JP2004500874A - Neuroactive peptides for the treatment of hypoxia and related conditions - Google Patents

Abstract

低酸素症治療のための組成物および方法が提供される。好ましい態様において、組成物および方法は中枢神経系に対する低酸素症または虚血の影響の治療のために提供される。Compositions and methods for treating hypoxia are provided. In a preferred embodiment, compositions and methods are provided for the treatment of the effects of hypoxia or ischemia on the central nervous system.

Description

【０００１】
関連出願との関係
本出願は２０００年６月２２日出願の米国仮出願第６０／２１３，６１４号の恩典を主張し、その開示の全体は参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、神経活性ペプチド、タンパク質、またはアミノ酸組成物の分野に関する。
【０００３】
関連技術の説明
現在では、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）が脳および脊髄内で特殊シグナリングを行うために多くの神経活性ペプチドを用いることがよく知られている。よりよく知られている神経活性ペプチドの中には、ソマトスタチン、コレシストキニン、ＶＩＰ、サブスタンスＰ、エンケファリン、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ニューロテンシン、ＴＲＨ、ＣＣＫ、およびダイノルフィンがある。（一般には、「神経薬理学の生化学的基礎（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ）、ブルーム（Ｂｌｏｏｍ）およびロス（Ｒｏｔｈ）、第５版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８６参照）。ＣＮＳではたらく複雑なシグナリング経路の注意深い解明には、特定の神経活性ペプチドおよびそれら特有の性質の同定および特徴付け、ならびに特定の神経学的に重要な受容体の特徴付けおよび位置特定が必要である。公知の特定の神経活性ペプチドが多いほど、ＣＮＳ受容体タンパク質およびＣＮＳ受容体複合体の挙動に対して行うことができる操作の範囲が増大するという点で、ＣＮＳ受容体のアゴニストおよびアンタゴニストの同定は、部分、完全、協調作用、または独立作用にかかわらず有用である。重要なことに、独特のアゴニストまたはアンタゴニストを同定することで、これらのアゴニストまたはアンタゴニストへの神経活性受容体サブセットの結合により、これらサブセットの詳細な特徴付けおよび位置特定が可能となる。神経活性ペプチドを同定し、かつ公知の受容体複合体の挙動を特異的に混乱させるためにそれらを用いることにより、受容体複合体に関するより詳細な理解が得られるようになる。加えて、新規神経活性ペプチドは、公知のＣＮＳ受容体複合体の挙動を変える別の手段、またはこれまで未知であった受容体複合体もしくは公知の受容体の未知の挙動の発見のための手段を提供する。
【０００４】
Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体は、神経変性性障害、脳卒中関連脳細胞死、痙攣性障害、ならびに学習および記憶に関係があるとされており、ヒト組織からクローニングされている（ホフマンＭ．（Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｍ．）、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：８０１〜２参照）。ＮＭＤＡの結合によって活性化されるのに加えて、ＮＭＤＡ受容体はグルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ）によっても活性化され、同じくＤ−２−アミノ−５−ホスホノ吉草酸（Ｄ−ＡＰ５；Ｄ−ＡＰＶ）によって競合的に拮抗されるか、またはフェニルサイクリジン（ＰＣＰ）およびＭＫ−８０１によって非競合的に拮抗される。しかし、最も興味深いことに、ＮＭＤＡ受容体はグリシン（Ｇｌｙ）によって共活性化される。（コジコウスキ（Ｋｏｚｉｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９０、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６１〜１５７１）。ＮＭＤＡ受容体複合体上のアロステリックな調節部位へのグリシンの結合は、チャネルの開放時間と、最も劇的にはＮＭＤＡ受容体チャネルの開放頻度との両方を増大させる。
【０００５】
ＮＭＤＡ受容体は、学習および記憶の基礎と考えられている神経連絡の持続的強化である、長期増強（ＬＴＰ）の中心であると考えられている（総説は、ブリス（Ｂｌｉｓｓ）およびコリングリッジ（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ）、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：３１〜３９参照）。例えば、脳卒中時に起こりうるＣＮＳへの損傷は、ＮＭＤＡ受容体を有する細胞にグルタミン酸またはアスパラギン酸が多量に入ることによる、これら細胞の過剰興奮が原因であると考えられ、このような過剰興奮細胞のおよそ８０％は死滅することになる。ＮＭＤＡ受容体担持細胞の大部分は、脳の皮質および海馬領域にあり、そのような細胞の過剰興奮死滅後には、患者は新しいことの学習が不可能となるが、長期記憶における項目はまだ思い出すことができる。ＰＣＰ乱用に関連するヒトの記憶欠損はＰＣＰの作用に関係付けられており、ＮＭＤＡ受容体を通じてのカルシウム流動が阻害されて予想される結果である。
【０００６】
ＮＭＤＡ受容体を遮断することができるか、そうでなければＮＭＤＡ受容体のはたらきを変えることができる薬物は、過剰興奮死滅またはＮＭＤＡ受容体に関連する記憶の問題から細胞を保護することができると考えられる。ＮＭＤＡ受容体と相互作用する他の薬物は、細胞がＬＴＰを形成する能力を増強し、したがって学習および記憶を増強する可能性がある。
【０００７】
ＮＭＤＡ受容体が重要であるため、組織分布の詳細なマッピング、サブタイプの特徴付け、およびＮＭＤＡ受容体の細かい操作を可能にし、かつＮＭＤＡ受容体上の他のアゴニストまたはアンタゴニストの作用の特徴付けを可能にする、特定のペプチドアゴニストまたはアンタゴニストを得ることは非常に有用であると考えられる。
【０００８】
発明の概要
本発明は、脳内の酸素欠乏をきたす状態の治療または予防に関する。本発明は、低酸素症および虚血ならびに中枢神経系における低酸素症または虚血の影響を治療するためのペプチドおよびアミノ酸組成物を提供する。
【０００９】
一般に本発明は、脳内で見いだされる、ＮＭＤＡ受容体などの一定の受容体を調節するために有用なＤＮＡ分子、およびそれによりコードされるポリペプチドに関する。好ましい態様において、下記の表１に示すとおり、ＤＮＡ分子はポリペプチドのＮＴファミリーのメンバーをコードする。一つの態様において、このポリペプチドは学習機能を増強するために有用である。もう一つの態様において、このポリペプチドは低酸素症によって起こる状態の治療のために有用である。
【００１０】
好ましい態様において、本発明は、ペプチドまたはアミノ酸組成物の有効量を投与する段階を含む低酸素症の治療法であって、ペプチド組成物に

からなる群より選択されるペプチドと薬学的に許容される賦形剤とが含まれる方法を含む。好ましい態様において、本発明は、中枢神経系への低酸素症または虚血の影響を治療する方法であって、そのようなペプチド組成物の有効量を投与する段階を含む方法を含む。
【００１１】
好ましい態様において、ペプチドは

である。もう一つの態様において、ペプチドは環状化されている。もう一つの態様において、ペプチドは置換アミノ酸残基を含み、好ましくは置換アミノ酸残基は保存的に置換されている。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は、（配列番号：３）；（配列番号：４）；（配列番号：５）；（配列番号：９）；（配列番号：１０）；（配列番号：１２）；および（配列番号：１３）からなる群より選択されるペプチドをコードするＤＮＡ分子を提供する。
【００１３】
もう一つの態様において、本発明は、低酸素症の治療のための医薬品製造における、（配列番号：３）；（配列番号：４）；（配列番号：５）；（配列番号：９）；（配列番号：１０）；（配列番号：１２）；および（配列番号：１３）からなる群より選択されるペプチドの使用を含む。
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書において用いられる場合、「低酸素症」なる用語は、体の組織に到達する酸素の欠乏に関する。同様に、「虚血」とは、体の部分への酸素を豊富に含んだ血液の流量不足に関連するいかなる状態をも意味する。低酸素症および虚血は、組織への血流量が臨界レベル未満に低下するいかなる時にも起こりうる。この血流量の低下は下記の非限定的状態が原因となりうる：（ｉ）塞栓（血餅）による血管の遮断；（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症による血管の遮断；（ｉｉｉ）血管の破損（出血性脳卒中）；（ｉｖ）血管痙攣中、およびおそらくは一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）中、ならびにくも膜下出血後に起こる等の、血管収縮による血管の遮断。低酸素症および虚血が起こりうる他の状態には、（ｉ）心筋梗塞（心臓が停止すれば、臓器への血流量は低下し、虚血が起こる）；（ｉｉ）外傷；および（ｉｉｉ）心臓および神経手術（手術の目的を達成するために、血流を低下または停止する必要がある）が含まれる。中枢神経系における低酸素症または虚血の影響には、一時的または永久的機能損失およびニューロン損失が含まれうる。
【００１５】
本発明は、ＮＭＤＡ受容体に結合する能力によって特徴付けられる、ある特定の神経活性ペプチドを提供する。本発明は、ＮＭＤＡ受容体にグリシンコアゴニスト（ｇｌｙｃｉｎｅ ｃｏ−ａｇｏｎｉｓｔ）部位で結合し、ＮＭＤＡ受容体から少なくともグリシンの結合と同じ生物活性をもたらす、特定のポリペプチドまたはアミノ酸組成物を提供する。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物は、天然の組織、体液、または細胞から精製することができる。本発明の好ましい態様は、通常の生化学的方法、または分子生物学的技術を用いての、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物の化学合成を提供する。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物はＮＭＤＡ受容体活性の同定および特徴付け、ならびに組織の位置特定のために有用であるため、本発明は、安定性を増強するような修飾ペプチドを主鎖が組み込んでいるか、またはペプチド断片の三次元構造を安定化または強化するような枠組みの修飾が追加されている、安定化したポリペプチドまたはアミノ酸組成物を提供する。本発明は、環状化ポリペプチドまたはアミノ酸組成物も提供する。
【００１６】
本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物の他の利益は、小さいサイズのものは血液脳関門を通過する能力が高まると思われ、したがってインビボでの投与および検出に適することである。したがって、本発明は、放射性マーカー、ＭＲＩマーカー、金属イオンマーカー、酵素マーカー、化学発光マーカー、またはポリペプチドもしくはアミノ酸組成物の検出を可能にする任意のそのようなマーカーに結合された本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物を含む。本発明は、生きている対象に投与することができるような適当な薬学的担体中の、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物の薬学的製剤も含む。そのような投与は腹腔内、静脈内、筋肉内、またはいかなる他の適当な手段によるものであってもよい。
【００１７】
本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物が、組織摘出および染色などのインビトロスクリーニングを用いるＮＭＤＡ受容体の検出に用いられる場合、結合されるマーカーは、前述の適当なマーカーに加えて、タンパク質、抗体、アビジン、ビオチン、およびスクリーニングアッセイ法または染色法においてポリペプチドまたはアミノ酸組成物の存在が検出できる任意の他のそのようなマーカーであってもよい。
【００１８】
本発明は、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物、ならびに結合された受容体およびポリペプチドまたはアミノ酸組成物の検出に適当なマーカーを用いて、ＮＭＤＡ受容体を検出する方法も提供する。そのような方法は、用いる検出条件に応じて、インビトロおよびインビボで実施することができる。そのような方法を用いて使用することができる一定の手法には、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、Ｘ線、ソノグラム、および他のそのような非侵襲的検出法が含まれるが、これらに限定されることはない。侵襲的方法が企図される場合、すなわち生検または組織切片では、結合された受容体／ポリペプチドの存在を検出するために標準の免疫学的スクリーニング法が利用でき、またはそのような結合を、免疫学的染色もしくは広範囲に利用可能なマーカー／検出系を用いての他のそのような検出手段により、特異的に視覚化することもできる。したがって、本発明は、ＮＭＤＡ受容体の生物活性を改変する方法であって、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物と接触しているＮＭＤＡ受容体を含む方法も提供する。特に、下記の表１に挙げられるアミノ酸配列を有するペプチドが含まれ、これらは下記の実施例のアッセイデータにより有効であると予想される。
【００１９】
【表１】ＮＴペプチドファミリー

【００２０】
保存的アミノ酸置換は、典型的には生物系における合成ではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然アミノ酸残基も含む。これらはペプチド様物質、および他のアミノ酸部分の逆または反転型を含む。
【００２１】
天然残基は共通の側鎖の性質に基づいて分類することができる：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；好ましい態様において、変異型は１〜３個、または１〜５個、または１〜１０個、または１〜１５個、または１〜２０個、または１〜２５個、または１〜２６個のアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有し、ただし置換は保存的もしくは非保存的、またはその任意の組み合わせであってもよい。例えば、「保存的アミノ酸置換」には、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどまたはまったく影響がないような、天然アミノ酸残基の非天然残基による置換が含まれてもよい。さらに、以前に「アラニンスキャニング突然変異誘発」について記載されているとおり、ポリペプチド中のいかなる天然残基も、アラニンで置換することができる。
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００２２】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーの、他のクラスのメンバーとの交換を含みうる。そのような置換残基はＮＴポリペプチドの一つまたは複数の残基に導入されることもある。
【００２３】
そのような変更を行う際、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮してもよい。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づき、ハイドロパシー指数が割り当てられている。ハイドロパシー指数は次のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００２４】
タンパク質に相互作用的生体機能を付与する場合のアミノ酸のハイドロパシー指数の重要性は、当技術分野において一般に理解されている（カイト（Ｋｙｔｅ）ら、１９８２、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５〜３１）。あるアミノ酸は、同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに用いることができ、なおかつ同様の生物活性を保持していることが知られている。ハイドロパシー指数に基づく変更を行う際、ハイドロパシー指数が±２以内のアミノ酸へ置換することが好ましく、±１以内のものがさらに好ましく、±０．５以内のものがなおさらに好ましい。
【００２５】
類似のアミノ酸への置換は、それにより生成される生物学的機能が等価のタンパク質またはペプチドがこの場合のように免疫学的態様において用いられることが意図される場合は特に、親水性に基づいて有効に行うことができることも当技術分野において知られている。タンパク質の最大局所平均親水性度は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配され、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的性質に相関する。
【００２６】
下記の親水性の値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（＋０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づく変更を行う際、親水性値が±２以内のアミノ酸へ置換することが好ましく、±１以内のものがさらに好ましく、±０．５以内のものがなおさらに好ましい。親水性に基づき、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００２７】
望ましいアミノ酸置換（保存的または非保存的のいずれでも）は、そのような置換が望まれる場合には当業者であれば決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いて、ＮＴポリペプチドの重要な残基を同定する、または本明細書に記載のＳｅｃｓ−１ポリペプチドの親和性を増大もしくは低減させることができる。例示的アミノ酸置換を表Ｉに示す。
【００２８】
【表Ｉ】アミノ酸置換

【００２９】
当業者であれば、公知の技術を用いて、配列番号：１〜１７に記載のポリペプチドの適当な変異型を決定することができると思われる。生物活性を損なうことなく変更することができる、分子の適当な領域を特定するために、当業者であれば活性に重要ではないと考えられる領域を標的とすることができる。例えば、同種または他の種から類似の活性を有する類似のポリペプチドが知られている場合、当業者はＳｅｃｓ−１ポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似のポリペプチドと比較することができる。そのような比較により、類似のポリペプチドの中で保存されている残基および分子の部分を特定することができる。そのような類似のポリペプチドに比べて保存されていないＳｅｃｓ−１分子の領域における変更は、Ｓｅｃｓ−１ポリペプチドの生物活性および／または構造に有害な影響をおよぼす可能性が低いことが理解されると考えられる。当業者においては、比較的保存された領域においても、天然残基の活性を保持しつつ、その代わりに化学的に類似のアミノ酸を用いうる（保存的アミノ酸残基置換）ことも知られていると思われる。したがって、生物活性または構造にとって重要であると考えられる領域であっても、生物活性を損なうことなく、またはポリペプチド構造に有害な影響をおよぼすことなく、保存的アミノ酸置換を行うことができる。
【００３０】
ＮＴポリペプチドをコードするＤＮＡ分子も、本発明の範囲内に含まれる。以下に示すとおり、当技術分野において公知であるコドン表（表２）を用いて、いかなるいくつかのＤＮＡ分子によりペプチドをコードすることができる：
【００３１】
【表２】コドン表

【００３２】
例えば、表３に示すとおり、ＮＴ−１３ペプチドは下記の配列を有するＤＮＡ分子によってコードされうる：
【００３３】
【表３】ＮＴ−１３（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ）をコードするＤＮＡ配列

【００３４】
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒをコードするコドンの任意の組み合わせを用いて、ＮＴ−１３ペプチドをコードすることができる。例えば、ＮＴ−１３は

および表３に示されているコドンの他の組み合わせによってコードされうる。ＮＴ−１３または本発明によって提供されるいかなる他のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドは、標準的技術を用いて設計および合成することができる。加えて、ペプチドをコードするＤＮＡは、当技術分野において公知のとおり、インビトロまたはインビボでポリペプチドの発現のための発現ベクターに組み込むこともできる。これらの技術は本明細書に記載のいかなるペプチド（すなわち配列番号：１〜１７）にも、ならびにそれらの変異型にも適用可能である。
【００３５】
下記の実施例は例示のみを目的としており、本発明をいかなる様式においても限定することを意図するものではなく、また限定すると考えられるべきでもない。当業者であれば、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、変更および改変を加えうることを理解すると思われる。
【００３６】
実施例１
ＮＭＤＡ受容体に特異的なモノクローナル抗体
標準的プロトコル（モスカル（Ｍｏｓｋａｌ）およびシャフナー（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ）、１９８６、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、６（７）：２０４５〜２０５３参照）に従い、生後５日のラット新生仔から単離した歯状回組織でマウスを免疫化することにより、モノクローナル抗体を生成させた。組織化学的方法により歯状回組織への結合についてハイブリドーマをスクリーニングした後、有望な候補クローンを単離した。単離したクローンの中にモノクローナル抗体Ｂ６Ｅ１１があり、これはラット海馬切片においてＬＴＰの産生を阻止し、海馬ＣＡ１領域および歯状回の両方で確立されたＬＴＰを抑制することが明らかにされた（スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、サーベイ（Ｓａｒｖｅｙ）、およびモスカル、１９８７、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｕ．Ｓ．Ａ．、８４：１６８４〜１６８８参照）。モノクローナル抗体Ｂ６Ｅ１１は、増強インプットによりシナプス形成している先端樹状突起に適用した場合には、ＬＴＰの阻止において有効であるが、細胞体またはＣＡ１の基底樹状突起に適用した場合には有効ではないことが判明した。これとは対照的に、第二のモノクローナル抗体、Ｇ６Ｅ３は、同じ免疫グロブリンクラスの同じパネルからのものであり、標的組織に同様の様式で結合されるが、ＬＴＰに対して全く効果を示さなかった。
【００３７】
もう一つのモノクローナル抗体、Ｂ６Ｂ２１は、ＮＭＤＡ受容体のグリシン様調節によりＬＴＰを促進することが判明した（ハリング（Ｈａｒｉｎｇ）、スタントン、シャイデラー（Ｓｃｈｅｉｄｅｌｅｒ）およびモスカル、１９９１、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５７（１）：３２３〜３３２参照）。この独特のモノクローナル抗体は、ラット海馬切片のＣＡ１錐体細胞先端樹状突起に適用した場合、ＬＴＰを著しく高めることができた。Ｂ６Ｂ２１はＮ−（１−（２−チエニル）シクロヘキシル）−３，４−^３Ｈピペリジン（^３Ｈ−ＴＣＰ）のチャネル内ＰＣＰ部位への結合も上昇させた。この効果は、最大濃度のグルタミン酸、グリシン、およびマグネシウムの組み合わせ添加によるＮＭＤＡ受容体の最大飽和によって除去された。最も重要なことには、モノクローナル抗体Ｂ６Ｂ２１は、^３Ｈ−ＴＣＰ結合の７−クロロキヌレニン酸阻害を逆転したが、ＡＰＶによる^３Ｈ−ＴＣＰ結合の阻害には効果を示さなかった。モノクローナル抗体Ｂ６Ｂ２１による^３Ｈ−ＴＣＰ結合の促進は、グルタミン酸によって高められたが、グリシンでは高められなかった。
【００３８】
ウサギ瞬目条件付け試験を用いてのインビボ実験において、海馬依存性学習は、Ｂ６Ｂ２１の結合、またはＤ−シクロセリンの添加によって促進されることが判明したが、これらはいずれもＮＭＤＡ受容体に特異的に結合する（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、モスカルおよびディスターホフト（Ｄｉｓｔｅｒｈｏｆｔ）、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５９：６３８〜６４１参照）。Ｂ６Ｂ２１を脳室内（脳室の中へ）注入すると、ウサギの海馬依存性痕跡瞬目条件付けにおける獲得速度が著しく高まり、条件反応８０％の基準に達するのに要する試行回数が半減した。血液脳関門を通過する、ＮＭＤＡ受容体上のグリシン部位の部分アゴニストである、Ｄ−シクロセリンの末梢注入によっても、ウサギの学習速度は倍増した。
【００３９】
モノクローナル抗体Ｂ６Ｂ２１の試験によって、発明者らはｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１の活性を模擬し、したがってグリシンコアゴニスト作用を模擬することを可能にする、ポリペプチドまたはアミノ酸組成物のパネル（表１）を得ることができた。
【００４０】
実施例２
薬理学的ＮＭＤＡ特異的活性：^３ＨＭＫ−８０１アッセイ法
本発明のペプチドは、哺乳動物ＮＭＤＡ受容体のグリシンコアゴニスト部位への特異的結合が可能である。注目すべきことに、本発明のペプチドはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）アミノ酸の存在を必要としない。哺乳動物の脳内でＮＭＤＡ受容体が果たす役割は重要であるため、特異的アゴニストは、ＮＭＤＡ受容体組織分布の詳細なマッピング、および疾患、傷害、または他の薬理作用との相関のために非常に有用である。特定の小ペプチドアゴニストは、生物学的利用能を高めるため、および血液脳関門を通過しての輸送のために、さらに修飾しうる点で、特に有用である。
【００４１】
本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物を、過去に有効性確認されている［^３Ｈ］ＭＫ−８０１結合アッセイ法を用いて、ＮＭＤＡ受容体上でのグリシンコアゴニスト作用を模擬する能力について試験した。この機能アッセイ法は、ＮＭＤＡ受容体の［^３Ｈ］ＭＫ−８０１結合増大は、受容体結合チャネル開放によってのみ起こりうるという事実を利用している。このことは、ＭＫ−８０１結合部位がＮＭＤＡ受容体複合体のイオノフォアの内側に局在しており、したがって受容体−チャネル複合体の開放によってのみ接近可能となるためである。したがって、本アッセイ法において、［^３Ｈ］ＭＫ−８０１の結合増大は、本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物のグリシンコアゴニスト結合部位への結合によって誘発される、チャネル開放の増大と直接相関している。
【００４２】
アッセイ法をさらに精密にするために、ＮＭＤＡ受容体−チャネル複合体のグリシン結合部位の選択的アンタゴニストをアッセイ法に加える。７−クロロキヌレニン酸の正常な作用は、グリシン部位に選択的に結合してＮＭＤＡ受容体チャネル開放を阻害し、したがって［^３Ｈ］ＭＫ−８０１のＮＭＤＡ受容体複合体への結合を阻害することである。ペプチドＮＴ−３の添加は、［^３Ｈ］ＭＫ−８０１の結合の阻害を逆転させ、したがって本発明のポリペプチドまたはアミノ酸組成物がグリシン結合部位に結合するという知見と相関している。
【００４３】
膜の調製
アッセイ法に用いた粗シナプス膜を、ラット海馬組織（雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｙラット）を用いて調製し、以前に記載された方法（ヘアリング（Ｈａｒｉｎｇ）ら、１９９１、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５７：３２３〜３３１）を用いて十分に洗浄した。簡単に言えば、−８０℃で保存されていた組織を氷冷下の５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中でＢｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＲＴＭを用いてホモジナイズし、次いで、４８，０００ｇで２０分間遠心沈降することによりペレットとする。生じた上清は廃棄し、膜を冷緩衝液中で３回洗浄する。次いでペレットを５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、３７℃で１時間インキュベートする。次いで、膜懸濁液を４８，０００ｇで２０分間遠心沈降することによりペレットとし、アッセイ法に使用するまで−８０℃で保存する。
【００４４】
受容体結合アッセイ法
凍結ペレットを室温で解凍し、５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）への再懸濁および遠心沈降により３回洗浄する。最終ペレットを５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）中、２〜３ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁する。２００μｇの新しく調製した膜を、一連の濃度のペプチドおよび６０μＭ ７−クロロキヌレニン酸存在下、１ｎＭ^３ＨＭＫ−８０１を含む反応混合物（最終容量約１ｍｌ）に２５℃で加えることにより、結合反応を開始する。非特異的結合を、１０μＭ非標識ＭＫ−８０１を用いて定量する。あらかじめ０．２５％ポリエチレンイミンに３０分間浸漬しておいたＷｈａｔｍａｎのＧＦ／Ｂガラスフィルター上のＢｒａｎｄｅｌの２４穴セルハーベスターを通してろ過することにより、結合反応を停止させる。
【００４５】
データ解析／解釈
Ｄ−シクロセリンの有効量以下の濃度（１０^−５）で^３ＨＭＫ−８０１結合を刺激するペプチドが、ＮＭＤＡ受容体複合体のグリシン部位に結合する能力について陽性であると見なされる。
【００４６】
図１は、Ｄ−シクロセリン（図１Ａ）、ｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１（図１Ｂ）、およびペプチドＮＴ−３（図１Ｃ）を用いて結合データを比較したデータを示している。図１Ｃは、ペプチドＮＴ−３がＮＭＤＡ受容体のグリシン部位に、ｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１およびＤ−シクロセリンと同様の様式で結合することを明らかに示している。データは試験物質の濃度に対する、７−クロロキヌレニン酸存在下での対照結合の％として報告している。
【００４７】
図２は、前述のペプチドＮＴ−３の結合活性を示している。データは試験物質の濃度に対する、７−クロロキヌレニン酸存在下での対照結合の％として報告している。
【００４８】
下記の表４は、本発明のペプチドを用いたアッセイ結果からの結果を記載している。
【００４９】
【表４】

^＊１０μＭ Ｌ−グルタミン酸存在下
【００５０】
表４は、ペプチドＮＴ−１からＮＴ−１８の、ラット海馬における［^３Ｈ］ＭＫ−８０１結合により評価したＮＭＤＡ受容体活性化におよぼす効果を示しており、ペプチドの様々な濃度での対照結合のパーセンテージ（＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として報告している。ペプチドＮＴ−１５からＮＴ−１８について報告しているデータおよび各点の実験誤差により、これらのいずれかが意味のある生物活性を有する見込みがないと思われる。有効濃度としてのペプチド濃度１０^−５Ｍは、ミリモル範囲（１００ｍＭ）に近づきつつあり、ペプチドが生物学的に活性であることについての信頼できる指標であると考えるには高すぎることを強調しておくべきである。そのような高濃度では、特異的結合に関連して非特異的結合効果が拡大され、受容体／リガンドの結合平衡がゆがめられる可能性がある。したがって、最適結合活性を示すペプチドが候補となる。
【００５１】
例えば、ＮＴ−１４およびＮＴ−１５は試験したいかなる濃度でも効果がなく、ＮＴ−１７は広い範囲の濃度にわたってほぼ等しく活性があるが、ＮＴ−１６およびＮＴ−１８は１０^−５Ｍで最も有効である。濃度および実験誤差を考慮にいれることにより、これらのペプチドを生物学的に活性ではないとして除外することが妥当である。
【００５２】
しかし、Ｄ−シクロセリンはＮＭＤＡ受容体のグリシン部位の部分アゴニストであり、認知増強物質として作用しうることが認められている（トンプソン、モスカルおよびディスターホフト、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５９：６３８〜６４１）。セリンおよびトレオニンは多くの構造上の特徴を共有しており、トレオニンがセリンと同様の増強特性を有することも可能であると考えられる。したがって、ＮＴ−３およびＮＴ−１３のトレオニン部分をセリンで置き換えると、活性ペプチドが得られると予測することが可能である。
【００５３】
実施例３
電気生理学的ＮＭＤＡ特異的活性アッセイ法
本発明のペプチドのＮＭＤＡ受容体機能に対する作用の直接的な電気生理学的測定は、強力で明白かつ比較的費用および時間効率のよいスクリーニング法である。最初に^３ＨＭＫ−８０１結合アッセイ法により好ましいとして選択された本発明のペプチドを、次いで電気生理学的スクリーニングにかける。
【００５４】
電気生理学的に記録する方法は、２電極電圧固定法および標準の卵母細胞発現系調製により行われる（レオナルド（Ｌｅｏｎａｒｄ）およびケルソー（Ｋｅｌｓｏ）、１９９０、Ｎｅｕｒｏｎ ４：５３〜６０；ケルソーら、１９９２、Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ４４９：７０５〜７１８参照）。卵母細胞を単離し、マウスＮＭＤＡ受容体サブユニットのｍＲＮＡを注入する：７０ｎｌのｚ１（ｚ１）ＲＮＡと同量のｅ１（ｅ１）ＲＮＡとを同時注入する。２日間インキュベートした後、膜電位を−８０ｍＶに固定して記録を行う。標準の記録溶液は９５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、３．８ｍＭ ＢａＣｌ_２、および５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。Ｍｇ^２＋は一定の電位でＮＭＤＡ電流を阻止するため加えず、Ｃａ^２＋は卵母細胞の内因性Ｃａ^２＋依存性塩素イオン電流を誘発し得るため加えない。ＮＭＤＡ含有溶液３〜５ｍｌを連続灌流することによって反応を引き起こす。記録容器の容量は約４００ｍｌである。いくつかの実験では、試験するペプチドまたはアミノ酸組成物がグリシン結合部位と競合し、そこで作用しうることを示すために、灌流液に７−クロロキヌレニン酸を加える。
【００５５】
データ解析／解釈
図３Ａは、ペプチドＮＴ−１３がＮＭＤＡ電流に対し用量依存的効果を有することを示している。濃度が増大すると電流の増大がもたらされる。
【００５６】
図３Ｂは、グリシン非存在下で、ペプチドＮＴ−１３がＮＭＤＡ電流を高めることを示している。この実験では、１００μＭ ＮＭＤＡおよび１０μＭグリシンは大きな電流を惹起した（約２８４ｎＡ、トレースの下向きの振れ）。次の段階で、１００μＭ ＮＭＤＡおよび１００μＭペプチドＮＴ−１３は飽和グリシン＋ＮＭＤＡの約４０％の有意な電流を惹起した。この同じ細胞において、ＮＭＤＡ単独では無視できる程度の反応（約７ｎＡ）しか示さなかった。
【００５７】
図３Ｃは、高グリシン濃度でペプチドＮＴ−１３を加えるとＮＭＤＡ電流が低下することを示しており、ＮＭＤＡおよび飽和グリシンに対する対照反応の約９１％への低下が認められた。このデータは、このペプチドがグリシン結合部位で競合するとの結論をさらに裏付けるものである。
【００５８】
図３Ｄは、グリシン非存在下で、ペプチドＮＴ−１３の効果がアンタゴニストの７−クロロキヌレニン酸の選択的な添加により阻止されたことを示している。
【００５９】
実施例４
行動ＮＭＤＡ特異的活性アッセイ法
モリス水迷路（ＭＷＭ）
海馬（ＨＰＣ）依存性連合学習には２つの型がある。すなわち、時間依存型と空間依存型である。モリス水迷路（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）、１９８４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． １１：４７〜６０；ブランデイス（Ｂｒａｎｄｅｉｓ）ら、１９８９、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ４８：２９〜６９）は、空間依存性学習を評価するための十分に確立されたパラダイムであり、したがって時間学習を評価する瞬目試験などの他の行動アッセイ法を補足するものである。これらの学習の型はいずれも加齢による影響を受け、ＮＭＤＡ受容体活性化に依存している（モリス、１９８９、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９：３０４０〜３０５７）。
【００６０】
アプローチの方法
すべての実験で雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣を用いる。１群につき合計８から１０匹のラットを用いる。１群あたりのラット数は同様の研究で得られた過去のデータの検出力関数解析によって選択した。これらの先行試験の結果に基づき、生化学および行動終点の誤差分散の現実的推定値を得た。この情報を用いて値をｐ＜０．０５と確立し、許容できる統計検出力レベルを提供するサンプルサイズを選択した。推定値はケッペル（Ｋｅｐｐｅｌ）（「設計と解析（Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ、ニューヨーク州、１９７３）に記載の示唆に基づいて得た。すべての場合に、最小数のラットから得た情報量を最大化するよう試験を設計した。
【００６１】
ラット脳の左右両方の側脳室にステンレススチールのガイドカニューレを埋め込む。ラットを２週間休ませた後、行動試験を開始する。下記の水迷路課題で毎日の訓練セッションを行う１５分前に、ラットに適当な濃度のペプチド、または人工脳脊髄液対照媒質（ａＣＳＦ）を注入する。ＣＭＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ精密注入ポンプに装備された１０ｍｌハミルトンシリンジにＰＥ−１０チューブで接続した３０ゲージの注入カニューレを用いて、溶液を約１．０ｍｌ／分の速度で脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）に注入する。各脳室に合計約３．０ｍｌを注入する。拡散を助けるため、注入カニューレを注入後２分間その位置にとどめておく。特定の処置・試験間隔を維持するため、短時間注入法を用いる。遂行に対する注入処置自体の影響を評価するため、注入を行わない対照群を含める。
【００６２】
水迷路課題
脳室内注入の１５分後に、ラットをモリス水迷路課題で試験する。この課題は、ラットの空間記憶における行動特性および神経生物学的基質を評価するために広く用いられている。これは、速やかに獲得される行動であり、また摂食妨害によって動機づけするものではないため、普及してきた。多くの試験により、この課題の遂行は完全な海馬および中隔海馬コリン作動性回路に依存していることが示されている。課題の遂行は、（ｉ）外科的、または（ｉｉ）薬理学的なＨＰＣもしくはそのコリン作動性神経支配の破壊、および（ｉｉｉ）老化によって妨害される。この課題は、中隔海馬経路およびＨＰＣの機能的完全性についての高感度で有用な行動アッセイ法を提供することが認められている（オペロ（Ｏｐｅｌｌ）ら、１９９３、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｅｈａｖ． ５４（６）：１２２７〜１２３３）。
【００６３】
標準的ＭＷＭ課題で、ラットは、不透明な水を含む円形プールの水中に沈められた台まで泳ぐことを学習しなければならない。プールの周囲に等間隔に設けた４つの地点を開始位置とし、プールを４つの等しい四分円に分ける。水中の避難台は、訓練の期間中ずっと、４つの四分円の１つに位置する。各訓練試行は、ラットを４つの開始点の１つで水中に入れることからなる。ラットに６０秒まで水中の台を探させ、台の上に３０秒間とどめる。ラットを連続１５日間、１日に２回の試行で試験する。プール周囲の異なる開始点を、無作為の順序で与える。水中の台まで泳ぐための潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）を獲得の尺度とする。これらの試験パラメーターは、処置により誘導される空間記憶の改善および減退の両方に対して感度の高い課題が提供される。試験の第二の成分は、試行２、１４、２６および３８の後のプローブ試行の導入を含む。プローブ試行では、避難台を取り除き、ラットの行動を３０秒間ビデオに記録する。下記の尺度は自動ビデオ追跡システムによるものである：（ｉ）正しい四分円で泳ぐために費やした時間のパーセント、（ｉｉ）プローブ試行中の標的からの平均距離、および（ｉｉｉ）泳ぐ速度。この連続プローブ試行法を使用することにより、空間学習の異なる成分、すなわち海馬機能に関係しない記憶型である手続き的記憶、およびＨＰＣ依存性過程である記述記憶の評価が可能になる。老化、アルツハイマー病、およびＡＦ６４Ａモデルでは、記述記憶のみが損傷される（オペロら、１９９３、Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｅｈａｖ． ５４（６）：１２２７〜１２３３）ため、これら２つの型の認知を評価することは重要である。
【００６４】
組織学的分析
行動試験完了後、ラットを屠殺し、組織検査のために調製する。ペプチドを反復注入することでＨＰＣにおいて興奮毒性による損傷のなんらかの徴候が見られるかどうかを調べるために、分析を行う。ＨＰＣの塊を、１０％ホルマリンおよび３０％ショ糖を含む０．１Ｍリン酸緩衝液中に入れて固定する。冠状切片を摘出し、クレシル紫で染色する。ＣＡ３およびＣＡ１中の錐体細胞層の染色を、画像分析システムで評価する。
【００６５】
データ解析／解釈
全般的な処置効果を、混合モデル分散分析（ＡＮＯＶＡ）に従い、複数の因子または反復測定の出現率に応じて、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡのいずれかを用いて評価する。適当な対比較を、フィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定を用いて行う。許容される統計学的有意性はｐ＜０．０５であり、すべての多重比較は両側検定である。
【００６６】
結果
図４は、人工脳脊髄液対照（ａＣＳＦ）およびｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１と比較して、行動ＮＭＤＡ特異的機能アッセイ法における部分アゴニストとしてのペプチドＮＴ−３の試験結果を示している。結果は、モリス水迷路課題において、水中の台まで泳ぐための潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）短縮（図４Ａ）、台までの路程短縮（図４Ｂ）、および訓練第８日のプローブ試行中の標的までの平均距離短縮（図４Ｃ）によって評価した場合、ペプチドＮＴ−１３がいくらかの認知増強をもたらしたことを示している。図４Ａのデータは、試験した処置それぞれについて避難潜時（秒）で表している。このデータでは、ペプチドＮＴ−１３で処置したラットは、ＣＳＦ対照（約１９秒）、およびｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１処置ラット（約１６．２５秒）と比べて、避難潜時の顕著な改善（約１０．７５秒）を示した。図４Ｂのデータは、試験した処置それぞれについて路程（センチメートル）で表しており、このデータでは、ペプチドＮＴ−１３で処置したラットは、ＣＳＦ対照（約４２０ｃｍ）、およびｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１処置ラット（約３３０ｃｍ）と比べて、標的までの路程短縮（約３００ｃｍ）を示した。図４Ｃのデータは、試験した処置それぞれについて標的までの距離（センチメートル）で表しており、プローブ試行中にいったん取り除いた標的からの平均距離を保持の尺度として用いている。このデータでは、ペプチドＮＴ−１３で処置したラットは取り除いた標的の位置の非常に近くにとどまり、平均距離は約３１ｃｍであったのに対し、ＣＳＦ対照およびｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１処置ラットはそれぞれ約３６．２５ｃｍおよび３５ｃｍであった。
【００６７】
これらのデータより、本発明のペプチドによる処置は、哺乳動物においてインビボでの行動上の効果、特にモリス水迷路課題における遂行改善によって示される認知増強を引き起こしうることが明らかである。
【００６８】
実施例５
行動ＮＭＤＡ特異的活性アッセイ法−痕跡瞬目
痕跡瞬目条件付け
瞬目または瞬膜条件付けは、いくつかの研究室で学習の神経基質の分析において用いるための「モデル行動システム」として採用されている（ディスターホフトら、１９７７、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １３７：１２７〜１４３；トンプソン、１９７６、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｓｔ ３１（３）：２０９〜２２７）。このシステムの利点としては、行動パラダイムが比較的単純であること、すぐれた制御法が利用可能であること、連合学習が分析されているという事実、条件刺激および無条件刺激の適用および制御が容易であること、正確な行動および神経生理学的測定が容易であること、およびこの調製に利用可能な行動データが多量にあることが挙げられる（ゴルメザーノ（Ｇｏｒｍｅｚａｎｏ）、１９６６、伝統的条件付け（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）、Ｊ．Ｂ．シドウスキ（Ｊ． Ｂ． Ｓｉｄｏｗｓｋｉ）編、マグローヒル、ニューヨーク、ｐ．３８５〜４２０；ゴルメザーノら、１９８７、Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ、ヒルスデール、ニュージャージー州）。このシステムは、老化に関連する記憶障害（ソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ）ら、１９８８、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ ９：５３５〜５４６）、カルシウム欠乏と老化（ディスターホフトら、１９９４、Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７４７：３８２〜４０６）、健忘症（ガブリエリ（Ｇａｂｒｉｅｌｉ）ら、１９９５、Ｂｅｈａｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０９：８１９〜８２７）、ならびに健忘性コルサコフ患者および回復したアルコール中毒者（マクグリンチェイ−ベロス（ＭｃＧｌｉｎｃｈｅｙ−Ｂｅｒｒｏｔｈ）ら、１９９５、Ａｌｃｏｈｏｌｉｓｍ： Ｃｌｉｎ． ａｎｄ Ｅｘｐ． Ｒｅｓ． １９：１１２７〜１１３２）を含むいくつかの病理に相関付けられている。
【００６９】
アプローチの方法
雌アルビノウサギ成獣、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）に、側脳室ガイドカニューレを両側に外科的に埋め込み、拘束頭部ボルトで固定した。手術は到着の少なくとも１週間後に行い、麻酔のための用量は体重に従って計算した（６０ｍｇ／ｋｇケタミン−ＨＣｌ、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン）。手術のおよそ１０日後、対象に訓練環境への１時間の馴化セッションを１回行った。
【００７０】
２日間の休養後、訓練を開始した。前後に引きひもの付いた、ぴったり合う袋を用いてウサギを拘束し、別の音波減衰室で訓練した。ゴルメザーノらが記載したもの（１９６６、伝統的条件付け、Ｊ．Ｂ．シドウスキ編、マグローヒル、ニューヨーク、ｐ．３８５〜４２０）と類似の台に頭部拘束のためのバーを取りつけた、パッドつきプレキシガラスの台にウサギを置いた。衣服用フックでまぶたを開いたままにし、瞬膜の伸展を赤外線反射センサーで測定した（トンプソンら、１９９４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ．、５４：１０９〜１１７）。
【００７１】
各訓練セッションの前に、対のウサギに人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；１２４ｍＭ ＮａＣｌ、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、３ｍＭ ＫＣｌ、２．４ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．３ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１．２４ｍＭ ＮａＨ_２Ｏ_４、１０ｍＭ Ｄ−グルコース；ｐＨ７．４）に懸濁したＢ６Ｂ２１、またはａＣＳＦ単独のいずれか５μｌを１μｌ／分／脳室の速度で両側に注入した。３段階の濃度、すなわち０．３μｇ／μｌ、１．０μｇ／μｌまたは３．０μｇ／μｌのＢ６Ｂ２１を用いた。実験実施者は、投与溶液の内容について知らされていなかった。カニューレ挿管したウサギを、各群最大６匹の４つの治療群の間で釣り合わせた対で訓練した。
【００７２】
痕跡瞬膜条件付けを、注入直後に開始した。訓練を８０試行／日で１５日間行った（ＣＳ：６ｋＨｚ、９０ｄＢ、１００ミリ秒、上下時間５ミリ秒；ＵＣＳ；３．５ｐｓｉの音、１５０ミリ秒）。課題を海馬依存性とするために、痕跡間隔は５００ミリ秒とした（モイヤー（Ｍｏｙｅｒ）ら、１９９０、Ｂｅｈａｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０４（２）：２４３〜２５２）。試行は、試行間の間隔を変動する３０〜６０秒とし、ＩＢＭ ＰＣ−互換性コンピューターシステムで制御して行った（アカセ（Ａｋａｓｅ）ら、１９９４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄ． ５４：１１９〜１３０；トンプソンら、１９９４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ．、５４：１０９〜１１７）。
【００７３】
データ解析／解釈
全般的な処置効果を、混合モデル分散分析（ＡＮＯＶＡ）に従い、複数の因子または反復測定の出現率に応じて、一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡのいずれかを用いて評価する。適当な対比較を、フィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定を用いて行う。許容される統計学的有意性はｐ＜０．０５であり、すべての多重比較は両側検定である。
【００７４】
結果
投与した抗体Ｂ６Ｂ２１の用量に基づいて行動尺度を比較するために、ウサギを各日に投与したＢ６Ｂ２１の全量にしたがって次の群に分類した：ＣＳＦ対照群、１．５μｇ、３．０〜５．０μｇ、および１０．０〜１５．０μｇ投与群。１．５μｇ Ｂ６Ｂ２１薬物群は対象１匹だけからなっていたため、統計解析には入れなかった。
【００７５】
最終結果より、Ｂ６Ｂ２１投与は老化ウサギで痕跡条件付け瞬目反射の獲得を用量依存的に高めることが判明した（図５）。同じ痕跡条件付けプロトコルを用いて、トンプソンら（１９９５、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ ７４７：３８２〜４０６）は、月齢３６ヶ月以上のウサギ（ｎ＝５０）の４０％が訓練２５日以内にＣＲ８０％の基準に到達したと報告している。残りの６０％のウサギは＞３０％のレベルで遂行することができず、「重度障害」とされた。本試験におけるａＣＳＦ対照群（ｎ＝２）の遂行は、トンプソンの「重度障害」ウサギと同様で、１．５μｇ Ｂ６Ｂ２１を投与した１匹のウサギ（低用量群；ｎ＝１、データは示していない）も同様であった。本試験で１０．０〜１５．０μｇのＢ６Ｂ２１を投与したウサギ（高用量群；ｎ＝３）はいずれも、１５日以内にＣＲ８０％に到達しなかった。しかし、３．０〜５．０μｇのＢ６Ｂ２１を投与したウサギ（中用量群；ｎ＝４）は、他のすべての群に比べて第５日により高い獲得を示し始め、達成した最大ＣＲにより評価すると、対照群よりも高い獲得を示した（スチューデントｔ検定：ｔ（４）＝３．３４、ｐ≦０．０５、図５の挿入図参照）。
【００７６】
学習を評価するために、各群の訓練最終週におけるＣＲの平均パーセンテージを求めた。対照群と実験群との間の一元配置ＡＮＯＶＡにより、群の平均値の間には有意差が認められた（Ｆ（３，１２）＝３．９、ｐ≦０．０５、ｐ＝０．０３７）。対照群と３．０〜５．０μｇ投与群との間のフィッシャーのＰＬＳＴ多重比較Ｔ検定の比較により、学習の増強が認められた（Ｐ（Ｔ≦ｔ）片側＝０．０３、ｐ≦０．０５）が、より高用量の群では、同じ多重比較ｔ検定で、獲得における有意差は見られなかった（Ｐ（Ｔ≦ｔ）片側＝０．０９）。
【００７７】
統計解析に用いた動物の全体の数は少ないが、これらの結果は、老化ウサギにおいてｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１が痕跡瞬目条件付けの獲得を用量依存的に有意に高めることを明らかに示している。これらの結果は、生物活性Ｂ６Ｂ２１ペプチド様物質の開発が予想通りに成功したことを示すものである。
【００７８】
実施例６
仮説実施例
行動ＮＭＤＡ特異的活性アッセイ法−ラットの痕跡瞬目
アプローチの方法
年齢関連の病理（ブロンソン（Ｂｒｏｎｓｏｎ）、１９９０、「老化に対する遺伝的影響ＩＩ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ａｇｉｎｇ ＩＩ）」、ハリソンＤ．Ｅ．（Ｈａｒｉｓｏｎ， Ｄ． Ｅ．）編、Ｔｅｌｆｏｒｄ Ｐｒｅｓｓ、コールドウェル、ニュージャージー州）、および瞬目条件付けにおける年齢関連の障害（ワイス（Ｗｅｉｓｓ）およびトンプソン、１９９２、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １３：３１９〜３２３）が最小であるため、フィッシャー３４４×ブラウンノルウェーラットのＦ１雑種を用いる。月齢９ヶ月の交尾経験のない雄性ラットを実験に用いる。
【００７９】
ラットをペントバルビタールナトリウム（体重１ｋｇあたり６５ｍｇ）の腹腔内注入によって麻酔する。頭頂を剃毛し、アルコールおよびベタジンで消毒する。ガス麻酔アダプターおよび非外傷性イヤーバー（鼓膜を保護するため）のついた脳定位固定装置を用いる。動物を注意深く固定し、頭皮の正中線切開を行う。骨膜の皮膚を開創し、頭骨を消毒および乾燥する。頭骨の前頂の約０．８ｍｍ後部、正中線の左右まで１．３ｍｍの点に穿孔する（頭部レベル調整）。次いで、硬膜を貫通し、２５ゲージのカニューレをそれぞれの孔の皮質表面から４．０ｍｍの深さまで挿入する（トンキス（Ｔｏｎｋｉｓｓ）およびロウリンズ（Ｒａｗｌｉｎｓ）、１９９１、Ｅｘｐ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ８５：３４９〜３５８）。次いで、これらのガイドカニューレを頭骨に歯科用アクリル樹脂で接着する。カニューレの前方に細片連結器を接着する。連結器は接地線、ＥＭＧ活性を測定するために上まぶた内の皮下に埋め込む２本のワイヤー（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）コーティングされたステンレススチール）、および眼窩周囲にショックを与えるために埋め込む２本のワイヤーを含む。馴化前に１週間の回復期間を与える。
【００８０】
下記のとおり毎日の訓練セッションを行う１５分前に、ラットに適当な濃度のペプチド、または人工脳脊髄液対照媒質（ａＣＳＦ）を注入する。ＣＭＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ精密注入ポンプに装備された１０ｍｌハミルトンシリンジにＰＥ−１０チューブで接続した３０ゲージの注入カニューレを用いて、溶液を約１．０ｍｌ／分の速度で脳室内（ｉ．ｃ．ｖ）に注入する。各脳室に合計約３．０ｍｌを注入する。拡散を助けるため、注入カニューレを注入後２分間その位置にとどめておく。特定の処置・試験間隔を維持するため、短時間注入法を用いる。遂行に対する注入処置自体の影響を評価するため、注入を行わない対照群を含める。
【００８１】
スピーカーおよび換気扇を備えた音波減衰室内の小さいケージにラットを入れる。次いで、実験装置と頭部に埋め込んだ細片連結器との間をケーブルで連結する。条件刺激をＰＣ互換性コンピューター上で作動するソフトウェアおよびＣｏｕｌｂｏｕｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製の電子モジュールによって制御する（アカセら、１９９４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． ５４：１１９〜１３０）。ＥＭＧ活性を増幅し、フィルターにかけ、時間定数４５ｍｓで全波整流する（スケルトン（Ｓｋｅｌｔｏｎ）、１９８８、Ｂｅｈａｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０２：５８６〜５９０）。データ収集および解析のためにシグナルをコンピューターに送る（トンプソンら、１９９４、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｍｅｔｈ． ５４：１０９〜１１７）。
【００８２】
瞬目条件付けを、ワイスおよびトンプソン（１９９２、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ａｇｉｎｇ １３：３１９〜３２３）が報告している改変法を用いて行う。訓練セッションの前に、ラットを４５分間のセッションで条件付け装置に馴化する。ラットを対で毎日１５日間、痕跡５００パラダイムまたは偽条件づけのための対応のない対照パラダイムのいずれかで訓練する。ラットを音条件刺激（ＣＳ、１００ｍｓ、１ＫＨｚ、８５ｄＢ、上下時間５ｍｓ）および眼窩周囲ショック無条件刺激（ＵＳ、１５０ｍｓ、２ｍＡ ＡＣ）を用いて痕跡瞬目条件付けする。課題を海馬依存性とするために、無刺激痕跡期間は５００ｍｓとした（モイヤー（Ｍｏｙｅｒ）ら、１９９０、Ｂｅｈａｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １０４（２）：２４３〜２５２）。条件付けラットは、３０〜６０秒の無作為の間隔（ＩＴＩ）で、対応のある音およびショックで８０試行する。対照ラットは、１５〜３０秒の無作為ＩＴＩで、音単独、またはショック単独のいずれかで１６０試行する。条件付けセッションの後、各ラットに３０〜６０秒のＩＴＩで音単独の試行８０セッションからなる５日間の消去訓練を行う。
【００８３】
組織学的分析
行動試験完了後、ラットを屠殺し、組織検査のために調製する。ペプチドを反復注入することでＨＰＣにおいて興奮毒性による損傷のなんらかの徴候が見られるかどうかを調べるために、分析を行う。ＨＰＣの塊を、１０％ホルマリンおよび３０％ショ糖を含む０．１Ｍリン酸緩衝液中に入れて固定する。冠状切片を摘出し、クレシル紫で染色する。ＣＡ３およびＣＡ１中の錐体細胞層の染色を、画像分析システムで評価する。
【００８４】
データ解析／解釈
データを群（条件付け群対対照群）×用量（ＡＣＳＦおよび３用量）のＡＮＯＶＡ（一元配置または二元配置の分散分析）で解析する。反復測定もＡＮＯＶＡで解析する。獲得についてのＡＮＯＶＡはＡＮＯＶＡの１５レベルを含むことになる。消去についてのＡＮＯＶＡは５レベルを含む。この要因配置設計により、信頼性のある統計解析のためには、１群あたりラット約１０匹の８群となる。
【００８５】
実施例７
オートラジオグラフィ試験
本発明のペプチドは、脳組織における生物活性ペプチドおよび／または受容体の分布の詳細な試験を可能にする。
【００８６】
試験法
ベケンステイン（Ｂｅｋｅｎｓｔｅｉｎ）ら（１９９０、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １２６：３９７〜４２５）のオートラジオグラフィ法を本発明のペプチドに適合させることにより、脳の海馬領域、ならびに他の組織全体の局所結合特異性を調べる。最初の試験では、予備インキュベーションおよび洗浄、乾燥法、時間経過の平衡、飽和、ならびに２３℃での結合部位の薬理学に関して、最適結合条件を求める。未処置のラットを屠殺し、脳を速やかに摘出し、ＯＣＴに包埋し、２−メチルブタン中−２０℃で凍結した後、切片化する。クリオスタット上で１０μｍの冠状切片を切断し、ポリ−Ｄ−リジンでコーティングされたカバーガラスに解凍封入する。連続切片作成により、海馬全体の中隔−側頭および背側−腹側の範囲に沿っての結合勾配を評価することができる。（全域にわたってではなく）特定の海馬下位領域または細胞集団内の結合に勾配が認められる場合、そのような勾配がない領域へのスキャッチャード分析を制限するよう、特に注意する。ニッセル染色組織検査および非特異的結合の定量のために、隣接する切片を用いる。内因性または外因性リガンドの濃度を低下させるために、個々の切片を２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で数回繰り返して予備インキュベートする。組織を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、最適濃度の本発明の^３Ｈ−ペプチドと共に、様々な時間インキュベートして、飽和試験のための平衡結合を求める。飽和実験のために、脳切片を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中、様々な濃度の本発明の^３Ｈ−ペプチドと共にインキュベートする。非特異的結合を過剰の非放射性ペプチドの添加により求める。
【００８７】
解析／解釈
組織切片を^３Ｈ−Ｕｌｔｒｏｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にあて、フィルムの線形曝露のために、必要に応じてメタクリレート包埋トリチウム標準と同時曝露する。これらの試験のためにＢｉｏＲａｄのＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅアナライザーを用いることができる。定量的デンシトメトリー分析を、Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ ＩＩｆｘワークステーション上、８−ビットのグレイスケールスキャナー、およびＮＩＭＨで開発された公衆ドメイン画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ（登録商標） ｖ．１．２９）で実施する。
【００８８】
実施例８
ＮＴ−１３を用いての低酸素症の治療
本発明は、脳内の酸素の欠乏をきたす状態の治療または予防に関する。本明細書において用いられる場合、「低酸素症」なる用語は、体の組織に到達する酸素の欠乏に関する。同様に、「虚血」とは、体の部分への酸素を豊富に含んだ血液の流量不足に関連するいかなる状態も意味する。低酸素症および虚血は、組織への血流量が臨界レベル未満に低下するいかなる時にも起こりうる。この血流量の低下は下記の非限定的状態が原因となりうる：（ｉ）塞栓（血餅）による血管の遮断；（ｉｉ）アテローム性動脈硬化症による血管の遮断；（ｉｉｉ）血管の破損（出血性脳卒中）；（ｉｖ）血管痙攣中、およびおそらくは一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）中、ならびにくも膜下出血後に起こる等の、血管収縮による血管の遮断。低酸素症および虚血が起こりうる他の状態には、（ｉ）心筋梗塞（心臓が停止すれば、臓器への血流量は低下し、虚血が起こる）；（ｉｉ）外傷；および（ｉｉｉ）心臓および神経手術（手術の目的を達成するために、血流を低下または停止する必要がある）が含まれる。中枢神経系における低酸素症または虚血の影響には、一時的または永久的機能損失およびニューロン損失が含まれうる。本発明は、低酸素症および虚血ならびに中枢神経系における低酸素症または虚血の影響を治療するためのペプチドおよびアミノ酸組成物を提供する。
【００８９】
図６に示すとおり、ペプチドＮＴ−１３は低酸素症を治療するために有用である。アレチネズミ（ｇｅｒｂｉｌ）モデルを用いて、低酸素状態に曝露した後の海馬における細胞生存のためのＮＴ−１３の有効性を示した。被検動物を、担体単独（すなわち、食塩水）、ＭＫ−８０１または示された濃度のＮＴ−１３ペプチドを含む薬学的組成物の脳室内投与により予備処置（頚動脈クランピングの１５分前、下記参照）した。次いで、アレチネズミの頚動脈を、３０分間クランピングして動物の脳への血流を一時的に妨害し、それによって低酸素症を誘導した。２４時間後、担体単独（すなわち、食塩水）、ＭＫ−８０１または示された濃度のＮＴ−１３ペプチドを屠殺の３０分前に投与した。次いで、動物を屠殺し、生体染色を用いて細胞の生存力を調べるために、海馬のＣＡ１領域の切片を染色した。図６に示すとおり、食塩水対照は細胞の低酸素症にまったく影響をおよぼさなかった。ＭＫ−８０１により低酸素症後も細胞は生存していた。１ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ用量のＮＴ−１３投与後に用量依存的生存が認められた。したがって、ＮＴ−１３ペプチドは、低酸素症によって引き起こされる状態を治療するために有用である。前述の方法は、本明細書において提供される他のＮＴペプチドおよびポリペプチド（すなわち、配列番号：１〜１２および１４〜１７）にも適用可能である。
【００９０】
前述の明細および実施例は例示的なもので、限定的なものではないことが理解されると思われる。当業者であれば、他の特定の態様も本発明の精神およぼ範囲内でありうることを、本発明の開示から理解し、調べることができると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、薬理学的ＮＭＤＡ特異的機能^３ＨＭＫ−８０１結合アッセイ法を用いての、ＮＭＤＡ受容体結合グリシンアゴニストについての試験結果を比較する三つのグラフを示す図である。図１Ａは、Ｄ−シクロセリンの活性を示し、１Ｂはモノクローナル抗体Ｂ６Ｂ２１の活性を示し、かつ１ＣはペプチドＮＴ−３の活性を示している。結果は、選択的グリシン部位アゴニストの７−クロロキヌレニン酸存在下における試験成分の濃度対^３ＨＭＫ−８０１の対照結合のパーセンテージとしてプロットしている。
【図２】図２は、^３ＨＭＫ−８０１結合により評価した薬理学的ＮＭＤＡ特異的機能アッセイ法における部分アゴニストとしてのペプチドＮＴ−３の試験結果を示す図である。
【図３】図３は、卵母細胞発現系における電圧固定実験、すなわち電気生理学的ＮＭＤＡ特異的機能アッセイ法における部分アゴニストとしてのペプチドＮＴ−１３の試験結果を示す図である。図３Ａは電圧固定実験によるＮＭＤＡ電流に対するＮＴ−１３の用量依存的効果を示している。図３Ｂ〜ＤはペプチドＮＴ−１３が部分グリシンアゴニストの特徴を有していることを示している。図３ＢはＮＴ−１３の作用がグリシンの作用と類似であるが、それほど有効ではないことを示している。図３ＣはＮＴ−１３が標準のＮＭＤＡ＋グリシン電流を阻害することを示している。図３ＤはＮＴ−１３誘導性ＮＭＤＡ電流が、選択的グリシン部位アンタゴニストの７−クロロキヌレニン酸によって阻止されることを示している。
【図４】図４は、行動ＮＭＤＡ特異的機能アッセイ法における部分アゴニストとしてのペプチドＮＴ−３の、脳脊髄液対照（ＣＳＦ）およびｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１と比較しての試験結果を示す図である。図４はモリス水迷路課題において、水中の台まで泳ぐための潜時（ｌａｔｅｎｃｙ）短縮（図４Ａ）、台までの路程（図４Ｂ）、および訓練第８日のプローブ試行中の標的までの平均距離短縮（図４Ｃ）によって評価した場合、ペプチドＮＴ−１３がいくらかの認知増強をもたらしたことを示している。
【図５】図５は、老化ウサギでｍＡｂ Ｂ６Ｂ２１による処置後の瞬目条件付けの結果を示す図である。挿入図は、収集データを得られた最大ＣＲとして示している。
【図６】図６は、低酸素症のアレチネズミの視床下部に対するＮＴ−１３の効果を示す図である。[0001]
Relationship with related applications
This application claims the benefit of US Provisional Application No. 60 / 213,614, filed June 22, 2000, the entire disclosure of which is incorporated herein by reference.
[0002]
Field of the invention
The present invention relates to the field of neuroactive peptide, protein, or amino acid compositions.
[0003]
Description of related technology
It is now well known that the mammalian central nervous system (CNS) uses many neuroactive peptides to perform specialized signaling in the brain and spinal cord. Among the better known neuroactive peptides are somatostatin, cholecystokinin, VIP, substance P, enkephalin, neuropeptide Y (NPY), neurotensin, TRH, CCK, and dynorphin. (Generally, "The Biochemical Basis of Neuropharmacology," Cooper, Bloom and Roth, 5th ed., Oxford University Press, New York, 19, New York Press 19, 86. . Careful elucidation of the complex signaling pathways that work in the CNS requires the identification and characterization of certain neuroactive peptides and their unique properties, and the characterization and localization of certain neurologically important receptors . The identification of agonists and antagonists of the CNS receptor is that the more known specific neuroactive peptides, the greater the range of manipulations that can be performed on the behavior of the CNS receptor protein and CNS receptor complex. Useful, whether partial, complete, cooperative, or independent. Importantly, by identifying unique agonists or antagonists, binding of the subset of neuroactive receptors to these agonists or antagonists allows for detailed characterization and localization of these subsets. The identification of neuroactive peptides and their use to specifically perturb the behavior of known receptor complexes provides a more detailed understanding of receptor complexes. In addition, the novel neuroactive peptides are another means of altering the behavior of known CNS receptor complexes, or a means for discovering previously unknown receptor complexes or unknown behavior of known receptors. I will provide a.
[0004]
N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors have been implicated in neurodegenerative disorders, stroke-related brain cell death, spastic disorders, and learning and memory, and have been cloned from human tissues. (See Hoffman, M., 1991, Science, 254: 801-2). In addition to being activated by the binding of NMDA, the NMDA receptor is also activated by glutamate (Glu) and aspartate (Asp), also by D-2-amino-5-phosphonovaleric acid (D-AP5; D-APV) or non-competitively by phenylcyclidine (PCP) and MK-801. However, most interestingly, the NMDA receptor is co-activated by glycine (Gly). (Kozikowski et al., 1990, Journal of Medical Chemistry 33: 1561-1571). Glycine binding to allosteric regulatory sites on the NMDA receptor complex increases both channel open time and, most dramatically, NMDA receptor channel open frequency.
[0005]
NMDA receptors are thought to be central to long-term potentiation (LTP), a persistent enhancement of neural communication that is considered the basis of learning and memory (for review, see Bliss and Collingridge ( Collingridge), 1993, Nature 361: 31-39). For example, damage to the CNS that can occur during a stroke is thought to be due to hyperexcitation of NMDA receptor-bearing cells due to the influx of glutamate or aspartate into these cells, leading to the overexcitation of such cells. Approximately 80% will die. The majority of NMDA receptor-bearing cells are in the cortical and hippocampal regions of the brain, and after hyperexcitable death of such cells, patients are unable to learn new things, but still remember items in long-term memory be able to. The memory deficits in humans associated with PCP abuse have been linked to the effects of PCP, a possible consequence of impaired calcium flux through the NMDA receptor.
[0006]
Drugs that can block the NMDA receptor or otherwise alter the function of the NMDA receptor could protect cells from hyperexcitatory killing or memory problems associated with the NMDA receptor. Conceivable. Other drugs that interact with the NMDA receptor may enhance the ability of cells to form LTP, and thus enhance learning and memory.
[0007]
The importance of the NMDA receptor allows for detailed mapping of tissue distribution, subtype characterization, and fine manipulation of the NMDA receptor, and characterization of the effects of other agonists or antagonists on the NMDA receptor. Obtaining a particular peptide agonist or antagonist that allows it would be very useful.
[0008]
Summary of the Invention
The present invention relates to treatment or prevention of conditions that cause oxygen deprivation in the brain. The present invention provides peptide and amino acid compositions for treating hypoxia and ischemia and the effects of hypoxia or ischemia on the central nervous system.
[0009]
In general, the invention relates to DNA molecules useful for modulating certain receptors, such as the NMDA receptor, found in the brain, and the polypeptides encoded thereby. In a preferred embodiment, the DNA molecule encodes a member of the NT family of polypeptides, as shown in Table 1 below. In one embodiment, the polypeptide is useful for enhancing learning functions. In another embodiment, the polypeptide is useful for treating a condition caused by hypoxia.
[0010]
In a preferred embodiment, the present invention is a method of treating hypoxia comprising administering an effective amount of a peptide or amino acid composition, wherein the method comprises administering to the peptide composition

A method comprising a peptide selected from the group consisting of and a pharmaceutically acceptable excipient. In a preferred embodiment, the invention includes a method of treating the effects of hypoxia or ischemia on the central nervous system, comprising the step of administering an effective amount of such a peptide composition.
[0011]
In a preferred embodiment, the peptide is

It is. In another embodiment, the peptide is cyclized. In another embodiment, the peptide comprises a substituted amino acid residue, preferably the substituted amino acid residue is conservatively substituted.
[0012]
(SEQ ID NO: 3); (SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 5); (SEQ ID NO: 9); (SEQ ID NO: 10); And a DNA molecule encoding a peptide selected from the group consisting of: (SEQ ID NO: 13).
[0013]
In another embodiment, the present invention relates to the manufacture of a medicament for the treatment of hypoxia: (SEQ ID NO: 3); (SEQ ID NO: 4); (SEQ ID NO: 5); (SEQ ID NO: 9); (SEQ ID NO: 10); (SEQ ID NO: 12); and (SEQ ID NO: 13).
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
As used herein, the term “hypoxia” relates to a lack of oxygen reaching body tissues. Similarly, "ischemia" refers to any condition associated with insufficient flow of oxygen-rich blood to a body part. Hypoxia and ischemia can occur at any time when blood flow to tissues drops below a critical level. This reduced blood flow can be due to the following non-limiting conditions: (i) blockage of blood vessels by embolism (blood clot); (ii) blockage of blood vessels by atherosclerosis; (iii) damage of blood vessels ( (Iv) hemorrhagic stroke); (iv) blockage of blood vessels by vasoconstriction, such as occurs during vasospasm and possibly during transient ischemic attack (TIA), and after subarachnoid hemorrhage. Hypoxia and other conditions in which ischemia can occur include (i) myocardial infarction (if the heart stops, blood flow to organs will decrease and ischemia will occur); (ii) trauma; and (iii) ) Heart and neurosurgery, where blood flow needs to be reduced or stopped to achieve surgical goals. The effects of hypoxia or ischemia in the central nervous system can include temporary or permanent loss of function and neuronal loss.
[0015]
The present invention provides certain neuroactive peptides that are characterized by their ability to bind to NMDA receptors. The present invention provides certain polypeptide or amino acid compositions that bind to the NMDA receptor at a glycine co-agonist site, resulting in at least the same biological activity as binding glycine from the NMDA receptor. The polypeptide or amino acid composition of the present invention can be purified from natural tissues, body fluids, or cells. A preferred embodiment of the present invention provides for the chemical synthesis of a polypeptide or amino acid composition of the present invention using conventional biochemical methods or molecular biology techniques. Because the polypeptides or amino acid compositions of the present invention are useful for the identification and characterization of NMDA receptor activity, and for localization of tissues, the present invention provides modified peptides whose backbones have enhanced stability. Provided is a stabilized polypeptide or amino acid composition that incorporates or that has additional framework modifications to stabilize or enhance the three-dimensional structure of the peptide fragment. The invention also provides for cyclized polypeptide or amino acid compositions.
[0016]
Another benefit of the polypeptide or amino acid compositions of the present invention is that smaller sizes are likely to have an increased ability to cross the blood-brain barrier and are therefore suitable for administration and detection in vivo. Accordingly, the present invention relates to a polynucleotide of the invention conjugated to a radioactive marker, an MRI marker, a metal ion marker, an enzyme marker, a chemiluminescent marker, or any such marker that permits the detection of a polypeptide or amino acid composition. Including a peptide or amino acid composition. The present invention also includes pharmaceutical formulations of the polypeptide or amino acid composition of the present invention in a suitable pharmaceutical carrier, such that they can be administered to a living subject. Such administration may be intraperitoneal, intravenous, intramuscular, or by any other suitable means.
[0017]
When the polypeptide or amino acid composition of the present invention is used for detection of NMDA receptor using in vitro screening such as tissue excision and staining, the marker to be bound may be a protein, antibody, Avidin, biotin, and any other such marker that can detect the presence of the polypeptide or amino acid composition in a screening assay or staining method.
[0018]
The invention also provides polypeptides or amino acid compositions of the invention, and methods for detecting NMDA receptors using bound receptors and markers suitable for the detection of the polypeptide or amino acid composition. Such methods can be performed in vitro and in vivo, depending on the detection conditions used. Certain techniques that can be used with such methods include, but are not limited to, MRI, CAT scan, X-ray, sonogram, and other such non-invasive detection methods There is no. If an invasive method is contemplated, ie, in a biopsy or tissue section, standard immunological screening methods are available to detect the presence of bound receptor / polypeptide, or such binding is Specific visualization can also be achieved by immunological staining or other such means of detection using widely available markers / detection systems. Accordingly, the present invention also provides a method of modifying the biological activity of a NMDA receptor, the method comprising the NMDA receptor in contact with a polypeptide or amino acid composition of the invention. In particular, peptides having the amino acid sequences listed in Table 1 below are included, and are expected to be effective according to the assay data in the Examples below.
[0019]
[Table 1] NT peptide family

[0020]
Conservative amino acid substitutions also include unnatural amino acid residues, which are typically incorporated by chemical peptide synthesis rather than by synthesis in biological systems. These include peptidomimetics, and inverted or inverted forms of other amino acid portions.
[0021]
Natural residues can be classified based on common side chain properties:
1) Hydrophobic: norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) Neutral hydrophilicity: Cys, Ser, Thr;
3) acidic: Asp, Glu; in a preferred embodiment, the variant is 1-3, or 1-5, or 1-10, or 1-15, or 1-20, or 1-25, Or having substitutions, insertions, additions and / or deletions of 1-26 amino acids, provided that the substitutions can be conservative or non-conservative, or any combination thereof. For example, a "conservative amino acid substitution" may include a substitution of a naturally occurring amino acid residue with a non-naturally occurring residue that has little or no effect on the polarity or charge of the amino acid residue at that position. In addition, any natural residue in the polypeptide can be replaced with alanine, as described previously for "alanine scanning mutagenesis."
4) Basic: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Residues affecting chain orientation: Gly, Pro; and
6) Aromatic: Trp, Tyr, Phe.
[0022]
For example, non-conservative substitutions could involve the exchange of a member of one of these classes for a member of another class. Such substitution residues may be introduced at one or more residues of the NT polypeptide.
[0023]
In making such changes, the hydropathic index of the amino acid may be considered. Each amino acid has been assigned a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge characteristics. The hydropathic index is as follows: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1). Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3) Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamic acid (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartic acid (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
[0024]
The importance of the hydropathic index of amino acids in conferring interactive biological function on a protein is generally understood in the art (Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-105). 31). Certain amino acids can be substituted for other amino acids having similar hydropathic indices or scores, and are known to retain similar biological activities. When making a change based on the hydropathic index, it is preferable to substitute an amino acid having a hydropathic index within ± 2, more preferably within ± 1, more preferably within ± 0.5.
[0025]
Substitutions for similar amino acids may be based on hydrophilicity, particularly where the protein or peptide of equivalent biological function produced is intended to be used in an immunological embodiment, as in this case. What can be done effectively is also known in the art. The maximum local average degree of hydrophilicity of a protein is governed by the hydrophilicity of its neighboring amino acids and correlates with its immunogenicity and antigenicity, ie, the biological properties of the protein.
[0026]
The following hydrophilicity values have been assigned to these amino acid residues: arginine (+3.0); lysine (+3.0); aspartic acid (+ 3.0 ± 1); glutamic acid (+ 3.0 ± 1). Serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (+0); threonine (-0.4); proline (-0.5 ± 1); 5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8). Tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); and tryptophan (-3.4). When making changes based on similar hydrophilicity values, it is preferable to substitute amino acids whose hydrophilicity values are within ± 2, more preferably those within ± 1 and even more preferably those within ± 0.5. Epitopes can also be identified from primary amino acid sequences based on hydrophilicity. These regions are also called "epitope core regions".
[0027]
Desired amino acid substitutions (whether conservative or non-conservative) can be determined by one skilled in the art if such substitutions are desired. For example, amino acid substitutions can be used to identify key residues in the NT polypeptide, or to increase or decrease the affinity of a Secs-1 polypeptide described herein. Exemplary amino acid substitutions are shown in Table I.
[0028]
[Table I] Amino acid substitution

[0029]
One of skill in the art would be able to determine suitable variants of the polypeptides of SEQ ID NOs: 1-17 using known techniques. To identify appropriate regions of the molecule that can be altered without compromising biological activity, those skilled in the art can target regions that are not believed to be important for activity. For example, if similar polypeptides with similar activities are known from the same or other species, one skilled in the art can compare the amino acid sequence of a Secs-1 polypeptide to such similar polypeptides. Such comparisons can identify residues and portions of the molecules that are conserved among similar polypeptides. It is understood that changes in regions of the Secs-1 molecule that are not conserved relative to such similar polypeptides are less likely to have a deleterious effect on the biological activity and / or structure of the Secs-1 polypeptide. It is thought that. It is also known to those skilled in the art that, even in relatively conserved regions, chemically similar amino acids can be used instead (conservative amino acid residue substitutions) while retaining the activity of the natural residue. I think that the. Thus, conservative amino acid substitutions can be made in regions deemed important for biological activity or structure without compromising biological activity or adversely affecting the polypeptide structure.
[0030]
DNA molecules encoding NT polypeptides are also included within the scope of the present invention. As shown below, the peptide can be encoded by any of several DNA molecules using codon tables known in the art (Table 2):
[0031]
[Table 2] Codon table

[0032]
For example, as shown in Table 3, the NT-13 peptide can be encoded by a DNA molecule having the following sequence:
[0033]
TABLE 3 DNA sequence encoding NT-13 (Thr-Pro-Pro-Thr)

[0034]
Any combination of codons encoding Thr-Pro-Pro-Thr can be used to encode the NT-13 peptide. For example, NT-13

And other combinations of the codons shown in Table 3. Oligonucleotides encoding NT-13 or any other polypeptide provided by the present invention can be designed and synthesized using standard techniques. In addition, the DNA encoding the peptide can be incorporated into an expression vector for expression of the polypeptide in vitro or in vivo, as is known in the art. These techniques are applicable to any of the peptides described herein (ie, SEQ ID NOs: 1-17), as well as to their variants.
[0035]
The following examples are for illustrative purposes only and are not intended or should be considered limiting of the invention in any manner. Those skilled in the art will appreciate that changes and modifications can be made without departing from the spirit or scope of the invention.
[0036]
Example 1
Monoclonal antibody specific for NMDA receptor
Mice with dentate gyrus tissue isolated from 5 day old rat neonates according to standard protocols (see Moscal and Schaffner, 1986, The Journal of Neuroscience, 6 (7): 2045-2053). Was immunized to generate monoclonal antibodies. After screening the hybridomas for binding to dentate gyrus tissue by histochemical methods, promising candidate clones were isolated. Among the clones isolated is the monoclonal antibody B6E11, which has been shown to block LTP production in rat hippocampal slices and suppress LTP established in both the hippocampal CA1 region and the dentate gyrus ( See Stanton, Survey, and Moscal, 1987, Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A., 84: 1684-1688. Monoclonal antibody B6E11 is effective in inhibiting LTP when applied to synaptic apical dendrites due to enhanced input, but not when applied to cell bodies or basal dendrites of CA1. Turned out not to be. In contrast, the second monoclonal antibody, G6E3, is from the same panel of the same immunoglobulin class and binds to target tissues in a similar manner, but has no effect on LTP. Was.
[0037]
Another monoclonal antibody, B6B21, was found to promote LTP by glycine-like modulation of the NMDA receptor (Harring, Stanton, Scheiderer and Moscal, 1991, Journal of Neurochemistry, 57 (1)). : 323-332). This unique monoclonal antibody was able to significantly enhance LTP when applied to CA1 pyramidal cell tip dendrites of rat hippocampal slices. B6B21 is N- (1- (2-thienyl) cyclohexyl) -3,4-³H piperidine (³H-TCP) also increased binding to intra-channel PCP sites. This effect was eliminated by maximal saturation of the NMDA receptor by the addition of a maximum concentration of a combination of glutamate, glycine and magnesium. Most importantly, monoclonal antibody B6B21³Reversed 7-chlorokynurenic acid inhibition of H-TCP binding, but by APV³It had no effect on inhibiting H-TCP binding. By monoclonal antibody B6B21³Enhancement of H-TCP binding was enhanced by glutamic acid but not glycine.
[0038]
In vivo experiments using the rabbit eyeblink conditioning test showed that hippocampal-dependent learning was enhanced by B6B21 binding, or by the addition of D-cycloserine, both of which were specific for the NMDA receptor. Binds (see Thompson, Moscal and Disterhoft, 1992, Nature, 359: 638-641). Infusion of B6B21 intraventricularly (into the ventricle) significantly increased the rate of acquisition of hippocampus-dependent trace-blink conditioning in rabbits and halved the number of trials required to reach the criterion of 80% conditioned response. Peripheral infusion of D-cycloserine, a partial agonist of the glycine site on the NMDA receptor, which crosses the blood-brain barrier, also doubled the learning rate in rabbits.
[0039]
By testing the monoclonal antibody B6B21, we can obtain a panel of polypeptide or amino acid compositions (Table 1) that mimic the activity of the mAb B6B21 and thus enable it to mimic glycine coagonism. Was.
[0040]
Example 2
Pharmacological NMDA-specific activity:³HMK-801 assay
The peptides of the present invention are capable of specific binding to the glycine co-agonist site of a mammalian NMDA receptor. Notably, the peptides of the present invention do not require the presence of glycine (Gly, G) amino acids. Because the role played by the NMDA receptor in the mammalian brain is important, specific agonists are very important for detailed mapping of NMDA receptor tissue distribution and correlation with disease, injury, or other pharmacological effects. Useful for Certain small peptide agonists are particularly useful in that they can be further modified to enhance bioavailability and for transport across the blood-brain barrier.
[0041]
The polypeptides or amino acid compositions of the present invention have been previously validated [³[H] MK-801 binding assay was used to test for the ability to mimic glycine co-agonism on NMDA receptors. This functional assay is based on the NMDA receptor [³[H] MK-801 binding takes advantage of the fact that it can only occur by opening receptor binding channels. This is because the MK-801 binding site is located inside the ionophore of the NMDA receptor complex and is therefore only accessible by opening the receptor-channel complex. Therefore, in this assay, [³Increased binding of [H] MK-801 is directly correlated with the increased channel opening induced by binding of the polypeptide or amino acid composition of the invention to the glycine co-agonist binding site.
[0042]
To further refine the assay, a selective antagonist of the glycine binding site of the NMDA receptor-channel complex is added to the assay. The normal action of 7-chlorokynurenic acid selectively binds to glycine sites and inhibits NMDA receptor channel opening, thus [³H] inhibiting the binding of MK-801 to the NMDA receptor complex. The addition of peptide NT-3 was carried out in [³H] reverses the inhibition of MK-801 binding and thus correlates with the finding that the polypeptide or amino acid composition of the invention binds to the glycine binding site.
[0043]
Preparation of membrane
Crude synaptic membranes used in the assay were prepared using rat hippocampal tissue (male Sprague-Dawly rats) and prepared as previously described (Harling et al., 1991, J. Neurochem. 57: 323-). 331). Briefly, tissues stored at −80 ° C. were homogenized using a Brinkman Polytron RTM in 5 mM Tris (pH 7.4) under ice-cooling, and then centrifuged at 48,000 g for 20 minutes. Pellet. The resulting supernatant is discarded and the membrane is washed three times in cold buffer. The pellet is then resuspended in 5 mM EDTA, 15 mM Tris (pH 7.4) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The membrane suspension is then pelleted by centrifugation at 48,000 g for 20 minutes and stored at -80 ° C until used in the assay.
[0044]
Receptor binding assay
The frozen pellet is thawed at room temperature and washed three times by resuspension in 5 mM Tris (pH 7.4) and centrifugation. The final pellet is suspended at a concentration of 2-3 mg / ml in 5 mM Tris buffer (pH 7.4). 200 μg of freshly prepared membrane was incubated with 1 nM in the presence of a range of concentrations of peptide and 60 μM 7-chlorokynurenic acid.³The conjugation reaction is started by adding at 25 ° C. to the reaction mixture containing HMK-801 (final volume about 1 ml). Non-specific binding is quantified using 10 μM unlabeled MK-801. The binding reaction is stopped by filtering through a Brandel 24-well cell harvester on Whatman GF / B glass filters pre-soaked in 0.25% polyethyleneimine for 30 minutes.
[0045]
Data analysis / interpretation
Sub-effective concentration of D-cycloserine (10^-5)so³Peptides that stimulate HMK-801 binding are considered positive for the ability to bind to the glycine site of the NMDA receptor complex.
[0046]
FIG. 1 shows data comparing binding data using D-cycloserine (FIG. 1A), mAb B6B21 (FIG. 1B), and peptide NT-3 (FIG. 1C). FIG. 1C clearly shows that peptide NT-3 binds to the glycine site of the NMDA receptor in a manner similar to mAbs B6B21 and D-cycloserine. Data are reported as% of control binding in the presence of 7-chlorokynurenic acid relative to the concentration of the test substance.
[0047]
FIG. 2 shows the binding activity of the aforementioned peptide NT-3. Data are reported as% of control binding in the presence of 7-chlorokynurenic acid relative to the concentration of the test substance.
[0048]
Table 4 below describes the results from the assay results using the peptides of the invention.
[0049]
[Table 4]

^*In the presence of 10 μM L-glutamic acid
[0050]
Table 4 shows that peptides NT-1 to NT-18 in rat hippocampus [³H] Effect on NMDA receptor activation as assessed by MK-801 binding, reported as percentage of control binding (+/− SEM) at various concentrations of peptide. The data reported for peptides NT-15 to NT-18 and the experimental error at each point suggest that it is unlikely that any of these will have significant biological activity. Peptide concentration 10 as effective concentration^-5It should be emphasized that M is approaching the millimolar range (100 mM) and is too high to be considered a reliable indicator of the biological activity of a peptide. At such high concentrations, non-specific binding effects associated with specific binding may be magnified and the binding equilibrium of the receptor / ligand may be distorted. Therefore, peptides showing the optimal binding activity are candidates.
[0051]
For example, NT-14 and NT-15 are ineffective at any concentration tested, while NT-17 is almost equally active over a wide range of concentrations, whereas NT-16 and NT-18 are 10^-5M is most effective. By taking into account concentration and experimental errors, it is reasonable to exclude these peptides as not biologically active.
[0052]
However, it has been recognized that D-cycloserine is a partial agonist at the glycine site of the NMDA receptor and can act as a cognitive enhancer (Thompson, Moscal and Disterhoft, 1992, Nature, 359: 638-641). . Serine and threonine share many structural features, and it is believed that threonine may have similar enhancing properties as serine. Therefore, it can be predicted that replacing the threonine moiety of NT-3 and NT-13 with serine will result in an active peptide.
[0053]
Example 3
Electrophysiological NMDA-specific activity assay
Direct electrophysiological measurement of the effect of the peptides of the present invention on NMDA receptor function is a powerful, obvious and relatively cost- and time-efficient screening method. At first³The peptides of the invention selected as preferred by the HMK-801 binding assay are then subjected to an electrophysiological screen.
[0054]
Electrophysiological recording methods are performed by two-electrode voltage clamp method and standard oocyte expression system preparation (Leonard and Kelso, 1990, Neuron 4: 53-60; Kelso et al., 1992). , J. Physiology 449: 705-718). Oocytes are isolated and injected with mouse NMDA receptor subunit mRNA: co-inject 70 nl z1 (z1) RNA with the same amount of e1 (e1) RNA. After incubation for 2 days, recording is performed with the membrane potential fixed at -80 mV. The standard recording solution was 95 mM NaCl, 2 mM KCl, 3.8 mM BaCl.₂, And 5 mM HEPES. Mg²⁺Is not added to block the NMDA current at a constant potential.²⁺Is the endogenous Ca of the oocyte²⁺Not added because it can induce a dependent chloride current. The reaction is triggered by continuous perfusion of 3-5 ml of NMDA containing solution. The capacity of the recording container is about 400 ml. In some experiments, 7-chlorokynurenic acid is added to the perfusate to indicate that the peptide or amino acid composition being tested competes with and can act at the glycine binding site.
[0055]
Data analysis / interpretation
FIG. 3A shows that peptide NT-13 has a dose-dependent effect on NMDA current. Increasing concentrations results in increased current.
[0056]
FIG. 3B shows that in the absence of glycine, peptide NT-13 increases NMDA current. In this experiment, 100 μM NMDA and 10 μM glycine elicited a large current (about 284 nA, downward swing of the trace). In the next step, 100 μM NMDA and 100 μM peptide NT-13 elicited a significant current of about 40% of saturated glycine + NMDA. In this same cell, NMDA alone showed negligible response (about 7 nA).
[0057]
FIG. 3C shows that the addition of peptide NT-13 at high glycine concentrations reduced the NMDA current, showing a reduction of the control response to NMDA and saturated glycine to about 91%. This data further supports the conclusion that this peptide competes at the glycine binding site.
[0058]
FIG. 3D shows that in the absence of glycine, the effect of peptide NT-13 was blocked by selective addition of the antagonist 7-chlorokynurenic acid.
[0059]
Example 4
Behavioral NMDA-specific activity assay
Morris Water Maze (MWM)
There are two types of hippocampus (HPC) -dependent associative learning. That is, a time-dependent type and a space-dependent type. The Morris water maze (Morris, 1984, J. Neurosci. Meth. 11: 47-60; Brandeis et al., 1989, Int. J. Neurosci. 48: 29-69) teach spatially dependent learning. It is a well-established paradigm for evaluating and thus complements other behavioral assays, such as the blink test, which evaluates time learning. All of these learning types are affected by aging and are dependent on NMDA receptor activation (Morris, 1989, J. Neurosci. 9: 3040-3057).
[0060]
Approach method
All experiments use adult male Sprague-Dawley rats. A total of 8 to 10 rats are used per group. The number of rats per group was selected by power function analysis of past data obtained in a similar study. Based on the results of these prior studies, a realistic estimate of the error variance of biochemistry and behavioral endpoints was obtained. This information was used to establish a value of p <0.05 and to select a sample size that provided an acceptable level of statistical power. Estimates were obtained based on the suggestions described in Keppel (“Design and Analysis”, Prentice Hall, NY, 1973). In all cases, the study was designed to maximize the amount of information obtained from the minimum number of rats.
[0061]
Implant stainless steel guide cannulas into both left and right lateral ventricles of the rat brain. After resting the rats for two weeks, the behavioral test is started. Rats are infused with appropriate concentrations of peptide or artificial cerebrospinal fluid control medium (aCSF) 15 minutes prior to a daily training session in the water maze task described below. The solution was injected intracerebroventricularly (icv) at a rate of about 1.0 ml / min using a 30 gauge infusion cannula connected by a PE-10 tube to a 10 ml Hamilton syringe equipped with a CMA Instruments precision infusion pump. inject. A total of about 3.0 ml is injected into each ventricle. The injection cannula remains in place for 2 minutes after injection to aid in diffusion. Use short-term infusion techniques to maintain specific treatment and test intervals. A control group without injection is included to evaluate the effect of the injection treatment itself on performance.
[0062]
Water maze task
Rats are tested on the Morris water maze task 15 minutes after intraventricular injection. This task is widely used to assess behavioral characteristics and neurobiological substrates in spatial memory in rats. It has become popular because it is a behavior that is acquired quickly and is not motivated by eating disturbance. Numerous studies have shown that performance of this task relies on the complete hippocampal and septal hippocampal cholinergic circuits. Performance of the task is hindered by (i) surgical, or (ii) pharmacological disruption of HPC or its cholinergic innervation, and (iii) aging. This task has been shown to provide a sensitive and useful behavioral assay for the functional integrity of the septal hippocampal pathway and HPC (Opell et al., 1993, Physiol. Behav. 54 (6). ): 1227-1233).
[0063]
In a standard MWM task, rats must learn to swim to a submerged platform in a circular pool containing opaque water. The pool is divided into four equal quadrants, starting at four equally spaced points around the pool. The underwater evacuation platform is located in one of four quadrants throughout the training. Each training trial consisted of placing the rats in water at one of four starting points. Let the rat search for the underwater platform for up to 60 seconds and stay on the platform for 30 seconds. Rats are tested on two trials per day for 15 consecutive days. The different starting points around the pool are given in a random order. Latency to swim to an underwater platform is a measure of acquisition. These test parameters provide a challenge that is sensitive to both treatment-induced improvement and decline in spatial memory. The second component of the test involves the introduction of probe trials after trials 2, 14, 26 and 38. In the probe trial, the evacuation platform is removed and the behavior of the rat is recorded on video for 30 seconds. The following measures are from an automatic video tracking system: (i) the percentage of time spent swimming in the correct quadrant, (ii) the average distance from the target during the probe trial, and (iii) the speed of swimming. The use of this continuous probe trial allows the evaluation of different components of spatial learning: procedural memory, which is a memory type that is not related to hippocampal function, and descriptive memory, which is an HPC-dependent process. Assessing these two types of cognition is important because in aging, Alzheimer's disease, and the AF64A model, only descriptive memory is impaired (Opero et al., 1993, Physiol. Behav. 54 (6): 1227-1233). It is.
[0064]
Histological analysis
After completion of the behavioral test, the rats are sacrificed and prepared for histology. An analysis is performed to determine if repeated injections of the peptide show any signs of excitotoxic damage in HPC. The HPC mass is fixed in 0.1 M phosphate buffer containing 10% formalin and 30% sucrose. Coronal sections are removed and stained with cresyl purple. Staining of the pyramidal cell layer in CA3 and CA1 is evaluated with an image analysis system.
[0065]
Data analysis / interpretation
The overall treatment effect is assessed according to the mixed model analysis of variance (ANOVA), using either one-way or two-way ANOVA, depending on the incidence of multiple factors or repeated measures. Suitable pairwise comparisons are performed using Fisher's least significant difference (LSD) test. Accepted statistical significance is p <0.05, and all multiple comparisons are two-tailed.
[0066]
result
FIG. 4 shows the test results of peptide NT-3 as a partial agonist in behavioral NMDA-specific functional assays compared to artificial cerebrospinal fluid control (aCSF) and mAb B6B21. The results show that in the Morris water maze task, the latency reduction to swim to the underwater platform (FIG. 4A), the path to platform reduction (FIG. 4B), and the target to target during the probe trial on day 8 of training. It shows that peptide NT-13 caused some cognitive enhancement as assessed by mean distance shortening (FIG. 4C). The data in FIG. 4A is expressed in escape latencies (seconds) for each of the treatments tested. In this data, rats treated with peptide NT-13 showed a significant improvement in evacuation latency (approximately 10.75 seconds) compared to CSF control (approximately 19 seconds) and mAb B6B21 treated rats (approximately 16.25 seconds). Seconds). The data in FIG. 4B is expressed in paths (centimeters) for each of the treatments tested, in which rats treated with peptide NT-13 were compared to CSF control (about 420 cm) and mAb B6B21 treated rats (about 330 cm). ) Showed a shorter path to the target (about 300 cm). The data in FIG. 4C is expressed as distance to the target (centimeters) for each treatment tested, and the average distance from the target once removed during the probe trial is used as a measure of retention. In this data, rats treated with peptide NT-13 remained very close to the location of the removed target, with an average distance of about 31 cm, whereas the CSF control and mAb B6B21 treated rats were about 36.25 cm each. And 35 cm.
[0067]
From these data, it is clear that treatment with the peptides of the invention can cause behavioral effects in mammals in vivo, particularly cognitive enhancement as indicated by improved performance in the Morris water maze task.
[0068]
Example 5
Behavioral NMDA Specific Activity Assay-Trace Blink
Trace blink condition
Blink or nictitating membrane conditioning has been adopted in some laboratories as a “model behavioral system” for use in analyzing neural substrates of learning (Disterhoff et al., 1977, Brain Res. 137: 127-143). Thompson, 1976, American Psychologist 31 (3): 209-227). The advantages of this system are the relatively simple behavioral paradigm, the availability of good control methods, the fact that associative learning is being analyzed, the ease of applying and controlling conditional and unconditional stimuli. The ease of accurate behavioral and neurophysiological measurements, and the large amount of behavioral data available for this preparation (Gormezano, 1966, Traditional Conditioning). J. B. Sidowski, Ed., McGraw-Hill, New York, pp. 385-420; Gormesano et al., 1987, Classical Conditioning, Hildsdale, NJ. This system has been shown to reduce aging-related memory impairments (Solomon et al., 1988, Neurobiol. Aging 9: 535-546), calcium deficiency and aging (Disterhoff et al., 1994, Annals NY Acad. Sci. 747: 382). 406), amnesia (Gabrieli et al., 1995, Behav. Neurosci. 109: 819-827), and amnesic Korsakoff patients and recovered alcoholics (McGlinkey-Berroth et al.). 1995, Alcoholism: Clin. And Exp. Res. 19: 1127-1132).
[0069]
Approach method
Adult female albino rabbits, rabbits (Oryctolagus cuniculus) were surgically implanted on both sides with lateral ventricular guide cannulas and secured with captive head bolts. Surgery was performed at least one week after arrival, and the dose for anesthesia was calculated according to body weight (60 mg / kg ketamine-HCl, 10 mg / kg xylazine). Approximately 10 days after surgery, subjects underwent one one-hour habituation session to the training environment.
[0070]
After two days of rest, training began. Rabbits were restrained using snug bags with front and back drawstrings and trained in a separate acoustic attenuation chamber. (1966, Traditional Conditioning, Ed. JB Sydowski, McGraw-Hill, New York, pp. 385-420), a padded plexiglass with a bar for head restraint mounted on a platform similar to that described by Gormesano et al. The rabbit was placed on the table. The eyelids were kept open with the clothes hook and the extension of the nictitating membrane was measured with an infrared reflection sensor (Thompson et al., 1994, J. Neurosci. Meth., 54: 109-117).
[0071]
Prior to each training session, paired rabbits were given artificial cerebrospinal fluid (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO3).₃, 3 mM KCl, 2.4 mM CaCl₂1.3 mM MgSO₄, 1.24 mM NaH₂O₄5 μl of either B6B21 or aCSF alone suspended in 10 mM D-glucose; pH 7.4) were injected on both sides at a rate of 1 μl / min / ventricle. Three concentrations of B6B21 were used: 0.3 μg / μl, 1.0 μg / μl or 3.0 μg / μl. The experimenter was unaware of the contents of the dosing solution. Cannulated rabbits were trained in balanced pairs between the four treatment groups, up to 6 in each group.
[0072]
Trace nictitating membrane conditioning was started immediately after injection. Training was performed at 80 trials / day for 15 days (CS: 6 kHz, 90 dB, 100 ms, 5 ms up / down; UCS; 3.5 psi sound, 150 ms). In order to make the task hippocampus dependent, the trace interval was 500 milliseconds (Moyer et al., 1990, Behav. Neurosci. 104 (2): 243-252). The trials were performed with a variable interval between trials of 30-60 seconds, controlled by an IBM PC-compatible computer system (Akase et al., 1994, J. Neurosci. Method. 54: 119-130; Thompson et al., 1994, J. Neurosci. Meth., 54: 109-117).
[0073]
Data analysis / interpretation
The overall treatment effect is assessed according to the mixed model analysis of variance (ANOVA), using either one-way or two-way ANOVA, depending on the incidence of multiple factors or repeated measures. Suitable pairwise comparisons are performed using Fisher's least significant difference (LSD) test. Accepted statistical significance is p <0.05, and all multiple comparisons are two-tailed.
[0074]
result
To compare behavioral measures based on the dose of antibody B6B21 administered, rabbits were classified into the following groups according to the total amount of B6B21 administered each day: CSF control group, 1.5 μg, 3.0-5. 0 μg and 10.0 to 15.0 μg administration groups. The 1.5 μg B6B21 drug group was not included in the statistical analysis because it consisted of only one subject.
[0075]
The final results showed that B6B21 administration dose-dependently increased the acquisition of trace-conditioned blink reflex in aged rabbits (FIG. 5). Using the same trace conditioning protocol, Thompson et al. (1995, Neurobiol. Aging 747: 382-406) found that 40% of rabbits (n = 50) over 36 months of age reached a CR of 80% within 25 days of training Reported that The remaining 60% of rabbits failed to perform at levels> 30% and were rated "severely disabled". The performance of the aCSF control group (n = 2) in this study was similar to Thompson's "severely injured" rabbit, with one rabbit receiving 1.5 μg B6B21 (low dose group; n = 1, data shown) No) was similar. In this test, none of the rabbits that received 10.0 to 15.0 μg of B6B21 (high dose group; n = 3) reached CR80% within 15 days. However, rabbits receiving 3.0-5.0 μg B6B21 (middle dose group; n = 4) began to show higher gains on day 5 compared to all other groups and were evaluated by the maximum CR achieved. As a result, a higher acquisition was obtained than in the control group (Student's t test: t (4) = 3.34, p ≦ 0.05, see inset in FIG. 5).
[0076]
To assess learning, the average percentage of CR in the last week of training for each group was determined. One-way ANOVA between the control group and the experimental group showed significant differences between group means (F (3,12) = 3.9, p ≦ 0.05, p = 0. 037). Comparison of the Fisher's PLST multiple comparison T test between the control group and the 3.0-5.0 μg administration group showed enhanced learning (P (T ≦ t) one-sided = 0.03, p ≦ 0 .05), but in the higher dose group, the same multiple comparison t-test showed no significant difference in acquisition (P (T ≦ t) one-sided = 0.09).
[0077]
Although the overall number of animals used for statistical analysis is small, these results clearly indicate that mAb B6B21 significantly enhances the acquisition of trace blink conditioning in aged rabbits in a dose-dependent manner. These results indicate that the development of the bioactive B6B21 peptide-like substance was successful as expected.
[0078]
Example 6
Hypothesis example
Behavioral NMDA Specific Activity Assay-Trace Blink in Rats
Approach method
Age-Related Pathology (Bronson, 1990), Genetic Effects on Aging II, Ed. Harrison, DE, Telford Press, Caldwell, New Jersey. F1 hybrids of Fisher 344 x Brown Norwegian rats are used due to minimal age-related impairments in eyeblink conditioning (Weiss and Thompson, 1992, Neurobiol. Aging 13: 319-323). Male rats, 9 months of age and no mating experience, are used for the experiment.
[0079]
Rats are anesthetized by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (65 mg / kg body weight). The head is shaved and disinfected with alcohol and betadine. Use a stereotaxic device with a gas anesthesia adapter and a non-traumatic earbar (to protect the eardrum). The animals are carefully fixed and a midline incision in the scalp is made. Open the periosteal skin, disinfect and dry the skull. A hole is drilled about 0.8 mm behind the anterior crest of the skull and 1.3 mm to the left and right of the midline (head level adjustment). The dura is then penetrated and a 25 gauge cannula is inserted to a depth of 4.0 mm from the cortical surface of each hole (Tonkiss and Rawlins, 1991, Exp. Brain Res. 85: 349-). 358). These guide cannulas are then glued to the skull with dental acrylic resin. Glue the strip coupler in front of the cannula. The connector was a ground wire, two wires implanted subcutaneously in the upper eyelid (Teflon® coated stainless steel) to measure EMG activity, and two wires implanted to shock around the orbit. Including wire. Give a one week recovery period before habituation.
[0080]
Fifteen minutes before a daily training session as described below, rats are infused with the appropriate concentration of peptide or artificial cerebrospinal fluid control medium (aCSF). The solution was injected intracerebroventricularly (icv) at a rate of about 1.0 ml / min using a 30 gauge infusion cannula connected by a PE-10 tube to a 10 ml Hamilton syringe equipped with a CMA Instruments precision infusion pump. inject. A total of about 3.0 ml is injected into each ventricle. The injection cannula remains in place for 2 minutes after injection to aid in diffusion. Use short-term infusion techniques to maintain specific treatment and test intervals. A control group without injection is included to evaluate the effect of the injection treatment itself on performance.
[0081]
Rats are placed in small cages in a sound-attenuated room equipped with speakers and ventilation fans. Next, a cable is connected between the experimental apparatus and the strip coupler embedded in the head. Conditional stimuli are controlled by software running on a PC compatible computer and electronic modules from Coulbourn Instrument (Akase et al., 1994, J. Neurosci. Meth. 54: 119-130). EMG activity is amplified, filtered and full-wave rectified with a time constant of 45 ms (Skelton, 1988, Behav. Neurosci. 102: 586-590). Signals are sent to a computer for data collection and analysis (Thompson et al., 1994, J. Neurosci. Meth. 54: 109-117).
[0082]
Blink conditioning is performed using a modified method reported by Weiss and Thompson (1992, Neurobiol. Aging 13: 319-323). Prior to the training session, the rats are acclimated to the conditioning device in a 45 minute session. Rats are trained in pairs for 15 days each day, either with a trace 500 paradigm or an unmatched control paradigm for sham conditioning. Rats are conditioned with a trace eyeblink using sound-conditioned stimuli (CS, 100 ms, 1 KHz, 85 dB, up-down time 5 ms) and periorbital shock unconditioned stimuli (US, 150 ms, 2 mA AC). In order to make the task hippocampus dependent, the unstimulated trace period was 500 ms (Moyer et al., 1990, Behav. Neurosci. 104 (2): 243-252). Conditioned rats perform 80 trials with matched sounds and shocks at random intervals (ITI) of 30-60 seconds. Control rats undergo 160 trials of either sound alone or shock alone with a random ITI of 15-30 seconds. After the conditioning session, each rat is given a 5-day extinction training consisting of 80 sessions of sound alone trials at an ITI of 30-60 seconds.
[0083]
Histological analysis
After completion of the behavioral test, the rats are sacrificed and prepared for histology. An analysis is performed to determine if repeated injections of the peptide show any signs of excitotoxic damage in HPC. The HPC mass is fixed in 0.1 M phosphate buffer containing 10% formalin and 30% sucrose. Coronal sections are removed and stained with cresyl purple. Staining of the pyramidal cell layer in CA3 and CA1 is evaluated with an image analysis system.
[0084]
Data analysis / interpretation
Data are analyzed by ANOVA (one-way or two-way analysis of variance) at group (conditioned vs. control) x dose (ACSF and 3 doses). Repeated measurements are also analyzed by ANOVA. ANOVA for acquisition will include the 15 levels of ANOVA. ANOVA for erase includes 5 levels. This factorial design results in eight groups of approximately 10 rats per group for reliable statistical analysis.
[0085]
Example 7
Autoradiography test
The peptides of the present invention allow for a detailed study of the distribution of bioactive peptides and / or receptors in brain tissue.
[0086]
Test method
By adapting the autoradiographic method of Bekenstein et al. (1990, Brain Res. 126: 397-425) to the peptides of the invention, the local binding specificity of the hippocampus region of the brain, as well as of other whole tissues, is examined. . Initial tests determine optimal binding conditions with respect to preincubation and washing, drying methods, equilibrium over time, saturation, and pharmacology of binding sites at 23 ° C. Untreated rats are sacrificed, brains are immediately removed, embedded in OCT, frozen in 2-methylbutane at -20 ° C, and sectioned. 10 μm coronal sections are cut on a cryostat and thaw encapsulated on poly-D-lysine coated cover slips. Serial sectioning allows the assessment of joint gradients along the septal-temporal and dorsal-ventral extent of the entire hippocampus. If there is a gradient in binding within a particular hippocampal subregion or cell population (rather than across the whole), special care is taken to limit Scatchard analysis to regions without such a gradient. Adjacent sections are used for Nissel stained histology and quantification of non-specific binding. Individual sections are repeatedly preincubated with 20 mM HEPES buffer (pH 7.4) several times to reduce the concentration of endogenous or exogenous ligand. Tissues were prepared at optimal concentration of the present invention in 20 mM HEPES buffer.³Incubate with H-peptide for various times to determine equilibrium binding for saturation studies. For saturation experiments, brain sections were prepared at various concentrations of the present invention in 20 mM HEPES buffer.³Incubate with H-peptide. Non-specific binding is determined by adding excess non-radioactive peptide.
[0087]
Analysis / interpretation
Tissue section³For H-Ultrofilm (Amersham), co-expose with methacrylate embedded tritium standard as needed for linear exposure of film. BioRad's Phosphorimage analyzer can be used for these tests. Quantitative densitometric analysis is performed on a Macintosh IIfx workstation with an 8-bit grayscale scanner and public domain image analysis software (Image® v. 1.29) developed at NIMH.
[0088]
Example 8
Treatment of hypoxia with NT-13
The present invention relates to the treatment or prevention of conditions leading to a lack of oxygen in the brain. As used herein, the term “hypoxia” relates to a lack of oxygen reaching body tissues. Similarly, "ischemia" refers to any condition associated with insufficient flow of oxygen-rich blood to a body part. Hypoxia and ischemia can occur at any time when blood flow to tissues drops below a critical level. This reduced blood flow can be due to the following non-limiting conditions: (i) blockage of blood vessels by embolism (blood clot); (ii) blockage of blood vessels by atherosclerosis; (iii) damage of blood vessels ( (Iv) hemorrhagic stroke); (iv) blockage of blood vessels by vasoconstriction, such as occurs during vasospasm and possibly during transient ischemic attack (TIA), and after subarachnoid hemorrhage. Hypoxia and other conditions in which ischemia can occur include (i) myocardial infarction (if the heart stops, blood flow to organs will decrease and ischemia will occur); (ii) trauma; and (iii) ) Heart and neurosurgery, where blood flow needs to be reduced or stopped to achieve surgical goals. The effects of hypoxia or ischemia in the central nervous system can include temporary or permanent loss of function and neuronal loss. The present invention provides peptide and amino acid compositions for treating hypoxia and ischemia and the effects of hypoxia or ischemia on the central nervous system.
[0089]
As shown in FIG. 6, peptide NT-13 is useful for treating hypoxia. A gerbil model was used to demonstrate the effectiveness of NT-13 for cell survival in the hippocampus after exposure to hypoxia. Test animals are pretreated (15 minutes prior to carotid artery clamping, below) by intraventricular administration of carrier alone (ie, saline), MK-801 or a pharmaceutical composition containing the indicated concentration of NT-13 peptide. Referenced. The gerbil's carotid artery was then clamped for 30 minutes to temporarily disrupt blood flow to the animal's brain, thereby inducing hypoxia. Twenty-four hours later, vehicle alone (ie, saline), MK-801 or the indicated concentration of NT-13 peptide was administered 30 minutes prior to sacrifice. The animals were then sacrificed and sections of the CA1 area of the hippocampus were stained for cell viability using vital staining. As shown in FIG. 6, the saline control had no effect on cellular hypoxia. Cells survived hypoxia due to MK-801. Dose-dependent survival was observed after administration of the 1 mg / kg and 2 mg / kg doses of NT-13. Thus, the NT-13 peptide is useful for treating conditions caused by hypoxia. The foregoing methods are also applicable to other NT peptides and polypeptides provided herein (i.e., SEQ ID NOs: 1-12 and 14-17).
[0090]
It will be understood that the foregoing specification and examples are illustrative and not restrictive. Those skilled in the art will appreciate and appreciate from the present disclosure that other specific embodiments may also be within the spirit and scope of the present invention.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows pharmacological NMDA-specific functions³FIG. 3 shows three graphs comparing test results for NMDA receptor binding glycine agonists using the HMK-801 binding assay. FIG. 1A shows the activity of D-cycloserine, 1B shows the activity of monoclonal antibody B6B21, and 1C shows the activity of peptide NT-3. The results show the concentration of the test component in the presence of the selective glycine site agonist 7-chlorokynurenic acid versus the concentration of the test component.³Plotted as percentage of HMK-801 control binding.
FIG. 2³FIG. 10 shows the test results of peptide NT-3 as a partial agonist in a pharmacological NMDA-specific function assay assayed by HMK-801 binding.
FIG. 3 shows the results of a voltage clamp experiment in an oocyte expression system, ie, the test results of peptide NT-13 as a partial agonist in an electrophysiological NMDA-specific function assay. FIG. 3A shows the dose-dependent effect of NT-13 on NMDA current from voltage clamp experiments. Figures 3B-D show that peptide NT-13 has the characteristics of a partial glycine agonist. FIG. 3B shows that the effect of NT-13 is similar to that of glycine, but not as effective. FIG. 3C shows that NT-13 inhibits normal NMDA + glycine current. FIG. 3D shows that NT-13-induced NMDA current is blocked by the selective glycine site antagonist 7-chlorokynurenic acid.
FIG. 4 shows the test results of peptide NT-3 as a partial agonist in a behavioral NMDA-specific functional assay compared to cerebrospinal fluid control (CSF) and mAb B6B21. FIG. 4 shows the reduced latency for swimming to the underwater platform (FIG. 4A), the path to the platform (FIG. 4B), and the average to target during probe trial on day 8 of training in the Morris water maze task. It shows that peptide NT-13 caused some cognitive enhancement as assessed by distance shortening (FIG. 4C).
FIG. 5 shows the results of blink conditioning after treatment with mAb B6B21 in aged rabbits. The inset shows the acquired data as the maximum CR obtained.
FIG. 6 shows the effect of NT-13 on hypothalamus in hypoxic gerbils.

Claims (9)

ペプチドまたはアミノ酸組成物の有効量を投与する段階を含む、低酸素症を治療する方法であって、該ペプチドまたはアミノ酸組成物が

からなる群より選択されるペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む方法。A method of treating hypoxia comprising administering an effective amount of a peptide or amino acid composition, wherein the peptide or amino acid composition comprises

A method comprising a peptide selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable excipient. ペプチドが

である、請求項１に記載の方法。Peptide

The method of claim 1, wherein ペプチドが環状化されている、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the peptide is cyclized. ペプチドが置換アミノ酸残基を含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the peptide comprises a substituted amino acid residue. 置換アミノ酸残基が保存的に置換されている、請求項４に記載の方法。5. The method of claim 4, wherein the substituted amino acid residue is conservatively substituted.

からなる群より選択されるペプチドをコードするＤＮＡ分子。

A DNA molecule encoding a peptide selected from the group consisting of:

からなる群より選択されるペプチドの、低酸素症治療のための医薬品製造における使用。

Use of a peptide selected from the group consisting of in the manufacture of a medicament for treating hypoxia. 中枢神経系に対する低酸素症の影響を治療する方法であって、治療を必要としている哺乳動物に、

からなる群より選択されるペプチドと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物の有効量を投与する段階を含む方法。A method of treating the effects of hypoxia on the central nervous system, wherein the mammal in need of treatment is:

Administering an effective amount of a composition comprising a peptide selected from the group consisting of: and a pharmaceutically acceptable excipient. ペプチドが

である、請求項８に記載の方法。Peptide

The method of claim 8, wherein

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