【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経細胞死を抑制する２４残基のアミノ酸からなる短鎖ペプチドヒューマニン（ＨＮ）に結合し、ＨＮを制御または破壊するタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，以後、ＡＤと略記する）は、認知機能の障害、神経細胞の萎縮・脱落、老人班（ＳｅｎｉｌｅＰｌａｑｕｅｓ）と呼ばれる細胞外沈着、神経原繊維変化などを特徴とする神経変性疾患の一つで、アミロイドβタンパク（Ａβ）の凝集沈着による神経毒性、タウタンパクの異常リン酸化による神経原繊維変化がその原因と言われていたが、直接の原因であるか、結果として現れた（例えば、非特許文献１）。また、ＡＤ治療薬に関してはあくまで対症療法であり、ＡＤ病態の進行を阻止することは期待できない。ＡＤ患者の脳内では神経伝達物質のアセチルコリンが低下しており、現在Ａｃｈエステラーゼ阻害剤が広く実用化されている。（例えば、非特許文献２および特許文献１参照）。
【０００３】
【非特許文献１】
西本征央、「日本薬理学会誌」（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、１２０，補冊１，ｐ．１１（２００２）
【０００４】
【非特許文献２】
鍋島、野田、亀井、「日本薬理学会誌」（Ｆｏｌｉａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．）、１２０，補冊１，ｐ．２４（２００２）
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−３５６４４０号公報
【０００６】
タンパク質のユビキチン化とそのユビキチン化されたタンパク質のプロテアソームによる分解系は、様々な細胞機能に非常に重要な働きをしている。ユビキチンは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）により活性化され、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）に結合した後、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）へと運ばれる。多くのタンパク質が、その特徴的構造であるＨＥＣＴドメイン或いはＲＩＮＧフィンガードメインを有する事によりＥ３として分類されている（Ｐｉｃｋａｒｔ，２００１）。
【０００７】
ＤＮＡ上の特徴的な短い配列であって、かつ一定の機能を持つ塩基配列を有するモチーフが三部からなるＴｒｉｐａｒｔｉｔｅモチーフ（以後、ＴＲＩＭという）、それはＲＢＣＣとも言われるが、そのモチーフを有するタンパク質ファミリーは、ＲＩＮＧフィンガードメイン、Ｂ−ｂｏｘ．ドメイン、そしてＣｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインというユニークな構造で特徴づけられる（Ｓａｕｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｂｏｒｄｅｎ １９９８；Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。このファミリーのメンバーは、細胞の発生や癌化を含む種々の細胞過程に関与している。また、ＴＲＩＭモチーフを有するアフリカツメガエルの核因子７（Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａａｃｔｏｒ７）は、背と腹の形成に決定的な役割を果たすということが報告されている（Ｅｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ＰＭＬ−ＰＲＡ・融合タンパクは、急性前骨髄球白血病を誘導するが、ＴＲＩＭ／ＲＢＣＣモチーフはＰＭＬにおいては、プロトオンコジーン機能を果たす事が知られている（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０００８】
最近、データーベースにあるデータを組織的に収集することによりその生理的役割は明確ではないが、多くの新規なＴＲＩＭタンパクが同定され、報告されている（Ｒｅｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ＴＲＩＭ／ＢＲＲＣモチーフにおいて、Ｂ−ｂｏｘとＣｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインの両方がマルチタンパク複合体を形成するときのタンパク質間相互作用に関与している事が報告されている（Ｂｏｒｄｅｎ，１９９８，２０００）。また、そのＲＩＮＧフィンガードメインがタンパクのユビキチン化に関与している事も報告されている。
【０００９】
発明者らによって見出されたヒューマニン（Ｈｕｍａｎｉｎ、以後、ＮＨと略記する）は、アルツハイマー病（ＡＤ）に関連した侵害刺激であるＡＤ関連変異体遺伝子やアミロイドβタンパク（Ａβ）および抗アミロイド前駆体タンパク質抗体等による神経細胞死に拮抗する２４のアミノ酸ペプチドからなる新規神経細胞死抑制因子として同定された（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ，ｂ，ｃ）。また、ＨＮは、無血清培養による神経細胞死をも抑制する効果があることが報告されている（Ｋａｒｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
【００１０】
ＨＮペプチドは、初代培養神経および神経細胞株におけるＡＤに関連した神経細胞死を特異的に抑制することが発明者らによって既に明らかにされている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ）。また、ＨＮペプチドは、ＥＲ−Ｇｏｌｇｉ分泌システムを介して分泌され、細胞外から細胞表面に存在するリセプターに結合し何らかのタイロシンカイネースが関与するシグナル経路を使って機能することが知られている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ）。ＨＮのｉｎ ｖｉｖｏにおける影響としてスコポラミン処理による健忘症モデルマウスの記憶障害を回復させることが観察されている（Ｍａｍｉｙａ ａｎｄ Ｕｋａｉ，２００１）。
【００１１】
また、Ｃａｒｉｃａｓｏｌｅ等（２００２）は、ラットＨＮ、ラティンを発見した。ラティンの生化学的特性は、ＨＮと同様の広域スペクトルの神経保護作用に加えて興奮毒に対する神経細胞死をも抑制することが報告されている。この興奮毒に対する神経細胞保護作用は、ＨＮにはないことが明らかにされている（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ｃ）。ＨＮあるいはＨＮ様タンパクの発現は、ＡＤ患者脳の後頭葉で検出される。しかし、同年令のＡＤ患者でない人の脳からは検出されない。
【００１２】
ＨＮペプチドを特異的に認識する抗−ＨＮ抗体による免疫反応性は３週令マウスの睾丸や大腸にも検出されたが１２週令になると大腸での反応性はなくなり、睾丸にのみに検出された（Ｔａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。このように、ＨＮに付いて多くのインフォメーションが得られているが、ＨＮ生成の制御についてはほとんど知られていない。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
係る状況に鑑み、発明者らはＨＮ生成の制御機構を明らかにするための初めての試みとして、広く知られたスクリーニング法であるイーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法により、ＨＮと作用するタンパクを探索し、ＴＲＩＭ／ＢＲＲＣファミリーの１１番目のメンバー（以後、ＴＲＩＭ１１と略記する）がプロテオソーム分解経路を介してＨＮを制御または破壊すること、或いは、その可能性が最も高いことを見い出して課題を解決した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
ＴＲＩＭ１１／ＲＢＣＣファミリーの１１番目のメンバーのＴＲＩＭ１１は、ｉｎ ｖｉｖｏとｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でＨＮと特異的に結合すること、およびＨＮと結合するＴＲＩＭ１１の主な領域は、Ｂ３０．２ＤドメインであることがＴＲＩＭ１１からＢ３０．２Ｄドメインを除去するとＴＲＩＭ１１はＨＮと結合しなくなることから明らかにされた。しかしながら、Ｂ３０．２ドメインだけではＨＮと結合せず、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインがその結合に必要であることも明かである。また、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインはいくつかのＴＲＩＭファミリータンパクのホモ２量体化であると言う報告がある。これは、 ＴＲＩＭ１１のＣｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインによるホモ２量体化が、Ｂ３０．２ドメインのＨＮとの結合に必要であることを示唆するものである。
【００１５】
本発明は、ＴＲＩＭ１１の共発現が細胞内ＨＮレベルを大きく減少させることを発見したことで課題を解決した。ＴＲＩＭ１１は、ＲＩＮＧフィンガードメインをＮ末端に持ち、ＲＩＮＧフィンガードメインを含むタンパクはユビキチンＥ３リガーゼとして機能することが知られている。それ故、ＴＲＩＭ１１は、Ｅ３リガーゼとしてＨＮに作用し、その発現を減少させていると推測される。さらに、この結果を裏付けるものとして、プロテアソームインヒビターのラクタシスチンの処理でＨＮ発現レベルへの影響が阻止されることを明らかにした。また、ＴＲＩＭ１１のＲＩＮＧフィンガードメインを壊すと共発現しているＨＮタンパクの細胞内レベルを増加させ、それと一致してＲＩＮＧタイプＥ３であるタイロシンキナーゼ（ｃ−Ｃｂｌ）のＲＩＮＧフィンガードメインのはじめのシステインを含む部分欠損をさせるるか、あるいはシステイン残基を変異させるとＥＧＦレセプターのユビキチン化の欠陥となり、ＥＧＲＦをダウン・レギュレーションする結果となる。以上のことから、ＴＲＩＭ１１がＥ３リガーゼとして細胞内でＨＮ或いはＨＮを含むタンパクをターゲットとし、ＨＮ生成レベルを、プロテアソーム分解経路を介して制御していることを見出した。
【００１６】
ＴＲＩＭ１１ΔＮΔＢ３０をＨＮ融合タンパクと共導入するとＨＮ融合タンパクのレベルはかなり増大する。このＨＮレベルの増大は、ＨＮとＴＲＩＭ１１ΔＮ・ΔＢ３０ が結合しないからである。何故ならば、Ｂ３０．２ＢドメインがＨＮとの結合に必要なドメインだからである。ＴＲＩＭ１１ΔＮ・ΔＢ３０はＢ−ｂｏｘドメインとＣｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインを含み、Ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌドメインはホモ２量体化に関わると思われる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の神経細胞株の細胞死を抑制する神経防御ペプチドＨＮを制御または破壊する化合物のスクリーニング法および同定に関して図面を参照して詳細に説明する。
【００１８】
ＨＮをベイトとするイーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング法により、全長ＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡがマウスｃＤＮＡライブラリーからＮＨに結合するタンパクとしてスクリーニングされた。全長のクローンは、２２６６ｂｐで、その配列は、データベースにあるものと同一であった（Ｇｅｎ−ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＭＮ−０５３１６８）。同じスクリーニングで分離された断片型クローンの中で最短クローンは、ＴＲＩＭ１１のＣ末端側の３８３アミノ酸配列をコードしていた。また、イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムでＨＮとＴＲＩＭ１１との結合は・・ｇａｌアッセイを含む他の幾つかのリポーターアッセイによっても確認された。ＴＲＩＭファミリーの他のメンバーであるＴＲＩＭ２やＴＲＩＭ６はこれ等のアッセイでは、ＨＮと結合しなかった（図１Ａ）。さらに、ＴＲＩＭ１１の全長とＮ末端欠損ＴＲＩＭ１１断片がＭＢＰ−ＨＮと共沈した（図１Ｂ）。この結果は、ＴＲＩＭ１１がＨＮに特異的に結合することを示している。
【００１９】
ＴＲＩＭ１１ｍＲＮＡは、あらゆるマウス組織に発現している（図２Ａ）。主なバンドは、２．４ｋｂとして観察され、それはＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡのサイズと一致する。二本のマイナーバンド（４．１，１１ｋｂ）もＢ３０．２ドメインを含まない転写解読枠の領域に相当するプローブにより検出された。これら３つのバンドは、Ｅ１４マウス胎児脳、Ｅ１４初代培養大脳皮質神経、Ｆ１１神経細胞に同じプローブか、あるいはＢ３０．２ドメインと塩基配列３’側の翻訳されていない領域に特異的なプローブを用いて検出される（図２Ｂ）。
【００２０】
プロテアソーム分解系による細胞内ＨＮレベルの調節
抗ＨＮ抗体でＨＮ免疫反応性がＡＤ脳の後頭葉神経に既に検出されているので不死化神経細胞であるＦ１１にＨＮとＴＲＩＭ１１ｃＤＮＡの共導入を試みた。
Ｎ末端にＧＳＴを融合し、Ｃ末端にＦＬＡＧを融合したＨＮ（ＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧ）の細胞内レベルは、ＴＲＩＭ１１を共導入すると大きく減少した（図３Ａ）。ＴＲＩＭ２と共導入してもＨＮと結合しないので、ＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧの細胞内発現レベルには何の影響も認められなかった（図３Ｂ）。
【００２１】
ＲＩＮＧフィンガードメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼとしてその機能に関与しているのでプロテアソーム阻害剤を使ってＨＮ細胞内レベルへの影響を確かめた。その結果、２６Ｓプロテアソームの既によく知られた阻害剤であるラクタシスチンで処理すると、ＴＲＩＭ１１の共発現によるＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧレベルの下降は、少しではあるが有意に回復を示した。ＴＲＩＭ１１の導入をしていない時には、同じ処理によってもＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧの細胞内レベルには何の影響もなかった。また、細胞内ＴＲＩＭ１１のレベルは、ラクタシスチンの処理により容量依存的に増加した（図３Ａ）。ＧＳＴ−ＦＬＡＧの発現は、ＴＲＩＭ１１の共発現やラクタシスチンによっては影響されなかった（図３Ｂ）。さらに他のＨＮコンストラクト、Ｃ末端にＥＧＦＴを融合したＨＮ（ＨＮ−ＥＧＦＰ）も、ＴＲＩＭ１１を共発現下、ラクタシスチンの処理によりそのレベルが増加した。一方、ＥＧＦＰのみの発現は、ＴＲＩＭ１１を共発現しても、ラクタシスチンを処理しても影響されなかった（図３Ｃ）。これらの結果は、細胞内ＨＮレベルがＴＲＩＭ１１に関連したプロテオソーム分解系により、制御されていることを示すものである。
【００２２】
ＴＲＩＭ１１のＨＮ結合領域とＨＮ発現への影響
ＴＲＩＭ１１におけるＨＮ結合領域を同定するため、一連のＴＲＩＭ１１が欠損した変異体を作り、その相互作用を確認した。その結果、ＲＩＮＧフィンガードメインの２９アミノ酸残基を除いた欠損変異体はＨＮとの結合に影響はなかった（図４Ａ）。
【００２３】
Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインとＢ３０．２ドメインからなるクローン（アミノ酸配列１２６−４６７；そのコンストラクトをＴＲＩＭ−Ｃｏｉｌ−Ｂ３０と名付ける）はＨＮと結合した。この結果は、もともとｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングで得られたクローンであり納得できる。しかし、ＲＩＮＧフィンガーとＢ−ｂｏｘ（アミノ酸配列３０−１２８）からなるクローンは、ＨＮと結合しなかった。また、Ｂ３０．２ドメインが欠損したクローン（アミノ酸配列３０−２９２；ＴＲＩＭ１１・Ｎ・・Ｂ３０）は、ＴＲＩＭ１１とＨＮのもともとある結合を無効なものとした。一方、Ｂ３０．２ドメインのみのクローン（アミノ酸配列２２６−４６７；ＴＲＩＭ１１−Ｂ３０）は、ＨＮと結合しない。これは、Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌドメインとＢ３０．２ドメインの両方が、ＨＮとＴＲＩＭ１１の結合に必要であることを示すものである。また、以上の結果はＧＳＴ−ＨＮ−ＦＬＡＧとＴＲＩＭ１１Ｃｏｉｌｄ−ｃｏｉｌ＋Ｂ３０．２領域を共発現した細胞溶解物を用いＧＳＴプルダウン実験によって確認された。
【００２４】
部分的にＴＲＩＭ１１Ｔ断片をコードするこれらの欠損変異体は、全長ＴＲＩＭ１１と比べて細胞内ＨＮ発現レベルへの影響は少ない（図４Ｂ）。Ｎ末端２７残基を欠損させることによって（そのコンストラクトは、ＴＲＩＭ１１？Ｎと定義する）ＲＩＮＧフィンガードメインを破壊するとＨＮの発現レベルを少しだけ下げる結果となった。また、ＲＩＮＧフィンガードメインとＢ−ｂｏｘドメインの完全な欠損は、（ＴＲＩＭ１１−ｃｏｉｌ−Ｂ３０）ＨＮ発現レベルへの影響を消失させる結果となった。
【００２５】
【実施例】
以下に、実施例で本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００２６】
【実施例１】
イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング
ＦＬＡＧ−ＨＮｃＤＮＡをｐＤＢＬｅｕ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）のＳｔｕ１サイトにサブクローニングし、バイトコンストラクトとして使用した。イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングをマウス脳ｃＤＮＡライブラリー（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で実施した。Ｘ−ｇａｌ アッセイを試薬会社のインストラクションに従いイーストクローンをＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレートに植え付け、３０℃で１８時間生育させた。一方でＹＡＰＤプレートにフィルターで複製しておく。フィルターを２４時間インキュベート後、液体窒素で凍らせ、Ｘ−ｇａｌを含むＺバッファーに浸し３７℃で２４時間インキュベートした。
【００２７】
【実施例２】
発現コンストラクトと試薬
ＦＬＡＧ−ＨＮのｃＤＮＡをマルトース結合タンパクと融合させるために、ｐＭＡＬ−ｐ２（ＮＥＢ）の？ｍｎＩサイトに、また、ＥＧＦＰ融合タンパクのためにｐＥＧＦＰ−Ｎ１のＥｃｏＲＩとＫｐｎＩサイトにサブクローニングした。ＧＳＰ融合タンパクには、ＨＮ−ＦＬＡＧｃＤＮＡをまずｐＧＥＸ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。そしてＧＳＴ遺伝子に融合したＨＮ遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）で増幅した。その時のプライマーとして、５’−ＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＴＡＧＧＴＴＡＴ−３’（塩基配列１）と、
５’−ＧＴＴＴＴＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧＡＡＡＣ−３’（塩基配列２）、
を使用した。ＰＣＲで増幅された断片を、哺乳類発現プラズミドを作り出すためｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａ ベクターのＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩサイトにクローニングした。参照として、ＧＳＴ ｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ５ａにクローニングしたものを作製した。次に、全長マウスＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡを発現させるために、ＰＣＲ増幅断片をプライマー、
５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣ−３’（塩基配列３）、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列４）、
を使用し、最長ＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡとにより、ＰＣＲで作製した。次にｐＥＦ４−Ｈｉｓ ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶサイトにｐＰＣ８６（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）のＳａｌＩとＳｍａＩサイトに各々クローニングした。
【００２８】
イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ アッセイのためのＴＲＩＭ１１欠損変異体を以下の様にして作製した。ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）とＴＲＩＭ１１（１２６−４６７）は、イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニング中に得られた。ＴＲＩＭ１１（３０−２９２），ＴＲＩＭ１１（３０−１２８）およびＴＲＩＭ１１（２６６−１２８）は、ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）の部分を３０−２９２には、
５’−ＴＡＴＡＡＣＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴ−３’（塩基配列５），
５’−ＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＣ−３’（塩基配列６），
３０−１２８には、
５’−ＣＴＧＣＡＧＣＧＧＴＣＴＣＡＣＣＣＧＧＴＧ−３’（塩基配列７）、
また、２６６−４６７には、
５’−ＧＴＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＧＴＡ−３’（塩基配列８），
５’−ＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列９）、
プライマーでそれぞれ増幅する事により得た。そのＰＣＲ断片をｐＰＣ８６のＳａｌＩとＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。哺乳類の発現に使うため、ＴＲＩＭ１１（３０−４６７）をｐｃＤＮＡ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩとＮｏｔＩサイトにクローニングした（ＴＲＩＭ１１・Ｎ）。ＴＲＩＭ１１・・・・・には、ｐＰＣ８６ベクターの・ＴＲＩＭ１１（３０−１２８）断片をｐＥＦ４−ＨｉｓベクターにＥｃｏＲＶとＮｏｔＩサイトを使ってクローニングした。ＴＲＩＭ１１−ｃｏｉｌ−Ｂ３０は、
５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣ−３’（塩基配列１０）と、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＧＧＧＴＧＴＣ−３’（塩基配列１１）、
をプライマーとするＰＣＲで増幅されたものをＰＥＦ４−ＨｉｓのＥｃｏＲＶサイトにクローニングした。ＴＲＩＭ１１（２６６−４６７）断片はｐＥＦ４−ＨｉｓベクターにＥｃｏＲＶとＮｏｔＩサイトを介してクローニングした。
（ＴＲＩＭ１１−Ｂ３０）。マウスＴＲＩＭ２ｃＤＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ社）を使用して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）でマウスＥ１６胎児脳のｔｏｔａｌ ＲＮＡからプライマーとして、
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＧ−３’（塩基配列１２）、
５’−ＡＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＴＡＡＧＴＡＣＣＧＣＴＡＧＡＣ−３’（塩基配列１３）、
を使用してＰＣＲ断片を得て、ｐＰＣ８６とｐＥＦ４−Ｈｉｓベクターの各々ＳａＩＩ−ＮｏｔＩサイトとＥｃｏＲＶ−ＮｏｔＩサイトにクローニングした。また、ヒトのＴＲＩＭ８ｃＤＮＡは正常ヒト海馬のｃＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ）からプライマーとして、
５’−ＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧ−３’（塩基配列１４），
５’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＧＣＴＣＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧ−３’（塩基配列１５）、
を使い、ＰＣＲで得たｐＰＣ８６にＳｍａＩとＸｂａＩサイトを使ってクローニングした。
【００２９】
【実施例３】
免疫ブロットアッセイ
タンパク試料を１０％ＳＤＳＰＡＧＥで処理してＰＶＤＦ膜の上に移動し、その後、ＰＶＤＦＰ膜を剥がし、処理済みタンパク試料を抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（１／５０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、あるいは抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２，１／５０００，ＳＩＧＭＡ）、あるいは抗ＭＢＰ抗体（１／５０００，ＮＥＢ）、あるいは抗アクチン抗体（１／２５００，ＳＩＧＭＡ）と反応させた。免疫反応性バンドをＨＲＰ結合抗マウス、あるいは抗ラビットＩｇＧ（１／５０００，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を反応させ、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により検出した。
【００３０】
【実施例４】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイ
ＣＯＳ７細胞は１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ），抗生物質を含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）で培養した。ＣＯＳ７ 細胞（１ｘ１０６／１００ｍｍｄｉｓｈ）にプラズミド（５・ｇ）を無血清下でリポフェクション（１０？｜ ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ ｔｏ １０ ・｜ＰＬＵＳ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により導入した。３時間後、培養液を１０％ＦＢＳ を含むＤＭＥＭに変換した。導入後４８時間細胞をＰＢＳで洗い、細胞溶解液［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＣＨＡＰＳ］で溶解した。細胞溶解物を４℃で３０分インキュベートし、１００００ｘｇ，２０分遠心分離した。得られた上澄み液を結合実験に使った。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに発現したＭＢＰ融合タンパクをアミロース樹脂（ＮＥＢ）に結合させた。１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で洗浄後、ＭＢＰ融合タンパク−樹脂複合体をＣＯＳ７細胞溶解物と１時間４℃でインキュベートした。３回細胞溶解液で洗浄後、樹脂上の結合物質をＳＤＳＰＡＧＥサンプルバッファーで分離し、免疫ブロット解析を実施した。
【００３１】
【実施例５】
ＴＲＩＭ１１とＨＮの共発現
ラットＥ１３初代培養神経とマウスニューロブラストーマＮＴＧ１８のハイブリッド細胞であるＦ１１細胞を１８％ＦＢＳ、抗生物質を含むＨａｍ’ｓＦ１２（Ｓｉｇｍａ社）培養液で培養し、Ｆ１１細胞（１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／６０ｍｍ ｄｉｓｈ）にプラズミドをリポフェクション（１．２ｇのＴＲＩＭプラズミドと０．８・ｇのＥＧＦＰ、 あるいはＧＳＴプラズミドと４・｜のＰＬＵＳ試薬）により無血清下で導入した。３時間後、培養液に１８％のＦＢＳを補足した。プラズミドを導入後、４２時間で細胞をラクタシスチン（Ｓｉｇｍａ社）と６時間反応させた。次に細胞をＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，キレート剤（５ｍＭ ＥＤＴＡ），界面活性剤（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００），及びプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，Ｒｏｃｈｅ社）を含む細胞溶解液で溶解した。１００００ｘｇ，１０分間の条件で遠心分離した後、上澄み液を免疫ブロット分析した。
【００３２】
【実施例６】
Ｎｏｒｔｈａｎブロット分析
ｍＲＮＡをマウスＥ１４初代培養神経、マウスＥ１４脳、およびＦ１１細胞からＩＳＯＧＥＮ（Ｔｏｙｏｂｏ社）とＯｌｉｇｏｔｅｘ ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ分離キット（Ｔａｋａｒａ社）により分離した。他のマウス組織のｍＲＮＡサンプルはＯｒｉＧｅｎｅ社から購入した。各ｍＲＮＡ ２？ｇを１％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ Ｂ，Ｐｏｌｅ社）に移した。ＴＲＩＭ１１ ｃＤＮＡ断片を［Ｐ３２］ｄＣＴＰでＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ｒａｎｄｏｍラベリングシステム（ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、メーカーの指示に従い標識した。ブロットを放射線標識したプローブによりＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ ハイブリダイゼーション溶液中（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でハイブリダイズさせた。メーカー指示に従い、２段階の洗浄後、膜をＸ線フィルムに−８０℃で露出させた。
【００３３】
【発明の効果】
本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）に起因する神経細胞株の細胞死を抑制する２４アミノ酸ペプチドからなるヒューマニン（ＨＮ）を制御または破戒する化合物であるＴＲＩＭ１１の機能を初めて同定したものである。ＴＲＩＭ１１は、ＨＮと結合し、そしてＨＮを分解する。ＨＮは、ＡＤに関連する損傷を抑制する２４アミノ酸からなる短鎖ペプチドである。それ故、ＨＮはＡＤの明らかな新規療法達成のターゲットである。この発明は、細胞内で合成されたＨＮのレベルがＴＲＩＭ１１により、プロテアソーム経路を介して完全に制御されていることを示したもので、ＴＲＩＭ１１を薬理学的に抑制することは内在性ＨＮとＨＮを含むタンパクの過剰発現を導くことができ、それは、もう一つのＡＤ療法を達成すると言う効果がある。
【００３４】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号２：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号３：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号４：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号５：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号６：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号７：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号８：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号９：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１０：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１１：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１２：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１３：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１４：人工的に合成されたプライマー配列
配列番号１５：人工的に合成されたプライマー配列
【図面の簡単な説明】
【図１】イーストｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄアッセイによるｉｎ ｖｉｖｏ相互作用（Ａ）とプルダウンアッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用（Ｂ）を示す図である。
【図２】ＴＲＩＭ１１をプローブとしたマウス組織ｍＲＮＡのノーダンブロット分析（Ａ）とＴＲＩＭ１１をプローブとした初代培養Ｅ１４マウス胎児の大脳皮質神経、Ｅ１４マウス胎児脳とＦ１１神経細胞のノーダンブロット分析（Ｂ）を示す図である。
【図３】ＨＮとＴＲＩＭ１１の細胞内レベルに対するプロテアソーム阻害剤の影響を示す図（Ａ，Ｂ，Ｃ）である。
【図４】ＨＮ発現レベルに対するＴＲＩＭ欠陥変異体の影響を示す図（Ａａ，Ａｂ，Ｂ）である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a protein that binds to a short peptide humanin (HN) consisting of 24 amino acids and suppresses neuronal cell death, and controls or destroys HN.
[0002]
[Prior art]
Alzheimer's disease (hereinafter abbreviated as AD) is a neurological disorder characterized by impairment of cognitive function, atrophy or loss of nerve cells, extracellular deposition called senile plaque (SenilePlaques), and neurofibrillary tangles. One of the degenerative diseases, neurotoxicity caused by aggregation and deposition of amyloid β protein (Aβ) and neurofibrillary tangles caused by abnormal phosphorylation of tau protein were said to be the causes. (For example, Non-Patent Document 1). In addition, AD therapeutics are only symptomatic treatments and cannot be expected to prevent the progress of AD pathological conditions. The neurotransmitter acetylcholine is reduced in the brain of AD patients, and Ach esterase inhibitors are now widely used. (For example, see Non-Patent Document 2 and Patent Document 1).
[0003]
[Non-patent document 1]
Seishi Nishimoto, "Journal of the Pharmacological Society of Japan" (Folia Pharmacol. Jpn.), 120, Supplement 1, p. 11 (2002)
[0004]
[Non-patent document 2]
Nabeshima, Noda, Kamei, "Journal of the Pharmacological Society of Japan" (Folia Pharmacol. Jpn.), 120, Supplement 1, p. 24 (2002)
[0005]
[Patent Document 1]
JP-A-2002-356440
[0006]
Ubiquitination of proteins and the degradation system of the ubiquitinated proteins by proteasome play a very important role in various cell functions. Ubiquitin is activated by the ubiquitin activating enzyme (E1), is bound to the ubiquitin-conjugating enzyme (E2), and is transported to the ubiquitin ligase (E3). Many proteins are classified as E3 by having a HECT domain or a RING finger domain which is a characteristic structure thereof (Pickart, 2001).
[0007]
A tripartite motif (hereinafter referred to as TRIM) comprising a three-part motif having a base sequence having a certain function, which is a characteristic short sequence on DNA, which is also called RBCC, a protein family having the motif. Is a RING finger domain, B-box. Domain and a unique structure, the Cold-coil domain (Saurin et al., 1996; Borden 1998; Reymond et al., 2001). Members of this family are involved in various cellular processes, including cell development and canceration. In addition, it has been reported that Xenopus nuclear factor 7 having a TRIM motif plays a critical role in the formation of the back and the abdomen (Etkin et al., 1997). The PML-PRA fusion protein induces acute promyelocytic leukemia, but the TRIM / RBCC motif is known to play a proto-oncogene function in PML (Jensen et al., 2001).
[0008]
Recently, a systematic collection of data in the database has not identified its physiological role, but a number of novel TRIM proteins have been identified and reported (Reymond et al., 2001). In the TRIM / BRRC motif, it has been reported that both the B-box and the Cold-coil domain are involved in protein-protein interactions when forming a multiprotein complex (Borden, 1998, 2000). It has also been reported that the RING finger domain is involved in protein ubiquitination.
[0009]
Humanin (Humanin, hereinafter abbreviated as NH) discovered by the present inventors is a nociceptive stimulus related to Alzheimer's disease (AD), an AD-related mutant gene, amyloid β protein (Aβ) and an anti-amyloid precursor. It was identified as a novel nerve cell death inhibitor consisting of 24 amino acid peptides that antagonize nerve cell death by protein antibodies and the like (Hashimoto et al., 2001a, b, c). It has been reported that HN also has an effect of suppressing neuronal cell death due to serum-free culture (Kariya et al., 2002).
[0010]
The HN peptide has previously been shown by the inventors to specifically inhibit AD-related neuronal cell death in primary cultured neurons and neuronal cell lines (Hashimoto et al., 2001a). Further, it is known that the HN peptide is secreted via the ER-Golgi secretion system, binds to a receptor present on the cell surface from outside the cell, and functions using a signaling pathway involving some tyrosin kinase ( Hashimoto et al., 2001a). As an in vivo effect of HN, it has been observed that scopolamine treatment restores memory dysfunction in amnesia model mice (Mamiya and Ukai, 2001).
[0011]
(2002) also found rat HN, Latin. It has been reported that the biochemical properties of Latin inhibit neuronal death against excitotoxins in addition to the same broad spectrum neuroprotective effects as HN. It has been shown that HN does not have this neuroprotective effect on excitotoxicity (Hashimoto et al., 2001c). The expression of HN or HN-like protein is detected in the occipital lobe of the AD patient brain. However, it is not detected in the brain of non-AD patients of the same age.
[0012]
Immunoreactivity with an anti-HN antibody that specifically recognizes the HN peptide was also detected in the testes and colon of 3-week old mice, but at 12 weeks of age, there was no reactivity in the large intestine and was detected only in the testes. (Tajima et al., 2002). Thus, much information has been obtained about HN, but little is known about the control of HN generation.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
In view of such circumstances, the present inventors, as the first attempt to elucidate the control mechanism of HN production, to search for proteins that interact with HN by yeast two-hybrid screening method, which is a widely known screening method, The eleventh member of the TRIM / BRRC family (hereinafter abbreviated as TRIM11) solved or solved the problem by controlling or destroying HN via the proteosome degradation pathway, or finding that it is most likely.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
TRIM11, the eleventh member of the TRIM11 / RBCC family, specifically binds to HN both in vivo and in vitro, and the major region of TRIM11 that binds to HN may be the B30.2D domain. Removal of the B30.2D domain from TRIM11 revealed that TRIM11 did not bind to HN. However, it is also clear that the B30.2 domain alone does not bind HN, and that a coiled-coil domain is required for its binding. There are also reports that the coiled-coil domain is a homodimerization of some TRIM family proteins. This suggests that homodimerization by the coiled-coil domain of TRIM11 is required for binding of B30.2 domain to HN.
[0015]
The present invention has solved the problem by finding that co-expression of TRIM11 significantly reduces intracellular HN levels. TRIM11 has a RING finger domain at the N-terminus, and a protein containing the RING finger domain is known to function as a ubiquitin E3 ligase. Therefore, it is presumed that TRIM11 acts on HN as an E3 ligase and reduces its expression. Further, in support of this result, it was revealed that treatment with the proteasome inhibitor lactacystin prevented the effect on HN expression levels. In addition, disruption of the RING finger domain of TRIM11 increased the intracellular level of the co-expressed HN protein, and in agreement with that, the first cysteine of the RING finger domain of the RING type E3 tyrosine kinase (c-Cbl) was deleted. Deletion or mutation of a cysteine residue results in a deficiency in ubiquitination of the EGF receptor, which results in down-regulation of EGRF. From the above, it was found that TRIM11 targets HN or a protein containing HN in cells as an E3 ligase, and regulates the level of HN production via a proteasome degradation pathway.
[0016]
When TRIM11ΔNΔB30 is co-introduced with HN fusion protein, the level of HN fusion protein is significantly increased. This increase in HN level is because HN and TRIM11ΔN · ΔB30 do not couple. This is because the B30.2B domain is a domain required for binding to HN. TRIM11ΔN · ΔB30 contains a B-box domain and a coiled-coil domain, and the coiled-coil domain appears to be involved in homodimerization.
[0017]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The screening method and identification of a compound that controls or destroys the neuroprotective peptide HN that suppresses cell death of the nerve cell line of the present invention will be described in detail with reference to the drawings.
[0018]
By a yeast two-hybrid screening method using HN as a bait, a full-length TRIM11 cDNA was screened as a protein binding to NH from a mouse cDNA library. The full length clone was 2266 bp and its sequence was identical to that in the database (Gen-bank accession # MN-053168). The shortest clone among the fragment clones isolated by the same screening encoded the 383 amino acid sequence at the C-terminal side of TRIM11. The binding of HN to TRIM11 in the yeast two-hybrid system was also confirmed by several other reporter assays, including a gal assay. TRIM2 and TRIM6, other members of the TRIM family, did not bind HN in these assays (FIG. 1A). Furthermore, TRIM11 full length and N-terminal deletion TRIM11 fragment co-precipitated with MBP-HN (FIG. 1B). This result indicates that TRIM11 specifically binds to HN.
[0019]
TRIM11 mRNA is expressed in all mouse tissues (FIG. 2A). The major band was observed as 2.4 kb, which is consistent with the size of TRIM11 cDNA. Two minor bands (4.1, 11 kb) were also detected by the probe corresponding to the region of the open reading frame that did not contain the B30.2 domain. These three bands were prepared using the same probe for the E14 mouse fetal brain, E14 primary cultured cerebral cortical nerve, or F11 neuron, or a probe specific to the B30.2 domain and the untranslated region of the nucleotide sequence 3 ′. (FIG. 2B).
[0020]
Regulation of intracellular HN level by proteasome degradation system
Since HN immunoreactivity with an anti-HN antibody was already detected in the occipital lobe nerve of AD brain, co-transfection of HN and TRIM11 cDNA into F11, an immortalized neuron, was attempted.
The intracellular level of HN (GST-HN-FLAG) in which GST was fused to the N-terminus and FLAG was fused to the C-terminus was significantly reduced when TRIM11 was co-transfected (FIG. 3A). Since it did not bind to HN even when co-introduced with TRIM2, there was no effect on the intracellular expression level of GST-HN-FLAG (FIG. 3B).
[0021]
Since the RING finger domain is involved in its function as an E3 ubiquitin ligase, its effect on HN cell levels was confirmed using a proteasome inhibitor. As a result, when treated with lactacystin, a well-known inhibitor of the 26S proteasome, the decrease in GST-HN-FLAG levels due to co-expression of TRIM11 showed a small but significant recovery. When TRIM11 was not introduced, the same treatment had no effect on intracellular levels of GST-HN-FLAG. In addition, intracellular TRIM11 levels increased in a dose-dependent manner by treatment with lactacystin (FIG. 3A). GST-FLAG expression was not affected by TRIM11 co-expression or lactacystin (FIG. 3B). Furthermore, the level of other HN constructs, HN with EGFT fused to the C-terminus (HN-EGFP), was increased by lactacystin treatment under co-expression of TRIM11. On the other hand, expression of EGFP alone was unaffected by co-expression of TRIM11 or by treatment with lactacystin (FIG. 3C). These results indicate that intracellular HN levels are regulated by a proteosomal degradation system associated with TRIM11.
[0022]
HN binding domain of TRIM11 and its effect on HN expression
To identify the HN binding region in TRIM11, a series of mutants lacking TRIM11 were created and their interaction was confirmed. As a result, the mutant lacking the 29 amino acid residues of the RING finger domain had no effect on the binding to HN (FIG. 4A).
[0023]
A clone consisting of the Cold-coil domain and the B30.2 domain (amino acid sequence 126-467; the construct was named TRIM-Coil-B30) bound to HN. This result is a clone originally obtained by the two-hybrid screening, and is thus acceptable. However, the clone consisting of the RING finger and B-box (amino acid sequence 30-128) did not bind to HN. In addition, clones lacking the B30.2 domain (amino acid sequence 30-292; TRIM11 • N •• B30) invalidated the intrinsic binding between TRIM11 and HN. On the other hand, a clone having only the B30.2 domain (amino acid sequence 226-467; TRIM11-B30) does not bind to HN. This indicates that both the Cold-coil domain and the B30.2 domain are required for binding HN to TRIM11. The above results were confirmed by a GST pull-down experiment using a cell lysate in which GST-HN-FLAG and TRIM11Coil-coil + B30.2 region were co-expressed.
[0024]
These deletion mutants, which partially encode the TRIM11T fragment, have less effect on intracellular HN expression levels compared to full-length TRIM11 (FIG. 4B). Disruption of the RING finger domain by deleting the N-terminal 27 residues (the construct is defined as TRIM11? N) resulted in a slight decrease in HN expression levels. Further, complete deletion of the RING finger domain and the B-box domain resulted in elimination of the effect on (TRIM11-coil-B30) HN expression level.
[0025]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[0026]
Embodiment 1
Yeast two-hybrid screening
FLAG-HNcDNA was subcloned into the Stu1 site of pDBLEu (GIBCOBRL) and used as a byte construct. An yeast two-hybrid screen was performed on a mouse brain cDNA library (GIBCOBRL). Yeast clones were seeded on SD-Leu-Trp plates according to the X-gal assay according to the instructions of the reagent companies, and grown at 30 ° C for 18 hours. On the other hand, it is duplicated with a filter on a YAPD plate. After the filter was incubated for 24 hours, it was frozen with liquid nitrogen, immersed in a Z buffer containing X-gal, and incubated at 37 ° C for 24 hours.
[0027]
Embodiment 2
Expression constructs and reagents
To fuse the FLAG-HN cDNA with the maltose binding protein, the pMAL-p2 (NEB) It was subcloned into the mnI site and into the EcoRI and KpnI sites of pEGFP-N1 for the EGFP fusion protein. For the GSP fusion protein, HN-FLAG cDNA was first cloned into pGEX2T (Pharmacia). Then, the HN gene fused to the GST gene was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). 5'-AAGCTTACCATGTCCCCTATACTAGGTTT-3 '(base sequence 1) as a primer at that time;
5′-GTTTTCACCGTCATCACCGAAAC-3 ′ (base sequence 2),
It was used. The fragment amplified by PCR was cloned into the HindIII and KpnI sites of the pFLAG-CMV5a vector to create a mammalian expression plasmid. A GST cDNA cloned into pFLAG-CMV5a was prepared for reference. Next, in order to express the full-length mouse TRIM11 cDNA, the PCR amplified fragment was
5'-AACTACTGAGACCATGCTGCCCCAGAC-3 '(base sequence 3),
5′-GATATCACTGCGGGCCAAGGGTGTC-3 ′ (base sequence 4),
Using the longest TRIM11 cDNA. Next, they were cloned into the EcoRI and EcoRV sites of the pEF4-His vector (Invitrogen) and into the SalI and SmaI sites of pPC86 (GIBCOBRL), respectively.
[0028]
A TRIM11 deficient mutant for the yeast two-hybrid assay was prepared as follows. TRIM11 (30-467) and TRIM11 (126-467) were obtained during yeast two-hybrid screening. TRIM11 (30-292), TRIM11 (30-128), and TRIM11 (266-128) include the TRIM11 (30-467) portion at 30-292.
5'-TATAACCGCGTTTGGAATCACT-3 '(base sequence 5),
5'-CTGGGTCCAGGGGTTATGTC-3 '(base sequence 6),
30-128
5′-CTGCAGCGGTCTCCACCCGGGTG-3 ′ (base sequence 7),
Also, at 266-467,
5′-GTGTCGACCATGGAGCTGAGGACCGTA-3 ′ (base sequence 8),
5′-AGAATTCGCTGCCGGGCCAAGGGTGTC-3 ′ (base sequence 9),
Obtained by amplifying each with primers. The PCR fragment was cloned into the SalI and EcoRI sites of pPC86. TRIM11 (30-467) was cloned into the KpnI and NotI sites of pcDNA-His (Invitrogen) for use in mammalian expression (TRIM11.N). TRIM11 (30-128) fragment of pPC86 vector was cloned into pEF4-His vector by using EcoRV and NotI site. TRIM11-coil-B30 is
5′-GTCGACCCATGCAGGAGGCGGGCGAC-3 ′ (base sequence 10);
5′-GATATCACTGCGGGCCAAGGGTGTC-3 ′ (base sequence 11),
The product amplified by PCR using as a primer was cloned into the EcoRV site of PEF4-His. The TRIM11 (266-467) fragment was cloned into the pEF4-His vector via EcoRV and NotI sites.
(TRIM11-B30). Mouse TRIM2 cDNA was obtained as a primer from total RNA of mouse E16 fetal brain by reverse transcription PCR (RT-PCR) using a High Fidelity RT-PCR kit (Takara).
5′-GATATCACCATGGCCAGTGAGGGCGCCAG-3 ′ (base sequence 12),
5'-ATCAGTTACTGTAAGTACCGCTAGAC-3 '(base sequence 13),
Was used to obtain a PCR fragment, which was cloned into the SaII-NotI site and the EcoRV-NotI site of the pPC86 and pEF4-His vectors, respectively. In addition, human TRIM8 cDNA is derived from normal human hippocampus cDNA (BioChain) as a primer.
5′-GATATCCACCATGGCGGAGAATTGGAAG-3 ′ (base sequence 14),
5′-ACTATAGTAGCTCGTCACGGTAGGTTTTG-3 ′ (base sequence 15),
Was cloned into pPC86 obtained by PCR using SmaI and XbaI sites.
[0029]
Embodiment 3
Immunoblot assay
The protein sample was treated with 10% SDSPAGE and transferred onto the PVDF membrane, and then the PVDFFP membrane was peeled off, and the treated protein sample was subjected to an anti-Xpress antibody (1/5000, Invitrogen) or an anti-FLAG antibody (M2,1 / 1). 5000, SIGMA), or anti-MBP antibody (1/5000, NEB), or anti-actin antibody (1/2500, SIGMA). The immunoreactive band was reacted with HRP-conjugated anti-mouse or anti-rabbit IgG (1/5000, Bio-Rad) and detected by ECL (Amersham Pharmacia).
[0030]
Embodiment 4
In vitro pull down assay
COS7 cells were cultured in DMEM (Sigma) containing 10% FBS (Hyclone) and antibiotics. Plasmid (5 g) was introduced into COS7 cells (1 x 106/100 mmdish) by lipofection (10? | LipofectAmine to 10. After 3 hours, the culture was converted to DMEM containing 10% FBS. For 48 hours after the introduction, the cells were washed with PBS and lysed with a cell lysis solution [25 mM Tris / HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% CHAPS]. Cell lysates were incubated at 4 ° C. for 30 minutes and centrifuged at 10,000 × g for 20 minutes. The resulting supernatant was used for binding experiments. The MBP fusion protein expressed on BL21 (DE3) pLysS was bound to amylose resin (NEB). After washing with 25 mM Tris / HCl (pH 7.5) containing 150 mM NaCl, the MBP fusion protein-resin complex was incubated with COS7 cell lysate for 1 hour at 4 ° C. After washing three times with the cell lysate, the bound substance on the resin was separated with SDSPAGE sample buffer, and immunoblot analysis was performed.
[0031]
Embodiment 5
Co-expression of TRIN11 and HN
F11 cells, which are hybrid cells of rat E13 primary cultured nerve and mouse neuroblastoma NTG18, are cultured in Ham's F12 (Sigma) culture solution containing 18% FBS and antibiotics, and F11 cells (1.5 × 105 cells / 60 mm dish) Was transfected with lipofection (1.2 g TRIM plasmid and 0.8 g EGFP, or GST plasmid and 4 PLUS reagent) under serum-free conditions. After 3 hours, the culture was supplemented with 18% FBS. After the introduction of the plasmid, the cells were reacted with lactacystin (Sigma) for 42 hours at 42 hours. The cells are then washed with PBS, 25 mM Tris / HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, chelating agent (5 mM EDTA), detergent (1% Triton X-100), and protease inhibitor (Complete, Roche) ) Was lysed. After centrifugation at 10,000 xg for 10 minutes, the supernatant was subjected to immunoblot analysis.
[0032]
Embodiment 6
Northern blot analysis
mRNA was isolated from mouse E14 primary cultured nerve, mouse E14 brain, and F11 cells using ISOGEN (Toyobo) and Oligotex dT30 <super> mRNA separation kit (Takara). MRNA samples from other mouse tissues were purchased from OriGene. Each mRNA 2? g was separated on a 1% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Biodyne B, Pole). The TRIM11 cDNA fragment was labeled with [P32] dCTP using a Ready-To-Go random labeling system (amersham Pharmacia) according to the manufacturer's instructions. The blots were hybridized with a radiolabeled probe in an ExpressHyb hybridization solution (Clontech). Following two washing steps, the membrane was exposed to X-ray film at -80 ° C according to the manufacturer's instructions.
[0033]
【The invention's effect】
The present invention has identified, for the first time, the function of TRIM11, a compound that controls or breaks down humanin (HN), which is a 24-amino acid peptide, that suppresses cell death of neuronal cell lines caused by Alzheimer's disease (AD). TRIM11 binds to and degrades HN. HN is a short peptide consisting of 24 amino acids that suppresses damage associated with AD. Therefore, HN is a clear target for achieving a novel therapy for AD. The present invention has shown that the level of HN synthesized in cells is completely controlled by TRIM11 via the proteasome pathway, and pharmacological suppression of TRIM11 is dependent on endogenous HN and HN. Can lead to overexpression of proteins, including the effect of achieving another AD therapy.
[0034]
[Sequence list]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 2: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 3: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 4: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 5: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 6: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 7: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 8: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 9: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 10: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 11: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 12: Primer sequence artificially synthesized
SEQ ID NO: 13: Primer sequence artificially synthesized
SEQ ID NO: 14: artificially synthesized primer sequence
SEQ ID NO: 15: Primer sequence artificially synthesized
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows in vivo interaction (A) by yeast two-hybrid assay and in vitro interaction (B) by pull-down assay.
FIG. 2 shows a Nordan blot analysis of mouse tissue mRNA using TRIM11 as a probe (A) and a cerebral cortical nerve of primary cultured E14 mouse embryo, and a Nordan blot analysis of E14 mouse fetal brain and F11 neuron using TRIM11 as a probe. It is a figure showing B).
FIG. 3 shows the effects of a proteasome inhibitor on the intracellular levels of HN and TRIM11 (A, B, C).
FIG. 4 is a diagram (Aa, Ab, B) showing the effect of a TRIM defective mutant on HN expression level.
