JP2004321075A

JP2004321075A - Gene encoding d-aspartic acid oxidase specific to d-aspartic acid

Info

Publication number: JP2004321075A
Application number: JP2003120211A
Authority: JP
Inventors: Shoji Takahashi; 祥司高橋; Ryohei Yamada; 良平山田; Yoshio Kaira; 芳夫解良
Original assignee: Nagaoka University of Technology NUC
Current assignee: Nagaoka University of Technology NUC
Priority date: 2003-04-24
Filing date: 2003-04-24
Publication date: 2004-11-18

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a gene encoding a D-aspartic acid oxidase having high specificity to a free D-aspartic acid. <P>SOLUTION: The gene comprises a DNA comprising a base sequence encoding the gene of yeast Cryptococcus humicolus( UJ1 strain ) or a DNA encoding a protein hybridizable with the above DNA under stringent conditions and having the activity of the oxidase protein. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アミノ酸は不斉炭素原子を有していることから、グリシンを除くアミノ酸にはＤ型およびＬ型の２つの鏡像異性体が存在する。生体に存在するアミノ酸は、Ｌ型が大多数であるが、Ｄ型も少数ながら存在している。その存在状態としては、蛋白質中のアミノ酸として存在する場合、また遊離した単独の状態の双方で存在していることが確認されている。Ｄ型のアミノ酸は、ヒトを含む様々な種において存在が確認されており、且つＤ型アミノ酸を基質として特異的に反応する酵素なども存在することなどから重要な生体機能を担っていることが推測されている。
【０００３】
Ｄ−アスパラギン酸は、このようなＤ型アミノ酸の一種であり、生体内に遊離した状態でも存在している（以後、このような生体内で遊離した状態で存在しているＤ−アスパラギン酸を遊離Ｄ−アスパラギン酸と呼称する）。このＤ型アミノ酸も、様々な生理活性を有することが明らかとなってきている。生物試料中の遊離Ｄ−アスパラギン酸を解析する場合、そのＬ型異性体と区別して検出する手段が必要である。しかしながら、Ｄ型とＬ型とは構造上酷似しているため、それらを区別して検出する方法は限られている。これらの方法には、各種キラルカラムクロマトグラフィーなどを使用してＤ型アミノ酸を分離した後に検出する方法が知られている。また、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的に作用する酵素を遊離Ｄ−アスパラギン酸に反応させて、対応する代謝産物に変換して、その代謝産物を検出することによって間接的に検出する酵素反応に基づく方法などが知られている。
【０００４】
特異的な酵素反応に基づく方法には、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素（Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅｏｘｉｄａｓｅ）を用いる方法がある。この酵素は、ＦＡＤを補酵素とし、遊離Ｄ−アスパラギン酸および遊離Ｄ−グルタミン酸などの酸性Ｄ−アミノ酸の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素である。この酵素は、これらのアミノ酸に作用して、オキサロ酢酸およびα−ケトグルタル酸などのα−ケト酸、過酸化水素、アンモニウムイオンを生じる。この酵素は、多くの真核生物に存在し、高等動物では腎臓、肝臓、及び脳などに発現している。
【０００５】
これまでウシ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子、ヒトの脳のＤ−アスパラギン酸酸化遺伝子が既にクローニングされており、その配列情報は公知である。従って、これら公知の遺伝子は、当業者が容易にクローニングし、適切な宿主に導入して発現させることが可能である。しかし、これら公知の遺伝子は、上述のとおりＤ−アスパラギン酸およびＤ−グルタミン酸の遊離型の双方を基質とするので、Ｄ−アスパラギン酸のみを特異的に検出することはできないという問題点を有する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、以下に記載される発明を提供することを課題とするものである。即ち、遊離Ｄ−アスパラギン酸を特異的に認識する酵素をコードする遺伝子を提供する。また、該遺伝子を組込んだ発現ベクターを提供する。更に、該ベクターを導入した形質転換体を提供する。なお更に、該遺伝子による組換えタンパク質を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下に手段によって本発明の課題を解決するものである。即ち、
遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子を提供する。
【０００８】
また、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡにおいて１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子を提供する。
【０００９】
更に、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；または
前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質；をコードする遺伝子を提供する。
【００１０】
更に、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の組換え蛋白質であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる組換え蛋白質、または
該配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する組換え蛋白質を提供する。
更に、前記遺伝子を含むベクター、前記ベクターによって形質転換した形質転換体、および前記遺伝子による組換えタンパク質を提供する。
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、これまで構造が明らかとされていなかった酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株由来の遊離Ｄ−アスパラギン酸特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードする遺伝子をクローニングした。そして、前記遺伝子が座位するゲノムＤＮＡの構造、前記遺伝子のｃＤＮＡにおける構造などの詳細を明らかにした。
【００１２】
以下に本発明の遺伝子と、公知の遺伝子との関係を説明する。
【００１３】
＜公知の遺伝子との比較＞
公知の遺伝子の産物（酵素）は、上述のとおり遊離Ｄ−アスパラギン酸のみならず遊離Ｄ−グルタミン酸に対しても反応するという問題点があった。それ故、公知の遺伝子の産物を利用する遊離Ｄ−アスパラギン酸を特異的に検出するための従来技術は、直接的に遊離Ｄ−アスパラギン酸を検出することはできず、煩雑な操作を必要とする間接的なものであった。
【００１４】
発明者は、上記問題点を克服すべく優れた特性を有するＤ−アスパラギン酸酸化酵素を具備する生物種をスクリーニングした結果、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）のＵＪ１株を土壌中から分離した。そして、ＵＪ１株が具備するＤ−アスパラギン酸酸化酵素が、Ｄ−アスパラギン酸に特異的に作用することを見出した。そして更に研究を重ねた結果、前記酵素を発現させ、発現した酵素を精製する方法を確立した。
【００１５】
しかしながら、前記株は生育環境中にＤ−アスパラギン酸が存在する場合のみ前記酵素を発現するため、培地中にＤ−アスパラギン酸を添加して、菌体内で前記酵素の転写発現を条件的に誘導する必要があった。Ｄ−アスパラギン酸は、高価であり培地中に大量に添加した場合にはコストがかかる。また、発現した酵素は更に各種の精製工程をへて精製される必要がある。一般的に、蛋白質の精製には時間がかかり、且つ熟練を要するものであり、更に本酵素の生産コストを増大させている。
【００１６】
これらのコスト面に関する課題は、本酵素をコードする遺伝子をクローニングすることによって解決すると思われる。即ち、適切な異種のプロモータの制御下にクローニングした本酵素の遺伝子を組み込むことによって、Ｄ−アスパラギン酸を必要としない発現系を作成することができる。更に本酵素の組換えタンパク質に精製用のタグを付与するなどの改変を施すことによって、精製の工程を減らし、且つ精製を容易にすることができる。しかしながら、本酵素の遺伝子は公知の遺伝子配列情報を基にした従来の技術によっては容易にクローニングすることができなかった。この理由としては、本酵素の遺伝子は発明者によって土壌中から分離された特殊な分離株であるクリプトコッカス・ヒュミコラスのＵＪ１株がコードする遺伝子であることに起因すると思われる。
【００１７】
即ち、（ａ）酵母類は、哺乳動物との系統類縁関係が低いこと、（ｂ）ＵＪ１株は、遺伝情報がよく知られたパン酵母などとは異なる特殊な分離株であること、（ｃ）系統類縁関係が高い生物種から本酵素活性を有する酵素の遺伝子がクローニングされていないこと、（ｄ）本酵素は、哺乳動物の酵素とは酵素活性の諸特性が顕著に相違していること、などから哺乳類の遺伝子とは配列の相同性が低いことが容易に予想され、恐らくこの相同性の低さ故に、配列の相同性に依拠する従来技術では容易にクローニングできなかったものと推測される。
【００１８】
本発明によってクローニングされた遺伝子と、既に公表されている公知の遺伝子とのｃＤＮＡの配列の相同性解析をＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１コンピュータープログラム〔Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｌｅｗｎｉａｋ，Ｆ．，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，Ｆ．ａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，２４，ｐ．４８７６（１９９７）〕を用いて行ったところ相同性は実際に低い値であった。例えば、本発明の遺伝子と、ウシ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子〔ＧｅｎＢａｎＫａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｘ９５３１０；Ｓｉｍｏｎｉｃ，Ｔ．，Ｄｕｇａ，Ｓ．，Ｎｅｇｒｉ，Ａ．，Ｔｅｄｅｓｃｈｉ，Ｇ．，Ｍａｌｃｏｖａｔｉ，Ｍ．，Ｔｅｎｃｈｉｎｉ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄＲｏｎｃｈｉ，Ｓ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２２，Ｐ．７２９（１９９７）〕との相同性は約４３％である。また、同様に本発明の遺伝子と、ヒト脳のＤ−アスパラギン酸酸化遺伝子〔ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｄ８９８５８；Ｓｅｔｏｙａｍａ，Ｃ．ａｎｄＭｉｕｒａ，Ｒ．：Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１，ｐ．７９８（１９９７）〕との相同性も約４３％程度である。
【００１９】
更に、本発明の遺伝子と、他の酵母の中性アミノ酸を基質とするＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性も低いものである（ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の双方の相同性とも低い）。例えば、ｃＤＮＡ配列に関して、本発明の遺伝子と、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）〔ＧｅｎＢａｎＫａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＣＡＢ４０１７４〕のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性は約４４％程度、更にロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）〔ＧｅｎＢａｎＫａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｕ６００６６；Ｐｏｌｌｅｇｉｏｎｉ，Ｌ．，Ｍｏｌｌａ，Ｇ．，Ｃａｍｐａｎｅｒ，Ｓ．，Ｍａｒｔｅｇａｎｉ，Ｅ．ａｎｄＰｉｌｏｎｅ，Ｍ．Ｓ．：Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８，ｐ．１１５（１９９７）〕のＤ−アミノ酸酸化酵素遺伝子との相同性は約４８％程度である。
【００２０】
以上のように本発明の遺伝子は公知の遺伝子配列とは相同性が低いため、公知の配列情報をもとに従来技術を利用しても容易にクローニングできたものではない。従って、本発明は当該技術分野の当業者によって容易に達成できたものではないことは明らかである。
以下に本発明の遺伝子について更に詳細に説明する。
【００２１】
＜本発明の遺伝子＞
本発明の遺伝子は、一般的な適用において、前記ＵＪ１株のＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチド、および該酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドの形態で使用される。より具体的には、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドである。また、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドは、例えば配列番号１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、配列番号１２に示すアミノ酸配列は、配列番号１１に示す塩基配列を翻訳したアミノ酸配列である。アミノ酸をコードするコドンは単一ではなく、縮重により複数のコドンが対応することは周知の事実である。従って、配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドには、配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドのみならず、異なるコドンに基づく塩基配列からなるポリヌクレオチドも含まれる。従って、前記Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素をコードするポリヌクレオチドには、複数のポリヌクレオチドが含まれ得る。
【００２２】
前記ホモログは、例えば、遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の酵素活性を有し、且つ以下の（ａ）〜（ｃ）に定義するポリヌクレオチドのうち少なくとも１つに適合するポリヌクレオチドがコードする酵素蛋白質である。
（ａ）配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号１１に示す塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号１２に示すアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【００２３】
上記（ａ）の「ストリンジェントな条件」は、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（例えば、０．５％ＳＤＳ、１００ μｇ／ｍｌ変性サケ***核酸、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドなどを少なくとも含む）中、４２℃で１２時間加熱することで達成される条件である。このような条件下において、公知のハイブリダイゼーション法に従って実施できるが、例えば、ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔＬａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて５５℃で４時間加熱することによりハイブリダイゼーションすることもできる。
【００２４】
上記（ｂ）および（ｃ）のポリヌクレオチドは、当業者であれば、配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡに、部位特異的変異導入法〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１０，ｐ．６４８７（１９８２），ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１００，ｐ．４４８（１９８３），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄＥｄｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）〕などに記載の方法を用いて、置換、欠失、挿入および付加変異を導入することにより得ることが可能である。
【００２５】
更に、前記ホモログは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上のホモロジーを有するタンパク質であってもよい。タンパク質のホモロジー検索は、例えばＤＤＢＪ（ＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｆＪＡＰＡＮ）を対象に、ＦＡＳＴＡプログラムやＢＬＡＳＴプログラムなどを用いて行うことができる。
【００２６】
また、遺伝子を規定するものは、その遺伝子が具備する特異的な塩基配列情報であることも周知の事実である。従って、本発明において「遺伝子」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの特定のポリヌクレオチドに限定して解釈されない。従って、本発明において「遺伝子」は、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡの何れのポリヌクレオチドであってもよく、１本鎖もしくは２本鎖の何れの状態であってもよく、および各種の標識、タグ、ヌクレオチド誘導体などの人為的な物質を含むポリヌクレオチドなどであってもよい。
以下、特に他に説明しない限り、本発明の遺伝子をコードする様々なポリヌクレオチドを、総括的に「本発明のポリヌクレオチド」と呼称する。当業者であれば、以下の記載中において「本発明のポリヌクレオチド」がどのような形態をとりうるものであるかを判断できる。
【００２７】
［本発明のポリヌクレオチドの単離］
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、以下のような方法によって単離することができる。
《ライブラリーの作成》
Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の産生能を有する酵母のゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、配列番号８もしくは配列番号１１に示す塩基配列から適切に選択された塩基配列を含むＤＮＡをプローブとしてスクリーニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。配列番号８および配列番号１１に示す塩基配列は、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株に由来するものなので、この菌株から調製したライブラリーを用いて本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。前記ＵＪ１株は、理化学研究所の生物基盤研究部微生物系統保存施設にＪＣＭアクセッション番号［９５７５］で寄託されており、この施設から入手することが可能である。また近縁の酵母や、あるいは他種の酵母に由来するライブラリーを利用することによって、前記ホモログを単離することもできる。
【００２８】
酵母のゲノムライブラリーは、公知の方法によって得ることができる。例えば、まず酵母の培養物を集めて、酵母を物理的に、あるいは酵素的に破壊する。具体的には、たとえば菌体の凍結等により細胞壁を破壊することができる。更に核分画を集めて、フェノール／クロロホルム等で核酸を抽出し、制限酵素等でランダムに切断する。ランダムに切断されたゲノムの断片を、適切なクローニングベクターに挿入すればゲノムライブラリーを得ることができる。
【００２９】
一方、ｃＤＮＡライブラリーは、以下のようにして得ることができる。例えば、凍結菌体から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を用いて、プロトコルに従ってｍＲＮＡを抽出し、それを精製する。得られたｍＲＮＡを鋳型として、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎらの方法〔Ｇｅｎｅ，２５，ｐ．２６３（１９８３）〕などに基づいて、ｃＤＮＡライブラリーを合成する。すなわちＯｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと、逆転写酵素とを用いて各ｍＲＮＡから、それぞれに対応するｃＤＮＡが合成される。これを適切なプラスミドやファージベクターに挿入することにより、ｃＤＮＡライブラリーを作出することができる。
【００３０】
《ハイブリダイゼーションによるクローニング》
これらのライブラリーに対して、好ましくは先に述べたようなストリンジェントな条件下でプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズに関して陽性の反応を呈したクローン（ポジティブクローン）を集めて、そのクローンが具備する塩基配列を確認することにより、本発明のポリヌクレオチドを具備していることが確認される。
【００３１】
前記クローンから単離されたポリヌクレオチドが、タンパク質翻訳領域の全長を含まない場合には、下記のように全長を含む本発明のポリヌクレオチドを取得できる。即ち、得られた全長を含まない配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適切な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄＰＣＲ）を行うことにより〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０，ｐ．６２１（１９８８）〕、また、ＲＡＣＥ法（ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄ、「ＰＣＲ実験マニュアル」ｐ２５−３３，ＨＢＪ出版局）などにより取得することができる。
【００３２】
《ＰＣＲクローニング》
さらに、配列番号８または配列番号１１に示す塩基配列に基づいて設定されたプライマーを用い、ＰＣＲ法を利用して本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。すなわち、先に述べたゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ法を行い、目的とする長さの断片を回収する。これを適切なクローニングベクターに挿入してクローニングすることにより、本発明のポリヌクレオチドを単離することができる。プライマーとして縮重プライマーを用いることによって、配列番号８や配列番号１１のみならず、これらの塩基配列と相同性の高いホモログをクローニングすることもできる。与えられた塩基配列に基づいて、その配列を有するポリヌクレオチドを増幅することができるプライマー、並びにその配列に相同性のあるホモログをコードするポリヌクレオチドを増幅することができる縮重プライマーを設計することは、当業者が日常的に行っていることである。なお本発明のポリヌクレオチドは、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡとして取得する以外にも、例えば、化学合成によって得ることもできる。
【００３３】
＜本発明のベクターおよび形質転換体＞
このようにして単離されたＤ−アスパラギン酸酸化酵素をコードする本発明のポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素の発現ベクターが提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養し、適切に発現誘導し、そして精製することにより、本発明の組換えタンパク質を得ることができる。
【００３４】
［形質転換の対象］
本発明において形質転換の対象となる生物は、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、結果としてＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限されない。当業者であれば、適切な生物とベクターの組み合わせを選択することができる。
例えば、利用可能な微生物としては、以下のような微生物を使用することができる。即ち、
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌、
また、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、
更に、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、
なお更に、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などである。
【００３５】
［ベクターの作出］
形質転換体の作製方法および宿主に適合した組み換えベクターの構築方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている方法に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。例えば、微生物中で本発明の遺伝子を発現させるためには、まずその微生物中において安定に存在し得るプラスミドベクターやファージベクター中に本発明のポリヌクレオチドを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。
【００３６】
プロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−などに関しては「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに、特に酵母に関しては、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．，４３，ｐ．７５（１９９０）、Ｙｅａｓｔ，８，ｐ．４２３（１９９２）などに詳細に記述されている。
【００３７】
《好適なベクターの構成》
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネータ−の例を以下に記載する。
エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドなどを利用でき、プロモーターとしてｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用でき、および、ターミネーターとして、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを利用することができる。
【００３８】
バチルス属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーターおよびターミネーターとして、ａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）のプロモーターおよびターミネーターなどを利用できる。
【００３９】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｃｅｐａｃｉａ）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能である。プロモーターおよびターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子の由来のプロモーターおよびターミネーターなどが利用できる。
【００４０】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、ｐＡＪ４３〔Ｇｅｎｅ，３９，ｐ．２８１（１９８５）〕などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターおよびターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーターおよびターミネーターが、この属においても同様に利用可能である。
【００４１】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９６，ｐ．１７５（１９８４）〕などのプラスミドベクターが利用可能である。
【００４２】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ｐＨＶ１３０１（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２６，ｐ．２３９（１９８５）〕、ｐＧＫ１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５０，ｐ．９４（１９８５）〕などがプラスミドベクターとして利用可能である。
【００４３】
ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１３７，ｐ．６１４（１９７９）〕などが利用可能であり、プロモーターとしては、大腸菌で利用されているものが利用可能である。
【００４４】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である〔Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３８，ｐ．１００３（１９９２）〕。
【００４５】
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（１９８５）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）においては、ｐＩＪ４８６〔Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０３，ｐ．４６８（１９８６）〕、ｐＫＣ１０６４〔Ｇｅｎｅ，１０３，ｐ．９７（１９９１）〕、ｐＵＷＬ−ＫＳ〔Ｇｅｎｅ，１６５，ｐ．１４９（１９９５）〕が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒｇｉｎｉａｅ）においても、同様のプラスミドを使用することができる〔Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｌ．，１１，ｐ．４６（１９９７）〕。
【００４６】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能である。また、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４７】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１４５，ｐ．３８２（１９８１）〕、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫ遺伝子などに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００４８】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、以下のものを使用することができる。即ち、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，ｐ．８０（１９８６）〕。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる〔ＥＭＢＯＪ．，６，ｐ．７２９（１９８７）〕。特に、ｐＡＵＲ２２４は宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００４９】
チゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）においては、以下のものを使用することができる。即ち、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｒｏｕｘｉｉ）由来のｐＳＢ３〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，ｐ．４２６７（１９８５）〕などに由来するプラスミドベクターが利用可能である。また、サッカロマイセス・セレビジアエ由来ＰＨＯ５プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来ＧＡＰ−Ｚｒ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）のプロモーター〔Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，ｐ．２５２１（１９９０）〕などが利用可能である。
【００５０】
ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属においては、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ハンゼヌラ・ポリモルファ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である〔Ｙｅａｓｔ，７，ｐ．４３１（１９９１）〕。また、メタノールなどで誘導されるＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。
【００５１】
ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属においては、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子（ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，ｐ．３３７６（１９８５）〕、高濃度培養とメタノールで誘導可能なＡＯＸなど強いプロモーターが利用できる〔ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１５，ｐ．３８５９（１９８７）〕。
【００５２】
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）、キャンディダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）、キャンディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、キャンディダ・ウチルス（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ〔Ａｇｒｉ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１，ｐ．１５８７（１９８７）〕、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８−１７３１７０）。
【００５３】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）などがカビの中で最もよく研究されている。これらの種において、プラスミドや染色体ＤＮＡに異種遺伝子をインテグレーションすることが可能である。また、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である〔ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，ｐ．２８３（１９８９）〕。
【００５４】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，ｐ．５９６（１９８９）〕。
【００５５】
更に、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、こららの宿主・ベクター系を利用して本発明の遺伝子を発現させることもできる。特に蚕を用いた昆虫〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５，ｐ．５９２（１９８５）〕、および菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物を利用して大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、これらの系を好適に利用できる。
【００５６】
［形質転換方法］
本明細書に記載のとおりに作出されたベクターおよび形質転換する対象である宿主生物に応じて適切な方法によって形質転換すればよい。例えば、電気穿孔法は、各種の生物種において汎用される方法であり、適切な条件は適用する対象毎に公知の条件を使用すればよい。また、アルカリカチオン法、スフェロプラスト法、パーティクルガン法、リポフェクション法やリン酸カルシウム法などの宿主に応じた適切な方法によって形質転換することができる。
【００５７】
［形質転換体の調製］
本発明の形質転換体は、その宿主生物に適した公知の方法で生育、栽培、および培養される。例えば、宿主生物が微生物である場合について以下に培養条件を説明する。
《宿主微生物の培地》
培地としては、炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体培地または固体培地を使用することができる。具体的には、
炭素源として、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類、麦、とうもろこしなどの天然炭水化物、グリセロール、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸などの脂肪酸類、ノルマルパラフィンなどの炭化水素類、グリシン、グルタミン、アスパラギンなどのアミノ酸類等の一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
【００５８】
また、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素などの無機窒素化合物より使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
【００５９】
更に、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。
【００６０】
また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加してもよい。培養は前記培地成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、該菌株が増殖し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。通常は、培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節し、１５から５０℃、好ましくは２５から３５℃の温度条件下で培養することが望ましい。
【００６１】
［遺伝子の発現誘導］
本発明の形質転換体を、その形質転換体に適した公知の方法で処理して導入した遺伝子を発現誘導させる。先に酵母クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株によるＤ−アスパラギン酸酸化酵素の生産にはＤ−アスパラギン酸を唯一の窒素源として用いなければならないことは既に述べた。これに対して、異種のプロモータの制御下に本発明の遺伝子を組み込んだ遺伝子組み換え体を用いた場合には、この遺伝子の発現にＤ−アスパラギン酸を必要としない。
【００６２】
例えば、宿主生物が微生物である場合について以下に発現誘導条件を説明する。
即ち、十分に菌体が増殖した後に、または増殖過程の途中に、形質転換体内に導入された外来遺伝子の発現を誘導する条件を与える。例えば、ｌａｃプロモーターに対しては、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を与えることにより、その下流に連結されている外来遺伝子の発現が誘導される。温度感受性プロモーターであれば、発現に必要な温度条件で培養を行う。
培養時間は、十分量のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を有する菌体が得られれば特に制限はなく、通常は１日から１４日、このましくは１日から３日培養する。
【００６３】
［酵素タンパク質の精製］
形質転換体内で生産蓄積された本発明の組換えタンパク質であるＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質は、周知のタンパク質の精製方法に従って精製すればよい。
【００６４】
《抽出操作》
例えば、次のような方法によって、前記酵素タンパク質を抽出することができる。即ち、
本発明の遺伝子を発現誘導した形質転換体の細胞を、宿主生物に適切な方法で分離する。次に、その細胞をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で洗浄する。次に、例えば、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理手段、またはリゾチームなどの細胞壁溶解酵素処理のような生化学的処理、または界面活性剤との接触処理などの化学的処理を、単独もしくは組み合わせて行うことにより細胞を破砕し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質を適切な緩衝液中に抽出して粗精製物を作出することができる。
【００６５】
また、本発明の組換えタンパク質が、形質転換した細胞の外へ排出される場合には、その培養液を前記粗精製物と同様に以下の操作により精製すればよい。更に、本発明の組換えタンパク質が、公知のインビトロ・トランスレーション法により無細胞系において発現される場合にも、翻訳処理が終了した反応液を前記粗精製物と同様に以下の操作により精製すればよい。更に、前記粗精製物などの本発明の組換えタンパク質を含有する溶液は、目的によってはそのまま使用してもよい。
【００６６】
《精製操作》
前記粗精製物は、以下に説明する方法を単独もしくは組み合わせて使用することによって精製できる。前記方法としては、例えば塩析、有機溶媒などによる分別沈殿；また、塩析クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを、オープンカラム、中圧クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行うクロマトグラフィー；更に、等電点電気泳動、ｎａｔｉｖｅ電気泳動などの電気泳動法；などが存在する。
【００６７】
より具体的には、例えば、以下に説明する方法によって本発明の組換えタンパク質を精製することができる。即ち、
本発明の遺伝子を発現誘導させた形質転換体の細胞を、ろ過もしくは遠心分離によって集める。この細胞を、緩衝液に懸濁し、次に超音波破砕機を用いて破砕処理してＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質を含有する抽出液を得る。その後、硫安を用いた塩析処理、Ｂｕｔｙｌ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ疎水クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラフィーを２回行い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単一のバンドに精製することができる。
【００６８】
＜酵素タンパク質の特性＞
配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は、下記の（ａ）から（ｈ）の理化学的性質を有する。
【００６９】
（ａ）作用：遊離Ｄ−アスパラギン酸に作用して、オキサロ酢酸、過酸化水素、アンモニウムイオンを生じる。
（ｂ）補酵素：本酵素活性に補酵素としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を要求する。ＦＡＤの解離定数（Ｋｄ）は８．２×１０^−１２Ｍ程度である。
（ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子質量が約４０ｋＤａである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｈｉ−Ｌｏａｄ１．６／６０（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した分子質量が１６０〜１７０ｋＤａ付近を示す。また、ＦＡＤを含まないアポ体は上記ゲルろ過クロマトグラフィーによる分子質量が約４０ｋＤａである。
【００７０】
（ｄ）基質特異性：Ｄ−アスパラギン酸に対して最も高い活性を有する。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）にも作用を示す。Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギンに対してはわずかにしか活性を示さない。一方、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、およびＤ−アルギニンには全く活性を示さない。
（ｅ）温度安定性：ｐＨ７．５で１０分間熱処理した場合、４５℃までは比較的安定であり、５０℃以上では失活する。
（ｆ）至適温度：ｐＨ７．５で反応させる場合、温度３３℃から３７℃において作用が至適である。
【００７１】
（ｇ）安定化剤：０．５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン存在下において、その活性が安定に保持されるが、１０％（ｖ／ｖ）グリセリン溶液中では安定に保持されない。
（ｈ）阻害剤：マロン酸が最も強く阻害し、次いでＤ−リンゴ酸が強く阻害する。また、ｍｅｓｏ−酒石酸、マレイン酸はわずかに阻害する。なおＤＬ−酒石酸、フマル酸、シュウ酸、コハク酸、グルタル酸、クエン酸、ｎ−酪酸、安息香酸、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ではほとんど阻害されない。
【００７２】
本発明によるＤ−アスパラギン酸酸化酵素の基質特異性は、次のようにして確認することができる。例えば、５０ μｌの酵素液と２０ｍＭの基質（各種Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸）を含む５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）緩衝液（全量１．０ｍｌ）中で、３７℃、１０分間で反応させる。この反応によって生成する様々なα−ケト酸の量を２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）と反応させ、生じたヒドラゾンの光吸収を分光光度計で（４４５ｎｍ）で測定することにより、各基質に対する酵素活性を比較することができる。
【００７３】
酵素活性の比較のためには、Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸を基質とし、３７℃において１分間に１ μｍｏｌのα−ケト酸を生成する酵素量を１単位（ユニットもしくはＵ）として、酵素間、あるいは基質間の反応性を比較することができる。このような解析結果によれば、配列番号１２に示すアミノ酸配列からなる本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は、以下のような基質特異性を有する。
【００７４】
遊離Ｄ−アスパラギン酸に対する活性を１００％とした場合、ＮＭＤＡに対しては９．４％、Ｄ−アスパラギンに対しては０．７％、Ｄ−グルタミン酸に対しては０．４％の活性を示す。一方、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−バリン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、およびＤ−アルギニンには全く活性を示さない。本発明において全く活性を示さないとは、上記反応条件で検出し得るα−ケト酸が生成されないことを意味する。
【００７５】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
【００７６】
また、以下の実施例において市販の試薬あるいはキットを用いている場合は、それらに添付の指示書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）や添付の試薬などを使用している。また、以下の記載において、「％」は特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００７７】
［実施例１］
＜遺伝子クローニング＞
本実施例は、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株からの本発明の遺伝子のクローニングについて記載する。
《ゲノムＤＮＡの調製》
酵母クリプトコッカスヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株を、２５ｍｌの試験管に入った５ｍｌＹＭ液体培地〔０．３％酵母エキス（ナカライテスク）、０．３％麦芽エキス（ナカライテスク）、０．５％ミクニペプトン（ミクニ化学産業）、１％グルコース（ナカライテスク）、ｐＨ７．０〕に稙菌し、３０℃、２４時間、１４０ｒｐｍで振盪培養し、これを前培養液とした。５００ｍｌの坂口フラスコに入った２００ｍｌのＹＭ液体培地に前培養液を１ｍｌ稙菌し、３０℃で１６時間、１４０ｒｐｍで振盪培養した。菌体を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）により集菌し、氷冷生理食塩水で洗浄を行った。洗浄後の菌体５ｇをＳＰ緩衝液（１Ｍソルビトール、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）で洗浄し、ＳＰ緩衝液１０ｍｌに懸濁した。
【００７８】
この細胞懸濁液にＬＹＳＩＮＧＥＮＺＹＭＥＳＦｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ｓｉｇｍａ）１００ｍｇと２−メルカプトエタノール（ナカライテスク）１０μｌを加えた後、３０℃で１時間保温した。１時間後、ＬＹＳＩＮＧＥＮＺＹＭＥＳＦｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｈａｒｚｉａｎｕｍ（Ｓｉｇｍａ）をさらに５０ｍｇ添加し、さらに３０℃で１時間保温した。この処理によってスフェロプラスト化した菌体を遠心分離（３，０００×ｇ、２０分間、４℃）により集菌し、ＳＥＰ緩衝液（１．０Ｍソルビトール、０．５ｍＭＥＤＴＡ、２．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を、ＴＥ緩衝液１６ｍｌに懸濁したのち、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を８ｍｌ添加し、６０℃で３０分間保温した。
【００７９】
保温後、この溶液に、２０ｍｌのフェノール／クロロホルム混合液と２ｍｌの５Ｍ酢酸カリウム溶液とを加え撹拌したのち、氷上で３０分間静置した。次に、この溶液を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）し、上清を回収したのち、その上清に２倍量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させた。次に、この溶液を遠心分離（５，５００×ｇ、２０分間、４℃）し、沈殿したＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、ＴＥ緩衝液と称す）２０ｍｌに溶解した。その溶解液にＲＮａｓｅＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）（ナカライテスク）を５ μｌ加え、３７℃で１時間保温した後、ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）（ナカライテスク）を１００ μｌ添加し、３７℃で１時間保温した。その後、この溶液に２０％ポリエチレングリコール６０００（ナカライテスク）／２．５ＭＮａＣｌ溶液１２ｍｌを添加し、一晩４℃で静置したのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間、４℃）によりＤＮＡを沈殿させた。そして、この沈殿したＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、フェノール／クロロホルム処理を２〜３回行ったのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、２０分間、４℃）により上清を回収した。この回収した上清中のＤＮＡをエタノール沈殿により回収し、ＴＥ緩衝液に溶解させて使用時まで４℃で保存した。
【００８０】
《ゲノムＤＮＡライブラリーの作成》
上記の「ゲノムＤＮＡの調製」において調製した染色体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ（ＴａＫａＲａ）で部分消化し、９〜２３ｋｂｐの染色体ＤＮＡ断片をショ糖密度勾配遠心法により精製・単離した。この単離したＤＮＡ断片の脱リン酸化処理をＣａｌｆｉｎｔｅｓｔｉｎｅアルカリホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行ったのち、λＤＡＳＨＩＩ／ＢａｍＨＩベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて組込んだ。パッケージングはＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩＰｌｕｓＰａｃｋａｇｉｎｇＥｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。
【００８１】
《ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成》
クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株を、７０ｍｌ試験管に入った１０ｍｌＹＰＤ液体培地〔１％酵母エキス（ナカライテスク）、２％カゼインペプトン（ナカライテスク）、２％グルコース（ナカライテスク）〕に稙菌し、３０℃、２９時間、１６０ｒｐｍで振盪培養した。この培養した菌体を遠心分離（１０，０００×ｇ、１分間、４℃）により集菌したのち、氷冷滅菌水で２度洗浄し、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍｌのＹＣＢＤ液体培地〔１％Ｄ−アスパラギン酸（田辺製薬）、１．１７％ｙｅａｓｔｃａｒｂｏｎｂａｓｅ（Ｄｉｆｃｏ）、ｐＨ７．０〕にＯＤ_６００が０．０５になるよう稙菌し、３０℃、１１．５時間、１６０ｒｐｍで振盪培養した。この培養した菌体を遠心分離（５，０００×ｇ、５分間、４℃）により集菌し、氷冷水で洗浄を行った。
【００８２】
調製した菌体からの全ＲＮＡの抽出は、Ｂｒａｗｎらの方法〔Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｊ．Ｐ．：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，ｐ．２６９（１９９６）〕に従い行った。全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて単離した。ＧｕｂｌｅｒａｎｄＨｏｆｆｍａｎらの方法〔Ｇｅｎｅ，２５，ｐ．２６３（１９８３）〕に基づいたｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて、上記で調製したｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡを鋳型として２本鎖ＤＮＡを合成し、ＴａＫａＲａｃＤＮＡＰＣＲｌｉｂｒａｒｙＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いてｃＤＮＡを増幅した。
【００８３】
《遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片の取得》
クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質のＮ末端アミノ酸配列（配列番号１）と内部アミノ酸配列（配列番号２）をもとに２種の縮重プライマー（日清紡）を合成した。これらの縮重プライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号３（ＮＤＤＯｐ１）および配列番号４（ＮＡＤＤＯｐ１）に示す。上記「ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成」で調製したｃＤＮＡを鋳型として使用し、ＰＣＲにより本酵素をコードする部分遺伝子断片を得た。ＰＣＲの条件は以下の通りである。即ち、ＮＤＤＯｐ１プライマーを５０ｐｍｏｌ、ＮＡＤＤＯｐ１プライマーを５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）を２０ｎｍｏｌ、ｃＤＮＡ溶液２ μｌ、ＴａＫａＲａＥＸＴａｑ（ＴａＫａＲａ）を２．５Ｕ、１０×ＥＸＴａｑバッファー（ＴａＫａＲａ）を１０ μｌを含む１００ μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５０℃、３０秒）、伸長（７２℃、１分）からなるサイクルを３５サイクル、ＰＴＣ−１００ＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅＴｈｅｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲを行った。この反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出された。
【００８４】
《ＰＣＲ産物の塩基配列解析》
上記「遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片の取得」において得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収した。次に回収したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動し、目的とするＤＮＡ断片を含むバンド部分を切り出し、ゲル中のＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。次に精製したＤＮＡ断片をＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。そして、このＤＮＡ断片の塩基配列を解析するために前記ｐＴ７ＢｌｕｅＴベクターから前記ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）とＨｉｎｄＩＩＩ（ＴａＫａＲａ）で切り出し、上述した方法でアガロースゲルより抽出・精製し、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイト間にクローニングし、大腸菌ＸＬＩ−ＢｌｕｅＭＲＦ’に導入した。
【００８５】
塩基配列解析は、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法〔ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄＥｄｔ．（２００１）〕に従って調製した一本鎖ＤＮＡを用いて行った。調製した一本鎖ＤＮＡ０．６５ μｇを鋳型とし、配列番号５に示した塩基配列を含むＣｙ５標識化Ｔ７プロモータープライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ）をプライマーとした、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｌａｂｅｌｌｅｄｐｒｉｍｅｒｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔｗｉｔｈ７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたジデオキシチェーンターミネイター法により反応させた。この反応による生成物をＤＮＡシーケンサーＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍｐｈａｒｍａｃｉａｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて解析し、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号６に示す。
【００８６】
決定したＤＮＡ塩基配列をコンピュータ解析したところ、５’末端および３’末端に使用したプライマー配列に一致する配列がみられ、プライマー特異的に増幅されたＤＮＡであることが確認できた。更に、前記塩基配列と、前記塩基配列から推定される推定アミノ酸配列（配列番号７）とをＤＤＢＪ（ＤＮＡＤａｔａｂａｎｋｏｆＪＡＰＡＮ）を対象に、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて相同検索した。その結果、塩基配列に対しては有意な相同性を示す配列はなかったが、前記推定アミノ酸配列に対しては相同性を示す配列が存在した。即ち、前記推定アミノ酸配列は、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）およびロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）のＤ−アミノ酸酸化酵素と約２８％の相同性を示した。ＤＮＡ塩基配列及び推定アミノ酸配列のコンピュータ解析はＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮＶｅｒｓｉｏｎ４（ソフトウェア開発）を用いて行った。
【００８７】
《ゲノムＤＮＡライブラリーからの遺伝子全長の単離》
この処理工程により上記「ゲノムＤＮＡライブラリーの作成」において作成したクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株のゲノムＤＮＡライブラリーから、本発明の遺伝子の全長をコードする領域が座位するゲノムＤＮＡを有するクローンを取得する。
【００８８】
上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」において取得されたＤＮＡ断片をベクターより切り出し、上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」に記した方法でアガロースゲルより抽出・精製した。この抽出・精製したＤＮＡ断片を、ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔＬａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてアルカリホスファターゼで標識化し、ゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した。
【００８９】
ＡｌｋＰｈｏｓＤｉｒｅｃｔＬａｂｅｌｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた２００００個のプラークのスクリーニングにより、４個の陽性クローンを単離した。そのクローン中の１個の陽性プラークを純化し、大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＡ（Ｐ２）に感染させてファージを増やした後に、ファージ粒子を精製し、ファージＤＮＡを得た。調製したファージＤＮＡから、全長Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有すると推測されたＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ）消化により生じる約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をファージＤＮＡから切り出し、上述のようにアガロースゲルを用いて精製した。この精製したＤＮＡ断片を、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターのＳａｌＩサイトにサブクローニングした。
【００９０】
このベクターにより形質転換し、クローン化した大腸菌から、プラスミドＤＮＡを常法〔Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄＥｄｔ．（２００１）〕に従って調製した。調製したプラスミドＤＮＡは、ＴａＫａＲａＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ＤｅｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて様々な欠失体を作成した。上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」で使用した方法と同様な方法を用いて、両鎖について全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号８に示す。この塩基配列のＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮＶｅｒｓｉｏｎ４（ソフトウェア開発）を用いたコンピューター解析により、クローニングしたＤＮＡに５’および３’非翻訳領域を含むＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードする遺伝子が含まれていることが確認できた。また、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子中にイントロンの存在が示唆された。
【００９１】
《遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離》
上記「ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡの合成」に記載した方法と同様な方法を用いてクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から全ＲＮＡを調製した。この全ＲＮＡ２４μｇを鋳型とし、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。そして、クローニングした本遺伝子が座位する領域のゲノムＤＮＡの塩基配列情報をもとに、ＯＲＦの５’上流および３’下流とそれぞれハイブリダイズする２種類のプライマーＤＤＯ５ｐ１（配列番号９）およびＤＤＯ３ｐ１（配列番号１０）を設計した。これらのプライマーと、調製したｃＤＮＡとを用いたＰＣＲによりＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードするｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りである。即ち、ＤＤＯ５ｐ１プライマーを１５ｐｍｏｌ、ＤＤＯ３ｐ１プライマーを１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）を１５ｎｍｏｌ、ｃＤＮＡ溶液２ μｌ、ＰｌｕｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．２５Ｕ、１０×ＰｆｘＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ μｌ、１０×ＰＣＲｘＥｎｈａｎｃｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ μｌ、ＭｇＳＯ_４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０ｎｍｏｌ含む５０ μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）からなるサイクルを３５サイクル、ＰＴＣ−１００ＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅＴｈｅｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲ行った。
【００９２】
ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出できた。ＰＣＲ反応により得られた前記ｃＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、ＳａｌＩ（ＴａＫａＲａ）で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、目的とするバンド部分を切り出し、ゲル中に存在するｃＤＮＡをＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳａｌＩサイトにクローニングした。この構築したプラスミドをｐＫＳＣＤ２と名付けた。そして、クローニングしたｃＤＮＡの全長塩基配列を解析するために上記「ゲノムＤＮＡライブラリーからの遺伝子全長の単離」中に記した同様な方法で様々な欠失体を作成し、上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」中に記した同様な方法で一本鎖ＤＮＡを調製した後、その全塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１１に示す。
【００９３】
塩基配列解析の結果、クローニングしたｃＤＮＡの配列中には、本遺伝子のゲノムＤＮＡ配列と一致する配列が確認でき、開始コドンおよび終始コドンも確認できた。また、ゲノムＤＮＡ配列中にみられたイントロンは確認されなかった。また、このｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２に示す。このアミノ酸配列中には、クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素のＮ末端配列（配列番号１）と内部アミノ酸配列（配列番号２）が確認でき、Ｄ−アミノ酸酸化酵素間で保存性の高いアミノ酸残基も確認できた。これらの結果から、クローニングしたｃＤＮＡがクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の全長をコードするｃＤＮＡであることが確認できた。これらの解析はＧＥＮＥＴＩＸ−ＷＩＮＶｅｒｓｉｏｎ４（ソフトウェア開発社）を用いて行った。
【００９４】
［実施例２］
＜ベクターおよび形質転換体の作成＞
本実施例は、本発明の遺伝子を組み込んだベクター、該ベクターを導入した形質転換体について記載する。
《大腸菌における遺伝子発現ベクターの構築》
実施例１の「遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離」で得られた遺伝子を大腸菌で発現させるため、まず「遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡの単離」で構築したｐＫＳＣＤ２を鋳型として、ＯＲＦの５’末端部分にハイブリダイズするプライマーＣＤ１ｐ（配列番号１３）と３’末端部分にハイブリダイズするプライマーＣＤ２ｐ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行い、全長遺伝子を増幅した。ＰＣＲの条件は、以下の通りである。即ち、ＣＤ１ｐプライマーを１５ｐｍｏｌ、ＣＤ２ｐプライマーを１５ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ（ＴａＫａＲａ）を１５ｎｍｏｌ、ｐＫＳＣＤ２を２０ｎｇ、ＰｌｕｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．２５Ｕ、１０×ＰｆｘＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ μｌ、１０×ＰＣＲｘＥｎｈａｎｃｅｒＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５ μｌ、ＭｇＳＯ_４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０ｎｍｏｌ含む５０ μｌの反応液を用いて、変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（５８℃、３０秒）、伸長（６８℃、１分）からなるサイクルを３０サイクル、ＰＴＣ−１００ＰｒｏｇｒａｍａｂｌｅＴｈｅｒｍａｌＣｏｎｔｒｏｌｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅｒｃｈ）を用いて繰り返すことによりＰＣＲを行った。
【００９５】
ＰＣＲ反応後、反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、目的のＤＮＡバンドが確認できた。得られたＤＮＡ断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿として回収し、ＮｄｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）とＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）で切断した後、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、ゲル中の目的とするバンド部分を切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて大腸菌発現用プラスミドであるｐＥＴ１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイト間にクローニングした。この発現プラスミドをｐＥＣＤ５と名付けた。次に、以下の処理を行って、このｐＥＣＤ５にクローニングされたＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子にＰＣＲ反応中に変異が生じていないことを確認する。
【００９６】
まず、ｐＥＣＤ５のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子をＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）とＢａｍＨＩ（ＴａＫａＲａ）で切り出し、アガロースゲル電気泳動を行った。そして、ゲル中の目的のバンドを切り出し、このバンド中に存在するＤＮＡをＱＩＡＥＸＩＩＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した後、ＴａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔｖｅｒ．ＩＩ（ＴａＫａＲａ）を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＸｂａＩとＢａｍＨＩサイト間にクローニングした。上記「ＰＣＲ産物の塩基配列解析」に記した方法と同様な方法を用いて、このＤＮＡの塩基配列を解析した。解析の結果、ｐＥＣＤ５のＤ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子上に変異がないことが確認された。
【００９７】
《形質転換体を用いた遺伝子発現》
発現プラスミドｐＥＣＤ５をＩｎｏｕｅらの方法〔Ｉｎｏｕｅ，Ｈ．，Ｎｏｊｉｍａ，Ｈ．ａｎｄＯｋａｙａｍａ，Ｈ．：Ｇｅｎｅ，９６，ｐ．２３（１９９０）〕に従って発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入し、形質転換体を得た。先ず得られた大腸菌形質転換体を、２５ｍｌ試験管中のアンピシリン（１００ μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地〔１％トリプトン（ナカライテスク）、０．５％酵母エキス（ナカライテスク）、１％塩化ナトリウム（ナカライテスク）〕５ｍｌに稙菌し、３０℃で一晩１６７ｒｐｍで振盪培養し、これを前培養とした。５００ｍｌの三角フラスコに１００ｍｌの上記培地を入れて前培養した菌液を５００ μｌ稙菌し、ＯＤ_６００が約０．５となるまで、３０℃、２００ｒｐｍで培養した。ＯＤ_６００が約０．５に到達した時に、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ナカライテスク、以下、ＩＰＴＧと称す）を終濃度１ｍＭになるように添加し、さらに６時間、３０℃、２００ｒｐｍで培養を行った。培養終了後、遠心分離（５，０００×ｇ、１０分、４℃）により集菌し、氷冷した１ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で菌体を洗浄後、同緩衝液１０ｍｌに懸濁した。そして、ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣＤＩＳＲＵＰＴＯＲＵＤ−２０１（ＴＯＭＹ）を用いて氷上で超音波破砕処理（Ｏｕｔｐｕｔ５、Ｄｕｔｙｃｙｃｌｅ５０％、３０秒を１５回）により菌体を破砕した後、遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分、４℃）し上清を回収した。この上清を無細胞抽出液として以下の実験に使用した。一方、陰性コントロールとして以下の大腸菌、即ち、ＩＰＴＧを添加しないで培養したｐＥＣＤ５を導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有しないｐＥＴ１１ｂを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、及びＩＰＴＧを添加して培養した前記ｐＥＴ１１ｂを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から同様な方法で調製した無細胞抽出液を陰性コントロール無細胞抽出液とした。
【００９８】
《発現産物のウエスタンブロット解析》
上記「形質転換体を用いた遺伝子発現」において得られた無細胞抽出液（タンパク質１０ μｇを含む）、およびクリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素タンパク質０．２ μｇに対して、２×ＳＤＳローディングバッファー〔０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノール・ブルー〕を等量加えて、沸騰水浴にて５分間加熱し、両試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを作成した。次にＬａｅｍｍｌｉの方法〔Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，ｐ．６８０（１９７０）〕に従い、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて、還元条件下で前記サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９９】
電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質を転写緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）中でゲルメンブレン転写装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＳＤＳＥＭＩ−ＤＲＹＴＡＮＳＦＥＲＣＥＬＬ）を用いて９０分、１００ｍＡの条件でＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。
【０１００】
転写後のＰＶＤＦ膜をＴＢＳ〔２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ＮａＣｌ〕中、室温で１０分間振とうして２回洗浄した後、ブロッキング緩衝液〔３％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ〕に浸して、室温で１時間振盪した。そして、ＰＶＤＦ膜を０．１％のＴｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むＴＢＳ（以下、ＴＴＢＳと称す）で１０分間、二回洗浄した後、クリプトコッカス・ヒュミコラスＵＪ１株から精製したＤ−アスパラギン酸酸化酵素を用いて作成したウサギ抗Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素抗血清を１％ゼラチンを含むＴＴＢＳで３０００倍希釈した溶液に浸して、室温で１時間穏やかに振とうした。次いで、前記ＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＴＢＳで１０分間、３回洗浄した。その後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をＴＴＢＳ（１％ゼラチンを含有する）で３０００倍に希釈した溶液に前記ＰＶＤＦ膜を浸して、室温で１時間振とうした。処理したＰＶＤＦ膜を取り出し、ＴＴＢＳで１０分間、２回洗浄した後、ＴＢＳで１０分間、２回洗浄した。洗浄後のＰＶＤＦ膜を発色による検出試薬（Ｉｍｍｕｎ−ＢｌｏｔＫｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に浸し、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素に対する抗体が結合するタンパク質の検出を行った。
その結果、前記両試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの双方において、特異的なバンドが分子質量約４０ｋＤａに検出された。一方、上記「形質転換体を用いた遺伝子発現」に記載の陰性コントロール無細胞抽出液から調製したＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルの全てにおいて、特異的なバンドは確認できなかった。
【０１０１】
［実施例３］
＜酵素活性の解析＞
本実施例は、本発明の遺伝子によりコードされる酵素蛋白質の酵素活性について記載する。
実施例２の「形質転換体を用いた遺伝子発現」に記載した無細胞抽出液のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性をＹａｍａｄａらの方法〔Ｙａｍａｄａ，Ｒ．，Ｕｊｉｉｅ，Ｈ．，Ｋｅｒａ，Ｙ．，Ｎａｋａｓｅ，Ｔ．，Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｋ．，Ｉｍａｓａｋａ，Ｔ．，Ａｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．ａｎｄＭａｔｓｕｍｕｒａ，Ｙ．：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２９４，ｐ．１５３（１９９６）〕により測定した。その結果、無細胞抽出液に比活性８２．８ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質のＤ−アスパギン酸酸化酵素酵素活性が確認できた。一方、陰性コントロールである前記陰性コントロール無細胞抽出液のＤ−アスパラギン酸酸化酵素活性を同様に測定したところ、以下の数値が得られた。即ち、それぞれＩＰＴＧを添加しないで培養したｐＥＣＤ５を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の無細胞抽出液では０．０５３１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質、Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素遺伝子を有しないｐＥＴ１１ｂを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．０２２４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質、及びＩＰＴＧを添加して培養したｐＥＴ１１ｂを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．０６２３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ蛋白質であり、有意な活性は確認できなかった。なお、無細胞抽出液中のタンパク質濃度測定はウシ血清アルブミン（ナカライテスク）を標準物質として用いＬｏｗｒｙらの方法〔Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．ａｎｄＲａｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３，ｐ．２６５（１９５１）〕に従って行った。
【０１０２】
［実施例４］
＜酵素の諸特性の解析＞
本実施例は、本発明の遺伝子によりコードされる酵素蛋白質の特性について記載する。
前記酵素蛋白質の諸特性について、他の生物に由来する酵素と比較して解析した結果を以下に記載する。特に、熱安定性やタンパク質濃度などの酵素活性への影響。更に、基質特異性および阻害剤の影響について速度論的解析を行なった。他の生物に由来する酵素としては、ウシ腎臓とタコ肝膵臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素、部分精製されたブタ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素、および酵母キャンディダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｎｄｉｎｉｉ）２２０１株から精製されたＤ−グルタミン酸酸化酵素を使用した。
【０１０３】
【表１】

【０１０４】
ブタ腎臓のＤ−アスパラギン酸酸化酵素を１９５倍に部分精製した。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、５３および５７ｋＤａの２つの主要なタンパク質と、数種の他のタンパク質とからなるものであった。
キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素を精製した。これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、４５ｋＤａのタンパク質からなるものであった。未変性（ｎａｔｉｖｅ）の酵素の分子量は、ゲル濾過によって４３ｋＤａであると推定された。
【０１０５】
《材料》
Ｄ−アスパラギン酸は田辺製薬から寄贈されたものを使用した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、その他の試薬はナカライテスクより購入した試薬を使用した。
【０１０６】
《方法》
Ｄ−アスパラギン酸酸化酵素活性は、特に示さない限り２０ｍＭＤ−アスパラギン酸を含む５０ｍＭピロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を用い、反応温度３７℃、反応時間１０分間で測定した。また、失活を防ぐため酵素希釈の際には、最終濃度が０．５ｇ／ｍＬＢＳＡとなるように希釈した。
至適ｐＨと最適温度
至適ｐＨの検討は、５０ｍＭピロリン酸カリウムバッファーを用いてｐＨ６．０〜１０．０の範囲で各ｐＨにおける酵素活性を測定した。最適温度の検討は、２０〜６０℃の範囲で各温度における酵素活性を測定した。
【０１０７】
熱安定性
本酵素の熱安定性の検討は、酵素（５８μｇ／ｍＬ、７６．１μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ）を２０〜６０℃の範囲で１０分間インキュベーションした後の残存酵素活性を測定した。また、酵素をさらに安定化するため、ＢＳＡを２５もしくは５００μｇ／ｍＬ添加したときの熱安定性についても検討した。
【０１０８】
活性測定条件の検討
酵素の希釈方法の検討は、希釈液として０．５ｍｇ／ｍｌＢＳＡまたは１０％（ｖ／ｖ）グリセリンを含んだ５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を用いて酵素を希釈・氷冷し、経過時間ごとに酵素活性を測定した。また、２５〜４０℃の範囲における酵素反応直線性はそれぞれの温度でインキュベーションし、経過時間ごとに活性測定を行なった。酵素活性と吸光度の相関関係は、酵素（１１．１μｍｏｌ／ｍｉｍ／ｍＬ）の希釈倍率をそれぞれ変えて活性測定を行なうことにより示した。
【０１０９】
基質特異性
本酵素の基質として、酸性アミノ酸であるＤ−型およびＬ−型のアスパラギン酸およびグルタミン酸、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）、それ以外のＤ−アミノ酸のうちアラニン、アスパラギン、グルタミン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニンを用いたときの酵素活性を測定した。基質濃度はすべて２０ｍＭで、緩衝液のｐＨは７．５とした。
【０１１０】
基質に対するＫｍ、Ｖｍａｘ値
本酵素の基質として、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、ＮＭＤＡを用いたときの基質濃度の影響を測定し、ミカエリス定数（Ｋｍ）および最大速度（Ｖｍａｘ）の値を求めた。このときの基質濃度は、Ｄ−アスパラギン酸が０．１〜２０ｍＭ、Ｄ−グルタミン酸が４〜５０ｍＭ、ＮＭＤＡが１〜２０ｍＭとなるようにしてそれぞれ測定を行なった。
【０１１１】
阻害剤の影響
本酵素の阻害剤として、ジカルボン酸であるシュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、Ｄ−リンゴ酸、ｍｅｓｏ−酒石酸、ＤＬ−酒石酸、フマル酸、マレイン酸；モノカルボン酸である安息香酸、ｎ−酪酸；トリカルボン酸であるクエン酸；金属キレート剤であるＥＤＴＡを添加したときの阻害効果を測定した。阻害剤濃度はすべて２０ｍＭとした。
【０１１２】
阻害剤に対するＫｉ値
本酵素の阻害剤として、マロン酸、Ｄ−リンゴ酸、ｍｅｓｏ−酒石酸を用いたときの基質濃度の影響をそれぞれの阻害剤の濃度に対して測定した。このときの基質濃度はＤ−アスパラギン酸０．０７〜２０ｍＭとした。また、阻害剤濃度はそれぞれについて０〜２０ｍＭとなるようにしてそれぞれ測定を行なった。
【０１１３】
《結果と考察》
至適ｐＨと最適温度
本酵素活性に及ぼすｐＨの影響について検討した（図１）。本酵素の至適ｐＨは７．５であり、高い活性を示す領域はｐＨ７〜８と狭い範囲（ｐＨ８．５では最大活性の約６０％）であることが明らかとなった。この結果は、これまでに報告されている脊椎動物やタコに由来する本酵素において認められた結果、即ち、酸性Ｄ−アミノ酸を基質とした場合にみられる生理的ｐＨよりかなり高いｐＨで高い活性を示す傾向にあるとの結果とは異なっていた。例えば、ブタ腎では至適ｐＨは８．５であり、最大活性の約９０％以上を示す領域は７．５〜９．５とかなり広範囲にわたっている。一方、キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素では至適ｐＨが７．０であり、高い活性を示す領域もかなり狭い（ｐＨ８．５では最大活性の約３０％）。
【０１１４】
次に、本酵素活性に及ぼす温度の影響について検討した（図２）。本酵素の最適温度は３３〜３７℃であり、高い活性を示す領域は狭い範囲であった。ブタ腎における最適温度４７．５℃（３５〜５０℃の広い範囲で高い活性）と比較するとかなり低い。一方、キャンディダ・ボイジニ２２０１株の酵素の結果は、本酵素の結果と類似しており、最適温度は３７℃であった。
以上のように本発明の酵素は、至適ｐＨ、至適温度とも動物の酵素とは異なる性質を呈したが、同じ酵母の一種であるキャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素とは類似した性質を呈した。
【０１１５】
熱安定性
本酵素の熱安定性について検討した（図３）。本酵素は３０℃までほぼ安定であったが、それ以上の温度ではやや不安定となり、４５℃を超えると急激に不安定となることが明らかとなった。また、ＢＳＡを添加することにより安定化を試みたが、ほとんど効果はなかった。このことから、４５℃以上で酵素タンパクが変性するために失活している可能性が示唆される。一方、ブタ腎のＤ−アスパラギン酸酸化酵素は熱に対して比較的安定（タンパク質濃度約０．５ｍｇ／ｍｌ、１０分間のインキュベーションにより６０℃で約６０％の残存活性）であり、本酵素のそれとは大きく異なっていた。
【０１１６】
活性測定条件の検討
本酵素は熱や低タンパク質濃度により不安定となることが示唆されたので、これらを踏まえて活性測定条件を確立することを試みた。
本酵素活性測定を行なう場合、酵素活性が高いときには希釈してから測定を行なっていたが、精製酵素を希釈するとただちに失活することが明らかとなった。そこで、酵素の希釈方法について検討を行なった（図４）。本酵素はリン酸緩衝液やグリセリン溶液で希釈すると速やかに失活し、また、リン酸緩衝液を用いると希釈直後から活性が失われていることが明らかとなった。一方、ＢＳＡ溶液で希釈すると約２０分間酵素の失活はみられなかった。この結果から、酵素を希釈する際にはＢＳＡ溶液などを用いたほうが好ましいと考えられる。
【０１１７】
本酵素は熱安定性に乏しいので、活性測定の問に酵素が失活していることが示唆される。そこで、酵素活性測定の温度と時間を検討することにした（図５）。本酵素は最適温度である３４〜３７℃で活性測定を行なった場合、約１５分間ほぼ直線性が認められるが、それ以上の時間では直線からはずれてくることがわかる。また、それより高い４０℃では直線性は認められなかった。一方、最適温度より低い２５℃と３０℃では長時間直線性を保っているが、３０分間以内では最適温度よりも低い吸光度を示した。これらの結果から、本酵素活性測定は最適温度で１０分間反応させるのが良いと考えられる。
【０１１８】
さらに、同じ酵素量で基質をより多く消費させるには、低い温度で長時間反応させる方が効率的であると思われる。酵素活性測定の際、反応溶液中に高濃度の酵素を添加すると、期待される活性値よりも低く算出されることが明らかとなった。そこで、活性測定中の酵素量と吸光度にどの程度相関があるのか検討した（図６）。吸光度が０．６、酵素活性が２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ（反応溶液１ｍｌ中では１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応）まではほぼ直線性が認められるが、それ以上だと直線から少しずつはずれていくことがわかった。以上の結果より、活性測定の条件は酵素２００ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ以下、３７℃、１０分間で行ない、酵素希釈には０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを用いることにする。
【０１１９】
基質特異性
本酵素の各アミノ酸に対する基質特異性について検討した（表２）。ここでは、Ｄ−アスパラギン酸に対する酵素活性を１００％として、その他を相対活性で示した。本酵素はＤ−アスパラギン酸に対してもっとも活性が高く、次いでＮＭＤＡに対して９．４％、同じ酸性Ｄ−アミノ酸であるＤ−グルタミン酸に対しては０．４％と低い値であった。この結果から、本酵素はＤ−アスパラギン酸を良い基質とし、他のアミノ酸に対してあまり作用しないことが明らかとなった。
【０１２０】
【表２】

【０１２１】
基質を２０ｍＭの濃度で使用した。
【０１２２】
基質に対するＫｍ、Ｖｍａｘ値
本酵素と基質（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、ＮＭＤＡ）との親和性について速度論的解析を行なった。各基質についてＫｍおよびＶｍａｘ値を解析した（表３）。ＫｍおよびＶｍａｘ値は、Ｄ−アスパラギン酸に対してそれぞれ３．６５ｍＭ、８１．３μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇ、Ｄ−グルタミン酸に対してそれぞれ１５２ｍＭ、３．０４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ、ＮＭＤＡに対してそれぞれ２８．０ｍＭ、１５．８μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｍｇであった。酵素効率を示す（ｋｃａｔ／Ｋｍ）で比較すると、Ｄ−アスパラギン酸に対して圧倒的に高く、Ｄ−グルタミン酸に対する値の約１０００倍、ＮＭＤＡに対する値の約４０倍であった。他の動物と比較する（表４）と、ウシやブタではＮＭＤＡがＤ−アスパラギン酸よりも適した基質（それぞれ約４７倍、約３．６倍）である。一方、タコではＤ−アスパラギン酸とほぼ同程度の割合でＤ−グルタミン酸にも作用する。従って、本酵素は基質特異性の点で他の生物由来の酵素とは大きく異なることが明らかとなった。
【０１２３】
【表３】

【０１２４】
使用した基質濃度は、Ｄ−アスパラギン酸が０．１〜２０ｍＭ、Ｄ−グルタミン酸が４〜５０ｍＭ、ＮＭＤＡが１〜２０ｍＭ。ｋｃａｔは単量体サブユニット（４０ｋＤａ）の分子量に基ずいて計算した。
【０１２５】
【表４】

【０１２６】
ウシおよびタコ；速度論的パラメータを、２５℃で５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ｍＭの固定酸素濃度下において測定した。
ブタ；速度論的パラメータを、３７℃で２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭピロリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）において測定した。
【０１２７】
さらに、Ｄ−アスパラギン酸に対しては基質を低濃度にして検討を行なった。ラインウィーバー・バークプロット（データ示さず）は、基質が低濃度でも直線性を示し、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に従うことが明らかとなった。しかし、今までに報告されているウシやブタ、タコのＤ−アスパラギン酸酸化酵素ではＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの式に従わないことが知られている。この傾向も既知の酵素ではみられない特徴である。
【０１２８】
阻害剤の影響
本酵素の阻害剤の影響について検討を行なった（表５）。本酵素に対してマロン酸が最も強く阻害し、次いでＤ−リンゴ酸が強く阻害した。しかし、ウシやタコ、当研究室で研究されたニワトリ、ハト、両生類、ニジマスのＤ−アスパラギン酸酸化酵素、酵母キャンディダ・ボイジニ２２０１株のＤ−グルタミン酸酸化酵素などで強い阻害が確認されているｍｅｓｏ−酒石酸はあまり阻害効果がなかった。この傾向も既知の酵素ではみられない特徴である。また、Ｄ−アミノ酸酸化酵素に対する阻害剤である安息香酸も阻害効果はみられなかった。
【０１２９】
【表５】

【０１３０】
【発明の効果】
Ｄ−アスパラギン酸を特異的に認識する酵素をコードする新規遺伝子が提供される。また、該遺伝子を組込んだ発現ベクターが提供される。更に、該ベクターを導入した形質転換体が提供される。なお更に、該遺伝子による組換えタンパク質が提供される。
【０１３１】
また、これらの発明は、Ｄ−アスパラギン酸を特異的に且つ低コストで検出する手段に使用でき、更にケト酸の生産、アスパラギン酸のラセミ体の光学分割などに応用することができる。
【０１３２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、ｐＨ条件と活性との相関関係を示す図である。
酵素活性をｐＨ６〜１０の範囲（５０ｍＭピロリン酸緩衝液中）で測定した。データをｐＨ７．５での最大活性のパーセントとして示す。
【図２】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、温度条件と活性との相関関係を示す図である。
酵素活性を図に示す温度で１０分間インキュベーションした後に測定した。データを３７℃での最大活性のパーセントとして示す。
【図３】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素における、温度条件と酵素の安定性との相関関係を示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ）を２０〜６０℃の範囲で１０分間インキュイベーションし、その後通常の活性測定を行った。相対活性は２０℃における酵素活性を１００％として示した。
【図４】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素のＢＳＡもしくはグリセロールの存在下における安定性を示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ、９５．１ユニット／ｍｇ）を以下に示す試薬を含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で３０倍希釈した。使用した試薬は、ＢＳＡが０．５ｍｇ／ｍｌ、グリセロールが１０％（ｖ／ｖ）。これらを氷中で保温し、各時間ごとに酵素活性を測定した。相対活性はＢＳＡを添加した際の０ｍｉｎを１００％とした。
【図５】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の様々な温度条件での反応のタイムコースを示す図である。
酵素溶液（５８μｇ／ｍｌ、９８．６ユニット／ｍｇ）を０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いて８０倍希釈した。酵素溶液は反応溶液１ｍｌに対し、５０μｌを添加した。吸光度０．６は、１ｍｌの反応溶液中の約１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応する。
【図６】本発明のＤ−アスパラギン酸酸化酵素の活性と吸光度変化（反応物の蓄積）との相関関係を示す図である。
酵素溶液（８２μｇ／ｍｌ、１３７．０ユニット／ｍｇ）を０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを用いてそれぞれ希釈した。酵素溶液は反応溶液１ｍｌに対し、５０μｌを添加した。吸光度０．６は、１ｍｌの反応溶液中の約１００ｎｍｏｌのＤ−アスパラギン酸の酸化に対応する。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a gene for D-aspartate oxidase.
[0002]
[Prior art]
Since amino acids have an asymmetric carbon atom, amino acids other than glycine have two enantiomers, D-type and L-type. The majority of amino acids present in living organisms are L-type, but D-type is also present in a small number. It has been confirmed that the protein exists as an amino acid in a protein or in a free state alone. The existence of D-type amino acids has been confirmed in various species including humans, and there is also an enzyme that specifically reacts with D-type amino acids as a substrate. Is speculated.
[0003]
D-aspartic acid is one type of such D-amino acids and is present in a free state in a living body (hereinafter, D-aspartic acid present in a free state in a living body is referred to as D-aspartic acid). Free D-aspartic acid). It has been revealed that this D-amino acid also has various physiological activities. When analyzing free D-aspartic acid in a biological sample, a means for detecting it separately from its L-isomer is required. However, since the D-type and the L-type are very similar in structure, the method of distinguishing and detecting them is limited. As these methods, there is known a method in which D-type amino acids are separated and then detected using various chiral column chromatography and the like. In addition, an enzyme that specifically acts on free D-aspartic acid is reacted with free D-aspartic acid to convert the enzyme into a corresponding metabolite, and the metabolite is detected. Based methods are known.
[0004]
As a method based on a specific enzyme reaction, there is a method using D-aspartate oxidase. This enzyme uses FAD as a coenzyme and catalyzes the oxidative deamination of acidic D-amino acids such as free D-aspartic acid and free D-glutamic acid. The enzyme acts on these amino acids to produce α-keto acids, such as oxaloacetate and α-ketoglutarate, hydrogen peroxide, and ammonium ions. This enzyme is present in many eukaryotes, and is expressed in higher animals such as kidney, liver, and brain.
[0005]
The bovine kidney D-aspartate oxidase gene and the human brain D-aspartate oxidase gene have been cloned, and their sequence information is known. Therefore, these known genes can be easily cloned by a person skilled in the art, introduced into an appropriate host, and expressed. However, since these known genes use both D-aspartic acid and the free form of D-glutamic acid as substrates as described above, there is a problem that only D-aspartic acid cannot be specifically detected.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide the invention described below. That is, the present invention provides a gene encoding an enzyme that specifically recognizes free D-aspartic acid. Further, the present invention provides an expression vector incorporating the gene. Further, the present invention provides a transformant into which the vector has been introduced. Still further, a recombinant protein derived from the gene is provided.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present invention solves the problems of the present invention by the following means. That is,
A gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific for free D-aspartate,
DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; or
A DNA that hybridizes with the DNA consisting of the nucleotide sequence under stringent conditions and encodes a protein having the activity of the enzyme protein;
A gene consisting of
[0008]
A gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific to free D-aspartic acid,
DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; or
A DNA consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added to a DNA consisting of the base sequence, and encoding a protein having the activity of the enzyme protein;
A gene consisting of
[0009]
Further, a gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific to free D-aspartic acid,
A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or
A gene comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and encoding a protein having the activity of the enzyme protein.
[0010]
Further, it is a recombinant protein of D-aspartate oxidase protein specific to free D-aspartic acid,
A recombinant protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or
Provided is a recombinant protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the sequence, and having the activity of the enzyme protein.
Further, the present invention provides a vector containing the gene, a transformant transformed with the vector, and a recombinant protein derived from the gene.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors have cloned a gene encoding a free D-aspartic acid-specific D-aspartate oxidase derived from the yeast Cryptococcus humicolus strain UJ1 whose structure has not been elucidated until now. The details of the structure of the genomic DNA in which the gene is located, the structure of the gene in the cDNA, and the like were clarified.
[0012]
Hereinafter, the relationship between the gene of the present invention and a known gene will be described.
[0013]
<Comparison with known genes>
As described above, the product (enzyme) of a known gene has a problem that it reacts not only with free D-aspartic acid but also with free D-glutamic acid. Therefore, the conventional technique for specifically detecting free D-aspartic acid using a product of a known gene cannot directly detect free D-aspartic acid, and requires a complicated operation. Was indirect.
[0014]
The inventor screened a biological species having D-aspartate oxidase having excellent properties in order to overcome the above problems, and as a result, isolated the UJ1 strain of the yeast Cryptococcus humicolus from soil. And it discovered that D-aspartate oxidase which UJ1 strain possesses specifically acts on D-aspartic acid. As a result of further studies, a method for expressing the enzyme and purifying the expressed enzyme was established.
[0015]
However, since the strain expresses the enzyme only when D-aspartic acid is present in the growth environment, D-aspartic acid is added to the medium to conditionally induce transcriptional expression of the enzyme in the cells. I needed to. D-aspartic acid is expensive and costly when added in large amounts to the medium. Further, the expressed enzyme needs to be further purified through various purification steps. Generally, protein purification is time-consuming and requires skill, and further increases the production cost of the enzyme.
[0016]
These cost issues are likely to be solved by cloning the gene encoding the enzyme. That is, by incorporating the gene of the present enzyme cloned under the control of an appropriate heterologous promoter, an expression system that does not require D-aspartic acid can be prepared. Furthermore, by modifying the recombinant protein of the present enzyme such as adding a tag for purification, the number of purification steps can be reduced and purification can be facilitated. However, the gene of the present enzyme could not be easily cloned by conventional techniques based on known gene sequence information. The reason for this is considered to be that the gene of the present enzyme is a gene encoded by the UJ1 strain of Cryptococcus humicolas, which is a special isolate isolated from soil by the present inventors.
[0017]
That is, (a) yeasts have a low pedigree relationship with mammals, (b) UJ1 strain is a special isolate different from baker's yeast and the like whose genetic information is well known, (c) ) The gene of the enzyme having the present enzyme activity has not been cloned from a species closely related to the strain, and (d) the enzyme has significantly different enzymatic activities from mammalian enzymes. Thus, it is easily predicted that the sequence homology with mammalian genes is low, and it is presumed that, due to the low homology, cloning could not be easily performed by conventional techniques relying on sequence homology. You.
[0018]
The homology analysis of the sequence of the cDNA between the gene cloned according to the present invention and a known gene that has already been published was performed using the Clustal X 1.81 computer program [Thompson, J. et al. D. Gibson, T .; J. Plewniak, F .; , Jean Mougin, F .; and Higgins, D.C. G. FIG. : Nucleic Acids Research, 24, p. 4876 (1997)], the homology was actually low. For example, a gene of the present invention and a bovine kidney D-aspartate oxidase gene [GenBank accession number: X95310; Simonic, T. et al. , Duga, S.M. Negri, A .; , Tedeschi, G .; , Malkovati, M .; , Tenchini, M .; L. and Ronchi, S.M. : Biochem. J. , 322, p. 729 (1997)] is about 43%. Similarly, the gene of the present invention and a D-aspartate oxidation gene of human brain [GenBank accession number: D89858; Setoyama, C. et al. and Miura, R.A. : J. Biochem. , 121, p. 798 (1997)] is about 43%.
[0019]
Furthermore, the homology between the gene of the present invention and a D-amino acid oxidase gene using a neutral amino acid as a substrate of another yeast is low (the homology of both the genomic DNA sequence and the cDNA sequence is low). For example, regarding the cDNA sequence, the homology between the gene of the present invention and the D-amino acid oxidase gene of Schizosaccharomyces pombe [GenBank accession number: CAB40174] is about 44%, and further, rhodosporidium. Rhodosporium torroides [GenBank accession number: U60066; Pollegioni, L .; , Molla, G .; , Campaner, S.A. Martegani, E .; and Pilone, M.A. S. : J. Biotechnol. 58, p. 115 (1997)] is about 48% homologous to the D-amino acid oxidase gene.
[0020]
As described above, since the gene of the present invention has low homology to known gene sequences, it cannot be easily cloned using conventional techniques based on known sequence information. Therefore, it is clear that the present invention has not been easily achieved by those skilled in the art.
Hereinafter, the gene of the present invention will be described in more detail.
[0021]
<Gene of the present invention>
The gene of the present invention is used in a general application in the form of a polynucleotide encoding the D-aspartate oxidase of the UJ1 strain and a polynucleotide encoding a homolog of the enzyme. More specifically, the polynucleotide encoding the D-aspartate oxidase is, for example, a polynucleotide having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11. The polynucleotide encoding the D-aspartate oxidase is, for example, a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 is an amino acid sequence translated from the base sequence shown in SEQ ID NO: 11. It is a well-known fact that codons encoding amino acids are not single, but multiple codons correspond due to degeneracy. Therefore, the polynucleotide consisting of the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 includes not only the polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, but also the polynucleotide consisting of the base sequence based on different codons. Therefore, the polynucleotide encoding the D-aspartate oxidase may include a plurality of polynucleotides.
[0022]
The homolog has, for example, an enzymatic activity of a D-aspartate oxidase protein specific to free D-aspartic acid, and has at least one of the polynucleotides defined in the following (a) to (c). Enzyme protein encoded by a compatible polynucleotide.
(A) a polynucleotide that hybridizes with a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 under stringent conditions.
(B) a polynucleotide consisting of a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11.
(C) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
[0023]
The “stringent conditions” in the above (a) include, for example, a hybridization solution (at least containing 0.5% SDS, 100 μg / ml denatured salmon sperm nucleic acid, 50% (v / v) formamide, etc.) , 42 ° C. for 12 hours. Under such conditions, the hybridization can be carried out according to a known hybridization method. For example, hybridization can be carried out by heating at 55 ° C. for 4 hours using an AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Bioscience).
[0024]
Those skilled in the art can use the polynucleotides (b) and (c) described above by site-directed mutagenesis [Nucleic Acid Res. , 10, p. 6487 (1982), Methods in Enzymol. , 100, p. 448 (1983), Molecular Cloning, 3rd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)] and the like, by introducing substitution, deletion, insertion and addition mutations.
[0025]
Further, the homolog may be a protein having at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, and most preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12. The protein homology search can be performed using, for example, a FASTA program or a BLAST program for DDBJ (DNA Data of Japan).
[0026]
It is also a well-known fact that what defines a gene is specific nucleotide sequence information of the gene. Therefore, in the present invention, “gene” is not interpreted as being limited to a specific polynucleotide such as DNA or RNA. Therefore, in the present invention, the “gene” may be, for example, any polynucleotide of DNA or RNA, may be in a single-stranded or double-stranded state, and may include various labels, tags, and nucleotides. It may be a polynucleotide containing an artificial substance such as a derivative.
Hereinafter, various polynucleotides encoding the gene of the present invention are collectively referred to as “polynucleotides of the present invention” unless otherwise specified. Those skilled in the art can determine what form the “polynucleotide of the present invention” can take in the following description.
[0027]
[Isolation of the polynucleotide of the present invention]
The polynucleotide of the present invention can be isolated, for example, by the following method.
《Creating a library》
Screening a genomic library or cDNA library of yeast capable of producing D-aspartate oxidase using a DNA containing a base sequence appropriately selected from the base sequences shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 as a probe. Thus, the polynucleotide of the present invention can be isolated. Since the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 are derived from the yeast strain Cryptococcus humicolus UJ1, it is possible to isolate the polynucleotide of the present invention using a library prepared from this strain. it can. The UJ1 strain has been deposited under the JCM Accession No. [9575] with the Microbial Strain Preservation Facility of the RIKEN Bioscience Institute, and can be obtained from this facility. The homolog can also be isolated by using a library derived from a closely related yeast or another kind of yeast.
[0028]
A yeast genomic library can be obtained by a known method. For example, a yeast culture is first collected and the yeast is physically or enzymatically destroyed. Specifically, for example, the cell wall can be destroyed by freezing the cells. Further, the nuclear fraction is collected, the nucleic acid is extracted with phenol / chloroform or the like, and randomly cut with a restriction enzyme or the like. A genomic library can be obtained by inserting a randomly cut genomic fragment into an appropriate cloning vector.
[0029]
On the other hand, a cDNA library can be obtained as follows. For example, mRNA is extracted from the frozen cells using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech) according to the protocol and purified. Using the obtained mRNA as a template, the method of Gubler and Hoffman et al. [Gene, 25, p. 263 (1983)] and the like. That is, cDNA corresponding to each mRNA is synthesized from each mRNA using Oligo (dT) primer and reverse transcriptase. By inserting this into an appropriate plasmid or phage vector, a cDNA library can be created.
[0030]
<< Cloning by hybridization >>
Probes are hybridized to these libraries, preferably under stringent conditions as described above. Clones that show a positive reaction for hybridization (positive clones) are collected, and the nucleotide sequence of the clone is confirmed, thereby confirming that the clone of the present invention is provided.
[0031]
When the polynucleotide isolated from the clone does not include the full length of the protein translation region, the polynucleotide of the present invention including the full length can be obtained as described below. That is, from the obtained sequence not including the full length, a PCR primer is designed to extend outside the known DNA, the chromosomal DNA of the enzyme-producing strain is digested with an appropriate restriction enzyme, and the DNA is subjected to a self-cyclization reaction. By performing inverse PCR (inverted PCR) as a template [Genetics, 120, p. 621 (1988)], and the RACE method (Rapid Amplification of cDNA End, “PCR Experiment Manual”, p25-33, HBJ Publishing Office).
[0032]
<< PCR cloning >>
Furthermore, the polynucleotide of the present invention can also be obtained by using a primer set based on the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 and utilizing the PCR method. That is, a PCR method is performed using the genomic library or the cDNA library described above as a template, and a fragment of a desired length is recovered. By inserting this into an appropriate cloning vector and cloning, the polynucleotide of the present invention can be isolated. By using a degenerate primer as a primer, not only SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11, but also a homolog having high homology to these nucleotide sequences can be cloned. Based on a given base sequence, to design a primer capable of amplifying a polynucleotide having that sequence and a degenerate primer capable of amplifying a polynucleotide encoding a homolog having homology to the sequence Is what a person skilled in the art does on a daily basis. The polynucleotide of the present invention can be obtained, for example, by chemical synthesis, in addition to the genomic DNA and cDNA cloned by the above method.
[0033]
<Vector and transformant of the present invention>
By inserting the polynucleotide of the present invention encoding the thus isolated D-aspartate oxidase into a known expression vector, a D-aspartate oxidase expression vector is provided. In addition, the recombinant protein of the present invention can be obtained by culturing a transformant transformed with this expression vector, appropriately inducing expression, and purifying the transformant.
[0034]
[Target of transformation]
In the present invention, an organism to be transformed is transformed with a recombinant vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide having D-aspartate oxidase activity, and as a result, expresses D-aspartate oxidase activity. It is not particularly limited as long as it is a living thing. One skilled in the art can select an appropriate combination of organism and vector.
For example, the following microorganisms can be used as available microorganisms. That is,
The genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Serratia, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium (Corynebacterium), the genus Streptococcus lactobacco Bacteria whose host vector system is being developed, such as
In addition, actinomycetes whose host vector system has been developed, such as the genus Rhodococcus and the genus Streptomyces,
Furthermore, the genera Saccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Zygosaccharomyces, the genus Zyorchoropirospori, and the genus Yarrowo-Rhoropi sp. Yeasts for which host vector systems of the genus, Hansenula, Pichia, Candida, etc. have been developed;
Still further, molds for which host vector systems such as the genus Aspergillus, the genus Cephalosporium, and the genus Trichoderma have been developed, such as the genus Neurospora.
[0035]
[Creation of vector]
A method for producing a transformant and a method for constructing a recombinant vector suitable for a host can be performed according to a method commonly used in the fields of molecular biology, biotechnology, and genetic engineering (for example, Sambrook et al., : Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories). For example, in order to express the gene of the present invention in a microorganism, first, the polynucleotide of the present invention is introduced into a plasmid vector or phage vector which can be stably present in the microorganism, and the genetic information is transcribed and translated. There is a need. For this purpose, a promoter, which is a unit for controlling transcription and translation, may be incorporated 5'-upstream of the DNA strand of the present invention, preferably a terminator 3'-downstream.
[0036]
As the promoter and the terminator, it is necessary to use a promoter and a terminator known to function in a microorganism used as a host. Vectors, promoters, terminators, and the like that can be used in these various microorganisms are described in “Basic Lectures on Microbiology 8 Genetic Engineering / Kyoritsu Shuppan” and the like. Biochem. Eng. , 43, p. 75 (1990), Yeast, 8, p. 423 (1992).
[0037]
<< Structure of suitable vector >>
Examples of vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described below.
In the genus Escherichia, particularly in Escherichia coli, the following can be used. That is, pBR, pUC-type plasmids and the like can be used as plasmid vectors, and promoters derived from lac (β-galactosidase), trp (tryptophan operon), tac, trc (fusion of lac, trp), λ phage PL, PR, etc. And terminators such as trpA-derived, phage-derived, and rrnB ribosomal RNA-derived terminators.
[0038]
In the genus Bacillus, the following can be used. That is, a pUB110-based plasmid, a pC194-based plasmid, or the like can be used as a vector, and can be integrated into a chromosome. As the promoter and terminator, apr (alkaline protease), npr (neutral protease), amy (α-amylase) promoter and terminator can be used.
[0039]
In the genus Pseudomonas, host vector systems have been developed for Pseudomonas putida, Pseudomonas cepacia, and the like. A broad host range vector (including a gene derived from RSF1010 or the like and required for autonomous replication) based on a plasmid TOL plasmid involved in the degradation of a toluene compound, pKT240, and the like can be used. As the promoter and terminator, a promoter and terminator derived from a lipase (Japanese Patent Laid-Open No. 5-284973) can be used.
[0040]
In the genus Brevibacterium, in particular, Brevibacterium lactofermentum, the following can be used. That is, pAJ43 [Gene, 39, p. 281 (1985)]. As the promoter and terminator, the promoter and terminator used in Escherichia coli can be similarly used in this genus.
[0041]
In the genus Corynebacterium, especially Corynebacterium glutamicum, pCS11 (JP-A-57-183799), pCB101 [Mol. Gen. Genet. , 196, p. 175 (1984)].
[0042]
In the genus Streptococcus, the following can be used. That is, pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett., 26, p. 239 (1985)), pGK1 (Appl. Environ. Microbiol., 50, p. 94 (1985)) and the like can be used as plasmid vectors.
[0043]
In the genus Lactobacillus, the following can be used. That is, pAMβ1 (J. Bacteriol., 137, p. 614 (1979)) developed for Streptococcus can be used, and a promoter used in Escherichia coli can be used as the promoter.
[0044]
In the genus Rhodococcus, a plasmid vector isolated from Rhodococcus rhodochrous can be used [J. Gen. Microbiol. 138, p. 1003 (1992)].
[0045]
For the genus Streptomyces, the method described in Hopwood et al., Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985), can be described in Plasmid. In particular, in Streptomyces lividans, pIJ486 [Mol. Gen. Genet. , 203, p. 468 (1986)], pKC1064 [Gene, 103, p. 97 (1991)], pUWL-KS [Gene, 165, p. 149 (1995)]. A similar plasmid can also be used in Streptomyces virginiae [Actinomycetol. , 11, p. 46 (1997)].
[0046]
In the genus Saccharomyces, in particular, in Saccharomyces cerevisiae, YRp, YEp, YCp, and YIp plasmids can be used. In addition, an integration vector (such as EP 537456) utilizing homologous recombination with ribosomal DNA present in multiple copies in a chromosome is extremely useful because a gene can be introduced in multiple copies and the gene can be stably retained. ADH (alcohol dehydrogenase), GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PHO (acid phosphatase), GAL (β-galactosidase), PGK (phosphoglycerate kinase), ENO (enolase) Promoters and terminators derived from such as can be used.
[0047]
In the genus Kleiberomyces, in particular, Kluyveromyces lactis, the following can be used. That is, a 2 μm plasmid derived from Saccharomyces cerevisiae, a pKD1 plasmid [J. Bacteriol. 145, p. 382 (1981)], a plasmid derived from pGKl1 involved in killer activity, an autonomous growth gene KARS-based plasmid in the genus Cryveromyces, a vector plasmid that can be integrated into the chromosome by homologous recombination with ribosomal DNA, etc. (EP 573456, etc.) Is available. In addition, promoters and terminators derived from ADH, PGK genes and the like can be used.
[0048]
In the genus Schizosaccharomyces, the following can be used. That is, a plasmid vector containing an ARS (gene involved in autonomous replication) derived from Schizosaccharomyces pombe and a selection marker complementary to an auxotrophy derived from Saccharomyces cerevisiae can be used [Mol. Cell. Biol. , 6, p. 80 (1986)]. Further, an ADH promoter derived from Schizosaccharomyces pombe or the like can be used [EMBO J. et al. , 6, p. 729 (1987)]. In particular, pAUR224 is commercially available from Takara Shuzo and can be easily used.
[0049]
In the genus Zygosaccharomyces, the following can be used. That is, pSB3 derived from Zygosaccharomyces rouxii [Nucleic Acids Res. , 13, p. 4267 (1985)] and the like. Also, a PHO5 promoter derived from Saccharomyces cerevisiae and a promoter of GAP-Zr (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) derived from S. saccharomyces rouxi [Agri. Biol. Chem. , 54, p. 2521 (1990)].
[0050]
In the genus Hansenula, a host vector system has been developed in Hansenula polymorpha. As a vector, genes involved in autonomous replication derived from Hansenula polymorpha (HARS1, HARS2) can also be used, but since they are relatively unstable, multicopy integration into the chromosome is effective [Yeast, 7, p. . 431 (1991)]. Further, promoters of AOX (alcohol oxidase), FDH (formate dehydrogenase) and the like, which are induced by methanol or the like, can be used.
[0051]
In the genus Pichia, a host vector system utilizing genes involved in Pichia-derived autonomous replication (PARS1, PARS2) in Pichia pastoris and the like has been developed [Mol. Cell. Biol. , 5, p. 3376 (1985)], and strong promoters such as AOX inducible by high-concentration culture and methanol can be used [Nucleic Acids Res. , 15, p. 3859 (1987)].
[0052]
In the genus Candida, Candida maltosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida utilis in Candida utilis, etc. Is being developed. In Candida maltosa, an ARS derived from Candida maltosa has been cloned [Agri. Biol. Chem. , 51, p. 1587 (1987)], and vectors utilizing this have been developed. In Candida utilis, a strong promoter has been developed for a chromosome integration type vector (Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-173170).
[0053]
In the genus Aspergillus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and the like are the most studied among molds. In these species, it is possible to integrate a heterologous gene into a plasmid or chromosomal DNA. In addition, promoters derived from extracellular proteases and amylase can be used [Trends in Biotechnology, 7, p. 283 (1989)].
[0054]
In the genus Trichoderma, a host vector system utilizing Trichoderma reesei has been developed, and a promoter derived from an extracellular cellulase gene can be used [Biotechnology, 7, p. 596 (1989)].
[0055]
Furthermore, various host / vector systems have been developed for plants and animals other than microorganisms, and the gene of the present invention can be expressed using these host / vector systems. In particular, insects using silkworms [Nature, 315, p. 592 (1985)], and a system for expressing a large amount of a heterologous protein using plants such as rapeseed, corn and potato has been developed, and these systems can be suitably used.
[0056]
[Transformation method]
Transformation may be performed by an appropriate method depending on the vector created as described in the present specification and the host organism to be transformed. For example, the electroporation method is a method widely used in various kinds of organisms, and a suitable condition may be a known condition for each target to be applied. In addition, transformation can be performed by an appropriate method depending on the host, such as an alkali cation method, a spheroplast method, a particle gun method, a lipofection method or a calcium phosphate method.
[0057]
[Preparation of transformant]
The transformant of the present invention is grown, cultivated, and cultured by a known method suitable for the host organism. For example, the culture conditions when the host organism is a microorganism will be described below.
《Host microorganism culture medium》
As the medium, any synthetic medium or natural medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic substances and other nutrients in an appropriate amount, and a liquid medium or a solid medium can be used. In particular,
As a carbon source, glucose, fructose, maltose, galactose, starch, starch hydrolysate, molasses, sugars such as molasses, wheat, natural carbohydrates such as corn, glycerol, alcohols such as methanol, ethanol, acetic acid, gluconic acid, Pyruvic acid, fatty acids such as citric acid, hydrocarbons such as normal paraffin, glycine, glutamine, asparagine, etc. Select and use two or more.
[0058]
Also, as a nitrogen source, meat extract, peptone, yeast extract, soybean hydrolysate, milk casein, casamino acid, various amino acids, corn steep liquor, other animals, plants, organic nitrogen compounds such as hydrolysates of microorganisms, One or more kinds are appropriately selected and used in consideration of the assimilation of microorganisms to be used from ammonium salts such as ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate and ammonium chloride, nitrates such as sodium nitrate, and inorganic nitrogen compounds such as urea.
[0059]
Further, one or two or more kinds can be appropriately selected and used from trace amounts of phosphates, hydrochlorides, nitrates, acetates and the like of magnesium, manganese, potassium, calcium, sodium, copper, zinc and the like as inorganic salts. .
[0060]
Further, an antifoaming agent such as a vegetable oil, a surfactant, and silicone may be added as necessary. The cultivation can be carried out in a liquid medium containing the above-mentioned medium components using a conventional culturing method such as shaking culture, aeration stirring culture, continuous culture, and fed-batch culture. Culture conditions may be appropriately selected depending on the type of culture and the culture method, and are not particularly limited as long as the strain can grow and produce D-aspartate oxidase. Usually, it is desirable to adjust the pH at the start of the cultivation to 4 to 10, preferably 6 to 8, and cultivate at a temperature of 15 to 50C, preferably 25 to 35C.
[0061]
[Induction of gene expression]
The transformant of the present invention is treated by a known method suitable for the transformant to induce the expression of the introduced gene. It was mentioned earlier that D-aspartic acid must be used as the sole nitrogen source for the production of D-aspartate oxidase by the yeast strain Cryptococcus humiculus UJ1. On the other hand, when a recombinant obtained by incorporating the gene of the present invention under the control of a heterologous promoter is used, D-aspartic acid is not required for expression of this gene.
[0062]
For example, the expression induction conditions when the host organism is a microorganism will be described below.
That is, conditions for inducing the expression of a foreign gene introduced into the transformant after sufficient growth of the cells or during the growth process are provided. For example, by giving IPTG (isopropylthio-β-D-galactopyranoside) to the lac promoter, the expression of a foreign gene linked downstream thereof is induced. If a temperature-sensitive promoter is used, culture is performed under the temperature conditions necessary for expression.
The cultivation time is not particularly limited as long as a sufficient amount of cells having D-aspartate oxidase activity can be obtained, and the cultivation is usually performed for 1 to 14 days, preferably 1 to 3 days.
[0063]
[Purification of enzyme protein]
The D-aspartate oxidase protein which is the recombinant protein of the present invention produced and accumulated in the transformant may be purified according to a known protein purification method.
[0064]
《Extraction operation》
For example, the enzyme protein can be extracted by the following method. That is,
The cells of the transformant in which the expression of the gene of the present invention has been induced are separated by a method suitable for the host organism. Next, the cells are collected by a method such as filtration or centrifugation, and washed with a buffer solution, physiological saline or the like. Next, for example, freezing and thawing treatment, ultrasonic treatment, pressure treatment, osmotic pressure difference treatment, physical means such as grinding treatment, or biochemical treatment such as cell wall lysing enzyme treatment such as lysozyme, or with a surfactant The cells can be crushed by performing a chemical treatment such as a contact treatment alone or in combination, and a D-aspartate oxidase protein can be extracted into an appropriate buffer to produce a crude product.
[0065]
When the recombinant protein of the present invention is excreted out of the transformed cells, the culture solution may be purified by the following operation in the same manner as the crude product. Furthermore, even when the recombinant protein of the present invention is expressed in a cell-free system by a known in vitro translation method, the reaction solution after the translation treatment can be purified by the following operation in the same manner as the crude product. Just fine. Further, the solution containing the recombinant protein of the present invention such as the above-mentioned crude product may be used as it is depending on the purpose.
[0066]
《Purification operation》
The crude product can be purified by using the methods described below alone or in combination. Examples of the method include salting out, fractional precipitation with an organic solvent, and the like; and salting out chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, hydrophobic chromatography, dye chromatography, hydroxyapatite chromatography, affinity chromatography, and the like. Of various types of chromatography using open columns, medium pressure chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC); and electrophoresis methods such as isoelectric focusing and native electrophoresis.
[0067]
More specifically, for example, the recombinant protein of the present invention can be purified by the method described below. That is,
The cells of the transformant in which the expression of the gene of the present invention has been induced are collected by filtration or centrifugation. The cells are suspended in a buffer and then crushed using an ultrasonic crusher to obtain an extract containing D-aspartate oxidase protein. Thereafter, salting-out treatment using ammonium sulfate, Butyl-Sepharose FF hydrophobic chromatography, and Superdex 200 gel filtration chromatography are performed twice, and the resultant can be purified into a single band by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
[0068]
<Characteristics of enzyme protein>
The D-aspartate oxidase of the present invention having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 has the following physicochemical properties (a) to (h).
[0069]
(A) Action: Acts on free D-aspartic acid to produce oxaloacetate, hydrogen peroxide and ammonium ions.
(B) Coenzyme: This enzyme activity requires flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme. The dissociation constant (Kd) of FAD is 8.2 × 10^-12 It is about M.
(C) Molecular weight: The molecular mass in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is about 40 kDa. The molecular mass measured by Superdex200 Hi-Load 1.6 / 60 (Amersham Pharmacia Biotech) gel filtration chromatography is around 160 to 170 kDa. The apo-form containing no FAD has a molecular mass of about 40 kDa as determined by the gel filtration chromatography.
[0070]
(D) Substrate specificity: It has the highest activity against D-aspartic acid. It also acts on N-methyl-D-aspartic acid (NMDA). It shows little activity against D-glutamic acid and D-asparagine. On the other hand, L-aspartic acid, L-glutamic acid, D-alanine, D-glutamine, D-valine, D-leucine, D-phenylalanine, D-proline, D-serine, D-threonine, and D-arginine are completely different. No activity.
(E) Temperature stability: When heat-treated at pH 7.5 for 10 minutes, it is relatively stable up to 45 ° C and deactivated at 50 ° C or higher.
(F) Optimum temperature: When the reaction is carried out at pH 7.5, the action is optimal at a temperature of 33 ° C to 37 ° C.
[0071]
(G) Stabilizer: Its activity is stably maintained in the presence of 0.5 mg / ml bovine serum albumin, but not stably in a 10% (v / v) glycerin solution.
(H) Inhibitor: Malonic acid inhibits most strongly, followed by D-malic acid. Also, meso-tartaric acid and maleic acid slightly inhibit. In addition, it is hardly inhibited by DL-tartaric acid, fumaric acid, oxalic acid, succinic acid, glutaric acid, citric acid, n-butyric acid, benzoic acid, and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
[0072]
The substrate specificity of the D-aspartate oxidase according to the present invention can be confirmed as follows. For example, in a 50 mM potassium phosphate (pH 7.5) buffer solution (total volume: 1.0 ml) containing 50 μl of the enzyme solution and 20 mM substrate (various D- or L-amino acids), at 37 ° C., 10 ° C. Let react in minutes. The amount of various α-keto acids produced by this reaction is reacted with 2,4-dinitrophenylhydrazine (2,4-DNPH), and the light absorption of the resulting hydrazone is measured with a spectrophotometer (445 nm). This makes it possible to compare enzyme activities for each substrate.
[0073]
For comparison of enzymatic activities, the amount of enzyme that produces 1 μmol α-keto acid per minute at 37 ° C. with 1 unit (unit or U) using D- or L-amino acid as a substrate, Alternatively, the reactivity between the substrates can be compared. According to such analysis results, the D-aspartate oxidase of the present invention having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 has the following substrate specificity.
[0074]
Assuming that the activity against free D-aspartic acid is 100%, the activity is 9.4% against NMDA, 0.7% against D-asparagine, and 0.4% against D-glutamic acid. Show. On the other hand, L-aspartic acid, L-glutamic acid, D-alanine, D-glutamine, D-valine, D-leucine, D-phenylalanine, D-proline, D-serine, D-threonine, and D-arginine No activity. In the present invention, having no activity means that no detectable α-keto acid is produced under the above reaction conditions.
[0075]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0076]
When commercially available reagents or kits are used in the following examples, the accompanying instructions (protocols) and the attached reagents are used. In the following description, “%” means “% by weight” unless otherwise specified.
[0077]
[Example 1]
<Gene cloning>
This example describes the cloning of the gene of the invention from the yeast strain Cryptococcus humicolus UJ1.
<< Preparation of genomic DNA >>
The yeast Cryptococcus humiculus UJ1 strain was added to a 25 ml test tube in 5 ml YM liquid medium [0.3% yeast extract (Nacalai Tesque), 0.3% malt extract (Nacalai Tesque), 0.5% % Mikunipeptone (Mikuni Chemical Industry), 1% glucose (Nacalai Tesque), pH 7.0], and cultured at 30 ° C. for 24 hours with shaking at 140 rpm to obtain a preculture solution. 1 ml of the preculture was inoculated into 200 ml of YM liquid medium in a 500 ml Sakaguchi flask, and cultured at 30 ° C. for 16 hours with shaking at 140 rpm. The cells were collected by centrifugation (5,500 × g, 20 minutes, 4 ° C.) and washed with ice-cold physiological saline. 5 g of the washed cells were washed with SP buffer (1 M sorbitol, 40 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0), and suspended in 10 ml of SP buffer.
[0078]
100 mg of LYSING ENZYMES From Trichoderma harzianum (Sigma) and 10 μl of 2-mercaptoethanol (Nacalai Tesque) were added to the cell suspension, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 1 hour. One hour later, 50 mg of LYSING ENZYMES From Trichoderma harzianum (Sigma) was further added, and the mixture was further kept at 30 ° C for 1 hour. The cells transformed into spheroplasts by this treatment are collected by centrifugation (3,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.), and SEP buffer (1.0 M sorbitol, 0.5 mM EDTA, 2.5 mM Washed twice with mM potassium phosphate buffer, pH 7.2). After washing, the bacterial cells were suspended in 16 ml of TE buffer, 8 ml of 10% sodium dodecyl sulfate solution was added, and the mixture was kept at 60 ° C. for 30 minutes.
[0079]
After keeping the temperature, 20 ml of a phenol / chloroform mixed solution and 2 ml of a 5 M potassium acetate solution were added to the solution, and the mixture was stirred and then allowed to stand on ice for 30 minutes. Next, this solution was centrifuged (5,500 × g, 20 minutes, 4 ° C.), and the supernatant was recovered. To the supernatant, twice the amount of ethanol was added to precipitate DNA. Next, this solution was centrifuged (5,500 × g, 20 minutes, 4 ° C.), and the precipitated DNA was recovered. This DNA was dissolved in 20 ml of Tris-EDTA buffer (pH 8.0) (hereinafter referred to as TE buffer). 5 μl of an RNase A solution (10 mg / ml) (Nacalai Tesque) was added to the solution, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour, and then 100 μl of a Proteinase K solution (10 mg / ml) (Nacalai Tesque) was added. For 1 hour. Thereafter, 12 ml of a 20% polyethylene glycol 6000 (Nacalai Tesque) /2.5 M NaCl solution was added to the solution, the mixture was allowed to stand at 4 ° C. overnight, and then centrifuged (12,000 × g, 20 minutes, 4 minutes). C) to precipitate the DNA. Then, the precipitated DNA was dissolved in a TE buffer, subjected to phenol / chloroform treatment two to three times, and then the supernatant was recovered by centrifugation (12,000 × g, 20 minutes, 4 ° C.). The DNA in the collected supernatant was recovered by ethanol precipitation, dissolved in TE buffer, and stored at 4 ° C. until use.
[0080]
《Creating a genomic DNA library》
The chromosomal DNA prepared in the above "Preparation of Genomic DNA" was partially digested with Sau3AI (TaKaRa), and a 9-23 kbp chromosomal DNA fragment was purified and isolated by sucrose density gradient centrifugation. After the dephosphorylation treatment of the isolated DNA fragment was performed using Cal intestine alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim), the TaKaRa ligation kit ver. Was added to the λDASHII / BamHI vector (Strategene). II (TaKaRa). Packaging was performed using Gigapack III Plus Packaging Extract (Stratagene).
[0081]
<< mRNA isolation and cDNA synthesis >>
Cryptococcus humicolas UJ1 strain was inoculated into a 10 ml YPD liquid medium [1% yeast extract (Nacalai Tesque), 2% casein peptone (Nacalai Tesque), 2% glucose (Nacalai Tesque)] in a 70 ml test tube. The cells were cultured with shaking at 160 rpm for 30 hours at 30 ° C. The cultured cells are collected by centrifugation (10,000 × g, 1 minute, 4 ° C.), washed twice with ice-cold sterilized water, and 100 ml of YCBD liquid in a 500 ml Sakaguchi flask. OD in medium [1% D-aspartic acid (Tanabe Seiyaku), 1.17% yeast carbon base (Difco), pH 7.0]₆₀₀Was inoculated to be 0.05, and cultured at 30 ° C. for 11.5 hours with shaking at 160 rpm. The cultured cells were collected by centrifugation (5,000 × g, 5 minutes, 4 ° C.), and washed with ice-cold water.
[0082]
Extraction of total RNA from the prepared cells was performed by the method of Brown et al. [Brown, A. et al. J. P. : Methods in Molecular Biology, 53, p. 269 (1996)]. Poly (A) from total RNA⁺RNA was isolated using the Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit (TaKaRa). Gubler and Hoffman et al. [Gene, 25, p. 263 (1983)], and using the cDNA Synthesis Kit (TaKaRa), poly (A) prepared as described above.⁺Double-stranded DNA was synthesized using RNA as a template, and the cDNA was amplified using TaKaRa cDNA PCR library Kit (TaKaRa).
[0083]
<< Acquisition of DNA fragment encoding a part of gene >>
Two types of degenerate primers (Nisshinbo) were synthesized based on the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the internal amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the D-aspartate oxidase protein purified from the Cryptococcus humiculus UJ1 strain. . The nucleotide sequences of these degenerate primers are shown in SEQ ID NO: 3 (NDDOp1) and SEQ ID NO: 4 (NADDOp1), respectively. Using the cDNA prepared in the above "Isolation of mRNA and synthesis of cDNA" as a template, a partial gene fragment encoding the present enzyme was obtained by PCR. The conditions for PCR are as follows. That is, 50 pmol of NDDOp1 primer, 50 pmol of NADDOp1 primer, 20 nmol of dNTP (TaKaRa), 2 μl of cDNA solution, 2.5 U of TaKaRa EX Taq (TaKaRa), and 10 μl of 10 × EXTaq buffer (TaKaRa). Using a 100 μl reaction solution containing the mixture, 35 cycles of denaturation (94 ° C., 30 seconds), annealing (50 ° C., 30 seconds), and extension (72 ° C., 1 minute) were performed, and PTC-100 Programmable Thermal Controller (PTC-100) was used. PCR was performed by repetition using MJ Research. After this reaction, a part of the reaction solution was analyzed by agarose gel electrophoresis, and as a result, a band considered to be specific was detected.
[0084]
《Base sequence analysis of PCR product》
The DNA fragment obtained in the above-mentioned "Obtainment of DNA fragment encoding a part of gene" was extracted with phenol / chloroform and recovered as an ethanol precipitate. Next, the recovered DNA fragment was subjected to agarose gel electrophoresis, a band portion containing the target DNA fragment was cut out, and the DNA fragment in the gel was purified using QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen). Next, the purified DNA fragment was transferred to TaKaRa ligation kit ver. It was cloned into pT7BlueT vector (Novagen) using II (TaKaRa). Then, in order to analyze the base sequence of this DNA fragment, the DNA fragment was excised from the pT7BlueT vector with EcoRI (TaKaRa) and HindIII (TaKaRa), extracted and purified from an agarose gel by the above-described method, and extracted with TaKaRa ligation kit ver. It was cloned between EcoRI site and HindIII site of pBluescriptII SK (+) (Stratagene) using II (TaKaRa), and introduced into E. coli XLI-Blue MRF '.
[0085]
Nucleotide sequence analysis was performed using the VCSM13 helper phage (Stratagene) according to the method of Sambrook et al. [Molecular Cloning, 3rd Edt. (2001)]. Using the prepared single-stranded DNA (0.65 μg) as a template, and using a Cy5-labeled T7 promoter primer (Amersham pharmacia biotech) containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 as a primer, Thermo Sequenase fluorescein liquefaction commercial cycling chemistry The reaction was performed by the dideoxy chain terminator method using -deaza-dGTP (Amersham Bioscience). The product of this reaction was analyzed using a DNA sequencer ALFexpressII (Amersham pharmacia biotech) to determine the nucleotide sequence. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
[0086]
Computer analysis of the determined DNA base sequence revealed sequences corresponding to the primer sequences used at the 5 'end and the 3' end, confirming that the DNA was a primer-specifically amplified DNA. Further, the base sequence and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) deduced from the base sequence were subjected to homology search using DDBJ (DNA Data of Japan) using the BLAST program. As a result, there was no sequence showing significant homology to the base sequence, but there was a sequence showing homology to the deduced amino acid sequence. That is, the deduced amino acid sequence showed about 28% homology with the D-amino acid oxidase of Schizosaccharomyces pombe and Rhodosporium toluroides. Computer analysis of the DNA base sequence and the deduced amino acid sequence was performed using GENETIX-WIN Version 4 (software development).
[0087]
<< Isolation of full length gene from genomic DNA library >>
Through this processing step, a clone having a genomic DNA in which the region encoding the full-length gene of the present invention is located is obtained from the genomic DNA library of the Cryptococcus humiculus UJ1 strain prepared in the above-mentioned "Preparation of genomic DNA library".
[0088]
The DNA fragment obtained in the above “PCR product nucleotide sequence analysis” was excised from the vector, and extracted and purified from agarose gel by the method described in the above “PCR product nucleotide sequence analysis”. The extracted and purified DNA fragment was labeled with alkaline phosphatase using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Bioscience) and used for screening a genomic DNA library.
[0089]
Four positive clones were isolated by screening 20,000 plaques using AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Bioscience). One positive plaque in the clone was purified and infected with Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2) to increase the number of phages. Then, phage particles were purified to obtain phage DNA. From the prepared phage DNA, a DNA fragment of about 1.8 kbp generated by digestion with SalI (TaKaRa) presumed to have a full-length D-aspartate oxidase gene was cut out from the phage DNA, and agarose gel was used as described above. Purified. This purified DNA fragment was obtained using TaKaRa ligation kit ver. It was subcloned into the SalI site of the pBluescript II KS (+) (Stratagene) vector using II (TaKaRa).
[0090]
Plasmid DNA was obtained from Escherichia coli transformed and cloned with this vector by a conventional method [Sambrook, J. et al. and Russell, D.C. W. : Molecular Cloning, 3rd Edt. (2001)]. Various deletions were prepared from the prepared plasmid DNA using the TaKaRa Kilo-Sequence Deletion Kit (TaKaRa). Using the same method as the method used in the above “Analysis of base sequence of PCR product”, the entire base sequence was determined for both strands. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 8. Computer analysis of this nucleotide sequence using GENETIX-WIN Version 4 (software development) revealed that the cloned DNA contained a gene encoding the full-length D-aspartate oxidase including the 5 ′ and 3 ′ untranslated regions. Was confirmed. In addition, the presence of an intron in the D-aspartate oxidase gene was suggested.
[0091]
<< Isolation of cDNA encoding full-length gene >>
Total RNA was prepared from Cryptococcus humicolas UJ1 using a method similar to that described in the above “Isolation of mRNA and Synthesis of cDNA”. Using 24 μg of the total RNA as a template, reverse transcription was performed using ThermoScript RT-PCR System (Invitrogen) to synthesize cDNA. Based on the nucleotide sequence information of the genomic DNA in the region where the cloned gene is located, two primers DDO5p1 (SEQ ID NO: 9) and DDO3p1 (sequence No. 9) hybridizing with the 5 ′ upstream and 3 ′ downstream of the ORF, respectively. No. 10) was designed. A cDNA encoding the full length of D-aspartate oxidase was amplified by PCR using these primers and the prepared cDNA. The PCR conditions are as follows. That is, 15 pmol of the DDO5p1 primer, 15 pmol of the DDO3p1 primer, 15 nmol of dNTP (TaKaRa), 2 μl of a cDNA solution, 1.25 U of Plutinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) and 1.25 U of 10 × Pfx Amplification 5 μl of 10 × PCR × Enhancer Solution (Invitrogen), MgSO₄Using 50 μl of a reaction solution containing 50 nmol (Invitrogen), 35 cycles of denaturation (94 ° C., 30 seconds), annealing (58 ° C., 30 seconds), and extension (68 ° C., 1 minute) were performed, and PTC was performed. PCR was performed by repeating using -100 Programmable Thermal Controller (MJ Research).
[0092]
After the PCR reaction, a part of the reaction solution was analyzed by agarose gel electrophoresis. As a result, a band considered to be specific was detected. The cDNA obtained by the PCR reaction was extracted with phenol / chloroform, recovered as an ethanol precipitate, cut with SalI (TaKaRa), and then subjected to agarose gel electrophoresis. Then, the target band portion is cut out, and the cDNA present in the gel is purified by QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), and then TaKaRa ligation kit ver. It was cloned into the SalI site of pBluescriptII KS (+) (Stratagene) using II (TaKaRa). This constructed plasmid was named pKSCD2. Then, in order to analyze the full-length nucleotide sequence of the cloned cDNA, various deletions were prepared by the same method as described in the above “Isolation of full length gene from genomic DNA library”, and the above “PCR product A single-stranded DNA was prepared in the same manner as described in "Nucleotide Sequence Analysis", and the entire nucleotide sequence was determined. The determined nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
[0093]
As a result of the nucleotide sequence analysis, a sequence corresponding to the genomic DNA sequence of the present gene was confirmed in the sequence of the cloned cDNA, and a start codon and a stop codon were also confirmed. Also, no introns were found in the genomic DNA sequence. SEQ ID NO: 12 shows the amino acid sequence of the protein encoded by this cDNA. In this amino acid sequence, the N-terminal sequence (SEQ ID NO: 1) and the internal amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of D-aspartate oxidase purified from Cryptococcus humiculus UJ1 strain can be confirmed. Highly conserved amino acid residues were also confirmed. From these results, it was confirmed that the cloned cDNA was a cDNA encoding the full-length D-aspartate oxidase of the Cryptococcus humiculus UJ1 strain. These analyzes were performed using GENETIX-WIN Version 4 (Software Development).
[0094]
[Example 2]
<Preparation of vector and transformant>
This example describes a vector into which the gene of the present invention has been incorporated, and a transformant into which the vector has been introduced.
<< Construction of gene expression vector in Escherichia coli >>
In order to express the gene obtained in Example 1 "Isolation of cDNA encoding full-length gene" in Escherichia coli, first, pKSCD2 constructed in "Isolation of cDNA encoding full-length gene" was used as a template and ORF was used. PCR was carried out using primer CD1p (SEQ ID NO: 13) that hybridizes to the 5 ′ end and primer CD2p (SEQ ID NO: 14) that hybridizes to the 3 ′ end to amplify the full-length gene. The PCR conditions are as follows. That is, 15 pmol of the CD1p primer, 15 pmol of the CD2p primer, 15 nmol of dNTP (TaKaRa), 20 ng of pKSCD2, 1.25 U of Plutinum Pfx DNA polymerase (Invitrogen) and 1.25 U of 10 × Pfx AmplificationEnvironmentBuffer 5 μl of 10 × PCR × Enhancer Solution (Invitrogen), MgSO 4₄Using 50 μl of a reaction solution containing 50 nmol (Invitrogen), 30 cycles of denaturation (94 ° C., 30 seconds), annealing (58 ° C., 30 seconds), and extension (68 ° C., 1 minute) were performed, and PTC was performed. PCR was performed by repeating using -100 Programmable Thermal Controller (MJ Research).
[0095]
After the PCR reaction, a part of the reaction solution was analyzed by agarose gel electrophoresis, and as a result, a target DNA band was confirmed. The obtained DNA fragment was extracted with phenol / chloroform, recovered as ethanol precipitate, cut with NdeI (New England BioLabs) and BamHI (TaKaRa), and then subjected to agarose gel electrophoresis. Then, a target band portion in the gel is cut out and purified by QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), and then TaKaRa ligation kit ver. It was cloned between NdeI and BamHI sites of pET11b (Novagen), a plasmid for expression of E. coli, using II (TaKaRa). This expression plasmid was named pECD5. Next, the following treatment is performed to confirm that no mutation has occurred in the D-aspartate oxidase gene cloned in this pECD5 during the PCR reaction.
[0096]
First, the D-aspartate oxidase gene of pECD5 was cut out with XbaI (TaKaRa) and BamHI (TaKaRa), and agarose gel electrophoresis was performed. Then, a target band in the gel is cut out, and the DNA present in this band is purified by QIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen), and then TaKaRa ligation kit ver. It was cloned between XbaI and BamHI sites of pBluescriptII SK (+) using II (TaKaRa). The nucleotide sequence of this DNA was analyzed using a method similar to the method described in “Analysis of base sequence of PCR product” above. As a result of the analysis, it was confirmed that there was no mutation in the D-aspartate oxidase gene of pECD5.
[0097]
<< Gene expression using transformants >>
The expression plasmid pECD5 was prepared by the method of Inoue et al. [Inoue, H .; Nojima, H .; and Okayama, H .; Gene, 96, p. 23 (1990)], and introduced into E. coli BL21 (DE3) for expression (Novagen) to obtain a transformant. First, the obtained Escherichia coli transformant was added to an LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) in a 25 ml test tube [1% tryptone (Nacalai Tesque), 0.5% yeast extract (Nacalai Tesque), 1% Sodium chloride (Nacalai Tesque)] was inoculated into 5 ml, and shaking-cultured at 30 ° C. overnight at 167 rpm to obtain a preculture. A 500 ml Erlenmeyer flask was charged with 100 ml of the above-mentioned medium, and pre-cultured.₆₀₀Was cultivated at 30 ° C. and 200 rpm until the value became about 0.5. OD₆₀₀Reached about 0.5, isopropylthio-β-D-galactopyranoside (Nacalai Tesque, hereinafter referred to as IPTG) was added to a final concentration of 1 mM, and further added at 30 ° C. for 6 hours. Culture was performed at 200 rpm. After completion of the culture, the cells are collected by centrifugation (5,000 × g, 10 minutes, 4 ° C.), and the cells are washed with ice-cold 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 1 mM EDTA. Was suspended in 10 ml of the same buffer. Then, the cells are crushed by ultrasonic crushing (Output 5, Duty cycle 50%, 30 seconds 15 times) on ice using ULTRASONIC DISRUPTOR UD-201 (TOMY), followed by centrifugation (20,000 × g). , 30 minutes, 4 ° C) and the supernatant was collected. This supernatant was used in the following experiments as a cell-free extract. On the other hand, the following Escherichia coli as negative controls: Escherichia coli BL21 (DE3) transfected with pECD5 cultured without adding IPTG, Escherichia coli BL21 (DE3) transfected with pET11b having no D-aspartate oxidase gene, and IPTG A cell-free extract prepared in the same manner from Escherichia coli BL21 (DE3) into which pET11b was introduced and cultured with pET11b was used as a negative control cell-free extract.
[0098]
<< Western blot analysis of expression products >>
The cell-free extract (containing 10 μg of protein) obtained in the above “Gene Expression Using Transformant” and 0.2 μg of D-aspartate oxidase protein purified from Cryptococcus humicolas UJ1 strain 2 × SDS loading buffer [0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0.01% bromophenol blue] The mixture was heated in a boiling water bath for 5 minutes to prepare SDS-PAGE samples of both samples. Next, the method of Laemmli [Laemmli, U.S.A. K. : Nature, 227, p. 680 (1970)], and the sample was subjected to SDS-PAGE under reducing conditions using a 12% polyacrylamide gel.
[0099]
After electrophoresis, the proteins were transferred from the polyacrylamide gel to a transfer buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% methanol) using a gel membrane transfer device (Bio-Rad, TRANS-BLOT SD SEMI-DRY TANSFER CELL). And transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad) under the conditions of 100 mA.
[0100]
After the transfer, the PVDF membrane was washed twice by shaking in TBS [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 NaCl] at room temperature for 10 minutes, and then a blocking buffer [3% gelatin (Bio-Rad)] And then shaken at room temperature for 1 hour. Then, the PVDF membrane was washed twice with TBS containing 0.1% Tween 20 (Bio-Rad) for 10 minutes (hereinafter referred to as TTBS), and then D-aspartate oxidation purified from Cryptococcus humicolaus UJ1 strain Rabbit anti-D-aspartate oxidase antiserum prepared using the enzyme was immersed in a 3000-fold diluted solution of TTBS containing 1% gelatin and gently shaken at room temperature for 1 hour. Next, the PVDF membrane was taken out and washed three times for 10 minutes with TTBS. Thereafter, the PVDF membrane was immersed in a solution of an alkaline phosphatase-labeled goat anti-rabbit IgG antibody (Bio-Rad) diluted 3000 times with TTBS (containing 1% gelatin), and shaken at room temperature for 1 hour. The treated PVDF membrane was taken out, washed twice with TTBS for 10 minutes, and then washed twice with TBS for 10 minutes. The washed PVDF membrane was immersed in a detection reagent for color development (Immun-Blot Kit, Bio-Rad) to detect a protein to which an antibody against D-aspartate oxidase binds.
As a result, a specific band was detected at a molecular mass of about 40 kDa in both SDS-PAGE samples. On the other hand, no specific band could be confirmed in any of the SDS-PAGE samples prepared from the negative control cell-free extract described in the above “Gene Expression Using Transformant”.
[0101]
[Example 3]
<Analysis of enzyme activity>
This example describes the enzymatic activity of an enzyme protein encoded by the gene of the present invention.
The D-aspartate oxidase activity of the cell-free extract described in "Gene Expression Using Transformants" in Example 2 was determined by the method of Yamada et al. [Yamada, R .; Ujiie, H .; Kera, Y .; , Nakase, T .; , Kitagawa, K .; , Imasaka, T .; Arimoto, K .; , Takahashi, M .; and Matsumura, Y .; : Biochim. Biophys. Acta, 1294, p. 153 (1996)]. As a result, the D-aspartate oxidase activity of the protein having a specific activity of 82.8 nmol / min · mg protein was confirmed in the cell-free extract. On the other hand, when the D-aspartate oxidase activity of the negative control cell-free extract as a negative control was measured in the same manner, the following numerical values were obtained. That is, in the cell-free extract of E. coli BL21 (DE3) having pECD5 cultured without adding IPTG, E. coli BL21 having pET11b having no 0.0531 nmol / min · mg protein and D-aspartate oxidase gene ( DE3) was 0.0224 nmol / min · mg protein, and E. coli BL21 (DE3) having pET11b cultured with IPTG was 0.0623 nmol / min · mg protein, and no significant activity could be confirmed. . The protein concentration in the cell-free extract was measured using the method of Lowry et al. [Lowry, O. et al., Using bovine serum albumin (Nacalai Tesque) as a standard substance. H. Rosebrough, N .; J. , Farr, A .; L. and Randall, R.A. J. : J. Biol. Chem. , 193, p. 265 (1951)].
[0102]
[Example 4]
<Analysis of various properties of enzymes>
This example describes the properties of the enzyme protein encoded by the gene of the present invention.
The results of analysis of various properties of the enzyme protein in comparison with enzymes derived from other organisms are described below. In particular, effects on enzyme activity such as thermal stability and protein concentration. In addition, kinetic analyzes were performed on substrate specificity and the effect of inhibitors. Enzymes derived from other organisms include bovine kidney and octopus hepatopancreas D-aspartate oxidase, partially purified porcine kidney D-aspartate oxidase, and yeast Candida bondinii 2201 strain D-glutamate oxidase purified from was used.
[0103]
[Table 1]

[0104]
Porcine kidney D-aspartate oxidase was partially purified 195-fold. This was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and consisted of two major proteins, 53 and 57 kDa, and several other proteins.
The D-glutamate oxidase of Candida boizini 2201 strain was purified. When this was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, it was composed of a 45 kDa protein. The molecular weight of the native enzyme was estimated to be 43 kDa by gel filtration.
[0105]
"material"
D-aspartic acid used was donated by Tanabe Seiyaku. Bovine serum albumin (BSA) and other reagents used were reagents purchased from Nacalai Tesque.
[0106]
"Method"
The D-aspartate oxidase activity was measured using a 50 mM sodium pyrophosphate buffer (pH 7.5) containing 20 mM D-aspartic acid at a reaction temperature of 37 ° C. and a reaction time of 10 minutes unless otherwise indicated. In addition, in order to prevent inactivation, the enzyme was diluted so that the final concentration was 0.5 g / mL BSA.
Optimum pH and optimum temperature
For the examination of the optimum pH, the enzyme activity at each pH was measured in the range of pH 6.0 to 10.0 using a 50 mM potassium pyrophosphate buffer. For the study of the optimum temperature, the enzyme activity at each temperature was measured in the range of 20 to 60 ° C.
[0107]
Thermal stability
In order to examine the thermostability of the present enzyme, the enzyme activity (58 μg / mL, 76.1 μmol / min · mg) was measured after the enzyme was incubated at 20 to 60 ° C. for 10 minutes. In addition, to further stabilize the enzyme, the thermal stability when BSA was added at 25 or 500 μg / mL was also examined.
[0108]
Examination of activity measurement conditions
The method for diluting the enzyme was examined by diluting the enzyme using 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.5 mg / ml BSA or 10% (v / v) glycerin as a diluent, cooling on ice, and proceeding. Enzyme activity was measured every hour. The linearity of the enzyme reaction in the range of 25 to 40 ° C. was measured at each temperature after incubation at each temperature. The correlation between the enzyme activity and the absorbance was shown by measuring the activity while changing the dilution ratio of the enzyme (11.1 μmol / mim / mL).
[0109]
Substrate specificity
Substrates for the present enzyme include acidic amino acids D-type and L-type aspartic acid and glutamic acid, NMDA (N-methyl-D-aspartic acid), and other D-amino acids, alanine, asparagine, glutamine, and valine. , Leucine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, and arginine were used to measure enzyme activity. All substrate concentrations were 20 mM and the pH of the buffer was 7.5.
[0110]
Km, V for substrate max value
The effects of the substrate concentration when D-aspartic acid, D-glutamic acid, and NMDA were used as substrates for the enzyme were measured, and the values of the Michaelis constant (Km) and the maximum velocity (Vmax) were determined. The substrate concentration at this time was measured such that D-aspartic acid was 0.1 to 20 mM, D-glutamic acid was 4 to 50 mM, and NMDA was 1 to 20 mM.
[0111]
Effects of inhibitors
As inhibitors of this enzyme, dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, D-malic acid, meso-tartaric acid, DL-tartaric acid, fumaric acid, and maleic acid; n-butyric acid; citric acid, a tricarboxylic acid; and the inhibitory effect when EDTA, a metal chelating agent, was added. All inhibitor concentrations were 20 mM.
[0112]
Ki value for inhibitor
The effect of substrate concentration when malonic acid, D-malic acid, and meso-tartaric acid were used as inhibitors of this enzyme was measured with respect to the concentration of each inhibitor. At this time, the substrate concentration was D-aspartic acid 0.07 to 20 mM. In addition, each inhibitor concentration was measured to be 0 to 20 mM.
[0113]
"Results and discussion"
Optimum pH and optimum temperature
The effect of pH on the activity of the enzyme was examined (FIG. 1). The optimum pH of this enzyme was 7.5, and it was revealed that the region exhibiting high activity was in a narrow range of pH 7 to 8 (about 60% of the maximum activity at pH 8.5). This result is the result observed for the present enzyme derived from vertebrates and octopuses reported so far, that is, high activity at a pH significantly higher than the physiological pH observed when an acidic D-amino acid is used as a substrate. Tended to be different from the result. For example, in pig kidney, the optimum pH is 8.5, and the region showing about 90% or more of the maximum activity is quite wide, from 7.5 to 9.5. On the other hand, the optimum pH of D-glutamate oxidase of Candida boijini 2201 strain is 7.0, and the region showing high activity is quite narrow (at pH 8.5, about 30% of the maximum activity).
[0114]
Next, the effect of temperature on the enzyme activity was examined (FIG. 2). The optimum temperature of this enzyme was 33 to 37 ° C, and the region showing high activity was within a narrow range. Significantly lower when compared to the optimal temperature of 47.5 ° C in pig kidney (high activity over a wide range of 35-50 ° C) On the other hand, the result of the enzyme of Candida boijini strain 2201 was similar to the result of the present enzyme, and the optimum temperature was 37 ° C.
As described above, the enzyme of the present invention exhibited properties different from those of animals at both the optimum pH and the optimum temperature. However, the enzyme of the present invention differs from D-glutamate oxidase of Candida boijini 2201, which is a kind of the same yeast. It exhibited similar properties.
[0115]
Thermal stability
The thermostability of this enzyme was examined (FIG. 3). This enzyme was almost stable up to 30 ° C, but it became clear that it became slightly unstable at a temperature higher than 30 ° C, and rapidly became unstable above 45 ° C. Stabilization was attempted by adding BSA, but had little effect. This suggests that the enzyme protein may be inactivated at 45 ° C. or higher due to denaturation. On the other hand, porcine kidney D-aspartate oxidase is relatively stable to heat (protein concentration: about 0.5 mg / ml, about 60% residual activity at 60 ° C. by incubation for 10 minutes). It was very different.
[0116]
Examination of activity measurement conditions
This enzyme was suggested to be unstable due to heat and low protein concentration, so we tried to establish the activity measurement conditions based on these.
When performing the enzyme activity measurement, when the enzyme activity was high, the measurement was performed after dilution, but it was clarified that the enzyme was immediately inactivated when the purified enzyme was diluted. Therefore, a method of diluting the enzyme was examined (FIG. 4). It was revealed that this enzyme was quickly inactivated when diluted with a phosphate buffer or glycerin solution, and that the activity was lost immediately after dilution when a phosphate buffer was used. On the other hand, when diluted with the BSA solution, no inactivation of the enzyme was observed for about 20 minutes. From these results, it is considered that it is preferable to use a BSA solution or the like when diluting the enzyme.
[0117]
Since this enzyme has poor thermostability, it was suggested that the enzyme was inactivated in the measurement of the activity. Therefore, the temperature and time of the enzyme activity measurement were examined (FIG. 5). When the activity of this enzyme was measured at an optimum temperature of 34 to 37 ° C., the linearity was observed for about 15 minutes, but it was found that the enzyme deviated from the straight line for a longer time. At 40 ° C. higher than that, no linearity was observed. On the other hand, at 25 ° C. and 30 ° C. lower than the optimum temperature, the linearity was maintained for a long time, but within 30 minutes, the absorbance was lower than the optimum temperature. From these results, it is considered that this enzyme activity measurement is preferably performed at the optimum temperature for 10 minutes.
[0118]
Furthermore, in order to consume more substrate with the same amount of enzyme, it is more efficient to react at a low temperature for a long time. In the measurement of the enzyme activity, it was revealed that when a high concentration of the enzyme was added to the reaction solution, the calculated value was lower than the expected activity value. Therefore, the degree of correlation between the amount of the enzyme during the activity measurement and the absorbance was examined (FIG. 6). Almost linearity was observed up to an absorbance of 0.6 and an enzymatic activity of 200 nmol / min / ml (corresponding to the oxidation of 100 nmol of D-aspartic acid in 1 ml of the reaction solution). I knew it would go. Based on the above results, the conditions for activity measurement were 200 nmol / min / ml or less at 37 ° C. for 10 minutes, and 0.5 mg / mL BSA was used for enzyme dilution.
[0119]
Substrate specificity
The substrate specificity of the present enzyme for each amino acid was examined (Table 2). Here, the relative activities are shown for the other activities assuming that the enzyme activity for D-aspartic acid is 100%. This enzyme was the most active against D-aspartic acid, followed by 9.4% against NMDA and 0.4% against D-glutamic acid, the same acidic D-amino acid. From this result, it was clarified that the present enzyme uses D-aspartic acid as a good substrate and does not act much on other amino acids.
[0120]
[Table 2]

[0121]
Substrate was used at a concentration of 20 mM.
[0122]
Km, V for substrate max value
Kinetic analysis was performed on the affinity between this enzyme and a substrate (D-aspartic acid, D-glutamic acid, NMDA). Km and Vmax values were analyzed for each substrate (Table 3). The Km and Vmax values were 3.65 mM and 81.3 μmol / min · mg for D-aspartic acid, 152 mM and 3.04 μmol / min / mg for D-glutamic acid, and 28 for NMDA, respectively. 0.0 mM and 15.8 μmol / min · mg. Comparing the enzyme efficiencies (kcat / Km), it was overwhelmingly higher for D-aspartic acid, about 1000 times the value for D-glutamic acid, and about 40 times the value for NMDA. Compared to other animals (Table 4), NMDA is a more suitable substrate (approximately 47 and 3.6 times, respectively) than D-aspartic acid in cattle and pigs. On the other hand, octopus also acts on D-glutamic acid at almost the same ratio as D-aspartic acid. Therefore, it became clear that this enzyme is significantly different from enzymes derived from other organisms in terms of substrate specificity.
[0123]
[Table 3]

[0124]
The substrate concentrations used were 0.1-20 mM for D-aspartic acid, 4-50 mM for D-glutamic acid, and 1-20 mM for NMDA. kcat was calculated based on the molecular weight of the monomer subunit (40 kDa).
[0125]
[Table 4]

[0126]
Bovine and octopus; Kinetic parameters were measured at 25 ° C. in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 0.3 mM EDTA, 0.25 mM fixed oxygen concentration.
Pigs; Kinetic parameters were measured at 37 ° C. in 50 mM sodium pyrophosphate buffer (pH 8.5) containing 25 μg / ml bovine serum albumin.
[0127]
Further, for D-aspartic acid, investigation was carried out with a low concentration of the substrate. The Lineweaver-Burk plot (data not shown) showed linearity even at low concentrations of the substrate and was found to follow the Michaelis-Menten equation. However, it is known that D-aspartate oxidase of bovine, porcine and octopus reported so far does not follow the Michaelis-Menten equation. This tendency is also a feature not found in known enzymes.
[0128]
Effects of inhibitors
The effect of the inhibitor of this enzyme was examined (Table 5). Malonic acid inhibited the enzyme most strongly, followed by D-malic acid. However, strong inhibition has been confirmed in cattle, octopuses, chickens, pigeons, amphibians, rainbow trout D-aspartate oxidase studied in our laboratory, and D-glutamate oxidase in yeast Candida voidini 2201 strain. meso-tartaric acid had no significant inhibitory effect. This tendency is also a feature not found in known enzymes. Also, benzoic acid, which is an inhibitor for D-amino acid oxidase, had no inhibitory effect.
[0129]
[Table 5]

[0130]
【The invention's effect】
A novel gene encoding an enzyme that specifically recognizes D-aspartic acid is provided. Also provided is an expression vector incorporating the gene. Further, a transformant into which the vector has been introduced is provided. Still further, a recombinant protein comprising the gene is provided.
[0131]
Further, these inventions can be used as a means for detecting D-aspartic acid specifically and at low cost, and can be applied to production of keto acid, optical resolution of racemic aspartic acid, and the like.
[0132]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the correlation between pH conditions and activity in D-aspartate oxidase of the present invention.
Enzyme activity was measured in the pH range 6-10 (in 50 mM pyrophosphate buffer). Data are shown as percentage of maximal activity at pH 7.5.
FIG. 2 is a diagram showing the correlation between temperature conditions and activity in D-aspartate oxidase of the present invention.
Enzyme activity was measured after 10 minutes incubation at the indicated temperature. Data are shown as percentage of maximal activity at 37 ° C.
FIG. 3 is a diagram showing a correlation between temperature conditions and enzyme stability in the D-aspartate oxidase of the present invention.
The enzyme solution (58 μg / ml) was incubated for 10 minutes at a temperature in the range of 20 to 60 ° C., after which a normal activity measurement was performed. Relative activity is shown as the enzyme activity at 20 ° C. being 100%.
FIG. 4 shows the stability of D-aspartate oxidase of the present invention in the presence of BSA or glycerol.
The enzyme solution (58 μg / ml, 95.1 units / mg) was diluted 30-fold with a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing the following reagents. The reagents used were 0.5 mg / ml BSA and 10% glycerol (v / v). These were kept in ice and the enzyme activity was measured at each time. The relative activity was defined as 100% at 0 min when BSA was added.
FIG. 5 is a diagram showing the time course of the reaction of the D-aspartate oxidase of the present invention under various temperature conditions.
The enzyme solution (58 μg / ml, 98.6 units / mg) was diluted 80-fold with 0.5 mg / ml BSA. 50 μl of the enzyme solution was added to 1 ml of the reaction solution. An absorbance of 0.6 corresponds to the oxidation of about 100 nmol of D-aspartic acid in 1 ml of reaction solution.
FIG. 6 is a diagram showing a correlation between the activity of D-aspartate oxidase of the present invention and a change in absorbance (accumulation of a reaction product).
The enzyme solutions (82 μg / ml, 137.0 units / mg) were each diluted with 0.5 mg / ml BSA. 50 μl of the enzyme solution was added to 1 ml of the reaction solution. An absorbance of 0.6 corresponds to the oxidation of about 100 nmol of D-aspartic acid in 1 ml of reaction solution.

Claims

遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子。A gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific for free D-aspartate,
A DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; or a DNA that hybridizes with the DNA consisting of the nucleotide sequence under stringent conditions and encodes a protein having the activity of the enzyme protein;
A gene consisting of

遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１１記載の塩基配列からなるＤＮＡ；または
前記塩基配列からなるＤＮＡにおいて１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
からなる遺伝子。A gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific for free D-aspartate,
A DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11; or a DNA consisting of a nucleotide sequence in which one or several bases have been deleted, substituted, or added to the DNA consisting of the nucleotide sequence, and having the activity of the enzyme protein. Encoding DNA;
A gene consisting of

遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質をコードする遺伝子であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；または
前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する蛋白質；をコードする遺伝子。A gene encoding a D-aspartate oxidase protein specific for free D-aspartate,
A protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12; or a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and having the activity of the enzyme protein. gene.

請求項１〜３の何れか１項に記載の遺伝子であって、前記遺伝子が、酵母クリプトコッカス・ヒュミコラス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｈｕｍｉｃｏｌｕｓ）ＵＪ１株に由来することを特徴とする遺伝子。The gene according to any one of claims 1 to 3, wherein the gene is derived from the yeast strain Cryptococcus humicolus UJ1.

遊離Ｄ−アスパラギン酸に特異的なＤ−アスパラギン酸酸化酵素蛋白質の組換え蛋白質であって、
配列番号１２記載のアミノ酸配列からなる組換え蛋白質、または
該配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ前記酵素蛋白質の活性を有する組換え蛋白質。A recombinant D-aspartate oxidase protein specific to free D-aspartic acid,
A recombinant protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or a recombinant protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, or added, and having the activity of the enzyme protein.

請求項１〜４の何れか１項に記載の遺伝子を含むベクター。A vector comprising the gene according to any one of claims 1 to 4.

請求項６記載のベクターによって形質転換した形質転換体。A transformant transformed by the vector according to claim 6.

請求項７記載の形質転換体であって、前記形質転換体が真核生物である形質転換体。The transformant according to claim 7, wherein the transformant is a eukaryote.

請求項８記載の形質転換体であって、前記真核生物が酵母である形質転換体。The transformant according to claim 8, wherein the eukaryote is yeast.

請求項７記載の形質転換体であって、前記形質転換体が原核生物である形質転換体。The transformant according to claim 7, wherein the transformant is a prokaryote.

請求項１０記載の形質転換体であって、前記原核生物が細菌である形質転換体。The transformant according to claim 10, wherein the prokaryote is a bacterium.

請求項１１記載の形質転換体であって、前記細菌が大腸菌である形質転換体。The transformant according to claim 11, wherein the bacterium is Escherichia coli.