JP2004290177A - New protein and its use - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、その製造法、癌の予防・治療剤または診断薬、アポトーシス促進剤、癌の予防・治療剤またはアポトーシス促進剤のスクリーニングなどに関する。 The present invention relates to a novel protein, a polynucleotide encoding the same, a method for producing the same, a prophylactic / therapeutic or diagnostic agent for cancer, an apoptosis promoter, a screening for a prophylactic / therapeutic agent for cancer or an apoptosis promoter, and the like.
近年のマイクロアレイ・オリゴヌクレオチドアレイ技術の進歩により、遺伝子発現の網羅的な解析が可能となってきた。癌においても遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価しうることも予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（i）その発現量を低下させる、（ii）機能を抑制する、（iii）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
Semaphorinファミリーは分泌型分子と膜結合型分子の両方から構成される大きなタンパク質ファミリーで、脊椎動物で少なくとも19種、非脊椎動物で3種の遺伝子が報告されている（Cell 97巻，551-552頁, 1999年）。
Semaphorinファミリーは神経軸索誘導やシナプス形成などに代表される広範囲な神経発生過程に関わることが知られている。近年になり、Semaphorinファミリーの免疫系への関与（Trends in Immunol. 22巻，670-676頁, 2001年）や、臓器発生・血管新生における関与が明らかになりつつある。Semaphorinファミリーに属するヒト由来のSemaphorin 3B、Semaphorin 3Fは、癌抑制遺伝子として報告されている（Proc. Natl Acad. Sci. USA 98巻，13954-13959頁, 2001年、Cancer Res. 62巻，542-546頁, 2002年、Cancer Res. 62巻，2637-2643頁, 2002年）。Semaphorin 3Cは、ヒト肺がん組織で発現が亢進しているという報告がある（J. Surg. Oncol. 72巻，18-23頁, 1999年、Proc. Natl Acad. Sci. USA 94巻，14713-14718頁, 1997年）。Semaphorin 3Eは転移性細胞で発現していると報告されている（Cancer Res. 58巻，1238-1244頁, 1998年）。
Semaphorin4Dとアミノ酸レベルで相同性が41％のSemaphorin 4B（以下、SEMA4Bと略すこともある）はGenBankにゲノム配列から予想された遺伝子として登録されている（非特許文献１ GenBank Accession No. XM_044533）。SEMA4Bは低酸素条件下で発現が上昇する遺伝子のひとつとして報告されている（特許文献１ WO 02/46465）。また、ジーンチップ解析に基づきSEMA4Bなどを含む数百種の塩基配列が、肺癌の診断または肺癌を治療する化合物の探索などに使用できるとの報告もある（特許文献２ WO 02/86443）。SEMA4Bとアミノ酸レベルで93％の相同性を有するNOV7は、癌で発現亢進していることが報告されている（特許文献３ WO 02/06329）。
The Semaphorin family is a large protein family consisting of both secreted and membrane-bound molecules, with at least 19 vertebrates and three invertebrates genes reported (Cell 97, 551-552). P., 1999).
The Semaphorin family is known to be involved in a wide range of neurogenesis processes typified by nerve axon guidance and synapse formation. In recent years, the involvement of the Semaphorin family in the immune system (Trends in Immunol. 22, 670-676, 2001) and its involvement in organ development and angiogenesis are becoming apparent. Semaphorin 3B and Semaphorin 3F derived from human belonging to the Semaphorin family have been reported as tumor suppressor genes (Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 13954-13959, 2001, Cancer Res. 62, 542-). 546, 2002, Cancer Res. 62, 2637-2643, 2002). It has been reported that the expression of Semaphorin 3C is enhanced in human lung cancer tissues (J. Surg. Oncol. 72, 18-23, 1999, Proc. Natl Acad. Sci. USA 94, 14713-14718). P. 1997). Semaphorin 3E has been reported to be expressed in metastatic cells (Cancer Res. 58, 1238-1244, 1998).
Semaphorin 4B having 41% homology with Semaphorin 4D at the amino acid level (hereinafter sometimes abbreviated as SEMA4B) is registered in GenBank as a gene predicted from the genomic sequence (Non-Patent Document 1 GenBank Accession No. XM_044533). SEMA4B has been reported as one of the genes whose expression increases under hypoxic conditions (Patent Document 1 WO 02/46465). In addition, there are reports that hundreds of base sequences including SEMA4B and the like based on gene chip analysis can be used for diagnosis of lung cancer or search for compounds for treating lung cancer (Patent Document 2 WO 02/86443). It has been reported that NOV7 having 93% homology at the amino acid level with SEMA4B is upregulated in cancer (Patent Document 3 WO 02/06329).
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤が切望されている。 There is a long-felt need for safe drugs that target molecules that are specifically expressed in cancer cells and that induce cancer cell growth inhibition.
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、肺癌組織で発現が顕著に増加する新規遺伝子を見出し、この遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することも見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
（２）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
（３）上記（１）記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
（４）上記（１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（５）ＤＮＡである上記（４）記載のポリヌクレオチド、
（６）配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列を含有する上記（５）記載のポリヌクレオチド、
（７）配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（８）上記（４）記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
（９）上記（８）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
（１０）上記（９）記載の形質転換体を培養し、上記（１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
（１１）上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
（１２）上記（４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１３）上記（４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
（１４）上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
（１５）上記（１４）記載の抗体を含有してなる医薬、
（１６）上記（１４）記載の抗体を含有してなる診断薬、
（１７）上記（４）記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（１８）上記（１７）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（１９）上記（１４）記載の抗体を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質の定量方法、
（２０）上記（１９）記載の定量方法を用いることを特徴とする上記（１）記載のタンパク質またはその機能が関連する疾患の診断方法、
（２１）上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２２）上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記（１）記載のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２２ａ）上記（２１）記載のスクリーニング方法または上記（２２）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩、
（２２ｂ）上記（２２ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２３）上記（４）記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２４）上記（４）記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（２４ａ）上記（２３）記載のスクリーニング方法または上記（２４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記（１）記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、
（２４ｂ）上記（２４ａ）記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
（２５）癌の予防・治療剤である上記（１１）、（１２）、（１５）または（１８）記載の医薬、
（２５ａ）癌が、肺癌、卵巣癌または膵臓癌である、上記（２５）記載の医薬、
（２５ｂ）癌の予防・治療剤である上記（２２ｂ）または（２４ｂ）記載の医薬、
（２６）（癌細胞の）アポトーシス促進剤である上記（１１）、（１２）、（１５）または（１８）記載の医薬、
（２６ａ）（癌細胞の）アポトーシス促進剤である上記（２２ｂ）または（２４ｂ）記載の医薬、
（２６ｂ）癌細胞の増殖阻害促進剤である上記（１１）、（１２）、（１５）、（１８）、（２２ｂ）または（２４ｂ）記載の医薬、
（２７）癌の診断薬である上記（１３）または（１６）記載の診断薬、
（２８）上記（１）記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドの発現または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポトーシス促進剤、
（２９）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス促進剤、
（３０）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤、
（３０ａ）癌が、肺癌、卵巣癌または膵臓癌である上記（３０）記載の予防・治療剤、
（３０ｂ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌細胞の増殖阻害促進剤、
（３１）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド、
（３２）上記（３１）記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
（３３）アポトーシス促進剤である上記（３２）記載の医薬、
（３３ａ）癌細胞の増殖阻害促進剤である上記（３２）記載の医薬、
（３４）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、
（３５）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング用キット、
（３５ａ）上記（３４）記載のスクリーニング方法または上記（３５）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうるアポトーシス促進剤、
（３６）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの発現または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなるアポトーシス促進剤、
（３６ａ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質を含有してなる癌細胞の増殖阻害促進剤、
（３７）哺乳動物に対し、（i）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、（ii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、または（iii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌の予防・治療法、
（３８）哺乳動物に対し、（i）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、（ii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、または（iii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進方法、
（３９）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する、または該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌の予防・治療法、
（４０）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する、または該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法、
（４１）癌の予防・治療剤を製造するための（i）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、（ii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、または（iii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
（４２）癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための（i）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の発現を阻害する物質、（ii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドの遺伝子の発現を阻害する物質、または（iii）該タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用などを提供する。
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, found a novel gene whose expression is remarkably increased in lung cancer tissue, and an antisense oligonucleotide of this gene promotes apoptosis of cancer cells. I also found out. As a result of further studies based on this finding, the present invention has been completed.
That is, the present invention
(1) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof,
(2) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, or a salt thereof;
(3) a partial peptide of the protein according to (1) or a salt thereof;
(4) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding the protein or a partial peptide thereof according to (1),
(5) the polynucleotide according to (4), which is a DNA;
(6) the polynucleotide according to the above (5), comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11;
(7) a polynucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, or SEQ ID NO: 11,
(8) a recombinant vector containing the polynucleotide according to (4),
(9) a transformant transformed with the recombinant vector according to (8),
(10) The protein according to (1) or a partial peptide thereof or a partial peptide thereof, wherein the transformant according to (9) is cultured to produce and accumulate the protein or partial peptide thereof according to (1). Salt production method,
(11) a medicament comprising the protein according to (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof;
(12) a medicine comprising the polynucleotide according to (4),
(13) a diagnostic agent comprising the polynucleotide according to (4) above,
(14) an antibody against the protein according to (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(15) a medicine comprising the antibody according to (14),
(16) a diagnostic agent comprising the antibody of the above (14),
(17) a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the polynucleotide according to (4) or a part thereof;
(18) a medicine comprising the polynucleotide according to the above (17),
(19) The method for quantifying a protein according to (1), comprising using the antibody according to (14);
(20) a method for diagnosing a disease associated with the protein or its function according to (1), wherein the method according to (19) is used,
(21) A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein according to (1), comprising using the protein according to (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof;
(22) A kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein of (1), comprising the protein of (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(22a) a compound or a salt thereof, which inhibits the expression of the protein of (1), obtained by using the screening method of (21) or the screening kit of (22);
(22b) a medicament comprising the compound according to (22a) or a salt thereof,
(23) A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits expression of the protein gene according to (1), which comprises using the polynucleotide according to (4).
(24) A kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits expression of the protein gene according to (1), comprising the polynucleotide according to (4).
(24a) a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene according to (1), obtained by using the screening method according to (23) or the screening kit according to (24);
(24b) a medicament comprising the compound according to (24a) or a salt thereof,
(25) The medicament according to the above (11), (12), (15) or (18), which is an agent for preventing or treating cancer.
(25a) The medicament according to the above (25), wherein the cancer is lung cancer, ovarian cancer or pancreatic cancer.
(25b) the medicament according to the above (22b) or (24b), which is an agent for preventing or treating cancer;
(26) the medicament according to the above (11), (12), (15) or (18), which is an apoptosis promoting agent (of a cancer cell);
(26a) the medicament according to the above (22b) or (24b), which is an apoptosis promoting agent (of a cancer cell);
(26b) the medicament according to the above (11), (12), (15), (18), (22b) or (24b), which is a cancer cell growth inhibitory promoter;
(27) The diagnostic agent according to (13) or (16) above, which is a diagnostic agent for cancer.
(28) an apoptosis-promoting agent comprising a substance that inhibits the expression of the protein according to (1) or a partial peptide thereof or the expression of a gene of the protein,
(29) an apoptosis-promoting agent comprising an antibody to a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
(30) a prophylactic / therapeutic agent for cancer comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof;
(30a) the prophylactic / therapeutic agent according to the above (30), wherein the cancer is lung cancer, ovarian cancer or pancreatic cancer;
(30b) a cancer cell growth inhibitory agent comprising an antibody against a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof or a salt thereof,
(31) a base complementary or substantially complementary to the base sequence of a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A polynucleotide containing the sequence or a portion thereof,
(32) a medicine comprising the polynucleotide according to the above (31),
(33) the medicament according to the above (32), which is an apoptosis promoting agent;
(33a) the medicament according to the above (32), which is a cancer cell growth inhibitory promoter;
(34) a method for screening an apoptosis-promoting agent, which comprises using a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(35) for screening an apoptosis-promoting agent, comprising a polynucleotide encoding a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof; kit,
(35a) an apoptosis promoting agent obtainable by using the screening method according to (34) or the screening kit according to (35);
(36) Apoptosis containing a substance that inhibits the expression of a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial peptide thereof, or the expression of a gene of the protein Accelerator,
(36a) Promotion of cancer cell growth inhibition comprising a substance having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a substance that inhibits the expression of a partial peptide gene Agent,
(37) a protein which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 for a mammal Or a substance that inhibits expression of a partial peptide or a salt thereof, (ii) a substance that inhibits expression of a gene of the protein or a partial peptide thereof, or (iii) an effective amount of an antibody against the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof. Administering cancer, prevention and treatment of cancer,
(38) a protein containing, with respect to a mammal, (i) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10 Or a substance that inhibits expression of a partial peptide or a salt thereof, (ii) a substance that inhibits expression of a gene of the protein or a partial peptide thereof, or (iii) an effective amount of an antibody against the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof. Administering a cancer cell apoptosis promoting method,
(39) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, a partial peptide thereof, or a salt thereof; A method for preventing or treating cancer, which comprises inhibiting the expression or inhibiting the expression of the gene for the protein or its partial peptide,
(40) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, a partial peptide thereof, or a salt thereof A method for promoting apoptosis of cancer cells, which comprises inhibiting expression, or inhibiting expression of a gene for the protein or a partial peptide thereof,
(41) (i) The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 for producing a prophylactic / therapeutic agent for cancer A substance that inhibits expression of a protein containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, (ii) a substance that inhibits expression of a gene of the protein or a partial peptide thereof, or (iii) a protein or a partial peptide thereof or Use of antibodies against salts,
(42) (i) The same or substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 for producing an agent for promoting apoptosis of cancer cells A substance that inhibits expression of a protein containing an amino acid sequence or a partial peptide thereof or a salt thereof, (ii) a substance that inhibits expression of a gene of the protein or a partial peptide thereof, or (iii) a protein or a partial peptide thereof or And the use of antibodies against salts.
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（本発明で用いられるタンパク質）は、癌細胞に特異的に発現し、癌の診断マーカーである。したがって、該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明の抗体は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして安全に使用することができる。また、本発明で用いられるタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体などは、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などのスクリーニングに有用である。 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 (protein used in the present invention) It is specifically expressed in cells and is a diagnostic marker for cancer. Therefore, the compound or its salt that inhibits the activity of the protein, the compound or its salt that inhibits the expression of the protein gene, the antisense polynucleotide of the present invention, and the antibody of the present invention include, for example, cancer (eg, colon cancer, Breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) -It can be used safely as a therapeutic agent, an apoptosis promoting agent, etc. In addition, the protein used in the present invention or a polynucleotide encoding the same, the antibody of the present invention, etc. may be used for cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer). , Renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.), and is useful for screening an apoptosis promoting agent.
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。 A protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 (hereinafter referred to as the protein of the present invention or the present invention; The protein used may be referred to as a human or warm-blooded animal (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, cow, monkey, etc.) cells (eg, hepatocytes, splenocytes, nerves). Cells, glial cells, pancreatic β cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells ( For example, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, Cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells, or cancer cells of these cells) or any tissue in which those cells are present, for example, brain, brain, etc. Sites (eg, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, pancreas, kidney, liver, gonad, thyroid, gallbladder, bone marrow, adrenal gland , Skin, muscle, lung, digestive tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, peripheral blood, prostate, testicle, ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc. It may be a derived protein or a synthetic protein.
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは約９８％以上、好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。
The amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes 95% or more, preferably about 98% or more, preferably about 99% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Examples include amino acid sequences having homology.
Examples of the protein containing an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein containing the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. And proteins having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
Examples of the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include an amino acid sequence having 99.9% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
Amino acid sequence homology was determined using the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) under the following conditions (expected value = 10; gap allowed; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF). Can be calculated.
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。 Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the activity of the protein of the present invention is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may vary.
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（１）（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、（２）（i）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列中の１または２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列に１または２個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列中の１または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
Examples of the protein used in the present invention include (1) (i) one or more (for example, about 1 to 50, preferably 1 to 30) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Degree, more preferably about 1 to 10, more preferably number (1 to 5) amino acids, and (ii) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (E.g., about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably a number (1 to 5) amino acids); (iii) SEQ ID NO: One or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence represented by 1 Amino acids with amino acids inserted Column, (iv) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and still more preferably A so-called mutein such as a protein containing an amino acid sequence in which several (1 to 5) amino acids have been substituted with another amino acid, or (v) a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them (2) (i) SEQ ID NO: 4 An amino acid sequence having one or two amino acids deleted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10, (ii) represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 1 or 2 or more amino acids (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) to the amino acid sequence to be added did Amino acid sequence, (iii) an amino acid sequence having one or two amino acids inserted into the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 10, (iv) SEQ ID NO: 4, sequence A so-called protein containing an amino acid sequence in which one or two amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 are substituted with another amino acid, or (v) an amino acid sequence obtained by combining them. Mutein is also included.
When the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ1-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
In the protein in this specification, the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (carboxyl terminus) in accordance with the convention of peptide labeling. SEQ ID NO: including the protein containing the amino acid sequence represented by the protein used in the present invention, C-terminal, carboxyl group (-COOH), a carboxylate (-COO -), amide (-CONH 2) Alternatively, any of ester (—COOR) may be used.
Here, as R in the ester, for example, a C 1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl, for example, a C 3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl and cyclohexyl, for example, phenyl , C 6-12 aryl groups such as α-naphthyl, for example, phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl or C 7- alkyl groups such as α-naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl. 14 An aralkyl group, a pivaloyloxymethyl group and the like are used.
When the protein used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus, a protein in which the carboxyl group is amidated or esterified is also included in the protein used in the present invention. As the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
Furthermore, the protein used in the present invention, the amino acid residue (eg, methionine residue) of the N-terminal amino group protecting group (e.g., formyl group, such as C 1-6 alkanoyl such as acetyl group C 1- 6- acyl group), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, pyroglutamine-oxidized, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (for example, -OH,- SH, an amino group, an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.) are protected with a suitable protecting group (for example, a C 1-6 acyl group such as a C 1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group). Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
Specific examples of the protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7. And a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
The partial peptide of the protein used in the present invention is a partial peptide of the protein used in the present invention described above, and is preferably any peptide having the same properties as the protein used in the present invention described above. It may be something.
For example, it has at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, and most preferably 200 or more amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of the protein used in the present invention. Peptides and the like are used.
The partial peptide used in the present invention has one or two or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably about 1 to 5) amino acid sequences in the amino acid sequence. Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence. 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably, about 1 to 5) amino acids are added to the amino acid sequence, or One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence In may be substituted.
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
The partial peptide used in the present invention may have a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO − ), an amide (—CONH 2 ) or an ester (—COOR) at the C-terminus.
Further, similar to the protein used in the present invention, the partial peptide used in the present invention has a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminal, and the N-terminal amino acid residue (eg, , A methionine residue) in which the amino group is protected by a protecting group, a glutamine residue produced by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, and a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule. Also included are those protected with an appropriate protecting group, and complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bonded.
The partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for preparing an antibody.
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
As the salt of the protein or partial peptide used in the present invention, a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid, an organic acid) or a base (eg, an alkali metal salt) is used. Are preferred. Examples of such a salt include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
The protein or its partial peptide or its salt used in the present invention can be produced from the aforementioned human or warm-blooded animal cells or tissues by a known protein purification method, or contains a DNA encoding the protein. It can also be produced by culturing a transformant. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
When producing from human or mammalian tissues or cells, after homogenizing human or mammalian tissues or cells, extraction is performed with an acid or the like, and the extract is subjected to chromatography such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. Can be purified and isolated.
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
For the synthesis of the protein or partial peptide or a salt thereof, or an amide thereof used in the present invention, a commercially available resin for protein synthesis can be generally used. Examples of such a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, and 4-hydroxymethylmethyl. Phenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmocaminoethyl) phenoxy resin, and the like. it can. Using such a resin, an amino acid having an α-amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods. At the end of the reaction, the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.In addition, an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or an amide thereof. I do.
For the condensation of the above protected amino acids, various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable. As the carbodiimides, DCC, N, N′-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide and the like are used. For activation by these, the protected amino acid was directly added to the resin together with a racemization inhibitor additive (for example, HOBt, HOOBt), or the protected amino acid was previously activated as a symmetric acid anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added later to the resin.
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 The solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction. For example, acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol, and dimethyl sulfoxide. Examples thereof include sulfoxides, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; and appropriate mixtures thereof. The reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about −20 to 50 ° C. The activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. As a result of the test using the ninhydrin reaction, when the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. When sufficient condensation cannot be obtained even by repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using acetic anhydride or acetylimidazole to prevent the subsequent reaction from being affected.
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include, for example, Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl , Phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
The carboxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl ester such as an alkyl esterified ester (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl). ), Aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonylhydrazide, t-butoxy It can be protected by carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
The hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification. Examples of groups suitable for this esterification include lower (C 1-6 ) alkanoyl groups such as acetyl groups, aroyl groups such as benzoyl groups, and groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl groups and ethoxycarbonyl groups. Used. Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
As the protecting group for the phenolic hydroxyl group of tyrosine, for example, Bzl, Cl 2 -Bzl, 2-nitrobenzyl, Br-Z, t-butyl and the like are used.
As the imidazole protecting group for histidine, for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, a corresponding acid anhydride, azide, active ester [alcohol (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4-dinitrophenol, Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, and an ester with HOBt). As the activated amino group of the raw material, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
As a method for removing (eliminating) the protecting group, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride, methanesulfonic acid, trifluoromethane, etc. Acid treatment with dichloromethane, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. The elimination reaction by the above acid treatment is generally performed at a temperature of about -20 ° C to 40 ° C. In the acid treatment, for example, anisole, phenol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4 -Addition of a cation scavenger such as butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like is effective. Further, the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is the above 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane. In addition to deprotection by acid treatment in the presence of dithiol or the like, it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia or the like.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
The protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protective group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
As another method for obtaining an amide form of a protein or a partial peptide, for example, after amidating and protecting the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid, a peptide (protein) chain is added to the amino group side to a desired chain length. After the elongation, a protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal α-amino group of the peptide chain has been removed and a protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carboxyl group has been removed, and these are produced. The protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein or peptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method to obtain a desired crude protein or peptide. This crude protein or peptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired protein or peptide.
In order to obtain an ester of a protein or peptide, for example, after condensing the α-carboxyl group of the carboxy terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the desired protein or An ester of the peptide can be obtained.
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法が挙げられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
The partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase. As a method for synthesizing a peptide, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid that can constitute the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the target peptide. it can. Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include the methods described in the following (i) to (v).
(I) M. Bodanszky and MA Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(Ii) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965)
(Iii) Nobuo Izumiya et al., Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. (1975)
(Iv) Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara, Biochemistry Experiments Lecture 1, Protein Chemistry IV, 205, (1977)
(V) Supervised by Haruaki Yajima, Development of Continuing Pharmaceuticals, Volume 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten After the reaction, conventional purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, etc. Can be used to purify and isolate the partial peptide used in the present invention. When the partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, when the partial peptide obtained by a salt is a known method or analogous method It can be converted into a free form or another salt by a method.
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
（i）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ii）配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（iii）配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（iv）配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
The polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention. Preferably it is DNA. The DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-described cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA.
The vector used for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of a total RNA or mRNA fraction from the cells and tissues described above.
Examples of the DNA encoding the protein used in the present invention include, for example,
(I) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; A DNA encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing an amino acid sequence represented by
(Ii) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 or a nucleotide sequence hybridizing under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; A DNA encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing an amino acid sequence represented by
(Iii) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8; A DNA encoding a protein having substantially the same properties as a protein containing an amino acid sequence represented by
(Iv) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or a nucleotide sequence hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions; Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９８以上、好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（i）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ii）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（iii）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（iv）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
Examples of the DNA that can hybridize with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, 95% or more, preferably about 98 or more, and more preferably the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. DNA containing a nucleotide sequence having about 99% or more homology is used.
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence having 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 And the like.
Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence having 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 And the like.
Examples of a DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringency conditions include, for example, a nucleotide sequence having 99.9% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 And the like.
Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringent conditions.
The high stringent conditions are, for example, conditions in which the sodium concentration is about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
More specifically, (i) the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 The DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is used as the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Alternatively, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 or the like, as (iii) a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, is represented by SEQ ID NO: 8 The DNA containing the nucleotide sequence or the DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 encodes (iv) a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 The that DNA, SEQ ID NO: 11 DNA or sequence comprising the base sequence represented by numbers: a DNA containing the base sequence represented by 12 is used.
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
The polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. In addition, any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cells / tissues, cDNA library derived from the aforementioned cells / tissues, and synthetic DNA may be used.
Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include a DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11. Or a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11, and substantially corresponds to the protein of the present invention. For example, a DNA containing a part of a DNA encoding a protein having a similar activity can be used.
DNAs capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 have the same significance as described above.
The same hybridization method and high stringency conditions as described above are used.
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
Means for cloning a DNA that completely encodes the protein or partial peptide used in the present invention (hereinafter, in the description of the cloning and expression of the DNA encoding the same, these may be simply abbreviated as the protein of the present invention) Amplification by a PCR method using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or encoding a DNA incorporated into an appropriate vector into a part or the entire region of the protein of the present invention. And a DNA fragment labeled with a DNA fragment or a synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
The DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan ™ -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan ™ -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the ODA-LA PCR method. The method can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method and the Kunkel method, or a method analogous thereto.
The DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
The expression vector for the protein of the present invention is, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (b) ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by the following.
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), λ phage and the like. In addition to animal viruses such as bacteriophage, retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNAI / Neo, and the like are used.
The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression. For example, when an animal cell is used as a host, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
Of these, it is preferable to use a CMV (cytomegalovirus) promoter, SRα promoter, or the like. When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, .lambda.P L promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc. When the host is Bacillus, SPO1 promoter, SPO2 promoter, penP promoter, etc. When the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable. When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
In addition to the above, an expression vector containing an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), and the like may be used, if desired. it can. As the selection marker include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r), neomycin resistant gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r, G418 resistance). In particular, when the dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells, the target gene can also be selected using a thymidine-free medium.
If necessary, a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the protein of the present invention. When the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc., when the host is Bacillus, α-amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In some cases, MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc., and when the host is an animal cell, insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. can be used.
A transformant can be produced using the vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed.
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
As the host, for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
Specific examples of the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli K12.DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] Are used.
As the Bacillus bacterium, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
Examples of yeast include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R − , NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036P, and so on. Used.
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and High Five ™ derived from egg of Trichoplusia ni. Cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N cell; BmN cell) or the like is used. As the Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
As the insect, for example, a silkworm larva is used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr − ) cells), mouse L Cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells and the like are used.
Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) and Gene, 17, 107 (1982) can be used to transform Escherichia.
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
Transformation of Bacillus sp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, vol. 168, 111 (1979).
To transform yeast, for example, the method described in Methods in Enzymology, vol. 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) can be used. it can.
Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
To transform animal cells, for example, see Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha) and Virology, vol. 52, 456 (1973).
Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding the protein can be obtained.
When culturing a transformant whose host is a genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and among them, a carbon source necessary for growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. As a carbon source, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc., as a nitrogen source, for example, ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like Examples of the inorganic or organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added. The pH of the medium is preferably about 5 to 8.
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller，Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433,Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science，122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
As a medium for culturing the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] is preferable. If necessary, an agent such as 3β-indolylacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
When the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
When culturing a transformant in which the host is yeast, examples of the medium include Burkholder's minimum medium [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] and 0.5%. SD medium containing casamino acid [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)]. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. The cultivation is usually performed at about 20 ° C. to 35 ° C. for about 24 to 72 hours, and if necessary, aeration or stirring is added.
When culturing a transformant in which the host is an insect cell or an insect, the medium may be Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) to which additives such as immobilized 10% bovine serum are appropriately added. Is used. The pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. The cultivation is usually performed at about 27 ° C. for about 3 to 5 days, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
When culturing a transformant whose animal host is an animal cell, examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, Vol. 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967), 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)), etc. The pH is preferably about 6 to 8. Culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and / or agitation may be added as necessary.
As described above, the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
The protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and / or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration is used as appropriate. The buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 ™ . When the protein is secreted into the culture solution, after completion of the culture, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
Purification of the protein contained in the culture supernatant or extract thus obtained can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods. These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight. Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, and use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography A method utilizing a difference between isoelectric points, such as an isoelectric focusing method, is used.
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
When the protein thus obtained is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein obtained is a salt, a method known per se or analogous thereto Can be converted to a free form or another salt.
The protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification. As the protein modifying enzyme, for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
The presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody, Western blotting, or the like.
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
The antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention.
An antibody against a protein or a partial peptide or a salt thereof (hereinafter, these may be simply referred to as the protein of the present invention) used in the present invention uses the protein of the present invention as an antigen and is known per se. Can be produced according to the method for producing an antibody or antiserum described in (1).
[Preparation of monoclonal antibody]
(A) Preparation of Monoclonal Antibody-Producing Cell The protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier and a diluent at a site where antibody production is possible by administration. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
When producing monoclonal antibody-producing cells, a warm-blooded animal immunized with an antigen, for example, an individual having an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained therein. By fusing the antibody-producing cells thus obtained with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared. The antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of a labeling agent bound to the antibody. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)]. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
Examples of myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used. The preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%. By incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes, cell fusion can be carried out efficiently.
Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas. For example, a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a protein antigen is directly or adsorbed together with a carrier, and then radioactive substances or A method for detecting a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding an anti-immunoglobulin antibody labeled with an enzyme or the like (an anti-mouse immunoglobulin antibody is used when cells used for cell fusion are mice) or protein A; A method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase to which globulin antibodies or protein A is adsorbed, a protein labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow. For example, RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal calf serum, GIT medium containing 1-10% fetal calf serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or serum-free for hybridoma culture A culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) or the like can be used. The culturing temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. The culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. The culture can be usually performed under 5% carbon dioxide gas. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
(B) Purification of monoclonal antibody Monoclonal antibody can be separated and purified by a method known per se, for example, an immunoglobulin separation and purification method [eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchange method Absorption / desorption method using body (eg, DEAE), ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific antibody that collects only antibody by active adsorbent such as protein A or protein G, and dissociates the bond to obtain antibody Purification method].
(Preparation of polyclonal antibody)
The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, an immunizing antigen (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and a warm-blooded animal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody. It can be produced by collecting a substance and separating and purifying the antibody.
Regarding a complex of an immunizing antigen and a carrier protein used to immunize a warm-blooded animal, the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier protein and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by crosslinking the carrier protein. Any material may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently produced. A method of coupling at a rate of about 1 to 5 is used.
Various coupling agents can be used for coupling the hapten and the carrier protein. For example, glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually performed once every about 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
The polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, or the like, preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
The measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above. The separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-mentioned separation and purification of the monoclonal antibody.
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１２で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
The nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a protein or a partial peptide used in the present invention (eg, DNA (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as the DNA of the present invention in the description of antisense polynucleotide)) The antisense polynucleotide having a complementary or substantially complementary base sequence or a part thereof includes a complementary or substantially complementary base sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention. Any antisense polynucleotide may be used as long as it contains a base sequence or a part thereof and has an action of suppressing the expression of the DNA, and antisense DNA is preferable.
The nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the total nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, in the case of an antisense polynucleotide directed to translation inhibition in the entire base sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention, the base sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention (for example, An antisense polynucleotide having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with a complementary strand of a base sequence near a codon, etc.) B) In the case of an antisense polynucleotide which directs RNA degradation by RNase H, it is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% with the complementary strand of the entire base sequence of the DNA of the present invention including introns. As described above, most preferably, antisense polynucleotides each having about 95% or more homology are suitable.
Specifically, the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the contained DNA, or a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence of DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, or a part thereof. Nucleotides and the like.
The antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40, preferably about 15 to 30 bases.
In order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, a phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense DNA may be, for example, a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphorodithionate. It may be substituted. In addition, the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-O-methylation, and the base portion (pyrimidine, purine) may also be chemically modified. Or any one that hybridizes to DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. These antisense polynucleotides can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできる該遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とタンパク質との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される（指令にある）タンパク質のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどは、好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばPharm Tech Japan, 8巻, 247頁または395頁, 1992年、Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、または本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
According to the present invention, the antisense polynucleotide (nucleic acid) corresponding to the protein gene of the present invention, which can inhibit the replication or expression of the gene, is cloned or the base of DNA encoding the determined protein is determined. It can be designed and synthesized based on sequence information. Such antisense polynucleotides can hybridize to the RNA of the protein gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through interaction with the protein-related RNA of the present invention. The expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled. Polynucleotides that are complementary to a selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, can be used in vivo and in vitro to produce the protein gene of the present invention. It is useful for regulating and controlling the expression of, and also useful for treating or diagnosing diseases and the like. The term "corresponding" means having homology or being complementary to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids including genes. The "correspondence" between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a protein usually refers to the amino acid of the protein (as indicated) derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement. 5 'end hairpin loop of protein gene, 5' end 6-base pair repeat, 5 'end untranslated region, polypeptide translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end untranslated region, 3 ' Although a terminal palindrome region or a 3′-end hairpin loop can be selected as a preferable target region, any region within a protein gene can be selected as a target.
Regarding the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region, if the target nucleic acid can hybridize with the target region, the target nucleic acid is Can be said to be "antisense." Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-deoxy-D-ribose, polynucleotides containing D-ribose, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, non-polynucleotides, Other polymers having a nucleotide backbone (eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers) or other polymers containing special bonds, provided that the polymer is composed of bases such as those found in DNA or RNA. Pairing and nucleotides having an arrangement permitting base attachment) are included. They may be double stranded DNA, single stranded DNA, double stranded RNA, single stranded RNA, DNA: RNA hybrids, and may further comprise unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides), known modifications. Additions, e.g., those with labels known in the art, capped, methylated, substituted for one or more natural nucleotides with analogs, modified with intramolecular nucleotides Having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, carbamate, etc.), having a charged or sulfur-containing bond (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.) Such as proteins (eg, nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, Nal peptides, poly-L-lysine, etc.) or sugars (eg, monosaccharides, etc.) having side chain groups, interactive compounds (eg, acridine, psoralen, etc.), chelating compounds (eg, , Metals, radioactive metals, boron, oxidizable metals, etc.), those containing alkylating agents, those having modified bonds (eg, α-anomeric nucleic acids, etc.) Is also good. Here, "nucleoside", "nucleotide", and "nucleic acid" may include not only those containing purine and pyrimidine bases but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, or the like, or with functional groups such as ethers, amines, and the like. It may have been converted.
The antisense polynucleotide of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA). Specific examples of the modified nucleic acid include a sulfur derivative of a nucleic acid, a thiophosphate derivative, a nucleic acid which is resistant to degradation of polynucleoside amide and oligonucleoside amide, and the like. The antisense polynucleotide of the present invention can be designed, for example, as follows. That is, the antisense polynucleotide in a cell is made more stable, the cell permeability of the antisense polynucleotide is increased, the affinity for a target sense strand is increased, and if the toxicity is reduced. In some cases, the toxicity of the antisense polynucleotide is reduced. Many such modifications have been reported, for example, in Pharm Tech Japan, 8, 247 or 395, 1992, Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993.
The antisense polynucleotides of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, bonds, and may be provided in special forms such as liposomes, microspheres, or applied by gene therapy. , Can be provided in an added form. Thus, in the form of addition, polycations such as polylysine which acts to neutralize the charge of the phosphate skeleton, lipids which enhance the interaction with the cell membrane or increase the uptake of nucleic acids ( Hydrophobic substances such as, for example, phospholipids, cholesterol, etc.). Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). These can be attached to the 3 'or 5' end of the nucleic acid and can be attached via bases, sugars, intramolecular nucleoside bonds. Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of a nucleic acid for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Such capping groups include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
The inhibitory activity of the antisense polynucleotide can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention. .
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。 Hereinafter, the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention (hereinafter referred to as the DNA of the present invention) ), An antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the antibody of the present invention), and an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention (hereinafter, the antisense polynucleotide of the present invention). (May be abbreviated as nucleotide).
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、癌組織における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。よって、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤として使用することができる。 Since the expression of the protein of the present invention is increased in cancer tissues, it can be used as a disease marker. That is, it is useful as a marker for early diagnosis in cancer tissues, determination of the severity of symptoms, and prediction of disease progression. Therefore, an antisense polynucleotide of a polynucleotide encoding the protein of the present invention, a compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention, a compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or the present invention Pharmaceuticals containing an antibody against the protein of, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovary) Cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.), and can be used as an apoptosis promoter.
（１）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進してしており、さらに、本発明のタンパク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。従って、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、例えば、（i）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の活性と、（ii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
例えば、上記（ii）の場合における本発明のタンパク質の活性を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
(1) Screening of Candidate Drug Compounds for Disease Expression of the protein of the present invention is enhanced in cancer tissues. Further, when the activity of the protein of the present invention is inhibited, cancer cells undergo apoptosis. Accordingly, the compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder) Cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.), and can be used as an apoptosis promoting agent.
Therefore, the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof.
That is, the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
Specifically, for example, the activity of (i) a cell capable of producing the protein of the present invention and (ii) the activity of a mixture of a cell capable of producing the protein of the present invention and a test compound are compared. A method for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, which is characterized in that:
As a cell having the ability to produce the protein of the present invention, for example, a host (transformant) transformed with a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention described above is used. As a host, for example, animal cells such as COS7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used. For the screening, for example, a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used. The method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the method for culturing the transformant of the present invention described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
For example, a test compound that inhibits the activity of the protein of the present invention in the case (ii) above by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the case (i). And compounds that inhibit the activity of the protein of the present invention.
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。 The compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
さらに、本発明のタンパク質の遺伝子も、癌組織において発現が増加するので、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして使用することができる。
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（iii）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（iv）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（iii）と（iv）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（iv）の場合における遺伝子の発現を、上記（iii）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
Furthermore, since the expression of the gene of the protein of the present invention also increases in cancer tissues, compounds that inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof include, for example, cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate) Cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It can be used as an accelerator or the like.
Therefore, the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention.
The screening method includes (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of the test compound. A screening method characterized by performing a comparison with the case.
In the above method, the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
Examples of the test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
The protein amount is measured by a known method, for example, using an antibody recognizing the protein of the present invention, and measuring the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis or ELISA method or a method analogous thereto. can do.
The amount of mRNA is measured by a known method, for example, using a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 or a part thereof as a probe. It is measured by hybridization or a PCR method using a nucleic acid containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 11 or a part thereof as a primer or a method analogous thereto. be able to.
For example, a test compound that inhibits the expression of the gene in the case of the above (iv) by about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more as compared with the above case (iii), Can be selected as compounds that inhibit the expression of the protein gene.
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の治療・予防剤、アポトーシス促進剤などとして低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
The screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention are test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts. A compound selected from animal tissue extract, plasma and the like, or a salt thereof, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, or a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention. .
As the salt of the compound, those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
The compound or its salt that inhibits the activity of the protein of the present invention and the compound or its salt that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention are, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer) , Gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It is useful as a low toxic and safe drug.
When the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
For example, compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like. Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation. For example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
As compositions for parenteral administration, for example, injections, suppositories and the like are used. Dosage forms such as agents. Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections. As the aqueous liquid for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil, or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule. Suppositories used for rectal administration are prepared by mixing the above compound or a salt thereof with a conventional suppository base.
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
The above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient. Examples of such dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories and the like. Usually, each dosage unit dosage form has a dosage of 5 to 500 mg, especially 5 to 100 mg for an injection. Other dosage forms preferably contain 10 to 250 mg of the above compound.
Each of the above-mentioned compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the compound.
The preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, human or warm-blooded animals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep, pig, cow, horse, bird, cat, dog, monkey, chimpanzee, etc.) ) Can be administered orally or parenterally.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route, and the like. When a salt is orally administered, generally, for an adult (assuming a body weight of 60 kg), the compound or a salt thereof is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target disease, and the like, but, for example, inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention for the purpose of treating breast cancer. When the compound or a salt thereof is usually administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound or a salt thereof per day is administered. Is conveniently administered to cancerous lesions by injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（２）本発明のタンパク質の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
(2) Quantification of the protein of the present invention Since the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly quantification by sandwich immunoassay, etc. Can be used for
That is, the present invention
(I) reacting the antibody of the present invention with a test solution and a labeled protein of the present invention competitively, and measuring the ratio of the labeled protein of the present invention bound to the antibody; And (ii) simultaneously or sequentially reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on a carrier and another antibody of the present invention labeled on a carrier. The present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after the reaction.
In the quantification method (ii), it is desirable that one antibody is an antibody that recognizes the N-terminal of the protein of the present invention and the other antibody is an antibody that reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')２ 、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
The protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like. For these purposes, the antibody molecule itself may be used, or F (ab ′) 2 , Fab ′, or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
The method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephelometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
As a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance, for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. As the radioisotope, for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used. As the above enzyme, a stable enzyme having a large specific activity is preferable. For example, β-galactosidase, β-glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used. As the fluorescent substance, for example, a cyanine fluorescent dye (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used. As the luminescent substance, for example, luminol, a luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Further, a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
For the insolubilization of an antigen or an antibody, physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing a protein or an enzyme may be used. Examples of the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
In the sandwich method, the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction). By measuring the activity of the labeling agent, the amount of the protein of the present invention in the test solution can be determined. The primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times. The labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above. In the immunoassay by the sandwich method, the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. You may.
In the method for measuring the protein of the present invention by the sandwich method of the present invention, as the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction, an antibody having a different site to which the protein of the present invention binds is preferably used. That is, the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is preferably An antibody that recognizes, for example, the N-terminal other than the C-terminal is used.
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
The monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, a nephrometry, or the like.
In the competition method, after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation), the amount of any of B and F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified. In this reaction method, a soluble antibody is used as the antibody, B / F separation is performed using polyethylene glycol, a liquid phase method using a second antibody against the antibody, or a solid phase antibody is used as the first antibody. As the first antibody, a soluble antibody is used, and an immobilization method using an immobilized antibody as the second antibody is used.
In the immunometric method, the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction against a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. And an excess amount of the labeled antibody, and then immobilized antigen is added to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
In nephelometry, the amount of insoluble precipitates generated as a result of an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
In applying these individual immunoassays to the quantification method of the present invention, no special conditions, operations, and the like need to be set. The protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations of those skilled in the art to ordinary conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews, books, and the like.
For example, Hiroe Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie, "Radio Immunoassay" (Kodansha, published in 1974), Eiji Ishikawa et al., "Enzyme Immunoassay" (Medical Shoin, Showa Ed. Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay” (2nd edition) (Issue Shoin, 1982), Eiji Ishikawa et al. “Enzyme Immunoassay” (3rd Edition), Ishikawa, Showa Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)) 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibid.Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibid.Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies). )) (The above is from Academic Press) ) And the like can be referred to.
As described above, the protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
Furthermore, when an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer) , Esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) or may be affected in the future Can be diagnosed as having high propensity.
Further, the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue. Further, for preparation of an antibody column used for purifying the protein of the present invention, detection of the protein of the present invention in each fraction at the time of purification, analysis of the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
（３）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics,第5巻,874〜879頁(1989年)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，第86巻,2766〜2770頁(1989年))などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異などが検出された場合は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である可能性が高いと診断することができる。
(3) Gene Diagnostics The DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce a human or warm-blooded animal (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, bird, sheep, pig, cow, horse, cat, dog) , Monkeys, chimpanzees, etc.) can detect abnormalities (genetic abnormalities) in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or partial peptides thereof, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, It is useful as a diagnostic agent for a gene such as an increase or an overexpression of the DNA or mRNA.
The above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)).
For example, when overexpression is detected by Northern hybridization or when DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer) , Liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.).
（４）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能や作用を抑制し、癌細胞のアポトーシスを誘導することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤、促進剤などして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重60kg）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約0.1〜100mg投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、アポトーシス促進剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
(4) Pharmaceutical Containing Antisense Polynucleotide The antisense polynucleotide of the present invention, which can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppresses the expression of the DNA, has low toxicity, and exhibits the present invention in vivo. Can suppress the function and action of the protein of the present invention or the DNA of the present invention and induce apoptosis of cancer cells. For example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, It can also be used as a preventive / therapeutic agent for a biliary tract cancer, a spleen cancer, a renal cancer, a bladder cancer, a uterine cancer, an ovarian cancer, a testis cancer, a thyroid cancer, a pancreatic cancer, a brain tumor, a blood tumor, etc.), an apoptosis promoting agent, and the like.
When the antisense polynucleotide is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, accelerator, etc., it can be formulated and administered according to a method known per se.
Also, for example, after inserting the antisense polynucleotide alone or into a suitable vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, a human or mammal (eg, rat, Rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, and the like). The antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary agent for promoting uptake, and can be administered using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter. Alternatively, they can be aerosolized and administered locally into the trachea as an inhalant.
Furthermore, for the purpose of improving pharmacokinetics, prolonging the half-life, and improving the efficiency of cellular uptake, the antisense polynucleotide is formulated alone or together with a carrier such as liposome (injection) and administered intravenously, subcutaneously, etc. May be.
The dosage of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, it is generally used in adults ( (Body weight 60 kg), about 0.1 to 100 mg of the antisense polynucleotide is administered per day.
Further, the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in tissues or cells and the state of expression thereof.
Like the above-mentioned antisense polynucleotide, a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a ribozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, and the like also include the gene of the present invention. Can be suppressed, and the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in a living body can be suppressed, for example, cancer (eg, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer) , Esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It can be used as an agent and the like.
The double-stranded RNA can be produced by designing based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
A ribozyme can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, pp. 221, 2001). For example, it can be produced by linking a known ribozyme to a part of RNA encoding the protein of the present invention. As a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a portion (RNA fragment) close to a cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known ribozyme, can be mentioned.
When the above-mentioned double-stranded RNA or ribozyme is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as an antisense polynucleotide.
（５）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、癌細胞のアポトーシス誘導活性を有するため、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（例、ワクチンなど）（好ましくは、肺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤など）、アポトーシス促進剤等として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、促進剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調整できる。注射剤の調整方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
(5) Pharmaceutical Containing Antibody of the Present Invention Since the antibody of the present invention has an activity of inducing apoptosis of cancer cells, it can be used for, for example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, Biliary, spleen, renal, bladder, uterine, ovarian, testicular, thyroid, pancreatic, brain, blood, etc. prophylactic / therapeutic agents (eg, vaccines) (preferably lung cancer, Ovarian cancer, pancreatic cancer, etc.).
The prophylactic / therapeutic agents and promoters for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention have low toxicity and can be used as they are as liquids or as pharmaceutical compositions in appropriate dosage forms, in humans or mammals (eg, rats, rabbits, sheep). , Pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous, etc.). Preferably, it can be administered as a vaccine according to a standard method.
The antibodies of the present invention may be administered per se or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention and a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
As compositions for parenteral administration, for example, injections, suppositories, vaccines and the like are used. Injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip injections and the like. Dosage forms may be included. Such an injection can be prepared according to a known method. The injection can be prepared, for example, by dissolving, suspending, or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid commonly used for injections. As the aqueous liquid for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents and the like are used, and suitable solubilizing agents, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent. The prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule. A suppository for rectal administration may be prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
Compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like. Such compositions are prepared by known methods and may contain carriers, diluents or excipients commonly used in the field of formulation. As carriers and excipients for tablets, for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
The above-mentioned parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in dosage unit form so as to be compatible with the dosage of the active ingredient. Such dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories. The content of the antibody is usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, particularly preferably 5 to 100 mg for injection and 10 to 250 mg for other dosage forms.
The dose of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent or modulator containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, symptom, administration route and the like, but is used, for example, for the treatment and prevention of adult breast cancer. In some cases, the amount of the antibody of the present invention per dose is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, 1 to 5 times a day. It is convenient to administer by intravenous injection about once, preferably about once to three times a day. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased according to the symptoms.
The antibodies of the present invention can be administered as such or as a suitable pharmaceutical composition. The pharmaceutical composition used for the administration contains the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient. Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
Each of the above-mentioned compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the antibody.
Furthermore, the antibody of the present invention may be used for other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, Mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, vincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide and the like. The antibody of the present invention and the above agent may be administered to a patient at the same time or at different times.
（６）本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。
例えば、強力な抗原提示細胞（例、樹状細胞）を本発明のタンパク質存在下に培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
また、本発明のタンパク質は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど）、防腐剤（例、チメロサールなど）、無痛化剤（例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン（例、インターロイキン−２などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために本発明のタンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素）による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人（体重60kg）に皮下的に注射剤として投与する場合、1回当たり通常0.1〜300mg程度、好ましくは100〜300mg程度である。ワクチン製剤の投与回数は１回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約2週間〜約6ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を2〜4回投与することもできる。
(6) Medicine containing the protein of the present invention Since the protein of the present invention is overexpressed in cancer, the protein of the present invention can also be used as a cancer vaccine to activate the immune system of cancer patients. .
For example, so-called adoptive immunotherapy or the like, in which strong antigen-presenting cells (eg, dendritic cells) are cultured in the presence of the protein of the present invention, phagocytosed the protein, and then returned to the patient's body, can be preferably applied. . The dendritic cells returned into the body can kill cancer cells by inducing and activating cancer antigen-specific cytotoxic T cells.
In addition, the protein of the present invention can be used, for example, in cancers (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis) It can be safely administered to mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, pigs) as vaccine preparations for the prevention or treatment of cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumors, blood tumors, etc. it can.
The vaccine formulation usually contains the protein of the invention and a physiologically acceptable carrier. Examples of the carrier include liquid carriers such as water, saline (including physiological saline), buffers (eg, phosphate buffer), and alcohols (eg, ethanol).
The vaccine preparation can be prepared according to a usual method for producing a vaccine preparation.
Usually, the protein of the present invention is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier. In addition, the protein of the present invention and a physiologically acceptable carrier may be separately prepared, and they may be mixed and used at the time of use.
In the vaccine preparation, in addition to the protein of the present invention and a physiologically acceptable carrier, an adjuvant (eg, aluminum hydroxide gel, serum albumin, etc.), a preservative (eg, thimerosal, etc.), a soothing agent (eg, glucose) Benzyl alcohol). Further, in order to promote the production of an antibody against the protein of the present invention, for example, cytokines (eg, interleukins such as interleukin-2, interferons such as interferon-γ) may be further added.
When used as a vaccine preparation, the protein of the present invention may be used as an active form, but the protein of the present invention may be denatured to enhance antigenicity. Denaturation of the protein of the present invention is usually performed by heat treatment and treatment with a protein denaturant (eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea).
The resulting vaccine preparation has low toxicity, and may be usually administered as an injection, for example, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, or may be locally administered to or near a cancer cell mass.
The dose of the protein of the present invention varies depending on, for example, the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like. The dose is usually about 0.1 to 300 mg, preferably about 100 to 300 mg per time. The vaccine preparation may be administered once, but the vaccine preparation may be administered 2 to 4 times at intervals of about 2 weeks to about 6 months in order to increase antibody production.
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１)記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、***およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
(7) DNA-transferred animal The present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention) Is provided.
That is, the present invention
(1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
(2) the animal according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(3) The animal according to (2), wherein the rodent is a mouse or rat, and (4) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal. Things.
Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof (hereinafter abbreviated as the DNA-transferred animal of the present invention) can be used for non-fertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like. And preferably at the stage of embryonic development in non-human mammal development (more preferably at the stage of single cells or fertilized eggs and generally before the 8-cell stage), the calcium phosphate method, the electric pulse method, the lipofection method, the agglutination method, It can be produced by transferring a target DNA by a microinjection method, a particle gun method, a DEAE-dextran method, or the like. In addition, the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like by the DNA transfer method, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like. The DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the above-mentioned germ cells with a cell fusion method known per se.
As the non-human mammal, for example, cow, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, mouse, rat and the like are used. Among them, rodents, which are relatively short in ontogeny and biological cycle in terms of preparation of disease animal model systems, and are easy to breed, especially mice (for example, hybrids such as C57BL / 6 strain and DBA2 strain as pure strains) As a system, one B6C3F system, one BDF system, one B6D2F system, a BALB / c system, an ICR system, or the like, or a rat (for example, Wistar, SD, etc.) is preferable.
"Mammals" in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
The exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
As the mutant DNA of the present invention, those having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, base addition, deletion, substitution with another base, etc. The resulting DNA and the like are used, and also include abnormal DNA.
The abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
The exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest. In transferring the DNA of the present invention to a target animal, it is generally advantageous to use the DNA as a DNA construct linked downstream of a promoter capable of being expressed in animal cells. For example, when the human DNA of the present invention is transferred, DNA derived from various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) having the DNA of the present invention having high homology thereto is expressed. Highly expressing the DNA of the present invention by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) in which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters that can be made into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. DNA-transferring mammals can be created.
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（i）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子1α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
Examples of the expression vector of the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as λ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus. Are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
Examples of the promoter for controlling the DNA expression include, for example, (i) a promoter of a DNA derived from a virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.); ) Promoters derived from various mammals (human, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.), for example, albumin, insulin II, uroplakin II, elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acid Protein, glutathione S-transferase, platelet-derived growth factor β, keratins K1, K10 and K14, collagen type I and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase βI subunit, dystrophy Int, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase), neurofilament light chain, metallothionein I And IIA, metalloproteinase 1 tissue inhibitor, MHC class I antigen (H-2L), H-ras, renin, dopamine β-hydroxylase, thyroid peroxidase (TPO), peptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β Actin, α and β myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2, myelin basic protein, thyroglobulin, Thy-1, immunoglobulin, heavy chain variable region (VNP), serum amyloid P component, myoglobin, troponin C, smooth muscle α acti , Pre-pro-enkephalin A, such as a promoter, such as vasopressin is used. Among them, a cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the body, a human peptide chain elongation factor 1α (EF-1α) promoter, human and chicken β-actin promoters and the like are preferable.
The above vector preferably has a sequence that terminates transcription of a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally called a terminator). A simian virus SV40 terminator or the like is preferably used.
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
In addition, a splicing signal of each DNA, an enhancer region, a part of an intron of a eukaryotic DNA, and the like are placed 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or between the translation region for the purpose of further expressing the desired foreign DNA. It is also possible to connect 3 ′ downstream of the above depending on the purpose.
The normal translation region of the protein of the present invention can be obtained from liver, kidney, thyroid cells, fibroblast-derived DNA derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) and commercially available DNAs. From the various genomic DNA libraries described above, or as a starting material, a complementary DNA prepared by a known method from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts. In addition, a translation region obtained by mutating a translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by a point mutagenesis method can be used for the exogenous abnormal DNA.
The translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transposed animal by a conventional DNA engineering technique in which it is ligated downstream of the above-mentioned promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the progeny of the produced animal retain the exogenous DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells. means. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
The non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-carrying animal by confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in germ cells of a produced animal after DNA transfer means that all offspring of the produced animal have an excessive amount of the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. Means Progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
By obtaining a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes and mating the male and female animals, all offspring can be bred to have the DNA in excess.
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
The non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and eventually promotes the hyperactivity of the protein of the present invention by promoting the function of endogenous normal DNA. Occasionally, it can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
In addition, since the mammal into which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the free protein of the present invention, a prophylactic / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, for example, cancer (eg, Colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc. ) Can also be used for screening tests for prophylactic / therapeutic agents.
On the other hand, a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. Furthermore, the target foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material. The DNA construct with the promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. The progeny of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. A homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all progeny have the DNA.
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（i）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（v）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
The non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention, in which the abnormal DNA of the present invention is highly expressed, inhibits the function of the endogenous normal DNA, and finally the functionally inactive form of the protein of the present invention. It can be refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
Also, as a specific possibility, the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention can inhibit the abnormal protein of the present invention (dominant negative action) by the abnormal protein of the present invention in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. A model to elucidate.
In addition, since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the free protein of the present invention, a prophylactic / therapeutic agent for the protein of the present invention or a functionally inactive refractory disease, such as cancer ( For example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testis cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood It can also be used for screening tests for prophylactic / therapeutic agents such as tumors.
In addition, other possible uses of the above two kinds of DNA transgenic animals of the present invention include, for example,
(I) use as a cell source for tissue culture,
(Ii) A peptide specifically expressed or activated by the protein of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or analyzing a peptide tissue expressed by the DNA Analysis of the relationship with
(Iii) culturing cells of DNA-bearing tissue by standard tissue culture techniques and using them to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture;
(Iv) Screening of a drug that enhances the function of the cell by using the cell described in (iii) above, and (v) Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of an antibody thereof are conceivable.
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to examine clinical symptoms of a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. More detailed pathological findings in each organ of a disease model related to the disease can be obtained, which can contribute to the development of a new treatment method, and further to the research and treatment of a secondary disease caused by the disease.
In addition, it is possible to take out each organ from the DNA-transferred animal of the present invention, cut it into small pieces, and then use a protease such as trypsin to obtain the released DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells. . Furthermore, it is possible to identify the protein-producing cell of the present invention, examine its relevance to apoptosis, differentiation or proliferation, or investigate the signal transduction mechanism thereof, and investigate their abnormalities. It is an effective research material for
Further, in order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, using the DNA-transferred animal of the present invention, It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using a method or the like. In addition, using the transgenic animal of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a DNA treatment method for diseases associated with the protein of the present invention.
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
(8) Knockout Animal The present invention provides a non-human mammal embryonic stem cell in which the DNA of the present invention is inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
That is, the present invention
(1) a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated,
(2) the embryonic stem cell according to (1), wherein the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli);
(3) the embryonic stem cell according to (1), which is neomycin-resistant;
(4) the embryonic stem cell according to (1), wherein the non-human mammal is a rodent;
(5) The embryonic stem cell according to (4), wherein the rodent is a mouse,
(6) a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, wherein the DNA is inactivated;
(7) The DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a β-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention (6). The non-human mammal according to the item,
(8) the non-human mammal according to (6), wherein the non-human mammal is a rodent;
(9) Administering a test compound to the non-human mammal according to (8), wherein the rodent is a mouse, and (10) the animal according to (7), and detecting the expression of a reporter gene. And a method of screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention.
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
A non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is a DNA which is artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, or By substantially eliminating the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA does not substantially have the ability to express the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the knockout DNA of the present invention). ) Non-human mammal embryonic stem cells (hereinafter abbreviated as ES cells).
As the non-human mammal, the same one as described above is used.
The method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
Specific examples of the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated (hereinafter abbreviated as the DNA-inactivated ES cells of the present invention or the knockout ES cells of the present invention) include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal is isolated, and its exon portion is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene or a hygromycin resistance gene, or lacZ (β-galactosidase gene), cat (chloramphenicol acetyl). A reporter gene or the like typified by a transferase gene) to disrupt the exon function, or insert a DNA sequence that terminates gene transcription into an intron between exons (for example, a polyA addition signal); Inability to synthesize complete messenger RNA Thus, a DNA strand having a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the gene (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the resulting ES cells PCR using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe and a DNA sequence on a targeting vector and a DNA sequence in a neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector as a primer And selecting the knockout ES cells of the present invention.
As the ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like, for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. It may be a newly established one. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129-line ES cells are generally used. for example the purpose of acquiring the obvious ES cells, the BDF 1 mice (C57BL / 6 and DBA / 2 for the egg collection number of lack of C57BL / 6 mice and C57BL / 6 were improved by crossing with DBA / 2 Those established using F 1 ) can also be used favorably. BDF 1 mice are often egg number, and, in addition to the advantage that the egg is tough, since with C57BL / 6 mice in the background, when the ES cells obtained therefrom, which were generated pathological model mice , C57BL / 6 mice can be advantageously used in that their genetic background can be replaced with C57BL / 6 mice by backcrossing.
In addition, when ES cells are established, blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used. However, a large number of blastocysts can be efficiently obtained by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
Although either male or female ES cells may be used, male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（1〜10000 U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０.００１〜０.５％トリプシン／０.１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０.１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature、第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
As a method for determining the sex of ES cells, for example, a method of amplifying and detecting a gene in a sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be mentioned. Using this method, conventionally, for example G-banding method, requires about 10 6 cells for karyotype analysis, since suffices ES cell number of about 1 colony (about 50), culture The primary selection of ES cells in the early stage can be performed by discriminating between male and female, and the early stage of culture can be greatly reduced by enabling the selection of male cells at an early stage.
The secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method. The number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number. However, when it is difficult due to physical operations at the time of establishment, after knocking out the gene of the ES cells, the cells are knocked out of normal cells (for example, chromosomes in mice). It is desirable to clone again into cells (number 2n = 40).
The embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ontogenic ability. For example, on a suitable feeder cell such as STO fibroblast in the presence of LIF (1-10000 U / ml) in a carbon dioxide incubator (preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, % Carbon dioxide, 90% air) at about 37 ° C., and at the time of subculture, for example, trypsin / EDTA solution (usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA) (Preferably, about 0.1% trypsin / 1 mM EDTA), and the cells are seeded on freshly prepared feeder cells. Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and, if any morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
ES cells are differentiated into various types of cells, such as parietal muscle, visceral muscle, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions. [MJ Evans and MH Kaufman, Nature, 292, 154, 1981; GR Martin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al. Journal of Embryology and Experimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985], and the DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is a novel in vitro cell line. The proteins of the invention are useful in cell biological studies.
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
As the non-human mammal, those similar to the aforementioned can be used.
The non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is, for example, a DNA in which the targeting vector prepared as described above is introduced into mouse embryonic stem cells or mouse egg cells, and the DNA of the targeting vector is inactivated by the introduction. The DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination in which the sequence replaces the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by homologous recombination.
Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a DNA sequence on a Southern hybridization analysis or targeting vector using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the DNA of the present invention derived from the mouse used for the targeting vector. The determination can be made by analysis by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than DNA as a primer. When non-human mammalian embryonic stem cells are used, a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human mammalian cells. The chimeric embryo is injected into an animal embryo or a blastocyst, and the produced chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal. The produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
When a part of the germ cells of the chimeric animal has a mutated DNA locus of the present invention, all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color or the like. The individual thus obtained is usually an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, which is crossed with an individual with a heterozygous expression of the protein of the present invention, and homozygous expression of the protein of the present invention from their offspring. Defective individuals can be obtained.
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
When an egg cell is used, for example, a transgenic non-human mammal having a targeting vector introduced into a chromosome can be obtained by injecting a DNA solution into a nucleus of an egg by a microinjection method. Compared to mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
In this manner, the individual in which the DNA of the present invention has been knocked out can be bred in an ordinary breeding environment after confirming that the DNA has been knocked out in the animal individual obtained by mating.
Furthermore, the germline can be obtained and maintained in accordance with a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by breeding the mother animal in such a manner that there are one normal animal and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and subcultured.
The non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
In addition, since the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, a model of a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
(8a) Method of screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention The non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is deficient or damaged of the DNA of the present invention Can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on diseases caused by the disease.
That is, the present invention is characterized by administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and observing and measuring a change in the animal. Provided is a method for screening a compound having a therapeutic or preventive effect on a disease, for example, cancer, or a salt thereof.
Examples of the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include the same ones as described above.
Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma, and the like. These compounds are novel compounds. Or a known compound.
Specifically, a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with an untreated control animal, and tested using changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal as an index. The therapeutic / preventive effects of the compounds can be tested.
As a method of treating a test animal with a test compound, for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like. The dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
For example, cancer (eg, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, When screening for a compound having a therapeutic / preventive effect on brain tumors, blood tumors, etc., a test compound is administered to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and the difference between the non-test compound-administered group and the degree of onset of cancer is observed. And the degree of healing of the cancer are observed over time in the tissue.
In the screening method, when the test compound is administered to a test animal, if the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more, the test compound is administered. It can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above diseases.
The compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect on a disease caused by deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a drug for safe and low toxic prophylactic / therapeutic agents. Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
The compound obtained by the screening method may form a salt. Examples of the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally in an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patients, About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound is administered per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease and the like. For example, the compound is usually administered in the form of an injection to an adult (with a body weight of 60 kg) breast cancer patients. If so, it is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
(8b) Screening method for compound that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention The present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention, and detecting the expression of a reporter gene. The present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of a promoter for DNA of the present invention.
In the above-described screening method, the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is inactivated by introducing a reporter gene, A reporter gene that can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
Examples of the test compound include the same compounds as described above.
As the reporter gene, the same one as described above is used, and a β-galactosidase gene (lacZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
In a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention is replaced with a reporter gene, since the reporter gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention, the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced. By doing so, the activity of the promoter can be detected.
For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a β-galactosidase gene (lacZ) derived from Escherichia coli, a tissue that expresses the protein of the present invention should be used instead of the protein of the present invention. Β-galactosidase is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for β-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galactopyranoside (X-gal). Of the protein in an animal body can be observed. Specifically, the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with glutaraldehyde, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-gal at room temperature or around 37 ° C. After reacting for about 30 minutes to 1 hour, the β-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with a 1 mM EDTA / PBS solution, and coloration may be observed. Further, mRNA encoding lacZ may be detected according to a conventional method.
The compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned test compounds, and is a compound that promotes or inhibits the promoter activity for the DNA of the present invention.
The compound obtained by the screening method may form a salt, and the salt of the compound may be a salt with a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) or a base (eg, an alkali metal). Are used, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, For example, salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like are used.
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重60kgとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重60kgとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
The compound or a salt thereof that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention can inhibit the expression of the protein of the present invention and the function of the protein. Cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, thyroid cancer, pancreatic cancer, brain tumor, blood tumor, etc.) It is.
Furthermore, compounds derived from the compounds obtained by the above screening can be used in the same manner.
A drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
Since the preparation thus obtained is safe and low toxic, it can be used, for example, in humans or mammals (eg, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.). Can be administered.
The dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject to be administered, the administration route, and the like. In a breast cancer patient (as 60 kg), the compound is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg per day. When administered parenterally, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like. For example, the compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is usually administered in the form of an injection to an adult ( When administered to a breast cancer patient (with a body weight of 60 kg), it is advantageous to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound by intravenous injection per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the weight per 60 kg.
As described above, the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening for a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter for the DNA of the present invention, It can greatly contribute to the investigation of the cause of various diseases caused or the development of preventive / therapeutic agents.
Further, using a DNA containing the promoter region of the protein of the present invention, genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into egg cells of an animal to produce a so-called transgenic animal (gene-transferred animal). Once created, the protein can be specifically synthesized and its action in the living body can be examined. Furthermore, if a suitable reporter gene is bound to the above promoter portion, and a cell line that expresses the reporter gene is established, a low-molecular compound having an action of specifically promoting or suppressing the production ability of the protein itself of the present invention in the body. Can be used as a search system.
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ ：セレノシステイン（selenocysteine）
In the present specification, when bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations, they are based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below. When an amino acid can have an optical isomer, the L-form is indicated unless otherwise specified.
DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: thyronine : Methionine Glu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe Phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine pGlu: pyroglutamic acid Sec: selenocysteine (selenocysteine)
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Cl2-Bzl ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３,４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１,２,３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Further, substituents, protecting groups and reagents frequently used in the present specification are represented by the following symbols.
Me: methyl group Et: ethyl group Bu: butyl group Ph: phenyl group TC: thiazolidine-4 (R) -carboxamide group Tos: p-toluenesulfonyl CHO: formyl Bzl: benzyl
Cl 2 -Bzl: 2,6-dichlorobenzyl Bom: benzyloxymethyl Z: benzyloxycarbonyl Cl-Z: 2-chlorobenzyloxycarbonyl Br-Z: 2-bromobenzyloxycarbonyl Boc: t-butoxycarbonyl DNP: dinitro Phenyl Trt: Trityl Bum: t-butoxymethyl Fmoc: N-9-fluorenylmethoxycarbonyl HOBt: 1-hydroxybenztriazole HOOBT: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-
1,2,3-benzotriazine HONB: 1-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide DCC: N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＳＥＭＡ４Ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４ＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＳＥＭＡ４Ｂをコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
実施例２、実施例３、実施例１５および実施例１６で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
実施例２、実施例３、実施例１５および実施例１６で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
実施例３で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
実施例３で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例４、実施例６および実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例４および実施例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例８で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
実施例８で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
実施例８で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
実施例８で用いられたペプチド４のアミノ酸配列を示す。
後述の実施例４で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPOは、2003年3月4日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8316として寄託されている。
後述の実施例４で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPOは、2003年3月4日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8317として寄託されている。
後述の実施例４で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPOは、2003年3月4日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6（郵便番号305-8566）の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、寄託番号FERM BP-8318として寄託されている。
The sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
[SEQ ID NO: 1]
2 shows the amino acid sequence of SEMA4B.
[SEQ ID NO: 2]
This shows the base sequence of DNA encoding SEMA4B having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
[SEQ ID NO: 3]
The nucleotide sequence of a DNA containing the full-length gene encoding SEMA4B is shown.
[SEQ ID NO: 4]
2 shows the amino acid sequence of SEMA4B-M1.
[SEQ ID NO: 5]
This shows the base sequence of DNA encoding SEMA4B-M1 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
[SEQ ID NO: 6]
The nucleotide sequence of a DNA containing the full-length gene encoding SEMA4B-M1 is shown.
[SEQ ID NO: 7]
2 shows the amino acid sequence of SEMA4B-M2.
[SEQ ID NO: 8]
This shows the base sequence of DNA encoding SEMA4B-M2 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
[SEQ ID NO: 9]
The nucleotide sequence of the DNA containing the full-length gene encoding SEMA4B-M2 is shown.
[SEQ ID NO: 10]
2 shows the amino acid sequence of SEMA4B-M3.
[SEQ ID NO: 11]
This shows the base sequence of DNA encoding SEMA4B-M3 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
[SEQ ID NO: 12]
The nucleotide sequence of the DNA containing the full-length gene encoding SEMA4B-M3 is shown.
[SEQ ID NO: 13]
The base sequence of the antisense oligonucleotide used in Example 2, Example 3, Example 15 and Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 14]
The base sequence of the oligonucleotide used in Example 2, Example 3, Example 15 and Example 16 is shown.
[SEQ ID NO: 15]
4 shows the base sequence of the antisense oligonucleotide used in Example 3.
[SEQ ID NO: 16]
3 shows the base sequence of the oligonucleotide used in Example 3.
[SEQ ID NO: 17]
3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
[SEQ ID NO: 18]
3 shows the nucleotide sequence of a primer used in Example 3.
[SEQ ID NO: 19]
[Fig. 7] Fig. 7 shows base sequences of primers used in Examples 4, 6, and 7.
[SEQ ID NO: 20]
14 shows the base sequences of primers used in Examples 4 and 7.
[SEQ ID NO: 21]
14 shows the base sequence of a primer used in Example 6.
[SEQ ID NO: 22]
14 shows the amino acid sequence of peptide 1 used in Example 8.
[SEQ ID NO: 23]
14 shows the amino acid sequence of peptide 2 used in Example 8.
[SEQ ID NO: 24]
14 shows the amino acid sequence of peptide 3 used in Example 8.
[SEQ ID NO: 25]
14 shows the amino acid sequence of peptide 4 used in Example 8.
The transformant Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-M1 / pCR4-TOPO obtained in Example 4 described below has been used since March 4, 2003, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (zip code 305-8566). ) Has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8316.
The transformant Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-M2 / pCR4-TOPO obtained in Example 4 described below has been used since March 4, 2003, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (zip code 305-8566). ) Has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8317.
The transformant Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-M3 / pCR4-TOPO obtained in Example 4 described below has been used since March 4, 2003, 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Chuo No. 6 (zip code 305-8566). ) Has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8318.
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
遺伝子発現解析
肺がん組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、肺がん組織4例、正常肺組織5例から抽出されたtotal RNA（表１）を材料とし、oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Affymetrix社) を用いて遺伝子発現解析を行った。実験方法は、Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。
その結果、肺がん組織3例（lot.0011-192-01285、lot.0011-192-01293およびlot.0011-192-01297）において、Semaphorin 4B（SEMA4B）および後述の実施例４記載のSemaphorin 4B-M1（SEMA4B-M1）、Semaphorin 4B-M2（SEMA4B-M2）ならびにSemaphorin 4B-M3（SEMA4B-M3）遺伝子の発現亢進が検出された（表２）。
Example 1
Gene expression analysis To clarify the genes that are specifically upregulated in lung cancer tissues, total RNA (Table 1) extracted from 4 cases of lung cancer tissues and 5 cases of normal lung tissues was used as a material, and oligonucleotide microarray (Human Gene expression analysis was performed using Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E (Affymetrix). The experimental method was in accordance with the experimental manual (Expression analysis technical manual) of Affymetrix.
As a result, in three lung cancer tissues (lot.0011-192-01285, lot.0011-192-01293 and lot.0011-192-01297), Semaphorin 4B (SEMA4B) and Semaphorin 4B- described in Example 4 described later. Enhanced expression of the M1 (SEMA4B-M1), Semaphorin 4B-M2 (SEMA4B-M2) and Semaphorin 4B-M3 (SEMA4B-M3) genes was detected (Table 2).
実施例２
ヒト肺癌細胞株のアポトーシス誘発
SEMA4Bおよび後述の実施例４記載のSEMA4B-M1、SEMA4B-M2ならびにSEMA4B-M3遺伝子の発現を抑制することにより、ヒト肺がん細胞株のアポトーシスが誘発されるか否かを調べた。
まず、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）より購入したヒト非小細胞肺がん細胞株NCI-H1703を、RPMI-1640培地 (25mM HEPES含有) （Invitrogen社）に牛胎仔血清（ATCC）を10％加えた培地で懸濁し、1ウェル当たり1万個の細胞密度（培地液量0.1ml）で96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の3’非翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１３）を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、HPLC精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する）。コントロールとしては、配列番号：１３で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１４）を同様にphosphorothioate化し、HPLC精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する）。
Opti-MEM（Invitrogen社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Opti-MEM（Invitrogen社）で5倍に希釈し室温で5分間放置したオリゴフェクトアミン（Invitrogen社）と8:3の割合（容量比）で混合し、1ウェル当たり40μLの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は250nMとなるよう調整した。上記の条件で更に3日間培養した後、Cell Death Detection ELISAPLUSキット（Roche Diagnostics社）を用いて添付プロトコールに従い、上記の2種類のオリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）はコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）に比べて約1.6倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（P≦0.01）を示した（表３）。
Apoptosis induction of human lung cancer cell line
It was examined whether suppression of the expression of SEMA4B and the SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes described in Example 4 described below would induce apoptosis of a human lung cancer cell line.
First, a human non-small cell lung cancer cell line NCI-H1703 purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) was added to RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES) (Invitrogen) with 10% fetal bovine serum (ATCC). And seeded on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 10,000 cells per well (medium volume 0.1 ml). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides were transfected.
Specifically, an antisense oligonucleotide sequence that hybridizes to the 3 ′ untranslated region sequence of a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 10 ( After designing SEQ ID NO: 13), a phosphorothioated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC, and used for an introduction experiment (hereinafter, abbreviated as antisense oligonucleotide). As a control, the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used (hereinafter abbreviated as control oligonucleotide).
Antisense oligonucleotide or control oligonucleotide diluted with Opti-MEM (Invitrogen) was mixed with Oligofectamine (Invitrogen) 8: 3 diluted 5-fold with Opti-MEM (Invitrogen) and left at room temperature for 5 minutes. (Volume ratio) and added to the plate at a rate of 40 μL per well. The final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 250 nM. After further culturing for 3 days under the above conditions, the apoptosis-inducing activity of the above two kinds of oligonucleotides was measured using Cell Death Detection ELISA PLUS kit (Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
As a result, the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) showed about 1.6 times the apoptosis-inducing activity as compared to the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), showing a statistically significant difference (P ≦ 0.01). (Table 3).
実施例３
SEMA4Bアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現量の低下
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、SEMA4Bおよび後述の実施例４記載のSEMA4B-M1、SEMA4B-M2ならびにSEMA4B-M3遺伝子の発現量が低下するか否か調べた。
実施例２で用いたヒト非小細胞肺がん細胞株NCI-H1703を実施例２と同じ培地に懸濁し、1ウェル当たり6万個の細胞密度（培地液量0.6ml）で24穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種した。5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、実施例２の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、オリゴヌクレオチドの添加量は1ウェル当たり240μLとし、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして2種類（配列番号：１３および配列番号：１５）、コントロールオリゴヌクレオチドとして2種類（配列番号：１４および配列番号：１６）のオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号：１５および配列番号：１６に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドに関しては、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の3’非翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１５）を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、HPLC精製して導入実験に用いた。配列番号：１５で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１６）を同様にphosphorothioate化し、HPLC精製して用いた。
トランスフェクション後、5％炭酸ガス気流中、37℃で24時間培養を継続した後にRNeasy（登録商標）Mini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを抽出した。約300ngのトータルRNAを鋳型として、TaqMan Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。トータルRNAにして7〜9ngに相当するcDNAを鋳型とし、2種類のプライマー（配列番号：１７および配列番号：１８）とSYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems社）を用いてSEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2およびSEMA4B-M3遺伝子の発現コピー数を測定した。同量の鋳型cDNA中に含まれるβ-アクチン遺伝子発現量をTaqMan β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチド溶液の代わりに蒸留水を用いた場合（以下、非トランスフェクション群と略する）では、SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2およびSEMA4B-M3遺伝子発現量の総和はβ-アクチン遺伝子発現量の6.6％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３および配列番号：１５）投与群では0.98％および1.1％であり、統計学的に有意（P≦0.05）な遺伝子の発現量低下が認められた。
一方、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４および配列番号：１６）投与群では4.1％および3.4％であり、非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これより、SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2およびSEMA4B-M3遺伝子の発現抑制とアポトーシス誘導とは相関することがわかった。
Example 3
Reduction of Gene Expression Level by SEMA4B Antisense Oligonucleotide It was examined whether administration of the antisense oligonucleotide reduced the expression level of SEMA4B and SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes described in Example 4 described below. .
The human non-small cell lung cancer cell line NCI-H1703 used in Example 2 was suspended in the same medium as in Example 2, and a 24-well flat bottom tissue culture plate was prepared at a cell density of 60,000 cells / well (medium volume: 0.6 ml). (BD Falcon). After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides were transfected according to the method of Example 2. However, the addition amount of the oligonucleotide was 240 μL per well, and two kinds of antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) and two kinds of control oligonucleotides (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) Was used.
The antisense oligonucleotide and the control oligonucleotide derived from SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 have the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10. After designing an antisense oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 15) that hybridizes to the 3 ′ untranslated region sequence of the protein, a phosphorothioated oligonucleotide was synthesized, purified by HPLC, and used in a transfer experiment. The reverse sequence (SEQ ID NO: 16) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used.
After transfection, culturing was continued at 37 ° C. for 24 hours in a 5% carbon dioxide gas stream, and then total RNA was extracted using RNeasy (registered trademark) Mini Total RNA Kit (QIAGEN). Using about 300 ng of total RNA as a template, reverse transcription was performed using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol. Using cDNA corresponding to 7 to 9 ng of total RNA as a template, SEMA4B, SEMA4B-M1, SEMA4B-M1, using two types of primers (SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18) and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). The expression copy number of the SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes was measured. The expression amount of β-actin gene contained in the same amount of template cDNA was measured using TaqMan β-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
When distilled water was used in place of the oligonucleotide solution (hereinafter, abbreviated as a non-transfection group), the sum of SEMA4B, SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 gene expression amounts was β-actin gene expression amount. 6.6%, whereas the antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 15) administration groups were 0.98% and 1.1%, respectively, indicating statistically significant (P ≦ 0.05) gene expression. A decrease in the amount was observed.
On the other hand, in the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 16) administration groups, the expression levels were 4.1% and 3.4%, and no statistically significant decrease in the expression level was observed as compared with the non-transfection group.
From this, it was found that the suppression of the expression of the SEMA4B, SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes was correlated with the induction of apoptosis.
実施例４
SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2およびSEMA4B-M3をコードするcDNAのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株（A549）由来のMarathon-Ready cDNA（CLONTECH社）を鋳型とし、2種のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）を用いてPCR反応を行った。該反応液50μlは、1μlの上記cDNA、2.5U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）、各1.0μMのプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）、200μM dNTPs、および25μl 2x GC Buffer I（宝酒造社）を含む組成とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・1分、60℃・1分、72℃・4分を30サイクル繰り返し、さらに72℃・5分間伸長反応を行った。PCR反応産物の3’端にdATPを付加するため、5UのEx Taq DNA Polymerase（宝酒造社）を添加して72℃・7分間保温した。得られたPCR反応産物は、PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製した。これをTOPO TA PCRクローニングキット（Invitrogen社）の処方に従いプラスミドベクターpCR4-TOPO（Invitrogen社）へサブクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入後、アンピシリンを含むLB寒天培地中でcDNAを持つクローンを選択した。個々のクローンについて塩基配列を解析した結果、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、および配列番号：１１で表されるcDNAの塩基配列がそれぞれ得られた。
SEMA4B遺伝子（GeneBank Accession No. XM_044533遺伝子）の塩基配列の1〜237番目および2749〜3766番目の塩基配列を、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８および配列番号：１１で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列をそれぞれ配列番号：３、配列番号：６、配列番号：９および配列番号：１２に示す。
配列番号：２で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１）はSEMA4B遺伝子（GeneBank Accession No. XM_044533遺伝子）がコードするSEMA4Bタンパク質と完全に一致した。
配列番号：５で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：４）を含有するタンパク質をSEMA4B-M1、配列番号：８で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：７）を含有するタンパク質をSEMA4B-M2、配列番号：１１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１０）を含有するタンパク質をSEMA4B-M3とそれぞれ命名した。
SEMA4B-M1のアミノ酸配列（配列番号：４）は、SEMA4Bのアミノ酸配列（配列番号：１）の208番目のSerがIleに置換されている。
SEMA4B-M1をコードするDNAの塩基配列（配列番号：５）では、SEMA4BをコードするDNAの塩基配列（配列番号：２）の90番目のgがaに、111番目のgがaに、623番目のgがtにそれぞれ置換されており、623番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
SEMA4B-M2のアミノ酸配列（配列番号：７）は、SEMA4Bのアミノ酸配列（配列番号：１）の163番目のMetがIleに置換されている。
SEMA4B-M2をコードするDNAの塩基配列（配列番号：８）では、SEMA4BをコードするDNAの塩基配列（配列番号：２）の150番目のgがaに、489番目のgがaに、528番目のcがtに、1266番目のtがcに、1588番目のcがaに、2343番目のaがgにそれぞれ置換されており、489番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
SEMA4B-M3のアミノ酸配列（配列番号：１０）は、SEMA4Bのアミノ酸配列（配列番号：１）の364番目のLysがAsnに置換されている。
SEMA4B-M3をコードするDNAの塩基配列（配列番号：１１）では、SEMA4BをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）の1092番目のgがtに置換されており、アミノ酸置換を伴っている。
配列番号：２で表される塩基配列を有するDNAを有するプラスミドをSEMA4B/pCR4-TOPO、配列番号：５で表される塩基配列を有するDNAを有するプラスミドをSEMA4B-M1/pCR4-TOPO、配列番号：８で表される塩基配列を有するDNAを有するプラスミドをSEMA4B-M2/pCR4-TOPO、配列番号：１１で表される塩基配列を有するDNAを有するプラスミドをSEMA4B-M3/pCR4-TOPOとそれぞれ名付けた。
さらに、プラスミドSEMA4B/pCR4-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/SEMA4B/pCR4-TOPO、プラスミドSEMA4B-M1/pCR4-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/SEMA4B-M1/pCR4-TOPO、プラスミドSEMA4B-M2/pCR4-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/SEMA4B-M2/pCR4-TOPO、プラスミドSEMA4B-M3/pCR4-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/SEMA4B-M3/pCR4-TOPOとそれぞれ命名した。
Example 4
Cloning of cDNA encoding SEMA4B, SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 and determination of nucleotide sequence Using Marathon-Ready cDNA (CLONTECH) derived from human lung cancer cell line (A549) as a template, two primers ( PCR reaction was performed using SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). 50 μl of the reaction solution was composed of 1 μl of the above cDNA, 2.5 U PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), 1.0 μM each of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20), 200 μM dNTPs, and 25 μl 2x GC Buffer I (Takara Shuzo) Company). In the PCR reaction, 95 ° C. for 1 minute, 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 4 minutes were repeated 30 cycles, and an extension reaction was performed at 72 ° C. for 5 minutes. In order to add dATP to the 3 'end of the PCR reaction product, 5 U of Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo) was added and the mixture was kept at 72 ° C for 7 minutes. The obtained PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN). This was subcloned into a plasmid vector pCR4-TOPO (Invitrogen) according to the prescription of TOPO TA PCR Cloning Kit (Invitrogen). After introducing this into Escherichia coli TOP10, a clone having cDNA in LB agar medium containing ampicillin was selected. As a result of analyzing the nucleotide sequence of each clone, the nucleotide sequences of the cDNAs represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 11 were obtained.
The nucleotide sequences at positions 1-237 and 2749-3766 of the nucleotide sequence of the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. XM_044533 gene) are represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11. The nucleotide sequences added to the 5 'end and 3' end of the base sequence are shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 12, respectively.
The amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 completely matched the SEMA4B protein encoded by the SEMA4B gene (GeneBank Accession No. XM_044533 gene).
The protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is SEMA4B-M1, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 7) ) Was named SEMA4B-M2, and a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 was named SEMA4B-M3.
In the amino acid sequence of SEMA4B-M1 (SEQ ID NO: 4), Ser at position 208 in the amino acid sequence of SEMA4B (SEQ ID NO: 1) is substituted with Ile.
In the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B-M1 (SEQ ID NO: 5), the 90th g of the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B (SEQ ID NO: 2) corresponds to a, the 111th g corresponds to a, The gth is replaced by t, respectively, and the 623th substitution is accompanied by an amino acid substitution.
In the amino acid sequence of SEMA4B-M2 (SEQ ID NO: 7), Met at position 163 in the amino acid sequence of SEMA4B (SEQ ID NO: 1) is substituted with Ile.
In the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B-M2 (SEQ ID NO: 8), the 150th g of the DNA sequence (SEQ ID NO: 2) of the SEMA4B-encoding DNA (SEQ ID NO: 2) corresponds to a, the 489th g corresponds to a, The c-th is replaced by t, the 1266-th t is replaced by c, the 1588-th c is replaced by a, and the 2343-th a is replaced by g, and the 489th replacement is accompanied by an amino acid substitution.
In the amino acid sequence of SEMA4B-M3 (SEQ ID NO: 10), Lys at position 364 of the amino acid sequence of SEMA4B (SEQ ID NO: 1) is substituted with Asn.
In the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B-M3 (SEQ ID NO: 11), g at the 1092th position in the nucleotide sequence of the DNA encoding SEMA4B (SEQ ID NO: 2) has been replaced with t, and with the amino acid substitution I have.
A plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is SEMA4B / pCR4-TOPO, a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 is SEMA4B-M1 / pCR4-TOPO, SEQ ID NO: : A plasmid having a DNA having the nucleotide sequence represented by 8 is named SEMA4B-M2 / pCR4-TOPO, and a plasmid having the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 is named SEMA4B-M3 / pCR4-TOPO, respectively. Was.
Furthermore, the transformant in which the plasmid SEMA4B / pCR4-TOPO was introduced was Escherichia coli TOP10 / SEMA4B / pCR4-TOPO, and the transformant in which the plasmid SEMA4B-M1 / pCR4-TOPO was introduced was Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-M1 / Escherichia coli TOP10 / SEMA4B-M2 / pCR4-TOPO, a transformant in which plasmid SEMA4B-M2 / pCR4-TOPO was introduced, and a transformant in which plasmid SEMA4B-M3 / pCR4-TOPO was introduced, Escherichia coli They were named TOP10 / SEMA4B-M3 / pCR4-TOPO, respectively.
実施例５
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118 MG、U-87 MG、CCF-STTG1およびSW 1088；ヒト乳癌細胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7およびMDA-MB-231；ヒト大腸癌細胞株Caco-2、COLO201、COLO 205、COLO 320DM、HCT-8、HT-29、LoVo、LS123、SNU-C1、SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW480、SW 620、SW 837およびSW 948；ヒト胎児腎臓細胞株HEK293；ヒト小細胞肺癌細胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H2227、NCI-N417およびSHP-77；ヒト非小細胞肺癌細胞株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1417、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H1963、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342およびNCI-H2347；ヒト卵巣癌細胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIH:OVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112DおよびTOV-21G；ヒト膵臓癌細胞株PANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、Capan-1およびCapan-2；ヒト前立腺癌細胞株DU145；ヒト網膜芽腫細胞株WERI-Rb-1およびY79；ヒト精巣癌細胞株Cates-1Bの86株は、ATCCより購入した。ヒト正常気道上皮細胞SAECおよびヒト正常前立腺上皮細胞HPrECは、Clonetics社より購入した。ヒト大腸癌細胞株COCM1、ヒト非小細胞肺癌細胞株VMRC-LCDおよびヒト前立腺癌細胞株PC3は、JCRBより購入した。これら細胞株は実施例９以降の実施例でも用いることがある。
上記細胞株91株よりRNeasy Mini Total RNA Kit（QIAGEN社）を用いてトータルRNAを調製した。このトータルRNAを鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写反応でcDNAを調製し、定量的PCR反応を行うことにより、SEMA4B遺伝子（配列番号：２）、SEMA4B-M1遺伝子（配列番号：５）、SEMA4B-M2遺伝子（配列番号：８）およびSEMA4B-M3遺伝子（配列番号：１１）の発現量を検討した。
該PCR反応は、上記トータルRNA 3〜4ngより得られたcDNAを鋳型として使用し、実施例３と同一条件でPCR反応を行い、SEMA4B、SEMA4B-M1、SEMA4B-M2およびSEMA4B-M3遺伝子の発現コピー数を算出した。並行してTaqManTMHuman β-actin Control Reagents（Applied Biosystems社）を用いて上記トータルRNA 1 ngに含まれるβ-アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、β-アクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現率を表４および表５に示す。
上記遺伝子発現量の総量がβ-アクチン遺伝子発現量の1％を超える癌細胞株が17株見出され、上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
Examination of gene expression level in human cultured cell lines Brain tumor cell lines SK-N-MC, SK-N-AS, SK-N-BE, SK-N-DZ, SK-N-FI, SK- N-SH, D341Med, Daoy, DBTRG-05MG, U-118 MG, U-87 MG, CCF-STTG1 and SW 1088; human breast cancer cell lines HCC1937, ZR-75-1, AU565, MCF-7 and MDA-MB -231; human colon cancer cell lines Caco-2, COLO201, COLO 205, COLO 320DM, HCT-8, HT-29, LoVo, LS123, SNU-C1, SK-CO-1, SW403, SW48, SW480, SW620, SW837 and SW948; human fetal kidney cell line HEK293; human small cell lung cancer cell line NCI-H187, NCI-H378, NCI-H526, NCI-H889, NCI-H1672, NCI-H1836, NCI-H2227, NCI-N417 and SHP-77; human non-small cell lung cancer cell lines A549, NCI-H23, NCI-H226, NCI-H358, NCI-H460, NCI-H522, NCI-H661, NCI-H810, NCI-H1155, NCI -H1299, NCI-H1395, NCI-H1417, NCI-H1435, NCI-H1581, NCI-H1651, NCI-H1703, NCI-H1793, NCI-H1963, NCI-H2073, NCI-H2085, NCI-H2106, NCI-H2228 , NCI-H2342 and NCI-H2347; human ovarian cancer cells Strains ES-2, Caov-3, MDAH2774, NIH: OVCAR3, OV-90, SK-OV-3, TOV-112D and TOV-21G; human pancreatic cancer cell lines PANC-1, MIA-PaCa-2, AsPC- 1, BxPC-3, Capan-1 and Capan-2; human prostate cancer cell line DU145; human retinoblastoma cell lines WERI-Rb-1 and Y79; 86 human testis cancer cell lines Cates-1B are from ATCC Purchased. Human normal airway epithelial cells SAEC and human normal prostate epithelial cells HPrEC were purchased from Clonetics. Human colon cancer cell line COCM1, human non-small cell lung cancer cell line VMRC-LCD and human prostate cancer cell line PC3 were purchased from JCRB. These cell lines may be used in Examples 9 and thereafter.
Total RNA was prepared from the above 91 cell lines using the RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN). Using this total RNA as a template, a cDNA is prepared by a reverse transcription reaction using random primers, and a quantitative PCR reaction is performed to obtain a SEMA4B gene (SEQ ID NO: 2), a SEMA4B-M1 gene (SEQ ID NO: 5), a SEMA4B The expression levels of -M2 gene (SEQ ID NO: 8) and SEMA4B-M3 gene (SEQ ID NO: 11) were examined.
The PCR reaction was carried out under the same conditions as in Example 3, using the cDNA obtained from 3 to 4 ng of the total RNA as a template, and expressing the SEMA4B, SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 genes. The number of copies was calculated. In parallel, the copy number of the β-actin gene contained in 1 ng of the total RNA was calculated using TaqMan ™ Human β-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
Tables 4 and 5 show relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the entire gene with the β-actin gene expression level.
Seventeen cancer cell lines in which the total amount of the gene expression exceeded 1% of the β-actin gene expression amount were found, and high expression of the gene in the cancer cell lines was confirmed.
実施例６
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
実施例４で得たプラスミドSEMA4B/pCR4-TOPOを鋳型とし、PCRでSEMA4B遺伝子を増幅した。該反応における反応液の組成はSEMA4B/pCR4-TOPO 2ngを鋳型として使用し、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase（STRATAGENE社）を2.5U、2種類のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２１）を各1μM、dNTPsを200μM、および10ｘ Pfu Bufferを5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・1分、60℃・1分、72℃・4分のサイクルを25回繰り返し行った。次にPCR Purification Kit（QIAGEN社）にて該PCR反応産物を精製した後、制限酵素XbaＩおよびEco RIにて処理した。プラスミドp3xFLAG-CMV-14（Sigma社）もXbaＩおよびEco RIにて処理した。それぞれのDNA断片はPCR Purification Kitにて精製し、DNA Ligation Kit ver.2（Takara Bio社）を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を大腸菌TOP10に導入した後、形質転換された大腸菌をアンピシリンを含むLB寒天培地中で選択し個々のクローンを解析した結果、SEMA4B遺伝子（配列番号：２）に相当するcDNA断片を含むプラスミドpCMV-14- SEMA4Bを得た。
Example 6
Construction of Expression Vector for Recombinant Full-Length Protein for Animal Cells Using the plasmid SEMA4B / pCR4-TOPO obtained in Example 4 as a template, the SEMA4B gene was amplified by PCR. In the reaction, the composition of the reaction solution was such that 2 ng of SEMA4B / pCR4-TOPO was used as a template, 2.5 U of Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (STRATAGENE), and two types of primers (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21). 1 μM, 200 μM of dNTPs, and 5 μl of 10 × Pfu Buffer were added to make a liquid volume of 50 μl. In the PCR reaction, a cycle of 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 1 minute, 60 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 4 minutes was repeated 25 times. Next, the PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN) and then treated with restriction enzymes XbaI and EcoRI. Plasmid p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) was also treated with XbaI and EcoRI. Each DNA fragment was purified using a PCR Purification Kit, and a ligation reaction was performed using a DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio). After introducing the ligation reaction solution into E. coli TOP10, the transformed E. coli was selected on LB agar medium containing ampicillin, and each clone was analyzed. As a result, it contained a cDNA fragment corresponding to the SEMA4B gene (SEQ ID NO: 2). The plasmid pCMV-14-SEMA4B was obtained.
実施例７
組換え型タグ付き完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
SEMA4Bタンパク質のC末端に3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。SEMA4B遺伝子をPCRで増幅する時に用いるプライマーペアを、別のプライマーペア（配列番号：１９および配列番号：２０）に変更したこと以外は実施例６記載の方法に従い、形質転換した大腸菌の選別を行った。その結果、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）のＣ末端に3xFLAGタグが融合したタンパク質をコードするcDNA断片を含むプラスミドpCMV-14-SEMA4B-3xFLAGを得た。
Example 7
Construction of animal cell expression vector for recombinant-tagged full-length protein
An expression vector for animal cells expressing a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-terminal of the SEMA4B protein was constructed. The transformed Escherichia coli was selected according to the method described in Example 6 except that the primer pair used when amplifying the SEMA4B gene by PCR was changed to another primer pair (SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20). Was. As a result, a plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG containing a cDNA fragment encoding a protein in which a 3xFLAG tag was fused to the C-terminal of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was obtained.
実施例８
ペプチド抗体の作製と精製
SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）、SEMA4B-M1タンパク質（配列番号：４）、SEMA4B-M2タンパク質（配列番号：７）およびSEMA4B-M3タンパク質（配列番号：１０）のアミノ酸配列に基づき、12〜15アミノ酸からなる以下の4種のペプチド（ペプチド１〜４）をFmoc固相合成法により合成した。
ペプチド１のアミノ酸配列〔Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-Ile-Asn-Ser-Ser-Cys（配列番号：２２）〕は、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）の402番目から412番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド２のアミノ酸配列〔Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-Phe-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys（配列番号：２３）〕のアミノ酸配列は、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）の582番目から596番目までの配列である。
ペプチド３のアミノ酸配列〔Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys（配列番号：２４）〕は、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）の781番目から794番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド４のアミノ酸配列〔Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys（配列番号：２５）〕は、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）の797番目から809番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
上記ペプチド１、ペプチド２、ぺプチド３およびペプチド４のそれぞれのペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）をキャリアータンパク質として結合させ抗原とし、以下のように、ウサギポリクローナル抗体を作製した。
免疫動物は雄性ウサギKBL:JW（11週齢、オリエンタル酵母）一羽を用い、初回感作は完全フロインドアジュバンド（Difco社）懸濁液、2回目以降は不完全フロインドアジュバンド（Difco社）懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い、１回の感作には各抗原0.5mgを用い、初回感作後14日毎に3回繰り返した。初回感作後52日目に麻酔下頚動脈採血を行い、血清約50mlを得た。このようにして得られた血清を硫酸アンモニウム塩析法により濃縮し、得られた粗IgG画分全量をプロテインAアフィニティーカラム（Amersham-Bioscience社）により精製し、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３またはペプチド４を免疫したウサギから、それぞれ約103mg、約76mg、約112mgおよび約122mgの精製IgGを得た。さらに、各々の免疫源ペプチドを固定化したカラムに結合するIgG画分を取得した。固定化には各ペプチドのＣ末端のCysを利用し、ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム（Amersham-Bioscience社）にカップリングした。カラムからの溶出には8M尿素／リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いた。溶出液をPBSに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４に対するアフィニティー精製抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591およびAS-2592を、約15mg、約126mg、約17mgおよび約35mgずつ取得した。
Example 8
Preparation and purification of peptide antibodies
Based on the amino acid sequences of SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1), SEMA4B-M1 protein (SEQ ID NO: 4), SEMA4B-M2 protein (SEQ ID NO: 7) and SEMA4B-M3 protein (SEQ ID NO: 10), 12-15 The following four kinds of peptides consisting of amino acids (peptides 1 to 4) were synthesized by the Fmoc solid phase synthesis method.
The amino acid sequence of peptide 1 [Asn-Ser-Ala-Arg-Glu-Arg-Lys-Ile-Asn-Ser-Ser-Cys (SEQ ID NO: 22)] is from the 402nd position of SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1). This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence up to the 412th position.
The amino acid sequence of peptide 2 [Ser-Val-Val-Ser-Pro-Ser-Phe-Val-Pro-Thr-Gly-Glu-Lys-Pro-Cys (SEQ ID NO: 23)] is the SEMA4B protein ( This is a sequence from the 582th position to the 596th position in SEQ ID NO: 1).
The amino acid sequence of peptide 3 [Pro-Leu-Asp-His-Arg-Gly-Tyr-Gln-Ser-Leu-Ser-Asp-Ser-Pro-Cys (SEQ ID NO: 24)] is a SEMA4B protein (SEQ ID NO: 24). This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence from the 781th position to the 794th position in 1).
The amino acid sequence of peptide 4 [Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Glu-Ser-Glu-Lys-Arg-Pro-Leu-Ser-Cys (SEQ ID NO: 25)] is a SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1). This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence from the 797th position to the 809th position.
Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was bound as a carrier protein to each of peptide 1, peptide 2, peptide 3 and peptide 4 as an antigen to prepare a rabbit polyclonal antibody as follows.
One male rabbit KBL: JW (11-week-old, Oriental yeast) was used as the immunized animal, and the first sensitization was performed with a complete Freund's adjuvant (Difco) suspension. The suspension was used. The sensitization was performed by subcutaneous injection in the back, and 0.5 mg of each antigen was used for one sensitization, and the sensitization was repeated three times every 14 days after the first sensitization. On the 52nd day after the first sensitization, blood was collected from the carotid artery under anesthesia to obtain about 50 ml of serum. The serum thus obtained was concentrated by ammonium sulfate salting-out method, and the entire amount of the obtained crude IgG fraction was purified by a protein A affinity column (Amersham-Bioscience) to obtain peptide 1, peptide 2, peptide 3, or peptide 3. About 103 mg, about 76 mg, about 112 mg, and about 122 mg of purified IgG were obtained from rabbits immunized with No. 4 respectively. Furthermore, an IgG fraction that binds to the column on which each immunogenic peptide was immobilized was obtained. For immobilization, Cys at the C-terminus of each peptide was used and coupled to a Sepharose column (Amersham-Bioscience) using a borate buffer. For elution from the column, 8M urea / phosphate buffered saline (PBS) was used. The eluate was dialyzed against PBS to remove urea, then ultra-concentrated, and sterilized by filtration with a filter to obtain affinity-purified antibodies AS-2531, AS-2532, and Peptide 1, Peptide 2, Peptide 3, and Peptide 4. AS-2591 and AS-2592 were obtained in about 15 mg, about 126 mg, about 17 mg and about 35 mg, respectively.
実施例９
ウサギペプチド抗体を用いたウエスタンブロッティング
SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）の検出は、実施例８で作製した精製ペプチド抗体を用いて行った。ヒト非小細胞肺癌由来NCI-H358細胞1.5×106個を10％牛胎仔血清（JRH社）を含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）10 mlに懸濁し、直径10cmのぺトリディッシュに播種した。5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した。実施例６で作製したプラスミドpCMV-14- SEMA4B 6μg とPlus試薬（Invitrogen社）およびOPTI-MEM I（Invitrogen社）とを混合し、室温で15分間放置した後、LipofectAMINEトランスフェクション試薬（Invitrogen社）およびOPTI-MEM Iを添加し、さらに室温で15分間放置した。この混合液を培養液に滴下して培養を継続した。発現プラスミド導入2日後に細胞を氷冷したPBSで洗浄し、氷冷したRIPA緩衝液〔50mMトリス・塩酸緩衝液、pH 7.5、150 mM 塩化ナトリウム、1％Triton X-100、0.1％SDS、1％デオキシコール酸、CompleteTMタブレット（Roche Diagnostics社）、Phosphatase Inhibitor Cocktail-2（Sigma社）〕1mlを添加し4℃で30分間放置した。このRIPA緩衝液を回収し、15,000rpmで20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液および2倍濃度SDS-PAGE用サンプルバッファー〔125mM トリス・塩酸緩衝液、pH6.8、40％グリセロール、4％SDS、0.04％ブロモフェノールブルーおよび5％ 2-メルカプトエタノール〕を等容量で混合し、95℃で5分間加熱した後、10μlを10％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットP膜（ATTO社）に転写した後、ブロッキング溶液〔50mMトリス・塩酸緩衝液、pH 7.5、500 mM 塩化ナトリウム、0.1％ Tween 20、5％スキムミルク〕中に１時間室温放置した。次に、実施例８で作製したペプチド抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591またはAS-2592を、3μg/mlの濃度となるようブロッキング溶液で希釈し、4℃にて一晩反応させた。続いて、ブロッキング溶液で5万倍または10万倍に希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体（Amersham-Bioscience社）中で１時間室温放置した。検出にはECL plus（Amersham-Bioscience社）を用い、添付プロトコールに従いSEMA4Bタンパク質を検出した。
AS-2531を除き、AS-2532、AS-2591およびAS-2592のいずれを用いた場合でも、分子量100kD近傍の位置にSEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
Example 9
Western blotting using rabbit peptide antibody
Detection of the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was performed using the purified peptide antibody prepared in Example 8. 1.5 × 10 6 NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer were suspended in 10 ml of RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and seeded on a 10 cm diameter Petri dish. . The cells were cultured overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream. After mixing 6 μg of the plasmid pCMV-14-SEMA4B prepared in Example 6, Plus reagent (Invitrogen) and OPTI-MEM I (Invitrogen), and leaving it to stand at room temperature for 15 minutes, LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) And OPTI-MEM I were added, and further left at room temperature for 15 minutes. This mixture was dropped into the culture solution to continue the culture. Two days after the introduction of the expression plasmid, the cells were washed with ice-cooled PBS, and ice-cooled RIPA buffer [50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% % Deoxycholic acid, Complete ™ tablet (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail-2 (Sigma)] (1 ml) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C for 30 minutes. The RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract. This cell-free extract and a sample buffer for double concentration SDS-PAGE [125 mM Tris / HCl buffer, pH 6.8, 40% glycerol, 4% SDS, 0.04% bromophenol blue and 5% 2-mercaptoethanol] etc. After mixing in a volume and heating at 95 ° C. for 5 minutes, 10 μl was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. The proteins separated by electrophoresis were transferred to a clear blot P membrane (ATTO) according to a conventional method, and then transferred to a blocking solution [50 mM Tris / HCl buffer, pH 7.5, 500 mM sodium chloride, 0.1% Tween 20, 5% skim milk]. For 1 hour at room temperature. Next, the peptide antibody AS-2531, AS-2532, AS-2591 or AS-2592 prepared in Example 8 was diluted with a blocking solution to a concentration of 3 μg / ml, and reacted at 4 ° C. overnight. Was. Subsequently, it was left at room temperature for 1 hour in an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (Amersham-Bioscience) diluted 50,000-fold or 100,000-fold with a blocking solution. For detection, SEMA4B protein was detected using ECL plus (Amersham-Bioscience) according to the attached protocol.
Except for AS-2531, when using any of AS-2532, AS-2591 and AS-2592, a specific band derived from the SEMA4B protein was observed at a position near the molecular weight of 100 kD.
実施例１０
ウサギペプチド抗体を用いた免疫沈降
実施例８で作製した精製ペプチド抗体を用いて、SEMA4Bタンパク質の免疫沈降を非変性状態にて行った。
実施例７で得たプラスミドpCMV-14-SEMA4B-3xFLAGを用いて、実施例９と同様の操作で無細胞抽出液を調製した。Protein G-Sepharose 4FF（Amersham-Bioscience社）を等容量のRIPA緩衝液で懸濁した懸濁液50μlに無細胞抽出液400μlを加え、さらに実施例８記載のペプチド抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591またはAS-2592のいずれか一つを5μg加えた混合液を調製し、4℃にて一晩撹拌した。Protein G-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、50μl のSDS-PAGE用サンプルバッファー〔62.5mM トリス・塩酸緩衝液、pH6.8、20％グリセロール、2％SDS、0.02％ブロモフェノールブルーおよび2.5％２-メルカプトエタノール〕に懸濁し、95℃で5分間加熱した後、5μlまたは10μlを10％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。検出は実施例９記載の方法に準拠した。但し、マウス抗FLAG M2抗体（Sigma社）をブロッキング溶液で0.2μg/mlまたは0.1μg/mlとなるように希釈したものを一次抗体として、HRP標識抗マウスIgG抗体（Amersham- Bioscience社）をブロッキング溶液で2.5万倍または5万倍に希釈したものを二次抗体として用いた。
ペプチド抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591およびAS-2592のいずれを用いて免疫沈降を行った場合にも、分子量100kD近傍にSEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、ペプチド抗体AS-2531、AS-2532、AS-2591およびAS-2592は、未変性のSEMA4Bタンパク質と結合することが明らかとなった。
Example 10
Immunoprecipitation Using Rabbit Peptide Antibody Using the purified peptide antibody prepared in Example 8, immunoprecipitation of SEMA4B protein was performed in a non-denaturing state.
Using the plasmid pCMV-14-SEMA4B-3xFLAG obtained in Example 7, a cell-free extract was prepared in the same manner as in Example 9. To 50 μl of a suspension of Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) in an equal volume of RIPA buffer was added 400 μl of a cell-free extract, and the peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 described in Example 8 were further added. , AS-2591 or AS-2592 was added to the mixture, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. After washing the protein G-Sepharose 4FF coprecipitate fraction with RIPA buffer, 50 μl of SDS-PAGE sample buffer [62.5 mM Tris / HCl buffer, pH 6.8, 20% glycerol, 2% SDS, 0.02% Phenol blue and 2.5% 2-mercaptoethanol], and heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 5 μl or 10 μl was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. Detection was based on the method described in Example 9. However, HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham-Bioscience) was blocked by diluting mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) at 0.2 μg / ml or 0.1 μg / ml with a blocking solution as a primary antibody. Those diluted 25,000 times or 50,000 times with the solution were used as secondary antibodies.
When immunoprecipitation was performed using any of the peptide antibodies AS-2531, AS-2532, AS-2591 and AS-2592, a specific band derived from the SEMA4B protein was observed at a molecular weight of around 100 kD.
This revealed that peptide antibodies AS-2531, AS-2532, AS-2591 and AS-2592 bind to native SEMA4B protein.
実施例１１
癌細胞株におけるSEMA4Bタンパク質の発現検討
肺癌細胞株NCI-H2228、NCI-H1651、NCI-H358、NCI-H23ならびにNCI-H1703；卵巣癌細胞株SKOV-3ならびにTOV-21G；前立腺癌細胞株DU145；および膵癌細胞株PANC-1を、直径10cmのぺトリディッシュ2枚で培養した。各々の細胞についてペトリディッシュ1枚分をトリプシン・EDTA（Invitrogen社）で分散し、細胞数を計測した。計測した細胞数を基にして、5×106個の細胞に対して１mlの割合で氷冷RIPA緩衝液（実施例９に記載）を残りのペトリディッシュ1枚に添加し、4℃で30分間放置した。このRIPA緩衝液を回収し、15,000rpmで20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。一方、SizeTMX ProteinG Immunoprecipitation Kit（Pierce社）の添付プロトコールに従い実施例８記載のペプチド抗体AS-2531をProteinG-Sepharose 4FF（Amersham-Bioscience社）に架橋した樹脂を用意し、等容量のRIPA緩衝液で懸濁した。この懸濁液30μlに前述の無細胞抽出液400μlを加え、4℃にて一晩撹拌を行った。ProteinG-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、実施例１０記載のSDS-PAGE用サンプルバッファー30μlに懸濁し95℃で5分間加熱した後、20μlを10％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。検出はペプチド抗体AS-2532を用いて実施例９記載の方法に準じて行った。
上記9種類の細胞株の中で、NCI-H2228、NCI-H358、NCI-H23、SKOV-3、DU145およびPANC-1の各細胞株において、分子量100kD近傍に、SEMA4Bタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。これより、SEMA4Bタンパク質が、上記6種類の癌細胞株で高発現していることが明らかとなった。
Example 11
Examination of SEMA4B protein expression in cancer cell lines Lung cancer cell lines NCI-H2228, NCI-H1651, NCI-H358, NCI-H23 and NCI-H1703; Ovarian cancer cell lines SKOV-3 and TOV-21G; Prostate cancer cell line DU145; And the pancreatic cancer cell line PANC-1 was cultured in two Petri dishes having a diameter of 10 cm. One petri dish of each cell was dispersed with trypsin / EDTA (Invitrogen), and the number of cells was counted. Based on the counted cell number, 1 ml of ice-cold RIPA buffer (described in Example 9) was added to the remaining one petri dish at 5 × 10 6 cells. Let stand for minutes. The RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract. On the other hand, according to the protocol attached to the Size ™ X Protein G Immunoprecipitation Kit (Pierce), a resin in which the peptide antibody AS-2531 described in Example 8 was cross-linked to Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) was prepared, and an equal volume of RIPA buffer was prepared. The liquid was suspended. To 30 μl of this suspension was added 400 μl of the cell-free extract described above, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. The ProteinG-Sepharose 4FF co-precipitated fraction was washed with RIPA buffer, suspended in 30 μl of the sample buffer for SDS-PAGE described in Example 10, heated at 95 ° C. for 5 minutes, and then 20 μl of SDS on a 10% acrylamide gel. -PAGE. Detection was carried out using peptide antibody AS-2532 according to the method described in Example 9.
Among the above nine cell lines, NCI-H2228, NCI-H358, NCI-H23, SKOV-3, DU145 and PANC-1 each have a molecular weight of around 100 kD, specific to the SEMA4B protein. A band was observed. This revealed that the SEMA4B protein was highly expressed in the above six types of cancer cell lines.
実施例１２
組換え型完全長タンパク質安定発現細胞株の樹立
ヒト非小細胞肺がん由来NCI-H358細胞2.0×105個を10％牛胎仔血清（JRH社）、1mMピルビン酸ナトリウムおよび25mM HEPESを含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）2 mlに懸濁し、6ウェルプレートに播種した後、5％炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した。一方、OPTI-MEM I（Invitrogen社）で希釈した実施例６記載のプラスミドpCMV-14-SEMA4B 1μgをPlus試薬（Invitrogen社）6μlと混合し室温で15分間放置した後、OPTI-MEM I で希釈したLipofectAMINEトランスフェクション試薬（Invitrogen社）4μlを添加し、さらに室温で15分間放置した。この混合液を培養液に滴下してさらに１日培養を継続した後、トリプシン・EDTA（Invitrogen社）で細胞を分散し、上記の培養培地にG418（プロメガ社）を400μg/mlとなるように加えた培地で10倍に希釈して24ウェルプレートに播種した。3日または4日ごとにG418を含む上記培地（G418選択培地）を交換しながら5％炭酸ガス気流下、37℃で培養を継続した。1個〜3個の細胞が増殖しコロニーを形成したウェルから細胞を回収し、48ウェルプレートの2ウェルに等しく播種した。細胞密度が50％以上になるまで培養を継続した後、1ウェル分の細胞に実施例１０記載のSDS-PAGE用サンプルバッファー 50μlを加え、細胞溶解液を調製した。95℃で5分間加熱処理した後、5μlを10％アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。実施例９で記載した方法に準じ、ペプチド抗体AS-2532を用いてウエスタンブロッティングを行い、SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）を構成的に発現する安定発現細胞を探索した。もう一方のウェルから回収した細胞を、１ウェルあたり0.7個となるように希釈後、96ウェルプレートに播種した。G418選択培地を3日あるいは4日ごとに交換しながら細胞密度が50％程度になるまで、5％炭酸ガス気流下、37℃で培養を継続した。再び、48ウェルプレートの2ウェルに等しく播種し、細胞密度が50％以上になるまで培養を継続し、１ウェル分の細胞から調製した細胞溶解液を用いて、上記と同様にウエスタンブロッティングを行った。SEMA4Bタンパク質（配列番号：１）を最も高発現するクローンを選び、SEMA4B安定発現細胞株SEMA4B/H358を得た。
Example 12
Establishment of a recombinant full-length protein stable expression cell line 2.0 × 10 5 NCI-H358 cells derived from human non-small cell lung cancer RPMI-1640 containing 10% fetal calf serum (JRH), 1 mM sodium pyruvate and 25 mM HEPES The cells were suspended in 2 ml of a medium (Invitrogen), seeded in a 6-well plate, and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. On the other hand, 1 μg of the plasmid pCMV-14-SEMA4B described in Example 6 diluted with OPTI-MEM I (Invitrogen) was mixed with 6 μl of Plus reagent (Invitrogen), allowed to stand at room temperature for 15 minutes, and then diluted with OPTI-MEM I. 4 μl of the thus obtained LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) was added, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes. This mixture was added dropwise to the culture, and the culture was further continued for one day. Then, the cells were dispersed with trypsin / EDTA (Invitrogen), and G418 (Promega) was added to the culture medium at 400 μg / ml. After dilution 10-fold with the added medium, the cells were seeded on a 24-well plate. The culture was continued at 37 ° C. under a 5% carbon dioxide gas flow while replacing the medium containing G418 (G418 selective medium) every 3 or 4 days. Cells were harvested from wells where 1-3 cells grew and formed colonies, and were equally seeded on two wells of a 48-well plate. After culturing was continued until the cell density became 50% or more, 50 μl of the sample buffer for SDS-PAGE described in Example 10 was added to one well of cells to prepare a cell lysate. After heat treatment at 95 ° C. for 5 minutes, 5 μl was subjected to SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel. According to the method described in Example 9, Western blotting was performed using the peptide antibody AS-2532 to search for stable expression cells that constitutively express the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1). The cells collected from the other well were diluted to 0.7 cells per well, and then seeded on a 96-well plate. The culture was continued at 37 ° C. under a 5% carbon dioxide gas flow while changing the G418 selection medium every 3 or 4 days until the cell density reached about 50%. Again, seed the cells equally in two wells of a 48-well plate, continue culturing until the cell density becomes 50% or more, and perform Western blotting in the same manner as described above using a cell lysate prepared from cells in one well. Was. A clone that highly expressed the SEMA4B protein (SEQ ID NO: 1) was selected to obtain a SEMA4B stable expression cell line SEMA4B / H358.
実施例１３
SEMA4Bタンパク質の局在性検討（ビオチン標識）
ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228ならびにNCI-H358、および実施例１２で作製した組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株（SEMA4B/H358）を用いて、細胞表層上に露出しているタンパク質をCellular Labeling and Immunoprecipitation Kit（Roche Diagnostics社）を用いてビオチン標識した。続いて、実施例９の方法に従い調製した無細胞抽出液1mlと実施例８で作製したペプチド抗体AS-2591 5μgとを用いて、実施例１０の方法に従って免疫沈降しSDS-PAGEを行った。HRP標識したストレプトアビジン（Amersham-Bioscience社）を用いて検出したところ、分子量100ｋＤ近傍にSEMA4Bタンパク質に由来するバンドが認められ、SEMA4Bタンパク質、SEMA4B-M1タンパク質、SEMA4B-M2タンパク質およびSEMA4B-M3タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。
Example 13
Localization of SEMA4B protein (biotin labeling)
Using human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228 and NCI-H358, and the cell line (SEMA4B / H358) for stably expressing the recombinant full-length protein prepared in Example 12, it is exposed on the cell surface. The protein was biotin-labeled using Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics). Subsequently, using 1 ml of the cell-free extract prepared according to the method of Example 9 and 5 μg of the peptide antibody AS-2591 prepared in Example 8, immunoprecipitation was performed according to the method of Example 10, and SDS-PAGE was performed. When detected using HRP-labeled streptavidin (Amersham-Bioscience), a band derived from SEMA4B protein was observed at a molecular weight of about 100 kD, and SEMA4B protein, SEMA4B-M1, SEMA4B-M2 and SEMA4B-M3 proteins were detected. It was found that it was localized on the cell surface.
実施例１４
SEMA4Bタンパク質の局在性検討（FACS解析）
ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228ならびにNCI-H358、および実施例１２に記載したSEMA4B/H358を、直径10cmのペトリディッシュにそれぞれ播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。各細胞をPBSで洗浄後、0.5％BSAおよび5mM EDTAを含むPBSを加え室温で15分間放置し、細胞を分散した。次に、緩衝液A〔2％牛胎仔血清（JRH社）および0.1％アジ化ナトリウムを含むHBSS（Hanks’Balanced Salt Solutions、Invitrogen社）〕で4×106個/mlの濃度になるように細胞を懸濁し、終濃度10μg/mlとなるようAS-2532または非免疫ウサギIgG（Jackson社）を加え、氷中に3時間放置した。緩衝液Aで細胞を洗浄後、10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG抗体（Molecular Probes社）を含む緩衝液Aで懸濁し、氷上にて2時間放置した。緩衝液Aで再び洗浄後、FACScan（BDバイオサイエンス社）にて解析した。その結果、いずれの細胞においてもウサギペプチド抗体AS-2532特異的に染色され、SEMA4Bタンパク質、SEMA4B-M1タンパク質、SEMA4B-M2タンパク質およびSEMA4B-M3タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。
Example 14
Localization of SEMA4B protein (FACS analysis)
The human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228 and NCI-H358, and SEMA4B / H358 described in Example 12 were each seeded in a Petri dish having a diameter of 10 cm, and cultured until they became subconfluent. After washing each cell with PBS, PBS containing 0.5% BSA and 5 mM EDTA was added, and the mixture was left at room temperature for 15 minutes to disperse the cells. Next, buffer A (HBSS containing 2% fetal bovine serum (JRH) and 0.1% sodium azide (Hanks' Balanced Salt Solutions, Invitrogen)) was used to a concentration of 4 × 10 6 cells / ml. The cells were suspended, AS-2532 or non-immune rabbit IgG (Jackson) was added to a final concentration of 10 μg / ml, and the mixture was left on ice for 3 hours. After washing the cells with buffer A, the cells were suspended in buffer A containing 10 μg / ml of Alexa488-labeled anti-rabbit IgG antibody (Molecular Probes), and left on ice for 2 hours. After washing again with buffer A, analysis was performed with FACScan (BD Biosciences). As a result, in all cells, the rabbit peptide antibody AS-2532 was specifically stained, and it was clear that the SEMA4B protein, SEMA4B-M1 protein, SEMA4B-M2 protein and SEMA4B-M3 protein were localized on the cell surface. It became.
実施例１５
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H358のアポトーシス誘導
実施例２に記載のNCI-H1703以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
10％牛胎仔血清（JRH社）、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび25mM HEPESを含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）でNCI-H358を懸濁し、１ウェル当たり8×103個の細胞密度（培地液量80μl）となるよう、NCI-H358を96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種し、5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した。一方、実施例２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）およびコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）各0.06μgをOPTI-MEM I（Invitrogen社）で希釈し、Plus試薬（Invitrogen社）0.5μlと混合した後、室温で15分間放置した。OPTI-MEM I で希釈したLipofectAMINEトランスフェクション試薬（Invitrogen社）0.4μlを加え、さらに室温で15分間放置した。この混合液全量をNCI-H358の培養液に添加し3日間培養を継続した後、Cell Death Detection ELISAPLUS（Roche Diagnostics社）およびCaspase-Glo 3/7 assay（Promega社）の添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、NCI-H358においては、Cell Death Detection ELISAPLUSおよびCaspase-Glo 3/7 assayともに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ1.42倍および1.77倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（P≦0.01）を示した（表６および表７）。
Apoptosis induction of human non-small cell lung cancer cell line NCI-H358 by introduction of antisense oligonucleotides Apoptosis is induced by introduction of antisense oligonucleotides in human non-small cell lung cancer cell lines other than NCI-H1703 described in Example 2. We examined whether or not.
NCI-H358 was suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), 1 mM sodium pyruvate and 25 mM HEPES, and the cell density was 8 × 10 3 cells / well (medium volume). NCI-H358 was seeded on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate (BD Falcon) at a concentration of 80 μl) and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. On the other hand, 0.06 μg of each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) and the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) described in Example 2 was diluted with OPTI-MEM I (Invitrogen) and added with Plus reagent (Invitrogen) 0.5 After mixing with μl, the mixture was left at room temperature for 15 minutes. 0.4 μl of LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) diluted with OPTI-MEM I was added, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes. After adding the whole amount of the mixture to the culture solution of NCI-H358 and continuing the culture for 3 days, the above method was followed according to the attached protocol of Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics) and Caspase-Glo 3/7 assay (Promega). The apoptosis-inducing activity of the oligonucleotide was measured.
As a result, in NCI-H358, in both Cell Death Detection ELISA PLUS and Caspase-Glo 3/7 assay, the antisense oligonucleotide was 1.42-fold and 1.77-fold more apoptosis-inducing activity than the control oligonucleotide used as a negative control, respectively. , Indicating a statistically significant difference (P ≦ 0.01) (Tables 6 and 7).
実施例１６
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228、NCI-H1651およびNCI-H23のアポトーシス誘導
NCI-H1703（実施例２）およびNCI-H358（実施例１５）以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においても、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
NCI-H2228には、10％牛胎仔血清（JRH社）、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび25mM HEPESを含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）を用いた。NCI-H1651には、10％FBSを含むACL-4培地（ATCC）を用いた。NCI-H23には、10％牛胎仔血清（JRH社）および25mM HEPESを含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）を用いた。各細胞をそれぞれの培地に懸濁し、１ウェル当たり7.5×103個（NCI-H2228）、7.5×103個（NCI-H1651）および5×103個(NCI-H23)の細胞密度（培地液量125μl）となるよう96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種し、5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した。一方、実施例２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）およびコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）各0.135μgをOPTI-MEM I（Invitrogen社）で希釈し、Plus試薬（Invitrogen社）0.75μlと混合した後、室温で15分間放置した。OPTI-MEM I で希釈したLipofectAMINEトランスフェクション試薬（Invitrogen社）0.4μlを加え、さらに室温で15分間放置した。この混合液全量を各細胞の培養液に添加し3日間培養を継続した後、Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics社)の添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、いずれの細胞株においても、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ1.58倍（NCI-H2228）、1.21倍（NCI-H1651）および1.25倍(NCI-H23)のアポトーシス誘導活性を示し、危険率はP≦0.05（NCI-H2228）、P≦0.05（NCI-H1651）およびP≦0.01(NCI-H23)と算出され、統計学的に有意な差を示した(表８、表９および表１０)。
Apoptosis induction of human non-small cell lung cancer cell lines NCI-H2228, NCI-H1651 and NCI-H23 by introducing antisense oligonucleotide
In human non-small cell lung cancer cell lines other than NCI-H1703 (Example 2) and NCI-H358 (Example 15), it was examined whether apoptosis was induced by introduction of antisense oligonucleotides.
For NCI-H2228, an RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), 1 mM sodium pyruvate and 25 mM HEPES was used. ACL-4 medium (ATCC) containing 10% FBS was used for NCI-H1651. For NCI-H23, an RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and 25 mM HEPES was used. Each cell was suspended in the respective medium, and the cell density (medium) of 7.5 × 10 3 cells (NCI-H2228), 7.5 × 10 3 cells (NCI-H1651) and 5 × 10 3 cells (NCI-H23) per well was added. The solution was inoculated into a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) in a volume of 125 μl) and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. On the other hand, 0.135 μg of each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) and the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) described in Example 2 was diluted with OPTI-MEM I (Invitrogen), and the Plus reagent (Invitrogen) 0.75 After mixing with μl, the mixture was left at room temperature for 15 minutes. 0.4 μl of LipofectAMINE transfection reagent (Invitrogen) diluted with OPTI-MEM I was added, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes. After adding the whole amount of the mixture to the culture solution of each cell and continuing the culture for 3 days, the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotide was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
As a result, in each cell line, the antisense oligonucleotide was 1.58 times (NCI-H2228), 1.21 times (NCI-H1651) and 1.25 times (NCI-H23) as compared to the control oligonucleotide used as a negative control. Apoptosis-inducing activity, and the risk factors were calculated as P ≦ 0.05 (NCI-H2228), P ≦ 0.05 (NCI-H1651) and P ≦ 0.01 (NCI-H23), showing a statistically significant difference (Tables 8, 9 and 10).
実施例１７
ウサギペプチド抗体を用いたアポトーシス誘発
ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H2228を実施例８で取得したウサギペプチド抗体AS-2531およびAS-2532で処理し、これらウサギペプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
NCI-H2228を、10％牛胎仔血清（JRH社）、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび25mM HEPESを含むRPMI-1640培地（Invitrogen社）に懸濁し、１ウェル当たり4×103個の細胞密度になるようI型コラーゲンをコートした96穴平底組織培養プレート（BDファルコン社）に播種し、5％炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した。実施例８で取得したウサギペプチド抗体AS-2531、AS-2532、および非免疫ウサギIgG（Jackson社）をPBSで希釈し、各抗体について終濃度が15μg/ml、45μg/mlおよび150μg/mlとなるよう培養液にそれぞれ添加した。さらに5日間培養を継続した後、Cell Death Detection ELISAPLUS（Roche Diagnostics社）の添付プロトコールに従い、上記ウサギペプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、45μg/mlおよび15μg/mlのAS-2531存在下では、同濃度の非免疫ウサギIgGに比べ、1.26倍および1.31倍のアポトーシス誘導活性を示した（P≦0.05およびP≦0.01）。また、150μg/mlのAS-2532存在下では、同濃度の非免疫ウサギIgGに比べ、1.27倍のアポトーシス誘導活性を示した（P≦0.01）。
このように、SEMA4Bタンパク質、SEMA4B-M1タンパク質、SEMA4B-M2タンパク質およびSEMA4B-M3タンパク質は、ヒト肺癌細胞の生存維持に重要な働きをしていることが明らかとなった。
Example 17
Apoptosis induction using rabbit peptide antibody The human non-small cell lung cancer cell line NCI-H2228 was treated with the rabbit peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 obtained in Example 8, and the apoptosis-inducing activity of these rabbit peptide antibodies was measured. .
NCI-H2228 was suspended in RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH), 1 mM sodium pyruvate and 25 mM HEPES to a cell density of 4 × 10 3 cells / well. The cells were seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) coated with type I collagen, and cultured overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream. The rabbit peptide antibodies AS-2531 and AS-2532 obtained in Example 8 and non-immune rabbit IgG (Jackson) were diluted with PBS, and the final concentration of each antibody was adjusted to 15 μg / ml, 45 μg / ml and 150 μg / ml. Each of them was added to the culture solution so as to be as follows. After culturing was further continued for 5 days, the apoptosis-inducing activity of the rabbit peptide antibody was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
As a result, in the presence of 45 μg / ml and 15 μg / ml of AS-2531, apoptosis-inducing activity was 1.26 times and 1.31 times that of non-immune rabbit IgG at the same concentration (P ≦ 0.05 and P ≦ 0.01). In the presence of 150 μg / ml AS-2532, apoptosis-inducing activity was 1.27 times higher than that of non-immune rabbit IgG at the same concentration (P ≦ 0.01).
Thus, it was revealed that the SEMA4B protein, the SEMA4B-M1, the SEMA4B-M2 protein and the SEMA4B-M3 protein play an important role in maintaining the survival of human lung cancer cells.
Claims (42)
(I) an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 10 for producing an agent for promoting apoptosis of cancer cells; A substance that inhibits the expression of the contained protein or its partial peptide or its salt, (ii) a substance that inhibits the expression of the gene of the protein or its partial peptide, or (iii) an antibody against the protein or its partial peptide or its salt Use of.
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