【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性の検査方法及び該耐性を低減させるための薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（ｃｉｓ−ジアミンジクロロ白金）は、２個の塩素リガンドがシス位に配位した、正方形の平面的な白金（ＩＩ）錯体であり（非特許文献１）、受動的拡散により細胞内に入る。この薬剤で細胞を処理すると、ＤＮＡ複製及びＲＮＡ転写が阻害され、細胞が細胞サイクルのＧ２期で停止するか、そのまま細胞死（アポトーシス）に至る（非特許文献２）。シスプラチンは、頭頚部の扁平上皮癌を包含する、固形癌の治療に最も強力で有用な抗癌剤の１つとして広く用いられている。しかしながら、多くの腫瘍が、本来的にシスプラチンに耐性であるか又は抗癌剤での治療が当初は有効であるが後から耐性を獲得するという問題がある（非特許文献３）。腫瘍細胞における、シスプラチンに対する耐性についてのメカニズムを調べるために、シスプラチン耐性株の確立に関する多くの研究が報告されている。よく研究された例の１つは、ＡＴＰ結合カセット膜貫通トランスポーター、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）及び、多剤耐性細胞中で過発現し、薬剤排出ポンプとして機能する小細管多剤特異的有機アニオントランスポーター（ｃＭＯＡＴ）の発現に関するものである（非特許文献４、５）。他の因子としては、グルタチオン及びメタロチオネインのような細胞内タンパク質によるシスプラチンの不活化が亢進しており、損傷ＤＮＡの修復の促進、並びにシグナル伝達経路の変化（非特許文献２）などがある。シスプラチン耐性細胞に関するこれらの研究は、シスプラチン耐性のメカニズムが複雑であろうことを示している。
【０００３】
細胞表面の糖タンパク質の修飾は、細胞の癌化の重要な段階の１つであり、種々の特異的生物学的相互作用において重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献６）。糖鎖と薬剤耐性の関係について、いくつかの研究が報告されている。例えば、糖タンパク質に関連したＮ−結合型糖鎖の合成の最初の段階をブロックするツニカマイシンで処理することにより、インビトロ及びインビボにおいてシスプラチンに対する感受性が高められる（非特許文献７）。α１，２−フコシルトランスフェラーゼ及び組織−血液型抗原Ｈタイプ２が、５−ＦＵに対する細胞の耐性に関与することが報告されている（非特許文献８）。これらの研究は、いくつかの糖タンパク質中の糖鎖の変化が、シスプラチン耐性に関与していることを示唆している。もし、糖鎖がシスプラチン耐性を変化させ得るのであれば、多くのグリコシルトランスフェラーゼの主な標的分子である接着分子及び／又はレセプターが関与しているであろう。
【０００４】
インテグリンは、細胞−ＥＣＭ（細胞外マトリックス、ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）相互作用を支配し、細胞の接着及び移動を媒介し、さらに細胞内シグナル伝達を媒介する、ヘテロダイマーから成る細胞表面レセプターである（非特許文献９）。インテグリンは、約２０ないし３０のＮ−結合型糖鎖付加部位を含んでいるので、インテグリン上のこれらのＮ−結合型糖鎖の修飾は、それらの機能を変化させる可能性がある。α５β１インテグリン（ＶＬＡ−５）は、インテグリンファミリーの一つであり、細胞生存についての役割を果たし得る。α５β１インテグリンにより媒介される接着は、腸上皮細胞（非特許文献１０）及びＨＴ２９大腸癌細胞（非特許文献１１）をアポトーシスから回避することが報告されている。特に、β１インテグリン刺激によるチロシンキナーゼの活性化は、小細胞肺癌における化学療法誘導アポトーシスを抑制する（非特許文献１２）。さらに、α５β１インテグリンの糖鎖構造は、種々の糖転移酵素により調節され得る（非特許文献１３及び１４）。
【０００５】
α５β１インテグリンにより媒介される細胞生存に関与するいくつかの下流分子が報告されている（非特許文献１０）。シグナルは、インテグリンの細胞内ドメイン及びフォーカルアドヒージョン複合物を起源とする。フォーカルアドヒージョン複合物中に存在する１２５ ｋＤａの細胞質チロシンキナーゼであるＦＡＫ（フォーカルアドヒージョンキナーゼ）は、インテグリン活性化後にリン酸化される主なタンパク質である（非特許文献１５）。ＦＡＫは、細胞生存の制御を包含するインテグリン媒介シグナル伝達において中心的な役割を果たす（非特許文献１６）。特に、ＦＡＫのＴｙｒ３９７（アミノ配列のＮ末端から３９７番目のＴｙｒという意味、以下、アミノ酸残基の位置と種類を同様に表示する）は、ＦＡＫ媒介生存シグナルを司る主な自己リン酸化の部位を構成する（非特許文献１７）。そして、このリン酸化は、ＦＡＫにより誘導されるアポトーシスに対する耐性に関与すると報告されている、フォスファチジルイノシチド３’−ＯＨ−キナーゼ−Ａｋｔ（Ｐ１３Ｋ／Ａｋｔ）生存経路を活性化し得る（非特許文献１６、１８）。
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｏｅｈｒｅｒ， Ｐ．Ｊ．， Ｅｉｎｈｏｒｎ， Ｌ．Ｈ．， Ｄｒｕｇｓ ｆｉｖｅ ｙｅａｒｓ ｌａｔｅｒ． Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ． Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ．， １００（５）： ７０４−１３， １９８４．
【非特許文献２】Ｋａｒｔａｌｏｕ， Ｍ．， Ｅｓｓｉｇｍａｎｎ， Ｊ．Ｍ．， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ． Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．， ４７８（１−２）： ２３−４３， ２００１．
【非特許文献３】Ｓｈｅｎ， Ｄ．Ｗ．， Ａｋｉｙａｍａ， Ｓ．， Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ， Ｐ．， Ｐａｓｔａｎ， Ｉ．， Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｍ．Ｍ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＫＢ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ： ｃｒｏｓｓ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈａｎｇｅｓ． Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ．， ７１（４）： ６７６−８３， １９９５．
【非特許文献４】Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｔ．， Ｂａｏ， Ｊ．Ｊ．， Ｙａｍａｎｅ， Ｙ．， Ａｋｉｍａｒｕ， Ｋ．， Ｆｒｉｎｄｒｉｃｈ， Ｋ．， Ｗｒｉｇｈｔ， Ｃ．Ｄ．， Ｋｕｏ， Ｍ．Ｔ．， Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＭＲＰ／ＧＳ−Ｘ ｐｕｍｐ ａｎｄ ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｂｙ ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（２５）： １４９８１−８， １９９６．
【非特許文献５】Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｋ， Ｗａｄａ Ｍ， Ｋｏｈｎｏ Ｋ， Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ， Ｋａｗａｂｅ Ｔ， Ｋａｗａｋａｍｉ Ｍ， Ｋａｇｏｔａｎｉ Ｋ， Ｏｋｕｍｕｒａ Ｋ， Ａｋｉｙａｍａ Ｓ， Ｋｕｗａｎｏ Ｍ．， Ａ ｈｕｍａｎ ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ （ｃＭＯＡＴ） ｇｅｎｅ ｉｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｄｒｕｇ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６（１８）：４１２４−９， １９９６．
【非特許文献６】Ｈａｋｏｍｏｒｉ， Ｓ．， Ｔｕｍｏｒ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ａｂｅｒｒａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｈｉｎｇｏ（ｇｌｙｃｏ）ｌｉｐｉｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６（２３）： ５３０９−１８， １９９６．
【非特許文献７】Ｎｏｄａ， Ｉ．， Ｆｕｊｉｅｄａ， Ｓ．， Ｓｅｋｉ， Ｍ．， Ｔａｎａｋａ， Ｎ．， Ｓｕｎａｇａ， Ｈ．， Ｏｈｔｓｕｂｏ， Ｔ．， Ｔｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， Ｆａｎ， Ｇ．Ｋ．， Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｄ−ａｎｄ−ｎｅｃｋ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ．， ８０（２）：２７９−８４， １９９９．
【非特許文献８】Ｃｏｒｄｅｌ， Ｓ．， Ｇｏｕｐｉｌｌｅ， Ｃ．， Ｈａｌｌｏｕｉｎ， Ｆ．， Ｍｅｆｌａｈ， Ｋ．， Ｌｅ， Ｐｅｎｄｕ， Ｊ．， Ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｌｐｈａ１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎ Ｈ ｔｙｐｅ ２ ｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｒａｔ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ．， ８５（１）：１４２−８， ２０００
【非特許文献９】Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ， ＦＧ．， Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ．， ２８５（５４３０）：１０２８−３２， １９９９．
【非特許文献１０】Ｌｅｅ， Ｊ．Ｗ．， Ｊｕｌｉａｎｏ， Ｒ．Ｌ．， ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｂ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ．， １１（６）：１９７３−８７， ２０００．
【非特許文献１１】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ， Ｖ．， Ｆｒｉｓｃｈ， Ｓ．Ｍ．， Ｊｕｌｉａｎｏ， Ｒ．Ｌ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ ５ ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ ＨＴ２９ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｓｅｒｕｍ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ． Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ．， ２２４（１）：
２０８−１３， １９９６．
【非特許文献１２】Ｓｅｔｈｉ， Ｔ．， Ｒｉｎｔｏｕｌ， Ｒ．Ｃ．， Ｍｏｏｒｅ， Ｓ．Ｍ．， ＭａｃＫｉｎｎｏｎ， Ａ．Ｃ．， Ｓａｌｔｅｒ， Ｄ．， Ｃｈｏｏ， Ｃ．， Ｃｈｉｌｖｅｒｓ， Ｅ．Ｒ．， Ｄｒａｎｓｆｉｅｌｄ， Ｉ．， Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｓ．Ｃ．， Ｓｔｒｉｅｔｅｒ， Ｒ．， Ｈａｓｌｅｔｔ， Ｃ．， Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ： ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ５（６）： ６６２−８， １９９９．
【非特許文献１３】Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ， Ｍ．， Ｎａｂｉ， Ｉ．Ｒ．， Ｃｏｐｐｏｌｉｎｏ， Ｍ．， Ｄｅｄｈａｒ， Ｓ．， Ｄｅｎｎｉｓ， Ｊ．Ｗ．， Ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｏｎｔａｃｔ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧｌｃＮＡｃ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３０（２）： ３８３−９２，１９９５．
【非特許文献１４】Ｍｉｙｏｓｈｉ， Ｅ．， Ｎｏｄａ， Ｋ．， Ｋｏ， Ｊ．Ｈ．， Ｅｋｕｎｉ， Ａ．， Ｋｉｔａｄａ， Ｔ．， Ｕｏｚｕｍｉ， Ｎ．， Ｉｋｅｄａ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｕｒａ， Ｎ．， Ｓａｓａｋｉ， Ｙ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｎ．， Ｈｏｒｉ， Ｍ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ． Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１−６ ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｓｐｌｅｎｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｔｈｙｍｉｃ ｍｉｃｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９（９）： ２２３７−４３， １９９９．
【非特許文献１５】Ｗｅｙａｎｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｃａｒｏｔｈｅｒｓ， Ａ．Ｍ．， Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ， Ｍ．Ｅ．， Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ， Ｍ．Ｍ．， Ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６（３）： ９４９−５６， ２０００．
【非特許文献１６】Ｓｏｎｏｄａ， Ｙ．， Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ， Ｙ．， Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ， Ｍ．， Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｄ．， Ｈａｎｋｓ， Ｓ．Ｋ．， Ｋａｓａｈａｒａ， Ｔ．， Ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ （ＦＡＫ）． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｏｆ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＦＡＫ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， ＨＬ−６０． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（２１）： １６３０９−１５， ２０００．
【非特許文献１７】Ｃｈｅｎ， Ｑ．， Ｌｉｎ， Ｔ．Ｈ．， Ｄｅｒ， Ｃ．Ｊ．， Ｊｕｌｉａｎｏ， Ｒ．Ｌ．， Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＥＫ ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ Ｒａｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（３０）： １８１２２−７， １９９６．
【非特許文献１８】Ｋｉｍ， Ｂ．， Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｅ．Ｌ．， Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｍａｎｎｉｔｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ Ａｋｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（３０）： ２７３９３−４００， ２００２．
【非特許文献１９】Ｅｓａｋｉ， Ｔ．， Ｎａｋａｎｏ， Ｓ．， Ｍａｓｕｍｏｔｏ， Ｎ．， Ｆｕｊｉｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｎｉｈｏ， Ｙ． Ｓｃｈｅｄｕｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｉｎ ａ ｎｅｗｌｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＨＳＴ−１ ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ６５（４）： ４７９−８４， １９９６．
【非特許文献２０】Ｍｉｙｏｓｈｉ， Ｅ．， Ｉｈａｒａ， Ｙ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｎ．， Ｆｕｓａｍｏｔｏ， Ｈ．， Ｋａｍａｄａ， Ｔ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｇｅｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， ＨＢ６１１． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０（４７）： ２８３１１−５， １９９５．
【非特許文献２１】Ｓａｉｔｏ， Ｈ．， Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ａ．， Ｇｕ， Ｊ．， Ｉｈａｒａ， Ｙ．， Ｓｏｅｊｉｍａ， Ｈ．， Ｗａｄａ， Ｙ．， Ｓｅｋｉｙａ， Ｃ．， Ｎｉｉｋａｗａ， Ｎ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ＋． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １９８（１）：３１８−２７， １９９４．
【非特許文献２２】Ｍｉｙｏｓｈｉ， Ｅ．， Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ａ．， Ｉｈａｒａ， Ｙ．， Ｇｕ， Ｊ．， Ｓｕｇｉｙａｍａ， Ｔ．， Ｈａｙａｓｈｉ， Ｎ．， Ｆｕｓａｍｏｔｏ， Ｈ．， Ｋａｍａｄａ， Ｔ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩＩ ａｎｄ Ｖ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ＬＥＣ ｒａｔｓ ｄｕｒｉｎｇ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３（１７）： ３８９９−９０２， １９９３．
【非特許文献２３】Ｓａｓａｉ， Ｋ．， Ｉｋｅｄａ， Ｙ．， Ｔｓｕｄａ， Ｔ．， Ｉｈａｒａ， Ｈ．， Ｋｏｒｅｋａｎｅ， Ｈ．， Ｓｈｉｏｔａ， Ｋ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｏｌｇｉ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ． Ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｄｏｍａｉｎ ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（１）： ７５９−６５， ２００１．
【非特許文献２４】Ｎｏｄａ Ｋ， Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｅ， Ｎａｋａｈａｒａ Ｓ， Ｉｈａｒａ Ｈ， Ｇａｏ ＣＸ， Ｈｏｎｋｅ Ｋ， Ｙａｎａｇｉｄａｎｉ Ｓ， Ｓａｓａｋｉ Ｙ， Ｋａｓａｈａｒａ Ａ， Ｈｏｒｉ Ｍ， Ｈａｙａｓｈｉ Ｎ， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ．， Ａｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ， ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ３１０（１）：１００−６， ２００２．
【非特許文献２５】Ｉｋｅｄａ Ｙ， Ｋｏｙｏｔａ Ｓ， Ｉｈａｒａ Ｈ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｙ， Ｋｏｒｅｋａｎｅ Ｈ， Ｔｓｕｄａ Ｔ， Ｓａｓａｉ Ｋ， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ．， Ｋｉｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓｕｇａｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂｅｔａ１， ４−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩＩ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ）．， １２８（４）：６０９−１９， ２０００．
【非特許文献２６】Ｎｉｓｈｉｋａｗａ Ａ， Ｉｈａｒａ Ｙ， Ｈａｔａｋｅｙａｍａ Ｍ， Ｋａｎｇａｗａ Ｋ， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ Ｎ．， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ， ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ： ｂｅｔａ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｉｄｅ ｂｅｔａ−１，４Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｆｒｏｍ ｒａｔ ｋｉｄｎｅｙ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６７（２５）：１８１９９−２０４， １９９２．
【非特許文献２７】Ｍｉｗａ， Ｋ．， Ｍａｔｓｕｉ， Ｋ．， Ｔｅｒａｂｅ， Ｍ．， Ｉｔｏ， Ｋ．， Ｉｓｈｉｄａ， Ｍ．， Ｔａｋａｇｉ， Ｈ．， Ｎａｋａｍｏｒｉ， Ｓ．， Ｓａｎｏ， Ｋ．， Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｓｈｕｔｔｌｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａ ｃｏｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ａｎｄ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ． Ｇｅｎｅ．， ３９（２−３）：２８１−６， １９８５．
【非特許文献２８】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｍ．， Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ａ．， Ｉｈａｒａ， Ｙ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｓ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｂ１６ ｍｏｕｓｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｂｙ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＩＩＩ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， ９２（１９）： ８７５４−８， １９９５．
【非特許文献２９】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｒ．Ｄ．， Ｋｏｒｎｆｅｌｄ， Ｓ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｌｅｃｔｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５７（１９）： １１２３０−４， １９８２．
【非特許文献３０】Ｓａｓａｉ， Ｋ．， Ｉｋｅｄａ， Ｙ．， Ｆｕｊｉｉ， Ｔ．， Ｔｓｕｄａ， Ｔ．， Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｎ．， ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｂｅｔａ１，６−ｂｒａｎｃｈｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ： ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．， １２（２）： １１９−２７， ２００２．
【非特許文献３１】Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ， Ｄ．Ｄ．， Ｈａｕｃｋ， Ｃ．Ｒ．， Ｓｉｅｇ， Ｄ．Ｊ．， Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ７１（３−４）： ４３５−７８， １９９９．
【非特許文献３２】Ｈｓｕ， Ｓ．Ｌ．， Ｃｈｅｎｇ， Ｃ．Ｃ．， Ｓｈｉ， Ｙ．Ｒ．， Ｃｈｉａｎｇ， Ｃ．Ｗ．， Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｌｐｈａ５ ａｎｄ ｂｅｔａ１ ｓｕｂｕｎｉｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ Ｈｅｐ３Ｂ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．， １６７（２）：１９３−２０４， ２００１．
【非特許文献３３】Ｍａｔｔｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｎｏｒｄｓｔｅｄｔ， Ｃ．， Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．， Ｔｈｅ ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ． Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １４１（４）： １０１９−３０．， １９９８．
【非特許文献３４】Ｍａｔｔｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．， Ａ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１ ａｎｄ ａｌｐｈａ（ｖ）ｂｅｔａ３ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｔｈａｔ ｅｌｅｖａｔｅｓ ｂｃｌ−２ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６（３０）： ２７７５７−６３．， ２００１．
【非特許文献３５】Ｗｉｌｃｏｘ−Ａｄｅｌｍａｎ， Ｓ． Ａ， Ｄｅｎｈｅｚ， Ｆ．， Ｇｏｅｔｉｎｃｋ， Ｐ． Ｆ．， Ｓｙｎｄｅｃａｎ−４ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７７（３６）： ３２９７０−７， ２００２．
【非特許文献３６】Ｆｒａｎｋｅ， Ｔ．Ｆ．（１９９７） Ｃｅｌｌ ８８， ４３５−４３７，やＢｕｒｇｅｒｉｎｇ， Ｂ．Ｔ． ａｎｄ Ｃｏｆｆｅｒ， Ｐ．Ｊ． （１９９５） Ｎａｔｕｒｅ ３７６， ５９９−６０２， やＦｒａｎｋｅ， Ｔ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｃｅｌｌ ８１， ７２７−７３６
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
シスプラチンのような金属錯化合物抗癌剤は、固形癌の治療に有効であり、広く用いられているが、副作用を有することも知られている。したがって、癌細胞が金属錯化合物抗癌剤に対する耐性を有するか否かを予め検査することができれば、耐性の患者に投与することを避けることができ、効かない抗癌剤を投与して無用の副作用をもたらすことを回避することができる。また、金属錯化合物抗癌剤に対する耐性を有する癌細胞を、該抗癌剤に対して感受性の癌細胞に変化させることができれば、該抗癌剤の投与が有効となり、癌を治療することができ有利である。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を検査する方法を提供することである。また、本発明の目的は、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を低減させるための薬剤を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、癌細胞のシスプラチンに対する耐性にα５β１インテグリンが関与しているかもしれないと考え、下記実施例において詳述する方法により、種々のレクチンを用いたレクチンブロット分析を行った。その結果、α５β１インテグリンのβ１サブユニットでは、耐性細胞由来のものが、感受性細胞由来のものよりも、白血球凝集性フィトヘマグルチニン（Ｌ４−ＰＨＡ）への結合が明らかに少なかった。Ｌ４−ＰＨＡは、β１−６ＧｌｃＮＡｃに特異的に結合することが知られているＰＨＡである。これにより、本願発明者らは、シスプラチンに対して耐性を有する癌細胞は、シスプラチン感受性の癌細胞に比べ、α５β１インテグリンのβ１サブユニット上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝が明らかに減少していることを見出した。さらに、α５β１インテグリンの中和抗体を癌細胞に作用させることにより、シスプラチン耐性癌細胞がシスプラチン感受性癌細胞に変化することを見出し、シスプラチンに対する耐性は、α５β１インテグリンの変化に基づくものであることが確認された。これに基づき、本願発明者らは、癌細胞のα５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝が感受性細胞に比べて減少しているか否かを調べることにより、癌細胞がシスプラチンに対して耐性を有するか否かを検査することができることに想到した。また、α５β１インテグリン中和抗体のような、α５β１インテグリンの機能阻害剤を投与することにより、シスプラチン耐性細胞をシスプラチン感受性細胞に変えることができ、シスプラチンを用いた癌治療が可能になることに想到した。
【００１０】
すなわち、本発明は、生体から採取した細胞のα５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチルグルコサミン）分枝の程度を調べることを含む、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を検査する方法を提供する。また、本発明は、α５β１インテグリンの機能阻害物質を有効成分として含有する、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を低減させるための薬剤を提供する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の方法は、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を検査する方法である。ここで、「金属錯化合物」としては、プラチナ錯化合物が好ましく、特にシスプラチンが好ましい。金属錯化合物抗癌剤は、錯化合物中の金属がＤＮＡと結合してＤＮＡの複製及びＲＮＡの転写を妨害することにより、細胞の増殖を阻害したりアポトーシスに導くものである。また、癌細胞としては、固形癌細胞が好ましく、例として、頭頚部癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、睾丸癌、腎臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、種々の部位における扁平上皮癌等を挙げることができる。
【００１２】
本発明の検査方法では、生体から採取した細胞のα５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を調べる。下記実施例に具体的に記載されるように、シスプラチンのような金属錯化合物抗癌剤耐性細胞では、α５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝が減少している。ここで、「減少している」とは、同じ金属錯化合物抗癌剤に対して感受性の細胞と比較して減少しているという意味である。したがって、α５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を調べ、それが同じ抗癌剤に対する感受性細胞におけるα５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度よりも有意に少なければ該抗癌剤に対して耐性であると判定できる。
【００１３】
ここで、「分枝の程度を調べる」とは、α５β１インテグリン上の分枝の密度が、感受性細胞よりも減少しているか否かがわかる方法により分枝の密度を調べるということであり、定量的な測定は必ずしも必要ではない。耐性細胞と感受性細胞のα５β１インテグリン上の分枝の密度の違いは明らかであるので、下記実施例のように、レクチンブロット分析におけるバンドの太さを比較するといった、定量性の高くない方法でも目的を達成することができる。
【００１４】
下記実施例で実験的に示されるように、α５β１インテグリンを構成するサブユニットのうち、α５サブユニット上の分枝の密度は、耐性細胞と感受性細胞に差は認められず、β１サブユニット上の分枝の密度には明らかな差が認められる。したがって、α５サブユニットとβ１サブユニットを電気泳動等により分離してβ１サブユニット上の分枝の程度を調べてもよいし、これらを分離することなく分枝の程度を調べてもよい。後者の場合でも、結果的にβ１サブユニット上の分枝の程度が反映される。
【００１５】
分枝の程度を調べることは、例えば、細胞から取り出したα５β１インテグリン又はそのβ１サブユニットとＬ４−ＰＨＡとを接触させ、Ｌ４−ＰＨＡに結合するα５β１インテグリン又はそのβ１サブユニットの量を調べることによって行うことができる。上記の通り、Ｌ４−ＰＨＡは、β１−６ＧｌｃＮＡｃ構造に特異的に結合する性質を有しているので、この性質を利用してβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を調べることができる。これは、例えば下記実施例に詳述するように、被検細胞をホモジナイズし、α５β１インテグリンを免疫沈降により回収し、得られた免疫沈降物又はこれをさらに電気泳動によりサブユニットに分離したものと、Ｌ４−ＰＨＡとを接触させることを含む方法により行うことができる。
【００１６】
ここで、免疫沈降は、例えば、被検細胞のホモジネートを、抗α５β１インテグリンＩｇＧ抗体で処理し、次いで、生じる免疫複合物を、プロテインＧ固定化ビーズで処理し、ビーズを遠心又は磁力（磁気ビーズを用いた場合）により沈降させて回収する方法により行うことができる。ここで用いる抗α５β１インテグリンＩｇＧ抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、ＩｇＧ以外の抗体が含まれていてもよい。抗α５β１インテグリンＩｇＧ抗体は、市販されているので、市販品を用いることができる。プロテインＧは、ＩｇＧ抗体の定常領域に特異的に結合する性質を有しているので、この性質を利用してα５β１インテグリンの免疫複合物をビーズ上に結合させることができる。なお、プロテインＧ固定化ビーズとしては、例えば、プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＥＦビーズ（商品名、スウェーデン国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａより市販）のような市販のビーズを利用することができる。なお、α５β１インテグリン複合物以外のＩｇＧがビーズに結合することを防止するために、細胞ホモジネートを抗α５β１インテグリン抗体で処理する前に、プロテインＧ固定化ビーズで処理し、該ビーズを除去しておくことが好ましい。
【００１７】
次いで、免疫沈降により回収したα５β１インテグリン又はそのβ１サブユニットとＬ４−ＰＨＡとを接触させ、Ｌ４−ＰＨＡに結合するα５β１インテグリン又はそのβ１サブユニットの量を調べる。これは、例えばいわゆるレクチンブロット分析により行うことができる。なお、免疫沈降をプロテインＧ固定化ビーズを用いて行う場合には、沈降により回収されるものは、ビーズに結合したα５β１インテグリン免疫複合物であるが、これを例えばレムリのサンプリング緩衝液中で煮沸することにより、α５β１インテグリンを回収することができる。回収したα５β１インテグリンは、電気泳動で各サブユニットに分離してもよい。レクチンブロット分析は、下記実施例に詳述するように、標識したＬ４−ＰＨＡをプローブとして用い、ニトロセルロース膜等の膜上に固定化されたα５β１インテグリン又はそのβ１サブユニットと反応させ、結合した標識Ｌ４−ＰＨＡを測定することにより行うことができる。標識としては、ビオチン標識、放射標識、蛍光標識等の周知の標識を用いることができる。
【００１８】
下記実施例に実験的に示される通り、シスプラチンに対する耐性細胞と感受性細胞との間には、α５β１インテグリン、より詳細にはそのβ１サブユニット上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度が明らかに異なり、上記した方法により、α５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を直接的に調べることができる。さらに、該分枝の程度は、これを反映した他の指標により間接的に調べることも可能であり、むしろこちらの方が簡便な場合がある。
【００１９】
例えば、被検細胞から採取した糖タンパク質を分画し、分子量９０、０００〜１５０、０００の範囲に含まれる糖タンパク質上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を調べることにより行うことができる。α５β１インテグリンは、上記分子量範囲に含まれ、この範囲に含まれる糖タンパク質上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度は、α５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度を反映し得るので、この方法によっても癌細胞の抗癌剤に対する耐性を検査することができる。なお、β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度は、上記と同様、例えばレクチンブロット分析等の方法により、Ｌ４−ＰＨＡと結合する糖タンパク質の量を調べることにより行うことができる。具体的な手法は下記実施例に記載されている。
【００２０】
また、α５β１インテグリンのβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度は、細胞のフィブロネクチンへの接着性にも反映される（α５β１インテグリンはフィブロネクチンのレセプターである）ので、細胞のフィブロネクチンへの接着性を調べることにより、抗癌剤に対する耐性を検査することができる。すなわち、耐性細胞では、フィブロネクチンに対する接着性が、感受性細胞よりも明らかに増大するので、これに基づいて耐性か否かを検査することができる。細胞接着は、公知の方法（非特許文献２８）により測定することができ、下記実施例にもその１例が具体的に記載されている。簡単に述べると、マイクロプレートのウェルにフィブロネクチンを付着させ、これと被検細胞を接触させる。洗浄後、接着した細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞を溶解させて溶解液中の吸光度を測定することにより、接着した細胞数を測定することができる。
【００２１】
また、α５β１インテグリンのβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度は、細胞中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度を測定することにより調べることもできる。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは、β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝を生成させる酵素であるＧｎＴ−Ｖ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：α−Ｄ−マンノシドβ１， ６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）の基質である。下記実施例において実験的に確認されたように、耐性細胞と感受性細胞では、ＧｎＴ−Ｖ濃度にはほとんど差がないが、細胞内のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ウラシル二リン酸−ＧｌｃＮＡｃ）濃度が有意に異なり、耐性細胞中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度は、感受性細胞中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度よりも小さい。したがって、細胞内のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度を測定することにより、被検細胞が、抗癌剤に対する耐性を有するか否かを検査することができる。細胞中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度は、公知の方法（非特許文献２４）を応用することにより測定することができるし、下記実施例にも測定方法の１例が具体的に記載されている。原理は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として、ＧｎＴ−ＩＩＩ（Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ）の作用により、ＧｌｃＮＡｃ残基をＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからアクセプター基質に移させ、生成したβ１−４ＧｌｃＮＡｃ残基を測定するものである。
【００２２】
また、α５β１インテグリンのβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の程度は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（ＦＡＫ）のＴｙｒ３９７残基のリン酸化の程度又はＡｋｔ（非特許文献３６）のＳｅｒ４７３残基のリン酸化の程度を調べることによっても調べることができる。ＦＡＫは、インテグリン活性化後にリン酸化される主なタンパク質であり（非特許文献１５）、Ａｋｔは、リン酸化ＦＡＫによりリン酸化される。下記実施例において実験的に示されるように、ＦＡＫ及びＡｋｔの上記部位のリン酸化は、耐性細胞では感受性細胞よりも明らかに増加する。したがって、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化の程度又はＡｋｔのＳｅｒ４７３残基のリン酸化の程度を調べることによっても抗癌剤に対する耐性を検査することができる。ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化及びＡｋｔのＳｅｒ４７３残基のリン酸化は、これらの部位がリン酸化したＦＡＫ又はＡｋｔに特異的に結合する（リン酸化したＦＡＫ又はＡｋｔに結合するが、リン酸化していないＦＡＫ又はＡｋｔには結合しない）ポリクローナル抗体が市販されているので、それを用いた免疫測定により容易に測定することができる。下記実施例にも、これらのポリクローナル抗体を用い、免疫測定の一種であるウェスタンブロット法によりリン酸化の程度を測定した１例が記載されている。
【００２３】
下記実施例に記載するように、耐性細胞にα５β１インテグリン中和抗体を作用させることにより、耐性細胞を感受性細胞に変化させることができることが明らかになった。したがって、本発明は、α５β１インテグリンの機能阻害物質を有効成分として含有する、金属錯化合物抗癌剤に対する癌細胞の耐性を低減させるための薬剤をも提供する。ここで、「金属錯化合物」としては、上記の通り、プラチナ錯化合物が好ましく、特にシスプラチンが好ましい。また、「機能阻害物質」とは、α５β１インテグリンがフィブロネクチンに結合することを阻害する物質であり、好ましい例としては、抗α５β１インテグリン中和抗体又はその抗原結合性断片（Ｆａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等）を挙げることができる。抗α５β１インテグリン中和抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。常法により作製されたポリクローナル抗体は、中和抗体であり、また、中和モノクローナル抗体も周知であり、市販されているので、市販のモノクローナル抗体（例えば、ＤＡＫＯ社製クローン番号Ｐ１Ｄ６）を用いることができる。
【００２４】
抗α５β１インテグリン中和抗体を、耐性細胞から感受性細胞に変化させるための薬剤として用いる場合、投与量は、癌の種類や進行程度、病巣の大きさ等に基づいて適宜選択されるが、通常、固形癌組織１００ ｇ当たり０．１ ｍｇ〜１０ｍｇ程度が適当である。また、投与経路は、注射、注入、塗布、噴霧等の方法により、抗体溶液を固形癌組織に直接投与することが好ましい。製剤としては、例えば、中和抗体又はその抗原結合性断片を緩衝液中に溶解したものを用いることができるし、これに注射剤用の周知の添加剤（ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤等）を添加してもよい。なお、抗体溶液中の抗体濃度は、特に限定されないが、通常、０．７μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ程度が適当である。
【００２５】
本発明の薬剤を、癌細胞に投与することにより、金属錯化合物抗癌剤に対する耐性を感受性に変化させることができる。このように感受性に変化させた後に、該金属錯化合物抗癌剤を投与することにより、該抗癌剤に対して元々耐性であった癌も治療することが可能になる。したがって、本発明の薬剤は、癌の治療に大いに貢献する。
【００２６】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２７】
材料及び方法
１． 細胞培養及び細胞株
口腔内のヒト扁平上皮癌から誘導されたＨＳＣ−２細胞株（東北大学加齢医学研究所より分譲）を、１０％ウシ胎児血清（米国Ｓｔ ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ社）、１００μｇ／ｍｌのカナマイシン（和光純薬）、５０単位／ｍｌのペニシリン（万有製薬）含有ＲＰＭＩ培地（米国Ｓｔ ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ社）中、ＣＯ２５％気圧、３７℃で維持した。シスプラチン耐性ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞は、公知の方法（非特許文献１９）により、段階的に濃度を高めながらシスプラチン（日本化薬）に１２ヶ月間暴露することにより確立した。すなわち、最初、２μＭ濃度のシスプラチン存在下で細胞を６ヶ月間に亘って培養し、次いで、シスプラチン濃度を３μＭに上げて３ヶ月間培養し、最後に濃度５μＭに上げてさらに３ヶ月間培養した。２週間の間、５μＭのシスプラチン存在下で培養可能な状態にした後で、シスプラチンを含まない培地に戻した。確立した細胞の安定な耐性を確保するために、全ての実験は、シスプラチンを含まない培地中で２週間培養した後に行った。
【００２８】
２． ＭＴＴアッセイによる細胞生存
インビトロでの薬剤に対する細胞の感受性を調べるために、ＭＴＴアッセイを用いた。４８ウェルプレート中の各ウェル中で、２００μｌの培地中に約１ ｘ １０４個の細胞を播き、培養した。同じ条件での実験を３系列ずつ行った。１２時間後、細胞を種々の濃度のシスプラチンで処理した。シスプラチン処理４８時間後、２０μｌのＭＴＴ（３−（４， ５−ジメチル−２−チアゾリル）−２， ５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド）（５ ｍｇ／ｍｌ）（同仁堂）を投与し、細胞を３７℃で４時間培養した。８００μｌの２−プロパノールを添加し、各ウェルの波長５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）を測定した。細胞の生存に対する薬剤の効果は、生存率で表した。生存率は、次の式を用いて計算した。
（Ａ５６０（シスプラチン処理）／Ａ５６０（シスプラチン未処理）） ｘ １００
全ての値は、３系列の平均±標準偏差（ＳＤ）で示す。試験は独立して３回行い、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、５０％の細胞を殺すシスプラチン濃度として定義した。
【００２９】
３． レクチンブロット分析
レクチンブロット分析のために、ＨＳＣ−２細胞及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞からそれぞれタンパク質を抽出した。抽出は次のようにして行った。直径１０ｃｍのディッシュで培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、スクレーパーで掻き取り、１ｍｌのＰＢＳに入れ、３０００ ｒｐｍで５分間遠心した。沈澱した細胞を１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．８）， １ ％ ＮＰ−４０， ０．１５ Ｍ ＮａＣｌ， １ ｍＭ ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤混合物（和光純薬）を含むＴＮＥ緩衝液で懸濁し氷中で２０分間静置し、次いで１５０００ ｒｐｍで４℃で１５分間遠心した。上清画分を、除核上清の可溶化タンパク質として保存し、ウシ血清アルブミンを濃度測定標準物質として用い、ＢＣＡキット（米国ＲｏｃｋｆｏｒｄのＰｉｅｒｃｅ社製）でタンパク濃度を測定した。抽出した２０μｇのタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、次いでニトロセルロース膜上に転写した。３％のＢＳＡを含むＰＢＳで４℃で一夜ブロッキングした後、膜を１μｇ／ｍｌのビオチン化した種々のレクチン（Ｃｏｎ Ａ， ＳＳＡ， ＭＡＭ， Ｌ４−ＰＨＡ， Ｅ４−ＰＨＡ， ＬＣＡ）（生化学工業）と共に３時間インキュベートした。洗浄及び以降の操作は公知の方法により行った（非特許文献２０）。すなわち、具体的には次のようにして行った。１３７ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣｌ， １３７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）， ０．５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＴＢＳ−Ｔにて、５分間洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｋｉｔ （米国ＢｕｒｌｉｎｇａｍｅのＶＥＣＴＯＲ社製）で１時間インキュベートした後、さらに３０分間ＴＢＳ−Ｔにて非特異的なバンドを除去するために洗浄した。反応する糖タンパク質は、ＥＣＬシステム（英国ＢｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いた化学発光により可視化した。
【００３０】
４． ノーザン及びウェスタンブロット分析並びにＧｎＴ−Ｖ活性測定
ＴＲＩＺＯＬ（米国ＲｏｃｋｖｉｌｌｅのＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）の方法に従い、ＨＳＣ−２細胞及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞からそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。２．２ Ｍのフォルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル上で２０μｇのＲＮＡを電気泳動し、毛管現象によりＺｅｔａ−ｐｒｏｂｅ膜（米国ＨｅｒｃｕｌｅｓのＢｉｏ−Ｒａｄ）上に転写した。メンブランは、公知の方法（非特許文献２２）により、プレハイブリダイゼーション緩衝液中で３時間プレハイブリダイズを行い、ついで、ハイブリダイゼーション緩衝液中で［３２Ｐ］標識ＧｎＴ−Ｖ ｃＤＮＡ（非特許文献２１）断片と共に４２℃で１２時間ハイブリダイズした。ＧｎＴ−Ｖのウェスタンブロッティングのために、ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞からそれぞれ抽出したタンパク２０μｇを、８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、次いで、ニトロセルロース膜に転写した。５％スキムミルクを含むＰＢＳで４℃で一夜ブロッキングした後、膜を抗ヒトＧｎＴ−Ｖモノクローナル抗体２４Ｄ１１（富士レビオ）と共に２時間インキュベートした。洗浄及び以降の操作は、公知の方法（非特許文献２０）により行った。ＧｎＴ−Ｖバンドは、ＥＣＬシステムを用いた化学発光により可視化した。ＧｎＴ−Ｖ活性は、蛍光アッセイ法により分析した。抽出したタンパク質（２０μｇ〜５０μｇ）を、アクセプター基質としての５μＭのピリジルアミノ化アガラクト２本鎖糖鎖と、ドナーとしての４０ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと共に３７℃で８時間インキュベートした。以降の操作は公知の方法（非特許文献２３）により行った。すなわち、具体的には次のようにして行った。サンプルを１００℃で５分間熱することにより反応を停止させ、微小遠心機にて１５、０００ｒｐｍにて１５分間遠心した。上清をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．６ ｘ １５０ ｍｍ）（日本のＴＯＳＯＨ）を用いて、ＨＰＬＣ（日本の島津）にて分析した。具体的には、２０ｍＭ の酢酸アンモニウム（ｐＨ ４．０）で分離したピークを３２０ ｎｍの波長で励起し４００ ｎｍで検出することにより、合成された生成物の量を測定した。
【００３１】
５． ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの測定
細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの量は、公知の方法（非特許文献２４）を改良した方法により測定した。まず、ＰＢＳで洗浄したあと細胞を遠心で集めた。細胞は、氷冷した８０％エタノールで懸濁したあとＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ ２５０ （米国ＭｕｓｋｅｇｏｎのＷｅｓｔｓｈｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を用い、超音波処理した。可溶性画分を遠心（１５０００ ｒｐｍ ｘ １０分、４℃）により得、液体窒素中で凍結し、そのまま凍結乾燥した。試料を４０μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、次いで６０μｇのタンパク質を上記と同様に抽出し、ＰＢＳで体積を５μｌに調整した。１００μＭ（２００ ｐｍｏｌ）のアクセプター溶液２μｌと、糖転移酵素の一つであり、ドナー基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを触媒する（非特許文献２６）精製ＧｎＴ−ＩＩＩ（非特許文献２５）３μｌとを試料に添加し、２０μｌに調整した（反応混合物中のアクセプター分子及びＧｎＴ−ＩＩＩの最終濃度はそれぞれ１０μＭ及び１８μＵ／μｌであった）。さらに、１００ ｐｍｏｌ及び５００ ｐｍｏｌのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを濃度測定標準物質として反応させた。混合物を次いで３７℃で５時間インキュベートし、ＧｎＴ−ＩＩＩの作用により、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＧｌｃＮＡｃ残基をアクセプター基質に移させた。以降は公知の方法（非特許文献２３）により、上記と同様に行った。
【００３２】
６．ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞へのＧｎＴ−Ｖのトランスフェクション
β−アクチンプロモーター（非特許文献２７）により調節される哺乳動物発現ベクターであるｐＣＸＮ２（非特許文献２７）にヒトＧｎＴ−Ｖ ｃＤＮＡを挿入し、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）により、２μｇのＧｎＴ−Ｖ発現ベクターをＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞にそれぞれトランスフェクションした。このとき、それぞれの細胞にベクターだけを同様にトランスフェクションした細胞（対照細胞：ｍｏｃｋという）も作成した。これらの細胞を４８時間培養した後、トランスフェクトされた細胞を選択し、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ナカライテスク社）を添加した培地中で維持した。これらのトランスフェクタントを、ＧｎＴ−Ｖのウェスタンブロット分析、レクチンブロット分析、ＧｎＴ−Ｖ活性の測定及びＭＴＴアッセイに用いた。
【００３３】
７． 細胞接着アッセイ
公知の方法（非特許文献２８）によるクリスタルバイオレット染色により、細胞接着を測定した。すなわち、９６ウェル培養プレートを、５０μｌのフィブロネクチン、ラミニン又はＩ型コラーゲンで前コートし、一夜風乾し、次いで、３％ＢＳＡ加ＲＰＭＩ培地で３７℃で１時間ブロッキングした。細胞（１ ｘ １０５個）をそれぞれのマトリックス上に３７℃で３０分間付着させた。細胞を２００μｌのＰＢＳで洗浄した後、０．０４％クリスタルバイオレットで１０分間染色し、次いで細胞を洗浄し、溶解した。波長５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）を分光光度計で測定した。接着細胞率は以下の式により計算した。
（Ａ５６０（マトリックス）−Ａ５６０（マトリックスなし））／Ａ５６０（マトリックスなし）
【００３４】
８． 免疫沈降したα５β１インテグリンについてのレクチンブロット分析
免疫沈降のために、１５μｌのプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＥＦビーズ（スウェーデン国Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ）を、ＨＳＣ−２細胞、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞、ＨＳＣ−２のｍｏｃｋ細胞（ベクターのみを導入した対照細胞）又はＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントから上記と同様に抽出した６００μｇのタンパク質を４℃で３時間、回転しながらインキュベートした。プロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＥＦビーズは、３０００ ｒｐｍで４℃で５分間遠心することにより予め除去した。６００ ｎｇ／ｍｌの抗ヒトα５β１インテグリン抗体Ｐ１Ｄ６（米国ＣａｒｐｉｎｔｅｒｉａのＤａｋｏ社）と共に４℃で２時間インキュベートした後、１５μｌのプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＥＦビーズと共に免疫複合物を回収した。ＴＮＥ緩衝液で２回洗浄後、還元剤を含まないレムリのサンプリング緩衝液中で煮沸することにより複合物をビーズから切り放し、８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に電気転写した。メンブランは、上記の通り、Ｌ４−ＰＨＡレクチンブロットにより分析した。膜を脱プローブ及びブロッキングした後、抗α５インテグリン抗体（米国ＬｅｘｉｎｇｔｏｎのＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）及び抗β１インテグリン抗体４Ｂ７Ｒ（米国Ｓａｎｔａ ＣｒｕｚのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．）を用いて上記の通りウェスタンブロット分析を行い、α５β１インテグリンが各細胞について同程度に泳動されていることを確認した。
【００３５】
９． ＦＡＫのチロシンリン酸化及びＡｋｔのセリンリン酸化
ＨＳＣ−２細胞、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞、ＨＳＣ−２のｍｏｃｋ細胞（ベクターのみを導入した対照細胞）又はＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントを、直径６ｃｍのディッシュ上に５ ｘ １０５細胞の密度で播いた。１２時間インキュベートした後、これらの細胞を３０μＭのシスプラチンで処理し、さらに２４時間インキュベートした。細胞を氷冷した溶液（１ｍＭ ｏ−バナジウム酸ナトリウム、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム）で洗浄し、氷冷した溶解緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ｏ−バナジウム酸ナトリウム、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭフッ化ナトリウム、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）、プロテアーゼ阻害剤混合物（和光純薬）で懸濁した後氷中で２０分間静置し、次いで１５０００ ｒｐｍで４℃で１５分間遠心することによりペレット（不溶性画分）を予め除去した。これらの細胞から抽出した２０μｇのタンパク質を、１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に転写した。上記のようにブロッキングした後、メンブランを抗ＦＡＫ（ｐＹ３９７）リン酸化特異的（ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体（米国ＣａｍａｒｉｌｌｏのＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）又は抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（米国ＢｅｖｅｒｌｙのＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， Ｉｎｃ．）と共に室温で２時間インキュベートした。洗浄及び現像操作は上記の通りに行った。メンブランを脱プローブ及びブロッキングした後、抗ＦＡＫ抗体（米国ＬｅｘｉｎｇｔｏｎのＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）及び抗Ａｋｔ抗体（米国ＢｅｖｅｒｌｙのＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， Ｉｎｃ．）を用いて上記の通りメンブランをウェスタンブロット分析に供した。
【００３６】
１０． ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞の生存に対する抗α５β１インテグリン中和抗体の効果
ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞を、１μｇ／ｍｌのα５β１インテグリン中和抗体と共に６ウェル培養プレート上に５ ｘ １０５細胞の密度で播いた。１２時間培養後、細胞を３０μＭのシスプラチンで処理し、さらに１２時間培養した。ＦＡＫリン酸化を検出するために、これらの細胞を上記の通りウェスタンブロットに供した。細胞生存アッセイのために、１μｇ／ｍｌのα５β１インテグリン中和抗体を含む又は含まない５０μｌの培地中で２ ｘ １０３個のＨＳＣ−２／ＣＲ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播いた。同じ条件での実験を３系列ずつ行った。１２時間後、種々の濃度のシスプラチンを含む５０μｌの培地を添加し、細胞をさらに４８時間培養した。この段階で、１０μｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を投与し、細胞を３７℃で培養した。４時間後、２００μｌの２−プロパノールを添加し、各ウェルの波長５６０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定した。以下の操作は上記と同様に行った。
【００３７】
結果
１． ヒト扁平上皮癌ＨＳＣ−２細胞からのシスプラチン耐性細胞の確立
ヒト扁平上皮癌ＨＳＣ−２細胞を段階的に濃度を高めたシスプラチンに１２ヶ月に亘って暴露することにより、高度にシスプラチン耐性な細胞株ＨＳＣ−２／ＣＲを確立した。図１の生存曲線は、ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲのシスプラチン感受性のレベルを示している。ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲのＩＣ５０値はそれぞれ４．０μＭ及び１４．６μＭであった。ＨＳＣ−２／ＣＲの相対耐性レベルは、その親株であるＨＳＣ−２の３．６５倍の高さであった。この結果は、他の種々の研究における確立されたシスプラチン耐性細胞についての結果と同様であった。なお、図１中のプロットは、３系列の試験の平均値を示し、縦棒は、標準偏差を示す。
【００３８】
２． ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲのレクチンブロット分析
薬剤耐性と糖鎖構造との関係を知るために、いくつかの種類のレクチンブロット分析により、多くの糖タンパク質の糖鎖付加のパターンを研究した。Ｃｏｎ Ａ， ＳＳＡ， ＭＡＭ， Ｅ４−ＰＨＡ及びＬＣＡレクチンブロット分析の結果、有意な糖鎖の変化は見られなかった（各バンドの太さを目視判定）。しかしながら、３本鎖又は４本鎖糖鎖のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝上のＧｌｃＮＡｃ残基を優先的に認識する（非特許文献２９）Ｌ４−ＰＨＡレクチンブロット分析によると、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞においては、分子量９０、０００〜１５０、０００ の糖タンパク質のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝がＨＳＣ−２細胞よりも明らかに減少していることが示された（バンドの太さを目視判定）。
【００３９】
３． ノーザンブロット分析及びウェスタンブロット分析並びにＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ中でのＧｎＴ−Ｖの酵素活性
β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝は、ＧｎＴ−Ｖの作用により触媒されることが知られている。先ず、ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ中でのＧｎＴ−Ｖの発現レベルを調べた。ノーザンブロット及びウェスタンブロット分析の結果、ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中でのＧｎＴ−Ｖの発現に差は認められなかった。対照的に、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中でのＧｎＴ−Ｖ活性は、ＨＳＣ−２細胞中での活性よりも少し減少していたが、ｔ検定の結果、有意差はなかった（表１）。なお表中の「ｍｏｃｋ」はベクターのみを導入した対照細胞を示す。
【００４０】
【表１】
表 １
＊ ｔ検定によりＨＳＣ−２ 細胞と比較して顕著な差はない
【００４１】
４． ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ中での細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの量
ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中でのβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝は、ＨＳＣ−２細胞中での分枝よりも有意に減少していた（上述）が、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中でのＧｎＴ−Ｖの活性は、ＨＳＣ−２親細胞と比較して有意に減少していなかった（表１）。ＧｎＴ−ＶのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対するＫｍ値は大きすぎるので、ＧｎＴ−Ｖのドナー基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの濃度がβ１−６ＧｌｃＮＡｃの生合成において重要な因子であることが報告されている（非特許文献３０）。興味深いことに、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中の細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの濃度は、ＨＳＣ−２細胞中での濃度の約半分に減少していた（表２）。このＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ濃度の減少が、β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の減少をもたらしていると考えられた。
【００４２】
【表２】
表２
＊ ｔ検定により、ＨＳＣ−２ 細胞との差を認める（Ｐ＜ ０．０１）
【００４３】
５． ＨＳＣ−２及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントの作製並びにＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントはｍｏｃｋ細胞に比べてシスプラチンに対する感受性が高い
ＧｎＴ−Ｖが扁平上皮癌細胞のシスプラチン耐性に関係しているか否かを調べるために、ヒトＧｎＴ−Ｖを発現する哺乳動物発現ベクターでＨＳＣ−２細胞及びＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のトランスフェクタントを作製し、これらの細胞におけるシスプラチン耐性を分析した。ＧｎＴ−Ｖタンパクの発現及びその酵素活性は、両細胞とも、ｍｏｃｋ（対照）細胞に比べて有意に増大した（バンドの太さを目視判定及び表１）。ＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタント上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝は、ｍｏｃｋ（対照）細胞に比べて有意に増大することが観察されたが（バンドの太さを目視判定）、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントにおいては観察されなかった（バンドの太さを目視判定）。これらの結果は、ＧｎＴ−Ｖの酵素活性のレベルが、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中の糖タンパクにおけるβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝を決定するものではないことを示唆している。それ以上に、細胞内ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃの濃度が、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞におけるβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の合成の重要な因子であり得る。さらに、ＭＴＴアッセイにより、これらのＧｎＴ−Ｖトランスフェクトのシスプラチンに対する感受性を調べた。興味深いことに、ＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクトは、ｍｏｃｋ（対照）細胞に比べてシスプラチンに対する感受性がより高かった（図２）が、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントの生存曲線は、ｍｏｃｋ（対照）細胞と類似していた（図３）。これらの結果は、ＨＳＣ−２細胞とＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチンに対する感受性の差は、β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の量に相関し、ＧｎＴ−Ｖの酵素活性のレベルに関係するものではないことを示唆している。なお、図２及び図３中のプロットは、３系列の試験の平均値を示し、縦棒は、標準偏差を示す。
【００４４】
６． 細胞外マトリックスへの細胞接着
ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチン耐性に、どのような糖タンパク質が関係しているか否かを調べるために、細胞接着アッセイを行った。図４Ａに示すように、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のフィブロネクチンに対する接着は、ＨＳＣ−２細胞と比較して劇的に増大したが、ラミニン及びＩ型コラーゲンに対する接着は、これらの細胞で有意な差はなかった（図４Ｂ、４Ｃ）。これらの結果は、フィブロネクチンに結合するある糖タンパク質が、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチン耐性に関与していることを示唆している。なお、図４中のプロットは、３系列の試験の平均値を示し、縦棒は、標準偏差を示す。
【００４５】
７． 免疫沈降α５β１インテグリンについてのレクチンブロット分析
ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞についてのＬ４−ＰＨＡレクチンブロット分析は、分子量９０、０００〜１５０、０００ の糖タンパク質の劇的な変化を示し、フィブロネクチンへの細胞接着は、ＨＳＣ−２細胞とＨＳＣ−２／ＣＲ細胞との間の有意な変化を示した。さらに、シスプラチンはアポトーシスを誘導することが報告されている。したがって、α５β１インテグリンが、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞におけるシスプラチン耐性についての鍵となる分子であると推測される。α５β１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ付加の程度を調べるために、免疫沈降したα５β１インテグリンについてＬ４−ＰＨＡレクチンブロット分析を行った。興味深いことに、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞から免疫沈降したβ１インテグリンでは、ＨＳＣ−２細胞と比較してβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の密度が有意に減少していたが、α５インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の密度は、これらの細胞間でほぼ同程度であった（バンドの太さを目視判定）。ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中のβ１インテグリンの分子量は、糖鎖の量が少ないことに起因して、ＨＳＣ−２細胞におけるβ１インテグリンの分子量よりも僅かに小さかった（バンドの太さを目視判定）。さらに、ＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクトから免疫沈降されたα５及びβ１の両インテグリンとも、β１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の密度は有意に増大した（バンドの太さを目視判定）。これらの結果は、α５β１インテグリン、特にβ１インテグリン上のβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の密度がシスプラチン耐性にとって重要であることを示唆している。
【００４６】
８． シスプラチン処理の前後におけるＦＡＫのＴｙｒ３９７残基及びＡｋｔのＳｅｒ４７３残基のリン酸化
ＦＡＫは、インテグリン活性化後のチロシンリン酸化の主たる基質である（非特許文献１５）。ＦＡＫ媒介生存シグナルには、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化及びＡｋｔのＳｅｒ４７３のリン酸化が必須的なので（非特許文献１６、１７、１８、３１）、ＨＳＣ−２、ＨＳＣ−２／ＣＲ及びトランスフェクトＨＳＣ−２細胞を３０μＭのシスプラチンで処理し、それぞれのリン酸化のレベルを調べた。ＨＳＣ−２細胞とＨＳＣ−２／ＣＲ細胞の間で、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化に劇的な差異が認められた（バンドの太さを目視判定）。ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞では、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化は、シスプラチン処理の前では他の細胞に比べて僅かに減少していたが、３０μＭのシスプラチンで処理した２４時間後には劇的に増大していた。対照的に、ＨＳＣ−２細胞では、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化のレベルは、シスプラチン処理前に高く、３０μＭのシスプラチンで処理した後には減少した。興味深いことに、ＦＡＫの分解は、シスプラチン処理ＨＳＣ−２細胞中で観察されたが、シスプラチン処理ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞中では観察されなかった（バンドの太さを目視判定）。ＦＡＫの分解は、マンニトール誘導アポトーシス（非特許文献１８）又はレチノイン酸誘導アポトーシス（非特許文献３０）において観察されることが報告されている。さらに、このＦＡＫの分解及びＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化のレベルの低さは、シスプラチンで処理したＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントにおいてより顕著であった。ＦＡＫリン酸化の下流シグナルを知るために、Ａｋｔの活性化を調べた。Ａｋｔの活性化を意味するＡｋｔのＳｅｒ４７３残基のリン酸化は、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞を３０μＭのシスプラチンで処理した２４時間後においてのみ検出された（バンドの太さを目視判定）。Ａｋｔの発現レベルは、シスプラチン処理前は各細胞で同等であったが、シスプラチン処理後は、ＨＳＣ−２細胞、ＨＳＣ−２のｍｃｋ細胞及びＨＳＣ−２細胞のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントにおいて、Ａｋｔの分解のためにかなり低かった（バンドの太さを目視判定）。Ａｋｔの分解は、マンニトール誘導アポトーシスにおいてもまた観察されている（非特許文献１８）。これらの結果は、α５β１インテグリンのβ１−６ＧｌｃＮＡｃ分枝の減少が、ＦＡＫの分解及びＴｙｒ３９７残基のリン酸化並びにそれに続くＡｋｔの活性化を防止し、それによってＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチン誘導アポトーシスを阻害することを示唆している。
【００４７】
９． ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチン耐性に対するα５β１インテグリン中和抗体によるＦＡＫのリン酸化の阻害
α５β１インテグリン中和抗体が、α５β１インテグリンの機能を阻害し得るので、この中和抗体によってＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化が阻害されるか否かを調べた。１μｇ／ｍｌの抗α５β１インテグリン中和抗体でＨＳＣ−２／ＣＲ細胞を処理することにより、シスプラチン処理の前後のいずれの細胞においても、ＦＡＫのＴｙｒ３９７残基のリン酸化は完全に消滅した（バンドの太さを目視判定）。さらに、細胞生存に対するα５β１インテグリンの効果を調べるために、この中和抗体の存在下及び非存在下でＭＴＴアッセイを行った。０．５μｇ／ｍｌの抗α５β１インテグリン中和抗体で処理しても、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチンに対する感受性には影響なかった（データ示さず）。しかしながら、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチンに対する感受性は、１μｇ／ｍｌの抗α５β１中和抗体で処理すると、ＨＳＣ−２細胞と同じレベルにまで戻った（図５）。これらの結果は、α５β１インテグリンの機能が、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞におけるシスプラチン耐性にとって重要であることを示している。なお図５中のプロットは、３系列の試験の平均値を示し、縦棒は、標準偏差を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
シスプラチン耐性細胞ＨＳＣ−２／ＣＲ及びシスプラチン感受性細胞ＨＳＣ−２の、種々の濃度のシスプラチンで処理した場合の生存率を示す図である。
【図２】
シスプラチン感受性細胞ＨＳＣ−２のｍｏｃｋ細胞及びシスプラチン感受性細胞ＨＳＣ−２のＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントの、種々の濃度のシスプラチンで処理した場合の生存率を示す図である。
【図３】
シスプラチン耐性細胞ＨＳＣ−２／ＣＲのｍｏｃｋ細胞及びシスプラチン耐性細胞ＨＳＣ−２／ＣＲのＧｎＴ−Ｖトランスフェクタントの、種々の濃度のシスプラチンで処理した場合の生存率を示す図である。
【図４】
シスプラチン耐性細胞ＨＳＣ−２／ＣＲ及びシスプラチン感受性細胞ＨＳＣ−２の、種々の細胞外マトリックス物質に対する種々の濃度における接着率を示す図である。
【図５】
１μｇ／ｍｌの抗α５β１中和抗体で処理した場合の、ＨＳＣ−２／ＣＲ細胞のシスプラチンに対する感受性を、ＨＳＣ−２細胞及び中和抗体処理していないＨＳＣ−２／ＣＲ細胞の感受性と比較して示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for testing the resistance of a cancer cell to a metal complex compound anticancer agent, and an agent for reducing the resistance.
[0002]
[Prior art]
Cisplatin (cis-diaminedichloroplatinum) is a square planar platinum (II) complex in which two chlorine ligands are coordinated at the cis position (Non-Patent Document 1), and cells are spread by passive diffusion. Get in. When cells are treated with this drug, DNA replication and RNA transcription are inhibited, and the cells are stopped at the G2 phase of the cell cycle or directly lead to cell death (apoptosis) (Non-Patent Document 2). Cisplatin is widely used as one of the most powerful and useful anticancer agents for the treatment of solid tumors, including squamous cell carcinoma of the head and neck. However, there is a problem that many tumors are inherently resistant to cisplatin or that treatment with an anticancer drug is initially effective but later acquires resistance (Non-Patent Document 3). Many studies on the establishment of cisplatin-resistant strains have been reported to investigate the mechanism for resistance to cisplatin in tumor cells. One of the well-studied examples is the ATP-binding cassette transmembrane transporter, multidrug resistance protein (MRP), and microtubule multidrug-specific organics that are overexpressed in multidrug resistant cells and function as drug efflux pumps It relates to the expression of an anion transporter (cMOAT) (Non-patent Documents 4, 5). Other factors include enhanced inactivation of cisplatin by intracellular proteins such as glutathione and metallothionein, promotion of repair of damaged DNA, and changes in signaling pathways (Non-Patent Document 2). These studies on cisplatin-resistant cells indicate that the mechanism of cisplatin resistance may be complex.
[0003]
Modification of cell surface glycoproteins is one of the important stages of cell carcinogenesis and is thought to play an important role in various specific biological interactions (Non-Patent Document 6). . Several studies have been reported on the relationship between sugar chains and drug resistance. For example, treatment with tunicamycin, which blocks the first step in the synthesis of N-linked sugar chains associated with glycoproteins, increases sensitivity to cisplatin in vitro and in vivo (Non-Patent Document 7). It has been reported that α1,2-fucosyltransferase and tissue-blood group antigen H type 2 are involved in cell resistance to 5-FU (Non-Patent Document 8). These studies suggest that changes in sugar chains in some glycoproteins are involved in cisplatin resistance. If sugar chains could alter cisplatin resistance, many glycosyltransferase target molecules, adhesion molecules and / or receptors would be involved.
[0004]
Integrins are heterodimeric cell surface receptors that govern cell-ECM (extracellular matrix) interactions, mediate cell adhesion and migration, and mediate intracellular signaling (Non-patented). Reference 9). Since integrins contain about 20 to 30 N-linked glycosylation sites, modification of these N-linked glycoproteins on integrins may alter their function. α5β1 integrin (VLA-5) is a member of the integrin family and may play a role in cell survival. It has been reported that adhesion mediated by α5β1 integrin evades intestinal epithelial cells (Non-Patent Document 10) and HT29 colon cancer cells (Non-Patent Document 11) from apoptosis. In particular, activation of tyrosine kinase by β1 integrin stimulation suppresses chemotherapy-induced apoptosis in small cell lung cancer (Non-Patent Document 12). Furthermore, the sugar chain structure of α5β1 integrin can be regulated by various glycosyltransferases (Non-Patent Documents 13 and 14).
[0005]
Several downstream molecules involved in α5β1 integrin-mediated cell survival have been reported (Non-Patent Document 10). The signal originates from the intracellular domain of the integrin and the focal adhesion complex. FAK (focal adhesion kinase), a 125 kDa cytoplasmic tyrosine kinase present in the focal adhesion complex, is the main protein that is phosphorylated after integrin activation (Non-Patent Document 15). FAK plays a central role in integrin-mediated signaling, including regulation of cell survival (Non-Patent Document 16). In particular, Tyr397 of FAK (meaning Tyr at the 397th position from the N-terminus of the amino acid sequence; hereinafter, the positions and types of amino acid residues are similarly indicated) is the main autophosphorylation site that controls the FAK-mediated survival signal. (Non-Patent Document 17). And this phosphorylation can activate the phosphatidylinositide 3'-OH-kinase-Akt (P13K / Akt) survival pathway, which has been reported to be involved in resistance to FAK-induced apoptosis (Non-patented). References 16, 18).
[0006]
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[0007]
[Problems to be solved by the invention]
Metal complex compound anticancer agents such as cisplatin are effective for the treatment of solid tumors and are widely used, but are also known to have side effects. Therefore, if cancer cells can be tested in advance to see whether or not they have resistance to metal complex compound anticancer agents, it is possible to avoid administration to resistant patients and to administer ineffective anticancer agents to cause unnecessary side effects. Can be avoided. Further, if cancer cells having resistance to the metal complex compound anticancer agent can be changed to cancer cells sensitive to the anticancer agent, administration of the anticancer agent becomes effective, and cancer can be advantageously treated.
[0008]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for testing the resistance of a cancer cell to a metal complex compound anticancer agent. Another object of the present invention is to provide an agent for reducing the resistance of a cancer cell to a metal complex compound anticancer agent.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors considered that α5β1 integrin might be involved in the resistance of cancer cells to cisplatin, and performed lectin blot analysis using various lectins by the method described in detail in the Examples below. As a result, in the β1 subunit of α5β1 integrin, those derived from resistant cells were more likely than those derived from sensitive cells to have hemagglutinating phytohemagglutinin (L). 4 -PHA) was clearly less bound. L 4 -PHA is a PHA known to specifically bind to β1-6GlcNAc. Thus, the inventors of the present application have shown that cancer cells having resistance to cisplatin have clearly reduced β1-6GlcNAc branching on the β1 subunit of α5β1 integrin, as compared to cisplatin-sensitive cancer cells. I found it. Furthermore, it was found that the action of a neutralizing antibody of α5β1 integrin on cancer cells changed cisplatin-resistant cancer cells into cisplatin-sensitive cancer cells. It was confirmed that the resistance to cisplatin was based on the change of α5β1 integrin. Was done. Based on this, the present inventors examined whether the cancer cells are resistant to cisplatin by examining whether the β1-6GlcNAc branch on α5β1 integrin in cancer cells was reduced as compared to sensitive cells. I came up with the ability to test for no. Also, by administering a function inhibitor of α5β1 integrin, such as an α5β1 integrin neutralizing antibody, it was possible to convert cisplatin-resistant cells into cisplatin-sensitive cells, and to realize cancer treatment using cisplatin. .
[0010]
That is, the present invention examines the resistance of cancer cells to metal complex anticancer agents, including examining the degree of branching of β1-6GlcNAc (GlcNAc is N-acetylglucosamine) on α5β1 integrin in cells collected from a living body. Provide a method. The present invention also provides a drug for reducing the resistance of a cancer cell to a metal complex anticancer drug, which comprises an α5β1 integrin function inhibitor as an active ingredient.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The method of the present invention is a method for testing the resistance of a cancer cell to a metal complex compound anticancer agent. Here, as the “metal complex compound”, a platinum complex compound is preferable, and cisplatin is particularly preferable. The metal complex compound anticancer agent inhibits cell growth or induces apoptosis by binding of a metal in the complex compound to DNA to hinder DNA replication and RNA transcription. As the cancer cells, solid cancer cells are preferable, and examples thereof include head and neck cancer, gastric cancer, esophageal cancer, bladder cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, testicular cancer, kidney cancer, lung cancer, and neuroblastoma. And squamous cell carcinoma at various sites.
[0012]
In the test method of the present invention, the degree of branching of β1-6GlcNAc on α5β1 integrin of cells collected from a living body is examined. As specifically described in the Examples below, β1-6GlcNAc branching on α5β1 integrin is reduced in cells resistant to metal complex compounds such as cisplatin. Here, “reduced” means that the cell is reduced compared to cells sensitive to the same metal complex compound anticancer agent. Thus, the extent of β1-6GlcNAc branching on α5β1 integrin was determined and if it was significantly less than the extent of β1-6GlcNAc branching on α5β1 integrin in cells susceptible to the same anticancer agent, it was considered resistant to the anticancer agent. Can be determined.
[0013]
Here, “determining the degree of branching” means that the density of branches on α5β1 integrin is determined by a method that can be used to determine whether the density of branches is lower than that of susceptible cells. Measurement is not always necessary. Since the difference in the density of branches on the α5β1 integrin between the resistant cells and the susceptible cells is apparent, even a method with low quantitativeness, such as comparing the band widths in lectin blot analysis, as in the following example, was used. Can be achieved.
[0014]
As experimentally shown in the following examples, among the subunits constituting the α5β1 integrin, the density of the branches on the α5 subunit showed no difference between the resistant cells and the susceptible cells. There is a clear difference in branch density. Therefore, the α5 subunit and the β1 subunit may be separated by electrophoresis or the like to determine the degree of branching on the β1 subunit, or the degree of branching may be determined without separating them. Even in the latter case, the degree of branching on the β1 subunit is eventually reflected.
[0015]
To determine the degree of branching, for example, α5β1 integrin or its β1 subunit and L1 4 -Contact with PHA, L 4 -It can be performed by examining the amount of α5β1 integrin or its β1 subunit that binds to PHA. As described above, L 4 Since -PHA has a property of specifically binding to the β1-6GlcNAc structure, the degree of β1-6GlcNAc branching can be examined using this property. For example, as described in detail in the Examples below, test cells are homogenized, α5β1 integrin is recovered by immunoprecipitation, and the obtained immunoprecipitate or a product obtained by further separating the subunit by electrophoresis is used. , L 4 -Contact with PHA.
[0016]
Here, immunoprecipitation is performed, for example, by treating a homogenate of a test cell with an anti-α5β1 integrin IgG antibody, then treating the resulting immune complex with protein G-immobilized beads, and centrifuging or magnetically (magnetic beads). (In the case where is used), and can be carried out by a method of collecting by sedimentation. The anti-α5β1 integrin IgG antibody used here may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may include an antibody other than IgG. Since the anti-α5β1 integrin IgG antibody is commercially available, a commercially available product can be used. Since protein G has the property of specifically binding to the constant region of an IgG antibody, the immunoconjugate of α5β1 integrin can be bound to beads using this property. Commercially available beads such as protein G-Sepharose 4EF beads (trade name, commercially available from Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) can be used as the protein G-immobilized beads. In order to prevent IgG other than the α5β1 integrin complex from binding to the beads, the cell homogenate is treated with protein G-immobilized beads before the cell homogenate is treated with the anti-α5β1 integrin antibody, and the beads are removed. Is preferred.
[0017]
Next, α5β1 integrin recovered by immunoprecipitation or its β1 subunit and L 4 -Contact with PHA, L 4 -Determine the amount of α5β1 integrin or its β1 subunit that binds to PHA. This can be done, for example, by so-called lectin blot analysis. When immunoprecipitation is performed using protein G-immobilized beads, what is recovered by precipitation is the α5β1 integrin immunocomplex bound to the beads, which is boiled in, for example, a Lemli sampling buffer. By doing so, α5β1 integrin can be recovered. The collected α5β1 integrin may be separated into each subunit by electrophoresis. Lectin blot analysis was performed using labeled L as described in the Examples below. 4 -PHA was used as a probe to react with α5β1 integrin or its β1 subunit immobilized on a membrane such as a nitrocellulose membrane, and bound label L 4 -It can be performed by measuring PHA. As the label, a well-known label such as a biotin label, a radiolabel, and a fluorescent label can be used.
[0018]
As shown experimentally in the examples below, the degree of α5β1 integrin, and more specifically the degree of β1-6GlcNAc branching on its β1 subunit, is distinctly different between cells resistant and susceptible to cisplatin. By the above method, the degree of β1-6GlcNAc branching on α5β1 integrin can be directly examined. Furthermore, the degree of branching can be indirectly examined by another index reflecting this, and this may be more convenient in some cases.
[0019]
For example, it can be performed by fractionating glycoproteins collected from test cells and examining the degree of β1-6GlcNAc branching on glycoproteins having a molecular weight in the range of 90,000 to 150,000. α5β1 integrin is included in the above molecular weight range, and the degree of β1-6GlcNAc branching on the glycoprotein included in this range can reflect the degree of β1-6GlcNAc branching on α5β1 integrin. Cancer cells can be tested for resistance to anticancer agents. The degree of branching of β1-6GlcNAc can be determined by a method such as lectin blot analysis in the same manner as described above. 4 -It can be carried out by examining the amount of glycoprotein that binds to PHA. The specific method is described in the following examples.
[0020]
In addition, the degree of branching of α5β1 integrin to β1-6GlcNAc is also reflected in the adhesion of cells to fibronectin (α5β1 integrin is a receptor for fibronectin). Resistance to anticancer drugs can be tested. That is, in the resistant cells, the adhesiveness to fibronectin is clearly increased as compared to the susceptible cells, so that it is possible to examine whether or not the cells are resistant. Cell adhesion can be measured by a known method (Non-Patent Document 28), one example of which is specifically described in the following Examples. Briefly, fibronectin is attached to wells of a microplate, and a test cell is brought into contact with the fibronectin. After washing, the adhered cells are stained with crystal violet, the cells are lysed, and the number of adhered cells can be determined by measuring the absorbance in the lysate.
[0021]
The degree of β1-6GlcNAc branching of α5β1 integrin can also be examined by measuring the concentration of UDP-GlcNAc in cells. UDP-GlcNAc is a substrate of GnT-V (UDP-GlcNAc: α-D-mannoside β1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase), which is an enzyme that generates β1-6GlcNAc branching. As confirmed experimentally in the Examples below, there is almost no difference in GnT-V concentration between the resistant cells and the sensitive cells, but the UDP-GlcNAc (uracil diphosphate-GlcNAc) concentration in the cells is significantly higher. Differently, the concentration of UDP-GlcNAc in resistant cells is lower than the concentration of UDP-GlcNAc in sensitive cells. Therefore, by measuring the concentration of UDP-GlcNAc in the cells, it can be examined whether or not the test cells have resistance to the anticancer agent. The UDP-GlcNAc concentration in cells can be measured by applying a known method (Non-Patent Document 24), and one example of the measurement method is specifically described in the following Examples. The principle is that GnT-III (N-acetylglucosaminyltransferase III) is used to transfer a GlcNAc residue from UDP-GlcNAc to an acceptor substrate using UDP-GlcNAc as a substrate, and the generated β1-4GlcNAc residue is measured. Is what you do.
[0022]
The degree of β1-6GlcNAc branching of α5β1 integrin is determined by examining the degree of phosphorylation of Tyr397 residue of focal adhesion kinase (FAK) or the degree of phosphorylation of Ser473 residue of Akt (Non-Patent Document 36). You can also find out. FAK is a main protein that is phosphorylated after integrin activation (Non-Patent Document 15), and Akt is phosphorylated by phosphorylated FAK. As shown experimentally in the Examples below, phosphorylation of the above sites of FAK and Akt is clearly increased in resistant cells compared to sensitive cells. Therefore, the resistance to the anticancer agent can also be examined by examining the degree of phosphorylation of the Tyr397 residue of FAK or the degree of phosphorylation of the Ser473 residue of Akt. Phosphorylation of the Tyr397 residue of FAK and the phosphorylation of Ser473 residue of Akt result in specific binding of these sites to phosphorylated FAK or Akt (binding to phosphorylated FAK or Akt but phosphorylation Polyclonal antibodies that do not bind to FAK or Akt, which are not yet commercially available, can be easily measured by immunoassay using them. The following example also describes an example in which the degree of phosphorylation was measured by Western blotting, which is a type of immunoassay, using these polyclonal antibodies.
[0023]
As described in the Examples below, it was revealed that the action of α5β1 integrin-neutralizing antibody on resistant cells can change the resistant cells into sensitive cells. Therefore, the present invention also provides an agent for reducing the resistance of a cancer cell to a metal complex anticancer agent, which comprises an α5β1 integrin function inhibitor as an active ingredient. Here, as described above, the “metal complex compound” is preferably a platinum complex compound, particularly preferably cisplatin. The “function inhibitor” is a substance that inhibits α5β1 integrin from binding to fibronectin. Preferred examples thereof include an anti-α5β1 integrin neutralizing antibody or an antigen-binding fragment thereof (Fab fragment or F (ab ′)). ) 2 Fragments, etc.). The anti-α5β1 integrin neutralizing antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The polyclonal antibody produced by an ordinary method is a neutralizing antibody, and a neutralizing monoclonal antibody is also known and commercially available. Therefore, use a commercially available monoclonal antibody (for example, clone number P1D6 manufactured by DAKO). Can be.
[0024]
When the anti-α5β1 integrin neutralizing antibody is used as a drug for changing a resistant cell to a sensitive cell, the dose is appropriately selected based on the type and progress of cancer, the size of a lesion, and the like. About 0.1 mg to 10 mg per 100 g of solid cancer tissue is appropriate. The administration route is preferably such that the antibody solution is directly administered to the solid cancer tissue by a method such as injection, infusion, application, spraying and the like. As the preparation, for example, a solution obtained by dissolving a neutralizing antibody or an antigen-binding fragment thereof in a buffer solution can be used, and a well-known additive for injection (eg, a pH regulator, an osmotic pressure regulator, etc.) ) May be added. In addition, the antibody concentration in the antibody solution is not particularly limited, but usually about 0.7 μg / ml to about 10 μg / ml is appropriate.
[0025]
By administering the agent of the present invention to cancer cells, the resistance to the metal complex compound anticancer agent can be changed to sensitivity. By administering the metal complex compound anticancer agent after the sensitivity is changed in this way, it is possible to treat cancers originally resistant to the anticancer agent. Therefore, the agents of the present invention greatly contribute to the treatment of cancer.
[0026]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
[0027]
Materials and methods
1. Cell culture and cell lines
An HSC-2 cell line derived from human squamous cell carcinoma in the oral cavity (available from the Institute of Aging, Tohoku University) was obtained from 10% fetal bovine serum (Sigma, St Louis, USA) and 100 μg / ml kanamycin (Japanese). In an RPMI medium (Sigma, St Louis, USA) containing 50 units / ml penicillin (Manyu Pharmaceutical), CO 2 Maintained at 37 ° C., 5% pressure. Cisplatin-resistant HSC-2 / CR cells were established by a known method (Non-Patent Document 19) by exposing to cisplatin (Nippon Kayaku) for 12 months while gradually increasing the concentration. That is, cells were first cultured for 6 months in the presence of 2 μM concentration of cisplatin, then raised to 3 μM for 3 months, and finally raised to 5 μM for another 3 months. . After being allowed to culture in the presence of 5 μM cisplatin for 2 weeks, the medium was returned to a medium not containing cisplatin. To ensure stable resistance of the established cells, all experiments were performed after culturing for 2 weeks in medium without cisplatin.
[0028]
2. Cell survival by MTT assay
To determine the sensitivity of cells to the drug in vitro, the MTT assay was used. In each well in a 48-well plate, about 1 × 10 5 in 200 μl of medium 4 Individual cells were seeded and cultured. Experiments under the same conditions were performed in three series. After 12 hours, cells were treated with various concentrations of cisplatin. 48 hours after the treatment with cisplatin, 20 μl of MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) (5 mg / ml) (Dojindo) was administered, and the cells were treated. The cells were cultured at 37 ° C. for 4 hours. 800 μl of 2-propanol was added, and the absorbance at a wavelength of 560 nm (A 560 ) Was measured. The effect of the drug on cell viability was expressed as viability. The survival rate was calculated using the following formula.
(A 560 (Cisplatin treatment) / A 560 (Untreated with cisplatin)) x 100
All values are shown as the mean of three series ± standard deviation (SD). The test was performed three times independently, and the 50% inhibitory concentration (IC 50 ) Was defined as the concentration of cisplatin that killed 50% of the cells.
[0029]
3. Lectin blot analysis
Proteins were extracted from HSC-2 and HSC-2 / CR cells, respectively, for lectin blot analysis. The extraction was performed as follows. The cells cultured in a 10 cm diameter dish were washed with PBS, scraped with a scraper, placed in 1 ml of PBS, and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. The precipitated cells were suspended in a TNE buffer containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.8), 1% NP-40, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA and a protease inhibitor mixture (Wako Pure Chemical Industries), and iced. And then centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. The supernatant fraction was stored as a solubilized protein of the enucleated supernatant, and the protein concentration was measured using a BCA kit (Pierce, Rockford, USA) using bovine serum albumin as a concentration measurement standard. 20 μg of extracted protein was electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel and then transferred onto a nitrocellulose membrane. After blocking overnight at 4 ° C. with PBS containing 3% BSA, the membrane was treated with various biotinylated lectins (Con A, SSA, MAM, L) at 1 μg / ml. 4 −PHA, E 4 -PHA, LCA) (Seikagaku Corporation) for 3 hours. Washing and subsequent operations were performed by a known method (Non-Patent Document 20). That is, specifically, it carried out as follows. After washing with TBS-T containing 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 137 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 0.5% Tween 20 for 5 minutes, VECTASTAIN ABC Kit (VECTOR, Burlingame, USA) For 1 hour, and then washed with TBS-T for another 30 minutes to remove non-specific bands. Reacting glycoproteins were visualized by chemiluminescence using an ECL system (Amersham Pharmacia Biotech UK Limited, Buckinghamshire, UK).
[0030]
4. Northern and Western blot analysis and GnT-V activity measurement
Total RNA was extracted from HSC-2 cells and HSC-2 / CR cells according to the method of TRIZOL (Life Technologies, Inc. of Rockville, USA). 20 μg of RNA was electrophoresed on a 1% agarose gel containing 2.2 M formaldehyde and transferred by capillary action onto a Zeta-probe membrane (Bio-Rad, Hercules, USA). The membrane was pre-hybridized in a pre-hybridization buffer for 3 hours by a known method (Non-Patent Document 22), and then [ 32 P] -labeled GnT-V cDNA (Non-Patent Document 21) fragment and hybridized at 42 ° C for 12 hours. For Western blotting of GnT-V, 20 μg of each protein extracted from HSC-2 and HSC-2 / CR cells was electrophoresed on an 8% polyacrylamide gel and then transferred to a nitrocellulose membrane. After blocking overnight in PBS containing 5% skim milk at 4 ° C., the membrane was incubated with anti-human GnT-V monoclonal antibody 24D11 (Fujirebio) for 2 hours. Washing and subsequent operations were performed by a known method (Non-Patent Document 20). The GnT-V band was visualized by chemiluminescence using the ECL system. GnT-V activity was analyzed by a fluorescence assay. The extracted protein (20 μg to 50 μg) was incubated at 37 ° C. for 8 hours with 5 μM of a pyridylaminated agalacto double-stranded sugar chain as an acceptor substrate and 40 mM UDP-GlcNAc as a donor. The subsequent operation was performed by a known method (Non-Patent Document 23). That is, specifically, it carried out as follows. The reaction was stopped by heating the sample at 100 ° C. for 5 minutes and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes in a microcentrifuge. The supernatant was analyzed by HPLC (Shimadzu, Japan) using TSKgel ODS-80TM (4.6 x 150 mm) (TOSOH, Japan). Specifically, the amount of the synthesized product was measured by exciting a peak separated by 20 mM ammonium acetate (pH 4.0) at a wavelength of 320 nm and detecting it at 400 nm.
[0031]
5. Measurement of UDP-GlcNAc in HSC-2 and HSC-2 / CR cells
The amount of intracellular UDP-GlcNAc was measured by a method improved from a known method (Non-Patent Document 24). First, cells were collected by centrifugation after washing with PBS. The cells were suspended in ice-cooled 80% ethanol and then sonicated using BRANSON SONIFIER 250 (Westshore Technologies, Inc., Muskegon, USA). The soluble fraction was obtained by centrifugation (15000 rpm × 10 minutes, 4 ° C.), frozen in liquid nitrogen, and freeze-dried as it was. The sample was resuspended in 40 μl of PBS, then 60 μg of protein was extracted as above and the volume adjusted to 5 μl with PBS. 2 μl of a 100 μM (200 pmol) acceptor solution and 3 μl of purified GnT-III (Non-Patent Document 25), which is one of glycosyltransferases and catalyzes UDP-GlcNAc as a donor substrate (Non-Patent Document 26), are used as samples. And adjusted to 20 μl (final concentrations of acceptor molecule and GnT-III in the reaction mixture were 10 μM and 18 μU / μl, respectively). Further, 100 pmol and 500 pmol of UDP-GlcNAc were reacted as standard substances for concentration measurement. The mixture was then incubated at 37 ° C. for 5 hours to transfer GlcNAc residues from UDP-GlcNAc to the acceptor substrate by the action of GnT-III. Thereafter, a known method (Non-Patent Document 23) was used in the same manner as above.
[0032]
6. Transfection of GnT-V into HSC-2 and HSC-2 / CR cells
Human GnT-V cDNA was inserted into pCXN2 (Non-patent Document 27), which is a mammalian expression vector regulated by the β-actin promoter (Non-patent Document 27), and 2 μg of GnT-V was expressed by Effectene (QIAGEN). The vector was transfected into HSC-2 and HSC-2 / CR cells, respectively. At this time, cells in which each vector was similarly transfected with only the vector (control cells: mock) were also prepared. After culturing these cells for 48 hours, transfected cells were selected and maintained in a medium supplemented with 500 μg / ml G418 (Nacalai Tesque). These transfectants were used for Western blot analysis of GnT-V, lectin blot analysis, measurement of GnT-V activity and MTT assay.
[0033]
7. Cell adhesion assay
Cell adhesion was measured by crystal violet staining according to a known method (Non-Patent Document 28). Briefly, 96-well culture plates were pre-coated with 50 μl of fibronectin, laminin or type I collagen, air-dried overnight, and then blocked with RPMI medium supplemented with 3% BSA at 37 ° C. for 1 hour. Cells (1 x 10 5 ) Were deposited on each matrix for 30 minutes at 37 ° C. After washing the cells with 200 μl of PBS, they were stained with 0.04% crystal violet for 10 minutes, then the cells were washed and lysed. Absorbance at wavelength 560 nm (A 560 ) Was measured with a spectrophotometer. The percentage of adherent cells was calculated by the following equation.
(A 560 (Matrix) -A 560 (No matrix)) / A 560 (Without matrix)
[0034]
8. Lectin blot analysis for immunoprecipitated α5β1 integrin
For immunoprecipitation, 15 μl of protein G-Sepharose 4EF beads (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) were introduced into HSC-2 cells, HSC-2 / CR cells, and HSC-2 mock cells (vector only). 600 μg of protein, extracted as above from GnT-V transfectants of control cells) or HSC-2 cells, were incubated with rotation at 4 ° C. for 3 hours. Protein G-Sepharose 4EF beads were previously removed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. After incubation with 600 ng / ml of the anti-human α5β1 integrin antibody P1D6 (Dako, Carpinteria, USA) for 2 hours at 4 ° C., the immunoconjugate was recovered together with 15 μl of protein G-Sepharose 4EF beads. After washing twice with TNE buffer, the complex was cut off from the beads by boiling in Laemmli's sampling buffer without reducing agent, separated by 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred to a nitrocellulose membrane. Transcribed. The membrane is L 4 -Analyzed by PHA lectin blot. After deprobing and blocking the membrane, the anti-α5 integrin antibody (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA) and the anti-β1 integrin antibody 4B7R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA) were analyzed using Western blots as described above. It was confirmed that α5β1 integrin was migrated to the same extent in each cell.
[0035]
9. Tyrosine phosphorylation of FAK and serine phosphorylation of Akt
GnT-V transfectants of HSC-2 cells, HSC-2 / CR cells, mock cells of HSC-2 (control cells transfected with vector only) or HSC-2 cells were placed on a 6 cm diameter dish at 5 × 10 5 Seeded at cell density. After a 12 hour incubation, the cells were treated with 30 μM cisplatin and incubated for an additional 24 hours. The cells were washed with an ice-cold solution (1 mM sodium o-vanadate, 1 mM sodium pyrophosphate, 100 mM sodium fluoride), and ice-cold lysis buffer (5 mM EDTA, 1 mM sodium o-vanadate, 1 mM sodium pyrophosphate, After suspending with 100 mM sodium fluoride, 0.5% Triton X-100 (trade name) and a protease inhibitor mixture (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the suspension was allowed to stand in ice for 20 minutes, and then at 15000 rpm at 4 ° C. for 15 minutes. The pellet (insoluble fraction) was previously removed by centrifugation, and 20 μg of protein extracted from these cells was electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel and transferred to a nitrocellulose membrane. After the purification, the membrane was subjected to anti-FAK (pY397) phosphorylation-specific (ph The plate was incubated with a spospecific antibody (BioSource International, Inc., Camarillo, USA) or an anti-phosphorylated Akt (Ser473) antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc., Beverly, USA) for 2 hours at room temperature as described above. After deprobing and blocking the membrane, Western blot analysis was performed on the membrane as described above using an anti-FAK antibody (BD Transduction Laboratories, Lexington, USA) and an anti-Akt antibody (Cell Signaling TECHNOLOGY, Inc., Beverly, USA). Was served.
[0036]
10. Effect of anti-α5β1 integrin neutralizing antibody on survival of HSC-2 / CR cells
HSC-2 / CR cells were plated at 5 × 10 5 on 6-well culture plates with 1 μg / ml α5β1 integrin neutralizing antibody. 5 Seeded at cell density. After culturing for 12 hours, the cells were treated with 30 μM cisplatin and further cultured for 12 hours. To detect FAK phosphorylation, these cells were subjected to Western blot as described above. For cell viability assays, 2 × 10 5 in 50 μl medium with or without 1 μg / ml α5β1 integrin neutralizing antibody. 3 HSC-2 / CR cells were seeded in each well of a 96-well plate. Experiments under the same conditions were performed in three series. After 12 hours, 50 μl of medium containing various concentrations of cisplatin was added and the cells were cultured for another 48 hours. At this stage, 10 μl of MTT solution (5 mg / ml) was administered and cells were cultured at 37 ° C. Four hours later, 200 µl of 2-propanol was added, and the absorbance of each well at a wavelength of 560 nm was measured using a spectrophotometer. The following operations were performed as described above.
[0037]
result
1. Establishment of cisplatin-resistant cells from human squamous cell carcinoma HSC-2 cells
A highly cisplatin-resistant cell line HSC-2 / CR was established by exposing human squamous cell carcinoma HSC-2 cells to graded concentrations of cisplatin for 12 months. The survival curves in FIG. 1 show the levels of cisplatin sensitivity of HSC-2 and HSC-2 / CR. HSC-2 and HSC-2 / CR IC 50 The values were 4.0 μM and 14.6 μM, respectively. The relative resistance level of HSC-2 / CR was 3.65 times higher than its parent strain, HSC-2. The results were similar to those for established cisplatin-resistant cells in various other studies. In addition, the plot in FIG. 1 shows the average value of three series of tests, and the vertical bar shows the standard deviation.
[0038]
2. Lectin blot analysis of HSC-2 and HSC-2 / CR
In order to understand the relationship between drug resistance and carbohydrate structure, the patterns of glycosylation of many glycoproteins were studied by several types of lectin blot analysis. As a result of Con A, SSA, MAM, E4-PHA and LCA lectin blot analysis, no significant change in sugar chain was observed (the thickness of each band was visually judged). However, GlcNAc residues on the β1-6GlcNAc branch of a three- or four-chain sugar chain are preferentially recognized (Non-Patent Document 29) L 4 -PHA lectin blot analysis shows that in HSC-2 / CR cells, the β1-6GlcNAc branch of glycoproteins with a molecular weight of 90,000-150,000 is clearly less than in HSC-2 cells. (The thickness of the band is visually determined).
[0039]
3. Northern and Western blot analysis and enzymatic activity of GnT-V in HSC-2 and HSC-2 / CR
The β1-6GlcNAc branch is known to be catalyzed by the action of GnT-V. First, the expression level of GnT-V in HSC-2 and HSC-2 / CR was examined. As a result of Northern blot analysis and Western blot analysis, no difference was observed in the expression of GnT-V in HSC-2 and HSC-2 / CR cells. In contrast, GnT-V activity in HSC-2 / CR cells was slightly reduced compared to activity in HSC-2 cells, but was not significantly different by t-test (Table 1). . “Mock” in the table indicates a control cell into which only the vector was introduced.
[0040]
[Table 1]
Table 1
* No significant difference compared to HSC-2 cells by t-test
[0041]
4. Amount of intracellular UDP-GlcNAc in HSC-2 and HSC-2 / CR
Β1-6GlcNAc branching in HSC-2 / CR cells was significantly reduced compared to branching in HSC-2 cells (described above), but GnT-V in HSC-2 / CR cells. Did not significantly decrease as compared to the HSC-2 parent cells (Table 1). K for UDP-GlcNAc of GnT-V m Since the value is too large, it has been reported that the concentration of UDP-GlcNAc, a donor substrate of GnT-V, is an important factor in the biosynthesis of β1-6GlcNAc (Non-Patent Document 30). Interestingly, the concentration of intracellular UDP-GlcNAc in HSC-2 / CR cells was reduced to about half that in HSC-2 cells (Table 2). This decrease in UDP-GlcNAc concentration was thought to have resulted in a decrease in β1-6GlcNAc branching.
[0042]
[Table 2]
Table 2
* Difference from HSC-2 cells is observed by t-test (P <0.01)
[0043]
5. Generation of GnT-V transfectants in HSC-2 and HSC-2 / CR cells and GnT-V transfectants in HSC-2 cells are more sensitive to cisplatin than mock cells
To determine whether GnT-V is involved in cisplatin resistance of squamous cell carcinoma cells, transfection of HSC-2 cells and HSC-2 / CR cells with a mammalian expression vector expressing human GnT-V was performed. Tanto was made and analyzed for cisplatin resistance in these cells. GnT-V protein expression and its enzymatic activity were significantly increased in both cells compared to mock (control) cells (band thickness was visually determined and Table 1). The β1-6GlcNAc branching on GnT-V transfectants of HSC-2 cells was observed to be significantly increased compared to mock (control) cells (band thickness was visually determined), but HSC -2 / Not observed in GnT-V transfectants of CR cells (band thickness was visually determined). These results suggest that the level of GnT-V enzymatic activity is not determinative of β1-6GlcNAc branching on glycoproteins in HSC-2 / CR cells. Furthermore, the concentration of intracellular UDP-GlcNAc may be an important factor in the synthesis of β1-6GlcNAc branches in HSC-2 / CR cells. In addition, the sensitivity of these GnT-V transfectants to cisplatin was determined by MTT assay. Interestingly, GnT-V transfections of HSC-2 cells were more sensitive to cisplatin than mock (control) cells (FIG. 2), but GnT-V transfections of HSC-2 / CR cells. The survival curve of the tant was similar to mock (control) cells (FIG. 3). These results indicate that the difference in sensitivity of HSC-2 and HSC-2 / CR cells to cisplatin correlates with the amount of β1-6GlcNAc branching and not with the level of GnT-V enzymatic activity. It suggests. The plots in FIGS. 2 and 3 show the average values of the three series of tests, and the vertical bars show the standard deviation.
[0044]
6. Cell adhesion to extracellular matrix
Cell adhesion assays were performed to determine what glycoproteins were involved in cisplatin resistance of HSC-2 / CR cells. As shown in FIG. 4A, adhesion of HSC-2 / CR cells to fibronectin was dramatically increased compared to HSC-2 cells, whereas adhesion to laminin and type I collagen was significantly different in these cells. Was not found (FIGS. 4B, 4C). These results suggest that certain glycoproteins that bind to fibronectin are involved in cisplatin resistance of HSC-2 / CR cells. In addition, the plot in FIG. 4 shows the average value of three series of tests, and the vertical bar shows the standard deviation.
[0045]
7. Lectin blot analysis for immunoprecipitated α5β1 integrin
L for HSC-2 / CR cells 4 -PHA lectin blot analysis shows dramatic changes in glycoproteins of molecular weight 90,000-150,000, and cell adhesion to fibronectin is significant between HSC-2 and HSC-2 / CR cells. Showed a change. In addition, cisplatin has been reported to induce apoptosis. Therefore, it is speculated that α5β1 integrin is a key molecule for cisplatin resistance in HSC-2 / CR cells. To determine the extent of β1-6GlcNAc addition on α5β1 integrin, L 4 -PHA lectin blot analysis was performed. Interestingly, in β1 integrin immunoprecipitated from HSC-2 / CR cells, the density of β1-6GlcNAc branches was significantly reduced compared to HSC-2 cells, while β1-6GlcNAc content on α5 integrin was The branch density was almost the same between these cells (the thickness of the band was visually determined). The molecular weight of β1 integrin in HSC-2 / CR cells was slightly smaller than the molecular weight of β1 integrin in HSC-2 cells due to the small amount of sugar chains (the band thickness was visually determined). . Furthermore, both α5 and β1 integrins immunoprecipitated from GnT-V transfections of HSC-2 cells significantly increased the density of β1-6GlcNAc branches (visual judgment of band thickness). These results suggest that the density of α5β1 integrin, particularly the β1-6GlcNAc branch on β1 integrin, is important for cisplatin resistance.
[0046]
8. Phosphorylation of Tyr397 residue of FAK and Ser473 residue of Akt before and after cisplatin treatment
FAK is a major substrate for tyrosine phosphorylation after integrin activation (Non-Patent Document 15). Since the phosphorylation of Tyr397 residue of FAK and the phosphorylation of Ser473 of Akt are essential for the FAK-mediated survival signal (Non-patent Documents 16, 17, 18, and 31), HSC-2, HSC-2 / CR and trans Transfected HSC-2 cells were treated with 30 μM cisplatin and the level of phosphorylation of each was determined. A dramatic difference was observed in the phosphorylation of Tyr397 residue of FAK between HSC-2 cells and HSC-2 / CR cells (band thickness was visually determined). In HSC-2 / CR cells, phosphorylation of the Tyr397 residue of FAK was slightly reduced before cisplatin treatment compared to other cells, but dramatically after 24 hours of treatment with 30 μM cisplatin. Was growing. In contrast, in HSC-2 cells, the level of phosphorylation of Tyr397 residue of FAK was high before cisplatin treatment and decreased after treatment with 30 μM cisplatin. Interestingly, FAK degradation was observed in cisplatin-treated HSC-2 cells but not in cisplatin-treated HSC-2 / CR cells (band thickness was visually determined). It has been reported that FAK degradation is observed in mannitol-induced apoptosis (Non-Patent Document 18) or retinoic acid-induced apoptosis (Non-Patent Document 30). Furthermore, this lower level of FAK degradation and phosphorylation of Tyr397 residues of FAK was more pronounced in cisplatin-treated GnT-V transfectants. To determine the downstream signal of FAK phosphorylation, Akt activation was examined. Phosphorylation of Ser473 residue of Akt, which means activation of Akt, was detected only 24 hours after treating HSC-2 / CR cells with 30 μM cisplatin (band thickness was visually determined). Akt expression levels were comparable in each cell before cisplatin treatment, but after cisplatin treatment, HSC-2 cells, HSC-2 mck cells and GnT-V transfectants in HSC-2 cells showed: It was quite low due to Akt decomposition (band thickness was visually determined). Akt degradation has also been observed in mannitol-induced apoptosis (18). These results indicate that reduction of the β1-6GlcNAc branch of the α5β1 integrin prevents FAK degradation and phosphorylation of Tyr397 residues and subsequent activation of Akt, thereby causing cisplatin-induced apoptosis of HSC-2 / CR cells Is suggested to be inhibited.
[0047]
9. Inhibition of FAK phosphorylation by α5β1 integrin neutralizing antibody on cisplatin resistance of HSC-2 / CR cells
Since an α5β1 integrin neutralizing antibody can inhibit the function of α5β1 integrin, it was examined whether or not this neutralizing antibody inhibits the phosphorylation of Tyr397 residue of FAK. Treatment of HSC-2 / CR cells with 1 μg / ml anti-α5β1 integrin neutralizing antibody completely abolished phosphorylation of Tyr397 residue of FAK in both cells before and after cisplatin treatment (band of Visually determine the thickness). In addition, to examine the effect of α5β1 integrin on cell survival, MTT assays were performed in the presence and absence of this neutralizing antibody. Treatment with 0.5 μg / ml anti-α5β1 integrin neutralizing antibody did not affect the sensitivity of HSC-2 / CR cells to cisplatin (data not shown). However, the sensitivity of HSC-2 / CR cells to cisplatin returned to the same level as HSC-2 cells when treated with 1 μg / ml anti-α5β1 neutralizing antibody (FIG. 5). These results indicate that the function of α5β1 integrin is important for cisplatin resistance in HSC-2 / CR cells. The plot in FIG. 5 shows the average value of three series of tests, and the vertical bar shows the standard deviation.
[Brief description of the drawings]
FIG.
It is a figure which shows the survival rate when the cisplatin-resistant cell HSC-2 / CR and the cisplatin-sensitive cell HSC-2 are treated with various concentrations of cisplatin.
FIG. 2
It is a figure which shows the survival rate when the mock cell of the cisplatin-sensitive cell HSC-2 and the GnT-V transfectant of the cisplatin-sensitive cell HSC-2 are treated with various concentrations of cisplatin.
FIG. 3
It is a figure which shows the survival rate when the mock cell of the cisplatin-resistant cell HSC-2 / CR and the GnT-V transfectant of the cisplatin-resistant cell HSC-2 / CR are treated with various concentrations of cisplatin.
FIG. 4
FIG. 3 shows the adhesion ratio of cisplatin-resistant cells HSC-2 / CR and cisplatin-sensitive cells HSC-2 to various extracellular matrix substances at various concentrations.
FIG. 5
The sensitivity of HSC-2 / CR cells to cisplatin when treated with 1 μg / ml anti-α5β1 neutralizing antibody was compared with the sensitivity of HSC-2 cells and HSC-2 / CR cells not treated with neutralizing antibody. FIG.
