【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、サイトカインを誘導する炎症性疾患治療剤、及び、炎症性疾患治療用具に関する。
【０００２】
【従来の技術】
リウマチのような炎症性疾患の治療薬としては、アスピリン（非特許文献１）やインドメタシン（非特許文献２）等の非ステロイド性抗炎症剤、及び、プレドニゾロン等のステロイド性抗炎症剤が有効である。
【０００３】
しかしながら、ステロイド性抗炎症剤は優れた臨床効果を示す反面、感染防御機能の低下、消化管障害、下垂体副腎皮質機能の抑制、骨形成の低下等の副作用の点で問題があった。また、非ステロイド性抗炎症剤は、ステロイド性抗炎症剤に比べて安全性が高いと考えられるものの、臨床効果が弱いという問題点があった。
【０００４】
一方、従来、サイトカインの活性を生体内で惹起して疾患を治療するサイトカイン誘導療法が知られている。
サイトカインとは、多種多様な細胞間情報伝達因子の総称であり、生体内で様々な活性を有し、様々な疾患に関与していることが知られている。
サイトカインとしては、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン１〜インターロイキン２７、腫瘍壊死因子−α（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子−β（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ−β）、トランスフォーミング増殖因子−α（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ−β）、及び、各種細胞増殖因子等が挙げられる（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。
【０００５】
このサイトカイン誘導療法では、患者に、サイトカイン誘導剤を投与し、生体内においてサイトカインの誘導を引き起こす。
サイトカイン誘導療法に用いられるサイトカイン誘導物質としては、様々な物質が知られており、例えば、微生物由来のＯＫ−４３２、ＢＣＧ、ベスタチン、丸山ワクチン、又は、ロムリチド等が知られており、担子菌類由来のサイトカイン誘導物質として、クレスチン、レンチナン、又は、シゾフィラン等が知られている。
【０００６】
なお、特許文献１には、不溶性担体に刺激剤が共有結合されている悪性腫瘍治療用白血球刺激材が記載されている。また、特許文献２には、インターロイキン１、ＯＫ−４３２、遺伝子組み換えインターロイキン２、又は、γ−インターフェロンを不溶性担体に共有結合で結合してなる癌治療用白血球刺激材が記載されている。しかしながら、これらは腫瘍障害性細胞を誘導するものであり、これらの先行技術文献にはサイトカイン誘導や抗炎症作用については全く述べられていない。
【０００７】
【特許文献１】
特開昭６０−１２０８２１号公報
【特許文献２】
特開昭６１−２７７６２８号公報
【非特許文献１】
「日経サイエンス」、１９９１年、第３号、ｐ７０
【非特許文献２】
「Ｔｈｅｒ． Ｒｅｓ．， 」、１９８５年、第３巻、ｐ１０５７
【非特許文献３】
「臨床免疫」、科学評論社、１９９５年、第２７巻特別増刊号「サイトカインのすべて」
【非特許文献４】
「臨床免疫」、２００１年、第３６巻、ｐ３９−４４、
【非特許文献５】
「臨床免疫」、２００３年、第３９巻、ｐ１８９−２００
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、従来の炎症性疾患治療剤に比べて、抗炎症作用をより効果的に発揮することができ、かつ、副作用の少ない炎症性疾患治療剤、及び、炎症性疾患治療用具を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、サイトカイン誘導剤と、水に不溶性の担体とを併用してなる炎症性疾患治療剤、及び、炎症性疾患治療用具が、著しく高い抗炎症作用を示すことを見いだし、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、サイトカイン誘導剤と、水に不溶性の担体とを含有する炎症性疾患治療剤である。
以下に本発明を詳述する。
【００１１】
本発明の炎症性疾患治療剤は、サイトカイン誘導剤、及び、水に不溶性の担体を含有する。
上記サイトカイン誘導剤としては特に限定されず、それ自体のみではサイトカイン誘導活性を充分に発揮し得ず、水に不溶性の担体と併用されることにより、サイトカイン誘導活性を発揮するものであってもよい。したがって、上記サイトカイン誘導剤としては、従来用いられているサイトカイン誘導物質だけでなく、様々な物質を用いることができ、例えば、ＢＣＧ、ＢＣＧ−ＣＷＳ、ＰＰＤ、Ｎｏｃａｒｄｉａ−ＣＷＳ、ＯＫ−４３２、Ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄｅ等の細菌類及びその成分；ＰＳＫ、レンチナン、シゾフィラン等の多糖類；ポリＩ：Ｃ、ポリＡ：Ｕ等の高分子；Ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ、ＤＮＣＢ、Ａｚｉｍｅｘｏｎ、Ｔｉｌｏｒｏｎｅ、Ｂｅｓｔａｔｉｎ等の化学物質等の生理活性物質だけでなく、菌体、菌体成分、ペプチド類、核酸類、蛋白質、糖成分、脂質等を用いることができる。なかでも、菌体及び／又は菌体由来成分が好適に用いられる。
【００１２】
上記菌体及び／又は菌体由来成分としては特に限定されないが、例えば、抗酸菌及び／又は抗酸菌由来成分、溶連菌及び／又は溶連菌由来成分、放線菌及び／又は放線菌由来成分等が好ましい。
上記抗酸菌及び／又は抗酸菌由来成分としては特に限定されないが、例えば、結核菌及び／又は結核菌由来成分、牛型結核菌弱毒株であるＢＣＧ及び／及びＢＣＧ由来成分等が特に好ましい。
【００１３】
上記サイトカイン誘導剤により誘導されるサイトカインとしては特に限定されないが、例えば、インターフェロンγ、インターロイキン２、インターロイキン１０、インターロイキン１２、腫瘍壊死因子−α、及び、トランスフォーミング増殖因子−βからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００１４】
上記担体としては水に不溶性であれば特に限定されず、例えば、金属、有機物又は無機物等により構成され、好ましくは有機物、より好ましくは高分子材料からなる。また、上記担体は、サントカイン誘導剤のサイトカイン誘導作用を増強する誘導増強剤であることが好ましく、なかでも、ＩＦＮ−γを誘導増強するものであることがより好ましい。
【００１５】
上記金属としては、例えば、金、金合金、銀、銀合金、チタン、チタン合金、ステンレス等が挙げられる。
上記無機物としては、例えば、活性炭、ガラス、ガラスの誘導体、シリカ系組成物、アルミナ、ヒドロキシアパタイト等が挙げられる。
【００１６】
上記有機物、上記高分子材料としては、例えば、セルロース系、アガロース系、デキストラン系、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエチレンテレフタレート系、ナイロン系、ポリビニルアルコール系、ポリスルホン系、ポリアミド系、ポリアクリロニトリル系、ポリエチレン系、ポリウレタン系、ポリプロピレン系、ポリエステル系等の材料が挙げられる。なかでも、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系、及び、ポリビニルアルコール系の各高分子材料が特に好ましい。
【００１７】
上記ポリスチレン系の材料としては特に限定されず、例えば、ジビニルベンゼン−スチレン共重合体等が挙げられる。
上記アクリルエステル系の材料としては特に限定されず、例えば、ポリメチルメタクリレート又はポリヒドロキシエチルメタクリレート等が挙げられる。
上記セルロース系の材料としては特に限定されず、例えば、酢酸セルロース等が挙げられる。
【００１８】
上記担体は、水に不溶性であり、無極性、疎水性である。特にサイトカイン誘導剤を物理吸着法によって担体に固定化する場合には、イオン交換性官能基や親水性官能基を有さず、表面の疎水性が強いものであることが好ましい。なかでも、イオン交換性官能基や親水性官能基を有さない、ポリスチレン系の高分子材料からなることがより好ましく、ジビニルベンゼン等の架橋剤を用いてなるポリスチレン系の高分子材料からなることが特に好ましい。
また、上記担体には、表面修飾や表面コーティング等により、表面に親水性を付与してもよい。
【００１９】
上記担体は、白血球を吸着する材料であることが好ましい。
上記白血球を吸着する材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系、ポリビニルアルコール系の各高分子材料、及び、ガラス系の材料等が挙げられる。
【００２０】
上記担体の形状としては特に限定されず、例えば、繊維状、不織布状、スポンジ状、粒子状、膜状、中空糸状等が挙げられる。
上記担体の大きさとしては特に限定されないが、例えば、その形状が粒子状である場合には、直径の好ましい下限は５０μｍ、好ましい上限は２ｍｍであり、繊維状である場合には、繊維径の好ましい上限は１０μｍ、より好ましい上限は５μｍである。
上記担体が繊維状である場合は不織布からなることが好ましく、繊維径は３μｍ以下であることが好ましい。
【００２１】
上記担体は、多孔性であることが好ましく、多孔性高分子材料からなることがより好ましい。上記担体の表面積としては、４００ｍ２／ｇ以上であることが好ましく、細孔容積としては、０．５ｍＬ／ｇ以上であることが好ましく、平均細孔径としては、下限が２０Å、上限が８００Åであることが好ましい。
【００２２】
上記多孔性高分子材料を大別すると標準的なゲル構造をもつゲル型と、巨大網目構造（Ｍａｃｒｏ ｒｅｔｉｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）をもつＭＲ型とに分けられる。単にスチレンとジビニルベンゼンのような架橋剤を用いて重合して得られた多孔性樹脂等は透明に近く、ゲル構造を呈するのでゲル型多孔性樹脂と呼ばれる。一方、特殊な重合法、例えば、懸濁重合の際に、水に不溶でモノマーだけを溶かすことのできる特殊な有機溶剤を使用する方法により、粒子の内部奥にまで大きな孔（マクロポア）をもった粒子を作製することができ、このような物理的に多孔性の樹脂は、ＭＲ型又はポーラス型多孔性樹脂と呼ばれる。
【００２３】
粒子状の多孔性高分子材料としては、例えば、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂、合成吸着剤の他、キレート樹脂等からなるものが挙げられる。これらの多孔性粒子は公知の方法によって得ることができ、例えば、原料モノマーをゼラチン等の適当な懸濁安定剤を用いて水中で懸濁重合することにより球状の重合体として製造される。上記原料モノマーとしては、スチレン、ビニルトルエン、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、アクリロニトリル等のエチレン性二重結合を有する化合物等が用いられ、これにジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート等の多官能性モノマーである架橋剤を加え、多孔化剤の存在下過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチルニトリル等の重合開始剤を用いて架橋重合体を得る。上記多孔性粒子のうち市販されているものとしては、例えば、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標）、ロームアンドハース社製アンバーライト等、ダウケミカル製ダウエックス等が挙げられる。
【００２４】
上記担体は、巨大網目構造を有する多孔性高分子材料からなることがより好ましい。上記巨大網目構造の細孔分布としては、下限が２Å、上限が２０００Åであることが好ましく、より好ましい上限は３００Åである。
【００２５】
上記担体は、表面に粗化処理が施されていることが好ましい。
上記担体の表面の中心線平均粗さＲａ値は、下限が０．２μｍ、上限が１０μｍであることが好ましい。上記担体の表面にＲａ値が０．２μｍ以上の粗さを付与することにより、著しくサイトカインの誘導が増強される。また、この表面粗さのサイトカイン誘導増強作用は、白血球の大きさが１０〜２０μｍであり、白血球に比べて上記Ｒａ値が非常に小さいことを考えると、単なる接触表面積の増大によるものでないと考えられる。
ここで、上記中心線平均粗さＲａ値とは、ＪＩＳ Ｂ０６０１に基づく中心線平均粗さである。
【００２６】
更に、上記担体の表面の凹凸平均間隔Ｓｍ値は、下限が５μｍ、上限が２００μｍであることが好ましい。
ここで、上記凸凹平均間隔Ｓｍ値は、以下のようにして定義される値である。
【００２７】
まず、図１に示す粗さ曲線Ａの中心線Ｂに対して、それぞれ、一定の高さ及び深さの位置に上側カウントレベルＣ及び下側カウントレベルＤを引く。次に、下側のカウントレベルＤと粗さ曲線Ａとが交差する２点間において、上側カウントレベルと粗さ曲線とが交差する点が一つ以上存在するときに、一つの山として「山」を定義する。
そして、凹凸平均間隔Ｓｍ値は、図２に示すように、基準長さＬの間に含まれる山の間隔をＳｍｉとしたときに、下記式（１）で定義される値である。
【００２８】
【数１】
【００２９】
すなわち、凹凸平均間隔Ｓｍ値とは、基準長さＬの間に含まれる各山の間隔の平均値を示す。このようにして、凹凸平均間隔Ｓｍ値により、表面における凸凹の面方向の分布状態が定義される。
【００３０】
現在のＪＩＳ規格では、表面粗さの高さ方向の情報については規定されているが、面方向の情報に関しては規定されていない。しかしながら、本発明における表面粗さは、凸凹の面方向における間隔によっても特徴付けられるものである。
【００３１】
上記担体の表面粗さは材料の多孔性等に由来するものであっても良く、その場合、上記担体に好適に用いられる多孔性高分子材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系、ポリビニルアルコール系等の高分子材料が挙げられる。
【００３２】
上記担体の表面粗さは材料の繊維形状に由来するものであっても良く、その場合、上記担体としては、繊維状又は不織布状材料からなるものが好ましい。上記繊維状材料又は不織布状材料としては、例えば、ポリスチレン系、アクリルエステル系、ポリエステル系、ナイロン系、セルロース系、ポリビニルアルコール系等の高分子材料からなるものが挙げられる。
【００３３】
上記サイトカイン誘導剤は、上記担体に固定化されていることが好ましい。
上記サイトカイン誘導剤を上記担体の表面に固定化するには、物理吸着、共有結合、イオン結合等の公知の方法を用いることができる。
また、共有結合等による場合には、必要に応じて、上記サイトカイン誘導剤と上記担体との結合部に任意の長さをもつスペーサーを導入することが好ましい。
【００３４】
上記サイトカイン誘導剤が菌体等である場合は、必要に応じて、固定化する前に菌体の洗浄操作や破砕操作、成分分画操作等のさまざまな前処理を施してもよい。また、上記サイトカイン誘導剤が生菌等である場合は、より安全性を高めるために必要に応じて、固定化する前、固定化と同時、固定化の後のいずれの時点でも、加熱処理・薬品処理・放射線処理・ガス滅菌処理等のさまざまな方法により死菌化してもよい。上記加熱処理としては、例えば、オートクレーブ処理が挙げられ、上記薬品処理としては、例えば、グルタルアルデヒド処理、ホルマリン処理、又は、エタノール処理が挙げられ、上記放射線処理としては、例えば、γ線処理が挙げられ、上記ガス滅菌処理としては、エチレンオキサイドガス処理等が挙げられる。なかでも、タンパク質変性作用を有する処理が好ましく、例えば、グルタルアルデヒド、ホルマリン、エタノール等の各種溶剤や界面活性剤等のタンパク質変性作用を有する薬剤を用いた薬品処理、水溶液中での加熱処理等が挙げられ、ホルマリンを用いた薬品処理が特に好ましい。
【００３５】
上記サイトカイン誘導剤がＢＣＧのような微生物である場合は、菌体表面外壁成分のアミノ酸や糖成分等を介して、上記担体のカルボキシル基、アミノ基及び／又はエポキシ基等の官能基に結合させることができる。この際、必要に応じてさまざまな鎖長や構造のスペーサーを導入することもできる。
【００３６】
上記サイトカイン誘導剤がＢＣＧのような菌体外層が脂質等により覆われている微生物である場合には、必要に応じて脂質を洗浄除去した後、上記担体の官能基に結合してもよい。
【００３７】
上記サイトカイン誘導剤を上記担体に固定化する方法としては、物理吸着法が好ましい。例えば、上記担体が疎水性表面を有し、上記サイトカイン誘導剤がＢＣＧである場合、物理吸着作用によって固定化することができる。また、上記サイトカイン誘導剤が微生物やその成分であり、その表面が電荷を帯びている場合にも、その対極電荷を表面に有する担体に物理吸着作用によって固定化することができる。
【００３８】
上記サイトカイン誘導剤の使用割合としては特に限定されないが、例えば、ＢＣＧである場合には、血液に添加される濃度として、乾燥重量で下限は０．００１ｍｇ／ｍＬ、上限は１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。また、上記サイトカイン誘導剤がＯＫ−４３２である場合には、血液に添加される濃度として、下限は０．０００１ＫＥ／ｍＬ、上限は１０ＫＥ／ｍＬであることが好ましい。
【００３９】
上記担体の使用割合としては特に限定されないが、粒子状の担体を用いる場合には、血液容積に対する担体のかさ体積量として、下限は０．０２％、上限は８０％程度であり、好ましい下限は０．１％、好ましい上限は５０％程度である。
【００４０】
本発明の炎症性疾患治療剤を容器内に収納することにより炎症性疾患治療用具を作製することができる。容器と、容器内に収納された本発明の炎症性疾患治療剤とを有する炎症性疾患治療用具も本発明の１つである。
【００４１】
本発明の炎症性疾患治療用具では、容器内にて、本発明の炎症性疾患治療剤と、血液又は血液成分とを接触させることによって、血液又は血液成分等の中で抗炎症活性を示すサイトカインを効果的に誘導することができる。この場合、接触温度を下限は１５℃、上限は４２℃の範囲とすることが好ましく、それによって、抗炎症活性を示すサイトカインをより効果的に誘導することができる。
なお、上記サイトカイン誘導剤及び上記担体は、予め混合されて血液と接触してもよく、又は、個別に血液若しくは血液成分等と接触してもよい。
【００４２】
本発明の炎症性疾患治療用具を構成する容器の構造は特に限定されないが、図３に模式的に示すように、血液等の導入部１と、本発明の炎症性疾患治療剤と接触した血液４等を容器外に導く導出部２とが備えられている容器３が好ましい。
上記容器としては、カラム状の容器や血液バッグ状の容器等がより好ましい。血液バッグ状の容器等を用いれば、体外循環装置のような大がかりなシステムを必要とせず、ベッドサイドで比較的簡便に本発明の炎症性疾患治療剤を投与することができ、有用であると考えられる。
【００４３】
上記血液バッグ状の容器等の容量としては下限は５０ｍＬ、上限は１０００ｍＬであることが好ましく、より好ましい下限は１００ｍＬ、より好ましい上限は４００ｍＬである。
【００４４】
また、上記容器には、本発明の炎症性疾患治療剤と接触させた血液等を容器外に導く場合に、本発明の炎症性疾患治療剤が血液に混入しないような炎症性患治療剤流出防止機構が備えられていることが好ましい。
図３に模式的に示すように、炎症性患治療剤流出防止機構５は、本発明の炎症性疾患治療剤があらかじめ脱離しないように、容器内部に固定化されていても良く、このような場合の炎症性患治療剤流出防止機構としては、例えば、流出防止用の分離膜や分離フィルター等が挙げられる。また、その他の炎症性患治療剤流出防止機構としては、例えば、遠心操作等によって血液と分離する機構等が挙げられる。
【００４５】
本発明の炎症性疾患治療剤及び本発明の炎症性疾患治療用具の使用方法としては、例えば、導入部と導出部を有する血液バッグ状の容器に導入部から本発明の炎症性疾患治療剤を充填し、更に、炎症性疾患患者の血液又は血液成分を注入し、本発明の炎症性疾患治療剤と血液又は血液成分とを接触させて、サイトカインを誘導し、次いで、抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液又は血液成分を導出部から取り出し、点滴投与等により患者体内に戻す方法等が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の炎症性疾患治療剤及び本発明の炎症性疾患治療用具の使用に際しては、上記抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液又は血液成分を凍結保存しておき、必要に応じて融解して炎症性疾患患者に投与することにより有効な治療を行うこともでき、例えば、予め凍結しておいた抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された患者自身の血液又は血液成分を全身又は局所に投与し、治療する方法が可能となる。
この治療方法では、抗炎症効果を示す高濃度のサイトカインを含む血液又は血液成分を炎症性疾患患者の体内に戻すことにより、炎症性疾患患者の体内に患者由来のサイトカインが投与されることになり、有効な治療効果が発揮される。
また、必要に応じて、この治療方法では、抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液から、血液構成成分の一部、例えば、血漿や血清成分だけを取り出し、それを患者に戻してもよい。この際、抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液から取り出した血液構成成分の一部を通常の血液バッグに移し、直後に、患者に戻してもよく、又は、凍結等の手段で保存後に、患者に戻してもよい。なお、抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液から得た血漿等を患者に投与する際には、上述したように、全身投与であっても、局所投与であってもよい。
【００４７】
また、この治療方法では、抗炎症効果を示すサイトカインが誘導された血液又は血液成分のみを用いてもよいが、他の抗炎症性疾患治療剤を併用することが好ましい。本発明の炎症性疾患治療用具を用いて得られる血液又は血液成分と上記他の抗炎症性疾患治療剤とを併用することにより、相互の抗炎症効果が増強されるため、安全な用量で治療効果を著しく増強することができる。
上記他の抗炎症性疾患治療剤の投与法としては特に限定されず、例えば、静脈注射、内服等の投与法も可能である。
【００４８】
また、本発明の炎症性疾患治療用具では、本発明の炎症性疾患治療剤により、血液又は血液成分等に限らず、骨髄系細胞、表皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞、骨芽細胞、血液幹細胞、胚性幹細胞等の組織から採取した細胞、培養細胞、株化細胞等の様々な細胞からも抗炎症活性を示すサイトカインを誘導することができる。
【００４９】
本発明の治療対象となる疾患としては、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、鼻炎、結膜炎、花粉症、食品アレルギー、アレルギー性肺疾患、アナフィラキシーショック、じんま疹、腎炎、肝炎、甲状腺炎、薬物アレルギー、接触性皮膚炎、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、強皮症、皮膚筋炎、重力筋無力症、慢性関節リウマチ等の関節炎等の炎症性疾患が挙げられる。
【００５０】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）
担体１（オルガノ社製、商品名：アンバーライトＸＡＤ４、多孔性ポリスチレン粒子、ＭＲ型、細孔分布２〜１５０Å、表面積７００ｍ２／ｇ以上、細孔容積０．５ｍＬ／ｇ以上、平均細孔径約１２０Å）を、精製水（大塚製薬社製）を用いてデカンテーションし、次いで、メタノール（和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）を用いてデカンテーションし、最後に、注射用生理食塩水（大塚製薬社製）を用いてデカンテーションし、洗浄した。その後、粒子かさ体積で１００μＬの担体１を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（コーニング社製）に添加した。
【００５２】
ウィスタールイスラット（日本ＳＬＣ、８週齢）を頸椎脱臼し、できるだけ無菌的に脾臓を取り出し、ＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ社製）培地にて脾臓細胞浮遊液を作製した。この細胞浮遊液を遠心（１３００ｒｐｍ、１０分間、室温）し、沈査に５ｍＬの０．８３％塩化アンモニウム−０．１７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を加え溶血させた。培養用ＲＰＭＩ１６４０培地［２％ＦＣＳ（フナコシ社製、ＨｉｇｈＣｌｏｎｅシリーズ）、０．０５ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０Ｕ／ｍＬペニシリン含有］を約４５ｍＬ加えて溶血反応を止め、遠心洗浄を行い、最後に培養用培地１０ｍＬに細胞を再浮遊し、トリパンブルーを用いて生細胞のカウントを行い、細胞濃度を５×１０６個／ｍＬに調製した。
【００５３】
ＢＣＧワクチン（日本ビーシージー製造社製）の１２ｍｇ入りアンプルに２４０μＬの注射用生理食塩水を添加して５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を作製した。この５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を３４．６ｍｇ／ｍＬグルタミン酸ナトリウム１水和物含有生理食塩水にて希釈し、濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＢＣＧ希釈液を作製した。このＢＣＧ希釈液を１００倍希釈されるように細胞に添加して濃度０．０５５ｍｇ／ｍＬのＢＣＧ刺激用細胞浮遊液を作製した。このＢＣＧ添加細胞浮遊液１．５ｍＬを担体１が添加された２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（コーニング社製）のｗｅｌｌに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。（参考文献：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９５年、１５５、ｐ．５７２８− ５７３５）
【００５４】
４４時間培養後の各ｗｅｌｌから培養上清を滅菌済み１．５ｍＬ用チューブ（エッペンドルフ社製）に回収し、１５０００ｒｐｍにて４℃、１０分間の遠心操作を行い、上清を新しい滅菌済み１．５ｍＬ用チューブに回収した。これを−７０℃にて凍結保存し、翌日融解し、１５０００ｒｐｍにて４℃、５分間の遠心操作を行い、０．２２μｍの濾過フィルターで濾過した上清を下記の方法でラットに投与した。また、上清のサイトカイン誘導作用を確認するために、上清中のＩＦＮ−γ濃度をＥＮＤＯＧＥＮ社製ＥＬＩＳＡキットにて測定した。
【００５５】
（比較例１）
担体１を添加しなかったこと、及び、ＢＣＧワクチンを添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして行った。
【００５６】
（比較例２）
担体１を添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして行った。
【００５７】
（比較例３）
ＢＣＧワクチンを添加しなかったこと以外は、実施例１と同様にして行った。
【００５８】
（抗炎症効果の試験）
＜ラットアジュバント関節炎に対する作用＞
被検物質として、実施例１及び比較例１〜３で得られた上清を用い供試液とした。被検動物としては体重１２０〜２００ｇのウィスタールイスラットを用いた。
【００５９】
流動パラフィンに懸濁したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ３７ＲＡ（６ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬをラット右後肢皮下に注射して、関節炎を誘発した。
なお、ラットの右後肢の腫れの度合いを調べるため、関節炎誘発前後にラットの右後肢の容積をＰｌｅｔｈｙｓｍｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ社製）を用いて測定し、関節炎誘発前の容積と関節炎誘発後２１日目の容積との差を足蹠浮腫容積とした。
【００６０】
実施例１で得られたサイトカインを誘導増強された上清又は比較例１〜３で得られた上清を用いた供試液（５ｍＬ／ｋｇ／ｄａｙ）を、それぞれ関節炎を誘発した５匹のラットの群に、誘発後０日、４日、７日、１１日、１４日、１８日後の合計６回静脈内投与した。本試験では、これらラットについて得られた値の平均値を腫れの度合いの評価に用いた。この試験結果を表１に示した。
【００６１】
【表１】
【００６２】
表１に示したように、実施例１で得られたサイトカインを誘導増強された上清を投与した群では、比較例１〜３で得られた上清を投与した群に比べて、右後肢足蹠の腫れの度合いが明らかに抑制された。すなわち、本発明の炎症性疾患治療剤によってサイトカインを誘導増強された上清は、顕著な炎症抑制活性を有することが分かった。
【００６３】
【発明の効果】
本発明は、上述の構成よりなるので、本発明の炎症性疾患治療剤を、例えば、生体由来の細胞、血液又は血液成分と接触させることにより、従来の炎症性疾患治療剤に比べて、抗炎症作用をより効果的に誘導することができ、かつ、副作用を少なくすることができ、本発明の炎症性疾患治療剤、及び、炎症性疾患治療用具は、サイトカインの誘導が有効である様々な炎症性疾患の治療に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】表面粗さを説明するための模式図であり、凹凸の「山」を説明するための図である。
【図２】表面粗さにおける凹凸平均間隔Ｓｍ値を説明するための図である。
【図３】本発明の炎症性疾患治療用具の一例を示す模式的断面図である。
【符号の説明】
１ 導入部
２ 導出部
３ 容器
４ 本発明の炎症性患治療剤と接触した血液
５ 炎症性患治療剤流出防止機構[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory diseases that induces cytokines, and a device for treating inflammatory diseases.
[0002]
[Prior art]
Non-steroidal anti-inflammatory agents such as aspirin (Non-patent Document 1) and indomethacin (Non-patent Document 2) and steroidal anti-inflammatory agents such as prednisolone are effective as therapeutic agents for inflammatory diseases such as rheumatism. is there.
[0003]
However, steroidal anti-inflammatory agents have excellent clinical effects, but have problems in terms of side effects such as a reduction in infection defense function, digestive tract disorders, suppression of pituitary adrenal cortex function, and bone formation. In addition, although non-steroidal anti-inflammatory agents are considered to be safer than steroidal anti-inflammatory agents, there is a problem that clinical effects are weak.
[0004]
On the other hand, cytokine induction therapy is known in which cytokine activity is induced in vivo to treat a disease.
Cytokines are a general term for a wide variety of intercellular signal transduction factors, and are known to have various activities in vivo and to be involved in various diseases.
Examples of cytokines include interferon α, interferon β, interferon γ (IFN-γ), interleukin 1 to interleukin 27, tumor necrosis factor-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α), and tumor necrosis factor-β. (Tumor Necrosis Factor-β), Transforming Growth Factor-α (Transforming Growth Factor-α), Transforming Growth Factor-β (Transforming Growth Factor-β, TGF-β), and various cell growth factors. (Non-patent document 3, Non-patent document 4, Non-patent document 5).
[0005]
In this cytokine induction therapy, a cytokine inducer is administered to a patient to induce the cytokine in vivo.
Various substances are known as cytokine inducers used for cytokine induction therapy, for example, microorganism-derived OK-432, BCG, bestatin, Maruyama vaccine, or Romlitide are known, and derived from basidiomycetes As a cytokine inducer, krestin, lentinan, schizophyllan and the like are known.
[0006]
Patent Document 1 describes a leukocyte stimulating material for malignant tumor treatment in which a stimulant is covalently bonded to an insoluble carrier. Patent Document 2 describes a leukocyte stimulating agent for cancer treatment, which is formed by covalently binding interleukin 1, OK-432, gene recombinant interleukin 2, or γ-interferon to an insoluble carrier. However, these induce tumor-damaging cells, and these prior art documents do not describe cytokine induction or anti-inflammatory action at all.
[0007]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Laid-Open No. 60-120821 [Patent Document 2]
JP 61-277628 A [Non-patent Document 1]
"Nikkei Science", 1991, No. 3, p70
[Non-Patent Document 2]
“Ther. Res.,” 1985, Vol. 3, p1057.
[Non-Patent Document 3]
“Clinical Immunity”, Science Review, 1995, Volume 27 Special Issue “All About Cytokines”
[Non-Patent Document 4]
"Clinical Immunity", 2001, 36, p39-44,
[Non-Patent Document 5]
“Clinical Immunity”, 2003, Vol. 39, p189-200
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the above-mentioned present situation, the present invention can exhibit an anti-inflammatory action more effectively than conventional inflammatory disease therapeutic agents and has few side effects, and inflammatory diseases. An object is to provide a therapeutic device.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies, the present inventors have found that an inflammatory disease therapeutic agent and a inflammatory disease treatment tool comprising a cytokine inducer and a water-insoluble carrier in combination exhibit a remarkably high anti-inflammatory effect. As a result, the present invention has been completed.
[0010]
That is, the present invention is an inflammatory disease therapeutic agent comprising a cytokine inducer and a water-insoluble carrier.
The present invention is described in detail below.
[0011]
The therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention contains a cytokine-inducing agent and a water-insoluble carrier.
The cytokine-inducing agent is not particularly limited and may not exhibit cytokine-inducing activity sufficiently by itself, and may exhibit cytokine-inducing activity when used in combination with a water-insoluble carrier. . Therefore, as the cytokine inducer, not only a conventionally used cytokine inducer but also various substances can be used, for example, BCG, BCG-CWS, PPD, Nocardia-CWS, OK-432, Muramyldipeptide, etc. Bacteria and its components; polysaccharides such as PSK, lentinan, and schizophyllan; polymers such as poly I: C, poly A: U; and only biologically active substances such as chemicals such as Levamisole, DNCB, Azimexon, Tirorone, Bestatin Instead, bacterial cells, bacterial cell components, peptides, nucleic acids, proteins, sugar components, lipids, and the like can be used. Especially, a microbial cell and / or a microbial cell origin component are used suitably.
[0012]
Although it does not specifically limit as said microbial cell and / or a microbial cell origin component, For example, an acid-fast bacterium and / or an acid-fast bacterium-derived component, a streptococcus and / or a lytic streptococcus-derived component, an actinomycete and / or an actinomycete-derived component, etc. preferable.
The mycobacteria and / or mycobacteria-derived components are not particularly limited, but for example, Mycobacterium tuberculosis and / or Mycobacterium tuberculosis-derived components, BCG and / or BCG-derived components that are attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis are particularly preferable. .
[0013]
Although it does not specifically limit as a cytokine induced | guided | derived by the said cytokine inducer, For example, the group which consists of interferon gamma, interleukin 2, interleukin 10, interleukin 12, tumor necrosis factor-alpha, and transforming growth factor-beta It is preferable that it is at least one selected from more.
[0014]
The carrier is not particularly limited as long as it is insoluble in water, and is composed of, for example, a metal, an organic substance, an inorganic substance, or the like, preferably an organic substance, more preferably a polymer material. Moreover, the carrier is preferably an induction enhancer that enhances the cytokine-inducing action of the santocaine inducer, and more preferably an agent that induces and enhances IFN-γ.
[0015]
Examples of the metal include gold, gold alloy, silver, silver alloy, titanium, titanium alloy, and stainless steel.
Examples of the inorganic material include activated carbon, glass, glass derivatives, silica-based compositions, alumina, and hydroxyapatite.
[0016]
Examples of the organic material and the polymer material include cellulose, agarose, dextran, polystyrene, acrylic ester, polyethylene terephthalate, nylon, polyvinyl alcohol, polysulfone, polyamide, polyacrylonitrile, polyethylene. Materials such as polyurethane, polypropylene, and polyester. Of these, polystyrene, acrylic ester, polyester, nylon, cellulose, and polyvinyl alcohol polymer materials are particularly preferable.
[0017]
It does not specifically limit as said polystyrene type material, For example, a divinylbenzene-styrene copolymer etc. are mentioned.
The acrylic ester-based material is not particularly limited, and examples thereof include polymethyl methacrylate and polyhydroxyethyl methacrylate.
The cellulose-based material is not particularly limited, and examples thereof include cellulose acetate.
[0018]
The carrier is insoluble in water, nonpolar and hydrophobic. In particular, when a cytokine inducer is immobilized on a carrier by a physical adsorption method, it is preferable that the surface does not have an ion-exchange functional group or a hydrophilic functional group and has a strong surface hydrophobicity. Among them, it is more preferably made of a polystyrene-based polymer material that does not have an ion-exchange functional group or a hydrophilic functional group, and is made of a polystyrene-based polymer material using a crosslinking agent such as divinylbenzene. Is particularly preferred.
The carrier may be given hydrophilicity by surface modification, surface coating, or the like.
[0019]
The carrier is preferably a material that adsorbs leukocytes.
Examples of the material that adsorbs leukocytes include polystyrene-based, acrylic ester-based, polyester-based, nylon-based, cellulose-based, polyvinyl alcohol-based polymer materials, and glass-based materials.
[0020]
The shape of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a fiber shape, a nonwoven fabric shape, a sponge shape, a particle shape, a membrane shape, and a hollow fiber shape.
The size of the carrier is not particularly limited. For example, when the shape is particulate, the preferred lower limit of the diameter is 50 μm, the preferred upper limit is 2 mm, and when the shape is fibrous, the fiber diameter is A preferable upper limit is 10 μm, and a more preferable upper limit is 5 μm.
When the carrier is fibrous, it is preferably made of a nonwoven fabric, and the fiber diameter is preferably 3 μm or less.
[0021]
The carrier is preferably porous and more preferably made of a porous polymer material. The surface area of the carrier is preferably 400 m 2 / g or more, the pore volume is preferably 0.5 mL / g or more, and the average pore diameter is a lower limit of 20 mm and an upper limit of 800 mm. Preferably there is.
[0022]
The porous polymer material can be roughly classified into a gel type having a standard gel structure and an MR type having a macro network structure (Macro-reticular structure). A porous resin or the like obtained by simply polymerizing using a cross-linking agent such as styrene and divinylbenzene is nearly transparent and has a gel structure, and is therefore called a gel-type porous resin. On the other hand, a special polymerization method, for example, a method using a special organic solvent that is insoluble in water and can dissolve only the monomer in suspension polymerization, has large pores (macropores) deep inside the particles. Such physically porous resin is called MR type or porous type porous resin.
[0023]
Examples of the particulate porous polymer material include strong acid cation exchange resin, weak acid cation exchange resin, strong base anion exchange resin, weak base anion exchange resin, synthetic adsorbent, chelate, and the like. The thing which consists of resin etc. is mentioned. These porous particles can be obtained by a known method. For example, the porous particles are produced as a spherical polymer by suspension polymerization of the raw material monomer in water using an appropriate suspension stabilizer such as gelatin. As the raw material monomer, a compound having an ethylenic double bond such as styrene, vinyl toluene, ethyl acrylate, methyl methacrylate, acrylonitrile, etc. is used, and this is a polyfunctional monomer such as divinylbenzene or ethylene dimethacrylate. A cross-linking polymer is obtained by adding a cross-linking agent and using a polymerization initiator such as benzoyl peroxide or azobisisobutyl nitrile in the presence of a porosifying agent. Examples of commercially available porous particles include Diaion (registered trademark) manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation, Amberlite manufactured by Rohm and Haas, and Dow Chemical manufactured by Dow Chemical.
[0024]
The carrier is more preferably made of a porous polymer material having a giant network structure. As the pore distribution of the giant network structure, the lower limit is preferably 2 cm and the upper limit is 2000 mm, and the more preferable upper limit is 300 cm.
[0025]
The carrier preferably has a roughened surface.
The lower limit of the center line average roughness Ra value of the surface of the carrier is preferably 0.2 μm and the upper limit is 10 μm. By imparting a roughness with a Ra value of 0.2 μm or more to the surface of the carrier, cytokine induction is remarkably enhanced. In addition, the cytokine-inducing enhancement effect of this surface roughness is not due to an increase in the contact surface area, considering that the white blood cell size is 10 to 20 μm and the Ra value is much smaller than that of the white blood cell. It is done.
Here, the centerline average roughness Ra value is a centerline average roughness based on JIS B0601.
[0026]
Further, the average irregularity interval Sm value on the surface of the carrier is preferably 5 μm at the lower limit and 200 μm at the upper limit.
Here, the uneven average spacing Sm value is a value defined as follows.
[0027]
First, the upper count level C and the lower count level D are subtracted from the center line B of the roughness curve A shown in FIG. Next, when there is one or more points where the upper count level and the roughness curve intersect between two points where the lower count level D and the roughness curve A intersect, Is defined.
Then, as shown in FIG. 2, the uneven average interval Sm value is a value defined by the following formula (1) when the interval between the peaks included between the reference lengths L is Smi.
[0028]
[Expression 1]
[0029]
That is, the unevenness average interval Sm value indicates an average value of intervals between the peaks included in the reference length L. In this way, the distribution state in the surface direction of the unevenness on the surface is defined by the average unevenness interval Sm value.
[0030]
In the current JIS standard, information on the height direction of the surface roughness is specified, but information on the surface direction is not specified. However, the surface roughness in the present invention is also characterized by the spacing in the surface direction of the unevenness.
[0031]
The surface roughness of the carrier may be derived from the porosity of the material. In this case, examples of the porous polymer material suitably used for the carrier include polystyrene, acrylic ester, and polyester. Polymer materials such as nylon, cellulose, and polyvinyl alcohol.
[0032]
The surface roughness of the carrier may be derived from the fiber shape of the material. In this case, the carrier is preferably made of a fibrous or non-woven material. Examples of the fibrous material or the non-woven material include those made of polymer materials such as polystyrene, acrylic ester, polyester, nylon, cellulose, and polyvinyl alcohol.
[0033]
The cytokine-inducing agent is preferably immobilized on the carrier.
In order to immobilize the cytokine-inducing agent on the surface of the carrier, known methods such as physical adsorption, covalent bond, and ionic bond can be used.
In addition, in the case of covalent bonding or the like, it is preferable to introduce a spacer having an arbitrary length at the binding portion between the cytokine-inducing agent and the carrier, if necessary.
[0034]
When the cytokine inducer is a microbial cell or the like, if necessary, various pretreatments such as a washing operation, a crushing operation, and a component fractionation operation of the microbial cell may be performed before immobilization. In addition, when the cytokine-inducing agent is a live cell or the like, it is necessary to carry out heat treatment / immobilization at any time before, simultaneously with, or after immobilization, as necessary in order to further increase safety. It may be killed by various methods such as chemical treatment, radiation treatment, and gas sterilization treatment. Examples of the heat treatment include autoclave treatment, examples of the chemical treatment include glutaraldehyde treatment, formalin treatment, and ethanol treatment. Examples of the radiation treatment include γ-ray treatment. Examples of the gas sterilization treatment include ethylene oxide gas treatment. Among them, a treatment having a protein denaturing action is preferable, for example, chemical treatment using various solvents such as glutaraldehyde, formalin, ethanol, and agents having a protein denaturing action such as a surfactant, heat treatment in an aqueous solution, and the like. And chemical treatment using formalin is particularly preferable.
[0035]
When the cytokine-inducing agent is a microorganism such as BCG, it is bound to a functional group such as a carboxyl group, an amino group and / or an epoxy group of the carrier via an amino acid, a sugar component, or the like of a cell surface outer wall component. be able to. In this case, spacers having various chain lengths and structures can be introduced as necessary.
[0036]
When the cytokine-inducing agent is a microorganism whose outer layer is covered with lipids such as BCG, the lipid may be washed and removed as necessary, and then bound to the functional group of the carrier.
[0037]
As a method for immobilizing the cytokine inducer on the carrier, a physical adsorption method is preferred. For example, when the carrier has a hydrophobic surface and the cytokine-inducing agent is BCG, it can be immobilized by physical adsorption. Further, even when the cytokine inducer is a microorganism or a component thereof and the surface thereof is charged, it can be immobilized by a physical adsorption action on a carrier having the counter electrode charge on the surface.
[0038]
The use ratio of the cytokine inducer is not particularly limited. For example, in the case of BCG, the concentration added to the blood is such that the lower limit is 0.001 mg / mL in dry weight and the upper limit is 10 mg / mL. Is preferred. Moreover, when the said cytokine inducer is OK-432, as a density | concentration added to blood, it is preferable that a minimum is 0.0001KE / mL and an upper limit is 10KE / mL.
[0039]
The proportion of the carrier used is not particularly limited, but when a particulate carrier is used, the lower limit is about 0.02% and the upper limit is about 80% as the bulk volume of the carrier relative to the blood volume, and the preferred lower limit is 0.1%, and a preferable upper limit is about 50%.
[0040]
By storing the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention in a container, a device for treating inflammatory diseases can be produced. An inflammatory disease treatment tool having a container and the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention housed in the container is also one aspect of the present invention.
[0041]
In the inflammatory disease treatment device of the present invention, a cytokine exhibiting anti-inflammatory activity in blood or blood components, etc. by contacting the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention with blood or blood components in a container. Can be effectively induced. In this case, the contact temperature is preferably 15 ° C. at the lower limit and 42 ° C. at the upper limit, whereby cytokines exhibiting anti-inflammatory activity can be induced more effectively.
The cytokine-inducing agent and the carrier may be mixed in advance and contacted with blood, or may be individually contacted with blood or blood components.
[0042]
The structure of the container constituting the inflammatory disease treatment tool of the present invention is not particularly limited, but as schematically shown in FIG. 3, blood that is in contact with the blood introduction portion 1 and the inflammatory disease treatment agent of the present invention. The container 3 provided with the derivation | leading-out part 2 which guides 4 etc. out of a container is preferable.
As said container, a column-shaped container, a blood bag-shaped container, etc. are more preferable. If a blood bag-like container or the like is used, the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention can be administered relatively easily at the bedside without requiring a large-scale system such as an extracorporeal circulation device, and is useful. Conceivable.
[0043]
As for the capacity of the blood bag-like container or the like, the lower limit is preferably 50 mL, and the upper limit is preferably 1000 mL, the more preferable lower limit is 100 mL, and the more preferable upper limit is 400 mL.
[0044]
In addition, when the blood brought into contact with the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention is led out of the container, the inflammatory disease therapeutic agent outflow is prevented from mixing into the blood. A prevention mechanism is preferably provided.
As schematically shown in FIG. 3, the inflammatory disease therapeutic agent outflow prevention mechanism 5 may be immobilized inside the container so that the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention is not detached in advance. Examples of the mechanism for preventing the outflow of the therapeutic agent for inflammatory disease in such cases include a separation membrane for preventing outflow and a separation filter. Examples of other inflammatory disease therapeutic agent outflow prevention mechanisms include a mechanism that separates from blood by centrifugation or the like.
[0045]
Examples of the method for using the therapeutic agent for inflammatory disease of the present invention and the device for treating inflammatory disease of the present invention include the therapeutic agent for inflammatory disease of the present invention from an introduction part into a blood bag-like container having an introduction part and a lead-out part. In addition, the blood or blood component of an inflammatory disease patient is injected, the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention and the blood or blood component are contacted to induce cytokine, and then the cytokine exhibiting anti-inflammatory effect A method of taking out blood or blood components from which the blood was induced from the outlet and returning it to the patient by infusion or the like.
[0046]
In addition, when using the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention and the device for treating inflammatory diseases of the present invention, blood or blood components from which cytokines exhibiting the anti-inflammatory effect are induced are stored frozen, and if necessary Effective treatment can also be performed by thawing and administering to patients with inflammatory diseases. For example, the patient's own blood or blood components in which cytokines exhibiting anti-inflammatory effects that have been frozen in advance have been induced can be systemically or locally. The method of administering and treating can be made possible.
In this method of treatment, by returning blood or blood components containing a high concentration of cytokines exhibiting anti-inflammatory effects to the body of the inflammatory disease patient, the patient-derived cytokine is administered to the body of the inflammatory disease patient. An effective therapeutic effect is exhibited.
In addition, if necessary, in this treatment method, a part of blood components such as plasma and serum components may be extracted from the blood in which cytokines exhibiting anti-inflammatory effects are induced and returned to the patient. . At this time, a part of the blood components extracted from the blood in which cytokine showing anti-inflammatory effect is induced may be transferred to a normal blood bag and immediately returned to the patient, or after storage by means such as freezing May be returned to the patient. When plasma or the like obtained from blood in which a cytokine exhibiting an anti-inflammatory effect is induced is administered to a patient, it may be administered systemically or locally as described above.
[0047]
In this method of treatment, only blood or blood components in which cytokines exhibiting anti-inflammatory effects are induced may be used, but it is preferable to use other anti-inflammatory disease therapeutic agents in combination. Since the anti-inflammatory effect of each other is enhanced by using the blood or blood component obtained by using the inflammatory disease treatment device of the present invention in combination with the other anti-inflammatory disease therapeutic agent, treatment is performed at a safe dose. The effect can be significantly enhanced.
The administration method of the other anti-inflammatory disease therapeutic agent is not particularly limited, and administration methods such as intravenous injection and internal use are also possible.
[0048]
In the inflammatory disease treatment device of the present invention, the inflammatory disease therapeutic agent of the present invention is not limited to blood or blood components and the like, but also myeloid cells, epidermal cells, fibroblasts, hepatocytes, osteoblasts, blood Cytokines exhibiting anti-inflammatory activity can also be induced from various cells such as cells collected from tissues such as stem cells and embryonic stem cells, cultured cells and established cells.
[0049]
Examples of the disease to be treated according to the present invention include asthma, atopic dermatitis, rhinitis, conjunctivitis, hay fever, food allergy, allergic lung disease, anaphylactic shock, urticaria, nephritis, hepatitis, thyroiditis, drug Inflammatory diseases such as arthritis such as allergy, contact dermatitis, systemic lupus erythematosus (SLE), scleroderma, dermatomyositis, gravity myasthenia, rheumatoid arthritis and the like can be mentioned.
[0050]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited only to these examples.
[0051]
(Example 1)
Carrier 1 (trade name: Amberlite XAD4, porous polystyrene particles, MR type, pore distribution 2 to 150 mm, surface area 700 m 2 / g or more, pore volume 0.5 mL / g or more, average pore diameter approximately 120Å) was decanted using purified water (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.), then decanted using methanol (Wako Pure Chemical Industries, HPLC), and finally saline for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). The product was decanted and washed. Thereafter, 100 μL of carrier 1 in a bulk particle volume was added to 24 well plate (manufactured by Corning).
[0052]
Wistar Lewis rats (Japan SLC, 8 weeks old) were dislocated from the cervical vertebrae, and the spleen was removed as aseptically as possible, and a spleen cell suspension was prepared in RPMI1640 (manufactured by SIGMA) medium. This cell suspension was centrifuged (1300 rpm, 10 minutes, room temperature), and 5 mL of 0.83% ammonium chloride-0.17 mM Tris-HCl (pH 7.6) was added to the precipitate for hemolysis. About 45 mL of culture RPMI 1640 medium [2% FCS (manufactured by Funakoshi, HighClone series), 0.05 mM 2-mercaptoethanol, containing 10 U / mL penicillin] was added to stop the hemolysis reaction, perform centrifugal washing, and finally culture medium for culture Cells were resuspended in 10 mL, viable cells were counted using trypan blue, and the cell concentration was adjusted to 5 × 10 6 cells / mL.
[0053]
240 μL of physiological saline for injection was added to a 12 mg ampoule of BCG vaccine (manufactured by Nippon BCG Co., Ltd.) to prepare a 50 mg / mL suspension. This 50 mg / mL suspension was diluted with 34.6 mg / mL sodium glutamate monohydrate-containing physiological saline to prepare a BCG diluted solution having a concentration of 0.5 mg / mL. This BCG diluted solution was added to the cells so as to be diluted 100 times to prepare a cell suspension for BCG stimulation having a concentration of 0.055 mg / mL. 1.5 mL of this BCG-added cell suspension was added to a well of 24 well plate (manufactured by Corning) to which carrier 1 was added, and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 . (Reference: Journal of Immunology, 1995, 155, p. 5728-5735)
[0054]
The culture supernatant is collected from each well after 44 hours of culture into a sterilized 1.5 mL tube (manufactured by Eppendorf), centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant is newly sterilized. It collected in the tube for 5 mL. This was stored frozen at −70 ° C., thawed the next day, centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant filtered through a 0.22 μm filter was administered to the rat by the following method. Further, in order to confirm the cytokine-inducing action of the supernatant, the IFN-γ concentration in the supernatant was measured with an ELISA kit manufactured by Endogen.
[0055]
(Comparative Example 1)
The same procedure as in Example 1 was carried out except that Carrier 1 was not added and BCG vaccine was not added.
[0056]
(Comparative Example 2)
The same procedure as in Example 1 was performed except that carrier 1 was not added.
[0057]
(Comparative Example 3)
The same procedure as in Example 1 was performed except that no BCG vaccine was added.
[0058]
(Test of anti-inflammatory effect)
<Action on rat adjuvant arthritis>
As test substances, the supernatants obtained in Example 1 and Comparative Examples 1 to 3 were used as test solutions. As test animals, Wistar Lewis rats weighing 120 to 200 g were used.
[0059]
Arthritis was induced by injecting 0.1 mL of Mycobacterium tuberculosis H37RA (6 mg / mL) suspended in liquid paraffin subcutaneously into the rat right hind limb.
In order to investigate the degree of swelling of the rat right hind limb, the volume of the rat right hind limb was measured before and after arthritis induction using a plethysmometer (manufactured by Ugo Basile), and the volume before arthritis induction and the 21st day after arthritis induction. The difference from the above volume was taken as the footpad edema volume.
[0060]
The test liquid (5 mL / kg / day) using the supernatant obtained by inducing enhancement of the cytokine obtained in Example 1 or the supernatant obtained in Comparative Examples 1 to 3 was used for each of the 5 rats in which arthritis was induced. Were administered intravenously a total of 6 times after 0 days, 4 days, 7 days, 11 days, 14 days and 18 days after induction. In this study, the average value obtained for these rats was used to evaluate the degree of swelling. The test results are shown in Table 1.
[0061]
[Table 1]
[0062]
As shown in Table 1, in the group administered with the supernatant obtained by inducing and enhancing the cytokine obtained in Example 1, the right hind limb was compared with the group administered with the supernatant obtained in Comparative Examples 1 to 3. The degree of swelling of the footpad was clearly suppressed. That is, it was found that the supernatant in which cytokines were induced and enhanced by the therapeutic agent for inflammatory diseases of the present invention had a remarkable anti-inflammatory activity.
[0063]
【The invention's effect】
Since this invention consists of the above-mentioned structure, compared with the conventional inflammatory disease therapeutic agent by making the inflammatory disease therapeutic agent of this invention contact the cell, blood, or blood component derived from a living body, for example. Inflammatory action can be induced more effectively and side effects can be reduced. The inflammatory disease therapeutic agent and inflammatory disease therapeutic device of the present invention can be used in various ways in which cytokine induction is effective. It can be suitably used for the treatment of inflammatory diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram for explaining surface roughness, and is a diagram for explaining “mountains” of unevenness.
FIG. 2 is a diagram for explaining an unevenness average interval Sm value in surface roughness.
FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing an example of the inflammatory disease treatment device of the present invention.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Introduction part 2 Outlet part 3 Container 4 The blood which contacted the inflammatory disease therapeutic agent of this invention 5 The inflammatory disease therapeutic agent outflow prevention mechanism
