JP2004313043A - Alkali protease - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain an alkali protease for a detergent, having low homology in amino acid sequences to conventionally known alkali proteases and having oxidizing agent resistance in spite of being a wild type, and a gene encoding the same. <P>SOLUTION: The protease comprises (a) a protein composed of an amino acid sequence having alkali protease activity of alkalophilic Bacillus, (b) a protein in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in (a) the amino acid sequence and has alkali protease activity, or a protein composed of an amino acid sequence having ≥85% homology of the amino acid sequence and has alkali protease activity. The gene encodes the protein. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【発明の属する技術分野】
本発明は、洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００１】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤へ配合されているアルカリプロテアーゼは、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。洗剤という大量消費剤に用いられることから、アルカリプロテアーゼは工業用酵素の中でも最も大量に生産されている酵素である。
【０００２】
代表的な洗剤用アルカリプロテアーゼとしては、バチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属し、分子量２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイムズ）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア）、ブラップ（登録商標；ヘンケル）及びＫＡＰ（花王）等が知られている。しかし、これらの洗剤用アルカリプロテアーゼは酸化剤に対して非常に感受性が高く、わずかな濃度の酸化剤を添加するだけで短期間に失活するという問題があった（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
また最近では、デュラザイム（登録商標；ノボザイムズ、例えば特許文献１参照）のような、タンパク質工学により酵素を改良し、酸化剤に対して抵抗性の高いアルカリプロテアーゼも創製されるに至っている。
【０００４】
しかしながら、タンパク質工学を用いて創製した酵素は生産量の低下、比活性の低下などが認められる場合がある。また、このような改変酵素の使用範囲も限定されることが知られている。
【０００５】
本発明は、従来知られているアルカリプロテアーゼとはアミノ酸配列において相同性が低く、野生型でありながら酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特表平６−５０１５０９号公報
【非特許文献１】
Ｓｔａｕｆｆｅｒ ａｎｄ Ｅｔｓｏｎ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４４， ５３３３−５３３８ （１９６９）
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌のゲノムＤＮＡから公知のズブチリシンとアミノ酸配列において相同性の低いアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、種々検討したところ、酸化剤に対し影響を受け難い新規なアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を取得し、さらにこれを用いて新規なアルカリプロテアーゼを生産することに成功した。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を提供するものであり、また、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を提供するものである。
【０００９】
また本発明は、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
【００１０】
【発明実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、或いは配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１１】
ここで、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１のアミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００１２】
本発明の配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列間の相同性は９８．９％と非常に高い。しかし、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、ズブチリシンＢＰＮ’及びズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇとは６７．６−７２．７％の相同性を示すにすぎない。さらに洗剤用アルカリプロテアーゼとして用いられているサビナ−ゼ、エスペラーゼ、ＫＡＰ（Ｍ−プロテアーゼ）とは５７．７−６２．６％の相同性を示すにすぎない。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−ＬＤ１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５７６）由来のアルカリプロテアーゼで酸化剤耐性を有するＬＤ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＢ０８５７５２）とは６２．２−６３．０％、アルカリプロテアーゼＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＢ０９０３３４）、ＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ ＡＢ０９６６８９）とは７４．６−８０．４％の相同性であった。さらに好アルカリ性バチルスＬＧ１２株由来のアルカリプロテアーゼＳｐｒＣとは８３．３％、ＳｐｒＤとは７５．７％の相同性を示した（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６１， ４４９０−４４９３， １９９５）が、完全に一致するものではなかった。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示すものである。
【００１３】
参考までに、配列番号３と４におけるアミノ酸番号−１〜−１０４番の間、即ちプレプロ配列間における相同性は９８．１％と非常に高いが、上記した公知のアルカリプロテアーゼのプレプロ配列と比較した場合、２８．２−５６．０％の相同性を示すにすぎず、相同性の高い配列は見当たらない。
【００１４】
従って、本発明のタンパク質には、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質を包含するものである。斯かるアミノ酸配列における相同性は、より好ましくは９０％以上、さらに９５％以上であることが望ましい。
尚、ここで述べる相同性の検索は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムやマキシマムマッチング法を用いて算出することができる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼ遺伝子は、上記のとおり、配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、或いは配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、をコードするものであればよいが、（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列又は（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子が好ましい。
【００１６】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ − ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に記載の条件等が挙げられる。例えば、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン***ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１７】
本発明のアルカリプロテアーゼは、その遺伝子と適当なベクターと宿主菌とを用いることにより大量に生産することができる。
当該遺伝子は、例えばバチルス属に属する微生物、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）等から、ショットガン法、ＰＣＲ法を用いクローニングすること、更に必要に応じて、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法、例えば変異導入用キット［Ｍｕｔａｎ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ キット（タカラ）］等を用いて変異を導入すること、により調製することができる。
【００１８】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
【００１９】
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００２０】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００２１】
斯くして得られた本発明アルカリプロテアーゼの特徴は、後記実施例に示すとおりであるが、特に、分子量が約２８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）であり、最適反応ｐＨを９付近（グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液あるいはトリス／塩酸緩衝液）、最適温度を５５℃付近に有し、０．１％過酸化水素（ｐＨ１０）中で３０℃、１０分間処理した場合に５０％以上の残存活性を有することが望ましい。
【００２２】
【実施例】
実施例１ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来アルカリプロテアーゼ（ＫＳ）遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
ＫＳＭ−ＫＰ４３株は分子量２８ｋＤａ、４３ｋＤａ、及び７２ｋＤａのアルカリプロテアーゼを菌体外に生産することが判っている。それぞれのプロテアーゼは培養液からカラムクロマトグラフィーにより電気泳動的に均一にまで精製され、Ｎ末アミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステムズ）により決定した。分子量２８ｋＤａのプロテアーゼＫＳのＮ末アミノ酸配列はＡｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅであった。また、バチルス属細菌由来で分子量２８ｋＤａのアルカリプロテアーゼにおいて活性中心に相当し、高度に保存されている２２１番目のＳｅｒ周辺のアミノ酸配列としてＧｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏが挙げられる（アミノ酸番号はスブチリシンＢＰＮ’を基準とした）。
【００２３】
そこで、本発明のプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングを行うに際し、上記２種類のアミノ酸配列の情報を基にプライマー１（配列番号５）及びプライマー２（配列番号６）を合成した。ＫＳＭ−ＫＰ４３株から斎藤と三浦の方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ７２， ６１９−６２９， １９６３）に準じ、ゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型としてプライマー１と２を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ条件はゲノムＤＮＡ１０〜１００ｎｇ、各プライマー２０ｎｍｏｌ、Ｐｗｏ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベーリンガーマンハイム）を用いて９４℃で１分間の熱変性後、９４℃で１分間、４０〜６０℃で１分間、７２℃で３分間を１サイクルとし３０サイクル行なった。
【００２４】
得られたＰＣＲ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（ロッシュ）にて精製し、ＳｍａＩにて消化したｐＵＣ１８に連結し、大腸菌ＨＢ１０１株に導入した。形質転換体よりＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ キット（ロッシュ）を用いてプラスミドを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（パーキンエルマー）及びＤＮＡシークエンサー（３７７型：アプライドバイオシステムズ）を用いて約６５０ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２５】
得られた配列情報を基にインバースＰＣＲにより構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＨｉｎｄＩＩＩにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ キット ｖｅｒ．２（タカラ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。先の部分遺伝子配列からプライマー３〜６（配列番号７〜１０）を合成し、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型とし、プライマー３及び４を、又、ＨｉｎｄＩＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型とし、プライマー３及び５又はプライマー４及び６を用いＬＡＴａｑ（タカラ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。ＰＣＲ産物をｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ （ノバゲン）へクローニングし、ＥｃｏＲＩ分解物から約２．５ｋｂのＤＮＡ増幅断片が、ＨｉｎｄＩＩＩ分解物から約０．２及び０．５ｋｂのＤＮＡ増幅断片がそれぞれ得られた。構築されたプラスミド内の挿入断片に関し、それぞれのプライマーを用いてプロテアーゼＫＳをコードする遺伝子〔１１３７ｂｐ：３７９アミノ酸（配列番号３）〕を含む２１６４ｂｐの塩基配列を決定した。
【００２６】
実施例２ アルカリプロテアーゼＫＳの組換え生産
アルカリプロテアーゼＫＳを大量に生産させるためにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域（Ｓｕｍｉｔｏｍｏら， Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５９， ２１７２−２１７５， １９９５）及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｋ１６株由来のＭ−プロテアーゼ遺伝子のＳＤ配列（Ｈａｋａｍａｄａ ら， Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ７８， １０５−１０８， １９９４）を利用したプラスミドを作製した。即ち、プライマー７（配列番号１１）並びにプライマー８（配列番号１２）を合成し、ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで切断した後、同様の制限酵素で処理したｐＨＳＰ６４［プライマーＨＭ５（配列番号２１）及びＨＭ６（配列番号２２）を用いて増幅したＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域をｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位に導入したプラスミド］へ連結し（ｐＨＳＰＫＳ）、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換した。
【００２７】
スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍＬの種母培地［６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。次いで３０ｍＬの主培地［８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン］に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２８】
実施例３ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−９８６５株由来アルカリプロテアーゼ（ＭＳ）遺伝子のクローニング及び塩基配列の決定
【００２９】
実施例１で決定したアルカリプロテアーゼＫＳをコードする遺伝子の塩基配列並びにその上下流域の塩基配列情報を基に、プライマー９〜１５（配列番号１３〜１９）を合成した。ＫＳＭ−９８６５株から調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、プライマー９及び１０又はプライマー９及び１２又はプライマー１１及び１２又はプライマー１２及び１５又はプライマー１３及び１４を用い、実施例１に示した条件によりＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ断片を精製し、プライマー９〜１４を用いたダイレクトシークエンスを行い、アルカリプロテアーゼＭＳをコードする遺伝子〔１１３７ｂｐ：３７９アミノ酸（配列番号４）〕を含む２５５７ｂｐの塩基配列を決定した。
【００３０】
実施例４ アルカリプロテアーゼＭＳの組換え生産
実施例２と同様にアルカリプロテアーゼＭＳの生産を行った。即ち、ＫＳＭ−９８６５株のゲノムを鋳型にプライマー８並びに１６（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲ産物を精製し、ｐＨＳＰ６４のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位に導入し、バチルス エスピーＫＳＭ−９８６５株の変異株をエレクトロポレーション法で形質転換した。スキムミルク溶解斑の有無から形質転換体を選抜し、ポリペプトンＳ／マルトース系の培地にて振盪培養を行った。
【００３１】
実施例５ プロテアーゼＫＳの調製法
実施例２で得られた培養液５０ｍＬを脱イオン水で３倍に希釈し、２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したスーパーＱトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着し、同緩衝液で洗浄したところ、プロテアーゼ活性は、非吸着部に溶出した。活性画分を集め、最終濃度が１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め１Ｍ硫酸アンモニウム及び２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＢｕｔｙｌ−トヨパールカラム（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。１Ｍ硫酸アンモニウムから硫酸アンモニウム無添加の濃度まで濃度勾配法にて吸着タンパク質の溶出を行った結果、プロテアーゼ活性は、０．５Ｍ硫酸アンモニウム濃度付近に溶出された。この画分を限外濾過にて加水濃縮し（アミコン：ＹＭ３メンブレン）、予め２ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．６）で平衡化しておいたＣＭ―トヨパールカラム（東ソー：１．５×１４ｃｍ）に添着した。プロテアーゼ活性は非吸着画分として得られたので限外濾過にて加水濃縮を行った。濃縮液について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動を行った結果、分子量約２８，０００の均一なタンパク質であることを確認した。また、本精製酵素の比活性は１５４Ｕ／ｍｇであった。尚、タンパク質量は牛血清アルブミンを標準とし、ＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド）を用いて測定した。
【００３２】
実施例６ アルカリプロテアーゼＫＳの酵素学的性質
実施例５で得られた精製アルカリプロテアーゼＫＳの活性を測定する場合は以下に示す合成基質法により行った。
［合成基質法］
０．０５ｍＬの０．５Ｍトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９）、０．４ｍＬの脱イオン水及び０．０２５ｍＬの５０ｍＭ ＡＡＰＦ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｙｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ：シグマ）からなる反応液を３０℃で３分間恒温した後、０．０２５ｍＬの酵素液を加え反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％（ｗ／ｖ）クエン酸を加え反応を停止した。４２０ｎｍにおける吸光度を測定し、遊離したｐ−ニトロアニリンを定量した。酵素１ｕｎｉｔは上記反応条件下において１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離する量とした。
【００３３】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼＫＳはｐＨ９のグリシン／水酸化ナトリウム緩衝液及びトリス／塩酸緩衝液中において最も高い分解活性を示した。さらにｐＨ７−１１．５の範囲で最大活性値の８０％以上の相対活性値を示した。尚、使用した緩衝液は、酢酸（ｐＨ４−６）、リン酸（ｐＨ６−８）、トリス／塩酸（ｐＨ７−９）、グリシン／水酸化ナトリウム（ｐＨ８−１１．５）、炭酸（ｐＨ９−１１）、ホウ酸（ｐＨ９−１１）及びリン酸／水酸化ナトリウム（ｐＨ１１−１２．５）であった。
【００３４】
（２）最適温度
５０ｍＭトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、３０〜８０℃の範囲で酵素反応を行った結果、アルカリプロテアーゼＫＳは５５℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加した場合、最大活性を与える反応温度は６０−６５℃にシフトし、カルシウム無添加系に比べ２０％程度の活性化が認められた。
【００３５】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）あるいはトリス／塩酸緩衝液（ｐＨ７）中、３０〜７５℃の範囲でアルカリプロテアーゼＫＳを１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、３０℃以上では不安定であった。しかし、５ｍＭ塩化カルシウムを添加したそれぞれの系においては、５０℃まで安定であった。
【００３６】
（４）基質特異性
各種合成基質に対する相対比活性を調べた結果、ＡＡＰＦを１００％とした場合、ＡＡＰＬ（６３％）、ＡＩＰＭ及びＡＡＰＭ（１９％）、ＬＳＴＲ（２．８％）、ＡＡＶＡ（２．６％）、ＡＡＡ（１．３％）であった。
【００３７】
（５）酸化剤耐性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）に０．０１〜５％となるように過酸化水素を添加し、アルカリプロテアーゼＫＳを加え３０℃で恒温した。１０分後、適当量のカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム）を加え余分な過酸化水素を除去し、残存活性を測定した。その結果、アルカリプロテアーゼＫＳは、０．１％の過酸化水素処理では５８％の活性が残存し、０．５〜５％の過酸化水素処理では３０％の残存活性を示した。対照に用いた洗剤用アルカリプロテアーゼＫＡＰは、０．１％の過酸化水素処理では４０％の活性が残存し、０．５〜５％の過酸化水素処理では７−１２％の活性が残存したに過ぎなかった。
【００３８】
以上の諸性質は実施例５に述べた方法にて精製したアルカリプロテアーゼＭＳにおいても同様の結果であった。
【００３９】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、従来のズブチリシンとはアミノ酸配列において相同性が低く、酸化剤に対する安定性を有しており、衣料用洗浄剤をはじめ各種産業用の酵素として有用である。
【配列表】

TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel alkaline protease useful as a detergent enzyme and a gene encoding the same.
[0001]
Problems to be solved by the prior art and the invention
Alkaline protease, which is blended in various detergents such as clothing detergents, has played an important role as an essential component for improving the detergency. Alkaline protease is the most widely produced enzyme among industrial enzymes because it is used as a mass consumer such as a detergent.
[0002]
Representative detergent alkaline proteases are derived from Bacillus bacteria, belong to the subtilisin family, and have a molecular weight of around 28 kDa, Savinase (registered trademark), cannase (registered trademark; Novozymes), maxacal (registered trademark; Genencor), Blap (registered trademark; Henkel) and KAP (Kao) are known. However, these alkaline proteases for detergents are very sensitive to oxidizing agents, and have a problem that they are inactivated in a short time by adding only a small concentration of oxidizing agents (for example, see Non-Patent Document 1). ).
[0003]
In recent years, an enzyme such as Durazyme (registered trademark; Novozymes, see Patent Document 1, for example) has been improved by protein engineering to create an alkaline protease having high resistance to an oxidizing agent.
[0004]
However, in some cases, enzymes produced using protein engineering may show a decrease in production amount, a decrease in specific activity, and the like. It is known that the range of use of such modified enzymes is also limited.
[0005]
An object of the present invention is to provide an alkaline protease for detergents having low homology in amino acid sequence to a conventionally known alkaline protease and having oxidant resistance despite being wild type, and a gene encoding the same.
[0006]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 6-501509 [Non-Patent Document 1]
Stauffer and Etson, J.A. Biol. Chem. , 244, 5333-5338 (1969).
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have obtained a gene encoding an alkaline protease having a low homology in amino acid sequence with a known subtilisin from the genomic DNA of an alkalophilic Bacillus bacterium. We obtained a gene encoding a novel alkaline protease and succeeded in producing a novel alkaline protease using this gene.
[0008]
That is, the present invention provides a protein of the following (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) The present invention provides a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and which has alkaline protease activity. Or a protein having an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence represented by 2, and having an alkaline protease activity.
[0009]
The present invention also provides a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, and a transformant having the recombinant vector.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The protein of the present invention (hereinafter also referred to as “alkaline protease”) comprises (a) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and one or more amino acids deleted in the amino acid sequence of (a). A protein comprising an amino acid sequence substituted or added and having an alkaline protease activity, or a protein comprising an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 and having an alkaline protease activity Yes, the gene of the present invention is a DNA encoding the protein.
[0011]
Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added means an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, An amino acid sequence in which one or several, preferably 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted or added, which still retains the alkaline protease activity. Includes the addition of amino acids.
[0012]
The homology between the amino acid sequences of the present invention represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 is as high as 98.9%. However, when compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 and the amino acid sequences of other known alkaline proteases, they show 67.6-72.7% homology with subtilisin BPN 'and subtilisin Carlsberg. Only. Furthermore, it shows only 57.7-62.6% homology with sabinase, esperase and KAP (M-protease) used as alkaline protease for detergents. In addition, Bacillus sp. KSM-LD1 strain (FERM P-18576) derived from alkaline protease LD1 (GenBank Accession No. AB085752) having oxidant resistance and having an oxidizing agent resistance of 62.2-63.0%, alkaline protease SA (GenBank Accession No. AB090334), SB ( GenBank Accession No. AB0969689) with 74.6-80.4% homology. Furthermore, it showed 83.3% homology with the alkaline protease SprC derived from the alkalophilic Bacillus LG12 strain and 75.7% with SprD (Schmidt et al., Appl. Environ. Microbiol., 61, 4490-4493, 1995). But it was not an exact match. These results indicate that the alkaline protease of the present invention is a novel enzyme.
[0013]
For reference, the homology between amino acid numbers -1 to -104 in SEQ ID NOs: 3 and 4, ie, the homology between the prepro sequences is as high as 98.1%, but is higher than the prepro sequence of the known alkaline protease described above. In this case, only 28.2-56.0% of homology is shown, and no sequence having high homology is found.
[0014]
Therefore, the protein of the present invention comprises a protein comprising an amino acid sequence having a homology of 85% or more when the corresponding sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 is properly aligned, and having an alkaline protease activity. Is included. The homology in such an amino acid sequence is more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
The homology search described here can be calculated using a search homology program of GENETYX-WIN (software development) or a maximum matching method.
[0015]
As described above, the alkaline protease gene of the present invention comprises a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, a protein having an amino acid sequence equivalent to the amino acid sequence and having alkaline protease activity, or SEQ ID NO: 1 or 2 May be any as long as it encodes a protein having an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence represented by and having alkaline protease activity, and (a) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 or An alkaline protease gene consisting of a DNA that hybridizes with the DNA consisting of the base sequence of (a) under stringent conditions and encodes a protein having alkaline protease activity is preferred.
[0016]
Here, “stringent conditions” include, for example, the conditions described in Molecular cloning-a Laboratory manual 2nd edition (Sambrook et al., 1989). For example, a solution containing 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhardt, and 100 mg / mL herring sperm DNA at 65 ° C. with the probe. Conditions for keeping the temperature constant for 8 to 16 hours for hybridization are listed.
[0017]
The alkaline protease of the present invention can be produced in large quantities by using its gene, a suitable vector and a host bacterium.
The gene is, for example, a microorganism belonging to the genus Bacillus , preferably Bacillus sp . KSM-KP43 strain (FERM BP-6532), Bacillus sp . Cloning from the KSM-9865 strain (FERM P-18566) or the like using the shotgun method or the PCR method, and, if necessary, a known method such as a site-directed mutagenesis method, for example, a mutagenesis kit [ Mutan-super Express Km kit (Takara)] or the like, and introducing the mutation.
[0018]
To produce an alkaline protease using the gene of the present invention, the above-mentioned alkaline protease gene is integrated into any vector suitable for expressing the gene in the intended host, and the host is transformed with the recombinant vector. After the transformation, the obtained transformant is cultured, and the alkaline protease may be collected from the culture solution.
[0019]
The cultivation may be performed by inoculating a medium containing a carbon source, a nitrogen source, and other essential nutrients that can be assimilated by the microorganism, according to a conventional method.
[0020]
Collection and purification of the alkaline protease from the culture thus obtained can be performed according to a general method. That is, cells can be removed from the culture by centrifugation or filtration, and the target enzyme can be concentrated from the obtained culture supernatant by a conventional method. The enzyme solution or the dried powder thus obtained can be used as it is, but can be further crystallized or granulated by a known method.
[0021]
The characteristics of the thus-obtained alkaline protease of the present invention are as shown in the Examples below. In particular, the molecular weight is about 28,000 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) and the optimal reaction pH is 9 Near (glycine / sodium hydroxide buffer or Tris / hydrochloric acid buffer), optimal temperature is around 55 ° C, 50% when treated at 30 ° C for 10 minutes in 0.1% hydrogen peroxide (pH 10) It is desirable to have the above residual activity.
[0022]
【Example】
Example 1 Bacillus sp. Cloning and Determination of the Base Sequence of Alkaline Protease (KS) Gene Derived from KSM-KP43 Strain KSM-KP43 has been found to produce alkaline protease having a molecular weight of 28 kDa, 43 kDa, and 72 kDa outside the cells. Each protease was purified from the culture broth by electrophoresis to uniformity by column chromatography, and the N-terminal amino acid sequence was determined using an amino acid sequencer (Type 476A: Applied Biosystems). The N-terminal amino acid sequence of the protease KS having a molecular weight of 28 kDa was Ala-Gln-Ser-Thr-Pro-Trp-Gly-Ile. Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Thr-Pro is an amino acid sequence around Ser at position 221 that is highly conserved and corresponds to the active center in an alkaline protease having a molecular weight of 28 kDa and derived from Bacillus bacteria. (The amino acid numbers were based on subtilisin BPN ').
[0023]
Therefore, when cloning the gene encoding the protease of the present invention, primer 1 (SEQ ID NO: 5) and primer 2 (SEQ ID NO: 6) were synthesized based on the information of the above two types of amino acid sequences. Genomic DNA was prepared from the KSM-KP43 strain according to the method of Saito and Miura (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963), and PCR was carried out using this as a template and primers 1 and 2. The PCR conditions were as follows: 10 to 100 ng of genomic DNA, 20 nmol of each primer, heat denaturation at 94 ° C. for 1 minute using Pwo DNA polymerase (Boehringer Mannheim), then 94 ° C. for 1 minute, 40 to 60 ° C. for 1 minute, 72 ° C. The cycle was performed for 30 minutes with the cycle being 1 minute.
[0024]
The resulting PCR fragment was purified by High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) and ligated into pUC18 digested with Sma I, was introduced into E. coli HB101. A plasmid was prepared from the transformant using a High Pure Plasmid Isolation kit (Roche), and the nucleotide sequence of about 650 bp was determined using a BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (PerkinElmer) and a DNA sequencer (Type 377: Applied Biosystems). did.
[0025]
Based on the obtained sequence information, the base sequence of the structural gene was determined by inverse PCR. That is, after complete degradation at 37 ° C. by KSM-KP43 strain genomic DNA restriction enzyme Eco RI or Hin dIII, were heat-inactivated restriction enzyme treated for 15 minutes at 70 ° C.. Thereafter, an equivalent amount of the DNA ligation kit ver. 2 (Takara) was added, and a ligation reaction was carried out at 16 ° C. for 24 hours to prepare a template for inverse PCR. Was synthesized from the preceding partial gene sequence primers 3-6 (SEQ ID NO: 7-10), the self-ligation of DNA Eco RI decomposition product as a template, primers 3 and 4, also the self-ligation of DNA Hin dIII hydrolyzate PCR was performed with LATaq (Takara) using primers 3 and 5 or primers 4 and 6 as a template. The reaction was performed by denaturing the template DNA at 94 ° C. for 2 minutes, and then 30 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 50 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 4 minutes. The PCR product was cloned into pT7 Blue T-Vector (Novagen), DNA amplification fragment of about 2.5kb from the Eco RI decomposition product, Hin dIII DNA amplification fragment of about 0.2 and 0.5kb from decomposition products respectively obtained Was done. With respect to the inserted fragment in the constructed plasmid, a 2164 bp base sequence containing a gene encoding protease KS [1137 bp: 379 amino acids (SEQ ID NO: 3)] was determined using each primer.
[0026]
Example 2 Recombinant Production of Alkaline Protease KS In order to produce alkaline protease KS in large quantities, Bacillus sp. The promoter region of the alkaline cellulase gene derived from the KSM-64 strain (Sumitomo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175, 1995) and Bacillus sp. A plasmid was prepared using the SD sequence of the M-protease gene derived from the KSM-K16 strain (Hakamada et al., J. Ferment. Bioeng., 78, 105-108, 1994). That is, primer 7 (SEQ ID NO: 11) and primer 8 (SEQ ID NO: 12) were synthesized, and PCR was performed using the genome of KSM-KP43 strain as a template. The PCR product was purified, after cutting with Bam HI and Xba I, treated with the same restriction enzymes pHSP64 [primer HM5 (SEQ ID NO: 21) and HM6 (SEQ ID NO: 22) derived from KSM-64 strain was amplified using The promoter region of the alkaline cellulase gene was ligated to a plasmid introduced at the Bam HI and Eco RI sites of pHY300PLK (Yakult Honsha)] (pHSPKS), and a mutant of Bacillus sp. KSM-9865 (FERM P-18566) (molecular weight 28 kDa, A strain in which two types of alkaline protease genes of 72 kDa were disrupted) was transformed by electroporation.
[0027]
Smear milk-containing alkaline LB agar medium (containing 0.05% sodium carbonate and 15 ppm tetracycline) was smeared, and a transformant into which a protease gene had been introduced was selected based on the presence or absence of skim milk dissolving spots. Each of the obtained transformants was treated with 5 mL of a seed culture medium [6.0% (w / v) polypeptone S, 0.1% yeast extract, 1.0% maltose, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.3% anhydrous sodium carbonate, 30 ppm tetracycline], and cultured at 30 ° C. for 16 hours with shaking. Then 30 mL of the main medium [8% polypeptone S, 0.3% yeast extract, 10% maltose, 0.04% magnesium sulfate heptahydrate, 0.2% potassium dihydrogen phosphate, 1.5% anhydrous sodium carbonate , 30 ppm tetracycline] was inoculated with 1% (v / v) of the seed culture and cultured with shaking at 30 ° C. for 3 days.
[0028]
Example 3 Bacillus sp. Cloning and Determination of the Base Sequence of Alkaline Protease (MS) Gene Derived from KSM-9865 Strain
Primers 9 to 15 (SEQ ID NOs: 13 to 19) were synthesized based on the nucleotide sequence of the gene encoding the alkaline protease KS determined in Example 1 and the nucleotide sequence information in the upstream and downstream regions thereof. Using genomic DNA prepared from KSM-9865 strain as a template, PCR was performed under the conditions described in Example 1 using primers 9 and 10, primers 9 and 12, primers 11 and 12, primers 12 and 15, and primers 13 and 14. Done. The obtained PCR fragment was purified and subjected to direct sequencing using primers 9 to 14 to determine a 2557 bp base sequence containing the gene [1137 bp: 379 amino acids (SEQ ID NO: 4)] encoding alkaline protease MS.
[0030]
Example 4 Recombinant Production of Alkaline Protease MS Alkaline protease MS was produced in the same manner as in Example 2. That is, PCR was performed using the genome of the KSM-9865 strain as a template and primers 8 and 16 (SEQ ID NO: 20). The PCR product was purified, introduced into the Bam HI and Xba I sites of pHSP64, and transformed into a mutant strain of Bacillus sp. KSM-9865 by electroporation. Transformants were selected based on the presence or absence of skim milk dissolution spots, and cultured with shaking in a polypeptone S / maltose medium.
[0031]
Example 5 Method for Preparing Protease KS 50 mL of the culture solution obtained in Example 2 was diluted 3-fold with deionized water and equilibrated with 50 mM Tris / HCl buffer (pH 7.5) containing 2 mM calcium chloride. When attached to a Q Toyopearl column (Tosoh: 2.5 × 8 cm) and washed with the same buffer, protease activity eluted in the non-adsorbed part. The active fractions were collected, ammonium sulfate was added to a final concentration of 1 M, and Butyl-Toyopearl previously equilibrated with a 10 mM Tris / HCl buffer (pH 7.5) containing 1 M ammonium sulfate and 2 mM calcium chloride. It was attached to a column (Tosoh: 2.5 × 12 cm). As a result of elution of the adsorbed protein by a concentration gradient method from 1 M ammonium sulfate to a concentration in which no ammonium sulfate was added, the protease activity was eluted near the 0.5 M ammonium sulfate concentration. This fraction was concentrated by ultrafiltration (Amicon: YM3 membrane), and a CM-Toyopearl column (Tosoh: 1) preliminarily equilibrated with a 10 mM borate buffer (pH 9.6) containing 2 mM calcium chloride. (0.5 × 14 cm). Since protease activity was obtained as a non-adsorbed fraction, hydroconcentration was performed by ultrafiltration. The concentrated solution was subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, and as a result, it was confirmed that the concentrated solution was a uniform protein having a molecular weight of about 28,000. The specific activity of the purified enzyme was 154 U / mg. The protein amount was measured using a DC protein assay kit (Bio-Rad) using bovine serum albumin as a standard.
[0032]
Example 6 Enzymatic properties of alkaline protease KS The activity of the purified alkaline protease KS obtained in Example 5 was measured by the following synthetic substrate method.
[Synthetic substrate method]
From 0.05 mL of 0.5 M Tris / HCl buffer (pH 9), 0.4 mL of deionized water and 0.025 mL of 50 mM AAPF (N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide: Sigma) After the resulting reaction solution was kept at 30 ° C. for 3 minutes, 0.025 mL of the enzyme solution was added to start the reaction. After incubating at 30 ° C. for 10 minutes, 2 mL of 5% (w / v) citric acid was added to stop the reaction. The absorbance at 420 nm was measured, and the released p-nitroaniline was quantified. One unit of the enzyme was used to release 1 μmol of p-nitroaniline per minute under the above reaction conditions.
[0033]
(1) Optimal reaction pH
As a result of performing the enzyme reaction in each buffer solution of pH 4-12, alkaline protease KS showed the highest decomposition activity in glycine / sodium hydroxide buffer solution of pH 9 and Tris / hydrochloric acid buffer solution. Further, in the range of pH 7-11.5, the relative activity value was 80% or more of the maximum activity value. The buffers used were acetic acid (pH 4-6), phosphoric acid (pH 6-8), Tris / hydrochloric acid (pH 7-9), glycine / sodium hydroxide (pH 8-11.5), and carbonic acid (pH 9-11). ), Boric acid (pH 9-11) and phosphoric acid / sodium hydroxide (pH 11-12.5).
[0034]
(2) As a result of performing an enzyme reaction in a range of 30 to 80 ° C. in an optimum temperature of 50 mM Tris / hydrochloric acid buffer (pH 9), alkaline protease KS showed the highest decomposition activity at 55 ° C. When 2 mM calcium chloride was added to the reaction solution, the reaction temperature at which the maximum activity was obtained was shifted to 60-65 ° C., and activation of about 20% was observed as compared with the calcium-free system.
[0035]
(3) Heat resistance In a 50 mM borate buffer (pH 10) or Tris / HCl buffer (pH 7), alkali protease KS was kept at a constant temperature in the range of 30 to 75 ° C. for 15 minutes. Thereafter, the mixture was cooled on ice and subjected to an enzymatic reaction. As a result, it was unstable at 30 ° C. or higher. However, each system to which 5 mM calcium chloride was added was stable up to 50 ° C.
[0036]
(4) Substrate specificity As a result of examining the relative specific activity to various synthetic substrates, when AAPF was 100%, AAPL (63%), AIPM and AAPM (19%), LSTR (2.8%), AAVA ( 2.6%) and AAA (1.3%).
[0037]
(5) Hydrogen peroxide was added to an oxidizing agent-resistant 50 mM borate buffer (pH 10) to a concentration of 0.01 to 5%, alkali protease KS was added, and the temperature was kept at 30 ° C. After 10 minutes, an appropriate amount of catalase (Boehringer Mannheim) was added to remove excess hydrogen peroxide, and the remaining activity was measured. As a result, the alkaline protease KS exhibited 58% activity when treated with 0.1% hydrogen peroxide, and exhibited 30% residual activity when treated with 0.5 to 5% hydrogen peroxide. Alkaline protease KAP for detergent used as a control retained 40% of the activity when treated with 0.1% hydrogen peroxide, and retained 7 to 12% of the activity when treated with 0.5 to 5% hydrogen peroxide. It was only.
[0038]
The above properties were also the same for alkaline protease MS purified by the method described in Example 5.
[0039]
【The invention's effect】
The alkaline protease of the present invention has low homology in amino acid sequence to conventional subtilisin, has stability against oxidizing agents, and is useful as an enzyme for various industries including a detergent for clothes.
[Sequence list]

Claims (7)

以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。The following protein (a) or (b):
(A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2,
(B) A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of (a), and having an alkaline protease activity. 配列番号１又は２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。A protein consisting of an amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and having alkaline protease activity. 請求項１記載のタンパク質をコードする遺伝子。A gene encoding the protein according to claim 1. 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子：
（ａ）配列番号３又は４で示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。Alkaline protease gene consisting of the following DNA (a) or (b):
(A) a DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4,
(B) DNA that hybridizes with the DNA comprising the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions and encodes a protein having alkaline protease activity. 請求項３又は４記載のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。A recombinant vector comprising the gene according to claim 3. 請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。A transformant comprising the recombinant vector according to claim 5. 宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。
【０００１】The transformant according to claim 6, wherein the host is a microorganism.
[0001]