JP2004315381A - THERAPEUTIC DRUG FOR IMMUNOLOGICAL DISEASE USING STIMULATION OF NATURAL KILLER T CELL BY INTERLEUKIN 18, THERAPEUTIC KIT, AND METHOD FOR CONTROLLING IgE PRODUCTION - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ナチュラルキラーＴ細胞のインターロイキン１８による刺激を利用した免疫疾患治療薬剤、免疫疾患治療キット、およびＩｇＥ産生の制御方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞と略す）は、ＮＫ細胞のマーカーであるＮＫ１．１抗原と、Ｖα１４−Ｊα２８１鎖およびＶβ８．２鎖のヘテロ二量体からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲと略す）とを発現しているユニークなＴ細胞である。
【０００３】
このＮＫＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子類似の糖タンパク質であるＣＤ１ｄにより提示されるα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）等の糖脂質を認識することが知られている。また、ＮＫＴ細胞の約６割はＣＤ４（ヘルパー細胞の細胞膜糖タンパク質の一つ）を発現（ＣＤ４＋）しており、残りは、ＣＤ４もＣＤ８（キラーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞のマーカーとして知られる細胞表面抗原）も発現していない（ＣＤ４−ＣＤ８−）ものが多い（非特許文献１参照）。
【０００４】
ＮＫＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒ等の抗原で刺激されると、迅速にインターロイキン４（ＩＬ−４）およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を産生する。したがって、ＮＫＴ細胞におけるこの反応系（ＩＬ−４・ＩＮＦ−γを産生する系）を制御することができれば、ホストの免疫応答を制御したり、各種の免疫疾患の治療等に応用したりすることが可能である。したがって、このようなＮＫＴ細胞の反応系を選択的に誘導する技術は、Ｔｈ１サイトカインやＴｈ２サイトカインの産生を制御することを可能にする。
【０００５】
なお、上記ＮＫＴ細胞は、生体内の様々な臓器に存在するが、この細胞が減少すると、ＩｇＥの産生が生じないことが知られている。また、ＮＫＴ細胞の胸腺内の消長と１型糖尿病の発生とに相関があること、特に、ＮＫＴ細胞を糖尿病好発症マウス（ＮＯＤ）に投与すると、ＮＫＴ細胞から産生されたＩＬ−４およびＩＬ−１０の作用で、発症が阻止されることも報告されている。
【０００６】
ところで、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）は、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）と相互作用することでＴｈ１応答を増進させる。一方、ＩＬ−１８の単独投与は、ＩｇＥの産生とアレルギー性炎症とを誘導する。つまりＩＬ−１８は、ヘルパーＴ細胞のサブセットであるタイプ２（Ｔｈ２）細胞応答を誘導する活性も有している。このＩＬ−１８の示すＩｇＥを誘導する能力は、ＣＤ４を発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、ＩＬ−４およびＳＴＡＴ６（サイトカインの作用機構に関与する細胞内シグナル伝達分子で、ＩＬ−４で特異的に活性化される）に依存する。
【０００７】
このＩＬ−１８は、最初は、抗ＣＤ３抗体とＩＬ−１２の作用で誘導される、ヘルパーＴ細胞のサブセットであるヘルパータイプ１（Ｔｈ１）細胞からのＩＦＮ−γの産生を高めるファクターとして同定された（非特許文献２・３参照）。後の研究で、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２は、直接的および相互作用的にＴｈ１細胞、非分極型状態にあるＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、マクロファージ、および樹状細胞に作用してＩＦＮ−γの産生を誘導することが明らかとなっている（非特許文献４−９）。
【０００８】
さらに、最近では、ＩＬ−１２の非共存下で、ＩＬ−１８はＴ細胞、好塩基球、肥満細胞に作用してＴｈ２サイトカインの産生を誘導することが明らかとなっている。すなわち、ＩＬ−３の存在下で、ＩＬ−１８は、好塩基球および肥満細胞を刺激し、ＩｇＥ抗体によるＦｃεＲ（好塩基球のＩｇＥ抗体に対するＦｃ受容体（ＦｃＲ））の架橋が無くてもＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生する（非特許文献１０参照）。
【０００９】
これらの知見から、ＩＬ−１８は、アレルギー疾患、特に、特定の抗原に対する感受性の欠損に特徴を有する固有型のアトピー疾患を促進することが示唆される。
【００１０】
【非特許文献１】
Ｂｅｎｄｅｌａｃ， Ａ．， Ｍ．Ｎ． Ｒｉｖｅｒａ， Ｓ．−Ｈ． Ｐａｒｋ， ａｎｄ Ｊ．Ｈ． Ｒｏａｒｋ． １９９７． Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＫ１ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ｓｐｅｃ−ｉｆｉｃｉｔｙ， ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：５３５−５６２．
【００１１】
【非特許文献２】
Ｏｋａｍｕｒａ， Ｈ．， Ｈ． Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｔ． Ｋｏｍａｔｓｕ， Ｍ． Ｙｕｔｓｕｄｏ， Ａ． Ｈａｋｕｒａ， Ｔ． Ｔａｎｉｍｏｔｏ， Ｋ． Ｔｏｒｉｇｏｅ， Ｔ． Ｏｋｕｒａ， Ｙ． Ｎｕｋａｄａ， Ｋ． Ｈａｔｔｏｒｉ， ｅｔ ａｌ． １９９５． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ＩＦＮ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ． ３７８：８８−９１．
【００１２】
【非特許文献３】
Ｇｕ， Ｙ．， Ｋ． Ｋｕｉｄａ， Ｈ． Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｇ． Ｋｕ， Ｋ． Ｈｓｉａｏ， Ｍ．Ａ． Ｆｌｅｍｉｎｇ， Ｎ． Ｈａｙａｓｈｉ， Ｋ． Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ， Ｈ． Ｏｋａｍｕｒａ， Ｋ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， ｅｔ ａｌ． １９９７． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｄｉ−ａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． ２７５：２０６−２０９．
【００１３】
【非特許文献４】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｄ．， Ｋ． Ｓｈｉｂｕｙａ， Ａ． Ｍｕｉ， Ｆ． Ｚｏｎｉｎ， Ｅ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｔ． Ｓａｎａ， Ｓ．Ｂ． Ｈａｒｔｌｅｙ， Ｓ． Ｍｅｎｏｎ， Ｒ． Ｋａｓｔｅｌｅｉｎ， Ｆ． Ｂａｚａｎ， ｅｔ ａｌ． １９９７． ＩＧＩＦ ｄｏｓｅ ｎｏｔ ｄｒｉｖｅ Ｔｈ１ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｕｔ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＩＲＡＫ ａｎｄ ＮＦ Ｂ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ７：５７１−５８１．
【００１４】
【非特許文献５】
Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｋ． Ｔａｋｅｄａ， Ｔ． Ｔａｎａｋａ， Ｋ． Ｏｈｋｕｓｕ， Ｓ． Ｋａｓｉｗａｍｕｒａ， Ｈ． Ｏｋａｍｕｒａ， Ｓ． Ａｋｉｒａ， ａｎｄ Ｋ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ． １９９８． ＩＬ−１２ ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＩＬ−１８ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ， Ｔｈ１ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ： ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ｗｉｔｈ ＩＬ−１８ ｆｏｒ ＩＦＮ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１：３４００−３４０７．
【００１５】
【非特許文献６】
Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｈ． Ｏｋａｍｕｒａ， Ｙ．Ｉ． Ｔａｇａｗａ， Ｙ． Ｉｗａｋｕｒａ， ａｎｄ Ｋ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ． １９９７． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １８ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １２ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＩｇＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９４：３９４８−３９５３．
【００１６】
【非特許文献７】
Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ， Ｃ．Ａ．， Ｄ． Ｎｏｖｉｃｋ， Ａ．Ｊ． Ｐｕｒｅｎ， Ｇ． Ｆａｎｔｕｚｚｉ， Ｌ． Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｈ． Ｍｕｈｌ， Ｄ．Ｙ． Ｙｏｏｎ， Ｌ．Ｌ． Ｒｅｚｎｉｋｏｖ， Ｓ．Ｈ． Ｋｉｍ， ａｎｄ Ｍ． Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ． １９９８． Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８： ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ． Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ． Ｂｉｏｌ． ６３：６５８−６６４．
【００１７】
【非特許文献８】
Ｍｕｎｄｅｒ， Ｍ．， Ｍ． Ｍａｌｌｏ， Ｋ． Ｅｉｃｈｍａｎｎ， ａｎｄ Ｍ． Ｍｏｄｏｌｅｌｌ． １９９８． Ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｕｐｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−１２ ａｎｄ ＩＬ−１８： ａ ｎｏｖｅｌ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７：２１０３−２１０８．
【００１８】
【非特許文献９】
Ｆｕｋａｏ， Ｔ．， Ｓ． Ｍａｔｓｕｄａ， ａｎｄ Ｓ． Ｋｏｙａｓｕ． ２０００． Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＩＬ−４ ａｎｄ ＩＬ−１８ ｏｎ ＩＬ−１２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＩＦＮ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：６４−７１．
【００１９】
【非特許文献１０】
Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｈ． Ｔｓｕｔｓｕｉ， Ｋ． Ｔｏｍｉｎａｇａ， Ｋ． Ｈｏｓｈｉｎｏ， Ｈ． Ｏｋａｍｕｒａ， Ｓ． Ａｋｉｒａ， Ｗ．Ｅ． Ｐａｕｌ， ａｎｄ Ｋ． Ｎａｋａｎｉｓｈｉ． １９９９． ＩＬ−１８， ａｌｔｈｏｕｇｈ ａｎｔｉａｌｌｅｒｇｉｃ ｗｈｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ＩＬ−１２， ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ ＩＬ−４ ａｎｄ ｈｉｓｔａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｂｙ ｂａｓｏｐｈｉｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６：１３９６２−１３９６６．
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、ＮＫＴ細胞により産生されるＩＬ−４とＩＦＮ−γとは、相互に機能を打ち消す。そのため、何れかのサイトカインを選択的に誘導する技術が求められている。
【００２１】
また、上述したように、ＮＫＴ細胞はＴｈ１サイトカインやＴｈ２サイトカインを産生する反応系に関与し、ＩＬ−１８は、Ｔｈ２細胞応答を生じさせる反応系に関与する。しかしながら、サイトカインネットワークにおいて、ＮＫＴ細胞とＩＬ−１８との関係はこれまで明らかになっていない。
【００２２】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであって、その目的は、サイトカインネットワークにおけるＮＫＴ細胞およびＩＬ−１８の関係を明らかにし、これを利用して新規な免疫疾患治療薬剤および免疫薬剤治療キットと、ＩｇＥ産生の制御方法とを提供することにある。
【００２３】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を鑑み鋭意検討した結果、これまでにＩＬ−１８をマウスに投与するとＩｇＥの産生が誘導されることが明らかになっていることから、この反応系（ＩＬ−１８の投与によるＩｇＥの産生の系）で、ＩＬ−１８の生体内のターゲットは、ＩＬ−１８受容体を発現しているＮＫＴ細胞であることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２４】
すなわち、本発明にかかる免疫疾患治療薬剤は、インターロイキン１８で刺激して誘導されるＩＬ−１８刺激ナチュラルキラーＴ細胞を含むことを特徴としている。
【００２５】
上記免疫疾患治療薬剤においては、ＩＬ−１８刺激ナチュラルキラーＴ細胞が、ＣＤ４を発現しているものであることが好ましい。また、上記ＩＬ−１８刺激ナチュラルキラーＴ細胞としては、ホスト生物から単離したナチュラルキラーＴ細胞を、インターロイキン１８の存在下で培養して得られるものを挙げることができる。さらに、上記ＩＬ−１８刺激ナチュラルキラーＴ細胞は、インターロイキン１８に加えてインターロイキン２を存在させた状態で培養して得られるものであることが好ましい。加えて、上記免疫疾患治療薬剤の一例としては、静脈注射用のものを挙げることができる。
【００２６】
また、本発明にかかる他の免疫疾患治療薬剤は、インターロイキン１８によるナチュラルキラーＴ細胞の刺激を阻害するＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤を含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明にかかる免疫疾患治療キットは、上述した各種免疫疾患治療薬剤を含む構成と、ナチュラルキラーＴ細胞をホスト生物から単離するための単離用素材と、ナチュラルキラーＴ細胞をインターロイキン１８の存在下で培養するための刺激用培地と、上記刺激用培地に加えるインターロイキン１８を含有する刺激薬剤とを含む構成を挙げることができる。上記刺激薬剤には、インターロイキン２が含有されることが必要で、インターロイキン１８を含有する刺激薬剤を第一の刺激薬剤とした場合に、インターロイキン２を含有する第二の刺激薬剤となる。
【００２８】
さらに、上記何れのタイプの免疫疾患治療キットにおいても、ＣＤ４を発現するナチュラルキラーＴ細胞を含む必要がある。
【００２９】
本発明にかかるＩｇＥ産生の制御方法は、インターロイキン１８によりナチュラルキラーＴ細胞を刺激して、インターロイキン−４産生とＣＤ４０リガンド発現とを選択的に増強するＮＫＴ刺激工程、または、インターロイキン１８によるナチュラルキラーＴ細胞の刺激を阻害するＮＫＴ刺激阻害工程の何れかを含むことを特徴としている。
【００３０】
上記ＮＫＴ刺激工程は、インターロイキン１８の投与、または、インターロイキン１８で刺激して誘導されるＩＬ−１８刺激ナチュラルキラーＴ細胞の投与により実施されればよく、上記ＮＫＴ刺激阻害工程は、インターロイキン１８によるナチュラルキラーＴ細胞の刺激を阻害するＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤の投与により実施されればよい。
【００３１】
上記構成または方法によれば、ＩＬ−１８によってＮＫＴ細胞を刺激することにより、ＩＬ−４を選択的に産生してＩｇＥの産生を正に制御したり、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害してＩｇＥの産生を負に制御したりすることができる。その結果、本発明は、各種免疫疾患の治療に有効に利用することができる。
【００３２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３３】
本発明の重要な特徴点は、ＮＫＴ細胞をＩＬ−１８で刺激することにあり、特に、ＩＬ−１８およびＩＬ−２で刺激すると、ＩＦＮ−γの産生は軽度のままで、主にＩＬ−４の産生のみを選択的に誘導することができる。
【００３４】
したがって、本発明には、ＩＬ−１８で刺激したＮＫＴ細胞を含む免疫疾患治療薬剤等が含まれ、これを投与することで、過剰なＴｈ１免疫応答が原因で起こる自己免疫疾患を有効に治療することが可能となる。また、本発明には、ＩＬ−１８のＮＫＴ細胞への作用を阻止する阻害剤等も含まれ、これにより、ＩｇＥ産生誘導を阻止することが可能となり、アレルギー疾患等を有効に治療することが可能となる。
【００３５】
（１）本発明にかかる免疫疾患治療薬剤
本発明にかかる免疫疾患治療薬剤としては、ＩＬ−１８で刺激して誘導されるＮＫＴ細胞（説明の便宜上、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞と称する）を含むタイプと、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害する阻害剤（説明の便宜上、ＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤と称する）を含むタイプとを挙げることができる。なお、以下の説明では、便宜上、前者をＮＫＴ刺激タイプと称し、後者をＮＫＴ阻害剤タイプと称する。
【００３６】
＜ＣＤ４発現ＮＫＴ細胞＞
ＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤は、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を含むものであれば特に限定されるものではないが、このＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４を発現しているものであることが好ましい。
【００３７】
ＮＫＴ細胞は、ＮＫ１．１、ＣＤ４等の抗原を発現している。なお、これら抗原の発現の有無については、右上付きのプラスまたはマイナスで示す。例えば、ＣＤ４については、発現している場合には「ＣＤ４＋」で示し、発現していない場合には「ＣＤ４−」で示す。前述したように、ＮＫＴ細胞の約６割はＣＤ４＋であり、残りは、ＣＤ４−ＣＤ８−であるものが多い。ここで、後述する実施例４に示すように、ＮＫＴ細胞はＣＤ４＋であれば、ＩＬ−１８へ高い応答性を有する。それゆえ、本発明にかかるＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４を発現していることが好ましい。
【００３８】
＜ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞の調製＞
上記ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞は、ＩＬ−１８により刺激されて誘導されるＮＫＴ細胞であれば特に限定されるものではないが、この刺激の方法、すなわちＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞の調製方法としては、ホスト生物から単離したＮＫＴ細胞をＩＬ−１８の存在下で培養する方法を挙げることができる。
【００３９】
ホスト生物としては、具体的に特に限定されるものではなく、本発明にかかる免疫疾患治療薬剤を投与する対象となる生物（ホストあるいはレシピエントと呼ばれる）に投与しても生理学的に問題が生じなければよい。代表的には、ヒト；マウス、ラット等の実験動物；ウシ、ブタ等の家畜等が挙げられるが、もちろんこれに限定されるものではない。ホスト生物がヒトである場合には、本発明を幅広い医療分野に用いることができる。また、ホスト生物が実験動物であれば、免疫系の研究や、薬品の開発等に利用することができる。
【００４０】
本発明では、基本的に、ＮＫＴ細胞は、同種の生物からＮＫＴ細胞を単離すればよいが、遺伝子工学的な手法を利用する等して、他の種からＮＫＴ細胞を単離してもよい。例えば、ドナーがヒトであれば、同じヒトからＮＫＴ細胞を単離すればよいが、遺伝子工学的な手法を利用する等して、他の種にヒトのＮＫＴ細胞を発現させるようにしてもよいし、培養細胞や微生物にＮＫＴ細胞を発現させてもよい。さらに、幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＫＴ細胞を分化させて用いてもよい。また、例えば、ヒトに用いる場合等には、本発明にかかる免疫疾患治療薬剤を投与する対象（レシピエント）からＮＫＴ細胞を単離し、それをＩＬ−１８で刺激してからレシピエントに戻してもよい。すなわち、ドナーとレシピエントが同じ個体であってもよい。
【００４１】
ＮＫＴ細胞の単離方法についても特に限定されるものではなく、後述する実施例で挙げられているフローサイトメトリーを用いる陽性選別的な方法や、他の細胞を涸渇させる陰性選別的な方法等を挙げることができる。ＮＫＴ細胞を単離する臓器としては、後述する実施例で示すように、ホスト生物の脾臓あるいは骨髄細胞を用いることができるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
また、単離したＮＫＴ細胞は、それ単独で培養して増殖させてもよい。これによって微量のＮＫＴ細胞しか得られない場合であっても、本発明にかかるＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤を十分な量を産生することができる。
【００４３】
＜ＩＬ−１８による刺激＞
得られたＮＫＴ細胞をＩＬ−１８の存在下で培養する条件については、特に限定されるものではなく、ＩＬ−１８を含む培地やバッファー等を調製し、これとＮＫＴ細胞とを混合して任意の温度で静置（インキュベーション）すればよい。培地やバッファーの具体的な種類についても特に限定されるものではなく、公知の培地やバッファーを用いることができる。
【００４４】
インキュベーションする温度については特に限定されるものではなく、ＩＬ−１８によりＮＫＴ細胞が十分に刺激できるような温度であればよい。一般的には、３７℃前後が挙げられる。また、インキュベーションする時間についても特に限定されるものではなく、ＩＬ−１８によりＮＫＴ細胞が十分に刺激できるような時間であればよい。後述する実施例では、４日間という期間を挙げているが、もちろん本発明はこれに限定されるものではない。
【００４５】
ここで、本発明では、ＩＬ−１８の存在下でＮＫＴ細胞を培養する場合に、ＩＬ−１８に加えてＩＬ−２を存在させた状態で培養することがより好ましい。すなわち、本発明では、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を調製する場合には、ＩＬ−１８およびＩＬ−２を併用して培養することが好ましい。
【００４６】
後述する実施例で示すように、ＩＬ−２とＩＬ−１８との共存下でＮＫＴ細胞を培養すると、ＴＣＲを介した刺激なしに、ＣＤ４０Ｌの発現が顕著に増加するとともに、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞により十分な量のＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３が産生される。それゆえ、ＩＬ−１８単独でＮＫＴ細胞を刺激するよりもＩＬ−２と併用してＮＫＴ細胞を刺激することがより好ましい。なお、ＩＬ−２を併用する場合の条件は特に限定されるものではなく、ＩＬ−１８単独の場合と同様である。
【００４７】
＜免疫疾患治療薬剤の組成＞
本発明にかかるＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤は、その具体的な組成は特に限定されるものではなく、少なくとも上記ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を含んでいればよい。したがって、本発明にかかるＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤は、その用途に応じた様々な組成物とすることができる。
【００４８】
例えば、後述する実施例でも挙げているように、本発明にかかるＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤は、静脈注射される薬剤とすることができる。このとき、当該薬剤には、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を静脈注射する目的で、様々なバッファー等を含めることができる。このバッファーは、生体に投与したときに悪影響を及ぼすことがなく、かつ、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞にも悪影響を及ぼすものでなければ、その具体的な種類は特に限定されるものではなく、公知の各種バッファーを用いることができる。
【００４９】
さらに、本発明にかかるＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤を生産した後、一定期間保存するために、保存用の薬剤を別途含んでいてもよい。この保存用の薬剤は、生体に投与したときに悪影響を及ぼすことがなく、かつ、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞にも悪影響を及ぼすものでなければ、その具体的な種類は特に限定されるものではなく、公知の各種薬剤を用いることができる。
【００５０】
＜ＮＫＴ阻害剤＞
前述したように、本発明にかかる免疫疾患治療薬剤としては、ＮＫＴ刺激タイプ以外に、ＮＫＴ阻害剤タイプも含まれる。
【００５１】
前述したように、本発明者は、ＩＬ−１８による応答でＮＫＴ細胞が刺激され、ＮＫＴ細胞によりＩＬ−４が選択的に産生されること、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩＬ−１８の投与により、ＮＫＴ細胞にＣＤ４０Ｌが発現しＩＬ−４産生が誘導されることを見出した。したがって、本発明は、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を正または負に制御することが可能であり、正に制御するための手段の一つとして、上記ＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤が挙げられる。一方、負に制御するための手段の一つとして、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害するＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤を含む様々な阻害剤の免疫疾患治療薬剤を挙げることができる。
【００５２】
ＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤としては特に限定されるものではなく、生体内でＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害することができる物質であればよい。例えば、後述する実施例から、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激においては、ＮＫＴ細胞にＩＬ−１８Ｒα鎖が発現していること、ＩＬ−４等の産生とともにＣＤ４０Ｌの発現が見られること、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞がヘルパー機能を有すること等が重要であることが明らかとなっている。そこで、例えば、ＩＬ−１８Ｒα鎖に特異的に結合する分子や、ＣＤ４０Ｌの発現を抑制する物質や、ＣＤ４＋Ｔ細胞の機能を抑制する物質等をＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤の候補として挙げることができる。
【００５３】
上記のような物質は、公知の物質を用いてもよいし、新規な物質をスクリーニングにより新たに見出してもよい。ＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤のスクリーニング方法としては、ＩＬ−１８とＮＫＴ細胞との間における相互作用の有無を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。
【００５４】
例えば、ＩＬ−１８Ｒα鎖に特異的に結合する分子のスクリーニング方法としては、候補分子の中からＩＬ−１８Ｒα鎖に結合する分子をＥＬＩＳＡ法等によって検出するｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｙｓｔｅｍでの方法、培養細胞等を用いて細胞内でスクリーニングを行う方法、ＩＬ−１８Ｒα鎖をカラムに固定してこれと結合する物質を検索する方法等、物質間の結合の有無や解離の有無を調べる従来公知の種々の方法を用いることができる。
【００５５】
（２）本発明にかかる免疫疾患治療キット
本発明にかかる免疫疾患治療キットは、上記免疫疾患治療薬剤を含むもの（薬剤含有タイプ）であってもよいし、ホスト生物からＮＫＴ細胞を単離してＩＬ−１８で刺激する工程を実施するための各種素材や薬剤を含むもの（刺激工程実施タイプ、ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を適宜調製するタイプ）であってもよい。
【００５６】
＜免疫疾患治療キットの一例＞
刺激工程実施タイプの免疫疾患治療キットの一例としては、例えば、ＮＫＴ細胞をホスト生物から単離するための単離用素材と、ＮＫＴ細胞をＩＬ−１８の存在下で培養するための刺激用培地と、上記刺激用培地に加えるＩＬ−１８を含有する刺激薬剤とを含む構成を挙げることができる。さらに、上記刺激薬剤には、ＩＬ−２が含有されていてもよいし、ＩＬ−１８を含有する刺激薬剤とは別にＩＬ−２を含有する刺激薬剤が含まれていてもよい。つまり、ＩＬ−１８を含有する刺激薬剤を第一の刺激薬剤とした場合に、第二の刺激薬剤としてＩＬ−２を含有するものが含まれていてもよい。
【００５７】
上記単離用素材としては、ホスト生物からＮＫＴ細胞を有効に単離できるマテリアルであれば特に限定されるものではないが、例えば、後述する実施例にて例示するように、ＣＤ４＋Ｔ細胞をホスト生物の脾臓から精製するためのカラム用担体、ＣＤ４＋Ｔ細胞からフルオレセンスセルソーターを用いてＮＫＴ細胞を分画するための染色剤、脾臓細胞からＮＫＴ細胞以外の細胞集団を涸渇させるための各種抗体、抗体コート磁気ビーズのような磁気を利用した素材等を挙げることができる。
【００５８】
上記刺激用培地としては、ＩＬ−１８、ＩＬ−２、ＮＫＴ細胞に対して悪影響を及ぼすことなく、かつ、ＩＬ−１８またはＩＬ−１８とＩＬ−２とによるＮＫＴ細胞の刺激にも悪影響を及ぼすことのない培地であれば特に限定されるものではない。この刺激用培地としては、公知の各種培地を用いることができる。
【００５９】
上記刺激薬剤の具体的な組成についても特に限定されるものではなく、前述したＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤と同様、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−２を含んでおり、使用目的に悪影響を及ぼすものでなければどのような組成であってもよい。
【００６０】
＜ＮＫＴヘルパー剤＞
上記免疫疾患治療キットにおいては、ＩＬ−１８−刺激ＮＫＴ細胞によるＩｇＥの誘導作用をより増強する目的で、さらに、ＣＤ４を発現するＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）を含有するＮＫＴ細胞を含んでいてもよい。
【００６１】
後述する実施例でも説明するように、ＣＤ１ｄ−／−マウスおよびクラスＩＩ−／−マウスの双方にＩＬ−１８を投与してもＩｇＥの誘導は失敗する。ＣＤ１ｄ−／−マウスはＮＫＴ細胞を欠いたマウス（ＮＫＴ細胞欠損マウス）であり、クラスＩＩ−／−マウスは標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を欠いたマウス（標準的ＣＤ４＋Ｔ細胞欠損マウス）である。これに対して、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を移植することで再構築したクラスＩＩ−／−マウスは、ＩＬ−１８を投与すると、有意な量のＩｇＥを産生する能力を示す。
【００６２】
ＮＫＴ細胞は、ＩＬ−１８Ｒα鎖を高レベルで発現し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−２およびＩＬ−１８により刺激されると、これに応答して、ＩＬ−４、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を十分な量産生し、ＣＤ４０リガンドの発現を増強する。これに対して、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１８Ｒαを発現しないか、あるいは低レベルでしか発現しておらず、ＩＬ−２およびＩＬ−１８にほとんど応答しない。それにもかかわらず、上記のように、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１８の投与に伴うＢ細胞によるＩｇＥの応答に重要な役割を果たしている。つまり、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞の存在下でヘルパー機能を示すことになる。
【００６３】
それゆえ、本発明にかかる免疫疾患治療キットには、薬剤含有タイプであっても刺激工程実施タイプ（ＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞を適宜調製するタイプ）であっても、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含有するＮＫＴ細胞が含まれていてもよい。なお、ＮＫＴ細胞と標準型ヘルパーＴ細胞の具体的な組成については特に限定されるものではなく、前述したＮＫＴ刺激タイプの免疫疾患治療薬剤と同様、ＣＤ４＋細胞を含んでおり、使用目的に悪影響を及ぼすものでなければどのような組成であってもよい。
【００６４】
（３）ＩｇＥ産生の制御方法
本発明には、前述した免疫疾患治療薬剤、免疫疾患治療キットに加えて、ＩｇＥ産生の制御方法も含まれる。すなわち、本発明にかかるＩｇＥ産生の制御方法は、ＩＬ−１８によりＮＫＴ細胞を刺激して、ＩＬ−４産生とＣＤ４０リガンド発現とを選択的に増強するＮＫＴ刺激工程、または、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害するＮＫＴ刺激阻害工程の何れかを含んでいればよい。
【００６５】
このうち、上記ＮＫＴ刺激工程は、ＩＬ−１８の投与、または、ＩＬ−１８で刺激して誘導されるＩＬ−１８刺激ＮＫＴ細胞の投与により実施されればよく、上記ＮＫＴ刺激阻害工程は、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害するＩＬ−１８−ＮＫＴ阻害剤の投与により実施されればよい。これら各工程の具体的な実施においては、前述した免疫疾患治療薬剤や免疫疾患治療キットを用いればよい。
【００６６】
ＮＫＴ細胞により産生されるサイトカインであるＩＬ−４とＩＦＮ−γとは、相互に機能を打ち消す。そのため、何れかのサイトカインを選択的に誘導することができれば、自己免疫疾患の治療に有効である。また、ＮＫＴ細胞によるサイトカインの誘導のメカニズムを明らかにすれば、アレルギー疾患の治療への応用も見出される。しかしながら、これまでそのような技術は見出されなかった。
【００６７】
これに対して本発明では、ＩＬ−１８によってＮＫＴ細胞を刺激することにより、ＩＬ−４を選択的に産生して、またＣＤ４０Ｌ発現を増強してＩｇＥの産生を正に制御したり、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害してＩｇＥの産生を負に制御したりすることができる。
【００６８】
（４）本発明の利用
本発明は、各種免疫疾患の治療に利用することができる。具体的には、本発明によりＩＬ−４を選択的に産生する場合、ＮＫＴ細胞を糖尿病好発症マウス（ＮＯＤ）に投与すると、ＮＫＴ細胞から産生されたＩＬ−４とＩＬ−１０との作用で、発症が阻止されることが報告されていることから、過剰なＴｈ１免疫応答が原因で起こる自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患等の治療に利用することができる。
【００６９】
一方、本発明によりＩｇＥの産生を負に制御する（ＩｇＥの産生誘導を抑制または阻止する）場合には、各種アレルギー疾患の治療に利用することができる。
【００７０】
【実施例】
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例において用いられたマウスやマテリアル、並びに、具体的な実験方法の詳細について、次に示す。
【００７１】
〔マウスおよびマテリアル〕
病原体に感染していないのメスのＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウス、および８週齢のＣ５７ＢＬ／６ ｃｌａｓｓ ＩＩ−／−マウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。また、Ｃ５７ＢＬ／６ ＩＬ−４−／−マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓから入手した。ＯＶＡ３２３−３３９（ＤＯ１１．１０；ＢＡＬＢ／ｃ遺伝背景）を認識するαβ型ヘテロ二量体ＴＣＲを発現するトランスジェニックマウスは、Ｄｒ． Ｄ． Ｌｏｈ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。
【００７２】
組み換えマウスＩＬ−１８および抗ＩＬ−１８Ｒα鎖ｍＡｂ（Ｙ３８）は、林原生物化学研究所により提供された。ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＦＩＴＣ抗マウスＣＤ４４（ＩＭ７）、ＦＩＴＣ−抗ラットＩｇＧ１（ＲＧ１１／３９．４）、ＦＩＴＣ抗マウスＩＬ−４（ＢＶＤ４−１Ｄ１１）、Ｃｙクローム抗マウスＣＤ４（ＲＭ４−５）、ビオチン化抗マウスＣＤ４０Ｌ、ＰＥ抗マウスＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、およびＰＥラベルストレプトアビジンは、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社から購入した。
【００７３】
〔ＮＫＴ細胞の調製〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（抗マウスＣＤ４；クローンＲＭ４−５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）により精製した。この精製により高純度に濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、４℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌの抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩで処理し、その後、染色バッファー（ＰＢＳ、１％ＦＣＳ）中で４℃３０分間、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ４およびＰＥ−抗ＮＫ１．１を伴う処理を行った。ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞の双方は、フルオレセンスセルソーターを用いて分画した。各細胞集団の純度は、後の再分析で９８．５％以上となった。
【００７４】
一部の実施例では、ＣＤ４＋細胞は、脾臓細胞から他の細胞集団を涸渇させることにより、陰性選別的なプロセスで濃縮した。細胞の涸渇は、ＦＩＴＣ−抗Ｂ２２０、ＦＩＴＣ抗ＣＤ８、ＦＩＴＣ抗Ｉ−Ａ、ＦＩＴＣ抗ＮＫ１．１およびＦＩＴＣ抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）の混合物で処理し、その後、抗ＦＩＴＣコート磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）でのインキュベーション処理および磁場へさらす処理を１セットとして二回行うことにより実行した。
【００７５】
高純度に濃縮されたＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４４およびＰＥ抗ＮＫ１．１で着色し、ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−Ｔ細胞を分画した。
【００７６】
〔ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫＴ細胞の培養〕
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来で分画済のＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を、１×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌの濃度とした上で、培地単独か、またはＩＬ−２（２００ｐＭ）、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせの何れかを添加した培地で４日間培養した。培地としては、ＦＢＳが１０％、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）が５０ｍＭ、Ｌ−グルタミンが２ｍＭ、ペニシリンが１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトアビジンが１００μｇ／ｍｌの濃度となるように補ったＲＰＭＩ１６４０を用いた。
【００７７】
培養後に上清を採取し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γでテストした。得られたＴ細胞に対して、ＣＤ４０Ｌの発現および高精製のＢ細胞を伴うインキュベーションにより、ＩｇＥを産生するＢ細胞を誘導する能力についての試験を行った。
【００７８】
〔ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス処理〕
クラスＩＩ−／−マウスに対して、野生型およびＩＬ−４−／−マウスから採取した１０７個の精製したＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を静脈注射することで、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を当該クラスＩＩ−／−マウスに移植した。ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞の移植した翌日から、これらの処置を受けたクラスＩＩ−／−マウスおよび無処置の野生型マウスに対して、ＰＢＳバッファーまたはＩＬ−１８（２μｇ／日）を１３日間、毎日注射した。そして、０日、７日、１０日および１４日後に採血し、血清中のＩｇＥ、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３をＥＬＩＳＡにより測定した。
【００７９】
一部の実施例では、野生型マウスから採取したＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）でラベルし、クラスＩＩ−／−マウスに移植した。移植した細胞を含む細胞をＰＥ−抗ＣＤ４で染色し、移植した細胞をＣＦＳＥフルオレセンスおよびＣＤ４発現によって確認した。
【００８０】
クラスＩＩ−／−マウスにおいて、移植後、そのマウスの脾臓に定着したＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、（ＣＦＳＥ＋ＣＤ４＋細胞の数）／（トランスファーした細胞の数）の計算式から算出した。
【００８１】
〔フローサイトメトリー〕
ＩＬ−１８で処理したマウスからＩＬ−４を産生する細胞を検出するために、１０日間ＩＬ−１８を注射したＣ５７ＢＬ／６マウス由来の全脾臓細胞を、Ｃｙクローム抗ＣＤ４およびＰＥ−抗ＮＫ１．１で染色し、ＰＢＳ中４％（ｗ／ｖ）のパラホルマルアルデヒドで固定し、１％ＦＣＳおよび０．１％サポニンを含む氷冷ＰＢＳで細胞膜を浸透化した。得られた細胞は、０．５μｇＦＩＴＣ抗マウスＩＬ−４またはアイソタイプが適合するコントロールＡｂでまず染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ社製）により、細胞質のＩＬ−４に陽性を示す細胞の割合を分析した。
【００８２】
また、ＩＬ−１８で処理したマウスにおいて、ＣＤ４０Ｌが陽性の細胞を検出するために、全脾臓細胞について、ＦＩＴＣ抗ＣＤ４およびＰＥ抗ＮＫ１．１並びにビオチニル化抗ＣＤ４０Ｌの組み合わせ、およびトリカラーストレプトアビジン（ＣＡＬＴＡＧ社製）の組み合わせで染色し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。
【００８３】
さらに、ＮＫＴ細胞に発現するＩＬ−１８Ｒα鎖を確認するために、抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩでＦｃＲをブロックした後に、脾臓のリンパ球について、抗マウスＩＬ−１８Ｒα鎖ｍＡｂまたはコントロールラットＩｇＧ１ｍＡｂ（Ｒ３−３４）で、３０分４℃でインキュベートし、その後、３０分４℃で、染色バッファー中で、ＦＩＴＣを結合した抗ラットＩｇＧ１ｍＡｂ、ＰＥ抗ＮＫ１．１およびＣｙクローム抗マウスＣＤ４をインキュベートした。サンプルはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒで分析した。
【００８４】
〔実施例１：ＣＤ１−／−マウスは、ＩＬ−１８の投与に応答してＴｈ２サイトカインおよびＩｇＥを産生する能力を欠損している。〕
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対するＩＬ−１８処理は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に依存する挙動でＩｇＥを誘導する。このＩｇＥ応答はＴｈ２細胞の誘導に関連せず、ＴＣＲ会合によるＴ細胞の活性化はＩＬ−１８を注入したマウスにおいて、ＩｇＥ産生誘導に必要でないことが示唆される。
【００８５】
そこで、ＩｇＥ応答は内生的な抗原によるＴＣＲの会合が不必要なことを実証するために、ＯＶＡペプチドを認識するＴＣＲをコードする遺伝子を発現するＢＡＬＢ／ｃ背景のトランスジェニックマウス（ＤＯ１１．１０マウス）において、ＩＬ−１８に応答してＩｇＥを産生する能力をテストした。また、ＩＬ−１８によって誘導されるＩｇＥ応答に関連するＩＬ−１８応答Ｔ細胞を確認するために、さらに、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞を欠損するＣ５７ＢＬ／６背景ＣＤ１−／−マウスにおいて、ＩＬ−１８に応答してＩｇＥを産生する能力を比較した。これらの結果を図１ＡからＤに示す。
【００８６】
図１ＡからＤは、それぞれ、ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＢＡＬＢ／ｃ背景ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣ５７ＢＬ／６背景ＣＤ１−／−マウスの結果であり、これら各種マウスは何れも５匹ずつを用いた。１３日間毎日ＩＬ−１８（２μｇ／日）を注射し、０日、７日、１０日および１４日目に採血し、ＥＬＩＳＡにより血清中のＩｇＥ（Ａ、Ｂ）、ＩＬ−４（Ｃ）およびＩＬ−１３（Ｄ）を測定した。結果は相乗平均±ＳＤである。
【００８７】
図１Ａに示すように、これら普通のＢＡＬＢ／ｃマウスと同様、ＤＯ１１．１０マウスは、このＩＬ−１８注射に応答してＩｇＥを産生したが、このＩＬ−１８注射の処理では、Ｔｈ２応答を誘導しなかった（図示せず）。さらに、図示しないが、このＩＬ−１８誘導によるＩｇＥ産生は、シクロスポリンＡ処理に抵抗性を示し、このＩｇＥ応答において、ＴＣＲにより仲介されるＴ細胞の活性化は排除される。
【００８８】
また、図１Ｂに示すように、ＩＬ−１８は、野生型マウスにおける血清ＩｇＥレベルの顕著な増加を引き起こすが、ＣＤ１−／−マウスでは起きなかった。さらに、野生型マウスへのＩＬ−１８の投与は、ＩＬ−４およびＩＬ−１３について優位な量の産生を生じさせるが、図１ＣおよびＤに示すように、ＣＤ１−／−マウスは、ＩＬ−４を全く産生せず、ＩＬ−１３の産生量は減少している。これらの結果から、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１８に応答してＩＬ−４およびＩＬ−１３の双方を産生することが示唆される。
【００８９】
〔実施例２：ＮＫＴ細胞は、ＩＬ−１８でのｉｎ ｖｉｖｏにおける処理に応答してＩＬ−４を産生し、ＣＤ４０Ｌを発現する。〕
ＩＬ−１８に誘導されたＩｇＥ応答において、ＮＫＴ細胞の役割を決定するために、野生型マウスにＩＬ−１８を直接注射したときに、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞がＩＬ−４を産生し、ＣＤ４０Ｌの発現を増加するか否かについて直接テストした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、１０日間毎日ＩＬ−１８（２μｇ／日）またはＰＢＳを注射した。ＰＢＳ注射およびＩＬ−１８注射の各グループは何れも４匹のマウスとした。その結果を図２ＡおよびＢに示す。
【００９０】
図２Ａは、細胞内のＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞をＩＬ−４で染色した結果であり、図２Ｂは、これらＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞をＣＤ４０Ｌで染色した結果である。見本データは４つの個別のマウスから示す。また、示されるパーセンテージはＩＬ−４に陽性の細胞の比率を示す。
【００９１】
図２Ａに示すように、ＰＢＳ注射マウスと比較したとき、ＩＬ−１８注入マウスから得られたＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞では、ｅｘ ｖｉｖｏでＩＬ−４を産生するＴ細胞の比率について有意な増加（ｐ＜０．０１）が示された。一方、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞は細胞質のＩＬ−４を含んでいない。同様に、図２Ｂに示すように、ＩＬ−１８を注入されたマウスのＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞においては、ＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞の比率が有意に増加（ｐ＜０．０１）していた。なお、ＩＬ−１８は、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞においてもＣＤ４０Ｌを発現するＴ細胞の比率についても増加させたが、その程度は、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞での増加率よりも有意に少なかった。
【００９２】
〔実施例３：ＮＫＴ細胞に発現するＩＬ−１８Ｒα鎖〕
ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞のＩＬ−１８に対する応答性は、この種の細胞が本質的にＩＬ−１８Ｒを発現することを示唆する。そこで、抗ＩＬ−１８Ｒα鎖ｍＡｂを用いたフローサイトメトリー分析により、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−細胞上のＩＬ−１８Ｒα鎖の発現を比較した。
【００９３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから新たに調製した脾臓細胞について、フローサイトメトリーによりＣＤ４およびＮＫ１．１の発現を分析した。その結果を図２Ｃに示す。なお、ＩＬ−１８Ｒα鎖の高いレベルを発現するＮＫ細胞（ＣＤ４−ＮＫ１．１ｈｉｇｈ）を陽性コントロールとして用いた。図２Ｃでは、Ｒ１がＣＤ４＋ＮＫ１．１−細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現の発現であり、Ｒ２がＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現の発現であり、Ｒ３がＣＤ４−ＮＫ１．１ｈｉｇｈ細胞におけるＩＬ−１８Ｒα鎖の発現の発現である。示される数値はＩＬ−１８Ｒα鎖染色のＭＦＩ（蛍光の強さ）を示す。
【００９４】
図２ＣのＲ２に示すように、新たに調製した脾臓のＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、本質的にＩＬ−１８Ｒα鎖を高いレベルで発現している（ＭＦＩが１１．０）が、Ｒ１に示すように、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞は、低いレベルの発現にとどまっている（ＭＦＩ：３．９）。一方、Ｒ３に示すように、陽性コントロールのＮＫ細胞（ＣＤ４−ＮＫ１．１ｈｉｇｈ細胞）は、ＩＬ−１８Ｒα鎖を高いレベルで発現している。一方、ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−１８の刺激によりＩＬ−１３を産生するがＩＬ−４を産生しない。
【００９５】
〔実施例４：ＩＬ−１８は、ＩＬ−４を産生し、ＣＤ４０Ｌを発現し、Ｂ細胞によるＩｇＥ産生を高めるために、ＮＫＴ細胞を刺激する。〕
ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞において、ＩＬ−１８の応答によるＩＬ−４の産生およびＣＤ４０Ｌの発現の能力をさらに実証するために、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を分画し、４日間ＩＬ−２（２００ｐＭ）および／またはＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）でこれら細胞を刺激した。
【００９６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞をそれぞれ分画し、それぞれ１×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌの濃度とした上で、培地のみ、あるいは、ＩＬ−２（２００ｐＭ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）およびこれら組み合わせの何れかを添加した培地で培養した。培養の４日後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＮＦ−γの濃度をテストした。その結果を図３Ａに示す。
【００９７】
図３Ａに示すように、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１８およびＩＬ−２で培養すると、有意な量のＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生するが、標準的なＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞は、ほとんどＩＬ−４を産生せず、ＩＬ−１３を少量産生する。また、図３Ａの結果から、ＩＬ−１８およびＩＬ−２がＣＤ４＋ＮＫ１．１＋細胞を刺激して、ＩＬ−９の産生を誘導するが、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を刺激してもＩＬ−９の産生が誘導されないことも見出された。ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、ＩＬ−１８およびＩＬ−２で培養すると、ＩＬ−１８およびＩＬ−１２により刺激される（５３８１ｐｇ／ｍｌ）よりも、ＩＦＮ−γをはるかに少ない量（２４ｐｇ／ｍｌ）産生した。
【００９８】
また、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞におけるＣＤ４０Ｌの表面発現については、フローサイトメトリーで分析した。その結果を図３Ｂに示す。図中のパーセンテージは、全ＣＤ４＋Ｔ細胞中におけるＣＤ４０Ｌ陽性の細胞の比率を示す。
【００９９】
図３Ｂに示すように、ＩＬ−２またはＩＬ−１８は、単独では、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞上で発現するＣＤ４０Ｌを十分に増加させる（４６．１％および３９．７％）が、その組み合わせは、さらなる大きな誘導を引き起こす（９４．２％）。これに対して、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞では、同じ処理を行っても、ＣＤ４０Ｌの誘導は軽度であるので、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞がＩＬ−１８の主なターゲットであることが示唆される。
【０１００】
さらに、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞をＩＬ−２およびＩＬ−１８にて４日間刺激した後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＢ細胞をこれらＴ細胞で刺激した場合のＩｇＥの誘導能力をテストした。
【０１０１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を、それぞれ１×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌの濃度とし、培地単独で培養するか、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（２００ｐＭ）を培地に加えて培養した。培養４日後、新たに精製したＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓由来のＢ細胞を、１×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌの濃度となるように加え、さらに、抗ＩＮＦ−γ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。１０日間インキュベートした後、上清を採取し、ＩｇＥ濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を表１に示す。結果は相乗平均±ＳＤである。
【０１０２】
【表１】
このように、ＩＬ−１８およびＩＬ−２で刺激したＮＫＴ細胞をＢ細胞と共培養した場合、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞を刺激してＩｇＥ産生を誘導することができるが、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞であるＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞をＢ細胞と共培養した場合、Ｂ細胞からのＩｇＥ産生の誘導はできない。
【０１０４】
この結果から、ＩＬ−１８Ｒα鎖を発現するＮＫＴ細胞は、ＩＬ−１８刺激に応答してＩＬ−４とＣＤ４０Ｌとを発現すること、さらにＩＬ−１８で刺激を受けたＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの双方でＢ細胞に作用してＩｇＥ産生を誘導することが示された。したがって、ＮＫＴ細胞は、この応答系においてＣＤ４＋Ｔ細胞の決定的なサブセットであることを示す。
【０１０５】
〔実施例５：活性化されたＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞ではなく、ＮＫＴ細胞が、ＩＬ−１８に応答してＩＬ−４を産生する。〕
前記実施例４では、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞が、ＩＬ−１８に高い応答性を示すことを実証した。次に、ＩＬ−１８によるＴｈ２サイトカインおよびＣＤ４０Ｌの誘導が、ＮＫＴ細胞に独自で起こるのか、または、すでに活性化されたＴ細胞あるいは記憶Ｔ細胞で起こるのかを確定するために、ＮＫＴ細胞のＩＬ−１８応答性と、すでに活性化された標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞の応答性とを比較した。
【０１０６】
まず、活性化Ｔ細胞集団の代表として、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ４＋Ｔ細胞を利用し、通常のＣ５７ＢＬ／６マウスから得られた、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞、およびＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞におけるＣＤ４４の発現をテストした。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから新規に調製したＣＤ４＋細胞を、フローサイトメトリーにより、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞に分画し、それぞれＣＤ４４の発現について分析した。その結果を図４Ａに示す。図４Ａでは、Ｒ１が全ＣＤ４＋Ｔ細胞を示し、Ｒ２がＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞を示し、Ｒ３がＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を示す。
【０１０７】
図４Ａに示すように、ほとんど全てのＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞（Ｒ２）は、ＣＤ４４を高いレベルで発現（９５．７％）していたが、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞（Ｒ３）はＣＤ４４の発現が１２．９％に、全ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｒ１）はＣＤ４４の発現が２１．６％に留まっていた。
【０１０８】
次に、ＮＫＴ細胞のＩＬ−１８に対する応答性と、ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−Ｔ細胞またはＣＤ４４ｉｎｔＮＫ１．１−ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答性とを比較した。全ＣＤ４＋Ｔ細胞において、他の細胞集団と同じようにＮＫＴ細胞（ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）を涸渇させ、それから、ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−Ｔ細胞を分画した。つまり、刺激の間または刺激後に、ＮＫＴ細胞はそのＮＫ１．１発現を失うことが知られているため、他の細胞集団、特にＮＫＴ細胞を涸渇させるという陰性選別的な手法で、全ＣＤ４＋Ｔ細胞から、ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−ＣＤ４＋Ｔ細胞を分画した。また、ＣＤ４４ｉｎｔＮＫ１．１−Ｔ細胞およびＮＫＴ細胞は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞から分画した。この分画はソーターを用いた陽性選別的な手法である。その結果を図４Ｂに示す。
【０１０９】
図４Ｂでは、Ｒ１がＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−Ｔ細胞を示し、Ｒ２がＣＤ４４ｉｎｔＮＫ１．１−Ｔ細胞を示し、Ｒ３がＮＫＴ細胞を示す。図４Ｂから明らかなように、陽性選別的な手法を用いても陰性選別的な手法を用いても有効に分画が行われている。
【０１１０】
次に、分画したＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉｇｈＮＫ１．１−Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ４４ｉｎｔＮＫ１．１−Ｔ細胞を、それぞれ１×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌの濃度とし、培地のみ、あるいは、ＩＬ−２（２００ｐＭ）、ＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍｌ）およびこれらの組み合わせの何れかを培地に加えて培養した。培養４日後に、上清を採取し、ＩＬ−４およびＩＬ−１３を用いてＥＬＩＳＡによりテストした。
【０１１１】
このように、これら３つの細胞集団をＩＬ−２および／またはＩＬ−１８で刺激すると、図４Ｃに示すように、前記実施例４の結果と矛盾無く、ＮＫＴ細胞のみが、ＩＬ−２とＩＬ−１８との刺激に応答してＩＬ−４およびＩＬ−１３の双方を産生した。この結果から、ＮＫＴ細胞は前もって活性化された標準的なＴ細胞とは異なっており、Ｂ細胞からＩｇＥを誘導する能力を有することが支持される。
【０１１２】
〔実施例６：ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞は、ＩＬ−１８誘導ＩｇＥ応答を要求する。〕
標準的なＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞は、ＩＬ−１８で刺激を受けてもＩＬ−４およびＣＤ４０Ｌのそれぞれの誘導は軽度であるので、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−１８にはほとんど応答しないことになる。しかしながら、この結果から、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞が、前述してきたＩＬ−１８で誘導されるＩｇＥ産生において必要か否かを決定することはできない。
【０１１３】
そこで、野生型マウスが発現するＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞とほぼ同じ数を発現しているクラスＩＩ−／−マウスのＩＬ−１８の応答性をテストした
まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス、ＣＤ１−／−マウスおよびクラスＩＩ−／−マウス由来の全脾臓細胞およびＣＤ４濃縮脾臓細胞における、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞の割合を図５Ａに示す。図中のパーセンテージは選択された領域における細胞の割合である。また図の上側が全脾臓細胞を示し、下側がＣＤ４濃縮脾臓細胞を示す。クラスＩＩ−／−マウスのＣＤ４＋Ｔ細胞は、脾臓細胞のうち４〜５％のみを占めているにも関わらず、ＣＤ４＋ＮＫ１．１＋Ｔ細胞の割合は、野生型マウスの割合と同等であった。
【０１１４】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびクラスＩＩ−／−マウスについて、それぞれ、何もしないか、または、野生型マウスあるいはＩＬ−４−／−マウス由来のＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞（１０７）をそれぞれ移入した。各グループは何れもマウス５匹ずつとした。これらマウスに、１３日間毎日１Ｌ−１８（２μｇ／日）を注射した。これらマウスから０日、７日、１０日および１４日後に採血し、血清中のＩｇＥをＥＬＩＳＡで測定した。何もしない方のマウスの結果を図５Ｂに示し、ＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞を移入された方のマウスの結果を図５Ｃに示す。
【０１１５】
図５Ｂに示すように、クラスＩＩ−／−マウスは、ＩＬ−１８処理に応答してＩｇＥを産生することに完全に失敗した。これに対して、図５Ｃに示すように、野生型マウスから標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を移入することで再構築されたクラスＩＩ−／−マウスは、程度は低いながらもＩＬ−１８に反応して有意なＩｇＥを産生した。しかしながら、同じく図５Ｃに示すように、ＩＬ−４−／−マウスから標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を移入することで再構築されたマウスは、ＩＬ−１８に応答することに失敗した。このように、野生型マウスと比較しても、ＣＤ４＋Ｔ細胞で再構築されたクラスＩＩ−／−マウスは、弱いＩｇＥ応答を示し、移入されたＣＤ４＋Ｔ細胞の一部がホストの脾臓に定着していることが示唆された。
【０１１６】
さらに、クラスＩＩ−／−マウスについて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を静脈注射した。具体的には、ＣＦＳＥでラベルしたＣＤ４＋Ｔ細胞を静脈注射して移植した。その後、脾臓細胞を３日、７日および１０日でレシピエントから単離した。なお、３日、７日および１０日に脾臓細胞を単離したグループは、それぞれ３匹ずつのマウスとした。移植した細胞は、ＣＳＦＥ蛍光により確認した。その結果を図５Ｄに示す。
【０１１７】
図５Ｄから明らかなように、移植した標準的なＴ細胞は、３日で０．９４％、７日で１．５８％、１０日で０．６４％の割合で定着していた。この結果から、標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するＩＬ−４は、Ｂ細胞によるＩｇＥ産生のために必要であるが示される。
【０１１８】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、ＩＬ−１８によりＮＫＴ細胞を刺激するか、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害するものである。これによって、ＮＫＴ細胞が関与するＩｇＥ産生を正または負に制御することができ、各種免疫疾患の治療に利用することができる。
【０１１９】
そのため、本発明では、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激でＩＬ−４を選択的に産生する場合、過剰なＴｈ１免疫応答が原因で起こる自己免疫疾患、例えば、１型糖尿病、自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患等の治療に利用することができるという効果を奏する。一方、ＩＬ−１８によるＮＫＴ細胞の刺激を阻害してＩｇＥの産生を負に制御する場合には、各種アレルギー疾患の治療に利用することができるという効果を奏する。
【０１２０】
したがって、本発明は、各種医薬品産業や研究用試薬産業に好適に利用できるだけでなく、医療分野にも応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ａ〜Ｄは、ＣＤ１−／−マウスは、ＩＬ−１８の投与を受けてもＩｇＥおよびＩＬ−４を産生できない状態にあることを示す図である。
【図２】Ａ〜Ｃは、ＮＫＴ細胞が、ＩＬ−１８でのｉｎ ｖｉｔｒｏの処理に応答してＩＬ−４を産生し、ＣＤ４０Ｌを発現することを示す図である。
【図３】Ａ・Ｂは、ＮＫＴ細胞が、ＩＬ−１８刺激に応答してｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−４、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を産生し、ＣＤ４０Ｌを発現することを示す図である。
【図４】Ａ〜Ｃは、活性化されたＣＤ４＋ＮＫ１．１−Ｔ細胞が、ＩＬ−１８で刺激されてもＩＬ−４を産生しないことを示す図である。
【図５】Ａ〜Ｄは、クラスＩＩ−／−マウスに野生型マウスから採取した標準的なＣＤ４＋Ｔ細胞を移植することで、ＩＬ−１８に対する応答性を獲得させることが可能となり、投与したＩＬ−１８に応答してＩｇＥ産生を示すことができるようになった結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an immunological disease therapeutic agent, an immune disease therapeutic kit, and a method for controlling IgE production using stimulation of natural killer T cells by
[0002]
[Prior art]
Natural killer T cells (abbreviated as NKT cells) are NK1.1 antigens, which are markers of NK cells, and T cell receptors (abbreviated as TCR) consisting of Vα14-Jα281 chain and Vβ8.2 chain heterodimers. Is a unique T cell expressing
[0003]
This NKT cell is known to recognize glycolipids such as α-galactosylceramide (α-GalCer) presented by CD1d, a glycoprotein similar to MHC class I molecules. In addition, about 60% of NKT cells express CD4 (one of the membrane glycoproteins of helper cells) (CD4 + And the remainder do not express CD4 or CD8 (a cell surface antigen known as a marker for killer T cells, suppressor T cells) (CD4). − CD8 − ) Many (see Non-Patent Document 1).
[0004]
NKT cells rapidly produce interleukin 4 (IL-4) and interferon γ (IFN-γ) when stimulated with an antigen such as α-GalCer. Therefore, if this reaction system (system producing IL-4 • INF-γ) in NKT cells can be controlled, the immune response of the host can be controlled and applied to the treatment of various immune diseases. Is possible. Therefore, such a technique for selectively inducing the NKT cell reaction system makes it possible to control the production of Th1 cytokines and Th2 cytokines.
[0005]
In addition, although the said NKT cell exists in various organs in the living body, it is known that production of IgE will not occur if this cell decreases. In addition, there is a correlation between the change of NKT cells in the thymus and the occurrence of
[0006]
By the way, interleukin 18 (IL-18) enhances the Th1 response by interacting with interleukin 12 (IL-12). On the other hand, administration of IL-18 alone induces IgE production and allergic inflammation. That is, IL-18 also has the activity of inducing a type 2 (Th2) cell response that is a subset of helper T cells. The ability of IL-18 to induce IgE is related to T cells expressing CD4 (CD4 + T cells), IL-4 and STAT6, which are intracellular signaling molecules involved in the mechanism of cytokine action and are specifically activated by IL-4.
[0007]
This IL-18 was initially identified as a factor that enhances the production of IFN-γ from helper type 1 (Th1) cells, a subset of helper T cells, induced by the action of anti-CD3 antibodies and IL-12. (See
[0008]
Furthermore, recently, in the absence of IL-12, IL-18 has been shown to act on T cells, basophils, and mast cells to induce Th2 cytokine production. That is, in the presence of IL-3, IL-18 stimulates basophils and mast cells without the cross-linking of FcεR (Fc receptor for basophil IgE antibodies (FcR)) by IgE antibodies. IL-4 and IL-13 are produced (see Non-Patent Document 10).
[0009]
These findings suggest that IL-18 promotes allergic diseases, particularly endemic atopic diseases characterized by a lack of sensitivity to specific antigens.
[0010]
[Non-Patent Document 1]
Bendelac, A.M. , M.M. N. Rivera, S.M. -H. Park, and J.M. H. Roark. 1997. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, spec-ifity, and function. Annu. Rev. Immunol. 15: 535-562.
[0011]
[Non-Patent Document 2]
Okamura, H .; , H .; Tsutsui, T .; Komatsu, M .; Yutsudo, A. Hakura, T .; Tanimoto, K. et al. Torigoe, T .; Okura, Y .; Nukada, K .; Hattori, et al. 1995. Cloning of a new cytokine that inductors IFN-production by T cells. Nature. 378: 88-91.
[0012]
[Non-Patent Document 3]
Gu, Y. et al. , K .; Kuida, H.M. Tsutsui, G .; Ku, K.K. Hsiao, M.C. A. Fleming, N.M. Hayashi, K .; Higasino, H .; Okamura, K .; Nakanishi, et al. 1997. Activation of interferon-inducing factor medi-ated by interleukin-1 converting enzyme. Science. 275: 206-209.
[0013]
[Non-Patent Document 4]
Robinson, D.C. , K .; Shibuya, A.M. Mui, F.M. Zonin, E .; Murphy, T .; Sana, S.M. B. Hartley, S.M. Menon, R.M. Kastelein, F.A. Bazan, et al. 1997. IGIF dose not drive Th1 development but synergies with IL-12 for interferon-production and activations IRAK and NF B. Immunity. 7: 571-581.
[0014]
[Non-Patent Document 5]
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[0015]
[Non-Patent Document 6]
Yoshimoto, T .; , H .; Okamura, Y. et al. I. Tagawa, Y. et al. Iwakura, and K.K. Nakanishi. 1997.
[0016]
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[0017]
[Non-Patent Document 8]
Munder, M.M. , M.M. Mallo, K.M. Eichmann, and M.M. Modollell. 1998. Murine macrophages secret interferon combined simulation with interleukin (IL) -12 and IL-18: a novel pathway of autocrine macroactivation. J. et al. Exp. Med. 187: 2103-2108.
[0018]
[Non-patent document 9]
Fukao, T .; S. Matsuda, and S.M. Koyasu. 2000. Synergistic effects of IL-4 and IL-18 on IL-12-dependent IFN-production by dendritic cells. J. et al. Immunol. 164: 64-71.
[0019]
[Non-Patent Document 10]
Yoshimoto, T .; , H .; Tsutsui, K .; Tominaga, K.M. Hoshino, H .; Okamura, S .; Akira, W.M. E. Paul, and K.C. Nakanishi. 1999. IL-18, although antiallergic when administered with IL-12, stimulates IL-4 and histone release by bassophiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 13962-13966.
[0020]
[Problems to be solved by the invention]
Here, IL-4 and IFN-γ produced by NKT cells cancel each other's functions. Therefore, a technique for selectively inducing any cytokine is required.
[0021]
Further, as described above, NKT cells are involved in a reaction system that produces Th1 cytokines and Th2 cytokines, and IL-18 is involved in a reaction system that generates a Th2 cell response. However, the relationship between NKT cells and IL-18 in the cytokine network has not been clarified so far.
[0022]
The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and its object is to clarify the relationship between NKT cells and IL-18 in a cytokine network, and to utilize this, a novel therapeutic agent and immunological agent for immune diseases. It is to provide a therapeutic kit and a method for controlling IgE production.
[0023]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventor has clarified that the production of IgE is induced by administering IL-18 to mice so far. In the system of IgE production by administration), the in vivo target of IL-18 was uniquely found to be an NKT cell expressing IL-18 receptor, and the present invention was completed.
[0024]
That is, the therapeutic agent for immune diseases according to the present invention is characterized by containing IL-18-stimulated natural killer T cells induced by stimulation with
[0025]
In the above-mentioned therapeutic agent for immune diseases, it is preferable that IL-18 stimulated natural killer T cells express CD4. Examples of the IL-18 stimulated natural killer T cells include those obtained by culturing natural killer T cells isolated from a host organism in the presence of
[0026]
In addition, another therapeutic agent for immune diseases according to the present invention is characterized by including an IL-18-NKT inhibitor that inhibits stimulation of natural killer T cells by
[0027]
The immunological disease treatment kit according to the present invention includes a composition containing the above-mentioned various immunological disease therapeutic agents, an isolation material for isolating natural killer T cells from a host organism, and natural killer T cells of
[0028]
Furthermore, any type of immune disease treatment kit described above needs to contain natural killer T cells that express CD4.
[0029]
The method for controlling IgE production according to the present invention includes a NKT stimulation step in which natural killer T cells are stimulated with
[0030]
The NKT stimulation step may be performed by administration of
[0031]
According to the above-described configuration or method, by stimulating NKT cells with IL-18, IL-4 is selectively produced to positively control IgE production, or IL-18 is inhibited from stimulating NKT cells. Thus, the production of IgE can be negatively controlled. As a result, the present invention can be effectively used for the treatment of various immune diseases.
[0032]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.
[0033]
An important feature of the present invention is that NKT cells are stimulated with IL-18, especially when stimulated with IL-18 and IL-2, the production of IFN-γ remains mild, mainly IL-. Only the production of 4 can be selectively induced.
[0034]
Therefore, the present invention includes an immunological disease therapeutic drug containing NKT cells stimulated with IL-18, and the administration thereof effectively treats an autoimmune disease caused by an excessive Th1 immune response. It becomes possible. In addition, the present invention also includes an inhibitor that blocks the action of IL-18 on NKT cells, which makes it possible to block the induction of IgE production and effectively treat allergic diseases and the like. It becomes possible.
[0035]
(1) Immune disease therapeutic drug according to the present invention
Examples of the therapeutic agent for immune diseases according to the present invention include a type including NKT cells (referred to as IL-18 stimulated NKT cells for convenience of explanation) induced by stimulation with IL-18, and stimulation of NKT cells by IL-18. And a type containing an inhibitor that inhibits (referred to as an IL-18-NKT inhibitor for convenience of explanation). In the following description, for the sake of convenience, the former is referred to as an NKT stimulation type, and the latter is referred to as an NKT inhibitor type.
[0036]
<CD4-expressing NKT cells>
The NKT-stimulated drug for treating immune diseases is not particularly limited as long as it contains IL-18-stimulated NKT cells, but the IL-18-stimulated NKT cells express CD4. Is preferred.
[0037]
NKT cells express antigens such as NK1.1 and CD4. The presence or absence of expression of these antigens is indicated by plus or minus with an upper right. For example, for CD4, if it is expressed, “CD4 + ", And when not expressed" CD4 − ". As described above, about 60% of NKT cells are CD4. + And the rest is CD4 − CD8 − There are many things that are. Here, as shown in Example 4 described later, NKT cells are CD4. + If so, it has high responsiveness to IL-18. Therefore, the IL-18 stimulated NKT cell according to the present invention preferably expresses CD4.
[0038]
<Preparation of IL-18 stimulated NKT cells>
The IL-18-stimulated NKT cell is not particularly limited as long as it is an NKT cell that is stimulated and induced by IL-18, but as a method for this stimulation, that is, a method for preparing an IL-18-stimulated NKT cell, And a method of culturing NKT cells isolated from a host organism in the presence of IL-18.
[0039]
The host organism is not particularly limited, and a physiological problem occurs even when administered to an organism (referred to as a host or a recipient) to which the immune disease therapeutic agent according to the present invention is administered. If there is no. Representative examples include humans; laboratory animals such as mice and rats; domestic animals such as cows and pigs, but of course not limited thereto. When the host organism is a human, the present invention can be used in a wide range of medical fields. If the host organism is an experimental animal, it can be used for immune system research, drug development, and the like.
[0040]
In the present invention, NKT cells may basically be isolated from organisms of the same species. However, NKT cells may be isolated from other species by using genetic engineering techniques. . For example, if the donor is a human, NKT cells may be isolated from the same human, but other species may be made to express human NKT cells by using genetic engineering techniques. In addition, NKT cells may be expressed in cultured cells or microorganisms. Furthermore, NKT cells may be differentiated from stem cells in vitro. In addition, for example, when used for humans, NKT cells are isolated from a subject (recipient) to which the immunological disease therapeutic agent according to the present invention is administered, stimulated with IL-18, and then returned to the recipient. Also good. That is, the donor and the recipient may be the same individual.
[0041]
The method for isolating NKT cells is not particularly limited, and a positive selection method using flow cytometry, a negative selection method for depleting other cells, etc., which are mentioned in the examples described later. Can be mentioned. As an organ for isolating NKT cells, spleen or bone marrow cells of a host organism can be used as shown in Examples described later, but is not limited thereto.
[0042]
In addition, the isolated NKT cell may be cultured and proliferated alone. Thus, even when only a small amount of NKT cells can be obtained, it is possible to produce a sufficient amount of the NKT-stimulated immune disease therapeutic drug according to the present invention.
[0043]
<Stimulation with IL-18>
The conditions for culturing the obtained NKT cells in the presence of IL-18 are not particularly limited, and a medium or buffer containing IL-18 is prepared, and this is mixed with NKT cells. It is only necessary to stand at this temperature (incubation). The specific types of the medium and buffer are not particularly limited, and a known medium or buffer can be used.
[0044]
The temperature for incubation is not particularly limited, and may be a temperature at which NKT cells can be sufficiently stimulated with IL-18. Generally, the temperature is around 37 ° C. In addition, the incubation time is not particularly limited as long as the NKT cells can be sufficiently stimulated with IL-18. In the examples described later, a period of four days is mentioned, but the present invention is not limited to this.
[0045]
Here, in the present invention, when culturing NKT cells in the presence of IL-18, it is more preferable to culture in a state where IL-2 is present in addition to IL-18. That is, in the present invention, when preparing an IL-18 stimulated NKT cell, it is preferable to culture in combination with IL-18 and IL-2.
[0046]
As shown in Examples described later, when NKT cells are cultured in the presence of IL-2 and IL-18, the expression of CD40L is significantly increased without stimulation via TCR, and IL-18-stimulated NKT. Sufficient amounts of IL-4, IL-9, IL-13 are produced by the cells. Therefore, it is more preferable to stimulate NKT cells in combination with IL-2 than to stimulate NKT cells with IL-18 alone. In addition, the conditions in the case of using IL-2 together are not particularly limited, and are the same as in the case of IL-18 alone.
[0047]
<Composition of immune disease therapeutic drug>
The specific composition of the NKT-stimulated drug for treating immune diseases according to the present invention is not particularly limited as long as it contains at least the IL-18-stimulated NKT cells. Therefore, the NKT-stimulated drug for treating immune diseases according to the present invention can be made into various compositions according to its use.
[0048]
For example, as described in Examples described later, the NKT-stimulated immune disease therapeutic drug according to the present invention can be a drug that is injected intravenously. At this time, the drug can contain various buffers and the like for the purpose of intravenous injection of IL-18 stimulated NKT cells. The specific type of this buffer is not particularly limited as long as it does not have an adverse effect when administered to a living body and does not have an adverse effect on IL-18 stimulated NKT cells. Various buffers can be used.
[0049]
Furthermore, after producing the NKT-stimulated drug for treating immune diseases according to the present invention, a preservative drug may be separately included for storage for a certain period of time. The specific type of the preservative agent is not particularly limited as long as it does not have an adverse effect when administered to a living body and does not have an adverse effect on IL-18 stimulated NKT cells. In addition, various known drugs can be used.
[0050]
<NKT inhibitor>
As described above, the immunological disease therapeutic agent according to the present invention includes an NKT inhibitor type in addition to the NKT stimulation type.
[0051]
As described above, the present inventor confirmed that NKT cells are stimulated in response to IL-18, and that IL-4 is selectively produced by NKT cells, and that administration of IL-18 in vivo results in NKT cells. It was found that CD40L is expressed and IL-4 production is induced. Therefore, the present invention can positively or negatively control the stimulation of NKT cells by IL-18, and one of the means for positively controlling the NKT-stimulated immune disease therapeutic agent is mentioned above. It is done. On the other hand, as one of the means for negatively controlling, various therapeutic agents for immunological diseases including various inhibitors including IL-18-NKT inhibitor that inhibits stimulation of NKT cells by IL-18 can be mentioned.
[0052]
The IL-18-NKT inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that can inhibit the stimulation of NKT cells by IL-18 in vivo. For example, from the examples described later, in the stimulation of NKT cells with IL-18, the expression of IL-18Rα chain in NKT cells, the expression of CD40L along with the production of IL-4, etc. CD4 + It has been clarified that T cells have a helper function. Therefore, for example, a molecule that specifically binds to the IL-18Rα chain, a substance that suppresses the expression of CD40L, CD4 + Substances that suppress the function of T cells can be mentioned as candidates for IL-18-NKT inhibitors.
[0053]
As the above substances, known substances may be used, or new substances may be newly found by screening. As a screening method for an IL-18-NKT inhibitor, various conventionally known methods for examining the presence or absence of an interaction between IL-18 and NKT cells can be applied and are not particularly limited.
[0054]
For example, as a screening method for a molecule that specifically binds to the IL-18Rα chain, a cell-free system method in which a molecule that binds to the IL-18Rα chain among candidate molecules is detected by an ELISA method, cultured cells, etc. Various conventionally known methods for examining the presence / absence of binding between substances or the presence / absence of dissociation, such as a method for screening in a cell using a method, a method for searching for a substance that binds to an IL-18Rα chain fixed to a column Can be used.
[0055]
(2) Immune disease treatment kit according to the present invention
The immunological disease treatment kit according to the present invention may be one containing the above immunological disease treatment drug (drug-containing type), or for performing a step of isolating NKT cells from a host organism and stimulating with IL-18. (Stimulation process implementation type, type that appropriately prepares IL-18 stimulated NKT cells) may be used.
[0056]
<Example of immune disease treatment kit>
As an example of an immune disease treatment kit of the stimulation process implementation type, for example, an isolation material for isolating NKT cells from a host organism, and a stimulation medium for culturing NKT cells in the presence of IL-18 And a stimulant containing IL-18 added to the stimulation medium. Furthermore, IL-2 may be contained in the stimulating drug, and a stimulating drug containing IL-2 may be contained separately from the stimulating drug containing IL-18. That is, when the stimulating drug containing IL-18 is used as the first stimulating drug, a drug containing IL-2 may be included as the second stimulating drug.
[0057]
The material for isolation is not particularly limited as long as it can effectively isolate NKT cells from a host organism. For example, as illustrated in the examples described later, CD4 + CD4, a column carrier for purifying T cells from the spleen of a host organism + Staining agent for fractionating NKT cells from T cells using a fluorescein cell sorter, various antibodies for depleting cell populations other than NKT cells from spleen cells, materials using magnetism such as antibody-coated magnetic beads Etc.
[0058]
The stimulation medium does not adversely affect IL-18, IL-2, or NKT cells, and also adversely affects stimulation of NKT cells by IL-18 or IL-18 and IL-2. There is no particular limitation as long as it is a culture medium that does not cause any problems. Various known media can be used as the stimulation medium.
[0059]
The specific composition of the stimulant is not particularly limited, and includes IL-18 and / or IL-2, as with the NKT-stimulated immune disease therapeutic agent described above. Any composition may be used as long as it does not affect.
[0060]
<NKT helper agent>
In the immunological disease treatment kit, for the purpose of further enhancing the IgE-inducing action by IL-18-stimulated NKT cells, CD4 expressing T cells (CD4 + NKT cells containing T cells) may be included.
[0061]
As will be described later in the examples, CD1d − / − Mouse and class II − / − IgE induction fails when IL-18 is administered to both mice. CD1d − / − The mouse is a mouse lacking NKT cells (NKT cell-deficient mouse), and is a class II − / − Mouse is standard CD4 + Mice lacking T cells (standard CD4 + T cell-deficient mice). In contrast, standard CD4 + Class II reconstructed by transplanting T cells − / − Mice show the ability to produce significant amounts of IgE when administered IL-18.
[0062]
NKT cells express IL-18Rα chains at high levels and respond well to IL-4, IL-9, and IL-13 in response to stimulation in vitro with IL-2 and IL-18. In large quantities to enhance the expression of CD40 ligand. In contrast, standard CD4 + T cells do not express IL-18Rα or are only expressed at low levels and respond very little to IL-2 and IL-18. Nevertheless, as described above, standard CD4 + T cells play an important role in the response of IgE by B cells upon administration of IL-18. In other words, standard CD4 + T cells will exhibit helper function in the presence of NKT cells.
[0063]
Therefore, the immunological disease treatment kit according to the present invention includes a drug-containing type and a stimulation process execution type (a type in which IL-18 stimulated NKT cells are appropriately prepared). + NKT cells containing T cells may be included. The specific composition of NKT cells and standard helper T cells is not particularly limited, and CD4 is the same as the NKT-stimulated immune disease therapeutic agent described above. + Any composition may be used as long as it contains cells and does not adversely affect the purpose of use.
[0064]
(3) Method for controlling IgE production
The present invention includes a method for controlling IgE production, in addition to the above-described immune disease therapeutic drug and immune disease treatment kit. That is, the method for controlling IgE production according to the present invention includes an NKT stimulation step of selectively enhancing IL-4 production and CD40 ligand expression by stimulating NKT cells with IL-18, or NKT by IL-18. Any of the NKT stimulation inhibition steps for inhibiting cell stimulation may be included.
[0065]
Among these, the NKT stimulation step may be performed by administration of IL-18 or administration of IL-18 stimulated NKT cells induced by stimulation with IL-18, and the NKT stimulation inhibition step It may be carried out by administration of an IL-18-NKT inhibitor that inhibits stimulation of NKT cells by -18. In the specific implementation of each of these steps, the aforementioned immune disease therapeutic drug or immune disease treatment kit may be used.
[0066]
IL-4 and IFN-γ, cytokines produced by NKT cells, cancel each other's functions. Therefore, if any cytokine can be selectively induced, it is effective for the treatment of autoimmune diseases. Moreover, if the mechanism of cytokine induction by NKT cells is clarified, its application to the treatment of allergic diseases can also be found. However, no such technique has been found so far.
[0067]
On the other hand, in the present invention, IL-4 is selectively produced by stimulating NKT cells with IL-18, and CD40L expression is enhanced to positively control the production of IgE. Inhibition of NKT cell stimulation by 18 can negatively control the production of IgE.
[0068]
(4) Use of the present invention
The present invention can be used for treatment of various immune diseases. Specifically, when IL-4 is selectively produced according to the present invention, when NKT cells are administered to diabetic mice (NOD), the action of IL-4 and IL-10 produced from NKT cells Since it has been reported that its onset is prevented, it is used for the treatment of autoimmune diseases caused by excessive Th1 immune response, such as
[0069]
On the other hand, when IgE production is negatively controlled according to the present invention (inhibition or inhibition of IgE production induction), it can be used for treatment of various allergic diseases.
[0070]
【Example】
Hereinafter, although an example and a comparative example explain the present invention still in detail, the present invention is not limited to this. Details of the mouse and material used in the examples and specific experimental methods are shown below.
[0071]
[Mouse and Material]
Female BALB / c and C57BL / 6 mice not infected with the pathogen, and 8-week-old C57BL / 6 class II − / − Mice were purchased from Jackson Laboratory. In addition, C57BL / 6 IL-4 − / − Mice were obtained from Taconic Farms. OVA 323-339 Transgenic mice expressing an αβ-type heterodimeric TCR that recognizes (DO11.10; BALB / c genetic background) are Dr. D. Provided by Loh (Washington University).
[0072]
Recombinant mouse IL-18 and anti-IL-18Rα chain mAb (Y38) were provided by Hayashibara Biochemical Institute. FITC-anti-mouse CD4 (GK1.5), FITC anti-mouse CD44 (IM7), FITC-anti-rat IgG1 (RG11 / 39.4), FITC anti-mouse IL-4 (BVD4-1D11), Cychrome anti-mouse CD4 ( RM4-5), biotinylated anti-mouse CD40L, PE anti-mouse NK1.1 (PK136), and PE-labeled streptavidin were purchased from PharMingen.
[0073]
[Preparation of NKT cells]
CD4 from spleen of C57BL / 6 mice + T cells were purified by MicroBeads (anti-mouse CD4; clone RM4-5, manufactured by Miltenyi Biotec). CD4 concentrated to high purity by this purification + T cells were treated with 10 μg / ml anti-FcγRII / III for 30 minutes at 4 ° C., followed by FITC-anti-CD4 and PE-anti-NK1.4 in staining buffer (PBS, 1% FCS) for 30 minutes. Treatment with 1 was performed. CD4 + NK1.1 + Cells and CD4 + NK1.1 − Both T cells were fractionated using a fluoresce cell sorter. The purity of each cell population was greater than 98.5% in later reanalysis.
[0074]
In some embodiments, CD4 + Cells were enriched in a negative selective process by depleting other cell populations from spleen cells. Cell depletion was treated with a mixture of FITC-anti-B220, FITC anti-CD8, FITC anti-IA, FITC anti-NK1.1 and FITC anti-FcγRII / III antibody (PharMingen) followed by anti-FITC coated magnetic beads Incubation treatment (by Miltenyi Biotec) and exposure to a magnetic field were performed twice as a set.
[0075]
CD4 concentrated to high purity + NK1.1 − T cells are stained with FITC anti-CD44 and PE anti-NK1.1, and CD44 high NK1.1 − T cells were fractionated.
[0076]
[In vitro culture of NKT cells]
CD4 derived from C57BL / 6 mice + NK1.1 + Cells and CD4 + NK1.1 − T cells are 1 × 10 5 /0.2 ml / well and either medium alone or a combination of IL-2 (200 pM), IL-12 (10 ng / ml) and IL-18 (50 ng / ml) was added Cultured in the medium for 4 days. As the medium, RPMI1640 supplemented so that FBS is 10%, 2-mercaptoethanol (2-ME) is 50 mM, L-glutamine is 2 mM, penicillin is 100 U / ml and streptavidin is 100 μg / ml is used. It was.
[0077]
Supernatants were collected after incubation and tested with IL-4, IL-9, IL-13 and IFN-γ by ELISA. The resulting T cells were tested for their ability to induce IgE-producing B cells by CD40L expression and incubation with highly purified B cells.
[0078]
[Mouse processing in vivo]
Class II − / − For mice, wild type and IL-4 − / − 10 collected from mice 7 Pieces of purified CD4 + NK1.1 − By injecting T cells intravenously, CD4 + NK1.1 − T cells are classified as Class II − / − Mice were transplanted. CD4 + NK1.1 − Class II who have received these treatments from the day after T cell transplantation − / − Mice and untreated wild type mice were injected daily with PBS buffer or IL-18 (2 μg / day) for 13 days. Blood was collected after 0, 7, 10, and 14 days, and IgE, IL-4, and IL-13 in the serum were measured by ELISA.
[0079]
In some examples, CD4 collected from wild type mice + NK1.1 − T cells are labeled with carboxyfluorescein diacetate succinimide ester (CFSE) (Molecular Probes), class II − / − Mice were transplanted. Cells containing the transplanted cells were stained with PE-anti-CD4 and the transplanted cells were confirmed by CFSE fluorescence and CD4 expression.
[0080]
Class II − / − In mice, CD4 established in the spleen of the mouse after transplantation + The frequency of T cells is (CFSE + CD4 + It was calculated from the formula of (number of cells) / (number of transferred cells).
[0081]
[Flow cytometry]
To detect cells producing IL-4 from mice treated with IL-18, whole spleen cells from C57BL / 6 mice injected with IL-18 for 10 days were treated with Cychrome anti-CD4 and PE-antiNK1. 1, stained with 4% (w / v) paraformaldehyde in PBS, and permeabilized the cell membrane with ice-cold PBS containing 1% FCS and 0.1% saponin. The obtained cells were first stained with 0.5 μg FITC anti-mouse IL-4 or an isotype-matched control Ab and analyzed by FACS Calibur (Becton) for the percentage of cells positive for cytoplasmic IL-4. .
[0082]
In addition, in order to detect CD40L-positive cells in IL-18-treated mice, a combination of FITC anti-CD4 and PE anti-NK1.1 and biotinylated anti-CD40L and tricolor streptavidin ( The product was stained with a combination of CALTAG) and analyzed by FACS Calibur.
[0083]
Furthermore, to confirm the IL-18Rα chain expressed in NKT cells, after blocking FcR with anti-FcγRII / III, anti-mouse IL-18Rα chain mAb or control rat IgG1 mAb (R3-34) was used for splenic lymphocytes. Incubate for 30 minutes at 4 ° C., followed by incubation of FITC-conjugated anti-rat IgG1 mAb, PE anti-NK1.1 and Cychrome anti-mouse CD4 in staining buffer for 30 minutes at 4 ° C. Samples were analyzed on a FACS Calibur.
[0084]
[Example 1: CD1 − / − Mice are deficient in the ability to produce Th2 cytokines and IgE in response to IL-18 administration. ]
IL-18 treatment on BALB / c mice is CD4 + IgE is induced in a T cell dependent manner. This IgE response is not related to the induction of Th2 cells, suggesting that T cell activation by TCR association is not required for the induction of IgE production in mice injected with IL-18.
[0085]
Thus, in order to demonstrate that IgE responses do not require TCR association by endogenous antigens, BALB / c background transgenic mice (DO11.10) expressing genes encoding TCRs that recognize OVA peptides. Mice) was tested for the ability to produce IgE in response to IL-18. In addition, in order to confirm IL-18 responsive T cells associated with the IgE response induced by IL-18, C57BL / 6 mice and CD4 + NK1.1 + C57BL / 6 background CD1 lacking T cells − / − In mice, the ability to produce IgE in response to IL-18 was compared. These results are shown in FIGS.
[0086]
Figures 1A-D show BALB / c mice, BALB / c background DO11.10 transgenic mice, C57BL / 6 mice and C57BL / 6 background CD1, respectively. − / − It is a result of a mouse | mouth, and each of these various mice | mouths used 5 each. IL-18 (2 μg / day) was injected daily for 13 days, blood was collected on
[0087]
As shown in FIG. 1A, like these normal BALB / c mice, DO11.10 mice produced IgE in response to this IL-18 injection, but treatment with this IL-18 injection produced a Th2 response. Not induced (not shown). Furthermore, although not shown, this IL-18-induced IgE production is resistant to cyclosporin A treatment, and TCR-mediated T cell activation is eliminated in this IgE response.
[0088]
Also, as shown in FIG. 1B, IL-18 causes a significant increase in serum IgE levels in wild type mice, but CD1 − / − It did not happen in mice. Furthermore, administration of IL-18 to wild-type mice results in a significant amount of production for IL-4 and IL-13, but as shown in FIGS. 1C and D, CD1 − / − Mice do not produce IL-4 at all and IL-13 production is reduced. From these results, CD4 + NK1.1 + T cells are suggested to produce both IL-4 and IL-13 in response to IL-18.
[0089]
Example 2: NKT cells produce IL-4 and express CD40L in response to treatment in vivo with IL-18. ]
To determine the role of NKT cells in the IL-18-induced IgE response, when wild-type mice were directly injected with IL-18, CD4 + NK1.1 + We directly tested whether T cells produce IL-4 and increase the expression of CD40L. C57BL / 6 mice were injected daily for 10 days with IL-18 (2 μg / day) or PBS. Each group of PBS injection and IL-18 injection had 4 mice. The results are shown in FIGS. 2A and B.
[0090]
FIG. 2A shows intracellular CD4 + NK1.1 + Cells and CD4 + NK1.1 − FIG. 2B shows the results of staining T cells with IL-4. + NK1.1 + Cells and CD4 + NK1.1 − It is the result of staining T cells with CD40L. Sample data is shown from four individual mice. The percentages shown indicate the percentage of cells positive for IL-4.
[0091]
As shown in FIG. 2A, CD4 obtained from IL-18 injected mice when compared to PBS injected mice. + NK1.1 + T cells showed a significant increase (p <0.01) in the proportion of T cells producing IL-4 ex vivo. Meanwhile, CD4 + NK1.1 − T cells do not contain cytoplasmic IL-4. Similarly, as shown in FIG. 2B, CD4 of mice injected with IL-18. + NK1.1 + In T cells, the proportion of T cells expressing CD40L was significantly increased (p <0.01). IL-18 is CD4 + NK1.1 − The proportion of T cells that express CD40L was also increased in T cells, but the extent of CD4L was increased to the extent of CD4. + NK1.1 + Significantly less than the increase in T cells.
[0092]
[Example 3: IL-18Rα chain expressed in NKT cells]
CD4 + NK1.1 + The responsiveness of T cells to IL-18 suggests that this type of cell inherently expresses IL-18R. Therefore, CD4 was analyzed by flow cytometry analysis using anti-IL-18Rα chain mAb. + NK1.1 + And CD4 + NK1.1 − The expression of IL-18Rα chain on the cells was compared.
[0093]
Spleen cells freshly prepared from C57BL / 6 mice were analyzed for CD4 and NK1.1 expression by flow cytometry. The result is shown in FIG. 2C. NK cells (CD4 expressing high levels of IL-18Rα chain) − NK1.1 high ) Was used as a positive control. In FIG. 2C, R1 is CD4 + NK1.1 − Expression of IL-18Rα chain expression in cells, R2 is CD4 + NK1.1 + Expression of IL-18Rα chain expression in cells, where R3 is CD4 − NK1.1 high Expression of IL-18Rα chain expression in cells. The numerical value shown shows MFI (intensity of fluorescence) of IL-18Rα chain staining.
[0094]
As shown in R2 of FIG. 2C, CD4 of freshly prepared spleen + NK1.1 + T cells essentially express high levels of IL-18Rα chain (MFI 11.0), but as shown in R1, CD4 + NK1.1 − T cells remain at low levels of expression (MFI: 3.9). On the other hand, as shown by R3, positive control NK cells (CD4 − NK1.1 high Cells) express the IL-18Rα chain at a high level. On the other hand, NK cells produce IL-13 by IL-18 stimulation in vitro but do not produce IL-4.
[0095]
Example 4: IL-18 stimulates NKT cells to produce IL-4, express CD40L, and enhance IgE production by B cells. ]
CD4 + NK1.1 + T cells and CD4 + To further demonstrate the ability of IL-4 production and CD40L expression in response to IL-18 in NK1.1-T cells, CD4 + NK1.1 + T cells and CD4 + NK1.1 − T cells were fractionated and stimulated with IL-2 (200 pM) and / or IL-18 (50 ng / ml) for 4 days.
[0096]
CD4 from C57BL / 6 mice + NK1.1 + T cells and CD4 + NK1.1 − Each T cell is fractionated and each 1 × 10 5 After the concentration of /0.2 ml / well, the cells were cultured in the medium alone or in a medium supplemented with IL-2 (200 pM), IL-18 (50 ng / ml), or a combination thereof. After 4 days of culture, supernatants were collected and tested for concentrations of IL-4, IL-9, IL-13 and INF-γ by ELISA. The result is shown in FIG. 3A.
[0097]
As shown in FIG. 3A, CD4 + NK1.1 + T cells produce significant amounts of IL-4 and IL-13 when cultured with IL-18 and IL-2, but canonical CD4 + NK1.1 − T cells produce little IL-4 and produce small amounts of IL-13. Moreover, from the result of FIG. 3A, IL-18 and IL-2 are CD4. + NK1.1 + Stimulate cells to induce IL-9 production, but CD4 + NK1.1 − It has also been found that stimulation of T cells does not induce IL-9 production. CD4 + NK1.1 + T cells produced much lower amounts (24 pg / ml) of IFN-γ when cultured with IL-18 and IL-2 than were stimulated by IL-18 and IL-12 (5381 pg / ml).
[0098]
CD4 + NK1.1 + T cells and CD4 + NK1.1 − The surface expression of CD40L in T cells was analyzed by flow cytometry. The result is shown in FIG. 3B. The percentages in the figure are all CD4 + The ratio of CD40L positive cells in T cells is shown.
[0099]
As shown in FIG. 3B, IL-2 or IL-18 alone is CD4 + NK1.1 + Although the CD40L expressed on T cells is sufficiently increased (46.1% and 39.7%), the combination causes an even greater induction (94.2%). In contrast, CD4 + NK1.1 − In T cells, CD4L induction is mild even with the same treatment, so CD4 + NK1.1 + It is suggested that T cells are the main target of IL-18.
[0100]
In addition, CD4 + NK1.1 + T cells and CD4 + After NK1.1-T cells were stimulated with IL-2 and IL-18 for 4 days, the ability to induce IgE when B cells were stimulated with these T cells in vitro was tested.
[0101]
CD4 from C57BL / 6 mice + NK1.1 + T cells and CD4 + NK1.1 − T cells are each 1 × 10 5 The concentration was /0.2 ml / well, and the medium was cultured alone, or IL-18 (50 ng / ml) and IL-2 (200 pM) were added to the medium and cultured. After 4 days of culture, spleen-derived B cells of freshly purified C57BL / 6 mice were obtained at 1 × 10 5 Anti-INF-γ antibody (10 μg / ml) was further added to a concentration of /0.2 ml / well. After 10 days of incubation, the supernatant was collected and the IgE concentration was measured by ELISA. The results are shown in Table 1. Results are geometric mean ± SD.
[0102]
[Table 1]
Thus, when NKT cells stimulated with IL-18 and IL-2 are co-cultured with B cells, CD4 + NK1.1 + T cells can stimulate B cells to induce IgE production, but standard CD4 + CD4 is a T cell + NK1.1 − When T cells are co-cultured with B cells, IgE production from B cells cannot be induced.
[0104]
From this result, NKT cells expressing IL-18Rα chain express IL-4 and CD40L in response to IL-18 stimulation, and T cells stimulated with IL-18 are expressed in vivo and It was shown to act on B cells both in vitro to induce IgE production. Thus, NKT cells are CD4 in this response system. + Shown to be a critical subset of T cells.
[0105]
Example 5: Activated CD4 + NK1.1 − NKT cells, but not T cells, produce IL-4 in response to IL-18. ]
In Example 4, CD4 + NK1.1 + It has been demonstrated that T cells are highly responsive to IL-18. Next, to determine whether the induction of Th2 cytokines and CD40L by IL-18 occurs independently in NKT cells or in already activated or memory T cells, the IL- of
[0106]
First, as a representative of the activated T cell population, CD44 high CD4 + Total CD4 obtained from normal C57BL / 6 mice using T cells + T cells, CD4 + NK1.1 + T cells and CD4 + NK1.1 − CD44 expression in T cells was tested. CD4 newly prepared from C57BL / 6 mice + Cells were analyzed for total CD4 by flow cytometry. + T cells, CD4 + NK1.1 + T cells, CD4 + NK1.1 − T cells were fractionated and analyzed for CD44 expression, respectively. The result is shown in FIG. 4A. In FIG. 4A, R1 is all CD4 + T cells are shown, R2 is CD4 + NK1.1 + T cells are shown, R3 is CD4 + NK1.1 − T cells are shown.
[0107]
As shown in FIG. 4A, almost all CD4 + NK1.1 + T cells (R2) expressed CD44 at high levels (95.7%), whereas CD4 + NK1.1 − T cells (R3) had CD44 expression of 12.9% and total CD4 + In T cells (R1), CD44 expression remained at 21.6%.
[0108]
Next, responsiveness of NKT cells to IL-18 and CD44 high NK1.1 − T cells or CD44 int NK1.1 − CD4 + The responsiveness of T cells was compared. All CD4 + In T cells, as with other cell populations, NKT cells (CD44 high NK1.1 + CD4 + T cells) and then CD44 high NK1.1 − T cells were fractionated. That is, since NKT cells are known to lose their NK1.1 expression during or after stimulation, all CD4 can be expressed in a negative selective manner to deplete other cell populations, particularly NKT cells. + From T cells, CD44 high NK1.1 − CD4 + T cells were fractionated. CD44 int NK1.1 − T cells and NKT cells are all CD4 + Fractionated from T cells. This fractionation is a positive selection method using a sorter. The result is shown in FIG. 4B.
[0109]
In FIG. 4B, R1 is CD44. high NK1.1 − T cells are shown, R2 is CD44 int NK1.1 − T cells are shown and R3 is NKT cells. As is apparent from FIG. 4B, fractionation is effectively performed using either a positive selection method or a negative selection method.
[0110]
Next, fractionated CD4 + CD44 high NK1.1 − T cells, NKT cells and CD4 + CD44 int NK1.1 − T cells are each 1 × 10 5 The concentration was /0.2 ml / well, and either the medium alone or IL-2 (200 pM), IL-18 (50 ng / ml) and a combination thereof were added to the medium and cultured. After 4 days in culture, supernatants were collected and tested by ELISA using IL-4 and IL-13.
[0111]
Thus, when these three cell populations were stimulated with IL-2 and / or IL-18, as shown in FIG. 4C, only the NKT cells were consistent with IL-2 and IL, consistent with the results of Example 4 above. Both IL-4 and IL-13 were produced in response to stimulation with -18. This result supports that NKT cells differ from previously activated standard T cells and have the ability to induce IgE from B cells.
[0112]
[Example 6: CD4 + NK1.1 − T cells require an IL-18 induced IgE response. ]
Standard CD4 + NK1.1 − T cells will be less responsive to IL-18 in vivo and in vitro because the induction of IL-4 and CD40L is mild even when stimulated with IL-18. However, this result shows that standard CD4 + It is not possible to determine whether T cells are required for IL-18-induced IgE production as described above.
[0113]
Therefore, CD4 expressed by wild-type mice + NK1.1 + Class II expressing approximately the same number as T cells − / − Mouse IL-18 responsiveness was tested.
First, C57BL / 6 mice, CD1 − / − Mouse and class II − / − CD4 in whole spleen cells from mice and CD4 enriched spleen cells + NK1.1 + The percentage of T cells is shown in FIG. 5A. The percentage in the figure is the percentage of cells in the selected area. Further, the upper side of the figure shows whole spleen cells, and the lower side shows CD4 concentrated spleen cells. Class II − / − Mouse CD4 + T cells account for only 4-5% of spleen cells, but CD4 + NK1.1 + The proportion of T cells was equivalent to that of wild type mice.
[0114]
Next, C57BL / 6 mice and class II − / − Do nothing for mice, or wild type mice or IL-4, respectively − / − CD4 from mouse + NK1.1 − T cells (10 7 ). Each group consisted of 5 mice. These mice were injected daily with 1L-18 (2 μg / day) for 13 days. Blood was collected from these mice at 0, 7, 10, and 14 days, and IgE in the serum was measured by ELISA. The results for the mouse that does nothing are shown in FIG. + NK1.1 − FIG. 5C shows the results of the mouse transfected with T cells.
[0115]
As shown in FIG. 5B, class II − / − Mice completely failed to produce IgE in response to IL-18 treatment. In contrast, standard CD4 from wild-type mice, as shown in FIG. 5C. + Class II reconstructed by transferring T cells − / − Mice produced significant IgE in response to IL-18 to a lesser extent. However, as shown in FIG. − / − Standard CD4 from mouse + Mice reconstituted by transferring T cells failed to respond to IL-18. Thus, even when compared with wild-type mice, CD4 + Class II reconstituted with T cells − / − Mice show a weak IgE response and transferred CD4 + It was suggested that some of the T cells were established in the host spleen.
[0116]
In addition, for class II − / − mice, CD4 from C57BL / 6 mice + T cells were injected intravenously. Specifically, CD4 labeled with CFSE + T cells were implanted intravenously. Spleen cells were then isolated from the recipients at 3, 7, and 10 days. In addition, the group which isolate | separated the spleen cell on the 3rd, the 7th, and the 10th was made into three mice each. The transplanted cells were confirmed by CSFE fluorescence. The result is shown in FIG. 5D.
[0117]
As is apparent from FIG. 5D, transplanted standard T cells were established at a rate of 0.94% at 3 days, 1.58% at 7 days, and 0.64% at 10 days. From this result, standard CD4 + IL-4 producing T cells is shown to be necessary for IgE production by B cells.
[0118]
【The invention's effect】
As described above, the present invention stimulates NKT cells with IL-18 or inhibits stimulation of NKT cells with IL-18. Thus, IgE production involving NKT cells can be positively or negatively controlled, and can be used for treatment of various immune diseases.
[0119]
Therefore, in the present invention, when IL-4 is selectively produced by stimulation of NKT cells with IL-18, an autoimmune disease caused by an excessive Th1 immune response, such as
[0120]
Therefore, the present invention can be applied not only to various pharmaceutical industries and research reagent industries but also to the medical field.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A to D are CD1 − / − It is a figure which shows that a mouse | mouth is in the state which cannot produce IgE and IL-4 even if administration of IL-18 is received.
FIGS. 2A-C show that NKT cells produce IL-4 and express CD40L in response to in vitro treatment with IL-18.
FIGS. 3A and 3B show that NKT cells produce IL-4, IL-9 and IL-13 in vitro in response to IL-18 stimulation and express CD40L.
FIGS. 4A-4C show activated CD4 + NK1.1 − FIG. 3 shows that T cells do not produce IL-4 when stimulated with IL-18.
FIGS. 5A-5D show standard CD4 collected from wild type mice in class II − / − mice. + It is a figure which shows the result which became able to acquire the responsiveness with respect to IL-18 by transplanting T cell, and became able to show IgE production in response to the administered IL-18.
Claims (13)
ナチュラルキラーＴ細胞をインターロイキン１８の存在下で培養するための刺激用培地と、
上記刺激用培地に加えるインターロイキン１８を含有する刺激薬剤とを含むことを特徴とする免疫疾患治療キット。An isolation material for isolating natural killer T cells from a host organism;
A stimulation medium for culturing natural killer T cells in the presence of interleukin 18,
An immunological disease treatment kit comprising a stimulant containing interleukin 18 added to the stimulating medium.
または、インターロイキン１８を含有する刺激薬剤を第一の刺激薬剤とした場合に、インターロイキン２を含有する第二の刺激薬剤を含むことを特徴とする請求項８に記載の免疫疾患治療キット。Furthermore, whether the stimulant contains interleukin 2,
Alternatively, when the stimulant containing interleukin 18 is used as the first stimulant, the immune disease treatment kit according to claim 8, comprising a second stimulant containing interleukin 2.
インターロイキン１８によるナチュラルキラーＴ細胞の刺激を阻害するＮＫＴ刺激阻害工程の何れかを含むことを特徴とするＩｇＥ産生の制御方法。Stimulating natural killer T cells with interleukin 18 to selectively enhance interleukin-4 production and CD40 ligand expression, or
A method for controlling IgE production comprising any one of NKT stimulation inhibiting steps for inhibiting stimulation of natural killer T cells by interleukin 18.
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