伝子産物、
i) 哺乳類Timp4 (Tissue−inhibitor of metalloproteinase 4)、および
j) 哺乳類カルポニン
をコードする遺伝子のエンハンサーからなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のキメラ構築物。 - 上記筋特異的エンハンサーがウサギミオシン重鎖コード遺伝子に由来する、請求項7に記載のキメラ構築物。
- 上記筋特異的エンハンサーがウサギミオシン重鎖コード遺伝子の転写開始部位の上流約−1332〜約−1225位(すなわち、配列番号:2)に配置されている、請求項8に記載のキメラ構築物。
- 上記筋特異的エンハンサーがヒトクレアチンキナーゼ遺伝子の転写開始部位の上流約−919〜約−711位(すなわち、配列番号:3)に配置されている、請求項7に記載のキメラ構築物。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラ構築物の制御下に置かれた目的の遺伝子を含んでなり、ターゲット細胞でそれを発現させる、発現カセット。
- 上記目的の遺伝子がSMC上で増殖抑制活性を有するポリペプチドをコードする、請求項11に記載の発現カセット。
- 上記ポリペプチドがIFNβ、IFNγ、酸化窒素シンターゼeNOS、Fasリガンド、ヘムオキシゲナーゼ、インターロイキン−10、およびヘパリン結合VEGF、好ましくはそれぞれがヒト由来のもの、からなる群から選択される、請求項12に記載の発現カセット。
- 上記発現カセットが1個以上のエキソンまたはそれらの部分をも含んでなる、請求項11〜13のいずれか一項に記載の発現カセット。
- +1位〜約+65位まで伸張しているマウスSM22α遺伝子の第一の非コードエキソンの部分(すなわち、配列番号:1、446〜510位)または+1〜約+63位まで伸張しているヒトSM22α遺伝子の第一の非コードエキソンの部分(すなわち、配列番号:14、446〜508位)を含んでなる、請求項14に記載の発現カセット。
- 請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセットを含んでなるベクター。
- 上記ベクターがヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、フォーミーウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、AAV(アデノ随伴ウイルス)、ポックスウイルス、レトロウイルスおよびアデノウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである、請求項16に記載のベクター。
- 上記ウイルスベクターが複製欠陥アデノウイルスベクターである、請求項18に記載のベクター。
- ターゲット細胞の目的の遺伝子をSMC特異的に発現させるウイルス粒子の製造方法であって、
a) 許容細胞系に請求項17または18に記載のウイルスベクターを導入し、
b) 工程a)で得た許容細胞系を適当な時間適当な条件下で培養して、上記ウイルス粒子を産生させ、
c) 細胞培養物から上記ウイルス粒子を回収し、
d) 場合によっては、回収したウイルス粒子を精製する
工程を含んでなる、方法。 - 請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、または請求項19に記載の方法によって得られる、ウイルス粒子。
- 請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、または請求項20に記載のウイルス粒子に感染した、真核宿主細胞。
- 上記細胞が血管平滑筋である、請求項21に記載の真核宿主細胞。
- 請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクター、請求項20に記載のウイルス粒子、または請求項21または22に記載の真核宿主細胞、および場合によっては、薬学上許容可能なキャリヤーを含んでなる、医薬組成物。
- 遺伝子治療によるヒトまたは動物生体の疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクター、請求項20に記載のウイルス粒子、または請求項21または22に記載の真核宿主細胞の使用。
- 循環器疾患の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項24に記載の使用。
- 請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクター、請求項20に記載のウイルス粒子、または請求項21または22に記載の真核宿主細胞の治療上有効量をヒトまたは動物生体に投与することを含んでなる、上記生体の治療方法。
- SMCにおける目的の遺伝子の特異的発現のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラ構築物、請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクター、または請求項20に記載のウイルス粒子の使用。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載のキメラ構築物、請求項11〜15のいずれか一項に記載の発現カセット、または請求項16〜18のいずれか一項に記載のベクターをゲノムに組込んでなる、非ヒトトランスジェニック動物。
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Cited By (2)
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Zhang | Adenovirus-based gene therapy approaches for hemophilia B | |
Shi et al. | In: Gene Therapy and Cancer Research Progress ISBN: 978-1-60021-811-8© 2008 Nova Science Publishers, Inc. Editor: Jessica L. Lewis, pp. 23-129 |
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