JP2004196814A - Composition for treating neuron damage associated with ischemia - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、虚血状態、例えば、発作（ｓｔｒｏｋｅ）に関連したニューロン損傷を減ずる際に使用するための組成物に、および、当該組成物に含まれている新規ペプチドに関する。 The present invention relates to compositions for use in reducing neuronal damage associated with ischemic conditions, eg, stroke, and to novel peptides contained therein.
中枢神経系（ＣＮＳ）に対する虚血損傷は、全体的なまたは局部的な虚血状態から生じ得る。全体的な虚血は、脳全体への血流がある時間止まる状態下に起こり、例えば、心拍停止から生じ得る。局部的な虚血は、脳の一部に、その通常の血液供給がない状態下に起こり、例えば、大脳血管の血栓塞栓症による閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、外傷性頭部損傷、水腫、および脳腫瘍から生じ得る。 Ischemic damage to the central nervous system (CNS) can result from global or localized ischemic conditions. Global ischemia occurs when blood flow to the entire brain stops for a period of time, and may result, for example, from cardiac arrest. Regional ischemia occurs when part of the brain lacks its normal blood supply, for example, from occlusion by thromboembolism of cerebral blood vessels, traumatic head injury, edema, and brain tumors. Can occur.
全体的および局部的な虚血状態は共に、たとえ虚血状態が一時的であっても、広範囲にわたるニューロン損傷を引き起こす可能性を有する。永久的なニューロン損傷は、脳への血流の停止に続く最初の１分間に生じ得、全体的および局部的な虚血における損傷の大部分は、虚血の発症に続く数時間あるいは数日すらにわたって起こる。このニューロン損傷の多くは、組織の再灌流の二次的な結果、例えば、損傷した内皮による血管に作用する生成物の放出および損傷した組織による細胞に有毒な生成物（フリーラジカル、ロイコトリエンなど）の放出に帰せられる。 Both global and localized ischemic conditions have the potential to cause extensive neuronal damage, even if the ischemic condition is transient. Permanent neuronal damage can occur during the first minute following cessation of blood flow to the brain, and the majority of damage in global and localized ischemia occurs in the hours or days following the onset of ischemia. It even happens. Many of these neuronal injuries are secondary to the reperfusion of tissue, such as the release of vasoactive products by damaged endothelium and products toxic to cells by damaged tissue (free radicals, leukotrienes, etc.). Attributable to the release of
いくつかの薬物方法が、虚血に関連した発作および別のニューロン状態の処置のために提案され、そしてこれらは最近の論説（例えば、Ｗａｕｑｕｉｅｒ）中で精査されている。抗凝血剤、例えば、ヘパリンが検討されているが、雑多な結果である。 Several drug regimens have been proposed for the treatment of stroke and other neuronal conditions associated with ischemia, and these have been reviewed in recent editorials (eg, Wauquier). Anticoagulants, such as heparin, have been studied, but with mixed results.
同様に、抗血管収縮剤、例えば、フルナラジン（ｆｌｕｎａｒａｚｉｎｅ）、興奮性神経伝達物質アンタゴニスト、例えば、ＭＫ−８０１およびＡＰ７、ならびに抗水腫化合物は、神経毒神経病または感染に対する高められた感受性を含む種々の副作用よりまさる明らかな利点なしで、雑多な結果を示す。 Similarly, anti-vasoconstrictors, eg, flunarazine, excitatory neurotransmitter antagonists, eg, MK-801 and AP7, and anti-edema compounds, have a variety of effects, including increased susceptibility to neurotoxic neuropathy or infection. Show mixed results without any obvious advantage over the side effects of
血管拡張剤の２つの一般的な類が、ニューロン虚血損傷の可能な処置のために研究されている。パパべリン、プロスタサイクリン、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、およびニトロプルシド（ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ）を含む非特異的な血管拡張剤は、虚血損傷を減ずる際にいかなる明らかな利点をも証明することはできなかった。血管拡張剤の第二の一般的な類は、種々のカルシウム−アンタゴニスト血管拡張薬物を含む。ベラパミルならびに、平滑筋および横紋筋へのカルシウムの流入を妨げる関連化合物は、重大な心臓毒性が続き得る高い薬物濃度でのみ有効であると思われる。ジヒドロピリジン、例えば、ニモジピンは、雑多な結果を生じる−−いくつかの神経学的改善が見られ得るが、増加した大脳水腫も観察されている。ジルチアゼムによって例示されるような、ベンゾチアゼピンは、適度な保護作用を示すが、これらの薬物も、処置に不利であり得る低血圧のような望ましくない副作用を引き起こすと思われる。 Two general classes of vasodilators are being investigated for possible treatment of neuronal ischemic injury. Non-specific vasodilators, including papaverine, prostacyclin, pentoxifylline, and nitroprusside, failed to demonstrate any obvious benefit in reducing ischemic damage . The second general class of vasodilators includes various calcium-antagonist vasodilator drugs. Verapamil and related compounds that block calcium influx into smooth and striated muscle appear to be effective only at high drug concentrations, where significant cardiotoxicity can persist. Dihydropyridines, such as nimodipine, produce mixed results--some neurological improvement may be seen, but increased cerebral edema has also been observed. Although benzothiazepines, as exemplified by diltiazem, show modest protective effects, these drugs also appear to cause undesirable side effects, such as hypotension, which can be disadvantageous for treatment.
要約すると、今日までのところ発作および脳の別の虚血関連状態の処置のために提案されている薬物は、（ｉ）比較的有効でない、（ｉｉ）望ましくない副作用が観察される用量レベルでのみ有効である、および／または（ｉｉｉ）薬物の潜在的有効性を傷つける、全身性の作用、例えば、低血圧を生じる。 In summary, drugs proposed to date for the treatment of stroke and other ischemic-related conditions of the brain are: (i) relatively ineffective, (ii) at dose levels at which undesirable side effects are observed. Produces systemic effects, such as hypotension, which are only effective and / or (iii) impair the potential effectiveness of the drug.
それ故、本発明の一般的目的は、脳内の虚血損傷に関連したニューロン損傷を処置するために有効な組成物を提供することである。 Therefore, it is a general object of the present invention to provide a composition that is effective for treating neuronal damage associated with ischemic damage in the brain.
本発明の別の目的は、このようなニューロン損傷を処置するための新規ペプチドを提供することである。 Another object of the present invention is to provide novel peptides for treating such neuronal damage.
本発明の薬学的組成物は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロン細胞中のノルエピネフリン放出を遮断する、およびニューロン膜ω−コノトキシン（ＯＣＴ）ＭＶＩＩＡ結合部位に結合する活性−それらは、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にある−を有するニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタゴニズトω−コノトキシンペプチドを包含する。当該ペプチドは、注射に適当なビヒクル中に保持される。 The pharmaceutical compositions of the present invention block norepinephrine release in mammalian central nervous system (CNS) neuron cells and bind to the neuronal membrane ω-conotoxin (OCT) MVIIA binding site—they are those of OCT Include neuronal cell calcium channel antagonist omega-conotoxin peptides having-within such activities for MVIIA, GVIA and TVIA. The peptide is kept in a suitable vehicle for injection.
１つの好ましいＯＣＴペプチドは、形：ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基である。〕を有している。 One preferred OCT peptide is of the form: CKGKGAX 1 CX 2 RX 3 X 4 YDCCT GSCX 5 RX 6 GKC-t [where X 1 = K or S; X 2 = S or H; X 3 = L or T; X 4 = M or S; X 5 = N or missing; X 6 = S or deletion; and t is a carboxy or amidated carboxy terminal group. 〕have.
もう１つの好ましいＯＣＴペプチドは、形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基である。〕を有している。 Another preferred OCT peptide is of the form CX 1 SXGSSCSXTSYNCRCSCNXYX 2 X 3 X 4 CX 5 -t, where X 1 = K or L; X 2 = T or S; X 3 = K or R; X 4 = R Or K; X 5 = Y or R; and t = carboxy or amidated carboxy end group. 〕have.
より一般的に、当該組成物は、哺乳動物のＣＮＳニューロン細胞からのノルエプネフリンの放出を阻害する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に結合する活性を、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にある活性で、有するニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を含む。当該化合物は、適当な薬学的ビヒクル中に保持される。 More generally, the composition inhibits the release of norepnephrine from mammalian CNS neuronal cells and binds to the neuronal membrane ω-conotoxin MVIIA binding site, as described for OCT's MVIIA, GVIA and TVIA. Neuronal calcium channel antagonist compounds having an activity within a range of specific activities. The compound is maintained in a suitable pharmaceutical vehicle.
１つの実施態様において、ＭＶＩＩＡ部位に対する当該化合物の結合活性は、当該化合物によるニューロン膜からのＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によって求められる結合定数によって特徴づけられる。 In one embodiment, the binding activity of the compound to the MVIIA site is characterized by a binding constant determined by competitive displacement of OCT MVIIA from the neuronal membrane by the compound.
第二の実施態様において、結合活性は、ニューロン細胞ＯＣＴ ＳＶＩＢ部位およびニューロン細胞ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位に結合する化合物に関する結合定数の比によって特徴づけられる。 In a second embodiment, the binding activity is characterized by the ratio of the binding constants for compounds that bind to the neuronal cell OCT SVIB site and the neuronal cell OCT MVIIA site.
本発明はさらに、Ｘ1＝Ｋ，Ｘ2＝Ｓ，Ｘ3＝Ｌ，Ｘ4＝Ｍ，Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝Ｓ、およびＸ1＝Ｓ，Ｘ2＝Ｈ，Ｘ3＝Ｔ，Ｘ4＝Ｓ，Ｘ5＝Ｎ、そしてＸ6＝欠落のペプチドを除く、形：ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕、または、Ｘ1＝Ｋ，Ｘ2＝Ｔ，Ｘ3＝Ｋ，Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ，Ｘ2＝Ｓ，Ｘ3＝Ｒ，Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除く、形：ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕を有するＯＣＴペプチドを含む。
The present invention further provides that X 1 = K, X 2 = S, X 3 = L, X 4 = M, X 5 = missing, and X 6 = S, and X 1 = S, X 2 = H, X 3 = T, X 4 = S, X 5 = N, and X 6 = excluding the missing peptide, form: CKGKGAX 1 CX 2 RX 3 X 4 YDCCTGSCX 5 RX 6 GKC-t [where X 1 = K or S; X 2 = S or H; X 3 = L or T; X 4 = M or S; X 5 = N or missing; X 6 = S or deletion; and t = carboxy or amidated carboxy terminal group], or, X 1 = K, X 2 = T, X 3 = K, X 4 = R, and X 5 = Y; and X 1 = L, X 2 = S, X 3 = R, X 4 = K, and X 5 = R excluding the
未だ別の面で、本発明は、哺乳動物種における、例えば、発作により生ずるような、虚血関連ニューロン損傷を減ずるのに有効なカルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を選択する方法を含む。当該化合物は、ニューロン細胞ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に対するその親和性について、および、哺乳動物のＣＮＳニューロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその能力についてアッセイされる。アッセイした化合物は、もし、ＣＮＳニューロン細胞からのノルエピネフリン放出に関する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位への結合に関するその活性が、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にあるならば、このような処置において使用するために選択される。 In yet another aspect, the invention includes a method of selecting a calcium channel antagonist compound that is effective in reducing ischemia-related neuronal damage, eg, caused by stroke, in a mammalian species. The compounds are assayed for their affinity for the neuronal cell OCT MVIIA binding site and for their ability to inhibit norepinephrine release in mammalian CNS neuronal cells. The compounds assayed show that their activity for norepinephrine release from CNS neuronal cells and for binding to the neuronal membrane ω-conotoxin MVIIA binding site is within such activity for OCT's MVIIA, GVIA, and TVIA. If so, they are selected for use in such procedures.
本発明のこれらのおよび別の目的および特徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付した図面と関連して読まれるとき、より完全に明らかになるであろう。 These and other objects and features of the invention will become more fully apparent when the following detailed description of the invention is read in conjunction with the accompanying drawings.
１．ＯＣＴペプチド
ω−コノトキシン（ＯＣＴ）ペプチドは、イモガイ（Ｃｏｎｕｓ）属の海生巻貝により生産されるペプチド毒素であり、そしてそれは、カルシウムチャンネル遮断薬として作用する。イモガイ属中の、約５００種の円錐状の巻貝は確認されており、そして、これらの種のいくつかから種々のＯＣＴペプチドが単離されている。いくつかの天然のＯＣＴペプチドの一次配列が、図１に示されている。慣用の文字イニシアルが、アミノ酸残基について使用され、そしてＸは、４−ヒドロキシプロリンを表し、４Ｈｙｐとも略書される。図中に示されている全てのペプチドは、それらのＣ末端でアミド化されている。
1. OCT Peptide [omega] -Conotoxin (OCT) peptide is a peptide toxin produced by marine snails of the genus Conus, which acts as a calcium channel blocker. Approximately 500 conical snails in the genus Conch have been identified, and various OCT peptides have been isolated from some of these species. The primary sequence of some natural OCT peptides is shown in FIG. The conventional letter initial is used for amino acid residues, and X represents 4-hydroxyproline, also abbreviated 4Hyp. All peptides shown in the figures are amidated at their C-terminus.
ペプチドの同定する名称は、図中に同様に示されており、そしてこれらの名称は本明細書において特定のＯＣＴペプチドに関連して使用されるであろう。例えば、配列がＭＶＩＩＡと称されるペプチドは、本明細書においてＯＣＴ ＭＶＩＩＡと呼ばれる。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＧＶＩＡペプチドは、それぞれ、一般の名称ＣｍＴｘおよびＣｇＴｘをも有する。ＯＣＴペプチドの全ては、ＭＶＩＩＡペプチドについて示されているように、システイン残基１および４、２および５、そして３および６をつなぐ３つのジスルフィド結合を有する。
The identifying names of the peptides are similarly shown in the figures, and these names will be used herein in connection with the particular OCT peptide. For example, a peptide whose sequence is referred to as MVIIA is referred to herein as OCT MVIIA. OCT MVIIA and OCT GVIA peptides also have the common names CmTx and CgTx, respectively. All of the OCT peptides have three disulfide bonds connecting
図２は、本発明により合成されそして試験された、天然のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ、ＯＣＴ ＧＶＩＡ、およびＳＶＩＢペプチドの類似体を示している。標準の単一アミノ酸コード文字が図中で使用されている；Ｘ＝ヒドロキシプロリン；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｃ末端のＮＨ2基は、ペプチドが、Ｃ末端アミノ化されていることを示している；Ｇ−ＯＨは、未変性グリシン残基中の末端を示している。 FIG. 2 shows analogs of native OCT MVIIA, OCT GVIA, and SVIB peptides synthesized and tested according to the present invention. Single amino acid code letters standards are used in the figure; X = hydroxyproline; Nle = norleucine; NH 2 group of the C-terminal peptide, indicating that it is C-terminal aminated; G -OH indicates the end in the native glycine residue.
ＯＣＴペプチド、例えば、図１および２に示されているようなものは、開示されているような（Ｒｉｖｉｅｒ）慣用の固体相方法によって合成され得る。手短に言えば、Ｎ−α−保護アミノ酸無水物を、結晶形で調製しそしてＮ末端への連続するアミノ酸付加に使用する。各残基の付加で、成長するペプチド（固体保持体上）を酸処理してＮ−α−保護基を除去し、数回洗浄して残った酸を除去する、そして反応媒体へのペプチド末端の接近性を増進する。次いで当該ペプチドを、活性化したＮ−保護アミノ酸対称無水物と反応させ、そして固体保持体を洗浄する。各残基付加工程で、アミノ酸付加反応は、２または３の個々の付加反応の全てについて繰り返され得、反応される、成長するペプチド分子の割合を高める。一般に、１〜２の反応サイクルが、第一の１２の残基付加に、そして２〜３の反応サイクルが、残りの残基のために使用される。 OCT peptides, such as those shown in FIGS. 1 and 2, can be synthesized by conventional solid phase methods as disclosed (Rivier). Briefly, N-α-protected amino acid anhydrides are prepared in crystalline form and used for successive amino acid additions to the N-terminus. With the addition of each residue, the growing peptide (on the solid support) is acid treated to remove the N-α-protecting group, washed several times to remove residual acid, and the peptide terminus to the reaction medium. Improve accessibility. The peptide is then reacted with an activated N-protected amino acid symmetrical anhydride and the solid support is washed. At each residue addition step, the amino acid addition reaction can be repeated for all two or three individual addition reactions, increasing the proportion of growing peptide molecules that are reacted. Generally, 1-2 reaction cycles are used for the first 12 residue additions and 2-3 reaction cycles for the remaining residues.
成長するペプチド鎖を完全なものにした後、保護したペプチド樹脂を液体フッ化水素酸で処理して保持体からペプチドを脱ブロック化し（ｄｅｂｌｏｃｋ）そして遊離する。アミド化ペプチドの調製のために、環からのペプチド開裂後、合成の際に使用される樹脂保持体を選択してＣ末端アミンを供給する。 After completion of the growing peptide chain, the protected peptide resin is treated with liquid hydrofluoric acid to deblock and release the peptide from the support. For the preparation of the amidated peptide, after cleavage of the peptide from the ring, the resin support used in the synthesis is selected to provide the C-terminal amine.
ペプチド中の３つのジスルフィド結合は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）存在下に室温でまたは４℃で延長された反応期間にわたって空気酸化により形成され得る。代わりに、正しいまたは所望の架橋がランダム酸化によって達成され得ない場合、ブリッジが連続的に、１度に１つのブリッジが形成される化学的直接方法が使用され得る。以下の側鎖保護基が、システイン残基の各対のために使用され得る：４−メチルベンジル、エチルカルバモイル、およびアセトアミドメチル。これらの保護基は、保護基のどの１つの種類もが他の２つに影響を与えない条件下で除去され得る、直交するセットを構成する。方法は、ここでは、保護基の１つの種類をシステイン残基の対から除去し、次いで酸化して第一のジスルフィドブリッジを形成することを包含している。保護基の第二の種類を次いで除去し、再度酸化して第二のブリッジを形成する。第三ブリッジは同様の方法で形成される。 The three disulfide bonds in the peptide can be formed by air oxidation in the presence of dithiothreitol (DTT) at room temperature or at 4 ° C. for an extended reaction period. Alternatively, if the correct or desired cross-linking cannot be achieved by random oxidation, a direct chemical method can be used where the bridges are formed continuously, one bridge at a time. The following side chain protecting groups may be used for each pair of cysteine residues: 4-methylbenzyl, ethylcarbamoyl, and acetamidomethyl. These protecting groups constitute an orthogonal set in which any one type of protecting group can be removed under conditions that do not affect the other two. The method herein involves removing one type of protecting group from a pair of cysteine residues and then oxidizing to form a first disulfide bridge. The second type of protecting group is then removed and re-oxidized to form a second bridge. The third bridge is formed in a similar manner.
当該ペプチドは、ゲル濾過による最初の分離により単離され得、ペプチド二量体およびより高度なポリマーを除去し、そして同様に、酸化反応において使用される、望ましくない塩、例えば、グアニジン塩酸塩を除去する。 The peptide can be isolated by initial separation by gel filtration, removing peptide dimers and higher polymers, and also removing unwanted salts, such as guanidine hydrochloride, used in oxidation reactions. Remove.
不十分に精製したペプチドをさらに、分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、そして当該ペプチドの純度をアミノ酸組成物分析により確認する。 The poorly purified peptide is further purified by preparative HPLC chromatography, and the purity of the peptide is confirmed by amino acid composition analysis.
ＩＩ．神経保護化合物
このセクションは、本発明による、ＯＣＴペプチドによって例示されるような、虚血関連ニューロン損傷を減ずるのに有効である化合物の試験管内阻害および結合特性を記載している。以下のセクションＶに記載されているように、試験管内阻害および結合特性は、神経保護化合物の選択の際に使用できる。
II. Neuroprotective Compounds This section describes the in vitro inhibitory and binding properties of compounds that are effective in reducing ischemia-related neuronal damage, as exemplified by the OCT peptide, according to the present invention. As described in Section V below, in vitro inhibitory and binding properties can be used in selecting neuroprotective compounds.
Ａ．カルシウムチャンネルアンタゴニスト活性
本発明の神経保護化合物は、ニューロン細胞中の電圧ゲートイオン電流を阻害するそれらの活性によって定義されるような、ニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタゴニストである。
A. Calcium channel antagonist activity The neuroprotective compounds of the present invention are neuronal cell calcium channel antagonists, as defined by their activity of inhibiting voltage-gated ionic currents in neuronal cells.
電圧ゲートカルシウムチャンネルは、ニューロン中、そして、心筋、平滑筋、および骨格筋ならびに別の興奮性細胞中に存在し、そして膜興奮、筋収縮、および細胞分泌中、例えば、シナプス伝達中で種々の役割を果たすことが知られている（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。ニューロン細胞中で、電圧ゲートカルシウムチャンネルは、それぞれ、神経化学により、特徴的なゲート電圧（ｇａｔｉｎｇｖｏｌｔａｇｅ）、不活性化速度、および選択的変調を有するＬ、Ｔ、およびＮチャンネルに分類されている（Ｎｏｗｖｃｋｙ）。 Voltage-gated calcium channels are present in neurons and in myocardial, smooth, and skeletal muscle and other excitable cells, and vary during membrane excitation, muscle contraction, and cell secretion, such as synaptic transmission. It is known to play a role (McCleskey). In neuronal cells, voltage-gated calcium channels have been classified by neurochemistry into L, T, and N channels with characteristic gating voltage, inactivation rates, and selective modulation, respectively ( Nowvcky).
電圧ゲートニューロンカルシウムチャンネルの阻害（遮断）を試験する１つの適当なシステムは、マウス神経芽細胞腫細胞系，Ｎ１Ｅ１１５系である。膜電流は、通常、実施例１に詳述されている方法に従って、パッチクランプ法の全細胞形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を用いて測定される。 One suitable system for testing inhibition (blocking) of voltage-gated neuronal calcium channels is the mouse neuroblastoma cell line, N1E115 line. Membrane currents are typically measured using the whole cell configuration of the patch clamp method, according to the method detailed in Example 1.
手短に言えば、細胞電位が約−１００ｍＶの保持電圧から−６０ｍＶ〜＋２０ｍＶの範囲にある試験電位まで進められる電圧クランププロトコールが行われ、そして細胞は、当該保持電位でパルスの間５秒間保持された。 Briefly, a voltage clamp protocol is performed in which the cell potential is advanced from a holding voltage of about -100 mV to a test potential in the range of -60 mV to +20 mV, and the cells are held at the holding potential for 5 seconds between pulses. Was.
図３は、−８０ｍＶ〜−２０ｍＶの電位段階によって引き出される典型的な内向きのカルシウム電流を示している。これ、および記録の大部分において、シグナルを増加するために、Ｃａに代わってＢａが、カルシウムチャンネルを通じて、電荷キャリヤーとなった（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。実施例１に記載した手順によれば、Ｎ１Ｅ１１５神経芽細胞腫細胞は、ナトリウムに代えてＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＤＧ）、および２ｍＭ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを有する塩類溶液中に浸された。これらの置換は、どちらかといえばカルシウム電流記録を汚染するであろうナトリウム電流を減じ、そして浴中２ｍＭ Ｃａのみの場合より高くカルシウム電流を高めた。カリウム電流は、浴中のＴＥＡおよびピペット溶液中のＣｓによって遮断された。 FIG. 3 shows a typical inward calcium current drawn by a potential step from −80 mV to −20 mV. In this, and in most of the recordings, Ba instead of Ca became the charge carrier through the calcium channel to increase the signal (McCleskey). According to the procedure described in Example 1, N1E115 neuroblastoma cells are soaked in a saline solution having N-methyl-D-glucamine (NMDG) instead of sodium and 10 mM Ba instead of 2 mM Ca. Was. These substitutions reduced the sodium current, which would rather contaminate the calcium current record, and increased the calcium current higher than with only 2 mM Ca in the bath. The potassium current was blocked by TEA in the bath and Cs in the pipette solution.
図３，曲線Ａから明らかなように、カルシウム電流は素早く（約２０ｍｓ内に）活性化しそして３０〜４０ｍｓの時間定数で不活性化する。カルシウム電流は、脱分極ピークによって引き出されたピークの内向きの電流の振幅によって測定され、そして約−１２００ｐＡの測定値を有する。図３（曲線Ａ）中の細胞は、神経芽細胞腫細胞中のＬ型カルシウムチャンネルを有効に遮断することを予期される１μＭニフェジピン，ジヒドロピリジンにもさらされ、そして測定されたカルシウム電流に対する影響は全く観察されなかった。観察されたカルシウム電流は従って主としてＮ型カルシウムチャンネル電流であることが予期される。 As is evident from FIG. 3, curve A, the calcium current is activated quickly (within about 20 ms) and inactivated with a time constant of 30-40 ms. Calcium current is measured by the inward current amplitude of the peak elicited by the depolarization peak, and has a reading of about -1200 pA. The cells in FIG. 3 (curve A) were also exposed to 1 μM nifedipine, dihydropyridine, which is expected to effectively block L-type calcium channels in neuroblastoma cells, and the effect on measured calcium currents was No observations were made. The observed calcium currents are therefore expected to be mainly N-type calcium channel currents.
ＯＣＴのＭＶＩＩＡおよびＧＶＩＡの増加する用量に対する、電圧ゲートカルシウム電流の応答が図４に示されている。カルシウム電流の５０％阻害が引き起こされるＥＤ50濃度は、電圧ゲート電流振幅から決定され、ＯＣＴペプチド濃度の関数としてプロットされる。計算されたＥＤ50は、高い阻害ペプチド活性を示し、ＧＶＩＡについて１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについて１１６ｎＭである。これらならびにＯＣＴペプチドＳＶＩＡおよびＳＶＩＢに関するＥＤ50濃度は以下の表１に示されている。以下のセクションＩＩＩにおいて理解されるであろうように、比較的低いＩＣ50値（１μＭ以下）を有する２つの化合物は、両方とも、神経保護剤として活性であり、他方、この閾値より高いＩＣ50を有するＯＣＴ ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢはない。より一般的には、本発明の化合物は例１に詳述されたアッセイ中約１μＭより低いＥＤ50値で電圧ゲートカルシウムチャンネル電流を阻害するそれらの能力により、電圧ゲートカルシウムチャンネルのアンタゴニストとして分類される。 The response of voltage-gated calcium current to increasing doses of OCT MVIIA and GVIA is shown in FIG. The ED 50 concentration at which 50% inhibition of the calcium current is caused is determined from the voltage gating current amplitude and plotted as a function of OCT peptide concentration. The calculated ED 50 shows high inhibitory peptide activity, 12 nM for GVIA and 116 nM for MVIIA. These and ED 50 concentrations for OCT peptides SVIA and SVIB are given in Table 1 below. As will be understood in the following sections III, the two compounds with relatively low an IC 50 value of (1 [mu] M or less), both are active as neuroprotective agents, while higher than the threshold value IC 50 There are no OCT SVIA and SVIB with More generally, compounds of the present invention are classified as antagonists of voltage-gated calcium channels by their ability to inhibit voltage-gated calcium channel currents with an ED 50 value of less than about 1 μM in the assay detailed in Example 1. You.
神経細胞カルシウム電流について抑制する試験ペプエチドはさらにカルシウム電流を遮断する際のペプチド活性がニューロン細胞に特異的であることを確認するために、非ニューロン細胞中で試験され得る。ＯＣＴによるカルシウム電流阻害に無反応性である種々の筋細胞、例えば、脊椎動物胎児心筋および骨格筋細胞が適している。細胞電流測定は、実質的に、上に概説されそして実施例１に詳述されているようになされる。例えば、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡは、後根ガングリオン（ｄｏｒｓａｌｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ）（ＤＲＧ）ニューロンを含む、種々のニューロン細胞中の電圧ゲートカルシウムチャンネルを遮断することが報告されている（ＭｃＣｌｅｓｋｅｙ）。カルシウムチャンネル電流のこの遮断または阻害は、ペプチドによるカルシウム電流阻害は、心筋、平滑筋、および骨格筋において観察されなかったので、ニューロン特異的であることが報告されている。 Test peptides that inhibit neuronal calcium current can also be tested in non-neuronal cells to confirm that the peptide activity in blocking calcium currents is specific to neuronal cells. Various muscle cells that are unresponsive to calcium current inhibition by OCT, such as fetal vertebrate myocardial and skeletal muscle cells, are suitable. Cell current measurements are made substantially as outlined above and detailed in Example 1. For example, OCT MVIIA has been reported to block voltage-gated calcium channels in various neuronal cells, including dorsal root ganglion (DRG) neurons (McCleskey). This blockade or inhibition of calcium channel currents has been reported to be neuron-specific, as no inhibition of calcium currents by peptides was observed in cardiac, smooth, and skeletal muscle.
Ｂ．ノルエピネフリン放出の選択的阻害
本発明による、神経保護化合物の第二の必要な特性な、脳（ＣＮＳ）ニューロン細胞中の脱分極誘発およびカルシウム依存ノルエピネフリン放出を特異的に阻害するが、しかし骨格筋の哺乳動物神経筋接合部での神経伝達物質放出を阻害しない能力である。ニューロン細胞中のノルエピネフリン放出の阻害は、実施例２に詳述されているように、標準方法により哺乳動物脳海馬スライスにおいてアッセイされ得る。手短に言えば、海馬スライスをミクロ力価プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ）の個々のウエルに分布しそして細胞接種に好都合である条件下に放射能標識化ノルエピネフリンと共にインキュベーションする。細胞を低カリウム媒体で洗浄し、次いで、１５分間刺激媒体中に、試験化合物の選択された濃度の存在下に浸す。興奮緩衝液の除去後、各スライス中に残っている放射能を測定する。
B. Selective Inhibition of Norepinephrine Release According to the present invention, it specifically inhibits the second necessary property of neuroprotective compounds, depolarization-induced and brain-dependent norepinephrine release in brain (CNS) neuronal cells, but in skeletal muscle. The ability to not inhibit neurotransmitter release at the mammalian neuromuscular junction. Inhibition of norepinephrine release in neuronal cells can be assayed in mammalian brain hippocampal slices by standard methods, as detailed in Example 2. Briefly, hippocampal slices are distributed on individual wells of a microtitre plate and incubated with radiolabeled norepinephrine under conditions that favor cell inoculation. The cells are washed with a low potassium medium and then immersed in the stimulation medium for 15 minutes in the presence of the selected concentration of the test compound. After removal of the excitation buffer, the radioactivity remaining in each slice is measured.
図５は、先ず、通常の洗浄溶液（白地棒）、次いで、興奮媒体（黒地棒）に浸したラット脳海馬スライスからのノルエピネフリン放出に関する、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡペプチドの増加する濃度の効果を示している。理解されるように、当該化合物は、興奮媒体の存在下にノルエピネフリン放出の強い用量依存阻害を引き起こすが、興奮媒体の不存在下には引き起こさない。用量依存阻害データから、エピネフリン放出の５０％阻害を引き起こすのに有効な化合物濃度が計算される。 FIG. 5 shows the effect of increasing concentrations of OCT MVIIA peptide on norepinephrine release from rat brain hippocampal slices immersed first in a normal wash solution (white bar) and then in the excitatory medium (black bar). As will be appreciated, the compounds cause a strong dose-dependent inhibition of norepinephrine release in the presence of an excitatory medium, but not in the absence of an excitatory medium. From the dose-dependent inhibition data, the compound concentration effective to cause a 50% inhibition of epinephrine release is calculated.
この方法により試験された種々のＯＣＴペプチドに関する表２中に示されたＩＣ50値は、薄い（２００μ）および厚い（４００μ）海馬スライスから計算された平均ＩＣ50値を表している。０.８〜２.４ｎＭの間の、３つの最も低いＩＣ50値は、著しい神経保護活性を示すＯＣＴペプチドに対応している（以下のセクションＩＩＩ）。ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ（１９５）およびＭＶＩＩＡ（２０１）は、以下のセクションＩＶにおいて検討されているように、キー残基部位（図２）にアミノ酸置換または変性を有するＭＶＩＩＡである。この変性ペプチドについて測定された、より高いＩＣ50値は、神経保護活性の実質的減少または損失に反映される。ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢ ＯＣＴペプチドは、神経保護活性を示さないＯＣＴ化合物を代表しており、そしてこれは、ノルエピネフリン放出に関する高いＩＣ50値によって反映されている。ＳＶＩＢ（２０２）ペプチドは、ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ中位置９〜１２のＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ残基をＳＶＩＢ ＯＣＴ中の同一位置のＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ残基の代わりに用いる、ＳＶＩＢペプチドの変性である。この変性は、ノルエピネフリン放出の阻害に関するＩＣ50値を著しく減じ、そして弱い神経保護活性しか観察されなかった。 The IC 50 values shown in Table 2 for the various OCT peptides tested by this method represent the average IC 50 values calculated from thin (200μ) and thick (400μ) hippocampal slices. The three lowest IC 50 values between 0.8 and 2.4 nM correspond to OCT peptides exhibiting significant neuroprotective activity (Section III below). OCT peptides MVIIA (195) and MVIIA (201) are MVIIA with amino acid substitutions or modifications at key residue sites (FIG. 2), as discussed in Section IV below. The higher IC 50 values measured for this denatured peptide are reflected in a substantial reduction or loss of neuroprotective activity. The SVIA and SVIB OCT peptides represent OCT compounds that show no neuroprotective activity, and are reflected by high IC 50 values for norepinephrine release. The SVIB (202) peptide is a modification of the SVIB peptide using Ser-Arg-Leu-Met residues at positions 9-12 in the MVIIA OCT in place of the Arg-Leu-Thr-Ser residues at the same position in the SVIB OCT. It is. This denaturation significantly reduced the IC 50 value for inhibition of norepinephrine release and only weak neuroprotective activity was observed.
要約すると、著しい神経保護活性は、０.８〜２.４ｎＭ範囲中のＩＣ50で、そしてより一般的には、活性なＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定されたＩＣ50値の範囲内にあるＩＣ50値；即ち、これらの活性なＯＣＴペプチドについて測定された最も大きいＩＣ50値未満で、ノルエピネフリン放出を阻害する能力に関連している。この範囲のわずかに外側のＩＣ50値を持つ化合物は、中位〜低い神経保護活性を有し得、そして、高いＩＣ50値を持つ化合物は神経保護しない。 In summary, significant neuroprotective activity is with an IC 50 in the 0.8-2.4 nM range, and more generally within the IC 50 values measured for active OCT MVIIA, GVIA, and TVIA. the IC 50 values in; that is, less than the measured largest IC 50 values for these active OCT peptides are related to their ability to inhibit norepinephrine release. Compounds with IC 50 values slightly outside this range may have moderate to low neuroprotective activity, and compounds with high IC 50 values do not.
Ｃ．ＯＣＴ受容体への、特異的な、高い親和性結合
本発明による、神経保護化合物の別の特性は、ニューロン細胞中のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い親和性結合である。以下で理解されるであろうように、結合親和性は、ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合定数により、または、ニューロン細胞ＭＶＩＩＡ結合部位およびＳＶＩＢ結合部位への結合について測定された結合定数の比により、特徴づけられ得る。
C. Specific, High Affinity Binding to OCT Receptor Another property of the neuroprotective compounds according to the present invention is high affinity binding for the OCT MVIIA binding site in neuronal cells. As will be understood below, the binding affinity is determined by the binding constant of the compound for the MVIIA binding site or by the ratio of the binding constants measured for binding to the neuronal cell MVIIA binding site and the SVIB binding site. Can be characterized.
ニューロン組織中のＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位への結合は、種々の細胞型およびシナプトソーム細胞フラクションで論証され得る。１つの好ましいニューロン膜は、哺乳動物脳シナプトソーム調製物、例えば、実施例３に記載されたラット脳シナプトソーム調製物である。ＭＶＩＩＡ結合部位に関する化合物の結合定数は一般に、次のように、シナプトソーム調製物から放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの競合的置換によって決定される。 Binding to OCT MVIIA binding sites in neuronal tissue can be demonstrated in a variety of cell types and synaptosome cell fractions. One preferred neuronal membrane is a mammalian brain synaptosome preparation, such as the rat brain synaptosome preparation described in Example 3. Compound binding constants for the MVIIA binding site are generally determined by competitive displacement of radiolabeled OCT MVIIA from synaptosome preparations, as follows.
シナプトソーム膜に関するＭＶＩＩＡペプチドの結合定数Ｋdは、放射能標識化ペプチドの増加する量をシナプトソーム膜に添加する飽和結合方法によって決定され、そして各濃度で結合された標識化材料の量を求める。次に、濃度の関数としての結合したペプチドのプロットを使用して、Ｂmax,シナプトソーム上の結合部位の濃度、およびＫdを、標準方法に従って計算する。特に、Ｋd値は、シナプトソーム特異的結合部位を半分飽和するのに必要とされるペプチドの計算された濃度である。図６Ａは、ラット脳シナプトソームヘのＯＣＴ ＭＶＩＩＡの特異的結合を示し、ＯＣＴペプチド濃度の関数としてプロットされ、そして図６Ｂは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット形にある同一データを示している。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット線の傾斜から、８.８ｐＭのＫd結合値が得られる。 The binding constant Kd of the MVIIA peptide for the synaptosome membrane is determined by a saturation binding method in which increasing amounts of radiolabeled peptide are added to the synaptosome membrane, and the amount of labeled material bound at each concentration is determined. Next, using the plot of bound peptide as a function of concentration, B max, the concentration of the binding site on synaptosomes, and K d are calculated according to standard methods. In particular, the K d value is the calculated concentration of peptide required to half-saturate the synaptosome-specific binding site. FIG. 6A shows the specific binding of OCT MVIIA to rat brain synaptosomes, plotted as a function of OCT peptide concentration, and FIG. 6B shows the same data in a Scatchard plot. The slope of the Scatchard plot line gives a Kd binding value of 8.8 pM.
ＭＶＩＩＡ結合部位に関する試験化合物の結合定数を決定するために、試験化合物を、ｎＭ範囲中の増加する濃度で、結合した、放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡを有するシナプトソーム調製物に添加する。次いで、シナプトソーム材料を素早く濾過し、洗浄しそして結合した放射能標識についてアッセイする。試験化合物の結合定数（Ｋi）は、ＧＶＩＡペプチドについて図７に示されているように、コンピューター適合競合的結合曲線を用いて求め、先ず、化合物のＩＣ50値、即ち、標識化ＭＶＩＩＡペプチドの５０％置換を与える濃度を求め、次に、例３に詳述されているように、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡのＫd値および当該化合物のＩＣ50値からＫiを計算する。試験した多数のＯＣＴペプチドに関する、計算されたＩＣ50およびＫi値を表３に示す。当該化合物は、増加するＩＣ50およびＫi値の順序で配列されている。 To determine the binding constant of the test compound for the MVIIA binding site, the test compound is added at increasing concentrations in the nM range to the synaptosome preparation with bound radiolabeled OCT MVIIA. The synaptosome material is then quickly filtered, washed and assayed for bound radiolabel. The binding constant (K i ) of the test compound was determined using a computer-adapted competitive binding curve, as shown in FIG. 7 for the GVIA peptide, first of all, the IC 50 value of the compound, ie of the labeled MVIIA peptide. The concentration that gives 50% displacement is determined, and then the K i is calculated from the K d value of OCT MVIIA and the IC 50 value of the compound as detailed in Example 3. The calculated IC 50 and K i values for a number of OCT peptides tested are shown in Table 3. The compounds are arranged in order of increasing IC 50 and Ki values.
ＭＶＩＩＡ（１９８）化合物は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ中の位置２にＡｌａ置換を含み、そして、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（２００）はＯＣＴ ＭＶＩＩＡの７位にＡｌａ置換を含む。他の化合物は図２中に同定されている。
The MVIIA (198) compound contains an Ala substitution at
既知の神経保護活性を有する化合物、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ、ＧＶＩＡ、およびＴＶＩＡは、約１５〜３００ｐＭの間のＩＣ50値ならびに約１および１００ｐＭの間のＫ1値を有している。逆に、神経保護でないＯＣＴペプチド、例えば、ＯＣＴ ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢは十分により大きいＩＣ50およびＫi値を有している。 Compounds with known neuroprotective activity, OCT MVIIA, GVIA, and TVIA has a K 1 values between IC 50 values and about 1 and 100pM of between about 15～300PM. Conversely, OCT peptides not neuroprotective, e.g., OCT SVIA and SVIB has a sufficiently IC 50 of greater than and K i values.
試験された多数のＯＣＴペプチド化合物は、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，および／またはＴＶＩＡのそれらの範囲内のＩＣ50およびＫi値を示し、従ってこれらの化合物は神経保護化合物として重きをなす候補者であるべきである。しかしながら、これらの化合物のいくつか、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０１）、ＭＶＩＩＡ（１９５）、およびＳＶＩＢ（２０２）は、神経保護化合物の範囲外にあるノルエピネフリン放出の阻害に関するＩＣ50値を有しており（表２）、従って、これらの化合物は、神経保護化合物についての全ての基準を満たすわけではない。 Numerous OCT peptide compounds tested, OCT peptides MVIIA, GVIA, and / or show an IC 50 and K i values within those ranges of TVIA, therefore these compounds are candidates forming an emphasis as neuroprotective compound Should be. However, some of these compounds, e.g., MVIIA (201), MVIIA ( 195), and SVIB (202) has an IC 50 value for inhibition of norepinephrine release which are outside the scope of the neuroprotective compound ( Table 2), therefore, do not fulfill all the criteria for neuroprotective compounds.
ニューロン細胞膜細胞中のＭＶＩＩＡ結合タンパク質の同定は、実施例５に詳述されているように、放射能標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡをシナプトソームに結合し、そしてペプチドを標識化するニューロン膜に架橋することによって、試験された。標識化した膜を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分別し、そして標識化バンドについてオートラジオグラフィーによって試験した。１つの場合において、当該膜を、過剰の未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの存在下に標識化ペプチドと共にインキュベーションした。同様の結合研究が、標識化ＯＣＴ ＧＶＩＡで行われた。 The identification of MVIIA binding proteins in neuronal cell membrane cells was accomplished by linking radiolabeled OCT MVIIA to synaptosomes and cross-linking the peptide to the labeling neuronal membrane, as detailed in Example 5. Tested. Labeled membranes were solubilized with sodium dodecyl sulfate (SDS), fractionated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and tested for labeled bands by autoradiography. In one case, the membrane was incubated with the labeled peptide in the presence of excess unlabeled OCT MVIIA. Similar binding studies were performed with labeled OCT GVIA.
ゲルのオートラジオグラフィーは、図８に示され、そこでは、レーンａおよびｂは、未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡの不存在（レーンａ）および存在（レーンｂ）下でのシナプトソーム膜へのＭＶＩＩＡ結合パターンを示しており、そして、レーンｃおよびｄは、未標識化ＯＣＴ ＧＶＩＡの不存在（レーンｃ）および存在（レーンｄ）の存在下でのシナプトソーム膜へのＧＶＩＡ結合パターンを示している。ゲルパターンは、標識化ＭＶＩＩＡペプチドの大部分が２００〜２１０キロダルトンのタンパク質バンドに結合すること、および、当該結合は、未標識化ＯＣＴ ＭＶＩＩＡでの置換による証拠として、特異的であることを示している（レーンｂ）。この結合は、レーンｃおよびｄにおける放射能標識化パターンから判断されるように、ＯＣＴ ＧＶＩＡの主要な特異的結合部位であると同様に思われる。 The autoradiography of the gel is shown in Figure 8, where lanes a and b show MVIIA binding patterns to synaptosome membranes in the absence (lane a) and presence (lane b) of unlabeled OCT MVIIA. And lanes c and d show GVIA binding patterns to synaptosome membranes in the absence (lane c) and presence (lane d) of unlabeled OCT GVIA. The gel pattern shows that the majority of the labeled MVIIA peptide binds to the 200-210 kilodalton protein band, and that the binding is specific, as evidenced by displacement with unlabeled OCT MVIIA. (Lane b). This binding appears to be the major specific binding site of OCT GVIA, as judged by the radiolabeling patterns in lanes c and d.
本発明によれば、最も高い神経保護活性を有する化合物が、ニューロン膜上のＳＶＩＢ結合部位に関する比較的低い結合親和性を示し、他方、この部位に関する高い結合親和性は、不活性化合物で観察されることが、同様に発見された。ニューロン細胞ＳＶＩＡ結合部位に結合する化合物に関するＩＣ50およびＫi値は、上述したように、シナプトソーム調製物に結合するＯＣＴ ＳＶＩＢのＫdを決定し、次いで、試験化合物による標識化ＯＣＴ ＳＶＩＢの競合的置換を用いて試験化合物のＩＣ50およびＫi値を求めることによって計算され得る。図９は、ＳＶＩＢ結合部位への結合が試験されたいくつかのＯＣＴペプチドに関するコンピューター適合競合的結合曲線を示している。これらの曲線から、上述したように、ＩＣ50およびＫi値が決定された。 According to the present invention, the compound with the highest neuroprotective activity shows a relatively low binding affinity for the SVIB binding site on the neuronal membrane, whereas the high binding affinity for this site is observed with the inactive compounds. Was found as well. The IC 50 and K i values for compounds that bind to the neuronal cell SVIA binding site determine the K d of OCT SVIB that binds to synaptosome preparations, as described above, and then compete with labeled OCT SVIB for the test compound. It can be calculated by determining the IC 50 and K i values of the test compound using substitution. FIG. 9 shows computer-compatible competitive binding curves for several OCT peptides tested for binding to the SVIB binding site. From these curves, the IC 50 and K i values were determined as described above.
表４は、試験した化合物に関するＫi値を示している。理解されるように、最も低い親和性結合（最も高い結合定数値）が、神経保護化合物（ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡおよびＴＶＩＡ）について観察され、そして最も高い親和性が、非保護性化合物、例えば、ＳＶＩＡおよびＳＶＩＢについて観察された。神経保護活性およびＳＶＩＢ結合の間の一般的逆相関が、いくつかの変性化合物、例えば、ＭＶＩＩＡ（２０１）で観察されるが、別のもの、例えば、ＭＶＩＩＡ（１９５）では見られない。表４は同様に、表３からの、ＭＶＩＩＡ結合部位に関するＯＣＴ化合物のＫi、そして対応するＫi比すなわちＫi（ＳＶＩＢ）／Ｋi（ＭＶＩＩＡ）を列挙している。これらの比は、神経保護化合物および神経保護活性を示さないものの間の結合特性の相違を強調する。 Table 4 shows the Ki values for the compounds tested. As will be appreciated, the lowest affinity binding (highest binding constant value) is observed for neuroprotective compounds (OCT MVIIA, GVIA and TVIA), and the highest affinity is observed for non-protective compounds such as SVIA. And SVIB. A general inverse correlation between neuroprotective activity and SVIB binding is observed with some denaturing compounds, eg, MVIIA (201), but not with others, eg, MVIIA (195). Table 4 Similarly, from Table 3, lists K i of OCT compounds for MVIIA binding site, and the corresponding K i ratio or K i (SVIB) / K i The (MVIIA). These ratios highlight the differences in binding properties between neuroprotective compounds and those that do not exhibit neuroprotective activity.
前述から、本発明による神経保護化合物は、ニューロン膜上のＭＶＩＩＡ結合部位に関する高い結合親和性によって特徴づけられることが理解される。この部位に関する結合親和性は、２つの方法うちの１っによって特徴づけられ得る。第一のアプローチにおいて、ＭＶＩＩＡ部位に関する当該化合物の結合親和性は、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡのものと直接比較される。神経保護化合物は、結合親和性がＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定された結合親和性の範囲内にあるものである、すなわち、結合定数がこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最も高い結合定数より大きくない。 From the foregoing, it is understood that the neuroprotective compounds according to the invention are characterized by a high binding affinity for the MVIIA binding site on the neuronal membrane. The binding affinity for this site can be characterized by one of two methods. In a first approach, the binding affinity of the compound for the MVIIA site is compared directly with that of OCT MVIIA, GVIA, or TVIA. A neuroprotective compound is one whose binding affinity is within the range of binding affinities measured for OCT MVIIA, GVIA, and TVIA, ie, the binding constant is the highest of these three OCT peptides Not bigger.
代わりに、ＭＶＩＩＡ部位に関する結合親和性は、ちょうど今記載したように、ＭＶＩＩＡおよびＳＶＩＢ部位に関する結合定数の比によって特徴づけられ得る。ここで、神経保護化合物は、結合比が、ＯＣＴのＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡについて測定されたこのような結合比の範囲内にあるものである、すなわち、結合比はこれら３つのＯＣＴペプチドの中で最も大きい比よりも大きくない。 Alternatively, the binding affinity for the MVIIA site can be characterized by the ratio of the binding constants for the MVIIA and SVIB sites, as just described. Here, a neuroprotective compound is one whose binding ratio is within the range of such binding ratios measured for OCT MVIIA, GVIA, and TVIA, ie, the binding ratio is within these three OCT peptides. Not greater than the largest ratio.
ＩＩＩ．神経保護組成物
本発明は、ヒト患者の虚血状態に関連したニューロン損傷を減ずるのに有効な組成物を提供する。虚血状態は、例えば、心不全によって引き起こされるような、大脳循環における中断、または、脳への血液供給の全体的損失に導かれる別の状態に、あるいは血流における局部的中断による、例えば、大脳出血、あるいは局部的血栓または塞栓事象、あるいは頭部外傷により得る。
III. Neuroprotective Compositions The present invention provides compositions effective to reduce neuronal damage associated with ischemic conditions in human patients. An ischemic condition can be caused by, for example, a disruption in the cerebral circulation, such as caused by heart failure, or another condition that leads to a total loss of blood supply to the brain, or by a local disruption in blood flow, e.g., Obtained by cerebral hemorrhage, or a local thrombotic or embolic event, or head trauma.
当該組成物で処置され得る虚血状態は、一般に、脳内の血管の閉塞（ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）または破壊により引き起こされる神経学的機能の突然の減少または損失として定義されるような、発作に関連している。発作および別のタイプの大脳虚血状態において、ペプチド処置は、最初の虚血事象から生じる二次的な脳損傷を妨げるかまたは減ずることを目指している。二次的な損傷は、一般に、病巣の虚血の場合、虚血損傷を取り囲む領域中の、そして同様に、全体的虚血の場合、海馬または基底核のような、病変における選択的な傷をうけやすい領域中の、大脳細胞破壊、または、病変を包含する。二次的な損傷は、しばしば、機能性障害、例えば、短期または長期の記憶の損失により明らかにされ得る。以下に見られるように、本発明の処置方法は、虚血に関連した解剖学上のおよび機能性の二次的損傷を減ずるかまたは妨げるのに有効である。 The ischemic condition that can be treated with the composition is generally associated with a seizure, as defined as a sudden decrease or loss of neurological function caused by obstruction or destruction of blood vessels in the brain. I have. In stroke and another type of cerebral ischemic condition, peptide treatment aims to prevent or reduce secondary brain damage resulting from the initial ischemic event. Secondary injury is generally selective in the lesion surrounding the ischemic injury, in the case of focal ischemia, and also in the lesion, such as the hippocampus or basal ganglia, in the case of global ischemia. Cerebral cell destruction or lesions in vulnerable areas. Secondary damage can often be manifested by dysfunction, for example, short or long term loss of memory. As will be seen below, the treatment methods of the present invention are effective in reducing or preventing secondary anatomical and functional damage associated with ischemia.
本発明の組成物は、哺乳動物ニューロン細胞中のノルエピネフリン放出を選択的に遮断する、およびニューロン膜ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位に結合する活性−それらは、ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，またはＴＶＩＡに関するこのような活性の範囲内にある−を有しているニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を包含している。結合活性は、上記セクションＩＩに検討されているように、ニューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する結合定数として、または、ＭＶＩＩＡおよびＳＶＩＢ結合部位に関する結合定数の比として表され得る。当該化合物は、適当な薬学的キャリヤー、例えば、無菌注射溶液中に保持される。 The compositions of the present invention selectively block norepinephrine release in mammalian neuronal cells and bind to the neuronal membrane ω-conotoxin MVIIA binding site—they may be those associated with the OCT peptide MVIIA, GVIA, or TVIA. Neuronal calcium channel antagonist compounds that have a range of activity. Binding activity can be expressed as the binding constant for the MVIIA site on the neuronal membrane, or as a ratio of the binding constants for the MVIIA and SVIB binding sites, as discussed in Section II above. The compound is maintained in a suitable pharmaceutical carrier, for example, a sterile injectable solution.
ニューロン細胞カルシウムチャンネルアンタゴニストの１つの典型的な類は、必要な阻害および結合活性を有するＯＣＴペプチドである。当該ペプチドは、非経口的投与のために適当な不活性キャリヤー、例えば、無菌生理学的食塩溶液中に配合される。キャリヤー溶液中のペプチドの濃度は、一般に、約０.１〜１０ｍｇ／ｍｌの間にある。投与される用量は、投与経路によって決められるであろう。１つの適当な経路は、ペプチドの結合および阻害値により、約０.１〜５０μｇペプチド／ｋｇ体重の用量レベルで、大脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）である。当該ペプチド化合物は、以下に論証されているように、代わりに、静脈内（ＩＶ）に投与され得る。被検者をＨ１およびＨ２ヒスタミン受容体に特異的な抗ヒスタミンで前もって処置してペプチド投与後に起こり得る血圧の低下を減ずることが、ＩＶ投与に所望され得る。 One typical class of neuronal cell calcium channel antagonists are OCT peptides that have the necessary inhibitory and avidity. The peptides are formulated in an inert carrier suitable for parenteral administration, for example, in sterile saline. The concentration of the peptide in the carrier solution is generally between about 0.1 and 10 mg / ml. The dose to be administered will depend on the route of administration. One suitable route is intracerebroventricular (ICV) at dose levels of about 0.1-50 μg peptide / kg body weight, depending on the binding and inhibition values of the peptide. The peptide compound may alternatively be administered intravenously (IV), as demonstrated below. It may be desirable for IV administration to pre-treat the subject with an antihistamine specific for the H1 and H2 histamine receptors to reduce the possible drop in blood pressure following peptide administration.
以下に報告されているように、そして本発明の重要な特徴によれば、虚血事象後に十分、例えば、一時的閉塞期間に続いて１時間、投与されると、神経保護化合物の保護効果の損失はほとんどまたは全ぐないということが見出された。遅延した投与保護事象は、ペプチドが、虚血損傷から二次的な大脳損傷に導く事象を遮断するのに有効であることを示唆する、なぜならば、これらの事象は損傷後かなりの時間にわたって、または数日間にわたってすら生じ得るからである。従って、遅延した投与は、虚血の発病に続いて、数時間にわたって、または１日またはそれ以上にわたってすら、二次的な大脳損傷を減ずるのに有効であり得る。 As reported below and according to an important feature of the invention, when administered well after an ischemic event, eg, one hour following a period of temporary occlusion, the protective effect of the neuroprotective compound is reduced. It has been found that there is little or no loss. A delayed dosing protection event suggests that the peptide is effective in blocking events that lead to secondary cerebral injury from ischemic injury, since these events are likely to occur for a significant amount of time after injury. Or even over several days. Thus, delayed administration may be effective in reducing secondary cerebral damage for several hours, or even a day or more, following the onset of ischemia.
虚血損傷に関連した神経損傷を減ずる際の当該組成物の有効性は、全体的虚血および二次的発作損傷のためのモデルシステムとして広範に使用される、３種の動物系において試験された。第一の系は、首の頸動脈の一時的閉塞によって引き起こされる全体的虚血のアレチネズミの２血管閉塞モデルである。臨床的比較のために、このモデルにおいて生じる虚血は、心停止によって引き起こされる虚血に連結している、なぜならば、脳への全ての血流が、決まった期間、一般には５〜１０分間止められるからである。 The effectiveness of the composition in reducing nerve damage associated with ischemic injury has been tested in three animal systems, which are widely used as model systems for global ischemia and secondary stroke attacks. Was. The first system is a gerbil two-vessel occlusion model of global ischemia caused by temporary occlusion of the carotid artery of the neck. For clinical comparisons, the ischemia produced in this model is linked to ischemia caused by cardiac arrest, because all blood flow to the brain is for a fixed period of time, typically 5-10 minutes Because it can be stopped.
個々な後遺症におけるいくつかの相違が、種の間で認められるが、アレチネズミは、人を含む別の哺乳動物において見出されるのと同一種類の、虚血に対する選択的局部的損傷を示す。特に、海馬ＣＡ１領域において観察される特徴的な二次的損傷は、人を含む別の哺乳動物において見られるものに類似している（Ｋｉｒｉｎｏ；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）。この領域のニューロン、そして特に錐体ニューロンは、虚血損傷の４日後までの期間にわたって、遅延したニューロン死を示す。 Although some differences in individual sequelae are observed between species, gerbils show selective local damage to ischemia of the same type as found in other mammals, including humans. In particular, the characteristic secondary damage observed in the hippocampal CA1 region is similar to that seen in other mammals, including humans (Kirino; Yamaguchi). Neurons in this area, and especially pyramidal neurons, exhibit delayed neuronal death over a period of up to four days after ischemic injury.
第二のモデルは、ラットの４血管閉塞モデルである。一次的閉塞を引き起こすための実験手順は、次の類似点を含む心停止に続くヒト脳中の状態によく似た虚血を引き起こす：虚血事象は、一時的、一般に５〜３０分である；それは麻酔していない状態で生じる；たいていのラットにおいて、虚血事象は、全身性発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を伴わず、そして発作を有する動物は研究から除外され得る。さらに、当該閉塞手順は、当該動物を容易に監視し、維持しそして分析することを可能にする（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）。 The second model is a rat four vessel occlusion model. Experimental procedures to cause primary occlusion result in ischemia mimicking conditions in the human brain following cardiac arrest, including the following similarities: The ischemic event is transient, typically 5-30 minutes It occurs without anaesthesia; in most rats, the ischemic event is not accompanied by a generalized seizure, and animals with seizures can be excluded from the study. In addition, the occlusion procedure allows the animal to be easily monitored, maintained and analyzed (Pulsinelli).
第三モデルは、局部的虚血のラット大脳動脈閉塞モデルである。このモデルにおいて、左大脳動脈は、電気凝固により永久的に閉塞される。閉塞の２４時間後、当該動物を麻酔にかけ、そした、損傷領域を磁気共鳴画像によって調べる。 The third model is a rat cerebral artery occlusion model of focal ischemia. In this model, the left cerebral artery is permanently occluded by electrocoagulation. Twenty-four hours after occlusion, the animals are anesthetized and the injured area is examined by magnetic resonance imaging.
Ａ．解剖学的損傷の減少
アレチネズミモデルシステム中の虚血を、実施例７に詳述されているように、８分間、２つの頸動脈を閉塞することによって、麻酔をかけた動物中に引き起こした。ＯＣＴペプチドを閉塞期間の間、あるいは閉塞に続いて１時間ＩＣＶ投与した。閉塞およびペプチド処置の４日後、当該動物を、例７に詳述されているように、海馬ＣＡ１領域中の解剖学的損傷について組織学的に調べた。
A. Reduction of Anatomical Injury Ischemia in the gerbil model system was induced in anesthetized animals by occluding two carotid arteries for 8 minutes as detailed in Example 7. Was. The OCT peptide was administered ICV during the occlusion period or for 1 hour following occlusion. Four days after occlusion and peptide treatment, the animals were examined histologically for anatomical damage in the hippocampal CA1 area, as detailed in Example 7.
図１０Ａおよび１０Ｂは、虚血、およびＭＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）または薬物ビヒクル（１０Ｂ）の注入後の動物中のアレチネズミ海馬ＣＡ１領域の低倍率顕微鏡写真である。図中の矢印は、ＣＡ１領域のおおよその境界を示している。より高い倍率で、薬物処置した虚血動物中の細胞は正常であるように見え（図１１Ａ）、他方、損傷は、ビヒクルのみを受け取った虚血動物中で明白である。完全な薬物保護のもう１つの例は、図１１Ｃ中に見られ、そして、部分的保護の例は、図１１Ｄ中に見られ、そこには、少数の損傷細胞がある。 10A and 10B are low magnification micrographs of the gerbil hippocampus CA1 area in animals after ischemia and injection of MVIIA OCT (10A) or drug vehicle (10B). Arrows in the figure indicate approximate boundaries of the CA1 region. At higher magnification, cells in drug-treated ischemic animals appear normal (FIG. 11A), whereas damage is evident in ischemic animals receiving vehicle only. Another example of complete drug protection is seen in FIG. 11C, and an example of partial protection is seen in FIG. 11D, where there are a few damaged cells.
解剖学的切片、例えば、図１０および１１において見られるものは、実施例７に述べれている基準に従って採点された。上記採点システムを基準とした、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＯＣＴ ＧＶＩＡで処置した、あるいは、ビヒクルのみを受け取った虚血動物中の解剖学的損傷の程度を、以下の表５に示す。当該ペプチドは、以下の表中に示されてた全用量で、虚血の８分間にＩＣＶ注入によって投与された。理解されるように、より高い用量のＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置した動物中の損傷の程度は、未処理動物中のそれの２５％しかなかった。ＧＶＩＡペプチドは、損傷に関して５０％より多い減少をも引き起こしそしてより低い用量は、ほぼ最高の有効性であった。 Anatomical sections, such as those seen in FIGS. 10 and 11, were scored according to the criteria described in Example 7. The extent of anatomical damage in ischemic animals treated with OCT MVIIA or OCT GVIA, or receiving vehicle alone, relative to the scoring system described above, is shown in Table 5 below. The peptide was administered by ICV infusion during 8 minutes of ischemia at all doses indicated in the table below. As can be seen, the extent of injury in animals treated with higher doses of OCT MVIIA was only 25% of that in untreated animals. The GVIA peptide also caused more than a 50% reduction in damage and lower doses were near the highest efficacy.
同様の処置方法が、アレチネズミ全体的虚血モデルにおいて適用されたが、そこでは、神経保護剤が、虚血の１時間後に投与された。解剖学的損傷において観察された減少は、以下の表６に要約されている。表５中のデータの比較は、当該薬物が虚血事象（８分の閉塞）の１時間後に投与された時に、比較できる用量（０.１μｇ）で保護効果のほとんどの損失を示す。 A similar method of treatment was applied in a gerbil global ischemia model, where the neuroprotective agent was administered 1 hour after ischemia. The observed reductions in anatomical injuries are summarized in Table 6 below. Comparison of the data in Table 5 shows that when the drug was administered 1 hour after an ischemic event (8 minute occlusion), at a comparable dose (0.1 μg), most of the protective effect was lost.
ラットモデルシステム中の虚血は、脊椎動脈をまず外科的に遮断し、外科的回復後、１５分間頸動脈を一時的に遮断する（従って、脳への血流を完全に遮断する）ことによって引き起こされた。閉塞の間、動物に、０.３μｇＯＣＴ ＭＶＩＩＡペプチドをＩＣＶで与えた。閉塞の４日後、上述したように、当該動物を組織学的に調べて、一海馬ＣＡ１領域中の損傷の程度を求めた。平均スコアを、塩類溶液およびＭＶＩＡ ＯＣＴ処置の比較のために、表７に示す。理解されるように、処置した動物中の損傷の程度は、未処置動物のそれの約１／３に過ぎなかった。 Ischemia in the rat model system is achieved by first surgically blocking the vertebral artery and temporarily blocking the carotid artery for 15 minutes after surgical recovery (thus completely blocking blood flow to the brain). Was provoked. During occlusion, animals received 0.3 μg OCT MVIIA peptide by ICV. Four days after occlusion, the animals were examined histologically as described above to determine the extent of damage in the CA1 area of the hippocampus. Average scores are shown in Table 7 for comparison of saline and MVIA OCT treatments. As can be seen, the extent of damage in the treated animals was only about one-third that of untreated animals.
個々の研究において、一連の付加的なＯＣＴペプチドは、同一動物系において試験された。これらの研究の結果を図１２に要約する。データは、この比較のためにいくつかの実験から持ち寄った。データを、Ｚ−スコア変換して種々の平均対照（塩類溶液処置）損傷値を有する試料間の比較を促進した。この分析において、対照群の平均はゼロの値を仮定し、そして対照からの偏差を正（対照と比較して損傷の増加を示す）および負（対照と比較して損傷の減少を示す）の値として示す。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡおよびＯＣＴ ＴＶＩＡは各々、それらの負のＺ−スコアから示されるように、研究において著しい神経保護を示した。ＭＶＩＩＡ（１９５）は、対照とはあまり異ならないが、両方の用量でその負のＺ−スコアによって示されるように、試験された２つの用量で神経保護に対する傾向を示した。対照的に、ＯＣＴ ＳＶＩＢ、ＯＴＣ ＳＶＩＢ（２０２）、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（２０１）、およびＯＣＴ ＳＶＩＡは全て、それらの正のＺ−スコアによって示されるように、神経保護活性を示さなかった。 In individual studies, a series of additional OCT peptides were tested in the same animal system. The results of these studies are summarized in FIG. Data was taken from several experiments for this comparison. The data was Z-scored to facilitate comparison between samples with different mean control (saline treatment) damage values. In this analysis, the mean of the control group assumed a value of zero, and the deviation from the control was positive (indicating increased damage compared to control) and negative (indicating decreased damage compared to control). Shown as a value. OCT MVIIA and OCT TVIA each showed significant neuroprotection in the study, as indicated by their negative Z-score. MVIIA (195) did not differ significantly from the control, but showed a propensity for neuroprotection at the two doses tested, as indicated by its negative Z-score at both doses. In contrast, OCT SVIB, OTC SVIB (202), OCT MVIIA (201), and OCT SVIA all showed no neuroprotective activity, as indicated by their positive Z-score.
第二の処置方法で、ＯＣＴペプチドを、実施例８Ｂに詳述したように、静脈内投与した。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡによって引き起こされた全体的虚血における神経保護の程度が表８に示されている。表中の「ＮＳＤ」は、「統計学的に異ならない」ことを示している。 In a second method of treatment, the OCT peptide was administered intravenously as detailed in Example 8B. The degree of neuroprotection in global ischemia caused by OCT MVIIA is shown in Table 8. “NSD” in the table indicates “not statistically different”.
第三の虚血モデルシステムにおいて、実施例９に詳述されているように、ＯＣＴペプチドが、左中央の大脳動脈の閉塞の１０分前にＩＣＶ注入により投与された。２４時間後、対照および処置動物中の解剖学的損傷の程度を、磁気共鳴画像によって調べた。８つの対照画像を記録し、そして、各画像中の梗塞領域が、絵素を数えることによって決定された。表９中に示されているのが、ラットごとの８つの冠状切片からの絵素の平均総数である。１.７μｇのＯＣＴ ＭＶＩＩＡ（ＩＣＶ）を用いた処置により、中央大脳動脈閉塞によって引き起こされた平均梗塞サイズの面積が２４％減少した。この減少は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験により評価されるように、統計学的に重要であった。
In a third ischemia model system, the OCT peptide was administered by
Ｂ．機能的活性保護：機能冗進
動物中の大脳虚血の１つの共通する結果は、機能亢進であり、それは、数時間の閉塞の間の歩く（探索）行動として見られ得、そして、数日後まで観察され得る。虚血アレチネズミにおける機能亢進は、例１０に記載されたように監視された。手短に言えば、アレチネズミを、個々に、６０分間、統計学的分析のために１５分ごとに記録した累積活性カウントを用いて試験した。ベースライン活性は、この測定に関する種々の処置群の比較可能性を確実にするために、外科的処置の前に測定し、そして活性測定は、閉塞の１日および３日後になされた。
B. Functional Activity Protection: Functional Redundancy One common consequence of cerebral ischemia in animals is hyperactivity, which can be seen as walking (exploring) behavior during several hours of occlusion, and a few days later To be observed. Hyperactivity in ischemic gerbils was monitored as described in Example 10. Briefly, gerbils were individually tested using cumulative activity counts recorded every 15 minutes for statistical analysis for 60 minutes. Baseline activity was measured prior to surgical treatment to ensure comparability of the various treatment groups for this measurement, and activity measurements were taken 1 and 3 days after occlusion.
試験の結果を図１３にプロットする。各試験曲線中の下向きの傾斜は、当該動物が試験環境に、より馴れるにつれて、試験の、４回の１５分間隔（１〜４はベースラインについて、５〜８は１日目について、そして９〜１２は３日目について）にわたり活動が減少するためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日後、ベースラインレベルを越えて活性レベルに著しい上昇を生じ、そして、高められた活性レベルが、３日間にわたって観察され、永久的な行動損傷を示す。ビヒクルのＩＣＴ投与を受け取った非閉塞対照動物（白丸）は、試験期間を通じてベースライン活性レベルを維持した。虚血不存在下のＯＣＴペプチド自体（黒三角）は活動を減じた、そして、この効果は３日目ですらわずかに持続する。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置した閉塞動物（黒三角）は、１日目でベースラインより低い値を示し、明らかに、ペプチドだけにより生ずる減ぜられた活性を反映している。３日目で、処置動物は、活性のほぼ正常なレベルを示し、ＯＣＴペプチド処置が虚血誘発機能亢進に対して保護を与えることを示している。
The results of the test are plotted in FIG. The downward slope in each test curve indicates that the animals became more familiar with the test environment and that the test was performed at four 15-minute intervals (1-4 for baseline, 5-8 for
Ｂ．機能活性保護：自発的交互（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）
脳の海馬領域に対する損傷は、場所的学習および記憶における欠損を生ずることが知られており、それ故、海馬細胞に対する虚血損傷は、上に文献で証明されているように、短期記憶に関連する機能活性の損失をも伴い得ることが予期され得る。
B. Functional activity protection: Spontaneous Alternation
Damage to the hippocampal region of the brain is known to result in deficits in spatial learning and memory; therefore, ischemic damage to hippocampal cells is associated with short-term memory, as demonstrated in the literature above. It can be expected that this may also be accompanied by a loss of functional activity.
実験動物中の短期記憶の測定として広く適用されている１つの試験は、Ｙ迷路であり、そこでは、動物は、Ｙ「迷路」のステムの出発点に置かれそして２つのＹアームのいずれかに入るのを許される。当該動物が１つのアームに入ると、ドアはその背後で閉じられる。５秒後、当該動物を２〜１２分の試験間間隔（ｉｎｔｅｒｔｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＩＴＩ）でそのホームケージに戻す。その間隔の終わりに、当該動物を同一方法で再度迷路中で走らせる。たいていの正常な動物は交互になるであろう、すなわち、最初の試験で入らなかったアームに入るであろう。試験は、交互について「Ｙ」および同一Ｙアームの反復選択について「Ｎ」により採点される。 One test that has been widely applied as a measure of short-term memory in experimental animals is the Y-maze, where the animal is placed at the starting point of the stem of the Y "maze" and either of the two Y-arms Allowed to enter. When the animal enters one arm, the door is closed behind it. After 5 seconds, the animals are returned to their home cages at an inter-interval interval (ITI) of 2-12 minutes. At the end of the interval, the animal is run again in the maze in the same manner. Most normal animals will alternate, ie, will enter the arm that did not enter in the first test. The test is scored by "Y" for alternating and "N" for repeated selection of the same Y arm.
試験手順において、アナネズミ中の虚血は、ビヒクル（対照）あるいは、０.１または０.３μｇのＯＣＴ ＭＶＩＩＡまたはＧＶＩＡペプチド（全ての薬物処置からの結果は、実施例１０に記載されたように合わされた）の同時のＩＣＴ投与と共に、上述したように誘発された。閉塞の３日後、当該動物をＹ迷路中で試験した。自発的な交互試験の結果は、少なくとも０.１μｇのいずれか一方の化合物の用量からの解剖学的保護が存在する動物について表１０に要約されている。 In the test procedure, ischemia in gerbils was determined by vehicle (control) or 0.1 or 0.3 μg of OCT MVIIA or GVIA peptide (results from all drug treatments were combined as described in Example 10). ) Was induced as described above with concurrent ICT administration. Three days after occlusion, the animals were tested in the Y maze. The results of the spontaneous alternation test are summarized in Table 10 for animals that have anatomical protection from a dose of at least 0.1 μg of either compound.
表中のデータから理解されるように、対照動物（閉塞なし、ビヒクルのＩＣＶ投与）に関する正常なＹ／Ｎ比は約２：１であった。虚血損傷は、この比を、Ｙ試験において実質的にランダム行動を示す、１未満までの低下を引き起こした。虚血動物において見られる短期記憶の損失は、ペプチド処置により完全に妨げられ、約２：１のＹ／Ｎ比が得られた、虚血損傷の不存在下でのペプチドのみは、Ｙ／Ｎ比を高めるように見えた、そしてこの増強は処置された、虚血動物の改善された行動に寄与し得る。 As can be seen from the data in the table, the normal Y / N ratio for the control animals (no occlusion, ICV administration of vehicle) was about 2: 1. Ischemic injury caused this ratio to drop below 1 indicating substantially random behavior in the Y test. The loss of short-term memory seen in ischemic animals was completely prevented by peptide treatment, yielding a Y / N ratio of about 2: 1. Only the peptide in the absence of ischemic injury had a Y / N The ratio appeared to increase, and this enhancement could contribute to the improved behavior of the treated, ischemic animal.
要約すると、ＯＣＴペプチド処置が解剖学的損傷を著しく減ずることを示した虚血動物は、虚血誘発機能亢進および短期記憶の損失に対するペプチド保護によって立証されるように、統計学的に改善された機能活性をも示した。 In summary, ischemic animals that showed that OCT peptide treatment significantly reduced anatomical damage were statistically improved, as evidenced by peptide protection against ischemia-induced hyperactivity and loss of short-term memory It also showed functional activity.
ＩＶ．神経保護ＯＣＴペプチド化合物
Ａ．ＯＣＴペプチドの選択
完全な配列が知られているペプチド（図１）の配列相同性分析に基づいて、天然に生じる神経保護ＯＣＴペプチドを、図１４から認識され得るように、別個のグループＩおよびＩＩに、それぞれ、そのグループに対する異なる内部相同性を用いて、分類された。グループＩは、神経保護活性を有する化合物の範囲内のＭＶＩＩＡ部位に対する結合定数を有する活性ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡおよびＭＶＩＩＢを含んでいる。グループＩＩは、神経保護ペプチドＧＶＩＡおよびＴＶＩＡを含んでいる。第三のグループは、不活性ペプチドＳＶＩＡおよびＳＶＩＢならびに、ニューロン膜上のＭＶＩＩＡ部位に関する結合活性および／またはノルエピネフリン阻害における活性が活性化合物の範囲外にあるＯＣＴペプチドを含んでいる。
IV. Neuroprotective OCT Peptide Compounds A. Selection of OCT Peptides Based on sequence homology analysis of peptides with known complete sequences (FIG. 1), naturally occurring neuroprotective OCT peptides were identified as distinct groups I and II, as can be seen from FIG. Each was classified using a different internal homology to that group. Group I includes the active OCT peptides MVIIA and MVIIB with binding constants for MVIIA sites within compounds having neuroprotective activity. Group II contains the neuroprotective peptides GVIA and TVIA. The third group includes the inactive peptides SVIA and SVIB and OCT peptides whose binding activity for MVIIA sites on neuronal membranes and / or activity in norepinephrine inhibition is outside the range of active compounds.
ＯＣＴペプチドの３つのグループは、一直線にされたそれらの６つのＣｙｓ残基と共に、図１４中に配列され、それは、位置１，８，１５，１６，２０および２８にこれらの残基を置いている。この直線を作るために、ギャップが、３つのグループの中に示された位置に導入された。以下の分析において、これらのギャップは、たとえ、それらが、活性ＯＣＴペプチドのそれぞれのグループ中のアミノ酸の欠落を表していても、図１４中に示された割り当てられた数を保持する。
Three groups of OCT peptides are arranged in FIG. 14, with their six Cys residues aligned, which places these residues at
ペプチド中の配列変化は、一次構造のみに基づいて、次の制約を採用することによって分析された：
１．両方のグループ中のペプチドは、位置１，８，１５，１６，２０，および２８にＣｙｓ残基を含んでいる。他のＣｙｓ残基は、それらがペプチドの酸化の際に選択的に保護されて３つのジスルフィド結合を形成する場合にのみ、以下に示す位置で置換され得た。
Sequence changes in the peptides were analyzed based on primary structure only and by employing the following constraints:
1. Peptides in both groups contain Cys residues at
２．両方のグループ中のペプチドは、位置１および１６、８および２０、そして１５および３０でＣｙｓ残基に連結している３つのジスルフィド結合を含んでいる。上述したように、ジスルフィドブリッヂは、ＤＴＴの存在下に完全配列ペプチドの空気酸化により形成される。ペプチドが３つの所望のジスルフィド結合を形成できることは、それ故、ペプチドが、ジスルフィド架橋の前に、３つの選択された結合を許す構造を、上で検討されたＣｙｓ保護基方法を用いてまたは用いずに、取り入れることができることを必要とするであろう。この制約は、従って、３つの選択したブリッジの形成を妨げるかまたは別の方法でじゃまするアミノ酸変化を除外するであろう。
2. The peptides in both groups contain three disulfide bonds connecting Cys residues at
制約１および２は、３つのジスルフィドブリッジにより課されたＯＣＴペプチドの基本的構造を保つ。
３．第一グループ内で、６つの非保存残基で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含む。すなわち、第一グループの化合物は、形：
ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ
〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落；そしてｔはカルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基である。〕
を有するペプチド構造を含んでいる。
3. Within the first group, amino acid changes that occur at the six non-conserved residues are allowed, and include peptides that are amidated at the carboxy terminus or have the free acid form. That is, the first group of compounds has the form:
CKGKGAX 1 CX 2 RX 3 X 4 YDCCTGSCX 5 RX 6 GKC-t
[Where X 1 = K or S; X 2 = S or H; X 3 = L or T; X 4 = M or S; X 5 = N or missing; X 6 = S or missing; and t is carboxy or It is an amidated carboxy terminal group. ]
And a peptide structure having
４．第二グループ内で、５つの非保存残基で生じるアミノ酸変化が許され、カルボキシ末端がアミド化されるかまたは遊離酸の形を有するペプチドを含む。従って、第二グループの化合物は、形：
ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ
〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；Ｘ5＝ＹまたはＲ；そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕
を有するペプチド構造を含んでいる。
4. Within the second group, amino acid changes that occur at five non-conserved residues are allowed, and include peptides that are amidated at the carboxy terminus or have the free acid form. Thus, a second group of compounds has the form:
CX 1 SXGSCSSXTSYNCCRSCNXYX 2 X 3 X 4 CX 5 -t
[Where X 1 = K or L; X 2 = T or S; X 3 = K or R; X 4 = R or K; X 5 = Y or R; and t = carboxy or amidated carboxy terminal group]
And a peptide structure having
５．両方の活性グループを共に考慮すると、全ての活性種中で保存されているアミノ酸位置が維持される。従って、例えば、Ｃｙｓ残基、５位グリシン、１３位チロシン、１９位セリン、そして２６位リシンは全て維持される。
5. When both active groups are considered together, conserved amino acid positions in all active species are maintained. Thus, for example, the Cys residue, glycine at
６．両方の活性グループを共に考慮すると、活性種の範囲内で変わりそうなアミノ酸位置がある。例えば、位置２のアミノ酸は、リシンまたはロイシンであり得、そして位置３のアミノ酸はグリシンまたはセリンであり得る。さらに、もし異なる位置の２つまたはそれ以上のアミノ酸が共通の置換クラス中にあるならば、そのクラス中の置換が好都合であり得る。標準的置換クラスは、例えば、標準Ｄａｙｈｏｆｆ頻度交換マトリックス（Ｄａｙｈｏｆｆ）により決定されるように、実際に、相同タンパク質中の共通の側鎖特性および最も高い置換頻度に基づいて６つのクラスがある。これらのクラスは、クラスＩ：Ｃｙｓ；クラスＩＩ：Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，４Ｈｙｐ，Ａｌａ，およびＧｌｙ，小さい脂肪族側鎖およびＯＨ基側鎖を表している；クラスＩＩＩ：Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，およびＧｌｎ，水素結合を形成できる、中性および負電荷側鎖を表している；クラスＩＶ：Ｈｉｓ，Ａｒｇ，およびＬｙｓ，塩基性極性側鎖を表している；クラスＶ：Ｉｌｅ，Ｖａｌ，およびＬｅｕ，分枝脂肪族側鎖を表している、ならびにＭｅｔ；ならびにクラスＶＩ：Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，およびＴｒｐ，芳香族側鎖を表している、である。さらに、各グループは、関連したアミノ酸類似体、例えば、クラスＩＶ中に、オルニチン、ホモアルギニン、Ｎ‐メチルリシン、ジメチルリシン、またはトリメチルリシン、および、クラスＶＩ中にシクロヘキシルアラニンまたはハロゲン化チロシンを含み得る。さらに、当該クラスは、Ｌ‐アミノ酸が置換に好ましいにもかかわらず、ＬおよびＤ立体異性体を含み得る。
6. When both active groups are considered together, there are amino acid positions that are likely to vary within the active species. For example, the amino acid at
７．既知の不活性種を考慮すると、不活性種中に存在するが活性種に存在しないアミノ酸に、任意の選択された残基位置で置換することは、活性化合物中の活性を維持するのに好ましくない。従って、例えば、３位のセリンは、活性および不活性化合物の両方の中に存在するが、４位のセリンは不活性種のみの中に存在し、従って好ましくない。
7. In view of known inert species, substitution at any selected residue position for an amino acid present in the inert species but not present in the active species is preferred to maintain activity in the active compound. Absent. Thus, for example, serine at
上記アミノ酸選択ルール６〜７は、神経保護ＯＣＴペプチド中の許されたアミノ酸置換のための基準として意図される。いったんアミノ酸置換または変性がなされると、上述したように、ペプチドはさらに必要なカルシウムチャンネルアンタゴニスト活性、および、ノルエピネフリン放出の阻害およびニューロン膜のＭＶＩＩＡ結合部位への結合に関する、必要な活性についてスクリーニングされる。 The above amino acid selection rules 6-7 are intended as criteria for allowed amino acid substitutions in the neuroprotective OCT peptide. Once the amino acid substitutions or modifications have been made, the peptides are screened for further required calcium channel antagonist activity and, as described above, for the inhibition of norepinephrine release and binding to the MVIIA binding site of the neuronal membrane. .
ＯＣＴペプチドヘのアミノ酸置換または変性のいくつかは、上で概説された原理を説明している。例えば、図２と関連して、ＭＶＩＩＡ（１９５）化合物は、図１４中に示されたＭＶＩＩＡ構造中の位置２６に対応する位置にＬｙｓ〜Ａｌａ置換を含む。この置換は、保存した配列位置にあるので、神経保護活性が失われるか減ぜられるであろうことが予測される。上に見られるように（図１２）、ＭＶＩＩＡ（１９５）ペプチドは、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示すが、置換されていないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比べて、減ぜられたノルエピネフリン活性、および、弱い神経保護活性を示す。 Some of the amino acid substitutions or modifications to the OCT peptide illustrate the principles outlined above. For example, in connection with FIG. 2, the MVIIA (195) compound contains a Lys to Ala substitution at a position corresponding to position 26 in the MVIIA structure shown in FIG. Since this substitution is at a conserved sequence position, it is expected that neuroprotective activity will be lost or diminished. As seen above (FIG. 12), the MVIIA (195) peptide shows retention of MVIIA binding activity but reduced norepinephrine activity and weak neuroprotective activity compared to unsubstituted MVIIA OCT. Is shown.
別の例として、ＭＶＩＩＡ（２０１）化合物は、位置９〜１２に、Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＭｅｔからＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，不活性ＳＶＩＢ ＯＣＴペプチド中の位置９〜１２の配列への置換を含む。位置９の置換は、Ａｒｇが、非神経保護化合物中のこの位置に存在しているが、神経保護ＯＣＴペプチドの１つの中に存在していないので、好ましくない。位置１０の置換は、同じ理由で好ましくない。しかしながら、ＬｅｕからＴｈｒへの置換は神経保護ペプチド内で起こるので、位置１１の置換は好ましい。位置１２でのＭｅｔからＳｅｒへの置換は同一の理由で好ましい。ペプチド変性は２つの好ましくない置換を含むので、神経保護活性が失われるか減ぜられるであろうことが予期される。上に見られるように、ＭＶＩＩＡ（２０１）ペプチドは、ＭＶＩＩＡ結合活性の保持を示す（表３）が、置換されていないＭＶＩＩＡ ＯＣＴと比較して、減ぜられたノルエピネフリン阻害活性（表２）および弱い神経保護活性を示す（図１２）。
As another example, the MVIIA (201) compound is a substitution of Ser-Arg-Leu-Met at positions 9-12 with a sequence at positions 9-12 in an Arg-Lys-Thr-Ser, inactive SVIB OCT peptide. including. Substitution at
Ｂ．ＣＯＴペプチド
本発明はさらに、天然のＣ末端アミド化ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＭＶＩＩＢ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡを除いて、上記アミノ酸選択規則３および４に従って形成された活性ＯＣＴペプチドを含む。
B. COT Peptide The invention further includes an active OCT peptide formed according to amino
さらに特に、本発明のペプチド化合物は、
Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｓ、Ｘ3＝Ｌ、Ｘ4＝Ｍ、Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝ＳおよびＸ1＝Ｓ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｓ、Ｘ5＝欠落、そしてＸ6＝欠落のペプチドを除く、形：
ＣＫＧＫＧＡＸ1ＣＸ2ＲＸ3Ｘ4ＹＤＣＣＴＧＳＣＸ5ＲＸ6ＧＫＣ−ｔ（グループ１）
〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＳ；Ｘ2＝ＳまたはＨ；Ｘ3＝ＬまたはＴ；Ｘ4＝ＭまたはＳ；Ｘ5＝Ｎまたは欠落；Ｘ6＝Ｓまたは欠落、そしてｔ＝カルボキシまたはアミド化カルボキシ末端基〕；および、
Ｘ1＝Ｋ、Ｘ2＝Ｔ、Ｘ3＝Ｋ、Ｘ4＝Ｒ、そしてＸ5＝Ｙ；およびＸ1＝Ｌ、Ｘ2＝Ｓ、Ｘ3＝Ｒ、Ｘ4＝Ｋ、そしてＸ5＝Ｒのペプチドを除く：
ＣＸ1ＳＸＧＳＳＣＳＸＴＳＹＮＣＣＲＳＣＮＸＹＸ2Ｘ3Ｘ4ＣＸ5−ｔ（グループ２）
〔但し、Ｘ1＝ＫまたはＬ；Ｘ2＝ＴまたはＳ；Ｘ3＝ＫまたはＲ；Ｘ4＝ＲまたはＫ；そしてＸ5＝ＹまたはＲ〕
を有する。
More particularly, the peptide compounds of the present invention
X 1 = K, X 2 = S, X 3 = L, X 4 = M, X 5 = missing, and X 6 = S and X 1 = S, X 2 = H, X 3 = T, X 4 = S , X 5 = missing, and X 6 = exclude missing peptides, form:
CKGKGAX 1 CX 2 RX 3 X 4 YDCCTGSCX 5 RX 6 GKC-t (Group 1)
[Provided that X 1 = K or S; X 2 = S or H; X 3 = L or T; X 4 = M or S; X 5 = N or missing; X 6 = S or missing, and t = carboxy or Amidated carboxy terminal group]; and
X 1 = K, X 2 = T, X 3 = K, X 4 = R, and X 5 = Y; and X 1 = L, X 2 = S, X 3 = R, X 4 = K, and X 5 Excluding the peptide of = R:
CX 1 SXGSSCSXTSSYNCRCSCNXYX 2 X 3 X 4 CX 5 -t (Group 2)
[However, X 1 = K or L; X 2 = T or S; X 3 = K or R; X 4 = R or K; and X 5 = Y or R]
Having.
これらのペプチドは、本発明の組成物中に、適当な薬学的キャリヤーと共に配合のために意図される。 These peptides are intended for formulation in a composition of the invention with a suitable pharmaceutical carrier.
Ｖ．神経保護化合物を選択する
セクションＩＩ中で検討された化合物試験方法が、本発明に従って同様に使用されて、神経保護活性を有するカルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物を同定することができる。スクリーニング方法において、カルシウムチャンネルアンタゴニスト化合物が、哺乳動物ＣＮＳニューロン細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するその能力について、および、神経細胞ω−コノトキシンＭＶＩＩＡ結合部位へのその親和性について、スクリーニングされる。試験化合物のカルシウムチャンネルアンタゴニスト活性は既知であり得、または、実施例１に記載されているように、ニューロン細胞中の脱分極誘発カルシウムチャンネル電流を阻害するその能力により、示され得る。
V. Selecting Neuroprotective Compounds The compound testing methods discussed in Section II can also be used in accordance with the present invention to identify calcium channel antagonist compounds having neuroprotective activity. In a screening method, a calcium channel antagonist compound is screened for its ability to inhibit norepinephrine release in mammalian CNS neuronal cells and for its affinity for the neural cell ω-conotoxin MVIIA binding site. The calcium channel antagonist activity of the test compound may be known, or may be indicated by its ability to inhibit depolarization-induced calcium channel currents in neuronal cells, as described in Example 1.
試験化合物は、当該化合物が：
（ｉ）ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡがこのようなノルエピネフリン放出を有効に阻害する、濃度範囲中で、哺乳動物ＣＮＳ神経細胞中のノルエピネフリン放出を阻害するのに有効であり、そして
（ｉｉ）ＯＣＴペプチドＭＶＩＩＡ，ＧＶＩＡ，およびＴＶＩＡの結合部位に関する結合親和性の範囲内にあるＯＣＴ ＭＶＩＩＡ結合部位に関する結合親和性を有する
ならばこのような神経損傷を処置する際に使用するために選択される。
The test compound is:
(I) effective in inhibiting norepinephrine release in mammalian CNS neurons in a concentration range in which the OCT peptides MVIIA, GVIA, and TVIA effectively inhibit such norepinephrine release; and (ii) The OCT peptides MVIIA, GVIA, and TVIA are selected for use in treating such nerve damage if they have a binding affinity for the OCT MVIIA binding site that is within the binding affinity for the binding site.
スクリーニングされ得る化合物は、ＯＣＴペプチド、ならびにその類似体およびフラグメントに加えて、別のペプチドおよびペプチドフラグメントならびに有機分子を含む。好ましいスクリーニング方法は上に記載され、そして実施例２、４、および５に詳述されている。 Compounds that can be screened include OCT peptides, and analogs and fragments thereof, as well as other peptides and peptide fragments and organic molecules. Preferred screening methods are described above and are detailed in Examples 2, 4, and 5.
次の実施例で、本発明の組成物の種々の特徴、および虚血関連損傷（ｉｎｊｕｒｙ）中のニューロン損傷（ｄａｍａｇｅ）を減ずる際のそれらの使用を説明するつもりであるが、本発明の範囲を限定することは決して意図されていない。 The following examples are intended to illustrate various features of the compositions of the present invention and their use in reducing neuronal damage during ischemia-related injury. Is by no means intended to be limited.
（実施例１）
カルシウム−チャンネルアンタゴニスト活性：イオン電流の阻害
カルシウムチャンネルを通るイオン電流を、単一のパッチ−クランプ電極により電圧固定された細胞中で調べた。これらの完全な細胞のパッチ−クランプ研究は、種々の細胞型が調べられているが、主としてＮ１Ｅ１１５マウス神経芽細胞腫細胞に関してなされた。
(Example 1)
Calcium-Channel Antagonist Activity: Inhibition of Ion Current Ionic current through calcium channels was examined in cells voltage clamped by a single patch-clamp electrode. Patch-clamp studies of these whole cells have been performed primarily on N1E115 mouse neuroblastoma cells, although various cell types have been examined.
Ａ．電流測定方法
たいていの測定値は、カルシウム電流の調査を他のイオン電流の不存在下に可能にする浴塩類溶液を用いて得られた。これらの溶液は、８０ｍＭ ＮＭＤＧ（ナトリウム置換として）、３０ｍＭ ＴＥＡＣｌ（カリウム電流を遮断する）、１０ｍＭ ＢａＣｌ2（カルシウムチャンネルを通る電荷キャリヤーとして）、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを、ｐＨ７.３で含んでいた。いくつかの溶液は、２ｍＭキニジン（カリウム電流を遮断する）および３μＭテトロドトキシン（ナトリウム電流を遮断する）をも含む。通常の浴塩類溶液は（ｍＭ）：１４０ ＮａＣｌ、１０ ブドウ糖、３ ＫＣｌ、２ ＣａＣｌ2、１ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７.３であった。細胞間溶液は、１５０ｍＭ ＣｓＣｌ、０.５ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ Ｋ2ＡＴＰをｐＨ７.３〜７.４で含んでいた。浴塩類溶液および全ての内部溶液は、使用する前に濾過された。
A. Current Measurement Methods Most measurements were obtained using a bath salt solution that allowed the investigation of calcium currents in the absence of other ionic currents. These solutions contained 80 mM NMDG (as sodium replacement), 30 mM TEACl (block potassium current), 10 mM BaCl 2 (as charge carrier through calcium channel), and 10 mM HEPES at pH 7.3. Some solutions also contain 2 mM quinidine (blocks potassium current) and 3 μM tetrodotoxin (blocks sodium current). Normal bath saline solution (mM): 140 NaCl, 10 glucose, was 3 KCl, 2 CaCl 2, 1
ピペットは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ７０５２ガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，カリフォルニア州 ９１７１１）から作られ、Ｓｙｌｇａｒｄ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ミシガン州
４８６４０）で被覆されそして使用前に火仕上げされた。泡数は、ピペット抵抗一般に２〜５ＭＯｈｍで、一般に５〜６であった。Ｃｏｒｎｉｎｇ ８１６１、Ｋｉｍｂｌｅ、および別のガラスも、観察されたカルシウム電流に関する顕著な影響なしに使用された。
Pipettes were made from Corning 7052 glass (Garner Glass Company, Claremont, 91711, CA), coated with Sylgard (Dow Corning, Midland, MI, 48640) and fire finished prior to use. The foam number was typically 2-5 MOhm of pipette resistance and generally 5-6. Corning 8161, Kimble, and another glass were also used without significant effect on the observed calcium current.
記録は、室温で、Ａｘｏｐａｔｃｈ １−Ｃ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州 ９４４０４）を用いて行われそして、ｐＣＬＡＭＰソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて分析された。データは、１ｋＨｚの典型的なサンプリング率として１０００Ｈｚでフィルターにかけた；全ての場合において、データは、ほとんどサンプリング率の１／５の振動数でフィルターにかけた。データは、当該ソフトウェアによりオンラインで集められた。分析は、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ ＬａｓｅｒＪｅｔ Ｐｒｉｎｔｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，カリフォルニア州 ９４３０６）を介してプリントアウトしてスクリーン上で行われた。 Recordings were performed at room temperature using an Axopatch 1-C amplifier (Axon Instruments, Foster City, CA 94404) and analyzed using pCLAMP software (Axon Instruments). The data was filtered at 1000 Hz as a typical sampling rate of 1 kHz; in all cases, the data was filtered at a frequency of almost 1/5 of the sampling rate. Data was collected online by the software. The analysis was performed on screen by printing out via a Hewlett-Packard LaserJet Printer (Hewlett-Packard, Palo Alto, 94306, CA).
典型的な実験は次のようにして行われた：シール形成に続いて直列抵抗補正および容量性一時的相殺の後、１０ｍＶずつの増加で、細胞電位を、保持電位（一般に−１００ｍＶ）から、−６０ｍＶから＋２０ｍＶに変動する試験電位まで上げる電圧クランププロトコールを行った。細胞を、パルスの間５秒間保持電位で保持した。別の保持電位から出発するプロトコールは通常、試験電位の同一範囲をカバーした。 A typical experiment was performed as follows: after seal formation, series resistance correction and capacitive temporary cancellation, the cell potential was increased from the holding potential (typically -100 mV) in 10 mV increments. A voltage clamp protocol was performed to raise the test potential from -60 mV to +20 mV. Cells were held at the holding potential for 5 seconds between pulses. Protocols starting from different holding potentials typically covered the same range of test potentials.
Ｂ．電流阻害測定
図３は、Ｎ１Ｅ−１１５マウス神経芽細胞腫細胞からのカルシウム電流トレースを示す。この図は、時間に関して、左から右へ読み、トレースの下向きの振れば、細胞中への正の電流を示している。電流は、１００ｍＶから−１０ｍＶへの電圧段階によって引き出された。細胞は、ナトリウムをＮＭＤＧによって置き換えそして２ｍＭ Ｃａの代わりに１０ｍＭ Ｂａを含む塩類溶液中に浸した。カリウム電流は、浴中のＴＥＡおよびピペット溶液中のＣｓによって遮断された。
B. Current Inhibition Measurement FIG. 3 shows a calcium current trace from N1E-115 mouse neuroblastoma cells. This figure shows a positive current into the cell when read from left to right with respect to time and the trace is swung down. The current was drawn by a voltage step from 100 mV to -10 mV. The cells were immersed in a saline solution containing 10 mM Ba instead of 2 mM Ca replacing sodium with NMDG. The potassium current was blocked by TEA in the bath and Cs in the pipette solution.
図３中，Ｂ〜Ｄを付けた３つのトレースは、１０ｎＭ（３Ｂ），５０ｎＭ（３Ｃ）、そして２００ｎＭ（３Ｄ）の増加するＭＶＩＩＡ ＯＣＴペプチド濃度で、減少するカルシウム電流を示している。 In FIG. 3, the three traces labeled BD show decreasing calcium currents at increasing MVIIA OCT peptide concentrations of 10 nM (3B), 50 nM (3C), and 200 nM (3D).
電圧ゲートカルシウム電流の、ＯＣＴｓ ＭＶＩＩＡおよびＧＶＩＡの増加する用量に対する応答が図４中に示されている。計算したＩＣ50は、ＧＶＩＡについて１２ｎＭそしてＭＶＩＩＡについて１１６ｎＭである。これらの値は、それらの作用部位に関する当該ペプチドの極めて高い特異性を示している。 The response of voltage-gated calcium current to increasing doses of OCTs MVIIA and GVIA is shown in FIG. The calculated IC 50 is 12 nM for GVIA and 116 nM for MVIIA. These values indicate the very high specificity of the peptides for their site of action.
表１は、ＧＶＩＡ，ＭＶＩＩＡ，ＳＶＩＢおよびＳＶＩＡ ＯＣＴに関するＩＣ50値を比較している。ＯＣＴ ＧＶＩＡおよびＯＣＴ ＭＶＩＩＡはナノモル濃度範囲で、測定されたカルシウム電流の５０％阻害を示すのに、ＯＣＴ ＳＶＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩＡに関するＩＣ50値は、試験した濃度範囲内で測定できなかった、それ故、示されたマイクロモル濃度より上のＩＣ50値を有するように列挙されている。ＯＣＴ ＳＶＩＢおよびＯＣＴ ＳＶＩＡは、このアッセイ中で不活性であると考察される。 Table 1 compares GVIA, MVIIA, IC 50 values relating SVIB and SVIA OCT. Whereas OCT GVIA and OCT MVIIA show a 50% inhibition of the measured calcium current in the nanomolar range, the IC 50 values for OCT SVIB and OCT SVIA could not be measured within the concentration range tested, therefore It is listed to have an IC 50 value above the indicated micromolar. OCT SVIB and OCT SVIA are considered inactive in this assay.
（実施例２）
神経伝達物質放出の阻害
Ａ．ラット海馬スライスからの［3Ｈ］ノルエピネフリン放出
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、エーテルで軽く麻酔をかけ、首を切り、そして脳を取り除いた。次いで海馬を解剖して大脳皮質を取り除きそして室温の酸素化した捕集緩衝液（０.１％子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２３、ＫＣｌ，４.８；ＣａＣｌ2，１.２；ＭｇＳＯ4，１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＣＯ3，２５）ですすいだ。スライス（厚さ２００または４００μＭ）を、ＴｃＩｌｗａｉｎＴｉｓｓｕｅ Ｃｈｏｐｐｅｒを用いて作りそして直ちに室温の捕集緩衝液に移した。次いで、スライスを、ウエルごとに、０.１ｍｌ捕集緩衝液を含む９６−ウエルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のそれぞれのウエルに分配した。次いで、１ｍＭアスコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）および試験化合物を含む捕集緩衝液中に稀釈された［3Ｈ］ノルエピネフリン（３μＣｉ／ｍｌ）を各ウエルに添加した。インキュベーションは３７度で３０分間、加湿した、５％ＣＯ2インキュベーター中であった。次いで、浸している緩衝液を取り除きそしてスライスを２回それぞれ１１分間、適当な試験化合物を含む基本緩衝液（基本緩衝液：０.１％ＢＳＡおよびｍＭにおいて：ＮａＣｌ，１２３、ＫＣｌ，５.０；ＣａＣｌ2，０.４；ＭｇＳＯ4，１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１；ＮａＨＯ3，２５）で洗浄した。次いで各スライスを１５分間基本緩衝液０.１ｍｌ中でインキュベーションした。次いでこの緩衝液を測定のために取り除きそして１５分間０.１ｍｌ興奮緩衝液（０.１％ＢＳＡ ｍＭにおいて：ＮａＣｌ，９７、ＫＣｌ，３０；ＣａＣｌ2，０.４；ＭｇＳＯ4，１.２；ＫＨ2ＰＯ4，１.２；ブドウ糖，１１、ＮａＨＣＯ3，２５）によって置き換えた。次いで、興奮緩衝液を、放射能測定のために取り除いた。各スライス中に残っている放射能を測定した。データを、スライスごとの放射能の総ｃｐｍに正規化した：総放射能＝Ｓ＋Ｂ＋スライス〔但し、Ｓは興奮緩衝液中に存在する放射能の量であり、そしてＢは、基本緩衝液中に存在する放射能の量である。〕。総放射能の割合としての興奮された放出＝１００（Ｓ／（Ｓ＋Ｂ＋スライス））、および総放射能の割合としての基本放出＝１００（Ｂ／（Ｓ＋Ｂ＋スライス））。濃度効果グラフは、図５中のようにプロットされた。コンピューターを用いた曲線適合を用いて、このようなデータからＩＣ50値を決定した。これらの値を図２に示す。
(Example 2)
Inhibition of neurotransmitter release A. [ 3 H] Norepinephrine release from rat hippocampal slices Male Sprague-Dawley rats were lightly anesthetized with ether, decapitated, and the brain was removed. Then dissected hippocampi removed cerebral cortex and collecting buffer was oxygenated at room temperature (0.1% calf serum albumin (BSA) and in mM: NaCl, 123, KCl, 4.8;
（実施例３）
シナプトソーム膜調製物
Ａ．哺乳動物−脳シナプトソームおよびシナプトソーム膜
シナプトソームを、ラット全脳または脳の海馬領域から調製した。ラットを犠牲にし、そして前脳を取り除き、次のプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷した０.３２Ｍ蔗糖に移した：１ｍＭ ＥＧＴＡ；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１μＭ ペプスタチン；２μＭロイペプチン。脳を、モーターで動かされるＴｅｆｌｏｎ−ガラスホモジナイザーを用いて均一化した（４００ｒｐｍで約８パス）。４個の脳からのホモジネートをプールしそして９００×ｇで１０分間４度で遠心分離した。上清を次いで８，５００×ｇで１５分間遠心分離した。結果として得られるペレットをそれぞれ１０ｍｌの氷冷した０.３２Ｍ蔗糖＋ＰＩ中で渦状混合で再懸濁した。サスペンションを、次いで、８,５００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを２０ｍｌの氷冷した０.３２Ｍ蔗糖＋ＰＩ中に再懸濁した。サスペンション（５ｍｌ／管）を四段階蔗糖密度勾配で層にした（それぞれ７ｍｌ：１.２Ｍ蔗糖，１.０Ｍ蔗糖，０.８Ｍ蔗糖，０.６Ｍ蔗糖；全ての蔗糖溶液はＰＩを含んでいる）。勾配管を、振動バケットローター中で１６０,０００×ｇで６０分間４度で遠心分離した。１.０Ｍ蔗糖層＋１.０および１.２Ｍ蔗糖層の間の境界面を集めそして氷冷した脱イオン水＋ＰＩで稀釈して０.３２Ｍの最終蔗糖濃度にした。結果として得られるサスペンションを、２０,０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを次いで５ｍｌ氷冷リン酸緩衝塩類溶液＋ＰＩ中に再懸濁した。結果として生じるラット脳シナプトソームを次いで分割し（ａｌｉｑｕｏｔｅ）そして液体窒素封入システム中に貯蔵した。
(Example 3)
Synaptosome membrane preparation A. Mammalian-brain synaptosomes and synaptosome membranes Synaptosomes were prepared from rat whole brain or hippocampal regions of the brain. Rats were sacrificed and the forebrain was removed and transferred to 10 ml ice-cold 0.32 M sucrose containing the following protease inhibitors: 1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 1 μM pepstatin; 2 μM leupeptin. Brains were homogenized using a motor-driven Teflon-glass homogenizer (approximately 8 passes at 400 rpm). Homogenates from the four brains were pooled and centrifuged at 900 xg for 10 minutes at 4 degrees. The supernatant was then centrifuged at 8,500 × g for 15 minutes. The resulting pellet was resuspended in 10 ml of ice-cold 0.32 M sucrose + PI by vortexing. The suspension was then centrifuged at 8,500 xg for 15 minutes. The pellet was resuspended in 20 ml of ice-cold 0.32M sucrose + PI. The suspension (5 ml / tube) was layered on a four-stage sucrose density gradient (7 ml each: 1.2 M sucrose, 1.0 M sucrose, 0.8 M sucrose, 0.6 M sucrose; all sucrose solutions contain PI. ). The gradient tube was centrifuged at 160,000 × g for 60 minutes at 4 ° C. in a vibrating bucket rotor. The interface between the 1.0M sucrose layer +1.0 and the 1.2M sucrose layer was collected and diluted with ice-cold deionized water + PI to a final sucrose concentration of 0.32M. The resulting suspension was centrifuged at 20,000 xg for 15 minutes. The pellet was then resuspended in 5 ml ice cold phosphate buffered saline + PI. The resulting rat brain synaptosomes were then aliquoted and stored in a liquid nitrogen encapsulation system.
結合アッセイで使用する前に、シナプトソームを解かしそして３容積の氷冷した脱イオン水＋ＰＩで稀釈した。このサスペンションをＰＴ１０−３５Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（６に合わせる）を用いて２回の１０秒バーストで均一化した。ホモジネートを、４０,０００×ｇで２０分間４度で遠心分離した。結果として得られるペレットを約５ｍｌの氷冷したリン酸緩衝塩類溶液＋ＰＩ中に再懸濁した。結果として得られる脳シナプトソーム膜調製物を分割しそして使用するまで−８０℃で貯蔵した。膜調製物のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、標準として子ウシ血清アルブミンを用いて求めた。 Prior to use in binding assays, synaptosomes were thawed and diluted with 3 volumes of ice-cold deionized water + PI. The suspension was homogenized in two 10-second bursts using PT10-35 Polytron (matched to 6). The homogenate was centrifuged at 40,000 xg for 20 minutes at 4 ° C. The resulting pellet was resuspended in about 5 ml of ice-cold phosphate buffered saline + PI. The resulting brain synaptosome membrane preparation was aliquoted and stored at -80 C until use. The protein concentration of the membrane preparation was determined using Bradford reagent (BioRad) using calf serum albumin as a standard.
（実施例４）
シナプトソーム膜中のＭＶＩＩＡ結合部位へのＯＣＴペプチド結合
Ａ．飽和結合アッセイ
ＭＶＩＩＡ ＯＣＴを、本質的にＡｈｍａｄらの方法に従って、125Ｉ−ヨウ素を用いて、ＩｏｄｏｇｅｎTMとの反応により放射能標識化した。Ｉｏｄｏｇｅｎ反応に続いて、ペプチド溶液を、ＨＰＬＣによってＣ−８逆相カラムを介してクロマトグラフィーで分離しそして０.１％トリフルオロ酢酸から０.１％トリフルオロ酢酸中６０％アセトニトリルまでの勾配で溶出した。誘導されてないＭＶＩＩＡ ＯＣＴに続く放射活性のきわだったピークを集めた。
(Example 4)
OCT Peptide Binding to MVIIA Binding Site in Synaptosome Membrane Saturation Binding Assay MVIIA OCT was radiolabeled by reaction with Iodogen ™ using 125 I-iodine, essentially according to the method of Ahmad et al. Following the Iodogen reaction, the peptide solution was chromatographed by HPLC through a C-8 reverse phase column by HPLC and with a gradient from 0.1% trifluoroacetic acid to 60% acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid. Eluted. A prominent peak of radioactivity following uninduced MVIIA OCT was collected.
ラット脳シナプトソーム膜への［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴに関する結合定数（Ｋd）を、［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの増加する量をシナプトソーム膜調製物（１０μｇ膜タンパク質，全容積０.５ｍｌ中、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、２μＭロイペプチン，０.０３５μｇ／ｍｌアプロチニン、および０.１％子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる結合緩衝液中に懸濁された）のアリコートに添加する飽和結合法によって決定された。標識化化合物の各濃度での結合を、１ｎＭの標識化していないＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在または存在下に決定して特異的結合を求めた。各濃度で特異的に結合した標識化ペプチドの量を用いてＢmax、シナプトソーム上の特異的結合部位の濃度、および標準結合分析方法（Ｂｅｎｎｅｔｔ）の後で、Ｋdを求めた。図６Ａは、ラットシナプトソーム膜への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡの飽和結合曲線を示している。図６Ｂは、データのＳｃａｔｃｈａｒｄ変換を示し、そこから、約１０ｐＭの計算されたＫｄが求められる。 The binding constant (K d ) for [ 125 I] -MVIIA OCT to rat brain synaptosome membrane was determined by increasing the amount of [ 125 I] MVIIA OCT by the amount of synaptosome membrane preparation (10 μg membrane protein, 20 mM in a total volume of 0.5 ml). Suspension in a binding buffer consisting of HEPES, pH 7.0, 75 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 2 μM leupeptin, 0.035 μg / ml aprotinin, and 0.1% calf serum albumin (BSA). Was determined by the saturation binding method added to the aliquots of the above. Binding at each concentration of labeled compound was determined in the absence or presence of 1 nM unlabeled MVIIA OCT to determine specific binding. The amount of labeled peptide specifically bound at each concentration was used to determine B max , the concentration of specific binding sites on synaptosomes, and K d after standard binding assays (Bennett). FIG. 6A shows the saturation binding curve of [ 125 I] MVIIA to rat synaptosome membrane. FIG. 6B shows a Scatchard transform of the data from which a calculated Kd of about 10 pM is determined.
Ｂ．競合的置換結合アッセイ
実施例３に記載されたように調製したラット脳シナプトソーム膜を、２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、２μＭロイペプチン、０.０３５μｇ／ｍｌアプロチニン、および０.１％子ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる結合緩衝液中に懸濁した。［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴ（２５−３０,０００ｃｐｍ，約１５００〜２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および試験化合物をポリプロピレン管に１ｎＭ ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在下または存在下に分割して非特異的結合を求めた。膜サスペンションを稀釈しそして、各アッセイ管が１０μｇの膜タンパク質を含みそして全容積が０.５ｍｌになるように、最後に試験管に分割した。１時間室温でインキュベーションした後、管を氷浴中に置き、次いで、ＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して濾過し、それを０.６％ポリエチレンイミン中で前もって浸しそして洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.０、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１％ＢＳＡ）で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ濾過システムを用いて予備洗浄した。濾過のほんの前に、各アッセイ管は３ｍｌの氷冷した洗浄緩衝液を受け取った。濾過した膜を２回３ｍｌ容積の氷冷した洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥し、そして、フィルターに結合した放射能を、Ｂｅｃｋｍａｎ γ計数管中で測定した（７５％計数効率）。
B. Competitive Displacement Binding Assay Rat brain synaptosome membranes prepared as described in Example 3 were
Suspension in a binding buffer consisting of HEPES, pH 7.0, 75 mM NaCl, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM EDTA, 2 μM leupeptin, 0.035 μg / ml aprotinin, and 0.1% calf serum albumin (BSA). did. [ 125 I] -MVIIA OCT (25-30,000 cpm, about 1500-2000 Ci / mmol) and test compounds were split into polypropylene tubes in the absence or presence of 1 nM MVIIA OCT to determine non-specific binding. The membrane suspension was diluted and finally divided into tubes so that each assay tube contained 10 μg of membrane protein and had a total volume of 0.5 ml. After 1 hour incubation at room temperature, the tubes are placed in an ice bath and then filtered through a GF / C filter (Whatman), which is presoaked in 0.6% polyethyleneimine and washed with washing buffer (20 mM HEPES, pH 7). 0.0, 125 mM NaCl, 0.1% BSA) using a Millipore filtration system. Just prior to filtration, each assay tube received 3 ml of ice-cold wash buffer. The filtered membrane was washed twice with 3 ml volume of ice-cold wash buffer, dried and the radioactivity bound to the filter was measured in a Beckman gamma counter (75% counting efficiency).
ラット脳シナプトソーム膜に関する代表的置換結合曲線を図７に示した。ＩＣ50値は、４−パラメーターロジスティファンクションによって作成されたライン適合曲線から算定された。これらの値は、ラット脳シナプトソーム膜への、［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの全特異的結合を５０まで阻害するのに必要な試験化合物の濃度を表しており、そこでは、特異的結合は、過剰の（１ｎＭ）未標識化［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの不存在および存在下での［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの結合の間の相違として定義される。このような値は、特異的結合部位に関する一連の化合物の相対的親和性の近似値として役に立つ。 Representative displacement binding curves for rat brain synaptosome membranes are shown in FIG. IC 50 values were calculated from line fit curves generated by a 4-parameter logistic function. These values represent the concentration of test compound required to inhibit the total specific binding of [ 125 I] MVIIA OCT to rat brain synaptosome membranes by 50, where the specific binding is of (1 nM) is defined as the difference between binding of [125 I] MVIIA OCT in the absence and presence of unlabeled [125 I] MVIIA OCT. Such a value serves as an approximation of the relative affinity of a series of compounds for a specific binding site.
各試験物質に関する結合定数（Ｋi）は、別々の機会に二重に行われた２つのアッセイからの競合的結合データの、非線形の、最小自乗法の回帰分析を用いて計算された。ＫiおよびＩＣ50（標識化化合物の５０％が試験化合物によって置換される濃度）の間の関係は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式：
Ｋi＝ＩＣ50／（１十［Ｌ］／Ｋd）
〔但し、ＩＣ50は、標識化リガンドの特異的結合を５０％まで減ずるのに必要な試験物質の濃度である；［Ｌ］は、実験に使用した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの濃度である；そしてＫdは、飽和結合実験のラット脳シナプトソーム膜への［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴの結合について求められた結合定数である。〕によって表される。表３は、ラット脳シナプトソームのＭＶＩＩＡ結合部位に関する種々のＯＣＴペプチドについての、算定されたＩＣ50およびＫi値をまとめている。
Binding constants (K i ) for each test substance were calculated using non-linear, least squares regression analysis of competitive binding data from two assays performed in duplicate on separate occasions. The relationship between K i and IC 50 (the concentration at which 50% of the labeled compound is displaced by the test compound) is described by the Cheng-Prusoff equation:
K i = IC 50 / (1 tens [L] / K d)
[Where IC 50 is the concentration of the test substance required to reduce the specific binding of the labeled ligand by 50%; [L] is the concentration of [ 125 I] -MVIIA OCT used in the experiment. And K d is the binding constant determined for the binding of [ 125 I] -MVII OCT to rat brain synaptosome membranes in saturation binding experiments. ]. Table 3 summarizes the calculated IC 50 and K i values for various OCT peptides for the MVIIA binding site of rat brain synaptosomes.
（実施例５）
ＯＣＴＭＶＩＩＡ結合タンパク質の同定
ラット脳海馬領域（ＲＨＭ）からのシナプトソーム膜は、実施例３に記載されたように調製された。４０μｇタンパク質を含むシナプトソーム調製物のアリコートを、架橋結合緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.１、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ、０.００２ｍＭロイペプチン、０.５ＴＩＵ／ｍｌアプロチニン）中で稀釈した。このサスペンションを次いでペレット化した（１３,０００×ｇ、１５分）。ペレットを次いで架橋結合緩衝液中に再懸濁し、再度ペレット化しくそして結果として得られるペレットを、架橋結合緩衝液中に懸濁して約１ｍｇ／ｍｌの最終的タンパク質濃度を有する洗浄されたシナプトソーム調製物を得た。
(Example 5)
Identification of OCTMVIIA Binding Protein Synaptosome membranes from rat brain hippocampal region (RHM) were prepared as described in Example 3. Aliquots of the synaptosome preparation containing 40 μg protein were added in crosslinking buffer (20 mM HEPES, pH 7.1, 75 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.002 mM leupeptin, 0.5 TIU / ml aprotinin). Diluted. The suspension was then pelletized (13,000 × g, 15 minutes). The pellet is then resuspended in the cross-linking buffer, re-pelletized and the resulting pellet is suspended in the cross-linking buffer to prepare a washed synaptosome with a final protein concentration of about 1 mg / ml. I got something.
結合は、０.４ｍｌの適当な架橋結合緩衝液、０.０５ｍｌの洗浄したシナプトソーム調製物（結合部位の濃度：（最終濃度：０.０５μＭ）、０.０５ｍｌの［125Ｉ］−ＭＶＩＩ ＯＣＴ（最終濃度：０.１ｎＭ）を含む、全容積０.５ｍｌの中で行われた。分けたアリコートにおいて、０.００５ｍｌの未標識化ＭＶＩＩＡ ＯＣＴを添加して、非特異的結合を評価した（最終濃度：０.０５μＭ）。インキュベーションは、試料をくるくると回転して、２０〜２４°で２５分間であった。 Binding was performed with 0.4 ml of the appropriate crosslinking buffer, 0.05 ml of the washed synaptosome preparation (concentration of binding site: (final concentration: 0.05 μM), 0.05 ml of [ 125 I] -MVII OCT ( (Final concentration: 0.1 nM) in a total volume of 0.5 ml.In separate aliquots, 0.005 ml of unlabeled MVIIA OCT was added to evaluate non-specific binding (final). (Concentration: 0.05 μM) Incubation was for 20 minutes at 20-24 ° with swirling the sample.
インキュベーション期間の終わりで、その受容体に対する、結合した［125Ｉ］−ＭＶＩＩＡ ＯＣＴの架橋は、０.０１ｍｌの２５ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣＬ（ＥＤＣ）をサスペンション（使用の直前に、２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．１に溶解されたＥＤＣ）に添加することによって行われた。この混合物を１０分間氷温度で、断続的に混合しながら、インキュベーションした。反応を、２０ｍＭ酢酸アンモニウムの添加によって抑えた。この混合物を次いで１３,０００×ｇで１５分間遠心分離することによってペレット化し、続いて１〜２回、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７.５中で再懸濁しそしてペレット化することによって洗浄した。最終的なぺレットを、２０μｌの新しい試料緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭジチオトレイトール、４Ｍ尿素、８％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０.１％ブロモフェノールブルー）中に溶解し、次いで、試料の前加熱なしに、ＳＤＳ
ＰＡＧＥ（４〜１５％アクリルアミド勾配ゲル）にかけた。類似の実験を、［125Ｉ］ＧＶＩＡ ＯＣＴを架橋リガンドとして用いて行った。
At the end of the incubation period, cross-linking of the bound [ 125 I] -MVIIA OCT to its receptor suspended 0.01 ml of 25 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide HCL (EDC) (EDC). Immediately before use, it was performed by addition to 25 mM PIPES, EDC dissolved in pH 6.1). The mixture was incubated for 10 minutes at ice temperature with intermittent mixing. The reaction was quenched by the addition of 20 mM ammonium acetate. The mixture was then pelleted by centrifugation at 13,000 xg for 15 minutes, followed by 1-2 washes by resuspending and pelleting in 25 mM HEPES buffer pH 7.5. The final pellet was dissolved in 20 μl of fresh sample buffer (200 mM Tris-HCl, 10 mM dithiothreitol, 4 M urea, 8% SDS, 10% glycerol, 0.1% bromophenol blue) and then SDS without sample pre-heating
PAGE (4-15% acrylamide gradient gel). Similar experiments were performed using [ 125 I] GVIA OCT as the bridging ligand.
図８は、ラット脳シナプトソーム膜調製物への［125Ｉ］ＭＶＩＩＡ ＯＣＴおよび［125Ｉ］ＭＶＩＩＢ ＯＣＴの架橋結合を証明するオートラジオグラフを示す。多数のタンパク質バンドが、当該手順によって標識化されるが、２００〜２３０キロダルトンタンパク質として移動するタンパク質バンドでの結合は、上述したような過剰の未標識化リガンドの含有物によって特に置換された。 FIG. 8 shows an autoradiograph demonstrating the cross-linking of [ 125 I] MVIIA OCT and [ 125 I] MVIIB OCT to rat brain synaptosomal membrane preparations. Although a number of protein bands are labeled by this procedure, binding at the protein band migrating as a 200-230 kilodalton protein was specifically displaced by the inclusion of excess unlabeled ligand as described above.
これらの結果は、ラットシナプトソーム膜への高い親和性特異的結合が少なくとも部分的には、ゲル上の２００〜２３０Ｋｄ領域中で移動するタンパク質バンドでの結合に帰することを示唆している。他のバンドの標識化は、より低い親和性または非特異的結合のいずれかのためであり得る、なぜならば、これらのバンドヘの標識化は、未標識化リガンドによって置き換えられなかったからである。 These results suggest that high affinity specific binding to rat synaptosome membranes is at least partially attributed to binding at protein bands that migrate in the 200-230 Kd region on the gel. Labeling of the other bands may be due to either lower affinity or non-specific binding, since labeling on these bands was not displaced by the unlabeled ligand.
（実施例６）
シナプトソーム膜中のＳＶＩＢ結合部位へのＯＣＴペプチド結合
ラット脳シナプトソーム膜を、実施例３に記載したように調製した。ＯＣＴ ＳＶＩＢを、実施例４に記載した、Ｉｏｄｏｇｅｎ反応により125Ｉ−ヨウ素でヨウ素化することにより放射能標識化した。ラット脳シナプトソーム膜上の放射能標識化ＳＶＩＢの置換結合は、実施例４Ｂと同様に行った。アッセイした、いくつかのＯＣＴペプチドに関するＳＶＩＢ置換曲線を図９に示す。ＩＣ50値およびＫi値は、実施例４に記載したように計算した。表４は、試験したＯＣＴペプチドに関する計算したＫi値、および、ＯＣＴ ＭＶＩＩＡ部位へのＫi結合定数とＳＶＩＢ結合部位へのＫi結合定数との比を示している。
(Example 6)
OCT Peptide Binding to SVIB Binding Site in Synaptosome Membrane Rat brain synaptosome membrane was prepared as described in Example 3. OCT SVIB was radiolabeled by iodination with 125 I-iodine by the Iodogen reaction as described in Example 4. Displacement binding of radiolabeled SVIB on rat brain synaptosome membrane was performed as in Example 4B. The SVIB displacement curves for several OCT peptides assayed are shown in FIG. IC 50 and K i values were calculated as described in Example 4. Table 4, K i values calculated regarding OCT peptides tested, and indicates the ratio of the K i binding constant to K i binding constant and SVIB binding sites to OCT MVIIA site.
（実施例７）
解剖学的損傷の減少：全体的虚血モデル１
全体的虚血損傷を、標準手順（Ｋｉｒｉｎｏ）に従って、アレチネズミモデルにおいて調べた。体重５０〜８０ｇの雄のモンゴリアンアレチネズミ（Ｍｅｒｉｏｎｅｓ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔｕｓ，Ｔｕｍｂｌｅｂｒｏｏｋ Ｆａｒｍ，Ｗｅｓｔ Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，マサチューセッツ州）を、７０％亜酸化窒素（０.４４Ｌ／分）および３０％酸素（０.１９Ｌ／分）によって保持される４％ハロセンで、小室中で麻酔した。それらを次いで、２％ハロセンを用いた外科的処置の間ずっと、それらの鼻を、ガス発射管上のゴム製のダム中の穴を通して置くことによって保った。無菌技術を用いて、両方の共通の頸動脈を露出し、解剖して取り囲んでいる領域を除き、そして、鎖骨の約３〜４ｍｍ上で微小血管クランプを用いて閉塞した。両方の動脈を閉塞する間、時間を計って閉塞を８分間継続した。一般に、２つの動脈の各々を締める間は、約１分間であり、そして、それらを締めていない間は、約４秒であった。クランプを除いた後、皮膚を縫合して閉じそして麻酔を中止した。
(Example 7)
Reduction of anatomical damage:
Global ischemic damage was examined in a gerbil model according to standard procedures (Kirino). Male Mongolian gerbils (Merions Unguiculatus, Tumblebrook Farm, West Brookfield, Mass.) Weighing 50-80 g were treated with 70% nitrous oxide (0.44 L / min) and 30% oxygen (0.19 L / min). Anesthetized in the chamber with 4% halothane retained. They were then kept throughout the surgical procedure with 2% halothane by placing their nose through a hole in a rubber dam on a gas firing tube. Using aseptic technique, both common carotid arteries were exposed, dissected free of the surrounding area, and occluded using a microvascular clamp approximately 3-4 mm above the collarbone. During occlusion of both arteries, occlusion was continued for 8 minutes. Generally, it took about 1 minute to tighten each of the two arteries, and about 4 seconds while not tightening them. After removing the clamp, the skin was sutured closed and anesthesia was discontinued.
閉塞の間または後、側脳室をねらった大脳室内（ＩＣＶ）注射を行った。これをなし遂げるために、２７ゲージ針を伴う１０マイクロリットル Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を、この系内の空気の不存在を保証するためにバック充填により注射液（ｉｎｊｅｃｔａｔｅｅ）で満たした。堅いプラスチックスリーブを、針の３.５ｍｍがスリーブ通って突き出すように、針にはめた。ブレブマの周囲の頭蓋を露出し、真ん中の１.１ｍｍ左の距離をコンパスで測定し、そしてブレグマの０.４ｍｍ後ろの距離を目によって見積もった。針の先端を頭蓋に垂直に保持しそしてそれを通して回転させながら一般的圧力を適用することによってその点に挿入した。それは、スリーブが頭蓋に接するまで進められ、そして５マイクロリットルの注射液を約３秒間にわたって注入した。次いで皮膚を縫合して閉じた。閉塞した動物は、薬物またはそのビヒクルのいずれかを受け取った。注射した、閉塞されていない対照は麻酔され、そしてＩＣＴ注射のみを受け取った。 During or after occlusion, intracerebroventricular (ICV) injections aimed at the lateral ventricles were performed. To accomplish this, a 10 microliter Hamilton syringe with a 27 gauge needle was filled with an injectate by backfilling to ensure the absence of air in the system. A rigid plastic sleeve was fitted over the needle such that 3.5 mm of the needle protruded through the sleeve. The skull around the bregma was exposed, the middle 1.1 mm left was measured with a compass, and the distance 0.4 mm behind the bregma was estimated by eye. The needle tip was held perpendicular to the skull and inserted at that point by applying general pressure while rotating through it. It was advanced until the sleeve touched the skull, and 5 microliters of the injection was infused over about 3 seconds. The skin was then sutured closed. Occluded animals received either the drug or its vehicle. Injected, unobstructed controls were anesthetized and received only ICT injections.
動物をＣＯ2で麻酔した。胸腔を開きそして頭蓋動物を心臓を通して、ヘパリン（１０単位／ｍｌ）を含む約３ミリリットルのリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ；０.１０Ｍリン酸ナトリウム；０.１５Ｍ塩化ナトリウム）、その後約１０ｍｌのＺａｍｂｏｎｉ’ｓ ｆｉｘ（０.１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７.４または１０％リン酸緩衝ホルマリン中１５％（容積／容積）ピクリン酸４％（重量／容積）パラホルムアルデヒド）で灌流した。脳を取り除きそして同一の固定液に数時間浸しておいた。
The animals were anesthetized with CO 2. The thoracic cavity is opened and the cranial animal is passed through the heart through approximately 3 ml of phosphate buffered saline (PBS; 0.10 M sodium phosphate; 0.15 M sodium chloride) containing heparin (10 units / ml) followed by approximately 10 ml of Zamboni. Perfused with 's fix (15% (vol / vol)
脳を視交叉のすぐ後でおよび乳頭体の後ろでブロックにした。次いでそれらを１０％（重量／容積）蔗糖中にＰＢＳ中で一晩４度で置いた。海馬を含むブロックを液体フレオン中でクリオスタットチャック上に凍結組織検体のためのＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．包埋媒体（Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，アイオワ州）を用いて液体フレオンで凍結した。厚さ１０ミクロンの切片を切った。海馬の適切な部分が得られるまで（脳ごとに４０〜５０切片）、約１００ミクロン離れた各シリーズに関して５切片のシリーズを集めた。脳ごとに少なくとも８切片を、実質的に、報告された手順により、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。 The brain was blocked immediately after chiasm and behind the nipple. They were then placed in 10% (weight / volume) sucrose in PBS overnight at 4 degrees. The block containing the hippocampus is placed on a cryostat chuck in liquid freon on a Tissue-Tek® O.D. C. T. Frozen in liquid freon using embedding media (Miles Inc., Elkhart, IA). Sections of 10 microns thickness were cut. A series of 5 sections was collected for each series about 100 microns apart until an appropriate portion of the hippocampus was obtained (40-50 sections per brain). At least 8 sections per brain were stained with hematoxylin and eosin substantially by the reported procedure.
次いでカバーガラスを、接着剤としてＰｅｒｍｏｕｎｔTMを用いて、切片上に置いた。図１０Ａおよび１０Ｂは、虚血後くＭＶＩＩＡ ＯＣＴ（１０Ａ）の注入後または薬物ビヒクル後（１０Ｂ）の動物中のアナネズミ海馬（ＣＡ１領域）の低倍率顕微鏡写真である。図中の矢印は、海馬のＣＡ１領域のおおよその境界を示している。より高い倍率で、薬物処置虚血動物中の細胞は、正常であると思われ（図１１Ａ）、他方、損傷は、ビヒクルのみを受け取うた虚血動物中ではっきりしている（図１１Ｂ）。完全な薬物保護の別の例は、図１１Ｃに見られ、そして、部分的保護の例は、図１１Ｄに見られ、そこには、少数の損傷細胞が存在している。 The coverslip was then placed on the sections using Permount ™ as an adhesive. FIGS. 10A and 10B are low magnification micrographs of the gerbil hippocampus (CA1 area) in animals after injection of MVIIA OCT (10A) or after drug vehicle (10B) after ischemia. The arrows in the figure indicate the approximate boundaries of the CA1 region of the hippocampus. At higher magnification, cells in drug-treated ischemic animals appear normal (FIG. 11A), while damage is evident in ischemic animals receiving vehicle only (FIG. 11B). Another example of complete drug protection is seen in FIG. 11C, and an example of partial protection is seen in FIG. 11D, where there are a small number of damaged cells.
切片、例えば、図１０および１１に見られるようなものは、個々の試料の処置を知らない調査者によって検査されそして採点された。虚血損傷は、海馬のＣＡ１領域中で採点された。損傷は一般にピンク色（エオシン好性）細胞質および収縮した、暗青色の核として見られた。採点は以下に記載されたようなものであった。 Sections, such as those seen in FIGS. 10 and 11, were examined and scored by an investigator unaware of the treatment of the individual samples. Ischemic injury was scored in the CA1 area of the hippocampus. Injuries were generally seen as pink (eosinophile) cytoplasm and contracted, dark blue nuclei. The scoring was as described below.
上記採点システムに基づいた、ＭＶＩＩＡまたはＧＶＩＡ ＯＣＴで処置した、あるいは、ビヒクルのみを受け取った（対照）虚血動物中の解剖学的損傷の程度は、表５中に示されている。８分間の閉塞の間、表５に示した全用量で、当該ペプチドをＩＣＶ注入により投与した。理解されるように、より高い用量のＭＶＩＩＡ ＯＣＴで処置した動物中の損傷の程度は、未処置動物中のそれの２５％に過ぎなかった。ＧＶＩＡペプチドは同様に、５０％より高い、損傷の減少を引起し、そしてより低い用量は、ほぼ最高の有効性であった。 The extent of anatomical damage in ischemic animals treated with MVIIA or GVIA OCT or receiving vehicle only (control) based on the above scoring system is shown in Table 5. The peptide was administered by ICV infusion at all doses shown in Table 5 during the 8 minute occlusion. As will be appreciated, the extent of damage in animals treated with higher doses of MVIIA OCT was only 25% of that in untreated animals. The GVIA peptide also caused a reduction in damage, greater than 50%, and lower doses were near the highest efficacy.
第二の処置方法において、ＯＣＴペプチドを、上記と同一の薬物用量レベルで、８分の閉塞後１時間、ＩＣＶ注入によって投与した。薬物の存在および不存在下での解剖学的損傷は、表６に示されている。 In a second method of treatment, the OCT peptide was administered by ICV infusion at the same drug dose level as above, 1 hour after an 8 minute occlusion. The anatomical damage in the presence and absence of the drug is shown in Table 6.
（実施例８）
解剖学的損傷の減少：アナネズミ虚血モデル２
全体的虚血損傷を、ラット中の一時的全体的虚血を誘導するためのＰｕｌｓｉｎｅｌｌｉおよびＢｒｉｅｒｌｙ（Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ）の４容器閉塞方法を用いて、ラット脳モデル中で調べた。２つの頸動脈は全脳に血液を供給するが、それらの閉塞のみでは、前脳血流に対する中位の効果を有するに過ぎない、なぜならば、後部の連絡動脈が、２つの脊椎動脈によって供給される脳幹血液供給から血液の短絡を作ることを可能にするからである。それ故、苛酷な前脳虚血を行うために、４つ全ての血管を閉塞しなければならない。使用される手順は、虚血を、外科的に移植されたクランプを閉じることによって、意識のある動物中に引き起こし、それ故薬物処理との起こりうる相互作用を避けることを可能にする。手順は、意識のある動物中の皮膚の傷を再び開く必要なしに頸動脈閉塞を可能にするように修正された。
(Example 8)
Reduction of anatomical damage:
Global ischemic damage was examined in a rat brain model using the Pulsinelli and Brierly (Pulsinelli) four-vessel occlusion method to induce transient global ischemia in rats. Although the two carotids supply blood to the whole brain, their occlusion alone has only a moderate effect on forebrain blood flow because the posterior connecting arteries are supplied by the two vertebral arteries Because it makes it possible to create a blood short circuit from the supplied brain stem blood supply. Therefore, to perform severe forebrain ischemia, all four blood vessels must be occluded. The procedure used allows to cause ischemia in conscious animals by closing the surgically implanted clamp, thus avoiding possible interactions with drug treatment. The procedure was modified to allow for carotid artery occlusion without having to reopen skin wounds in conscious animals.
外科的処置は、両方の脊椎動脈を永久的に閉塞するそして動脈クラスプを移植してより遅い時間での頸動脈の一時的閉塞を可能にするように行った。ベントバルビタールナトリウム麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ）の下、雄のＦｉｓｈｅｒ３４４ラットを、定位的容器中に置きそして第一頸部脊椎を解剖用顕微鏡を用いて露出した。脊椎動脈を、翼状の孔を通じて焼灼装置を用いて閉塞しそして皮膚を傷クリップで閉じた。当該動物を、あお向けに置きそして頸動脈を注意深く解剖して取り囲む神経および管を顕微鏡下に取り除いた。クラスプのＳｉｌａｓｔｉｃループのくくりつけていない端を、動脈の後ろに通しそしてクラスプのじゃまもののない側を経て置きそして他方の末端について固定した。次いでこのことを別の頸動脈について繰り返した。ループの末端を外に向けさせるように皮膚を閉じる時、クラスプを、皮膚に３−０縫合線で結紮した。 Surgical procedures were performed to permanently occlude both spinal arteries and implant an arterial clasp to allow for temporary occlusion of the carotid artery at a later time. Under sodium bentobarbital anesthesia (60 mg / kg), male Fisher 344 rats were placed in a stereotaxic container and the first cervical spine was exposed using a dissecting microscope. The spinal artery was occluded using a cautery device through the pterygium and the skin closed with wound clips. The animal was placed on its back and the carotid artery was carefully dissected and the surrounding nerves and tubes were removed under a microscope. The unclamped end of the clastic Silastic loop was passed behind the artery and placed over the unobstructed side of the clasp and secured on the other end. This was then repeated for another carotid artery. The clasp was ligated to the skin with a 3-0 suture when the skin was closed so that the ends of the loop were outward.
虚血を、手術の２日後に引き起こした。頸動脈を閉塞するために、当該動物を、皮膚を、首の後ろで軽くつまむことによって保持しそして各ループの末端を引出しそして、強力なクランプで固定した。１５分閉塞の終わりに、クランプを取り除いて再灌流した。有効な閉塞は、当該動物に、閉塞の約１分内に、その直立応答（ｒｉｇｈｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を失わせる。当該動物が、閉塞の間に直立応答を失わないか、または、それを回復する時、ループをよりしっかり引いて完全な頸動脈閉塞を確実にした。それらの直立応答を失わない動物は、研究から除いた、なぜならば、これは、未だかなりの大脳血流が存在することを示唆していたからである。 Ischemia was induced two days after surgery. To occlude the carotid artery, the animal was held by gently pinching the skin behind the neck and the ends of each loop were withdrawn and secured with a strong clamp. At the end of the 15 minute occlusion, the clamp was removed and reperfusion was performed. Effective occlusion causes the animal to lose its righting response within about one minute of the occlusion. When the animal did not lose or recover the upright response during occlusion, the loop was pulled tighter to ensure complete carotid occlusion. Animals that did not lose their upright response were excluded from the study because this suggested that significant cerebral blood flow was still present.
このような動物の神経病理学的分析（以下参照）が、この観察を確かにしている、なぜならば、当該損傷は、それらの直立応答を失う動物中よりも少ないことが発見されているからである。いくつかの動物は閉塞の間に１回または２回自ら直立したが、直ちに直立応答を再度失い、そして研究から除かれなかった。自ら直立しそしてそのままの動物は除外された。 Neuropathological analysis of such animals (see below) confirms this observation, since the damage has been found to be less than in animals losing their upright response. is there. Some animals erect themselves one or two times during the occlusion, but immediately lost their upright response again and were not removed from the study. Animals standing upright and intact were excluded.
Ａ．ＯＣＴペプチドの大脳室内投与
大脳室内（ＩＣＶ）化合物を受け取ったラットを、ハロタンを用いて麻酔し、直ぐ後に再灌流し、そして５μＬ塩類溶液中に含まれた化合物または塩類溶液のみを、アレチネズミについて側脳室に注射した。注射の座標は、真ん中の１.２ｍｍ左そしてブレグマの後ろ０.５ｍｍで、深さ３〜４ｍｍであった。直腸温度を、閉塞のちょうど前から、そして閉塞後４〜６時間監視した。ラットは、閉塞に続く４〜６時間平常体温で維持された（直腸温度約３７度で）。神経保護の程度は表７に示されている。
A. Intracerebroventricular Administration of OCT Peptide Rats receiving the intracerebroventricular (ICV) compound are anesthetized with halothane, immediately reperfused, and only the compound or saline contained in 5 μL saline is applied to gerbils. It was injected into the ventricle. The coordinates of the injection were 3-4 mm deep, 1.2 mm left in the middle and 0.5 mm behind bregma. Rectal temperature was monitored just before occlusion and for 4-6 hours after occlusion. Rats were maintained at normal body temperature (at a rectal temperature of about 37 degrees) for 4-6 hours following occlusion. The degree of neuroprotection is shown in Table 7.
Ｂ．ＯＣＴペプチドの静脈内投与
大脳虚血のラット４−ＶＯモデルに関する化合物の静脈内（ＩＶ）投与について、ラットを上述したように手術し次いで閉塞した。閉塞クランプを取り除いた後、ラットを、Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ Ｃｏｎｅｓ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に置いた。可逆止血帯を尾静脈に適用し、そしてＯＣＴ ＭＶＩＩＡを全容積０.２５ｍｌで、表８に示した用量で注入した。ＩＣＶ投与について、加熱装置を用いた閉塞の後、ラットは４〜６時間平常温度で維持された（直腸温度約３７度で）。神経保護の程度は表８に示されている。
B. Intravenous Administration of OCT Peptide For intravenous (IV) administration of the compound for the rat 4-VO model of cerebral ischemia, the rats were operated on as described above and then occluded. After removing the occlusion clamp, the rats were placed in Rodent Rest Constraints (Harvard Bioscience). A reversible tourniquet was applied to the tail vein and OCT MVIIA was infused in a total volume of 0.25 ml at the doses shown in Table 8. For ICV administration, following occlusion with a heating device, rats were maintained at normal temperature for 4-6 hours (at a rectal temperature of about 37 degrees). The degree of neuroprotection is shown in Table 8.
（実施例９）
解剖学的損傷の減少：局部的虚血モデル
大脳虚血のラットの中央大脳動脈閉塞モデルを、ＳＨＲ系ラットで行った。ラットを、Ｅｖｉｐａｎ（１５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を用いて麻酔した。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡを、例８に記載したように、５μｌの容積で大脳室内に左の側脳室へ注射した。１０分以内に、左中央の大脳動脈は、電気凝固によって永久的に閉塞された。閉塞が行われた２４時間後、ラットを再度Ｅｖｉｐａｎで磁気共鳴画像のために麻酔した。８つの冠状像が記録された。各像中の梗塞像は、絵素を数えることによって決定された。表９には、ラットごとの、８つの冠状切片からの絵素の平均総数が示されている。１．７μｇのＭＶＩＩＡ ＯＣＴでの処置（ｉ．ｖ．ｃ．）は、中央大脳動脈閉塞により引き起こされる平均梗塞サイズ面積を２４％減少する。この減少は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験によってアッセイされるように、統計学的に重要である。
(Example 9)
Reduction of anatomical damage: regional ischemia model A model of central cerebral artery occlusion in rats with cerebral ischemia was performed in SHR rats. Rats were anesthetized using Evipan (150 mg / kg ip). OCT MVIIA was injected into the cerebral ventricle into the left lateral ventricle in a volume of 5 μl as described in Example 8. Within 10 minutes, the left central cerebral artery was permanently occluded by electrocoagulation. Twenty-four hours after the occlusion was performed, the rats were again anesthetized with Evipan for magnetic resonance imaging. Eight coronal images were recorded. The infarct image in each image was determined by counting the picture elements. Table 9 shows the average total number of picture elements from eight coronal sections for each rat. Treatment with 1.7 μg of MVIIA OCT (ivc) reduces the average infarct size area caused by central cerebral artery occlusion by 24%. This reduction is statistically significant, as assayed by the Mann-Whitney U test.
（実施例１０）
機能活性の損失に対する保護
Ａ．機能亢進
大脳虚血の１つの共通する後遺症は、機能亢進であり、それは、閉塞の数時間内の歩き回る行動として見られ得、そして、その後数時間まで測定され得る。機能冗進は、Ａｕｔｏｍｅｘ活性モニター（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，オハイオ州）で量的に表され、それは、ラジオ周波数電界の摂動を記録する。アレチネズミをそれぞれ１７×２７ｃｍのプラスチック製かご中で６０分間、統計学的分析のために１５分間ごとに記録した累積活性計数を用いて、試験した。ベースライン活性を手術前に測定してこの測定に関する異なる処置群の比較可能性を確実にした。
(Example 10)
Protection against loss of functional activity A. Hyperactivity One common sequela of cerebral ischemia is hyperactivity, which can be seen as walking behavior within hours of the obstruction and can be measured up to hours thereafter. Functional redundancy is quantified by an Automex activity monitor (Columbia Instruments, Columbia, Ohio), which records perturbations in the radio frequency electric field. The gerbils were tested using cumulative activity counts recorded in plastic baskets of 17 × 27 cm each for 60 minutes and every 15 minutes for statistical analysis. Baseline activity was measured pre-operatively to ensure comparability of different treatment groups for this measurement.
試験の結果は図１３にプロットされている。各試験曲線の下向きの傾斜は、当該動物は、試験環境に、より馴れるにつれて、試験の、４つの１５分間隔（１〜４はベースラインについて、５〜８は１日目について、そして９〜１２は３日目について）にわたり活性が減少するためである。閉塞のみ（△）は、閉塞の１日後にベースラインレベルを越えた活性レベルの著しい上昇を引き起こし、そして、高められた活性レベルが３日間にわたって、永久的な行動損傷を示して、観察された。ビヒクルのＩＣＴ投与を受け取った、非閉塞対照動物（白丸）は、試験期間を通じてベースライン活性レベルのままであった。ＯＣＴペプチドそれ自体（９）は、虚血の不存在下に、活性を下げ、そしてこの効果は３日目ですらわずかに持続した。ＯＣＴ ＭＶＩＩＡで処置した閉塞動物（黒三角）は、ペプチドのみによって引き起こされる減ぜられた活性を明らかに反映して、１日目にベースラインより低い値を示した。３日目で、処置動物は、ほぼ正常レベルの活性を示し、ＯＣＴペプチド処置が、虚血誘発機能元進に対して保護を与えることを示した。
The results of the test are plotted in FIG. The downward slope of each test curve indicates that, as the animals become more familiar with the test environment, the four 15-minute intervals of the test (1 to 4 for baseline, 5 to 8 for
Ｂ．自発的交互
ここで使用されたタイプの虚血の、卓越した神経病理学的結果が、場所的学習および記憶の欠落を引き起こすことが知られている海馬損傷であるので、迷路行動における新しい（作動）記憶の試験を用いた。この試験はＹ迷路を使用する。
B. Spontaneous alternation A new (activate) in maze behavior is the predominant neuropathological consequence of ischemia of the type used here is hippocampal damage known to cause spatial learning and memory loss. ) Memory tests were used. This test uses the Y maze.
アレチネズミを、Ｙ迷路中で試験した、そこでは、当該動物は、迷路のステムの出発点に置かれ、そして当該動物がアームに入った時に、ドアがその後ろで閉じられる。５秒後に、アレチネズミを、２〜１２分の試験間間隔（ＩＴＩ）でそのホームケージに戻す。その間隔の終わりに、アレチネズミを再度同一の方法で迷路中で走らせる。たいていの正常のネズミは交互であるであろう、即ち、最初の試験で入ったアームに入るであろう。場合により、動物は約１分以内にアームに入らなかった、なぜならば、それは発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）を有しており、それ故この試験から除外された。 Gerbils were tested in the Y maze, where the animal was placed at the start of the maze stem and when the animal entered the arm, the door was closed behind it. After 5 seconds, the gerbils are returned to their home cage at an inter-trial interval (ITI) of 2-12 minutes. At the end of the interval, the gerbils are again run in the same way in the maze. Most normal rats will be alternating, ie, will enter the arm that was entered in the first test. In some cases, the animal did not enter the arm within about 1 minute because it had a seizure and was therefore excluded from this study.
個々の実験は、データの有意味な統計学的評価を可能するには、グループごとに少なすぎる動物を含んでいたので、結果を、海馬損傷に対する薬物処置による保護の良好な証拠が存在する全ての実験について合わせた（実施例７）。正の結果を有する実験のみが合わされ、解剖学的保護が行動保護と関連しているかを決定した。 Since individual experiments included too few animals per group to allow a meaningful statistical evaluation of the data, the results were based on good evidence that there was good evidence of drug treatment protection against hippocampal damage. (Example 7). Only experiments with positive results were combined to determine if anatomical protection was associated with behavioral protection.
自発的交互試験の結果を、少なくとも０.１μｇの用量の各化合物からの解剖学的保護が存在する実験について表１０に要約した。合わせたデータに関するカイ二乗検定法は、ｐ＜０.０１で重要であった。各ファクターを別々に調べるために合わせた処置群（例えば、閉塞された全て対未閉塞の全て、薬物処置にかかわらず）は、そぞれ、カイ二乗検定法によりｐ＜０.０５で重要であることを示した；すなわち、（ａ）虚血は、一層悪い行動を引き起こした、そして（ｂ）行動のレベルは、処置動物中で大部分再度蓄積された。 The results of the spontaneous alternation test are summarized in Table 10 for experiments where there was anatomic protection from each compound at a dose of at least 0.1 μg. The chi-square test for the combined data was significant at p <0.01. Treatment groups tailored to examine each factor separately (eg, all occluded versus all unoccluded, regardless of drug treatment) were each significant at p <0.05 by chi-square test. It was shown that: (a) ischemia caused worse behavior, and (b) the level of behavior was largely re-accumulated in treated animals.
本発明が特別な実施態様に関して記載されているにもかかわず、当業者にとって、種々の変化および修正は、本発明から離れることなくなし得ることは明らかである。 Although the present invention has been described with respect to particular embodiments, it will be apparent to one skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the invention.
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