【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダーゼの破骨細胞分化誘導作用又は破骨細胞分化抑制作用に基づく骨代謝回転調節関連技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨は、常に破骨細胞による骨吸収と、骨芽細胞との間の情報伝達に基づく骨形成と、を繰り返す「骨再構築（リモデリング）」を行っている。この骨再構築は、サイトカインやホルモンなどの多くの因子が関与している複雑な過程であると考えられ、通常の骨再構築では、骨吸収量と骨形成量はほぼ等しく、骨量の変化は生じない。
【０００３】
しかし、「骨粗鬆症」や「慢性関節リウマチ」を発症すると、骨吸収が骨形成量を上回るため、骨量の減少が見られる。一方、「大理石骨病」は、骨吸収不全が原因となる病態であり、破骨細胞の分化に異常があって骨組織に破骨細胞が存在しない場合や破骨細胞の機能に異常があって骨吸収が行えない場合等に発症するものと考えられている。
【０００４】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下、「γ−ＧＴＰ」と略称する。）は、γ−グルタミルペプチドを加水分解すると同時に、γ−グルタミル基を他のペプチドやアミノ酸に転移する反応を触媒する酵素であり、グルタチオン代謝に関与している。このγ−ＧＴＰには、その具体的な作用機序については全く不明ではあったけれども、前記破骨細胞の分化促進活性のあることが、本願発明者によって明らかにされている（特許文献１参照）。
【０００５】
また、現在までに、骨吸収に促進的に作用する因子として、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン関連蛋白、甲状腺ホルモン、１，２５−水酸化ビタミンＤ、インターロイキン−１、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、Ｍ−ＣＳＦ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：マクロファージコロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＴＧＦ−β（形質転換増殖因子β）、プロスタグランジンなどが知られている。
【０００６】
一方、骨吸収に抑制的に作用する因子としては、エストロゲン、アンドロゲン、カルシトニン、インターフェロンγ、インターロイキン−４、ＴＧＦ−β等が知られており、更に、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、略称ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する液性因子（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ、略称ＯＰＧ）が、破骨細胞を抑制する因子として同定されている（非特許文献１、非特許文献２参照）。
【０００７】
前記ＯＰＧに結合する膜結合型サイトカインとして同定されているのが破骨細胞分化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ、略称ＲＡＮＫＬ）である（非特許文献３，非特許文献４参照）。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬとそのレセプターである破骨細胞分化因子（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ、略称ＲＡＮＫ）との結合を競合的に阻害することによって、破骨細胞分化を調節すると考えられている。
【０００８】
このＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系のノックアウトマウスを用いた実験の結果からは、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系が生理的な破骨細胞形成に役割を果たしていることが示唆されている（非特許文献５、非特許文献６参照）。そして、現在、種々の生理活性物質であるサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１１等）、ホルモン（ＰＴＨ等）やプロスタグランジンが、上記ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系を介して破骨細胞の形成に関与していることが判明している（非特許文献７参照）。
【０００９】
他方、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系が全ての破骨細胞の分化誘導に関与しているわけではないという知見がある。例えば、ＩＬ−１やＴＮＦαは、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系を介さずに、直接破骨細胞の分化誘導する作用も発揮するという報告がある。即ち、骨代謝異常の病変における骨破壊には、複数の機構が関与していると考えられている（非特許文献８参照）。
【００１０】
骨吸収に促進的に作用する因子の一つである上記Ｍ−ＣＳＦ（別名：ＣＳＦ−１）は、骨髄中の単球前駆細胞に働いて単球への分化を促進する因子としての作用（単球増殖誘導作用）を有するサイトカインであり、単球やマクロファージの活性化やそれに伴う好中球の増加、抗腫瘍活性、抗真菌作用等の機能を持っていることが一般的に知られている。
【００１１】
このＭ−ＣＳＦ欠乏によるｏｐ／ｏｐマウスは、破骨細胞とマクロファージが存在しないが、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍ−ＣＳＦの投与によって、破骨細胞が劇的に増加し骨吸収が開始することから、破骨細胞の分化に対して間質系細胞由来のＭ−ＣＳＦが必須であることが明らかにされている（非特許文献９）。
【００１２】
また、特許文献２には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が破骨細胞の形成、生存を促進する活性を有しており、Ｍ−ＣＳＦ欠損マウスの血管内皮増殖因子受容体１型（ＶＥＧＦＲ−１）の活性化を阻害することにより、破骨細胞を減少させることができることが開示されている。
【００１３】
【特許文献１】
特開平１０−８７５０７号公報。
【特許文献２】
特開２００１−８６９８２号報。
【非特許文献１】
Ｓｉｍｏｎｅｔ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，８９：３０９−３１９、１９９７。
【非特許文献２】
Ｙａｓｕｄａ，Ｈら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３９：１３２９−１３３７，１９９８。
【非特許文献３】
Ｙａｓｕｄａ，Ｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：３５９７−３６０２，１９９８。
【非特許文献４】
Ｌａｃｅｙ，Ｄ．Ｌら、Ｃｅｌｌ，９３：１６５−１７６，１９９８。
【非特許文献５】
Ｌｉ，Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１５６６−１５７１，２０００。
【非特許文献６】
Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｗ，Ｃら、Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．１３：２４１２−２４２４，１９９９。
【非特許文献７】
新・分子骨代謝学と骨粗鬆症、メディカルレビュー社。
【非特許文献８】
小竹 茂、宇田川信行、須田立雄、関節病変における破骨細胞．リウマチ科２１：１８２−１８７，１９９９。
【非特許文献９】
Ｋｏｄａｍａ Ｈ， Ｎｏｓｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１２９１−１２９４，１９９１。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
従来公知の骨代謝に関与する生理活性物質（例えば、サイトカイン）を利用した骨代謝調節関連薬剤は、免疫系への影響がある等の副作用の問題を抱えている。
【００１５】
従って、現在、骨再構築に係わる骨代謝回転を調節でき、かつ副作用の少ない薬剤が依然として求められており、かかる薬剤によって、骨代謝回転に異常をきたす疾病である骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、大理石骨病等の回復効果が期待されている。
【００１６】
また、上記したように、破骨細胞の分化促進活性のあることについてだけが判明していた上記γ−ＧＴＰについては、どのような反応経路、作用機序で破骨細胞を分化誘導させるのかが不明であった。特に、γ−ＧＴＰのサイトカインを介した破骨細胞分化に係る具体的な作用機序については全く不明であった。
【００１７】
さらには、酵素活性を備えるγ−ＧＴＰを骨代謝調節関連薬剤として用いた場合においては、酵素代謝系への副作用が懸念されること等の理由から、骨代謝回転調節に有効な薬剤としての実用化が前進していなかった。
【００１８】
そこで、本発明は、γ−ＧＴＰの破骨細胞分化誘導に係わる反応経路、作用機序を明らかにするとともに、γ−ＧＴＰを用いた、副作用の少ない骨代謝調節関連薬剤等を提供することを目的とする。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らが鋭意研究を重ねた結果、主に次の（１）〜（４）の知見を得ることができた。これらの知見は、従来全く知られていなかった新知見である。
【００２０】
（１）γ−ＧＴＰは、骨代謝異常の病変における骨破壊に係わる反応機構である「ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系」を介して、破骨細胞の分化促進作用を発揮する。即ち、γ−ＧＴＰは、破骨細胞の分化、誘導に関与する多数の反応経路、作用機序の中のＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ系を介して破骨細胞を形成する。
（２）γ−ＧＴＰは、骨髄細胞に破骨細胞分化因子であるＲＡＮＫＬと破骨細胞分化抑制因子であるＯＰＧを同時に誘導する。即ち、γ−ＧＴＰは、破骨細胞分化の促進と抑制の相反する作用を発揮する因子を同時に発現する。このため、γ−ＧＴＰは、骨代謝回転の調節を担うことができる。
（３）γ−ＧＴＰは、その酵素活性の有無に関係なく、ＲＡＮＫＬとＯＰＧを発現、誘導する。即ち、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列部位が破骨細胞分化の促進又は抑制に関与しており、酵素活性が不活化されたγ−ＧＴＰも骨代謝回転調整機能を発揮させることができる。
（４）γ−ＧＴＰは、その酵素活性の有無に関係なく、サイトカインであるＭ−ＣＳＦを、前記ＲＡＮＫＬよりも早期に発現誘導する。すなわち、γ−ＧＴＰは、破骨細胞形成に必要なＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの両サイトカインを順次発現誘導する。
【００２１】
前掲した新知見に基づいて、本発明では、まず、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列を用いることによって破骨細胞分化因子であるＲＡＮＫＬを誘導発現することを特徴とする破骨細胞分化促進剤を提供する。並びに、同アミノ酸配列を用いることによってＴＮＦ受容体ファミリーに属する液性因子ＯＰＧ（破骨細胞分化抑制因子）を誘導発現することを特徴とする破骨細胞分化抑制剤を提供する。更には、前記破骨細胞分化促進剤と破骨細胞分化抑制剤のいずれか一方又は双方を用いる骨代謝回転調整剤を提供する。
【００２２】
前掲した各手段においては、とりわけ、酵素活性を不活化したγ−ＧＴＰを用いることによって、生理条件下で酵素活性を発現させない状態で、骨代謝回転調整を行うことができる。即ち、副作用がない状態で、γ−ＧＴＰの骨代謝回転調整機能を生理条件下で発揮させることができるという有用性がある。
【００２３】
また、「骨粗鬆症」や「慢性関節リウマチ」は、破骨細胞の分化、誘導が亢進した結果生じる疾患であることから、本発明では、前記した破骨細胞分化抑制剤を少なくとも含有する骨粗鬆症治療薬、並びに慢性関節リウマチの治療薬を提供することができる。
【００２４】
さらには、「大理石骨病」は、骨吸収不全が原因となる病態であることから、本発明では、骨吸収を活性化させる作用を発揮する前記破骨細胞分化促進剤を少なくとも含有する大理石骨病治療薬を提供することができる。
【００２５】
そして、本発明では、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列には、ＲＡＮＫＬとＯＰＧを誘導発現するアミノ酸配列部分が存在することが判明したことに基づいて、前記アミノ酸配列部分を用いて行うＲＡＮＫＬとＯＰＧの両方の発現を促進又は抑制する骨代謝回転調節因子のスクリーニング方法を提供する。
【００２６】
本発明では、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列を用いることによって、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を誘導発現し、破骨細胞の分化を促進する破骨細胞分化促進剤、並びに、少なくとも該破骨細胞分化促進剤を用いる骨代謝回転調整剤を提供する。
【００２７】
これらの手段においても、とりわけ、酵素活性を不活化したγ−ＧＴＰを用いることによって、生理条件下で酵素活性を発現させない状態で、骨代謝回転調整を行うことができる。即ち、副作用がない状態で、γ−ＧＴＰの骨代謝回転調整機能を生理条件下で発揮させることができる。
【００２８】
そして、本発明では、γ−ＧＴＰの破骨細胞形成作用の阻害剤を提供する。この阻害剤は、γ−ＧＴＰとその受容体との結合を遮断又は阻害することによって、破骨細胞形成に係るシグナル伝達を止め、破骨細胞分化誘導に関与するサイトカインであるＭ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの発現誘導を抑制することができる。本阻害剤は、Ｍ−ＣＳＦやＲＡＮＫＬを直接阻害するわけではないので、免疫系に対する直接の副作用が少ないという利点があり、有用である。
【００２９】
また、本発明では、Ｍ−ＣＳＦを誘導発現するγ−グルタミルトランスペプチダーゼの酵素活性に関与しないアミノ酸配列を用いる、Ｍ−ＣＳＦの発現を抑制又は促進する骨代謝回転調節因子のスクリーニング方法を提供することができる。
【００３０】
なお、本願において「γ−ＧＴＰ」とは、全ての脊椎動物のγ−ＧＴＰを含むものである。既に、ヒト（Ｇｅｎｅ，７３，ｐ１（１９８８））、マウス（Ｇｅｎｅ，１６７，ｐ２３３（１９９５））、ラット（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，ｐ９３７（１９８６））等、脊椎動物のγ−ＧＴＰのｃＤＮＡがクローニングされている。
【００３１】
そして、マウスとラットのγ−ＧＴＰでは約９０％のホモロジーを、またヒトとラットのγ−ＧＴＰでは約８０％のホモロジーを有しており、種間で非常に高いホモロジーを有することが分かっている。従って、前記文献等において開示された塩基配列よりγ−ＧＴＰに特異的なプライマーあるいはプローブを作製し、該プライマーあるいはプローブを用いて脊椎動物の種々のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明のγ−ＧＴＰを容易にクローニングすることができる。
【００３２】
これらクローニングの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に詳しく述べられており、具体的には、ハイブリダイゼーションを用いる方法、あるいはＰＣＲを用いる方法等が挙げられる。また、クローニングされたｃＤＮＡの発現ベクターへの挿入、および該発現ベクターの原核性生物細胞または真核性生物細胞への導入は、いずれも前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ Ｅｄｔ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に従い、当業者ならば容易に行える状況にある。さらに、上記発現ベクター導入細胞の培養上清中に産生されたγ−ＧＴＰは、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法等によって、容易に精製することができる。
【００３３】
【実験例】
＜γ−ＧＴＰの酵素活性の不活化方法に係わる実施例＞
ラット精製γ−ＧＴＰ（０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に、Ａｃｉｖｉｃｉｎ（α−ａｍｉｎｏ−３−ｃｈｌｏｒｏ−５−ｉｓｏｘａｚｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を終濃度１ｍＭになるように加え、室温で３０分間反応させた。更に１ｍＭのＡｃｉｖｉｃｉｎを加え、室温で３０分間反応させた。
【００３４】
その後、未反応のＡｃｉｖｉｃｉｎをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムで、ＰＢＳを溶媒としてゲル濾過により除いた。γ−ＧＰＴの活性と蛋白質量を測定して、活性の無いことを確認して、以下の実験に用いた。
【００３５】
γ−ＧＴＰの酵素活性の測定は、Ｎ−（ＤＬ−γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ）ａｎｉｌｉｎｅ（Ｉ）を基質にし、アクセプターとしてアミノ酸（ＩＩ）を加え、反応生成物のアゾ色素を比色するという方法やγ−ＧＴ４１９（アスカ・シグマ）キット（ＳＩＧＭＡ ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ）を用いる方法によって測定した。ラットγ−ＧＴＰをＬ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリドとグリシルグリシンを基質として、３７℃で反応させ、生じたＬ−γ−グルタミルグリシルグリシンと５−アミノ−２−ニトロ−安息香酸のうち、後者を４０５ｎｍの吸光度計で測定した。反応時間に対する吸光度の増加からγ−ＧＴＰ活性を算出した。
【００３６】
＜酵素活性を不活化したγ−ＧＴＰの破骨細胞誘導活性の検証＞
マウス骨髄細胞培養系に１／１０量の１２５ｎｇ酵素活性不活化γ−ＧＴＰを添加して、１０−８Ｍの活性型ビタミンＤ｛１．２５（ＯＨ）２Ｄ３｝の存在下、非存在下の両方の条件で、破骨細胞誘導実験を行った。
【００３７】
その結果を図１に示す。この図１に示されているように、ＴＲＡＰ陽性細胞を破骨細胞として顕微鏡下で計測したところ、破骨細胞数は不活型γ−ＧＴＰの添加でビタミンＤの存在下にかかわらず増加した。この結果は、不活型γ−ＧＴＰが破骨細胞を分化、誘導できることを示している。また、ビタミンＤは、不活型γ−ＧＴＰの破骨細胞の分化誘導を促進していることが分かる。
【００３８】
＜破骨細胞誘導に関する実験＞
マウス骨髄細胞の調製。６−１２週令のＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（日本エスエルシー社）の大腿骨及び頚骨を無菌的に摘出し、それらの骨端を切除してから両端から１回ずつ２６Ｇの針を突き刺して１ｍｌの培地（α−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ，１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む。）で骨髄細胞を押し出して、細胞塊をピペティングした。その後、メッシュ（セルストレーナー：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で組織残渣を除いてから細胞数（２×１０６個細胞／ｍｌ）を調製して「マウス骨髄細胞」とした。
【００３９】
＜破骨細胞誘導系＞
前記マウス骨髄細胞を９６ｗｅｌｌ−プレートに１ｗｅｌｌ／１８０μｌ添加し、それに２０μｌのサンプル（γ−ＧＴＰ等）を添加して培養を開始した。３日目に培地の３／４を交換して、前記サンプルも同量を添加し、更に４日間培養した。
【００４０】
＜ＴＲＡＰ染色＞
このＴＲＡＰ染色は、破骨細胞の同定法の１つであり、破骨細胞のマーカーであるＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）を基質で染色する方法である。上記の破骨細胞誘導系（プレート）の細胞をアセトンークエン酸で固定し、酒石酸存在下で、基質（Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ−ＭＸ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と色素（Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ ｓａｌｔ）を３７℃で３０分間反応させて染色した。この反応はＰＢＳで反応液を洗い流して乾燥させることによって停止させた（Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，１３７３，１９８８）。
【００４１】
＜γ−ＧＴＰによるＲＡＮＫＬとＯＰＧの発現誘導＞
上記破骨細胞誘導系でγ−ＧＴＰを添加してから７日後に、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）で細胞を溶解させ、全ＲＮＡを回収した。そのＲＮＡをテンプレートにして、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔｔｈキット：東洋紡）を行い、目的の遺伝子を検出した。ＰＣＲプライマーはコントロールとして、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、増幅されるＤＮＡサイズは９８３ｂｐ、センス：５’−ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＣ−３’、アンチセンス：５’−ＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ−３’を用いた。
【００４２】
マウスのＲＡＮＫＬとＯＰＧは、以下のプライマーを用いて、９４℃で１分間、６０℃で１．５分間を４０サイクル行い、３％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチレンブロマイドにより染色して目的の遺伝子断片を検出した。
【００４３】
マウスのＲＡＮＫＬ増幅されるＤＮＡサイズは５８６ｂｐ、センス：５’−ＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧ−３’、アンチセンス：５’−ＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡ ＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧ−３’。マウスのＯＰＧ増幅されるＤＮＡサイズは６３１ｂｐ、センス：５’−ＡＣＡＣＣＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＴＧ−３’、アンチセンス：５’−ＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡ ＣＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧ−３’。
【００４４】
結果は図２に示したように、１のコントロールはビタミンＤのみ、２はビタミンＤにγ−ＧＴＰを添加して培養した細胞であるところ、明らかに、γ−ＧＴＰの添加によって、ＲＡＮＫＬとＯＰＧの遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が増幅されていることがわかる。
【００４５】
＜γ−ＧＴＰ誘導破骨細胞のＯＰＧによる阻害の検証＞
上記破骨細胞誘導系で、γ−ＧＴＰとＲＡＮＫＬのアンタゴニストであるＯＰＧを用量依存的に添加した。培養７日後にＴＲＡＰ染色し、破骨細胞数を比較した（図３参照）。
【００４６】
図３に示すように、ＯＰＧの添加量の増大に従い破骨細胞数の減少現象が認められた。具体的には、γ−ＧＴＰによりＲＡＮＫＬが蛋白質として発現し、このＲＡＮＫＬ蛋白質の作用が、共存しているＯＰＧ蛋白質によって阻害されたことによって、破骨細胞の形成が減少したことを表している。
【００４７】
＜γ−ＧＴＰ及び酵素活性不活化γ−ＧＴＰによるＲＡＮＫＬとＯＰＧの同時発現誘導の検証＞
上記同様に、上記破骨細胞誘導系で、不活型γ−ＧＴＰ（１２５ｎｇ）及びγ−ＧＴＰ（１２５ｎｇ）で処理した細胞におけるＲＡＮＫＬとＯＰＧのｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法により検討した（図４参照）。不活型γ−ＧＴＰ及び活性型γ−ＧＴＰ（酵素活性を有するγ−ＧＴＰ）の両方で、ＲＡＮＫＬとＯＰＧが同時に発現していることが示された。これは、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列部分が、ＲＡＮＫＬとＯＰＧの双方の発現に関与していることを実証するものである。
【００４８】
＜ＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧの発現を誘導するγ−ＧＴＰのアミノ酸配列のスクリーニング法に係わる実施例＞
目的のアミノ酸配列はγ−ＧＴＰ分子の表面に存在すると予測されるので、γ−ＧＴＰのアミノ酸配列より、親水性となる５残基から１５残基のペプチド配列を検索して、合成する。そのペプチドを、上記破骨細胞誘導系に添加して破骨細胞の形成を指標として、スクリーニングすることができる。
【００４９】
また、５−７日間反応させた破骨細胞誘導系の細胞のＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧのｍＲＮＡの発現を上記段落００２９に記載の方法によって、スクリーニングを行うことができる。
【００５０】
更には、抗γ−ＧＴＰ抗体は、γ−ＧＴＰ酵素活性は抑制しないが、破骨細胞の誘導を抑制することが知られているので、上記親水性のペプチド配列と抗γ−ＧＴＰ抗体との結合性を指標としたスクリーニング方法（例えば、ペプチドを標識した結合実験、Ｂｉａｃｏｒｅ等の分子間結合を検出する方法）も実施できる。
【００５１】
＜ＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧの発現を抑制する物質のスクリーニング法の実施例＞
ＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧの発現を誘導するペプチドまたは、γ−ＧＴＰを上記段落００２６に記載の破骨細胞誘導系に添加して、ＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧを発現誘導させるスクリーニング系に種々の物質を添加して、ＲＡＮＫＬ及び／又はＯＰＧの発現を抑制する物質を探すことができる。
【００５２】
＜γ−ＧＴＰとＭ−ＣＳＦの関係を検証する実験＞
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる、γ−ＧＴＰ添加時のＭ−ＣＳＦｍＲＮＡの定量実験を行い、Ｍ−ＣＳＦｍＲＮＡ量の変化を測定した。
【００５３】
具体的には、ＳＴ２細胞を１０ｃｍディッシュで培養し、γ−ＧＴＰをｆｉｎａｌ １μｇ／ｍｌで添加し、２４時間後に全ＲＮＡを回収した。その後、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅにかけるときのテンプレートとなるｃＤＮＡを１μｇのＲＮＡから、ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒを使用した逆転写反応により調製した（プロメガのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲｎａｓｅＨ（−），ＰｏｉｎｔＭｕｔａｎｔを使用）。
【００５４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでの反応は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉを使用し、Ｍ−ＣＳＦ特異的プライマーとして、Ｆｏｗａｒｄ：ＣＣＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＡ（１１９９−１２１７）、Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＡＧＣＡＧＴＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＣＧＧＧ（１２６６−１２４６）を使用した。ＰＣＲ生産物としては、６７ｂｐのものができており、これについて融点曲線解析を行ったところ、プライマーダイマーではないことを確認した。なお、ＰＣＲサイクル時のプログラムは、９５℃，１５ｓ、７５℃，１０ｓ、７２℃，４ｓである。
【００５５】
実験結果を図５に示す。この図５からわかるように、γ−ＧＴＰ添加（＋）して２４時間後には、Ｍ−ＣＳＦｍＲＮＡ量が、γ−ＧＴＰ未添加（−）の場合よりも２．５倍増加した。なお、図５中の縦軸の単位は、「倍」である。
【００５６】
この実験結果から、γ−ＧＴＰは、サイトカインであるＭ−ＣＳＦを発現誘導すること明らかになった。しかも、γ−ＧＴＰは、添加２４時間後にＭ−ＣＳＦを発現誘導し、前記ＲＡＮＫＬよりも早期に発現誘導する。このように、γ−ＧＴＰは、破骨細胞形成に必要なＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの両サイトカインを順次発現誘導することがわかった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明によれば、不活化されたγ−ＧＴＰやγ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列部分（ペプチド断片）を用いたことを特徴とする、生理条件下で副作用の少ない破骨細胞分化促進剤又は破骨細胞分化抑制剤及びこれらを用いる骨代謝回転調節剤を提供することができる。また、前記破骨細胞分化抑制剤を少なくとも含有する、副作用がなく有用な骨粗鬆症治療薬並びに慢性関節リウマチの治療薬を提供することができる。
【００５８】
大理石骨病は、骨吸収不全が原因となる病態であることから、骨吸収を活性化させる作用を発揮する前記破骨細胞分化促進剤を少なくとも含有する大理石骨病治療薬を提供することができる。
【００５９】
γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列には、ＲＡＮＫＬとＯＰＧを誘導発現するアミノ酸配列部分が存在することが判明したことに基づいて、同アミノ酸配列部分を用いて行うＲＡＮＫＬとＯＰＧの両方を発現抑制する骨代謝回転調節因子のスクリーニング方法を提供することができる。
【００６０】
γ−ＧＴＰは、その酵素活性の有無に関係なく、サイトカインであるＭ−ＣＳＦを、前記ＲＡＮＫＬよりも早期に発現誘導すること明らかにしたことに基づいて、γ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列を用いることによって、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を誘導発現し、破骨細胞の分化を促進する破骨細胞分化促進剤、並びに、少なくともこの破骨細胞分化促進剤を用いる骨代謝回転調整剤を提供することができる。酵素活性を不活化したγ−ＧＴＰを用いることによって、生理条件下で酵素活性を発現させない状態で、骨代謝回転調整を行うことができる。即ち、副作用がない状態で、γ−ＧＴＰの骨代謝回転調整機能を生理条件下で発揮させることができるので有用である。
【００６１】
本発明では、γ−ＧＴＰの破骨細胞形成作用の阻害剤を提供することができる。この阻害剤は、γ−ＧＴＰとその受容体との結合を遮断又は阻害することによって、破骨細胞形成に係るシグナル伝達を止め、破骨細胞分化誘導に関与するサイトカインであるＭ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬの発現誘導を抑制することができる。本阻害剤は、Ｍ−ＣＳＦやＲＡＮＫＬを直接阻害するわけではないことから、免疫系に対する直接の副作用が少ないという利点があり、有用である。
【００６２】
また、本発明では、Ｍ−ＣＳＦを誘導発現するγ−ＧＴＰの酵素活性に関与しないアミノ酸配列を用いる、Ｍ−ＣＳＦの発現を抑制又は促進する骨代謝回転調節因子のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素活性を不活化したγ−ＧＴＰの破骨細胞誘導活性の検証実験の結果を示す図
【図２】γ−ＧＴＰの添加によって、ＲＡＮＫＬとＯＰＧの遺伝子（ｍＲＮＡ）の発現が増幅されていることを示す図
【図３】ＯＰＧの添加量の増大に従い破骨細胞数が減少することを示す図
【図４】破骨細胞誘導系で、不活型γ−ＧＴＰ（１２５ｎｇ）及びγ−ＧＴＰ（１２５ｎｇ）で処理した細胞のＲＡＮＫＬとＯＰＧのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で検討した結果を示す図。
【図５】ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒによる、γ−ＧＴＰ添加時のＭ−ＣＳＦｍＲＮＡの定量実験の測定結果を示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a technique related to regulation of bone turnover based on an osteoclast differentiation-inducing action or an osteoclast differentiation-inhibiting action of γ-glutamyl transpeptidase.
[0002]
[Prior art]
BACKGROUND ART Bone always performs “bone remodeling” in which bone resorption by osteoclasts and bone formation based on information transmission between osteoblasts are repeated. This bone remodeling is considered to be a complex process involving many factors such as cytokines and hormones.In normal bone remodeling, bone resorption and bone formation are almost equal, and changes in bone mass Does not occur.
[0003]
However, when “osteoporosis” or “rheumatoid arthritis” develops, bone loss is seen because bone resorption exceeds bone formation. On the other hand, osteopetrosis is a condition caused by bone resorption, in which the differentiation of osteoclasts is abnormal and there is no osteoclast in bone tissue, or the function of osteoclasts is abnormal. It is thought that it occurs when bone resorption cannot be performed.
[0004]
γ-glutamyl transpeptidase (hereinafter abbreviated as “γ-GTP”) is an enzyme that catalyzes a reaction that hydrolyzes a γ-glutamyl peptide and transfers a γ-glutamyl group to another peptide or amino acid. Is involved in glutathione metabolism. Although the specific mechanism of action of this γ-GTP has not been completely clarified, it has been revealed by the present inventors that the γ-GTP has the activity of promoting osteoclast differentiation (see Patent Document 1). ).
[0005]
Further, to date, as a factor that has an effect on bone resorption, parathyroid hormone, parathyroid hormone-related protein, thyroid hormone, 1,25-hydroxyvitamin D, interleukin-1, TNF (tumor necrosis factor) , M-CSF (Macrophage colony-stimulating factor), GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), TGF-β (transforming growth factor β), prostaglandin and the like are known.
[0006]
On the other hand, estrogen, androgen, calcitonin, interferon γ, interleukin-4, TGF-β and the like are known as factors which act on bone resorption in a suppressed manner, and furthermore, tumor necrosis factor (abbreviated as TNF). ) A humoral factor (osteoprotegerin, abbreviated as OPG) belonging to the receptor family has been identified as a factor that suppresses osteoclasts (see Non-Patent Documents 1 and 2).
[0007]
The osteoclast differentiation factor (receptor activator of NF-κB ligand, abbreviated as RANKL) is identified as a membrane-bound cytokine that binds to OPG (see Non-Patent Documents 3 and 4). OPG is thought to regulate osteoclast differentiation by competitively inhibiting the binding between RANKL and its receptor, an osteoclast differentiation factor (NF-κB, abbreviated as RANK).
[0008]
The results of experiments using knockout mice of the RANKL / RANK system suggest that the RANKL / RANK system plays a role in physiological osteoclast formation (Non-Patent Document 5, Non-Patent Document 6). reference). At present, various physiologically active substances such as cytokines (IL-1, IL-11, etc.), hormones (PTH, etc.) and prostaglandins are involved in the formation of osteoclasts via the RANKL / RANK system. (See Non-Patent Document 7).
[0009]
On the other hand, there is a finding that the RANKL / RANK system is not involved in the differentiation induction of all osteoclasts. For example, there is a report that IL-1 and TNFα also exert the action of directly inducing osteoclast differentiation without involving the RANKL / RANK system. That is, it is considered that a plurality of mechanisms are involved in bone destruction in a lesion with abnormal bone metabolism (see Non-Patent Document 8).
[0010]
The above-mentioned M-CSF (also known as CSF-1), which is one of the factors that act on bone resorption in a promoting manner, acts on monocyte progenitor cells in bone marrow to promote differentiation into monocytes ( It is generally known to have a function of activating monocytes and macrophages and concomitantly increasing neutrophils, antitumor activity, antifungal action, etc. I have.
[0011]
Op / op mice lacking this M-CSF lack osteoclasts and macrophages, but administration of recombinant M-CSF dramatically increases osteoclasts and initiates bone resorption. It has been clarified that M-CSF derived from stromal cells is indispensable for the differentiation of (Non-Patent Document 9).
[0012]
Patent Document 2 discloses that vascular endothelial growth factor (VEGF) has an activity of promoting the formation and survival of osteoclasts, and vascular endothelial growth factor receptor type 1 (VEGFR- It is disclosed that by inhibiting the activation of 1), osteoclasts can be reduced.
[0013]
[Patent Document 1]
JP-A-10-87507.
[Patent Document 2]
JP-A-2001-86982.
[Non-patent document 1]
Simonet, W.C. S. Et al., Cell, 89: 309-319, 1997.
[Non-patent document 2]
Yasuda, H et al., Endocrinology, 139: 1329-1337, 1998.
[Non-Patent Document 3]
Yasuda, H et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA, 95: 3597-3602, 1998.
[Non-patent document 4]
Racey, D.M. L et al., Cell, 93: 165-176, 1998.
[Non-Patent Document 5]
Li, J et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ScL USA, 97: 1566-1571, 2000.
[Non-Patent Document 6]
Dougall, W, C et al., Genes. Dev. 13: 2412-2424, 1999.
[Non-Patent Document 7]
New molecular bone metabolism and osteoporosis, Medical Review.
[Non-Patent Document 8]
Kotake Shigeru, Udagawa Nobuyuki, Suda Tatsuo, Osteoclasts in joint lesions. Rheumatology 21: 182-187, 1999.
[Non-Patent Document 9]
Kodama H, Nose M et al. : Essential role of macrophage colony-stimulating factor in theosteoblast differentiation supported by structural cells. J Exp Med 173: 1291-1294, 1991.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally known bone metabolism regulation-related drugs utilizing physiologically active substances (eg, cytokines) involved in bone metabolism have a problem of side effects such as an influence on the immune system.
[0015]
Therefore, at present, there is still a need for a drug capable of regulating bone turnover related to bone remodeling and having few side effects. Such a drug causes osteoporosis, rheumatoid arthritis, and marble bone, which are abnormal diseases of bone turnover. It is expected to have a recovery effect on diseases and the like.
[0016]
In addition, as described above, regarding the above-mentioned γ-GTP, which has only been known to have osteoclast differentiation promoting activity, what kind of reaction pathway and mechanism of action induces osteoclast differentiation is determined. It was unknown. In particular, the specific mechanism of the action of γ-GTP on osteoclast differentiation mediated by cytokines was completely unknown.
[0017]
Furthermore, when γ-GTP having enzymatic activity is used as a drug related to bone metabolism regulation, practical use as a drug effective for regulation of bone turnover is possible due to concerns about side effects on the enzyme metabolic system. Was not progressing.
[0018]
Accordingly, the present invention aims to clarify the reaction pathway and action mechanism involved in the induction of osteoclast differentiation of γ-GTP, and to provide a bone metabolic regulation-related drug and the like using γ-GTP with few side effects. Aim.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies conducted by the inventors of the present application, the following findings (1) to (4) were mainly obtained. These findings are new findings that have never been known before.
[0020]
(1) γ-GTP exerts an osteoclast differentiation promoting effect via the “RANKL / RANK system” which is a reaction mechanism related to bone destruction in a lesion of abnormal bone metabolism. That is, γ-GTP forms osteoclasts via the RANKL / RANK system among many reaction pathways and mechanisms involved in osteoclast differentiation and induction.
(2) γ-GTP simultaneously induces RANKL, an osteoclast differentiation factor, and OPG, an osteoclast differentiation inhibitor, in bone marrow cells. That is, γ-GTP simultaneously expresses a factor that exerts an opposing action of promoting and suppressing osteoclast differentiation. Therefore, γ-GTP can play a role in regulating bone turnover.
(3) γ-GTP expresses and induces RANKL and OPG regardless of the presence or absence of its enzymatic activity. That is, an amino acid sequence site not involved in the enzyme activity of γ-GTP is involved in promotion or suppression of osteoclast differentiation, and γ-GTP in which the enzyme activity is inactivated can also exert a bone turnover regulating function. it can.
(4) γ-GTP induces the expression of M-CSF, a cytokine, earlier than the above-mentioned RANKL, regardless of the presence or absence of its enzymatic activity. That is, γ-GTP sequentially induces the expression of both M-CSF and RANKL cytokines necessary for osteoclast formation.
[0021]
Based on the above-mentioned new findings, the present invention first provides osteoclast differentiation characterized by inducing and expressing RANKL, an osteoclast differentiation factor, by using an amino acid sequence not involved in the enzyme activity of γ-GTP. Provide an accelerator. Also provided is an osteoclast differentiation inhibitor characterized by inducing and expressing a humoral factor OPG (osteoclast differentiation inhibitory factor) belonging to the TNF receptor family by using the same amino acid sequence. Furthermore, the present invention provides a bone turnover regulator using one or both of the above-mentioned osteoclast differentiation promoter and osteoclast differentiation inhibitor.
[0022]
In each of the above-mentioned means, in particular, by using γ-GTP in which the enzyme activity is inactivated, the bone turnover can be adjusted without expressing the enzyme activity under physiological conditions. That is, there is utility that γ-GTP can exert the bone turnover regulating function under physiological conditions without side effects.
[0023]
In addition, since “osteoporosis” and “rheumatoid arthritis” are diseases caused as a result of enhanced differentiation and induction of osteoclasts, the present invention provides a therapeutic agent for osteoporosis containing at least the above-mentioned osteoclast differentiation inhibitor. And a therapeutic agent for rheumatoid arthritis.
[0024]
Furthermore, since "marble bone disease" is a pathological condition caused by bone resorption insufficiency, in the present invention, marble bone containing at least the osteoclast differentiation promoting agent exhibiting an action of activating bone resorption is provided. An agent for treating a disease can be provided.
[0025]
In the present invention, based on the fact that an amino acid sequence that is not involved in the enzyme activity of γ-GTP has been found to have an amino acid sequence portion that induces and expresses RANKL and OPG, it is performed using the amino acid sequence portion. A method for screening a bone turnover regulator that promotes or suppresses the expression of both RANKL and OPG is provided.
[0026]
In the present invention, an osteoclast differentiation promoter that induces and expresses M-CSF (macrophage colony stimulating factor) and promotes osteoclast differentiation by using an amino acid sequence that is not involved in the enzyme activity of γ-GTP, and And a bone turnover regulator using at least the osteoclast differentiation promoting agent.
[0027]
In these means, especially, by using γ-GTP in which the enzyme activity is inactivated, it is possible to adjust bone turnover without expressing the enzyme activity under physiological conditions. That is, the bone turnover regulating function of γ-GTP can be exerted under physiological conditions without side effects.
[0028]
And in this invention, the inhibitor of the osteoclast-forming action of (gamma) -GTP is provided. This inhibitor blocks or inhibits the binding of γ-GTP to its receptor, thereby stopping signal transmission related to osteoclast formation, and M-CSF and RANKL, which are cytokines involved in induction of osteoclast differentiation. Can be suppressed. Since this inhibitor does not directly inhibit M-CSF or RANKL, it has an advantage that it has few direct side effects on the immune system and is useful.
[0029]
The present invention also provides a method for screening a bone turnover regulator that suppresses or promotes M-CSF expression, using an amino acid sequence that is not involved in the enzymatic activity of γ-glutamyl transpeptidase that induces and expresses M-CSF. be able to.
[0030]
In the present application, “γ-GTP” includes γ-GTP of all vertebrates. Already, human (Gene, 73, p1 (1988)), mouse (Gene, 167, p233 (1995)), rat (Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 83, p937 (1986)) and other vertebrate animals The cDNA for γ-GTP has been cloned.
[0031]
The mouse and rat γ-GTPs have about 90% homology, and the human and rat γ-GTPs have about 80% homology, indicating that they have very high homology between species. I have. Therefore, by preparing primers or probes specific to γ-GTP from the nucleotide sequences disclosed in the above-mentioned documents and the like, and screening various vertebrate cDNA libraries using the primers or probes, the present invention γ-GTP can be easily cloned.
[0032]
These cloning methods are described, for example, in Molecular Cloning 2 nd Edt. It is described in detail in Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like, and specifically includes a method using hybridization, a method using PCR, and the like. In addition, insertion of the cloned cDNA into an expression vector and introduction of the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic cell can be performed by using the above-mentioned Molecular Cloning 2 method. nd Edt. In accordance with Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like, those skilled in the art can easily do this. Furthermore, γ-GTP produced in the culture supernatant of the expression vector-introduced cells can be easily purified by a known method using zinc chelate agarose, concanavalin A agarose, Sephadex G-150, or the like. .
[0033]
[Experimental example]
<Example relating to method for inactivating enzyme activity of γ-GTP>
Acivicin (α-amino-3-chloro-5-isoxazoleacetic acid) was added to rat purified γ-GTP (0.5 mg / ml, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0) to a final concentration of 1 mM, and room temperature was added. For 30 minutes. Further, 1 mM Acivicin was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
[0034]
Thereafter, unreacted Acivicin was removed by gel filtration on a Sephadex G-25 column using PBS as a solvent. The activity of γ-GPT and the amount of protein were measured to confirm that there was no activity, and used in the following experiments.
[0035]
The enzyme activity of γ-GTP can be measured by using N- (DL-γ-glutamyl) aniline (I) as a substrate, adding an amino acid (II) as an acceptor, and colorimetrically measuring an azo dye as a reaction product. -Measured by a method using a GT419 (Asuka Sigma) kit (SIGMA DIAGNOSTICS). Rat γ-GTP was reacted at 37 ° C. with L-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide and glycylglycine as substrates, and the resulting L-γ-glutamylglycylglycine and 5-amino-2-nitro- Among the benzoic acids, the latter was measured with a 405 nm absorbance meter. Γ-GTP activity was calculated from the increase in absorbance with respect to the reaction time.
[0036]
<Verification of osteoclast-inducing activity of γ-GTP with inactivated enzyme activity>
1/10 volume of 125 ng enzyme inactivated γ-GTP was added to the mouse bone marrow cell culture system, -8 Active vitamin D of M の 1.25 (OH) 2 D 3 An osteoclast induction experiment was performed in both the presence and absence of｝.
[0037]
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, when the TRAP-positive cells were measured under a microscope as osteoclasts, the number of osteoclasts increased with the addition of inactive γ-GTP regardless of the presence of vitamin D. . This result indicates that inactive γ-GTP can differentiate and induce osteoclasts. In addition, it can be seen that vitamin D promotes the induction of osteoclast differentiation by inactive γ-GTP.
[0038]
<Experiment on osteoclast induction>
Preparation of mouse bone marrow cells. The femur and tibia of a 6-12-week-old C3H / HeJ mouse (Japan SLC, Inc.) are aseptically removed, their epiphyses are resected, and a 26-G needle is pierced once from each end to 1 ml. Bone marrow cells were extruded with a medium (containing α-MEM, 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin), and the cell mass was pipetted. Then, after removing the tissue residue with a mesh (Cell Strainer: BD Bioscience), the cell number (2 × 10 6 (Cells / ml) was prepared as "mouse bone marrow cells".
[0039]
<Osteoclast induction system>
The above mouse bone marrow cells were added to a 96-well plate at 1 well / 180 μl, and 20 μl of a sample (γ-GTP or the like) was added thereto to start culture. On the third day, 3/4 of the medium was replaced, the same amount of the sample was added, and the cells were further cultured for 4 days.
[0040]
<TRAP staining>
This TRAP staining is one of the methods for identifying osteoclasts, and is a method of staining TRAP (tartrate-resistant acid phosphatase), a marker for osteoclasts, with a substrate. The cells of the above-described osteoclast-inducing system (plate) are fixed with acetone-citric acid, and a substrate (Naphthol AS-MX phosphate) and a dye (Fast red violet salt) are reacted at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of tartaric acid. And stained. The reaction was stopped by rinsing and drying the reaction with PBS (Endcrinology, 122, 1373, 1988).
[0041]
<Induction of RANKL and OPG expression by γ-GTP>
Seven days after the addition of γ-GTP in the above-described osteoclast-inducing system, the cells were lysed with ISOGEN (Nippon Gene), and total RNA was recovered. Using the RNA as a template, RT-PCR (Tth kit: Toyobo) was performed to detect the target gene. GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) was used as a PCR primer as a control, the DNA size to be amplified was 983 bp, sense: 5′-TGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGC-3 ′, and antisense: 5′-CATGGTAGCCATCGCTGCGGTCAGCTGCGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGAGCGATCGGCGCATCGCTGCGGTCGAGG
[0042]
Mouse RANKL and OPG were subjected to 40 cycles of 94 ° C. for 1 minute and 60 ° C. for 1.5 minutes for 40 cycles using the following primers, separated by 3% agarose gel electrophoresis, and stained with ethylene bromide. Gene fragments were detected.
[0043]
RANKL of mouse The DNA size to be amplified is 586 bp, sense: 5'-ACACCTGGAATGAAGAAGAATAAATG-3 ', antisense: 5'-AGCCACTACTACCA CAGAGATGGAAG-3'. Mouse OPG DNA size to be amplified is 631 bp, sense: 5'-ACACCTGGAATGAAGAAGAATAAATG-3 ', antisense: 5'-AGCCACTACTACCA CAGAGATGGAAG-3'.
[0044]
As shown in FIG. 2, the control of 1 was vitamin D alone, and 2 was cells cultured by adding γ-GTP to vitamin D. It was apparent that RANKL and OPG were added by the addition of γ-GTP. It can be seen that the expression of the gene (mRNA) was amplified.
[0045]
<Verification of inhibition of γ-GTP-induced osteoclast by OPG>
In the above-described osteoclast-inducing system, OPG, an antagonist of γ-GTP and RANKL, was added in a dose-dependent manner. After 7 days of culture, TRAP staining was performed to compare the number of osteoclasts (see FIG. 3).
[0046]
As shown in FIG. 3, a decrease in the number of osteoclasts was observed with an increase in the amount of OPG added. Specifically, it indicates that RANKL was expressed as a protein by γ-GTP, and the action of this RANKL protein was inhibited by the coexisting OPG protein, thereby reducing osteoclast formation.
[0047]
<Verification of co-expression induction of RANKL and OPG by γ-GTP and enzyme activity inactivated γ-GTP>
Similarly, the expression of RANKL and OPG mRNA in cells treated with inactive γ-GTP (125 ng) and γ-GTP (125 ng) in the osteoclast induction system was examined by RT-PCR ( (See FIG. 4). It was shown that both inactive γ-GTP and active γ-GTP (γ-GTP having enzymatic activity) express RANKL and OPG simultaneously. This demonstrates that the amino acid sequence portion not involved in the enzyme activity of γ-GTP is involved in the expression of both RANKL and OPG.
[0048]
<Example relating to screening method of amino acid sequence of γ-GTP that induces expression of RANKL and / or OPG>
Since the target amino acid sequence is predicted to be present on the surface of the γ-GTP molecule, a peptide sequence of 5 to 15 residues that becomes hydrophilic is searched from the amino acid sequence of γ-GTP and synthesized. The peptide can be added to the above-described osteoclast-inducing system and screened using osteoclast formation as an indicator.
[0049]
In addition, the expression of RANKL and / or OPG mRNA in cells of the osteoclast-inducing system reacted for 5 to 7 days can be screened by the method described in the above paragraph 0029.
[0050]
Furthermore, since anti-γ-GTP antibody does not suppress γ-GTP enzyme activity, but is known to suppress osteoclast induction, the above-mentioned hydrophilic peptide sequence and anti-γ-GTP antibody Screening methods using binding as an index (for example, peptide-labeled binding experiments, methods for detecting intermolecular binding such as Biacore) can also be performed.
[0051]
<Example of screening method for substance that suppresses expression of RANKL and / or OPG>
A peptide that induces the expression of RANKL and / or OPG or γ-GTP is added to the osteoclast induction system described in the above paragraph 0026, and various substances are added to the screening system that induces the expression of RANKL and / or OPG. Then, a substance that suppresses the expression of RANKL and / or OPG can be searched for.
[0052]
<Experiment to verify the relationship between γ-GTP and M-CSF>
A Quantitative experiment of M-CSF mRNA when γ-GTP was added was performed by LightCycler, and the change in the amount of M-CSF mRNA was measured.
[0053]
Specifically, ST2 cells were cultured in a 10 cm dish, γ-GTP was added at a final concentration of 1 μg / ml, and 24 hours later, total RNA was recovered. Thereafter, cDNA as a template for LightCycle was prepared from 1 μg of RNA by a reverse transcription reaction using a random hexamer (using Promega's M-MLV reverse transcriptase, RnaseH (-), PointMutant).
[0054]
The reaction using LightCycler was performed using FastStart DNA Master SYBR Green I, and M-CSF-specific primers as Forward: CCCATATTGCGACACCGAA (1199-1217), and Reverse: AAGCAGTACACTGAGCAGGG. As a PCR product, a product of 67 bp was prepared, and a melting point curve analysis was performed on this product. As a result, it was confirmed that the product was not a primer dimer. The program in the PCR cycle is 95 ° C., 15 s, 75 ° C., 10 s, 72 ° C., 4 s.
[0055]
The experimental results are shown in FIG. As can be seen from FIG. 5, 24 hours after the addition of γ-GTP (+), the amount of M-CSF mRNA increased 2.5-fold compared to the case without γ-GTP added (−). The unit of the vertical axis in FIG. 5 is “times”.
[0056]
These experimental results revealed that γ-GTP induces the expression of cytokine M-CSF. Moreover, γ-GTP induces the expression of M-CSF 24 hours after the addition, and induces the expression earlier than the above-mentioned RANKL. Thus, it was found that γ-GTP sequentially induces the expression of both M-CSF and RANKL cytokines necessary for osteoclast formation.
[0057]
【The invention's effect】
According to the present invention, osteoclast differentiation with reduced side effects under physiological conditions, characterized by using inactivated γ-GTP or an amino acid sequence portion (peptide fragment) not involved in the enzyme activity of γ-GTP. An accelerator or an osteoclast differentiation inhibitor and a bone turnover regulator using the same can be provided. In addition, a useful therapeutic agent for osteoporosis and a therapeutic agent for rheumatoid arthritis, which contains at least the osteoclast differentiation inhibitor and has no side effects, can be provided.
[0058]
Since osteopetrosis is a pathological condition caused by bone resorption insufficiency, it is possible to provide a therapeutic agent for osteopetrosis containing at least the osteoclast differentiation promoting agent exhibiting an action of activating bone resorption. .
[0059]
Based on the finding that an amino acid sequence that is not involved in the enzyme activity of γ-GTP has an amino acid sequence portion that induces and expresses RANKL and OPG, both RANKL and OPG performed using the same amino acid sequence portion were determined. It is possible to provide a method for screening a bone turnover regulatory factor whose expression is suppressed.
[0060]
Based on the finding that γ-GTP induces the expression of the cytokine M-CSF earlier than the above-mentioned RANKL, regardless of the presence or absence of the enzyme activity, amino acids not involved in the enzyme activity of γ-GTP Use of the sequence induces and expresses M-CSF (macrophage colony stimulating factor) and promotes osteoclast differentiation, and at least bone turnover using the osteoclast differentiation promoter A conditioning agent can be provided. By using γ-GTP in which the enzyme activity is inactivated, it is possible to adjust bone turnover under physiological conditions without expressing the enzyme activity. That is, it is useful because γ-GTP can exert its bone turnover regulating function under physiological conditions without side effects.
[0061]
In the present invention, an inhibitor of the osteoclast-forming effect of γ-GTP can be provided. This inhibitor blocks or inhibits the binding of γ-GTP to its receptor, thereby stopping signal transmission related to osteoclast formation, and M-CSF and RANKL, which are cytokines involved in induction of osteoclast differentiation. Can be suppressed. Since this inhibitor does not directly inhibit M-CSF or RANKL, it has an advantage that it has few direct side effects on the immune system and is useful.
[0062]
Further, the present invention provides a method for screening a bone turnover regulator that suppresses or promotes M-CSF expression, using an amino acid sequence that is not involved in the enzymatic activity of γ-GTP that induces and expresses M-CSF. it can.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of a verification experiment on the osteoclast-inducing activity of γ-GTP in which the enzyme activity was inactivated.
FIG. 2 shows that the expression of RANKL and OPG genes (mRNA) is amplified by the addition of γ-GTP.
FIG. 3 shows that the number of osteoclasts decreases as the amount of OPG added increases.
FIG. 4 shows the results of examining the expression of RANKL and OPG mRNA by RT-PCR in cells treated with inactive γ-GTP (125 ng) and γ-GTP (125 ng) in an osteoclast induction system. FIG.
FIG. 5 is a view showing the measurement results of a Quantitative experiment of M-CSF mRNA when γ-GTP is added, using a LightCycler.
