JP2004166564A - Monoclonal antibody and method for diagnosing tuberculosis - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の属する技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なモノクローナル抗体、その用途および製造に関し、さらに詳細には、各種ヒト型結核菌およびウシ型結核菌が分泌する多型な蛋白質ＭＰＴ６４および蛋白質ＭＰＢ６４の間で保存された領域を特異的に認識するモノクローナル抗体、その結核症診断用途および製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核菌群は分類学的には抗酸菌に属する菌群である。抗酸菌には、ヒト型結核菌（マイコバクテリウム ツベルクローシス Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（マイコバクテリウム ボビス Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ネズミ型結核菌（マイコバクテリウム ミクロチ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏｔｉ）、トリ型結核菌（マイコバクテリウム アビウム Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）および冷血動物結核菌などが知られている。しかして、これらの中でヒトの結核症に関与するのは、ほとんど全てヒト型結核菌であるが、稀には、ウシ型結核菌による感染がある。また、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、マイコバクテリウム アフリカナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ）およびネズミ型結核菌以外のマイコバクテリウム属に属する微生物は、非定型抗酸菌と呼ばれている。
【０００３】
ヒト型結核菌（マイコバクテリム ツベルクローシス Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｌｏｓｉｓ）は、蛋白質ＭＰＴ６４（本明細書においては ＭＰＴ６４蛋白 とも記す）を特異的に産生し、菌体外へ分泌する。一方、ＢＣＧ菌株のウシ型結核菌（マイコバクテリウム ボビス ＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ）、以下、 ＢＣＧ菌 と記す）は、蛋白質ＭＰＢ６４（本明細書においては ＭＰＢ６４蛋白 とも記す）を特異的に産生し、菌体外へ分泌する。そして、ＭＰＴ６４蛋白はＭＰＢ６４蛋白と同一の物質であることが知られている。
【０００４】
Ｍ． Ｈａｒｂｏｅらは、このＭＰＢ６４蛋白をＢＣＧ菌から分離、精製して、その性質などについて研究して報告している（Ｍｏｒｔｅｎ Ｈａｒｂｏｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＰＢ６４， ＭＰＢ７０， ａｎｄ ＭＰＢ８０ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ．， ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ， Ｖｏｌ．５２， ２９３−３０２， １９８６）。また、特開平１−２４７０９４号公報も、ＭＰＢ６４蛋白は、ヒトに感染して結核症と酷似した症状を呈する非定型抗酸菌によっては産生されないが、ウシ型結核菌のＢＣＧ菌によって産生され、かつＭＰＴ６４蛋白と同一物質であり、ＢＣＧ菌およびヒト型結核菌に特異な蛋白質であるとしている。
【０００５】
従って、このことは抗ＭＰＢ６４蛋白抗体は抗原をＭＰＢ６４蛋白とする抗体であるが、同時にＭＰＴ６４蛋白の抗体でもあることを意味する。従って、病原性的には無害なＢＣＧ菌を培養し、その培養液からＢＣＧ菌によって産生されたＭＰＢ６４蛋白を抽出、精製し、該ＭＰＢ６４蛋白を抗原として抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を作成し、その抗体を用いた抗原抗体反応（免疫反応）によって被検体中の結核菌を検出することにより、ヒトの結核症を明確、かつ迅速に判別することができる結核症の簡便な診断法を確立することが可能となる。なお、ＭＰＢ６４蛋白をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列はＲ． Ｙａｍａｇｕｃｈｉらによって既に報告されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＰＢ６４ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｖｏｌ． ５７， ２８３−２８８， １９８９）。
【０００６】
抗ＭＰＢ６４蛋白抗体を使用した結核菌の検査薬および検出方法として、たとえば、特開平７−１１０３３２号公報記載の方法が知られている。この方法における免疫学的方法として、逆受身血球凝集反応（ＲＰＨＡ）、逆受身ラテックス凝集反応（ＲＰＬＡ）および固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などが記載されている。前二者においては凝集時間が、たとえば、３時間程度と長く、感度が低く、かつ定量性は全くないなどの不都合な問題がある。後者においては、前二者に比較して試験操作が煩雑で、かつ通常は特殊な機械を使用する関係上、安全キャビネット中での実施が容易ではないなどの欠点がある。
【０００７】
そこで、本発明者らは、特開平１１−１０８９３１号公報において、ＭＰＴ６４蛋白が混在する被検体を呈色標識抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体と免疫反応により結合せしめ、これによって生じた抗原抗体複合体を第二抗ＭＰＢ６４蛋白抗体により捕捉することを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法などによる結核菌検出法を提案した。しかしながら、最近、前記の免疫反応において、ヒト型結核菌のうちで陰性を示す或る種の結核菌が見受けられることが明らかとなった。
【０００８】
【特許文献１】特開平１−２４７０９４号公報
【特許文献２】特開平７−１１０３３２号公報
【特許文献３】特開平１１−１０８９３１号公報
【非特許文献１】Ｍｏｒｔｅｎ Ｈａｒｂｏｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＰＢ６４， ＭＰＢ７０， ａｎｄ ＭＰＢ８０ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ．， ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ， Ｖｏｌ．５２， ２９３−３０２， １９８６
【非特許文献２】Ｙａｍａｇｕｃｈｉ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＰＢ６４ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， Ｖｏｌ． ５７， ２８３−２８８， １９８９
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、従来の抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体が認識しないヒト型結核菌が存在することに鑑み、各種ヒト型結核菌およびウシ型結核菌が分泌する各種のＭＰＴ６４蛋白およびＭＰＢ６４蛋白に対して幅広く免疫反応するモノクローナル抗体を提供することにより、より精度の高い結核診断法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述の目的の下に鋭意研究した結果、結核菌の中にはＭＰＴ６４蛋白をコードする遺伝子のレベルでミューテーションが起きているものがあり、遺伝子に多型が存在することを見出した一方で、そのＮ末端付近の配列は多型の中でも保存されていることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、従来の抗ＭＰＢ６４蛋白モノクローナル抗体が認識しないヒト型結核菌のうち、１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、６６番目のアミノ酸のロイシン（Ｌｅｕ）から８６番目のアミノ酸のプロリン（Ｐｒｏ）までの２１個のアミノ酸をコードする遺伝子が欠損していることがわかった。また、他の１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、第２６６番目のシトシン（Ｃ）が欠損し、それ以降のコドンがフレームシフトを起こしていることがわかった。また、別の１つは、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、５１２番目から６８７番目までの１７６ｂｐの塩基が欠損していることがわかった。
【００１２】
その一方で、上記何れのヒト型結核菌においても、配列表の配列番号１で示される塩基配列において、２４番目のアミノ酸のアラニン（Ａｌａ）から６５番目のアミノ酸のセリン（Ｓｅｒ）までの４２個のアミノ酸配列からなるペプチド（以下ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチド と記す）をコードする遺伝子（以下 ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子 と記す）が保存されていることがわかった。
【００１３】
かくして、本発明者は、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドに対するモノクローナル抗体を取得することに鋭意研究した結果、配列表の配列番号１の２４番目のアミノ酸であるアラニン（Ａｌａ）から４１番目のアミノ酸であるシステイン（Ｃｙｓ）までの１８個のアミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸配列）からなるペプチド（以下 ＭＰＢ６４ΔＡペプチド と記すこともある）および４２番目のアミノ酸であるグルタミン（Ｇｌｎ）から６５番目のアミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）までの２４個のアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸配列）からなるペプチド（以下 ＭＰＢ６４ΔＢペプチド と記すこともある）のいずれも抗原性が強く、抗原決定基あるいはエピトープを含む領域であるとの知見が得られた。
【００１４】
したがって、本発明の第１の局面によれば、配列番号３または４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体が提供される。かくして、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドとＭＰＢ６４ΔＢペプチドの２種類の抗原のそれぞれに対する抗体が得られたので、変異の有無に拘わらず、これを使用して結核菌を検出することが可能となる。また、これら２種のモノクローナル抗体は、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドのそれぞれ異なる領域に位置するＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識するので、これら２種のモノクローナル抗体を併用することで、精度の高いサンドイッチ式免疫測定法が実施できる。
【００１５】
したがって、本発明の第２の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体とを併用するサンドイッチ式免疫測定法からなる結核症診断方法が提供される。ここにおいて、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を担体に固定しておくこともでき、例えば、ＥＬＩＳＡ測定系やイムノクロマトグラフィー測定法に応用できる。
【００１６】
かくして、本発明の第３の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体及び配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体の何れか一方を予め所定位置に固定せしめて形成された捕捉部位を備える膜担体を用意し、他方のモノクローナル抗体と所定量の被験試料との混合液を、前記捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記被験試料中に含まれる結核菌由来の蛋白と前記他方のモノクローナル抗体との複合体を前記捕捉部位に捕捉させることを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。ここにおいて、上記他方のモノクローナル抗体は適当な標識物質で標識しておくと好都合である。
【００１７】
また、本発明の第４の局面によれば、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記モノクローナル抗体の何れか一方は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記モノクローナル抗体の他方は適当な標識物質で標識され、かつ、前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されてなる結核症診断用イムノクロマト法テストストリップが提供される。
また、配列番号３および４のアミノ酸配列からなるペプチドがＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すことは従来知られていなかった。したがって、本発明の第５の局面によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチドが提供される：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
さらに、本発明の第６の局面によれば、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れか１つのペプチドをコードする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。
配列番号３および４には特定の遺伝子配列が記載されているが、上記アミノ酸配列をコードする限り、コドンの縮重に基づく変更が許容され、また、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す限り、１または数個のアミノ酸の欠失、置換または付加による変更が許容されることは言うまでもない。
また、この遺伝子は、常法により、各種の発現ベクターに組み込むことが可能であり、さらに、当該組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換して上記遺伝子を発現させることにより、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す組換えタンパク質を製造することができる。宿主は、遺伝子工学で通常使用されている大腸菌などの細菌や酵母などが好適であるが、これらに限定されるものではない。
したがって、本発明のさらに他の局面によれば、上記遺伝子を含有する組換えベクター、当該組換えベクターを含む形質転換体、および、当該形質転換体によって発現された前記組換えベクター由来の、ＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示す組換えタンパク質が提供される。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体の製造および本発明のモノクローナル抗体を使用するヒト結核症の診断法における各ステップは、それぞれ、それ自体、公知の免疫学的手法に準拠して行なわれる。
【００１９】
すなわち、ＭＰＢ６４蛋白に対する２種の特異的モノクローナル抗体は、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ 東京株のようなウシ型結核菌の培養上清から抽出精製したＭＰＢ６４蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめる。
【００２０】
増殖せしめた株を前記のようにして得られたＭＰＢ６４蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株を選別する。さらに、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドをコードする遺伝子（以下、 ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子 と記す）またはＭＰＢ６４ΔＢペプチドをコードする遺伝子（以下、 ＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子 と記す）を組み込んだ発現プラスミドを構築し、その発現蛋白を使用して、酵素標識免疫法などにより本発明のモノクローナル抗体産生株を選別する。
【００２１】
別法として、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を組み込んだ発現プラスミド構築し、その発現蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、免疫されたマウスのような動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞使用して、上記と同様の選別を行ってもよい。
【００２２】
ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子は、化学合成によって得ることができ、また、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を鋳型として適当なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させることによって得ることもできる。これらの遺伝子は、両末端に適当な制限酵素部位を付加するなど、常法により適当な発現プラスミドに組み込むことができる。
【００２３】
本発明の２種のモノクローナル抗体はそれぞれＭＰＢ６４蛋白の２種の異なる抗原決定基あるいはエピトープを認識するので、両者を従来のサンドイッチ式免疫測定法に使用することで、従来よりも精度の高い結核症診断を実施できる。上記２種のモノクローナル抗体の何れか一方を固定しておくことも可能であり、これにより、例えば、イムノクロマトグラフィー測定法を容易に実施できる。
【００２４】
イムノクロマトグラフィー測定法は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。一般に、イムノクロマト法テストストリップは、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応可能な第一の抗体と、前記抗原の第二の抗原決定基にて抗体抗原反応可能で且つ標識された第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は前記膜担体の所定位置に予め固定されて捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置で前記膜担体にてクロマト展開可能なように配置されて構成される。具体的には、例えば、図３に示されるイムノクロマト法テストストリップが挙げられる。本発明においては、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体と、配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドに対するモノクローナル抗体との何れか一方を第一の抗体として使用し、他方を第二の抗体として使用できる。
【００２５】
図３において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、３１は捕捉部位、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示している。図示の例では、膜担体３は、幅５ｍｍ、長さ３６ｍｍの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターで作成されている。該膜担体３には、そのクロマト展開始点側の末端から７．５ｍｍの位置に、抗原の第一の抗原決定基にて抗体抗原反応する第一の抗体が固定され、検体の捕捉部位３１が形成される。図示の例では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる検体をクロマト展開可能で、かつ、上記捕捉部位３１を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
【００２６】
含浸部材２は、前記第一の抗原決定基と異なる部位に位置する第二の抗原決定基にて前記抗原と抗体抗原反応する第二の抗体を含浸せしめた部材からなる。当該第二の抗体は、適当な標識物質で予め標識される。図示の例では、含浸部材２として、５ｍｍ×１５ｍｍの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
【００２７】
第二の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。このうち、捕捉部位３１での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便にに判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。当該含浸部材２は、標識された第二の抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
【００２８】
図３に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３のクロマト展開の開始点側（すなわち図３の左側、以下「上流側」と記す、また、その逆の側、すなわち図３の右側を、以下「下流側」と記す）の末端の上に、含浸部材２の下流側末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して本発明のイムノクロマト法テストストリップを作成できる。さらに、必要に応じて、含浸部材２の上面に試料添加用部材５の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材５の上流側部分を粘着シート１に貼着してもよく、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材４の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材４の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめることもできる。
【００２９】
試料添加用部材５としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。吸収用部材４は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
【００３０】
さらに、市販品の場合、図３のイムノクロマト法テストストリップは、試料添加用部材５と捕捉部位３１の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容されて提供される。
【００３１】
かくして、適当な展開溶媒中に所定量の生体試料を混合してクロマト展開可能な混合液を被験試料として得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップの試料添加用部材５上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材５を通過して含浸部材２において、標識された第二の抗体と混合する。その際、該混合液中に検体が存在すれば、抗原抗体反応により検体と第二の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位３１に到達し、そこに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉される。このとき、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により発色するので、直ちに、検体の有無を判定することができる。
【００３２】
【実施例】
次の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００３３】
参考例１（ＭＰＢ６４蛋白の精製）
ＭＰＢ６４蛋白は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＴＯＫＹＯ １７２（ＡＴＣＣ ３５７３７）の培養上清からＭｏｒｔｅｎ Ｈａｒｂｏｅらの方法（Ｍｏｒｔｅｎ Ｈａｒｂｏｅ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＰＢ６４， ＭＰＢ７０， ａｎｄ ＭＰＢ８０ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ．， ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＩＴＹ， Ｖｏｌ．５２， ２９３−３０２， １９８６）に準拠して抽出精製した。すなわち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ ＴＯＫＹＯ １７２を培養後、その培養上清を７５％飽和硫安分画し、生じた沈殿物を、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０カラムクロマト、次にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムクロマト操作により分画した。ゲル電気泳動法により確認したＭＰＢ６４蛋白相当画分を、限外ろ過濃縮後、さらに、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラムクロマト、限外ろ過濃縮、さらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００カラムクロマトを行い、精製した。
【００３４】
参考例２（ＭＰＢ６４蛋白によるマウス免疫とハイブリドーマの作製）
参考例１で得られたＭＰＢ６４蛋白２００μｇ（５０μｌ）をフロインドの完全アジュバンド５０μｌと混合してエマルジョンを作製し、これをＢａｌｂ／ｃメスマウス皮下に注射した。この免疫操作を３週間後に再度行い、さらに３週間後にタイター価の上昇を確認した後、５０μｇ（５０μｌ）の上記ＭＰＢ６４蛋白そのものを腹腔に注射し、３日後に脾臓を摘出し、その脾臓細胞とマウス・ミエローマ細胞（ＳＰＩＩ細胞）とを５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液を用いて細胞融合した。融合細胞は、一般的方法のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）含有培養液で選別後、ＰＲＭＩ１６４０培地（日水製薬（株）製、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ））含有ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地）で培養増殖させた。
【００３５】
参考例３（ＭＰＢ６４蛋白特異的抗体産生ハイブリドーマの選別）
参考例１で得られたＭＰＢ６４蛋白をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２μｇ／ｍｌに希釈し、その１００μｌを９６穴プレートの各ウェルに添加し、室温で約１６時間放置して固相化した。このＭＰＢ６４蛋白固相化プレートを０．２％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳ溶液でブロッキング処理した後、抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株の選別に使用した。
【００３６】
すなわち、参考例２で得られた種々のハイブリドーマの培養上清をそれぞれ採取し、その１００μｌを上記プレートの各ウェルに添加した。約１時間室温でインキュベーション後、培養上清を廃棄し、プレートを洗浄した。それに、ビオチン標識抗マウス・ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μｌ添加し、約３０分間室温でインキュベーション後に反応液を廃棄し、その後、プレートを洗浄した。
【００３７】
そのプレートに、アビジンとビオチン標識ホースラディッシュ・ぺルオキシダーゼ（以下 ＨＲＰ−ビオチン と記す）との複合体溶液を１００μｌ添加し、約３０分間室温でインキュベーション後、反応液を廃棄し、プレートを洗浄した。洗浄プレートにＨＲＰ基質、ＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と過酸化水素との混合溶液を１００μｌ添加し、室温で１０分間反応後、０．２Ｎリン酸溶液５０μｌを添加し反応を停止した。各ウェルの色度をマイクロプレートリーダーで測定し、その強度を指標に抗ＭＰＢ６４蛋白抗体産生株を選別した。
【００３８】
実施例１（ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドの大腸菌における発現）
ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体を取得することを目的に、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を備えた発現プラスミドを作成し，大腸菌で発現させた。
【００３９】
まず、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子を含む配列表の配列番号２に示されるＤＮＡの両ストランドを化学合成した。なお、この合成遺伝子では、ベクター挿入後に正常に融合タンパクが発現されるように、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子のＮ末端側及びＣ末端側にそれぞれ７塩基及び６塩基のＤＮＡ配列が付加されている。
【００４０】
化学合成した互いに相補的な２本のＤＮＡオリゴマー各３８ｐｍｏｌを総量３４μｌ水溶液にし、１００℃で１分間加熱した後、室温まで自然に冷やし、アニールした。このＤＮＡ溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ ＤＴＴ，Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼ ５４単位の総量５０μｌの溶液にして３７℃、１時間反応させた。反応後、フェノール抽出し、エーテルで洗浄後、２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈澱を行った。この沈澱を減圧乾燥後、１７μｌの滅菌水を加え大腸菌発現ベクター導入用ＤＮＡ断片とした。
【００４１】
このようにして得られたＤＮＡ断片を下記に示す方法で大腸菌発現用ベクターに導入した。
大腸菌発現用ベクターｐＲＳＥＴ Ａ １０μｇを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ＰｖｕＩＩ １００単位の総計５０μｌ反応溶液中で３７℃、１時間反応させた。反応後、１００℃、５分、熱処理をし、２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈殿を行った。沈殿を減圧乾燥後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０単位 子牛胸腺アルカリフォスファターゼの総量５０μｌ反応溶液を加え５０℃で３０分間反応させた。反応後、マイクロピュア−ＥＺ遠心式酵素リムーバー（ミリポア）でろ過し、子牛胸腺アルカリフォスファターゼを除去した。ろ過液に２．５倍量のエタノールと１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えＤＮＡのエタノール沈殿を行った。この沈殿を減圧乾燥後、１０μｌの滅菌水を加えＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子ＤＮＡ断片挿入用大腸菌発現ベクター断片とした。
【００４２】
この大腸菌発現ベクター断片０．１μｇと上記で調製した発現ベクター導入用ＤＮＡ断片０．５μｇを混合し、滅菌水を加えて２μｌにした後、２μｌのライゲーションキット（Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ， ＴＯＹＯＢＯ）溶液を加え、１６℃で３０分間反応させた。反応後、反応混合液４μｌをＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’株コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）５０μｌに加え、０℃で３０分間静置し、４２℃で３０秒間、次いで０℃で５分間静置した。この混合液に、トリプトン２％、イーストエクストラクト０．５％、ＮａＣｌ ０．０５％、ＫＣｌ ０．０１８６％、ＭｇＣｌ２ １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４ １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭを含有するＳＯＣ培地５００μｌを加え３７℃で３０分間震盪した。
【００４３】
次に６０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を半量捨て、再懸濁し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−Ｄ−ガラクトシド 以下同様）、０．００４％Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（トリプトン１％、イーストエクストラクト０．５％、ＮａＣｌ １％、アガー １．５％）に塗布し、３７℃にて一晩培養してβ−ガラクトシターゼ活性非保有株の白色クローンを得た。これらのクローン約５０個のコロニーをＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）にて一晩培養し、常法にてプラスミドＤＮＡを抽出精製した後、ＰｖｕＩＩ サイトの外側にある制限酵素サイトＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化した。この消化溶液をアガロース電気泳動に供し、９クローンに関して目的のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断断片フラグメントに相当する大きさの断片を確認した。
【００４４】
次に、これらクローンのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断断片フラグメントをダイデオキシ法による塩基配列決定法（Ｐｒｏ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７４，５４６３ （１９７７））により配列を決定した。その結果、目的の方向に挿入されており、かつ、正しいアミノ酸配列を有するＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミド１クローンを得た。
【００４５】
上記で調製したＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを常法に従ってＥ．Ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。形質転換した菌株をＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）中３７℃で一晩震盪培養した。この培養液２ｍｌを新たにＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン含有）に加え、３７℃で約４時間震盪培養し６００ｎｍの吸光度が０．５になった時点で、０．５Ｍ ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭになるように加え、さらに３７℃で３時間震盪培養を行った。
【００４６】
培養後、菌体を遠心分離にて集め−８０℃にて保存した。集めた菌体の少量をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム 以下同様）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（６０ｍＭトリス、２％ＳＤＳ、５％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．１％ブロモフェノールブルー）２０μｌに懸濁、１００℃で２分間処理し溶解した後、ラエンムリの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２７７， ６８０ （１９７０） ）に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した。その結果、４つのクローン全てにおいてＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子がコードするＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドが発現していることを確認できた。
【００４７】
実施例２（ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマの選別）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを発現する大腸菌を培養し、溶菌後、その溶解液の中から、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含有する蛋白をニッケル結合カラムを用いて分離精製した。精製した蛋白を２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解後、その１００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、固相化した。
【００４８】
その後、参考例３に記述した操作方法により、参考例３で得られたＭＰＢ６４蛋白に特異的な抗体を産生するハイブリドーマの中から、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを特異的に認識する抗体産生株の選別を行った。参考例３で約３００株のＭＰＢ６４蛋白特異的抗体産生株が得られたが、その内、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを特異的に認識する抗体産生株はわずか６株であった。
【００４９】
実施例３（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドまたはＭＰＢ６４ΔＢペプチドを持つ組み換え蛋白の作製）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを鋳型として、ＭＰＢ６４ΔＡペプチドまたはＭＰＢ６４ΔＢペプチドの発現プラスミドを構築し、大腸菌内で発現させた。
【００５０】
すなわち、実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミドを鋳型として、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子およびＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子の２つの遺伝子断片を増幅した。
【００５１】
増幅におけるポリメラーゼ連鎖反応は、１００ ｎｇの実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）遺伝子発現プラスミド、およびプライマーペア（それぞれ１００ ｐｍｏｌｅ）、１２．５ ｎｍｏｌｅのｄＡＴＰ（デオキシアデノシントリフォスフェート）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジントリフォスフェート）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジントリフォスフェート）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシントリフォスフェート）のそれぞれ、５μｍｏｌｅの塩化カリウム、５μｍｏｌｅのトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１５０ ｎｍｏｌｅの塩化マグネシウム、１０ ｍｇのゼラティンを含む、１００μｌの水溶液を調製し、これに２ユニットのＴａｑポリメラーゼ２０００（フナコシ株式会社から購入）を加え、９４℃で１分、５５℃で１分間、７２℃で３分間の反応を２０回繰り返して行った。
【００５２】
この反応後の１００μｌの水溶液を、０．７％のアガロース電気泳動に供した。電気泳動は、１００ボルト、約３０分で、緩衝液は１×ＴＥ（４０ ｍＭトリス酢酸、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ ８．０）を使用した。
【００５３】
電気泳動後、アガロースゲルを１０μｇ／ｍｌのエチジュウムブロマイド水溶液に２時間浸したのち、アガロースゲルをＤＮＡ用紫外線照射器上に置き、紫外線を照射し、オレンジ色に光るＤＮＡのバンドをカミソリで切り出し、さらに細かく切り、１．５ ｍｌ 容積のチューブに入れ、これに切り出したアガロースゲルと同量（体積）のＴＥ緩衝液（１０ ｍＭトリス塩酸、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、ｐＨ ８．０）で飽和したフェノールを加え、攪拌し、−８０℃冷凍庫で凍らせた。
【００５４】
１時間後、冷凍庫から上記チューブを出し室温に置き解かした後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この上清を１．５ ｍｌ 容積のチューブに採取した。この上清をクロロホルムで抽出を２回行ない、遠心分離した上清を取り、これに１０分の１量（体積）の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）を加えた後、最終濃度７０％になるようにエチルアルコールを加え、再び、−８０℃冷凍庫で凍らせた。１時間後、冷凍庫から上記１．５ ｍｌ 容積のチューブを出し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をロータリーエパポレターにて乾燥させた。
【００５５】
乾燥した沈殿を５μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、各２ ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを１μｌ、１００ ｍＭトリス塩酸を２μｌ、５０ ｍＭの塩化マグネシウムを２μｌ、２ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え、最終体積を純水で２０μｌとし、１０分間、室温に放置し、その後、７５℃で１０分間処理した。この２０μｌの反応液に２３０μｌのＴＥ緩衝液を加え混ぜ、ＴＥ緩衝液で飽和したフェノールを加え、攪拌し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、この上清を１．５ ｍｌ 容積のチューブに移し、クロロホルムによる抽出を２回おこない、遠心分離した上清を取り、前記と同じ工程でエチルアルコールにより沈殿させ、乾燥させた。
【００５６】
乾燥した沈殿を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、このうち５μｌに、１００ ｍＭトリス塩酸を２μｌ、５０ ｍＭの塩化マグネシウムを２μｌ、１μｌの１０ ｍＭ ＡＴＰ、２ユニットのＴ４ポリメラーゼを加え、最終体積を純水で２０μｌとし、３７℃で１時間保った。この２０μｌの反応液に２３０μｌのＴＥ緩衝液を加え混ぜ、前記と同じ工程で、フェノールとクロロホルムで処理し、エチルアルコールにより沈殿させ、乾燥させた。
【００５７】
乾燥した沈殿を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、このうち２μｌを０．５ ｍｌ 容積のチューブに移し、試薬ＬｉｇａｔｉｏｎＨｉｇｈ（東洋紡績株式会社から購入）２μｌと混ぜ、１６℃で１５時間、反応させた。凍結ＸＬ１−Ｂｌｕｅ大腸菌（フナコシ株式会社から購入）１００μｌを１．５ ｍｌ 容積のチューブに用意し、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを加え、１０分間、氷上で時々振り、前記の１６℃で反応させたＤＮＡ溶液を２μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢ培地（１ ％ ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 ０．５ ％ ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１ ％ 塩化ナトリウム）を加え、３７℃で１時間培養し、これを５０ ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。
【００５８】
ＬＢ寒天プレートに生じた大腸菌コロニー（それぞれ２５個）を５０ ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間、培養し、この培養液を、９，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。この菌体からキアゲンプラスミドミニキット（株式会社キアゲンの商品）によりプラスミドを調製した。得られたプラスミドについて ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムジャパン株式会社）によりその塩基配列を調べた。それぞれ２５個のプラスミドのうち、ＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子またはＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を含む目的の発現プラスミドが数個得られた。
【００５９】
上記操作により目的の発現プラスミドが得られたことから、これらを大腸菌に導入した。すなわち、凍結ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ大腸菌（フナコシ株式会社から購入）１００μｌを１．５ ｍｌ 容積のチューブに入れ、これに２０倍希釈した２‐メルカプトエタノールを加え、１０分間、氷上で時々振り、上記目的の発現プラスミドの１０ ｎｇ／μｌ溶液を１μｌ加え、３０分間、氷上で放置後、４２℃に保温した恒温漕に４５秒漬け、直ぐに氷上へもどし、９００μｌのＬＢ（１ ％ ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ、 ０．５ ％ ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、 １ ％ 塩化ナトリウム）を加え、３７℃で１時間培養し、これを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で１８時間、保温した。
【００６０】
生じた大腸菌コロニー（それぞれ４個）を３ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。この培養液を１００ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）に入れ、３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．６になったときに、１００ｍＭ ＩＰＴＧを１ｍｌ加え、さらに３時間培養した後、５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿させ、菌体を回収した。１．５ ｍｌ 容積のチューブにて、１ｍｌ培地あたりの菌体を２００μｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に懸濁した後、２００μｌの２×ＳＤＳＰＡＧＥ サンプリング液（５０ ｍＭ トリス、１％ラウリル硫酸ナトリウム、５％２‐メルカプトエタノール）を加え、混合し、９５℃で５分間、熱処理をし、このうち１０μｌをＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動およびウェスターン・イムノブロッティングに供与したところ、図１および図２のようにそれぞれのペプチドが発現していることが示された。なお、図１は、ゲルコードブルー（（株）フナコシから購入）により蛋白質染色した結果であり、図２は、抗ヒスチジンタグ抗体（マウスＩｇＧ）にビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体を反応させ、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｋｉｔ（（株）フナコシから購入）により呈色反応させた結果である。
【００６１】
図１および図２のそれぞれにおいて、−および＋は、それぞれ、ＩＰＴＧ誘導前およびＩＰＴＧ誘導後を示す。また、Ｌａｎｅ １はＭ （分子量マーカー）を、Ｌａｎｅ ２ および ３ はＭＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分を、Ｌａｎｅ ４ および ５ はＭＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分をそれぞれ示している。
【００６２】
実施例４（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマの選別）
実施例３で得られた形質転換大腸菌を培養し、ＩＰＴＧによる蛋白発現誘導を行った後、溶菌操作を行い可溶性蛋白質を回収した。その可溶化画分の中から、ＭＰＢ６４ΔＡペプチド含有発現蛋白質およびＭＰＢ６４ΔＢペプチド含有発現蛋白質をニッケル結合カラムを用いて分離精製した。それら精製蛋白質を２μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解後、その１００μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、固相化した。その後、参考例３に記述した操作方法により、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを認識する抗体産生ハイブリドーマ（すなわち実施例２で得られた６種）の培養上清を用いて、その特異性について検討した。
【００６３】
その結果、６種のハイブリドーマの内、４種のハイブリドーマがＭＰＢ６４ΔＡペプチドを認識する抗体を、２種のハイブリドーマがＭＰＢ６４ΔＢペプチドを認識する抗体を産生していることが判明した。
【００６４】
実施例５（選別したハイブリドーマの特性）
実施例４で最終的に得られた６種のハイブリドーマの特性を検討するため、参考例３で記述した免疫測定方法により、３種の抗原に対する反応性を検討した。用いた抗原は、以下の３種であった。
抗原６４：ＭＰＢ６４蛋白；
抗原６４ΔＡ：ＭＰＢ６４ΔＡペプチド含有発現蛋白質；
抗原６４ΔＢ：ＭＰＢ６４ΔＢペプチド含有発現蛋白質。
【００６５】
上記の３種の蛋白質をＥＬＩＳＡプレートに固相化した後、前記６種のハイブリドーマの培養上清を添加し、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体添加、アビジン−ＨＲＰ標識ビオチン複合体添加、ＨＲＰ基質添加、発色反応、比色定量の作業を順次行い、６種のハイブリドーマ産生抗体の特性を検討した。
【００６６】
【表１】
【表２】
上記表１および表２のそれぞれから、ハイブリドーマ１−２Ｇ、２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆは何れもＭＰＢ６４ΔＡペプチドに対する抗体産生細胞であり、ハイブリドーマ５−３Ｆおよび６−８Ｆは何れもＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する抗体産生細胞であることが示された。
【００６９】
実施例６（ＭＰＢ６４ΔＡペプチドおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する特異抗体を用いたＭＰＢ６４抗原のＥＬＩＳＡ測定系の作製）
実施例１で得られたＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含む発現蛋白質を抗原とし、実施例５で示したＭＰＢ６４ΔＡペプチドに対する抗体産生細胞であるハイブリドーマ１−２ＧおよびＭＰＢ６４ΔＢペプチドに対する抗体産生細胞であるハイブリドーマ５−３Ｆを用いてＥＬＩＳＡにより反応性を確認した。
【００７０】
ハイブリドーマ５−３Ｆが産生した抗体５−３Ｆを９６穴プレートのウェルに５０μｌ添加し、１晩冷所で固相化し、各ウェルをブロッキングし、続いて洗浄した後、ＭＰＢ６４Δ（２４−６５ａ．ａ．）ペプチドを含む発現蛋白質を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で２時間反応させた。各ウェルを洗浄し、ハイブリドーマ１−２Ｇが産生した抗体１−２ＧをＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）標識して各ウェルに１００μｌ添加した後、室温で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットＳＴの構成品である３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）液（株式会社タウンズの製品）を各ウェルに１００μｌ添加して発色させ、室温で１０分間反応させた後、２Ｎ硫酸１００μｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの色度を、測定波長４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにより測定した。
【００７１】
対照として、参考例３で得られたが実施例２で選別されなかった２種のハイブリドーマが産生する２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂとする）を用いたＥＬＩＳＡにより、反応性を確認した。なお、このＥＬＩＳＡ測定系は、抗体Ａを固相化し、抗体ＢをＰＯＤ標識した以外は、前記と同様であった。結果を表３に示す。なお、抗体Ａ及びＢは、免疫反応において抗原であるＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白に対する結合部位が相互に異なる従来のモノクローナル抗体である。
【００７２】
【表３】
なお、固相化抗体５−３Ｆの代わりにハイブリドーマ６−８Ｆが産生する抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。また、標識化抗体１−２Ｇの代わりにハイブリドーマ２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆが産生するいずれの抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。
【００７４】
この結果は、従来のモノクローナル抗体がＭＰＢ６４蛋白のＮ末端付近を認識しないのに対し、本発明の新規なモノクローナル抗体はＭＰＢ６４蛋白のＮ末端付近を認識することを示している。
【００７５】
実施例７（本発明によるヒト型結核菌の変異株１のＥＬＩＳＡ）
結核病患者１からの被検体由来の結核菌を小川培地で培養し、ヒト型結核菌と認められたコロニーを１白金耳掻き取り、５００ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝液 以下同様）に懸濁させた懸濁液を抗原液１とした。なお、この結核菌抗原蛋白ＭＰＢ６４遺伝子（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６２（５），２０５８−２０６４， Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＭＰＴ６４（１９９４））を調べた処、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列のうち、１９６番目から２５８番目までの６３ｂｐのＤＮＡ配列の欠落が確認された。
【００７６】
上記抗体１−２Ｇおよび５−３Ｆを用いてＥＬＩＳＡにより反応性を確認した。すなわち、抗体５−３Ｆを９６穴プレートのウェルに５０μｌ添加し、１晩冷所に放置して固相化し、各ウェルをブロッキングし、続いて洗浄した後、上記で調製した結核菌変異株の抗原液１を各ウェルに１００μｌ添加し、室温で２時間反応させた。
【００７７】
各ウェルを洗浄し、ＰＯＤ標識した抗体１−２Ｇを各ウェルに１００μｌ添加後、室温で１時間反応させ、続いて各ウェルを洗浄後、ＴＭＢＺ液を各ウェルに１００μｌ添加して発色させ、室温で１０分間反応後、２Ｎ硫酸１００μｌを添加して反応を停止させた。各ウェルの色度を、測定波長４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにより測定した。結果を表４に示す。
【００７８】
対照として、上記抗原液１を用いて、実施例６で使用した２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）を用いたＥＬＩＳＡにより、反応性を確認した。すなわち、抗体Ａを固相化し、抗体ＢをＰＯＤ標識した以外は、前記と同様な手順を行なった。結果を表４に示す。
【００７９】
【表４】
なお、固相化抗体５−３Ｆの代わりにハイブリドーマ６−８Ｆが産生する抗体を用いても測定値は殆ど変わらなかった。また、標識化抗体１−２Ｇの代わりにハイブリドーマ２−６Ｄ、３−２Ｃおよび４−７Ｆが産生する抗体のいずれを用いても測定値は殆ど変わらなかった。
【００８１】
これらの結果から、結核病患者の診断において、結核菌の分泌蛋白質であるＭＰＢ６４の遺伝子の変異株に感染した場合、従来の抗体を用いたアッセイでは偽陰性になってしまうのに対し、本発明の新規モノクローナル抗体を用いた場合では陽性となり、正しい診断を行なうことが可能となったことが判る。
【００８２】
実施例８（本発明のモノクローナル抗体を用いたイムノクロマト測定系によるヒト型結核菌の変異株の検出）
結核病患者２からの被検体由来の結核菌を小川培地で培養し、ヒト型結核菌と認められたコロニーを１白金耳掻き取り、５００ｍｌのＰＢＳに懸濁させた懸濁液を抗原液２とした。なお、この結核菌抗原蛋白ＭＰＢ６４遺伝子を調べた処、配列表の配列番号１のＤＮＡ配列の５１２番目から６８７番目に当たる１７６ｐｂの欠落が確認された。
【００８３】
上記抗体１−２Ｇおよび５−３Ｆを用いてイムノクロマトグラフィー法により反応性を確認した。
【００８４】
すなわち、図３に示される要領でイムノクロマト法テストストリップを作成した。抗体５−３Ｆを膜担体に固定して捕捉部位を形成する抗体として用い、抗体１−２Ｇを金コロイド標識抗体として用いた。このようにして作成したイムノクロマト法テストストリップの試料滴下部に、上記で得られた抗原液２を１００μｌ滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色を肉眼で判定した処、赤紫色の呈色が見られ、捕捉部位に上記抗原が捕捉されたことが示された。
【００８５】
対照として、上記抗原液２を用いて、実施例６で使用した２種のモノクローナル抗体（抗体Ａおよび抗体Ｂ）を用い、反応性を確認した。すなわち、抗体Ａを膜担体に固定して捕捉部位を形成する抗体として用い、抗体Ｂを金コロイド標識抗体として用いた以外、上記と同様のイムノクロマト法テストストリップを作成した。そして、その試料滴下部に、上記で得られた抗原液２を１００μｌ滴下し、室温で１５分放置後、捕捉部位における呈色を肉眼で判定した処、呈色は見られず、捕捉部に上記抗原が捕捉されなかったことを示した。
【００８６】
これらの結果から、イムノクロマト法テストストリップにおいても、本発明の新規モノクローナル抗体を使用することにより、結核病患者の診断において結核菌変異株による偽陰性を回避することが可能となることが判る。
【００８７】
【発明の効果】
本発明によれば、被検体中のヒト型結核菌および／またはウシ型結核菌のそれぞれを変異株または非変異株に拘わらず免疫学的手法により検知することが可能となる。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分（Ｌａｎｅ ２及び３）およびＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分（Ｌａｎｅ ４及び５）のそれぞれのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動像を示す写真である。
【図２】ＰＢ６４ΔＡ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白可溶化画分（Ｌａｎｅ ２及び３）およびＰＢ６４ΔＢ遺伝子を持つ発現ベクター導入大腸菌から得られた蛋白質可溶化画分（Ｌａｎｅ ４及び５）のそれぞれのウェスターン・イミュノブロッティング転写像を示す写真である。
【図３】ａはイムノクロマト法テストストリップの平面図、ｂはａで示されたイムノクロマト法テストストリップの縦断面図。
【符号の説明】
１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
３１ 捕捉部位
４ 吸収用部材
５ 試料添加用部材TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
[0001]
The present invention relates to a novel monoclonal antibody, its use and production, and more particularly, to a region conserved between polymorphic proteins MPT64 and MPB64 secreted by various M. tuberculosis and M. bovis. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a monoclonal antibody which is specifically recognized, its use for diagnosing tuberculosis, and its production.
[0002]
[Prior art]
The Mycobacterium tuberculosis group is a group of taxonomically belonging to acid-fast bacteria. Mycobacteria include Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis), Mycobacterium bovis (Mycobacterium bovis), Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium microti), and Mycobacterium tuberculosis. Bacteria (Mycobacterium avium) and cold-blooded tuberculosis Mycobacterium are known. Thus, among these, almost all of M. tuberculosis is involved in M. tuberculosis, but rarely there is infection with M. bovis. Microorganisms belonging to the genus Mycobacterium other than Mycobacterium tuberculosis, bovine Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum, and Mycobacterium tuberculosis are called atypical mycobacteria.
[0003]
Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis specifically produces the protein MPT64 (also referred to as MPT64 protein in the present specification) and secretes it outside the cells. On the other hand, BCG strain Mycobacterium bovis BCG (Mycobacterium bovis BCG, hereinafter referred to as BCG bacterium) specifically produces protein MPB64 (also referred to as MPB64 protein in this specification), Secreted outside the cells. It is known that MPT64 protein is the same substance as MPB64 protein.
[0004]
M. Harboe et al. Have isolated and purified the MPB64 protein from BCG bacteria and studied and reported on its properties (Morten Harboe et. Al., Properties of Protein MPB64, MPB70, and MPB80 of Mycobacterium bovis. , INFECTION AND IMMUNITY, Vol.52, 293-302, 1986). Also, Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-247094 discloses that MPB64 protein is not produced by atypical mycobacteria which infects humans and exhibits symptoms very similar to tuberculosis, but is produced by BCG bacillus of M. bovis, In addition, it is the same substance as the MPT64 protein and is a protein specific to BCG bacteria and Mycobacterium tuberculosis.
[0005]
Therefore, this means that the anti-MPB64 protein antibody is an antibody whose antigen is MPB64 protein, but is also an antibody of MPT64 protein. Therefore, a pathogenic harmless BCG bacterium is cultured, the MPB64 protein produced by the BCG bacterium is extracted and purified from the culture solution, an anti-MPB64 protein antibody is prepared using the MPB64 protein as an antigen, and the antibody is prepared. By detecting Mycobacterium tuberculosis in a subject by the antigen-antibody reaction (immune reaction) used, it is possible to establish a simple diagnostic method for tuberculosis that can clearly and quickly identify human tuberculosis. It becomes. The nucleotide sequence and amino acid sequence of the gene encoding MPB64 protein are described in (Yamaguchi, R. et al., Cloning and Characterization of the Gene for Immunogenic Protein MPB64 of Mycobacterium bovis.
[0006]
As a test drug and a detection method for Mycobacterium tuberculosis using an anti-MPB64 protein antibody, for example, a method described in JP-A-7-110332 is known. As the immunological method in this method, reverse passive hemagglutination (RPHA), reverse passive latex agglutination (RPLA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the like are described. The former two methods have the disadvantages that the aggregation time is long, for example, about 3 hours, the sensitivity is low, and there is no quantitative property. The latter has the drawback that the test operation is more complicated than the former, and it is not easy to carry out in a safety cabinet due to the use of special machines.
[0007]
Therefore, the inventors of the present invention disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-108931 an immunological reaction of a subject containing MPT64 protein with a color-labeled anti-MPB64 protein monoclonal antibody. We have proposed a method for detecting Mycobacterium tuberculosis by immunochromatographic measurement, which is characterized by capturing with two anti-MPB64 protein antibodies. However, it has recently been found that certain types of M. tuberculosis bacteria that are negative among the M. tuberculosis bacteria are found in the aforementioned immune reaction.
[0008]
[Patent Document 1] Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-247094
[Patent Document 2] JP-A-7-110332
[Patent Document 3] JP-A-11-108931
[Non-Patent Document 1] Morten Harboe et. al. , Properties of Protein MPB64, MPB70, and MPB80 of Mycobacterium bovis BCG. , INFECTION AND IMMUNITY, Vol. 52, 293-302, 1986
[Non-Patent Document 2] Yamaguchi, R .; et al. , Cloning and Characterization of the Gene for Immunogenic Protein MPB64 of Mycobacterium bovis BCG, Infection and Immunity, Vol. 57, 283-288, 1989.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
In view of the existence of M. tuberculosis that is not recognized by the conventional anti-MPB64 protein monoclonal antibody, the present inventors have studied various types of M. tuberculosis and M. bovis that secrete various MPT64 and MPB64 proteins. It is an object of the present invention to provide a more accurate method for diagnosing tuberculosis by providing a monoclonal antibody that reacts widely.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies for the above-mentioned purpose, and as a result, some tuberculosis bacteria have mutations at the level of the gene encoding the MPT64 protein, indicating that polymorphism exists in the gene. And found that the sequence near the N-terminus was conserved among polymorphisms, and completed the present invention.
[0011]
That is, one of the M. tuberculosis bacteria that is not recognized by the conventional anti-MPB64 protein monoclonal antibody is one of the 66th amino acid leucine (Leu) to the 86th amino acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The gene encoding 21 amino acids up to proline (Pro) was found to be defective. In the other, it was found that in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, the 266th cytosine (C) was deleted, and that the subsequent codons caused a frame shift. In another case, it was found that in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, 176 bp of nucleotides from the 512th to the 687th were deleted.
[0012]
On the other hand, in any of the above M. tuberculosis bacteria, 42 nucleotides from the alanine (Ala) at the 24th amino acid to the serine (Ser) at the 65th amino acid in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. (Hereinafter referred to as MPB64Δ (24-65a.a.) Gene) was found to be conserved.
[0013]
Thus, as a result of earnest studies on obtaining a monoclonal antibody against the MPB64Δ (24-65 aa) peptide, the present inventor found that the alanine (Ala), which is the 41st amino acid of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, had the 41st position. Peptide consisting of 18 amino acid sequences (amino acid sequence of SEQ ID NO: 3) up to cysteine (Cys) (hereinafter sometimes referred to as MPB64ΔA peptide) and 65th amino acid from glutamine (Gln) which is 42nd amino acid The peptide consisting of 24 amino acid sequences (the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) up to serine (Ser) (hereinafter sometimes referred to as MPB64ΔB peptide) has strong antigenicity, and has an antigenic determinant or epitope. It was found that the region was included.
[0014]
Therefore, according to the first aspect of the present invention, there is provided a monoclonal antibody against a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4. Thus, antibodies against each of the two types of antigens, MPB64ΔA peptide and MPB64ΔB peptide, were obtained, and it was possible to detect Mycobacterium tuberculosis using the same regardless of the presence or absence of the mutation. In addition, these two types of monoclonal antibodies recognize the MPB64ΔA peptide and the MPB64ΔB peptide located in different regions of the MPB64Δ (24-65 aa) peptide, respectively. , A sandwich-type immunoassay method with a high density can be performed.
[0015]
Therefore, according to the second aspect of the present invention, the method comprises a sandwich immunoassay in which a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 are used in combination. A method for diagnosing tuberculosis is provided. Here, either one of a monoclonal antibody against the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a monoclonal antibody against the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 can be immobilized on a carrier. For example, an ELISA measurement system or an immunochromatography Applicable to photographic measurement.
[0016]
Thus, according to the third aspect of the present invention, one of the monoclonal antibody against the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the monoclonal antibody against the peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is fixed at a predetermined position in advance. Prepare a membrane carrier having the formed capture site, develop a mixed solution of the other monoclonal antibody and a predetermined amount of the test sample with the membrane carrier toward the capture site, and include the mixture in the test sample. An immunochromatographic measurement method comprising capturing a complex of a M. tuberculosis-derived protein and the other monoclonal antibody at the capture site. Here, it is convenient to label the other monoclonal antibody with an appropriate labeling substance.
[0017]
According to a fourth aspect of the present invention, the monoclonal antibody comprises at least a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a membrane carrier. One of the antibodies is pre-fixed at a predetermined position on the membrane carrier to form a capture site, and the other of the monoclonal antibodies is labeled with a suitable labeling substance, and the membrane carrier is separated from the capture site by a distance. The present invention provides an immunochromatographic test strip for diagnosing tuberculosis, which is arranged so that it can be developed by chromatography.
It has not been known that a peptide comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 exhibits the immunogenicity of the MPT64 protein or the MPB64 protein. Therefore, according to a fifth aspect of the present invention, there is provided a peptide according to any one of the following (a) to (c):
(A) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(B) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(C) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and showing immunogenicity of MPT64 protein or MPB64 protein.
Further, according to a sixth aspect of the present invention, there is provided a gene encoding any one of the following peptides (a) to (c):
(A) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(B) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(C) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and showing immunogenicity of MPT64 protein or MPB64 protein.
Although specific gene sequences are described in SEQ ID NOS: 3 and 4, changes based on codon degeneracy are allowed as long as the above amino acid sequence is encoded, and the immunogenicity of MPT64 protein or MPB64 protein is shown. It goes without saying that changes by deletion, substitution or addition of one or several amino acids are allowed.
In addition, this gene can be incorporated into various expression vectors by a conventional method. Further, by introducing the recombinant vector into an appropriate host and transforming the same to express the gene, the MPT64 protein can be expressed. Alternatively, a recombinant protein exhibiting the immunogenicity of the MPB64 protein can be produced. The host is preferably a bacterium such as Escherichia coli or a yeast commonly used in genetic engineering, but is not limited thereto.
Therefore, according to still another aspect of the present invention, a recombinant vector containing the above gene, a transformant containing the recombinant vector, and MPT64 derived from the recombinant vector expressed by the transformant A recombinant protein exhibiting the immunogenicity of the protein or MPB64 protein is provided.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Each step in the production of the monoclonal antibody of the present invention and the method for diagnosing human tuberculosis using the monoclonal antibody of the present invention is performed in accordance with a per se known immunological technique.
[0019]
That is, two kinds of specific monoclonal antibodies against the MPB64 protein are obtained by immunizing an animal such as a mouse with the MPB64 protein extracted and purified from a culture supernatant of M. bovis such as Mycobacterium bovis Tokyo strain as an antigen. The fused cells obtained by cell fusion of spleen cells and myeloma cells of the immunized animal are selected and grown in a HAT-containing medium.
[0020]
Using the MPB64 protein obtained as described above for the grown strain, an anti-MPB64 protein antibody-producing strain is selected by, for example, enzyme-labeled immunoassay. Further, an expression plasmid containing the MPB64Δ (24-65 aa) gene, the gene encoding the MPB64ΔA peptide (hereinafter, referred to as MPB64ΔA gene) or the gene encoding the MPB64ΔB peptide (hereinafter, referred to as MPB64ΔB gene) was constructed. Using the expressed protein, the monoclonal antibody-producing strain of the present invention is selected by enzyme-labeled immunoassay or the like.
[0021]
Alternatively, an expression plasmid incorporating the MPB64ΔA gene or the MPB64ΔB gene is constructed, an animal such as a mouse is immunized with the expressed protein as an antigen, and then the spleen cells and myeloma cells of the immunized animal such as a mouse are used as cells. The same sorting as described above may be performed using the fused cells obtained by the fusion.
[0022]
The MPB64Δ (24-65 aa) gene, the MPB64 ΔA gene or the MPB64 ΔB gene can be obtained by chemical synthesis, and the polymerase chain reaction using the MPB64 Δ (24-65 aa) gene as a template and appropriate primers. Can also be obtained by amplification. These genes can be incorporated into an appropriate expression plasmid by a conventional method such as adding appropriate restriction enzyme sites to both ends.
[0023]
Since the two monoclonal antibodies of the present invention each recognize two different antigenic determinants or epitopes of the MPB64 protein, by using both of them in a conventional sandwich immunoassay, tuberculosis with higher accuracy than before can be obtained. Diagnosis can be performed. It is also possible to fix either one of the above-mentioned two types of monoclonal antibodies, so that, for example, an immunochromatographic measurement method can be easily performed.
[0024]
The immunochromatographic measurement method can be easily performed based on the configuration of a known immunochromatographic test strip. Generally, an immunochromatographic test strip comprises a first antibody capable of reacting with an antibody at a first antigenic determinant of an antigen, and a first antibody capable of reacting with an antibody at a second antigenic determinant of the antigen and labeled. A second antibody and at least a membrane carrier, wherein the first antibody is pre-fixed to a predetermined position of the membrane carrier to form a capture site, and the second antibody is at a position separated from the capture site. It is arranged and configured so that it can be developed by chromatography on a membrane carrier. Specifically, for example, an immunochromatographic test strip shown in FIG. 3 can be mentioned. In the present invention, one of a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a monoclonal antibody against a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is used as the first antibody, and the other is used as the second antibody. It can be used as an antibody.
[0025]
In FIG. 3,
[0026]
The impregnating
[0027]
As the labeling substance for the second antibody, any substance can be used as long as it can be used, and examples thereof include a coloring labeling substance, an enzyme labeling substance, and a radioactive labeling substance. Of these, it is preferable to use a color-marking substance, since the change in color at the
[0028]
As shown in FIG. 3, the
[0029]
As the
[0030]
Further, in the case of a commercially available product, the immunochromatographic test strip of FIG. 3 is housed in an appropriate plastic case having a test sample injection portion and a judgment portion opened above the
[0031]
Thus, after mixing a predetermined amount of a biological sample in an appropriate developing solvent to obtain a chromatographically developable mixed solution as a test sample, the mixed solution is used as a
[0032]
【Example】
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0033]
Reference Example 1 (Purification of MPB64 protein)
The MPB64 protein was obtained from the culture supernatant of Mycobacterium bovis BCG TOKYO 172 (ATCC 35737) by the method of Morten Harboe et al. (Morten Harboet et. Al., Properties of Protein MPB64, MPB64, MPB64. Vol.52, 293-302, 1986). That is, after culturing Mycobacterium bovis BCG TOKYO 172, the culture supernatant was subjected to 75% saturated ammonium sulfate fractionation, and the resulting precipitate was subjected to DEAE-Sephadex A-50 column chromatography, and then to DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography. By fractionation. The fraction corresponding to the MPB64 protein, which was confirmed by gel electrophoresis, was concentrated by ultrafiltration, and further purified by DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography, ultrafiltration concentration, and Sephacryl S-200 column chromatography.
[0034]
Reference Example 2 (mouse immunization with MPB64 protein and production of hybridoma)
200 μg (50 μl) of the MPB64 protein obtained in Reference Example 1 was mixed with 50 μl of Freund's complete adjuvant to prepare an emulsion, which was subcutaneously injected into a Balb / c female mouse. This immunization operation was performed again 3 weeks later, and after an increase in titer was confirmed 3 weeks later, 50 μg (50 μl) of the above MPB64 protein itself was injected into the abdominal cavity. Three days later, the spleen was removed, and the spleen cells were removed. Cell fusion was performed with mouse myeloma cells (SPII cells) using a 50% polyethylene glycol (molecular weight 1500) solution. The fused cells were selected with a culture solution containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) according to a general method, and then contained in PRMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., 10% fetal bovine serum (FBS (Fetal Bovine Serum)). The culture was grown in RPMI (Roswell Park Medical Institute) medium.
[0035]
Reference Example 3 (Selection of hybridoma producing antibody specific to MPB64 protein)
The MPB64 protein obtained in Reference Example 1 was diluted to 2 μg / ml with a phosphate buffer (PBS), and 100 μl of the diluted solution was added to each well of a 96-well plate, and allowed to stand at room temperature for about 16 hours to solidify. . After blocking the MPB64 protein-immobilized plate with a PBS solution containing 0.2% BSA (bovine serum albumin), the plate was used to select an anti-MPB64 protein antibody-producing strain.
[0036]
That is, the culture supernatants of the various hybridomas obtained in Reference Example 2 were respectively collected, and 100 μl of each was added to each well of the plate. After incubation at room temperature for about 1 hour, the culture supernatant was discarded and the plate was washed. Then, 100 μl of a biotin-labeled anti-mouse IgG (H + L) antibody was added, and after incubation at room temperature for about 30 minutes, the reaction solution was discarded, and then the plate was washed.
[0037]
100 μl of a complex solution of avidin and biotin-labeled horseradish peroxidase (hereinafter referred to as HRP-biotin) was added to the plate, and after incubation at room temperature for about 30 minutes, the reaction solution was discarded and the plate was washed. . 100 μl of a mixed solution of HRP substrate, TMBZ (3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine) and hydrogen peroxide was added to the washing plate, and reacted at room temperature for 10 minutes, and then 50 μl of 0.2N phosphoric acid solution was added. The reaction was stopped. The chromaticity of each well was measured with a microplate reader, and an anti-MPB64 protein antibody-producing strain was selected using the intensity as an index.
[0038]
Example 1 (Expression of MPB64Δ (24-65aa) peptide in E. coli)
For the purpose of obtaining an antibody recognizing the MPB64Δ (24-65aa) peptide, an expression plasmid having the MPB64Δ (24-65aa) gene was prepared and expressed in E. coli.
[0039]
First, both strands of the DNA shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing containing the MPB64Δ (24-65 aa) gene were chemically synthesized. In addition, in this synthetic gene, a DNA sequence of 7 bases and 6 bases were respectively present on the N-terminal side and the C-terminal side of the MPB64Δ (24-65aa) gene so that the fusion protein would be normally expressed after the vector insertion. Has been added.
[0040]
38 pmol of each of the two chemically synthesized DNA oligomers was converted into an aqueous solution having a total amount of 34 μl, heated at 100 ° C. for 1 minute, cooled naturally to room temperature, and annealed. This DNA solution was mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, T4 Polynucleotide Kinase 54 units were reacted in a total volume of 50 μl at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, the mixture was extracted with phenol, washed with ether, and 2.5 times the volume of ethanol and 1/10 volume of 3M sodium acetate were added to perform ethanol precipitation of DNA. The precipitate was dried under reduced pressure, and 17 μl of sterilized water was added to obtain a DNA fragment for introducing an Escherichia coli expression vector.
[0041]
The DNA fragment thus obtained was introduced into an E. coli expression vector by the method described below.
Escherichia coli expression
[0042]
0.1 μg of this E. coli expression vector fragment and 0.5 μg of the expression vector-introducing DNA fragment prepared above were mixed, and sterilized water was added to make 2 μl. Then, 2 μl of a ligation kit (Ligation High, TOYOBO) solution was added. The reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes. After the reaction, 4 μl of the reaction mixture was added to E. coli. Coli TOP10F 'strain Competent cells (Invitrogene) were added to 50 µl, and allowed to stand at 0 ° C for 30 minutes, at 42 ° C for 30 seconds, and then at 0 ° C for 5 minutes. To this mixture was added tryptone 2%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.05%, KCl 0.0186%,
[0043]
Next, the mixture was centrifuged at 6000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded in half, and resuspended. Containing LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar), and cultured overnight at 37 ° C. to obtain a strain having no β-galactosidase activity. A white clone was obtained. Approximately 50 colonies of these clones were cultured overnight in an LB medium (containing 50 μg / ml ampicillin), and the plasmid DNA was extracted and purified by a conventional method. Digested. This digestion solution was subjected to agarose electrophoresis, and a fragment having a size corresponding to the target EcoRI-BamHI fragment was confirmed for 9 clones.
[0044]
Next, the sequences of the EcoRI-BamHI-cleaved fragments of these clones were determined by the base sequencing method using the dideoxy method (Pro.NAS USA, 74, 5463 (1977)). As a result, one MPB64Δ (24-65 aa) gene expression plasmid clone having the correct amino acid sequence inserted in the desired direction was obtained.
[0045]
The MPB64Δ (24-65 aa) gene expression plasmid prepared as described above was transformed into E. coli according to a conventional method. Coli BL21 Gold (DE3) strain (Stratagene). The transformed strain was shake-cultured overnight at 37 ° C. in LB medium (containing 50 μg / ml ampicillin). 2 ml of this culture solution was newly added to an LB medium (containing 50 μg / ml ampicillin), and cultured with shaking at 37 ° C. for about 4 hours. When the absorbance at 600 nm reached 0.5, 0.5 M IPTG was added to a final concentration of 0. The solution was added to a concentration of 5 mM, and shaking culture was further performed at 37 ° C. for 3 hours.
[0046]
After the culture, the cells were collected by centrifugation and stored at -80 ° C. A small amount of the collected cells is subjected to SDS (sodium dodecyl sulfate), a sample buffer for polyacrylamide gel electrophoresis (60 mM Tris, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, 0.1% bromophenol blue) ) After suspending in 20 µl, treating at 100 ° C for 2 minutes and dissolving, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting using an anti-histidine tag antibody were performed according to the method of Laemmuri (Nature 277, 680 (1970)). Analyzed. As a result, it was confirmed that the MPB64Δ (24-65 aa) peptide encoded by the MPB64 Δ (24-65 aa) gene was expressed in all four clones.
[0047]
Example 2 (Selection of hybridoma producing antibody recognizing MPB64Δ (24-65a.a.) Peptide)
Escherichia coli expressing the MPB64Δ (24-65a.a.) Peptide obtained in Example 1 was cultured, and after lysis, a protein containing the MPB64Δ (24-65a.a.) Peptide was removed from the lysate. Separation and purification were performed using a nickel binding column. The purified protein was dissolved in PBS at a concentration of 2 μg / ml, and 100 μl of the protein was added to each well of a 96-well ELISA plate to be immobilized.
[0048]
Thereafter, the MPB64Δ (24-65 aa) peptide is specifically recognized from the hybridomas producing antibodies specific to the MPB64 protein obtained in Reference Example 3 by the operation method described in Reference Example 3. Antibody producing strains were selected. In Reference Example 3, about 300 MPB64 protein-specific antibody-producing strains were obtained, of which only 6 antibody-producing strains specifically recognize the MPB64Δ (24-65aa) peptide. .
[0049]
Example 3 (Preparation of Recombinant Protein Having MPB64ΔA Peptide or MPB64ΔB Peptide)
Using the MPB64Δ (24-65aa) gene expression plasmid obtained in Example 1 as a template, an MPB64ΔA peptide or MPB64ΔB peptide expression plasmid was constructed and expressed in E. coli.
[0050]
That is, two gene fragments of the MPB64ΔA gene and the MPB64ΔB gene were amplified using the MPB64Δ (24-65aa) gene expression plasmid obtained in Example 1 as a template.
[0051]
The polymerase chain reaction in the amplification was performed using 100 ng of the MPB64Δ (24-65 aa) gene expression plasmid obtained in Example 1 and primer pairs (100 pmole each) and 12.5 nmole of dATP (deoxyadenosine triphospho). FT), dTTP (deoxythymidine triphosphate), dCTP (deoxycytidine triphosphate), dGTP (deoxyguanosine triphosphate), respectively, 5 μmole of potassium chloride, 5 μmole of tris-hydrochloric acid (pH 8.3), 150 nmole of A 100 μl aqueous solution containing magnesium chloride and 10 mg of gelatin was prepared, and 2 units of Taq polymerase 2000 (purchased from Funakoshi Co., Ltd.) was added thereto. The mixture was added at 94 ° C. for 1 minute and at 55 ° C. for 1 minute. The reaction was repeated 20 times at 72 ° C. for 3 minutes.
[0052]
After the reaction, 100 μl of the aqueous solution was subjected to 0.7% agarose electrophoresis. The electrophoresis was performed at 100 volts for about 30 minutes, and the buffer used was 1 × TE (40 mM Tris acetic acid, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0).
[0053]
After the electrophoresis, the agarose gel was immersed in a 10 μg / ml ethidium bromide aqueous solution for 2 hours, and then the agarose gel was placed on a UV irradiator for DNA, irradiated with ultraviolet light, and the orange-colored DNA band was razor-shaded. Cut out, cut into smaller pieces, put in a 1.5 ml volume tube, and saturate with the same amount (volume) of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0) as the cut out agarose gel. The phenol was added, stirred, and frozen in a -80 ° C freezer.
[0054]
One hour later, the tube was taken out of the freezer, placed at room temperature, thawed, centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was collected in a 1.5-ml tube. The supernatant was extracted twice with chloroform, and the supernatant obtained by centrifugation was collected. One-tenth volume (volume) of 3 M sodium acetate (pH 7.0) was added to the supernatant. , And frozen again in a -80 ° C freezer. One hour later, the 1.5-ml tube was taken out of the freezer, centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the precipitate was dried using a rotary evaporator.
[0055]
The dried precipitate was dissolved in 5 μl of TE buffer, 1 μl of each of 2 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 2 μl of 100 mM Tris-HCl, 2 μl of 50 mM magnesium chloride, and 2 units of T4 polymerase were added. The final volume was adjusted to 20 μl with pure water, left at room temperature for 10 minutes, and then treated at 75 ° C. for 10 minutes. 230 µl of TE buffer was added to the 20 µl of the reaction mixture, mixed with phenol saturated with TE buffer, stirred, centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a 1.5 ml tube. After transfer, extraction with chloroform was performed twice, and the supernatant obtained by centrifugation was collected, precipitated in ethyl alcohol in the same steps as described above, and dried.
[0056]
The dried precipitate was dissolved in 20 μl of TE buffer, to which 5 μl was added 2 μl of 100 mM Tris-HCl, 2 μl of 50 mM magnesium chloride, 1 μl of 10 mM ATP, and 2 units of T4 polymerase. It was made up to 20 μl with pure water and kept at 37 ° C. for 1 hour. 230 μl of TE buffer was added to and mixed with the 20 μl of the reaction solution, treated with phenol and chloroform, precipitated with ethyl alcohol, and dried in the same step as described above.
[0057]
The dried precipitate was dissolved in 20 μl of TE buffer, 2 μl of which was transferred to a 0.5 ml tube, mixed with 2 μl of Reagent Ligation High (purchased from Toyobo Co., Ltd.), and reacted at 16 ° C. for 15 hours. . 100 μl of frozen XL1-Blue E. coli (purchased from Funakoshi Co., Ltd.) was prepared in a 1.5 ml tube, and 2-mercaptoethanol diluted 20-fold was added thereto. 2 μl of the DNA solution reacted in
[0058]
Escherichia coli colonies (25 each) formed on an LB agar plate were inoculated into 3 ml of LB medium containing 50 mg / ml ampicillin, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and the culture was incubated at 9,000 rpm for 5 minutes. After centrifugation and sedimentation, the cells were collected. A plasmid was prepared from the cells using a Qiagen plasmid mini kit (a product of Qiagen Co., Ltd.). The nucleotide sequence of the obtained plasmid was examined using ABI PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems Japan). Among the 25 plasmids, several target expression plasmids containing the MPB64ΔA gene or the MPB64ΔB gene were obtained.
[0059]
Since the desired expression plasmid was obtained by the above operation, these were introduced into E. coli. That is, 100 μl of frozen BL21 Gold Escherichia coli (purchased from Funakoshi Co., Ltd.) was placed in a 1.5-ml tube, and 2-mercaptoethanol diluted 20-fold was added thereto. 1 μl of a 10 ng / μl solution of the plasmid was added, left on ice for 30 minutes, immersed in a constant temperature bath kept at 42 ° C. for 45 seconds, immediately returned to ice, and 900 μl of LB (1% bacto-tryptone, 0.5% (Bacto-yeast extract, 1% sodium chloride) was added, and the mixture was cultured at 37 ° C. for 1 hour, inoculated on an LB agar plate containing 50 μg / ml ampicillin, and kept at 37 ° C. for 18 hours.
[0060]
The resulting E. coli colonies (4 each) were inoculated into 3 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. for 18 hours. This culture solution was placed in 100 ml of LB medium (containing 50 μg / ml of ampicillin) and cultured at 37 ° C. When the OD600 reached 0.6, 1 ml of 100 mM IPTG was added, and the cells were further cultured for 3 hours. The mixture was centrifuged at 5,000 rpm for 20 minutes to precipitate, and the cells were collected. After suspending the cells per 1 ml medium in 200 μl of 10 mM phosphate buffer in a 1.5 ml tube, 200 μl of 2 × SDSPAGE sampling solution (50 mM tris, 1% sodium lauryl sulfate, 5% 2-mercaptoethanol), mixed, heat-treated at 95 ° C. for 5 minutes, and 10 μl of the mixture was subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis and Western immunoblotting. As shown in FIG. 1 and FIG. Was shown to be expressed. FIG. 1 shows the results of protein staining using gel code blue (purchased from Funakoshi Co., Ltd.), and FIG. 2 shows the reaction of an anti-histidine tag antibody (mouse IgG) with a biotinylated anti-mouse IgG antibody to obtain VECTASTAIN ABC. This is the result of a color reaction performed by Standard Kit (purchased from Funakoshi Co., Ltd.).
[0061]
In each of FIG. 1 and FIG. 2, − and + indicate before and after IPTG induction, respectively.
[0062]
Example 4 (Selection of hybridoma producing antibody recognizing MPB64ΔA peptide and MPB64ΔB peptide)
The transformed Escherichia coli obtained in Example 3 was cultured, protein expression was induced by IPTG, and then lysis was performed to recover the soluble protein. From the solubilized fraction, the MPB64ΔA peptide-containing expression protein and the MPB64ΔB peptide-containing expression protein were separated and purified using a nickel-binding column. The purified protein was dissolved in PBS at a concentration of 2 μg / ml, and 100 μl of the protein was added to each well of a 96-well ELISA plate to be immobilized. Thereafter, by the operation method described in Reference Example 3, the culture supernatant of an antibody-producing hybridoma recognizing the MPB64Δ (24-65 aa) peptide (that is, the six types obtained in Example 2) was used to identify the specificity. Sex was examined.
[0063]
As a result, it was found that among the six hybridomas, four hybridomas produced antibodies recognizing the MPB64ΔA peptide, and two hybridomas produced antibodies recognizing the MPB64ΔB peptide.
[0064]
Example 5 (Characteristics of selected hybridomas)
In order to examine the characteristics of the six hybridomas finally obtained in Example 4, the reactivity to three antigens was examined by the immunoassay described in Reference Example 3. The following three antigens were used.
Antigen 64: MPB64 protein;
Antigen 64ΔA: MPB64ΔA peptide-containing expressed protein;
Antigen 64ΔB: MPB64ΔB peptide-containing expressed protein.
[0065]
After the above three proteins were immobilized on an ELISA plate, the culture supernatants of the six hybridomas were added, and a biotin-labeled anti-mouse IgG (H + L) antibody was added, an avidin-HRP-labeled biotin complex was added, and HRP was added. Substrate addition, color development, and colorimetric quantification were performed sequentially, and the characteristics of the six hybridoma-producing antibodies were examined.
[0066]
[Table 1]
[Table 2]
From each of the above Tables 1 and 2, hybridomas 1-2G, 2-6D, 3-2C and 4-7F are all antibody-producing cells against the MPB64ΔA peptide, and hybridomas 5-3F and 6-8F are all MPB64ΔB The cells were shown to be antibody-producing cells against the peptide.
[0069]
Example 6 (Preparation of MPB64 antigen ELISA measurement system using MPB64ΔA peptide and specific antibody against MPB64ΔB peptide)
Using the expressed protein containing the MPB64Δ (24-65 aa) peptide obtained in Example 1 as an antigen, hybridoma 1-2G which is an antibody-producing cell against the MPB64ΔA peptide shown in Example 5, and an antibody-producing cell against the MPB64ΔB peptide The reactivity was confirmed by ELISA using Hybridoma 5-3F.
[0070]
50 μl of the antibody 5-3F produced by the hybridoma 5-3F was added to the wells of a 96-well plate, immobilized overnight in a cool place, each well was blocked, and then washed, followed by MPB64Δ (24-65a.a). .) 100 μl of the expressed protein containing the peptide was added to each well and reacted at room temperature for 2 hours. Each well was washed, the antibody 1-2G produced by hybridoma 1-2G was labeled with POD (peroxidase), and 100 μl of the antibody was added to each well. After reacting at room temperature for 1 hour, each well was washed, and the peroxidase was washed. 100 μl of 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ) solution (a product of Towns Co., Ltd.), which is a component of the color development kit ST, is added to each well to develop color, and reacted at room temperature for 10 minutes. After the reaction, 100 μl of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction. The chromaticity of each well was measured using a microplate reader at a measurement wavelength of 450 nm.
[0071]
As a control, reactivity was confirmed by ELISA using two types of monoclonal antibodies (referred to as antibody A and antibody B) produced by two types of hybridomas obtained in Reference Example 3 but not selected in Example 2. did. The ELISA measurement system was the same as described above, except that antibody A was immobilized and antibody B was labeled with POD. Table 3 shows the results. The antibodies A and B are conventional monoclonal antibodies having different binding sites for an MPT64 protein or an MPB64 protein as an antigen in an immune reaction.
[0072]
[Table 3]
In addition, the measured value hardly changed even if the antibody produced by hybridoma 6-8F was used instead of the immobilized antibody 5-3F. In addition, the measurement value hardly changed when any of the antibodies produced by hybridomas 2-6D, 3-2C and 4-7F was used instead of the labeled antibody 1-2G.
[0074]
This result indicates that the conventional monoclonal antibody does not recognize the vicinity of the N-terminus of the MPB64 protein, whereas the novel monoclonal antibody of the present invention recognizes the vicinity of the N-terminus of the MPB64 protein.
[0075]
Example 7 (ELISA of
A tuberculosis bacterium derived from a subject from
[0076]
The reactivity was confirmed by ELISA using the above antibodies 1-2G and 5-3F. That is, 50 μl of antibody 5-3F was added to the wells of a 96-well plate, left to stand overnight in a cool place to immobilize, each well was blocked, washed, and then the M. tuberculosis mutant prepared above was washed. 100 μl of
[0077]
Each well was washed, 100 μl of POD-labeled antibody 1-2G was added to each well, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing each well, 100 μl of TMBZ solution was added to each well to develop color. After 10 minutes, the reaction was stopped by adding 100 μl of 2N sulfuric acid. The chromaticity of each well was measured using a microplate reader at a measurement wavelength of 450 nm. Table 4 shows the results.
[0078]
As a control, reactivity was confirmed by ELISA using the
[0079]
[Table 4]
In addition, the measured value hardly changed even if the antibody produced by hybridoma 6-8F was used instead of the immobilized antibody 5-3F. In addition, the measurement value hardly changed when any of the antibodies produced by hybridomas 2-6D, 3-2C and 4-7F was used instead of the labeled antibody 1-2G.
[0081]
From these results, in the diagnosis of a patient with tuberculosis disease, when infected with a mutant strain of the gene for MPB64, which is a secreted protein of Mycobacterium tuberculosis, the assay using a conventional antibody results in a false negative. When a new monoclonal antibody was used, the result was positive, indicating that a correct diagnosis could be made.
[0082]
Example 8 (Detection of Mycobacterium tuberculosis mutants by immunochromatography using the monoclonal antibody of the present invention)
A tuberculosis bacterium derived from a subject from
[0083]
Reactivity was confirmed by immunochromatography using the above antibodies 1-2G and 5-3F.
[0084]
That is, an immunochromatographic test strip was prepared as shown in FIG. Antibody 5-3F was immobilized on a membrane carrier and used as an antibody to form a capture site, and antibody 1-2G was used as a colloidal gold-labeled antibody. 100 μl of the
[0085]
As a control, reactivity was confirmed using the
[0086]
These results indicate that the use of the novel monoclonal antibody of the present invention also makes it possible to avoid false negatives caused by M. tuberculosis mutants in the diagnosis of patients with tuberculosis in immunochromatographic test strips.
[0087]
【The invention's effect】
According to the present invention, each of M. tuberculosis and / or M. bovis in a subject can be detected by an immunological technique regardless of a mutant strain or a non-mutant strain.
[0088]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows protein-solubilized fractions (
FIG. 2 shows protein-solubilized fractions (
FIG. 3A is a plan view of an immunochromatographic test strip, and FIG. 3B is a longitudinal sectional view of the immunochromatographic test strip indicated by a.
[Explanation of symbols]
1 Adhesive sheet
2 Impregnated members
3 Membrane carrier
31 Capture site
4 Absorbing members
5 Material for sample addition
Claims (14)
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。Any one of the following peptides (a) to (c):
(A) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(B) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(C) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and showing immunogenicity of MPT64 protein or MPB64 protein.
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＰＴ６４蛋白またはＭＰＢ６４蛋白の免疫原性を示すペプチド。A gene encoding any one of the following peptides (a) to (c):
(A) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3,
(B) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4,
(C) a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and showing immunogenicity of MPT64 protein or MPB64 protein.
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