【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は角結膜疾患患者に利用される角膜ないし結膜治療用培養シートおよびその作製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
角膜は眼球の前面に位置し、強膜とともに眼球の外壁を構成している。また、角膜は血管の存在しない透明な組織であり、外界からの光を眼内に透過、屈折させるレンズの機能を有するだけでなく、涙液とともに平滑な表面を形成することで、より良好な視力を得ることに貢献している。その角膜の最上層部に存在する角膜上皮の表層細胞の１〜２層は、タイトジャンクションと呼ばれる特殊な接着構造で細胞間が密に閉じており、涙液側からの物質の浸透を防御するためのバリアー機能がある。このバリアー機能により、角膜内部への水溶性物質の透過を制限するとともに、細菌の侵入をも防いでいる。すなわち、角膜上皮細胞は角膜の透明性を維持し、眼球の恒常性を維持するために極めて重要な役割を果たしている。
【０００３】
しかしこの角膜は疾患、不慮の事故などにより濁り、透明性が失われてしまう場合がある。このような角膜の濁りによる、永久的な視力低下および失明に対して角膜移植による治療が行なわれている。
【０００４】
難治性角膜上皮疾患患者に対する新規な治療法として培養角膜上皮シート移植が注目されている。通常、角膜上皮シートのような角膜上皮同等物を得るための手法は、自己またはドナー角膜から採取される角膜上皮細胞を様々な方法によって培養し、シート化して患者に移植するといった工程からなる。
【０００５】
たとえば、非特許文献１によると、自己の角膜上皮細胞を採取し、培養して、培養角膜上皮シートとすることが提案されている。しかしながら、現実的には自己の角膜上皮細胞が採取できるような片眼性の角膜疾患は稀であり、たとえ片眼性の角膜疾患の場合であっても、健康な目からの角質上皮細胞の採取する際のリスクを避ける傾向にある。したがって、培養角膜上皮シートを作製するための母細胞は、他人の角膜から採取される角膜上皮細胞を使用する場合が多い。
【０００６】
また、特許文献１においては、角膜上皮細胞の幹細胞組織である角膜輪部組織、もしくは結膜上皮細胞の幹細胞組織である結膜円縁部をスポンジ層および上皮層が除かれた羊膜上に付着させ、羊膜表面を覆うように上皮細胞を増殖させて得られる移植用細胞片が開示されている。しかしながら、角膜輪部組織または結膜円縁部などの上皮幹細胞組織および羊膜は、いずれも提供者の存在に依存するものであり、入手が困難であるという問題があった。また、仮に入手できたとしても、移植した細胞に対する免疫拒絶反応、または提供者由来の組織または羊膜からの感染といったリスクが存在する。
【０００７】
近年、眼科領域では、角膜と結膜の両方が同じ表面外胚葉由来の眼粘膜をもつことに着目し、角膜と結膜を一体化して“オキュラーサーフェス（Ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ）”とする概念が定着しつつある。また、結膜上皮が角膜上皮様ヘシフトする「化生」といった概念が一般的に知られつつある。
【０００８】
一方、特許文献２や、京都府立医科大学の木下茂教授らによる第２６回角膜カンファレンスでの発表により、自己の口腔粘膜細胞から角膜上皮代替物が作製されることが開示されている。しかしながら、結膜上皮が角膜上皮様へシフトするといった化生を考慮した内容は開示されていない。
【０００９】
【特許文献１】
特開２００１−１６１３５３号公報
【特許文献２】
特開２００２−３３１０２５号公報
【非特許文献１】
Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ Ｖｏｌ ３９４． ｐ ９９０−９９３， １９９７ Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｄａｍａｇｅｄ ｃｏｒｎｅａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記の問題を克服すべくなされたのものであり、結膜上皮細胞を用いることにより、結膜上皮細胞の角膜上皮細胞様への化生により高い治療効果が期待できる、角膜ないし結膜治療用培養シートおよびその作製方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、結膜上皮細胞を角膜に移植した際、実際に結膜上皮細胞が角膜上皮細胞様に化生することを確認した。さらに、結膜上皮細胞を１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウム塩を含有する基本培地で培養することにより、角膜ないし結膜治療に適した培養結膜上皮細胞シートを得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、結膜上皮細胞を（１）培養皿上または（２）羊膜以外の基質上に播種し、該結膜上皮細胞を培養することによって得られる培養結膜上皮細胞シートからなる、角膜ないし結膜治療用培養シートを提供する。
【００１３】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートにおいて、培養結膜上皮細胞シートは、結膜上皮細胞を１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウム塩を含有する基本培地において培養することによって得られる培養結膜上皮細胞シートであることが好ましい。
【００１４】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートにおいて、培養結膜上皮細胞シートは、酵素処理によって培養皿から剥離することによって得られる培養結膜上皮細胞シートであることが好ましい。
【００１５】
さらに、前記基質はフィブリンおよびコラーゲンのいずれか一つを含有してなる基質であることが好ましい。
【００１６】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートにおいて、結膜上皮細胞は自己由来の結膜上皮細胞であることが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明は、結膜上皮細胞を（１）培養皿上または（２）羊膜以外の基質上に播種し、該結膜上皮細胞を培養することにより培養結膜上皮細胞シートを得ることからなる、角膜ないし結膜治療用培養シートの作製方法を提供する。
【００１８】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートの作製方法において、結膜上皮細胞を１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウム塩を含有する基本培地において培養することが好ましい。
【００１９】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートの作製方法において、培養結膜上皮細胞シートは、酵素処理によって培養皿から剥離することが好ましい。
【００２０】
さらに、前記基質はフィブリンおよびコラーゲンのいずれか一つを含有してなる基質であることが好ましい。
【００２１】
前記角膜ないし結膜治療用培養シートの作製方法において、結膜上皮細胞は自己由来の結膜上皮細胞であることが好ましい。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の内容について詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、結膜上皮細胞を（１）培養皿上または（２）羊膜以外の基質上に播種し、該結膜上皮細胞を培養することによって得られる培養結膜上皮細胞シートからなる、角膜ないし結膜治療用培養シート、およびその作製方法である。本発明の培養シートは、角膜へ適用した場合に、該培養シート中の結膜上皮細胞が角膜上皮細胞様へ化生し、角膜の代替物として働き得ることを特徴とする角膜治療用培養シートである。
【００２４】
「化生」とは、一般的に、分化・成熟した細胞がその再生過程において本来の分化の方向とは異なる別の分化の方向に変わることをいう。本明細書において、「結膜上皮細胞の角膜上皮細胞様への化生」とは、結膜上皮細胞を角膜表面に適用した際に、結膜上皮細胞が角膜表面に生着し、角膜上皮細胞様へシフトし、角膜上皮のように透明化することを意味する。また、角膜上皮細胞様へ化生した結膜上皮細胞は、抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）製）を用いた蛍光免疫染色法において陽性を示す。抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）とは、角膜上皮細胞に対するマーカーであるサイトケラチン（角膜上皮細胞に特異的に発現している細胞骨格タンパク質）と特異的に結合する抗体である。
【００２５】
本明細書において結膜上皮細胞とは、眼瞼後面を裏打ちする結膜（眼瞼結膜）に存在する上皮細胞、強膜前面を覆う結膜（眼球結膜）に存在する上皮細胞、およびその移行部の結膜円縁部に存在する結膜上皮細胞である。その中でも、結膜円縁部に存在する結膜上皮細胞が好ましい。結膜上皮細胞は、正常な結膜より直径２〜１０ｍｍのシート状の結膜上皮組織の小片を採取することによって得ることができる。たとえば、結膜上皮細胞は、採取した結膜上皮組織から結膜上皮細胞を組織外へ伸展増殖させること（アウトグロース（ｏｕｔ−ｇｒｏｗｔｈ））からなる外植片を用いた方法（イクスプラント（Ｅｘｐｌａｎｔ）法）によって得ることができる。イクスプラント法においては、結膜上皮細胞とテノン嚢由来の線維芽細胞の２種類の細胞が結膜組織から２面に分かれてアウトグロースするため、たとえば滅菌されたスパーテルまたは細胞剥離用に市販されているスティックなどを用いて、線維芽細胞を剥ぎ取ることによって結膜上皮細胞を得ることができる。また、結膜上皮細胞は、ディスパーゼなどの酵素処理により結膜上皮組織から結膜上皮細胞を剥離させ、トリプシンにより分散させることからなる細胞懸濁液を用いた方法（サスペンジョン（Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）法）、またはインプレッションサイトロジーによって結膜表面から、ブラシまたはろ紙などによって直接細胞を収集する方法によって得ることもできる。結膜上皮組織は小片であればよいので、両眼性の角膜上皮疾患の患者自身からの採取も可能である。患者自身から結膜上皮細胞が得られた場合には、免疫拒絶反応を回避することができるため、結膜上皮細胞は自己由来の結膜上皮細胞であることが好ましい。
【００２６】
本発明において、前記結膜上皮細胞を培養するための培地としてはとくに限定されないが、基本培地（たとえば無機塩類やアミノ酸を含む）、または基本培地にウシ血清や脳下垂体分泌物などの動物由来栄養成分を添加した培地を使用することができる。
【００２７】
前記基本培地はカルシウム塩を含むことが好ましく、カルシウム塩としてはとくに限定されないが、塩化カルシウムまたはその水和物が好ましい。前記培地に含有されるカルシウム塩の濃度は、１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満であることが好ましい。１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満である場合、細胞の分化状態が過度に進まないことが考えられ、細胞形態が敷石状である結膜上皮細胞（たとえば図６）が得られる傾向がある。１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ以上である場合には、結膜上皮細胞は早期に老化が進行し、細胞形態が線維芽細胞状である結膜上皮細胞（たとえば図７）が得られる傾向がある。
【００２８】
本明細書において培養皿はとくに限定されないが、細胞培養に使用できる市販の培養皿を使用することができる。たとえば、温度に応じて培養シートとの接着強度などを調節できるような温度応答性培養皿などを使用することができる。
【００２９】
本明細書において基質は、移植用として安全であり、かつ細胞の接着性が好ましく、さらには細胞層を運ぶ支持体として使用しやすいものが挙げられる。前記の観点から、本発明において使用される基質として、生分解性材料、ポリペプチドおよび糖質からなる群から選ばれる少なくとも一つを含有してなる基質が挙げられる。生分解性材料としては、とくに限定されないが、フィブリン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸などがあげられる。この中でも、より生分解性および生体適合性に優れ、細胞の足場となりうることが知られているフィブリンまたはコラーゲンが好ましく、コラーゲンの一種であるアテロコラーゲンが最も好ましい。羊膜は、眼科領域において移植の際、使用される基質の１つであるが、提供者の存在に依存するものであるため入手が困難であり、入手できたとしても、免疫拒絶反応、羊膜からの感染といったリスクが存在することから、基質として羊膜を使用することは望ましくない。基質は、たとえば培養皿の内部に設置して使用することができる。たとえば、図１に示すように、基質２は支柱５が配された円筒４の片面に接着し、培養皿１ａに設置して使用することができる。図１においては、基質２を接着した面が培養皿１ａの底から約１ｍｍの高さに位置するよう支柱５は円筒４に配されている。図１に示すように、基質を設置して培養結膜上皮細胞シートを作製した場合には、たとえばナイフなどを用いて適当な大きさに培養結膜上皮細胞シートを切断し、ピンセットで取り出すことができる。
【００３０】
本明細書において培養結膜上皮細胞シートを得るためには、まず前記培養皿上または培養皿の内部に設置された基質上に、結膜上皮細胞を、たとえば、１．０×１０２〜１．０×１０６細胞個／ｃｍ２の細胞密度、好ましくは１．０×１０３〜１．０×１０５細胞個／ｃｍ２の細胞密度で播種する。ついで前記培地を培養皿に添加し、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃で、３〜３０日間、好ましくは７〜２１日間培養することにより培養結膜上皮細胞シートを得ることができる。
【００３１】
培養結膜上皮細胞シートは、当技術分野における既知の方法によって培養皿から剥離することによって得ることができる。たとえば、培養結膜上皮細胞シートは、培養皿から培地を除去し、カルシウム塩を含まないリン酸緩衝液で洗浄したのち、該培養皿に酵素溶液（たとえばディスパーゼ溶液）を加え、３７℃で５〜３０分処理することによって容易に培養皿から剥離することができる。また、剥離の際にはピンセットまたは支持膜を用いて剥離を促してもよい。剥離した培養結膜上皮細胞シートは細胞培養液またはリン酸緩衝液で洗浄することが好ましい。培養結膜上皮細胞シートが、培養皿の内部に設置された基質上に結膜上皮細胞を播種することにより作製された場合には、とくに酵素などの化学処理を施すことは必要なく、容易に培養皿から剥離することができる。
【００３２】
前記の方法によって得られた培養結膜上皮細胞シートは、角膜および結膜の治療に使用し得る。前記培養結膜上皮細胞シートは、たとえば化学薬品や火傷などによる角膜上皮障害、スティーブンス・ジョンソン症による角膜上皮障害および眼類天疱瘡などの角膜疾患に使用することができ、角膜上皮細胞および／または角膜輪部の状態が完全に破壊されている角膜疾患に対しても有効である。培養結膜上皮細胞シートを角膜創傷部に移植した場合、培養結膜上皮細胞シートは、角膜表面に生着し、角膜上皮のように透明化することにより正常角膜上皮として機能し、角膜創傷部は治療される。また、前記培養結膜上皮シートは、たとえば化学薬品や火傷などによる結膜上皮障害、スティーブンス・ジョンソン症による結膜上皮障害などの結膜疾患に使用することもできる。培養結膜上皮細胞シートを結膜に移植した場合、培養結膜上皮細胞シートは結膜表面に生着することにより正常結膜として機能し、創傷部が治癒される。
【００３３】
つぎに、本発明の角膜ないし結膜治療用培養シートを以下の実施例にもとづいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
【実施例】
実施例１
＜基質を用いる培養結膜上皮細胞シートの作製＞
健常で眼疾患歴のない日本白色ウサギの眼表面の結膜より、直径２〜３ｍｍのシート状小片を麻酔下にて切除し、６穴プレート（直径約３．５ｃｍ、ベクトン・ディッキンソン社製）に静置した（以下、実施例１において、６穴プレートを培養皿とする）。３．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有するＭＣＤＢ１５３培地（ＧＩＢＣＯ社製）に１０％ウシ血清を添加して得られた培地１ｍＬを該培養皿に加え、シート状小片を３７℃で１週間培養した。培地は、２日おきに交換した。ついで、１０％ウシ血清を添加された３．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する新鮮なＭＣＤＢ１５３培地２ｍＬと交換したのち、シート状小片を３７℃でさらに１週間培養した。さらなる１週間の培養においても、培地は２日おきに交換した。
【００３５】
合計２週間の培養ののち、結膜組織から２面に分かれて伸展増殖した２種類の細胞（結膜上皮細胞とテノン嚢由来の線維芽細胞）のうち、滅菌したスパーテルで線維芽細胞を剥ぎ取り、結膜の小片から結膜上皮細胞を入手した。
【００３６】
得られた結膜上皮細胞を、図１に示すように、培養皿に設置されたアテロコラーゲン膜上に１．６×１０４細胞個／ｃｍ２の細胞密度で播種した。ついで、１０％ウシ血清を添加された３．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する新鮮なＭＣＤＢ１５３培地を前記培養皿に加え、結膜上皮細胞を１週間、３７℃に設定したＣＯ２インキュベーター内で培養した。培地交換は２日に一度行なった。その結果、培養結膜上皮細胞シートが得られた。得られた培養結膜上皮細胞シートを観察したところ、アテロコラーゲン膜表面は結膜上皮細胞で完全に被覆されていることが確認された。
【００３７】
参考例１
＜結膜上皮細胞の角膜上皮細胞への化生確認試験＞
健常で眼疾患歴のない日本白色ウサギの眼表面の眼球結膜より、直径５〜６ｍｍの円形シート状の結膜上皮組織片を麻酔下にて切除し、ついで、同眼の角膜中央部の角膜実質内に該結膜上皮組織片を埋植し、縫合により固定した。図２に結膜上皮組織片の埋植から２４時間後の前眼部の様子を示す。
【００３８】
結膜上皮組織片の埋植から３週間ののち、縫合した糸の抜糸を行なった。図３に抜糸から２週間後の前眼部の様子を示す。図３に示すように、結膜上皮組織片が埋植された角膜において、血管浸入や混濁は認められなかった。図４には抜糸から２週間後に摘出された角膜の結膜上皮組織片の埋植部分のエオジン・ヘマトキシリン染色像を示す。図４で示されるように、埋植された結膜上皮組織片中の結膜上皮細胞がエオジン・ヘマトキシリンによって染色されたことから、血液からの栄養分の供給がなくても、結膜上皮細胞は角膜実質において生存し、角膜実質層に接着し、増殖し伸展できることが判明した。図５には抜糸から２週間後に摘出された角膜の結膜上皮組織片の埋植部分の抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）による蛍光免疫染色像を示す。通常、結膜上皮細胞は抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）に対して陰性であるが、図５より、埋植された結膜上皮組織片中の結膜上皮細胞は角膜上皮細胞と同様に、抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）に対して陽性を示した。したがって、結膜上皮細胞は角膜実質内に挿入されることにより角膜上皮細胞様の細胞に化生することが分かった。
【００３９】
参考例２
＜結膜上皮細胞の初代培養＞
健常で眼疾患歴のない日本白色ウサギの眼表面の結膜より、直径２〜３ｍｍのシート状小片を麻酔下にて切除し、６穴プレート（直径約３．５ｃｍ、ベクトン・ディッキンソン社製）に静置した（以下、参考例２において、６穴プレートを培養皿とする）。３．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有するＭＣＤＢ１５３培地（ＧＩＢＣＯ社製）へ１０％ウシ血清を添加して得られた培地１ｍＬを該培養皿に加え、シート状小片を３７℃で１週間培養した。培地は、２日おきに交換した。ついで、１０％ウシ血清を添加された３．０×１０−５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する新鮮なＭＣＤＢ１５３培地２ｍＬと交換したのち、シート状小片を３７℃でさらに１週間培養した。さらなる１週間の培養においても、培地は２日おきに交換した。
【００４０】
合計２週間の培養ののち、結膜組織から２面に分かれて伸展増殖（アウトグロース）した２種類の細胞（結膜上皮細胞とテノン嚢由来の線維芽細胞）のうち、線維芽細胞を滅菌したスパーテルで剥ぎ取り、結膜の小片から結膜上皮細胞を入手した。図６に、結膜組織からアウトグロースした結膜上皮細胞の位相差顕微鏡像を示す。図６に示すように、敷石状の形態の結膜上皮細胞が観察された。
【００４１】
参考例３
＜結膜上皮細胞の初代培養＞
健常で眼疾患歴のない日本白色ウサギの眼表面の結膜より、直径２〜３ｍｍのシート状小片を麻酔下にて切除し、６穴プレート（直径約３．５ｃｍ、ベクトン・ディッキンソン社製）に静置した（以下、参考例３において、６穴プレートを培養皿とする）。１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）へ１０％ウシ血清を添加して得られた培地１ｍＬを該培養皿に加え、３７℃で１週間培養した。培地は、２日おきに交換した。ついで、１０％ウシ血清を添加された１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウムを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地２ｍＬと交換したのち、シート状小片を３７℃でさらに１週間培養した。さらなる１週間の培養においても、培地は２日おきに交換した。
【００４２】
図７に、合計２週間の培養ののち結膜組織からアウトグロースした結膜上皮細胞の位相差顕微鏡像を示す。図７に示すように、線維芽細胞状の形態の結膜上皮細胞が観察された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、正常な結膜組織より直径２〜１０ｍｍの小片を入手することができれば、角膜ないし結膜の治療に有用な培養結膜上皮細胞シートを作製することができる。また、１．８×１０−３ｍｏｌ／Ｌ未満のカルシウム塩を含有する基本培地で結膜上皮細胞を培養することにより、角膜ないし結膜の治療に有用な培養結膜上皮細胞シートを得ることができる。とくに、基質としてアテロコラーゲンを使用した場合には、操作も容易であり、免疫原性も極めて低いため有用である。また、患者の角膜上皮が欠損している場合であっても、結膜上皮細胞は角膜上皮細胞に比べ容易に入手できる。このように得られた培養結膜上皮細胞シートを角膜へ適用した場合、培養結膜上皮細胞シート中の結膜上皮細胞は角膜上皮細胞様に化生することによって、培養結膜上皮細胞シートは正常角膜上皮として機能するため、角膜の治療に有用である。また、前記結膜上皮細胞シートは、角膜上皮細胞および／または角膜輪部の状態が完全に破壊されている角膜疾患に対しても有効である。前記培養結膜上皮細胞シートを結膜へ適用した場合、培養結膜上皮細胞シートは結膜表面に生着し、正常結膜として機能するため、結膜の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の角膜ないし結膜治療用培養シート作製の際に使用する培養皿の一実施態様を示す概略図である。
【図２】図２は、結膜上皮組織片を埋植してから２４時間後の前眼部を示す。
【図３】図３は、結膜上皮組織片を埋植してから５週間後の前眼部を示す。
【図４】図４は、結膜上皮組織片を埋植してから５週間後に角膜から摘出された角膜のエオジン・ヘマトキシリン染色による組織染色像である。
【図５】図５は、結膜上皮組織片を埋植してから５週間後に角膜から摘出された角膜の抗サイトケラチン３／１２抗体（ＡＥ５）による蛍光免疫染色による組織染色像を示す。
【図６】図６は、参考例２で結膜組織からアウトグロースした結膜上皮細胞の位相差顕微鏡像である。
【図７】図７は、参考例３で結膜組織からアウトグロースした結膜上皮細胞の位相差顕微鏡像である。
【符号の説明】
１ 培養器
１ａ 培養皿
１ｂ 蓋
２ アテロコラーゲン
３ 結膜上皮細胞
４ 円筒
５ 支柱
６ 結膜上皮組織片
７ 角膜上皮層
８ 角膜内皮層
９ 角膜実質[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a culture sheet for treating a cornea or a conjunctiva used for a patient having a corneal conjunctival disease and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
The cornea is located in front of the eyeball and, together with the sclera, constitutes the outer wall of the eyeball. In addition, the cornea is a transparent tissue free of blood vessels, and not only has the function of a lens that transmits light from the outside world into the eye and refracts it, but also forms a smooth surface together with tears, which is better. Contributes to gaining eyesight. One or two layers of surface cells of the corneal epithelium in the uppermost layer of the cornea are tightly closed by a special adhesive structure called tight junction, which prevents the penetration of substances from the tear fluid side There is a barrier function for This barrier function limits the penetration of water-soluble substances into the cornea and also prevents the invasion of bacteria. That is, corneal epithelial cells play an extremely important role in maintaining corneal transparency and maintaining eyeball homeostasis.
[0003]
However, the cornea may become cloudy due to a disease or an accident, and the transparency may be lost. Permanent vision loss and blindness due to such corneal turbidity are treated by corneal transplantation.
[0004]
Cultured corneal epithelial sheet transplantation has attracted attention as a novel treatment for patients with refractory corneal epithelial disease. In general, a technique for obtaining a corneal epithelium equivalent such as a corneal epithelial sheet includes a step of culturing corneal epithelial cells collected from an autologous or donor cornea by various methods, forming a sheet, and transplanting the sheet into a patient.
[0005]
For example, Non-Patent Document 1 proposes collecting and culturing autologous corneal epithelial cells to form a cultured corneal epithelial sheet. However, in practice, unicorneal corneal diseases that can collect their own corneal epithelial cells are rare, and even in the case of monocular corneal diseases, corneal epithelial cells from healthy eyes can be obtained. They tend to avoid the risk of sampling. Therefore, as a mother cell for producing a cultured corneal epithelial sheet, a corneal epithelial cell collected from another person's cornea is often used.
[0006]
Further, in Patent Document 1, a corneal limbal tissue, which is a stem cell tissue of corneal epithelial cells, or a conjunctival rim, which is a stem cell tissue of conjunctival epithelial cells, is attached to the amniotic membrane from which the sponge layer and the epithelial layer have been removed, A cell fragment for transplantation obtained by growing epithelial cells so as to cover an amniotic membrane surface is disclosed. However, the epithelial stem cell tissue such as the limbal tissue or the conjunctival margin and the amniotic membrane depend on the presence of the donor, and have a problem that they are difficult to obtain. Even if available, there is a risk of immune rejection of the transplanted cells or infection from donor-derived tissue or amnion.
[0007]
In recent years, in the field of ophthalmology, focusing on the fact that both the cornea and the conjunctiva have the same ocular mucosa derived from the surface ectoderm, the concept of integrating the cornea and conjunctiva into an "ocular surface" has been established. . In addition, a concept such as “metaplasia” in which the conjunctival epithelium shifts to a corneal epithelium-like shape is generally known.
[0008]
On the other hand, Patent Document 2 and a presentation at the 26th corneal conference by Professor Shigeru Kinoshita of Kyoto Prefectural University of Medicine disclose that a corneal epithelium substitute is prepared from own oral mucosal cells. However, there is no disclosure regarding metaplasia in which the conjunctival epithelium shifts like a corneal epithelium.
[0009]
[Patent Document 1]
JP 2001-161353 A [Patent Document 2]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-331525 [Non-Patent Document 1]
Pellegrini G, et al. , Lancet Vol 394. p 990-993, 1997 Long-term restoration of damaged coronal surface with autologous combined epithelium
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made to overcome the above-mentioned problems, and a culture sheet for treating a cornea or a conjunctiva that can be expected to have a high therapeutic effect due to metaplasia of the conjunctival epithelial cells into corneal epithelial cells by using the conjunctival epithelial cells. And a manufacturing method thereof.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, it was confirmed that when the conjunctival epithelial cells were transplanted into the cornea, the conjunctival epithelial cells actually metaplasia like corneal epithelial cells. Furthermore, it has been found that by culturing conjunctival epithelial cells in a basic medium containing a calcium salt of less than 1.8 × 10 −3 mol / L, a cultured conjunctival epithelial cell sheet suitable for treatment of cornea or conjunctiva can be obtained. Thus, the present invention has been completed.
[0012]
That is, the present invention provides a method for preparing a cornea or a cultured conjunctival epithelial cell sheet obtained by inoculating (1) a conjunctival epithelial cell on a culture dish or (2) a substrate other than amniotic membrane and culturing the conjunctival epithelial cell. Provided is a culture sheet for treating conjunctiva.
[0013]
In the culture sheet for treating cornea or conjunctiva, the cultured conjunctival epithelial cell sheet is a cultured conjunctival epithelial cell obtained by culturing conjunctival epithelial cells in a basal medium containing less than 1.8 × 10 −3 mol / L calcium salt. It is preferably a cell sheet.
[0014]
In the culture sheet for treating a cornea or conjunctiva, it is preferable that the cultured conjunctival epithelial cell sheet is a cultured conjunctival epithelial cell sheet obtained by peeling from a culture dish by an enzyme treatment.
[0015]
Further, the substrate is preferably a substrate containing one of fibrin and collagen.
[0016]
In the culture sheet for treating the cornea or conjunctiva, the conjunctival epithelial cells are preferably autologous conjunctival epithelial cells.
[0017]
Further, the present invention provides a method for obtaining a cultured conjunctival epithelial cell sheet by (1) seeding a conjunctival epithelial cell on a culture dish or (2) a substrate other than amniotic membrane and culturing the conjunctival epithelial cell. And a method for producing a culture sheet for conjunctival treatment.
[0018]
In the method for producing a culture sheet for treating a cornea or conjunctiva, it is preferable that the conjunctival epithelial cells be cultured in a basal medium containing less than 1.8 × 10 −3 mol / L calcium salt.
[0019]
In the method for producing a culture sheet for treating a cornea or conjunctiva, it is preferable that the cultured conjunctival epithelial cell sheet is detached from a culture dish by an enzyme treatment.
[0020]
Further, the substrate is preferably a substrate containing one of fibrin and collagen.
[0021]
In the method for producing a culture sheet for treating a cornea or a conjunctiva, the conjunctival epithelial cells are preferably autologous conjunctival epithelial cells.
[0022]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the contents of the present invention will be described in detail.
[0023]
The present invention provides a corneal or conjunctival treatment comprising a cultured conjunctival epithelial cell sheet obtained by (1) seeding a conjunctival epithelial cell on a culture dish or (2) a substrate other than amniotic membrane and culturing the conjunctival epithelial cell. And a method for producing the same. The culture sheet of the present invention is a culture sheet for treating cornea, wherein when applied to the cornea, the conjunctival epithelial cells in the culture sheet are transformed into corneal epithelial cells and can act as a substitute for the cornea. is there.
[0024]
“Metaplasia” generally means that a differentiated and mature cell changes in a different direction of differentiation different from the original direction of differentiation during its regeneration process. In the present specification, “metaplasia of conjunctival epithelial cells into corneal epithelial cells” means that when the conjunctival epithelial cells are applied to the corneal surface, the conjunctival epithelial cells adhere to the corneal surface and become corneal epithelial cell-like. Means to shift and become transparent like corneal epithelium. In addition, the conjunctival epithelial cells metaplasia into corneal epithelial cells show positive in the fluorescent immunostaining method using anti-cytokeratin 3/12 antibody (AE5) (manufactured by Sigma). The anti-cytokeratin 3/12 antibody (AE5) is an antibody that specifically binds to cytokeratin (a cytoskeletal protein specifically expressed in corneal epithelial cells), which is a marker for corneal epithelial cells.
[0025]
As used herein, the conjunctival epithelial cells are epithelial cells present in the conjunctiva lining the posterior surface of the eyelid (eyelid conjunctiva), epithelial cells present in the conjunctiva (eyeball conjunctiva) covering the front surface of the sclera, and the conjunctival rim at the transition thereof. It is a conjunctival epithelial cell present in the upper part. Among them, conjunctival epithelial cells present at the conjunctival margin are preferable. Conjunctival epithelial cells can be obtained by collecting small pieces of sheet-like conjunctival epithelial tissue having a diameter of 2 to 10 mm from normal conjunctiva. For example, the conjunctival epithelial cell is a method using an explant consisting of extending and growing the conjunctival epithelial cell out of the collected conjunctival epithelial tissue (out-growth) (Explant method). Can be obtained by In the explant method, two types of cells, a conjunctival epithelial cell and a fibroblast derived from Tenon's capsule, are separated from the conjunctival tissue in two planes and outgrow, and thus are commercially available, for example, for sterilized spatula or cell detachment. The conjunctival epithelial cells can be obtained by stripping the fibroblasts using a stick or the like. In addition, the conjunctival epithelial cells are obtained by detaching the conjunctival epithelial cells from the conjunctival epithelial tissue by enzymatic treatment such as dispase and dispersing the cells with trypsin (suspension method) or an impression site. It can also be obtained by a method of collecting cells directly from the conjunctival surface with a brush or filter paper depending on the nature of the cell. Since the conjunctival epithelial tissue may be a small piece, it can be collected from a patient with a binocular corneal epithelial disease. When conjunctival epithelial cells are obtained from the patient themselves, immune rejection can be avoided, and conjunctival epithelial cells are preferably autologous conjunctival epithelial cells.
[0026]
In the present invention, the medium for culturing the conjunctival epithelial cells is not particularly limited, but may be a basal medium (for example, containing inorganic salts or amino acids) or a basal medium containing animal-derived nutrients such as bovine serum and pituitary secretions. A medium to which the components have been added can be used.
[0027]
The basal medium preferably contains a calcium salt, and the calcium salt is not particularly limited, but is preferably calcium chloride or a hydrate thereof. The concentration of the calcium salt contained in the medium is preferably less than 1.8 × 10 −3 mol / L. When it is less than 1.8 × 10 −3 mol / L, it is considered that the differentiation state of the cells does not excessively progress, and conjunctival epithelial cells having a cobblestone-like cell morphology (for example, FIG. 6) tend to be obtained. . When the concentration is 1.8 × 10 −3 mol / L or more, senescence of the conjunctival epithelial cells proceeds at an early stage, and conjunctival epithelial cells having a fibroblast-like cell morphology (eg, FIG. 7) tend to be obtained. is there.
[0028]
In the present specification, the culture dish is not particularly limited, but a commercially available culture dish that can be used for cell culture can be used. For example, a temperature-responsive culture dish capable of adjusting the adhesive strength to a culture sheet or the like according to the temperature can be used.
[0029]
As used herein, the substrate includes those that are safe for transplantation, have good cell adhesion, and are easy to use as a support for carrying a cell layer. From the above viewpoint, examples of the substrate used in the present invention include a substrate containing at least one selected from the group consisting of a biodegradable material, a polypeptide and a saccharide. Biodegradable materials include, but are not limited to, fibrin, collagen, gelatin, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, and the like. Among them, fibrin or collagen, which is more excellent in biodegradability and biocompatibility and is known to be a scaffold for cells, is preferable, and atelocollagen, which is a kind of collagen, is most preferable. Amniotic membrane is one of the substrates used in transplantation in the ophthalmic field, but it is difficult to obtain because it depends on the presence of the donor. The use of amniotic membrane as a substrate is undesirable because of the risk of infection. The substrate can be used, for example, by being placed inside a culture dish. For example, as shown in FIG. 1, the substrate 2 is adhered to one surface of the cylinder 4 on which the columns 5 are arranged, and can be used by being placed on the culture dish 1a. In FIG. 1, the column 5 is arranged on the cylinder 4 such that the surface to which the substrate 2 is adhered is located at a height of about 1 mm from the bottom of the culture dish 1a. As shown in FIG. 1, when a cultured conjunctival epithelial cell sheet is prepared by setting a substrate, the cultured conjunctival epithelial cell sheet can be cut into an appropriate size using, for example, a knife or the like, and taken out with tweezers. .
[0030]
In order to obtain a cultured conjunctival epithelial cell sheet in the present specification, first, conjunctival epithelial cells are placed on the culture dish or on a substrate placed inside the culture dish, for example, from 1.0 × 10 2 to 1.0 The cells are seeded at a cell density of × 10 6 cells / cm 2 , preferably 1.0 × 10 3 to 1.0 × 10 5 cells / cm 2 . Then, the culture medium is added to a culture dish and cultured at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 38 ° C., for 3 to 30 days, preferably 7 to 21 days to obtain a cultured conjunctival epithelial cell sheet.
[0031]
The cultured conjunctival epithelial cell sheet can be obtained by detaching from a culture dish by a method known in the art. For example, in the case of a cultured conjunctival epithelial cell sheet, after removing the medium from the culture dish and washing with a phosphate buffer containing no calcium salt, an enzyme solution (for example, a dispase solution) is added to the culture dish, and the culture is performed at 37 ° C for 5 to 5 minutes. By treating for 30 minutes, it can be easily detached from the culture dish. Further, at the time of peeling, peeling may be promoted using tweezers or a support film. The detached cultured conjunctival epithelial cell sheet is preferably washed with a cell culture solution or a phosphate buffer. If the cultured conjunctival epithelial cell sheet is prepared by seeding the conjunctival epithelial cells on a substrate placed inside the culture dish, it is not necessary to perform chemical treatment such as enzymes, and the culture dish can be easily prepared. Can be peeled off.
[0032]
The cultured conjunctival epithelial cell sheet obtained by the above method can be used for treatment of cornea and conjunctiva. The cultured conjunctival epithelial cell sheet can be used, for example, for corneal epithelial damage due to chemicals or burns, corneal epithelial damage due to Stevens-Johnson disease, and corneal diseases such as pemphigus ophthalmicus. It is also effective for corneal diseases in which the condition of the limbus is completely destroyed. When a cultured conjunctival epithelial cell sheet is transplanted to a corneal wound, the cultured conjunctival epithelial cell sheet engrafts on the corneal surface and functions as normal corneal epithelium by becoming transparent like a corneal epithelium, and the corneal wound is treated. Is done. Further, the cultured conjunctival epithelial sheet can be used for conjunctival epithelial disorders such as conjunctival epithelial disorders due to chemicals or burns, and conjunctival epithelial disorders due to Stevens-Johnson disease. When the cultured conjunctival epithelial cell sheet is transplanted to the conjunctiva, the cultured conjunctival epithelial cell sheet functions as normal conjunctiva by engrafting on the conjunctival surface, and the wound is healed.
[0033]
Next, the culture sheet for treating a cornea or conjunctiva of the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to only these examples.
[0034]
【Example】
Example 1
<Preparation of cultured conjunctival epithelial cell sheet using substrate>
From a conjunctiva on the ocular surface of a healthy white rabbit with no history of eye disease, a small sheet-like piece having a diameter of 2 to 3 mm was excised under anesthesia, and placed on a 6-well plate (about 3.5 cm in diameter, manufactured by Becton Dickinson). The plate was allowed to stand (hereinafter, a 6-well plate is used as a culture dish in Example 1). 1 mL of a medium obtained by adding 10% bovine serum to MCDB153 medium (manufactured by GIBCO) containing 3.0 × 10 −5 mol / L calcium chloride was added to the culture dish. For one week. The medium was changed every two days. Then, after replacing with 2 mL of fresh MCDB153 medium containing 3.0 × 10 −5 mol / L calcium chloride supplemented with 10% bovine serum, the sheet-shaped pieces were further cultured at 37 ° C. for one week. For a further week of culture, the medium was changed every two days.
[0035]
After culturing for a total of 2 weeks, of the two types of cells (conjunctival epithelial cells and fibroblasts derived from Tenon's capsule), which were extended and divided into two surfaces from the conjunctival tissue, the fibroblasts were peeled off with a sterilized spatula, Conjunctival epithelial cells were obtained from small pieces of the conjunctiva.
[0036]
The obtained conjunctival epithelial cells were seeded at a cell density of 1.6 × 10 4 cells / cm 2 on an atelocollagen membrane set in a culture dish as shown in FIG. Then, fresh MCDB153 medium containing 3.0 × 10 −5 mol / L calcium chloride supplemented with 10% bovine serum was added to the culture dish, and the conjunctival epithelial cells were cultured for one week at 37 ° C. in CO 2. The cells were cultured in two incubators. The medium was changed once every two days. As a result, a cultured conjunctival epithelial cell sheet was obtained. Observation of the obtained cultured conjunctival epithelial cell sheet confirmed that the atelocollagen membrane surface was completely covered with conjunctival epithelial cells.
[0037]
Reference Example 1
<Confirmation test of metaplasia of conjunctival epithelial cells to corneal epithelial cells>
A circular sheet-like piece of conjunctival epithelium having a diameter of 5 to 6 mm was excised from the conjunctival epithelium on the surface of the eye of a healthy Japanese rabbit with no history of ocular disease under anesthesia. The piece of conjunctival epithelium was implanted therein and fixed by suturing. FIG. 2 shows the state of the anterior eye part 24 hours after implantation of the conjunctival epithelial tissue piece.
[0038]
Three weeks after the implantation of the conjunctival epithelium tissue piece, the suture was removed. FIG. 3 shows the state of the anterior eye part two weeks after thread removal. As shown in FIG. 3, no vascular invasion or opacity was observed in the cornea in which the conjunctival epithelial tissue piece was implanted. FIG. 4 shows an eosin / hematoxylin-stained image of an implanted portion of a corneal conjunctival epithelial tissue extirpated two weeks after thread removal. As shown in FIG. 4, since the conjunctival epithelial cells in the implanted conjunctival epithelial tissue piece were stained by eosin hematoxylin, even without the supply of nutrients from the blood, the conjunctival epithelial cells could be found in the corneal stroma. It was found to survive, adhere to the corneal stroma, proliferate and stretch. FIG. 5 shows a fluorescent immunostaining image of the implanted portion of the corneal conjunctival epithelial tissue extirpated two weeks after thread removal with an anti-cytokeratin 3/12 antibody (AE5). Normally, the conjunctival epithelial cells are negative for the anti-cytokeratin 3/12 antibody (AE5), but from FIG. 5, the conjunctival epithelial cells in the implanted conjunctival epithelial tissue section are similar to the corneal epithelial cells. It was positive for the cytokeratin 3/12 antibody (AE5). Therefore, it was found that the conjunctival epithelial cells were transformed into corneal epithelial cell-like cells by being inserted into the corneal stroma.
[0039]
Reference Example 2
<Primary culture of conjunctival epithelial cells>
From a conjunctiva on the ocular surface of a healthy white rabbit with no history of eye disease, a small sheet-like piece having a diameter of 2 to 3 mm was excised under anesthesia, and placed on a 6-well plate (about 3.5 cm in diameter, manufactured by Becton Dickinson). The plate was allowed to stand (hereinafter, in Reference Example 2, a 6-well plate was used as a culture dish). 1 mL of a medium obtained by adding 10% bovine serum to an MCDB153 medium (manufactured by GIBCO) containing 3.0 × 10 −5 mol / L calcium chloride was added to the culture dish. For one week. The medium was changed every two days. Then, after replacing with 2 mL of fresh MCDB153 medium containing 3.0 × 10 −5 mol / L calcium chloride supplemented with 10% bovine serum, the sheet-shaped pieces were further cultured at 37 ° C. for one week. For a further week of culture, the medium was changed every two days.
[0040]
After culturing for a total of 2 weeks, of the two types of cells (conjunctival epithelial cells and Tenon's capsule-derived fibroblasts) that have been extended and expanded (outgrowth) from the conjunctival tissue, the fibroblasts are sterilized. The conjunctival epithelial cells were obtained from small pieces of the conjunctiva. FIG. 6 shows a phase contrast microscope image of conjunctival epithelial cells outgrown from the conjunctival tissue. As shown in FIG. 6, the conjunctival epithelial cells in the form of cobblestones were observed.
[0041]
Reference Example 3
<Primary culture of conjunctival epithelial cells>
From a conjunctiva on the ocular surface of a healthy white rabbit with no history of eye disease, a small sheet-like piece having a diameter of 2 to 3 mm was excised under anesthesia, and placed on a 6-well plate (about 3.5 cm in diameter, manufactured by Becton Dickinson). The plate was allowed to stand (hereinafter, in Reference Example 3, a 6-well plate was used as a culture dish). 1 mL of a medium obtained by adding 10% bovine serum to a DMEM medium (manufactured by GIBCO) containing 1.8 × 10 −3 mol / L calcium chloride is added to the culture dish, and cultured at 37 ° C. for 1 week did. The medium was changed every two days. Then, after replacing with 2 mL of a fresh DMEM medium containing 1.8 × 10 −3 mol / L calcium chloride supplemented with 10% bovine serum, the sheet-shaped pieces were further cultured at 37 ° C. for one week. For a further week of culture, the medium was changed every two days.
[0042]
FIG. 7 shows a phase contrast microscope image of conjunctival epithelial cells outgrown from the conjunctival tissue after culturing for a total of two weeks. As shown in FIG. 7, conjunctival epithelial cells in a fibroblast-like form were observed.
[0043]
【The invention's effect】
According to the present invention, if a small piece having a diameter of 2 to 10 mm can be obtained from a normal conjunctival tissue, a cultured conjunctival epithelial cell sheet useful for treating the cornea or conjunctiva can be produced. Further, by culturing the conjunctival epithelial cells in a basic medium containing a calcium salt of less than 1.8 × 10 −3 mol / L, a cultured conjunctival epithelial cell sheet useful for treating the cornea or conjunctiva can be obtained. In particular, when atelocollagen is used as a substrate, the operation is easy and the immunogenicity is extremely low, which is useful. Further, even when the corneal epithelium of a patient is defective, conjunctival epithelial cells can be obtained more easily than corneal epithelial cells. When the thus obtained cultured conjunctival epithelial cell sheet is applied to the cornea, the conjunctival epithelial cells in the cultured conjunctival epithelial cell sheet metaplasia like corneal epithelial cells, so that the cultured conjunctival epithelial cell sheet becomes normal corneal epithelium. Because it works, it is useful for treating the cornea. The conjunctival epithelial cell sheet is also effective against corneal diseases in which the state of corneal epithelial cells and / or limbus is completely destroyed. When the cultured conjunctival epithelial cell sheet is applied to the conjunctiva, the cultured conjunctival epithelial cell sheet adheres to the conjunctival surface and functions as a normal conjunctiva, which is useful for treating conjunctiva.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view showing one embodiment of a culture dish used for producing a culture sheet for treating a cornea or conjunctiva according to the present invention.
FIG. 2 shows the anterior segment 24 hours after implantation of a conjunctival epithelial tissue piece.
FIG. 3 shows the anterior segment 5 weeks after implantation of a conjunctival epithelial tissue piece.
FIG. 4 is a tissue staining image of the cornea extracted from the cornea 5 weeks after implantation of the conjunctival epithelial tissue piece by eosin / hematoxylin staining.
FIG. 5 shows a tissue staining image of a cornea excised from the cornea 5 weeks after implantation of a conjunctival epithelial tissue piece by fluorescent immunostaining with an anti-cytokeratin 3/12 antibody (AE5).
FIG. 6 is a phase contrast microscope image of conjunctival epithelial cells outgrown from conjunctival tissue in Reference Example 2.
FIG. 7 is a phase contrast microscope image of conjunctival epithelial cells outgrown from conjunctival tissue in Reference Example 3.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Incubator 1a Culture dish 1b Lid 2 Atelocollagen 3 Conjunctival epithelial cell 4 Cylinder 5 Prop 6 Conjunctival epithelium tissue piece 7 Corneal epithelial layer 8 Corneal endothelial layer 9 Corneal stroma
