JP2004173531A

JP2004173531A - Immunoreceptor protein

Info

Publication number: JP2004173531A
Application number: JP2002341195A
Authority: JP
Inventors: Akira Shibuya; 彰渋谷
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2002-11-25
Publication date: 2004-06-24
Also published as: WO2004048574A1; AU2003284432A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a new immunoreceptor protein for positively or negatively regulating immune response; and to provide a gene encoding the protein. <P>SOLUTION: The protein having a specific amino acid sequence, the protein having an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids from, with or to the amino acid sequence, and further having functions for inhibiting the immune response of cells, or the protein having an amino acid sequence obtained by deleting, substituting or adding one or several amino acids from, with or to the amino acid sequence, and further having functions for activating the immune response of the cells are provided. The gene encodes one of the proteins. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な免疫受容体タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、及び該タンパク質の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫反応は活性化及び抑制性の細胞膜受容体からの正と負のシグナルのバランスにより制御を受けている。リンパ球や骨髄球系細胞などの免疫細胞の活性化は、活性化レセプターである細胞膜受容体がそのリガンドを認識し結合することによって、細胞膜受容体自身やその受容体に会合するアダプター分子の細胞内領域に存在する免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）と呼ばれるＹ−ｘ−ｘ−Ｌ−ｘ（６−８）−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｌ（ｘは任意のアミノ酸）から成る特徴的な配列のチロシンがリン酸化されることにより開始される（非特許文献１、非特許文献２参照）。一方、この活性化した免疫細胞は、抑制性レセプターである細胞膜受容体分子がリガンドと結合することによって細胞内領域に存在する免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｏｔｉｆ：ＩＴＩＭ）と呼ばれる（Ｉ／Ｖ／Ｌ／Ｓ）−ｘ−Ｙ−ｘ−ｘ−（Ｌ／Ｖ）（ｘは任意のアミノ酸を示す）から成る特徴的配列のチロシンが脱リン酸酵素を介して抑制的に制御されることがわかってきた（非特許文献１、非特許文献３参照）。
【０００３】
活性化受容体及び抑制性受容体は、▲１▼いずれも細胞外領域が高度に保存されていること、▲２▼活性化受容体はその細胞内領域に活性化モチーフＩＴＡＭがあるか、あるいは膜貫通領域にＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のようなＩＴＡＭをもつアダプター分子と会合するための荷電アミノ酸を持っていること、▲４▼抑制性受容体は細胞内領域に抑制性モチーフＩＴＩＭを有していること、▲５▼活性化受容体は抑制性受容体に比べて細胞内領域が短いこと、が特徴として挙げられる。また、活性化受容体の多くは、抑制性受容体と対（ペア）をなしており、その両方の遺伝子が染色体上の小さなクラスターに位置していることも明らかにされている（非特許文献４参照）。活性化受容体と抑制性受容体の両方を含む遺伝子ファミリー群としては、例えば、ＭＨＣクラスＩリガンドを認識するＮＫ抑制性受容体ファミリーであるＫＩＲ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２、及びＬｙ４９が知られている（非特許文献５参照）。またＴ細胞上に発現するＣＤ２８及びＣＴＬＡ４は同じリガンド（例えば、ＣＤ８０及びＣＤ８６）に結合し、それぞれ相反する正及び負のシグナルを送達する（非特許文献６参照）。同様に、Ｂ細胞及び／又は骨髄球系細胞は、ヒト及びマウスＦｃγ受容体（非特許文献７、非特許文献８参照）、マウスペア免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＰＩＲ）（非特許文献９、非特許文献１０参照）とそのヒトホモログＩｇ様転写物（ＩＬＴ；ＣＤ８５）（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３参照）、及びシグナル制御タンパク質（ＳＩＲＰ）（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６参照）などのペア受容体ファミリーを発現する。
【０００４】
これらのファミリー分子群は細胞外領域構造が極めて保存されているため、しばしば共通の、あるいは類似のリガンドを認識するが、その結果しての免疫細胞の反応は正（活性化）と負（抑制性）のまったく相反したものとなる。このようにまったく相反する免疫応答を誘導する現象の免疫学的意義は極めて興味深く、正と負のシグナルが生体内でどのように総合化され統御されているのかを解明することは免疫系の理解にとって非常に重要であると考えられる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，１３，３２６−３３１，２００１
【非特許文献２】
Ｂｏｌｌａｎｄ，Ｓ．，Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７２，１４９−１７７，１９９８
【非特許文献３】
Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，８４−８９，２０００
【非特許文献４】
Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ，２３，８１−８，２００２）
【非特許文献５】
Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１６，３５９−９３，１９９８
【非特許文献６】
Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｃ．Ａ．＆Ｊ．Ｐ．Ａｌｌｉｓｏｎ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌ，１１，２０３−２１０，１９９９
【非特許文献７】
Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．＆Ｒ．Ａ．Ｃｌｙｎｅｓ，ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１６，４２１−３２，１９９８
【非特許文献８】
Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ．，ＡｎｎｕｒＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３−３４，１９９７
【非特許文献９】
Ｋｕｂａｇａｗａ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，ＵＳＡ，９４，５２６１−５２６６，１９９７
【非特許文献１０】
Ｈａｙａｍｉ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７２，７３２０−７３２７，１９９７
【非特許文献１１】
Ｓａｍａｒｉｄｉｓ，Ｊ．＆Ｍ．Ｃｏｌｏｎｎａ，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ，２７，６６０−６６５，１９９７
【非特許文献１２】
Ｂｏｒｇｅｓ，Ｌ．，ｅｔａｌ．，ＪＩｍｍｕｎｏｌ，１５９，５１９２−５１９６，１９９７
【非特許文献１３】
Ｗｅｇｔｍａｎｎ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒＢｉｏｌ，７，６１５−６１８，１９９７
【非特許文献１４】
Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３８６，１８１−１８６，１９９７
【非特許文献１５】
Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ，１６，６８８７−６８９９，１９９６
【非特許文献１６】
Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２７１，２５５６９−２５５７４，１９９６
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、骨髄球系細胞などの増殖、活性化、分化を含む免疫応答に関与する新規なペアの活性化及び抑制性免疫受容体遺伝子を取得し、該受容体の分子的及び機能的特性を解明することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、マウスのマクロファージから、細胞内領域にＩＴＩＭを持ち、抑制性シグナルを伝達する抑制性免疫受容体タンパク質（ＭＡＩＲ−Ｉ）、該抑制性免疫受容体タンパク質の細胞外領域にある免疫グロブリンドメインに高い相同性を有し、活性化シグナルを伝達する活性化免疫受容体タンパク質（ＭＡＩＲ−ＩＩ）を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質
（２）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質
（３）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（５）以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（６）上記（４）又は（５）の遺伝子を含有する組換えベクター。
（７）上記（４）又は（５）の遺伝子で形質転換させた形質転換体。
（８）上記（７）の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から免疫受容体タンパク質を採取することを特徴とする、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の製造方法。
（９）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質のいずれか一方、又はその両方を認識する抗体。
（１０）上記（９）の抗体を用いる上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の定量方法。
（１１）上記（９）の抗体を含む上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の定量用キット。
（１２）ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる活性化免疫受容体遺伝子を単離する方法。
（１３）ＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる抑制性免疫受容体遺伝子を単離する方法。
（１４）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを含む、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法。
（１５）上記（１４）の方法により得られる上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンド。
（１６）（ａ）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング方法。
（１７）上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質を含むことを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング用キット。
（１８）上記（１６）の方法、又は上記（１７）のキットを用いて得られる、上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニスト。
（１９）上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
（２０）上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質に対するリガンド、又は上記（１）若しくは（２）の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト若しくはアゴニストを有効成分として含む免疫機能制御用医薬。
（２１）上記（９）の抗体を含む上記（１）又は（２）の免疫受容体タンパク質の検出用試薬。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫受容体タンパク質は、その細胞外領域が互いに高度に保存された骨髄球系−関連免疫グロブリン様受容体（ｍｙｅｌｏｉｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩと称する新規なペアの活性化及び抑制性受容体タンパクである。ＭＡＩＲ−Ｉは、マクロファージ、顆粒球、マスト細胞、及び樹状細胞を含む大多数の骨髄球系細胞上に発現し、細胞質内領域にチロシンベースの局在モチーフとチロシンベースの免疫受容体抑制性モチーフを含み、受容体のインターナリゼーションを誘発し、マスト細胞からのＩｇＥ−媒介脱顆粒を抑制する。他方、ＭＡＩＲ−ＩＩは、マクロファージ及びＢ細胞のサブセットに発現し、チロシンベースの免疫受容体活性化モチーフを有するアダプター分子ＤＡＰ１２と会合し、マクロファージからの炎症性サイトカイン分泌を亢進する。従って、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩは、自然免疫応答を正又は負にそれぞれ調節し、細胞シグナリングと免疫応答に重要な制御的役割を果たす。
【００１０】
１．本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子の単離
本発明の免疫受容体タンパク質（以下、ＭＡＩＲともいう）をコードする遺伝子のクローニングは、例えば骨髄球とＢ細胞の分化に必須の転写因子であるＰＵ．１を欠失したＰＵ．１−１−マウスと野生株マウスとの間で胎生１４日齢肝臓を材料としてＲＤＡ（ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ）法に基づくＰＣＲＳｕｂｔｒａｃｔｉｏｎにより行うことができる。ＲＤＡ法とは、制限酵素消化したゲノムＤＮＡにアダプターを付加し、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡの断片を増幅（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）したもの同士をｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ法（引き算法）により比較することによって変異欠失ＤＮＡを検出するものある。
【００１１】
ＭＡＩＲをコードする遺伝子また、下記の免疫系細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、上記ＲＤＡ法で調製したＤＮＡ断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーを作製するためのｍＲＮＡ供給源としては、ＭＡＩＲのｍＲＮＡが発現している細胞であれば特に限定されず、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等）のあらゆる免疫系細胞［例えば、マクロファージ、マスト細胞、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球）、単球、樹状細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等］、又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織（例えば、脾臓、リンパ節、骨髄、肝臓等）が挙げられる。
【００１２】
ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞又は組織を、グアジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得た後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００１３】
次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲｎａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のベクターに組み込んでｉｎｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。また、λファージ以外にもプラスミドを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。
【００１４】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のＤＮＡを有する株を選択するスクリーニング方法としては、例えば、マウス肝から精製した後記ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う方法が挙げられる。
【００１５】
ここで用いられる鋳型ＤＮＡとしては、前記ｍＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡが挙げられる。また、プライマーは、増幅したときのＤＮＡ断片の予想サイズ、あるいは縮重コドンの組み合わせなどを適宜検討しながら、上記のアミノ酸配列情報に基づいて設計することができる。
【００１６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００１７】
得られたクローンについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３ＡＤＮＡシークエンサー、ＴＡＫＡＲＡ社製ＢｃａＢＥＳＴジデオキシシークエンシングキット等）を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のＤＮＡ解析ソフトによって解析し、得られたＤＮＡ鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出す。
【００１８】
上記の方法で取得される本発明の受容体タンパク質コードする遺伝子としては、例えば、配列番号１の塩基配列で表されるマウス由来の免疫抑制性受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉａをコードする遺伝子、そのアイソタイプである配列番号５の塩基配列で表されるマウス由来の免疫抑制性受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉｂをコードする遺伝子、配列番号３の塩基配列で表されるマウス由来の免疫活性化受容体タンパク質ＭＡＩＲ−ＩＩａをコードする遺伝子、そのアイソタイプである配列番号７の塩基配列で表されるマウス由来の免疫活性化受容体タンパク質ＭＡＩＲ−ＩＩｂをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１９】
本発明の免疫受容体タンパク質は、（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質；又は（ｃ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（ｄ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質である。
【００２０】
上記の「配列番号２（又は配列番号４）に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００２１】
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、上記免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡＰＣＲｉｎｖｉｔｒｏＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
【００２２】
上記の「細胞の免疫応答を抑制させる機能を有する」とは、細胞の免疫応答の抑制性活性（例えば、脱顆粒の抑制、サイトカイン産生減少、細胞障害活性抑制、抗原提示機能抑制、貧喰能抑制等）が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
また、上記の「細胞の免疫応答を活性化させる機能を有する」とは、細胞の免疫応答の活性化活性（例えば、脱顆粒の促進、サイトカイン産生亢進、細胞障害活性亢進、抗原提示機能亢進、貧喰能亢進等）が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
【００２３】
より詳細には、当該活性が同等（例えば、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）である限り、分子量等の量的要素は元のタンパク質と異なっていてもよい。
【００２４】
上記いずれかの免疫受容体タンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も本発明の範囲に含まれる。特に、本発明の部分ペプチドの中でも、免疫受容体タンパク質が天然に存在する場合に細胞膜の外に露出し、且つリガンド結合活性を保有する部分は、免疫受容体タンパク質のリガンドを決定において特に有用である。そのような部分ペプチドとしては、配列番号２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列の疎水性プロット解析において、細胞外領域（親水性部位）と分析される部分が挙げられる。本発明の部分ペプチドを構成するアミノ酸数は、少なくとも１０個以上、好ましくは３０個以上、より好ましくは８０個以上である。
【００２５】
本発明の免疫受容体タンパク質又はその部分ペプチドは、必要に応じて塩の形態、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩の形態で提供され得る。そのような塩としては、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）の塩、有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）の塩等が挙げられる。
【００２６】
本発明の免疫受容体タンパク質は、該タンパク質を発現しているヒトや哺乳動物の培養細胞又は組織からの抽出・分離よって、あるいは後述のように該タンパク質をコードするＤＮＡを含む形質転換体を培養することによっても製造することができる。ヒトや哺乳動物の組織又は細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織又は細胞をホモジナイズ後、酸等で抽出を行い、得られた抽出液を疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィーを組み合わせることにより単離精製することができる。
【００２７】
また、前記部分ペプチドは、公知のペプチド合成法又は前記免疫受容体タンパク質を適当なペプチダーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ）で切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
【００２８】
本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子は、上記の本発明の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子であればいかなるものでもよく、具体的には、（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子；又は（ｃ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
【００２９】
上記の「配列番号１（又は配列番号３）に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡ」としては、配列番号１（又は配列番号３）で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
【００３０】
一旦本発明の遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又は本遺伝子のｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができる。
【００３１】
２．組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００３２】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３３】
本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３４】
このようなベクターとしては、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｘＦＵＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＣＹＢベクター（ＮＥＷＥＮＧＬＡＭＤＢｉｏＬａｂｓ社製）等が、宿主細胞が酵母である場合は、例えばｐＥＳＰ−１発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造社製）、ｐＰＩＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等が、また宿主細胞が動物細胞である場合は、例えばｐＭＡＭ−ｎｅｏ発現ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、ｐＣＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＢＫ−ＣＭＶベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が、宿主細胞が昆虫細胞である場合は、例えばｐＢａｃＰＡＫベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、ｐＡｃＵＷ３１ベクター（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）、ｐＡｃＰ（＋）ＩＥ１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等がそれぞれ挙げられる。
【００３５】
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）等の酵母；サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ヒトＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等の動物細胞；あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。
【００３６】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３７】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ１２、ＤＨ１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ６９，２１１０−２１１４）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３８】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７５，１９２９−１９３３）、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３，
１６３−１６８）等が挙げられる。
【００３９】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００４０】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
また、上記の各宿主細胞への遺伝子導入は、組換えベクターによらない方法、例えばパーティクルガン法なども用いることができる。
【００４１】
３．本発明の免疫受容体タンパク質の製造
本発明の免疫受容体タンパク質は、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４２】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００４３】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００４４】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４５】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００４６】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ_２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４７】
培養後、本発明の免疫受容体タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を抽出する。また、本発明の免疫系受容体タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の免疫受容体タンパク質を単離精製することができる。
【００４８】
４．本発明の免疫受容体タンパク質に対する抗体
本発明の抗体は以下の一般的な抗体調製方法によって取得できるが、特に、ＭＡＩＲ−Ｉのみを認識するＴＸ−８、ＭＡＩＲ−ＩとＭＡＩＲ−ＩＩの両方を認識するＴＸ−１０、ＭＡＩＲ−ＩＩのみを認識するＴＸ−１３は、Ｓｈｉｂｕｙａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１，４４１−６，２０００の記載に従って調製することができる。具体的には、後記実施例の示すように、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢａ／Ｆ３形質転換体とヒトＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質を足蹠に注射することによって免疫化したラット由来の膝窩リンパ節細胞とＳｐ２／０骨髄腫細胞株とを融合することによって調製する。
【００４９】
（１）抗原の調製
本発明においては、前記の通り単離精製した本発明の免疫受容体タンパク質又はその一部の断片を抗原として用いる。
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして調製した抗原を用いて動物を免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、ウサギの場合、例えばアジュバントを用いて１００〜５００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。
【００５０】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。投与部位は静脈内、皮下又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜３回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６〜６０日後に抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等により行うことができる。
【００５１】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００５２】
（３）モノクローナル抗体の作製
（３−１）免疫及び抗体産生細胞の採取
上記のようにして調製された抗原タンパク質を用いて動物を免疫する。必要であれば、免疫を効果的に行うため、前記と同様アジュバント（市販のフロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等）を混合してもよい。
【００５３】
免疫は、哺乳動物（例えばラット、マウス、ウサギなど）に投与することにより行われる。抗原の１回の投与量は、マウスの場合１匹当たり５０μｇである。投与部位は、主として静脈内、皮下、腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２〜３週間間隔で、最低２〜３回行う。そして、最終免疫後、抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が好ましい。
【００５４】
（３−２）細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株として、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えば、ミエローマ細胞の具体例としてはＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００５５】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１５：１〜２５：１の割合で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤存在下、あるいは電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００５６】
（３−３）ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地を用いて培養し、生育する細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００５７】
次に、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）等によってスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的に単クローン抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００５８】
（３−４）モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地又はＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ_２濃度）で３〜１０日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
【００５９】
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらの方法を組み合わせることにより精製することができる。
【００６０】
５．本発明の抗体による免疫受容体タンパク質の定量方法、定量用キット
本発明の抗体を用いた免疫受容体タンパク質の定量は、例えばイムノブロット法、酵素抗体法（ＥＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光抗体法、免疫細胞染色等より行うことが可能であるが、それらに限定されるものではない。
また、上記抗体は、その断片であってもよく、具体的には、当該抗体の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。
【００６１】
具体的には、ＥＬＩＳＡ法による場合は、以下の通り行う。まず、希釈した血液等の試料を９６ウェルマイクロプレートに吸着させた後、一次抗体として本発明の抗体を反応させる。次いで、発色反応に必要なＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）等の特異的酵素で標識した抗グロブリン抗体を反応させ、洗浄後、発色基質としてＡＢＴＳ２，２’−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）等を添加して発色させ、比色法により測定することによって試料中の本発明の免疫受容体タンパク質を検出する。あるいは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による場合は、以下の通り行う。まず、希釈した血液等の試料を、予め本発明の抗体を吸着させた９６ウェルマイクロプレートに添加して一定時間インキュベートする。その後、プレートを洗浄し、ビオチンで標識した精製抗体を各ウェルに添加して一定時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、酵素標識アビジンを添加してさらにインキュベートする。インキュベート後、プレートを洗浄し、発色基質としてオルトフェニレンジアミン等を添加して発色させ、比色法によって測定する。
【００６２】
また、本発明の抗体は免疫受容体タンパク質定量用キットに用いることもできる。当該キットは、少なくとも本発明の抗体を含むものであればよく、該抗体を固相に固定させる場合にあっては、該抗体とは抗原認識部位が異なり、二次抗体として用いられる抗体を含んでいてもよい。二次抗体として用いられる抗体は、例えば酵素等で標識されていてもよく、これら２つの抗体の他に、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）を含んでいてもよい。
【００６３】
６．ペア免疫受容体遺伝子の単離方法
ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体とＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体とは、その細胞外領域が互いに高度に保存されている。従って、本発明においては、上記のモチーフを有するいずれかの免疫受容体遺伝子が取得できれば、その細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる免疫受容体遺伝子を前述のｃＤＮＡライブラリー等から単離することができる。例えば、ＭＡＩＲ−Ｉの場合は、プローブとなりうる細胞外領域として、配列番号１に示される塩基配列のうち、第６３番目〜第５９６番目の塩基配列、好ましくは第１３５番目〜第４８８番目の塩基配列を含むＤＮＡが例示される。
【００６４】
７．本発明の受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法
本発明の受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法は、本発明の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを特徴とする。親和性のある物質を選択する具体的手法としては、本発明の免疫受容体タンパク質、又は該受容体タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜に被験物質を作用させ、該受容体タンパク質に対する被験物質の結合量を測定するか、あるいは、細胞の免疫応答シグナルを測定することなどにより行う。ここで、免疫応答シグナルとしては、例えば、脱顆粒（ヒスタミン、セロトニンなどの化学物質の放出）、ロイコトリエンや血小板活性化因子の合成、サイトカイン放出、補体の活性化、抗体産生、細胞内タンパク質のリン酸化、貧喰、細胞障害などをいう。測定において結合量の多い被験物質、免疫応答シグナルが強い被験物質を本発明の受容体タンパク質に対するリガンドの候補物質として選択することができる。
【００６５】
被験物質としては任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、天然物抽出物（植物抽出液、動物組織・動物細胞抽出液）、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる
【００６６】
８．本発明の受容体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング系
本発明の受容体タンパク質は、該受容体タンパク質とリガンドとの結合を阻害する物質（アンタゴニスト）、該受容体に結合してリガンドと同様な免疫応答を起こす物質（アゴニスト）のスクリーニングするための手段（スクリーニング方法、スクリーニング用キット）として有用である。
【００６７】
本発明の受容体タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング方法は、（ａ）免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする。被験物質を添加した場合に免疫受容体タンパク質とリガンドとの結合量が減少又は増加する被験物質が見つかれば、その被験物質は、本発明のタンパク質とリガンドとの結合を阻害又は拮抗し、免疫応答を制御するのに役立つアンタゴニスト又はアゴニストの候補物質となる。
【００６８】
また、本発明の受容体タンパク質は該タンパク質に対するアゴニスト又はアンタゴニストのスクリーニング用キットに用いることもできる。当該キットは、少なくとも本発明の受容体タンパク質を含むものであればよく、標識リガンド、リガンド標準液、各種試薬（例えば、緩衝液、洗浄液、希釈液等）を含んでいてもよい。
【００６９】
被験物質としては任意の物質を使用することができ、その種類は特に限定されない。被験物質の具体例としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、天然物抽出物（植物抽出液、動物組織・動物細胞抽出液）、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる
【００７０】
９．本発明の免疫応答機能制御用医薬
本発明の免疫受容体タンパク質は免疫応答と活性化させる機能又は抑制させる機能を有する。また、本発明のリガンド、アンタゴニスト、アゴニストは前記受容体タンパク質に結合することができ、免疫受容体からの活性化シグナル、抑制性シグナルを変化させる機能を果たす。従って、本発明のタンパク質、遺伝子、リガンド、アンタゴニスト、アゴニストはいずれも免疫応答機能制御用医薬として用いることができる。例えば、本発明の医薬を免疫制御機構の不全が原因となる疾患に用いると、免疫活性化と免疫抑制性の方向を制御することによって該疾患の治療を行うことができる。かかる疾患としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、全身性エリマトーデス、慢性関節リウマチ、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、強直性脊椎炎、インスリン依存性糖尿病、悪性貧血など）、アレルギー性疾患（例えば花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹血管浮腫、血清病、アナフィラキシー、薬剤アレルギーなど）、免疫不全疾患（原発性免疫不全症候群、続発性免疫不全症候群など）、腫瘍（肺癌、乳癌、大腸癌、膀胱癌、骨髄性白血病、神経芽細胞腫、黒色腫、パーキットリンパ腫など）などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７１】
本発明の医薬は、各種製剤形態に調製し、経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる。本発明の医薬を経口投与する場合は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等に製剤化するか、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。また、本発明の医薬を非経口投与する場合は、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、皮下注射剤、坐剤などに製剤化し、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
【００７２】
これらの各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【００７３】
上記各種製剤は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
【００７４】
本発明の医薬の投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。例えば、本発明のタンパク質の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲の投与量を選ぶことができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
【００７５】
本発明の遺伝子を免疫系疾患に対する遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用してもよい。
【００７６】
遺伝子治療剤の投与形態としては、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、免疫系組織（骨髄、リンパ節など）に局所投与を行うことができる。さらに、カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態を採用することもできる。
【００７７】
本発明の遺伝子治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にすると成人１日あたり０．１〜１００ｍｇ／体重の範囲が適当である。
【００７８】
１０．免疫受容体タンパク質検出用試薬
本発明の抗体は、本発明の免疫受容体タンパク質又はその部分断片と反応するため、該受容体タンパク質の検出用試薬として使用することができる。免疫受容体タンパク質の検出方法は特に限定されるものではなく、例えばウエスタンブロッティング法などを採用することができる。例えば、被検対象（細胞成分又はその各分画等）を電気泳動等により分画し、次に、予め標識（放射標識、蛍光染色等）された本発明の抗体と反応させてシグナルを検出する。本発明の免疫受容体タンパク質の検出に使用する抗体は、該受容体タンパク質の全長アミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体でもよく、該受容体タンパク質の部分アミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体でもよい。
【００７９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８０】
実施例に用いた抗体のうち、コントロールラット及びマウスのＩｇＧ、抗−マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ１）、ＣＤ１１ｃ、Ｌｙ６Ｇ（Ｇｒ−１）及びＣＤ３２／１６ｍＡｂｓ、ならびにＤＸ−５ｍＡｂはＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手した。抗−ホスホチロシンｍＡｂ（４Ｇ１０）及び抗−ＦｃεＲＩγｍＡｂはＵｐｓｔａｔｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｃ．（ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ，ＮＹ）より、また抗−ＦｌａｇｍＡｂはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）より入手した。抗−ＳＨＰ−１、抗−ＳＨＰ−２、抗−ＳＨＩＰ抗体はＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＣＡ）より入手した。ラットＩｇＥ抗−ＤＮＰｍＡｂはＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）より入手した。抗−ＤＡＰ１２ポリクローナル抗体は愛媛大学医学部より入手した。
【００８１】
［実施例１］（ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのクローニング及び分子特性）
（１）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのクローニング
骨髄球系細胞による免疫応答に関与する新規な遺伝子を同定するために、骨髄球系細胞を欠いているＰＵ．１−／−マウスと野生株由来の１４日齢の胎仔肝を、ＰＣＲ−べースのサブトラクティブハイブリダイゼーションであるｒｅｐｒｅｓｅｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＤＡ）に供した。
【００８２】
まず、全ＲＮＡをＩｓｏｇｅｎＬＳ溶液（ＮｉｐｐｏｎＧｅｎｅ）を用いて単離し、オリゴ（ｄＴ）−プライム二本鎖ｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成システム（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。ＲＤＡはＩｗａｍａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２６，３０３４−４３，１９９８に記載の方法に従って実施した。サブトラクションして得られたＤＮＡ断片から骨髄球細胞に特異的なｃＤＮＡ（ＭＡＩＲ−Ｉａ）を同定した。全長ＭＡＩＲ−ＩａｃＤＮＡをＲＤＡによって作成したｃＤＮＡ断片をプローブとしてマクロファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってクローン化した。
【００８３】
ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。ＭＡＩＲ−Ｉａは３１４個のアミノ酸からなるＩ型膜貫通型糖タンパク質であり、２７個のアミノ酸のリーダー配列、１５２個のアミノ酸の細胞外領域、２３個のアミノ酸の膜貫通領域、及び１１２個のアミノ酸の細胞内領域を有する（図１Ａ）。細胞内領域はアミノ酸配列ＶＥＹＳＴＬ及びＬＨＹＳＳＶを含み（図１Ａ）、それらはＩＴＩＭｓ（Ｉ／Ｖ／Ｌ／ＳｘＹｘｘＬ／Ｖ）のコンセンサス配列と一致した。また、ＩＴＩＭ−様配列ＹＶＮＬ及びＹＳＥＩはＭＡＩＲ−Ｉａがタンパク質チロシンホスファターゼを補充し、抑制性シグナルを媒介することを示した。なお、ＩＴＩＭ−様モチーフＹＶＮＬは受容体インターナリゼーションに関与するコンセンサス配列でもある（Ｍａｒｋｓ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，７，１２４−１２８，１９９７；Ｂｏｌｌ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，ＥｍｂｏＪ，１５，５７８９−９５，１９９６）。
【００８４】
次に、ＭＡＩＲ−Ｉａがペア受容体のメンバーであるかどうかを調べるために、ＭＡＩＲ−Ｉａの細胞外領域をコードするｃＤＮＡ（配列番号１の第６３番目〜第５９６番目の塩基配列）をプローブとして用いてマクロファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。その結果、ＭＡＩＲ−Ｉａのアミノ酸配列と９２％相同性のある一つのＩｇ−様ドメインが存在する細胞外領域、荷電アミノ酸（Ｌｙｓ）を有する膜貫通領域、及び短い（２０アミノ酸）細胞内テイルを含むタンパク質をコードするクローンを同定し、これをＭＡＩＲ−ＩＩａと命名した。さらに、ＭＡＩＲ−Ｉａに４つ、ＭＡＩＲ−ＩＩａに２つの追加的アミノ酸を含むアイソフォームを見出し、それぞれＭＡＩＲ−Ｉｂ（アミノ酸配列：配列番号６）、ＭＡＩＲ−ＩＩｂ（アミノ酸配列：配列番号８）と命名した。
【００８５】
図１Ａに、ＭＡＩＲ−Ｉａ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、ＭＡＩＲ−ＩＩｂのアミノ酸配列の比較を示す。図１Ａにおいて、下線は推定されるリーダー配列及び膜貫通領域を、丸で囲んだ箇所は細胞外領域におけるＮ−結合グリコシル部位及び膜貫通領域における荷電アミノ酸残基を、太字（図１Ａに示すアミノ酸配列の５５番目及び１１３番目のアミノ酸）はＩｇ−様ドメインのジスルフィド結合に関与するシステイン残基を表す。枠で囲んだ箇所は、細胞内領域のＩＴＩＭ、ＩＴＩＭ−様又は局在モチーフを表す。ＭＡＩＲ−Ｉ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、及びＭＡＩＲ−ＩＩｂｃＤＮＡ配列データはＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪからそれぞれ受理番号ＡＢＯ０９１７６５、ＡＢＯ０９１７６６、ＡＢＯ０９１７６７、及びＡＢＯ０９１７６８で入手可能である。
【００８６】
図１Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の模式図を示す。細胞外領域における一対のシステイン残基はＩｇ−様ドメインの形成のための内部鎖ジスルフィド結合に関与すると考えられ、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩがＩｇスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００８７】
（２）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析
図１Ｃに、ゲノムＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析を示す。マウスゲノムＤＮＡを制限酵素（Ｅ；Ｅｃｏ−ＲＩ、Ｂ；Ｂａｍ−ＨＩ、Ｈ；Ｈｉｎｄ−ＩＩＩ、Ｘ；Ｘｂａ−Ｉ、Ｐ；Ｐｓｔ−Ｉ）で消化し、ＭＡＩＲ−Ｉの細胞外領域をコードするｃＤＮＡでプローブした。ＭＡＩＲ−Ｉｂ及びＭＡＩＲ−ＩＩｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのゲノムＤＮＡ配列によって示されるように、ＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａの代替的スプライシング変異体である。上記のサザンブロット分析によれば、単一のハイブリダイゼーションパターンであることがわかり、これはＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩが単一の遺伝子によってコードされることを示す（図１Ｃ）。
【００８８】
（３）染色体ＦＩＳＨ法による解析
ダイレクトＲ−バンドＦＩＳＨ法をマウス及びラットにおけるＭＡＩＲ−Ｉ遺伝子の染色体アサインメントのために用いた。Ｒ−バンド染色体及びＦＩＳＨの調製をＭａｔｓｕｄａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，ＣｙｔｏｇｅｎｅｔＣｅｌｌＧｅｎｅｔ，６１，２８２−５，１９９２及びＭａｔｓｕｄａ，Ｙ．＆Ｃｈａｐｍａｎ，Ｖ．Ｍ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１６，２６１−７２，１９９５に記載されるように行った。ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子はマウス１１番染色体のＥ２バンドの近位領域に位置し、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）及びゲノムＤＮＡ配列データベースによって決定されるように、それぞれ６つ及び４つのエキソンからなる。データベースリサーチによれば、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩは、アミノ酸レベルでそれぞれヒトＣＭＲＦ−３５−Ｈ９（Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，１０，８９１−９，１９９８）と４４％、ヒトＣＭＲＦ−３５（Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ，１０，８９１−９，１９９８）と４９％の相同性を有することがわかった。ＣＭＲＦ−３５−Ｈ９、ＣＭＲＦ−３５はマウス１１番染色体に対応するヒト１７番染色体上に位置することから（Ｃｌａｒｋ，Ｇ．Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＡｎｔｉｇｅｎｓ，５５，１０１−９，２０００）、これらがマウスＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのヒト相同体であると考えられる。
【００８９】
（４）免疫ブロッティング
マウスＴ細胞白血球ＢＷ５１４７細胞を、Ｎ末端をＦｌａｇペプチドでタグ化したＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａｃＤＮＡで形質転換した。Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉａ又はＭＡＩＲ−ＩＩａを発現するＢＷ５１４７細胞又は親ＢＷ５１４７細胞を１％ＮＰ−４０、プロテアーゼインヒビター（１ｍＭＰＭＳＦ及び２０ＫａｌｌｉｋｒｅｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒＵ／ｍｌアプロチニン）、及びホスファターゼインヒビター（１ｍＭＥＧＴＡ，１０ｍＭＮａＦ，１ｍＭＮａ４Ｐ２Ｏ７，０．１ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭＮａ３Ｖ０４）を含むＴｒｉｓ−緩衝化生理食塩水（５０ｍＭＴｒｉｓ，１５ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．０）に溶解した。タンパク質を還元下又は非還元条件下で、抗−ＦｌａｇｍＡｂを用いて免疫ブロッティングによって分析した。結果を図２Ａに示す。ＢＷ５１４７形質転換体上のＦｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉａ及びＭＡＩＲ−ＩＩａの抗−Ｆｌａｇ−ｍＡｂとの免疫沈降物は、それぞれ〜５０ｋＤａび〜３５ｋＤａの分子量を有していた（図２Ａ）。
【００９０】
（５）ＭＡＩＲ−ＩａのＮ−グルコシダーゼ処理
ＭＡＩＲ−ＩａのＮ−グリコシル化を調べるために、Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉａを発現するＢＷ５１４７形質転換体を抗−ＦｌａｇｍＡｂ又はコントロールＩｇＧと共に免疫沈降させ、製造業者によって推奨される条件を用いてＮ−グリコシダーゼＦ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）にて処理した。
【００９１】
ＭＡＩＲ−Ｉａの移動度はＮ−グルコシダーゼＦ処理後〜５０ｋＤａから〜４５ｋＤａに減少した（図２Ｂ）。これは、ＭＡＩＲ−ＩｃＤＮＡから予想されるポリペプチドのサイズ及び細胞外領域のＮ−結合グルコシル部位の存在に一致した。
【００９２】
［実施例２］（ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩの発現）
（１）ノーザンブロット分析
ＭＡＩＲ−ＩｃＤＮＡをＲｅａｄｙｔｏＧｏＤＮＡＬａｂｅｌｌｉｎｇＢｅａｄｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＣｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて［３２Ｐ］−ｄＣＴＰにて標識化した。種々のマウス組織由来の各レーン中にある約１０μｇの全ＲＮＡを含む膜を、［３２Ｐ］−ｄＣＴＰ−標識化ｃＤＮＡプローブに、改良Ｃｈｕｒｃｈ’ｓハイブリダイゼーション緩衝液（０．５ＭＣｈｕｒｃｈ’ｓリン酸緩衝液、７％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ）中で６８℃にてハイブリダイズした。その膜をＣｈｕｒｃｈ’ｓ洗浄緩衝液（４０ｍＭＣｈｕｒｃｈ’ｓリン酸緩衝液、１％ＳＤＳ）中で６８℃にて１時間洗浄し、オートラジオグラフィーに供した。図３Ａ、図３ＢにＭＡＩＲ−Ｉ及び／又はＭＡＩＲ−ＩＩ転写物の発現をＭＡＩＲ−Ｉ細胞外部分をコードするｃＤＮＡをプローブとして用いるノーザンブロット法によって分析した結果を示す。ＭＡＩＲ転写物の優位な発現が脾臓、骨髄、腹腔マクロファージ、骨髄球系細胞株（４１６Ｂ、ＷＥＨＩ３、ＲＡＷ、及びＭ１細胞）などの造血組織において検出されたが、非造血器官では検出されなかった（図３Ａ）。
【００９３】
（２）逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
さらに血球系列でのＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩの発現を詳細に解析するため、骨髄、脾臓、胸腺からフローサイトメトリーにより各血球系列に分離し、ＭＡＩＲ−Ｉ−特異的プライマー及びＭＡＩＲ−ＩＩ−特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを以下のようにして行った。まず、ＲＮＡを骨髄、脾臓、胸腺からフローサイトメトリーによって精製した系統−分化した細胞（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｅｄｃｅｌｌｓ）から得た。このＲＮＡを逆転写し、ＨＰＲＴコントロールを用いて相対量に調節されたｃＤＮＡをセルソーターによる精製細胞から調製した。これらのｃＤＮＡを鋳型とし、ＭＡＩＲ−Ｉ−特異的プライマー（５’−ＡＡＧＣＴＧＡＴＡＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣ−３’：配列番号９及び５’−ＡＡＧＧＡＧＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＡＧＧＴＣ−３’：配列番号１０）、ＭＡＩＲ−ＩＩ−特異的プライマー（５’−ＴＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＡＧＡＣ−３’：配列番号１１及び５’−ＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＴＴＴＡＧＧＧＡＣＡＧ−３’：配列番号１２）、又はＨＰＲＴ−特異的プライマー（５’−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴ−３’：配列番号１３及び５’−ＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’：配列番号１４）を用いるＰＣＲ増幅に供した。ｃＤＮＡの量をＴａｑＭａｎＲｏｄｅｎｔＧＡＰＤＨコントロール試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて定量的ＰＣＲによって標準化した（Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｎ．，ｅｔａｌ．，ＥｕｒＪＩｍｍｕｎｏｌ，３１，１３１０−６，２００１）。ＰＣＲは：各サイクル２０秒間変性（９４℃）、２０秒間アニーリング（５５℃）、及び３０秒間伸長（７２℃）の条件で行った。図３ＢにＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ転写物はいずれもリンパ球造血前駆細胞、顆粒球、マクロファージ、赤血球系細胞、及び骨髄中のＢ細胞、脾臓中のＴ，Ｂ，及びＮＫ細胞を含む多系列の前駆細胞において発現したが、胸腺中のＴ細胞では検出されなかった（図３Ｂ）。
【００９４】
（３）ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の細胞表面発現解析
タンパク質レベルでの発現を解析するために、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質にそれぞれ特異的に反応するモノクローナル抗体ＴＸ−８及びＴＸ−１３を作成し、細胞表面における分子の発現をフローサイトメトリーで検討した。
【００９５】
（３−１）抗体の作成
ＴＸ−８（抗−ＭＡＩＲ−Ｉ）、ＴＸ−１０（抗−ＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ −ＩＩ）及びＴＸ−１３（抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ）ｍＡｂは、Ｓｈｉｂｕｙａ，Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１，４４１−６，２０００の記載に従い、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢａ／Ｆ３形質転換体とヒトＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質を足蹠に注射することによって免疫化したラット由来の膝窩リンパ節細胞とＳｐ２／０骨髄腫細胞株とを融合することによって調製した。
【００９６】
（３−２）フローサイトメトリー
Ｎ−末端をＦｌａｇｃＤＮＡでタグ化したＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩをｐＭＸレトロウイルスベクターにサブクローニングした（Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，ＵＳＡ，９２，９１４６−５０，１９９５）。Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−１及びＭＡＩＲ−ＩＩを安定に発現するＢＷ５１４７，Ｂａ／Ｆ３及びＲＡＷ細胞をＳｈｉｂｕｙａ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１，６１５−２３，１９９９に従って樹立した。
【００９７】
図４ＡはＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現しているＢＷ５１４７形質転換体をコントロールＩｇＧ又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合ストレプトアビジンで染色した結果を示す。
【００９８】
また、図４Ｂ，Ｃ，ＤはＣ５７／ＢＬ６マウス由来の脾臓、骨髄、又は腹腔マクロファージをビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）及びＰＥ−結合ｍＡｂ、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−結合ストレプトアビジンで染色した結果を示す。フローサイトメトリーによる脾臓及び骨髄細胞の分析では、ＭＡＩＲ−Ｉはマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、骨髄由来マスト細胞、及びＢ細胞の一部のサブセットを含むほとんどの骨髄球系細胞上で発現しているが、Ｔ細胞やＮＫ細胞では発現していないことが示された（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。他方、ＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質はＢ細胞のセブサット及び腹腔マクロファージのサブセットの細胞表面上でのみ検出され、ＲＴ−ＰＣＲの分析結果とは異なって樹状細胞、マスト細胞などには発現が認められなかった（図４Ｂ、Ｃ、Ｄ）。このことは、ＭＡＩＲ−ＩＩ分子の細胞膜上の発現が何らかの機構によって制御されている可能性が示唆され、転写物発現が認められても必ずしもタンパク質の細胞表面発現が起こらないことがわかった。
【００９９】
（４）細胞表面上のＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質発現の制御機構
細胞表面上のタンパク質発現の制御機構を調べるために、脾臓から精製したＢ細胞をＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は不存在下で４８時間培養し、培養前又は後、上記の抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）で染色した。４８時間培養後、ＭＡＩＲ−ＩＩ分子が細胞膜上で顕著に検出され、ＬＰＳの刺激によってそれはさらに増強された（図４Ｅ）。
【０１００】
［実施例３］ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩの機能解析
（１）インターナリゼーションアッセイ
ＭＡＩＲ−Ｉの細胞内領域はチロシンベースの局在モチーフ（ＹＶＮＬ）を含んでおり、（図１Ａ）、このモチーフはタンパク質のエンドソーム及びライソソームターゲッティングに関係し、アゴニスト−誘導インターナリゼーションに関与していることが報告されている（Ｍａｒｋｓ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，７，１２４−１２８，１９９７；Ｂｏｌｌ，Ｗ．，ｅｔａｌ．，ＥｍｂｏＪ，１５，５７８９−９５，１９９６）。従って、ＭＡＩＲ−Ｉが架橋後にインターナリゼーションを誘導するか否かを調べるために、腹腔マクロファージ上に発現しているＭＡＩＲ−Ｉをビオチン標識化抗−ＭＡＩＲ−ＩｍＡｂ（ＴＸ−８）、ＡＰＣ−標識化ストレプトアビジンで架橋し、４℃又は３７℃にて１時間インキュベートした。インターナリゼーションを受けなかった細胞表面ＭＡＩＲ−Ｉを除くために細胞を２．５％トリプシンにて処理（＋）又は処理せず（−）、フローサイトメトリーによって分析した。架橋後４℃でインキュベートした細胞の蛍光強度はトリプシン処理により顕著に減少したのに対し、架橋後３７℃でインキュベートした細胞では、トリプシン処理に関わらず蛍光は一定であった（図５Ａ）。これはＭＡＩＲ−Ｉの架橋が３７℃における培養中に受容体インターナリゼーションを誘導したことを示す。
【０１０１】
Ｎ末端をＦｌａｇ−タグ化したＭＡＩＲ−Ｉを発現するＢａ／Ｆ３形質転換体を抗−ＦｌａｇｍＡｂとインキュベートし、続いてＦＩＴＣ−標識化抗−マウスＩｇＧ第二抗体で架橋した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、ポリリジンで前もって被覆したチャンバースライド（Ｌａｂ−ＴｅｋＩＩ、ＮａｌｇｅＮｕｒｃ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）に載せ、３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、ＰＢＳにて２回洗浄し、３％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞をＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ，ＣＡ）を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤとともに載せ、共焦点走査レーザ顕微鏡下で分析した。緑色の蛍光がインキュベーション前では細胞表面にのみ検出されたのに対し、３７℃にて３０分間インキュベーション後では細胞内に豊富に観察され（図５Ｂ）、ＭＡＩＲ−Ｉは架橋後にインターナリゼーションを受けたことを示している。これに対し、局在モチーフ内のチロシン残基（Ｙ−Ｆ２３３）が変異を受けたＭＡＩＲ−Ｉのインターナリゼーションは検出されず、これは２３３位のチロシンがＭＡＩＲ−Ｉのインターナリゼーションを担っていることを示す。
【０１０２】
（２）ＭＡＩＲ−Ｉのチロシンリン酸化、ホスファターゼとの会合
ＭＡＩＲ−Ｉの細胞内領域におけるＩＴＩＭに対する共通配列の存在は、ＭＡＩＲ−Ｉはチロシンリン酸化を受け、ＳＨ−２−含有チロシンホスファターゼ補充する可能性を示唆した。そこで、骨髄由来培養マスト細胞上に発現したＭＡＩＲ−Ｉが過バナジン酸塩の刺激によってチロシンリン酸化されるかどうかを調べた。
【０１０３】
成体Ｂａｌｂ／ｃマウスの大腿及び頚骨由来の骨髄細胞を１０％ＦＢＳ、マウスｒＩＬ−３（４ｎｇ／ｍｌ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及びマウスｒＳＣＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地において２×１０５／ｍｌの濃度で培養した。培養後の骨髄由来のマスト細胞を１０分間３７℃にて過バナジン酸塩で刺激し、又は刺激せず、１％ＮＰ−４０（図６Ａ）又は１％ジギトニン（Ｓｉｇｍａ）緩衝液（０．１２％Ｔｒｉｔｏｎ−１００（片山化学製）、１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリエチルアミン（片山化学製）、又はプロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターを含む上述の１％ＮＰ−４０緩衝液）（図６Ｂ）に溶解し、コントロールＩｇＧ、抗−ＭＡＩＲ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−ＩＩ、又は抗−ＳＨＩＰで免疫沈降した。免疫沈降物を抗−ホスホチロシンｍＡｂ（抗−ｐＹ）（図６Ａ）又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（図６Ｂ）でイムノブロットした。図６Ａに示すように、過バナジン酸塩による刺激はＭＡＩＲ−Ｉのチロシンリン酸化を顕著に誘導した（図６Ａ）。タンパク質−チロシンホスファターゼＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２、及びポリホスフェートイノシトール５−ホスファターゼＳＨＩＰによって免疫沈降すると、マスト細胞の過バナジン酸塩の刺激後、ＭＡＩＲ−ＩはＳＨＩＰと結合したが、ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２とは結合しなかった（図６Ｂ）。これらの結果は、ＭＡＩＲ−Ｉは細胞質内領域のチロシンがリン酸化された後、抑制性シグナルを媒介する可能性があることを示す。
【０１０４】
（３）セロトニン放出アッセイ
ＭＡＩＲ−Ｉは細胞質領域にＩＴＩＭをもつが、これが実際に抑制性のシグナル伝達を担うどうかを確認するために、骨髄細胞をＩＬ−３とＳＣＦで培養して誘導したマスト細胞において、ＭＡＩＲ−ＩがＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）を介した脱顆粒を抑制するか否かを解析した。Ｉｇ−Ｅ−媒介セロトニン放出アッセイをＵｅｈａｒａ，Ｔ．，ｅｔａｌ．，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，１０８，１０４１−５０，２００１の記載に従って行った。まず、骨髄細胞由来マスト細胞を３Ｈ−セロトニン（５−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−ヒドロキシトリプタミンクレアチニン硫酸塩）（５μＣｉ／ｍｌ；ＮＥＮＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＰｒｏｄｕｃｓｔｓＩｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）とともに５時間３７℃にてインキュベートし、さらに１時間バックグランド放射活性を減らすために再インキュベートした。３Ｈ−セロトニン負荷マスト細胞を１０μｌのラットＩｇＥ抗−ＤＮＰｍＡｂ（２５μｇ／ｍｌ）及び種々の濃度のラット抗−ＭＡＩＲ−Ｉ又はコントロールＩｇＧ（ＩｇＥｍＡｂ＋抗−ＭＡＩＲ−Ｉ又はＩｇＥｍＡｂ＋コントロールＩｇＧ）を含む９６ウェルプレートに入れ、３０分間４℃にてインキュベートし、洗浄し、２５μＬの培地中に再懸濁した。抗体−初回刺激を受けたマスト細胞を２５μｌのウサギ抗−ラットＩｇ抗体（４０μｇ／ｍｌ）のＦ（ａｂ’）２断片で３７℃にて３０〜６０分間チャレンジした。反応を５０μｌの冷ＰＢＳを加えることによって停止させた。上清の３Ｈ−セロトニンを液体シンチレーションカウンダーにて測定した。３Ｈ−セロトニンの全取り込み量を１％ＳＤＳ／１％ＮＰ４０を含むＰＢＳにてマスト細胞を溶解することによって測定し、セロトニン放出の割合を１００×（上清のｃｐｍ／全取り込み量のｃｐｍ）によって定義した。図６Ｃに示すように、ＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ−ＩｍＡｂの架橋は濃度依存的に骨髄由来マスト細胞からのＩｇＥ−媒介セロトニン放出を抑制した。
【０１０５】
（４）ＭＡＩＲ−ＩＩのアダプター分子の会合
ＭＡＩＲ−Ｉとは異なって、ＭＡＩＲ−ＩＩは細胞内領域が短く、シグナル伝達に関与する配列を持たないこと、及び膜貫通領域の正電荷を持つリジン酸残基の存在から考え、同部位に負に荷電したアミノ酸残基をもったＦｃεＲＩγやＤＡＰ１２などのアダプター分子が会合することが予想された。そこで、ＭＡＩＲ−ＩＩのＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のようなアダプター膜貫通タンパクとの非共有結合を調べるために、ＦｃεＲＩγもＤＡＰ１２も発現しない２９３Ｔ細胞をＭＡＩＲ−ＩＩｃＤＮＡとＦｃεＲＩγ又はＤＡＰ１２のいずれかで形質転換した。形質転換体を１％ジギトニン緩衝液に溶解し、細胞溶解物をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２又は抗−ＦｃεＲＩγと共に免疫沈降させ、単離したタンパク質を抗− ＭＡＩＲ−ＩＩでイムノブロットした。図７Ａに示すように、ＭＡＩＲ−ＩＩとＤＡＰ１２との共免疫沈降が確認され、ＭＡＩＲ−ＩＩはＤＡＰ１２と会合していることが明らかとなったが、ＦｃεＲＩγとの共免疫沈降は確認されなかった。同様に、ＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子導入したマウスマクロファージＲＡＷ細胞を用いて免疫沈降を行ったところ、ＭＡＩＲ−ＩＩとＤＡＰ１２との共免疫沈降は確認されたが、ＦｃεＲＩγとの共免疫沈降は確認されなかった（図７Ｂ）。
【０１０６】
一次細胞におけるＭＡＩＲ−ＩＩのＤＡＰ１２との生理学的結合を確かめるために、脾臓細胞をＬＰＳで刺激し、１％ジギトニン緩衝液に溶解し、抗−ＦｃεＲＩ又は抗−ＤＡＰ１２と免疫沈降した。単離したンパク質を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩにて再び免疫ブロットすると、ＭＡＩＲ−ＩＩはＤＡＰ１２と共免疫沈降するが、ＦｃεＲＩγとは共免疫沈降しなかった（図７Ｃ）。これらの結果は、ＤＡＰ１２がＭＡＩＲ−ＩＩに対する生理学的パートナーであることを示す。
【０１０７】
また、２９３Ｔ細胞をＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２、ＭＡＩＲ−ＩＩ、又はＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２＋ＭＡＩＲ−ＩＩで形質転換し、ビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＦＩＴＣ−結合抗−ＦｌａｇｍＡｂ、続いてＡＰＣ−結合ストレプトアビジンで染色した。ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＤＡＰ１２の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を図７Ｄに示す。２９３Ｔ細胞の細胞表面上のＤＡＰ１２発現はＭＡＩＲ−ＩＩの発現に依存していることが観察された（図７Ｄ）。
【０１０８】
（５）ＴＮＦ−α分泌
ＤＡＰ１２はＩＴＡＭを有しており、活性化シグナルを伝えることが明らかになっている（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．２１，６１１−６１４，２０００；Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ，Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，３４１１５−３４１１９，１９９８；Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，７０３−７０７，１９９８）。実際に、ＭＡＩＲ−ＩＩから活性化シグナルの伝達があるか否かを解析した。Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−ＩＩ又はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の腹腔マクロファージを発現するＲＡＷ細胞を抗−ＣＤ３２／１６（ＦｃγＲ）で前処理し、プラスチック被覆コントロールＩｇＧ、抗−Ｆｌａｇ又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩｍＡｂで刺激し、４８時間培養した。細胞上清中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡｋｉｔ（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って測定した。図８に示すように、Ｎ末端にＦｌａｇを付加したＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子を導入した形質転換体では、抗−Ｆｌａｇ抗体で架橋すると炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの生産が有意に亢進した。また、腹腔マクロファージで直接ＭＡＩＲ−ＩＩ分子を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ抗体で架橋してもＴＮＦ−αの分泌が顕著に増加した。しかしながら、抗ＭＡＩＲ−ＩＩ抗体の架橋後、腹腔マクロファージからのＩＬ−６及びＩＬ−１２分泌の顕著な増加は認められなかった。これらの結果はＭＡＩＲ−ＩＩが離れたシグナリング経路を媒介し、マクロファージにおけるＴＮ−α分泌を導くことを示す。
【０１０９】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫応答を正又は負に調節する新規な免疫受容体タンパク質が提供される。本発明の免疫受容体タンパク質は、免疫応答を活性化及び抑制させる機能を有するため、自然免疫反応の制御機構の解明や免疫調節物質の探索、抗アレルギー薬や抗炎症薬などの医薬の開発に有用である。
【０１１０】
【配列表】

【０１１１】
【配列表フリーテキスト】
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
配列番号１１：合成ＤＮＡ
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、本発明の免疫受容体タンパク質ＭＡＩＲ−Ｉａ、ＭＡＩＲ−Ｉｂ、ＭＡＩＲ−ＩＩａ、ＭＡＩＲ−ＩＩｂのアミノ酸配列の比較を示す。
図１Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩタンパク質の模式図を示す。
図１Ｃは、ゲノムＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩのサザンブロット分析を示す。
【図２】図２Ａは、Ｆｌａｇ −タグ化ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩを発現するＢＷ５１４７細胞を溶解し、タンパク質を還元下又は非還元条件下で抗−ＦｌａｇｍＡｂで免疫ブロットした結果を示す。
図２Ｂは、Ｆｌａｇ−タグ化ＭＡＩＲ−Ｉを発現するＢＷ５１４７細胞又は親ＢＷ５１４７細胞を溶解し、タンパク質を抗−ＦｌａｇｍＡｂと免疫沈降させ、沈殿物をＮ−グリコシダーゼＦで処理又は処理せず、非還元下、抗−ＦｌａｇｍＡｂで免疫ブロットした結果を示す。
【図３】図３Ａ、図３ＢはＭＡＩＲ−Ｉ及びＭＡＩＲ−ＩＩ転写物の発現をノーザンブロット法によって分析した結果を示す。
【図４】図４Ａは形質転換細胞（ＢＷ５１４７細胞）におけるＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）を用いて分析した結果を示す。図４Ｂ，Ｃ，Ｄはマウス由来の脾臓、骨髄、又は腹腔マクロファージにおけるＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）を用いて分析した結果を示す。図４Ｅは、Ｂ細胞をＬＰＳの存在下又は不存在下で培養後、ＭＡＩＲ−Ｉ又はＭＡＩＲ−ＩＩの細胞膜表面発現を抗−ＭＡＩＲ−Ｉ（ＴＸ−８ｍＡｂ）又は抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１３ｍＡｂ）で分析した結果を示す。
【図５】図５Ａは、腹腔マクロファージ上のＭＡＩＲ−Ｉを抗−ＭＡＩＲ−ＩｍＡｂ（ＴＸ−８）で架橋し、４℃又は３７℃にてインキュベーション後、フローサイトメトリーで分析した結果を示す。図５Ｂは、ＭＡＩＲ−Ｉ発現細胞を抗−ＭＡＩＲ−ＩｍＡｂ（ＴＸ−８）で架橋し、３７℃でインキュベーションする前後において共焦点レーザ顕微鏡下で分析した結果を示す。
【図６】図６Ａは、骨髄由来マスト細胞を過バナジン酸塩で刺激後、コントロールＩｇＧ又は抗−ＭＡＩＲ−Ｉで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ホスホチロシンｍＡｂ（抗−ｐＹ）でイムノブロットした結果を示す。図６Ｂは、骨髄由来マスト細胞を過バナジン酸塩で刺激後、コントロールＩｇＧ、抗−ＭＡＩＲ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−Ｉ、抗−ＳＨＰ−ＩＩ、又は抗−ＳＨＩＰで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−Ｉでイムノブロットした結果を示す。図６ＣはＭＡＩＲ−Ｉと抗−ＭＡＩＲ−ＩｍＡｂの架橋後における骨髄由来マスト細胞からのＩｇＥ−媒介セロトニン放出アッセイの結果を示す。
【図７】図７Ａは、ＭＡＩＲ−ＩＩ＋ＤＡＰ１２、又はＭＡＩＲ−ＩＩ＋ＦｃεＲＩで形質転換した細胞（２９３Ｔ）をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、抗− ＦｃεＲＩで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｂは、ＭＡＩＲ−ＩＩで形質転換した細胞（ＲＡＷ）をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、又は抗− ＦｃεＲＩで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｃは脾臓細胞をコントロールＩｇＧ、抗−ＤＡＰ１２、又は抗− ＦｃεＲＩで免疫沈降し、免疫沈降物を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ（ＴＸ−１０）でイムノブロットした結果を示す。図７Ｄは、２９３Ｔ細胞をＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２、ＭＡＩＲ−ＩＩ、又はＦｌａｇ−タグ化ＤＡＰ１２＋ＭＡＩＲ−Ｉで形質転換し、ビオチン−結合抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＦＩＴＣ−結合抗−ＦｌａｇｍＡｂ、続いてＡＰＣ−結合ストレプトアビジンで染色後、ＭＡＩＲ−ＩＩ及びＤＡＰ１２の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって分析した結果を示す。
【図８】図８（左の図）は、Ｆｌａｇタグ化ＭＡＩＲ−ＩＩ遺伝子を導入した形質転換体を抗−Ｆｌａｇ抗体で架橋した後のＴＮＦ−α生産を示す。図８（右の図）は、腹腔マクロファージ上のＭＡＩＲ−ＩＩ分子を抗−ＭＡＩＲ−ＩＩ抗体で架橋した後のＴＮＦ−αの生産を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel immunoreceptor protein, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant containing the recombinant vector, a method for producing the protein, and the like.
[0002]
[Prior art]
The immune response is controlled by a balance of positive and negative signals from activating and inhibitory cell membrane receptors. The activation of immune cells, such as lymphocytes and myeloid cells, is achieved by the activation of the cell membrane receptor, which recognizes and binds to its ligand, and activates the cell membrane receptor itself or the adapter molecule that associates with the receptor. YxxxLx (6-8) -YxxxL (x is the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) present in the inner region) is called an immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM). It is started by phosphorylation of a tyrosine having a characteristic sequence consisting of any amino acid (see Non-Patent Documents 1 and 2). On the other hand, the activated immune cells have an immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) present in an intracellular region when a cell membrane receptor molecule, which is an inhibitory receptor, binds to a ligand. Tyrosine of a characteristic sequence consisting of (I / V / L / S) -x-Y-x-x- (L / V) (x represents an arbitrary amino acid) is suppressed through phosphatase (See Non-Patent Documents 1 and 3).
[0003]
Both the activating receptor and the inhibitory receptor have (1) that the extracellular region is highly conserved, (2) that the activating receptor has an activation motif ITAM in its intracellular region, or The transmembrane region has a charged amino acid for associating with an adapter molecule having an ITAM such as FcεRIγ or DAP12. (4) The inhibitory receptor has an inhibitory motif ITIM in an intracellular region. (5) Activating receptors are characterized by having a shorter intracellular region than inhibitory receptors. Many of the activating receptors are also paired with inhibitory receptors, and it has been revealed that both genes are located in small clusters on the chromosome (Non-patent Literature) 4). Known gene families including both activating and inhibitory receptors include, for example, KIR, CD94 / NKG2, and Ly49, which are NK inhibitory receptor families that recognize MHC class I ligands. Non-Patent Document 5). Also, CD28 and CTLA4 expressed on T cells bind to the same ligand (eg, CD80 and CD86) and deliver opposite positive and negative signals, respectively (see Non-Patent Document 6). Similarly, B cells and / or myeloid cells include human and mouse Fcγ receptors (see Non-Patent Documents 7 and 8), mouse pair immunoglobulin (Ig) -like receptor (PIR) (Non-patent Documents). 9, non-patent document 10) and its human homologue Ig-like transcript (ILT; CD85) (see non-patent document 11, non-patent document 12, non-patent document 13), and signal control protein (SIRP) (non-patent document 14) , Non-patent document 15, non-patent document 16).
[0004]
These family molecules are highly conserved in extracellular domain structure and often recognize common or similar ligands, but the resulting immune cell response is positive (activation) and negative (suppression). Gender). The immunological significance of inducing such completely contradictory immune responses is extremely interesting, and elucidating how positive and negative signals are integrated and controlled in vivo is an understanding of the immune system. Is considered very important to
[0005]
[Non-patent document 1]
Lanier, L .; L. , Curr Opin Immunol, 13, 326-331, 2001.
[Non-patent document 2]
Bollland, S.M. Ravetch, J. et al. V. , Et al. , Adv. Immunol. , 72, 149-177, 1998.
[Non-Patent Document 3]
Ravetch, J .; V. , Lanier, L .; L. , Science, 290, 84-89, 2000.
[Non-patent document 4]
Martin, A .; M. , Et al. , Trends Immunol, 23, 81-8, 2002).
[Non-Patent Document 5]
Lanier, L .; L. , Annu Rev Immunol, 16, 359-93, 1998.
[Non-Patent Document 6]
Chambers, C.I. A. & J. P. Allison, Curr Opin Cell Biol, 11, 203-210, 1999.
[Non-Patent Document 7]
Ravetch, J .; V. & R. A. Clynes, Annu Rev Immunol, 16, 421-32, 1998.
[Non-Patent Document 8]
Daeron, M .; , Annur Rev Immunol, 15, 203-34, 1997.
[Non-Patent Document 9]
Kubagawa, H .; , Et al. Proc Natl Acad Sci, USA, 94, 5261-5266, 1997.
[Non-Patent Document 10]
Hayami, K .; , Et al. , J Biol Chem, 272, 7320-7327, 1997.
[Non-Patent Document 11]
Samaridis, J .; & M. Colonna, Eur J Immunol, 27, 660-665, 1997.
[Non-Patent Document 12]
Borges, L.A. , Et al. , J Immunol, 159, 5192-5196, 1997.
[Non-patent document 13]
Wegtmann, N.W. , Et al. , Curr Biol, 7, 615-618, 1997.
[Non-patent document 14]
Kharitonenkov, A. et al. , Et al. , Nature, 386, 181-186, 1997.
[Non-Patent Document 15]
Fujioka, Y .; , Et al. , Mol Cell Biol, 16, 6887-6899, 1996.
[Non-Patent Document 16]
Ohnishi, H .; , Et al. , J Biol Chem, 271, 25569-25574, 1996.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to obtain a novel pair of activation and inhibitory immune receptor genes involved in an immune response including proliferation, activation and differentiation of myeloid cells and the like, and to obtain molecular and functional properties of the receptor. To clarify the characteristic.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, from a macrophage of a mouse, an inhibitory immune receptor protein (MAIR-I) having an ITIM in an intracellular region and transmitting an inhibitory signal, Activated immunoreceptor protein (MAIR-II) having high homology to the immunoglobulin domain in the extracellular region of the inhibitory immunoreceptor protein and transmitting an activation signal was successfully isolated, The present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An immunoreceptor protein represented by the following (a) or (b):
(A) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(B) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing, and having a function of suppressing a cellular immune response;
(2) An immunoreceptor protein shown in the following (c) or (d).
(C) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 in the sequence listing
(D) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing, and having a function of activating a cellular immune response
(3) A gene encoding the immunoreceptor protein of the above (1) or (2).
(4) A gene consisting of the DNA shown in the following (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(B) a DNA that hybridizes with a complementary sequence of the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing under stringent conditions and encodes a protein having a function of suppressing a cellular immune response
(5) A gene consisting of the DNA shown in (c) or (d) below.
(C) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing
(D) a DNA which hybridizes with a complementary sequence of the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing under stringent conditions and encodes a protein having a function of activating a cell immune response
(6) A recombinant vector containing the gene of (4) or (5).
(7) A transformant transformed with the gene of (4) or (5).
(8) The production of the immunoreceptor protein of (1) or (2), wherein the transformant of (7) is cultured in a medium, and the immunoreceptor protein is collected from the obtained culture. Method.
(9) An antibody that recognizes one or both of the immunoreceptor proteins of (1) and (2).
(10) The method for quantifying an immunoreceptor protein according to the above (1) or (2) using the antibody of the above (9).
(11) The kit for quantifying the immunoreceptor protein according to (1) or (2), comprising the antibody according to (9).
(12) A method for isolating a pair of activated immunoreceptor genes using a gene encoding an extracellular conserved region of an inhibitory immune receptor having an ITIM motif as a probe.
(13) A method of isolating a pair of inhibitory immune receptor genes using a gene encoding an extracellular conserved region of an activated immune receptor having an ITAM motif as a probe.
(14) The immunoreceptor protein of the above (1) or (2), or a cell or cell membrane that expresses the protein, is allowed to act on a test substance that is expected to contain a ligand, and the protein has an affinity for the protein. The method for screening a ligand for an immunoreceptor protein according to the above (1) or (2), comprising selecting a certain substance.
(15) A ligand for the immunoreceptor protein of (1) or (2) obtained by the method of (14).
(16) (a) a case where the immunoreceptor protein of the above (1) or (2) is caused to act on a ligand for the immunoreceptor protein in the absence of a test substance; and (b) a case where the above (1) or (2) 2) comparing the case where the immunoreceptor protein is caused to act on the ligand for the immunoreceptor protein in the presence of the test substance, and selecting a substance which affects the binding between the immunoreceptor protein and the ligand A method for screening for an antagonist or agonist for the immunoreceptor protein.
(17) A kit for screening an antagonist or agonist for the immunoreceptor protein, comprising the immunoreceptor protein of (1) or (2).
(18) An antagonist or agonist for the immunoreceptor protein of (1) or (2), obtained using the method of (16) or the kit of (17).
(19) A drug for controlling an immune function, comprising as an active ingredient the immunoreceptor protein of the above (1) or (2) or a gene encoding the protein.
(20) A drug for controlling an immune function, which comprises, as an active ingredient, a ligand for the immunoreceptor protein of (1) or (2) or an antagonist or agonist for the immunoreceptor protein of (1) or (2).
(21) The reagent for detecting an immunoreceptor protein of the above (1) or (2), comprising the antibody of the above (9).
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The immunoreceptor proteins of the present invention are novel myeloid-associated immunoglobulin-like receptors MAIR-I and MAIR-II, whose extracellular regions are highly conserved with each other. It is a pair of activating and inhibitory receptor proteins. MAIR-I is expressed on most myeloid cells, including macrophages, granulocytes, mast cells, and dendritic cells, and has a tyrosine-based localization motif and a tyrosine-based immunoreceptor inhibitor in the cytoplasmic region. Contains motifs, induces receptor internalization, and suppresses IgE-mediated degranulation from mast cells. On the other hand, MAIR-II is expressed on macrophages and a subset of B cells, associates with the adapter molecule DAP12, which has a tyrosine-based immunoreceptor activation motif, and enhances inflammatory cytokine secretion from macrophages. Thus, MAIR-I and MAIR-II positively or negatively regulate the innate immune response, respectively, and play important regulatory roles in cell signaling and immune responses.
[0010]
1. Isolation of the gene encoding the immunoreceptor protein of the present invention
The cloning of the gene encoding the immunoreceptor protein of the present invention (hereinafter also referred to as MAIR) can be performed, for example, by using PU. PU. It can be performed by PCR subtraction based on the RDA (Representative Difference Analysis) method using a 14-day-old embryonic liver as a material between a 1-1 mouse and a wild-type mouse. In the RDA method, an adapter is added to genomic DNA digested with restriction enzymes, and a fragment obtained by amplifying (representation) a fragment of the genomic DNA by PCR is compared with each other by a subtraction method (subtraction method) to detect mutation-deficient DNA. There is something.
[0011]
A gene encoding MAIR or a cDNA library derived from the following immune system cells or tissues is isolated by screening using a DNA probe synthesized based on the DNA fragment prepared by the RDA method. Can be. The source of mRNA for preparing the cDNA library is not particularly limited as long as it is a cell expressing MAIR mRNA, and may be human or other mammals (eg, mouse, rat, guinea pig, rabbit, pig, All immune system cells of sheep, cattle, monkeys, etc. [eg, macrophages, mast cells, granulocytes (neutrophils, basophils, eosinophils), monocytes, dendritic cells, B cells, NK cells, etc.] Or any tissue in which these cells are present (eg, spleen, lymph nodes, bone marrow, liver, etc.).
[0012]
Preparation of mRNA can be performed by a technique commonly used in the art. For example, the above cells or tissues are treated with a guanidine reagent, a phenol reagent or the like to obtain total RNA, and then subjected to an affinity column method using an oligo (dT) cellulose column or poly U-sepharose using Sepharose 2B as a carrier. Alternatively, poly (A) + RNA (mRNA) is obtained by a batch method. Further, poly (A +) RNA may be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
[0013]
Next, using the obtained mRNA as a template, a single-stranded cDNA was synthesized using an oligo dT primer and a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA was synthesized from the single-stranded cDNA using DNA synthase I, DNA ligase, RnaseH, and the like. Synthesize strand cDNA. A cDNA library is prepared by blunting the synthesized double-stranded cDNA with T4 DNA synthetase, ligation of an adapter (eg, EcoRI adapter), phosphorylation, etc., and incorporation into a vector such as λgt11 for in vivo packaging. can do. In addition, a cDNA library can also be prepared using a plasmid other than λ phage.
[0014]
As a screening method for selecting a strain having the target DNA from the transformants obtained as described above, for example, a sense primer and an antisense primer corresponding to the amino acid sequence of MAIR-Ia described below purified from mouse liver are synthesized. However, there is a method of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the same.
[0015]
Examples of the template DNA used herein include cDNA synthesized from the mRNA by a reverse transcription reaction. In addition, primers can be designed based on the above amino acid sequence information, while appropriately considering the expected size of the DNA fragment when amplified or the combination of degenerate codons.
[0016]
The amplified DNA fragment thus obtained is labeled with 32P, 35S, biotin, or the like to form a probe, which is hybridized with a nitrocellulose filter in which the DNA of the transformant is denatured and fixed, and the obtained positive strain is obtained. Screening can be performed by searching.
[0017]
The nucleotide sequence of the obtained clone is determined. The nucleotide sequence can be determined by a known method such as the Maxam-Gilbert chemical modification method or the dideoxynucleotide chain termination method using M13 phage. Usually, an automatic nucleotide sequencer (for example, 373A DNA manufactured by PERKIN-ELMER) is used. The sequence is determined using a sequencer, BcaBEST dideoxy sequencing kit manufactured by TAKARA). The obtained base sequence is analyzed by DNA analysis software such as DNASIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd.), and a protein coding portion encoded in the obtained DNA chain is found.
[0018]
Examples of the gene encoding the receptor protein of the present invention obtained by the above method include a gene encoding a mouse-derived immunosuppressive receptor protein MAIR-Ia represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and its isotype. A gene encoding a mouse-derived immunosuppressive receptor protein MAIR-Ib represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, and a mouse-derived immune-activating receptor protein MAIR- represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3. A gene encoding IIa, and a gene encoding a mouse-derived immune-activating receptor protein MAIR-IIb represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, which is an isotype thereof.
[0019]
The immunoreceptor protein of the present invention comprises (a) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or (b) one or several amino acids deleted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. A protein having an amino acid sequence substituted or added and having a function of suppressing a cell immune response; or (c) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing; It is a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and having a function of activating a cell immune response.
[0020]
The range of “1 to several” in the above “amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (or SEQ ID NO: 4)” is not particularly limited. However, for example, it means about 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, still more preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
[0021]
The deletion, addition and substitution of the amino acids can be performed by modifying the gene encoding the immunoreceptor protein by a method known in the art. Mutations can be introduced into a gene by a known method such as the Kunkel method or the Gapped Duplex method or a method analogous thereto. For example, a mutagenesis kit using site-directed mutagenesis (for example, Mutant-K) (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA) or the like, or using a TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit.
[0022]
The above “has a function of suppressing the immune response of a cell” refers to an inhibitory activity of a cell's immune response (for example, suppression of degranulation, reduction of cytokine production, suppression of cytotoxic activity, suppression of antigen presenting function, paucity Suppression) is substantially equivalent to the activity of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
In addition, the above “having a function of activating a cellular immune response” means activating activity of a cellular immune response (for example, promotion of degranulation, enhancement of cytokine production, enhancement of cytotoxic activity, enhancement of antigen presentation function, (E.g., increased prey ability) is substantially equivalent to the activity of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
[0023]
More specifically, as long as the activities are equivalent (for example, about 0.01 to 100-fold, preferably about 0.5 to 20-fold, more preferably about 0.5 to 2-fold), the quantitative The element may be different from the original protein.
[0024]
Peptides containing partial amino acid sequences in any of the above immunoreceptor proteins (also referred to as partial peptides) are also included in the scope of the present invention. In particular, among the partial peptides of the present invention, a portion that is exposed outside the cell membrane when the immunoreceptor protein is naturally present and has a ligand binding activity is particularly useful in determining the ligand of the immunoreceptor protein. is there. Examples of such a partial peptide include a portion analyzed as an extracellular region (hydrophilic site) in a hydrophobic plot analysis of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. The number of amino acids constituting the partial peptide of the present invention is at least 10 or more, preferably 30 or more, and more preferably 80 or more.
[0025]
The immunoreceptor protein or its partial peptide of the present invention can be provided in the form of a salt, if necessary, preferably in the form of a physiologically acceptable acid addition salt. Such salts include salts of inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, Citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
[0026]
The immunoreceptor protein of the present invention can be obtained by extracting and separating from a cultured cell or tissue of a human or mammal expressing the protein, or culturing a transformant containing a DNA encoding the protein as described below. Can also be manufactured. When producing from human or mammalian tissues or cells, the human or mammalian tissues or cells are homogenized, extracted with an acid or the like, and the resulting extract is subjected to hydrophobic chromatography, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography. It can be isolated and purified by combining various chromatography such as chromatography.
[0027]
The partial peptide can be produced by a known peptide synthesis method or by cleaving the immunoreceptor protein with an appropriate peptidase (eg, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase). As a peptide synthesis method, for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used.
[0028]
The gene encoding the immunoreceptor protein of the present invention may be any gene as long as it encodes the above-described immunoreceptor protein of the present invention. Specifically, (a) shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing DNA consisting of a base sequence, (b) hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and suppresses the immune response of cells A gene consisting of a DNA encoding a protein having a function; or (c) a DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing; Encodes a protein that hybridizes with DNA consisting of a base sequence under stringent conditions and has a function of activating a cellular immune response And a gene consisting of a DNA that forms
[0029]
The above-mentioned “DNA capable of hybridizing under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: 3)” includes SEQ ID NO: 1 (or SEQ ID NO: DNA comprising a base sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more with the base sequence represented by 3). Here, the stringent condition means, for example, a condition in which the sodium concentration is 600 to 900 mM and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C.
[0030]
Once the nucleotide sequence of the gene of the present invention has been determined, it is subsequently synthesized by chemical synthesis, by PCR using the cDNA of the gene as a template, or by hybridization using a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe. The gene of the invention can be obtained.
[0031]
2. Preparation of recombinant vector and transformant
(1) Preparation of recombinant vector
The recombinant vector of the present invention can be obtained by ligating the gene of the present invention to an appropriate vector. The vector for inserting the gene of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. Plasmid DNAs include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pRSET, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19), plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, etc.), and plasmids derived from yeast (eg, YEp13, YEp24, And phage DNAs include λ phage (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP, etc.). Furthermore, animal viruses such as retrovirus or vaccinia virus, and insect virus vectors such as baculovirus can also be used.
[0032]
In order to insert the gene of the present invention into a vector, first, the purified DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, inserted into an appropriate restriction enzyme site or a multiple cloning site of the vector DNA, and ligated to the vector. Adopted.
[0033]
The gene of the present invention needs to be incorporated into a vector so that the function of the gene is exerted. Therefore, the vector of the present invention includes a vector containing a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, a ribosome binding sequence (SD sequence), and the like, if desired, in addition to the promoter and the gene of the present invention. Can be linked. In addition, examples of the selection marker include a dihydrofolate reductase gene, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene, and the like.
[0034]
When the host cell is Escherichia coli, examples of such a vector include a pET vector (Novagen), a pTrxFUS vector (Invitrogen), and a pCYB vector (NEWENGLAMD Bio Labs). In some cases, for example, pESP-1 expression vector (manufactured by STRATAGENE), pAUR123 vector (manufactured by Takara Shuzo), pPIC vector (manufactured by Invitrogen), and when the host cell is an animal cell, for example, pMAM-neo expression When a host cell is an insect cell, for example, a pBacPAK vector is used when a vector (manufactured by CLONTECH), a pCDNA3.1 vector (manufactured by Invitrogen), a pBK-CMV vector (manufactured by STRATAGENE) and the like are used. (CLONTECH Inc.), (manufactured by CLONTECH Co.) PAcUW31 vector, PACP (+) (manufactured by Novagen Co.) IE1 vectors, and the like, respectively.
[0035]
(2) Preparation of transformant
The transformant of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. Here, the host is not particularly limited as long as it can express the DNA of the present invention. For example, bacteria belonging to the genus Escherichia such as Escherichia coli, the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, the genus Pseudomonas such as Pseudomonas putida, and the genus Rhizobium liophili belonging to the genus Rhizobium meliloti ibriophili such as Rhizobium meliloti. Yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe; monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, human L cells, HF cells, and the like. Animal cells; or insect cells such as Sf9 and Sf21.
[0036]
When a bacterium such as Escherichia coli is used as a host, the recombinant vector of the present invention must be capable of autonomous replication in the bacterium and be composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a gene of the present invention, and a transcription termination sequence. Is preferred. Further, a gene controlling a promoter may be included.
[0037]
Escherichia coli includes, for example, Escherichia coli K12 and DH1, and Bacillus subtilis includes, for example, Bacillus subtilis. Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage such as a trp promoter, a lac promoter, a PL promoter, and a PR promoter are used. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used. The method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. For example, a method using calcium ions (Cohen, SN et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114), an electroporation method and the like can be mentioned.
[0038]
When yeast is used as a host, for example, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and the like are used. In this case, the promoter is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter, etc. Is mentioned. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, an electroporation method (Becker, DM et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187), spheroplast method (Hinnen, A. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 1929-1933), lithium acetate method (Itoh, H. (1983)). J. Bacteriol.153,
163-168) and the like.
[0039]
When an animal cell is used as a host, monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), mouse L cells, rat GH3, human FL cells and the like are used. As the promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter and the like are used, and an early gene promoter of human cytomegalovirus may be used. Examples of a method for introducing a recombinant vector into animal cells include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
[0040]
When insect cells are used as hosts, Sf9 cells, Sf21 cells, and the like are used. As a method for introducing a recombinant vector into insect cells, for example, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, and the like are used.
In addition, a method that does not rely on a recombinant vector, such as a particle gun method, can be used to introduce a gene into each of the above host cells.
[0041]
3. Production of the immunoreceptor protein of the present invention
The immunoreceptor protein of the present invention can be obtained by culturing the transformant and collecting from the culture. The term “culture” means any of cultured cells or cultured cells, or crushed cells or cells, in addition to the culture supernatant.
[0042]
The method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing the host cell.
[0043]
The culture medium for culturing the transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host contains a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be used by the microorganism to efficiently culture the transformant. As long as the medium can be used, either a natural medium or a synthetic medium may be used. The carbon source may be any one that can be assimilated by the organism, and examples thereof include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch; organic acids such as acetic acid and propionic acid; and alcohols such as ethanol and propanol. Examples of the nitrogen source include ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, and other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, corn steep liquor, and the like. As the inorganic salts, potassium (I) phosphate, potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like are used.
[0044]
The cultivation is usually performed at 37 ° C. for 6 to 24 hours under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture. During the cultivation period, the pH is kept at 7.0 to 7.5. Adjustment of the pH is performed using an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like. During the culture, an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed.
[0045]
When culturing a microorganism transformed with an expression vector using an inducible promoter as a promoter, an inducer may be added to the medium as necessary. For example, when culturing a microorganism transformed with an expression vector using a Lac promoter, culturing a microorganism transformed with isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like using an expression vector using a trp promoter. In some cases, indoleacetic acid (IAA) or the like may be added to the medium.
[0046]
As a medium for culturing a transformant obtained by using an animal cell as a host, a commonly used RPMI1640 medium, a DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to such a medium is used. Culture is usually performed with 5% CO ₂ Perform in the presence at 37 ° C. for 1-30 days. During the culture, antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed.
[0047]
After culturing, when the immunoreceptor protein of the present invention is produced in cells or cells, the proteins are extracted by disrupting the cells or cells. When the immune system receptor protein of the present invention is produced outside the cells or cells, the culture solution is used as it is, or the cells or cells are removed by centrifugation or the like. Thereafter, by using a general biochemical method used for isolation and purification of proteins, for example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like, alone or in appropriate combination, the above-mentioned culture is performed. Can be isolated and purified from the immunoreceptor protein of the present invention.
[0048]
4. Antibodies to the immunoreceptor protein of the present invention
The antibody of the present invention can be obtained by the following general antibody preparation method. Particularly, TX-8 recognizing only MAIR-I, TX-10 recognizing both MAIR-I and MAIR-II, and MAIR-II TX-13, which recognizes only Tx, is described in Shibuya, A .; , Et al. , Natl. Immunol. , 1, 441-6, 2000. Specifically, as shown in the Examples below, immunization was performed by injecting a fusion protein of Ba / F3 transformant expressing MAIR-I or MAIR-II and the Fc portion of human IgG into the footpad. It is prepared by fusing popliteal lymph node cells from isolated rats with the Sp2 / 0 myeloma cell line.
[0049]
(1) Preparation of antigen
In the present invention, the immunoreceptor protein of the present invention or a partial fragment thereof isolated and purified as described above is used as an antigen.
(2) Preparation of polyclonal antibody
Animals are immunized with the antigen prepared as described above. The dose of the antigen per animal in the case of a rabbit is, for example, 100 to 500 μg using an adjuvant. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), aluminum hydroxide adjuvant, and the like.
[0050]
Immunization is performed by administering to mammals (for example, rats, mice, rabbits, etc.). The site of administration is intravenous, subcutaneous or intraperitoneal. The interval of immunization is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 3 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 2 to 3 weeks. Then, the antibody titer is measured 6 to 60 days after the last immunization day, and blood is collected on the day showing the maximum antibody titer to obtain an antiserum. The antibody titer can be measured by an enzyme immunoassay (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay), a radioimmunoassay (RIA; radioimmunoassay), or the like.
[0051]
If purification of the antibody from the antiserum is required, a known method such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc. may be appropriately selected, or a combination thereof may be used for purification. Can be.
[0052]
(3) Preparation of monoclonal antibody
(3-1) Collection of immune and antibody producing cells
An animal is immunized with the antigen protein prepared as described above. If necessary, an adjuvant (commercially available complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, etc.) may be mixed as described above for effective immunization.
[0053]
Immunization is performed by administering to mammals (for example, rats, mice, rabbits, etc.). The single dose of antigen is 50 μg per mouse in mice. The administration site is mainly intravenous, subcutaneous, or intraperitoneal. The interval of immunization is not particularly limited, and the immunization is performed at least two or three times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of two to three weeks. After the final immunization, antibody-producing cells are collected. Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, and the like, with spleen cells being preferred.
[0054]
(3-2) Cell fusion
To obtain hybridomas, cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed. As the myeloma cell to be fused with the antibody producing cell, a cell line derived from an animal such as a mouse and generally available can be used. As a cell line to be used, it has drug selectivity, cannot survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin and thymidine) in an unfused state, and can survive only in a state fused with antibody-producing cells. Are preferred. For example, specific examples of myeloma cells include P3X63-Ag. 8. Mouse myeloma cell lines such as U1 (P3U1), P3 / NSI / 1-Ag4-1, and Sp2 / 0-Ag14.
[0055]
Next, the myeloma cells are fused with the antibody-producing cells. In the cell fusion, antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at a ratio of 15: 1 to 25: 1 in an animal cell culture medium such as DMEM or RPMI-1640 medium containing no serum, and cells such as polyethylene glycol are mixed. The fusion reaction is performed in the presence of a fusion promoter or by electric pulse treatment (eg, electroporation).
[0056]
(3-3) Selection and cloning of hybridoma
The target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. For example, cells that are cultured in a medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine and grow can be obtained as hybridomas.
[0057]
Next, it is screened whether or not the target antibody is present in the culture supernatant of the grown hybridoma. Hybridoma screening may be performed according to a conventional method, and is not particularly limited. For example, a part of the culture supernatant contained in a well that has grown as a hybridoma can be collected and screened by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or the like. Cloning of the fused cells is performed by a limiting dilution method or the like, and finally a hybridoma, which is a monoclonal antibody-producing cell, is established.
[0058]
(3-4) Collection of monoclonal antibody
As a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma, an ordinary cell culture method or the like can be adopted. In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as an RPMI-1640 medium or a MEM medium containing 10% fetal bovine serum under ordinary culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2). ₂ ) For 3 to 10 days, and an antibody is obtained from the culture supernatant.
[0059]
In the above antibody collection method, when antibody purification is required, a known method such as ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel chromatography, or the like is appropriately selected, or Purification can be performed by combining the methods.
[0060]
5. Method for quantifying immunoreceptor protein using antibody of the present invention, kit for quantification
The quantification of the immunoreceptor protein using the antibody of the present invention can be performed by, for example, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent antibody method, immune cell staining, and the like. However, it is not limited to them.
The antibody may be a fragment thereof, specifically, a single-chain antibody fragment (scFv) of the antibody.
[0061]
Specifically, when the ELISA method is used, the procedure is as follows. First, after a sample such as diluted blood is adsorbed on a 96-well microplate, the antibody of the present invention is reacted as a primary antibody. Subsequently, an anti-globulin antibody labeled with a specific enzyme such as POD (peroxidase) necessary for the color reaction is reacted, washed, and then washed with ABTS2,2'-azino-di- (3-ethyl-benzothiazoline-6) as a color-developing substrate. -Sulfonic acid) and the like, and the color is developed. The immunoreceptor protein of the present invention in the sample is detected by measurement by a colorimetric method. Alternatively, when the sandwich ELISA method is used, the procedure is as follows. First, a diluted sample such as blood is added to a 96-well microplate on which the antibody of the present invention has been adsorbed in advance, and incubated for a certain period of time. Thereafter, the plate is washed, and a purified antibody labeled with biotin is added to each well and incubated for a certain period of time. Then, the plate is washed, and enzyme-labeled avidin is added and further incubated. After the incubation, the plate is washed, and color is developed by adding orthophenylenediamine or the like as a color-developing substrate, and the color is measured by a colorimetric method.
[0062]
Further, the antibody of the present invention can be used in a kit for quantitative determination of an immunoreceptor protein. The kit only needs to contain at least the antibody of the present invention.When the antibody is immobilized on a solid phase, the antibody has an antigen recognition site different from that of the antibody and contains an antibody used as a secondary antibody. You may go out. The antibody used as the secondary antibody may be labeled with, for example, an enzyme or the like, and may contain various reagents (eg, an enzyme substrate, a buffer, a diluent, etc.) in addition to the two antibodies.
[0063]
6. Method for isolating a pair immune receptor gene
The inhibitory immune receptor having the ITIM motif and the activating immune receptor having the ITAM motif have their extracellular regions highly conserved from each other. Therefore, in the present invention, if any of the immunoreceptor genes having the above motif can be obtained, a pair of immunoreceptor genes can be obtained by using the gene encoding the extracellular conserved region as a probe. And the like. For example, in the case of MAIR-I, as the extracellular region that can serve as a probe, the 63rd to 596th base sequences, preferably the 135th to 488th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 A DNA containing the sequence is exemplified.
[0064]
7. Method for screening ligand for receptor protein of the present invention
The method for screening a ligand for a receptor protein of the present invention comprises the steps of: causing an immunoreceptor protein of the present invention or a cell or cell membrane expressing the protein to act on a test substance expected to contain a ligand; And a substance having high affinity. As a specific method for selecting a substance having affinity, the immunoreceptor protein of the present invention, or a test substance is allowed to act on cells or cell membranes expressing the receptor protein, and the amount of the test substance bound to the receptor protein Or by measuring the immune response signal of cells. Here, as the immune response signal, for example, degranulation (release of chemical substances such as histamine and serotonin), synthesis of leukotriene and platelet activating factor, cytokine release, activation of complement, antibody production, production of intracellular protein It refers to phosphorylation, eating, cell damage and the like. A test substance having a large amount of binding in the measurement or a test substance having a strong immune response signal can be selected as a candidate substance for a ligand to the receptor protein of the present invention.
[0065]
Any substance can be used as the test substance, and its type is not particularly limited. Specific examples of the test substance include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, natural product extracts (plant extracts, animal tissues / animal cell extracts), compound libraries, phage display libraries or combinatorials It may be a library. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
[0066]
8. Screening system for agonist or antagonist for receptor protein of the present invention
The receptor protein of the present invention is a means for screening for a substance (antagonist) that inhibits the binding between the receptor protein and a ligand, and a substance (agonist) that binds to the receptor and causes an immune response similar to that of the ligand. (Screening method, screening kit).
[0067]
The method for screening for an agonist or antagonist for a receptor protein of the present invention includes (a) a method in which an immunoreceptor protein is caused to act on a ligand for the immunoreceptor protein in the absence of a test substance; Comparing a case where a protein is allowed to act on a ligand for the immunoreceptor protein in the presence of a test substance, and selecting a substance which affects the binding between the immunoreceptor protein and the ligand. . If a test substance is found in which the amount of binding between the immunoreceptor protein and the ligand decreases or increases when the test substance is added, the test substance inhibits or antagonizes the binding between the protein of the present invention and the ligand, and causes an immune response. Is a candidate for an antagonist or an agonist that helps to control E. coli.
[0068]
The receptor protein of the present invention can also be used in a kit for screening for an agonist or antagonist for the protein. The kit only needs to include at least the receptor protein of the present invention, and may include a labeled ligand, a ligand standard solution, and various reagents (for example, a buffer solution, a washing solution, a diluting solution, and the like).
[0069]
Any substance can be used as the test substance, and its type is not particularly limited. Specific examples of the test substance include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, natural product extracts (plant extracts, animal tissues / animal cell extracts), compound libraries, phage display libraries or combinatorials It may be a library. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
[0070]
9. Drug for controlling immune response function of the present invention
The immunoreceptor protein of the present invention has a function of activating or suppressing an immune response. Further, the ligands, antagonists and agonists of the present invention can bind to the receptor protein and function to change an activation signal and an inhibitory signal from an immune receptor. Therefore, any of the proteins, genes, ligands, antagonists, and agonists of the present invention can be used as a drug for controlling immune response functions. For example, when the medicament of the present invention is used for a disease caused by a deficiency of an immune control mechanism, the disease can be treated by controlling the direction of immune activation and immunosuppression. Such diseases include, for example, autoimmune diseases (eg, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, scleroderma, polymyositis, dermatomyositis, Sjogren's syndrome, Behcet's disease, ankylosing spondylitis, insulin dependence Diabetes mellitus, pernicious anemia, etc.), allergic diseases (eg, hay fever, bronchial asthma, atopic dermatitis, allergic rhinitis, urticaria angioedema, serum disease, anaphylaxis, drug allergy, etc.), immunodeficiency diseases (primary immunity) Deficiency syndrome, secondary immunodeficiency syndrome, etc.), tumors (lung cancer, breast cancer, colorectal cancer, bladder cancer, myeloid leukemia, neuroblastoma, melanoma, Parkit lymphoma, etc.) Not done.
[0071]
The medicament of the present invention can be prepared in various preparation forms and administered orally or parenterally systemically or locally. When the medicament of the present invention is orally administered, it is formulated into tablets, capsules, granules, powders, pills, solutions for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc., or reconstituted when used. It may be a dry product. When the medicament of the present invention is to be administered parenterally, it is formulated into an intravenous injection (including intravenous drip), an intramuscular injection, an intraperitoneal injection, a subcutaneous injection, a suppository, and the like. Is provided in unit dosage ampules or multidose containers.
[0072]
These various formulations, excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, lubricants, surfactants, dispersants, buffers, preservatives, dissolution aids, preservatives, preservatives, A flavoring agent, a soothing agent, a stabilizing agent, a tonicity agent and the like can be appropriately selected, and can be produced by an ordinary method.
[0073]
The above-mentioned various preparations may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive together. Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymers, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, Gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose and the like can be mentioned. The additives to be used are appropriately or in combination selected from the above depending on the dosage form.
[0074]
The dose of the medicament of the present invention varies depending on the age of the subject to be administered, the route of administration, and the number of administrations, and can be varied over a wide range. For example, an effective amount administered as a combination of an effective amount of the protein of the present invention and a suitable diluent and a pharmacologically usable carrier may range from 0.01 mg to 1000 mg / kg body weight at a time. The amount can be selected and is administered once a day to several times a day or more.
[0075]
When the gene of the present invention is used as a gene therapy agent for an immune system disease, a method of directly administering the gene of the present invention by injection and a method of administering a vector into which the gene has been incorporated can be mentioned. Examples of the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes virus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector, and the like. Efficient administration can be achieved by using these virus vectors. Alternatively, a method of introducing the gene of the present invention into a phospholipid vesicle such as a liposome and administering the liposome may be employed.
[0076]
As the administration form of the gene therapy agent, in addition to the usual systemic administration such as intravenous or intraarterial administration, local administration to an immune system tissue (bone marrow, lymph node, etc.) can be performed. In addition, dosage forms that are combined with catheter techniques, surgery, and the like, can also be employed.
[0077]
The dose of the gene therapy agent of the present invention varies depending on the age, sex, symptom, administration route, number of administrations, and dosage form. Usually, the weight of the gene of the present invention is 0.1 to 100 mg / day for an adult. A range of weight is appropriate.
[0078]
10. Immunoreceptor protein detection reagent
Since the antibody of the present invention reacts with the immunoreceptor protein of the present invention or a partial fragment thereof, it can be used as a reagent for detecting the receptor protein. The method for detecting the immune receptor protein is not particularly limited, and for example, a Western blotting method or the like can be employed. For example, a test subject (cell component or each fraction thereof) is fractionated by electrophoresis or the like, and then reacted with a pre-labeled (radiolabel, fluorescent staining, etc.) antibody of the present invention to detect a signal. I do. The antibody used for detecting the immunoreceptor protein of the present invention may be an antibody against a protein having the full-length amino acid sequence of the receptor protein or an antibody against a peptide having a partial amino acid sequence of the receptor protein.
[0079]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
[0080]
Among the antibodies used in the examples, control rat and mouse IgG, anti-mouse CD4, CD8, CD45R / B220, CD11b (Mac1), CD11c, Ly6G (Gr-1) and CD32 / 16 mAbs, and DX-5 mAb Was obtained from PharMingen (San Diego, CA). Anti-phosphotyrosine mAb (4G10) and anti-FcεRIγ mAb were obtained from Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY) and anti-Flag mAbs were obtained from Sigma (St. Louis, Missouri). Anti-SHP-1, anti-SHP-2, and anti-SHIP antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Rat IgE anti-DNP mAb was purchased from Zymed Laboratories, Inc. (South San Francisco, CA). Anti-DAP12 polyclonal antibody was obtained from Ehime University School of Medicine.
[0081]
[Example 1] (Cloning and molecular characteristics of MAIR-I and MAIR-II)
(1) Cloning of MAIR-I and MAIR-II
To identify new genes involved in the immune response by myeloid cells, PU. 14-day-old fetal livers from 1-/-mice and wild-type strains were subjected to PCR-based subtractive hybridization, represetation difference analysis (RDA).
[0082]
First, total RNA was isolated using an Isogen LS solution (Nippon Gene), and oligo (dT) -primed double-stranded cDNA was synthesized using a cDNA synthesis system (GIBCO BRL) according to the manufacturer's instructions. RDA is available from Iwama, A. et al. , Et al. , Nucleic Acids Res, 26, 3034-43, 1998. From the DNA fragment obtained by the subtraction, cDNA (MAIR-Ia) specific to myeloid cells was identified. The full-length MAIR-Ia cDNA was cloned by screening a macrophage cDNA library using a cDNA fragment prepared by RDA as a probe.
[0083]
The amino acid sequence of MAIR-Ia is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. MAIR-Ia is a type I transmembrane glycoprotein consisting of 314 amino acids, a leader sequence of 27 amino acids, an extracellular region of 152 amino acids, a transmembrane region of 23 amino acids, and 112 It has an intracellular region of amino acids (FIG. 1A). The intracellular region contained the amino acid sequences VEYSTL and LHYSSSV (FIG. 1A), which were consistent with the consensus sequence of ITIMs (I / V / L / SxYxxL / V). The ITIM-like sequences YVNL and YSEI also showed that MAIR-Ia recruits protein tyrosine phosphatases and mediates inhibitory signals. The ITIM-like motif YVNL is also a consensus sequence involved in receptor internalization (Marks, SM, et al., Trends in Cell Biology, 7, 124-128, 1997; Boll, W., et al., Embo J, 15, 5789-95, 1996).
[0084]
Next, in order to determine whether MAIR-Ia is a member of the paired receptor, a cDNA encoding the extracellular region of MAIR-Ia (the 63rd to 596th base sequence of SEQ ID NO: 1) was probed. Was used to screen a macrophage cDNA library. As a result, the extracellular region in which one Ig-like domain having 92% homology to the amino acid sequence of MAIR-Ia, the transmembrane region having a charged amino acid (Lys), and the short (20 amino acid) intracellular tail were obtained. A clone encoding the containing protein was identified and named MAIR-IIa. Furthermore, they found isoforms containing four additional amino acids in MAIR-Ia and two additional amino acids in MAIR-IIa, and MAIR-Ib (amino acid sequence: SEQ ID NO: 6) and MAIR-IIb (amino acid sequence: SEQ ID NO: 8), respectively. Named.
[0085]
FIG. 1A shows a comparison of the amino acid sequences of MAIR-Ia, MAIR-Ib, MAIR-IIa, and MAIR-IIb. In FIG. 1A, underlines indicate putative leader sequences and transmembrane regions, circles indicate N-linked glycosyl sites in extracellular regions and charged amino acid residues in transmembrane regions, and bold letters (amino acids shown in FIG. 1A). (The 55th and 113th amino acids of the sequence) represent the cysteine residues involved in disulfide bonds of the Ig-like domain. The boxed area represents the ITIM, ITIM-like or local motif of the intracellular region. MAIR-I, MAIR-Ib, MAIR-IIa, and MAIR-IIb cDNA sequence data are available from EMBL / GenBank / DDBJ under accession numbers ABO091765, ABO091766, ABO091767, and ABO091768, respectively.
[0086]
FIG. 1B shows a schematic diagram of the MAIR-I and MAIR-II proteins. A pair of cysteine residues in the extracellular region are thought to be involved in internal chain disulfide bonds for the formation of an Ig-like domain, indicating that MAIR-I and MAIR-II are members of the Ig superfamily.
[0087]
(2) Southern blot analysis of MAIR-I and MAIR-II
FIG. 1C shows Southern blot analysis of genomic MAIR-I and MAIR-II. Mouse genomic DNA is digested with restriction enzymes (E; Eco-RI, B; Bam-HI, H; Hind-III, X; Xba-I, P; Pst-I) to encode the extracellular region of MAIR-I. Probed with cDNA. MAIR-Ib and MAIR-IIb are alternative splicing variants of MAIR-Ia and MAIR-IIa, as indicated by the genomic DNA sequences of MAIR-I and MAIR-II. The Southern blot analysis described above revealed a single hybridization pattern, indicating that MAIR-I and MAIR-II were encoded by a single gene (FIG. 1C).
[0088]
(3) Chromosome FISH analysis
The direct R-band FISH method was used for chromosome assignment of the MAIR-I gene in mice and rats. The preparation of R-band chromosomes and FISH is described in Matsuda, Y .; , Et al. , Cytogenet Cell Genet, 61, 282-5, 1992 and Matsuda, Y .; & Chapman, V.A. M. , Electrophoresis, 16, 261-72, 1995. The MAIR-I and MAIR-II genes are located in the proximal region of the E2 band on mouse chromosome 11, with six and four, respectively, as determined by fluorescence in situ hybridization (FISH) and genomic DNA sequence databases. Consists of exons. According to database research, MAIR-I and MAIR-II were identified at the amino acid level as human CMRF-35-H9 (Green, BJ, et al., Int Immunol, 10, 891-9, 1998) and 44, respectively. % Of human CMRF-35 (Green, BJ, et al., Int Immunol, 10, 891-9, 1998). CMRF-35-H9 and CMRF-35 are located on human chromosome 17 corresponding to mouse chromosome 11 (Clark, GJ, et al., Tissue Antigens, 55, 101-9, 2000). Are considered to be human homologs of mouse MAIR-I and MAIR-II.
[0089]
(4) Immunoblotting
Mouse T-cell leukocyte BW5147 cells were transformed with MAIR-Ia and MAIR-IIa cDNAs whose N-terminus was tagged with Flag peptide. BW5147 cells expressing Flag-tagged MAIR-Ia or MAIR-IIa or parental BW5147 cells were treated with 1% NP-40, a protease inhibitor (1 mM PMSF and 20 Kalllikrein inhibitor U / ml aprotinin), and a phosphatase inhibitor (1 mM EGTA, 10 mM). It was dissolved in Tris-buffered saline (50 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8.0) containing NaF, 1 mM Na4P2O7, 0.1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3V04. Proteins were analyzed by immunoblotting with anti-Flag mAb under reducing or non-reducing conditions. The results are shown in FIG. 2A. Immunoprecipitates of Flag-tagged MAIR-Ia and MAIR-IIa with anti-Flag-mAb on BW5147 transformants had molecular weights of ５０50 kDa and ３５35 kDa, respectively (FIG. 2A).
[0090]
(5) N-glucosidase treatment of MAIR-Ia
To examine N-glycosylation of MAIR-Ia, BW5147 transformants expressing Flag-tagged MAIR-Ia were immunoprecipitated with anti-Flag mAb or control IgG and using conditions recommended by the manufacturer. Treated with N-glycosidase F (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN).
[0091]
The mobility of MAIR-Ia decreased from ５０50 kDa to ４５45 kDa after N-glucosidase F treatment (FIG. 2B). This was consistent with the predicted size of the polypeptide from the MAIR-I cDNA and the presence of an N-linked glucosyl site in the extracellular region.
[0092]
[Example 2] (Expression of MAIR-I and MAIR-II)
(1) Northern blot analysis
The MAIR-I cDNA was labeled with [32P] -dCTP using Ready to Go DNA Labeling Beads (Amersham Bioscience Corp., Piscataway, NJ). A membrane containing about 10 μg of total RNA in each lane from various mouse tissues was applied to a [32P] -dCTP-labeled cDNA probe using an improved Church's hybridization buffer (0.5 M Church's phosphate). Hybridization in buffer, 7% SDS, 1% BSA) at 68 ° C. The membrane was washed in Church's wash buffer (40 mM Church's phosphate buffer, 1% SDS) at 68 ° C. for 1 hour and subjected to autoradiography. FIGS. 3A and 3B show the results of analyzing the expression of MAIR-I and / or MAIR-II transcripts by Northern blotting using a cDNA encoding the extracellular portion of MAIR-I as a probe. Predominant expression of the MAIR transcript was detected in hematopoietic tissues such as spleen, bone marrow, peritoneal macrophages, myeloid cell lines (416B, WEHI3, RAW, and M1 cells), but not in non-hematopoietic organs ( (FIG. 3A).
[0093]
(2) Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
Furthermore, in order to analyze the expression of MAIR-I and MAIR-II in blood cell lineages in detail, each blood cell lineage was separated from bone marrow, spleen, and thymus by flow cytometry, and MAIR-I-specific primers and MAIR-II- RT-PCR was performed using specific primers as follows. First, RNA was obtained from lineage-committed cells purified from bone marrow, spleen, and thymus by flow cytometry. This RNA was reverse transcribed, and cDNA adjusted to a relative amount using an HPRT control was prepared from the purified cells using a cell sorter. Using these cDNAs as templates, MAIR-I-specific primers (5′-AAGCTGATAGGCCATCCAGAGC-3 ′: SEQ ID NO: 9 and 5′-AAGGAGTCACAGGGTAAAGGTC-3 ′: SEQ ID NO: 10), MAIR-II-specific primers (5 ′ -TCGAGCCTTGAGAGGTGGTAGAC-3 ': SEQ ID NO: 11 and 5'-AGGAGCTGTGTTTAGGGACAG-3': SEQ ID NO: 12, or HPRT-specific primer (5'-GCTGGTGAAAAGGACCCTCT-3 ': SEQ ID NO: 13 and 5'-CACACGGACTAGACACTGC-3GA) (SEQ ID NO: 14). The amount of cDNA was standardized by quantitative PCR using TaqManRodent GAPDH control reagent (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster, City, Calif.) (Sakamoto, N., et al., Eur. J., 31, Jur. 2001). The PCR was performed under the following conditions: denaturation (94 ° C.) for 20 seconds, annealing (55 ° C.) for 20 seconds, and extension (72 ° C.) for 30 seconds. FIG. 3B shows the results of the RT-PCR analysis. Both MAIR-I and MAIR-II transcripts are multilineage progenitors including lymphocytic hematopoietic progenitor cells, granulocytes, macrophages, erythroid cells, and B cells in bone marrow and T, B, and NK cells in spleen. It was expressed in cells but not detected in T cells in the thymus (FIG. 3B).
[0094]
(3) Analysis of cell surface expression of MAIR-I and MAIR-II proteins
In order to analyze expression at the protein level, monoclonal antibodies TX-8 and TX-13 that specifically react with the MAIR-I and MAIR-II proteins, respectively, were prepared, and the expression of the molecules on the cell surface was determined by flow cytometry. investigated.
[0095]
(3-1) Preparation of antibody
TX-8 (anti-MAIR-I), TX-10 (anti-MAIR-I and anti-MAIR-II) and TX-13 (anti-MAIR-II) mAbs are described in Shibuya, A .; , Et al. , Natl. Immunol. , 1, 441-6, 2000, by immunizing the footpad with a fusion protein of a Ba / F3 transformant expressing MAIR-I or MAIR-II and the Fc portion of human IgG. Prepared by fusing popliteal lymph node cells from rats with Sp2 / 0 myeloma cell line.
[0096]
(3-2) Flow cytometry
MAIR-I or MAIR-II in which the N-terminus was tagged with Flag cDNA was subcloned into a pMX retrovirus vector (Kitamura, T., et al., Proc Natl Acad Sci, USA, 92, 9146-50, 1995). . BW5147, Ba / F3 and RAW cells stably expressing Flag-tagged MAIR-1 and MAIR-II were obtained from Shibuya, K .; , Et al. , Immunity, 11, 615-23, 1999.
[0097]
FIG. 4A shows BW5147 transformants expressing MAIR-I or MAIR-II were isolated from control IgG or anti-MAIR-I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX-13 mAb) followed by allo-AIR. The result of staining with phycocyanin (APC) -bound streptavidin is shown.
[0098]
4B, 4C, and 4D show that spleen, bone marrow, or peritoneal macrophages derived from C57 / BL6 mice were transformed with biotin-conjugated anti-MAIR-I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX-13 mAb) and The results of staining with PE-bound mAb followed by allophycocyanin (APC) -bound streptavidin are shown. Analysis of spleen and bone marrow cells by flow cytometry shows that MAIR-I is expressed on most myeloid cells, including macrophages, dendritic cells, granulocytes, bone marrow-derived mast cells, and some subsets of B cells. But not expressed in T cells or NK cells (FIGS. 4B, C, D). On the other hand, the MAIR-II protein was detected only on the cell surface of a subset of B cells, CebSat and peritoneal macrophages, and unlike RT-PCR analysis, no expression was observed in dendritic cells, mast cells, etc. (FIGS. 4B, C, D). This suggested that the expression of the MAIR-II molecule on the cell membrane might be controlled by some mechanism, and it was found that even if transcript expression was observed, protein cell surface expression did not necessarily occur.
[0099]
(4) Control mechanism of MAIR-I and MAIR-II protein expression on cell surface
To examine the control mechanism of protein expression on the cell surface, B cells purified from spleen were cultured in the presence or absence of LPS (10 μg / ml) for 48 hours, and before or after culture, the anti-MAIR described above. Stained with -I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX-13 mAb). After 48 hours of culture, the MAIR-II molecule was significantly detected on the cell membrane, which was further enhanced by LPS stimulation (FIG. 4E).
[0100]
[Example 3] Functional analysis of MAIR-I and MAIR-II
(1) Internalization assay
The intracellular region of MAIR-I contains a tyrosine-based localization motif (YVNL) (FIG. 1A), which is involved in endosome and lysosomal targeting of proteins and is involved in agonist-induced internalization. (Marks, SM, et al., Trends in Cell Biology, 7, 124-128, 1997; Boll, W., et al., Embo J, 15, 5789-95, 1996). Therefore, to examine whether MAIR-I induces internalization after cross-linking, MAIR-I expressed on peritoneal macrophages was biotin-labeled anti-MAIR-I mAb (TX-8), APC -Cross-linked with labeled streptavidin and incubated for 1 hour at 4 ° C or 37 ° C. Cells were treated (+) or untreated (-) with 2.5% trypsin to remove uninternalized cell surface MAIR-I and analyzed by flow cytometry. The fluorescence intensity of cells incubated at 4 ° C. after cross-linking was significantly reduced by trypsin treatment, whereas the fluorescence of cells incubated at 37 ° C. after cross-linking was constant regardless of trypsin treatment (FIG. 5A). This indicates that cross-linking of MAIR-I induced receptor internalization during culture at 37 ° C.
[0101]
Ba / F3 transformants expressing NIR Flag-tagged MAIR-I were incubated with anti-Flag mAb and subsequently cross-linked with FITC-labeled anti-mouse IgG secondary antibody. Cells were resuspended in RPMI 1640 containing 10% FBS, mounted on chamber slides (Lab-TekII, Nalge Nrc, Naperville, Ill.) Pre-coated with polylysine and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The cells were centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes at 4 ° C., washed twice with PBS, and fixed with 3% paraformaldehyde. Cells were mounted with VECTASHIELD containing DAPI (Vector, CA) and analyzed under a confocal scanning laser microscope. While green fluorescence was detected only on the cell surface before incubation, it was abundantly observed in the cells after incubation at 37 ° C. for 30 minutes (FIG. 5B), and MAIR-I was internalized after crosslinking. It shows that. In contrast, the internalization of MAIR-I in which the tyrosine residue (Y-F233) in the localization motif was mutated was not detected, and the tyrosine at position 233 was responsible for the internalization of MAIR-I. To indicate that
[0102]
(2) Tyrosine phosphorylation of MAIR-I, association with phosphatase
The presence of a consensus sequence for ITIM in the intracellular region of MAIR-I suggested that MAIR-I may undergo tyrosine phosphorylation and recruit SH-2-containing tyrosine phosphatases. Therefore, it was examined whether MAIR-I expressed on cultured mast cells derived from bone marrow was phosphorylated on tyrosine by stimulation with pervanadate.
[0103]
Bone marrow cells from the thigh and tibia of adult Balb / c mice were cultured at a concentration of 2 × 105 / ml in RPMI1640 medium containing 10% FBS, mouse rIL-3 (4 ng / ml; PharMingen) and mouse rSCF (10 ng / ml). And cultured. Cultured marrow-derived mast cells were stimulated with pervanadate for 10 minutes at 37 ° C. with or without stimulation with 1% NP-40 (FIG. 6A) or 1% digitonin (Sigma) buffer (0.12 % Triton-100 (manufactured by Katayama Chemical), 150 mM NaCl, 20 mM triethylamine (manufactured by Katayama Chemical), or the above-mentioned 1% NP-40 buffer containing a protease and a phosphatase inhibitor) (FIG. 6B). Immunoprecipitated with -MAIR-I, anti-SHP-I, anti-SHP-II, or anti-SHIP. Immunoprecipitates were immunoblotted with anti-phosphotyrosine mAb (anti-pY) (FIG. 6A) or anti-MAIR-I (FIG. 6B). As shown in FIG. 6A, stimulation with pervanadate significantly induced tyrosine phosphorylation of MAIR-I (FIG. 6A). Upon immunoprecipitation with protein-tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2, and polyphosphate inositol 5-phosphatase SHIP, after pervanadate stimulation of mast cells, MAIR-I bound SHIP but not SHP-1 and SHP-1. It did not bind to SHP-2 (FIG. 6B). These results indicate that MAIR-I may mediate inhibitory signals after tyrosine in the cytoplasmic region is phosphorylated.
[0104]
(3) Serotonin release assay
Although MAIR-I has an ITIM in the cytoplasmic region, in order to confirm whether or not it is actually responsible for suppressive signaling, MAIR-I was used in mast cells induced by culturing bone marrow cells with IL-3 and SCF. Whether or not inhibits degranulation via the IgE receptor (FcεRI). Ig-E-mediated serotonin release assays were performed as described in Uehara, T. et al. , Et al. , J Clin Invest, 108, 1041-50, 2001. First, mast cells derived from bone marrow cells were treated with 3H-serotonin (5- [1,2-3H (N)]-hydroxytryptamine creatinine sulfate) (5 μCi / ml; NEN Life Science Products Inc., Boston, Mass.) For 5 hours. Incubated at 37 ° C. and re-incubated for another hour to reduce background radioactivity. 3H-serotonin-loaded mast cells contain 10 μl of rat IgE anti-DNP mAb (25 μg / ml) and various concentrations of rat anti-MAIR-I or control IgG (IgE mAb + anti-MAIR-I or IgE mAb + control IgG). Placed in a 96-well plate, incubated for 30 minutes at 4 ° C., washed and resuspended in 25 μL of medium. Antibody-primed mast cells were challenged with 25 μl of the F (ab ′) 2 fragment of a rabbit anti-rat Ig antibody (40 μg / ml) at 37 ° C. for 30-60 minutes. The reaction was stopped by adding 50 μl of cold PBS. 3H-serotonin in the supernatant was measured with a liquid scintillation counter. The total uptake of 3H-serotonin was measured by lysing mast cells in PBS containing 1% SDS / 1% NP40, and the rate of serotonin release was determined by 100 × (cpm of supernatant / cpm of total uptake). Defined. As shown in FIG. 6C, cross-linking of MAIR-I and anti-MAIR-I mAb inhibited IgE-mediated serotonin release from bone marrow-derived mast cells in a concentration-dependent manner.
[0105]
(4) Association of MAIR-II adapter molecules
Unlike MAIR-I, MAIR-II has a short intracellular region, has no sequence involved in signal transduction, and has the presence of a positively charged lysic acid residue in the transmembrane region. It was expected that adapter molecules such as FcεRIγ and DAP12 having negatively charged amino acid residues would associate. Thus, to examine non-covalent binding of MAIR-II to adapter transmembrane proteins such as FcεRIγ or DAP12, 293T cells that did not express FcεRIγ or DAP12 were transformed with MAIR-II cDNA and either FcεRIγ or DAP12. . Transformants were lysed in 1% digitonin buffer, cell lysates were immunoprecipitated with control IgG, anti-DAP12 or anti-FcεRIγ, and the isolated proteins were immunoblotted with anti-MAIR-II. As shown in FIG. 7A, co-immunoprecipitation of MAIR-II and DAP12 was confirmed, and it was revealed that MAIR-II was associated with DAP12, but co-immunoprecipitation with FcεRIγ was not confirmed. . Similarly, when immunoprecipitation was performed using mouse macrophage RAW cells transfected with the MAIR-II gene, co-immunoprecipitation of MAIR-II and DAP12 was confirmed, but co-immunoprecipitation of FcεRIγ was not confirmed. (FIG. 7B).
[0106]
To confirm the physiological binding of MAIR-II to DAP12 in primary cells, spleen cells were stimulated with LPS, lysed in 1% digitonin buffer, and immunoprecipitated with anti-FcεRI or anti-DAP12. When the isolated protein was again immunoblotted with anti-MAIR-II, MAIR-II co-immunoprecipitated with DAP12 but not with FcεRIγ (FIG. 7C). These results indicate that DAP12 is a physiological partner for MAIR-II.
[0107]
Alternatively, 293T cells were transformed with Flag-tagged DAP12, MAIR-II, or Flag-tagged DAP12 + MAIR-II, and biotin-conjugated anti-MAIR-II and FITC-conjugated anti-Flag mAb followed by APC-binding Stained with streptavidin. The result of analyzing the cell surface expression of MAIR-II and DAP12 by flow cytometry is shown in FIG. 7D. DAP12 expression on the cell surface of 293T cells was observed to be dependent on MAIR-II expression (FIG. 7D).
[0108]
(5) TNF-α secretion
DAP12 has an ITAM and has been shown to transmit an activation signal (Lanier, LL, et al., Immunol. Today. 21, 611-614, 2000; Tomasello, E.,). et al., J. Biol. Chem., 273, 34115-34119, 1998; Lanier, LL, et al., Nature, 391, 703-707, 1998). Actually, it was analyzed whether the activation signal was transmitted from MAIR-II. RAW cells expressing Flag-tagged MAIR-II or peritoneal macrophages from C57BL / 6 mice were pretreated with anti-CD32 / 16 (FcγR) and plastic coated control IgG, anti-Flag or anti-MAIR-II mAb. And cultured for 48 hours. The TNF-α concentration in the cell supernatant was measured using ELISA kit (e-Bioscience, San Diego, CA) according to the manufacturer's instructions. As shown in FIG. 8, in the transformant into which the MAIR-II gene having a Flag added to the N-terminus was introduced, the production of the inflammatory cytokine TNF-α was significantly enhanced when cross-linked with an anti-Flag antibody. In addition, even when MAIR-II molecules were directly cross-linked with anti-MAIR-II antibody in peritoneal macrophages, secretion of TNF-α was significantly increased. However, after crosslinking of the anti-MAIR-II antibody, no significant increase in IL-6 and IL-12 secretion from peritoneal macrophages was observed. These results indicate that MAIR-II mediates a distant signaling pathway and leads to TN-α secretion in macrophages.
[0109]
【The invention's effect】
According to the present invention, there is provided a novel immunoreceptor protein that positively or negatively regulates an immune response. Since the immunoreceptor protein of the present invention has a function of activating and suppressing an immune response, it is useful for elucidation of a control mechanism of an innate immune response, search for an immunomodulator, and development of a drug such as an anti-allergic drug or an anti-inflammatory drug. Useful.
[0110]
[Sequence list]

[0111]
[Sequence List Free Text]
SEQ ID NO: 9: synthetic DNA
SEQ ID NO: 10: synthetic DNA
SEQ ID NO: 11: synthetic DNA
SEQ ID NO: 12: synthetic DNA
SEQ ID NO: 13: synthetic DNA
SEQ ID NO: 14: synthetic DNA
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A shows a comparison of the amino acid sequences of the immunoreceptor proteins MAIR-Ia, MAIR-Ib, MAIR-IIa, and MAIR-IIb of the present invention.
FIG. 1B shows a schematic diagram of the MAIR-I and MAIR-II proteins.
FIG. 1C shows Southern blot analysis of genomic MAIR-I and MAIR-II.
FIG. 2A shows the results of lysing BW5147 cells expressing Flag-tagged MAIR-I or MAIR-II and immunoblotting the protein with anti-Flag mAb under reducing or non-reducing conditions.
FIG. 2B shows lysing BW5147 cells expressing Flag-tagged MAIR-I or parental BW5147 cells, immunoprecipitating the protein with anti-Flag mAb, and treating the precipitate with or without N-glycosidase F, FIG. 9 shows the results of immunoblotting with an anti-Flag mAb under reduction.
FIG. 3A and FIG. 3B show the results of analyzing the expression of MAIR-I and MAIR-II transcripts by Northern blotting.
FIG. 4A shows cell membrane surface expression of MAIR-I or MAIR-II in transformed cells (BW5147 cells) using anti-MAIR-I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX-13 mAb). 2 shows the results of the analysis using. FIGS. 4B, 4C, and 4D show the expression of MAIR-I or MAIR-II on the cell membrane surface in spleen, bone marrow, or peritoneal macrophages derived from mice by anti-MAIR-I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX-13) 5 shows the results of analysis using mAb). FIG. 4E shows that B-cells were cultured in the presence or absence of LPS, and then cell surface expression of MAIR-I or MAIR-II was measured using anti-MAIR-I (TX-8 mAb) or anti-MAIR-II (TX -13 mAb).
FIG. 5A shows the results of MAIR-I on peritoneal macrophages cross-linked with anti-MAIR-I mAb (TX-8), incubated at 4 ° C. or 37 ° C., and analyzed by flow cytometry. . FIG. 5B shows the results of MAIR-I expressing cells cross-linked with anti-MAIR-I mAb (TX-8) and analyzed under a confocal laser microscope before and after incubation at 37 ° C.
FIG. 6A shows that bone marrow-derived mast cells are stimulated with pervanadate, then immunoprecipitated with control IgG or anti-MAIR-I, and immunoprecipitates are immunoblotted with anti-phosphotyrosine mAb (anti-pY). The results obtained are shown. FIG. 6B shows that bone marrow-derived mast cells were stimulated with pervanadate, and then immunoprecipitated with control IgG, anti-MAIR-I, anti-SHP-I, anti-SHP-II, or anti-SHIP. Shows the results of immunoblotting with the anti-MAIR-I. FIG. 6C shows the results of an IgE-mediated serotonin release assay from bone marrow-derived mast cells after cross-linking of MAIR-I and anti-MAIR-I mAb.
FIG. 7A shows that cells (293T) transformed with MAIR-II + DAP12 or MAIR-II + FcεRI were immunoprecipitated with control IgG, anti-DAP12, anti-FcεRI, and the immunoprecipitate was purified with anti-MAIR-II (FIG. 7A). TX-10) shows the result of immunoblotting. FIG. 7B: MAIR-II transformed cells (RAW) were immunoprecipitated with control IgG, anti-DAP12, or anti-FcεRI, and immunoprecipitates were immunoblotted with anti-MAIR-II (TX-10). The results are shown. FIG. 7C shows the results of immunoprecipitation of spleen cells with control IgG, anti-DAP12, or anti-FcεRI, and immunoblot of the immunoprecipitates with anti-MAIR-II (TX-10). FIG. 7D shows that 293T cells were transformed with Flag-tagged DAP12, MAIR-II, or Flag-tagged DAP12 + MAIR-I and biotin-conjugated anti-MAIR-II and FITC-conjugated anti-Flag mAb followed by APC -Shows the results of analyzing the cell surface expression of MAIR-II and DAP12 by flow cytometry after staining with bound streptavidin.
FIG. 8 (left figure) shows TNF-α production after cross-linking a transformant into which a Flag-tagged MAIR-II gene has been introduced with an anti-Flag antibody. FIG. 8 (right panel) shows the production of TNF-α after cross-linking the MAIR-II molecule on peritoneal macrophages with an anti-MAIR-II antibody.

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ａ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質An immunoreceptor protein shown in the following (a) or (b):
(A) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing; and (b) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids are deleted, substituted or added. Having a function of suppressing the immune response of cells

以下の（ｃ）又は（ｄ）に示す免疫受容体タンパク質。
（ｃ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｄ）配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質An immunoreceptor protein represented by the following (c) or (d):
(C) a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing; Having a function of activating cell immune response

請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質をコードする遺伝子。A gene encoding the immune receptor protein according to claim 1 or 2.

以下の（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を抑制させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡA gene comprising the DNA shown in the following (a) or (b):
(A) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions to a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and encodes a protein having a function of suppressing the immune response of cells. DNA

以下の（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡからなる遺伝子。
（ｃ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列表の配列番号３に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞の免疫応答を活性化させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡA gene comprising the DNA shown in the following (c) or (d):
(C) DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing
(D) a protein having a function of hybridizing with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 of the sequence listing under stringent conditions and activating a cell immune response; DNA to encode

請求項４又は５に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。A recombinant vector containing the gene according to claim 4.

請求項４又は５に記載の遺伝子により形質転換された形質転換体。A transformant transformed by the gene according to claim 4 or 5.

請求項７に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から免疫受容体タンパク質を採取することを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質の製造方法。The method for producing an immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, wherein the transformant according to claim 7 is cultured in a medium, and the immunoreceptor protein is collected from the obtained culture.

請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質のいずれか一方、又はその両方を認識する抗体。An antibody that recognizes one or both of the immunoreceptor proteins according to claim 1.

ＩＴＩＭモチーフを有する抑制性免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる活性化免疫受容体遺伝子を単離する方法。A method for isolating a pair of activated immunoreceptor genes using a gene encoding an extracellular conserved region of an inhibitory immune receptor having an ITIM motif as a probe.

ＩＴＡＭモチーフを有する活性化免疫受容体の細胞外保存領域をコードする遺伝子をプローブとして用いて対となる抑制性免疫受容体遺伝子を単離する方法。A method for isolating a pair of inhibitory immune receptor genes using a gene encoding an extracellular conserved region of an activated immune receptor having an ITAM motif as a probe.

請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質を発現する細胞若しくは細胞膜をリガンドが含まれることが予想される被験物質に作用させ、該免疫受容体タンパク質に対して親和性のある物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法。The immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, or a cell or cell membrane that expresses the protein is caused to act on a test substance expected to contain a ligand, and has an affinity for the immunoreceptor protein. A method for screening a ligand for the immunoreceptor protein, which comprises selecting a substance.

請求項１２に記載の方法により得られる請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質に対するリガンド。A ligand for the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, which is obtained by the method according to claim 12.

（ａ）請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の非存在下において作用させた場合と、（ｂ）請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を該免疫受容体タンパク質に対するリガンドに被験物質の存在下において作用させた場合とを比較し、該免疫受容体タンパク質と該リガンドの結合に対して影響を与える物質を選択することを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング方法。(A) a case where the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2 is caused to act on a ligand for the immunoreceptor protein in the absence of a test substance; and (b) an immunoreceptor according to claim 1 or 2. Comparing a body protein with a ligand to the immunoreceptor protein in the presence of a test substance, and selecting a substance that affects the binding between the immunoreceptor protein and the ligand. A method of screening for an antagonist or agonist for the immune receptor protein.

請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質を含むことを特徴とする、該免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニストのスクリーニング用キット。A kit for screening an antagonist or agonist for the immunoreceptor protein, comprising the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2.

請求項１４に記載の方法、又は請求項１５に記載のキットを用いて得られる、請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト又はアゴニスト。An antagonist or agonist for the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, which is obtained using the method according to claim 14 or the kit according to claim 15.

請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝子を有効成分として含む免疫機能制御用医薬。A medicament for controlling an immune function, comprising the immunoreceptor protein according to claim 1 or a gene encoding the protein as an active ingredient.

請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質に対するリガンド、又は請求項１若しくは２に記載の免疫受容体タンパク質に対するアンタゴニスト若しくはアゴニストを有効成分として含む免疫機能制御用医薬。A drug for controlling an immune function, comprising a ligand for the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, or an antagonist or agonist for the immunoreceptor protein according to claim 1 or 2, as an active ingredient.

請求項９に記載の抗体を含む請求項１又は２に記載の免疫受容体タンパク質の検出用試薬。A reagent for detecting the immunoreceptor protein according to claim 1, comprising the antibody according to claim 9.