JP2004261068A - Method for detecting single nucleotide substitution and kit for detecting single nucleotide substitution - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To minimize the number of steps and to simply and rapidly detect gene single nucleotide substitution. <P>SOLUTION: A base at a position corresponding to a target base 11 between a single-stranded target nucleic acid 10 containing the target base 11 related to SNP and a single-stranded nucleic acid 20 to be hybridized into a base-deleted part 21 is previously removed. The target nucleic acid 10 is hybridized with the nucleic acid 20 for detection so that a hydrophobic field space is intentionally constructed around the target base 11. Then a hydrogen bond type receptor molecule 30 is inserted into the hydrophobic field space. Then the change in fluorescence intensity of the receptor molecule based on difference in the target base is detected to detect single nucleotide substitution. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）分野において特に有用な一塩基置換検出方法及びその方法を用いた一塩基置換検出用キットに関し、特に遺伝子配列における一塩基置換（ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を簡便且つ迅速に検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトゲノム配列が解読された今日の研究目標の１つは、遺伝子の同定、機能の解析、さらに遺伝子発現や機能に影響して個体差を決める遺伝子の多様性である。ここで、核酸塩基配列中の一塩基の違いから生じる遺伝子の個体差のことを一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ） と呼び、遺伝子中に点在するＳＮＰが各種疾患と強く関連することが明らかとなっている。
【０００３】
現在、この一塩基置換を検出する方法としては、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をゲルにより分離した後、色素でＤＮＡ断片を染色・検出するという電気泳動法が挙げられる。この方法は汎用されているものの、分離や染色に必要な時間が長く、迅速性に欠けるという欠点がある。
【０００４】
また、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板も、一塩基置換の検出に利用され始めている。このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種多数のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖やｃＤＮＡ等が集積されていることから、一度に多数の遺伝子検査が可能であり、臨床検査現場等への適用が期待されている。しかしながら、核酸塩基のミスマッチ形成に由来するＤＮＡ二本鎖の安定性を原理とする手法であるため、塩基配列によってはその温度制御が困難であり、さらに放射性物質や蛍光色素を被検体自体に修飾する前処理が必要である等の問題がある。
【０００５】
さらに、被検体の増幅と検出を同時に行うリアルタイムＰＣＲ法が、核酸増幅法による一段階の迅速な定量測定の技術として、近年普及しつつある。しかしながら、増幅反応における複雑な温度制御、プローブの導入も含めた各遺伝子配列に適用するプライマーの設計が複雑である上に、増幅装置や条件によって結果が異なる場合も少なくなく、再現性の面においても課題を残している。
【０００６】
このように、従来の遺伝子変異を検出する技術は、精密な温度制御、煩雑な被検体の前処理、測定までの時間が長い等の問題があり、簡便且つ迅速に遺伝子検査を行うことが不可能であった。
【０００７】
一方、下記非特許文献１には、ミスマッチ塩基対に結合する分子リガンドを固定化した表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）センサーを利用した新規な一塩基置換検出方法が提案されている。この文献記載の方法によれば、ＳＮＰを持つ２種類のＤＮＡからミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成し、このＤＮＡ溶液をナフチリジン二量体が固定化されたＳＰＲセンサーチップ上に流してＳＰＲ信号強度を検出することにより、一塩基置換を迅速に検出することができる。
【０００８】
【非特許文献１】
中谷和彦，山東信介，齋藤烈 著，「表面プラズモン共鳴を利用した合成リガンドによるＤＮＡ中グアニン−グアニンミスマッチの検出法（Ｓｃａｎｎｎｉｇ ｏｆ ｇｕａｎｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）」，ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），２００１年１月，第１９号，ｐ．５１−５５
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、この非特許文献１に記載の技術では、一塩基置換を検出するために予めミスマッチ塩基対を含むヘテロＤＮＡを作成する必要があり、ＳＰＲセンサーを用いる必要もあるため、より簡便且つ迅速に遺伝子検査を行う方法が望まれている。
【００１０】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、工程数を極力減らし、簡便且つ迅速に遺伝子の一塩基置換を検出する一塩基置換検出方法及び一塩基置換検出用キットを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するために、本発明に係る一塩基置換検出方法は、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ該一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸を調製する工程と、上記標的核酸と上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成する工程と、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加し、上記一塩基置換部位と水素結合を形成させる工程と、上記レセプターの蛍光強度を測定する工程とを有する。
【００１２】
ここで、上記レセプターは、複素環式芳香族基を有し、上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記一塩基置換部位と対を形成するものが望ましい。具体的には、ナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであり、例えば２−アミノ−７−メチルナフチリジン又は２−アミノ−４−オキソプテリジンである。
【００１３】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットは、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と、該標的核酸と相補的であり、且つ上記一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させ、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加して上記一塩基置換部位と水素結合を形成させ、上記レセプターの蛍光強度を測定するためのものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
一般に、水素結合を利用する核酸塩基認識では、レセプター分子の水素結合様式や数を変化させることで、比較的容易に高い塩基選択性を獲得できる特徴を持つ。この際、完全水溶液中では水素結合形成に基づく認識機能の発現は期待できないため、従来の研究の多くは、クロロホルム中のような無極性溶媒環境下に限定されていたが、溶媒中の核酸が変性、沈殿する要因ともなっていた。
【００１５】
そこで、本実施の形態では、図１に概念的に示すように、ＳＮＰに関連する標的塩基１１を含む一本鎖の標的核酸１０とハイブリダイゼーションさせる一本鎖の検出用核酸２０のうち、標的塩基１１に対応する位置の塩基を予め除き、脱塩基部位２１としておく。そして、これらの標的核酸１０及び検出用核酸２０をハイブリダイゼーションさせることで標的塩基１１の周辺に意図的に疎水場空間を構築した後、この疎水場空間に水素結合型のレセプター分子３０を挿入する。
【００１６】
このように、核酸塩基を除いて構築された疎水場空間内に水素結合性のレセプター分子３０を挿入し、標的塩基１１と水素結合を形成させることで、完全水溶液中においても効果的に核酸塩基認識を行い、標的塩基１１の変異を検出することができる。
【００１７】
ここで、本実施の形態で分析可能な標的核酸１０としては、例えばヒトや植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡ等が挙げられるが、特に限定されず、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行う。
【００１８】
また、水素結合性を有するレセプター分子３０としては、水素結合部位を有し、発蛍光性であるような試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、脱塩基部位に隣接する核酸塩基とスタッキングできるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性を有する試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなレセプター分子としては、例えばナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体、インダゾール誘導体等が挙げられる。
【００１９】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例では、レセプター分子として、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である（ａ）２−アミノ−７−メチルナフチリジン（ＡＭＮＤ）と、プテリジン誘導体である（ｂ）２−アミノ−４−オキソプテリジン（プテリン）とを準備した。このうち、プテリンは和光純薬株式会社から購入し（Ｃａｔ．Ｎｏ．５３９−３２６１１）、ＡＭＮＤは、文献「Ｅ．Ｖ．Ｂｒｏｗｎ， Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．３０， ｐ１６０７， １９６５」を参考にして、１，１−ジメトキシブタノンから合成した。
【００２１】
【化１】

【００２２】
この２つのレセプター分子は発蛍光性を有し、後述するように、検出用ＤＮＡの脱塩基部位に挿入されたときに標的塩基と相互作用し、標的塩基の違いに基づき蛍光強度が変化するため、蛍光強度を測定することで一塩基置換を検出することができる。
【００２３】
ここで、ＤＮＡとレセプター分子とを混合する際、レセプター分子は、該レセプター分子を含有する溶液の形態で混合してもよく、粉末や固形状の形態で混合してもよい。また、蛍光測定は、ＵＶランプを用いて目視で行ってもよく、蛍光分光器、蛍光顕微鏡、デンシトメーター等の機器を用いてもよい。
【００２４】
また、レセプター分子による一塩基置換検出の効果を検証するために、以下のような検出用ＤＮＡ（配列Ａ）と標的ＤＮＡ（配列Ｂ）とをモデル配列として、株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。
（配列Ａ）５’−ＴＣＣＡＧＸＧＣＡＡＣ−３’（配列番号１）
（配列Ｂ）３’−ＡＧＧＴＣＮＣＧＴＴＧ−５’（配列番号２〜５）
ここで、上記配列中、Ｘは脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）であり、具体的には以下の化学式に示すようなテトラヒドロフラニル残基（ｄＳｐａｃｅｒ）を示す。また、ＮはＧ（配列番号２），Ｃ（配列番号３），Ａ（配列番号４），Ｔ（配列番号５）の何れかを示す。
【００２５】
【化２】

【００２６】
実施例１
ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）の測定
実施例１では、二本鎖が一本鎖に解離する融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ）を測定し、レセプター分子の添加前後におけるＴｍ値の変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖の検出用ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖の標的ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、イオン強度調節剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、緩衝剤として１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含むカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ５８０μＭ、２９０μＭとなるようにＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液を毎秒１．５℃の割合で加熱してＴｍ値を測定した。
【００２７】
ここで、一本鎖ＤＮＡの濃度は、文献「Ｐｕｇｌｉｓｉ Ｊ．Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１８０， ｐ３０４−ｐ３２５， １９８９」を参考にして、モル吸光係数算出法を用いて吸光度で調整した。この際、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）のモル吸光係数は、ＴＣＧＧＡの吸光係数とＧＣＡＡＣの吸光係数との和とした。また、アニーリングは、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間加熱した後、毎秒３℃の割合で５℃まで冷却し、毎秒１℃の割合で２０℃まで再度加熱することにより行った。
【００２８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、レセプター分子の添加前のＴｍ値（Ｔｍ_（−））、添加後のＴｍ値（Ｔｍ_（＋））及びその変化量（ΔＴｍ）の測定結果を以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】

【００３０】
表１に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＡ＜Ｇ＜Ｔ＜Ｃの順でＴｍ値が上昇しており、ＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性が確認できる。一方、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧである場合にＴｍ値が有意に上昇しており、プテリンのグアニン選択性が確認できる。
【００３１】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図２に示す。図２に示すように、ＡＭＮＤ添加によるＴｍ値の上昇は比較的低濃度から生じ、５００μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３２】
実施例２
ＣＤスペクトルの測定
実施例２では、二本鎖のＣＤスペクトルを測定し、レセプター分子の添加前後におけるＣＤスペクトルの変化から、ＤＮＡとの相互作用を検討した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が３０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤが７２．５μＭとなるようにＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、ＣＤスペクトルを測定した。
【００３３】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤの添加前（破線）及び添加後（実線）のＣＤスペクトルの結果を図３（ａ）〜（ｄ）に示す。図３に示すように、標的塩基ＮがＣ，Ｔのときに選択的にＣＤスペクトルが変化していることが確認される。これは実施例１におけるＡＭＮＤのピリミジン塩基選択性の結果を支持するものであった。
【００３４】
また、Ｎ＝Ｃである二本鎖ＤＮＡを３０μＭ含むＤＮＡ溶液にＡＭＮＤを添加した場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性について検討した。結果を図４に示す。なお、図４には、二本鎖ＤＮＡ溶液に７２．５μＭのＡＭＮＤを添加する前（破線）と添加した後（実線）の吸光度と、５８０μＭのＡＭＮＤの吸光度とを併せて示している。図４に示すように、ＡＭＮＤ濃度の上昇に応じて、特に２４５ｎｍ付近及び２８０ｎｍ付近でモル楕円率θが上昇しており、３０μＭの濃度以上でほぼ完全に上昇が飽和に達している。
【００３５】
波長が２７８．５ｎｍのときのＡＭＮＤ濃度とモル楕円率θとの関係を図５に示す。図５に示すように、ＡＭＮＤ添加によるモル楕円率θの上昇は３０μＭの濃度以上でほぼ完全に飽和に達している。この結果、ＡＭＮＤの標的塩基Ｎへの結合定数Ｋ_１１は１０^６Ｍ^−１以上と求められ、ＡＭＮＤが脱塩基部位Ｘに安定に取り込まれていることが分かる。
【００３６】
実施例３
立体構造の検討
実施例３では、標的塩基ＮがＣ，Ｔ，Ａ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Ｍａｃｒｏ Ｍｏｄｅｌ）による最安定化構造を検討した。シミュレーション結果を図６（ａ）〜（ｄ）に示す。図６に示すように、標的塩基ＮがＣの場合にはＡＭＮＤ分子が隣接するグアニン残基と重なっているのに対し、それ以外の場合には隣接するグアニン残基からずれていることが確認できる。この結果から、ＡＭＮＤの塩基選択性が標的塩基Ｎとの水素結合形成、及び隣接する核酸塩基とのスタッキング相互作用に由来するものであることが推察される。
【００３７】
実施例４
蛍光スペクトルの測定
実施例４では、レセプター分子添加後の蛍光強度の減少値（−ΔＦ．Ｉ．）を測定した。具体的には、脱塩基部位を含む一本鎖ＤＮＡ（上記配列Ａ）と被検体となる一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｂ）とがアニーリングした二本鎖ＤＮＡ溶液が６０μＭ、ＮａＣｌが１００ｍＭ、ＥＤＴＡが１ｍＭ、カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、レセプター分子としてＡＭＮＤ又はプテリンがそれぞれ６０μＭ、１５μＭとなるようにＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製したＤＮＡ溶液について、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００３８】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＮがＧ，Ｃ，Ａ，Ｔである場合のそれぞれについて、ＡＭＮＤ、プテリンの添加後における蛍光強度の減少値をそれぞれ図７、図８に示す。ここで、図７は励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４０２ｎｍであり、図８は励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４５ｎｍである。図７、８に示すように、ＡＭＮＤを添加した場合には、標的塩基ＮがＣ，Ｔといったピリミジン塩基のときに選択的に消光しており、プテリンを添加した場合には、標的塩基ＮがＧのときに選択的に消光している。
【００３９】
実施例５
実際の配列での検討１
実施例５では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７７番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）であり、ＳはＧ（グアニン）又はＣ（シトシン）を示す。
（配列Ｃ）５’−ＣＴＧＣＣＳＣＣＡＣＣ−３’（配列番号６，７）
（配列Ｄ）３’−ＧＡＣＧＧＸＧＧＴＧＧ−５’（配列番号８）
上記配列Ｃにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｓは、正常型ではＣ（配列番号６）であり、変異型ではＧ（配列番号７）である。これにより、１７７番アミノ酸はプロリンからアルギニンに変異する。本実施例では、このＣからＧへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子としては、標的塩基ＳがＣであるときに選択的に消光するＡＭＮＤを用いた。
【００４０】
具体的には、被検体となる１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｃ）と脱塩基部位を含む１Ｍの一本鎖ＤＮＡ溶液（上記配列Ｄ）とをそれぞれ２５μｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌを５０μｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を５０μｌ、１２５μＭ ＡＭＮＤを５０μｌ混合し、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて全量を２５０μｌとした。得られたＤＮＡ溶液について、サーマルサイクラーでアニーリング処理を行ったものと行わなかったものとを準備し、蛍光強度を測定した。蛍光測定は、光路長１ｍｍの蛍光測定用セルを用い、反射蛍光測定により行った。
【００４１】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＳがＣ，Ｇである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ_０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ_０）を図９に示す。ここで、図９における励起波長は３５０ｎｍであり、蛍光波長は４００ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２，０３はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図９に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＳがＣ（シトシン）であるかＧ（グアニン）であるかを知ることができる。
【００４２】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液をプラスチック製の透明チューブに入れ、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いて蛍光を目視検出した結果を図１０に示す。図１０に示すように、標的塩基ＳがＣである場合に著しく消光しており、目視でも確認可能である。
【００４３】
実施例６
実際の配列での検討２
実施例６では、実際のｐ５３関連遺伝子の１７５番アミノ酸における一塩基置換を検出する効果を検証するために、以下のような配列を株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。ここで、下記配列中、Ｘは脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）であり、ＲはＧ（グアニン）又はＡ（アデニン）を示す。
（配列Ｅ）５’−ＧＡＧＧＣＲＣＴＧＣＣ−３’（配列番号９，１０）
（配列Ｆ）３’−ＣＴＣＣＧＸＧＡＣＧＧ−５’（配列番号１１）
上記配列Ｅにおいて、脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基Ｒは、正常型ではＧ（配列番号９）であり、変異型ではＡ（配列番号１０）である。これにより、１７５番アミノ酸はアルギニンからヒスチジンに変異する。本実施例では、このＧからＡへの変異を検出するために脱塩基部位Ｘを設け、構築された疎水場空間にレセプター分子を導入した。なお、レセプター分子として標的塩基ＲがＧであるときに選択的に消光するプテリンを用いた以外は、実施例５と同様にして行った。
【００４４】
脱塩基部位Ｘに対応する標的塩基ＲがＧ，Ａである場合のそれぞれについて、ＤＮＡを加えなかった場合の蛍光強度（Ｆ_０）と、加えた場合の蛍光強度（Ｆ）との比（Ｆ／Ｆ_０）を図１１に示す。ここで、図１１における励起波長は３６０ｎｍであり、蛍光波長は４４０ｎｍである。また、サンプル０１はアニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液であり、サンプル０２はアニーリング処理を行ったＤＮＡ溶液である。図１１に示すように、標的塩基ＲがＧである場合に消光しているため、消光の有無を検出することで、標的塩基ＲがＧ（グアニン）であるかＡ（アデニン）であるかを知ることができる。
【００４５】
アニーリング処理を行わなかったＤＮＡ溶液について、励起波長３０２ｎｍのＵＶランプを用いることで、蛍光を目視検出した結果を図１２に示す。図１２に示すように、対応塩基ＲがＧである場合に消光しており、目視でも確認可能である。
【００４６】
このように、本実施の形態における一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的ＤＮＡと、この標的ＤＮＡと相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用ＤＮＡとで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプター分子を添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプター分子の蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を効果的に検出することができる。
【００４７】
特に、被検体となる標的ＤＮＡのラベル化や熱制御等の煩雑な操作が原則的に不要であるため工程数が非常に少なく、また、原理上二本鎖ＤＮＡ自体の熱的な安定性に依存しないため、検出までの時間が非常に短時間であり、再現性にも優れている。また、ＵＶランプを用いた目視による確認も可能であるため、特別な設備を持たない状況下においても検出が可能である。
【００４８】
さらに、脱塩基部位を含む検出用ＤＮＡを基板に多数集積したＤＮＡマイクロアレイを作製し、一塩基置換検出用キットとして用いることで、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明に係る一塩基置換検出方法によれば、一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と、この標的核酸と相補的であり、且つ一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させ、この二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加して一塩基置換部位と水素結合を形成させ、このレセプターの蛍光強度変化を測定することにより、一塩基置換を簡便且つ迅速に検出することができる。
【００５０】
また、本発明に係る一塩基置換検出用キットによれば、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
【００５１】
【配列表】

【配列表フリーテキスト】
配列番号１：人工的に合成された１１−ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号２：人工的に合成された配列
配列番号３：人工的に合成された配列
配列番号４：人工的に合成された配列
配列番号５：人工的に合成された配列
配列番号６：人工的に合成された配列
配列番号７：人工的に合成された配列
配列番号８：人工的に合成された１１−ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号９：人工的に合成された配列
配列番号１０：人工的に合成された配列
配列番号１１：人工的に合成された１１−ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。６番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施の形態における一塩基検出の原理を説明する図である。
【図２】標的塩基がシトシンである場合のＴｍ値のＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図３】標的塩基がアデニン、シトシン、グアニン、チミンである場合のＡＭＮＤの添加前後のＣＤスペクトルを示す図である。
【図４】標的塩基がシトシンである場合のＣＤスペクトルのＡＭＮＤ濃度依存性を示す図である。
【図５】標的塩基がシトシンである場合のＡＭＮＤ濃度とモル楕円率との関係を示す図である。
【図６】ＡＭＮＤ添加後のＡｍｂｅｒ力場（Ｍａｃｒｏ Ｍｏｄｅｌ）による最安定化構造を示す図であり、
【図７】ＡＭＮＤ添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図８】プテリン添加後の蛍光強度の減少値を示す図である。
【図９】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１０】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のＡＭＮＤ添加後の蛍光を示す図である。
【図１１】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光スペクトルを示す図である。
【図１２】標的塩基がシトシン、グアニンである場合のプテリン添加後の蛍光を示す図である。
【符号の説明】
１０ 標的核酸、１１ 標的塩基、２０ 検出用核酸、２１ 脱塩基部位、３０ レセプター分子[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for detecting a single nucleotide substitution particularly useful in the field of bioinformatics (bioinformatics) and a kit for detecting a single nucleotide substitution using the method, and particularly to a method for easily and quickly performing a single nucleotide substitution (point mutation) in a gene sequence. And a kit for detecting a single base substitution.
[0002]
[Prior art]
One of the goals of today's research into the deciphering of the human genome sequence is gene identification, functional analysis, and gene diversity that determines gene differences that affect gene expression and function. Here, an individual difference of a gene caused by a single base difference in a nucleic acid base sequence is called a single nucleotide polymorphism (SNP), and SNPs scattered in a gene are strongly associated with various diseases. Is evident.
[0003]
At present, as a method for detecting the single base substitution, there is an electrophoresis method in which a DNA fragment cut with a restriction enzyme is separated by gel, and then the DNA fragment is stained and detected with a dye. Although this method is widely used, it has the disadvantage that the time required for separation and staining is long, and the method lacks rapidity.
[0004]
In addition, integrated substrates for bioassays called so-called DNA chips, in which predetermined DNAs are finely arranged by microarray technology, have begun to be used for detection of single base substitution. Since this DNA chip has a large number of DNA oligonucleotide chains and cDNAs integrated on a glass substrate or silicon substrate, it is possible to perform a large number of genetic tests at once, and is expected to be applied to clinical testing sites and the like. Have been. However, since it is a method based on the principle of stability of DNA duplex derived from nucleobase mismatch formation, it is difficult to control the temperature depending on the base sequence, and furthermore, the radioactive substance or fluorescent dye is modified on the subject itself. There is a problem that pre-processing is required.
[0005]
Furthermore, a real-time PCR method for simultaneously amplifying and detecting an analyte has been spreading in recent years as a one-step rapid quantitative measurement technique by a nucleic acid amplification method. However, the temperature control in the amplification reaction, the design of primers applied to each gene sequence including the introduction of probes is complicated, and the results often differ depending on the amplification equipment and conditions. Still have challenges.
[0006]
As described above, the conventional technology for detecting a gene mutation has problems such as precise temperature control, complicated pretreatment of a subject, and a long time until measurement, and it is difficult to perform a simple and quick genetic test. It was possible.
[0007]
On the other hand, Non-Patent Document 1 listed below proposes a novel single-base substitution detection method using a surface plasmon resonance (SPR) sensor in which a molecular ligand that binds to a mismatched base pair is immobilized. According to the method described in this document, heterologous DNA containing mismatched base pairs is prepared from two types of DNA having SNPs, and this DNA solution is flowed over an SPR sensor chip on which a naphthyridine dimer is immobilized to generate an SPR signal. By detecting the intensity, the single base substitution can be quickly detected.
[0008]
[Non-patent document 1]
Kazuhiko Nakatani, Shinsuke Yamato and Retsu Saito, "A method for detecting guanine-guanine mismatches in DNA using synthetic ligands utilizing surface plasmon resonance (Scanning of guanine-mismatches in DNA by synthetic linguistics). Technology (Nature Biotechnology), January 2001, No. 19, p. 51-55
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the technique described in Non-Patent Document 1, it is necessary to prepare a hetero DNA containing a mismatched base pair in advance in order to detect a single base substitution, and it is necessary to use an SPR sensor. A method for performing a genetic test is desired.
[0010]
The present invention has been proposed in view of such conventional circumstances, a method for detecting a single nucleotide substitution and a kit for detecting a single nucleotide substitution, which can reduce the number of steps as much as possible and simply and quickly detect a single nucleotide substitution in a gene. The purpose is to provide.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above-mentioned object, the method for detecting a single nucleotide substitution according to the present invention is complementary to a single-stranded target nucleic acid having a single nucleotide substitution site, and a corresponding base corresponding to the single nucleotide substitution site. A step of preparing a single-stranded nucleic acid for detection removed, a step of forming a double-stranded nucleic acid with the target nucleic acid and the nucleic acid for detection, and imparting hydrogen bonding and fluorescence to the double-stranded nucleic acid. A step of adding a receptor to form a hydrogen bond with the single base substitution site, and a step of measuring the fluorescence intensity of the receptor.
[0012]
Here, the receptor has a heterocyclic aromatic group, and is stabilized by the formation of hydrogen bonds with the monobasic substitution site and the stacking interaction with bases around the corresponding base. Those that form a pair with the base substitution site are desirable. Specifically, it is at least one of the group consisting of a naphthyridine derivative, a quinoline derivative, a pteridine derivative, a coumarin derivative and an indazole derivative, for example, 2-amino-7-methylnaphthyridine or 2-amino-4-oxopteridine.
[0013]
Further, the kit for detecting a single nucleotide substitution according to the present invention includes a single-stranded target nucleic acid having a single nucleotide substitution site and a corresponding base complementary to the target nucleic acid and corresponding to the single nucleotide substitution site. A double-stranded nucleic acid is formed with the single-stranded nucleic acid for detection, and a hydrogen-bonding and fluorescent receptor is added to the double-stranded nucleic acid to form a hydrogen bond with the single-base substitution site. , For measuring the fluorescence intensity of the receptor.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In general, nucleobase recognition using hydrogen bonding has a feature that high base selectivity can be obtained relatively easily by changing the hydrogen bonding mode and the number of receptor molecules. At this time, since expression of a recognition function based on hydrogen bond formation cannot be expected in a complete aqueous solution, most of the conventional research has been limited to a nonpolar solvent environment such as in chloroform. It was a factor of denaturation and precipitation.
[0015]
Therefore, in the present embodiment, as conceptually shown in FIG. 1, of the single-stranded detection nucleic acid 20 to be hybridized with the single-stranded target nucleic acid 10 containing the target base 11 related to the SNP, The base at the position corresponding to the base 11 is removed in advance, leaving the abasic site 21. Then, after the target nucleic acid 10 and the detection nucleic acid 20 are hybridized, a hydrophobic field space is intentionally constructed around the target base 11, and the hydrogen bond type receptor molecule 30 is inserted into the hydrophobic field space. .
[0016]
Thus, by inserting the hydrogen bonding receptor molecule 30 into the hydrophobic space constructed by removing the nucleobase and forming a hydrogen bond with the target base 11, the nucleobase can be effectively formed even in a complete aqueous solution. Recognition can be performed, and the mutation of the target base 11 can be detected.
[0017]
Here, the target nucleic acid 10 that can be analyzed in the present embodiment includes, for example, DNA and cDNA derived from humans and plants, but is not particularly limited, and dilution, concentration, and amplification are performed as necessary.
[0018]
As the receptor molecule 30 having a hydrogen bonding property, a reagent having a hydrogen bonding site and being fluorescent is preferable. Specifically, a reagent having at least one, preferably a plurality of stages of hydrogen bonding sites and having a heterocyclic aromatic group capable of stacking with a nucleobase adjacent to the abasic site is desirable. Particularly, a water-soluble reagent is preferable. However, in the case of a water-insoluble reagent, it is possible to use a small amount of an organic solvent. Examples of such receptor molecules include naphthyridine derivatives, quinoline derivatives, pteridine derivatives, coumarin derivatives, indazole derivatives and the like.
[0019]
Hereinafter, specific embodiments to which the present invention is applied will be described in detail with reference to the drawings. However, the present invention is not limited to the following embodiments, and various modifications may be made without departing from the spirit of the present invention. Of course, changes are possible.
[0020]
【Example】
In the following examples, as receptor molecules, (a) 2-amino-7-methylnaphthyridine (AMND), which is a naphthyridine derivative represented by the following chemical formula, and (b) 2-amino-4-, which is a pteridine derivative: Oxopteridine (pterin) was prepared. Among them, pterin was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Cat. No. 539-32611), and AMND published the document "EV Brown, J. Org. Chem., Vol. 30, p1607, 1965". For reference, it was synthesized from 1,1-dimethoxybutanone.
[0021]
Embedded image

[0022]
These two receptor molecules have a fluorescent property, and as described later, interact with a target base when inserted into the abasic site of the detection DNA, so that the fluorescence intensity changes based on the difference in the target base. By measuring the fluorescence intensity, single base substitution can be detected.
[0023]
Here, when mixing the DNA and the receptor molecule, the receptor molecule may be mixed in the form of a solution containing the receptor molecule, or may be mixed in the form of a powder or a solid. The fluorescence measurement may be performed visually using a UV lamp, or may be performed using a device such as a fluorescence spectroscope, a fluorescence microscope, or a densitometer.
[0024]
In addition, in order to verify the effect of single nucleotide substitution detection by a receptor molecule, an order was received from the Japan Genetic Research Institute, Inc. using the following detection DNA (sequence A) and target DNA (sequence B) as model sequences. And synthesized.
(Sequence A) 5′-TCCAGXGCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 1)
(Sequence B) 3′-AGGTCNCGTTG-5 ′ (SEQ ID NOs: 2 to 5)
Here, in the above sequence, X is an abasic site (AP site), and specifically represents a tetrahydrofuranyl residue (dSpacer) represented by the following chemical formula. N represents any one of G (SEQ ID NO: 2), C (SEQ ID NO: 3), A (SEQ ID NO: 4), and T (SEQ ID NO: 5).
[0025]
Embedded image

[0026]
Example 1
Measurement of DNA melting temperature (Tm) In Example 1, the melting temperature (Tm) at which a double strand dissociates into a single strand was measured, and the Tm value before and after the addition of the receptor molecule was measured. The interaction with DNA was examined. Specifically, a double-stranded DNA solution obtained by annealing a single-stranded detection DNA containing an abasic site (the above-described sequence A) and a single-stranded target DNA solution (the above-described sequence B) to be tested is 30 μM. MilliQ water such that NaCl is 100 mM as an ionic strength regulator, sodium cacodylate (pH 7.0) containing 1 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) is 10 mM as a buffer, and AMND or pterin is 580 μM and 290 μM, respectively, as a receptor molecule. Was heated at a rate of 1.5 ° C./sec to measure the Tm value.
[0027]
Here, the concentration of the single-stranded DNA is determined by using a molar extinction coefficient calculation method with reference to the document "Puglisi JD et al., Methods in energy, Vol. 180, p304-p325, 1989". Was adjusted. At this time, the molar extinction coefficient of the single-stranded DNA containing the abasic site (sequence A) was the sum of the extinction coefficient of TCGGA and the extinction coefficient of GCAAC. Annealing was performed by heating at 75 ° C. for 10 minutes using a thermal cycler, cooling to 5 ° C. at a rate of 3 ° C. per second, and heating again to 20 ° C. at a rate of 1 ° C. per second.
[0028]
For each of the cases where the target base N corresponding to the abasic site X is G, C, A, T, the Tm value before addition of the receptor molecule (Tm _(-) ) and the Tm value after addition (Tm ₍₊₎ ) And the change (ΔTm) are shown in Table 1 below.
[0029]
[Table 1]

[0030]
As shown in Table 1, when AMND was added, the Tm value of the target base N increased in the order of A <G <T <C, and the pyrimidine base selectivity of AMND could be confirmed. On the other hand, when pterin was added, when the target base N was G, the Tm value was significantly increased, confirming the guanine selectivity of pterin.
[0031]
Further, the dependency of Tm value on AMND concentration when AMND was added to a DNA solution containing 30 μM of double-stranded DNA in which N = C was examined. FIG. 2 shows the results. As shown in FIG. 2, the increase in the Tm value due to the addition of AMND occurs from a relatively low concentration, and the increase almost completely reaches saturation at a concentration of 500 μM or more.
[0032]
Example 2
Measurement of CD spectrum In Example 2, the double-stranded CD spectrum was measured, and the interaction with DNA was examined from the change in the CD spectrum before and after the addition of the receptor molecule. Specifically, a single-stranded DNA solution containing the abasic site (the above-mentioned sequence A) and a single-stranded DNA solution (the above-mentioned sequence B) to be tested were annealed to give a double-stranded DNA solution of 30 μM, NaCl of 100 mM, The CD spectrum was measured for a DNA solution prepared by adding MilliQ water so that EDTA was 1 mM, sodium cacodylate (pH 7.0) was 10 mM, and AMND was 72.5 μM as a receptor molecule.
[0033]
For each of the cases where the target base N corresponding to the abasic site X is A, C, G, T, the CD spectrum results before (broken line) and after (solid line) addition of AMND are shown in FIGS. (D). As shown in FIG. 3, it is confirmed that the CD spectrum is selectively changed when the target bases N are C and T. This supported the result of pyrimidine base selectivity of AMND in Example 1.
[0034]
Further, the dependence of the CD spectrum on the AMND concentration when AMND was added to a DNA solution containing 30 μM of double-stranded DNA in which N = C was examined. FIG. 4 shows the results. FIG. 4 also shows the absorbance before (broken line) and after (solid line) the addition of 72.5 μM AMND to the double-stranded DNA solution and the absorbance of 580 μM AMND. As shown in FIG. 4, as the AMND concentration increases, the molar ellipticity θ increases particularly around 245 nm and 280 nm, and the increase almost completely reaches saturation at a concentration of 30 μM or more.
[0035]
FIG. 5 shows the relationship between the AMND concentration and the molar ellipticity θ when the wavelength is 278.5 nm. As shown in FIG. 5, the increase of the molar ellipticity θ due to the addition of AMND reaches almost completely the saturation at a concentration of 30 μM or more. As a result, the binding constant K ₁₁ of AMND to the target base N was determined to be 10 ⁶ M ⁻¹ or more, indicating that AMND was stably incorporated into the abasic site X.
[0036]
Example 3
Examination of three-dimensional structure In Example 3, for each of the cases where the target bases N were C, T, A, and G, the most stabilized structure by the Amber force field (Macro Model) after the addition of AMND was examined. . The simulation results are shown in FIGS. As shown in FIG. 6, when the target base N is C, the AMND molecule overlaps with the adjacent guanine residue, whereas in other cases, the AMND molecule is shifted from the adjacent guanine residue. it can. From these results, it is inferred that the base selectivity of AMND is derived from hydrogen bond formation with the target base N and stacking interaction with the adjacent nucleobase.
[0037]
Example 4
Measurement of fluorescence spectrum In Example 4, the decrease value (-[Delta] FI) of the fluorescence intensity after addition of the receptor molecule was measured. Specifically, a single-stranded DNA containing an abasic site (the above-mentioned sequence A) and a single-stranded DNA solution (the above-mentioned sequence B) to be annealed are annealed double-stranded DNA solution at 60 μM, NaCl at 100 mM, Fluorescence intensity was measured for a DNA solution prepared by adding MilliQ water so that EDTA was 1 mM, sodium cacodylate (pH 7.0) was 10 mM, and AMND or pterin was 60 μM and 15 μM, respectively, as a receptor molecule. The fluorescence measurement was performed by reflection fluorescence measurement using a fluorescence measurement cell having an optical path length of 1 mm.
[0038]
For each of the cases where the target bases N corresponding to the abasic site X are G, C, A, and T, the decrease values of the fluorescence intensity after the addition of AMND and pterin are shown in FIGS. 7 and 8, respectively. Here, FIG. 7 shows an excitation wavelength of 355 nm and a fluorescence wavelength of 402 nm, and FIG. 8 shows an excitation wavelength of 360 nm and a fluorescence wavelength of 445 nm. As shown in FIGS. 7 and 8, when AMND was added, the target base N was selectively quenched when a pyrimidine base such as C or T was added. When pterin was added, the target base N was not quenched. Light is selectively extinguished at G.
[0039]
Example 5
Examination with actual arrangement 1
In Example 5, in order to verify the effect of detecting a single base substitution at the 177th amino acid of the actual p53-related gene, the following sequence was ordered and synthesized by the Japan Genetic Research Institute, Inc. Here, in the following sequence, X represents an abasic site (AP site), and S represents G (guanine) or C (cytosine).
(Sequence C) 5′-CTGCCSCCACC-3 ′ (SEQ ID NOs: 6, 7)
(Sequence D) 3′-GACGGGXGTGG-5 ′ (SEQ ID NO: 8)
In the sequence C, the target base S corresponding to the abasic site X is C (SEQ ID NO: 6) in the normal type and G (SEQ ID NO: 7) in the mutant type. Thereby, the 177th amino acid changes from proline to arginine. In this example, an abasic site X was provided to detect this C-to-G mutation, and a receptor molecule was introduced into the constructed hydrophobic field space. As the receptor molecule, AMND that selectively quench when the target base S is C was used.
[0040]
Specifically, 25 μl each of a 1 M single-stranded DNA solution (sequence C described above) and a 1 M single-stranded DNA solution containing an abasic site (sequence D described above), 50 μl of 500 mM NaCl, and 5 mM 50 μl of 50 mM sodium cacodylate (pH 7.0) containing EDTA and 50 μl of 125 μM AMND were mixed, and MilliQ water was added to make a total volume of 250 μl. With respect to the obtained DNA solution, those subjected to annealing treatment with a thermal cycler and those not subjected to annealing treatment were prepared, and the fluorescence intensity was measured. The fluorescence measurement was performed by reflection fluorescence measurement using a fluorescence measurement cell having an optical path length of 1 mm.
[0041]
For each of the cases where the target bases S corresponding to the abasic site X are C and G, the ratio (F ₀ ) between the fluorescence intensity (F ₀ ) when no DNA was added and the fluorescence intensity (F) when DNA was added. / F ₀ ) is shown in FIG. Here, the excitation wavelength in FIG. 9 is 350 nm, and the fluorescence wavelength is 400 nm. Sample 01 is a DNA solution that has not been subjected to annealing treatment, and samples 02 and 03 are DNA solutions that have been subjected to annealing treatment. As shown in FIG. 9, when the target base S is C, the quenching is remarkable. By detecting the presence or absence of quenching, whether the target base S is C (cytosine) or G (guanine) is detected. You can know.
[0042]
FIG. 10 shows the results of placing the DNA solution without annealing treatment in a plastic transparent tube and visually detecting the fluorescence using a UV lamp having an excitation wavelength of 302 nm. As shown in FIG. 10, when the target base S is C, the quenching is remarkable and can be confirmed visually.
[0043]
Example 6
Examination with actual arrangement 2
In Example 6, in order to verify the effect of detecting a single base substitution at the 175th amino acid of the actual p53-related gene, the following sequence was ordered from Japan Genetic Research Institute, Inc. and synthesized. Here, in the following sequence, X is an abasic site (AP site), and R represents G (guanine) or A (adenine).
(Sequence E) 5'-GAGGCRCTGCC-3 '(SEQ ID NOS: 9, 10)
(Sequence F) 3′-CTCCGXGACGG-5 ′ (SEQ ID NO: 11)
In the sequence E, the target base R corresponding to the abasic site X is G (SEQ ID NO: 9) in the normal type and A (SEQ ID NO: 10) in the mutant type. Thereby, the 175th amino acid changes from arginine to histidine. In this example, an abasic site X was provided to detect this G to A mutation, and a receptor molecule was introduced into the constructed hydrophobic space. In addition, it carried out similarly to Example 5 except having used pterin which quenches selectively when the target base R is G as a receptor molecule.
[0044]
For each of the cases where the target base R corresponding to the abasic site X is G or A, the ratio (F ₀ ) between the fluorescence intensity (F ₀ ) when no DNA is added and the fluorescence intensity (F) when the DNA is added is added. / F ₀ ) is shown in FIG. Here, the excitation wavelength in FIG. 11 is 360 nm, and the fluorescence wavelength is 440 nm. Sample 01 is a DNA solution that has not been subjected to an annealing treatment, and Sample 02 is a DNA solution that has been subjected to an annealing treatment. As shown in FIG. 11, since the quenching is performed when the target base R is G, the presence or absence of quenching is detected to determine whether the target base R is G (guanine) or A (adenine). You can know.
[0045]
FIG. 12 shows the result of visually detecting the fluorescence of the DNA solution that was not subjected to the annealing treatment by using a UV lamp having an excitation wavelength of 302 nm. As shown in FIG. 12, when the corresponding base R is G, the light is quenched and can be visually confirmed.
[0046]
As described above, according to the method for detecting a single nucleotide substitution in the present embodiment, a single-stranded target DNA having a single nucleotide substitution site and a single-stranded target DNA complementary to the target DNA and corresponding to the single nucleotide substitution site A double-stranded nucleic acid is formed with the single-stranded detection DNA from which the base has been removed, and a hydrogen-binding and fluorescent receptor molecule is added to the double-stranded nucleic acid to form a single-base substitution site with a hydrogen-bonding site. Is formed, and the change in the fluorescence intensity of the receptor molecule is measured, whereby the single base substitution can be effectively detected.
[0047]
In particular, since complicated operations such as labeling and thermal control of the target DNA as an analyte are not required in principle, the number of steps is very small, and in principle, the thermal stability of the double-stranded DNA itself is reduced. Since it does not depend on it, the time until detection is very short and the reproducibility is excellent. In addition, since visual confirmation using a UV lamp is also possible, detection is possible even in a situation without special equipment.
[0048]
Furthermore, by preparing a DNA microarray in which a large number of detection DNAs containing abasic sites are integrated on a substrate and using the DNA microarray as a single-base substitution detection kit, high-throughput diagnosis overcoming conventional disadvantages becomes possible.
[0049]
【The invention's effect】
As described in detail above, according to the method for detecting a single nucleotide substitution according to the present invention, a single-stranded target nucleic acid having a single nucleotide substitution site, and complementary to the target nucleic acid, and at the single nucleotide substitution site A double-stranded nucleic acid is formed with the single-stranded detection nucleic acid from which the corresponding base has been removed, and a hydrogen-bonding and fluorescent receptor is added to the double-stranded nucleic acid to form a single-base substitution site. By forming a hydrogen bond and measuring the change in the fluorescence intensity of this receptor, single base substitution can be detected simply and quickly.
[0050]
Further, according to the kit for detecting single nucleotide substitution according to the present invention, high-throughput diagnosis overcoming conventional disadvantages can be performed.
[0051]
[Sequence list]

[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 1: A sequence consisting of an artificially synthesized 11-mer oligodeoxynucleotide. The sixth deoxynucleotide is used as an abasic site.
SEQ ID NO: 2: artificially synthesized SEQ ID NO: 3: artificially synthesized SEQ ID NO: 4: artificially synthesized SEQ ID NO: 5: artificially synthesized SEQ ID NO: 6: artificial SEQ ID NO: 7: Artificially synthesized SEQ ID NO: 8: Sequence consisting of an artificially synthesized 11-mer oligodeoxynucleotide. The sixth deoxynucleotide is used as an abasic site.
SEQ ID NO: 9: Artificially synthesized SEQ ID NO: 10: Artificially synthesized SEQ ID NO: 11: Sequence consisting of an artificially synthesized 11-mer oligodeoxynucleotide. The sixth deoxynucleotide is used as an abasic site.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram illustrating the principle of single base detection in the present embodiment.
FIG. 2 is a diagram showing the AMND concentration dependency of the Tm value when the target base is cytosine.
FIG. 3 is a diagram showing CD spectra before and after addition of AMND when the target base is adenine, cytosine, guanine, or thymine.
FIG. 4 is a diagram showing the AMND concentration dependence of the CD spectrum when the target base is cytosine.
FIG. 5 is a graph showing the relationship between AMND concentration and molar ellipticity when the target base is cytosine.
FIG. 6 is a diagram showing the most stabilized structure by the Amber force field (Macro Model) after adding AMND;
FIG. 7 is a graph showing a decrease in fluorescence intensity after addition of AMND.
FIG. 8 is a graph showing a decrease in fluorescence intensity after the addition of pterin.
FIG. 9 is a diagram showing a fluorescence spectrum after addition of AMND when the target base is cytosine or guanine.
FIG. 10 is a diagram showing fluorescence after addition of AMND when the target base is cytosine or guanine.
FIG. 11 is a diagram showing a fluorescence spectrum after addition of pterin when the target base is cytosine or guanine.
FIG. 12 is a diagram showing fluorescence after addition of pterin when the target base is cytosine or guanine.
[Explanation of symbols]
Reference Signs List 10 target nucleic acid, 11 target base, 20 nucleic acid for detection, 21 abasic site, 30 receptor molecule

Claims (5)

一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と相補的であり、且つ該一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸を調製する工程と、
上記標的核酸と上記検出用核酸とで二本鎖核酸を形成する工程と、
上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加し、上記一塩基置換部位と水素結合を形成させる工程と、
上記レセプターの蛍光強度を測定する工程と
を有することを特徴とする一塩基置換検出方法。A step of preparing a single-stranded nucleic acid for detection that is complementary to a single-stranded target nucleic acid having a single-base substitution site, and from which the corresponding base corresponding to the single-base substitution site has been removed,
A step of forming a double-stranded nucleic acid with the target nucleic acid and the detection nucleic acid,
Adding a receptor having a hydrogen bonding property and a fluorescent property to the double-stranded nucleic acid, and forming a hydrogen bond with the single base substitution site,
Measuring the fluorescence intensity of the receptor. 上記レセプターは、複素環式芳香族基を有し、上記一塩基置換部位との水素結合形成及び上記対応塩基の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化されることで、上記一塩基置換部位と対を形成することを特徴とする請求項１記載の一塩基置換検出方法。The receptor has a heterocyclic aromatic group, and is stabilized by hydrogen bond formation with the monobasic substitution site and stacking interaction with bases surrounding the corresponding base, whereby the monobasic substitution site 2. The method for detecting a single base substitution according to claim 1, wherein the method forms a pair with. 上記レセプターは、ナフチリジン誘導体、キノリン誘導体、プテリジン誘導体、クマリン誘導体及びインダゾール誘導体からなる群の少なくとも１つであることを特徴とする請求項２記載の一塩基置換検出方法。The method according to claim 2, wherein the receptor is at least one of the group consisting of a naphthyridine derivative, a quinoline derivative, a pteridine derivative, a coumarin derivative and an indazole derivative. 上記レセプターは、２−アミノ−７−メチルナフチリジン又は２−アミノ−４−オキソプテリジンであることを特徴とする請求項３記載の一塩基置換検出方法。The method according to claim 3, wherein the receptor is 2-amino-7-methylnaphthyridine or 2-amino-4-oxopteridine. 一塩基置換部位を有する一本鎖の標的核酸と、該標的核酸と相補的であり、且つ上記一塩基置換部位に対応する対応塩基が除かれた一本鎖の検出用核酸とで二本鎖核酸を形成させ、上記二本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するレセプターを添加して上記一塩基置換部位と水素結合を形成させ、上記レセプターの蛍光強度を測定するための一塩基置換検出用キット。A double-stranded single-stranded target nucleic acid having a single-base substitution site and a single-stranded detection nucleic acid complementary to the target nucleic acid and having the corresponding base corresponding to the single-base substitution site removed; Forming a nucleic acid, adding a receptor having a hydrogen bonding property and a fluorescent property to the double-stranded nucleic acid to form a hydrogen bond with the single nucleotide substitution site, and performing a single nucleotide substitution for measuring the fluorescence intensity of the receptor; Detection kit.

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