JP2004309458A - Time-resolved fluorescence microscope - Google Patents

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太平 田原
Tatsuya Fujino
竜也 藤野
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a time-resolved fluorescence microscope having a high spatial resolution and high temporal resolution. <P>SOLUTION: Fluorescence from a sample 26 placed in a confocal inverted optical microscope 19 and excitation laser light are allowed to be simultaneously incident on a nonlinear optical element 32 to generate sum frequency light 34. By changing the delay amount of a delay line for optical delay 33, the time-resolved fluorescence of the sample is measured. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、微小領域からの蛍光をフェムト秒オーダーで時間分解測定できる時間分解蛍光顕微鏡に関する。   The present invention relates to a time-resolved fluorescence microscope capable of time-resolved measurement of fluorescence from a minute region on the order of femtoseconds.

時間分解蛍光分光法と光学顕微鏡を組み合わせた時間分解蛍光顕微鏡は、微小領域における分子の電子状態に関する情報を、他の要因に妨害されず、正確に与えてくれる優れた装置である。これまでの時間分解蛍光顕微鏡に用いられる時間分解の手法は、大きく分けて時間相関単一光子計測法とストリークカメラ法の二種類に分類できる。   A time-resolved fluorescence microscope, which combines time-resolved fluorescence spectroscopy and an optical microscope, is an excellent device that gives accurate information on the electronic state of a molecule in a minute region without being disturbed by other factors. The time-resolved techniques used in the conventional time-resolved fluorescence microscope can be roughly classified into two types, a time-correlated single-photon measurement method and a streak camera method.

図２は、時間相関単一光子計測装置の例を示す図である（非特許文献１参照）。レーザダイオード５１から発せられたパルス光は、フィルタ５２を通り、顕微鏡対物レンズ（油浸レンズ）５３によって集光され、励起光として試料５４の微小領域に照射される。試料の励起光照射位置は、ＣＣＤカメラ５５で撮像された試料の拡大画像をモニタ５６で観察しながら試料を微動することによって調整することができる。励起光照射によって試料から発生された蛍光は、フィルタ５７，５８によって波長選択された後、ピンホール５９を介してフォトダイオード６０で検出される。一方、レーザダイオード発光用の電気信号をトリガーとして、フォトダイオード６０で受けた試料からの蛍光によって生じた電気パルスを時間波高変換器（ＴＡＣ：time to amplitude converter）６１に入力する。ＴＡＣ６１はトリガー信号とフォトマルからの信号の時間差に応じた電気パルスを出力する。これをマルチチャンネルアナライザ（ＭＣＡ）６２に通して時間差と頻度の分布をとると、顕微鏡下に存在する試料による蛍光の時間減衰に相当する波形が得られる。   FIG. 2 is a diagram illustrating an example of a time-correlated single-photon measurement device (see Non-Patent Document 1). The pulse light emitted from the laser diode 51 passes through the filter 52, is condensed by the microscope objective lens (oil immersion lens) 53, and irradiates a minute area of the sample 54 as excitation light. The excitation light irradiation position of the sample can be adjusted by finely moving the sample while observing an enlarged image of the sample captured by the CCD camera 55 on the monitor 56. The fluorescence generated from the sample by the excitation light irradiation is wavelength-selected by the filters 57 and 58, and then detected by the photodiode 60 via the pinhole 59. On the other hand, using an electric signal for laser diode emission as a trigger, an electric pulse generated by fluorescence from a sample received by the photodiode 60 is input to a time-to-amplitude converter (TAC) 61. The TAC 61 outputs an electric pulse corresponding to a time difference between the trigger signal and the signal from the photomultiplier. When this is passed through a multi-channel analyzer (MCA) 62 to obtain a distribution of the time difference and the frequency, a waveform corresponding to the time decay of the fluorescence by the sample existing under the microscope is obtained.

ストリークカメラ法は、レーザからの電気信号をトリガーとして、顕微鏡下にある試料からの蛍光を分光器を通した後ストリーク管に導入する。入射した光は光電面にあたり、光から電子に変換される。発生した電子は加速された後、ストリーク管の上下に印加された電圧によって飛ぶ方向が変えられる。この印加電圧を高速に変化させることにより、蛍光の時間分布を空間変化として捕らえることができる（非特許文献２参照）。   In the streak camera method, an electric signal from a laser is used as a trigger, and fluorescence from a sample under a microscope is introduced into a streak tube after passing through a spectroscope. The incident light strikes the photocathode and is converted from light to electrons. After the generated electrons are accelerated, the direction in which they fly depends on the voltage applied above and below the streak tube. By changing the applied voltage at high speed, the time distribution of the fluorescence can be captured as a spatial change (see Non-Patent Document 2).

また、バルク試料から発生された蛍光を時間分解測定する方法として、レーザから発せられたパルス光を２分し、その一方を試料励起光として、試料から発せられた蛍光と他方のパルス光（ゲートパルス）とを非線形光学結晶中で混合し、非線形光学結晶から発生される両者の和周波数の光を検出する和周波発生法（アップコンバージョン法）が知られている（非特許文献３参照）。この方法によると、ゲートパルスの遅延時間を変化させて測定を反復することにより、蛍光を時間分解測定することができる。
Review of scientific instruments, vol.70, p1835-1841, 1999 Applied Physics Letters, vol.80, no.18, p3340-3342, 2002 Journal of Physical Chemistry A, vol.101, p3052-3060, 1997 As a method for time-resolved measurement of fluorescence generated from a bulk sample, a pulse light emitted from a laser is divided into two parts, and one of the two is used as sample excitation light, and the fluorescence emitted from the sample and the other pulse light (gate And a pulse) are mixed in a nonlinear optical crystal, and a sum frequency generation method (up-conversion method) for detecting light having a sum frequency of the two generated from the nonlinear optical crystal is known (see Non-Patent Document 3). According to this method, the fluorescence can be measured in a time-resolved manner by repeating the measurement while changing the delay time of the gate pulse.
Review of scientific instruments, vol. 70, p1835-1841, 1999 Applied Physics Letters, vol.80, no.18, p3340-3342, 2002 Journal of Physical Chemistry A, vol. 101, p3052-3060, 1997

一般に物体の各種の動的挙動（化学反応、エネルギー移動等）の解明にはサブピコ秒（１０−１２秒以下）から数百フェムト秒（１０−１３秒）の時間分解能が必要である。しかしながら、これまで使用されている時間分解蛍光顕微鏡では、時間分解測定において単一光子計測装置やストリークカメラといった蛍光を電気的に処理する手法を用いるため、ナノ秒（１０−９秒）から数十ピコ秒（１０−１１秒）といった不十分な時間分解能しか得られていなかった。実際、時間相関単一光子計測法を用いた装置では時間分解能は４０ｐｓ程度が限界である。また、ストリーク管を用いた時間分解蛍光顕微鏡の時間分解能は最高でも５ｐｓ程度である。なお、ストリークカメラ法は、分光器を用いないで時間分解する方法も可能であり、その場合、３００フェムト秒程度の高い時間分解能が得られるが、蛍光波長の判別はできない。アップコンバージョン法は、高い時間分解能で蛍光を測定することが可能であるが、微小領域の測定について配慮されておらず、そのままでは顕微鏡的な空間分解能を期待することはできない。 Generally, elucidation of various dynamic behaviors (chemical reaction, energy transfer, etc.) of an object requires a time resolution of subpicoseconds ( 10-12 seconds or less) to several hundred femtoseconds ( 10-13 seconds). However, the time-resolved fluorescence microscope used so far uses a technique for electrically processing fluorescence such as a single-photon measurement device or a streak camera in the time-resolved measurement, so that the time is from nanoseconds (10 −9 seconds) to several tens of seconds. Insufficient time resolution, such as picoseconds ( 10-11 seconds), was obtained. In fact, the time resolution of a device using the time-correlated single photon measurement method is limited to about 40 ps. The time resolution of a time-resolved fluorescence microscope using a streak tube is at most about 5 ps. Note that the streak camera method can be a method of performing time resolution without using a spectroscope. In this case, a high time resolution of about 300 femtoseconds can be obtained, but the fluorescence wavelength cannot be determined. The up-conversion method can measure fluorescence with a high time resolution, but does not consider the measurement of a minute region, and cannot directly expect a microscopic spatial resolution.

また光学顕微鏡の一種である共焦点顕微鏡は、顕微鏡に設置したピンホール径を極限まで小さくすることにより、物体の深さ方向の情報を選んで測定できる装置であるが、実際の測定に際しては十分な強度の信号を得るためにピンホールの径をある程度大きくとることが必要であり、そのため深さ方向の空間分解能には限界があった。このように、微小領域における分子の化学反応の解明に最も期待される時間分解蛍光顕微分光の時間分解能は、現在でも十分満足できるものにはなっていない。   A confocal microscope, a type of optical microscope, is a device that can select and measure information in the depth direction of an object by minimizing the pinhole diameter installed in the microscope, but it is not sufficient for actual measurement. In order to obtain a signal with a high intensity, it is necessary to increase the diameter of the pinhole to some extent, and therefore, the spatial resolution in the depth direction is limited. Thus, the time resolution of time-resolved fluorescence microspectroscopy, which is most expected to elucidate the chemical reaction of molecules in a minute region, has not been sufficiently satisfactory even at present.

本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、光学顕微鏡を用いてサブ・マイクロメートルの微小領域からの蛍光をフェムト秒の時間分解能で時間分解測定できる、高い空間分解能と高い時間分解能を有する時間分解蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。   In view of the problems of the prior art, the present invention provides a high spatial resolution and a high temporal resolution that can measure time-resolved fluorescence with a femtosecond time resolution from a sub-micrometer minute area using an optical microscope. It is an object of the present invention to provide a time-resolved fluorescence microscope.

本発明では、時間分解蛍光顕微鏡における時間分解能と深さ方向の空間分解能を同時に改善するために和周波発生法（アップコンバージョン法）を適用し、時間分解能を従来法の１００倍程度（〜６００フェムト秒）まで改善し、また深さ方向の空間分解能を通常の共焦点顕微鏡の約２倍程度改善した。   In the present invention, a sum frequency generation method (up-conversion method) is applied in order to simultaneously improve the time resolution and the spatial resolution in the depth direction in a time-resolved fluorescence microscope, and the time resolution is increased by about 100 times (up to 600 femto) compared with the conventional method. Second), and the spatial resolution in the depth direction is improved by about twice that of a normal confocal microscope.

従来法は、単一光子計測装置（ＴＡＣ）やストリークカメラ等の電気的手段を用いて時間分解測定を行うため、その電気的手段の性能できまる時間分解能が限界であり、このためフェムト秒領域での蛍光変化をモニタするには時間分解能が十分ではなかった。本発明ではアップコンバージョンとよばれる非線形光学効果を用いた光学的な時間分解の手法を採用することにより、フェムト秒の時間分解能（〜６００ｆｓ）を実現した。   In the conventional method, since time-resolved measurement is performed using electrical means such as a single photon measuring device (TAC) or a streak camera, the time resolution determined by the performance of the electrical means is limited. Time resolution was not enough to monitor the change in fluorescence at In the present invention, a femtosecond time resolution (up to 600 fs) is realized by employing an optical time-resolved technique using a nonlinear optical effect called up-conversion.

本発明による時間分解蛍光顕微鏡は、ピンホールと、試料を載置する試料ステージと、ピンホールの像を試料ステージ上の試料に縮小投影するとともに試料から発生された蛍光をピンホールに結像する対物レンズ系と、パルスレーザ発生手段と、パルスレーザ光発生手段から出射されたレーザ光を２分割する光分割手段と、光分割手段によって分割された一方のレーザ光を試料励起光として前記ピンホールに入射させる手段と、光分割手段によって分割された他方のレーザ光の光路長を可変する光路長可変手段と、前記ピンホールから出射した試料からの蛍光と光路長可変手段を通ったレーザ光とを混合して両者の和周波光を発生させる非線形光学素子と、非線形光学素子から発生された和周波光を分光する分光手段と、分光手段からの出射光を検出する検出器と、光路長可変手段によって前記他方のレーザ光の光路長を変化させたとき前記検出器から得られる出力を記録する記録手段とを含むことを特徴とする。   A time-resolved fluorescence microscope according to the present invention reduces the size of a pinhole, a sample stage on which a sample is mounted, and projects an image of the pinhole onto the sample on the sample stage, and forms fluorescence generated from the sample on the pinhole. An objective lens system, a pulsed laser generating means, a light splitting means for splitting the laser light emitted from the pulsed laser light generating means into two, and one of the laser lights split by the light splitting means as the sample excitation light and the pinhole Means for changing the optical path length of the other laser beam split by the light splitting means, and laser light passing through the optical path length changing means and fluorescence from the sample emitted from the pinhole. A non-linear optical element that generates a sum frequency light by mixing the two, a spectroscopic means for dispersing the sum frequency light generated from the non-linear optical element, and an emission from the spectroscopic means. A detector for detecting, characterized in that it comprises a recording means for recording an output obtained from the detector when the optical path length varying means varying the optical path length of the other laser beam.

光分割手段とピンホールの間の試料励起光光路中にプリズム対を配置し、励起光に予め負の分散を与えることが好ましい。励起光に予め負の分散を与えることによりサンプル位置で最も時間幅が短いパルスでサンプルを励起することができる。プリズムを対で用いることにより、人工的に異常分散回路（負の群速度分散）を作ることができる。通常フェムト秒のパルス光がレンズやミラーなどの媒体を通過すると、パルスを構成する光の波長の違いにより（フェムト秒パルスでは、１０ｎｍ程度のスペクトル幅を持つ）媒質中での屈折率が違うので、各波長により媒質を通過する速度が変化し、結果としてレーザパルスの時間幅が延びることになる（長波長成分が短波長成分に比べ、速く進む）。プリズム対をパルスが通過することにより、長波長成分を遅らせ、短波長成分を進めることができ、結果としてパルス時間幅が圧縮される。本装置のプリズム対では、顕微鏡の対物レンズ等を通過することによって生じてしまう正の分散（パルスの時間的広がり）を予め打ち消すように負の分散を与えており、サンプル部を理想的には分散ゼロの光（最短パルス）で励起することが可能となる。   It is preferable to arrange a prism pair in the optical path of the sample excitation light between the light splitting means and the pinhole, and to give negative dispersion to the excitation light in advance. By giving a negative dispersion to the excitation light in advance, the sample can be excited by a pulse having the shortest time width at the sample position. By using a pair of prisms, an anomalous dispersion circuit (negative group velocity dispersion) can be artificially created. Normally, when a femtosecond pulsed light passes through a medium such as a lens or a mirror, the refractive index in the medium is different due to the difference in the wavelength of the light constituting the pulse (a femtosecond pulse has a spectral width of about 10 nm). The speed of passing through the medium changes depending on each wavelength, and as a result, the time width of the laser pulse is extended (the long wavelength component advances faster than the short wavelength component). When the pulse passes through the prism pair, the long wavelength component can be delayed and the short wavelength component can be advanced, and as a result, the pulse time width is compressed. In the prism pair of the present apparatus, negative dispersion is given so as to cancel in advance the positive dispersion (time spread of the pulse) caused by passing through the objective lens or the like of the microscope. It becomes possible to excite with zero dispersion light (shortest pulse).

試料励起光の光路中に１／２波長板を配置し、その１／２波長板の角度と光路長可変手段とを連動させて制御する制御部を更に備えてもよい。この構成によると、励起光の偏向方向を自動制御しつつ蛍光の測定を行うことができ、自動で偏光異方性の測定が可能である。   The apparatus may further include a control unit that arranges a half-wave plate in the optical path of the sample excitation light, and controls the angle of the half-wave plate and the optical path length varying unit in conjunction with each other. According to this configuration, the fluorescence can be measured while automatically controlling the deflection direction of the excitation light, and the polarization anisotropy can be automatically measured.

また、非線形光学素子と分光手段の間に非線形光学素子を通った光を平行にするコリメート用レンズと、アイリスと、集光用レンズとを配置し、非線形光学素子から発生された和周波光を分離して分光手段に入射させるように構成するのが望ましい。また、ピンホールと対物レンズ系の間配置する光路を折り曲げる光学素子は、全反射ミラーとするのが好ましい。   In addition, a collimating lens for collimating the light passing through the nonlinear optical element between the nonlinear optical element and the spectroscopic means, an iris, and a condensing lens are arranged, and the sum frequency light generated from the nonlinear optical element is It is preferable that the light is separated and incident on the spectroscopic means. It is preferable that the optical element that bends the optical path between the pinhole and the objective lens system is a total reflection mirror.

本発明によると、試料のサブ・マイクロメートルの微小領域からの蛍光をフェムト秒の時間分解能で時間分解測定することが可能となる。   According to the present invention, it is possible to perform time-resolved measurement of fluorescence from a sub-micrometer minute area of a sample with a time resolution of femtosecond.

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１は、本発明によるフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の模式図である。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 1 is a schematic diagram of a femtosecond time-resolved fluorescence microscope according to the present invention.

Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ１１により励起されたチタンサファイアレーザ１２の基本波（中心波長８００ｎｍ，光出力７５０ｍＷ，パルス繰り返し周波数８２ＭＨｚ，パルス時間幅７５ｆｓ）を非線形光学素子１３に集光し、発生した第二次高調波（４００ｎｍ，５０ｍＷ）を試料励起用の光源として用いる。発生された励起光（４００ｎｍ）は波長選択ミラー１４ａで反射され、分散補償用プリズム対１５により予め負の群速度分散を与えられた後、１／２波長板１６ａ、集光用レンズ１７、共焦点用ピンホール１８を通り、倒立型の光学顕微鏡１９へ導入される。励起光はさらに対物レンズ２１，２４によってステージ２５上の試料２６に集光される。試料２６からの蛍光は再び同じ対物レンズ２４，２１によって集められ、顕微鏡１９の外に取り出される。試料２６からの蛍光は、波長選択ミラー３０により励起光と分離された後、蛍光集光用レンズ３１ａによって非線形光学素子（１ｍｍ厚、β−ＢａＢ２Ｏ４（ＢＢＯ））３２に集光される。 The fundamental wave (center wavelength 800 nm, light output 750 mW, pulse repetition frequency 82 MHz, pulse time width 75 fs) of the titanium sapphire laser 12 excited by the Nd: YVO 4 laser 11 is focused on the nonlinear optical element 13, and the generated second wave The second harmonic (400 nm, 50 mW) is used as a light source for exciting the sample. The generated excitation light (400 nm) is reflected by the wavelength selection mirror 14a, is given a negative group velocity dispersion by the dispersion compensating prism pair 15 in advance, and then the 波長 wavelength plate 16a and the condensing lens 17 are The light passes through a focusing pinhole 18 and is introduced into an inverted optical microscope 19. The excitation light is further focused on the sample 26 on the stage 25 by the objective lenses 21 and 24. The fluorescence from the sample 26 is collected again by the same objective lenses 24 and 21 and is taken out of the microscope 19. After the fluorescence from the sample 26 is separated from the excitation light by the wavelength selection mirror 30, the fluorescence is condensed on the nonlinear optical element (1 mm thick, β-BaB 2 O 4 (BBO)) 32 by the fluorescence condensing lens 31a. .

一方、チタンサファイアレーザ１２の基本波は、波長選択ミラー１４ｂで反射され、光学遅延回路（ディレイライン）３３を通り、１／２波長板１６ｂを通った後、基本波集光用レンズ３１ｂによって非線形光学素子３２に集光される（ゲート光）。試料２６からの蛍光とレーザの基本波は非線形光学素子３２の同じ位置に重なるように集光され、両者の和周波光３４を発生させる（アップコンバージョン法）。アップコンバージョン法は、試料からの蛍光を他の波長のフェムト秒レーザパルスとともに非線形光学結晶中に集光させ、両者の和周波光（和のエネルギーをもった光）を発生させる方法である。この和周波光は試料からの蛍光とフェムト秒レーザパルスがまったく同一時間に結晶中に存在するときにのみ発生させることができるので、フェムト秒レーザパルス側に設置した光学遅延回路３３を前後させながら和周波光３４を観測することで、試料からの蛍光の時間挙動を和周波光の時間挙動としてモニタできる。また試料からの蛍光のどの波長の和周波光を発生させるかは、ＢＢＯ結晶３２の角度を変えることで調整する。   On the other hand, the fundamental wave of the titanium sapphire laser 12 is reflected by the wavelength selection mirror 14b, passes through the optical delay circuit (delay line) 33, passes through the half-wave plate 16b, and is nonlinearized by the fundamental wave focusing lens 31b. The light is condensed on the optical element 32 (gate light). The fluorescence from the sample 26 and the fundamental wave of the laser are condensed so as to overlap the same position of the nonlinear optical element 32, and a sum frequency light 34 of both is generated (up-conversion method). The up-conversion method is a method of condensing fluorescence from a sample together with femtosecond laser pulses of other wavelengths in a nonlinear optical crystal to generate sum frequency light (light having sum energy) of both. Since this sum frequency light can be generated only when the fluorescence from the sample and the femtosecond laser pulse are present in the crystal at exactly the same time, while moving the optical delay circuit 33 installed on the femtosecond laser pulse side back and forth, By observing the sum frequency light 34, the time behavior of the fluorescence from the sample can be monitored as the time behavior of the sum frequency light. In addition, which wavelength of the fluorescence of the sample to generate the sum frequency light is adjusted by changing the angle of the BBO crystal 32.

和周波光３４は、迷光カット用アイリス４２を通った後、ディスクリミネーター内蔵のフォトンカウンティング用光電子増倍管３５を接続した分光器３６に入射され、その信号がパーソナルコンピュータに接続したカウンタ３７により計測される。この際、光学遅延用のディレイライン３３を前後させることにより、和周波光３４の強度変化をモニタし、試料２６からの蛍光の時間分解測定を行う。   After passing through the iris 42 for cutting stray light, the sum frequency light 34 is incident on a spectroscope 36 to which a photomultiplier tube 35 for photon counting built in a discriminator is connected, and its signal is output by a counter 37 connected to a personal computer. It is measured. At this time, by moving the delay line 33 for optical delay back and forth, a change in the intensity of the sum frequency light 34 is monitored, and time-resolved measurement of the fluorescence from the sample 26 is performed.

蛍光を測定する際に使用するフォトンカウンティング法は、蛍光の光子を１個づつ数える方法であり、非常に高感度な方法である。しかしながら、高感度であるゆえに迷光によるダークカウントも大きな値として観測してしまう。本装置においては、このダークカウントを最小にする目的で、非線形光学結晶３２によって生じた和周波光をアイリス（空間フィルタ）４２を用いて空間的に分離し、Ｓ／Ｎ比を向上させている。和周波光をコリメート用レンズ４１により平行光に戻し、アイリス４２を通した後、集光用レンズ４３を通して分光器３６に入射させる。アイリス４２を設置しない場合、ダークカウントは約６〜７カウント／ｓなのに対し、本方法を用いると、シグナル光強度は等しいまま、ダークカウントを約２〜３カウント／ｓまで低減することができる。アップコンバートされた信号のみを分光計３６に入射させるために、光学的バンドパスフィルタ３８が分光器３６の入射スリットの前に配置されている。   The photon counting method used when measuring fluorescence is a method of counting fluorescence photons one by one, and is a very sensitive method. However, due to the high sensitivity, the dark count due to stray light is also observed as a large value. In the present apparatus, in order to minimize the dark count, the sum frequency light generated by the nonlinear optical crystal 32 is spatially separated using an iris (spatial filter) 42 to improve the S / N ratio. . The sum frequency light is returned to parallel light by the collimating lens 41, passes through the iris 42, and then enters the spectroscope 36 through the focusing lens 43. When the iris 42 is not installed, the dark count is about 6 to 7 counts / s, whereas by using this method, the dark count can be reduced to about 2 to 3 counts / s while the signal light intensity is equal. An optical bandpass filter 38 is placed in front of the entrance slit of the spectrometer 36 so that only the upconverted signal is incident on the spectrometer 36.

また、励起光の偏光を変化させるための１／２波長板１６ａを自動回転ホルダーに装着し、制御部４５によって、光学遅延回路３３と１／２波長板１６ａを装着した自動回転ホルダーを同期的に制御できるようにした。すなわち、制御部４５は、光学遅延回路３３にある遅延量を設定したとき、その遅延量において１／２波長板１６ａによる励起光の偏向方向を９０゜回転させた測定が行えるようにした。   Further, the half-wave plate 16a for changing the polarization of the excitation light is mounted on the auto-rotation holder, and the control unit 45 synchronizes the optical delay circuit 33 with the auto-rotation holder mounted with the half-wave plate 16a. Can be controlled. That is, when a delay amount is set in the optical delay circuit 33, the control unit 45 can perform measurement with the deflection direction of the excitation light by the 波長 wavelength plate 16a rotated by 90 ° at the delay amount.

光学顕微鏡１９について説明すると、対物レンズ２４と第二対物レンズ２１の間の、光が平行に進む部分にハーフミラー２２，２３を二枚入れ、一方を反射照明用の白色光源２７、他方をモニタ用のＣＣＤカメラ２８に割り当てた。これによって試料全体を照明光源２７の白色光で観察しながら、試料２６にレーザ光があたっている様子を同時に観測できる。レーザ光を結像系を通して光学顕微鏡に導入し、顕微鏡の前にピンホール１８を置くことで共焦点光学系を構成した。   The optical microscope 19 will be described. Two half mirrors 22 and 23 are inserted between the objective lens 24 and the second objective lens 21 in a portion where light travels in parallel, one is a white light source 27 for reflection illumination, and the other is a monitor. For the CCD camera 28. Thus, while the entire sample is observed with the white light of the illumination light source 27, the state in which the sample 26 is irradiated with the laser light can be simultaneously observed. Laser light was introduced into an optical microscope through an imaging system, and a pinhole 18 was placed in front of the microscope to form a confocal optical system.

またフェムト秒の極短パルス光が、顕微鏡内の光学素子によって与えられてしまう分散を小さくするために、最初に光を跳ね上げる光学素子を、可視域を高い反射率で反射するアルミニウムミラー２０とした。具体的には、光学顕微鏡１９内に配置された光学素子（プリズム）の代わりに５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射（アルミ）ミラーを取り付けた。これにより、励起光およびサンプルからの蛍光の強度が顕微鏡内でロスすることを防ぐことができる。同時に全反射ミラーに変更することにより、フェムト秒パルス光が媒質を通ことによって生じてしまう光の分散を防ぐことができ、サンプルからの蛍光を高い時間分解能で測定することを可能とする。対物レンズ２４と対向するように設けた透過照明用の白色光光源２９は、主にレーザ光の光軸調整用に用いる。光軸調整時には、この白色光を顕微鏡の外に導き、この光とレーザ光とを同軸にすることで光軸調整を行う。   Further, in order to reduce the dispersion of femtosecond ultrashort pulsed light, which is given by the optical element in the microscope, an optical element that first bounces light is replaced with an aluminum mirror 20 that reflects the visible region with high reflectance. did. Specifically, a total reflection (aluminum) mirror having a reflection maximum near 550 nm was attached instead of the optical element (prism) arranged in the optical microscope 19. This can prevent the intensity of the excitation light and the fluorescence from the sample from being lost in the microscope. At the same time, by changing to a total reflection mirror, it is possible to prevent the dispersion of light that occurs when the femtosecond pulsed light passes through the medium, and it is possible to measure the fluorescence from the sample with high time resolution. The white light source 29 for transmitted illumination provided to face the objective lens 24 is mainly used for adjusting the optical axis of laser light. At the time of optical axis adjustment, the white light is guided outside the microscope, and the optical axis is adjusted by making this light and the laser light coaxial.

また、本発明では共焦点光学配置をアップコンバージョン法と併用することにより、試料の垂直方向（光軸方向）の空間分解能を上げる。共焦点光学配置における垂直方向の分解能は顕微鏡前に置くピンホール径の大小に関係するが、通常５００マイクロメートル径のピンホールを用いて、１０マイクロメートルほどの分解能がある。しかしながら本発明においては試料からの蛍光は同時にアップコンバージョン過程を経るため、垂直方向の空間分解能の改善が行われる。例えば同様に５００マイクロメートル径のピンホールを使用した場合、垂直方向の空間分解能は４．６マイクロメートルと約２倍改善される。さらに小さい径のピンホールを共焦点配置用に使用することにより、より高い垂直方向の空間分解能が得られる。   In the present invention, the spatial resolution in the vertical direction (optical axis direction) of the sample is increased by using the confocal optical arrangement in combination with the up-conversion method. The vertical resolution in the confocal optical arrangement is related to the size of the pinhole placed in front of the microscope, but usually has a resolution of about 10 micrometers using a pinhole having a diameter of 500 micrometers. However, in the present invention, since the fluorescence from the sample goes through an up-conversion process at the same time, the spatial resolution in the vertical direction is improved. For example, when a pinhole having a diameter of 500 micrometers is similarly used, the spatial resolution in the vertical direction is improved to about 4.6 micrometers, which is about twice. By using smaller diameter pinholes for confocal placement, higher vertical spatial resolution is obtained.

同時に本発明においては試料の光励起において繰り返しの早い（〜８０ＭＨｚ）パルスレーザを用いる。これにより溶液相に存在するマイクロメートルオーダーの微小な物体のブラウン運動をレーザ光の光圧と溶媒と試料の屈折率の違いを利用したレーザトラップ法により停止させ、試料をレーザ光下でマニピュレートしながら時間分解蛍光測定することも可能である。従来のレーザトラップ法ではトラップ用に別のＣＷレーザ（Ａｒ＋等）を用意する必要があったが、本発明では試料の励起用レーザをトラップ光として併用できるため、装置が簡略化された。 At the same time, in the present invention, a pulse laser with a fast repetition rate (up to 80 MHz) is used for the optical excitation of the sample. As a result, the Brownian motion of a micrometer-order minute object existing in the solution phase is stopped by the laser trap method using the light pressure of the laser beam and the difference between the refractive index of the solvent and the sample, and the sample is manipulated under the laser beam. Time-resolved fluorescence measurement is also possible. In the conventional laser trapping method, it was necessary to prepare another CW laser (Ar + or the like) for trapping. However, in the present invention, a laser for exciting a sample can be used as trapping light, so that the apparatus is simplified.

次に、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いた測定例について説明する。
〔測定例１〕
図３は励起光によりレーザトラップされた粒径４．９μｍのポリスチレンラテックスビーズのＣＣＤカメラ像である（励起パワーは１ｍＷ以下、１００倍の対物レンズを使用）。このポリスチレンラテックスビーズは、ビーズ内に色素分子、クマリン５１９を含むポリマー粒子である（セラダイン社製）。ビーズは水中に分散され、顕微鏡下で一粒を選択した。図に示すように繰り返しの早いレーザ光によりビーズのブラウン運動が止められ、なおかつビーズ内の蛍光分子が電子励起されることにより蛍光を発しているようすがわかる。 Next, a measurement example using the time-resolved fluorescence microscope of the present invention will be described.
[Measurement Example 1]
FIG. 3 is a CCD camera image of 4.9 μm-diameter polystyrene latex beads laser-trapped by the excitation light (excitation power is 1 mW or less, using a 100 × objective lens). The polystyrene latex beads are polymer particles containing dye molecules and coumarin 519 in the beads (Ceradyne Co., Ltd.). The beads were dispersed in water and one grain was selected under a microscope. As shown in the figure, it can be seen that the Brownian motion of the beads is stopped by the laser beam that is repeated quickly, and that the fluorescent molecules in the beads emit fluorescence by electronic excitation.

使用した蛍光ビーズは、波長５２０ｎｍに極大を持つ定常蛍光スペクトルを示す。この波長での蛍光を本装置によりフェムト秒の時間分解能で時間分解測定したものが図４である。得られた時間変化は２成分の減衰を示した。長い寿命成分はビーズ中の蛍光分子からの蛍光であり、早い寿命成分はビーズ自体からの蛍光であると考えられる。   The fluorescent beads used show a steady-state fluorescence spectrum having a maximum at a wavelength of 520 nm. FIG. 4 shows time-resolved measurement of fluorescence at this wavelength with a time resolution of femtoseconds by the present apparatus. The resulting time change showed a two component decay. The long-lived component is considered to be fluorescence from the fluorescent molecules in the beads, and the fast-lived component is considered to be fluorescence from the beads themselves.

ミクロスケールの物体を溶液中に分散させると、ブラウン運動により自由に動き回ってしまい、小物体一つを分光することは非常に困難である。このような場合、一般にはレーザトラップ法（レーザマニピュレーション法）という方法を用いて物体の動きを停止させる。これはレーザ光の光圧を用いる非常に有効な手段であるが、従来までの方法では、レーザトラップ用に（分光用レーザとは別に）もう一つレーザ（CW、連続光）を用意しなければならなかった。本方法では、分光用のレーザとして繰り返しの早い(82MHz)のチタンサファイアパルスレーザーを用いるため、トラップする対象にたいして、分光用レーザ光（励起光）をあたかも連続光のように扱うことができる。これによりトラップ用光源を省くことができ、装置の簡略化が行われた。   When a micro-scale object is dispersed in a solution, it moves freely due to Brownian motion, and it is very difficult to disperse one small object. In such a case, the movement of the object is generally stopped using a method called a laser trap method (laser manipulation method). This is a very effective means of using the light pressure of the laser beam, but in the conventional method, another laser (CW, continuous light) must be prepared for laser trapping (separate from the spectroscopic laser). I had to. In this method, a titanium sapphire pulse laser with a fast repetition rate (82 MHz) is used as a spectroscopic laser, so that the spectroscopic laser light (excitation light) can be treated as if it were continuous light for the trapping target. As a result, the trap light source can be omitted, and the apparatus is simplified.

図５は、分光用レーザ（励起光）のみによる本発明のレーザトラップの説明図である。図５（ａ）及び図５（ｂ）は、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いた分光用レーザ（励起光）による蛍光ビーズのレーザトラップを示す図である。励起光によりビーズのブラウン運動が停止させられ、蛍光ビーズの分光測定が可能になる。励起光をカットすると、図５（ｃ）、図５（ｄ）に示すように、蛍光ビーズはブラウン運動により動き始める。   FIG. 5 is an explanatory diagram of a laser trap of the present invention using only a spectroscopic laser (excitation light). FIGS. 5A and 5B are views showing a laser bead trap of fluorescent beads by a spectroscopic laser (excitation light) using the time-resolved fluorescence microscope of the present invention. The excitation light stops the Brownian motion of the beads, and enables spectroscopic measurement of the fluorescent beads. When the excitation light is cut, as shown in FIGS. 5C and 5D, the fluorescent beads start to move due to Brownian motion.

なお、図６は、光学顕微鏡の最初に光を跳ね上げる光学素子２０を、プリズムに代えて５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射ミラーとしたことの効果を示す図である。図６（ａ）は光学素子２０としてプリズムを用いた場合に、本発明の時間分解蛍光顕微鏡によって測定されたレーザトラップ中の蛍光ビーズからの蛍光の時間変化を表す図である。励起光は４００ｎｍ、蛍光測定波長は５２０ｎｍである。このときの時間分解能は約１．２ｐｓであった。図６（ｂ）は、光学素子２０として５５０ｎｍ付近に反射極大を持つ全反射ミラーを用いた以外は、同じ条件で測定した蛍光ビーズからの蛍光の時間変化を表す図である。時間変化曲線の立ち上がりが急になっており、時間分解能が改善したことがわかる（このときの時間分解能は約６００ｆｓ）。また縦軸の蛍光強度も時間原点付近を比べると、ほぼ３．５倍ほど信号強度が強くなっており顕微鏡（プリズム）による蛍光のロスを防ぐことができる。   FIG. 6 is a diagram showing the effect of using an optical element 20 that jumps up light at the beginning of the optical microscope, instead of a prism, as a total reflection mirror having a reflection maximum near 550 nm. FIG. 6A is a diagram illustrating a time change of the fluorescence from the fluorescent beads in the laser trap measured by the time-resolved fluorescence microscope of the present invention when a prism is used as the optical element 20. The excitation light is 400 nm, and the fluorescence measurement wavelength is 520 nm. The time resolution at this time was about 1.2 ps. FIG. 6B is a diagram illustrating a time change of the fluorescence from the fluorescent beads measured under the same conditions except that a total reflection mirror having a reflection maximum near 550 nm is used as the optical element 20. It can be seen that the rise of the time change curve is steep, and the time resolution is improved (at this time, the time resolution is about 600 fs). Also, the fluorescence intensity on the vertical axis is about 3.5 times as strong as that near the time origin, so that loss of fluorescence by the microscope (prism) can be prevented.

〔測定例２〕
図７（ａ）は、文献”Chem. Phys. Lett., 1993, 211, 364”の記述に従って調製したαペリレン微結晶のＣＣＤカメラ像である。ペリレンの結晶には２種類の結晶構造、すなわちαペリレンとβペリレンがある。αペリレンでは４分子がユニットセルを構成し、二量体結晶構造を作っている。またβペリレンでは２分子がユニットセルを構成する。これら２種類の結晶は異なる蛍光スペクトルを示すので、定常状態の蛍光スペクトルをチェックして顕微鏡下でαペリレン微結晶を選択した。室温でαペリレンは、６００ｎｍ付近に最大強度を有する非常に広い可視領域の蛍光を発する。この広い領域の蛍光は、光励起により生成したエキシトンからの発光に起因すると考えられる。高エネルギー領域の蛍光は、光励起によって直接発生されたフリーエキシトンによる発光であることが分かっている。フリーエキシトンはＹ状態（部分的に緩和されたエキシマー）に緩和され、５３０ｎｍ付近の蛍光がＹ状態に対応する。次に、Ｙ状態は６００ｎｍ付近に広く強い蛍光を発するＥ状態（完全に緩和したエキシマー、セルフトラップドエキシトン）に緩和する。Ｅ状態からの発光が室温で観察される定常状態蛍光を支配している。我々は、室温における微結晶中のエネルギー緩和過程を明らかにするために、本発明の時間分解蛍光顕微鏡を用いて時間分解蛍光測定を行った。 [Measurement Example 2]
FIG. 7 (a) is a CCD camera image of α-perylene microcrystal prepared according to the description of the document “Chem. Phys. Lett., 1993, 211 , 364”. There are two types of perylene crystals, α-perylene and β-perylene. In α-perylene, four molecules constitute a unit cell and form a dimer crystal structure. In β-perylene, two molecules constitute a unit cell. Since these two types of crystals show different fluorescence spectra, the fluorescence spectra in the steady state were checked and α-perylene microcrystals were selected under a microscope. At room temperature, α-perylene fluoresces in a very wide visible region with a maximum intensity around 600 nm. It is considered that the fluorescence in this wide area is caused by light emission from excitons generated by photoexcitation. It has been found that fluorescence in the high-energy region is emitted by free excitons directly generated by photoexcitation. Free excitons are relaxed to the Y state (partially relaxed excimer), and the fluorescence around 530 nm corresponds to the Y state. Next, the Y state is relaxed to an E state (completely relaxed excimer, self-trapped exciton) that emits strong fluorescence widely around 600 nm. Emission from the E state dominates the steady state fluorescence observed at room temperature. We performed time-resolved fluorescence measurement using the time-resolved fluorescence microscope of the present invention to clarify the energy relaxation process in microcrystals at room temperature.

図７（ａ）は、αペリレン微結晶の中心部分から観察された時間分解蛍光（５２０ｎｍ）を示す。図７（ｂ）は、光励起中のＣＣＤカメラ像である。観察された時間変化は、装置応答時間を考慮した三つの指数関数の和でよく再現される。２つの時定数は高い精度でτ１＝２．２ｐｓ、τ２＝３８．７ｐｓと決定されたが、第３の時定数は寿命が長いため高い精度で決定するのが困難であった。観察された蛍光の時間変化は、３つの成分の相対強度と同様に、励起パルスエネルギーの変化によって影響されなかった。このことは、この実験条件下では生成されたエキシトンの濃度は比較的小さく、エキシトン−エキシトン消滅による時定数への影響は無視できることを示している。 FIG. 7 (a) shows the time-resolved fluorescence (520 nm) observed from the center of the α-perylene microcrystal. FIG. 7B is a CCD camera image during light excitation. The observed time change is well reproduced by the sum of three exponential functions considering the device response time. The two time constants were determined with high accuracy as τ 1 = 2.2 ps and τ 2 = 38.7 ps. However, the third time constant was difficult to determine with high accuracy because of its long lifetime. The observed temporal changes in fluorescence, as well as the relative intensities of the three components, were not affected by changes in excitation pulse energy. This indicates that under the experimental conditions, the concentration of exciton produced was relatively small, and the effect of exciton-exciton annihilation on the time constant was negligible.

観察された３種類の減衰成分の帰属は時間分解蛍光信号の波長依存性に基づいて行われた。フリーエキシトンからの発光が主である４８０ｎｍにおける蛍光減衰（図８（ｂ））は、５２０ｎｍにおける蛍光変化に比較して、第一寿命（τ１）成分に非常に大きく寄与している。第二寿命（τ２）成分は非常に小さく、第３のゆっくりした成分は見当たらない。他方、長寿命成分からの大きな寄与は６００ｎｍにおける蛍光減衰に観察された（図８（ｃ））。観察された時間分解蛍光の波長依存性は、τ１成分及びτ２成分はそれぞれフリーエキシトン及びＹ状態に起因し、第３のゆっくりした成分はＥ状態に割り当てられることを直接的に示している。 Assignment of the observed three types of attenuation components was performed based on the wavelength dependence of the time-resolved fluorescence signal. The fluorescence decay at 480 nm (FIG. 8 (b)), which is mainly due to emission from free excitons, greatly contributes to the first lifetime (τ 1 ) component compared to the change in fluorescence at 520 nm. The second lifetime (τ 2 ) component is very small, and the third slow component is missing. On the other hand, a large contribution from the long-lived component was observed in the fluorescence decay at 600 nm (FIG. 8 (c)). The wavelength dependence of the observed time-resolved fluorescence directly indicates that the τ 1 and τ 2 components are due to the free exciton and the Y state, respectively, and the third slow component is assigned to the E state. .

〔測定例３〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡の高い空間分解能を利用して、αペリレン微結晶におけるエキシトン発光の位置依存性を調べた。 [Measurement Example 3]
Using the high spatial resolution of the femtosecond time-resolved microscope of the present invention, the position dependence of exciton emission in α-perylene microcrystals was investigated.

図９（ａ）は、微結晶の縁部を光励起して測定した時間分解蛍光（５２０ｎｍ）を示す。図７（ｃ）は、光励起中の微結晶のＣＣＤカメラ像であり、明るいスポットが励起レーザ光の照射領域を示している。観察された減衰曲線は、微結晶の中心を励起した場合と同様に三つの指数関数の和でよく再現された。しかしフリーエキシトン及びＹ状態の寿命は著しく短く、τ１＝１．４ｐｓ、τ２＝２９．８ｐｓであった。微結晶の中心部励起と縁部励起とで定常状態の蛍光スペクトルに差異を見出すことはできなかったが、局所的な環境がエキシトンの緩和に大きく影響していることは明らかである。結晶の縁部は中心部に比べて規則性が劣化しており、欠陥濃度が高いことが予想される。従って、観察されたエキシトン緩和の変化は、微結晶中の欠陥濃度の差による可能性が高い。 FIG. 9A shows time-resolved fluorescence (520 nm) measured by photoexcitation of the edge of the microcrystal. FIG. 7C is a CCD camera image of the microcrystal during light excitation, and a bright spot indicates an irradiation area of the excitation laser light. The observed decay curve was well reproduced with the sum of the three exponentials, as was the case when the center of the crystallite was excited. However, the lifetimes of the free exciton and the Y state were extremely short, τ 1 = 1.4 ps and τ 2 = 29.8 ps. No difference could be found in the steady state fluorescence spectra between the center and edge excitations of the microcrystal, but it is clear that the local environment has a large effect on exciton relaxation. The regularity of the edge of the crystal is lower than that of the center, and it is expected that the defect concentration is high. Therefore, the observed change in exciton relaxation is likely to be due to the difference in defect concentration in the microcrystal.

このことを確かめるため、微結晶の中心部に大出力のレーザ光を照射して損傷を与え、損傷を与える前後の時間分解蛍光信号を比較した。その結果、図９（ｂ）に示すように、フリーエキシトン及びＹ状態の寿命は、損傷を与えた後では明らかに短くなった。損傷箇所の欠陥濃度は高いため、この結果は、欠陥の存在がエキシトン発光の時間変に影響を与え、エネルギー緩和を加速することを示している。   To confirm this, the central part of the microcrystal was irradiated with high-power laser light to cause damage, and time-resolved fluorescence signals before and after the damage were compared. As a result, as shown in FIG. 9B, the lifetimes of the free exciton and the Y state were clearly shortened after the damage. Since the defect concentration at the damaged portion is high, this result indicates that the presence of the defect affects the time variation of exciton emission and accelerates energy relaxation.

図１０は、再び文献”Chem. Phys. Lett., 1993, 211, 364”の記述に従って調製した約２０×２０μｍのαペリレン微結晶における位置の違いによる自由励起子の寿命の変化を二次元等高線プロットとして表したものである。図中の数値の単位はピコ秒である。結晶の中央部では図８で示したように２．２〜２．４ｐｓ程度の寿命を持った自由励起子からの発光が主に観測されるが、結晶の端、または一部中央では著しく異なった寿命が観測されることがわかる。このようにフェムト秒の時間分解能を利用した“ダイナミクス・イメージング”を行うことにより、単なる顕微鏡像や、時間分解能が十分でない従来の時間分解蛍光顕微鏡からでは得られない、新しいタイプの物質のイメージ（情報）を得ることができる。 FIG. 10 is a graph showing the change in the lifetime of the free exciton due to the difference in the position of the α-perylene microcrystal of about 20 × 20 μm prepared again according to the description of the document “Chem. Phys. Lett., 1993, 211 , 364”. It is represented as a plot. The unit of the numerical value in the figure is picosecond. At the center of the crystal, light emission from free excitons having a lifetime of about 2.2 to 2.4 ps is mainly observed as shown in FIG. It can be seen that a long life is observed. By performing "dynamics imaging" using the femtosecond time resolution in this way, a mere microscope image or an image of a new type of substance that cannot be obtained from a conventional time-resolved fluorescence microscope with insufficient time resolution ( Information).

本発明のフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡は、フェムト秒の時間分解能と、サブマイクロメータの空間分解能を有する。本発明の時間分解蛍光顕微鏡により、微結晶中の位置を空間的に分解しながら、超高速のエキシトン蛍光を観測できた。本発明のフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡は、上記測定例で示したような有機微結晶だけでなく、デバイスあるいは生体細胞を含む、微細構造を有する材料の超高速現象の研究に適用可能である。このように本発明の時間分解蛍光顕微鏡は、マイクロメータ構造中の分子の特性の探求にとって強力なツールとなるものであり、ナノ・サイエンス及びナノ・テクノロジーのキーとなるものである。   The femtosecond time-resolved fluorescence microscope of the present invention has a femtosecond time resolution and a submicrometer spatial resolution. With the time-resolved fluorescence microscope of the present invention, ultrafast exciton fluorescence could be observed while spatially resolving the position in the microcrystal. The femtosecond time-resolved fluorescence microscope of the present invention is applicable to the study of ultrafast phenomena not only of organic microcrystals as shown in the above measurement examples but also of materials having a fine structure including devices or living cells. Thus, the time-resolved fluorescence microscope of the present invention is a powerful tool for exploring the properties of molecules in a micrometer structure, and is a key to nanoscience and nanotechnology.

〔測定例４〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡は、制御部４５により光学遅延回路３３と１／２波長板１６ａを装着した自動回転ホルダーを同期的に制御できるため、蛍光の時間変化の偏光依存性を容易にかつ正確に測定することができる。 [Measurement Example 4]
In the femtosecond time-resolved microscope of the present invention, the control unit 45 can synchronously control the optical delay circuit 33 and the auto-rotating holder equipped with the half-wave plate 16a. And it can be measured accurately.

一般の溶液は非常に早いフェムト秒の時間領域で、溶質のダイポールモーメントの変化に伴う溶媒の配向変化や溶質分子の回転運動が行われる。溶媒の配向変化（ダイナミクスストークスシフト）は物質の反応性に、また溶質の回転運動は物質の輸送に大きく関連しており、両者は溶液中での化学反応において非常に重要な意味を持っている。このダイナミクスストークスシフトや回転運動を観測するにはフェムト秒の時間分解能が必要であると同時に励起光の偏光をある遅延時間で変化させ、その違いを正確に観測することが必要となる。本装置はこのことを可能にした。   In a general solution, in a very fast femtosecond time region, the orientation change of the solvent and the rotational movement of the solute molecules are performed according to the change of the dipole moment of the solute. The change in the orientation of the solvent (dynamic Stokes shift) is related to the reactivity of the substance, and the rotational movement of the solute is greatly related to the transport of the substance, and both are very important in the chemical reaction in solution. . In order to observe the dynamic Stokes shift and rotational motion, a time resolution of femtosecond is required, and at the same time, it is necessary to change the polarization of the excitation light with a certain delay time and accurately observe the difference. The present device has made this possible.

偏光板の回転制御は次のようにして行った。ある遅延時間で（ステージを固定して）励起光の偏向方向がゲート光の偏向方向と平行な場合と垂直な場合を測定する。偏光測定の順番を平行→垂直→平行→垂直‥‥のようにするのではなく、図１１に示すように平行→垂直、垂直→平行、平行→垂直‥‥と移動させる。この方法により偏光子ホルダーの回転回数を少なくすることができ（回転に最短でも５秒程度かかる）、測定時間を短縮することができる。測定の際、各点について（例えば垂直の２）１秒積算を通常５回（回数は可変）行う。図１１の例の場合、平行と垂直を３回（ペア）づつ測定するので、遅延時間Ａでの並行及び垂直成分は３ｘ５回の積算を行ったことになる。   The rotation control of the polarizing plate was performed as follows. At a certain delay time (with the stage fixed), the case where the deflection direction of the excitation light is parallel to and perpendicular to the direction of deflection of the gate light is measured. Instead of changing the order of the polarization measurement from parallel → vertical → parallel → vertical ‥‥, as shown in FIG. 11, the order is moved from parallel → vertical, vertical → parallel, parallel → vertical ‥‥. With this method, the number of rotations of the polarizer holder can be reduced (it takes at least about 5 seconds for rotation), and the measurement time can be reduced. At the time of measurement, 5 seconds (variable in number) are usually performed for each point (for example, vertical 2) for 1 second integration. In the case of the example of FIG. 11, since the parallel and the vertical are measured three times (pairs), the parallel and the vertical components at the delay time A have been integrated 3 × 5 times.

図１２は、本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡による測定例を示し、レーザトラップ中の微小液滴（クマリン５１９のトルエン溶液を水中に分散させたもの）から得られた蛍光の時間変化を表したものである。励起波長は４００ｎｍ、測定した蛍光波長は５２０ｎｍである。図１２（ａ）は、励起光がゲート光と平行及び垂直の時に得られた信号を表している。上記の手法を用いると、各遅延時間における偏光による蛍光強度の違いを正確に得ることができる。図１２（ａ）から偏光異方性（anisotropy；（Ｉ//−Ｉ⊥）／（Ｉ//＋２＊Ｉ⊥））を計算すると、図１２（ｂ）に示すように液滴中でのクマリンの回転定数が求められる。偏光異方性の値を指数関数でフィットすることにより回転緩和の時定数は２５．２ｐｓと求められた。 FIG. 12 shows an example of measurement with a femtosecond time-resolved microscope of the present invention, and shows a time change of fluorescence obtained from a microdroplet (a toluene solution of coumarin 519 dispersed in water) in a laser trap. Things. The excitation wavelength is 400 nm and the measured fluorescence wavelength is 520 nm. FIG. 12A shows signals obtained when the excitation light is parallel and perpendicular to the gate light. By using the above method, it is possible to accurately obtain a difference in fluorescence intensity due to polarization at each delay time. When the polarization anisotropy (anisotropy; (I // −I ⊥ ) / (I // + 2 * I ⊥ )) is calculated from FIG. 12 (a), as shown in FIG. The coumarin rotation constant is determined. The time constant of rotation relaxation was determined to be 25.2 ps by fitting the value of polarization anisotropy by an exponential function.

〔測定例５〕
本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡の高い時間分解能を利用して、微小領域中でおきる励起エネルギーの移動を調べることが可能となる。 [Measurement Example 5]
By utilizing the high time resolution of the femtosecond time-resolved microscope of the present invention, it is possible to investigate the transfer of excitation energy occurring in a minute region.

図１３に、アントラセンとテトラセンの混合微結晶を励起した際に得られた定常蛍光スペクトルを示す（混合モル比 １：０．０１）。得られたスペクトルは、ほぼ５００，５３０，５７０，６２０ｎｍに極大を持ち、これは溶液中のテトラセンの蛍光スペクトルとの比較から、アントラセン結晶中に存在するモノマーのテトラセンからの発光であると帰属できる。テトラセンの単結晶を励起した場合には、図１３に示すような弱い蛍光しか観測されないのに対し、混合結晶中ではテトラセンからの非常に強い蛍光が観測される。これは混合結晶中においてアントラセンからテトラセンへの効率的な励起エネルギー移動が行われていることを示している。また、図１４に５００ｎｍで観測した蛍光の時間変化を示す。得られた時間変化は６．９ｐｓの時定数を持った指数関数的な立ち上がりと、時定数約４００ｐｓの減衰を示した。また蛍光の時間変化をアントラセン単結晶からの発光が観測される波長４７０ｎｍで観測すると、τ１と同じ時定数をもった非常に弱い蛍光の減衰が観測されることから、τ１はアントラセンからテトラセンへの励起エネルギー移動（励起子拡散）の時間を表していると結論できる。 FIG. 13 shows a steady-state fluorescence spectrum obtained when a mixed microcrystal of anthracene and tetracene was excited (mixing molar ratio 1: 0.01). The obtained spectrum has a maximum at about 500, 530, 570, and 620 nm, which can be attributed to emission from tetracene of the monomer present in the anthracene crystal from comparison with the fluorescence spectrum of tetracene in the solution. . When a tetracene single crystal is excited, only weak fluorescence as shown in FIG. 13 is observed, whereas extremely strong fluorescence from tetracene is observed in the mixed crystal. This indicates that efficient excitation energy transfer from anthracene to tetracene is performed in the mixed crystal. FIG. 14 shows the time change of the fluorescence observed at 500 nm. The obtained time change showed an exponential rise with a time constant of 6.9 ps and an attenuation of about 400 ps. The tetracene when observed at a wavelength 470nm light emission is observed in the time variation of the fluorescence from the anthracene single crystal, since the attenuation of the very weak fluorescence having the same time constant as tau 1 is observed, tau 1 is anthracene It can be concluded that it represents the time of excitation energy transfer (diffusion of excitons) to.

本発明によるフェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の模式図。1 is a schematic diagram of a femtosecond time-resolved fluorescence microscope according to the present invention. 時間相関単一光子計測装置を用いた時間分解蛍光顕微鏡の模式図。FIG. 2 is a schematic diagram of a time-resolved fluorescence microscope using a time-correlated single-photon measurement device. レーザトラップ中の蛍光ビーズ（粒径４．９mｍ）を示す図。The figure which shows the fluorescent bead (particle diameter 4.9mm) in a laser trap. 蛍光ビーズからの蛍光（５２０ｎｍ）の時間変化を示す図。The figure which shows the time change of the fluorescence (520 nm) from a fluorescent bead. 分光用レーザ（励起光）のみによる本発明のレーザトラップの説明図。FIG. 4 is an explanatory diagram of a laser trap of the present invention using only a spectroscopic laser (excitation light). 光学顕微鏡の最初に光を跳ね上げる光学素子をプリズムに代えて全反射ミラーとしたことの効果を示す図。The figure which shows the effect of having replaced the prism with the optical element which bounces light at the beginning of an optical microscope, and having used a total reflection mirror. αペリレン微結晶のＣＣＤカメラ像を示す図。The figure which shows the CCD camera image of (alpha) perylene microcrystal. 微結晶の中心で得られたフェムト秒時間分解蛍光を示す図。The figure which shows the femtosecond time-resolved fluorescence obtained in the center of a microcrystal. 微結晶の縁部で得られたフェムト秒時間分解蛍光を示す図。The figure which shows the femtosecond time-resolved fluorescence obtained in the edge part of the microcrystal. 約２０×２０μｍのαペリレン微結晶における位置の違いによる自由励起子の寿命の変化を二次元等高線プロットとして表した図。The figure which represented the change of the lifetime of the free exciton by the difference of the position in about 20x20 micrometer alpha perylene microcrystal as a two-dimensional contour plot. 偏光板と光学遅延用ディレイラインの制御方法を示す説明図。FIG. 4 is an explanatory view showing a method for controlling a polarizing plate and an optical delay line. 本発明のフェムト秒時間分解顕微鏡による測定例を示す図。The figure which shows the example of a measurement by the femtosecond time-resolved microscope of this invention. anthracene - tetracene 混合微結晶の定常蛍光スペクトルを示す図。The figure which shows the steady-state fluorescence spectrum of anthracene-tetracene mixed microcrystal. anthracene - tetracene 混合微結晶から得られた時間分解蛍光（500 nm）を示す図。The figure which shows the time-resolved fluorescence (500 nm) obtained from the anthracene-tetracene mixed microcrystal.

符号の説明Explanation of reference numerals

１１…Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、１２…チタンサファイアレーザ、１３…非線形光学素子、１５…分散補償用プリズム対、１６ａ，１６ｂ…１／２波長板、１８…共焦点用ピンホール、１９…倒立型光学顕微鏡、２２，２３…ハーフミラー、２４…対物レンズ、２６…試料、２７…反射照明用白色光源、２８…ＣＣＤカメラ、２９…透過照明用白色光光源、３２…非線形光学素子、３３…光学遅延用ディレイライン、３４…和周波光、３５…光電子増倍管、３６…分光器、４１…コリメート用レンズ、４２…アイリス、４３…集光用レンズ、４５…制御部、５１…レーザダイオード、５２…フィルタ、５３…顕微鏡対物レンズ、５４…試料、５５…ＣＣＤカメラ、５６…モニタ、５７，５８…フィルタ、５９…ピンホール、６０…フォトダイオード、６１…時間波高変換器、６２…マルチチャンネルアナライザ 11: Nd: YVO 4 laser, 12: titanium sapphire laser, 13: nonlinear optical element, 15: prism pair for dispersion compensation, 16a, 16b: 1/2 wavelength plate, 18: pinhole for confocal, 19: inverted type Optical microscope, 22, 23: half mirror, 24: objective lens, 26: sample, 27: white light source for reflective illumination, 28: CCD camera, 29: white light source for transmitted illumination, 32: nonlinear optical element, 33: optical Delay line for delay, 34: sum frequency light, 35: photomultiplier tube, 36: spectroscope, 41: collimating lens, 42: iris, 43: focusing lens, 45: control unit, 51: laser diode, 52: Filter, 53: Microscope objective lens, 54: Sample, 55: CCD camera, 56: Monitor, 57, 58: Filter, 59: Pinhole, 60: Photodiode Mode, 61: time-to-peak converter, 62: multi-channel analyzer

Claims (5)

ピンホールと、
試料を載置する試料ステージと、
前記ピンホールの像を前記試料ステージ上の試料に縮小投影するとともに試料から発生された蛍光を前記ピンホールに結像する対物レンズ系と、
パルスレーザ発生手段と、
前記パルスレーザ光発生手段から出射されたレーザ光を２分割する光分割手段と、
前記光分割手段によって分割された一方のレーザ光を試料励起光として前記ピンホールに入射させる手段と、
前記光分割手段によって分割された他方のレーザ光の光路長を可変する光路長可変手段と、
前記ピンホールから出射した試料からの蛍光と前記光路長可変手段を通ったレーザ光とを混合して両者の和周波光を発生させる非線形光学素子と、
前記非線形光学素子から発生された和周波光を分光する分光手段と、
前記分光手段からの出射光を検出する検出器と、
前記光路長可変手段によって前記他方のレーザ光の光路長を変化させたとき前記検出器から得られる出力を記録する記録手段と
を含むことを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。 A pinhole,
A sample stage for mounting the sample,
An objective lens system that projects the image of the pinhole onto the sample on the sample stage in a reduced size and images fluorescence generated from the sample on the pinhole;
Pulse laser generating means,
Light splitting means for splitting the laser light emitted from the pulsed laser light generating means into two,
Means for causing one of the laser lights split by the light splitting means to enter the pinhole as sample excitation light,
An optical path length varying unit that varies an optical path length of the other laser beam split by the light splitting unit,
A nonlinear optical element that mixes fluorescence from the sample emitted from the pinhole and laser light that has passed through the optical path length varying means to generate a sum frequency light of both,
Spectral means for dispersing the sum frequency light generated from the nonlinear optical element,
A detector for detecting light emitted from the spectral means,
Recording means for recording an output obtained from the detector when an optical path length of the other laser beam is changed by the optical path length varying means. 請求項１記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記光分割手段と前記ピンホールの間の試料励起光光路中にプリズム対を配置し、励起光に予め負の分散を与えることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。   2. The time-resolved fluorescence microscope according to claim 1, wherein a prism pair is arranged in an optical path of the sample excitation light between the light splitting means and the pinhole, and a negative dispersion is previously given to the excitation light. Fluorescence microscope. 請求項２記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記試料励起光の光路中に配置された１／２波長板と、前記１／２波長板の角度と前記光路長可変手段とを連動させて制御する制御部を更に備えることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。   3. The time-resolved fluorescence microscope according to claim 2, wherein a half-wave plate disposed in an optical path of the sample excitation light, an angle of the half-wave plate, and the optical path length varying unit are controlled in association with each other. A time-resolved fluorescence microscope further comprising a control unit. 請求項２記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記非線形光学素子と前記分光手段の間に前記非線形光学素子を通った光を平行にするコリメート用レンズと、アイリスと、集光用レンズとを配置し、前記非線形光学素子から発生された和周波光を分離して前記分光手段に入射させることを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。   3. The time-resolved fluorescence microscope according to claim 2, wherein a collimating lens for parallelizing light passing through the nonlinear optical element, an iris, and a condensing lens are arranged between the nonlinear optical element and the spectral unit. A time-resolved fluorescence microscope, wherein the sum frequency light generated from the nonlinear optical element is separated and incident on the spectroscopic means. 請求項４記載の時間分解蛍光顕微鏡において、前記ピンホールと前記対物レンズ系の間に光路を折り曲げる光学素子として全反射ミラーを配置したことを特徴とする時間分解蛍光顕微鏡。   5. The time-resolved fluorescence microscope according to claim 4, wherein a total reflection mirror is arranged between the pinhole and the objective lens system as an optical element for bending an optical path.
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