JP2004501923A - Chromophore improvement and chromophore improvement - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規なポルフィリン及びポルフィリン系発色団並びにポルフィリンとポルフィリン系発色団との組合せに関し、これらは特に、光化学治療及び蛍光分析及び画像処理を含む光線力学的な適用に広く有用である。特に、本発明は、新規で有用なポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン発色団；かかる発色団の製造方法；及びかかる発色団の分析及び医学での使用方法を提供する。The present invention relates to novel porphyrins and porphyrin-based chromophores and combinations of porphyrins and porphyrin-based chromophores, which are particularly useful for photodynamic therapy and photodynamic applications including fluorescence analysis and image processing. In particular, the present invention provides new and useful porphyrin, chlorin and bacteriochlorin chromophores; methods of making such chromophores; and methods of analyzing and using such chromophores in medicine.
Description
【０００１】
〔発明の属する技術分野〕
本発明は、新規なポルフィリン及びポルフィリン系発色団及びポルフィリン及びポルフィリン系発色団の組合せに関し、これらは特に、光化学治療及び蛍光分析及び画像処理を含む光線力学的な適用に広く有用である。
【０００２】
〔従来の技術〕
例えば蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）における研究道具、及び光線力学的治療（ＰＤＴ）におけるインビボでの標的にされた細胞の消滅をもたらすための治療薬としての、ポルフィリン及びポルフィリン系発色団の双方の重要性は、この技術で広く認識されている。これらの適用のそれぞれは、入射光線によって一重項の励起状態に励起され、及び結果的なエネルギーの放出を伴ってより一層低いエネルギー状態に減衰されるべき発色団の能力に依存する。このエネルギーは特定の波長での蛍光の光の形態で放出される場合があり、それによって、減衰する発色団に付着した細胞又は生物学的構造物が、可視化され、及び／又はＦＡＣＳによって選別され得る。あるいはまた、励起のエネルギーは、最初の一重項発色団の三重項励起状態への転換によって逸散され、次いで、二原子酸素のような他の三重項へエネルギーを転移し、結果的な一重項酸素の形成を伴うことがある。一重項酸素は強力な細胞障害性の薬剤であり、従ってこの後者の過程が細胞においてか又は細胞のすぐ近くで発生すると、それは通常その細胞に死を招く。したがって、発色団は、その蛍光特性、及び光増感剤として働く能力の双方のために用いることができる。
【０００３】
明らかに、蛍光画像処理又は分析、又はＰＤＴのために、インビトロ又はインビボにおいて、ある程度の発色団の局在性の制御が必須である。このことは、特に、光線力学的治療において重要であり、発色団の減衰によって生成する一重項酸素の照射の代表的範囲が直径０．１μｍ未満の場合、結果として、標的細胞の死をもたらすために、発色団は通常その細胞のすぐそば、又は好ましくはその細胞内に位置しなければならない。
【０００４】
〔発明が解決しようとする課題〕
しかし、これまでに、ＰＤＴの目的のために、インビボでの特定の標的細胞に対するポルフィリンの光増感剤のターゲティングを制御することについて、わずかの試みが行われているに過ぎない。その代わり、代表的に、ポルフィリンが、腫瘍構造物からのリンパのドレナージがない場合には、腫瘍に蓄積する固有の傾向があることに信頼性が置かれている。Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ（Ｒ）〔ホトフリン（登録商標）〕、ヘマトポルフィリン−ＩＸから酸でに処理によって誘導されるポルフィリン構造体の混合物からなる光増感性薬剤は、癌腫及び肉腫の処置に商業上用いられており、例えば、任意のターゲティング媒体又は手段を用いることなく、患者に従来どおり全身的に投与されている。このことは、明らかに、望ましくなく、光増感剤の間違った局在性が、光化学治療の効率を低下させるだけでなく、健康な細胞の死を招くことがある。
【０００５】
特に、ＦＡＣＳ及び蛍光画像処理の目的のために、発色団を適切なタンパク質送達分子に共有結合的に接合させることによって、発色団の生物学的標的へのインビトロでの特定の付着を達成するための努力が行われてきた。しかし、この手法は種々の問題にさらされた。第一に、細胞表面へのポルフィリン発色団の非特異的結合によって生じるバックグランド蛍光の程度を減少させるのが困難であることが分かった。第二に、発色団のタンパク質分子への付着によって、近位のタンパク質による著しい程度の励起状態のクエンチングが生じ、これが、マーカーとしてか、又は標的にされた光線力学的適用における発色団の有効性を明らかに減少させることが見出された。
これらの影響の減少が引き続き望ましい目標である。
【０００６】
〔課題を解決するための手段〕
したがって、本発明の１つの見地によれば、次の式（Ｉ）のポルフィリン発色団：
【化３７】
【化３８】
【化４２】
【化４３】
Ｒ２が親水性アリール部分であり；
Ｒ３がＨ又は親水性アリール又は親水性非芳香族部分であり；
及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれが、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４が互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋部分を形成し；
式中、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が随意に、更に１又はそれ以上の回数、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン，−Ｔ、又は−ＯＴ（式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。）によって置換されている。〕
を提供する。
【０００７】
本発明に従って発色団のコアの周りに１又はそれ以上の親水性置換基を含めることは、タンパク質の生物学的接合（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）において通常用いられる塩基性緩衝液／ＤＭＳＯ又はＤＭＦ共溶液中での高められた溶解度を招く。また、高められた親水性は、非共有結合的にタンパク質に結合する発色団の傾向を著しく低下させる。発色団が、例えば、ＰＤＴ又はＦＡＣＳの目的のために、所定の細胞又は組織に送達するためのモノクローナル抗体のようなターゲティングタンパク質に接合すべきである場合、発色団とタンパク質との間の非共有結合の減少は、発色団が細胞表面に非特異的に転移する程度を減少させ、興味のある細胞又は組織への発色団のターゲティングの精度を実質的に向上させる。
【０００８】
したがって、本発明の他の見地はまた、それぞれが親水性又は両親媒性部分を有する１又はそれ以上の親水性発色団、及びあまり親水性でない複数の物質及び／又は分子を含む混合物を分離するにあたり、前記混合物を疎水性溶離液に導入し、及び、前記１又はそれ以上の発色団が前記固相上に停止すると共に前記物質及び／又は分子が前記固相から前記溶出溶媒によって溶出するか、又は実質的に溶出するように、前記混合物及び前記溶出溶媒を親水性又は極性固相上に通す工程を含む方法を提供する。
【０００９】
例えば、前記方法は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｒ）〔セファデックス（登録商標）、（デキストラン）〕カラム、又は逆相ＨＰＬＣ上のクロマトグラフィを含む。代表的に、前記あまり親水性でない物質及び／又は分子の混合物は、細胞及び／又は膜の混合物を含むことができる。有利には、前記１又はそれ以上の親水性発色団は、本発明にかかる１又はそれ以上の発色団を含む。
【００１０】
いくつかの具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれか、又はいくつかがＨである。しかし、特に好ましい具体例では、Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれがＯＨである。したがって、前記発色団は、上記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）又は（Ｖ）のジヒドロキシクロリン又は上記式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）のテトラヒドロキシバクテリオクロリンであってもよい。ジヒドロキシクロリン及びテトラヒドロキシバクテリオクロリンの親水性は、相当するポルフィリンのものよりも、発色団のコアの周りの特別な親水性ヒドロキシ基の存在によって、高いことが見出される。
【００１１】
好ましくは、前記アリール部分Ｒ１はフェニル環を含んでおり、このフェニル環は、前記発色団の大環状コアに、単結合によって連結しているのが好ましく、あるいはまたＣ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結していてもよい。有利には、前記接合基Ｚは前記フェニル環にそのパラ（４’）位に連結することができる。
【００１２】
接合基Ｚは、ポリペプチド分子上のアミン基に共有結合で結合することができる基；例えば、イソシアナート、イソチオシアナート、又はＮＨＳエステル基を含むことができる。したがって、有利には、前記ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの周りのメソ置換基のそれぞれが、前記接合基Ｚに共有結合することになる場合がある−ＮＨ２、−ＮＨ２ ＋−又は−ＮＨ３ ＋を含まないべきである。このことは、前記発色団内の内部架橋の可能性を減少させるように働く。あるいはまた、前記接合基Ｚは、他の任意のタンパク質接合基、例えば、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜６アルキル）、マレアミド、ヨードアセトアミド、ケトン又はアルデヒドを含むことができる。かかる基のタンパク質分子への接合を達成する方法は、この技術において既知である。
【００１３】
特に好ましい具体例では、前記接合基はイソチオシアナート基を含む。イソチオシアナートはリジン残基とたやすく反応してタンパク質に対する安定な連鎖を生じ、従って本発明の発色団の生物学的接合にとって特に安定である。
【００１４】
前記接合基Ｚは前記アリール部分Ｒ１に単結合によって直接連結されることができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、前記アリール部分Ｒ１に、比較的高い程度の剛直性及び／又は立体障害を有する連結部分によって連結され得る。前記連結部分は、例えば、１０００ｇモル−１よりも大きくない全分子量を有する融合されたか、又は連結されたシクロアルキル及び／又はシクロアルキル環構造物の鎖を含むことができる。特に、前記連結部分は、アントラセン、アクリジン、アントラニル、ナフチル又はナフタレン部分、又はポリアセチレン、フェニルアセチレン、又はポリフェニルアセチレン部分を含むことができる。前記発色団がポリペプチド分子に対する前記接合基Ｚによって接合する場合、従って前記連結部分が前記ポリペプチドとは別の前記発色団の光活動性のコアを保持する役目を果たすことができ、これによって、前記発色団が蛍光を生じる場合に前記ポリペプチドによって生じることがある蛍光消光（クエンチング）を減少させるのに役立つ。前記連結部分は上述した種類の親水性又は両親媒性部分、例えば、Ｃ２〜Ｃ３０ポリエチレングリコール部分を含むことができる。このことは、発色団の親水性が前記連結部分の存在によって損なわれないことを確実にするのに役立つ。
【００１５】
随意に、前記アリール部分Ｒ１は、更に１又はそれ以上の、ヒドロキシのような、前記発色団の親水性を改善する役目を果たす、親水性置換基によって置換されていてもよい。
【００１６】
前記親水性アリール部分Ｒ２は、フェニル環を含んでいることができ、このフェニル環が１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されていてもよく、この親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記フェニル環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。あるいはまた、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ピリジル又は四級化（ｑｕａｒｔｅｎｉｓｅｄ）ピリジル｛ピリジニウミル（ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｙｌ）｝環のようなヘテロアリール環を含んでよく、ヘテロアリール環は随意に１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されることができ、親水性置換基は前記アリール部分Ｒ２の親水性を高める役目を果たす。前記ヘテロアリール環は、好ましくは、単結合によって、前記発色団の大環状コアに連結されるか、又は代わりに、Ｃ１〜６の分枝状又は線状アルキル鎖によってそれに連結されてもよい。前記１又はそれ以上の親水性置換基は、有利には、ヒドロキシ；メトキシ又はエトキシのようなアルコキシ；Ｃ２〜Ｃ１５ポリエチレングリコール；Ｎ−メチルピリジニウミルのような四級化ピリジル（ピリジニウミル）；モノ−、ジ−又はポリ−糖類；Ｃ１〜６アルキルスルホン酸；ホスホニウム基Ｒ４Ｐ（Ｒ５）（Ｒ６）（Ｒ７）（式中、Ｒ４が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれが、無関係に、水素、フェニル環のようなアリール環、ピリジル環のようなヘテロアリール環、及びＣ１〜６アルキル鎖から選ばれ、これらアリール環、ヘテロアリール環又はＣ１〜６アルキル鎖が置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル又はアルコキシ、アリール、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ又はシアノによって置換されている。）；又はリン酸基又はホスホネート基｛それぞれ、Ｒ８ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）又はＲ８Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）で表され、式中、Ｒ８が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ９及びＲ１０のそれぞれが無関係に水素及びＣ１〜６アルキルから選ばれている。｝から選ぶことができる。好ましくは、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれは同じであることができ、及び有利には、置換されていないフェニルでよい。適切には、前記Ｒ８はメチルでよい。有利には、前記Ｒ９及びＲ１０は同じであることができ、及び／又はメチル又はエチルでよい。
【００１７】
特に好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、
ｍ，ｍ−（ジヒドロキシ）フェニル
【化４４】
ｍ，ｍ，ｐ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４５】
ｏ，ｐ，ｏ−（トリヒドロキシ）フェニル
【化４６】
ｐ−（メチルトリフェニルホスホニウム）フェニル
【化４７】
ｐ−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル
【化４８】
ｐ−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル
【化４９】
ｍ−又はｐ−（Ｎ−メチル−ピリジニウミル）フェニル
【化５０】
【化５１】
から選ばれる。
【００１８】
他の好ましい具体例では、前記親水性アリール部分Ｒ２は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキル）ピリジニウミル基のような四級化ピリジル（ピリジニウミル）基を含む。四級化ピリジル（ピリジニウミル）基は高度に親水性であり、及び本発明の発色団に組み込まれる場合、有利な特性を示す。この点で特に好ましい基は、ｍ−又はｐ−Ｎ−（（Ｃ１〜６）アルキル）ピリジニウミル基、例えば、ｍ−Ｎ−メチルピリジニウミル
【化５２】
【化５３】
【００１９】
他の特に好ましい具体例では、前記四級化ピリミジニウミル基は、ｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル；特に、ｐ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
【化５４】
【化５５】
【００２０】
好ましくは、その又はそれぞれの四級化ピリジニウミル基Ｒ２は、ヨウ化物対イオン、又は、最も好ましい具体例では、塩化物対イオンのようなハロゲン化物対イオンと結び付くことができる。
【００２１】
いくつかの有利な具体例では、Ｒ３はＨであり、前記発色団は５，１５−ジアリール−ポルフィリン、−クロリン又は−バクテリオクロリンを構成する。他の有利な具体例では、前記Ｒ３は、親水性アリールであるか、又は非芳香族部分である。例えば、前記Ｒ３は、Ｒ２に関して、上記に規定するように親水性アリール部分を含むことができる。前記親水性アリール部分Ｒ３は、前記親水性アリール部分Ｒ２と同じでよく、発色団は、その１０，１５及び２０位に同じ置換基を持つか；又は前記親水性アリール部分Ｒ２と異なっていてもよい。あるいはまた、前記Ｒ３は、１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ又はＣ２〜１５ポリエチレングリコールのような１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されているＣ１〜６アルキル鎖のような親水性のアルキル部分を含むことができる。特に好ましい具体例では、前記Ｒ３は、１，２−ジヒドロキシエチルのようなポリヒドロキシ（Ｃ１〜６アルキル）からなる。
【００２２】
Ｒ２がＲ３と同じ本発明の発色団は、この技術において既知の方法、例えば、ピロールを用いるベンズアルデヒドの酸触媒縮合によるか、又はジピロメタンからのポルフィリンを合成するための“ＭａｃＤｏｎａｌｄ（マクドナルド）２＋２”法〔Ａｒｓｅｎａｕｌｔ（アルセナート）等のＪ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２：４３８４〜４３８９−参考として本明細書に組み入れる。〕に従って合成することができる。
【００２３】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−ピリジニウムポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式１として提示するが、式中、“ＲＸ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するようなＣ１〜６アルキル又は親水性置換基のような四級化する基を示す：
【化５６】
本発明の５−イソチオシアナトフェニル−１５−メチルホスホニウムフェニルポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンを合成するための一般化された図式を、次の図式２として提示するが、式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜６アルキル、ヘテロ環式基又は芳香族基を示す：
【化５７】
Ｒ２及び随意にＲ３がピリジニウミルフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式３として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような水素か、又は１又はそれ以上の親水性置換基を示す：
【化５８】
前記Ｒ２及び随意にＲ３がアルキルホスホナトフェニル又はアルキルホスホノフェニルからなる本発明のポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリンは、図式４として次に提示する一般化された反応図式に従って合成することができ、式中、“Ｒ”は、ＯＨ、ＯＮａ、又はＯ（Ｃ１〜６アルキル）を示す：
【化５９】
本発明の更なる見地においては、５，１０，１５及び２０メソ−位に選定された置換基を有する５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を合成するための新規な方法であって；５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団を提供する工程；脱離基Ｑを前記発色団の１０及び２０メソ−位に付着させる工程であって、脱離基Ｑがハロゲン化物及びトリフレートから選ばれている工程；連関（カップリング）試薬（Ｒ１１Ｏ）（Ｒ１２Ｏ）ＢＲ１３を提供する工程であって、Ｒ１１及びＲ１２が、無関係に、Ｈ又はＣ１〜６アルキルから選ばれているか、又はＲ１１及びＲ１２が互いに前記２つのＯ原子でつながれているＣ１〜６アルキル鎖を構成し、及びＲ１３が、上記Ｒ３に関して規定される親水性アリール部分のようなビニル又はアリールである工程；及び前記発色団と前記連関試薬とを、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、炭酸セシウム及び水酸化バリウムから選ばれる塩基、及びＰｄ０触媒の存在下に反応させる工程を含み；前記Ｒ１３を前記発色団の１０−及び２０−メソ位で前記離脱基Ｑと交換する方法を提供する。
【００２８】
ボロン酸又はボロンエステル試薬を用いるＰｄ０−触媒Ｓｕｚｕｋｉ（スズキ）カップリング反応は、この技術において既知であり、及び例えば、Ｍｉｙａｕｒａ（ミヤウラ）及びＳｕｚｕｋｉの、オルガノボロン化合物のパラジウム−触媒クロス−カップリング反応、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．（１９９５）９５：２４５７〜２４８３に記載されており；その開示を参考としてここに組み入れる。しかし、これまでに、ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−位で、選定された置換基を前記メソ位上に取り込む手段として、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングを行う試みは失敗している。しかし、本発明者は、本発明にかかる反応条件下に、Ｓｕｚｕｋｉ−カップリングが、出発ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの１０−及び２０−メソ位で速やかに及び首尾よく進むことを見出した。この方法は、それに関して、テトラ−メソ−置換されたポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンの都合のよい合成をＳｕｚｕｋｉ−カップリングによって可能にする。
【００２９】
前記脱離基Ｑは、塩化物、臭化物、ヨウ化物又はトリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）でよい。適切には、前記離脱基Ｑは臭化物でよい。ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリンのメソ−ブロム化のための方法は、この技術において既知である。例えば、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、その１０−及び２０−メソ−位で、ブロモスクシンイミドのようなハロスクシンイミドとの反応によりハロゲン化することができる。
【００３０】
前記連関試薬は、ボロン酸エステル又はボロン酸からなることができる。好ましい具体例では、前記Ｒ１１及びＲ１２のそれぞれはＨであり、前記連関試薬はボロン酸である。
【００３１】
有利には、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団であるか、又はその保護された形態である。したがって、前記５，１５−ジ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、次の式（ＶＩＩＩ）のポルフィリン発色団：
【化６０】
【化６１】
【化６５】
式中、Ｒ４は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ１であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；Ｒ５は、式（Ｉ）から（ＶＩＩ）に関して上記に規定するような基Ｒ２であるか、又はその保護形態であるか、又はそれに対して転換できる基であり；及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれは、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４は互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋（ｂｒｉｄｇｉｎｇ）部分を形成する。
【００３２】
したがって、式中、Ｒ１３は、Ｒ３に関して上記に規定するような親水性アリール置換基であり、また、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、本発明の発色団を構成することができる。
【００３３】
前記Ｐｄ０触媒は、例えば、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４、ＰｄＣｌ２（ＰＰｈ３）２、又はＰｄ（ＯＡｃ）２からなることができる。有利には、前記Ｐｄ０触媒はＰｄ（ＰＰｈ３）４からなることができる。
【００３４】
前記連関反応は、溶媒中で行われ、溶媒はトルエン又はドライＴＨＦから選ぶことができる。連関反応はドライＴＨＦ中ですばやく進むことがわかったので、ドライＴＨＦが溶媒として好ましい。
【００３５】
随意に、式中、前記Ｒ１３はビニルであり、前記５，１０，１５，２０−テトラ−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団は、前記連関反応に次いで、前記１０−及び２０−ビニル置換基をヒドロキシアルキルに転換させるような、ＯｓＯ４を用いるオスミレーション反応を受けさせることができる。前記オスミレーション反応は、ポルフィリンをジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリンに転換し次いでテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンにするのに適切な条件と同じ条件下で行うことができる。この工程が、本発明により、ＤｉＭａｇｎｏ（ジマグノ）等のＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３：５８，５９８３〜５９９３，（参考としてここに組み入れる。）に記載されたビニルトリブチルスズを連関試薬として用いる方法に従って、前記５，１５−ジ−メソ−置換発色団において行われたＰｄ−触媒Ｓｔｉｌｌｅ（シュティレ）カップリングによる方法のような本発明の方法によらないで得られた５，１０（ビニル），１５，２０（ビニル）−メソ−置換ポルフィリン、クロリン又はバクテリオクロリン発色団上でも行えることが注目される。
【００３６】
前記テトラ−メソ−置換発色団がポルフィリン又はクロリン発色団である場合、前記発色団は、それぞれ、この技術における熟練者に既知の方法に従って、クロリン又はバクテリオクロリン発色団にか、又はバクテリオクロリン発色団に転換させることができる。例えば、前記ポルフィリン又はクロリン発色団は、ジ−ベータ−ヒドロキシ−クロリン又はテトラ−ベータ−ヒドロキシ−バクテリオクロリンを生成させるような、ＯｓＯ４を用いる反応によってオスミレーションすることができる。
【００３７】
本発明にかかる反応のための一般化された図式を次の図式５及び６において提示する。図式５において、“Ｒ” 及び“Ｒ１”は、それぞれ、Ｒ２及びＲ３のそれぞれに関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示す。図式６において、“Ｒ” は、Ｒ２に関して上記に規定するような１又はそれ以上の親水性置換基を示し、及び“Ｘ”は炭素又は窒素原子を示す。
【化６７】
本発明の他の見地において、５，１５−ジフェニルポルフィリン、５，１５−ジフェニルクロリン又は５，１５−ジフェニルバクテリオクロリン発色団であって、５−及び１５−フェニル基のそれぞれのオルト−、メタ−、及び／又はパラ−位のそれぞれが、置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５のそれぞれによって置換されており、それら置換基が無関係にＨ又は不活性置換基であり、この置換基が他の置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５と相まって発色団の蛍光特性を実質的に損なうことなく；及び発色団が更に接合基Ｚを含み、この接合基がインビトロ又はインビボの所定の生物学的標的に発色団を送達するためのポリペプチド分子に前記発色団を接合させることができる発色団を提供する。
【００３９】
かかる発色団は、新規であり、及びそれぞれが、異なり及び実質的に重なりのない波長での蛍光の光を発光させる励起において有能である。上記に示したように、接合基Ｚの提供は、本発明の発色団が所定の生物学的標的を特異的に標的にするのを可能にし、従って、インビトロ又はインビボでの発色団の局在性の制御を促進する。したがって、本発明の発色団は、蛍光分析及び画像処理適用（ＦＡＣＳを含む）、又はＰＤＴにおいて、有効に用いることができる。
【００４０】
有利には、前記蛍光色素は、次の化合物：
【化６９】
【００４１】
上記化学構造式において、Ｚは、明確にするために除外している。しかし、前記Ｚ置換基は、各発色団の任意の１〜４，６〜１４，又は１６〜２０位に付着することができるか、又は置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つでよいか、又は前記置換基Ｐ１〜Ｐ５又はＱ１〜Ｑ５の１つによって５−又は１５−フェニル基の１つに付着することができる。
【００４２】
いくつかの具体例において、Ｐ１〜Ｐ５のそれぞれは、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されるように、前記Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じであるか、又は実質的に同じである。他の具体例では、Ｐ１〜Ｐ５の１又はそれ以上は、前記２つの主要なフェニル環が対称的に置換されないように、Ｑ１〜Ｑ５の相当する１種と同じでない。特に、Ｐ１〜Ｐ５のすべて及び／又はＱ１〜Ｑ５のすべては、前記２つの主要なフェニル環の一方又は双方が置換されないように、Ｈからなることができる。
【００４３】
有利には、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５が、全体として、前記発色団の自発的酸化の速度を減少させるのに十分な程度の前記発色団のコアの周りの立体障害を提供し、前記発色団が空気中で実質的に不活性であるが、実質的な範囲で、前記発色団のコアの周りの２、３、７、８、１２、１３、１７又は１８位での選択的な付加又は置換を抑制しない。したがって、Ｐ１、Ｐ５、Ｑ１及びＱ５のそれぞれはＨでよい。代表的に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えず、及び前記置換基Ｑ１〜Ｑ５のすべての累積的な分子量は１０００ｇモル−１を超えない。
【００４４】
前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン、−Ｔ、又は−ＯＴからなることができ、式中、ＴはＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、追加として又は代わりに、Ｃ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造、又は２と６との間の、好ましくは２〜３の、融合されたか、又は連結されたＣ３〜１２シクロアルキル及び／又はアリール環構造からなることができ、それらの環構造のそれぞれが随意に１又はそれ以上のＮ、Ｏ又はＳ原子を含むことがある。特に、１又はそれ以上の前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５は、Ｎ−メチルピリジル（ピリジニウミル）基のような四級化アミン又はピリジル基からなることができる。
【００４５】
好ましくは、Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１種は前記接合基Ｚからなる接合置換基である。特に好ましい具体例では、前記接合置換基はＰ３又はＱ３であり、前記接合基Ｚは２つの主要なフェニル環の１つのパラ位上に提供される。
【００４６】
適切には、前記接合基は、本発明の第１の見地に関して上記に規定されるようなものである。
【００４７】
特に、前記置換基Ｐ１〜Ｐ５及びＱ１〜Ｑ５の１又はそれ以上は、前記接合置換基でなく、Ａ１Ｚ１Ａ１４
からなる群より無関係に選ばれる一員からなることができ、式中、Ｚ１は、Ｚ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができ；
Ａ１４は、水素、メチル、ヒドロキシ、アリール、ハロ置換アリール、アリールオキシＣ１〜３アルキル、ハロ置換アリールオキシＣ１〜３アルキル、インダニル、インデニル、Ｃ７〜１１ポリシクロアルキル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、チオピラニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、又は１又は２の不飽和結合を含むＣ４〜６シクロアルキル｛シクロアルキル又は複素環式部分が置換されていないか、又は１〜３のメチル基、１つのエチル基、又はヒドロキシル基によって置換されている。｝である。
【００４８】
前記接合置換基は、Ａ１Ｚ１Ｚからなる群より選ばれる一員からなることができ、
式中、Ｚ１はＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５は、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’は無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４は無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２は単結合又はＺ３であり；Ｚ３はＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、 このＺ３は、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７は無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８はＯ又はＡ９であり；Ａ９はＣ１〜４アルキルであり、このアルキルは置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０はＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４はＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５は、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６は、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６は、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができる。
【００４９】
本発明の特に好ましい具体例では、前記発色団は、次の（ｘ）、（ｙ）又は（ｚ）
として提示される構造を有する発色団からなることができ：
【化７６】
Ｒ Ｒ’
４−Ｈ ４−ＮＣＳ
４−Ｍｅ ４−ＮＣＳ
４−Ｂｒ ４−ＮＣＳ
４−ＣＯ２Ｍｅ ４−ＮＣＳ
３，４，５−トリス（ＯＭｅ） ４−ＮＣＳ
４−ＮＣＳ ４−ＯＭｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｂｒ
４−ＮＣＳ ４−ＣＮ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
のいずれかであることができる。
【００５０】
本発明の他の具体例では、前記発色団は次に提示する構造を有するポルフィリン発色団からなることができ：
【化７９】
【００５１】
本発明の他の見地においては、マルチカラー蛍光色素分析用の蛍光色素マーカーの組合せであって、ポルフィリン発色団、クロリン発色団及びバクテリオクロリン発色団からなる群より選ばれる少なくとも２つの発色団からなり、それらの各発色団が同じポルフィリン骨格からなり、それらの各発色団が前記ポルフィリン骨格上の１又はそれ以上の置換基を含んでおり、それらの置換基の１つが接合基Ｚを含む接合置換基Ｌであり、Ｚが、複数の異なる所定の生物学的標的の１つに各発色団を送達するためのポリペプチド分子に、前記各発色団を接合させることができる接合基である組合せを提供する。
【００５２】
好ましくは、骨格上の他の前記置換基のそれぞれは、無関係に、Ｈ、又は前記接合置換基Ｌ及びすべての他のコア置換基とともに各発色団の蛍光特性を実質的に損なわない不活性置換基Ｒである。
【００５３】
本発明の組合せにおける各発色団が、励起において、異なる別々の波長で蛍光の光を放出することが見出された。したがって、組合せ中のすべての発色団は、単一レーザーによって励起され、実質的に個々に消散（ｒｅｓｏｌｖｅ）されることがある分かれた放出バンドを生成する。さらに、前記組合せにおいて提供される発色団のすべては、同じ分子構造を実質的に共有し、及び従って、与えられた条件下での生物学的標的に対する生物学的接合の同じ程度の効率を実質的に含む、同じ生物学的及び物理化学的特性を実質的に共有する。したがって、本発明の発色団の組合せは、ＦＡＣＳを含む、種々の種類の細胞又は他の生物学的標的の都合のよい選別及び分析のための蛍光分析及び選別の適用に有効に用いることができる。かかる組合せの構成成分は、例えば、１又はそれ以上の前記異なる所定の生物学的標的を含む混合物に、各発色団をそのそれぞれの所定の生物学的標的に送達させる条件の下で導入され；及び前記混合物は、前記発色団に蛍光を生じさせるように光に曝されることができる。次いで、マルチカラー分析を、各発色団によって生じる異なる放出バンドを確認するために実行し、それによって、それぞれの異なる生物学的標的の位置の計数及び可視化を可能にすることができる。
【００５４】
前記発色団の組合せは、特に、本発明の任意の見地の２又はそれ以上のポルフィリン発色団、相当するクロリン発色団、及び相当するバクテリオクロリン発色団からなることができる（ここで、“相当する”は、分子の大環状コアの周りに同じメソ−置換基を有することを意味する）。
【００５５】
本発明の発色団において、又は本発明の発色団の組合せのそれぞれの構成員において、前記接合基Ｚは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に接合することができる。あるいはまた、前記接合基Ｚは、架橋ポリペプチドに接合することができ、この架橋ポリペプチドは、前記発色団を相補的架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的架橋ポリペプチドに対する結合に適合する。
【００５６】
いくつかの具体例では、前記架橋ポリペプチドは、前記相補的架橋ポリペプチドに結合することができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質からなるか、これに連関するか、又はこれと融合することができる。したがって、前記発色団は、前記結合タンパク質と、前記架橋ポリペプチド及び前記相補的架橋ポリペプチドによって共有結合的に連結される場合がある。
【００５７】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せからなるキットであって、前記発色団又は各発色団が架橋ポリペプチドに接合され、この架橋ポリペプチドが、前記発色団を相補的な架橋ポリペプチドに連関させるために、前記相補的な架橋ポリペプチドに対する結合に適合し；及び構成物又は複数の構成物が、それぞれ、前記生物学的標的に対する特異的な結合に適合する結合タンパク質に融合するか、又は連関する前記相補的な架橋ポリペプチドからなり；その配列が、前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有する結合タンパク質に連結させるために、キット中の前記発色団又は各発色団を、前記所定の生物学的標的に対して特異性を有するキット中での異なる構成物への結合に適合されているキットを提供する。
【００５８】
例えば、前記結合タンパク質は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するモノクローナル又はポリクローナル抗体又はそれらの断片のような抗体でよい。特に、前記抗体は、ファージ抗体であり、バクテリオファージの表面上に発現される抗体であることができる。あるいはまた、前記結合タンパク質は、血清アルブミンタンパク質のような１又はそれ以上の細胞表面分子又は受容体に対する結合に適合するタンパク質からなることができる。また更に代わりとして、前記結合タンパク質は、細胞膜中への挿入のために適合される脂肪酸鎖のような低密度リポタンパク質からなることができる。発色団に接合させる場合、かかるリポタンパク質は、発色団を細胞膜に固定する役目を果たすことができる。
【００５９】
前記架橋ポリペプチドは、カルモジュリンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドは、カルモジュリン結合ペプチドからなることができ；又は逆もまた同じである。しかし、好ましくは、前記架橋ポリペプチドは、アビジン又はストレプトアビジンからなることができ、及び前記相補的架橋ポリペプチドはビオチンからなることができ；又は逆もまた同じである。特に、本発明のキット中の前記発色団又は各発色団は、アビジンに接合することができ、及び前記構成物又は各構成物は、前記生物学的標的の表面上の標的特異的分子に対して特異性を有するビオチン化モノクローナル抗体からなることができる。したがって、前記アビジン−連結発色団が前記ビオチン化抗体を結合させる場合、前記発色団は前記抗体にしっかりと連結することになる。都合のよいことには、前記発色団又は各発色団を望ましい生物学的標的に送達させるために、キット中の前記ビオチン化モノクローナル抗体又は各ビオチン化モノクローナル抗体は、選定され及び／又はたやすく置換することができる。モノクローナル抗体の調製のための及びそのビオチン化のための方法は、この技術においてよく知られている。
【００６０】
本発明の他の見地においては、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを、前記所定の生物学的標的又は標的群に対して付着させるにあたり、本発明のキットを提供する工程、及び前記キットの成分を、前記結合タンパク質又は各結合タンパク質の前記所定の生物学的標的又は標的群に対する結合を可能にするための適切な条件下に、前記所定の生物学的標的又は標的群の近くに導入する工程を含む方法を提供する。有利には、前記キットの成分は、前記発色団又は各発色団に接合する架橋ポリペプチドを、キット中の１つの前記構成物上に提供される相補的な架橋ポリペプチドに結合させるために、前記標的又は標的群の導入に先立って、互いに結び付かせることができる。このことは、キット中の前記発色団又は各発色団が、前記発色団の前記標的又は標的群への導入に先立って、結合タンパク質に連結するのを確実にする。あるいはまた、前記キットの成分は、前記標的又は標的群に次いで導入することができる。
【００６１】
代表的に、前記所定の生物学的標的は、細胞又は膜でよい。前記所定の生物学的標的は、インビボ又はインビトロ（エクスビボ）であってよい。例えば、前記生物学的標的は、癌細胞、腫瘍細胞、ＨＩＶにか、又は任意の他の微生物又はウイルスに感染した細胞、自己免疫疾患において有害な活性を引き起こす細胞、外来のか、又は異常細胞（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｅｌｌ）、又は任意の他のそのような細胞である場合がある。
【００６２】
本発明のいくつかの具体例では、前記生物学的標的は、インビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、ポリペプチド、糖質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）、脂肪酸、リポタンパク質、リン脂質又は他の生物学的分子のような、前記細胞の表面上に露出する分子からなる。好ましくは、前記標的特異的分子は、前記細胞によって特異的に発現されるか、又は余分に発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）されている。例えば、前記標的特異的分子は、ＣＤ４又はＣＤ８のようなＴ細胞マーカーでよい。したがって、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せの一部分を形成する発色団は、前記細胞に付着し、及び前記細胞が、前記発色団の蛍光を生じさせるために照射され、発色団の蛍光によって、前記細胞が可視化され、及びＦＡＣＳによる計数が行われ及び／又は選別される。
【００６３】
したがって、本発明の更なる見地においては、細胞の混合物から標的細胞を蛍光活性化選別するにあたり、本発明の発色団又は本発明の発色団の組合せを前記標的細胞に付着させ、前記標的細胞に付着した前記発色団の１又はそれ以上の蛍光を生じさせるために、細胞の前記混合物に照射をし、蛍光を発する細胞に荷電を与え、及び前記荷電細胞を前記混合物から分離するか、又は分離させるために、細胞の混合物を偏極環境（ｐｏｌａｒｉｓｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）に通す工程を含む方法を提供する。
【００６４】
本発明の他の見地においては、複数の標的細胞であって、前記標的細胞が２又は３の異なる細胞種の細胞を含んでいる複数の標的細胞の可視化及び／又は計数にあたり、本発明の発色団の組合せを提供する工程であって、発色団の組合せが２又は３の発色団を含み、各発色団が異なる１つの前記細胞種に送達されるのに適合する工程；その組合せ中の前記発色団を本発明の方法に従って前記標的細胞に付着させる工程；前記発色団によって蛍光の発光を生じさせるために、前記標的細胞に照射をする工程；前記各発色団によって生じる蛍光発光バンドを検出する工程；及び随意に前記各バンドについて、それぞれの個別の細胞種の蛍光細胞の数の測定値を得るために、発光／波長曲線の下での領域を測定する工程を含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の他の具体例では、前記標的細胞は、癌細胞、腫瘍細胞、又は感染したか、外来のか又は異常細胞のようなインビトロの細胞であり、及び前記標的特異的分子は、前記標的細胞の表面によって発現されるか、又は余分に発現されるか、又はそれに付着するか、及びその上に露出する；標的細胞特異的膜タンパク質のような標的細胞特異的分子である。したがって、本発明の発色団が前記標的特異的分子に送達される場合、前記発色団は前記細胞に対して付着することになる。前記細胞が次いで、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長で光を用いて照射される場合、前記細胞に付着する前記発色団は、励起を起こされ、及びこれが前記細胞のすぐ近くにおいて一重項酸素の生成を招き、従ってその細胞の死をもたらす。
【００６６】
特に好ましい具体例では、前記標的細胞特異的分子は、前記細胞の表面上の内部移行（インターナリゼーション）受容体からなり、この内部移行受容体は前記結合タンパク質と結合することができ、及びそれによって前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介する。したがって、その後の、前記発色団の励起を起こさせるのに適切な波長での前記細胞の光を用いる照射は、前記細胞内での一重項酸素の生成を招き、従って前記細胞の死をもたらす。
【００６７】
したがって、本発明は、標的細胞の消滅を起こさせるにあたり、本発明の発色団を前記細胞に付着させ及び一重項酸素の生成を前記細胞の近くで起こさせるために、前記細胞に照射をする工程を含み、それによって、細胞の死を起こさせる方法を包含する。好ましくは、前記発色団は、前記細胞の表面上の内部移行受容体に付着し、この内部移行受容体は、前記細胞内での前記発色団の内部移行を媒介することができ、及び前記細胞はその後、前記細胞内での一重項酸素の生成が生じるように照射をされ、それによって細胞の死が生じる。
【００６８】
好ましくは、前記発色団が細胞内に内部移行されるのに適合する場合、前記発色団は、ミトコンドリア膜上の正味負電荷（ｎｅｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅ）によって、細胞のミトコンドリアの周りの前記発色団の細胞内蓄積を促進するために、四級化アミン又はピリジル（ピリジニウミル）基、又はホスホニウム基のような、陽イオン性の基を含む。このことは、発色団の崩壊（ｄｅｃａｙ）による一重項酸素の提示があった場合に、細胞の迅速でかつ効率的な消滅をもたらす。
【００６９】
本発明の他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するにあたり、本発明の発色団の有効な量をそれを必要としている患者に投与する工程であって、その発色団が前記細胞への付着を生じるように、その発色団が前記異常細胞か又は望ましくない細胞の表面上の標的細胞特異的分子に対してそれらへの付着のための標的にされるのに適合し、及び前記細胞の近くで一重項酸素の生成を生じさせるために、光を用いて前記細胞に照射をする工程を含み、それによって前記細胞を死滅させる方法を提供する。適切には、前記標的細胞特異的分子は内部移行受容体からなり、及び前記発色団は、前記内部移行受容体への送達において細胞内に内部移行するのに適合し、その照射によって前記細胞内での一重項酸素の生成が可能にされる。
【００７０】
前記発色団は、局所的にか、又は全身的に前記患者に投与することができる。例えば、前記発色団は注射によって投与することができる。
【００７１】
本発明の更に他の見地においては、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を処置するために患者に投与される薬学組成物であって、組成物が、本発明の発色団であって、前記異常細胞か又は望ましくない細胞へ送達されるのに適合する発色団、及び適切な担体からなる薬学組成物を提供する。
【００７２】
本発明の更に他の見地は、腫瘍、癌、ＨＩＶ感染のようなウイルス感染、又はリウマチ様関節炎又は多発性硬化症のような自己免疫疾患のような、異常細胞か又は望ましくない細胞の体内での存在によって特徴付けられる疾病又は障害を患う患者の処置において用いる薬剤の製造において使用するための、本発明の発色団であって；前記発色団が、前記異常細胞か又は望ましくない細胞に対する送達のために適合する発色団を構想する。
【００７３】
本発明の例の詳細な説明
以下は、実例としてのみの、本発明の具体例及び本発明を実施するための方法の説明及び例である。
発色団の合成
計測手段（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及び材料
融点は修正しない。１Ｈ／１３Ｃ ＮＭＲスペクトルをＪｅｏｌ ＪＮＭ ＥＸ２７０ＦＴ−ＮＭＲ分光計上で記録し、特に明記しない限り、テトラメチルシランを基準にした。Ｉ．Ｒ．スペクトルを一連の１６００ ＦＴ−Ｉ．Ｒを用いて得、及び公称マススペクトルをＫｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ（クラトスコンパクト）ＭＡＬＤＩ ＩＩ分光計によって得た。正確な質量をＥＰＳＲＣ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ（マススペクトロメトリーサービス），Ｓｗａｎｓｅａ（スウォンジ）から得た。電子スペクトルをＵｎｉｃａｍ（ユニカム）ＵＶ−２又はＵＶ−４分光計を用いて得、及び特に明記しない限り、ＤＣＭにおいて取得した。すべての試薬及び溶媒は、市場で入手できるもので、試薬等級又はより一層高い等級であり、及び特別の定めのない限り、受け取ったものとして用いた。ＴＬＣ分析をＭｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ−ｇｅｌ（メルクシリカゲル）６０プレート（Ｆ２５４，５００μｍの厚さ）上で行った。メルクシリカゲル６０（２３０〜４００メッシュ）をフラッシュクロマトグラフィーの精製のために用いた。
【００７４】
説明
（１） ５−｛４−アセトアミドフェニル−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８０】
【００７５】
（２） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジメトキシフェニル）ポルフィリン
【化８１】
【００７６】
（３） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８２】
【００７７】
（４） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８３】
【００７８】
（５） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８４】
【００７９】
（６） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８５】
【００８０】
（７） ５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン
【化８６】
【００８１】
（８） ５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
Ｄｏｌｐｈｉｎ（ダルフィン）等の方法（１９９８年、５−フェニルジピロメタン及び５，１５−ジフェニルポルフィリン Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．７６，２８７〜２９３参考としてここに組み入れる）に従ってＤＤＰを合成した。３つのポルフィリンの得られた混合物を、クロマトグラフ処理し、５，１５−（４−メトキシ）−ＤＤＰを除去させるために最初にＤＣＭを用いて溶出し、及び次いで、酢酸エチル／ＤＣＭ（１：４）を続けて紫色の結晶（１５０ｍｇ，１２％）としての所要の生成物を溶出した；Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点３０５〜３０７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．４３（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（ｍ，４Ｈ，（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．００（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５５０．３（Ｍ＋，１００％）。
【００８２】
（９） ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン８（１等量（ｅｑ．），１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を５ＭのＨＣｌ水溶液（１００ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を還流下に３時間加熱した。熱い反応混合物を減圧中で濃縮して粗製の緑色の固体を得た。その固体を、ＤＣＭ／トリエチルアミン（９：１）（２００ｍＬ）の混合物中に再び溶解し、及び１０分間室温で撹拌した。次いで、その溶液を、水（３×２００ｍＬ）、飽和かん水（２００ｍＬ）を用いて洗浄し、及びその有機層を分離し、及び乾燥（Ｎａ２Ｓ０４）させ、次いで、減圧中で濃縮した。粗製の紫色の固体を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭを用いて溶出して、及び紫色の結晶性固体（５１ｍｇ，５４％）としての望ましいポルフィリンを与えた，Ｒｆ＝０．３０（ＤＣＭ），融点３００℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．３９（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），４．０８（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ），−３．０６（ｂｒ ｓ，２Ｈ ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５０８．３（［Ｍ＋１］＋，１００％）。Ｃ３３Ｈ２６Ｎ５Ｏ（［Ｍ＋１］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５０８．２１３７、見出されたのは５０８．２１４４である。
【００８３】
（１０） １７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び
（１１） ７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンのレジオイソマー，
ポルフィリン９（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ（サットン）等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）に従って、クロリンレジオイソマーの所要の混合物に転換させた。次いで、その粗製の反応混合物を、クロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いて溶出させた。最初に、いくつかの未反応の出発物質を溶出させ、次いで、茶色っぽい紫色（ｂｒｏｗｎ−ｐｕｒｐｌｅ）の結晶性固体としてのより一層高いＲｆ値のクロリン異性体１０を溶出した；Ｒｆ＝０．２８（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）。より一層低いＲｆ値の異性体１１を、ＤＣＭ中の２．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた、茶色っぽい紫色の結晶性固体（Ｒｆ＝０．１７（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１））を与えた。高いＲｆ値のクロリンレジオイソマー（以前与えられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アミノフェニル）クロリン（２６））（７．０ｍｇ，２４％），融点１６５〜１６７℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９５（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（ｓ，２Ｈ，β−Ｈ），８．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ．，ＣＨ３），｛ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない（ＮＨ’ｓ ｅｘｃｈａｎｇｅｄ ＆ ＯＨ’ｓ ｎｏｔ ｏｂｓｅｒｖｅｄ）｝；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８７である。 低いＲｆのクロリンレジオオソマー（７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン）（８．５ｍｇ，３０％），融点１６８〜１７１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ）８．９２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものの交換は観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５４２．２（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）Ｃ３３Ｈ２８Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、５４２．２１９２、見出されたのは５４２．２１８５である。
【００８４】
（１２） ５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン，
無水の１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中のポルフィリン９（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液中に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、Ｎ２下、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレニルメチルクロロホルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで覆い、光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このときに、反応が完結した（ＴＬＣによって監視されたように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物が水（２５ｍＬ）及びＤＣＭ（２×２５ｍＬ）の間に分配された。組み合わせられた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）を用いて洗浄し、次いで乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）し、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンを、ＤＣＭで溶出するクロマトグラフィーによって得た。望ましいポルフィリンが紫色の結晶（３８ｍｇ，９５％）として得られた，Ｒｆ＝０．３９（ＤＣＭ），融点２９２〜２９５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１０．３５（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），９．６９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４４（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（ｍ（重複），４Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（ｍ，２Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−３．１５（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤ−ＭＳｍ／ｚ７３１．５（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％），５０８．３（［Ｍ−ＦＭＯＣ＋２］＋，５０％）；Ｃ４８Ｈ３６Ｎ５Ｏ３（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７３０．２８１８、見出されたのは７３０．２８０９である。
【００８５】
（１３，１４） シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレニルメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ポルフィリン１２（３５ｍｇ，４８．０μモル）を、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法（２０００ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇ Ｊ． Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８−参考としてここに組み入れる。）の軽微な修正によって、バクテリオクロリン立体異性体の所要の混合物に転換した（反応は、１２を溶解させるために１，４−ジオキサン（５ｍＬ）を用いて行った。）。粗製の反応混合物を、最初にＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨを用いてクロリン副産物を除去するクロマトグラフ処理した。さらに、２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを用いる溶出によって、双方の立体異性のバクテリオクロリンテトロールを分離させた。より一層高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン異性体１３をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（６ｍｇ，１５％），Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４２〜１４５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（ｍ，２Ｈ ｏ’−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．９４（ｂｒ ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）］に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
より一層低いＲｆのシス−バクテリオクロリン異性体１４をピンク−グリーンの結晶性固体として単離した、（８．５ｍｇ，２１％），Ｒｆ＝０．２（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５０℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．１２（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ（重複），２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），７．８５（ｍ（不明瞭），２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（ｍ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（ｍ，６Ｈ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８５−５．８２（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．６５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８８（ｂｒ．ｓ（部分的に交換），２Ｈ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ８００．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ４８Ｈ４０Ｎ５Ｏ７（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは、７９８．２９２７、見出されたのは７９８．２９２１である。
【００８６】
（１５） ５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン
３，４，５−トリスメトキシベンズアルデヒド（５．０ｇ，２５．５ミリモル）を新しく蒸留したピロール（７５ｍＬ）中に溶解し、及びその溶液を、乾燥Ｎ２を用いる１０分間の通気によって脱気した。ＴＦＡ（０．０７５等量，０．１５ｍＬ，１．９１ミリモル）を添加し、及びその混合物を、最初のアルデヒドがＴＬＣ（約（ｃａ．）１０分）によって検出されないようになるまでＮ２下で撹拌した。反応混合物を減圧中、水吸引器圧（蒸発装置水浴温度７５℃）で、次いで高い減圧下で１６時間濃縮し、過剰のピロールを除去した。粗製の生成物を熱エチルアセテート／ｎヘキサンから再結晶し、及び白色の固体としての所要のジピロメタンを与えた，（５．４１ｇ，６８％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３３７８（ｂｒ．ＮＨ），１５９４（Ｃ＝Ｃ），１２３３，１０４０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度（ｒｅｌ．ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））２２２（１．０），２８０（０．７５）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．０７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．５３（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．６８（２Ｈ，ｓ，２’−Ｈ），６．３７（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９３（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．３８（１Ｈ，ｓ，メタン），３．８０（３Ｈ，ｓ，４’−ＯＣＨ３），３．７３（６Ｈ，ｓ，３’＋５’−ＯＣＨ３）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１５２．７（ＣＨ，２’−Ｃ），１３７．３（ｑ，３’＋５’−Ｃ），１３６．１（ｑ，４’−Ｃ），１３１．８（ｑ，４−Ｃ），１１６．７（ＣＨ，１−Ｃ），１０７．９（ＣＨ，２−Ｃ），１０６．６（ＣＨ，３−Ｃ），１０４．９（ｑ，１’−Ｃ），６０．３（ＣＨ３），５５．５（ＣＨ３），４３．７（ＣＨ．，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ３１１．２（１００％，（Ｍ−１）＋）。
【００８７】
（１６） ５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを、最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷（ｄｒｙ ｌｏａｄ）し）、及び４０％のエチルアセテート／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１３４０９（ＮＨ，アミド），３２４８（ｂｒ．ＮＨ），１６５０（Ｃ＝Ｏ），１５９３（Ｃ＝Ｃ），１３２０，１００９；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）８．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ−アセトミド），７．１３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．６８（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１６（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．９０（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４２（１Ｈ，ｓ，メタン），２．１４（３Ｈ，ｓ，ＮＨＣＨ ３ ）；δＣ（６８ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）１６８．４（ｑ，ＣＯＣＨ３），１３８．２（ｑ，４’−Ｃ），１３６．５（ｑ，２’−Ｃ），１３２．４（ｑ，４−Ｃ），１２８．９（ＣＨ，２’−Ｃ），１２０．３（ＣＨ，３’−Ｃ），１１７．２（ＣＨ，１−Ｃ），１０８．４（ＣＨ，２−Ｃ），１０７．１（ＣＨ，３−Ｃ），４３．４（ＣＨ．，メタン），２４．５（ＣＨ３）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２７９．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８８】
（１７） ５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン
ジピロメタンを最初のアルデヒドの同じモル量を用いる上記詳述の一般的な方法を用いて合成した。粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（３５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、（５０ｍＬのフラッシュシリカゲルにエチルアセテートから乾燥負荷し）、及び３０％のｎヘキサン／ＤＣＭで溶出し、及びオフホワイトの固体としての純粋な生成物を与えた，（４．３ｇ，５０％）：νｍａｘ（ヌジョールマル）／ｃｍ−１，３３８２（ｂｒ．ＮＨ），１５９８（Ｃ＝Ｃ），１３００，１０５０；ＵＶ−ＶＩＳ（ＭｅＯＨ）λｍａｘ／（相対強度）２２４（１．０）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）７．８７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），６．６６（２Ｈ，ｍ，１−Ｈ），６．１４（２Ｈ，ｍ，２−Ｈ），５．８９（２Ｈ，ｍ，３−Ｈ），５．４０（１Ｈ，ｓ，メタン）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｅ２５２．４（１００％，（Ｍ）＋）。
【００８９】
例１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）ポルフィリン
【化８７】
例２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−ピリジル）ポルフィリン
【化８８】
【００９１】
例３
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−ピリジル）ポルフィリン（１６０）
【化８９】
【００９２】
例４
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピラジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９０】
【００９３】
例５
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（３−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリヨウ化物
【化９１】
【００９４】
例６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９２】
【００９５】
例７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジニウミル）ポルフィリントリ塩化物
【化９３】
【００９６】
例８
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン，
より一層高いＲｆのレジオイソマーのクロリン１０（１７．５ｍｇ，２３．２μモル）を以下の方法によって相当するイソチオシアナートに転換した。新しく蒸留したＤＣＭ（２０ｍＬ）中の１０（１等量，５０ｍｇ，０．０９９ミリモル）の撹拌した溶液に、１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量，４６ｍｇ，０．１９８ミリモル）を添加した。反応物をアルゴン下に、２時間室温で撹拌させ、その後反応混合物をろ過し、及び濃縮し次いでクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％ＭｅＯＨで溶出して表題の化合物を与えた。表題の化合物を茶色っぽい紫色の結晶性固体として単離した、（１７ｍｇ，９０％）， Ｒｆ＝０．３６（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１）；融点１５５〜１５８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１２ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ１０．０（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４５（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．１５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．９３（ｍ，１Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．６５（ｍ，２Ｈ，５−ｍ−Ａｒ），７．２４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換及びＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８３．７（［Ｍ＝Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対しての計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８４．１７５７、見出されたのは５８４．１７５６である。
【００９７】
例９
シス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン
ＤＣＭにおける２５％ＭｅＯＨ（１．２５ｍＬ）中のシス−バクテリオクロリン１４（８．５ｍｇ，１０．７μモル）をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）を用いて処理し、及び光を遮って３時間の間室温でＮ２下に撹拌させた。反応混合物を減圧（０．１トル）中で濃縮しピペリジンのすべての痕跡量を除去した。次いで、粗製のアミンを上述の方法に従って所要のイソチオシアナートに転換した。このシス−バクテリオクロリン＿イソチオシアナートをピンク−グリーンの結晶性固体（５．０ｍｇ，７６％）として単離した，Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１３２〜１３５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；蛍光λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起＝５１６ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），９．１８（ｓ，１Ｈ，メソ−Ｈ），８．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（ｍ，２Ｈ，ｏ−Ａｒ），８．０５（ｍ，２Ｈ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（ｍ，４Ｈ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．９８（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），５．９３（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（ｂｒ ｓ，２Ｈ，部分的に交換した−ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１８．９（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓ（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１８．１８１５、見出されたのは６１８．１８１０である。
【００９８】
例１０，１１，１２，１３
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン／７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー，及び
シス／トランス−７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトアミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン立体異性体，
ポルフィリン８（１００ｍｇ，０．１８ミリモル）を、単一反応において、Ｓｕｔｔｏｎ等の方法に従ってクロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールの混合物に転換した。３８時間後、反応を停止させた。次いで、粗製の反応混合物をクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨでの溶出を用い、最初の、いくつかの未反応の出発物質、次いで、茶色っぽい紫色の結晶性固体（５ｍｇ，５％）としての例１０のより一層高いＲｆのクロリン異性体を与えた。例１１のより一層低いＲｆの異性体は、ＤＣＭ中の３．５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出によって得、及びまた茶色っぽい紫色の結晶性固体（７．０ｍｇ，７％）を与えた。ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨを用いる更なる溶出は、例１２及び１３のそれぞれの所要のトランス／シスバクテリオクロリンテトールを、それぞれ、ピンク／グリーンの固体（５．０ｍｇ，５％）及び（７．０ｍｇ，７％）として与えた。 例１０の高いＲｆのクロリンレジオイソマー〔これまでのデータに基づいて割り当てられた１７，１８−ジヒドロキシ−１５−（４−メトキシフェニル）−５−（４−アセトアミドフェニル）クロリン〕（２６）Ｒｆ＝０．４０（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８６〜１８８℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１２），５３５（０．０８），５８５．５（０．０５），６３７（０．１８）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．９７（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４−８．１０（ｍ，３Ｈ，５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．９６−７．８２（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．３４（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．４８（ｍ，１Ｈ，１７−Ｈ），６．２０（ｍ，１Ｈ，１８−Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８９，−２．２０（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）；Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３７である。
例１１の低いＲｆのクロリンレジオイソマー〔７，８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕Ｒｆ＝０．３５（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３），融点１８２〜１８５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５．５（０．１），５３５（０．０７），５８５（０．０４），６３６（０．１９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ） λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．９６（ｓ，１Ｈ，１０−Ｈ），９．９２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．４２（ｓ，１Ｈ，２０−Ｈ），９．２２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），９．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．９２（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５３（ｍ，１Ｈ，β−Ｈ），８．１８−７．９１（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．３３−７．２８（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３６（ｍ，１Ｈ，７−Ｈ），５．９６（ｍ，１Ｈ，８−Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．７４，−２．１７（ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ５８２．６（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ２８Ｎ５Ｏ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは５８２．２１４１、見出されたのは５８２．２１３５である。
例１２の高いＲｆ−トランスバクテリオクロリン；Ｒｆ＝０．２９（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，３７：３：１），融点１５２〜１５５℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４（０．２５），７０２（０．４９）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．２７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），９．１６（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．９６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９９−７．８９（ｍ，６Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．２５（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．３０（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），６．１５（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），５．６３（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），５．３２（ｍ，２Ｈ，ＯＨ），３．９９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．２０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），−１．８７（ｂｒ ｓ，２Ｈ，ＮＨ）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．３（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
低いＲｆシス−トランスバクテリオクロリン１３；Ｒｆ＝０．２４（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，１９：１），融点１４８〜１５１℃（分解）；ＵＶ−ｖｉｓ（ＤＣＭ）λｍａｘ（相対強度）３７３．５（１．０），５１４．５（０．２４），７０３（０．５０）ｎｍ；蛍光（ＤＣＭ）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起＝５１４ｎｍ）；１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の２０％ＣＤ３ＯＤ）δ９．２０（ｓ，２Ｈ，１０＋２０−Ｈ），８．７８（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．３５（ｍ，２Ｈ，β−Ｈ），８．０５（ｍ，２Ｈ，５−ｏ−Ａｒ），７．８９−７．８６（ｍ，３Ｈ，５＋１５−ｏ／ｍ−Ａｒ），７．７５（ｍ，１Ｈ，１５−ｏ−Ａｒ），７．２０−７．１７（ｍ，２Ｈ，１５−ｍ−Ａｒ），６．２５（ｍ，２Ｈ，７＋１７−Ｈ），５．８６（ｍ，２Ｈ，８＋１８−Ｈ），４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），２．３１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換）；ＭＡＬＤＩ−ＭＳｍ／ｚ６１６．４（［Ｍ＋Ｈ］＋，１００％）。Ｃ３５Ｈ３０Ｎ５Ｏ６（［Ｍ＋Ｈ］＋）に対して計算されたＥＳ−ＨＲＭＳは６１６．２１９６、見出されたのは６１６．２１９２である。
【００９９】
例１６
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メチルホスホニウムフェニル）−ポルフィリン−一般的合成方法
ボック（Ｂｏｃ）Ｎ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリン及び５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−カルボメトキシフェニル）ポルフィリンを、それぞれ、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｌｉｎｄｓｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｓｃｈｒｅｉｍａｎ（シュレイマン），Ｉ．Ｃ．，Ｈｓｕ（スウ），Ｈ．Ｃ．，Ｋｅａｒｎｅｙ（カーニー），Ｐ．Ｃ．，Ｍａｒｇｕｅｒｅｔｔａｚ（マルグレッタ），Ａ．Ｍ．（１９８７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２，８２７〕を用いる混合凝縮（ｍｉｘｅｄ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）又はＢｏｙｌｅ（ボイル）等の〔Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ（ブルックナー），Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ（ポサコニー），Ｊ．，Ｊａｍｅｓ（ジェームス），Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ（ドルフィン），Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７−参考としてここに組み入れる。〕により記載されているように適切に置換された５−フェニルジピロメタンによる２＋２凝縮法によって合成した。次いで、これらのポルフィリン上の（４−カルボメトキシフェニル）基を、次の標準的な方法：ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（２５ｍＬ）中に０℃で溶解し、及びアルゴン下に１０分間撹拌する方法を用いて、（４−（１−ブロモメチル）フェニル）基に転換した。リチウムアルミニウム水素化物（０．７ミリモル）を添加し、及び撹拌を２４時間続けた。反応物をＴＬＣによって監視し、反応が完結したとき、エチルアセテート（２ｍＬ）を添加し、及び反応物をＨＣｌ水溶液（０．２Ｍ，２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（３０ｍＬ）及び最後にかん水（２０ｍＬ）を用いて洗浄した。その有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び乾くまで蒸発させて、３つ又は１つの還元型のカルボメトキシ基をそれぞれ有する相当する（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリンを得た。（４−（１−ヒドロキシメチル）フェニル）置換ポルフィリン（０．２ミリモル）を乾燥クロロホルム（４０ｍＬ）中に溶解し、及びアルゴン下で撹拌し、一方でトリフェニルホスフィン（１．０ミリモル）及び四臭化炭素（１．６ミリモル）を添加した。反応物を、暗所で２４時間撹拌し、及び次いでＴＬＣによって監視した。一旦すべてのヒドロキシメチル基をブロモメチル基に転換させて、反応混合物をジクロロメタン（４０ｍＬ）を用いて希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２ｍＬ）次いでかん水（２×２ｍＬ）を用いて洗浄し、及び有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）させた。減圧中での溶媒の除去によって紫色の結晶性固体としての相当するブロモメチルポルフィリンを与えた。
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中に、アルゴン雰囲気下２５℃で溶解した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解したトリアリール又はトリアルキルホスフィン（７．５ミリモル）をシリンジによって注入し、及び反応の進行の後にはＴＬＣを行った。完結の際に、溶媒を減圧中で反応物から蒸発させ、及び粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、光沢のある紫色の結晶性固体としての所要のボック−Ｎ−保護−５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを得た。ボック保護基を、溶解度及びトリメチルシリルヨウ化物（５．０等量）の添加に応じて、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって、５−（アミノフェニル）−メチルホスホニウム−メソ−アリールポルフィリンを与え、これは、標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって所要のモノ−４−（イソシアナトフェニル）化合物に転換された。
【０１００】
例１７
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）をトリエチル亜リン酸エステル（１５ミリモル）及び乾燥アセトニトリル（５０ｍＬ）の混合物中に溶解した。還流冷却器を装着し、及びアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、及び完結の際に、飽和炭酸水素ナトリウム（２×２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）及びかん水（２×２０ｍＬ）を用いて洗浄した。次いで、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び溶媒を減圧中に蒸発させた。次いで、粗製の生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての表題の化合物を与えた。次いで、メチルホスホノ−ジ−エトキシ基を、水酸化ナトリウム水溶液中での１時間の超音波処理、次いで逆相中圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ（ファンリエル），Ｊ．Ｅ．（１９９３）Ｓｙｎｌｅｔｔ３５１）によるメチルホスホノ−モノ−エトキシナトリウム基にか、又はブロモトリエチルシラン（メチルホスホノ−ジ−エトキシ基当たり２等量）を用いる２時間の処理、次いで、逆相クロマトグラフィーによる精製クロマトグラフィ（Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）〔ＭｃＫｅｎｎａ（マッケナ），Ｃ．Ｅ．，Ｈｉｇａ（ヒガ），Ｍ．Ｔ．，Ｃｈｅｕｎｇ（チューン），Ｎ．Ｈ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ｍ−Ｃ．（１９７７）２，１５５〕による十分に脱保護されたメチルホスホン酸にかのいずれかに脱保護した。ボックの脱保護（上記参照）に次いで、マスクされてない４−（アミノフェニル）基のそのイソチオシアナト類似体への転換を、標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）を用いて行った。
【０１０１】
例１８
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護された５−（アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリ−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ヒドロキシメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、アルゴン雰囲気下に、ジクロロメタン及びピリジン（４：１）の混合物中に溶解した。ジエチルクロロホスフェート（ヒドロキシメチル基当たり２等量）を注入し、及び混合物を１６時間撹拌した。反応混合物からの溶媒の蒸発に次いで、クロマトグラフィーによる精製によって相当するトリ又はモノ（（４−メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル）ポルフィリンを与えた。水酸化ナトリウム（１Ｍ）を用いる処理によって、トリ又はモノ（（４−メチルホスホナトエトキシ）フェニル）ポルフィリンのナトリウム塩を与えた（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．及びｖａｎ Ｌｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．（１９９５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１０７９）。ボック脱保護及びイソチオシアナート基の生成は上述の様にして行った。
【０１０２】
例１９
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（（４−メチルピリジニウミル）フェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１０，２５，２０−トリ−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン及び５−（アミノフェニル）−１５−（４−ブロモメチルフェニル）ポルフィリン（０．７５ミリモル）を、ジクロロメタン（５０ｍＬ）及びピリジン（１５ミリモル）中に溶解し、又は置換されたピリジン（１５ミリモル）を要求に応じ添加した。還流冷却器を装着し、及び反応物をアルゴン下に還流させた。反応物をＴＬＣにかけ、完結の際に、乾くまで減圧中で蒸発させた。残留物を逆相媒体圧クロマトグラフィー〔Ｃ１８；勾配溶出０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで〕によって精製し、Ｎ−ボック保護４−アミノフェニル化合物を得た。アミノフェニル基（複数）の脱保護及びイソチオシアナト類似体（複数）への転換を標準的なプロトコル（上記参照）を用いて行った。
【０１０３】
例２０
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−アリール−１０，２０−（１，２−ジヒドロキシエチル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
エフモック（Ｆｍｏｃ）保護された５−（４−アミノフェニル）−１５−アリールポルフィリン（０．８ミリモル）を乾燥クロロホルム（３００ｍＬ）中にアルゴンの雰囲気下で溶解した。乾燥クロロホルム（２０ｍＬ）中に、新しく再結晶したＮ−ブロモスクシンイミド（１．８ミリモル）をシリンジによって注入し、及び混合物を３０分間撹拌した。次いで、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ヘキサンからエチルアセテートまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としての所要の５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリンを与えた。次いで、生成物を、酢酸亜鉛二水和物（８０ミリモル）のクロロホルム／メタノール（９：１）溶液中での還流によってメタレートした。メタレーションに次いで、可視分光法を行い、完結の際に、中性のアルミナの短いカラムに通し、配位してない亜鉛を除去した。亜鉛５，１５−ジブロモ−１０，２０−ジアリールポルフィリン（０，６ミリモル）を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、それにテトラキス（トリフェニルホスフィン）−パラジウム（０）（０．６ミリモル）及びビニルトリブチルスズ（１．４ミリモル）を添加した。混合物を窒素下に４８時間還流させ、その後、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び残留物をフラッシュカラム（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからエチルアセテートまで）によってクロマトグラフ処理し、紫色の結晶性固体としてのジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。ジンク５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸（１％ｖ／ｖ）の溶液における溶解によって脱メタレーションし、水を用いる抽出及び減圧中での有機層からの溶媒の蒸発後に、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンを与えた。最後に、１０及び２０のエテニル基を、記載したように（Ｓｕｔｔｏｎ Ｊ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ（フェルナンデス）Ｎ，Ｂｏｙｌｅ ＲＷ（２０００）Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５）、四酸化オスミウムによってヒドロキシル化するが、エテニル基と四酸化オスミウムとの間の反応が迅速であるために、反応時間及び化学量論の制御によってこれらの基の選択的なヒドロキシル化が可能であった。条件の代表的な組合せにおいては、５−（エフモックアミノフェニル−１５−アリール−１０，２０−ジエテニルポルフィリンは、１０％ピリジン／クロロホルム中の四酸化オスミウム（５等量）を用いて２４〜４８時間処理する場合に、望ましい５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）ポルフィリンを与え、一方で、より一層長い反応時間（７２時間）及び四酸化オスミウムのより一層高いモル比（７．５又は１０等量）を同じ条件下で用いる場合は、５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８−ジヒドロキシクロリン及び５−（エフモックアミノフェニル）−１５−アリール−１０，２０−ビス（１，２−ジヒドロキシエチル）７，８，１７，１８−テトラヒドロキシバクテリオクロリンのそれぞれが得られる。すべての上記生成物は、アミノ基のピペリジン媒介脱保護（上記参照）及び標準的な方法（Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１））を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理の際に、相当するイソチオシアナートにきれいに転換される。
【０１０４】
例２１
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリン−ＰＤ０媒介Ｓｕｚｕｋｉカップリングによる５，１５−ジフェニルポルフィリンからの合成
ボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニルポルフィリンを上述したように１０及び２０メソ位でブロム化した。メソ１０，２０−ジブロム化した生成物（０．７５ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）又はトルエン（５０ｍＬ）中に溶解し、カップリング反応で用いるボロン酸に応じて、テトラキス−（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．７５ミリモル）及び無水リン酸カリウム（０．７５ミリモル）を添加し、次いで、還流冷却器をフラスコに装着し、及び全体の装置をアルゴン雰囲気下に配置した。次いで、所要のアリール又は複素環式ボロン酸を適切な溶媒（１０ｍＬ）中の溶液として注入によって添加した。反応物を還流させ、ＴＬＣによって完結させた。完結の際に、粗製の反応混合物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、及び飽和炭酸水素ナトリウム（２×５０ｍＬ）、水（２×５０ｍＬ）及びかん水（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、及び減圧中の蒸発によって濃縮した。最後に、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配溶出：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、紫色の結晶性固体としてのボックＮ−保護５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与えた。ボック保護基を、クロロホルム又はアセトニトリル中のポルフィリンの溶解、溶解度に応じ、更にトリメチルシリルヨウ化物（１．２等量）の添加によって除去し、３０分後、メタノール（１０ｍＬ）を用いて反応をクエンチングさせた。蒸発による溶媒の除去、次いで、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ；勾配：ジクロロメタンからメタノールまで）によって精製し、５−（アミノフェニル）−１５−フェニル−１０，２０−（ジアリール）−ポルフィリンを与え、これを標準的な方法〔Ｃｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９．Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１）〕を用いる１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドンでの処理によって表題の化合物に転換した。
【０１０５】
例２２
５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１０，１５，２０−トリ（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン及び５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−グリコシルフェニル）−ポルフィリン−一般的な合成方法
４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルオキシ）ベンズアルデヒドを、Ｌｉｎｄｓｅｙ（リンジー）条件〔Ｓｏｌ（ソル），Ｖ．，Ｂｌａｉｓ（ブレイズ），Ｊ．Ｃ．，Ｃａｒｒｅ（カレ），Ｖ．，Ｇｒａｎｅｔ（グラネ），Ｒ．，Ｇｕｉｌｌｏｔｏｎ（ギロトン），Ｍ．，Ｓｐｉｒｏ（シュピーロ），Ｍ．，Ｋｒａｕｓｚ（クラウス），Ｐ．（１９９９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４，４４３１〕を用いて、４−ニトロベンズアルデヒド及びピロールで凝縮させ、及び粗製の反応混合物をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、５−（４−ニトロフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。あるいはまた、４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）ベンズアルデヒドを用い、Ｂｏｙｌｅの方法（Ｂｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｃ．，Ｐｏｓａｋｏｎｙ，Ｊ．，Ｊａｍｅｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｄ．（１９９９）Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ．７６，２８７）を用いることで、５−（４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシロキシ）フェニル）ジピロメタンを合成し、次いで凝縮して、５−（４−ニトロフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。これらのポルフィリンのニトロ基の還元をＴＨＦ中への溶解及び炭素上での１０％パラジウムの添加によって行った。混合物のＨ２下での５時間の撹拌に次いでＣｅｌｉｔｅ（セライト）によるろ過を行い、及びフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して相当するアミノポルフィリンを与え、これを、アルゴン下、無水１，４−ジオキサンにおいて炭酸水素ナトリウム（６等量）の存在下にエフモッククロライド（２等量）と反応させることによってＮ保護した。反応をＴＬＣによって監視し、及び完結の際、ジクロロメタンで希釈し、及び水で洗浄し次いで有機層の乾燥（ＭｇＳＯ４）の前にかん水で洗浄した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製は、エフモックＮ−保護５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリン又は５−（４−アミノフェニル）−１５，−［４−（２’，３’，４’，６’−テトラ−Ｏ−アセチル−β−グルコピラノシルオキシ）フェニル］ポルフィリンを与えた。Ｎ及びＯ保護基を、ジクロロメタン／モルフォリン（１：１）中でのポルフィリンの溶解及び１時間の撹拌によって除去した。減圧中での蒸発による溶媒の除去に次いで残留物をジクロロメタン及びメタノール（４：１）中で再溶解した。乾燥メタノール中のナトリウムメタノレート（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈａｎｏｌａｔｅ）（ＯＡｃ基当たり１．５等量）を添加し、及びその混合物を１時間撹拌した。十分に脱保護したポルフィリンを、ヘキサンを用いた沈殿によって回収した。最後に、５−（４−アミノフェニル）ポルフィリンを乾燥メタノール中で溶解し、及び１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（２等量）を添加した。反応物を、アルゴン下、２時間撹拌し、及びＴＬＣによって監視し、完結の際、溶媒を減圧中で蒸発させ、及び粗生成物を調製用の媒体圧逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８；勾配溶出：０．１％ＴＦＡ水溶液からメタノールまで）によって精製した。
【０１０６】
例２３：
対称的なポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロールシリーズ
５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（一般的方法）
３Ｌの丸底フラスコに、５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ジピロメタン（１．８６ｇ，６ミリモル）、次いで、Ｎ２下にＤＣＭ（１Ｌ）を添加した。この撹拌した溶液に、オルトギ酸トリメチル（４８ｍＬ，ミリモル）を添加した。次いで、ＤＣＭ（５００ｍＬ）中のトリクロロ酢酸（２３．０ｇ，ミリモル）の溶液を含有する圧均等滴下漏斗をそのフラスコに装着し、及びその溶液をその反応混合物に１０分間にかけて滴下して加えた。反応容器をアルミニウムホイル中に被覆して光を遮り、及びＮ２下に３．５時間撹拌した。次いで、ピリジンを反応混合物中に、迅速に撹拌しながら添加し、及び反応物を更に１６時間、光を遮りながら、Ｎ２の下に室温で撹拌させた。アルミニウムホイルを除去し、及びその溶液中で空気を２０分間泡立てた。この後、その反応物を更に３時間室温でアルミニウムホイルを除去した状態で栓なしで撹拌させた。次いで、反応混合物を減圧中で濃縮して、蒸発、次いで高い減圧によってＤＣＭ及び残留するピリジンを除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２５０ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから５０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、クロロホルムを用いて溶出した。表題の化合物を紫色の結晶性固体として得た（３４７ｍｇ，１８％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４０８ｎｍ）；（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４０（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１８（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），７．５２（４Ｈ，ｓ，ｏ−Ａｒ），４．２０（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（１２Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４３．４（１００％，Ｍ＋）。
【０１０７】
７，８−ジヒドロキシ５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）クロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（２．５等量，０．１９５ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びわずかに油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のＤｒｅｓｈｅｌ（ドレッシェル）ボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）（登録商標）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールを用いて溶出した。いくつかの出発物質を回収し（１５％）、及び表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た、（２６ｍｇ，５０％）；融点１７０℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０４（０．０９），５３４（０．０６），５８２（０．０４），６３６（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．９８（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），９．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９９（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．６６（１Ｈ，ｍ，β−Ｈ），７．４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），７．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１５−Ｏ−Ａｒ），６．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，７−Ｈ），６．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，８−Ｈ），４．１７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．１５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９１（３Ｈ，ＣＨ３），−１．８０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−２．１９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６７７．３（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ８についての計算されたＨＲＭＳは：６７６．２５３３、見出されたのは：６７６．２５８７である。
【０１０８】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）バクテリオクロリン（一般的方法）
ＨＰＬＣ等級のクロロホルム（５．０ｍＬ）中の５，１５−（３，４，５−トリスメトキシフェニル）ポルフィリン（５０ｍｇ，７７．８μモル）の撹拌した溶液に、無水ピリジン（０．５ｍＬ）中の四酸化オスミウム（５．０等量，０．３９ミリモル，４９ｍｇ）の溶液を添加した。反応容器にＮ２を流し、及びしっかりと油を塗ったガラス栓を用いて密封し、次いでアルミニウムホイル中に被覆し光を遮り、及び７２時間室温で撹拌させた。この期間の後、反応容器のガラス栓をプラスチック栓と置き換え、及び硫化水素ガスの連続した流れによって反応混合物中を５分間泡立てた（ガス出口ニードルを取り付け、及び過剰な硫化水素ガスを、鉱油及び漂白溶液でそれぞれ満たされた一連のドレッシェルボトル中に逃がした）。この時間の後、反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（Ｒ）によってろ過し、及び次いで減圧中で濃縮した。いくらかの過剰なピリジンを高減圧下に除去した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ中の１％メタノールを用いる溶出でクロリン副産物を溶出し、次いでＤＣＭ中の２．５％メタノールで、主要なバクテリオクロリン異性体〔トランス型と思われるＢｒｕｃｋｎｅｒ（ブレックナー）等の（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３６，９４２５〕を溶出させた。表題の化合物を緑がかった−ピンク（ｇｒｅｅｎｙ−ｐｉｎｋ）の結晶性固体として得た、（２０ｍｇ，３６％）；融点１３５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）９．２３（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），８．４４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，β−Ｈ），７．３７（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．１３（２Ｈ，ｓ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），６．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），６．０１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．１２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．９２（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．８９（６Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９７（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７１２．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３８Ｈ３６Ｎ４Ｏ１０についての計算されたＨＲＭＳは：７１０．２５９０、見出されたのは：７１０．２６０７である。
【０１０９】
例２４
生物学的接合のための非対称ポルフィリン／クロリンジオール／バクテリオクロリンテトロール蛍光色素の組合せ
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
所要の非対称ジフェニルポルフィリンを、先立って概要を述べた一般的な方法を用いるが、わずかな改変のみを行って合成した。この例では、ジピロメタンの混合物を用いた。それぞれのジピロメタンの異なる反応性により、混合されたポルフィリンの最適化に必要な量は異なっていた。同じ規模の反応のために、５−（４−メトキシフェニル）ジピロメタン（５０５ｍｇ，２ミリモル）及び５−（４−アセトミドフェニル）ジピロメタン（８３８ｍｇ，３ミリモル）を用いた。ポルフィリン混合物をシリカゲル（４００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷して完全な溶解性を確保した。）、最初にＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを溶出液の５００ｍＬに添加し溶出を助けた。）を用いて溶出し、５，１５−（メトキシフェニル）ポルフィリンの副産物を除去した。この成分の分離後、溶出をクロロホルムで続け、５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリンを収集した。望ましいポルフィリンを紫色の結晶として得た（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０２（０．０４），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．０１）ｎｍ；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．４３（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），８．２２−８．１２（４Ｈ，ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ＋１５−ｏ−Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），４．１４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．００（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５５０．３（１００％，Ｍ＋）。
【０１１０】
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（１００ｍｇ，０．１８２ミリモル）を１８％塩酸（２００ｍＬ）で処理し、及び空気冷却機を取り付けた。緑色の溶液を３時間８５℃に温めた。冷却に先立って、反応混合物を減圧中で濃縮し（水流吸引機；蒸発装置水浴７５℃）、過剰の塩酸を除去し、次いで、ＤＣＭ中のトリエチルアミン（５０ｍＬ）の溶液を用いて慎重に処理した。有機抽出物を、乾燥（無水Ｎａ２ＳＯ４）に先立って、水（１００ｍＬ）次いで飽和かん水（１００ｍＬ）で洗浄し、ブフナー漏斗によってろ過し、及び最後に減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（１０ｍＬのＤＣＭ中での液体負荷）、ＤＣＭ（１ガラスピペットいっぱいのトリエチルアミンを５００ｍＬの溶出液に添加し溶出を助けた。）を用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（１５０ｍｇ，１２％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０３（０．０４５），５３８（０．０２），５７８（０．０１５），６３０（０．００５）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３４ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．３９（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），９．１７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ）９．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，β−Ｈ），８．１９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｏ−Ａｒ），８．０７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｏ−Ａｒ），７．３５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１５−ｍ−Ａｒ），７．１４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，５−ｍ−Ａｒ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），４．０８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），−３．０６（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５０８．３（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１１】
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン
無水１，４−ジオキサン（２．５ｍＬ）中の５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５μモル）の撹拌した溶液に、固体の炭酸水素ナトリウム（６等量，２８ｍｇ，０．３３ミリモル）を添加した。次いで、この混合物に、１，４−ジオキサン（０．５ｍＬ）中の９−フルオレノメチルクロロフォルメート（２等量，０．１１ミリモル，２８．５ｍｇ）の溶液をＮ２下に添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及び室温で３時間撹拌した。このとき、反応が完結した（ＴＬＣによって監視したように）。１，４−ジオキサンを減圧中で除去し、及び残留物を水（２５ｍＬ）とＤＣＭ（２×２５ｍＬ）との間に分配させた。組み合わせた有機抽出物を飽和かん水（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（無水Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、及び減圧中で濃縮した。所要のポルフィリンをシリカゲル（１００ｍＬ）上のクロマトグラフィー（溶解のためにＤＣＭ及び少しのメタノールから１０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷した。）、ＤＣＭを用いる溶出によって得た。望ましいポルフィリンを、紫色の結晶として得た；（３８ｍｇ，９５％）；λｍａｘ／（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０４２），５４１（０．０２），５７８（０．０１５），６３３（０．０１）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ＝６３５ｎｍ（λ励起＝４１０ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１０．３５（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），９．６９（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），９．４４（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．１２（４Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２０−８．１７（４Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝８．１Ｈｚ，５＋１５−ｏ−Ａｒ），７．８５（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），７．７６−７．６６（２Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．５１−７．３０（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），４．６９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．１３（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−３．１５（２Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝７３１．５（１００％，（Ｍ＋１）＋），５０８．３（５２％，（Ｍ−ＦＭＯＣ＋１）＋）。
【０１１２】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン及び７，８−ジヒドロキシ５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリンレジオイソマー
５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（２８ｍｇ，５５．２μモル）を、先立って述べた一般的なクロリン形成方法を用いて、クロリンジオールのレジオイソマーの混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出し、最初にいくつかの未反応出発物質、次いでブラウニー−パープルの結晶性固体としてのより一層高いＲｆのクロリン異性体を溶出した。より一層低いＲｆの異性体を、更にＤＣＭ中の２．５％のメタノールでの溶出によって得、及びまたブラウニー−パープルの結晶性固体を与えた。
高いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン，ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ（ノエメジャーメンツ）及びＪＰＰ ｐａｐｅｒ（ペーパー）から〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１４（１．０），５０３（０．０８），５３５（０．０７），５８２（０．０３５），６３６（０．２２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９５（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４２（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．９７（２Ｈ，ｓ，β−Ｈ），８．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．５１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
低いＲ ｆ のクロリンレジオイソマー〔ｎＯｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ及びＪＰＰ ｐａｐｅｒからの２，３−ジヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン〕：（８．５ｍｇ，３０％）；融点１６８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４０１（０．９９），４１３（１．０），５０７（０．０８），５３６（０．０６），５８６（０．０２５），６３７（０．２０）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．９６（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．４０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．１８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０，β−Ｈ），８．９２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），７．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．３０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｍ−Ａｒ），７．１１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），６．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ），６．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），４．１１（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６４２．２（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１３】
１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）クロリン（より一層高いＲｆレジオイソマー）
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中の１，ｌ’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）の撹拌した溶液に、（活性化アルミナカラム中の通過によって乾燥させた。）、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１７，１８−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アミノフェニル）クロリン（１７．５ｍｇ，２３．２□モル）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間撹拌し、その時間でＴＬＣが出発物質の完全な消失を示した。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、乾燥した（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮し、及びフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の１％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトクロリンジオールを溶出した（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィーからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもないと、３つのより一層高いＲｆの副産物に対していくつかの分解が発生する。これらのことは、このときには確認できない。）表題の化合物をブラウニー−パープルの結晶性固体として得た（１７ｍｇ，９０％）；融点１５５℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）４１０（１．０），５０５（０．０９），５３４（０．０６），５８６（０．０４），６３７（０．１８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ６３９ｎｍ（λ励起４１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）１０．０（１Ｈ，ｓ，１０−Ｈ），９．４５（１Ｈ，ｓ，２０−Ｈ），９．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），９．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），９．０２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．１５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，ｏ−Ａｒ），８．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１７−Ｈ），６．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０８（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），（ＮＨのものの交換），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝５８３．７（１００％，Ｍ＋）；Ｃ３４Ｈ２６Ｎ５Ｏ３Ｓについての計算されたＨＲＭＳは：５８４．１７５７、見出されたのは：５８４．１７５６（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１４】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（シス／トランス立体異性体）
５−（４−フルオレノメチルアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）ポルフィリン（３５ｍｇ，４８．０□モル）を、先立って述べた一般的なバクテリオクロリン形成方法を用いて、バクテリオクロリンの立体異性体の混合物に転換した。次いで、粗製の反応混合物をフラッシュシリカゲル（２００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し（ＤＣＭ及び少しのメタノールから２０ｍＬのフラッシュシリカゲルに乾燥負荷し完全な溶解性を確保した。）、ＤＣＭ中の１％メタノールで最初に溶出し、より一層高いＲｆのクロリン副産物を溶出し、次いで２％メタノール／ＤＣＭで２つの立体異性のバクテリオクロリンを別々に溶出した。より一層高いＲ ｆ −トランスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（６ｍｇ，１５％）；融点１４２℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２３），７０２（０．５２）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），８．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，β−Ｈ），７．９５（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７９（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．６５（２Ｈ，ｍ，ｍ’−Ａｒ），７．４７−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０６（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．９４（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
より一層低いＲ ｆ −シスのバクテリオクロリン異性体を、ピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（８．５ｍｇ，２１％）；融点１４８℃（分解）；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７４（１．０），５１２（０．２４），７０３（０．５４）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０８ｎｍ（λ励起５１２ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．１２（２Ｈ，ｓ，１０−Ｈ，２０−Ｈ），８．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．０２（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），７．８５（２Ｈ，ｄ（不明瞭），Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｏ’−Ａｒ），７．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，フルオレノ−Ａｒ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ｍ’−Ａｒ），７．５０−７．３８（６Ｈ，ｍ，フルオレノ−Ａｒ），７．２４（２Ｈ，ｍ，ｍ−Ａｒ），６．２７−６．２３（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．８５−５．８２（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ，１８−Ｈ），４．６５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ２），４．３９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ），４．０５（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８８（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝８００．４（１００％，（Ｍ＋１）＋）。
【０１１５】
７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）
ＤＣＭ中の２５％メタノール（１．２５ｍＬ）における７，８，１７，１８−テトラヒドロキシ−５−（４−フルオレノメチアミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）（８．５ｍｇ，１０．７μモル）の溶液をピペリジン（５０等量，５３μＬ，０．５３ミリモル）で処理し、及び３時間の時間光を遮ってＮ２下に室温で撹拌した。反応混合物を減圧中に濃縮しピペリジンのすべての微量成分を除去した（高い減圧が必要である。）。ＤＣＭ中の１，１’−チオカルボニルジ−２（１Ｈ）−ピリドン（１．０７等量，７．６ｍｇ，４３．５ミリモル）（２５ｍＬ）の撹拌した溶液に、（活性化させたアルミナカラムに通すことによって乾燥させて）ＤＣＭ中の２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アミノフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（６．１ｍｇ，１０．７μモル）（１０ｍＬ）の溶液を添加した。反応フラスコをアルミニウムホイルで被覆し光を遮り、及びＮ２下に２時間、ＴＬＣが出発物質の完全な減少を示す時間撹拌させた。次いで、反応混合物を水（２×５０ｍＬ）で及び飽和かん水（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させた（無水Ｎａ２ＳＯ４）。次いで、有機抽出物をろ過し、及び１０ｍＬのフラッシュシリカゲル上で濃縮してフラッシュシリカゲル（１００ｍＬ）上でクロマトグラフ処理し、ＤＣＭ中の２％メタノールで溶出して所要のイソチオシアナトバクテリオクロリンテトロールを溶出させた（すべてのＴＤＰのＮＢ．微量成分を、カラムクロマトグラフィからの生成物の濃縮に先立って除去しなければならず、さもなければ、若干の分解が起こる。）。より一層低いＲ ｆ シスバクテリオクロリン異性体をピンキー−グリーンの結晶性固体として単離した（５．０ｍｇ，７６％）；融点１３２℃（分解）；）ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）λｍａｘ（相対強度）３７５（１．０），５１６（０．２２），７０２（０．４８）ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳ（ＣＨ２Ｃｌ２）（蛍光）λｍａｘ７０９ｎｍ（λ励起５１６ｎｍ）；δＨ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ−ｄ４）９．２０（１Ｈ，ｓ，メソ−Ｈ）、９．１８（１Ｈ，ｓ，メソ’−Ｈ），８．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，β−Ｈ），８．１４（２Ｈ，ｍ，ｏ−Ａｒ），８．０５（２Ｈ，ｍ，ｏ’−Ａｒ），７．４２−７．０８（４Ｈ，ｍ，５＋１５−ｍ−Ａｒ），６．２０（２Ｈ，２×ｄ（重複），Ｊ＝６．５Ｈｚ，７−Ｈ，１７−Ｈ），５．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，８−Ｈ），５．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１８−Ｈ），４．０４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），−１．８０（２Ｈ，ｂｒ．ｓ（部分的に交換），ＮＨ），（ＯＨのものは観察されない）；ＭＳ（ＭＡＬＤＩ）ｍ／ｚ＝６１８．９（１００％，（Ｍ＋１）＋）；Ｃ３４Ｈ２８Ｎ５Ｏ５Ｓについて計算されたＨＲＭＳは：６１８．１８１５、見出されたのは：６１８．１８１０（（Ｍ＋１）＋）である。
【０１１６】
また、さらなる合成プロトコル及び方法論プロトコルは、Ｓｕｔｔｏｎ等のＰｏｒｐｈｙｒｉｎ， Ｃｈｌｏｒｉｎ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ＆Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｓｅｒｓ−印刷中）及びＯｌｉｖｅｒ（オリバ）Ｊ Ｃｌａｒｋｅ（クラーク），Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏ Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ（博士号論文，２００１年４月，エセックス大学）に記載されている；各々のすべての内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１１７】
方法論の記載１：一般的な生物学的接合プロトコル
ヘキサヒドロキシＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７のモル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ及び必要なときまで０℃で貯蔵した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、３０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のヘキサヒドロキシＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、２５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液の添加によって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１１８】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌したＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを無菌のＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈により１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ，ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２０】
Ｎ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣ＋抗体
ＤＭＳＯ中のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を０．０２７モル濃度に調製し、この溶液を乾燥させ、及び用いるまで０℃で保存した。抗体の溶液を滅菌したＰＢＳに対して大規模に透析しアジ化物の任意の微量成分を除去した。次いで、透析した抗体の溶液を遠心性の濃縮によって１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整し、及び２５０μＬのアリコートに分けた。
炭酸水素ナトリウムの１Ｍ溶液を調製し、及び２Ｍ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０に調整した。
抗体の２５０μＬのアリコートに、２５０μＬの滅菌ＰＢＳ、次いで６０μＬの１Ｍ炭酸水素ナトリウムを添加した。次いで、所定の容積のＮ−メチルピリジニウムクロライドＰＩＴＣの保存溶液を添加し、望ましいモル比（ＭＲ）のポルフィリンを抗体に与えた。例えば、２０のＭＲは、５００μＬの５ｍｇ／ｍＬの抗体に１０μＬの保存溶液を添加することによって達成された。生物学的接合反応混合物中でのＤＭＳＯの一定の濃度を維持するために、保存溶液のすべてのアリコートを更に一部のＤＭＳＯを用いて２５μＬに希釈した。
【０１２１】
ＰＩＴＣの添加に次いで、生物学的接合の反応物を２５℃で１時間緩徐に撹拌した。１時間後、粗製の生物学的接合反応混合物を、滅菌ＰＢＳ（２５ｍＬ）で前もって平衡化された予め包装されたＰＤ１０寸法排除カラムの頂上に直接負荷した。カラムを滅菌ＰＢＳで溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物を最初の色のバンド／画分中に溶出させた。抗体−ポルフィリン接合物の濃度はクロマトグラフィーの間の希釈によって１．２５ｍｇ／ｍＬとして測定された。抗体に対するポルフィリンの標識の程度（ＤＯＬ）を、ポルフィリン及びタンパク質の双方についてのモル吸光率の既知の定数を用いる標準的な分光法によって算出した。
抗体−ポルフィリン接合物を、更に濃縮することなく、他に断らない限り、ＰＢＳ＋アジ化物中、０℃で保存した。
【０１２３】
方法論の記載２：標準的な光細胞障害性
細胞を、集密にまでか、又は適当な密度にまで増殖させ、次いで２回ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）のすべての痕跡成分を除去した。細胞密度を、ＦＢＳを含まない培地中で１．５×１０６細胞／ｍＬに調整し、及び次いで、これらを１時間、暗所（３７度Ｃ，５％ＣＯ２）、光増感剤／接合物濃度の範囲で温置する。温置後、細胞を更に培地（ＦＢＳを含まない）で洗浄して結合しない光増感剤を除去し、次いで再懸濁させ、及びクワドルプレート（ｑｕａｄｒｕｐｌａｔｅ）中の９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種した。次いで、プレートを照射するか（フィルターを通した赤色光□６００ｎｍの３．６Ｊ／ｃｍ２）、又は暗所中で“暗所毒性コントロール”として、同じ時間（〜１４分）の間放置するかのいずれかを行う。ＦＢＳの５マイクロリットル（５％／ウェル）を、照射／暗所の期間の後、添加し、及びプレートを、一昼夜の温置に戻す。処理後１２から２４時間まで、１０μＬのＭＴＴ溶液〔ＰＢＳ中のＳｉｇｍａ Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｂｌｕｅ（シグマチアゾリルブルー）、４．８×１０−４Ｍ〕を、ウェル当たりに添加し、及びプレートを、発色まで（１及び４時間の間）インキュベータに戻す。酸−アルコールの溶液（イソプロパノール中の０．０４ＮのＨＣｌの１００μＬ／ウェル）を添加し、及び十分に混合し濃青色の結晶を溶解する。次いで、プレートをマイクロプレート読み取り機において５７０ｎｍで読み取り、及びその％の細胞生存率をコントロールに対して算出する。
【０１２４】
方法論の記載３：初期（ｉｎｉｔｉａｌ）フローサイトメトリー発色団分析
２つの蛍光色素プローブを、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−イソチオシアナトフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−イソチオシアナトフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層低いＲｆシス立体異性体）とアビジンとの先立って述べた標準的な生物学的接合プロトコルの下での別々の反応から作製した。初期フロー実験をこれらの各々のアビジンのＲＡＪＩ細胞及びビオチンモノクローナル抗体（ＨＬＡ−ＤＲＩ，Ｌ２４３）との接合物を利用することによって行った（レーザ励起４８８ｎｍ，＜６４０ｎｍ（ＦＬ２）＞６７０ｎｍ（ＦＬ３）での発光の収集）。データは、ＤＰＢＣ試料からの信号が、発光フィルター（ＦＬ３）に良好に適合するために、著しく高いことを示した。アビジンＤＰＣＨ又はＤＰＢＣのＬ２４３抗体との接合物はコントロールに比べ蛍光において中程度の増加を示した。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣのより一層高い濃度を用いることによって、ピークの蛍光が増加し、それは接合物の初期濃度が、受容体を飽和させるのにか、又はそれほどではないにせよ、若干の非共有性の結合にとって余りに低いためのいずれかかもしれない。アビジン−ＤＰＣＨ／ＤＰＢＣ（抗体のない）とのコントロール試料は、Ｌ２４３抗体の不存在下に若干の背景蛍光を示し、接合物のＲＡＪＩ細胞に対する若干の非特異的結合が生じるか、又は若干の量の非共有的に結合するフルオロフォアがタンパク質から細胞表面に移ったことを示唆する。ＦＩＴＣ−アビジンのコントロールは、わずかにより一層高い信号がＦＬ２に存在し、それはまた広い発光バンドのためにＦＬ３にも現れることを示した。Ｌ２４３抗体の存在において、平均の信号は１５０％の増加を示した。このことは、非共有結合がＦＩＴＣ−アビジン接合物に対してあまり重要でないことを示した。
【０１２５】
実験を、フルオロフォアのタンパク質表面（ＢＳＡ及びアビジン）に対する非共有結合のレベルを決定するために行った。非反応性のＤＰＣＨ及びＤＰＢＣ誘導体２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）及び２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）とＢＳＡ及びアビジンの双方の混合物を用いる‘ブランク’の生物学的接合を実行し、及び得られたタンパク質溶液を先に記載した反応性プローブのために記載したように、ゲルろ過（ＰＤ−１０）によって精製した。ＵＶ分析は、ほぼ同様の量の非反応性プローブがタンパク質に非共有的に結合することを示した。ＢＳＡ又はアビジンにとって、１つの非反応性ＤＰＣＨが各タンパク質分子に結合するが、ＤＰＢＣは、おそらくその増加した極性及び非両親媒性の性質によって１つより少ない。
【０１２６】
初期の研究を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、タンパク質（ＢＳＡ及びアビジン）から、非共有的に結合したフルオロフォアを除去した。‘ブランク’の生物学的接合の混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける場合、すべての非共有的に結合したフルオロフォアの分離が行えた（可溶化したゲルセグメントの、ＢＳＡについての６６０００Ｄ及びアビジンモノマーについての１６５００ＤのＵＶ／蛍光は信号を示さなかった。）。さらに、これらの検討に加えて、我々は、ＢＳＡ（又はアビジン）に非共有結合するフルオロフォアがヒーラ細胞の表面に移ることを示すことができた。ヒーラ細胞を非共有結合的なフルオロフォア−タンパク質複合体の溶液に添加し、及び２０分間温置する場合、ヒーラ細胞を除去した溶液から蛍光が除去された。この効果は、２，３−ジヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−１５−（４−アセトミドフェニル）クロリン（より一層高いＲｆのレジオイソマー）で２，３，１２，１３−テトラヒドロキシ−５−（４−アセトミドフェニル）−１５−（４−メトキシフェニル）バクテリオクロリン（より一層高いＲｆのトランス立体異性体）よりも極めて顕著であった。細胞の再懸濁及び蛍光の測定は、ＤＰＣＨの場合において蛍光の１０倍の増加を示したが、ＤＰＢＣだけは中程度の増加を示した。これらの測定によって、タンパク質によるＤＰＣＨ及びＤＰＢＣの双方の重大な蛍光クエンチングが起こること、及びＤＰＣＨの両親媒性の性質がヒーラ細胞の膜中に組み込まれてほとんど完全な蛍光の修復が起こることを示唆する。ＤＰＢＣは、非両親媒性であり、それがタンパク質に対して行うように同様な方法でヒーラ細胞の表面を複雑にすることができ、同様な蛍光のクエンチングを起こす。
【０１２７】
フルオロフォア接合物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製できるので、我々は、非共有結合的に結合したフルオロフォアの除去のための技術として、調製用電気泳動の使用を検討した。このために、我々は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（ミリポア社）から購入したＣｅｎｔｒｉｌｕｔｏｒ（Ｒ）（セントリルータ、登録商標）ｍｉｃｒｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒ（マイクロ−エレクトロエルータ）を用いた。この装置はＳＤＳゲルから純粋なタンパク質フルオロフォア接合物を回収させた。
【０１２８】
方法論の記載４：Ｍｉｃｒｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｒを用いるＳＤＳ ＰＡＧＥからの接合物の溶出
・著しく抑制した照明での作業、所要のタンパク質接合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを小さなストリップに切断し、及びセントリルータ試料管に添加し、及びその頂上を閉じた（半分以下、３〜４試料管を用いた）。
・エレクトロエルータのより一層低い緩衝液チャンバーを脱気したＳＤＳランニング緩衝液を用いて第１電極のレベルまで満たした。
・ミリポア社からの３から４のＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）（セントリコン、登録商標）の遠心装置（ＢＳＡ接合物のためのＹＭ−３０及びアビジン接合物のためのＹＭ−３を用いた。）をエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーラック中の孔に下から（フィルター膜を下にして）しっかり挿入し、及びそのラックの空の孔を、ラックの下側から栓を設けることにより塞いだ。
・上側の緩衝液チャンバーを、エレクトロエルータの同じ側に並べた双方の電極を有する下側の緩衝液チャンバー中に配置した。
・次いで、上側の緩衝液チャンバーを、脱気したＳＤＳランニング緩衝液（上述のような）によって、すべてのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上が完全に浸漬するまで満たした。漏出が検出されない場合、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの下に捕捉された気泡を、曲がったプラスチックピペット（ペーパークリップを用いて強化した）によって除去した。
・次いで、セントリルータ試料管をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットの頂上中に配置して、試料管がぴったりと装着されるようにし、及び試料緩衝液（気泡を上述の様に除去した）で完全に満たした。
・エレクトロエルータの安全カバーを追加し、及び電源装置を接続した（２００Ｖ，５０ｍＡを用いた）。
・２〜３時間の後、電源装置を除去し、及びＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）フィルターをエレクトロエルータの上側緩衝液チャンバーから引き出した。
・ろ液バイアルをフィルターユニットに追加し、及び濃縮水のトップ（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ ｔｏｐ）を追加した。次いで、過剰の緩衝液を、５０００Ｇ（ＢＳＡ）及び７，５００Ｇ（アビジン）で２時間の遠心分離によって除去した。新鮮な０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｒ）ユニットに添加し、及びその方法をすべてのＳＤＳが除去されるまで繰り返した。
・次いで、濃縮された精製接合物を、フィルターユニットの濃縮水バイアル中に、反転及び遠心分離によって収集した。アジ化ナトリウム（２Ｍ，２０ｍＬ）を添加し、及び接合物を４℃で保存した。
【０１２９】
方法論の記載５：ＦＡＣＳ接合物結合プロトコル
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３を用いて細胞のフラスコを洗浄する。ＰＢＳ中の５ｍＭのＥＤＴＡを用いて３７℃で１０分間処理する。フラスコを軽くたたいて細胞を移動させ、５０ｍＬのポリプロピレン管中に配置し、及び４００ｇの３分間で小さく丸める。１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、及び細胞を計数する。ＦＡＣＳ管〔ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５４〕中に２×１０５で配置し、及び１ｍＬのＰＢＳを用いて遠心分離（４００ｇ３分）によって洗浄し、及びかき混ぜによって再懸濁させる。
細胞を、５００μＬのＰＢＳ中の２％マーベルミルク粉末、１％ＢＳＡ中で３０分間室温でブロックする。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
１０μＬの適切な希釈度の抗体を添加する。氷上で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し、及びペレットを再懸濁させる（上述のように）。
５０μＬのラビット抗−マウス：ＦＩＴＣ〔Ｓｅｒｏｔｅｃ（セロテック），１／１００希釈〕を添加し、及び氷上暗所で１時間温置する。
細胞を１ｍＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物遠心分離中で洗浄し（上述のように）、及びペレットを４００μＬのＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物中で再懸濁させる。
試料を、ＦＡＣＳ機械に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（セルクエスト）捕捉（ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ）ソフトウェアを用いて通し、データを収集する。
ＰＢＳ／ＢＳＡ／アジ化物
２５０ｍＬ ＰＢＳ
０．６２５ｇ ＢＳＡ
１．５６ｍＬアジ化ナトリウム（１．６Ｍ）
【０１３０】
方法論の記載６：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分離ゲル
成分 ゲルの％ ５ ２０
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．６７ｍＬ ６．６６ｍＬ
１．５Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ８．８） ２．５ｍＬ ２．５ｍＬ
水 ５．６７ｍＬ ０．７ｍＬ
ＴＥＭＥＤ １０μＬ １０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ １００μＬ
勾配ゲル５〜２０％のために、ペリスタポンプに連通させた勾配撹拌機を用いる。
スタッキングゲル（３％）
成分 ｍＬ
アクリルアミド／ビス（４０％ｗ／ｖ） １．３
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １．２５
水 ７．４
ＴＥＭＥＤ ２０μＬ
１０％過硫酸アンモニウム ５０μＬ
ＳＤＳ １００μＬ
ランニング緩衝液
０．０２５Ｍトリス，０．１９２Ｍグリシン，０．１％ＳＤＳ，水中ｐＨ８．３。
サンプル緩衝液
１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ６．８） １３ｍＬ
２０％ＳＤＳ ６．５ｍＬ
グリセロール ５．２ｍＬ
０．５％ブロモフェノールブルー ０．２６ｍＬ
ＢＩＯＲＡＤ（バイオラド社）プロテアン２（Ｐｒｏｔｅａｎ２）装置を製造者の指示に従って用いた。
試料（１〜１０μｇの試料タンパク質を含有する全量１５〜２０μＬ）をゲル上に負荷した。
ゲルを２００Ｖで約１時間運転した。次いで、ゲルを光によってスキャンし、その後、それらを、クーマシーブルー染色を用いて染色し、次いで、酢酸／メタノールを用いて脱染した。
【０１３１】
本発明の更なる例証
我々の独創的な研究において、特に、ＳｕｔｔｏｎＪ， Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｎ，及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（２０００）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ Ｄｉｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｉｎｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎｓ−Ｔｈｅｉｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｔｕｍｏｕｒ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ．Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ ａｎｄ Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅｓ ４，６５５−６５８）；及びＣｌａｒｋｅ，Ｏ．Ｊ．及びＢｏｙｌｅ，Ｒ．Ｗ．（１９９９）Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ，ｕｓｅｆｕｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ．，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２３１−２２３２に記載されるように、それらのそれぞれを参考として本明細書に組み入れ、それは、ポルフィリン、クロリン及びバクテリオクロリン分子の組合せが、安定なチオ尿素結合によってタンパク質に効率的に接合することができ、及びこれらの接合物が蛍光造影剤としての潜在能力を有することを示した。
【０１３２】
本発明の例証として、我々は次に、ヒトの癌細胞に高度な特異性を有するモノクローナル抗体と、ポルフィリン系の光増感剤の我々の組合せとの間に接合を形成するためのこの方法の使用を記載する。この方法で形成された接合物は、相当する癌腫細胞に対する光線力学的な活性について、及びまた、標的でない細胞の存在下にこれらの標的の細胞に選択的に結合し、及び光増感するそれらの能力についてアッセイした。また、我々は、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物のヒーラ細胞への特異的な内部移行を例示する。
【０１３３】
我々の例は、５，１０，１５−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＯＨ６）及び５，１０，１５−トリス（ピリジル）−２０−（４−イソチオシアナトフェニル）ポルフィリン（ＰＹＲ）を用い、我々が我々の以前の研究から見出したように、これらの発色団のそれぞれの光活動性のポルフィリンコアの周りの親水性置換基のパターンがタンパク質との効率的な接合を導き；親水性置換基がまた、より一層疎水性のポルフィリンで多く見られるように、光増感剤のタンパク質に対する非共有結合を最小化する。これらの発色団のための合成プロトコルを上記の例１及び２にそれぞれ記載する。
【化９４】
例２５−抗体に対する安定な接合
ＯＨ６及びＰＹＲを上記例１及び２にそれぞれ記載したように調製した。抗体１７．１Ａを生物学的接合の方法のために選定した。１７．１Ａは結腸直腸の癌細胞、特に、Ｃｏｌｏ（コロ）３２０細胞（ＥＣＡＣＣ，寄託番号８７０６１２０５）上に余分に発現する受容体と特異的に反応する抗体である。しかし、適切な細胞系上で余分に発現する任意の抗原に対し反応する任意の抗体を、本発明にしたがって用いることができる。かかる抗体の例には、Ｂｅｒ−ＥＰ４及びＭＯＫ−３１が含まれ、それぞれはＤＡＫＯ Ｌｔｄ（ダコ社），Ｅｌｙ（イーリー），ケンブリッジシャー州から商業的に入手でき、及びそれぞれは上皮細胞上に余分に発現する抗原に対して反応性である。
【０１３５】
抗体調製物の緩衝液ｐＨを約ｐＨ９に増加させるために、先立って、及び生物学的接合の方法の目的のために、モノクローナル抗体調製物を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心機を用いるか、又はリン酸緩衝液を酢酸緩衝液に交換するために、透析にかけて、リン酸から酢酸緩衝液に交換した。
【０１３６】
ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを、１７．１Ａモノクローナル抗体と、方法論の記載１に記載した方法に従って別々に接合させ、２．５，５，１０及び２０のそれぞれのＭＲを有する接合希釈率の範囲を得た。
【０１３７】
酢酸緩衝化抗体調製物及びそれから得られたさまざまな希釈率の接合物を方法論の記載６に説明した方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。結果を図１〜３にそれぞれ示す。図１は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図２は透析した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び透析した抗体／ＯＨ６接合物のＭＲ２．５（レーン２，３）、５（レーン４，５）、１０（レーン６，７）及び２０（レーン８，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。図３は緩衝液交換した１７．１Ａの抗体（レーン１）、及び緩衝液交換した抗体／ＰＹＲ接合物のＭＲ２．５（レーン２，６）、５（レーン３，７）、１０（レーン４，８）及び２０（レーン５，９）、及び分子量マーカー（レーン１０）を用いて負荷したゲルを示す。
【０１３８】
これらの図に示すように、緩衝液交換か、又は透析かのいずれの方法も、抗体構造を***させず、軽鎖及び重鎖は互いと結合したままであり、及びゲル（レーン１）のそれぞれに共に移動する。また、ＯＨ６及びＰＹＲの各ＭＲでの接合をゲル（レーン２〜９）上で確認することができる。
【０１３９】
例２６−ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析を方法論の記載５に従って行った。
図４はＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及び抗体の細胞への結合が起こっていることを示す（すなわち、Ｃｏｌｏ３２０細胞が１７．１Ａに特異的な抗原を発現する）。
図５は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＯＨ６／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図６は検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物が細胞に結合していることを示す。
図７は、ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４（３回繰り返し）を用いて引き出した結果を示し、ＯＸ−３４は１７．１Ａと同じクラス（ＩｇＧ２ａ）の抗体であるが、異なった高原特異性を有する。これらの結果は、ＯＸ−３４がＣｏｌｏ３２０細胞に結合せず、従ってＣｏｌｏ３２０細胞上にはＯＸ−３４のための結合部位がないことを示す。
【０１４０】
例２７−光細胞障害性の実験
方法論の記載２に説明した方法に従う光細胞障害性の試験を、種々の抗体接合物を用いてＣｏｌｏ３２０細胞上で行った。
図８及び９はＯＨ６／ＯＸ−３４及びＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のそれぞれを用いて行ったコントロール実験の結果を示す。例１６に示すように、ＯＸ−３４はＣｏｌｏ３２０細胞の表面に発現する任意の抗原に対して特異性を欠くことが見出された。したがって、予想通りに、これらのコントロール実験は照射後の光細胞障害性を示さない。
【０１４１】
図１０及び１１は”キャップ（ｃａｐｐｅｄ）”ＯＨ６及びＰＹＲのそれぞれを用いて行った更なるコントロール実験の結果を示す。”キャップ”法は、各発色団上のＮＣＳ基とプロピルアミンとの反応を含み、血清タンパク質の接合をブロックする。図１０では、暗所での細胞障害性を示さず、ＯＨ６がＣｏｌｏ３２０細胞に対して無毒であることを示す。しかし、照射において、若干の光細胞障害性が観察され、キャップＯＨ６のある量がＣｏｌｏ細胞の表面に移ったことが示される。一方、図１１は暗所での若干の細胞障害性を示し、ＰＹＲがＣｏｌｏ３２０細胞に対する若干の程度の細胞障害性に関し、及び照射による光細胞障害性を増加させることを示唆し、再び、キャップＰＹＲのある量がＣｏｌｏ３２０細胞の表面に移ったことを示す。
【０１４２】
任意の抗体の欠損下で、キャップ発色団の細胞膜への移動は、おそらくキャップ発色団の両親媒性の性質に起因し、これはポルフィリンのコアの周りの親水性基及び疎水性プロピルアミンの”キャッピング”基の双方を有する。このことは特にそれらをＣｏｌｏ３２０細胞膜のような脂質膜中に包埋させ易くする。
【０１４３】
図１２及び１３は、ＯＨ６／１７．１Ａ及びＰＹＲ／１７．１Ａ接合物をそれぞれ用い、種々の接合物希釈率（ＯＨ６／１７．１Ａについて２．５，５，１０，２０；ＰＹＲ／１７．１Ａについて１０及び２０）で得た結果を示す。これらの結果は、照射による細胞障害性の有意な増加を示し、生物学的接合物の細胞表面に対する結合が細胞上の感光性を与えることを示す。したがって、これらの種類はＰＤＴの適切な候補である。
【０１４４】
例２８−インビボの光線力学的治療
本発明にかかる接合物を用いる、インビボでの光線力学的治療を行い評価するプロトコルは、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９２）６５：８１３−８１７；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９３）６７：１１７７−１１８１；Ｒ Ｂｏｙｌｅ等の、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３；及びＬａｐｏｉｎｔｅ（ラポワント）等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に多様に記載されており；これらの各内容を参考として本明細書に組み入れる。
【０１４５】
これらの論文に記載されているように、腫瘍をマウスのような動物に誘導するか、又は移植することができ、及び次いでその動物に、本発明にかかる抗原に特異性を有する抗体に接合した光増感剤のある量を注射することができ、この抗原は腫瘍細胞の表面上に特異的に発現されるか、又は余分に発現される。その後、動物に照射をすることができ、及び腫瘍に対する効果を、質的にか、又は計量的に、腫瘍の代謝を参照して評価することができる（Ｌａｐｏｉｎｔｅ等の、Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．５（Ｍａｙ １９９９）８７６−８８２に記載されているように）。また、Ｒ Ｂｏｙｌｅ等のＢｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７３：４９−５３に記載されているように、インビボでの光増感剤の分布を、体内分布及び／又は血管性静止アッセイ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔａｓｉｓ ａｓｓａｙｓ）によって測定することができる。
【０１４６】
例２９−共焦点レーザー顕微鏡
１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−イソチオシアナトフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＣＳ）とＢＳＡとの接合物の細胞内局在性の予試験を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて行った。容易に入手できる上皮性のヒト癌腫細胞系ヒーラを、接合物との温置のために選定した。すべての温置は、ヒーラ細胞のサブ集密的な（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養物を用いて、一連の、標識していないＢＳＡのコントロール溶液、１０，１５，２０−トリス（３，５−ジヒドロキシフェニル）５−アミノフェニルポルフィリン（ＯＨ６−ＮＨ２，ＯＨ６−ＮＣＳのアミノ前駆体）、及びＰＢＳのそのままでのものを含む、３通りで行った。細胞を３５ｍｍの皿においてカバーガラスの上に播種した。
【０１４７】
細胞の蛍光画像を、６０×（ＮＡ１．４）の油浸対物レンズを用いる倒立のオリンパスＩＸ７０顕微鏡上のＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ（バイオラドラジアンス）２０００の共焦点レーザー顕微鏡〔Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（バイオラドマイクロサイエンス），ケンブリッジ，ＭＡ〕を用いて得た。照明源は２５ｍＷアルゴンイオンレーザーからの５１４ｎｍ線であった。ポルフィリンを、５１４ｎｍのバンドパス励起フィルター、５１０ｎｍの２色性ミラー、及び５７０ｎｍの長波長パス発光フィルターを用いて可視化した。
【０１４８】
細胞の各フィールドを、一連の焦平面からの記録画像によって３次元的に区分化した。１つの焦平面から他のものへの移動は、顕微鏡のファインフォーカスコントロールに関連するステッピングモーターによって達成され、増分量（ｓｔｅｐ ｓｉｚｅｓ）（０．５μｍから１．２５μｍまでの範囲における）は用いられる開口寸法に関して選定し、隣接する区分の間に若干の重複が存在する。十分な垂直区分を採用し、各フィールドにおけるすべての細胞の頂部及び底部を記録する。収集された各画像は共焦点顕微鏡の通常の走査速度での４つの走査の平均値であった。各画像化セッション較正の間に、画像を：（ｉ）培地を含む顕微鏡スライド、背景レベルを測定するため；（ｉｉ）ＤＭＳＯ中に溶解したＩＴＣポルフィリンＯＨ６−ＮＣＳを含むスライド；及び（ｉｉｉ）プローブでない（ｕｎ−ｐｒｏｂｅｄ）ヒーラ細胞のみを有するスライドで採取した。
【０１４９】
画像データの取得及び遠隔顕微鏡の操作はＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ２０００ソフトウェアを用いて行った。すべての画像を、Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ａｓｓｉｓｔａｎｔ（コンフォクルアシスタント）バージョン４．０２、（構築１０１）１９９４−１９９６ Ｔｏｄｄ Ｃｌａｒｋ Ｂｒｅｌｊｅ（トッドクラークブレルヘ）を用いて管理した。人工的な色を標準的なＢｉｏ−Ｒａｄの参照表（ｌｏｏｋ−ｕｐ ｔａｂｌｅｓ，ＬＵＴ）を用いてあてはめた。
【０１５０】
設定されたＣＬＳＭ上で入手できる励起レーザー線のそれぞれでのＯＨ６−ＮＣＳの蛍光の予備的な評価は、ＤＭＳＯ中のＯＨ６の０．０１ｍＭ溶液について行った。図１４はＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示し、その主要な吸収帯を確認できる。残念ながら、レーザー線はＯＨ６−ＮＣＳをそのソレー帯λｍａｘで励起するために入手できなかった。図１５は４２２ｎｍ（最適）、及び４種の波長、４５７、４７６、４８８、及び５１４ｎｍのアルゴンイオンレーザーで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳについての蛍光発光の相対的強度を示す。
【０１５１】
５１４ｎｍで励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの溶液によって発光した蛍光の強度が、４５７、４７６、及び４８８ｎｍの励起波長での蛍光発光よりおよそ３倍大きいことが示された。ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視吸収スペクトルは、５１６ｎｍのアルゴン−イオンレーザー線がＯＨ６−ＮＣＳに適合する唯一の励起源であることを示した。３種の最も強いレーザー線、４５７、４７６、及び４８８ｎｍは、ＯＨ６−ＮＣＳのソレー帯及び第１帯の間の領域においてすべて励起し、一方、５１４線は５１６ｎｍでＱ帯と十分に重複した。
【０１５２】
別々に接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡ及び各々の３つのコントロールと温置した細胞培養物を、次いで、洗浄し及び固定した。次いで、温置した細胞を含むカバースリップを標準ガラス顕微鏡スライド上に注意して取り付け、画像化の準備をした。すべての４種のアルゴン−イオンレーザー線を試験するが、予想通り、蛍光の良好な解像度は５１４ｎｍのレーザー線を用いることでのみ達成することができた。
【０１５３】
ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を図１６に示す（この図は左上から右下に見るべきである）。連続した区分を、顕微鏡によって分離された各焦平面の間の２μＭのステップで走査し、従って、細胞内での接合物の局在性の３次元の可視化を可能にする。明らかに、接合物ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡが細胞に入り、細胞の取り込みの性質の研究は行っていないが、取り込みが飲食細胞運動によって起こっている可能性が最も高い。接合物が核に入らないと思われ、細胞質の至るところに大部分分布していることがわかった。
【０１５４】
画像化のとき、ＢＳＡコントロール又はＰＢＳコントロールと温置した細胞は、極めて低い、かろうじて検出できる程度の蛍光のみを示し、通常の程度の細胞の自己蛍光のせいである。ＯＨ６−ＮＨ２（接合していないポルフィリンコントロール）の局在性を図１７に示すが、これは、ポルフィリンコントロール細胞のズーム画を伴うＣＬＳＭ画像を示す。細胞内から発する蛍光は観察されず、代わりに、大多数のＯＨ６−ＮＨ２は形質膜上に局在した。明らかに、接合物のＢＳＡ成分はポルフィリンが細胞の内部に運ばれるのを促進するために必要である。
【０１５５】
要約すれば、ポルフィリン−ＢＳＡ接合物の細胞での局在性が、共有結合性のチオ尿素結合の形成によって構成され、通常のＣＬＳＭ技術を用いて画像化できることが示された。接合していないポルフィリンＯＨ６−ＮＨ２は、細胞の膜を浸透しないことがわかったが、有意な程度の蛍光がＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置した細胞の内部から検出され、良好な接合物の浸透が示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図２】透析した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図３】緩衝液交換した１７．１Ａの抗体等を負荷したゲルを示す図である。
【図４】ＦＩＴＣ標識化１７．１Ａ及びＣｏｌｏ３２０細胞の結果を示す図である。
【図５】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＯＨ６／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図６】検出のためのＦＩＴＣ標識化した抗１７．１Ａ抗体と共にＰＹＲ／１７．１Ａ接合物及びＣｏｌｏ３２０細胞を用いた結果を示す図である。
【図７】ＦＩＴＣ標識化ＯＸ−３４を用いた結果を示す図である。
【図８】ＯＨ６／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図９】ＰＹＲ／ＯＸ−３４接合物のコントロール実験の結果を示す図である。
【図１０】キャップＯＨ６の更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１１】キャップＰＹＲの更なるコントロール実験の結果を示す図である。
【図１２】ＯＨ６／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１３】ＰＹＲ／１７．１Ａ接合物の種々の希釈率の結果を示す図である。
【図１４】ＯＨ６−ＮＣＳのＵＶ−可視スペクトルを示す図である。
【図１５】４種の波長で励起した場合のＯＨ６−ＮＣＳの蛍光発光の相対的強度を示す図である。
【図１６】ＯＨ６−ＮＣＳ−ＢＳＡと温置したヒーラ細胞のＺ−系列の蛍光画像を示す図である。
【図１７】ＯＨ６−ＮＨ２の局在性を示す図である。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to novel porphyrins and porphyrin-based chromophores and combinations of porphyrins and porphyrin-based chromophores, which are particularly useful for photodynamic therapy and photodynamic applications including fluorescence analysis and image processing.
[0002]
[Conventional technology]
The use of porphyrins and porphyrin-based chromophores, for example, as research tools in fluorescence activated cell sorters (FACS) and as therapeutics to effect the elimination of targeted cells in vivo in photodynamic therapy (PDT) The importance of both is widely recognized in this technology. Each of these applications relies on the ability of the chromophore to be excited to a singlet excited state by the incident light beam and attenuated to a lower energy state with resultant energy emission. This energy may be emitted in the form of fluorescent light at certain wavelengths, whereby cells or biological structures attached to the attenuating chromophore are visualized and / or sorted by FACS. obtain. Alternatively, the energy of the excitation is dissipated by the conversion of the first singlet chromophore to the triplet excited state, which then transfers energy to other triplets, such as dioxygen, resulting in a singlet. May be accompanied by the formation of oxygen. Singlet oxygen is a potent cytotoxic agent, so if this latter process occurs in or in the immediate vicinity of a cell, it usually causes the cell to die. Thus, a chromophore can be used for both its fluorescent properties and its ability to act as a photosensitizer.
[0003]
Clearly, for fluorescence imaging or analysis, or PDT, some control of chromophore localization in vitro or in vivo is essential. This is especially important in photodynamic therapy, where the typical range of singlet oxygen irradiation generated by chromophore attenuation is less than 0.1 μm in diameter, resulting in the death of target cells. In addition, the chromophore must usually be located immediately adjacent to, or preferably within, the cell.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, to date, only few attempts have been made to control the targeting of porphyrin photosensitizers to specific target cells in vivo for PDT purposes. Instead, it is typically trusted that porphyrins have an inherent tendency to accumulate in tumors in the absence of lymphatic drainage from tumor structures. Photosensitizers consisting of Photofin® (Photofrin®), a mixture of porphyrin structures derived from hematoporphyrin-IX by treatment with acid, are used commercially for the treatment of carcinomas and sarcomas. For example, it has been conventionally administered systemically to patients without the use of any targeting media or means. This is clearly undesirable, and mislocalization of the photosensitizer may not only reduce the efficiency of the photochemotherapy, but also lead to healthy cell death.
[0005]
In particular, for the purpose of FACS and fluorescence imaging, to achieve specific attachment of a chromophore to a biological target in vitro by covalently attaching the chromophore to an appropriate protein delivery molecule. Efforts have been made. However, this approach has been exposed to various problems. First, it has proven difficult to reduce the degree of background fluorescence caused by non-specific binding of the porphyrin chromophore to the cell surface. Second, attachment of the chromophore to the protein molecule results in a significant degree of quenching of the excited state by the proximal protein, which may be useful as a marker or in targeted photodynamic applications. It was found to significantly reduce sex.
Reducing these effects remains a desirable goal.
[0006]
[Means for solving the problem]
Thus, according to one aspect of the present invention, a porphyrin chromophore of formula (I):
Embedded image
Embedded image
Embedded image
Embedded image
R2Is a hydrophilic aryl moiety;
R3Is H or a hydrophilic aryl or hydrophilic non-aromatic moiety;
And X1, X2, X3, And X4Each independently, H, OH, halogen, C1-3Alkyl and OC1-3X selected from alkyl or having an adjacent CC bond1And X2And / or X3And X4Form an epoxide or cyclopropanyl structure such that X1And X2And / or X3And X4Are each other, O, CH2, CHC1-3Alkyl or C (C1-3Alkyl)2Forming a cross-linking moiety selected from:
Wherein R1, R2And R3Is optionally one or more additional times, -OH, -CN, -NO2, Halogen, -T, or -OT (where T is C1 to 15Alkyl, cycloalkyl or aryl groups or their hydroxylated, halogenated, sulfated, sulfonated or aminated derivatives or their carboxylic acid, ester, ether, polyether, amide, aldehyde or ketone derivatives. ). ]
I will provide a.
[0007]
Including one or more hydrophilic substituents around the core of the chromophore according to the present invention can be performed in a basic buffer / DMSO or DMF co-solution commonly used in bioconjugation of proteins. Induces increased solubility. Also, the increased hydrophilicity significantly reduces the tendency of the chromophore to non-covalently bind to the protein. If the chromophore is to be conjugated to a targeting protein, such as a monoclonal antibody for delivery to a given cell or tissue, e.g., for PDT or FACS purposes, the non-covalent Reduced binding reduces the extent to which the chromophore is non-specifically transferred to the cell surface and substantially improves the accuracy of targeting of the chromophore to the cell or tissue of interest.
[0008]
Thus, another aspect of the invention also separates a mixture comprising one or more hydrophilic chromophores, each having a hydrophilic or amphiphilic moiety, and a plurality of less hydrophilic substances and / or molecules. Introducing the mixture into a hydrophobic eluent and determining whether the one or more chromophores are stopped on the solid phase and the substances and / or molecules are eluted from the solid phase by the elution solvent. Or passing the mixture and the elution solvent over a hydrophilic or polar solid phase so as to substantially elute.
[0009]
For example, the method includes chromatography on a Sephadex® [Sephadex®, (Dextran)] column, or reverse phase HPLC. Typically, the mixture of less hydrophilic substances and / or molecules may comprise a mixture of cells and / or membranes. Advantageously, said one or more hydrophilic chromophores comprises one or more chromophores according to the invention.
[0010]
In some embodiments, X1~ X4Are H. However, in a particularly preferred embodiment, X1~ X4Are OH. Thus, the chromophore may be dihydroxychlorin of the above formula (II), (III), (IV) or (V) or tetrahydroxybacteriochlorin of the above formula (VI) or (VII). The hydrophilicity of dihydroxychlorin and tetrahydroxybacteriochlorin is found to be higher than that of the corresponding porphyrins due to the presence of special hydrophilic hydroxy groups around the core of the chromophore.
[0011]
Preferably, the aryl moiety R1Contains a phenyl ring, which is preferably connected to the macrocyclic core of the chromophore by a single bond, or1-6May be linked to it by a branched or linear alkyl chain. Advantageously, said conjugating group Z can be linked to said phenyl ring at its para (4 ') position.
[0012]
The conjugating group Z can include a group that can be covalently linked to an amine group on the polypeptide molecule; for example, an isocyanate, isothiocyanate, or NHS ester group. Thus, advantageously, each of the meso substituents around the porphyrin, chlorin or bacteriochlorin may result in a covalent bond to the bonding group Z -NH2, -NH2 +-Or -NH3 +Should not be included. This serves to reduce the possibility of internal crosslinking within the chromophore. Alternatively, the bonding group Z can be any other protein bonding group, for example, -NH2, -NH (C1-6Alkyl), maleamide, iodoacetamide, ketone or aldehyde. Methods for achieving conjugation of such groups to protein molecules are known in the art.
[0013]
In a particularly preferred embodiment, the conjugation group comprises an isothiocyanate group. Isothiocyanates readily react with lysine residues to form a stable linkage to proteins and are therefore particularly stable for the biological conjugation of the chromophores of the present invention.
[0014]
The bonding group Z is the same as the aryl moiety R1Can be directly linked by a single bond. Alternatively, the bonding group Z is the aryl moiety R1Can be connected by connecting parts having a relatively high degree of rigidity and / or steric hindrance. The connection portion is, for example, 1000 g mol-1Fused or linked chains of cycloalkyl and / or cycloalkyl ring structures having a total molecular weight of no greater than can be included. In particular, the linking moiety can include an anthracene, acridine, anthranyl, naphthyl or naphthalene moiety, or a polyacetylene, phenylacetylene, or polyphenylacetylene moiety. If the chromophore is joined by the joining group Z to a polypeptide molecule, then the linking moiety can serve to hold the photoactive core of the chromophore separate from the polypeptide, And helps reduce the fluorescence quenching that may be caused by the polypeptide when the chromophore fluoresces. The linking moiety may be a hydrophilic or amphiphilic moiety of the type described above, for example, C2~ C30A polyethylene glycol moiety can be included. This helps to ensure that the hydrophilicity of the chromophore is not compromised by the presence of the linking moiety.
[0015]
Optionally, said aryl moiety R1May be further substituted by one or more hydrophilic substituents, such as hydroxy, which serve to improve the hydrophilicity of the chromophore.
[0016]
The hydrophilic aryl moiety R2May comprise a phenyl ring, which phenyl ring may be substituted one or more times, preferably at least twice, with one or more hydrophilic substituents. The group is an aryl moiety R2Plays the role of increasing the hydrophilicity of The phenyl ring is preferably linked to the macrocyclic core of the chromophore by a single bond or, alternatively,1-6May be linked to it by a branched or linear alkyl chain. Alternatively, the hydrophilic aryl moiety R2May comprise a heteroaryl ring, such as a pyridyl or a quatenized pyridyl {pyridiniumyl} ring, wherein the heteroaryl ring is optionally one or more times, preferably at least twice, 1 or It can be substituted by further hydrophilic substituents, wherein the hydrophilic substituents are2Plays the role of increasing the hydrophilicity of The heteroaryl ring is preferably linked to the macrocyclic core of the chromophore by a single bond, or1-6May be linked to it by a branched or linear alkyl chain. The one or more hydrophilic substituents are preferably hydroxy; alkoxy, such as methoxy or ethoxy;2~ CFifteenPolyethylene glycol; quaternized pyridyls such as N-methylpyridinium (pyridinium); mono-, di- or poly-saccharides; C1-6Alkyl sulfonic acid; phosphonium group R4P (R5) (R6) (R7) (Where R4Is a single bond or C1-6Alkyl and R5, R6And R7Each independently represents hydrogen, an aryl ring such as a phenyl ring, a heteroaryl ring such as a pyridyl ring, and C1-6Selected from alkyl chains, these aryl rings, heteroaryl rings or C1-6The alkyl chain is unsubstituted or one or more times, hydroxy, C1-6Substituted by alkyl or alkoxy, aryl, oxo, halogen, nitro, amino or cyano. ); Or a phosphate group or a phosphonate group {each R8OP (O) (OR9) (OR10) Or R8P (O) (OR9) (OR10) Wherein R is8Is a single bond or C1-6Alkyl and R9And R10Each independently of hydrogen and C1-6Selected from alkyl. You can choose from｝. Preferably, R5, R6And R7Can be the same, and can advantageously be unsubstituted phenyl. Suitably, the R8May be methyl. Advantageously, said R9And R10Can be the same and / or can be methyl or ethyl.
[0017]
In a particularly preferred embodiment, the hydrophilic aryl moiety R2Is
m, m- (dihydroxy) phenyl
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m, m, p- (trihydroxy) phenyl
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o, p, o- (trihydroxy) phenyl
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p- (methyltriphenylphosphonium) phenyl
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p-methylphosphono-di-ethoxy) phenyl
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p-methylphosphonato-di-ethoxy) phenyl
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m- or p- (N-methyl-pyridiniumyl) phenyl
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Selected from
[0018]
In another preferred embodiment, the hydrophilic aryl moiety R2Is p-N- (C1-6Alkyl) pyridinium group or mN- (C1-6Quaternized pyridyl (pyridiniumyl) groups, such as alkyl) pyridinium groups. Quaternized pyridyl (pyridinyl) groups are highly hydrophilic and exhibit advantageous properties when incorporated into the chromophores of the present invention. Particularly preferred groups in this regard are m- or pN-((C1-6) Alkyl) pyridinium groups such as mN-methylpyridinium
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[0019]
In another particularly preferred embodiment, the quaternized pyrimidiniuyl group is p-N- (C1-6Alkylsulfonic acid) pyridinium or mN- (C1-6Alkylsulfonate) pyridinium; especially p-N- (propylsulfonate) pyridinium
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[0020]
Preferably, the or each quaternized pyridinium group R2Can be associated with an iodide counterion or, in the most preferred embodiment, a halide counterion such as a chloride counterion.
[0021]
In some advantageous embodiments, R3Is H and the chromophore comprises 5,15-diaryl-porphyrin, -chlorin or -bacteriochlorin. In another advantageous embodiment, the R3Is a hydrophilic aryl or non-aromatic moiety. For example, the R3Is R2Can include a hydrophilic aryl moiety as defined above. The hydrophilic aryl moiety R3Is the aforementioned hydrophilic aryl moiety R2And the chromophore has the same substituents at
[0022]
R2Is R3The same chromophores of the present invention can be prepared by methods known in the art, for example, by acid-catalyzed condensation of benzaldehyde with pyrrole, or by the "
[0023]
A generalized scheme for synthesizing the 5-isothiocyanatophenyl-15-pyridinium porphyrins, chlorins and bacteriochlorins of the present invention is presented below as
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A generalized scheme for synthesizing the 5-isothiocyanatophenyl-15-methylphosphonium phenyl porphyrins, chlorins and bacteriochlorins of the present invention is presented below as
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R2And optionally R3The porphyrins, chlorins and bacteriochlorins of the present invention consisting of pyridinium phenyl can be synthesized according to the generalized reaction scheme presented below as Scheme 3, where "R" is a compound of the formula (I Represents hydrogen as defined above for (VII) to (VII) or one or more hydrophilic substituents:
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The R2And optionally R3The porphyrins, chlorins and bacteriochlorins of the present invention, wherein R is alkylphosphonatophenyl or alkylphosphonophenyl, can be synthesized according to the generalized reaction scheme presented below as
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In a further aspect of the invention, a 5,10,15,20-tetra-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore is synthesized having selected substituents at the 5,10,15 and 20 meso positions. Providing a 5,15-di-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore; attaching a leaving group Q at the 10 and 20 meso-positions of the chromophore. Wherein the leaving group Q is selected from halide and triflate; a coupling reagent (R11O) (R12O) BRThirteenProviding R11And R12Independently of H or C1-6Selected from alkyl or R11And R12Are connected to each other by the two O atoms1-6Constituting an alkyl chain; and RThirteenIs the above R3Being a vinyl or aryl such as a hydrophilic aryl moiety as defined with respect to, and the chromophore and the linking reagent, a base selected from potassium phosphate, sodium phosphate, cesium carbonate and barium hydroxide, and Pd0Reacting in the presence of a catalyst;ThirteenWith the leaving group Q at the 10- and 20-meso positions of the chromophore.
[0028]
Pd using boronic acid or boron ester reagent0-Catalytic Suzuki (Suzuki) coupling reactions are known in the art and are described, for example, in Miyaura and Suzuki, palladium-catalyzed cross-coupling reactions of organoboron compounds, Chem. Rev .. (1995) 95: 2457-2483; the disclosure of which is incorporated herein by reference. However, to date, attempts to perform Suzuki-coupling at the meso-position of porphyrin, chlorin or bacteriochlorin as a means of incorporating a selected substituent onto said meso-position have failed. However, the inventor has found that under the reaction conditions according to the invention, Suzuki-coupling proceeds quickly and successfully at the 10- and 20-meso positions of the starting porphyrin, chlorin or bacteriochlorin. This method thereby enables a convenient synthesis of tetra-meso-substituted porphyrins, chlorins or bacteriochlorins by Suzuki-coupling.
[0029]
Said leaving group Q may be chloride, bromide, iodide or triflate (trifluoromethanesulfonate). Suitably, said leaving group Q may be bromide. Methods for the meso-bromination of di-meso-substituted porphyrins, chlorins or bacteriochlorins are known in the art. For example, the 5,15-di-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore can be halogenated at its 10- and 20-meso-positions by reaction with a halosuccinimide such as bromosuccinimide. .
[0030]
The linking reagent may be composed of a boronic ester or a boronic acid. In a preferred embodiment, R11And R12Is H, and the linking reagent is a boronic acid.
[0031]
Advantageously, said 5,15-di-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore is a chromophore of the invention or a protected form thereof. Thus, the 5,15-di-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore is a porphyrin chromophore of formula (VIII):
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Where R4Is a group R as defined above with respect to formulas (I) to (VII)1Or a protected form thereof, or a group convertible thereto;5Is a group R as defined above with respect to formulas (I) to (VII)2Or a protected form thereof, or a group convertible thereto; and X1, X2, X3, And X4Is independently of H, OH, halogen, C1-3Alkyl and OC1-3X selected from alkyl or having an adjacent CC bond1And X2And / or X3And X4Form an epoxide or cyclopropanyl structure such that X1And X2And / or X3And X4Are O and CH2, CHC1-3Alkyl or C (C1-3Alkyl)2Forming a bridging portion selected from:
[0032]
Therefore, in the formula, RThirteenIs R3And wherein said 5,10,15,20-tetra-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore constitutes the chromophore of the invention. Can be.
[0033]
The Pd0The catalyst is, for example, Pd (PPh3)4, PdCl2(PPh3)2Or Pd (OAc)2Can consist of Advantageously, the Pd0The catalyst is Pd (PPh3)4Can consist of
[0034]
The linking reaction is performed in a solvent, and the solvent can be selected from toluene or dry THF. The association reaction was found to proceed quickly in dry THF, so dry THF is preferred as the solvent.
[0035]
Optionally, wherein R isThirteenIs vinyl and the 5,10,15,20-tetra-meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore converts the 10- and 20-vinyl substituents to hydroxyalkyl following the association reaction. Like, OsO4Can be subjected to an osmulation reaction. The osmulation reaction can be performed under the same conditions as those appropriate for converting porphyrin to di-beta-hydroxy-chlorin and then to tetra-beta-hydroxy-bacteriochlorin. According to the present invention, this step is performed according to the method described in DiMagno (Dimagno) et al. Org. Chem. 1993: 58, 5983-5993 (incorporated herein by reference), using a Pd-catalyzed Stille performed on the 5,15-di-meso-substituted chromophore according to the method using vinyltributyltin as the linking reagent. What can be done on a 5,10 (vinyl), 15,20 (vinyl) -meso-substituted porphyrin, chlorin or bacteriochlorin chromophore obtained without the method of the present invention, such as by the (Styr) coupling. Is noted.
[0036]
Where the tetra-meso-substituted chromophore is a porphyrin or chlorin chromophore, the chromophore may be a chlorin or bacteriochlorin chromophore, or a bacteriochlorin chromophore, respectively, according to methods known to those skilled in the art. Can be converted to For example, the porphyrin or chlorin chromophore may be OsO, such as producing di-beta-hydroxy-chlorin or tetra-beta-hydroxy-bacteriochlorin.4Can be osmulated by a reaction using
[0037]
A generalized scheme for the reaction according to the invention is presented in
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In another aspect of the invention, there is provided a 5,15-diphenylporphyrin, 5,15-diphenylchlorin or 5,15-diphenylbacteriochlorin chromophore, wherein each of the 5- and 15-phenyl groups has an ortho-, meta- And / or each of the para-positions is a substituent P1~ P5And Q1~ Q5And each of these substituents is independently H or an inert substituent, and this substituent is the other substituent P1~ P5And Q1~ Q5In combination with substantially no loss of the fluorescent properties of the chromophore; and the chromophore further comprises a conjugating group Z, which is a polypeptide for delivering the chromophore to a given biological target in vitro or in vivo. A chromophore is provided that can conjugate the chromophore to a molecule.
[0039]
Such chromophores are novel and each are competent in excitation to emit fluorescent light at different and substantially non-overlapping wavelengths. As indicated above, the provision of the conjugation group Z allows the chromophores of the invention to specifically target a given biological target, thus localizing the chromophore in vitro or in vivo. Promotes sexual control. Thus, the chromophores of the present invention can be effectively used in fluorescence analysis and image processing applications (including FACS), or in PDT.
[0040]
Advantageously, said fluorescent dye is the following compound:
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[0041]
In the above chemical structural formula, Z is omitted for clarity. However, the Z substituent can be attached at any of the 1-4, 6-14, or 16-20 positions of each chromophore, or the substituent P1~ P5Or Q1~ Q5Or the substituent P1~ P5Or Q1~ Q5Can be attached to one of the 5- or 15-phenyl groups.
[0042]
In some embodiments, P1~ P5Are each such that the two main phenyl rings are symmetrically substituted.1~ Q5Or substantially the same as a corresponding one of In another embodiment, P1~ P5One or more of Q is such that the two major phenyl rings are not symmetrically substituted.1~ Q5Is not the same as the corresponding one of In particular, P1~ P5All and / or Q1~ Q5Can consist of H such that one or both of the two main phenyl rings are not substituted.
[0043]
Advantageously, said substituent P1~ P5And Q1~ Q5Provide, as a whole, a steric hindrance around the chromophore core sufficient to reduce the rate of spontaneous oxidation of the chromophore, such that the chromophore is substantially inert in air. However, it does not, to a substantial extent, inhibit selective addition or substitution at
[0044]
The substituent P1~ P5And Q1~ Q5One or more of -OH, -CN, -NO2, Halogen, -T, or -OT, wherein T is C1 to 15Alkyl, cycloalkyl or aryl groups or their hydroxylated, halogenated, sulfated or aminated derivatives or their carboxylic acids, esters, ethers, polyethers, amides, aldehydes or ketone derivatives. The substituent P1~ P5And Q1~ Q5One or more of the above may additionally or alternatively be C3-12A cycloalkyl and / or aryl ring structure, or between 2 and 6, preferably 2-3 fused or linked C3-12It may consist of cycloalkyl and / or aryl ring structures, each of which may optionally contain one or more N, O or S atoms. In particular, one or more of said substituents P1~ P5And Q1~ Q5Can consist of a quaternized amine such as an N-methylpyridyl (pyridinyl) group or a pyridyl group.
[0045]
Preferably, P1~ P5And Q1~ Q5Is a bonding substituent composed of the bonding group Z. In a particularly preferred embodiment, the conjugating substituent is P3Or Q3And the bonding group Z is provided on one para position of the two main phenyl rings.
[0046]
Suitably, said linking group is as defined above with respect to the first aspect of the invention.
[0047]
In particular, the substituent P1~ P5And Q1~ Q5One or more of the above is not the aforementioned bonding substituent,1Z1A14
Consisting of members independently selected from the group consisting of1Is Z2, Z2A5Or Z2A5A6And;
A1And A5Independently of-(CA2A3)n-, -C (Y) (CA2A3)n-, -C (Y) Y '(CA2A3)n-, -C (Y) NA4(CA2A3)n-, -NA4C (Y) (CA2A3)n-, -NA4(CA2A3)n, -YC (Y ') (CA2A3)n-And -Y (CA2A3)n-N is from 0 to 6; Y and Y 'are independently O or S;2, A3And A4Is independently H or C1-2Alkyl, which is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;
A6=-(C2H4O)m-Or -S (O)pM = 1 to 12; p = 0 to 2;
Z2Is a single bond or Z3And Z3Is Z4, Z5And Z6This Z3Is unsubstituted or one or more times, OH, halo, CN, NO2, A1A10, A6A8, NA10A11, C (Y) A7, C (Y) Y'A7, Y (CH2)qY'A7, Y (CH2)qA7, C (Y) NA10A11, Y (CH2)qC (Y ') NA10A11, Y (CH2)qC (Y ') A9, NA10C (Y) NA10A11, NA10C (Y) A11, NA10C (Y) Y'A9, NA10C (Y) Z6, C (NA10) NA10A11, C (NCN) NA10A11, C (NCN) SA9, NA10C (NCN) SA9, NA10C (NCN) NA10A11, NA10S (O)2A9, S (O)rA9, NA10C (Y) C (Y ') NA10A11, NA10C (Y) C (Y ') A10Or Z6A; q = 0, 1 or 2; r = 0-2;7Is independent of H and A9Selected from; A8Is O or A9And A9Is C1-4Alkyl, which is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;10Is OA9Or A11And A11Is A7Or A10And A11Is NA10A11When they can together with nitrogen form a 5- to 7-membered ring consisting only of carbon atoms or of carbon atoms and at least one heteroatom selected from O, N and S;
Z4Is C6-12Aryl or aryloxy C1-3Alkyl;
Z5Is C containing a furanyl, tetrahydrofuranyl, indanyl, indenyl, tetrahydropyranyl, pyranyl, thiopyranyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, one or two unsaturated bonds.3-8Cycloalkyl or C4-8Cycloalkyl, and C7-11Selected from polycycloalkyls;
Z6Is N-azolyl, dioxadiazinyl, dioxadiazolyl, dioxanyl, 2-N-dioxatriazinyl, dioxazinyl, N-dioxazolyl, dioxolyl, dithiadiazinyl, dithiadiazolyl, N-dithiatriazinyl, dithiazinyl, N-dithiazolyl, 1-N-imidazolyl, N-morpholinyl, pyrrolyl, tetrazolyl, thiazolyl, triazolyl, oxazinyl, oxazolyl, naphthidinyl, oxadiazinyl, oxadiazolyl, oxatetrazinyl, oxatriazinyl, oxatriazolyl, oxazinyl, oxazolyl , Pentazinyl, phthalazinyl, N-piperidinyl, N, N-piperazinyl, 1-N-pyrazolyl, pyridazinyl, pyridinyl, pyrimidinyl, tetrathiazinyl, tetrazinyl , 1-N-tetrazolyl, tetroxazinyl, thiadiazinyl, thiadiazolyl, thiatetrazinyl, thiatriazinyl, thiatriazolyl, thiazolyl, triazinyl, 1-N-triazolyl, trioxadazinyl, trioxanyl, trioxazinyl, trioxazolyl, trithiazinyl, trithiazinyl, trithiazinyl Selected from zolyl;
Z4, Z5Or Z6Is Z4, Z5And Z6Can be fused to one or more other members independently selected from:
A14Is hydrogen, methyl, hydroxy, aryl, halo-substituted aryl, aryloxy C1-3Alkyl, halo-substituted aryloxy C1-3Alkyl, indanyl, indenyl, C7-11Polycycloalkyl, tetrahydrofuranyl, furanyl, tetrahydropyranyl, pyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, tetrahydrothiopyranyl, thiopyranyl, C3-6Cycloalkyl or C containing one or two unsaturated bonds4-6The cycloalkyl ｛cycloalkyl or heterocyclic moiety is unsubstituted or substituted by one to three methyl groups, one ethyl group, or a hydroxyl group. ｝.
[0048]
The bonding substituent is A1Z1Z can be a member selected from the group consisting of
Where Z1Is Z2, Z2A5Or Z2A5A6And;
A1And A5Independently of-(CA2A3)n-, -C (Y) (CA2A3)n-, -C (Y) Y '(CA2A3)n-, -C (Y) NA4(CA2A3)n-, -NA4C (Y) (CA2A3)n-, -NA4(CA2A3)n, -YC (Y ') (CA2A3)n-And -Y (CA2A3)n-N is from 0 to 6; Y and Y 'are independently O or S;2, A3And A4Is independently H or C1-2Alkyl, which is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;
A6=-(C2H4O)m-Or -S (O)pM = 1 to 12; p = 0 to 2;
Z2Is a single bond or Z3And Z3Is Z4, Z5And Z6This Z3Is unsubstituted or one or more times, OH, halo, CN, NO2, A1A10, A6A8, NA10A11, C (Y) A7, C (Y) Y'A7, Y (CH2)qY'A7, Y (CH2)qA7, C (Y) NA10A11, Y (CH2)qC (Y ') NA10A11, Y (CH2)qC (Y ') A9, NA10C (Y) NA10A11, NA10C (Y) A11, NA10C (Y) Y'A9, NA10C (Y) Z6, C (NA10) NA10A11, C (NCN) NA10A11, C (NCN) SA9, NA10C (NCN) SA9, NA10C (NCN) NA10A11, NA10S (O)2A9, S (O)rA9, NA10C (Y) C (Y ') NA10A11, NA10C (Y) C (Y ') A10Or Z6A; q = 0, 1 or 2; r = 0-2;7Is independent of H and A9Selected from; A8Is O or A9And A9Is C1-4Alkyl, which is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;10Is OA9Or A11And A11Is A7Or A10And A11Is NA10A11When they can together with nitrogen form a 5- to 7-membered ring consisting only of carbon atoms or of carbon atoms and at least one heteroatom selected from O, N and S;
Z4Is C6-12Aryl or aryloxy C1-3Alkyl;
Z5Is C containing a furanyl, tetrahydrofuranyl, indanyl, indenyl, tetrahydropyranyl, pyranyl, thiopyranyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, one or two unsaturated bonds.3-8Cycloalkyl or C4-8Cycloalkyl, and C7-11Selected from polycycloalkyls;
Z6Is N-azolyl, dioxadiazinyl, dioxadiazolyl, dioxanyl, 2-N-dioxatriazinyl, dioxazinyl, N-dioxazolyl, dioxolyl, dithiadiazinyl, dithiadiazolyl, N-dithiatriazinyl, dithiazinyl, N-dithiazolyl, 1-N-imidazolyl, N-morpholinyl, pyrrolyl, tetrazolyl, thiazolyl, triazolyl, oxazinyl, oxazolyl, naphthidinyl, oxadiazinyl, oxadiazolyl, oxatetrazinyl, oxatriazinyl, oxatriazolyl, oxazinyl, oxazolyl , Pentazinyl, phthalazinyl, N-piperidinyl, N, N-piperazinyl, 1-N-pyrazolyl, pyridazinyl, pyridinyl, pyrimidinyl, tetrathiazinyl, tetrazinyl , 1-N-tetrazolyl, tetroxazinyl, thiadiazinyl, thiadiazolyl, thiatetrazinyl, thiatriazinyl, thiatriazolyl, thiazolyl, triazinyl, 1-N-triazolyl, trioxadazinyl, trioxanyl, trioxazinyl, trioxazolyl, trithiazinyl, trithiazinyl, trithiazinyl Selected from zolyl;
Z4, Z5Or Z6Is Z4, Z5And Z6Can be fused to one or more other members independently selected from:
[0049]
In a particularly preferred embodiment of the present invention, the chromophore comprises the following (x), (y) or (z)
Can consist of a chromophore having the structure presented as:
Embedded image
R R ’
4-H @ 4-NCS
4-Me @ 4-NCS
4-Br @ 4-NCS
4-CO2Me @ 4-NCS
3,4,5-Tris (OMe) @ 4-NCS
4-NCS @ 4-OMe
4-NCS @ 4-Me
4-NCS @ 4-CO2Me
4-NCS 4-Br
4-NCS @ 4-CN
4-NCS @ 4-CO2Me
Can be either.
[0050]
In another embodiment of the invention, the chromophore may comprise a porphyrin chromophore having the structure presented below:
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[0051]
In another aspect of the present invention, a combination of fluorochrome markers for multicolor fluorochrome analysis, comprising at least two chromophores selected from the group consisting of porphyrin chromophores, chlorin chromophores, and bacteriochlorin chromophores. Wherein each of those chromophores comprises the same porphyrin skeleton, each of those chromophores comprises one or more substituents on said porphyrin skeleton, and one of those substituents comprises a bonding group Z A combination wherein the group L is a conjugate group that can conjugate each chromophore to a polypeptide molecule for delivering the chromophore to one of a plurality of different predetermined biological targets. provide.
[0052]
Preferably, each of the other said substituents on the backbone is independently H, or an inert substituent which, together with said conjugated substituent L and all other core substituents, does not substantially impair the fluorescent properties of each chromophore. Group R.
[0053]
It has been found that each chromophore in the combination of the invention emits fluorescent light at a different and distinct wavelength upon excitation. Thus, all the chromophores in the combination are excited by a single laser and produce a separate emission band that can be substantially individually resolved. In addition, all of the chromophores provided in the combination substantially share the same molecular structure, and thus substantially achieve the same degree of efficiency of biological conjugation to a biological target under given conditions. Substantially share the same biological and physicochemical properties. Thus, the chromophore combinations of the present invention can be effectively used in fluorescence analysis and sorting applications for convenient sorting and analysis of various types of cells or other biological targets, including FACS. . The components of such a combination are introduced, for example, into a mixture comprising one or more of said different predetermined biological targets, under conditions that cause each chromophore to be delivered to its respective predetermined biological target; And the mixture can be exposed to light to cause the chromophore to fluoresce. A multi-color analysis can then be performed to identify the different emission bands produced by each chromophore, thereby allowing the location and visualization of the location of each different biological target.
[0054]
Said chromophore combination may in particular consist of two or more porphyrin chromophores of any aspect of the invention, the corresponding chlorin chromophore, and the corresponding bacteriochlorin chromophore (where "corresponding to "Means having the same meso-substituent around the macrocyclic core of the molecule).
[0055]
In the chromophore of the invention, or in each member of the chromophore combination of the invention, the conjugate Z can be conjugated to a binding protein that is compatible with specific binding to the biological target. Alternatively, the conjugating group Z can be conjugated to a cross-linking polypeptide, which is compatible with binding to the complementary cross-linking polypeptide to link the chromophore to a complementary cross-linking polypeptide. I do.
[0056]
In some embodiments, the cross-linking polypeptide is capable of binding to the complementary cross-linking polypeptide, and the complementary cross-linking polypeptide is a binding protein compatible with specific binding to the biological target. Consisting of, associated with, or fused with. Thus, the chromophore may be covalently linked to the binding protein by the cross-linked polypeptide and the complementary cross-linked polypeptide.
[0057]
In another aspect of the present invention, a kit comprising a chromophore of the present invention or a combination of chromophores of the present invention, wherein the chromophore or each chromophore is conjugated to a cross-linked polypeptide, wherein the cross-linked polypeptide is Adapted to bind to the complementary cross-linked polypeptide to link the chromophore to the complementary cross-linked polypeptide; and wherein the constituent or plurality of constituents are each specific for the biological target. Consist of said complementary cross-linked polypeptide fused to or associated with a binding protein that is compatible with binding; the sequence of which renders said chromophore or each chromophore specific for said predetermined biological target. Binding the chromophore or each chromophore in the kit to a different component in the kit that has specificity for the predetermined biological target to couple to a binding protein having To provide a kit that is adapted.
[0058]
For example, the binding protein may be an antibody, such as a monoclonal or polyclonal antibody or a fragment thereof, having specificity for a target-specific molecule on the surface of the biological target. In particular, the antibody is a phage antibody and can be an antibody expressed on the surface of a bacteriophage. Alternatively, the binding protein can consist of a protein that is compatible with binding to one or more cell surface molecules or receptors, such as serum albumin protein. As a still further alternative, the binding protein can consist of a low density lipoprotein, such as a fatty acid chain, adapted for insertion into the cell membrane. When conjugated to a chromophore, such lipoproteins can serve to anchor the chromophore to the cell membrane.
[0059]
The cross-linking polypeptide can consist of calmodulin, and the complementary cross-linking polypeptide can consist of calmodulin-binding peptide; or vice versa. However, preferably, the cross-linking polypeptide can consist of avidin or streptavidin, and the complementary cross-linking polypeptide can consist of biotin; or vice versa. In particular, the or each chromophore in the kit of the invention can be conjugated to avidin, and the or each component is capable of binding to a target-specific molecule on the surface of the biological target. And specific biotinylated monoclonal antibodies. Thus, when the avidin-linked chromophore binds the biotinylated antibody, the chromophore will be tightly linked to the antibody. Conveniently, the or each biotinylated monoclonal antibody in the kit is selected and / or easily substituted to deliver the or each chromophore to a desired biological target. can do. Methods for the preparation of monoclonal antibodies and for their biotinylation are well known in the art.
[0060]
In another aspect of the present invention, a step of providing a kit of the present invention in attaching a chromophore of the present invention or a combination of chromophores of the present invention to the predetermined biological target or target group, And combining the components of the kit with the predetermined biological target or group of targets under appropriate conditions to allow binding of the or each binding protein to the predetermined biological target or group of targets. There is provided a method comprising the step of introducing nearby. Advantageously, the components of the kit are used to bind the chromophore or a cross-linking polypeptide conjugated to each chromophore to a complementary cross-linking polypeptide provided on one of the components in the kit. Prior to introduction of the target or targets, they can be linked together. This ensures that the chromophore or each chromophore in the kit is linked to a binding protein prior to introduction of the chromophore to the target or targets. Alternatively, the components of the kit can then be introduced into the target or targets.
[0061]
Typically, the predetermined biological target may be a cell or a membrane. The predetermined biological target may be in vivo or in vitro (ex vivo). For example, the biological target may be a cancer cell, a tumor cell, a cell infected with HIV or any other microorganism or virus, a cell that causes deleterious activity in an autoimmune disease, a foreign or abnormal cell ( diseased cell), or any other such cell.
[0062]
In some embodiments of the invention, the biological target is an in vitro cell, and the target-specific molecule is a polypeptide, carbohydrate, fatty acid, lipoprotein, phospholipid or other. Consist of molecules that are exposed on the surface of the cell, such as biological molecules. Preferably, the target-specific molecule is specifically expressed or over-expressed by the cell. For example, the target-specific molecule can be a T cell marker such as CD4 or CD8. Thus, a chromophore that forms part of a chromophore of the invention or a combination of chromophores of the invention adheres to the cells, and the cells are illuminated to cause fluorescence of the chromophore, The cells are visualized by the fluorescence of and the counting by FACS is performed and / or sorted.
[0063]
Thus, in a further aspect of the present invention, in fluorescence-activated sorting of target cells from a mixture of cells, a chromophore of the present invention or a combination of chromophores of the present invention is attached to said target cells and allowed to bind to said target cells. Irradiating the mixture of cells, charging the fluorescing cells, and separating or separating the charged cells from the mixture to produce one or more fluorescence of the attached chromophore. Providing a mixture of cells through a polarized environment.
[0064]
In another aspect of the present invention, the method of the present invention comprises visualizing and / or counting a plurality of target cells, wherein the target cells comprise cells of two or three different cell types. Providing a combination of chromophores, wherein the chromophore combination comprises two or three chromophores, each chromophore adapted to be delivered to a different one of said cell types; Attaching a chromophore to the target cells according to the method of the invention; irradiating the target cells to cause the chromophore to emit fluorescence; detecting a fluorescent emission band generated by each of the chromophores And optionally, for each said band, measuring the area under the emission / wavelength curve to obtain a measure of the number of fluorescent cells of each individual cell type.
[0065]
In another embodiment of the invention, said target cell is a cancer cell, a tumor cell, or an in vitro cell, such as an infected, foreign or abnormal cell, and said target-specific molecule is said target cell. Expressed by, or superimposed on, or attached to, and exposed to the surface of a target cell-specific molecule, such as a target cell-specific membrane protein. Thus, when a chromophore of the invention is delivered to the target-specific molecule, the chromophore will attach to the cell. If the cell is then illuminated with light at an appropriate wavelength to cause excitation of the chromophore, the chromophore attached to the cell will be excited, and this will be in close proximity to the cell. Causes the production of singlet oxygen and thus death of the cell.
[0066]
In a particularly preferred embodiment, said target cell-specific molecule comprises an internalization receptor on the surface of said cell, said internalization receptor being capable of binding said binding protein, and Mediates the internalization of the chromophore within the cell. Thus, subsequent irradiation with the light of the cell at an appropriate wavelength to cause excitation of the chromophore will result in the production of singlet oxygen in the cell, thus resulting in death of the cell.
[0067]
Accordingly, the present invention provides a step of irradiating the cells in order to cause the chromophore of the present invention to adhere to the cells and cause the production of singlet oxygen to occur near the cells in causing the target cells to disappear. And thereby causing cell death. Preferably, said chromophore is attached to an internalization receptor on the surface of said cell, said internalization receptor capable of mediating internalization of said chromophore in said cell, and Is then irradiated such that the production of singlet oxygen in the cell occurs, thereby causing cell death.
[0068]
Preferably, when the chromophore is adapted to be internalized into the cell, the chromophore is caused by a net negative charge on the mitochondrial membrane by the cells of the chromophore around the mitochondria of the cell. Include cationic groups, such as quaternized amine or pyridyl (pyridiniumyl) groups, or phosphonium groups to promote internal accumulation. This results in the rapid and efficient disappearance of cells in the presence of singlet oxygen presentation due to chromophore decay.
[0069]
In another aspect of the present invention, within abnormal or unwanted cells, such as tumors, cancer, viral infections such as HIV infection, or autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis. Administering to a patient in need thereof an effective amount of a chromophore of the present invention in treating a disease or disorder characterized by the presence of a chromophore that causes adherence to said cells. The chromophore is adapted to be targeted for attachment to target cells specific molecules on the surface of said abnormal or unwanted cells, and a singlet near said cells Irradiating the cells with light to produce oxygen, thereby providing a method of killing the cells. Suitably, the target cell-specific molecule consists of an internalization receptor, and the chromophore is adapted to internalize into a cell upon delivery to the internalization receptor, and upon irradiation the intracellular To allow the production of singlet oxygen.
[0070]
The chromophore can be administered to the patient locally or systemically. For example, the chromophore can be administered by injection.
[0071]
In yet another aspect of the invention, the body of abnormal or unwanted cells, such as tumors, cancer, viral infections such as HIV infection, or autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis. A pharmaceutical composition administered to a patient to treat a disease or disorder characterized by its presence in a chromophore of the invention, which is delivered to said abnormal or unwanted cells. Provided is a pharmaceutical composition comprising a chromophore adapted to be administered and a suitable carrier.
[0072]
Yet another aspect of the present invention is in the context of abnormal or undesirable cells, such as tumors, cancer, viral infections such as HIV infection, or autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis or multiple sclerosis. A chromophore of the invention for use in the manufacture of a medicament for use in the treatment of a patient suffering from a disease or disorder characterized by the presence of a chromophore; A chromophore that fits in.
[0073]
Detailed description of examples of the invention
The following are descriptions and examples of embodiments of the invention and methods for practicing the invention, by way of example only.
Chromophore synthesis
Instrumentation and materials
Melting points are not modified.1H /ThirteenC NMR spectra were recorded on a Jeol JNM EX270FT-NMR spectrometer and were based on tetramethylsilane unless otherwise specified. I. R. The spectrum was converted to a series of 1600 ° FT-I. R and nominal mass spectra were obtained on a Kratos Kompact MALDI II spectrometer. Exact mass was obtained from EPSRC Mass Spectrometry Service (mass spectrometry service), Swansea (Swansea). Electronic spectra were obtained using a Unicam (Unicam) UV-2 or UV-4 spectrometer and were acquired in DCM unless otherwise specified. All reagents and solvents were commercially available, reagent grade or higher grade, and were used as received unless otherwise specified. TLC analysis was performed on Merck @ silica-gel (Merck silica gel) 60 plates (F254, 500 μm thickness). Merck silica gel 60 (230-400 mesh) was used for flash chromatography purification.
[0074]
Description
(1) {5-} 4-acetamidophenyl-10,15,20-tris (3,5-dimethoxyphenyl) porphyrin
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[0075]
(2) {5- (4-aminophenyl) -10,15,20-tris (3,5-dimethoxyphenyl) porphyrin
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[0076]
(3) {5- (4-aminophenyl) -10,15,20-tris (3,5-dihydroxyphenyl) porphyrin
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[0077]
(4) {5- (4-acetamidophenyl) -10,15,20-tris (4-pyridyl) porphyrin
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[0078]
(5) {5- (4-aminophenyl) -10,15,20-tris (4-pyridyl) porphyrin
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[0079]
(6) {5- (4-acetamidophenyl) -10,15,20-tris (3-pyridyl) porphyrin
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[0080]
(7) {5- (4-aminophenyl) -10,15,20-tris (3-pyridyl) porphyrin
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[0081]
(8) {5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin,
DDP was synthesized according to the method of Dolphin et al. (1998, 5-phenyldipyrromethane and 5,15-diphenylporphyrin {Org. Synth. 76, 287-293, incorporated herein by reference). The resulting mixture of the three porphyrins was chromatographed, first eluted with DCM to remove 5,15- (4-methoxy) -DDP, and then ethyl acetate / DCM (1: 4) was followed by eluting the required product as purple crystals (150 mg, 12%);f= 0.40 (DCM / MeOH, 19: 1); mp 305-307 ° C (decomposition); UV-vis (DCM) λ.max(Relative intensity) 410 (1.0), 502 (0.04), 538 (0.02), 578 (0.015), 630 (0.01) nm;1H NMR (270 MHz, CDCl3) Δ 10.35 (s, 2H, 10 + 20−H), 9.43 (d, 4H, J = 4.8 Hz, β−H), 9.14 (d, 4H, J = 4.8 Hz, β−H) ), 8.65 (m, 2H, J = 7.2 Hz, 5-m-Ar), 8.22-8.12 (m, 4H, (overlap), J = 8.1 Hz, 5 + 15-o-Ar) ), 7.56 (m, 2H, J = 8.1 Hz, 15-m-Ar), 4.14 (s, 3H, CH)3), -3.00 (br @ s, 2H, NH); MALDI-MS m / z 550.3 (M+, 100%).
[0082]
(9) {5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin,
5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin 8 (1 equivalent (eq.), 100 mg, 0.182 mmol) is dissolved in 5M aqueous HCl (100 mL) and The solution was heated under reflux for 3 hours. The hot reaction mixture was concentrated in vacuo to give a crude green solid. The solid was redissolved in a mixture of DCM / triethylamine (9: 1) (200 mL) and stirred for 10 minutes at room temperature. The solution is then washed with water (3 × 200 mL), saturated brine (200 mL), and the organic layer is separated and dried (Na2S04) And then concentrated in vacuo. The crude purple solid was chromatographed and eluted with DCM to give the desired porphyrin as a purple crystalline solid (51 mg, 54%).f= 0.30 (DCM), melting point 300 ° C (decomposition); UV-vis (DCM) λmax(Relative intensity) 410 (1.0), 503 (0.045), 538 (0.02), 578 (0.015), 630 (0.005) nm; fluorescence (DCM) λmax634 nm (λ excitation = 410 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3) Δ 10.30 (s, 2H, 10 + 20-H), 9.39 (d, 4H, J = 4.9 Hz, β-H), 9.17 (d, 2H, J = 4.9 Hz, β-H ), 9.10 (d, 2H, J = 4.9 Hz, β-H), 8.19 (m, 2H, J = 8.8 Hz, 15-o-Ar), 8.07 (m, 2H, J = 8.1 Hz, 5-o-Ar), 7.35 (m, 2H, J = 8.8 Hz, 15-m-Ar), 7.14 (m, 2H, J = 8.1 Hz, 5- m-Ar), 4.13 (s, 3H, CH3), 4.08 (br @ s, 2H, NH), -3.06 (br @ s, 2H @ NH); MALDI-MS m / z 508.3 ([M + 1]+, 100%). C33H26N5O ([M + 1]+ES-HRMS calculated for) is 508.2137, found 508.2144.
[0083]
(10) $ 17,18-dihydroxy-5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin and
(11) regioisomers of {7,8-dihydroxy 5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin,
Porphyrin 9 (28mg, 55.2μ mol), according to Sutton (Sutton) methods such as (2000 Functionalised diphenylchlorins and bacteriochlorins-their synthesis and bioconjugation for targeted photodynamic therapy and tumour cell imaging J. Porphyrin and Phthalocyanines 4,655-658) Was converted to the required mixture of chlorin regioisomers. The crude reaction mixture was then chromatographed and eluted with 1% MeOH in DCM. First, some unreacted starting material is eluted, then the higher R as a brownish-purple crystalline solidfValue of
[0084]
(12) {5- (4-fluorenylmethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin,
To a stirred solution of porphyrin 9 (28 mg, 55 μmol) in
[0085]
(13,14) cis / trans-7,8,17,18-tetrahydroxy-5- (4-fluorenylmethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin
Porphyrin 12 (35mg, 48.0μ mol), methods such as Sutton (2000 Functionalised diphenylchlorins and bacteriochlorins-their synthesis and bioconjugation for targeted photodynamic therapy and tumour cell imaging J. Porphyrin and Phthalocyanines 4,655-658- herein by reference Incorporation) was converted to the required mixture of bacteriochlorin stereoisomers (reaction was performed with 1,4-dioxane (5 mL) to dissolve 12). The crude reaction mixture was chromatographed first using 1% MeOH in DCM to remove chlorin by-products. In addition, elution with 2% MeOH / DCM separated both stereoisomeric bacteriochlorintetrols. Even higher Rf-Transbacteriochlorin isomer 13 was isolated as a pink-green crystalline solid, (6 mg, 15%), Rf= 0.25 (DCM / MeOH, 19: 1), melting point 142-145 [deg.] C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 374 (1.0), 512 (0.23), 702 (0.52) nm; fluorescence (DCM) λmax708 nm (λ excitation = 512 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3Medium 10% CD3OD) δ 9.20 (s, 2H, 10 + 20-H), 8.78 (d, 2H, J = 4.0 Hz, β-H), 8.36 (d, 2H, J = 4.0 Hz, β- H), 7.95 (m, 2H, o-Ar), 7.85 (m, 2H, J = 7.3 Hz, fluoreno-Ar), 7.79 (m, 2H @ o'-Ar), 7. 65 (m, 2H, m'-Ar), 7.47-7.38 (m, 6H, fluoreno-Ar), 7.24 (m, 2H, m-Ar), 6.27-6.24 ( m, 2H, 7 + 17-H), 5.85 (m, 2H, 8 + 18-H), 4.65 (d, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 4.39 (t, 1H, J = 7.2 Hz, CH), 4.06 (s, 3H, CH3), -1.94 (br @ s (partially exchanged), 2H, NH), (OH not observed); MALDI-MS m / z 800.4 ([M + H]+, 100%); C48H40N5O7([M + H]+)], The ES-HRMS calculated is 798.2927, found 798.2921.
Lower RfOf cis-bacteriochlorin isomer 14 was isolated as a pink-green crystalline solid, (8.5 mg, 21%), Rf= 0.2 (DCM / MeOH, 19: 1), mp 148-150 <0> C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 374 (1.0), 512 (0.24), 703 (0.54) nm; fluorescence (DCM) λmax708 nm (λ excitation = 512 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3Medium 10% CD3OD) δ 9.12 (s, 2H, 10 + 20-H), 8.76 (d, 2H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.34 (d (duplicate), 2H, J = 4.8 Hz) , Β-H), 8.02 (m, 2H, o-Ar), 7.85 (m (unclear), 2H, J = 8.0 Hz, o′-Ar), 7.83 (m, 2H) , J = 7.3 Hz, fluoreno-Ar), 7.76 (m, 2H, J = 8.0 Hz, m′-Ar), 7.50-7.38 (m, 6H, fluoreno-Ar), 7 .24 (m, 2H, m-Ar), 6.27-6.23 (m, 2H, 7 + 17-H), 5.85-5.82 (m, 2H, 8 + 18-H), 4.65 ( d, 2H, J = 7.2 Hz, CH2), 4.39 (t, 1H, J = 7.2 Hz, CH), 4.05 (s, 3H, CH3), -1.88 (br.s (partially exchanged), 2H, NH), (OH not observed); MALDI-MS m / z 800.4 ([M + H]+, 100%); C48H40N5O7([M + H]+ES-HRMS calculated for) is 798.2927, found 798.2921.
[0086]
(15) {5- (3,4,5-trismethoxyphenyl) dipyrromethane
3,4,5-Trismethoxybenzaldehyde (5.0 g, 25.5 mmol) was dissolved in freshly distilled pyrrole (75 mL) and the solution was dried with
[0087]
(16) 5- (4-acetamidophenyl) dipyrromethane
Dipyrromethane was synthesized using the general method detailed above using the same molar amount of the initial aldehyde. The crude reaction mixture was chromatographed on flash silica gel (350 mL) (dry load from ethyl acetate to 50 mL flash silica gel), and eluted with 40% ethyl acetate / DCM and off-white To give the pure product as a solid, (4.3 g, 50%): νmax(Nujolmar) / cm-13409 (NH, amide), 3248 (br. NH), 1650 (C = O), 1593 (C = C), 1320, 1009; UV-VIS (MeOH) λmax/ (Relative intensity) 224 (1.0) nm; δH (270 MHz; CDCl3) 8.00 (2H, br.s, NH), 7.40 (2H, d, J = 8.5 Hz, o-Ar), 7.30 (1H, br.s, NH-acetamide), 7. 13 (2H, d, J = 8.5 Hz, m-Ar), 6.68 (2H, m, 1-H), 6.16 (2H, m, 2-H), 5.90 (2H, m , 3-H), 5.42 (1H, s, methane), 2.14 (3H, s, NH)CH 3 ); ΔC (68 MHz; CDCl3) 168.4 (q,COCH3), 138.2 (q, 4'-C), 136.5 (q, 2'-C), 132.4 (q, 4-C), 128.9 (CH, 2'-C), 120 .3 (CH, 3'-C), 117.2 (CH, 1-C), 108.4 (CH, 2-C), 107.1 (CH, 3-C), 43.4 (CH. , Methane), 24.5 (CH3); MS (MALDI) m / e 279.4 (100%, (M)+).
[0088]
(17) {5- (4-methoxyphenyl) dipyrromethane
Dipyrromethane was synthesized using the general method detailed above using the same molar amount of the first aldehyde. The crude reaction mixture was chromatographed on flash silica gel (350 mL), eluted with 50 mL of flash silica gel from ethyl acetate, and eluted with 30% n-hexane / DCM and as an off-white solid To give pure product, (4.3 g, 50%): νmax(Nujolmar) / cm-1, 3382 (br. NH), 1598 (C = C), 1300, 1050; UV-VIS (MeOH) [lambda].max/ (Relative intensity) 224 (1.0) nm; δH (270 MHz; CDCl37.87 (2H, br.s, NH), 7.10 (2H, d, J = 8.8 Hz, m-Ar), 6.83 (2H, d, J = 8.8 Hz, o-Ar) ), 6.66 (2H, m, 1-H), 6.14 (2H, m, 2-H), 5.89 (2H, m, 3-H), 5.40 (1H, s, methane) ); MS (MALDI) m / e 252.4 (100%, (M)+).
[0089]
Example 1
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (3,5-dihydroxyphenyl) porphyrin
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Example 2
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (4-pyridyl) porphyrin
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[0091]
Example 3
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (3-pyridyl) porphyrin (160)
Embedded image
[0092]
Example 4
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (4-N-methylpyrazinium yl) porphyrin triiodide
Embedded image
[0093]
Example 5
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (3-N-methylpyridinium) porphyrin triiodide
Embedded image
[0094]
Example 6
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (4-N-methylpyridinium) porphyrin trichloride
Embedded image
[0095]
Example 7
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tris (4-N-methylpyridinium) porphyrin trichloride
Embedded image
[0096]
Example 8
17,18-dihydroxy-5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin,
Even higher RfThe regioisomer chlorin 10 (17.5 mg, 23.2 μmol) was converted to the corresponding isothiocyanate by the following method. To a stirred solution of 10 (1 eq, 50 mg, 0.099 mmol) in freshly distilled DCM (20 mL) was added 1,1′-thiocarbonyldi-2 (1H) -pyridone (2 eq, 46 mg, 0.198 mmol) was added. The reaction was allowed to stir at room temperature under argon for 2 hours, after which the reaction mixture was filtered and concentrated and chromatographed, eluting with 1% MeOH in DCM to give the title compound. The title compound was isolated as a brownish purple crystalline solid, (17 mg, 90%), Rf= 0.36 (DCM / MeOH, 19: 1); mp 155-158 <0> C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 410 (1.0), 505 (0.09), 534 (0.06), 586 (0.04), 637 (0.18) nm; fluorescence (DCM) λmax639 nm (λ excitation = 412 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3Medium 10% CD3OD) δ 10.0 (s, 1H, 10-H), 9.45 (s, 1H, 20-H), 9.20 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 9.06 (D, 1H, J = 4.0 Hz, β-H), 9.02 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.84 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β -H), 8.64 (d, 1H, J = 4.0 Hz, β-H), 8.55 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.21 (m, 1H, J = 8.1 Hz, 5-o-Ar), 8.15 (m, 1H, J = 8.1 Hz, 5-o-Ar), 8.05 (m, 1H, J = 8.9 Hz, 15- o-Ar), 7.93 (m, 1H, J = 8.9 Hz, 15-o-Ar), 7.65 (m, 2H, 5-m-Ar), 7.24 (m, 2H, 15 -M-Ar), 6.43 (d, 1H, J = 6.5 Hz, 7-H), 6.04 (d, 1H, J = 6.5Hz, 18-H), 4.08 (s, 3H, CH3), (Exchange of NH and no OH is observed); MALDI-MS m / z 583.7 ([M = H]+, 100%); C34H26N5O3S ([M + H]+) Is 584.1775, found 584.1756.
[0097]
Example 9
Cis-7,8,17,18-tetrahydroxy-5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin
Treated cis-bacteriochlorin 14 (8.5 mg, 10.7 μmol) in 25% MeOH in DCM (1.25 mL) with piperidine (50 eq, 53 μL, 0.53 mmol) and illuminated. N at room temperature for 3 hours2Allowed to stir below. The reaction mixture was concentrated in vacuo (0.1 torr) to remove any traces of piperidine. The crude amine was then converted to the required isothiocyanate according to the method described above. The cis-bacteriochlorin isothiocyanate was isolated as a pink-green crystalline solid (5.0 mg, 76%).f= 0.40 (DCM / MeOH, 19: 1), mp 132-135 <0> C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 375 (1.0), 516 (0.22), 702 (0.48) nm; fluorescence λmax709 nm (λ excitation = 516 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3Medium 10% CD3OD) δ 9.20 (s, 1H, meso-H), 9.18 (s, 1H, meso-H), 8.77 (d, 2H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.40 (D, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.34 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.14 (m, 2H, o-Ar), 8. 05 (m, 2H, o'-Ar), 7.42-7.08 (m, 4H, 5 + 15-m-Ar), 6.20 (m, 2H, 7 + 17-H), 5.98 (m, 1H, 8-H), 5.93 (m, 1H, 18-H), 4.04 (s, 3H, CH3), -1.80 (br @ s, 2H, partially exchanged -NH), (OH not observed); MALDI-MS m / z 618.9 ([M + H]+, 100%); C34H28N5O5S ([M + H]+ES-HRMS calculated for 618.1815 and found for 618.1810.
[0098]
Examples 10, 11, 12, 13
17,18-dihydroxy-5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin / 7,8-dihydroxy-5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorinregio Isomers, and
Cis / trans-7,8,17,18-tetrahydroxy-5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin stereoisomer,
Porphyrin 8 (100 mg, 0.18 mmol) was converted in a single reaction to a chlorindiol / bacteriochlorintetrol mixture according to the method of Sutton et al. After 38 hours, the reaction was stopped. The crude reaction mixture was then chromatographed, using elution with 10% MeOH in DCM, first several unreacted starting materials, then a brownish purple crystalline solid (5 mg, 5% Higher R of Example 10 asfTo give the chlorin isomer of Lower R of Example 11fThe isomer of was obtained by further elution with 3.5% MeOH in DCM and also gave a brownish purple crystalline solid (7.0 mg, 7%). Further elution with 5% MeOH in DCM gave the required trans / cis bacteriochlorintetol of Examples 12 and 13, respectively, a pink / green solid (5.0 mg, 5%) and (7. 0 mg, 7%).高 い High R of Example 10fChlorin regioisomer [17,18-dihydroxy-15- (4-methoxyphenyl) -5- (4-acetamidophenyl) chlorin assigned based on previous data] (26) Rf= 0.40 (DCM / MeOH, 37: 3), mp 186-188 [deg.] C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 410 (1.0), 505.5 (0.12), 535 (0.08), 585.5 (0.05), 637 (0.18) nm; fluorescence (DCM) λmax639 nm (λ excitation = 410 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3) Δ 9.97 (s, 1H, 10-H), 9.42 (s, 1H, 20-H), 9.19 (d, 1H, J = 4.0 Hz, β-H), 9.03 ( d, 1H, J = 4.0 Hz, β-H), 8.98 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.89 (d, 1H, J = 4.0 Hz, β- H), 8.70 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.52 (d, 1H, J = 4.8 Hz, β-H), 8.14-8.10 (m , 3H, 5-o / m-Ar), 7.96-7.82 (m, 3H, 5 + 15-o / m-Ar), 7.50 (s, 1H, NH), 7.34 (m, 2H, 15-m-Ar), 6.48 (m, 1H, 17-H), 6.20 (m, 1H, 18-H), 4.08 (s, 3H, CH3), 2.38 (s, 3H, CH3), -1.89, -2.20 (s, 2H, NH); MALDI-MS m / z 582.6 ([M + H]+, 100%); C35H28N5O4([M + H]+ES-HRMS calculated for) is 582.2141, found 582.2137.
Example 11 low RfChlorin regioisomer [7,8-dihydroxy-5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin] Rf= 0.35 (DCM / MeOH, 37: 3), mp 182-185 [deg.] C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 410 (1.0), 505.5 (0.1), 535 (0.07), 585 (0.04), 636 (0.19) nm; fluorescence (DCM) λmax639 nm (λ excitation = 410 nm);1H NMR (270 MHz,
Example 12 high Rf-Transbacteriochlorin; Rf= 0.29 (DCM / MeOH, 37: 3: 1), mp 152-155 ° C (decomposition); UV-vis (DCM) λ.max(Relative intensity) 373.5 (1.0), 514 (0.25), 702 (0.49) nm; fluorescence (DCM) λmax708 nm (λ excitation = 514 nm);1H NMR (270 MHz, DMSO-d6) Δ 10.27 (s, 1H, NH), 9.16 (s, 2H, 10 + 20-H), 8.96 (d, 2H, J = 4.0 Hz, β-H), 8.24 (d, 2H, J = 4.0 Hz, β-H), 7.99-7.89 (m, 6H, 5 + 15-o / m-Ar), 7.25 (m, 2H, 15-m-Ar), 6 .30 (m, 2H, 7 + 17-H), 6.15 (m, 2H, 8 + 18-H), 5.63 (m, 2H, OH), 5.32 (m, 2H, OH), 3.99 (S, 3H, CH3), 2.20 (s, 3H, CH3), -1.87 (br @ s, 2H, NH); MALDI-MS m / z 616.3 ([M + H]+, 100%). C35H30N5O6([M + H]+ES-HRMS calculated for) is 616.2196, found 616.2192.
Low RfCis-transbacteriochlorin 13; Rf= 0.24 (DCM / MeOH, 19: 1), mp 148-151 <0> C (decomposition); UV-vis (DCM) [lambda].max(Relative intensity) 373.5 (1.0), 514.5 (0.24), 703 (0.50) nm; fluorescence (DCM) λmax708 nm (λ excitation = 514 nm);1H NMR (270 MHz, CDCl3Medium 20% CD3OD) δ 9.20 (s, 2H, 10 + 20-H), 8.78 (m, 2H, β-H), 8.35 (m, 2H, β-H), 8.05 (m, 2H, 5) -O-Ar), 7.89-7.86 (m, 3H, 5 + 15-o / m-Ar), 7.75 (m, 1H, 15-o-Ar), 7.20-7.17 ( m, 2H, 15-m-Ar), 6.25 (m, 2H, 7 + 17-H), 5.86 (m, 2H, 8 + 18-H), 4.06 (s, 3H, CH3), 2.31 (s, 3H, CH3), (Exchange of NH); MALDI-MS m / z 616.4 ([M + H]+, 100%). C35H30N5O6([M + H]+ES-HRMS calculated for) is 616.2196, found 616.2192.
[0099]
Example 16
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tri (4-methylphosphoniumphenyl) -porphyrin and 5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methylphosphoniumphenyl) -porphyrin -General synthesis method
Boc N-protected 5- (4-aminophenyl) -10,25,20-tri- (4-carbomethoxyphenyl) porphyrin and 5- (4-aminophenyl) -15- (4-carbo Methoxyphenyl) porphyrin was used under Lindsey (Lindsey) conditions [Lindsey, J. et al. S. , Schreiman, I .; C. Hsu, H .; C. , Bearney, P.M. C. , Margueritettaz (Margretta), A.M. M. (1987) J. Amer. Org. Chem. 52, 827], [Boyle, R., et al.], Such as mixed condensation or Boyle. W. , Bruckner, C.I. , Posakony, J. et al. James, B .; R. Dolphin, D.D. (1999) Organic @ Syntheses. 76,287-incorporated herein by reference. The synthesis was by a 2 + 2 condensation procedure with 5-phenyldipyrromethane appropriately substituted as described by The (4-carbomethoxyphenyl) group on these porphyrins was then dissolved by the following standard method: porphyrin (0.2 mmol) was dissolved in dry THF (25 mL) at 0 ° C. and 10 g under argon. The mixture was converted to a (4- (1-bromomethyl) phenyl) group using a method of stirring for minutes. Lithium aluminum hydride (0.7 mmol) was added and stirring continued for 24 hours. The reaction was monitored by TLC, when the reaction was complete, ethyl acetate (2 mL) was added, and the reaction was quenched with aqueous HCl (0.2 M, 20 mL), saturated sodium bicarbonate solution (30 mL) and finally brine (30 mL). (20 mL). Dry the organic layer (MgSO 44) And evaporated to dryness to give the corresponding (4- (1-hydroxymethyl) phenyl) -substituted porphyrins bearing three or one reduced form of the carbomethoxy group, respectively. (4- (1-Hydroxymethyl) phenyl) -substituted porphyrin (0.2 mmol) is dissolved in dry chloroform (40 mL) and stirred under argon, while triphenylphosphine (1.0 mmol) and Carbon bromide (1.6 mmol) was added. The reaction was stirred for 24 hours in the dark and then monitored by TLC. Once all hydroxymethyl groups have been converted to bromomethyl groups, the reaction mixture is diluted with dichloromethane (40 mL), washed with saturated sodium bicarbonate (2 × 2 mL) and then with brine (2 × 2 mL), and Dry the organic layer (MgSO4). Removal of the solvent in vacuo gave the corresponding bromomethyl porphyrin as a purple crystalline solid.
Bock N-protected 5- (aminophenyl) -10,25,20-tri- (4-bromomethylphenyl) porphyrin and 5- (aminophenyl) -15- (4-bromomethylphenyl) porphyrin (0. 75 mmol) was dissolved in dry dichloromethane (50 mL) at 25 ° C. under an argon atmosphere. Triaryl or trialkylphosphine (7.5 mmol) dissolved in dichloromethane (10 mL) was injected by syringe and TLC was performed after the reaction proceeded. Upon completion, the solvent was evaporated from the reaction in vacuo and the crude product was purified by flash column chromatography (silica; gradient elution: dichloromethane to methanol) as a shiny purple crystalline solid To give the required Bock-N-protected-5- (aminophenyl) -methylphosphonium-meso-arylporphyrin. The Bock protecting group was removed by dissolution of the porphyrin in chloroform or acetonitrile, depending on the solubility and the addition of trimethylsilyl iodide (5.0 equivalents), and after 30 minutes the reaction was quenched with methanol (10 mL). I let it. Removal of the solvent by evaporation followed by flash column chromatography (silica; gradient: dichloromethane to methanol) gives 5- (aminophenyl) -methylphosphonium-meso-arylporphyrin, which is obtained by standard methods [Clarke (Clark), O.M. J. And Boyle, R .; W. (1999. JCS Chem. Commun. 2231)] to give the required mono-4- (isocyanatophenyl) compound by treatment with 1,1'-thiocarbonyldi-2 (1H) -pyridone. Converted.
[0100]
Example 17
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tri ((4-methylphosphono-di-ethoxy) phenyl) -porphyrin and 5- (4-isothiocyanatophenyl) -15-((4- Methylphosphono-di-ethoxy) phenyl) -porphyrin-general synthetic method
Bock N-protected 5- (4-aminophenyl) -10,15,20-tri- (4-bromomethylphenyl) porphyrin and 5- (aminophenyl) -15- (4-bromomethylphenyl) porphyrin ( (0.75 mmol) was dissolved in a mixture of triethyl phosphite (15 mmol) and dry acetonitrile (50 mL). A reflux condenser was fitted and refluxed under argon. The reaction was subjected to TLC and, upon completion, washed with saturated sodium bicarbonate (2 × 20 mL), water (2 × 20 mL) and brine (2 × 20 mL). The organic layer is then dried (MgSO 44) And the solvent was evaporated in vacuo. The crude product was then purified by flash column chromatography (silica; gradient elution: dichloromethane to ethyl acetate) to give the title compound as a purple crystalline solid. The methylphosphono-di-ethoxy group was then sonicated for 1 hour in aqueous sodium hydroxide, followed by reverse phase medium pressure chromatography [C18From gradient aqueous 0.1% TFA in water to methanol] (from Boyle, RW and van Lier, JE (1993) Synlett 351) to the methylphosphono-mono-ethoxysodium group or from bromo Treatment for 2 hours with triethylsilane (2 equivalents per methylphosphono-di-ethoxy group) followed by purification chromatography by reverse phase chromatography (C18Gradient elution from 0.1% TFA aqueous solution to methanol) [McKenna, McKenna, C .; E. FIG. Higa, M .; T. Cheung, N .; H. , McKenna, MC. (1977) 2,155] to any of the fully deprotected methylphosphonic acids. Following the deprotection of Bock (see above), the conversion of the unmasked 4- (aminophenyl) group to its isothiocyanato analog was accomplished by standard methods (Clarke, OJ and Boyle, RW). (1999 JCS Chem. Commun. 2231).
[0101]
Example 18
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tri ((4-methylphosphonato-di-ethoxy) phenyl) -porphyrin and 5- (4-isothiocyanatophenyl) -15-(( 4-methylphosphonato-di-ethoxy) phenyl) -porphyrin-general synthesis
Bock N-protected 5- (aminophenyl) -10,15,20-tri- (4-hydroxymethylphenyl) porphyrin and 5- (aminophenyl) -15- (4-hydroxymethylphenyl) porphyrin (0. 75 mmol) was dissolved in a mixture of dichloromethane and pyridine (4: 1) under an argon atmosphere. Diethyl chlorophosphate (2 equivalents per hydroxymethyl group) was injected and the mixture was stirred for 16 hours. Evaporation of the solvent from the reaction mixture followed by purification by chromatography gave the corresponding tri- or mono ((4-methylphosphonato-di-ethoxy) phenyl) porphyrin. Treatment with sodium hydroxide (1M) gave the sodium salt of tri- or mono ((4-methylphosphonatoethoxy) phenyl) porphyrin (Boyle, RW and van @ Lier, JE (1995)). Synthesis 1079). Bock deprotection and formation of isothiocyanate groups were performed as described above.
[0102]
Example 19
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tri ((4-methylpyridiniumyl) phenyl) -porphyrin and 5- (4-isothiocyanatophenyl) -15-((4- Methylpyridinium) phenyl) -porphyrin-general synthetic method
Bock N-protected 5- (aminophenyl) -10,25,20-tri- (4-bromomethylphenyl) porphyrin and 5- (aminophenyl) -15- (4-bromomethylphenyl) porphyrin (0.75 mmol) Was dissolved in dichloromethane (50 mL) and pyridine (15 mmol) or substituted pyridine (15 mmol) was added as required. A reflux condenser was fitted and the reaction was refluxed under argon. The reaction was subjected to TLC and upon completion was evaporated in vacuo to dryness. The residue was subjected to reversed phase medium pressure chromatography [C18From 0.1% TFA aqueous solution to methanol with gradient elution] to obtain an N-Bock protected 4-aminophenyl compound. Deprotection of the aminophenyl group (s) and conversion to the isothiocyanato analog (s) was performed using standard protocols (see above).
[0103]
Example 20
5- (4-isothiocyanatophenyl) -15-aryl-10,20- (1,2-dihydroxyethyl) -porphyrin-general synthesis method
Emoc (Fmoc) protected 5- (4-aminophenyl) -15-arylporphyrin (0.8 mmol) was dissolved in dry chloroform (300 mL) under an atmosphere of argon. In dry chloroform (20 mL), freshly recrystallized N-bromosuccinimide (1.8 mmol) was injected by syringe and the mixture was stirred for 30 minutes. The solvent is then evaporated in vacuo and the crude product is purified by flash column chromatography (silica; gradient elution: hexane to ethyl acetate) and the required 5,15-dibromo- as a purple crystalline solid is obtained. 10,20-Diarylporphyrin was provided. The product was then metalated by refluxing zinc acetate dihydrate (80 mmol) in a chloroform / methanol (9: 1) solution. The metallation was followed by visible spectroscopy, which, upon completion, was passed through a short column of neutral alumina to remove uncoordinated zinc.
[0104]
Example 21
5- (4-isothiocyanatophenyl) -15-phenyl-10,20- (diaryl) -porphyrin-PD0Synthesis from 5,15-diphenylporphyrin by mediated Suzuki coupling
Bock N-protected 5- (aminophenyl) -15-phenylporphyrin was brominated at the 10 and 20 meso positions as described above. The
[0105]
Example 22
5- (4-isothiocyanatophenyl) -10,15,20-tri (4-glycosylphenyl) -porphyrin and 5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-glycosylphenyl) -porphyrin-general Synthetic method
4- (2 ', 3', 4 ', 6'-Tetra-O-acetyl- [beta] -D-glucopyranosyloxy) benzaldehyde was converted to Lindsey (Lindsey) conditions [Sol, V. et al. Blais, J. et al. C. , Carre, V .; , Granet, R.A. Guilloton, M .; Spiro, M .; , Krausz, Claus. (1999) J. Amer. Org. Chem. 64,4431] with 4-nitrobenzaldehyde and pyrrole, and the crude reaction mixture is purified by flash column chromatography to give 5- (4-nitrophenyl) -10,15,20-tris [4 -(2 ', 3', 4 ', 6'-Tetra-O-acetyl-β-glucopyranosyloxy) phenyl] porphyrin was provided. Alternatively, 4- (2 ′, 3 ′, 4 ′, 6′-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy) benzaldehyde is used and the method of Boyle (Boyle, RW, Bruckner, C., Posakony, J., James, BR, Dolphin, D. (1999) [email protected], 287) to give 5- (4- (2 ', 3', 4 ', 6). '-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyloxy) phenyl) dipyrromethane was synthesized and then condensed to give 5- (4-nitrophenyl) -15,-[4- (2', 3 ' , 4 ', 6'-Tetra-O-acetyl-β-glucopyranosyloxy) phenyl] porphyrin. Reduction of these porphyrin nitro groups was accomplished by dissolving in THF and adding 10% palladium on carbon. H of the mixture2Under stirring for 5 h, followed by filtration through Celite, and purification by flash column chromatography to give the corresponding aminoporphyrin, which was combined with sodium hydrogen carbonate in
[0106]
Example 23:
Symmetric porphyrin / chlorindiol / bacteriochlorin tetrol series
5,15- (3,4,5-trismethoxyphenyl) porphyrin(General method)
In a 3 L round bottom flask, add 5- (3,4,5-trismethoxyphenyl) dipyrromethane (1.86 g, 6 mmol), then add N2Underneath DCM (1 L) was added. To this stirred solution was added trimethyl orthoformate (48 mL, mmol). A pressure equalizing dropping funnel containing a solution of trichloroacetic acid (23.0 g, mmol) in DCM (500 mL) was then fitted to the flask and the solution was added dropwise to the reaction mixture over 10 minutes. The reaction vessel is coated in aluminum foil to block light and2Stirred down for 3.5 hours. Pyridine was then added to the reaction mixture with rapid stirring, and the reaction was stirred for an additional 16 hours while blocking2Under a room temperature. The aluminum foil was removed and air was bubbled through the solution for 20 minutes. After this, the reaction was allowed to stir without the plug with the aluminum foil removed for another 3 hours at room temperature. The reaction mixture was then concentrated in vacuo to remove DCM and residual pyridine by evaporation and then high vacuum. The crude reaction mixture was then chromatographed on flash silica gel (250 mL) (dry loading from DCM and a little methanol onto 50 mL flash silica gel to ensure complete solubility) and eluted with chloroform. . The title compound was obtained as a purple crystalline solid (347 mg, 18%);max/ (Relative intensity) 410 (1.0), 502 (0.04), 538 (0.02), 578 (0.015), 630 (0.01) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax= 634 nm (λ excitation = 408 nm); (270 MHz, CDCl3) 10.32 (2H, s, 10-H, 20-H), 9.40 (4H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 9.18 (4H, d, J = 4.8 Hz) , Β-H), 7.52 (4H, s, o-Ar), 4.20 (6H, s, CH3), 4.00 (12H, s, CH)3), -3.10 (2H, br.s, NH); MS (MALDI) m / z = 643.4 (100%, M+).
[0107]
7,8-
To a stirred solution of 5,15- (3,4,5-trismethoxyphenyl) porphyrin (50 mg, 77.8 μmol) in HPLC grade chloroform (5.0 mL) was added anhydrous pyridine (0.5 mL). A solution of osmium tetroxide (2.5 eq, 0.195 mmol, 49 mg) was added. N in the reaction vessel2And sealed with a slightly greased glass stopper, then covered in aluminum foil to block light and allowed to stir at room temperature for 72 hours. After this period, the glass stopper of the reaction vessel was replaced with a plastic stopper and a continuous stream of hydrogen sulfide gas was bubbled through the reaction mixture for 5 minutes (gas outlet needles were attached and excess hydrogen sulfide gas was removed from mineral oil and Discharged into a series of Dreschel bottles each filled with bleach solution). After this time, the reaction mixture was filtered through Celite® and then concentrated in vacuo. Some excess pyridine was removed under high vacuum. The crude reaction mixture was then chromatographed on flash silica gel (100 mL) (dry loading from DCM and a little methanol onto 20 mL flash silica gel to ensure complete solubility) and 1% methanol in DCM. To elute. Some starting material was recovered (15%) and the title compound was obtained as a brownie-purple crystalline solid, (26 mg, 50%); mp 170 ° C (dec); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 410 (1.0), 504 (0.09), 534 (0.06), 582 (0.04), 636 (0.18) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax639 nm (λ excitation 410 nm); δH (270 MHz, CDCl3) 9.98 (1H, s, 10-H), 9.42 (1H, s, 20-H), 9.20 (1H, m, β-H), 9.04 (1H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 8.99 (2H, s, β-H), 8.79 (1H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 8.66 (1H, m, β) -H), 7.45 (1H, d, J = 1.6 Hz, 15-o-Ar), 7.42 (1H, d, J = 1.6 Hz, 15-o-Ar), 7.40 ( 1H, d, J = 1.6 Hz, 5-o-Ar), 7.19 (1H, d, J = 1.6 Hz, 15-O-Ar), 6.49 (1H, d, J = 7. 3Hz, 7-H), 6.23 (1H, d, J = 7.3Hz, 8-H), 4.17 (3H, s, CH)3), 4.15 (3H, s, CH3), 4.04 (3H, s, CH3), 4.00 (3H, s, CH3), 3.98 (3H, s, CH3), 3.91 (3H, CH3), -1.80 (1H, br.s, NH), -2.19 (1H, br.s, NH), (OH not observed); MS (MALDI) m / z = 677.3. (100%, M+); C38H36N4O8HRMS calculated for: 676.2533, found: 676.2587.
[0108]
7,8,17,18-tetrahydroxy-5,15- (3,4,5-trismethoxyphenyl) bacteriochlorin (General method)
To a stirred solution of 5,15- (3,4,5-trismethoxyphenyl) porphyrin (50 mg, 77.8 μmol) in HPLC grade chloroform (5.0 mL) was added anhydrous pyridine (0.5 mL). A solution of osmium tetroxide (5.0 eq, 0.39 mmol, 49 mg) was added. N in the reaction vessel2And sealed using a tightly greased glass stopper, then coated in aluminum foil to block light and allowed to stir at room temperature for 72 hours. After this period, the glass stopper of the reaction vessel was replaced with a plastic stopper and a continuous stream of hydrogen sulfide gas was bubbled through the reaction mixture for 5 minutes (gas outlet needles were attached and excess hydrogen sulfide gas was removed from mineral oil and Discharged into a series of dresser bottles each filled with a bleach solution). After this time, the reaction mixture was filtered through Celite® and then concentrated in vacuo. Some excess pyridine was removed under high vacuum. The crude reaction mixture was then chromatographed on flash silica gel (100 mL) (dry loading from DCM and a little methanol onto 20 mL flash silica gel to ensure complete solubility), first with 1 in DCM. The chlorin by-product was eluted by elution with% methanol, followed by 2.5% methanol in DCM with the major bacteriochlorin isomer [Bruckner et al. (1995) Tetrahedron @ Lett. 36, 9425]. The title compound was obtained as a green-pink crystalline solid, (20 mg, 36%); mp 135 [deg.] C (decomposition); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 374 (1.0), 512 (0.23), 702 (0.52) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax708 nm (λ excitation 512 nm); δH (270 MHz, CDCl3) 9.23 (2H, s, 10-H, 20-H), 8.79 (2H, d, J = 3.2 Hz, β-H), 8.44 (2H, d, J = 3.2 Hz) , Β-H), 7.37 (2H, s, 5 + 15-o-Ar), 7.13 (2H, s, 5 + 15-o-Ar), 6.31 (2H, d, J = 6.5 Hz, 7-H, 17-H), 6.01 (2H, d, J = 6.5 Hz, 8-H, 18-H), 4.12 (6H, s, CH)3), 3.92 (6H, s, CH)3), 3.89 (6H, s, CH3), -1.97 (2H, br.s, NH), (OH not observed); MS (MALDI) m / z = 712.4 (100%, (M + 1).+); C38H36N4O10HRMS calculated for: 710.2590, found: 710.2607.
[0109]
Example 24
Asymmetric porphyrin / chlorindiol / bacteriochlorintetrol fluorescent dye combination for biological conjugation
5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin
The required asymmetric diphenylporphyrin was synthesized using the general method outlined above, but with only minor modifications. In this example, a mixture of dipyrromethane was used. Due to the different reactivity of each dipyrromethane, the amount needed for optimization of the mixed porphyrins was different. For the same scale reaction, 5- (4-methoxyphenyl) dipyrromethane (505 mg, 2 mmol) and 5- (4-acetamidophenyl) dipyrromethane (838 mg, 3 mmol) were used. The porphyrin mixture was chromatographed on silica gel (400 mL) (dry loading onto 20 mL flash silica gel from DCM and a little methanol to ensure complete solubility), and first DCM (with one glass pipette full of triethylamine). Was added to 500 mL of the eluate to aid elution.) To remove a by-product of 5,15- (methoxyphenyl) porphyrin. After separation of this component, elution was continued with chloroform to collect 5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin. The desired porphyrin was obtained as purple crystals (150 mg, 12%);max/ (Relative intensity) 410 (1.0), 502 (0.04), 538 (0.02), 578 (0.015), 630 (0.01) nm; δH (270 MHz, CDCl3) 10.35 (2H, s, 10-H, 20-H), 9.43 (4H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 9.14 (4H, d, J = 4.8 Hz) , Β-H), 8.65 (2H, d, J = 7.2 Hz, 5-m-Ar), 8.22-8.12 (4H, d (overlap), J = 8.1 Hz, 5- o-Ar + 15-o-Ar), 7.56 (2H, d, J = 8.1 Hz, 15-m-Ar), 4.14 (3H, s, CH)3), -3.00 (2H, br.s, NH); MS (MALDI) m / z = 550.3 (100%, M+).
[0110]
5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin
5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin (100 mg, 0.182 mmol) was treated with 18% hydrochloric acid (200 mL) and fitted with an air cooler. The green solution was warmed to 85 ° C. for 3 hours. Prior to cooling, the reaction mixture was concentrated in vacuo (water aspirator; evaporator water bath 75 ° C.) to remove excess hydrochloric acid and then treated carefully with a solution of triethylamine (50 mL) in DCM. . The organic extract is dried (anhydrous Na)2SO4), Washed with water (100 mL) then with saturated brine (100 mL), filtered through a Buchner funnel and finally concentrated in vacuo. The required porphyrin was obtained by chromatography on silica gel (100 mL) (liquid loading in 10 mL DCM), elution using DCM (1 glass pipette full of triethylamine was added to 500 mL of eluate to aid elution). Was. The desired porphyrin was obtained as purple crystals; (150 mg, 12%);max/ (Relative intensity) 410 (1.0), 503 (0.045), 538 (0.02), 578 (0.015), 630 (0.005) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax= 634 nm (λ excitation = 410 nm); δH (270 MHz, CDCl3) 10.30 (2H, s, 10-H, 20-H), 9.39 (4H, d, J = 4.9 Hz, β-H), 9.17 (2H, d, J = 4.9 Hz) , Β-H) 9.10 (2H, d, J = 4.9 Hz, β-H), 8.19 (2H, d, J = 8.8 Hz, 15-o-Ar), 8.07 (2H , D, J = 8.1 Hz, 5-o-Ar), 7.35 (2H, d, J = 8.8 Hz, 15-m-Ar), 7.14 (2H, d, J = 8.1 Hz) , 5-m-Ar), 4.13 (3H, s, CH3), 4.08 (2H, br.s, NH), -3.06 (2H, br.s, NH); MS (MALDI) m / z = 508.3 (100%, (M + 1)).+).
[0111]
5- (4-fluorenomethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin
To a stirred solution of 5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin (28 mg, 55 μmol) in
[0112]
17,18-dihydroxy-5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorinas well as7,8-dihydroxy 5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorine regioisomer
5- (4-Aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin (28 mg, 55.2 μmol) is converted to a mixture of regioisomers of chlorindiol using the general chlorin formation method described previously. did. The crude reaction mixture was then chromatographed on flash silica gel (200 mL) (dry loading from DCM and a little methanol onto 20 mL of flash silica gel to ensure complete solubility) and 1% methanol in DCM. Eluted, first with some unreacted starting material, then with higher R as a brownie-purple crystalline solidfWas eluted. Lower RfWas further obtained by elution with 2.5% methanol in DCM and also gave a brownie-purple crystalline solid.
High R f Chlorin regioisomer of[From 2,3-dihydroxy-5- (4-methoxyphenyl) -15- (4-aminophenyl) chlorin, nOe @ measurements (Noe Measurements) and JPP paper (paper)]: (8.5 mg, 30%) ; Melting point 165 ° C (decomposition); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 401 (0.99), 414 (1.0), 503 (0.08), 535 (0.07), 582 (0.035), 636 (0.22) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax639 nm (λ excitation 412 nm); δH (270 MHz, CDCl310% MeOH-d in4) 9.95 (1H, s, 10-H), 9.42 (1H, s, 20-H), 9.17 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 9.03 ( 1H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 8.97 (2H, s, β-H), 8.78 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 8.51 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 8.05 (2H, d, J = 8.9 Hz, o-Ar), 7.94 (2H, d, J = 8.1 Hz, o '-Ar), 7.25 (2H, d, J = 8.9 Hz, m-Ar), 7.12 (2H, d, J = 8.1 Hz, m'-Ar), 6.42 (1H, d, J = 6.5 Hz, 17-H), 6.03 (1H, d, J = 6.5 Hz, 18-H), 4.08 (3H, s, CH)3), (Exchange of NH's), (OH's not observed); MS (MALDI) m / z = 642.2 (100%, (M + 1)+).
Low R f Chlorin regioisomer of[2,3-dihydroxy-5- (4-aminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin from nOe @ measurements and JPP @ paper]: (8.5 mg, 30%); mp 168 DEG C. (decomposition); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 401 (0.99), 413 (1.0), 507 (0.08), 536 (0.06), 586 (0.025), 637 (0.20) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax639 nm (λ excitation 412 nm); δH (270 MHz,
[0113]
17,18-dihydroxy-5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) chlorin (higher RfRegio isomer)
To a stirred solution of 1,1′-thiocarbonyldi-2 (1H) -pyridone (1.07 eq, 7.6 mg, 43.5 mmol) in DCM (25 mL) was added (in an activated alumina column). Dried by passage through.), 17,18-Dihydroxy-5- (4-methoxyphenyl) -15- (4-aminophenyl) chlorin (17.5 mg, 23.2 mol) in DCM (10 mL). The solution was added. The reaction flask was covered with aluminum foil to block light and2Stirred down for 2 h, at which time TLC showed complete disappearance of starting material. The reaction mixture was then washed with water (2 × 50 mL) and saturated brine (50 mL) and then dried (anhydrous Na2SO4). The organic extract was then filtered and concentrated on 10 mL of flash silica gel and chromatographed on flash silica gel (100 mL), eluting with 1% methanol in DCM to remove the required isothiocyanatochloroline diol. Eluted (all TDP NB. Trace components must be removed prior to concentrating the product from column chromatography, otherwise three higher RfSome degradation occurs for the by-products of These things cannot be confirmed at this time. ) The title compound was obtained as a brownie-purple crystalline solid (17 mg, 90%); mp 155 ° C (dec); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 410 (1.0), 505 (0.09), 534 (0.06), 586 (0.04), 637 (0.18) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax639 nm (λ excitation 412 nm); δH (270 MHz, CDCl310% MeOH-d in4) 10.0 (1H, s, 10-H), 9.45 (1H, s, 20-H), 9.20 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 9.06 ( 1H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 9.02 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 8.84 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H) H), 8.64 (1H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 8.55 (1H, d, J = 4.8 Hz, β-H), 8.21 (1H, d, J) = 8.1 Hz, o-Ar), 8.15 (1H, d, J = 8.1 Hz, o-Ar), 8.05 (1H, d, J = 8.9 Hz, o'-Ar), 7 .93 (1H, d, J = 8.9 Hz, o'-Ar), 7.65 (2H, m, m-Ar), 7.24 (2H, m, m'-Ar), 6.43 ( 1H, d, J = 6.5 Hz, 17-H), 6.04 (1H, d J = 6.5Hz, 18-H), 4.08 (3H, s, CH3), (Exchange of NH's), (OH's not observed); MS (MALDI) m / z = 583.7 (100%, M+); C34H26N5O3HRMS calculated for S: 584.1775, found: 584.1756 ((M + 1)+).
[0114]
7,8,17,18-tetrahydroxy-5- (4-fluorenomethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin (cis / trans stereoisomer)
5- (4-Fluorenomethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) porphyrin (35 mg, 48.0 □ mol) was converted to bacteriochlorin using the general method described above for forming bacteriochlorin. Converted to a mixture of stereoisomers. The crude reaction mixture was then chromatographed on flash silica gel (200 mL) (dry loading from DCM and a little methanol onto 20 mL of flash silica gel to ensure complete solubility) and 1% methanol in DCM. Eluting first, higher RfOf the chlorin by-product was then eluted, then the two stereoisomeric bacteriochlorins were eluted separately with 2% methanol / DCM.Even higher R f -Trans bacteriochlorinThe isomer was isolated as a pinky-green crystalline solid (6 mg, 15%); mp 142 ° C (dec); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 374 (1.0), 512 (0.23), 702 (0.52) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax708 nm (λ excitation 512 nm); δH (270 MHz, CDCl310% MeOH-d in4) 9.20 (2H, s, 10-H, 20-H), 8.78 (2H, d, J = 4.0 Hz, β-H), 8.36 (2H, d, J = 4.0 Hz) , Β-H), 7.95 (2H, m, o-Ar), 7.85 (2H, d, J = 7.3 Hz, fluoreno-Ar), 7.79 (2H, m, o'-Ar) ), 7.65 (2H, m, m'-Ar), 7.47-7.38 (6H, m, fluoreno-Ar), 7.24 (2H, m, m-Ar), 6.27-. 6.24 (2H, 2 × d (duplicate), J = 6.5 Hz, 7-H, 17-H), 5.85 (2H, d, J = 6.5 Hz, 8-H, 18-H) , 4.65 (2H, d, J = 7.2 Hz, CH2), 4.39 (1H, t, J = 7.2 Hz, CH), 4.06 (3H, s, CH)3), -1.94 (2H, br.s (partially exchanged), NH), (OH not observed); MS (MALDI) m / z = 800.4 (100%, (M + 1).+).
Lower R f -Cis bacteriochlorinThe isomer was isolated as a pinky-green crystalline solid (8.5 mg, 21%); mp 148 ° C (dec); UV-VIS (CH2Cl2) Λmax(Relative intensity) 374 (1.0), 512 (0.24), 703 (0.54) nm; UV-VIS (CH2Cl2) (Fluorescence) λmax708 nm (λ excitation 512 nm); δH (270 MHz,
[0115]
7,8,17,18-tetrahydroxy-5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin (lower RfCis stereoisomer)
7,8,17,18-Tetrahydroxy-5- (4-fluorenomethylaminophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin in 25% methanol (1.25 mL) in DCM (lower RfA solution of (cis-stereoisomer) (8.5 mg, 10.7 μmol) was treated with piperidine (50 eq, 53 μL, 0.53 mmol) and protected from light for 3 hours with light.2Stirred below at room temperature. The reaction mixture was concentrated in vacuo to remove all traces of piperidine (high vacuum is required). To a stirred solution of 1,1′-thiocarbonyldi-2 (1H) -pyridone (1.07 eq, 7.6 mg, 43.5 mmol) (25 mL) in DCM (activated
[0116]
Moreover, further synthetic protocols and methodologies protocols, such as Sutton Porphyrin, Chlorin and Bacteriochlorin Isothiocyanates-Synthesis and Potential Applications in Fluorescence Imaging and Photodynamic Therapy (Journal of Phthalocyanines & Photosensitisers- in press) and Oliver (Oliva) J Clarke (Clark), Isothiocyanato Porphyrins for bioconjugation synthesis synthesis and applications in photo motherapy and fluorescence imaging (PhD thesis, April 2001, University of Essex), which is incorporated herein by reference; incorporated herein all of the contents of each as a reference.
[0117]
Methodology Description 1: General Biological Conjugation Protocol
Hexahydroxy PITC + antibody
A stock solution of hexahydroxy PITC in DMSO was prepared at a molarity of 0.027, the solution was dried and stored at 0 ° C. until needed. The antibody solution was extensively dialyzed against sterile PBS to remove any trace components of azide. The dialyzed antibody solution was then adjusted to a concentration of 10 mg / mL by centrifugal concentration and divided into 250 μL aliquots.
A 1M solution of sodium bicarbonate was prepared and adjusted to pH 9.0 using 2M sodium hydroxide.
To a 250 μL aliquot of the antibody, 30 μL of 1 M sodium bicarbonate was added. A predetermined volume of a stock solution of hexahydroxy PITC was then added to give the antibody the desired molar ratio (MR) of porphyrin. For example, an MR of 20 was achieved by adding 10 μL of stock solution to 250 μL of 10 mg / mL antibody. To maintain a constant concentration of DMSO in the biological conjugation reaction mixture, all aliquots of the stock solution were further diluted to 25 μL with a portion of DMSO.
[0118]
Following the addition of PITC, the biological conjugation reaction was gently stirred at 25 ° C. for 1 hour. After 1 hour, the crude biological conjugation reaction mixture was loaded directly on top of a pre-packaged PD10 size exclusion column pre-equilibrated with sterile PBS (25 mL). The column was eluted with sterile PBS. The antibody-porphyrin conjugate eluted in the first color band / fraction. The concentration of the antibody-porphyrin conjugate was determined as 1.25 mg / mL by dilution during chromatography. The degree of porphyrin labeling to the antibody (DOL, degree of labeling) was calculated by standard spectroscopy using known constants of molar absorptivity for both porphyrin and protein.
The antibody-porphyrin conjugate was stored at 0 ° C. in PBS + azide without further concentration, unless otherwise noted.
[0120]
N-methylpyridinium chloride PITC + antibody
A stock solution of N-methylpyridinium chloride PITC in DMSO was prepared at 0.027 molar, the solution was dried and stored at 0 ° C. until use. The antibody solution was extensively dialyzed against sterile PBS to remove any trace components of azide. The dialyzed antibody solution was then adjusted to a concentration of 10 mg / mL by centrifugal concentration and divided into 250 μL aliquots.
A 1M solution of sodium bicarbonate was prepared and adjusted to pH 9.0 using 2M sodium hydroxide.
To a 250 μL aliquot of the antibody, 250 μL of sterile PBS was added, followed by 60 μL of 1 M sodium bicarbonate. A predetermined volume of a stock solution of N-methylpyridinium chloride PITC was then added to give the antibody the desired molar ratio (MR) of porphyrin. For example, an MR of 20 was achieved by adding 10 μL of stock solution to 500 μL of 5 mg / mL antibody. To maintain a constant concentration of DMSO in the biological conjugation reaction mixture, all aliquots of the stock solution were further diluted to 25 μL with a portion of DMSO.
[0121]
Following the addition of PITC, the biological conjugation reaction was gently stirred at 25 ° C. for 1 hour. After 1 hour, the crude biological conjugation reaction mixture was loaded directly on top of a prepackaged PD10 size exclusion column that had been pre-equilibrated with sterile PBS (25 mL). The column was eluted with sterile PBS. The antibody-porphyrin conjugate eluted in the first color band / fraction. The concentration of the antibody-porphyrin conjugate was determined as 1.25 mg / mL by dilution during chromatography. The degree of porphyrin labeling (DOL) for the antibody was calculated by standard spectroscopy using known constants of molar extinction for both porphyrin and protein.
The antibody-porphyrin conjugate was stored at 0 ° C. in PBS + azide without further concentration, unless otherwise noted.
[0123]
Methodology description 2: Standard photocytotoxicity
Cells were grown to confluence or to an appropriate density, and then washed twice with PBS (phosphate buffered saline) to remove any trace components of FBS (fetal calf serum). The cell density was 1.5 × 10 5 in medium without FBS.6Adjust to cells / mL and then place them in the dark (37 ° C., 5% CO 2) for 1 hour.2), Incubate in the range of photosensitizer / conjugate concentration. After incubation, the cells were further washed with medium (without FBS) to remove unbound photosensitizer, then resuspended, and placed in a 96-well plate (1 × 10 5) in a quadruplate.5Cells / well). The plate is then illuminated or (filtered red light □ 600 nm 3.6 J / cm2) Or as a "dark toxicity control" in the dark for the same amount of time (~ 14 minutes). Five microliters (5% / well) of FBS are added after the irradiation / dark period and the plate is returned to overnight incubation. From 12 to 24 hours after treatment, 10 μL of MTT solution [Sigma \ Thiazolyl \ blue (Sigma Thiazolyl Blue) in PBS, 4.8 × 10-4M] is added per well and the plate is returned to the incubator until color development (between 1 and 4 hours). Add a solution of acid-alcohol (100 μL / well of 0.04N HCl in isopropanol) and mix well to dissolve the dark blue crystals. The plate is then read at 570 nm in a microplate reader and its percent cell viability is calculated relative to the control.
[0124]
Methodology description 3: Initial flow cytometry chromophore analysis
The two fluorochrome probes were identified as 2,3-dihydroxy-5- (4-methoxyphenyl) -15- (4-isothiocyanatophenyl) chlorin (higher RfRegioisomers) and 2,3,12,13-tetrahydroxy-5- (4-isothiocyanatophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin (lower Rf(Cis-stereoisomer) and avidin from separate reactions under the previously described standard biological conjugation protocol. Initial flow experiments were performed by utilizing conjugates of each of these avidins with RAJI cells and a biotin monoclonal antibody (HLA-DRI, L243) (laser excitation 488 nm, <640 nm (FL2)> 670 nm (FL3). Luminescence collection). The data showed that the signal from the DPBC sample was significantly higher due to a good fit of the emission filter (FL3). Conjugates of avidin DPCH or DPBC with the L243 antibody showed a modest increase in fluorescence compared to controls. By using a higher concentration of avidin-DPCH / DPBC, the fluorescence of the peak is increased, since the initial concentration of the conjugate will saturate the receptor or, to a lesser extent, some non-covalent Maybe one for too low for sexual bonding. Control samples with avidin-DPCH / DPBC (without antibody) show some background fluorescence in the absence of the L243 antibody, resulting in some non-specific binding of the conjugate to RAJI cells or some amount Suggests that a non-covalently associated fluorophore has been transferred from the protein to the cell surface. Control of FITC-avidin showed that a slightly higher signal was present in FL2, which also appeared in FL3 due to the broad emission band. In the presence of the L243 antibody, the average signal showed a 150% increase. This indicated that non-covalent attachment was less important for the FITC-avidin conjugate.
[0125]
Experiments were performed to determine the level of non-covalent binding of the fluorophore to the protein surface (BSA and avidin). Non-reactive DPCH and
[0126]
Initial studies were performed to remove non-covalently bound fluorophores from proteins (BSA and avidin) using SDS-PAGE. When SDS-PAGE was performed on the 'blank' biological conjugation mixture, separation of all non-covalently bound fluorophores was performed (66000D for BSA and avidin monomer for the solubilized gel segment). UV / fluorescence at 16500D showed no signal.) Furthermore, in addition to these studies, we could show that the fluorophore non-covalently bound to BSA (or avidin) migrates to the surface of HeLa cells. When HeLa cells were added to a solution of non-covalently bound fluorophore-protein conjugate and incubated for 20 minutes, fluorescence was removed from the solution from which HeLa cells had been removed. This effect is due to 2,3-dihydroxy-5- (4-methoxyphenyl) -15- (4-acetamidophenyl) chlorin (higher RfOf 2,3,12,13-tetrahydroxy-5- (4-acetamidophenyl) -15- (4-methoxyphenyl) bacteriochlorin (higher RfTrans stereoisomer). Cell resuspension and measurement of fluorescence showed a 10-fold increase in fluorescence in the case of DPCH, but only a modest increase in DPBC. These measurements indicate that significant fluorescence quenching of both DPCH and DPBC by the protein occurs and that the amphipathic nature of DPCH is incorporated into the membrane of HeLa cells resulting in almost complete fluorescence repair. Suggest. DPBC is non-amphiphilic and can complicate the surface of HeLa cells in a similar manner as it does for proteins, causing a similar quenching of fluorescence.
[0127]
Since fluorophore conjugates could be purified by SDS-PAGE, we considered the use of preparative electrophoresis as a technique for removal of non-covalently bound fluorophores. For this, we used a Centrilator (R) (centrirouter, registered trademark) micro-electroeluter (Micro-electro-Elutor) purchased from Millipore (Millipore). This device recovered the pure protein fluorophore conjugate from the SDS gel.
[0128]
Methodology description 4: Elution of conjugates from SDS @ PAGE using a Micro-Electroeluter
Working with significantly reduced illumination, cutting the SDS-PAGE of the required protein conjugate into small strips and adding to the centri-router sample tubes and closing the top (less than half, 3-4 sample tubes Using).
• Filled the lower buffer chamber of the electro-eruta with the degassed SDS running buffer to the level of the first electrode.
Electrophoreting 3-4 Centricon® (Centricon®) centrifuges from Millipore (using YM-30 for BSA conjugate and YM-3 for avidin conjugate). The router was firmly inserted from below (filter membrane down) into the hole in the upper buffer chamber rack, and the empty hole in the rack was plugged with a stopper from below the rack.
-The upper buffer chamber was placed in the lower buffer chamber with both electrodes side-by-side on the same side of the electroelutor.
-The upper buffer chamber was then filled with degassed SDS running buffer (as described above) until the top of all Centricon® units was completely immersed. If no leak was detected, the air bubbles trapped under the Centricon® unit were removed with a bent plastic pipette (reinforced with paper clips).
-Then place the centri-router sample tube in the top of the Centricon® unit so that the sample tube fits snugly and completely fill with sample buffer (bubbles removed as described above) Was.
-The safety cover of the electro-E router was added and the power supply was connected (using 200V, 50mA).
• After a few hours, the power supply was removed and the Centricon® filter was withdrawn from the upper buffer chamber of the electro-erater.
-A filtrate vial was added to the filter unit and a retentate top was added. Excess buffer was then removed by centrifugation at 5000 G (BSA) and 7,500 G (avidin) for 2 hours. Fresh 0.5 M phosphate buffer (pH 7.0) was added to the Centricon® unit and the process was repeated until all SDS had been removed.
-The concentrated purified conjugate was then collected by inversion and centrifugation in a retentate vial of the filter unit. Sodium azide (2M, 20 mL) was added and the conjugate was stored at 4 ° C.
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Methodology description 5: FACS conjugate binding protocol
Wash the flask of cells with phosphate buffered saline (PBS) pH 7.3. Treat with 5 mM EDTA in PBS at 37 ° C. for 10 minutes. Tap the flask to move the cells, place in a 50 mL polypropylene tube, and roll up to 400 g for 3 minutes. Resuspend in 10 mL PBS and count cells. 2 × 10 in a FACS tube (Falcon 2054)5And wash by centrifugation (400 g for 3 min) with 1 mL of PBS and resuspend by stirring.
The cells are blocked in 500 μL of 2% Marvel milk powder in PBS, 1% BSA for 30 minutes at room temperature.
Wash cells in 1 mL PBS / BSA / azide centrifuge and resuspend pellet (as described above).
Add 10 μL of the appropriate dilution of antibody. Incubate on ice for 1 hour.
Wash cells in 1 mL PBS / BSA / azide centrifuge and resuspend pellet (as described above).
Add 50 μL of rabbit anti-mouse: FITC [Serotec (Serotec), 1/100 dilution] and incubate for 1 hour in the dark on ice.
Wash cells in 1 mL PBS / BSA / azide centrifuge (as described above) and resuspend pellet in 400 μL PBS / BSA / azide.
The sample is passed through a FACS machine using CellQuest acquisition software and data is collected.
PBS / BSA / azide
250mL @ PBS
0.625g@BSA
1.56 mL sodium azide (1.6 M)
[0130]
Methodology description 6: SDS-PAGE
Separation gel
Ingredient% of
Acrylamide / bis (40% w / v) 1.67 mL 6.66 mL
1.5M Tris-HCl (pH 8.8) ８2.5mL 2.5mL
Water 5.67mL 0.7mL
TEMED 10μL 10μL
10
SDS 100μL 100μL
A gradient stirrer connected to a peristaltic pump is used for 5-20% of the gradient gel.
Stacking gel (3%)
Ingredient mL
Acrylamide / bis (40% w / v) 1.3
1 M Tris-HCl (pH 6.8) @ 1.25
Wed $ 7.4
TEMED 20μL
10% ammonium persulfate @ 50 μL
SDS 100μL
Running buffer
0.025M Tris, 0.192M Glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 in water.
Sample buffer
1 M Tris-HCl (pH 6.8) @ 13 mL
20% SDS @ 6.5mL
Glycerol 5.2mL
0.5% bromophenol blue @ 0.26 mL
A BIORAD (Bio-Rad) Protean 2 instrument was used according to the manufacturer's instructions.
Samples (15-20 μL in total containing 1-10 μg of sample protein) were loaded on the gel.
The gel was run at 200V for about 1 hour. The gels were then scanned by light, after which they were stained using Coomassie blue stain and then destained using acetic acid / methanol.
[0131]
Further exemplification of the invention
In our original work, in particular, Sutton J, {Fernandez, N, and Boyle, R .; W. (2000) Functionalised Diphenylchlorins and Bacteriochlorins-Their Synthesis and Bioconjugation for Targeted Photodynamicａtherapeuticum. J. Porphyrin and and Phthalocyanines and 4,655-658); J. And Boyle, R .; W. (1999) Isothiocyanatoporphyrins, useful \ intermediates \ for \ the \ conjugation \ of \ porphyrins \ with \ biomolecules \ and \ solid \ supports. , J. et al. C. S. Chem. Commun. Each of them is incorporated herein by reference, as described in U.S. Pat. And showed that these conjugates have potential as fluorescent contrast agents.
[0132]
As an illustration of the present invention, we next turn to this method for forming a conjugate between a monoclonal antibody with a high degree of specificity for human cancer cells and our combination of porphyrin-based photosensitizers. Describe use. Conjugates formed in this way are capable of selectively binding and photosensitizing these target cells for photodynamic activity against the corresponding carcinoma cells, and also in the presence of non-target cells. Were assayed for their ability. We also illustrate the specific internalization of porphyrin-BSA conjugates into HeLa cells.
[0133]
Our examples include 5,10,15-tris (3,5-dihydroxyphenyl) -20- (4-isothiocyanatophenyl) porphyrin (OH6) and 5,10,15-tris (pyridyl) -20- ( Using 4-isothiocyanatophenyl) porphyrin (PYR), as we found from our previous work, the pattern of hydrophilic substituents around the photoactive porphyrin core of each of these chromophores was Leads to efficient conjugation with the protein; hydrophilic substituents also minimize non-covalent binding of the photosensitizer to the protein, as is often the case with more hydrophobic porphyrins. Synthetic protocols for these chromophores are described in Examples 1 and 2 above, respectively.
Embedded image
Example 25-Stable conjugation to an antibody
OH6 and PYR were prepared as described in Examples 1 and 2, respectively. Antibody 17.1A was selected for the method of biological conjugation. 17.1A is an antibody that specifically reacts with a receptor that is overexpressed on colorectal cancer cells, particularly
[0135]
Prior to increasing the buffer pH of the antibody preparation to about
[0136]
Each of OH6 and PYR was separately conjugated to the 17.1A monoclonal antibody according to the method described in
[0137]
Acetate buffered antibody preparations and conjugates of various dilutions obtained therefrom were subjected to SDS-PAGE according to the method described in
[0138]
As shown in these figures, neither the buffer exchange nor the dialysis method disrupted the antibody structure, the light and heavy chains remained attached to each other, and the gel (lane 1) Move with each one. In addition, bonding of OH6 and PYR at each MR can be confirmed on the gel (
[0139]
Example 26-FACS analysis
FACS analysis was performed according to
FIG. 4 shows the results obtained using FITC-labeled 17.1A and Colo320 cells (repeated three times), and shows that the binding of the antibody to the cells has occurred (that is, the Colo320 cells were changed to 17.1A). Express specific antigens).
FIG. 5 shows the results of using OH6 / 17.1A conjugate and Colo320 cells (repeated three times) with FITC-labeled anti-17.1A antibody for detection, and the OH6 / 17.1A conjugate was Indicates binding to cells.
FIG. 6 shows the results of using PYR / 17.1A conjugate and Colo320 cells (repeated three times) with FITC-labeled anti-17.1A antibody for detection, and the PYR / 17.1A conjugate was Indicates binding to cells.
FIG. 7 shows the results obtained using FITC-labeled OX-34 (repeated three times). OX-34 is an antibody of the same class (IgG2a) as 17.1A, but has a different plateau specificity. . These results indicate that OX-34 does not bind to Colo320 cells, and thus there is no binding site for OX-34 on Colo320 cells.
[0140]
Example 27-Photocytotoxicity experiment
Testing of photocytotoxicity according to the method described in
Figures 8 and 9 show the results of control experiments performed with each of the OH6 / OX-34 and PYR / OX-34 conjugates. As shown in Example 16, OX-34 was found to lack specificity for any antigen expressed on the surface of Colo320 cells. Thus, as expected, these control experiments do not show photocytotoxicity after irradiation.
[0141]
FIGS. 10 and 11 show the results of further control experiments performed using "capped" OH6 and PYR, respectively. The "cap" method involves the reaction of NCS groups on each chromophore with propylamine to block the conjugation of serum proteins. FIG. 10 shows no cytotoxicity in the dark, indicating that OH6 is nontoxic to Colo320 cells. However, upon irradiation, some photocytotoxicity was observed, indicating that some amount of cap OH6 was transferred to the surface of Colo cells. On the other hand, FIG. 11 shows some cytotoxicity in the dark, suggesting that PYR is associated with some degree of cytotoxicity against Colo320 cells and increases photocytotoxicity upon irradiation, and again cap PYR Indicates that a certain amount has been transferred to the surface of Colo320 cells.
[0142]
In the absence of any antibody, the migration of the cap chromophore to the cell membrane is probably due to the amphiphilic nature of the cap chromophore, which is due to the hydrophilic groups around the porphyrin core and the hydrophobic propylamine. It has both "capping" groups. This makes them particularly easy to embed in lipid membranes such as Colo320 cell membranes.
[0143]
Figures 12 and 13 use OH6 / 17.1A and PYR / 17.1A conjugates, respectively, with various conjugate dilutions (2.5, 5, 10, 20 for OH6 / 17.1A; PYR / 17. The results obtained in 10 and 20) for 1A are shown. These results indicate a significant increase in irradiation-induced cytotoxicity, indicating that binding of the biological conjugate to the cell surface confers photosensitivity on the cell. Therefore, these types are suitable candidates for PDT.
[0144]
Example 28-In Vivo Photodynamic Therapy
Protocols for performing and evaluating in vivo photodynamic therapy using conjugates of the invention are described in R. Boyle et al., Br. J. Cancer (1992) 65: 813-817; R @ Boyle et al., Br. J. Cancer (1993) 67: 1177-1181; R @ Boile et al., Br. J. Cancer (1996) 73: 49-53; and Lapointe et al. Nuclear @ Medicine, Vol. 40, no. 5 (May @ 1999) 876-882; each of which is incorporated herein by reference.
[0145]
As described in these articles, tumors can be induced or implanted in animals such as mice, and then the animals can be conjugated to an antibody having specificity for an antigen according to the invention. An amount of a photosensitizer can be injected, and the antigen is specifically expressed or overexpressed on the surface of the tumor cells. The animal can then be irradiated and the effect on the tumor can be assessed, qualitatively or quantitatively, by reference to the metabolism of the tumor (Lapointe et al., J. Nuclear Medicine, Vol. .40, No. 5 (as described in May @ 1999) 876-882). Also, Br. J. As described in Cancer (1996) 73: 49-53, the distribution of photosensitizers in vivo can be measured by biodistribution and / or vasostatic stasis assays.
[0146]
Example 29-Confocal laser microscope
A preliminary test of the intracellular localization of a conjugate of 10,15,20-tris (3,5-dihydroxyphenyl) 5-isothiocyanatophenylporphyrin (OH6-NCS) and BSA was performed using a confocal laser microscope. I went. A readily available epithelial human carcinoma cell line healer was selected for incubation with the conjugate. All incubations were performed using a sub-confluent culture of HeLa cells using a series of unlabeled BSA control solutions, 10,15,20-tris (3,5-dihydroxy). Phenyl) 5-aminophenylporphyrin (amino precursor of OH6-NH2, OH6-NCS), and in situ PBS, were run in triplicate. Cells were seeded on coverslips in 35 mm dishes.
[0147]
Fluorescence images of the cells were obtained using a Bio-Rad @ Radiance 2000 confocal laser microscope [Bio-Rad @ Microscience] on an inverted Olympus IX70 microscope using a 60 × (NA1.4) oil immersion objective. Rad Microscience), Cambridge, Mass.]. The illumination source was a 514 nm line from a 25 mW argon ion laser. Porphyrins were visualized using a 514 nm bandpass excitation filter, a 510 nm dichroic mirror, and a 570 nm long wavelength pass emission filter.
[0148]
Each field of cells was three-dimensionally segmented by recorded images from a series of focal planes. The movement from one focal plane to another is achieved by a stepper motor associated with the fine focus control of the microscope, and the step sizes (in the range from 0.5 μm to 1.25 μm) are used by the aperture used. With regard to dimensions, there is some overlap between adjacent sections. Take sufficient vertical sections and record the top and bottom of all cells in each field. Each image collected was the average of four scans at the normal scanning speed of a confocal microscope. During each imaging session calibration, the images were: (i) microscope slides containing medium, to measure background levels; (ii) slides containing ITC porphyrin OH6-NCS dissolved in DMSO; and (iii) probe Collected on slides with only unprobed HeLa cells.
[0149]
The acquisition of image data and the operation of the remote microscope were performed using Bio-Rad @ Lasersharp2000 software. All images were managed using Confocal Assistant (Confocle Assistant) version 4.02, (construction 101) 1994-1996 \ Todd \ Clark \ Brelje. Artificial colors were fitted using a standard Bio-Rad look-up table (LUT).
[0150]
A preliminary assessment of the fluorescence of OH6-NCS at each of the excitation laser lines available on the set CLSM was performed on a 0.01 mM solution of OH6 in DMSO. FIG. 14 shows the UV-visible spectrum of OH6-NCS, in which the main absorption bands can be confirmed. Unfortunately, the laser line has shifted its OH6-NCSmaxNot available to excite at FIG. 15 shows the relative intensities of the fluorescence emission for OH6-NCS when excited with an argon ion laser at 422 nm (optimal) and four wavelengths, 457, 476, 488, and 514 nm.
[0151]
The intensity of the fluorescence emitted by the solution of OH6-NCS when excited at 514 nm was shown to be approximately three times greater than the fluorescence emission at the excitation wavelengths of 457, 476, and 488 nm. The UV-visible absorption spectrum of OH6-NCS indicated that the 516 nm argon-ion laser line was the only excitation source compatible with OH6-NCS. The three strongest laser lines, 457, 476, and 488 nm, all excited in the region between the Soret band and the first band of OH6-NCS, while the 514 line overlapped the Q band well at 516 nm.
[0152]
Incubated cell cultures with conjugate OH6-NCS-BSA and each of the three controls separately were then washed and fixed. The coverslip containing the incubated cells was then carefully mounted on a standard glass microscope slide and prepared for imaging. All four argon-ion laser lines were tested, but as expected, good resolution of the fluorescence could only be achieved using the 514 nm laser line.
[0153]
The fluorescence image of the Z-line of HeLa cells incubated with OH6-NCS-BSA is shown in FIG. 16 (this figure should be seen from top left to bottom right). Successive sections are scanned in 2 μM steps between each focal plane separated by the microscope, thus allowing for a three-dimensional visualization of the localization of the conjugate within the cell. Apparently, the conjugate OH6-NCS-BSA enters the cells and no study of the nature of the cellular uptake has been performed, but it is most likely that uptake has occurred by phagocytic cell motility. The zygotes did not appear to enter the nucleus and were found to be largely distributed throughout the cytoplasm.
[0154]
Upon imaging, cells incubated with the BSA control or the PBS control show only very low, barely detectable fluorescence, due to the normal degree of cell autofluorescence. The localization of OH6-NH2 (unconjugated porphyrin control) is shown in FIG. 17, which shows a CLSM image with a zoom of the porphyrin control cells. No fluorescence emanating from inside the cells was observed, but instead the majority of OH6-NH2 was localized on the plasma membrane. Clearly, the BSA component of the conjugate is required to facilitate porphyrin transport into the interior of the cell.
[0155]
In summary, it was shown that the cellular localization of the porphyrin-BSA conjugate was constituted by the formation of covalent thiourea bonds and could be imaged using conventional CLSM technology. The unconjugated porphyrin OH6-NH2 was found not to penetrate the cell membrane, but a significant degree of fluorescence was detected from inside the cells incubated with OH6-NCS-BSA, indicating good conjugate penetration. It has been shown.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a gel loaded with a 17.1A antibody or the like after buffer exchange.
FIG. 2 is a diagram showing a gel loaded with dialyzed 17.1A antibody and the like.
FIG. 3 is a view showing a gel loaded with a 17.1A antibody or the like after buffer exchange.
FIG. 4 shows the results of FITC-labeled 17.1A and Colo320 cells.
FIG. 5 shows the results of using OH6 / 17.1A conjugate and Colo320 cells with FITC-labeled anti-17.1A antibody for detection.
FIG. 6 shows the results of using a PYR / 17.1A conjugate and Colo320 cells with a FITC-labeled anti-17.1A antibody for detection.
FIG. 7 is a diagram showing the results using FITC-labeled OX-34.
FIG. 8 shows the results of a control experiment of an OH6 / OX-34 conjugate.
FIG. 9 shows the results of a control experiment of a PYR / OX-34 conjugate.
FIG. 10 shows the results of a further control experiment on cap OH6.
FIG. 11 is a diagram showing the results of a further control experiment for cap PYR.
FIG. 12 shows the results of various dilutions of the OH6 / 17.1A conjugate.
FIG. 13 shows the results of various dilutions of the PYR / 17.1A conjugate.
FIG. 14 shows a UV-visible spectrum of OH6-NCS.
FIG. 15 is a diagram showing the relative intensity of fluorescence emission of OH6-NCS when excited at four wavelengths.
FIG. 16 shows a Z-line fluorescence image of HeLa cells incubated with OH6-NCS-BSA.
FIG. 17 shows the localization of OH6-NH2.
Claims (43)
Ｒ２が親水性アリール部分であり；
Ｒ３がＨ又は親水性アリール又は親水性非芳香族部分であり；
及びＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のそれぞれが、無関係に、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜３アルキル及びＯＣ１〜３アルキルから選ばれるか、又は隣接するＣ−Ｃ結合を有するＸ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４がエポキシド又はシクロプロパニル構造を形成するように、Ｘ１及びＸ２及び／又はＸ３及びＸ４が互いに、Ｏ、ＣＨ２、ＣＨＣ１〜３アルキル、又はＣ（Ｃ１〜３アルキル）２から選ばれる架橋部分を形成し；
式中、前記Ｒ２及び前記Ｒ３の一方又は双方が、フェニル環を含んでおり、このフェニル環が１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されており、この親水性置換基が前記Ｒ２及び／又は前記Ｒ３の親水性を高める役目を果たすか、又は四級化ピリジル（ピリジニウミル）環のようなヘテロアリール環を含んでおり、このヘテロアリール環が随意に１又はそれ以上の回数、好ましくは少なくとも２回、１又はそれ以上の親水性置換基によって置換されており、この親水性置換基が前記Ｒ２及び／又は前記Ｒ３の親水性を高める役目を果たしており；
前記１又はそれ以上の親水性置換基が、無関係に、ヒドロキシ；メトキシ又はエトキシのようなアルコキシ；Ｃ２〜Ｃ１５ポリエチレングリコール；Ｎ−メチルピリジニウミルのような四級化ピリジル（ピリジニウミル）；モノ−、ジ−又はポリ−糖類；Ｃ１〜６アルキルスルホン酸；ホスホニウム基Ｒ４Ｐ（Ｒ５）（Ｒ６）（Ｒ７）（式中、Ｒ４が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ５、Ｒ６及びＲ７のそれぞれが、無関係に、水素、フェニル環のようなアリール環、ピリジル環のようなヘテロアリール環、及びＣ１〜６アルキル鎖から選ばれ、これらアリール環、ヘテロアリール環又はＣ１〜６アルキル鎖が置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ヒドロキシ、Ｃ１〜６アルキル又はアルコキシ、アリール、オキソ、ハロゲン、ニトロ、アミノ又はシアノによって置換されている。）；又はリン酸基又はホスホネート基｛それぞれ、Ｒ８ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）又はＲ８Ｐ（Ｏ）（ＯＲ９）（ＯＲ１０）で表され、式中、Ｒ８が、単結合か、又はＣ１〜６アルキルであり、及びＲ９及びＲ１０のそれぞれが無関係に水素及びＣ１〜６アルキルから選ばれている。｝から選ばれており、
式中、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のそれぞれが随意に、更に１又はそれ以上の回数、−ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＯ２、ハロゲン，−Ｔ、又は−ＯＴ｛式中、ＴがＣ１〜１５アルキル、シクロアルキル又はアリール基又はそれらのヒドロキシル化、ハロゲン化、硫酸化、スルホン化又はアミノ化誘導体又はそれらのカルボン酸、エステル、エーテル、ポリエーテル、アミド、アルデヒド又はケトン誘導体である。｝によって置換されている。〕
であることを特徴とする発色団。A porphyrin chromophore of the formula (I):
R 2 is a hydrophilic aryl moiety;
R 3 is H or a hydrophilic aryl or hydrophilic non-aromatic moiety;
And each of X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 is independently selected from H, OH, halogen, C 1-3 alkyl and OC 1-3 alkyl, or forms an adjacent C—C bond. X 1 and X 2 and / or X 3 and X 4 are each other, O, CH 2 , CHC 1 such that X 1 and X 2 and / or X 3 and X 4 have an epoxide or cyclopropanyl structure. ~ 3 alkyl or C (C 1-3 alkyl) 2 to form a cross-linking moiety selected from;
Wherein one or both of R 2 and R 3 comprise a phenyl ring, wherein the phenyl ring is repeated one or more times, preferably at least twice, by one or more hydrophilic substituents. Substituted, wherein said hydrophilic substituent serves to increase the hydrophilicity of said R 2 and / or R 3 or comprises a heteroaryl ring such as a quaternized pyridyl (pyridinium) ring; The heteroaryl ring is optionally substituted one or more times, preferably at least twice, with one or more hydrophilic substituents, wherein the hydrophilic substituents are the R 2 and / or the R 3 Plays a role in increasing the hydrophilicity of
Said one or more hydrophilic substituents, independently, hydroxy, C 2 -C 15 glycol; methoxy or alkoxy, such as ethoxy N- methyl pyridinylbenzoyloxy c quaternized pyridyl, such as mils (Pirijiniumiru) ; mono -, di- - or poly - saccharides; C 1 to 6 alkyl sulfonic acid; phosphonium group R 4 P (R 5) ( R 6) (R 7) ( wherein, R 4 is a single bond or C And each of R 5 , R 6 and R 7 independently from hydrogen, an aryl ring such as a phenyl ring, a heteroaryl ring such as a pyridyl ring, and a C 1-6 alkyl chain. selected, these aryl ring or heteroaryl ring or a C 1 to 6 alkyl chain is unsubstituted, or one or more times, hydroxy, C 1 to 6 alkyl or alkoxy Aryl, oxo, halogen, nitro, which is substituted by amino or cyano);. Or phosphoric acid group or phosphonate group {respectively, R 8 OP (O) ( OR 9) (OR 10) , or R 8 P (O) (OR 9 ) (OR 10 ) wherein R 8 is a single bond or C 1-6 alkyl, and each of R 9 and R 10 is independently hydrogen and C 1-6 alkyl Is chosen from. ｝
Wherein each of R 1 , R 2 and R 3 is optionally one or more times, —OH, —CN, —NO 2 , halogen, —T, or —OT} where T is A C1-15 alkyl, cycloalkyl or aryl group or a hydroxylated, halogenated, sulfated, sulfonated or aminated derivative thereof or a carboxylic acid, ester, ether, polyether, amide, aldehyde or ketone derivative thereof. . Has been replaced by｝. ]
A chromophore characterized by being
ｍ，ｍ−（ジヒドロキシ）フェニル
ｍ，ｍ，ｐ−（トリヒドロキシ）フェニル
ｏ，ｐ，ｏ−（トリヒドロキシ）フェニル
ｐ−（メチルトリフェニルホスホニウム）フェニル
ｐ−（メチルホスホノ−ジ−エトキシ）フェニル
ｐ−（メチルホスホナト−ジ−エトキシ）フェニル
ｍ−又はｐ−（Ｎ−メチル−ピリジニウミル）フェニル
及びｍ−Ｎ−メチルピリジニウミル
及びｐ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル又はｍ−Ｎ−（Ｃ１〜６アルキルスルホン酸）ピリジニウミル、特に、ｐ−Ｎ−（プロピルスルホン酸）ピリジニウミル
から選ばれる請求項１〜４のいずれか一項記載の発色団。One or both of R 2 and R 3 are independently
m, m- (dihydroxy) phenyl
m, m, p- (trihydroxy) phenyl
o, p, o- (trihydroxy) phenyl
p- (methyltriphenylphosphonium) phenyl
p- (methylphosphono-di-ethoxy) phenyl
p- (methylphosphonato-di-ethoxy) phenyl
m- or p- (N-methyl-pyridiniumyl) phenyl
And mN-methylpyridinium
And p-N- (C 1~6 alkyl sulfonate) Pirijiniumiru or m-N- (C 1~6 alkyl sulfonate) Pirijiniumiru, in particular, p-N-(propyl sulfonic acid) Pirijiniumiru
から選ばれることを特徴とする請求項１記載の発色団。R 3 is H, and R 2 is
The chromophore of claim 1, wherein the chromophore is selected from the group consisting of:
の同じものであることを特徴とする請求項１記載の発色団。R 2 and R 3 are
2. The chromophore according to claim 1, wherein
〔式中、Ｚ１がＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５が、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’が無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４が無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、この基が置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２が単結合又はＺ３であり；Ｚ３がＺ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、 このＺ３が、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７が無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８がＯ又はＡ９であり；Ａ９がＣ１〜４アルキルであり、このアルキルが置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０がＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４がＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５が、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６が、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
式中、Ｚ４、Ｚ５又はＺ６が、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から無関係に選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができ；
Ａ１４が、水素、メチル、ヒドロキシ、アリール、ハロ置換アリール、アリールオキシＣ１〜３アルキル、ハロ置換アリールオキシＣ１〜３アルキル、インダニル、インデニル、Ｃ７〜１１ポリシクロアルキル、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、テトラヒドロチオピラニル、チオピラニル、Ｃ３〜６シクロアルキル、又は１又は２の不飽和結合を含むＣ４〜６シクロアルキル（シクロアルキル又は複素環式部分が置換されていないか、又は１〜３のメチル基、１のエチル基、又はヒドロキシル基によって置換されている。）である。〕
からなる群より選ばれる一員からなる請求項９〜１４のいずれか一項記載の発色団。One or more of the substituents P 1 to P 5 and Q 1 to Q 5 are independently A 1 Z 1 A 14
Wherein Z 1 is Z 2 , Z 2 A 5 or Z 2 A 5 A 6 ;
A 1 and A 5 are, independently, - (CA 2 A 3) n -, - C (Y) (CA 2 A 3) n -, - C (Y) Y '(CA 2 A 3) n -, -C (Y) NA 4 (CA 2 A 3) n -, - NA 4 C (Y) (CA 2 A 3) n -, - NA 4 (CA 2 A 3) n, -YC (Y ') ( CA 2 A 3) n - and -Y (CA 2 A 3) n - are selected from; be n = Less than six; Y and Y 'be independently O or S; A 2, A 3 And A 4 is independently H or C 1-2 alkyl, wherein the group is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;
A 6 = - (C 2 H 4 O) m - be or -S (O) p; m = be 1-12; be p = 0 to 2;
Z 2 is a single bond or Z 3 ; Z 3 is selected from Z 4 , Z 5 and Z 6 , wherein Z 3 is unsubstituted or one or more times, OH, halo , CN, NO 2, A 1 A 10, A 6 A 8, NA 10 A 11, C (Y) A 7, C (Y) Y'A 7, Y (CH 2) q Y'A 7, Y ( CH 2) q A 7, C (Y) NA 10 A 11, Y (CH 2) q C (Y ') NA 10 A 11, Y (CH 2) q C (Y') A 9, NA 10 C ( Y) NA 10 A 11, NA 10 C (Y) A 11, NA 10 C (Y) Y'A 9, NA 10 C (Y) Z 6, C (NA 10) NA 10 A 11, C (NCN) NA 10 A 11, C (NCN ) SA 9, NA 10 C (NCN) SA 9, NA 10 C (NCN) NA 10 A 11, A 10 S (O) 2 A 9, S (O) r A 9, NA 10 C (Y) C (Y ') NA 10 A 11, NA 10 C (Y) C (Y') A 10 or Z 6 A = 0, 1 or 2; r = 0-2; A 7 is independently selected from H and A 9 ; A 8 is O or A 9 ; 9 is C 1-4 alkyl, wherein the alkyl is unsubstituted or substituted by one or more fluorine; A 10 is OA 9 or A 11 ; A 11 is A 7 Or when A 10 and A 11 are NA 10 A 11 , they comprise, together with nitrogen, only carbon atoms, or from carbon atoms and at least one heteroatom selected from O, N and S. A 5- to 7-membered ring can be formed;
Z 4 is C 6-12 aryl or aryloxy C 1-3 alkyl;
Z 5 is furanyl, tetrahydrofuranyl, indanyl, indenyl, tetrahydropyranyl, pyranyl, thiopyranyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, C 3 to 8 cycloalkyl or C. 4 to include unsaturated bonds 1 or 2 8 cycloalkyl, and C7-11 polycycloalkyl;
Z 6 is N-azolyl, dioxadiazinyl, dioxadiazolyl, dioxanyl, 2-N-dioxatriazinyl, dioxazinyl, N-dioxazolyl, dioxolyl, dithiadiazinyl, dithiadiazolyl, N-dithiatriazinyl, Dithiazinyl, N-dithiazolyl, 1-N-imidazolyl, N-morpholinyl, pyrrolyl, tetrazolyl, thiazolyl, triazolyl, oxazinyl, oxazolyl, naphthdolinyl, oxadiazinyl, oxadiazolyl, oxatetrazinyl, oxatriazinyl, oxatriazolyl, oxazinyl , Oxazolyl, pentazinyl, phthalazinyl, N-piperidinyl, N, N-piperazinyl, 1-N-pyrazolyl, pyridazinyl, pyridinyl, pyrimidinyl, tetrathiazinyl, tetra Zinyl, 1-N-tetrazolyl, tetroxazinyl, thiadiazinyl, thiadiazolyl, thiatetrazinyl, thiatriazinyl, thiatriazolyl, thiazolyl, triazinyl, 1-N-triazolyl, trioxadazinyl, trioxanyl, trioxazinyl, trioxazolyl, trithiazinyl, trithiazinyl, trithiazinyl Selected from Asian zoril;
Wherein Z 4 , Z 5 or Z 6 can be fused to one or more other members independently selected from Z 4 , Z 5 and Z 6 ;
A 14 is hydrogen, methyl, hydroxy, aryl, halo-substituted aryl, aryloxy C 1-3 alkyl, halo-substituted aryloxy C 1-3 alkyl, indanyl, indenyl, C 7-11 polycycloalkyl, tetrahydrofuranyl, furanyl , Tetrahydropyranyl, pyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, tetrahydrothiopyranyl, thiopyranyl, C 3-6 cycloalkyl, or C 4-6 cycloalkyl containing one or two unsaturated bonds (cycloalkyl or heterocyclic moiety Is unsubstituted or substituted by 1 to 3 methyl groups, 1 ethyl group, or hydroxyl group.). ]
The chromophore according to any one of claims 9 to 14, comprising a member selected from the group consisting of:
〔式中、Ｚ１がＺ２、Ｚ２Ａ５又はＺ２Ａ５Ａ６であり；
Ａ１及びＡ５が、無関係に、−（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）Ｙ’（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−Ｃ（Ｙ）ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４Ｃ（Ｙ）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−、−ＮＡ４（ＣＡ２Ａ３）ｎ、−ＹＣ（Ｙ’）（ＣＡ２Ａ３）ｎ−及び−Ｙ（ＣＡ２Ａ３）ｎ−から選ばれており；ｎ＝０〜６であり；Ｙ及びＹ’が無関係にＯ又はＳであり；Ａ２、Ａ３及びＡ４が無関係にＨ又はＣ１〜２アルキルであり、この基が置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；
Ａ６＝−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｍ−又は−Ｓ（Ｏ）ｐであり；ｍ＝１〜１２であり；ｐ＝０〜２であり；
Ｚ２が単結合又はＺ３であり；Ｚ３が、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれており、
このＺ３が、置換されていないか、又は１又はそれ以上の回数、ＯＨ、ハロ、ＣＮ、ＮＯ２、Ａ１Ａ１０、Ａ６Ａ８、ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（Ｙ）Ａ７、Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＹ’Ａ７、Ｙ（ＣＨ２）ｑＡ７、Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、Ｙ（ＣＨ２）ｑＣ（Ｙ’）Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｙ’Ａ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｚ６、Ｃ（ＮＡ１０）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＳＡ９、ＮＡ１０Ｃ（ＮＣＮ）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｓ（Ｏ）２Ａ９、Ｓ（Ｏ）ｒＡ９、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）ＮＡ１０Ａ１１、ＮＡ１０Ｃ（Ｙ）Ｃ（Ｙ’）Ａ１０又はＺ６によって置換されており；ｑ＝０、１又は２であり；ｒ＝０〜２であり；Ａ７が無関係にＨ及びＡ９から選ばれており；Ａ８がＯ又はＡ９であり；Ａ９がＣ１〜４アルキルであり、このアルキルが置換されていないか、又は１又はそれ以上のフッ素によって置換されており；Ａ１０がＯＡ９又はＡ１１であり；Ａ１１は、Ａ７であるか、又はＡ１０及びＡ１１がＮＡ１０Ａ１１としてのときには、それらが窒素と共に、炭素原子だけからなるか、又は炭素原子と、Ｏ、Ｎ及びＳから選ばれる少なくとも１つのヘテロ原子とからなる５乃至７員環を形成することができ；
Ｚ４がＣ６〜１２アリール又はアリールオキシＣ１〜３アルキルであり；
Ｚ５が、フラニル、テトラヒドロフラニル、インダニル、インデニル、テトラヒドロピラニル、ピラニル、チオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチエニル、チエニル、１又は２の不飽和結合を含むＣ３〜８シクロアルキル又はＣ４〜８シクロアルキル、及びＣ７〜１１ポリシクロアルキルから選ばれており；
Ｚ６が、Ｎ−アゾリル、ジオキサジアジニル、ジオキサジアゾリル、ジオキサニル、２−Ｎ−ジオキサトリアジニル、ジオキサジニル、Ｎ−ジオキサゾリル、ジオキソリル、ジチアジアジニル、ジチアジアゾリル、Ｎ−ジチアトリアジニル、ジチアジニル、Ｎ−ジチアゾリル、１−Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−モルフォリニル、ピロールイル、テトラゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ナフチドリニル、オキサジアジニル、オキサジアゾリル、オキサテトラジニル、オキサトリアジニル、オキサトリアゾリル、オキサジニル、オキサゾリル、ペンタジニル、フタルアジニル、Ｎ−ピペリジニル、Ｎ，Ｎ−ピペラジニル、１−Ｎ−ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、テトラチアジニル、テトラジニル、１−Ｎ−テトラゾリル、テトロキサジニル、チアジアジニル、チアジアゾリル、チアテトラジニル、チアトリアジニル、チアトリアゾリル、チアゾリル、トリアジニル、１−Ｎ−トリアゾリル、トリオキサダジニル、トリオキサニル、トリオキサジニル、トリオキサゾリル、トリチアジアジニル、トリチアジニル、トリチアジアゾリルから選ばれており；
Ｚ４、Ｚ５又はＺ６が、無関係に、Ｚ４、Ｚ５及びＺ６から選ばれる１又はそれ以上の他の構成員に融合することができる。〕
からなる群より選ばれる一員からなる請求項１６記載の発色団。The bonding substituent is A 1 Z 1 Z;
Wherein Z 1 is Z 2 , Z 2 A 5 or Z 2 A 5 A 6 ;
A 1 and A 5 are, independently, - (CA 2 A 3) n -, - C (Y) (CA 2 A 3) n -, - C (Y) Y '(CA 2 A 3) n -, -C (Y) NA 4 (CA 2 A 3) n -, - NA 4 C (Y) (CA 2 A 3) n -, - NA 4 (CA 2 A 3) n, -YC (Y ') ( CA 2 A 3) n - and -Y (CA 2 A 3) n - are selected from; be n = Less than six; Y and Y 'be independently O or S; A 2, A 3 And A 4 is independently H or C 1-2 alkyl, wherein the group is unsubstituted or substituted by one or more fluorines;
A 6 = - (C 2 H 4 O) m - be or -S (O) p; m = be 1-12; be p = 0 to 2;
Z 2 is a single bond or Z 3 ; Z 3 is selected from Z 4 , Z 5 and Z 6 ;
Z 3 is unsubstituted or one or more times, OH, halo, CN, NO 2 , A 1 A 10 , A 6 A 8 , NA 10 A 11 , C (Y) A 7 , C (Y) Y'A 7, Y (CH 2) q Y'A 7, Y (CH 2) q A 7, C (Y) NA 10 A 11, Y (CH 2) q C (Y ') NA 10 A 11, Y (CH 2 ) q C (Y ') A 9, NA 10 C (Y) NA 10 A 11, NA 10 C (Y) A 11, NA 10 C (Y) Y'A 9, NA 10 C (Y) Z 6, C (NA 10) NA 10 A 11, C (NCN) NA 10 A 11, C (NCN) SA 9, NA 10 C (NCN) SA 9, NA 10 C (NCN) NA 10 A 11, NA 10 S ( O) 2 A 9, S (O) r A 9, NA 10 C (Y) C (Y ') N 10 A 11, NA 10 C ( Y) C (Y ') is substituted by A 10 or Z 6; be q = 0, 1 or 2; be r = 0 to 2; A 7 is independently H and it is selected from a 9; a 8 is O or a 9; a 9 is C 1 to 4 alkyl, or the alkyl is unsubstituted or substituted by one or more fluorine A 10 is OA 9 or A 11 ; A 11 is A 7 or, when A 10 and A 11 are NA 10 A 11 , they consist of only carbon atoms together with nitrogen; Or a 5- to 7-membered ring composed of a carbon atom and at least one heteroatom selected from O, N and S;
Z 4 is C 6-12 aryl or aryloxy C 1-3 alkyl;
Z 5 is furanyl, tetrahydrofuranyl, indanyl, indenyl, tetrahydropyranyl, pyranyl, thiopyranyl, tetrahydrothiopyranyl, tetrahydrothienyl, thienyl, C 3 to 8 cycloalkyl or C. 4 to include unsaturated bonds 1 or 2 8 cycloalkyl, and C7-11 polycycloalkyl;
Z 6 is N-azolyl, dioxadiazinyl, dioxadiazolyl, dioxanyl, 2-N-dioxatriazinyl, dioxazinyl, N-dioxazolyl, dioxolyl, dithiadiazinyl, dithiadiazolyl, N-dithiatriazinyl, Dithiazinyl, N-dithiazolyl, 1-N-imidazolyl, N-morpholinyl, pyrrolyl, tetrazolyl, thiazolyl, triazolyl, oxazinyl, oxazolyl, naphthdolinyl, oxadiazinyl, oxadiazolyl, oxatetrazinyl, oxatriazinyl, oxatriazolyl, oxazinyl , Oxazolyl, pentazinyl, phthalazinyl, N-piperidinyl, N, N-piperazinyl, 1-N-pyrazolyl, pyridazinyl, pyridinyl, pyrimidinyl, tetrathiazinyl, tetra Zinyl, 1-N-tetrazolyl, tetroxazinyl, thiadiazinyl, thiadiazolyl, thiatetrazinyl, thiatriazinyl, thiatriazolyl, thiazolyl, triazinyl, 1-N-triazolyl, trioxadazinyl, trioxanyl, trioxazinyl, trioxazolyl, trithiazinyl, trithiazinyl, trithiazinyl Selected from Asian zoril;
Z 4 , Z 5 or Z 6 can independently be fused to one or more other members selected from Z 4 , Z 5 and Z 6 . ]
17. The chromophore of claim 16, comprising a member selected from the group consisting of:
Ｒ Ｒ’
４−Ｈ ４−ＮＣＳ
４−Ｍｅ ４−ＮＣＳ
４−Ｂｒ ４−ＮＣＳ
４−ＣＯ２Ｍｅ ４−ＮＣＳ
３，４，５−トリス（ＯＭｅ） ４−ＮＣＳ
４−ＮＣＳ ４−ＯＭｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
４−ＮＣＳ ４−Ｂｒ
４−ＮＣＳ ４−ＣＮ
４−ＮＣＳ ４−ＣＯ２Ｍｅ
のいずれかであることができる。）
として示される構造を有する請求項９〜１７のいずれか一項記載の発色団。The next (x), (y) or (z)
4-H 4-NCS
4-Me 4-NCS
4-Br 4-NCS
4-CO 2 Me 4-NCS
3,4,5-Tris (OMe) 4-NCS
4-NCS 4-OMe
4-NCS 4-Me
4-NCS 4-CO 2 Me
4-NCS 4-Br
4-NCS 4-CN
4-NCS 4-CO 2 Me
Can be either. )
A chromophore according to any one of claims 9 to 17 having the structure shown as:
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