JP2004187643A - Method for producing lactic acid of high optical purity - Google Patents
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Abstract
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポリ乳酸の原料である乳酸の製造方法に関し、特に、生物宿主を用いた乳酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
組換えDNA技術の進歩により、微生物、カビ、動植物及び昆虫などの宿主で外来遺伝子を発現させ、その形質転換体を増殖させることによって、目的遺伝子産物を取得する技術が発展してきた。例えば、酵母などの培養によれば、発酵生産により大量の目的遺伝子産物を産生させることも可能である。これまで、酵母によってL-乳酸を生産させようとする試みはいくつか存在している。ウシ由来の乳酸脱水素酵素（LDH）遺伝子を酵母サッカロマイセス・セレビシエに導入し、L-乳酸を生産させる試みがある（非特許文献１及び２並びに特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、いずれの報告においても、L-乳酸の高生産は認められておらず、また、光学純度の高いL-乳酸を生産することはできなかった。
【０００４】
【非特許文献１】
Eri Adachiら "Modification of metabolic pasthway of Saccaromyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate genes fo the lactic acid fermentation at low pH value", J. Ferment. Bioeng. Vol.86, No.3, 284-289, 1988
【非特許文献２】
Danio Porroら"Development of metabolically engineered Saccaromyces cerevisiae cells for the production of lactic asid", Biotechnol.Prog. Vol.11,294-298, 1995
【特許文献１】
特表２００１−５１６５８４号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、本発明は、上述したような実状に鑑み、高い光学純度で乳酸を得ることができる乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、乳酸ラセマーゼ活性の低い宿主で乳酸を合成することによって、高い光学純度で乳酸を合成できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は以下を包含する。
（１）低乳酸ラセマーゼ活性の宿主内で乳酸を合成することを特徴とする乳酸の製造方法。
上記（１）の方法において、宿主は、乳酸ラセマーゼ遺伝子を欠損及び/又は変異させ、乳酸ラセマーゼを不活化及び/又は活性低下させたものを使用することができる。また、上記（１）の方法において、宿主は、L-乳酸脱水素酵素遺伝子又はD-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入したものを使用することができる。
【０００８】
さらに、上記（１）の方法において、宿主は酵母（Saccharomyces cerevisiae）を使用することが好ましい。さらにまた、上記（１）の方法において、宿主は、ウシ由来L-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入したものを使用することができる。上記（１）の方法において、上記宿主として酵母（Saccharomyces cerevisiae）を用い、当該酵母にウシ由来L-乳酸脱水素酵素遺伝子を多コピー導入することが好ましい。さらにまた、上記（１）の方法において、上記宿主内で合成された乳酸の光学純度が98％以上とすることができる。
【０００９】
また、本発明は以下を包含する。
（２）低ラセマーゼ活性の宿主内で乳酸を合成し、98％以上の光学純度で乳酸を合成することを特徴とする乳酸の製造方法。
（３）上記（１）の乳酸の製造方法により製造された乳酸を用いることを特徴とするポリ乳酸の製造方法。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明に係る乳酸の製造方法は、低乳酸ラセマーゼ活性の宿主内で乳酸を合成するものである。
【００１１】
本発明に係る乳酸の製造方法において宿主としては、低乳酸ラセマーゼ活性の宿主であれば特に限定されない。例えば、宿主としては、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を使用することができる。微生物としては、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、担子菌、藻類、リケッチア、乳酸菌、酢酸菌及びカビ等を挙げることができる。動物細胞としては、CHO細胞、Hela細胞等を挙げることができる。植物細胞としては、ブドウカルス細胞、イチイカルス細胞、サツマイモ細胞、タバコ細胞、トウモロコシ細胞、ニンジン細胞、イネ細胞等を挙げることができる。昆虫細胞としては、sf9、sf21等を挙げることができる。
【００１２】
また、乳酸ラセマーゼを発現し、乳酸ラセマーゼ活性を有する宿主であっても、乳酸ラセマーゼ遺伝子を欠損及び/又は変異させることによって、乳酸ラセマーゼを不活化及び/又は活性低下させれば、宿主として使用することができる。宿主中の乳酸ラセマーゼ遺伝子を欠損及び/又は変異させるには、従来公知の手法を適用することができる。例えば、“Genetic Analysis of the Pynucate Decarboxylase Reaction in Yeast Glycosis”(Jurnal of Bacteriology 1982, p1146-1152)に記載されているように、エチルメタンスルフォネートによる変異処理によりピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を欠損させることに成功しており、同様な手法によってラセマーゼ活性を欠損させることができる。また、染色体導入型ベクターを用い、相同組換えを利用して乳酸ラセマーゼ遺伝子を欠損又は変異させることができる。
【００１３】
本発明に係る乳酸の製造方法において、低乳酸ラセマーゼ活性とは、宿主における乳酸ラセマーゼ活性がゼロであるか、0.1U以下であることを意味する。
【００１４】
なお、乳酸ラセマーゼ活性は、L-乳酸から生じるD-乳酸又はD-乳酸から生じるL-乳酸を、それぞれD-乳酸に特異的な乳酸脱水素酵素又はL-乳酸脱水素酵素で定量する方法（Dennis, D. (1962) Meth. Enzymol. 5, 430-432参照）、旋光度変化を測定する方法（Katagiri, H.ら、(1961) Agric. Biol. Chem. 25, 281-289参照）或いはD-乳酸脱水素酵素とメチレンブルーの存在下で検圧法で測定する方法（Katagiri, H.ら、(1961) Agric. Biol. Chem. 25, 281-289参照）で測定することができる。
【００１５】
低乳酸ラセマーゼ活性の宿主内で乳酸を合成するには、例えば、当該宿主内にL-乳酸脱水素酵素遺伝子又はD-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入する方法が挙げられる。宿主内にL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した場合には、ピルビン酸からL-乳酸を合成することができる。また、宿主内にD-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入した場合には、D-乳酸を合成することができる。いずれの場合であっても、宿主における乳酸ラセマーゼ活性が低いため、宿主内におけるラセミ化を防止することができ、光学純度の高いL-乳酸又はD-乳酸を合成することができる。
【００１６】
乳酸脱水素酵素遺伝子
宿主に導入するL-乳酸脱水素酵素遺伝子及びD-乳酸脱水素酵素遺伝子としては、L-乳酸脱水素酵素活性又はD-乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質をコードするものであれば特に限定されない。以下、L-乳酸脱水素酵素活性を備えるタンパク質を、「ＬＤＨ」と称する。ＬＤＨは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物の解糖系、または高等生物の筋肉組織において、ピルビン酸からＬ−乳酸を産生する反応を媒介する酵素として知られている。
【００１７】
また、本明細書において、遺伝子を構成するＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡなど、その由来を問うものではない。また、当該ＤＮＡは、１本鎖でも、その相補鎖を有する２本鎖であってもよいし、また、天然のあるいは人工のヌクレオチド誘導体を含んでいてもよい。
【００１８】
ＬＤＨには、生物の種類に応じてあるいは生体内においても各種同族体が存在する。本発明におけるＬＤＨとしては、天然由来のＬＤＨの他、化学合成的あるいは遺伝子工学的に人工的に合成されたＬＤＨも包含している。
【００１９】
ＬＤＨとしては、好ましくは、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来であり、より好ましくは、植物、動物、昆虫などの高等真核生物由来であり、さらに好ましくは、ウシを始めとする哺乳類を含む高等真核生物由来である。最も好ましくは、ウシ由来のＬＤＨである。例えば、ウシ由来のＬＤＨとして配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。さらに、本発明におけるＬＤＨは、これらのＬＤＨのホモログも包含している。ＬＤＨホモログは、天然由来のＬＤＨのアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸でありかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質、および、天然由来のＬＤＨとアミノ酸配列の相同性が少なくとも７０％、好ましくは８０％以上を有しかつＬＤＨ活性を有しているタンパク質を含んでいる。
【００２０】
本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子は、形質転換しようとする宿主生物において多用されるコドン用法を用いた塩基配列を有することができる。例えば、L-乳酸脱水素酵素遺伝子は、サッカロマイセス属、とくに、サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用法を用いて遺伝暗号化された塩基配列を有することができる。サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用法を図２示す。
【００２１】
このコドン用法において、下線が施してあるコドンを、それに対応つけられているアミノ酸のコドンとして用いることが好ましい。すなわち、ＵＵＵ（Ｐｈｅ）、ＵＣＵ（Ｓｅｒ）、ＵＡＵ（Ｔｙｒ）、ＵＧＵ（Ｃｙｓ）、ＵＵＧ（Ｌｅｕ）、ＣＡＵ（Ｈｉｓ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＡＵＵ（Ｉｌｅ）、ＡＣＵ（Ｔｈｒ）、ＡＡＵ（Ａｓｎ）、ＡＡＡ（Ｌｙｓ）、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＵＧ（Ｍｅｔ）、ＧＵＵ（Ｖａｌ）、ＧＣＵ（Ａｌａ）、ＧＡＵ（Ａｓｐ），ＧＧＵ（Ｇｌｙ）、ＧＡＡ（Ｇｌｕ）を用いることが好ましい。なお、これらはいずれもＲＮＡ上の塩基配列の形態で示されているが、ＤＮＡの場合は、ＵがＴとなる。
【００２２】
本来のL-乳酸脱水素酵素遺伝子に対して、サッカロマイセス属など異種生物のコドン用法に基づいて改変して新たな塩基配列のL-乳酸脱水素酵素遺伝子を設計する場合、改変前（天然由来）の塩基配列のコドンの７０％以上にこのコドン用法が適用されていることが好ましく、より好ましくは、８０％以上であり、さらに好ましくは、９０％以上であり、もっとも好ましくは、全てのコドンについてこのコドン用法が適用されている。
【００２３】
本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子の好ましい態様として、ウシ由来のＬＤＨの塩基配列（配列番号４１）を上記コドン用法（サッカロマイセス・セレビシエのコドン用法）を適用して設計したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を挙げることができる。なかでも、配列番号１および配列番号３に記載の塩基配列を有する、あるいはこれらの塩基配列からなるL-乳酸脱水素酵素遺伝子が好適な態様である。当該塩基配列のコード領域の塩基配列においては、メチオニン以外の全てのアミノ酸において、本来のコドンと異なるコドンが用いられている。
【００２４】
また、好ましい態様として、ＬＤＨのコード領域の開始コドン近傍に（開始コドンを挟んで）コザック配列を有することが好ましい。具体的には、コザック配列としてＤＮＡにあっては、５’−ＡＮＮＡＴＧＧ−３’ただし、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧのいずれであってもよい。）を有するようにすることが好ましい（なお、ＲＮＡにあっては、この配列に対してＴをＵに置換した形態をいうものとする。）。例えば、配列番号３に記載の塩基配列では、開始コドン（ＡＴＧ）を挟んで、５’−ＡＣＡＡＴＧＧ−３’の塩基配列を有している。
【００２５】
また、L-乳酸脱水素酵素遺伝子においては、ｍＲＮＡを不安定化する配列を含まないようにすることが好ましい。例えば、ポリＡシグナル配列、ステムループ構造を含む配列、ＴＡＴＡＴＡ配列などの配列の他、著しい繰り返し配列を含まないようすることが好ましい。例えば、１０ｂｐ程度の配列の出現率がＤＮＡ（特にタンパク質のコード領域）において２％以下となるようにすることが好ましく、より好ましくは、全く含まないものとする。
【００２６】
また、L-乳酸脱水素酵素遺伝子全体において、ＧＣ含量の偏りに差がでないように設計することが好ましい。例えば、５’側（特に、開始コドン）から１００塩基毎に区切られる複数の領域のＧＣ含量がそれぞれ約２０％以上約４０％以下の範囲であることが好ましい。
【００２７】
また、全体のＧＣ含量が約２０％以上約４０％以下であることが好ましい。ウシ由来の天然のＬＤＨ配列（配列番号４１）の全体のＧＣ含量が４４．９４％であることと、例えば、配列番号１および３に記載の塩基配列においては、全体のＧＣ含量が、それぞれ３１．４％、３２．０％となっているからである。より好ましくは、約２５％以上約３５％以下である。
【００２８】
あるいは、天然のＤＮＡ配列に比較して、全体のＧＣ含量を１０％以上１５％以下程度、好ましくは、１３％以上１４％以下程度減少させるように設計することが好ましい。
【００２９】
本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子としては、導入しようとする宿主生物におけるコドン用法の適用、コザック配列の存在、好適なＧＣ含量（ＧＣ含量の分散性、全体のＧＣ含量）のうち、少なくとも１種類の特徴を有することが好ましい。より好ましくは、２種類以上、もっとも好ましくは３種類の特徴を有する。また、本L-乳酸脱水素酵素遺伝子においては、宿主生物におけるコドン用法が適用されていることが好ましい。
【００３０】
特に、サッカロマイセス属（セレビシエ種を含む）を宿主として形質転換する場合には、サッカロマイセス属（特に、セレビシエ種）におけるコドン用法が適用されていることが好ましい。
【００３１】
さらに、L-乳酸脱水素酵素遺伝子において、特にコード領域において遺伝子クローニング工程上不適当な制限酵素部位を有しないように設計されていることが好ましい。具体的には、Eco RI, Xho I、Afl IIなどのサイトを含まないことが好ましい。また一方、遺伝子クローニング操作を考慮すれば、コード領域の外側には操作上有用な制限酵素部位を備えていることが好ましい。例えば、Eco RI, Xho I、Afl IIなどのサイトをコード領域の上流および／または下流に有することができる。例えば、配列番号１および３に記載の塩基配列においては、開始コドンから終止コドンまでの範囲においては、Eco RI、Xho I、Afl IIのサイトを備えていない。また、配列番号３に記載の塩基配列においては、開始コドンの上流側に、Eco RIサイトを備え、終止コドンの下流側には、Xho I、Afl IIを備えている。
【００３２】
本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子は、配列番号１および３に示す塩基配列からなるL-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログも包含している。L-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログとしては、例えば、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするL-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログを挙げることができる。すなわち、これらのいずれかのL-乳酸脱水素酵素遺伝子の全体若しくは一部あるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするL-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログである。かかるホモログは、同時にＬＤＨ活性を備えるタンパク質をコードしている。
【００３３】
ストリンジェントな条件でハイブリダイズするL-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログとは、例えば、もとの塩基配列の任意の少なくとも２０個、好ましくは２５個、より好ましくは少なくとも３０個の連続した配列を一つあるいは複数個選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとして、当業者の周知のハイブリダイセーション技術（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 6.3-6.4）などを用いて、ハイブリダイズするＤＮＡを含む。
【００３４】
ここでストリンジェントな条件としては、５０％ホルムアミド存在下でハイブリダイゼーション温度が３７℃であり、より厳しい条件としては、約４２℃である。さらに厳しい条件としては５０％ホルムアミド存在下で約６５℃とすることができる。
【００３５】
また、ウシ由来のＬＤＨのアミノ酸配列（例えば、配列番号２）において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＤＨをコードするとともに、前記ウシ由来のＬＤＨをコードする塩基配列（例えば、配列番号１または３に記載の塩基配列）の全部若しくは一部からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、ＤＮＡも、本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子に含まれる。
【００３６】
また、配列番号１あるいは配列番号３のコード領域に記載の塩基配列によってコードされるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＬＤＨをコードするとともに、配列番号１あるいは配列番号３のコード領域において、前記アミノ酸の置換などに対応する塩基の改変がなされた塩基配列を有するＤＮＡも、本発明のL-乳酸脱水素酵素遺伝子に含まれる。
【００３７】
なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の機能が維持できる限り制限されないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ましくは２０％以内である。
【００３８】
また、このようなL-乳酸脱水素酵素遺伝子ホモログは、もとのＤＮＡの塩基配列のコード領域に対して、少なくとも８０％、好ましくは、９０％以上のホモロジーを有する塩基配列を含む、あるいは当該塩基配列からなるＤＮＡであることが好ましい。なお、ＤＮＡの塩基配列のホモロジーは、遺伝子解析プログラムＢＬＡＳＴなどによって決定することができる。
【００３９】
なお、L-乳酸脱水素酵素遺伝子は、化学的に合成することもできるし、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することもできる。
【００４０】
また、アミノ酸配列における改変は、改変しようとするアミノ酸配列に、部位特異的変位導入法（Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel etal., (1987) Publish . John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5）等を用いて、適宜、置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより行うことができる。また、このような改変は、人工的に変異を導入しあるいは合成したものに限られず、人工的な変異処理に基づいてあるいはこれに限られず自然界におけるアミノ酸の変異によっても生じたものも包含される。
【００４１】
乳酸脱水素酵素遺伝子を備えるＤＮＡ構築物
宿主に対して上述した乳酸脱水素酵素遺伝子を導入するためのＤＮＡ構築物について説明する。本発明の乳酸脱水素酵素遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換して、このＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現させることにより、そのＬＤＨ活性により宿主細胞においてＬ−乳酸を産生させることができる。
【００４２】
形質転換にあたっては、上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子からなるＤＮＡセグメントを、宿主細胞内で発現可能とするＤＮＡ構築物を用いる。形質転換のためのＤＮＡ構築物の態様としては、特に限定しないでプラスミド（ＤＮＡ）、バクテリオファージ（ＤＮＡ）、レトロトランスポゾン（ＤＮＡ）、人工染色体（ＹＡＣ、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＭＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体外あるいは染色体内）や宿主細胞の種類に応じて選択して採用することができる。したがって、本ＤＮＡ構築物は、上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子の他、これらのいずれかの態様のベクターの構成セグメントを備えることができる。好ましい原核細胞性ベクター、真核細胞性ベクター、動物細胞性ベクター、植物細胞性ベクターは当該分野において周知である。
【００４３】
なお、プラスミドＤＮＡとしては、例えば、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１５、ｐＲＳ４１６、ＹＣｐ５０、ｐＡＵＲ１１２またはｐＡＵＲ１２３などのＹＣｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＹＥＳ３２またはＹＥｐ１３などのＹＥｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＡＵＲ１０１またはｐＡＵＲ１３５などのＹＩｐ型大腸菌−酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ、ｐＴＶ１１９Ｎ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９６又はｐＴｒｃ９９ＡなどのＣｏｌＥ系プラスミド、ｐＡＣＹＣ１７７又はｐＡＣＹＣ１８４などのｐ１Ａ系プラスミド、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ２１８又はｐＭＷ２１９などのｐＳＣ１０１系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）などを挙げることができる。ファージＤＮＡとしては、λファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１００、ｇｔ１１、ｚａｐ）、φＸ１７４、Ｍ１３ｍｐ１８又はＭ１３ｍｐ１９などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしては、Ｔｙ因子などを挙げることができる。ＹＡＣとしては、ｐＹＡＣＣ２などを挙げることができる。
【００４４】
本ＤＮＡ構築物を作製するには、上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を含むフラグメントなどを適当な制限酵素で切断し、使用するベクターＤＮＡの制限酵素部位あるいはマルチクローニングサイトに挿入などすることによる。
【００４５】
本ＤＮＡ構築物の第１の態様は、上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子からなるＤＮＡセグメントを発現可能に連結されるプロモーターセグメントを備えている。すなわち、プロモーターにより制御可能にそのプロモーターの下流側に上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子セグメントが連結されている。
【００４６】
上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子の発現、すなわち、ＬＤＨの発現にあっては、酵母における発現が好ましいことから、酵母中で発現するプロモーターを使用することが好ましい。かかるプロモーターとしては、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどを使用することが好ましい。特に、サッカロマイセス属由来のピルビン酸脱炭酸酵素（１）プロモーターが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターを利用することがより好ましい。これらのプロモーターは、サッカロマイセス属（セレビシエ）のエタノール発酵経路において高発現されているからである。なお、かかるプロモーター配列は、サッカロマイセス属酵母のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅法によって単離することができる。サッカロマイセス・セレビシエ由来の当該プロモーターの塩基配列を、配列番号４０に示す。なお、本ＤＮＡ構築物におけるプロモーターセグメントには、この配列番号４０記載の塩基配列からなるＤＮＡの他、この塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失,置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、配列番号４０で示される塩基配列の全部若しくは一部の配列から調製されたＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ（換言すれば、当該プロモーターのホモログ）を用いることができる。
【００４７】
また、本ＤＮＡ構築物の他の態様である第２のＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡの他、宿主染色体に相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備える。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、宿主染色体において上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入しようとするターゲット部位近傍のＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列である。相同組換え用ＤＮＡセグメントは、少なくとも１個備えられ、好ましくは、２個備えられている。例えば、２個の相同組換え用ＤＮＡセグメントを、染色体上のターゲット部位の上流側と下流側のＤＮＡに相同なＤＮＡ配列とし、これらのＤＮＡセグメントの間に上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を連結することが好ましい。
【００４８】
相同組換えにより宿主染色体に上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入する場合、宿主染色体上のプロモーターにより制御可能に本ＤＮＡを導入することができる。この場合、目的遺伝子の導入によって、同時に、本来当該プロモーターによって制御されるべき内在性遺伝子を破壊し、この内在性遺伝子に替えて外来の上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させることができる。特に、当該プロモーターが、宿主細胞において高発現プロモーターである場合に有用である。
【００４９】
かかる発現系を宿主染色体上に創出するには、宿主染色体において高発現遺伝子をターゲットとし、この遺伝子を制御するプロモーターの下流にプロモーターにより制御を受けるように上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入するようにすることが好ましい。酵母などのエタノール発酵性微生物を宿主とする場合、ピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（特に、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）をターゲットとし、内在性のピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子プロモーターの制御下に上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子を導入することができる。この場合、相同組換え用ＤＮＡセグメントは、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のＬＤＨの構造遺伝子領域あるいはその近傍の配列（開始コドンの近傍の配列、開始コドンの上流域の配列、構造遺伝子内の配列などを含む）と相同とすることができる。好ましくは、サッカロマイセス属（特にセレビシエ）を宿主として、この宿主のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子をターゲットとするＤＮＡ構築物とする。かかるＤＮＡ構築物によれば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の破壊とこの構造遺伝子部分のＬＤＨによる置換を一つのベクターで達成することができる。ピルビン酸脱炭酸酵素１は、ピルビン酸からアセトアルデヒドへの付加逆反応を媒介する酵素であり、この遺伝子を破壊することにより、アセトアルデヒドを経たエタノール産生を抑制できることが期待されるとともに、ピルビン酸を基質とするＬＤＨによるL-乳酸の産生を促進することが期待できる。
【００５０】
なお、第１のＤＮＡ構築物あっても、宿主染色体との相同組換えのためのＤＮＡセグメントを備えることにより、相同組換え用のＤＮＡ構築物とすることができる。第１のＤＮＡ構築物にあっては、ＤＮＡ構築物中のプロモーターセグメントを、宿主染色体との相同組換え用のＤＮＡセグメントに兼用することもできる。例えば、宿主サッカロマイセス・セレビシエに対して、サッカロマイセス・セレビシエ宿主染色体にあるプロモーター、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターをプロモーターセグメントとして有するＤＮＡ構築物は、当該遺伝子をターゲット部位とするターゲティングベクターを構成する。この場合、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子の構造遺伝子領域に対する相同配列を備えることが好ましい。
【００５１】
なお、ＤＮＡ構築物には、ターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００５２】
ＤＮＡ構築物による形質転換
以下、上述したＤＮＡ構築物による宿主の形質転換について説明する。一旦、ＤＮＡ構築物が構築されたら、適当な宿主細胞に、トランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ法、直接マイクロインジェクション法等の各種の適切な手段のいずれかにより、これを導入することができる。ＤＮＡ構築物の導入後、その受容細胞は、選択培地で培養される。
【００５３】
宿主細胞は、上述したように、低乳酸ラセマーゼ活性の宿主を使用する。例えば、宿主としては、Eshrichia coli、Bacillus subtilisなどの細菌、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）などの酵母、ｓｆ９、ｓｆ２１等の昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの動物細胞、サツマイモ、タバコなどの植物細胞などとすることができる。好ましくは、酵母などのアルコール発酵を行う微生物あるいは耐酸性微生物であり、例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロマイセス属を始めとする酵母である。具体的には、サッカロマイセス・セレビシエＩＦＯ２２６０株や同ＹＰＨ株である。
【００５４】
ＤＮＡ構築物によって形質転換された形質転換体においては、ＤＮＡ構築物の構成成分が染色体上あるいは染色体外因子（人工染色体を含む）上に存在することになる。なお、ＤＮＡ構築物が染色体外に維持されている場合、あるいは、ランダムインテグレーションにより染色体に組み込まれている場合には、ＬＤＨの基質であるピルビン酸を基質とする他の酵素、例えば、ピルビン酸脱炭酸酵素の遺伝子（サッカロマイセス属酵母においては、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子）は、ターゲティングベクターによりノックアウトされていることが好ましい。
【００５５】
上述のＤＮＡ構築物であって、相同組換えを達成できるＤＮＡ構築物が導入されると、宿主染色体上の所望のプロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に連結された上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子であるＤＮＡセグメントが存在することになる。サッカロマイセス属酵母の形質転換体にあっては、宿主染色体上において、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子プロモーターあるいは当該プロモーターと置換された当該プロモーターのホモログの下流に当該プロモーターによって制御可能に本ＤＮＡを備えることが好ましい。
【００５６】
また、通常、相同組換え体における上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子の下流側には、選択マーカー遺伝子や、破壊された構造遺伝子の一部（ＤＮＡ構築物上の相同配列に対応する部位）が存在する。
【００５７】
なお、所望のプロモーター下に上述したL-乳酸脱水素酵素遺伝子が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、導入部位特異的プライマーによりＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物について、電気泳動において予期されるバンドを検出することによって確認できる。あるいは蛍光色素などで標識したプライマーでＰＣＲを行うことでも確認できる。これらの方法は、当業者において周知である。
【００５８】
乳酸の製造
以下、上述した形質転換体を用いて高光学活性の乳酸の製造について説明する。ＤＮＡ構築物が導入されて得られる形質転換体を培養することにより、培養物中に外来遺伝子の発現産物である乳酸が生成する。培養物から乳酸を分離する工程を実施することにより、乳酸を得ることができる。なお、本発明において培養物とは、培養上清の他、培養細胞あるいは菌体、細胞若しくは菌体の破砕物を包含している。
【００５９】
本発明の形質転換体の培養にあたっては、形質転換体の種類に応じて培養条件を選択することができる。このような培養条件は、当業者においては周知である。
【００６０】
大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化可能な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００６１】
培養は、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、３０℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは２．０〜６．０に保持することが好ましい。また、ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液等を用いて行うことができる。培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの構成物質を培地に添加することができる。
【００６２】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地またはこれらの培地にウシ胎児血清などを添加した培地を用いることができる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６３】
培養終了後、培養物から遺伝子産物を分離するには、通常のタンパク質の生成手段などを使用することができる。例えば、形質転換細胞内に生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などに細胞を破壊して、遺伝子産物を細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、培養上清に遺伝子産物が生産された場合には、この溶液を、ろ過、遠心分離などにより固形分を除去し、必要によりプロトタミン処理などにより核酸を除去する。
【００６４】
これらの粗抽出画分に対して、硫安、アルコール、アセトン等などを添加し分画し、沈殿物を採取し、粗タンパク質溶液を得る。このタンパク溶液を、各種クロマトグラフィー、電気泳動などにかけて精製酵素標品を得ることができる。たとえば、セファデックス、ウルトラゲルもしくはバイオゲルなどを用いるゲルろ過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲルなどを用いる電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより、精製された目的の遺伝子産物を取得することができる。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列は、公知のアミノ酸分析法により行うことができる。上記した培養法、精製法は、一例であってこれに限定する趣旨ではない。
【００６５】
特に、本発明においては、低乳酸ラセマーゼ活性の宿主内で乳酸を合成するため、合成されたＬ-乳酸又はＤ-乳酸のラセミ化を防止することができ、光学純度の高いＬ-乳酸又はＤ-乳酸を得ることができる。本発明を適用して得られたＬ-乳酸又はＤ-乳酸は、光学純度が高いため、例えば、高品質なポリ乳酸を製造する際の原料として好適である。言い換えると、本発明により、高品質なポリ乳酸を製造するための、高光学純度のＬ-乳酸又はＤ-乳酸を得ることができる。
【００６６】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６７】
実施例１：Ｌ−乳酸脱脂素酵素遺伝子のＤＮＡ配列の設計
高等真核生物であるウシ由来のタンパク質であるＬ−乳酸脱水素酵素を、酵母サッカロマイセス・セレビシエ属において効率的に生産するために、ウシ由来Ｌ−乳酸脱水素酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号４１）に対して、以下の項目を設計指針として、天然にない新規な遺伝子配列を設計した。
１）サッカロマイセス・セレビシエにおいて多用されているコドンを用いた。
２）開始コドンをはさんでコザック配列（ＡＮＮＡＴＧＧ）を付加した。
３）ｍＲＮＡの不安定配列や繰り返し配列をできる限り排除した
４）全領域にわたってＧＣ含量の偏りに差がでないようにした。
５）設計した配列中に遺伝子クローニングに不適当な制限酵素部位ができないようにした。
６）染色体導入型ベクターに組み込むための両末端に有用な制限酵素EcoRI、XhoI、AflIII部位を付加した。
【００６８】
酵母におけるコドンの使用頻度は、コドンユーセージデータベース（ HYPERLINK http://www.kazusa.co.jp/codon/、 http://www.kazusa.or.jp/codon/）から得られるサッカロマイセス・セレビシエのコドンユーセージを図２に示す。この図において特定アミノ酸に対応して多用されているコドンを特定した（下線をしたコドン）。
【００６９】
図２に示すコドンユーセージにおける多用コドンの適用の他、上記２）〜５）の設計指針に基づいて得られたＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードする新規なＤＮＡ配列（９９９ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ遺伝子と称す。）を配列番号１に示す。また、配列番号１に示すＤＮＡ配列とその開始コドンの上流側および終止コドンの下流側を含むＤＮＡ配列（１０５２ｂｐ）（以下、ＬＤＨＫＣＢ配列と称す。）を配列番号３および図１に示す。
【００７０】
配列番号１に記載のＤＮＡ配列においては、メチオニン以外の全てのアミノ酸において、もとのＤＮＡ配列で使用したのと異なるコドンを使用していた。なお、新たに採用されたコドンは、全て図２に示す多用コドンであった。さらに、もとのウシ由来のＬＤＨ遺伝子とＬＤＨＫＣＢ遺伝子とについて、コンピューターによるホモロジー解析を行った結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＤＮＡ配列のほぼ全域にわたって多数の置換を要することがわかった。
【００７１】
実施例２：ＬＤＨＫＣＢ配列の全合成
本実施例では、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７ 植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を用いた。この方法の原理は、１００MER程度のオリゴヌクレオチドプライマーを３’末端に１０〜１２ｍｅｒ程度のオーバーラップを持つように作製し、お互いのオリゴヌクレオチドプライマーのオーバーラップ領域を利用して、欠損部分を伸張させ、さらに両末端のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって増幅するというものである。この操作を順次繰り返し、目的とする長鎖ＤＮＡを合成する。ＰＣＲ増幅装置には、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。
【００７２】
具体的には、最初に連結させたい２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを混合し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）存在下で、９６℃、２分、６８℃２分、５４℃２分、７２℃３０分の反応条件でＤＮＡ伸張反応を行った。次に、本試料の１／１０量を鋳型にして、両末端のプライマー存在下で、９６℃２分後、９６℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の反応を２５サイクル行い、その後４℃とするＰＣＲ反応をおこなった。反応におけるバッファ、ｄＮＴＰｍｉｘなどは、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに附属のものを使用した。
【００７３】
一連のオーバーラップＰＣＲ法を図４に従って順次行っていき、最終目的とすつ遺伝子断片を作製した。図４に示す各種プライマー（BA、B01、BB、B02、BC、B03、BD、B04、BE、B05、BF、B06、BG、B07、BH、B08、BI、B09、BJ、B10、BK、B11、BL、B12、BM、B13、BN、B14の全２８種のプライマーのＤＮＡ配列を配列番号５〜３２にそれぞれ示す。合成したＬＤＨＫＣＢ配列について、塩基配列を確認した後、ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、同様にＥｃｏＲＩにて酵素処理したｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｉｒｏｇｅｎ）に常法により連結した。このベクターをｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターと称した。
【００７４】
実施例３：酵母染色体導入用ベクターの構築（２コピー導入）
実施例２において全合成したＬＤＨＫＣＢ配列を用いて、酵母染色体導入型ベクターを構築した。このベクターを、pBTRP-PDC1-LDHKCBと称し、このプラスミドマップを図５に示す。
【００７５】
１．ｐBTrp-PDC１-LDHKCB構築のためのPDC1P断片の単離
PDC1P断片は、サッカロマイセス・セレビシエYPH株（Stratagene社）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したPCR増幅法によって単離を行った。
【００７６】
サッカロマイセス・セレビシエYPH株のゲノムＤＮＡは、ゲノム調製キットであるFast DNA Kit（Bio 101社）を用い、詳細は、附属のプロトコールに従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏ ｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）にて測定した。
【００７７】
PCR反応には、増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるPyrobest DNA Polymerase（宝酒造）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡ５０ｎｇ／サンプル、プライマーＤＮＡ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置 Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）によってＤＮＡ増幅を行つた。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９６℃２分の後、９６℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃９０秒の反応を２５サイクル行い、その後４℃とした。ＰＤＣｌプライマーの増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断片の確認を行つた。なお反応に使用したプライマーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノロジー社）を用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下の通りであった。
・ＰＤＣＩＰ−ＬＤＨ−Ｕ（３１ｍｅｒ，Ｔｍ値５８．３℃）未端に制限酵素ＢａｍH1サイトを付加
：ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＴＴ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＣＴ Ｃ （配列番号３３）
・ＰＤＣｌＰ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．４℃）末端に制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを付加
：ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＧＴ Ｇ （配列番号３４）
【００７８】
２．プロモーター及び目的遺伝子を含む組換えベクターの構築
サッカロマイセス・セレビシエ由来のビルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ＰＤＣｌ）プロモーター配列の制御下で、目的遺伝子としてウシ由来のL-乳酸脱水素酵素遺伝子（ＬＤＨ遺伝子）を使用した。
【００７９】
本組換えベクター構築のために新たに構築した染色体導入型ベクターをｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢと名付けた。以下に本ベクター構築例の詳細を記す。なお本実施例の概要を図６〜９に示す。但し、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。
【００８０】
ベクターの構築にあたつて、必要な遺伝子断片であるＰＤＣｌ遺伝子のプロモーター断片（ＰＤＣＩＰ）９７１ｂｐと、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片（ＰＤＣ１Ｄ）５１８ｂｐは、上述のように、サッカロマイセス・セレビシエＹＰＨ株のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。ＰＣＲ増幅の手順は上記の通りであるが、ＰＤＣｌ遺伝子下流領域断片の増幅には、以下のプライマーを使用した。
・ＰＤＣ１Ｄ−ＬＤＨ−Ｕ（３４ｍｅｒ、Ｔｍ値５５．３℃）未端に制限酵素ＸｈｏＩサイトを付加
：ＡＴＡ ＴＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＴ ＣＧＡ Ｃ （配列番号３５）
・ＰＤＣＩＤ−ＬＤＨ−Ｄ（３１ｍｅｒ、Ｔｍ値５４．４℃）末端に制限酵素ＡｐａＩサイトを付加
：ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＣ ＴＧＴ Ｇ （配列番号３６）
【００８１】
上記反応にて取得したＰＤＣ１Ｐ及びＰＤＣ１Ｄ各遺伝子増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって精製した後、ＰＤＣ１Ｐ増幅断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ及びＰＤＣ１Ｄ増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩ／ＡｐａＩにて制限酵素反応処理を行った。なお、以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｌｏｎ （Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ．１９８９）に従った。
【００８２】
ベクターの構築における一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行った。すなわち、制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ（宝酒造社）及び脱リン酸化酵素Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社）を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋ベクター（東洋紡社）に、上記ＰＣＲ法にて増幅し制限酵素処理を施したＰＤＣ１Ｐ断片をＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応によって連結させた（図６上段）。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応には、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。
【００８３】
次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を用いて、コンピテント細胞への形質転換を行った。コンピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコロニーにつき、インサート断片のプライマーＤＮＡを用いたコロニーＰＣＲ法による確認、及びミニプレップによるプラスミドＤＮＡ調製溶液に対する制限酵素処理による確認を行い、目的とするベクターｐＢＰＤＣ１Ｐベクターを単離した（図６中段）。
【００８４】
ついで、図６の中段に示すように、株式会社豊田中央研究所によって構築されたｐＢＴＯＰＯ−ＬＤＨＫＣＢベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨＫＣＢ遺伝子断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターを作製した（図６下段）。
【００８５】
一方、図７に示すように、トヨタ自動車（株）によって構築されたｐＹＬＤｌベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＡａｔＩＩ処理及び末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理することで得られるＬＤＨ遺伝子（ビフィドバクテリウム・ロンガム由来）断片を、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ処理、末端修飾酵素Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理を行ったｐＢＰＤＣ１Ｐベクター中に、上述と同様の操作でサブクローニングを行い、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨ１ベクターを作製した（図７）。なお、上記のｐＹＬＤｌベクターは大腸菌に導入され（名称： 「Ｅ．ｃｏｌｌ ｐＹＬＤ１」）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４２３としてブダベスト条約に基づき国際寄託されている（原寄託日：平成１１（１９９９）年１０月２６日）。
【００８６】
続いて、図８に示すように、このベクターをＸｈｏＩ／ＡｐａＩ処理し、同様に制限酵素処理を施した増幅ＰＤＣ１Ｄ断片を連結させてｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨベクターを作製した（図８上段）。最後にｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＩＩベクターをＥｃｏＲＶ処理したものに、ｐＲＳ４０４ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＡａｔＩＩ／ＳｓｐＩ処理、Ｔ４ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理して得られたＴｒｐマーカー断片を連結させて、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣｌ−ＬＤＨベクターを構築した。
【００８７】
次に、図９に示すように、ｐＢＰＤＣ１Ｐ−ＬＤＨＫＣＢベクターをＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩにて制限酵素処理し、一方、ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨベクターを、制限酵素ＡｐａＩおよびＳｔｕＩで処理したＴｒｐマーカーを含む断片に処理し、増幅させた断片を連結させて、最終コンストラクトである染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターを構築した。
【００８８】
構築した染色体導入型ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢベクターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調製法、及び機器の使用方法等の詳細は本装置付属のマニュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてカラム精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏ ｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｌｏｔｅｃｈ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。
【００８９】
実施例４：酵母染色体導入用ベクターの構築（４コピー導入）
次に、フレオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして、LDH遺伝子4コピー導入用の染色体導入型ベクターを構築した。本ベクターをpBBLE-LDHKCBと称し、そのプラスミドベクターを図１０示す。構築の一連の手順を示すが、構築の順番はこれに限定されるものではない。
【００９０】
本ベクターの構築手順としては、まず、制限酵素BamHI／PstI処理を施したpBluescript II SK+ベクター（東洋紡社）中に、実施例２にて構築したpBTRP-PDC1-LDHKCBベクターに同様の制限酵素処理して得られるLDHKCB断片を連結して、pBLDHKCBベクターを作製した。次に、本ベクターに、PCR増幅して得たSLX4断片、PDC5下流断片（PDC5D）を順次連結していき、pBLDHKCB-PSを作製した。なお、SLX4断片、PDC5D断片のPCR増幅には、以下のプライマーを使用した。DNA増幅酵素としては、KOD plus DNA Polymerase（東洋紡社）を用い、PCR装置Gene Amp PCR system 9700（PE Applied Biosystems社）にて、96℃ 2分の処理後、96℃ 30秒→53℃ 30秒→72℃ 90秒の反応を25サイクル行い、4℃で保冷することにより増幅断片を得た。
【００９１】
SLX4断片の増幅
SLX4-U； ATA TAT GAG CTC GTA ATA CGC ATA CGA ATT CC （32mer：配列番号37）
SLX4-D； ATA TAT GCG GCC GCC CTG GAA GAC AGG ACA GAA （33mer：配列番号38）
PDC5D断片の増幅
PDC5D-U； CCA TGA TTA GAT GGG GTT TG （20mer：配列番号39）
PDC5D-D； CTG GAA GAC AGG ACA GAA （18mer：配列番号42）
【００９２】
選抜マーカーとして使用するフレオマイシン耐性BLEマーカー遺伝子は、次のように構築した。遺伝子データベース（GenebankおよびSGD; Saccharomyces Genome Database）を利用して、フレオマイシン耐性遺伝子、CYC1プロモーター遺伝子、CYC1ターミネーター遺伝子の配列データを入手し、本データをもとに、末端に制限酵素サイトを付加する形でプライマーを設計した。各プライマーの配列を以下に記す。
【００９３】
フレオマイシン耐性遺伝子断片の増幅
BLE ORF-U； ATA TAT GAA TTC ATG ACC GAC CAA GCG ACG C（31mer：配列番号43）
BLE ORF-D； ATA TAT AAG CTT TCA TGA GAT GCC TGC AAG C（31mer：配列番号44）
CYC1プロモーター断片の増幅
CYCP-U； ATA TAT GGA TCC GAC AGC ATC GTC GAA TAT G（31mer：配列番号45）
CYCP-D； ATA TAT GAA TTC TAT TAA TTT AGT GTG TGT ATT TG（35mer：配列番号46）
CYC1ターミネーター断片の増幅
CYCT-U； ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G（31mer：配列番号47）
CYCT-D； ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG（30mer：配列番号48）
【００９４】
フレオマイシン耐性遺伝子は、大腸菌XL1-Blue MRF' Kan株（STRATAGENE社）のゲノムDNAを鋳型に、またCYC1プロモーター遺伝子、CYC1ターミネーター遺伝子は、ワイン酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型にして、上記プライマーを用いてPCR反応を行い、遺伝子断片を得た。
【００９５】
PCRに鋳型として用いる大腸菌のゲノムDNAは、LB培地にて一晩振盪培養を行った後、集菌、洗浄したものを98℃ 10分間の加熱処理を加えて得た上清を、エタノール沈殿処理を行い、滅菌水50μlに溶解することにより調製した。また、酵母のゲノムDNAは、ワイン酵母OC2株を2ml YPD培地で一晩振盪培養を行った後、集菌し50mM Tris-HCl 500μlおよびガラスビース（425-600microns Acid Washed, SIGMA社）を加え、4℃で15分間ボルテックスを行った後、本溶液の上清にエタノール沈殿を行い、滅菌水50μlに溶解することにより調製した。
【００９６】
調製した各ゲノムDNA 5μlを鋳型として、50μｌの反応系でPCRを行った。DNA増幅酵素としてKOD plus DNA Polymerase（東洋紡社）を用い、PCR増幅装置GeneAmp PCR system 9700（PE Applied Biosystems社）にて、96℃ 2分の処理後、96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒の反応を25サイクル行い、 4℃で保冷した。増幅が確認された各遺伝子断片は、それぞれについて制限酵素反応を行い、末端に制限酵素サイトができるよう処理した。
【００９７】
上記の方法で作製した各断片を連結したpBBLECYCを構築した。構築における一連の設計手順を以下に示す。すなわち、制限酵素BamHI／EcoRI処理を施したCYC1P断片および、制限酵素HindIII／SalI処理を施したCYC1T断片を、同じ制限酵素で処理したpBluescript II SK+ベクター（東洋紡社）中に順次連結し、pBCYCPTベクターを作製した。次に本ベクターに制限酵素EcoRI／HindIII処理したものに、同じ制限酵素サイトをもつフレオマイシン耐性遺伝子断片を連結させて、pBBLECYCベクターを作製した。最後に、pBBLECYCから制限酵素SpeI／ApaI処理によってマーカー遺伝子を切り出し、これを平滑末端化した後、EcoRV処理したpBLDHKCB-PSベクターに連結し、最終目的とする染色体導入型ベクター pBBLE-LDHKCBベクターを構築した。
【００９８】
ベクター構築における詳細な操作方法はMolecular Cloning A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989) に従った。制限酵素および修飾酵素は、宝酒造のものを使用した。T4 DNA LigaseによるLigation反応には、Liga Fast Rapid DAN Ligation System（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。またプラスミドベクターの形質転換には大腸菌JM109株コンピテントセル（東洋紡社）を用いた。
【００９９】
構築したベクターpBBLE-LDHKCBが目的のものであるかどうかを、DNA塩基配列解析によって確認した。塩基配列解析装置としてはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems社）を使用し、操作の詳細は本装置添付のマニュアルに従った。試料となるベクターDNAはアルカリ抽出法により調製し、GFX DNAPurification kit（Amersham Pharmacia Biotech社）にてカラム精製した後、分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia Biotech社）にてDNA濃度を測定したものを用いた。
【０１００】
実施例５：酵母染色体導入用ベクターの構築（６コピー導入）
次に、G418耐性遺伝子をマーカーとして、LDH遺伝子6コピー導入用の染色体導入型ベクターを構築した。本ベクターをpBG418G-LDHKCBと称し、そのプラスミドベクターを図１１に示す。構築の一連の手順を以下に示すが、構築の順番はこれに限定されるものではない。
【０１０１】
本ベクターの構築手順としては、まず、制限酵素BamHI／PstI処理を施したpBluescript II SK+ベクター（東洋紡社）中に、実施例２にて構築したpBTRP-PDC1-LDHKCBベクターに同様の制限酵素処理して得られるLDHKCB断片を連結して、pBLDHKCBベクターを作製した。次に、本ベクターに、PCR増幅して得たPDC6断片、CTT1断片を順次連結していき、pBLDHKCB-PDC-CTTを作製した。なお、PDC6断片、CTT1断片のPCR増幅には、以下のプライマーを使用した。DNA増幅酵素としては、KODplus DNA Polymerase（東洋紡社）を用い、PCR装置Gene Amp PCR system 9700（PE Applied Biosystems社）にて、96℃ 2分の処理後、96℃ 30秒→53℃ 30秒→72℃ 90秒の反応を25サイクル行い、4℃で保冷することにより増幅断片を得た。
【０１０２】
PDC6断片の増幅
PDC6-U； ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C（31mer：配列番号49）
PDC6-D； ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C（34mer：配列番号50）
CTT1断片の増幅
CTT1-U； ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C（31mer：配列番号51）
CTT1-D； ATA TAT GGT ACC GGG CAA GTA ACG ACA AGA TTG（33mer：配列番号52）
【０１０３】
選抜マーカーとして使用するG418耐性マーカー遺伝子は、次のように構築した。遺伝子データベース（GenebankおよびSGD; Saccharomyces Genome Database）を利用して、G418耐性遺伝子、GAPプロモーター遺伝子、CYC1ターミネーター遺伝子の配列データを入手し、本データをもとに、末端に制限酵素サイトを付加する形でプライマーを設計した。各プライマーの配列を以下に記す。
【０１０４】
G418耐性断片の増幅
G418ORF-U； ATA TAT GAA TTC ATG AGC CAT ATT CAA CGG（30mer：配列番号53）
G418ORF-D； ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA（30mer：配列番号54）
GAPプロモーター断片の増幅
GAPP-U； ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AAA（33mer：配列番号55）
GAPP-D； ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CGA（33mer：配列番号56）
CYC1ターミネーター断片の増幅
CYCT-U； ATA TAT CTT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G（31mer：配列番号57）
CYCT-D； ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG（30mer：配列番号58）
【０１０５】
G418耐性遺伝子は、大腸菌XL1-Blue MRF' Kan株（STRATAGENE社）のゲノムDNAを鋳型に、またGAPプロモーター遺伝子、CYC1ターミネーター遺伝子は、ワイン酵母OC2株のゲノムDNAを鋳型にして、上記プライマーを用いてPCR反応を行い、遺伝子断片を得た。
【０１０６】
PCRに鋳型として用いる大腸菌のゲノムDNAは、LB培地にて一晩振盪培養を行った後、集菌、洗浄したものを98℃ 10分間の加熱処理を加えて得た上清を、エタノール沈殿処理を行い、滅菌水50μlに溶解することにより調製した。また、酵母のゲノムDNAは、ワイン酵母OC2株を2ml YPD培地で一晩振盪培養を行った後、集菌し50mM Tris-HCl 500μlおよびガラスビース（425-600microns Acid Washed, SIGMA社）を加え、4℃で15分間ボルテックスを行った後、本溶液の上清にエタノール沈殿を行い、滅菌水50μlに溶解することにより調製した。
【０１０７】
調製した各ゲノムDNA 5μlを鋳型として、50μｌの反応系でPCRを行った。DNA増幅酵素としてKOD plus DNA Polymerase（東洋紡社）を用い、PCR増幅装置GeneAmp PCR system 9700（PE Applied Biosystems社）にて、96℃ 2分の処理後、96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒の反応を25サイクル行い、 4℃で保冷した。増幅が確認された各遺伝子断片は、それぞれについて制限酵素反応を行い、末端に制限酵素サイトができるよう処理した。
【０１０８】
上記の方法で作製した各断片を連結したpBG418Gを構築した。構築における一連の設計手順を示す。すなわち、制限酵素BamHI／EcoRI処理を施したGAPP断片および、制限酵素HindIII／SalI処理を施したCYC1T断片を、同じ制限酵素で処理したpBluescript II SK+ベクター（東洋紡社）中に順次連結し、pBCYCPTベクターを作製した。次に本ベクターに制限酵素EcoRI／AflII処理したものに、同じ制限酵素サイトをもつG418耐性遺伝子断片を連結させて、pBG418Gベクターを作製した。
【０１０９】
PBG418Gから制限酵素BamHI／SacII処理によってマーカー遺伝子を切り出し、これを平滑末端化した後、HincII処理したpBLDHKCB-PDC-CTTベクターに連結し、最終目的とする染色体導入型ベクター pBG418G-LDHKCBベクターを構築した。
【０１１０】
ベクター構築における詳細な操作方法はMolecular Cloning ~A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989) に従った。制限酵素および修飾酵素は、宝酒造のものを使用した。T4 DNA LigaseによるLigation反応には、Liga Fast Rapid DAN Ligation System（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。またプラスミドベクターの形質転換には大腸菌JM109株コンピテントセル（東洋紡社）を用いた。
【０１１１】
構築したベクターpBG418G-LDHKCBが目的のものであるかどうかを、DNA塩基配列解析によって確認した。塩基配列解析装置としてはABI PRISM 310 Genetic Analyzer（PE Applied Biosystems社）を使用し、操作の詳細は本装置添付のマニュアルに従った。試料となるベクターDNAはアルカリ抽出法により調製し、GFX DNA Purification kit（Amersham Pharmacia Biotech社）にてカラム精製した後、分光光度計Ultro spec 3000（Amersham Pharmacia Biotech社）にてDNA濃度を測定したものを用いた。
【０１１２】
実施例６；酵母への形質転換
酵母への遺伝子導入法は、Itoらの手法（Ito,H., Y.Fukuda, K.Murata and A.Kimura, Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J.Bacteriol. Vol.153, p163-168, 1983）に従った。すなわち、実施例３，４及び５にて作製した３種類のベクターを順次導入した。酵母を10ml YPD培地にて30℃で対数増殖期まで培養を行い、集菌およびTEバッファーによる洗浄を行った。
【０１１３】
次に、0.5ml TEバッファーと0.5mlの0.2M酢酸リチウムを加え、30℃にて1時間の振盪培養を行った後に、ベクターを添加した。本酵母懸濁液を30℃で30分間振盪培養後、150μlの70%ポリエチレングリコール4000（和光純薬工業）を加え、よく攪拌した。さらに30℃にて1時間振盪培養した後、42℃にて5分間ヒートショックを与え、菌体を洗浄した。本試料を500μlのYPD培養液にて30℃、20時間振盪培養後、これを集菌および洗浄し、500μlの滅菌水に溶解した。G418濃度200μg/ml含有のYPD培地に50μl塗沫し、30℃ 静置培養にて選抜を行った。
【０１１４】
得られたコロニーを新たなG418選抜培地に画線培養し、安定性が確認できた選抜株について、遺伝子導入の有無をPCR解析によって確認した。PCRに鋳型として用いる酵母のゲノムDNAは、シングルコロニーを2ml YPD培地で一晩振盪培養を行った後、集菌し50mM Tris-HCl 500μlおよびガラスビース（425-600microns Acid Washed, SIGMA社）を加え、4℃で15分間ボルテックスを行うことにより調製した。本溶液の上清を用いてエタノール沈殿を行い、滅菌水50μlに溶解した。調製したゲノムDNA 5μlを鋳型として、50μｌの反応系でPCRを行った。DNA増幅酵素としてはEx Taq DNA Polymerase（宝酒造社）を用い、PCR増幅装置Gene AmpPCR system 9700（PE Applied Biosystems社）を使用した。PCR増幅装置の反応条件は、96℃ 2分の後、96℃ 30秒→55℃ 30秒→72℃ 90秒の反応を30サイクル行い、その後4℃とした。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
【０１１５】
検出用プライマー配列
▲１▼pBTRP-PDC1-LDHKCB:
プライマー１：CTCATACATGTTTCATGAGGGT（配列番号59）
プライマー２：AAAGTATCAGCAGATTTTTT（配列番号60）
▲２▼pBBLE-LDHKCB：
プライマー１：TCATTGGTGACGGTTCTCTACA（配列番号61）
プライマー２：CGATAGCAAGTAGATCAAGACA（配列番号62）
▲３▼pBG418G-LDHKCB:
プライマー１：ACCAGCCCATCTCAATCCATCT（配列番号63）
プライマー２：ACACCCAATCTTTCACCCATCA（配列番号64）
【０１１６】
実施例７：光学純度の測定
実施例６で得られた菌株を用いて１０％グルコースを含むYPD液体培地にて静置発酵させた培養液中のL乳酸、D乳酸を酵素法により分別測定した結果を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
また、実施例６で得られた菌株を用いて１５％グルコースを含むYPD液体培地にて炭酸カルシウムを３％加え静置発酵させた培養液中のL乳酸、D乳酸を酵素法により分別測定した結果を表２に示す。
【０１１９】
【表２】
表１及び２の結果から、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ属の酵母に対してＬＤＨ遺伝子を導入することで、光学純度の高いL-乳酸を合成できる事が明らかとなった。この結果から、宿主としてサッカロマイセス・セレビシエ属の酵母のように、低乳酸ラセマーゼ活性の宿主を用いることによって、光学純度の高いL-乳酸又はD-乳酸を合成できることが明らかとなった。
【０１２１】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明に係る乳酸の製造方法によれば、宿主内において、高光学純度で乳酸を合成することができる。したがって、本発明に係る乳酸の製造方法により得られた乳酸を使用して、高品質なポリ乳酸を製造することができる。
【０１２２】
【配列表】
【配列表フリーテキスト】
配列番号５〜３８、４２〜６４はプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【図１】全合成したＬＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す図である。
【図２】サッカロマイセス・セレビシエにおけるコドン用法と使用頻度を示す図である。
【図３】ウシ由来のＬＤＨの塩基配列とこれを改変設計した塩基配列とのホモロジー解析結果を示す図である。上段がウシ由来のＬＤＨ塩基配列であり、下段が改変塩基配列であり、改変塩基配列においてウシ由来の塩基配列と異なる塩基が記号（Ａ，Ｔ，ＣあるいはＧ）で記載されている。
【図４】実施例１で用いたＰＣＲによる長鎖ＤＮＡ合成に使用したプライマー構成と、合成ステップ（ステップ１〜４）を示す図である。
【図５】構築されたベクターｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨＫＣＢのプラスミドマップを示す図である。
【図６】図５に示すベクターの構築工程の一部を示す図である。
【図７】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一部を示す図である。
【図８】ｐＢＴｒｐ−ＰＤＣ１−ＬＤＨの構築工程の一部を示す図である。
【図９】図５に示すベクターの構築工程の一部（最終工程）を示す図である。
【図１０】構築されたpBBLE-LDHKCBのプラスミドマップを示す図である。
【図１１】構築されたpBG418G-LDHKCBのプラスミドマップを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing lactic acid, which is a raw material for polylactic acid, and particularly to a method for producing lactic acid using a biological host.
[0002]
[Prior art]
With the advance of recombinant DNA technology, a technology for obtaining a target gene product by expressing a foreign gene in a host such as a microorganism, a mold, an animal, a plant, and an insect and growing a transformant thereof has been developed. For example, by culturing yeast or the like, it is possible to produce a large amount of the target gene product by fermentation production. Until now, there have been several attempts to produce L-lactic acid by yeast. There is an attempt to introduce a bovine lactate dehydrogenase (LDH) gene into yeast Saccharomyces cerevisiae to produce L-lactic acid (see Non-Patent
[0003]
However, none of the reports showed high production of L-lactic acid, and it was not possible to produce L-lactic acid with high optical purity.
[0004]
[Non-patent document 1]
Eri Adachi et al. "Modification of metabolic pasthway of Saccaromyces cerevisiae by the expression of lactate dehydrogenase and deletion of pyruvate genes fo the lactic acid fermentation at low pH value", J. Ferment. Bioeng. Vol. 86, No. 3, 284-289. , 1988
[Non-patent document 2]
Danio Porro et al. "Development of metabolically engineered Saccaromyces cerevisiae cells for the production of lactic asid", Biotechnol.Prog. Vol. 11, 294-298, 1995.
[Patent Document 1]
JP 2001-516584 A
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, an object of the present invention is to provide a method for producing lactic acid that can obtain lactic acid with high optical purity in view of the above-described situation.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive studies and as a result, found that lactic acid can be synthesized with high optical purity by synthesizing lactic acid in a host having low lactate racemase activity, and completed the present invention. .
[0007]
The present invention includes the following.
(1) A method for producing lactic acid, wherein lactic acid is synthesized in a host having low lactic acid racemase activity.
In the above method (1), a host in which the lactate racemase gene is deleted and / or mutated to inactivate and / or reduce the activity of the lactate racemase can be used. In the method (1), a host into which an L-lactate dehydrogenase gene or a D-lactate dehydrogenase gene has been introduced can be used.
[0008]
Furthermore, in the above method (1), it is preferable to use yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a host. Furthermore, in the above method (1), a host into which a bovine L-lactate dehydrogenase gene has been introduced can be used. In the above method (1), it is preferable to use yeast (Saccharomyces cerevisiae) as the host and to introduce multiple copies of the bovine L-lactate dehydrogenase gene into the yeast. Furthermore, in the above method (1), the optical purity of lactic acid synthesized in the host can be 98% or more.
[0009]
Further, the present invention includes the following.
(2) A method for producing lactic acid, comprising synthesizing lactic acid in a host having low racemase activity and synthesizing lactic acid with an optical purity of 98% or more.
(3) A method for producing polylactic acid, comprising using lactic acid produced by the method for producing lactic acid according to (1).
[0010]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The method for producing lactic acid according to the present invention is to synthesize lactic acid in a host having low lactic acid racemase activity.
[0011]
The host in the method for producing lactic acid according to the present invention is not particularly limited as long as it has low lactic acid racemase activity. For example, as a host, microorganisms, animal cells, plant cells, insect cells, and the like can be used. Examples of microorganisms include Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi, basidiomycetes, algae, rickettsia, lactic acid bacteria, acetic acid bacteria, and mold. Examples of animal cells include CHO cells and Hela cells. Examples of plant cells include grape callus cells, yew callus cells, sweet potato cells, tobacco cells, corn cells, carrot cells, rice cells, and the like. Examples of insect cells include sf9 and sf21.
[0012]
In addition, a host that expresses lactate racemase and has lactate racemase activity can be used as a host if the lactate racemase gene is deleted and / or mutated to inactivate and / or reduce the activity of lactate racemase. be able to. Conventionally known techniques can be applied to delete and / or mutate the lactate racemase gene in the host. For example, as described in “Genetic Analysis of the Pynucate Decarboxylase Reaction in Yeast Glycosis” (Jurnal of Bacteriology 1982, p1146-1152), deletion of pyruvate decarboxylase activity by mutation treatment with ethyl methanesulfonate is described. And the racemase activity can be deleted by a similar technique. In addition, the lactate racemase gene can be deleted or mutated using a chromosome transfer type vector and homologous recombination.
[0013]
In the method for producing lactic acid according to the present invention, low lactate racemase activity means that the lactate racemase activity in the host is zero or 0.1 U or less.
[0014]
In addition, the lactate racemase activity is a method of quantifying D-lactic acid generated from L-lactic acid or L-lactic acid generated from D-lactic acid with lactate dehydrogenase or L-lactic acid dehydrogenase specific to D-lactic acid, respectively ( Dennis, D. (1962) Meth. Enzymol. 5, 430-432), a method for measuring the change in optical rotation (see Katagiri, H. et al., (1961) Agric. Biol. Chem. 25, 281-289) or It can be measured by a method of measuring by a pressure measurement method in the presence of D-lactate dehydrogenase and methylene blue (see Katagiri, H. et al., (1961) Agric. Biol. Chem. 25, 281-289).
[0015]
In order to synthesize lactic acid in a host having low lactate racemase activity, for example, a method of introducing an L-lactate dehydrogenase gene or a D-lactate dehydrogenase gene into the host can be mentioned. When an L-lactate dehydrogenase gene is introduced into a host, L-lactic acid can be synthesized from pyruvate. When a D-lactate dehydrogenase gene is introduced into a host, D-lactate can be synthesized. In any case, since the lactate racemase activity in the host is low, racemization in the host can be prevented, and L-lactic acid or D-lactic acid with high optical purity can be synthesized.
[0016]
Lactate dehydrogenase gene
The L-lactate dehydrogenase gene and the D-lactate dehydrogenase gene to be introduced into the host are not particularly limited as long as they encode a protein having L-lactate dehydrogenase activity or D-lactate dehydrogenase activity. . Hereinafter, a protein having L-lactate dehydrogenase activity is referred to as “LDH”. LDH is known as an enzyme that mediates the reaction that produces L-lactic acid from pyruvate in the glycolysis system of prokaryotes such as lactic acid bacteria or eukaryotic microorganisms such as mold, or in muscle tissues of higher organisms.
[0017]
In addition, in the present specification, the DNA constituting the gene does not ask for its origin such as cDNA, genomic DNA and synthetic DNA. The DNA may be a single strand, a double strand having a complementary strand thereof, or may contain a natural or artificial nucleotide derivative.
[0018]
LDH has various homologs depending on the type of organism or in vivo. The LDH of the present invention includes naturally-occurring LDH as well as LDH which is artificially synthesized by chemical synthesis or genetic engineering.
[0019]
The LDH is preferably derived from prokaryotes such as lactic acid bacteria or eukaryotic microorganisms such as mold, more preferably derived from higher eukaryotes such as plants, animals and insects, and further preferably derived from cows and the like. Derived from higher eukaryotes, including mammals. Most preferred is LDH from bovine. For example, a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be mentioned as a bovine LDH. Furthermore, the LDH of the present invention also includes homologs of these LDHs. LDH homologues are proteins having one or several amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions in the amino acid sequence of naturally occurring LDH and having LDH activity, and naturally occurring LDHs. It includes proteins having at least 70%, preferably at least 80%, homology between LDH and the amino acid sequence and having LDH activity.
[0020]
The L-lactate dehydrogenase gene of the present invention can have a base sequence using codon usage frequently used in a host organism to be transformed. For example, the L-lactate dehydrogenase gene can have a base sequence that is genetically encoded using codon usage in the genus Saccharomyces, particularly Saccharomyces cerevisiae. FIG. 2 shows codon usage in Saccharomyces cerevisiae.
[0021]
In this codon usage, it is preferable to use the underlined codon as the codon of the amino acid corresponding thereto. That is, UUU (Phe), UCU (Ser), UAU (Tyr), UGU (Cys), UUG (Leu), CAU (His), CCA (Pro), CAA (Gln), AUU (Ile), ACU (Thr) ), AAU (Asn), AAA (Lys), AGA (Arg), AUG (Met), GUU (Val), GCU (Ala), GAU (Asp), GGU (Gly), GAA (Glu) preferable. These are all shown in the form of a base sequence on RNA, but in the case of DNA, U is T.
[0022]
When designing the L-lactate dehydrogenase gene with a new base sequence by modifying the original L-lactate dehydrogenase gene based on the codon usage of heterologous organisms such as Saccharomyces, before modification (natural origin) This codon usage is preferably applied to 70% or more of the codons of the base sequence of the above, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, and most preferably all codons. This codon usage has been applied.
[0023]
In a preferred embodiment of the L-lactate dehydrogenase gene of the present invention, the base sequence of bovine LDH (SEQ ID NO: 41) is designed by applying the above codon usage (codon usage of Saccharomyces cerevisiae). Enzyme genes can be mentioned. Among them, an L-lactate dehydrogenase gene having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or consisting of these nucleotide sequences is a preferred embodiment. In the base sequence of the coding region of the base sequence, a codon different from the original codon is used for all amino acids except methionine.
[0024]
In a preferred embodiment, it is preferable to have a Kozak sequence near the start codon of the LDH coding region (with the start codon interposed). Specifically, in DNA as a Kozak sequence, 5'-ANNATGG-3 ', where N may be any of A, T, C and G. ) Is preferable (in the case of RNA, this refers to a form in which T is replaced by U in this sequence). For example, the base sequence described in SEQ ID NO: 3 has a base sequence of 5'-ACAATGG-3 'with the start codon (ATG) interposed therebetween.
[0025]
Further, it is preferable that the L-lactate dehydrogenase gene does not contain a sequence that destabilizes mRNA. For example, it is preferable not to include not only a sequence such as a poly A signal sequence, a sequence containing a stem loop structure, and a TATATA sequence, but also a remarkable repeating sequence. For example, it is preferable that the appearance rate of a sequence of about 10 bp is 2% or less in DNA (particularly, a coding region of a protein), and more preferably, it is not contained at all.
[0026]
In addition, it is preferable to design the entire L-lactate dehydrogenase gene so that there is no difference in the bias of the GC content. For example, it is preferable that the GC content of each of a plurality of regions separated from the 5 'side (particularly, the initiation codon) by 100 bases is in the range of about 20% to about 40%.
[0027]
Further, it is preferable that the total GC content is about 20% or more and about 40% or less. The total GC content of the bovine natural LDH sequence (SEQ ID NO: 41) is 44.94%. For example, in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3, the total GC content is 31 This is because it is 0.4% and 32.0%. More preferably, it is about 25% or more and about 35% or less.
[0028]
Alternatively, it is preferable to design such that the total GC content is reduced by about 10% to 15%, preferably about 13% to 14% as compared with the natural DNA sequence.
[0029]
As the L-lactate dehydrogenase gene of the present invention, at least one of application of codon usage in a host organism to be introduced, presence of a Kozak sequence, and suitable GC content (dispersibility of GC content, total GC content). Preferably, it has one type of feature. More preferably, it has two or more types, most preferably three types. Further, in the present L-lactate dehydrogenase gene, it is preferable that codon usage in a host organism is applied.
[0030]
In particular, when transforming a genus Saccharomyces (including a cerevisiae species) as a host, it is preferable that the codon usage in the genus Saccharomyces (especially, a cerevisiae species) is applied.
[0031]
Furthermore, it is preferable that the L-lactate dehydrogenase gene is designed so as not to have an inappropriate restriction enzyme site in the gene cloning step, particularly in the coding region. Specifically, it is preferable not to include sites such as Eco RI, Xho I, and Afl II. On the other hand, in consideration of the gene cloning operation, it is preferable to provide a useful restriction enzyme site outside the coding region. For example, sites such as Eco RI, Xho I, Afl II can be located upstream and / or downstream of the coding region. For example, in the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3, the region from the start codon to the stop codon does not have Eco RI, Xho I, and Afl II sites. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, an Eco RI site is provided upstream of the start codon, and Xho I and Afl II are provided downstream of the stop codon.
[0032]
The L-lactate dehydrogenase gene of the present invention also includes an L-lactate dehydrogenase gene homolog consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 1 and 3. Examples of L-lactate dehydrogenase gene homologs include L-lactate dehydrogenase gene homologs that hybridize with these DNAs under stringent conditions. That is, it is a homolog of the L-lactate dehydrogenase gene that hybridizes under stringent conditions to the whole or a part of any of these L-lactate dehydrogenase genes or a complementary strand thereof. Such homologs encode proteins that simultaneously have LDH activity.
[0033]
An L-lactate dehydrogenase gene homolog that hybridizes under stringent conditions refers to, for example, at least 20, preferably 25, more preferably at least 30 contiguous sequences of the original nucleotide sequence. One or a plurality of selected DNAs are used as probe DNAs, and hybridization techniques known to those skilled in the art (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons Sectoin 6.3-6.4) and the like are used. Used to include hybridizing DNA.
[0034]
Here, stringent conditions include a hybridization temperature of 37 ° C. in the presence of 50% formamide, and more stringent conditions of about 42 ° C. More severe conditions can be about 65 ° C. in the presence of 50% formamide.
[0035]
Further, in the amino acid sequence of bovine LDH (for example, SEQ ID NO: 2), one or several amino acids consist of an amino acid sequence with substitution, deletion, insertion and / or addition, and encode LDH. DNAs that hybridize under stringent conditions to DNA consisting of all or part of a bovine LDH-encoding nucleotide sequence (eg, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3) or a complementary strand thereof are also included in the present invention. L-lactate dehydrogenase gene.
[0036]
Further, in the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence described in the coding region of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3, one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added, and A DNA that encodes LDH and has a base sequence in which a base corresponding to the amino acid substitution or the like has been modified in the coding region of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is also included in the L-lactate dehydrogenase gene of the present invention. included.
[0037]
The number of mutations in the amino acid sequence is not limited as long as the function of the original protein can be maintained, but is preferably within 70% of all amino acids, more preferably within 30%, and still more preferably 20%. %.
[0038]
Further, such an L-lactate dehydrogenase gene homolog contains a base sequence having at least 80%, preferably 90% or more homology to the coding region of the base sequence of the original DNA, or It is preferably a DNA consisting of a base sequence. The homology of the DNA base sequence can be determined by a gene analysis program BLAST or the like.
[0039]
In addition, the L-lactate dehydrogenase gene can be chemically synthesized, or the method of Fujimoto et al., Which is known as a method for synthesizing long chain DNA (Fujimoto, Hideya, Synthetic gene production method, Plant cell engineering,
[0040]
The modification of the amino acid sequence may be performed by introducing a site-specific displacement method (Current Protocols I Molecular Biology edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wily & Sons Sectoin 8.1-8.5) into the amino acid sequence to be modified. It can be performed by appropriately introducing substitution, deletion, insertion, and / or addition mutation. In addition, such modifications are not limited to those obtained by artificially introducing or synthesizing mutations, but also include those resulting from amino acid mutations in the natural world based on or not limited to artificial mutation treatment. .
[0041]
DNA construct comprising lactate dehydrogenase gene
A DNA construct for introducing the above-described lactate dehydrogenase gene into a host will be described. By transforming a host cell with the lactate dehydrogenase gene of the present invention and expressing the protein encoded by this DNA, L-lactic acid can be produced in the host cell by its LDH activity.
[0042]
In the transformation, a DNA construct that enables the DNA segment comprising the above-described L-lactate dehydrogenase gene to be expressed in host cells is used. The form of the DNA construct for transformation is not particularly limited, and plasmid (DNA), bacteriophage (DNA), retrotransposon (DNA), artificial chromosome (YAC, PAC, BAC, MAC, etc.) may be It can be selected and adopted depending on the type of introduction (extrachromosomal or intrachromosomal) and the type of host cell. Therefore, the present DNA construct can include, in addition to the above-described L-lactate dehydrogenase gene, a component segment of the vector of any of these embodiments. Preferred prokaryotic, eukaryotic, animal and plant cell vectors are well known in the art.
[0043]
The plasmid DNA includes, for example, YCp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pRS413, pRS415, pRS416, YCp50, pAUR112 or pAUR123, YEp-type E. coli-yeast shuttle vector such as pYES32 or YEp13, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406. , PAUR101 or pAUR135, a plasmid derived from Escherichia coli (pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC119, pTV118N, pTV119N, pBluescript, pHSG298, pHSG39 or pCAC17 or pAC99, etc. P1A-based plasmid, pM 118, pMW119, pMW218 or pSC101-based plasmids such as pMW219 and the like), plasmids derived from Bacillus subtilis (e.g., and the like pUB110, pTP5, etc.). Examples of the phage DNA include λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt100, gt11, zap), φX174, M13mp18, and M13mp19. Examples of retrotransposons include Ty factors. Examples of YAC include pYACC2.
[0044]
To construct the present DNA construct, a fragment containing the above-described L-lactate dehydrogenase gene is cut with an appropriate restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multiple cloning site of a vector DNA to be used.
[0045]
A first embodiment of the present DNA construct includes a promoter segment that is linked to express a DNA segment comprising the above-described L-lactate dehydrogenase gene. That is, the above-mentioned L-lactate dehydrogenase gene segment is linked to the downstream side of the promoter so as to be controllable by the promoter.
[0046]
In expression of the above-mentioned L-lactate dehydrogenase gene, that is, expression of LDH, since expression in yeast is preferable, it is preferable to use a promoter expressed in yeast. As such a promoter, for example, it is preferable to use a pyruvate decarboxylase gene promoter, a gal1 promoter, a gal10 promoter, a heat shock protein promoter, an MFα1 promoter, a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, an AOX1 promoter, and the like. . In particular, a pyruvate decarboxylase (1) promoter derived from Saccharomyces is preferable, and a
[0047]
A second DNA construct, which is another embodiment of the present DNA construct, includes a DNA segment for homologous recombination in a host chromosome in addition to the present DNA. The DNA segment for homologous recombination is a DNA sequence homologous to the DNA sequence near the target site where the above-described L-lactate dehydrogenase gene is to be introduced into the host chromosome. At least one, and preferably two, DNA segments for homologous recombination are provided. For example, two DNA segments for homologous recombination are DNA sequences homologous to the DNA upstream and downstream of the target site on the chromosome, and the L-lactate dehydrogenase gene described above is interposed between these DNA segments. It is preferable to connect.
[0048]
When the above-described L-lactate dehydrogenase gene is introduced into a host chromosome by homologous recombination, the present DNA can be introduced so as to be controllable by a promoter on the host chromosome. In this case, by introducing the target gene, the endogenous gene which should be controlled by the promoter can be destroyed at the same time, and the exogenous L-lactate dehydrogenase gene can be expressed in place of the endogenous gene. . It is particularly useful when the promoter is a high expression promoter in a host cell.
[0049]
In order to create such an expression system on the host chromosome, a highly expressed gene is targeted in the host chromosome, and the above-described L-lactate dehydrogenase gene is introduced downstream of the promoter that controls this gene so as to be controlled by the promoter. It is preferable to do so. When an ethanol-fermenting microorganism such as yeast is used as a host, the pyruvate decarboxylase gene (particularly,
[0050]
The first DNA construct can be used as a DNA construct for homologous recombination by providing a DNA segment for homologous recombination with the host chromosome. In the first DNA construct, the promoter segment in the DNA construct can be used also as a DNA segment for homologous recombination with the host chromosome. For example, for a host Saccharomyces cerevisiae, a DNA construct having a promoter on the Saccharomyces cerevisiae host chromosome, for example, a
[0051]
In addition, a terminator, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and a ribosome binding sequence (SD sequence) can be linked to the DNA construct, if necessary. The selection marker is not particularly limited, and various known selection marker genes including a drug resistance gene, an auxotrophy gene and the like can be used. For example, a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene and the like can be used.
[0052]
Transformation with DNA construct
Hereinafter, the transformation of a host with the above-described DNA construct will be described. Once the DNA construct has been constructed, transforming, transfection, conjugation, protoplast fusion, electroporation, lipofection, lithium acetate, particle gun, calcium phosphate precipitation, and This can be introduced by any of various appropriate means such as Agrobacterium method, PEG method, direct microinjection method and the like. After introduction of the DNA construct, the recipient cells are cultured in a selective medium.
[0053]
As the host cell, as described above, a host having low lactate racemase activity is used. For example, as a host, bacteria such as Eshrichia coli and Bacillus subtilis, yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastoris, insect cells such as sf9 and sf21, COS cells, Chinese Animal cells such as hamster ovary cells (CHO cells) and plant cells such as sweet potato and tobacco can be used. Preferably, it is a microorganism such as yeast that performs alcohol fermentation or an acid-resistant microorganism, for example, yeast such as Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae. Specifically, it is Saccharomyces cerevisiae IFO2260 strain or YPH strain.
[0054]
In the transformant transformed with the DNA construct, the components of the DNA construct are present on the chromosome or on extrachromosomal factors (including artificial chromosomes). When the DNA construct is maintained extrachromosomally or is integrated into the chromosome by random integration, other enzymes using pyruvate as a substrate of LDH as a substrate, for example, pyruvate decarboxylation It is preferable that the enzyme gene (
[0055]
When the DNA construct described above, which is capable of achieving homologous recombination, is introduced, the promoter is controllably linked to a desired promoter on the host chromosome or a downstream of the homolog of the promoter replaced with the promoter. The DNA segment which is the above-described L-lactate dehydrogenase gene is present. In the case of a transformant of Saccharomyces yeast, the present DNA should be provided so that it can be controlled by the promoter downstream of the
[0056]
Usually, on the downstream side of the above-mentioned L-lactate dehydrogenase gene in the homologous recombinant, a selectable marker gene or a part of the disrupted structural gene (a site corresponding to the homologous sequence on the DNA construct) is located. Exists.
[0057]
In addition, whether or not the above-described L-lactate dehydrogenase gene has been introduced under a desired promoter can be confirmed by a PCR method or a Southern hybridization method. For example, it can be confirmed by preparing DNA from a transformant, performing PCR using primers specific for the introduced site, and detecting the expected band in the electrophoresis of the PCR product. Alternatively, it can be confirmed by performing PCR using a primer labeled with a fluorescent dye or the like. These methods are well known to those skilled in the art.
[0058]
Lactic acid production
Hereinafter, production of lactic acid having high optical activity using the above-described transformant will be described. By culturing a transformant obtained by introducing the DNA construct, lactic acid, which is an expression product of a foreign gene, is produced in the culture. Lactic acid can be obtained by performing the step of separating lactic acid from the culture. In the present invention, the culture includes culture cells or bacterial cells, crushed cells or bacterial cells, in addition to the culture supernatant.
[0059]
In culturing the transformant of the present invention, culture conditions can be selected according to the type of the transformant. Such culture conditions are well known to those skilled in the art.
[0060]
The medium for culturing the transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the microorganism, so that the culture of the transformant can be efficiently performed. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium can be used. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used. As the nitrogen source, ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate or other ammonium salts of inorganic or organic acids or other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, etc. may be used. it can. As the inorganic substance, potassium (I) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, and the like can be used.
[0061]
The cultivation is usually performed at 30 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. During the culture period, the pH is preferably maintained at 2.0 to 6.0. The pH can be adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, or the like. During the culture, constituents such as ampicillin and tetracycline can be added to the medium as needed.
[0062]
As a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host, a commonly used RPMI1640 medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums can be used. Culture is usually performed with 5% COTwoPerform in the presence at 37 ° C. for 1-30 days. During culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed.
[0063]
After completion of the cultivation, a usual protein production means or the like can be used to separate the gene product from the culture. For example, when it is produced in a transformed cell, the gene product can be separated from the cells by disrupting the cells by ultrasonic disruption, trituration, pressure crushing, etc., by a conventional method. In this case, a protease is added as necessary. When the gene product is produced in the culture supernatant, the solution is subjected to filtration, centrifugation or the like to remove solids, and if necessary, to remove nucleic acids by protamine treatment or the like.
[0064]
Ammonium sulfate, alcohol, acetone, and the like are added to these crude extract fractions, fractionated, and the precipitate is collected to obtain a crude protein solution. This protein solution can be subjected to various types of chromatography, electrophoresis and the like to obtain a purified enzyme preparation. For example, Sephadex, gel filtration using ultragel or biogel, etc., ion-exchange chromatography, electrophoresis using polyacrylamide gel, etc., affinity chromatography, fractionation method using reverse phase chromatography, etc., appropriately selected, Alternatively, by combining these, a purified target gene product can be obtained. The amino acid sequence of the purified gene product can be determined by a known amino acid analysis method. The above-described culturing method and purification method are merely examples and are not intended to limit the present invention.
[0065]
In particular, in the present invention, since lactic acid is synthesized in a host having low lactic acid racemase activity, racemization of the synthesized L-lactic acid or D-lactic acid can be prevented, and L-lactic acid or D-lactic acid having a high optical purity can be prevented. -You can get lactic acid. Since L-lactic acid or D-lactic acid obtained by applying the present invention has high optical purity, it is suitable, for example, as a raw material for producing high-quality polylactic acid. In other words, according to the present invention, L-lactic acid or D-lactic acid having high optical purity for producing high-quality polylactic acid can be obtained.
[0066]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0067]
Example 1: Design of DNA sequence of L-lactate delipidase gene
In order to efficiently produce L-lactate dehydrogenase, which is a protein derived from bovine as a higher eukaryote, in the genus Saccharomyces cerevisiae, a DNA encoding the amino acid sequence of L-lactate dehydrogenase from bovine ( Based on SEQ ID NO: 41), a novel gene sequence not found in nature was designed using the following items as design guidelines.
1) Codons frequently used in Saccharomyces cerevisiae were used.
2) Kozak sequence (ANNATGG) was added across the start codon.
3) Eliminate unstable and repeated sequences of mRNA as much as possible
4) There was no difference in the bias of the GC content over the entire region.
5) Inappropriate restriction enzyme sites for gene cloning were not formed in the designed sequence.
6) Useful restriction enzymes EcoRI, XhoI and AflIII sites were added to both ends for integration into a chromosome transfer vector.
[0068]
The frequency of codon usage in yeast can be determined using the Saccharomyces cerevisiae obtained from the Codon Usage Database (HYPERLINK http://www.kazusa.co.jp/codon/, http://www.kazusa.or.jp/codon/). Is shown in FIG. In this figure, codons frequently used corresponding to specific amino acids were identified (underlined codons).
[0069]
A novel DNA sequence (999 bp) (hereinafter referred to as LDHKCB gene) encoding a protein having LDH activity obtained based on the above 2) to 5) design guidelines, in addition to the use of codons in the codon usage shown in FIG. Is shown in SEQ ID NO: 1. In addition, the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a DNA sequence (1052 bp) containing the upstream side of the start codon and the downstream side of the stop codon (hereinafter, referred to as LDHKCB sequence) are shown in SEQ ID NO: 3 and FIG.
[0070]
In the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 1, codons different from those used in the original DNA sequence were used for all amino acids except methionine. The newly adopted codons were all frequently used codons shown in FIG. FIG. 3 shows the results of homology analysis performed by a computer on the original bovine LDH gene and LDHKCB gene. As apparent from FIG. 3, it was found that a large number of substitutions were required over almost the entire DNA sequence.
[0071]
Example 2: Total synthesis of LDHKCB sequence
In this example, Fujimoto et al.'S method known as a method for synthesizing long chain DNA (Fujimoto Hideya, Synthetic Gene Preparation Method, Plant
[0072]
Specifically, two kinds of oligonucleotide primers to be ligated first are mixed, and 96 ° C. for 2 minutes, 68 ° C. for 2 minutes, 54 ° C. for 2 minutes, and 72 ° C. in the presence of KOD-plus-DNA polymerase (Toyobo). The DNA extension reaction was performed under the reaction conditions at 30 ° C. for 30 minutes. Next, using a 1/10 amount of this sample as a template, in the presence of primers at both ends, after 96 minutes at 96 ° C., 25 cycles of 96 ° C. 30 seconds → 55 ° C. 30 seconds → 72 ° C. 90 seconds were performed, Thereafter, a PCR reaction at 4 ° C. was performed. As the buffer, dNTPmix, and the like in the reaction, those attached to the DNA polymerase were used.
[0073]
A series of overlapping PCR methods were sequentially performed according to FIG. 4 to prepare a final target gene fragment. Various primers shown in FIG. 4 (BA, B01, BB, B02, BC, B03, BD, B04, BE, B05, BF, B06, BG, B07, BH, B08, BI, B09, BJ, B10, BK, B11 , BL, B12, BM, B13, BN, and B14 are shown in SEQ ID NOs: 5 to 32. The nucleotide sequence of the synthesized LDHKCB sequence was confirmed, and then digested with EcoRI. Similarly, the resultant was ligated to pCR2.1 TOPO Vector (Invitrogen), which was similarly treated with EcoRI, and this vector was designated as pBTOPO-LDHKCB vector.
[0074]
Example 3: Construction of yeast chromosome transfer vector (2-copy transfer)
A yeast chromosome transfer vector was constructed using the LDHKCB sequence totally synthesized in Example 2. This vector is called pBTRP-PDC1-LDHKCB, and the plasmid map is shown in FIG.
[0075]
1. Isolation of PDC1P fragment for construction of pBTrp-PDC1-LDHKCB
The PDC1P fragment was isolated by PCR amplification using genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae strain YPH (Stratagene) as a template.
[0076]
Genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae YPH strain was prepared using Fast DNA Kit (Bio101), which is a genome preparation kit, in detail according to the attached protocol. The DNA concentration was measured with a spectrophotometer, Ultraspec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech).
[0077]
In the PCR reaction, Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo), which is considered to have high accuracy of the amplified fragment, was used as an amplification enzyme. 50 ng / sample of genomic DNA, 50 pmol / sample of primer DNA, and 0.2 units / sample of Pyrobest DNA polymerase of the Saccharomyces cerevisiae YPH strain prepared by the above method were prepared in a total of 50 μl of a reaction system. The reaction solution was subjected to DNA amplification using a PCR amplifier Gene Amp PCR system 9700 (PE Applied Biosystem). The reaction conditions of the PCR amplifying apparatus were as follows: 96 ° C. for 2 minutes, 25 cycles of 96 ° C. for 30 seconds → 55 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 90 seconds, and then to 4 ° C. The amplified fragment of the PDCl primer was subjected to 1% TBE agarose gel electrophoresis to confirm the amplified gene fragment. The primer DNA used for the reaction was synthetic DNA (Sawada Technology), and the DNA sequence of this primer was as follows.
-Add a restriction enzyme BamH1 site to the end of PDCIP-LDH-U (31mer, Tm value 58.3 ° C)
: ATA TAT GGA TCC GCG TTT ATT TAC CTA TCTC (SEQ ID NO: 33)
-Add restriction enzyme EcoRI site to PDClP-LDH-D (31mer, Tm value 54.4 ° C) end
: ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G (SEQ ID NO: 34)
[0078]
2. Construction of recombinant vector containing promoter and target gene
The bovine L-lactate dehydrogenase gene (LDH gene) was used as the target gene under the control of the Saccharomyces cerevisiae-derived
[0079]
The chromosome transfer vector newly constructed for the construction of this recombinant vector was named pBTrp-PDC1-LDHKCB. The details of this vector construction example are described below. 6 to 9 show the outline of this embodiment. However, the procedure of vector construction is not limited to this.
[0080]
In constructing the vector, 971 bp of the PDCl gene promoter fragment (PDCIP) and 518 bp of the PDCl gene downstream region fragment (PDC1D), which are necessary gene fragments, are used to transform the genomic DNA of Saccharomyces cerevisiae YPH strain as described above. Isolation was performed by the PCR amplification method used as a template. The procedure of PCR amplification was as described above, but the following primers were used for amplifying the downstream region fragment of the PDCl gene.
-Add restriction enzyme XhoI site to the end of PDC1D-LDH-U (34mer, Tm value 55.3 ° C)
: ATA TAT CTC GAG GCC AGC TAA CTT CTT GGT CGA C (SEQ ID NO: 35)
・ Addition of restriction enzyme ApaI site to PDCID-LDH-D (31mer, Tm value 54.4 ° C) end
: ATA TAT GAA TTC TTT GAT TGA TTT GAC TGT G (SEQ ID NO: 36)
[0081]
After each of the PDC1P and PDC1D gene amplified fragments obtained in the above reaction is purified by ethanol precipitation, the PDC1P amplified fragment is subjected to restriction enzyme reaction treatment with restriction enzymes BamHI / EcoRI and PDC1D with the restriction enzymes XhoI / ApaI. went. The enzymes used below were all manufactured by Takara Shuzo. A detailed manual of a series of operations for ethanol precipitation treatment and restriction enzyme treatment followed Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
[0082]
A series of reaction operations in the construction of the vector were performed according to a general DNA subcloning method. That is, pBluescriptII SK + vector (Toyobo) to which the restriction enzyme BamHI / EcoRI (Takara Shuzo) and the dephosphorylating enzyme Alkaline Phosphatases (BAP, Takara Shuzo) have been applied is PDC1P amplified by the PCR method and subjected to restriction enzyme treatment. The fragments were ligated by a T4 DNA Ligase reaction (upper row in FIG. 6). For the T4 DNA Ligase reaction, LigaFast Rapid DNA Ligation System (Promega) was used, and the details followed the attached protocol.
[0083]
Next, the competent cells were transformed using the solution subjected to the ligation reaction. Competent cells were Escherichia coli JM109 strain (Toyobo), and the details were carried out according to the attached protocol. The resulting culture was spread on an LB plate containing the
[0084]
Next, as shown in the middle part of FIG. 6, the LDHKCB gene fragment obtained by treating the pBTOPO-LDHKCB vector constructed by Toyoda Central Research Laboratories with the restriction enzyme EcoRI and the terminal modification enzyme T4 DNA polymerase is similarly restricted. Subcloning was performed in the same manner as described above in the pBPDC1P vector that had been treated with the enzyme EcoRI and the terminal modification enzyme T4 DNA polymerase to prepare a pBPDC1P-LDHKCB vector (lower part in FIG. 6).
[0085]
On the other hand, as shown in FIG. 7, the LDH gene (derived from Bifidobacterium longum) obtained by treating the pYLD1 vector constructed by Toyota Motor Corporation with the restriction enzymes EcoRI / AatII and the terminal modification enzyme T4 DNA polymerase. ) The fragment was subcloned into the pBPDC1P vector, which was also treated with the restriction enzyme EcoRI and the terminal modification enzyme T4 DNA polymerase, in the same manner as described above to prepare the pBPDC1P-LDH1 vector (FIG. 7). The above pYLDI vector was introduced into Escherichia coli (name: "E. col pYLD1") and deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (1-1-1, Higashi 1-1, Tsukuba, Ibaraki Prefecture) under the accession number FERM. It has been deposited internationally under the Budapest Treaty as BP-7423 (Original deposit date: October 26, 1999).
[0086]
Subsequently, as shown in FIG. 8, this vector was treated with XhoI / ApaI, and an amplified PDC1D fragment similarly treated with a restriction enzyme was ligated to prepare a pBPDC1P-LDH vector (upper row in FIG. 8). Finally, the pRPDC1P-LDHII vector was treated with EcoRV, and the pRS404 vector (Stratagene) was treated with AatII / SspI and T4 DNA polymerase, and the Trp marker fragment obtained was ligated to construct a pBTRP-PDCl-LDH vector. .
[0087]
Next, as shown in FIG. 9, the pBPDC1P-LDHKCB vector was treated with a restriction enzyme with ApaI / EcoRI, while the pBTrp-PDC1-LDH vector was treated with a fragment containing a Trp marker treated with restriction enzymes ApaI and StuI. Then, the amplified fragments were ligated to construct a chromosome-introduced pBTrp-PDC1-LDHKCB vector as a final construct.
[0088]
To confirm the constructed chromosome-introduced pBTrp-PDC1-LDHKCB vector, the nucleotide sequence was determined. ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Blosystems) was used as a base sequence analyzer, and details such as a sample preparation method and a method of using the instrument followed the manual attached to the apparatus. The vector DNA used as a sample was prepared by an alkali extraction method, and was subjected to column purification using a GFX DNA Purification kit (Amershan Pharmacia Blotech), and then to a spectrophotometer Ultra Spec 3000 (Amershan Pharmacia Blotech). The measured concentration was used.
[0089]
Example 4: Construction of yeast chromosome transfer vector (4 copies introduced)
Next, a chromosome transfer vector for introducing 4 copies of the LDH gene was constructed using the phleomycin resistance gene as a marker. This vector is called pBBLE-LDHKCB, and the plasmid vector is shown in FIG. A series of steps of the construction will be described, but the order of the construction is not limited to this.
[0090]
As a procedure for constructing this vector, first, the pBTRP-PDC1-LDHKCB vector constructed in Example 2 was treated with the same restriction enzymes in pBluescript II SK + vector (Toyobo Co., Ltd.) which had been treated with the restriction enzymes BamHI / PstI. The resulting LDHKCB fragments were ligated to construct a pBLDHKCB vector. Next, the SLX4 fragment obtained by PCR amplification and the PDC5 downstream fragment (PDC5D) were sequentially ligated to this vector to prepare pBLDHKCB-PS. The following primers were used for PCR amplification of the SLX4 fragment and the PDC5D fragment. KOD plus DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was used as the DNA amplifying enzyme, and the PCR device Gene Amp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems) was used. → The reaction was performed at 72 ° C. for 90 seconds for 25 cycles and kept at 4 ° C. to obtain an amplified fragment.
[0091]
Amplification of SLX4 fragment
SLX4-U; ATA TAT GAG CTC GTA ATA CGC ATA CGA ATT CC (32mer: SEQ ID NO: 37)
SLX4-D; ATA TAT GCG GCC GCC CTG GAA GAC AGG ACA GAA (33mer: SEQ ID NO: 38)
Amplification of PDC5D fragment
PDC5D-U; CCA TGA TTA GAT GGG GTT TG (20mer: SEQ ID NO: 39)
PDC5D-D; CTG GAA GAC AGG ACA GAA (18mer: SEQ ID NO: 42)
[0092]
The phleomycin resistant BLE marker gene used as a selection marker was constructed as follows. Using gene databases (Genebank and SGD; Saccharomyces Genome Database), obtain sequence data of phleomycin resistance gene, CYC1 promoter gene and CYC1 terminator gene, and add restriction enzyme sites to the ends based on this data. The primer was designed by. The sequence of each primer is described below.
[0093]
Amplification of phreomycin resistance gene fragment
BLE ORF-U; ATA TAT GAA TTC ATG ACC GAC CAA GCG ACG C (31mer: SEQ ID NO: 43)
BLE ORF-D; ATA TAT AAG CTT TCA TGA GAT GCC TGC AAG C (31mer: SEQ ID NO: 44)
Amplification of CYC1 promoter fragment
CYCP-U; ATA TAT GGA TCC GAC AGC ATC GTC GAA TAT G (31mer: SEQ ID NO: 45)
CYCP-D; ATA TAT GAA TTC TAT TAA TTT AGT GTG TGT ATT TG (35mer: SEQ ID NO: 46)
Amplification of CYC1 terminator fragment
CYCT-U; ATA TAT AAG CTT ACA GGC CCC TTT TCC TTT G (31mer: SEQ ID NO: 47)
CYCT-D; ATA TAT GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG (30mer: SEQ ID NO: 48)
[0094]
The pheomycin resistance gene was obtained by using the genomic DNA of Escherichia coli XL1-Blue MRF 'Kan strain (STRATAGENE) as a template, and the CYC1 promoter gene and the CYC1 terminator gene were obtained by using the genomic DNA of the wine yeast OC2 strain as a template and the above primers. PCR reaction was performed to obtain a gene fragment.
[0095]
Escherichia coli genomic DNA used as a template for PCR was shake-cultured overnight in an LB medium, collected, washed, and heated at 98 ° C for 10 minutes. And prepared by dissolving in 50 μl of sterile water. In addition, yeast genomic DNA was obtained by culturing wine yeast OC2 strain in 2 ml YPD medium overnight with shaking, collecting cells, adding 500 μl of 50 mM Tris-HCl and glass beads (425-600 microns Acid Washed, SIGMA), After vortexing at 4 ° C. for 15 minutes, the supernatant of the solution was precipitated with ethanol, and dissolved in 50 μl of sterilized water.
[0096]
Using 5 μl of each prepared genomic DNA as a template, PCR was performed in a 50 μl reaction system. Using KOD plus DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) as the DNA amplifying enzyme, the PCR amplification device GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems) was used, and the treatment was performed at 96 ° C for 2 minutes, then 96 ° C for 30 seconds → 55 ° C for 30 seconds → 72 The reaction at 90 ° C for 25 seconds was performed for 25 cycles, and the mixture was kept cool at 4 ° C. Each of the gene fragments for which amplification was confirmed was subjected to a restriction enzyme reaction, and was treated so that a restriction enzyme site was formed at the end.
[0097]
PBBLECYC was constructed by ligating each fragment prepared by the above method. A series of design procedures in the construction are shown below. That is, the CYC1P fragment treated with the restriction enzymes BamHI / EcoRI and the CYC1T fragment treated with the restriction enzymes HindIII / SalI were sequentially ligated into the pBluescript II SK + vector (Toyobo) treated with the same restriction enzymes, and the pBCYCPT vector Was prepared. Next, a pleomycin-resistant gene fragment having the same restriction enzyme site was ligated to the vector treated with the restriction enzymes EcoRI / HindIII to prepare a pBBLECYC vector. Finally, a marker gene was cut out from pBBLECYC by treatment with the restriction enzymes SpeI / ApaI, blunt-ended, ligated to EcoRV-treated pBLDHKCB-PS vector, and the final target chromosome transfer vector pBBLE-LDHKCB vector was constructed. did.
[0098]
Detailed procedures for the construction of the vector followed the Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989). Restriction enzymes and modification enzymes used were from Takara Shuzo. Ligation reaction by T4 DNA Ligase was performed using a Liga Fast Rapid DAN Ligation System (Promega), and the details followed the attached protocol. Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were used for plasmid vector transformation.
[0099]
Whether or not the constructed vector pBBLE-LDHKCB was the target was confirmed by DNA base sequence analysis. An ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) was used as a nucleotide sequence analyzer, and details of the operation were in accordance with the manual attached to this device. The vector DNA used as a sample was prepared by an alkali extraction method, purified by a column using a GFX DNA Purification kit (Amersham Pharmacia Biotech), and then subjected to DNA concentration measurement using a spectrophotometer Ultro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech). Using.
[0100]
Example 5: Construction of yeast chromosome transfer vector (6 copies introduced)
Next, a chromosome transfer vector for introducing 6 copies of the LDH gene was constructed using the G418 resistance gene as a marker. This vector is called pBG418G-LDHKCB, and the plasmid vector is shown in FIG. A series of steps of construction is shown below, but the order of construction is not limited to this.
[0101]
As a procedure for constructing this vector, first, the pBTRP-PDC1-LDHKCB vector constructed in Example 2 was treated with the same restriction enzymes in pBluescript II SK + vector (Toyobo Co., Ltd.) which had been treated with the restriction enzymes BamHI / PstI. The resulting LDHKCB fragments were ligated to construct a pBLDHKCB vector. Next, the PDC6 fragment and the CTT1 fragment obtained by PCR amplification were sequentially ligated to this vector to prepare pBLDHKCB-PDC-CTT. The following primers were used for PCR amplification of the PDC6 fragment and the CTT1 fragment. KODplus DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was used as the DNA amplifying enzyme, and the PCR device Gene Amp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems) was used to treat at 96 ° C for 2 minutes, then 96 ° C for 30 seconds → 53 ° C for 30 seconds → The reaction was performed at 72 ° C. for 90 seconds for 25 cycles, and cooled at 4 ° C. to obtain an amplified fragment.
[0102]
Amplification of PDC6 fragment
PDC6-U; ATA TAT GAG CTC GTT GGC AAT ATG TTT TTG C (31mer: SEQ ID NO: 49)
PDC6-D; ATA TAT GCG GCC GCT TCC AAG CAT CTC ATA AAC C (34mer: SEQ ID NO: 50)
Amplification of CTT1 fragment
CTT1-U; ATA TAT GGG CCC GAT GTC GTA CGA TCG CCT GCA C (31mer: SEQ ID NO: 51)
CTT1-D; ATA TAT GGT ACC GGG CAA GTA ACG ACA AGA TTG (33mer: SEQ ID NO: 52)
[0103]
The G418 resistance marker gene used as a selection marker was constructed as follows. Using gene databases (Genebank and SGD; Saccharomyces Genome Database), obtain the sequence data of G418 resistance gene, GAP promoter gene and CYC1 terminator gene, and add restriction enzyme sites to the ends based on this data. The primer was designed by. The sequence of each primer is described below.
[0104]
Amplification of G418 resistant fragment
G418ORF-U; ATA TAT GAA TTC ATG AGC CAT ATT CAA CGG (30mer: SEQ ID NO: 53)
G418ORF-D; ATA TAT CTT AAG TTA CAA CCA ATT AAC CAA (30mer: SEQ ID NO: 54)
Amplification of GAP promoter fragment
GAPP-U; ATA TAT GGA TCC GGT AGA ATC ATT TTG AAT AAA (33mer: SEQ ID NO: 55)
GAPP-D; ATA TAT GAA TTC TGT TTA TGT GTG TTT ATT CGA (33mer: SEQ ID NO: 56)
Amplification of CYC1 terminator fragment
CYCT-U; ATA TAT CTT AAG ACA GGC CCC TTT TCC TTT G (31mer: SEQ ID NO: 57)
CYCT-D; ATA TAT CCG CGG GTT ACA TGC GTA CAC GCG (30mer: SEQ ID NO: 58)
[0105]
The G418 resistance gene was obtained by using the genomic DNA of Escherichia coli XL1-Blue MRF 'Kan strain (STRATAGENE) as a template, and the GAP promoter gene and CYC1 terminator gene were obtained by using the genomic DNA of wine yeast OC2 strain as a template and the above primers. PCR reaction was performed to obtain a gene fragment.
[0106]
Escherichia coli genomic DNA used as a template for PCR was shake-cultured overnight in an LB medium, collected, washed, and heated at 98 ° C for 10 minutes. And prepared by dissolving in 50 μl of sterile water. In addition, yeast genomic DNA was obtained by culturing wine yeast OC2 strain in 2 ml YPD medium overnight with shaking, collecting cells, adding 500 μl of 50 mM Tris-HCl and glass beads (425-600 microns Acid Washed, SIGMA), After vortexing at 4 ° C. for 15 minutes, the supernatant of the solution was precipitated with ethanol, and dissolved in 50 μl of sterilized water.
[0107]
Using 5 μl of each prepared genomic DNA as a template, PCR was performed in a 50 μl reaction system. Using KOD plus DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.) as the DNA amplifying enzyme, the PCR amplification device GeneAmp PCR system 9700 (PE Applied Biosystems) was used, and the treatment was performed at 96 ° C for 2 minutes, then 96 ° C for 30 seconds → 55 ° C for 30 seconds → 72 The reaction at 90 ° C for 25 seconds was performed for 25 cycles, and the mixture was kept cool at 4 ° C. Each of the gene fragments for which amplification was confirmed was subjected to a restriction enzyme reaction, and was treated so that a restriction enzyme site was formed at the end.
[0108]
PBG418G in which each fragment prepared by the above method was ligated was constructed. This section shows a series of design procedures in construction. That is, the GAPP fragment treated with the restriction enzymes BamHI / EcoRI and the CYC1T fragment treated with the restriction enzymes HindIII / SalI were sequentially ligated into a pBluescript II SK + vector (Toyobo) treated with the same restriction enzymes, and the pBCYCPT vector Was prepared. Next, a G418 resistance gene fragment having the same restriction enzyme site was ligated to the vector treated with the restriction enzymes EcoRI / AflII to prepare a pBG418G vector.
[0109]
A marker gene was cut out from PBG418G by treatment with a restriction enzyme BamHI / SacII, blunt-ended, ligated to a HincII-treated pBLDHKCB-PDC-CTT vector, and a final target chromosome transfer vector pBG418G-LDHKCB vector was constructed. .
[0110]
The detailed operation method in vector construction was in accordance with Molecular Cloning ~ A Laboratory Manual second edition (Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory press. 1989). Restriction enzymes and modification enzymes used were from Takara Shuzo. Ligation reaction by T4 DNA Ligase was performed using a Liga Fast Rapid DAN Ligation System (Promega), and the details followed the attached protocol. Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were used for plasmid vector transformation.
[0111]
Whether the constructed vector pBG418G-LDHKCB was the target was confirmed by DNA base sequence analysis. An ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems) was used as a nucleotide sequence analyzer, and details of the operation were in accordance with the manual attached to this device. The vector DNA to be used as a sample is prepared by an alkali extraction method, purified by a column using a GFX DNA Purification kit (Amersham Pharmacia Biotech), and then the DNA concentration is measured with a spectrophotometer Ultro spec 3000 (Amersham Pharmacia Biotech). Was used.
[0112]
Example 6: Transformation into yeast
The method of gene transfer into yeast was carried out by the method of Ito et al. (Ito, H., Y. Fukuda, K. Murata and A. Kimura, Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriol. Vol. 153, p163- 168, 1983). That is, the three types of vectors prepared in Examples 3, 4, and 5 were sequentially introduced. The yeast was cultured in a 10 ml YPD medium at 30 ° C. until the exponential growth phase, and the cells were collected and washed with a TE buffer.
[0113]
Next, 0.5 ml of TE buffer and 0.5 ml of 0.2 M lithium acetate were added, and after shaking culture at 30 ° C. for 1 hour, the vector was added. The yeast suspension was cultured with shaking at 30 ° C. for 30 minutes, and 150 μl of 70% polyethylene glycol 4000 (Wako Pure Chemical Industries) was added, followed by thorough stirring. After further shaking culture at 30 ° C. for 1 hour, heat shock was applied at 42 ° C. for 5 minutes to wash the cells. This sample was shake-cultured in 500 μl of a YPD culture solution at 30 ° C. for 20 hours, collected, washed, and dissolved in 500 μl of sterilized water. 50 μl was spread on a YPD medium containing a G418 concentration of 200 μg / ml, and selection was carried out by static culture at 30 ° C.
[0114]
The obtained colonies were streaked on a new G418 selection medium, and the presence or absence of gene transfer was confirmed by PCR analysis for the selected strains whose stability was confirmed. For the genomic DNA of the yeast used as a template for PCR, a single colony was cultured overnight with shaking in 2 ml YPD medium, and then collected, added with 500 μl of 50 mM Tris-HCl and glass beads (425-600 microns Acid Washed, SIGMA). By vortexing at 4 ° C. for 15 minutes. Ethanol precipitation was performed using the supernatant of this solution, and dissolved in 50 μl of sterilized water. Using 5 μl of the prepared genomic DNA as a template, PCR was performed in a 50 μl reaction system. As a DNA amplification enzyme, Ex Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo) was used, and a PCR amplification apparatus Gene AmpPCR system 9700 (PE Applied Biosystems) was used. The reaction conditions of the PCR amplification apparatus were as follows: after 96 minutes at 96 ° C., 30 cycles of the reaction from 96 ° C. for 30 seconds → 55 ° C. for 30 seconds → 72 ° C. for 90 seconds, followed by 4 ° C. The sequences of the primers used are as follows.
[0115]
Detection primer sequence
▲ 1 ▼ pBTRP-PDC1-LDHKCB:
Primer 1: CTCATACATGTTTCATGAGGGT (SEQ ID NO: 59)
Primer 2: AAAGTATCAGCAGATTTTTT (SEQ ID NO: 60)
▲ 2 ▼ pBBLE-LDHKCB:
Primer 1: TCATTGGTGACGGTTCTCTACA (SEQ ID NO: 61)
Primer 2: CGATAGCAAGTAGATCAAGACA (SEQ ID NO: 62)
▲ 3 ▼ pBG418G-LDHKCB:
Primer 1: ACCAGCCCATCTCAATCCATCT (SEQ ID NO: 63)
Primer 2: ACACCCAATCTTTCACCCATCA (SEQ ID NO: 64)
[0116]
Example 7: Measurement of optical purity
Table 1 shows the results of fractionation and measurement of L-lactic acid and D-lactic acid in a culture solution obtained by static fermentation using the strain obtained in Example 6 in a YPD liquid medium containing 10% glucose by an enzymatic method.
[0117]
[Table 1]
Using the strain obtained in Example 6, L-lactic acid and D-lactic acid in a culture solution obtained by adding 3% of calcium carbonate to a YPD liquid medium containing 15% glucose and fermentation by standing were separately measured by an enzymatic method. Table 2 shows the results.
[0119]
[Table 2]
From the results in Tables 1 and 2, it was revealed that L-lactic acid with high optical purity can be synthesized by introducing the LDH gene into yeast of the genus Saccharomyces cerevisiae as a host. From these results, it was revealed that L-lactic acid or D-lactic acid having high optical purity can be synthesized by using a host having a low lactic acid racemase activity, such as a yeast belonging to the genus Saccharomyces cerevisiae.
[0121]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the method for producing lactic acid according to the present invention, lactic acid can be synthesized with high optical purity in a host. Therefore, high-quality polylactic acid can be produced using lactic acid obtained by the method for producing lactic acid according to the present invention.
[0122]
[Sequence list]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NOs: 5-38 and 42-64 are primers.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the nucleotide sequence of a DNA encoding a totally synthesized protein having LDH activity.
FIG. 2 shows codon usage and frequency of use in Saccharomyces cerevisiae.
FIG. 3 is a diagram showing the results of homology analysis between the base sequence of bovine LDH and the base sequence modified and designed therefrom. The upper row is a bovine LDH base sequence, the lower row is a modified base sequence, and bases different from the bovine-derived base sequence in the modified base sequence are indicated by symbols (A, T, C or G).
FIG. 4 is a diagram showing a primer configuration used for long-chain DNA synthesis by PCR and a synthesis step (
FIG. 5 is a view showing a plasmid map of the constructed vector pBTrp-PDC1-LDHKCB.
FIG. 6 is a diagram showing a part of the step of constructing the vector shown in FIG.
FIG. 7 is a diagram showing a part of a construction step of pBTrp-PDC1-LDH.
FIG. 8 is a diagram showing a part of a construction step of pBTrp-PDC1-LDH.
9 is a view showing a part (final step) of a step of constructing the vector shown in FIG.
FIG. 10 is a view showing a plasmid map of the constructed pBBLE-LDHKCB.
FIG. 11 is a view showing a plasmid map of the constructed pBG418G-LDHKCB.
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