JP2004161669A - 骨形成促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】茶(Camellia sinensis)を抽出して得られるカテキンの新たな用途を提供する。
【解決手段】本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤並びに骨形成促進飲食物を提供する。骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長(強化)することによって骨細胞による骨形成を促進することができる。カテキン又はカテキン混合物とは、(−)EC、(−)EGC、(−)ECg、(−)EGCg、(−)C、(−)GC、(−)Cg及び(−)GCgのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物であり、中でも(−)ECgを有効成分とするのが好ましい。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤並びに骨形成促進飲食物を提供する。骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長(強化)することによって骨細胞による骨形成を促進することができる。カテキン又はカテキン混合物とは、(−)EC、(−)EGC、(−)ECg、(−)EGCg、(−)C、(−)GC、(−)Cg及び(−)GCgのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物であり、中でも(−)ECgを有効成分とするのが好ましい。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、茶(Camellia sinensis)を抽出して得られるカテキンの新たな用途に関する。
【0002】
【従来の技術】
茶から抽出されるポリフェノール、中でもカテキンには既に様々な薬理作用が見出され、各種用途に使われている。
【0003】
例えば、特許文献1は、カテキンを有効成分とする体内アルコール及びその代謝物の低下促進剤を開示している。
【0004】
また、特許文献2は、茶カテキンを有効成分とする解毒剤、すなわち過剰飲酒等により体内の酢酸或いはアセトン濃度が過剰に上昇して酸性血症となり、吐き気、めまいなどの不快な症状が生じた際に摂取すれば体内における酢酸及びアセトンの代謝を促進させることができ、これらの体内濃度を有効に低下させて前記諸症状を短時間で消失させる解毒剤を開示しており、
特許文献3は、茶カテキンに活性酸素発生抑制効果があることを見出し、活性酸素発生抑制剤及び活性酸素起因疾患予防剤すなわち歯周病や肺炎、老化、癌などの活性酸素起因疾患を予防する予防剤として利用することを提案している。
【0005】
特許文献4は、茶カテキンを主成分とするヒトパピローマウイルス由来の尖圭コンジローマ治療剤を開示し、特許文献5は、抗ガン剤に茶カテキン類及び/またはテアフラビン類を添加すると抗ガン剤の効力増強効果を得られる旨を開示し、
特許文献6は、茶カテキンを有効成分とするガストリン分泌抑制剤及び胃酸分泌抑制剤を提案し、摂取することにより胃体部におけるガストリンの分泌及び胃酸の過剰分泌を抑制し、ひいては胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃癌等の消化器疾患の予防を図ることができる旨を開示している。
【0006】
特許文献7は、カテキンを含有する主要カテキン組成物が肝傷害保護効果(肝機能改善効果)を発揮する旨を開示し、特許文献8は緑茶由来のポリフェノール類を有効成分としたアポトーシス誘導性抗白血病細胞剤を開示している。
【0007】
また、特許文献9は、茶から得られるポリフェノール抽出物が、骨破壊を促進する因子であるPTHrp(副甲状腺ホルモン関連蛋白質)またはその活性フラグメント誘発する培養新生仔マウス頭蓋冠からのカルシウム及び無機リン酸の遊離抑制作用を示すことを見出し、かかる知見に基づいて、茶から得られるポリフェノール抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症などの吸収性骨疾患(例えば骨粗鬆症)の予防及び治療剤を開示している。
【0008】
【特許文献1】
特開平06−263648号公報
【特許文献2】
特開平09−59154号公報
【特許文献3】
特開平10−175858号公報
【特許文献4】
特開平10−147525号公報
【特許文献5】
特開平10−36260号公報
【特許文献6】
特開平11−193239号公報
【特許文献7】
特開2000−60427号公報
【特許文献8】
特開2001−226276号公報
【特許文献9】
特開平6−183985号公報
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、茶から抽出して得られるカテキンについては既に様々な研究がなされ、各種薬理作用が見出されているが、本発明者は、従来開示されていない新たな薬理作用を見出すことに成功し、かかる知見に基づいて本発明を想到するに至ったものである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、茶(Camellia sinensis)などに含まれるカテキンに、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化・成熟を助長(強化)する骨組織再生促進作用を見出し、かかる知見に基づいて本発明を想到したものである。
【0011】
すなわち、本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤(骨芽細胞死抑制剤、又は骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長する薬剤とも言える。)及び骨形成促進飲食物を提案する。
【0012】
骨は身体の骨格としての役割だけではなく、カルシウムなどのミネラルの貯蔵庫となり、ホルモン等による調整により身体を正常に保つ役割をしている。
骨は、一度出来上がればそのままという組織ではなく、体内の他の組織同様常に新陳代謝を繰り返している。すなわち、骨では絶えず骨を溶かす破骨細胞と骨を作る骨芽細胞とが密接に連係して骨破壊(骨吸収)と骨形成とを繰り返しており(リモデリング)、成人では骨骨格の3〜5%が活発にリモデリングしているといわれている。
このような骨組織リモデリングにおいて、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うことが知られているが、本発明では、カテキン及びカテキン混合物には、このような骨芽細胞の活動停止(すなわち細胞死)を抑制し、骨細胞による骨形成を促進させる得ることを見出した(下記試験)。これにより、カテキン又はカテキン混合物は、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長(強化)することによって骨細胞による骨形成を促進することができ、例えば骨折後の回復過程を促進したり、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状を軽減したりする効果を期待することができる。
【0013】
なお、骨形成を促進する要素としては、従来、女性ホルモン(エストロゲン)やビタミンDなどが知られていた。また、最近になって、牛乳や母乳等にごく微量含まれているミルク・ベーシック・プロテイン(MBP)が、骨芽細胞と破骨細胞の両方に働きかけ、骨の新陳代謝をスムーズにすることが分かってきたが、カテキンが骨芽細胞に作用し、骨形成促進に寄与し得る旨の報告は存在しなかった。
【0014】
本発明において「特定のカテキン(例えば(−)エピカテキン(EC)或いは(−)エピガロカテキン(EGC)、或いはこれらの混合物など、限定されたカテキン)を有効成分とする」とは、骨細胞による骨形成の促進作用が阻害しなければ、その他の成分、例えば当該特定のカテキン以外のカテキンなどの成分を含んでいてもよいという意を包含するものである。
また、EC、EGC、ECg、EGCg、C、GC、Cg及びGCgそれぞれのカテキンの重合体、並びに、当該それぞれのカテキンと他のカテキンとの共重合体、或いはそれらの二種類以上の組合わせからなる混合物は、「カテキン又はカテキン混合物」「EC、EGC、ECg、EGCg、C、GC、Cg及びGCgのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物」の均等物であると考えることができる。
【0015】
【発明の実施の形態】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進飲食物は、カテキン又はカテキン混合物を適宜濃度で配合することによって製造することができる。但し、カテキン又はカテキン混合物の薬理活性を阻害しない範囲でその他の成分を配合したり、その他の処理を施すことは適宜可能である。
【0016】
上記のカテキンとしては、(−)エピカテキン(EC)、(−)エピガロカテキン(EGC)、(−)エピカテキンガレート(ECg)及び(−)エピガロカテキンガレート(EGCg)、これらのエピマーである(−)カテキン(C)、(−)ガロカテキン(GC)、(−)カテキンガレート(Cg)及び(−)ガロカテキンガレート(GCg)の8種類のカテキンのいずれかを用いることができる。
また、上記のカテキン混合物としては、上記8種類のカテキンのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。
中でも特に、(−)エピカテキンガレート(ECg)の骨形成促進作用は優れているため、ECgを有効成分として含有するものが好ましい。
なお、上記各カテキンの重合体、上記カテキンから選ばれたいずれか二種類以上の組合わせからなる共重合体、それらの化合物或いは重合体或いは共重合体も同様の効果を有するものと期待することができる。
【0017】
上記カテキンの中でEC、EGC、ECg及びEGCgは、天然物、特に茶葉中に多く含有されているから、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって抽出及び精製などによって得ることができる。
【0018】
他方、これらのエピマーであるC、GC、Cg及び GCgは、茶葉を含めて天然植物中にはほとんど存在しないが、EC、EGC、ECg及びEGCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を加熱処理することにより熱異性化(エピマー化)させて得ることができる。例えば、精製したEC、EGC、ECg及びEGCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物、例えば茶の抽出液や浸出液などを、好ましくはpH5〜6に調整した上で、80℃以上の加熱処理することによりカテキンの熱異性化を促してC、GC、Cg及び GCgの含有濃度を高め、このような加熱処理後物からC、GC、Cg及び GCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を分離・精製して得ることができる。
この際、カテキンを熱異性化(エピマー化)させるための加熱処理としては、カテキンを含有する溶液(カテキン溶液)を少なくとも80℃以上に加熱処理する必要がある。例えば、100℃×15分加熱、115℃×20分加熱、120℃×3〜30分加熱、123℃×10分加熱、131℃×30秒加熱、133℃×45秒のいずれにおいてもカテキンの熱異性化が認められている。
カテキン溶液をpH5〜6に調製した上で加熱処理するのが好ましいとするのは、pH4.5以下ではカテキンはほとんど熱異性化しないことが報告されているためである(末松伸一ら、:日食工誌、39,178(1992))。
【0019】
なお、カテキンの分離・精製方法は、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって行えばよい。例えば、茶の抽出液を、例えば水−アセトニトリル−リン酸の混合液を移動相とした逆相HPLCにかけ、アセトニトリル濃度でグラジエントをかけることによってそれぞれ分離できることが知られている。
【0020】
本発明の「カテキン混合物」として、カテキン濃度20重量%以上、好ましくは25%以上、中でも特に30%以上の茶抽出物を用いることが可能である。
茶抽出物は、茶を水、温水または熱水、好ましくは40℃〜100℃の温熱水、中でも90〜100℃の熱水、或いは人体に無害なエタノール水溶液またはエタノールなどの有機溶媒で抽出して得ることができ、好ましくは、この茶抽出物を溶媒抽出法、樹脂吸着法、限外濾過・逆浸透濾過等の濾過などの精製手段によってカテキンの含有量を高める方向に精製して得ることができる。抽出の際、カテキン含有量を高めるべく塩酸等を添加した酸性条件下で抽出を行ってもよい。
また、市販の茶抽出物を用いることがもできる。例えば、テアフラン35及び30A(商品名;伊藤園社製)のいずれも、緑茶を熱水抽出処理し、この抽出物を乾燥させてカテキン濃度を約30%とした緑茶抽出物(組成(重量%):EGC7.62、EGCg13.70、EC2.13、ECg2.61、GC2.61、GCg0.49、(+)C0.43、Cg0.28)であり、テアフラン90S(商品名;伊藤園社製)は、緑茶を熱水抽出処理して得た抽出物を、水と低・高濃度アルコールを使って吸着カラムにて分離し乾燥させ、茶ポリフェノール濃度を約85〜99.5%とした緑茶抽出物(組成の一例(重量%):EGCg50.18、EC0.57、ECg17.11、GCg3.96、Cg0.91)である。
【0021】
本発明の骨形成促進剤において、カテキン又はカテキン混合物は、それぞれ単独で本発明の有効成分として配合することも可能であるが、既に或いは将来的に骨形成促進効果が認められた物質(例えば女性ホルモン(エストロゲン)やビタミンD、MBPなど)と混合し、これらの有効成分と併用することも可能である。
なお、単独で本発明の有効成分として配合する場合、例えばカテキン又はカテキン混合物を、精製水や生理食塩水などに溶解して骨形成促進剤(例えば経口投与剤、腹腔内投与剤等)とすることも可能である。
【0022】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与剤または非経口投与剤(筋肉注射、静脈注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など)とすることができ、それぞれの投与に適した配合及び剤型とするのが好ましい。
剤型について言えば、例えば経口投与剤用としては液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態に調製することができ、非経口投与剤用としては注射剤、アンプル剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などの形態に調製することができる。
配合(製剤)について言えば、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。また、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどの無毒性の添加剤を配合することも可能である。
【0023】
また、本発明の骨形成促進剤は、医薬品のほか、医薬部外品、薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品、食品添加剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や餌、餌用添加剤などとして提供することが可能である。
例えば、医薬部外品として調製し、これを瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。
【0024】
本発明の骨形成促進飲食物(本発明では、骨形成促進効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品を総称して「骨形成促進飲食物」という。)は、例えば、カテキン又はカテキン混合物、或いはこの混合物を含むカテキン溶液(例えばカテキン抽出液や浸出液)などを他の飲食品材料、例えば炭酸、賦形剤(造粒剤含む)、希釈剤、或いは更に甘味剤、フレーバー、小麦粉、でんぷん、糖、油脂類等の各種タンパク質、糖質原料やビタミン、ミネラルなどの飲食品材料群から選ばれた一種或いは二種以上と混合したり、或いは、現在公知の飲食品、例えばスポーツ飲料、果実飲料、乳飲料、茶飲料、野菜ジュース、乳性飲料、アルコール飲料、ゼリー、ゼリー飲料、炭酸飲料、チューインガム、チョコレート、キャンディ、ビスケット、スナック、パン、乳製品、魚肉練り製品、畜肉製品、冷菓、乾燥食品、サプリメントなどに添加して製造することができる。
【0025】
本発明における有効成分の含有量は、使用方法によっても異なるが、医薬品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を、乾燥重量換算で0.001〜1重量%、特に0.01〜0.5重量%配合するのが好ましく、
飲食品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を0.001〜1重量%、特に0.01〜0.5重量%配合するのが好ましい。特に飲料の形態とする場合、通常飲用されるお茶の1.4倍〜8倍の濃度に調製するのが好ましい。
なお、摂取量としては、カテキン或いはこれらの混合物を乾燥重量換算で大人一日に10〜5000mg、好ましくは100〜1500mg程度摂取するのが好ましい。
【0026】
(試験)
骨組織リモデリングは、破骨細胞と骨芽細胞により行われることは周知の事実であるが、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して、自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うと理解される。したがって、骨芽細胞の生存決定要因の追究は、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の発症原因解明研究のみならず、治療方法開発研究のうえでも、極めて大きな病態生理学的意義を持つと推察される。したがって、本研究では初代培養骨芽細胞を用いて、培養メディウム交換により引き起こされる細胞死について多面的解析を行った。
【0027】
<方法>
(試薬調整)
テアフラン90S(組成(重量%):EGCg43.14、EC0.82、ECg16.30、GCg4.16、Cg1.44、カテキンTOTAL総量65.86)及びテアニン(theanine)をPBS中に懸濁し、それぞれ100mg/mL及び1Mのstock solutionを作成した。
また、(−)−エピカテキン(EC)、(−)−エピカテキンガレート(ECg)、(−)−エピガロテキテキン(EGC)及び(−)−エピガロカテキンガレート(EGCg)をDMSO中に懸濁し、それぞれ100mMのstock solution(貯蔵液)を作成した。
【0028】
(骨芽細胞培養法)
1)Wistar系新生仔ラット(1−2日齢)を70%ethanolで消毒後に屠殺した。
2)頭蓋骨皮膚を剥離後、頭蓋骨をPBS中へ摘出した(ただし、後頭骨部分は除去)。
3)付着した血球や髄膜を除去し、PBSで洗浄した。
4)頭蓋骨を酵素溶液(0.1% collagenase、0.25% trypsin in PBS)10mL中で37℃、5分間攪拌後、細胞浮遊画分を吸引除去した。
5)新しい酵素溶液10mLを添加し37℃、10分間攪拌後、細胞浮遊画分を10%FBS−αMEM中へ回収した。
6)5)の作業をさらに3回繰り返し、それぞれの細胞浮遊画分を回収した。
7)回収した画分を細胞ろ過用フィルターでろ過した。
8)ろ液を250g、5分間遠心後、沈渣を10%FBS−αMEMで懸濁した。
9)1×104 cell/cm2の密度で各プレートに播種した。
10)翌日、メディウムを50mg/mL ascorbic acid及び5mM β−glycerophosphateを含む10%FBS−αMEMへ交換し、この日を培養0日目(開始日)とした。以後1日おきにメディウムを交換した。
【0029】
頭蓋骨由来骨芽細胞株MC3T3−E1についても、10%FBS−αMEMを用いて同様に培養した。
【0030】
(細胞生存活性測定法)
細胞生存活性の測定手順を図1に示す。
1)細胞は、各培養日数経過まで、10%FBSを含むαMEM中で培養した。
2)各培養日数経過後に、細胞培養メディウムを、被検化合物を含む10%FBS−αMEMに交換した。
3)メディウム交換12時間後に、cell counting kit−8 (DOJINDO)を添加後、450nmの吸光度を測定した(参照波長650nm)。
【0031】
(細胞死測定法)
1)細胞をPBSで2回洗浄後、10mg/mL Hoechst33342 及び 5mg/mL propidium iodideを添加し、室温で15分間反応させた。
2)励起主波長405nmまたは546nmのダイクロイックミラーを用いて、オリンパス倒立型顕微鏡で蛍光の観察をした。
【0032】
(DNA結合能測定法)
細胞核抽出液
1)細胞をPBSで2回洗浄後、10mM HEPES−NaOH緩衝液(pH 7.9)[10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10mM 各種 phosphatase inhibitors (sodium fluoride及びsodium β−glycerophosphate)、及び1 mg/mL 各種 protease inhibitors [(p−amidinophenyl)methanesulfonyl fluoride、benzamidine、leupeptin 及び antipain]]中で懸濁した。
2)10% Nonidet P40を最終濃度0.6%になるように添加し、攪拌後20,000g、5分間遠心分離した。
3)沈渣を50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)[400mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10%glycerol、10mM 上記各種 phosphatase inhibitors、及び1 mg/mL 上記各種 protease
inhibitors]を用いて懸濁した。
4)懸濁液を氷水中で30分間静置後、20,000g、5分間遠心分離し、その上清を細胞核抽出液とした。
【0033】
(ゲルシフト法)
1)細胞核抽出液を、[α−32P]deoxy−ATPで放射ラベルしたAP1 (5’−CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC−3’)プローブ、またはNF−kB(5’−AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC−3’)プローブと、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)[1 mg poly (dI−dC)、160mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10% glycerol、5mM 上記各種 phosphatase inhibitors、及び1mg/mL 上記各種 protease inhibitors]中で25℃、30分間反応させた。
2)反応終了後、6%ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動用緩衝液(pH8.5)(50mM Tris、0.38M glycine、2mM EDTA)中で、80V定電圧、2℃、1.5時間泳動分離した。ゲルを乾燥したのち、オートラジオグラフィー法によりゲル中の放射能を検出した。
【0034】
<結果>
培養液交換に関しては、培養開始後3日目までの初代培養骨芽細胞では、培養メディウムをαMEMからDMEMに交換すると、その12時間後には骨芽細胞の生存率は著明に減少した(図2〜図4)。これに対して、5日間以上αMEM中で培養した細胞では、培養液をDMEMに交換しても12時間後の細胞生存率は著変を示さなかった(図5)。培養0日目の細胞では、培養メディウム交換後2時間目には既に50%以上の細胞死が誘発され、交換後4時間目には殆ど全ての細胞が死滅した(図2)。これに対して、培養1日目の細胞では、メディウム交換2時間後でも60%以上の細胞の生存が確認されたが、交換後8時間目には殆どの細胞が死滅した(図3)。培養3日目の細胞では、メディウム交換後6時間目までは著明な細胞死は観察されなかったが、交換後12時間目には著しい細胞死が誘発された(図4)。したがって、αMEMメディウム中での培養初期にのみ、メディウム交換による骨芽細胞死が誘発されることは明白である。
【0035】
DNA結合能に関しては、3日間培養した細胞について、培養メディウム交換直後に細胞を回収して、遺伝子転写制御因子のDNA結合能を測定した。その結果、交換後60分目ではAP1 DNA結合に著変は見られなかったが、120分後にはAP1結合は2倍以上増強された。しかしながら、交換後240分経過時には有意なAP1結合上昇は観察されなかった。これに対して、NF−kBのDNA結合能は、メディウム交換後120分経過時に10倍以上の上昇が認められただけでなく、240分経過後にも5倍の上昇が見られた。したがって、培養メディウム交換はAP1の一過性発現のみならず、NF−kBの持続的発現を招来すると推察される。
【0036】
細胞死に関しては、3日間培養細胞について、メディウム交換後12時間目に細胞を染色して、蛍光顕微鏡で観察すると、Hoechst33342で染色した場合は、細胞核凝集を示す細胞が認められた。同様に、細胞をpropidium iodideで染色すると、高い染色性を示す細胞が複数観察された。したがって、培養メディウム交換に伴う細胞死には、アポトーシスとネクローシスの両方が関与すると推察される。
【0037】
株化細胞に関しては、初代培養骨芽細胞だけでなく、頭蓋骨由来株化細胞MC3T3−E1についても同様の検討を行ったところ、初代培養細胞の場合と同様に、1日間培養した株化細胞においても、培養メディウム交換により著明な細胞死が誘発された。
したがって、初代培養骨芽細胞だけでなく株化骨芽細胞でも、未成熟な発達段階では培養メディウムをα−MEMからDMEMに交換すると、著明な細胞死が出現することは明らかである。
【0038】
生存因子に関しては、骨芽細胞の生存に必須な物質を、αMEMとDMEM間の組成相違を基に検討した。3日間培養細胞について、交換メディウムDMEM中にピルビン酸やシステインを添加すると、メディウム交換後12時間目でも著明な細胞死が出現しないことが判明した。したがって、ピルビン酸やシステインは骨芽細胞の生存に必須な内在性物質であると類推される。
【0039】
次いで、骨芽細胞生存に必要な外因性物質を探索するために、多価フェノール群(カテキンやテアニンなど)の効果について検索を進めた。
【0040】
まず、緑茶成分カテキンの混合物であるテアフラン90Sについて同様の解析を行ったが、培養0日目及び培養1日目の細胞の場合は、交換メディウムDMEM中にテアフランを添加しても、メディウム交換に伴う骨芽細胞死は著明な影響を受けなかった(図18、図19)。これに対して、3日間培養細胞の場合は100μg/mLテアフラン90S添加の場合に著明な防御効果が観察されたが、より高濃度でもテアフランには細胞死防御作用は見られなかった(図20)。一方、培養7日目の細胞ではメディウム交換に伴う細胞死は元来誘発されなかったが、高濃度のテアフラン90Sを添加したαMEMにメディウムを交換すると、12時間後には殆どの骨芽細胞が死滅することが明らかとなった(図21)。これらの結果は、位相差顕微鏡による観察でも確認された(図22〜図27)。
以上の結果から、混合物であるテアフラン90S中には、未熟骨芽細胞において観察されるメディウム交換に伴う細胞死を防御する物質だけでなく、骨芽細胞死を誘導する物質が含まれることは明らかである。そこで次に、テアフラン90S中の各含有成分それぞれについて、メディウム交換誘発性細胞死に対する影響を検索した。
【0041】
エピカテキン(EC)に関しては、培養0日目から3日目までの細胞では、0.3から300μMまでのエピカテキン添加DMEMにメディウムを交換しても、メディウム交換に伴う細胞死には著明な変化は認められなかった(図28〜図30)。また、7日間培養細胞でも各濃度のエピカテキンは、細胞生存率に著変を与えなかった(図31)。
以上の結果から、エピカテキンは骨芽細胞の成熟度に拘わらず、メディウム交換に伴う細胞死を防御する活性や、或いは細胞死を誘導する活性を持たないと推察される。
【0042】
エピカテキンガレート(ECg)に関しては、培養0日目細胞の場合は、0.4から400μMまでのエピカテキンガレートを添加しても、メディウム交換に伴う細胞死は影響されなかったが(図32)、培養1日目及び3日目の細胞の場合は、メディウム交換による細胞死は40から400μMのエピカテキンガレート添加により阻止された。しかしながら、7日間培養した骨芽細胞では、高濃度(400μM)のエピカテキンガレートを添加したDMEMにメディウム交換すると、12時間後には軽度ではあるが有意な細胞死が招来された。
以上の結果から、エピカテキンガレートは超未熟な骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、強い防御作用を発揮することが判明した。しかしながら、成熟発達段階にある骨芽細胞では、極めて高濃度のエピカテキンガレートは弱い細胞毒性を示す可能性が考えられる。
【0043】
エピガロカテキン(EGC)に関しても、エピカテキンの場合と同様に、培養0日目から3日目までの細胞では、1から1,000μMまでの濃度を添加しても、メディウム交換に伴う細胞死に対する著明な影響を与えなかったが、エピカテキンの場合とは異なり、7日間培養細胞では高濃度のエピガロカテキン添加により、12時間後に殆どの骨芽細胞が死滅した。
以上の結果から、エピガロカテキンは未熟骨芽細胞におけるメディウム交換性細胞死を防御する活性を示さないのに対して、成熟発達段階にある骨芽細胞では極めて高濃度で強い細胞毒性を発揮する可能性が示唆される。
【0044】
エピガロカテキンガレート(EGCg)の場合は、培養0日目の細胞ではメディウム交換による細胞死に対する影響は認められなかったが、1日間培養及び3日間培養の細胞では、100μMでは有意な保護作用を示したのに対して、1,000μMでは有意な保護効果は見られなかった。一方、7日間培養細胞では、1,000μMエピガロカテキンガレート添加により、12時間後には著しい細胞死が誘発された。
以上の結果から、エピガロカテキンガレートは超未熟骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、二相性の防御効果を発揮することが判明した。すわなち、100μMでは強い防御効果を示すのに対して、1000μMではメディウム交換に伴う細胞死に対する保護作用は全く観察されなかった。この原因の一つには、成熟発達段階の骨芽細胞で見られたように、高濃度エピガロカテキンガレート自身の細胞毒性を挙げることができる。
【0045】
他の緑茶成分であるテアニンについてもカテキンと同様の検索を行ったが、何れの条件でも、テアニン10μMから10mMは、初代骨芽細胞の生存率に著明な影響を与えなかった。
したがって、カテキンとは異なり、テアニンにはメディウム交換に伴う骨芽細胞死に対する防御活性はないものと類推される。
【0046】
<考察>
緑茶成分カテキンの中でも、エピカテキンガレートは骨芽細胞の増殖、分化、あるいは成熟過程に対する影響を通じて、骨細胞による骨形成を促進させて、骨組織リモデリングに貢献する可能性が考えられる。この効果は、単に骨折後の回復過程促進だけでなく、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状軽減に臨床医学的意義を持つと類推される。
【図面の簡単な説明】
【図1】培養した骨芽細胞の生存活性の測定手順を示す図である。
【図2】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図3】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図4】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図5】細胞培養メディウムを培養0日目から培養21日目までのαMEMのまま又はDMEMに交換した日における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図6】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図7】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による120分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図8】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による240分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図9】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60〜240分後のAP1 DNA結合能の測定結果を示したグラフである。
【図10】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図11】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による120分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図12】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による240分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図13】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60〜240分後のNF−κB DNA結合能の測定結果を示したグラフである。
【図14】細胞培養メディウムをDMEMに交換した日(培養3日目)の12時間後に骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)をHoechst33342で染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図15】細胞培養メディウムをDMEMに交換した日(培養3日目)の12時間後に骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)をpropidium iodideで染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図16】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養1日目)における頭蓋骨由来初代培養骨芽細胞及び株化骨芽細胞の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図17】細胞培養メディウムを培養3日目にDMEMに交換する際に各種物質を添加した場合における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図18】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図19】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図20】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図21】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図22】細胞培養メディウムをαMEMのまま3日間培養した骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来、コントロール)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図23】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを添加しないDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図24】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを100μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図25】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図26】細胞培養メディウムをαMEMのまま7日間培養した骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来、コントロール)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図27】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図28】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図29】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図30】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図31】細胞培養メディウムをエピカテキンを0〜300μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図32】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図33】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図34】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図35】細胞培養メディウムをエピカテキンガレートを0〜400μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図36】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図37】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図38】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図39】細胞培養メディウムをエピガロカテキンを0〜1000μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図40】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図41】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図42】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図43】細胞培養メディウムをエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図44】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図45】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図46】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、茶(Camellia sinensis)を抽出して得られるカテキンの新たな用途に関する。
【0002】
【従来の技術】
茶から抽出されるポリフェノール、中でもカテキンには既に様々な薬理作用が見出され、各種用途に使われている。
【0003】
例えば、特許文献1は、カテキンを有効成分とする体内アルコール及びその代謝物の低下促進剤を開示している。
【0004】
また、特許文献2は、茶カテキンを有効成分とする解毒剤、すなわち過剰飲酒等により体内の酢酸或いはアセトン濃度が過剰に上昇して酸性血症となり、吐き気、めまいなどの不快な症状が生じた際に摂取すれば体内における酢酸及びアセトンの代謝を促進させることができ、これらの体内濃度を有効に低下させて前記諸症状を短時間で消失させる解毒剤を開示しており、
特許文献3は、茶カテキンに活性酸素発生抑制効果があることを見出し、活性酸素発生抑制剤及び活性酸素起因疾患予防剤すなわち歯周病や肺炎、老化、癌などの活性酸素起因疾患を予防する予防剤として利用することを提案している。
【0005】
特許文献4は、茶カテキンを主成分とするヒトパピローマウイルス由来の尖圭コンジローマ治療剤を開示し、特許文献5は、抗ガン剤に茶カテキン類及び/またはテアフラビン類を添加すると抗ガン剤の効力増強効果を得られる旨を開示し、
特許文献6は、茶カテキンを有効成分とするガストリン分泌抑制剤及び胃酸分泌抑制剤を提案し、摂取することにより胃体部におけるガストリンの分泌及び胃酸の過剰分泌を抑制し、ひいては胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃癌等の消化器疾患の予防を図ることができる旨を開示している。
【0006】
特許文献7は、カテキンを含有する主要カテキン組成物が肝傷害保護効果(肝機能改善効果)を発揮する旨を開示し、特許文献8は緑茶由来のポリフェノール類を有効成分としたアポトーシス誘導性抗白血病細胞剤を開示している。
【0007】
また、特許文献9は、茶から得られるポリフェノール抽出物が、骨破壊を促進する因子であるPTHrp(副甲状腺ホルモン関連蛋白質)またはその活性フラグメント誘発する培養新生仔マウス頭蓋冠からのカルシウム及び無機リン酸の遊離抑制作用を示すことを見出し、かかる知見に基づいて、茶から得られるポリフェノール抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症などの吸収性骨疾患(例えば骨粗鬆症)の予防及び治療剤を開示している。
【0008】
【特許文献1】
特開平06−263648号公報
【特許文献2】
特開平09−59154号公報
【特許文献3】
特開平10−175858号公報
【特許文献4】
特開平10−147525号公報
【特許文献5】
特開平10−36260号公報
【特許文献6】
特開平11−193239号公報
【特許文献7】
特開2000−60427号公報
【特許文献8】
特開2001−226276号公報
【特許文献9】
特開平6−183985号公報
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、茶から抽出して得られるカテキンについては既に様々な研究がなされ、各種薬理作用が見出されているが、本発明者は、従来開示されていない新たな薬理作用を見出すことに成功し、かかる知見に基づいて本発明を想到するに至ったものである。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、茶(Camellia sinensis)などに含まれるカテキンに、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化・成熟を助長(強化)する骨組織再生促進作用を見出し、かかる知見に基づいて本発明を想到したものである。
【0011】
すなわち、本発明は、カテキン又はカテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤(骨芽細胞死抑制剤、又は骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長する薬剤とも言える。)及び骨形成促進飲食物を提案する。
【0012】
骨は身体の骨格としての役割だけではなく、カルシウムなどのミネラルの貯蔵庫となり、ホルモン等による調整により身体を正常に保つ役割をしている。
骨は、一度出来上がればそのままという組織ではなく、体内の他の組織同様常に新陳代謝を繰り返している。すなわち、骨では絶えず骨を溶かす破骨細胞と骨を作る骨芽細胞とが密接に連係して骨破壊(骨吸収)と骨形成とを繰り返しており(リモデリング)、成人では骨骨格の3〜5%が活発にリモデリングしているといわれている。
このような骨組織リモデリングにおいて、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うことが知られているが、本発明では、カテキン及びカテキン混合物には、このような骨芽細胞の活動停止(すなわち細胞死)を抑制し、骨細胞による骨形成を促進させる得ることを見出した(下記試験)。これにより、カテキン又はカテキン混合物は、骨芽細胞死を抑制し、骨芽細胞の増殖・分化或いは成熟を助長(強化)することによって骨細胞による骨形成を促進することができ、例えば骨折後の回復過程を促進したり、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状を軽減したりする効果を期待することができる。
【0013】
なお、骨形成を促進する要素としては、従来、女性ホルモン(エストロゲン)やビタミンDなどが知られていた。また、最近になって、牛乳や母乳等にごく微量含まれているミルク・ベーシック・プロテイン(MBP)が、骨芽細胞と破骨細胞の両方に働きかけ、骨の新陳代謝をスムーズにすることが分かってきたが、カテキンが骨芽細胞に作用し、骨形成促進に寄与し得る旨の報告は存在しなかった。
【0014】
本発明において「特定のカテキン(例えば(−)エピカテキン(EC)或いは(−)エピガロカテキン(EGC)、或いはこれらの混合物など、限定されたカテキン)を有効成分とする」とは、骨細胞による骨形成の促進作用が阻害しなければ、その他の成分、例えば当該特定のカテキン以外のカテキンなどの成分を含んでいてもよいという意を包含するものである。
また、EC、EGC、ECg、EGCg、C、GC、Cg及びGCgそれぞれのカテキンの重合体、並びに、当該それぞれのカテキンと他のカテキンとの共重合体、或いはそれらの二種類以上の組合わせからなる混合物は、「カテキン又はカテキン混合物」「EC、EGC、ECg、EGCg、C、GC、Cg及びGCgのいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物」の均等物であると考えることができる。
【0015】
【発明の実施の形態】
本発明の骨形成促進剤及び骨形成促進飲食物は、カテキン又はカテキン混合物を適宜濃度で配合することによって製造することができる。但し、カテキン又はカテキン混合物の薬理活性を阻害しない範囲でその他の成分を配合したり、その他の処理を施すことは適宜可能である。
【0016】
上記のカテキンとしては、(−)エピカテキン(EC)、(−)エピガロカテキン(EGC)、(−)エピカテキンガレート(ECg)及び(−)エピガロカテキンガレート(EGCg)、これらのエピマーである(−)カテキン(C)、(−)ガロカテキン(GC)、(−)カテキンガレート(Cg)及び(−)ガロカテキンガレート(GCg)の8種類のカテキンのいずれかを用いることができる。
また、上記のカテキン混合物としては、上記8種類のカテキンのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物を用いることができる。
中でも特に、(−)エピカテキンガレート(ECg)の骨形成促進作用は優れているため、ECgを有効成分として含有するものが好ましい。
なお、上記各カテキンの重合体、上記カテキンから選ばれたいずれか二種類以上の組合わせからなる共重合体、それらの化合物或いは重合体或いは共重合体も同様の効果を有するものと期待することができる。
【0017】
上記カテキンの中でEC、EGC、ECg及びEGCgは、天然物、特に茶葉中に多く含有されているから、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって抽出及び精製などによって得ることができる。
【0018】
他方、これらのエピマーであるC、GC、Cg及び GCgは、茶葉を含めて天然植物中にはほとんど存在しないが、EC、EGC、ECg及びEGCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を加熱処理することにより熱異性化(エピマー化)させて得ることができる。例えば、精製したEC、EGC、ECg及びEGCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物、例えば茶の抽出液や浸出液などを、好ましくはpH5〜6に調整した上で、80℃以上の加熱処理することによりカテキンの熱異性化を促してC、GC、Cg及び GCgの含有濃度を高め、このような加熱処理後物からC、GC、Cg及び GCgのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物を分離・精製して得ることができる。
この際、カテキンを熱異性化(エピマー化)させるための加熱処理としては、カテキンを含有する溶液(カテキン溶液)を少なくとも80℃以上に加熱処理する必要がある。例えば、100℃×15分加熱、115℃×20分加熱、120℃×3〜30分加熱、123℃×10分加熱、131℃×30秒加熱、133℃×45秒のいずれにおいてもカテキンの熱異性化が認められている。
カテキン溶液をpH5〜6に調製した上で加熱処理するのが好ましいとするのは、pH4.5以下ではカテキンはほとんど熱異性化しないことが報告されているためである(末松伸一ら、:日食工誌、39,178(1992))。
【0019】
なお、カテキンの分離・精製方法は、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって行えばよい。例えば、茶の抽出液を、例えば水−アセトニトリル−リン酸の混合液を移動相とした逆相HPLCにかけ、アセトニトリル濃度でグラジエントをかけることによってそれぞれ分離できることが知られている。
【0020】
本発明の「カテキン混合物」として、カテキン濃度20重量%以上、好ましくは25%以上、中でも特に30%以上の茶抽出物を用いることが可能である。
茶抽出物は、茶を水、温水または熱水、好ましくは40℃〜100℃の温熱水、中でも90〜100℃の熱水、或いは人体に無害なエタノール水溶液またはエタノールなどの有機溶媒で抽出して得ることができ、好ましくは、この茶抽出物を溶媒抽出法、樹脂吸着法、限外濾過・逆浸透濾過等の濾過などの精製手段によってカテキンの含有量を高める方向に精製して得ることができる。抽出の際、カテキン含有量を高めるべく塩酸等を添加した酸性条件下で抽出を行ってもよい。
また、市販の茶抽出物を用いることがもできる。例えば、テアフラン35及び30A(商品名;伊藤園社製)のいずれも、緑茶を熱水抽出処理し、この抽出物を乾燥させてカテキン濃度を約30%とした緑茶抽出物(組成(重量%):EGC7.62、EGCg13.70、EC2.13、ECg2.61、GC2.61、GCg0.49、(+)C0.43、Cg0.28)であり、テアフラン90S(商品名;伊藤園社製)は、緑茶を熱水抽出処理して得た抽出物を、水と低・高濃度アルコールを使って吸着カラムにて分離し乾燥させ、茶ポリフェノール濃度を約85〜99.5%とした緑茶抽出物(組成の一例(重量%):EGCg50.18、EC0.57、ECg17.11、GCg3.96、Cg0.91)である。
【0021】
本発明の骨形成促進剤において、カテキン又はカテキン混合物は、それぞれ単独で本発明の有効成分として配合することも可能であるが、既に或いは将来的に骨形成促進効果が認められた物質(例えば女性ホルモン(エストロゲン)やビタミンD、MBPなど)と混合し、これらの有効成分と併用することも可能である。
なお、単独で本発明の有効成分として配合する場合、例えばカテキン又はカテキン混合物を、精製水や生理食塩水などに溶解して骨形成促進剤(例えば経口投与剤、腹腔内投与剤等)とすることも可能である。
【0022】
本発明の骨形成促進剤は、経口投与剤または非経口投与剤(筋肉注射、静脈注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など)とすることができ、それぞれの投与に適した配合及び剤型とするのが好ましい。
剤型について言えば、例えば経口投与剤用としては液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態に調製することができ、非経口投与剤用としては注射剤、アンプル剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などの形態に調製することができる。
配合(製剤)について言えば、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造することができる。また、例えば乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどの無毒性の添加剤を配合することも可能である。
【0023】
また、本発明の骨形成促進剤は、医薬品のほか、医薬部外品、薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品、食品添加剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や餌、餌用添加剤などとして提供することが可能である。
例えば、医薬部外品として調製し、これを瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。
【0024】
本発明の骨形成促進飲食物(本発明では、骨形成促進効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品を総称して「骨形成促進飲食物」という。)は、例えば、カテキン又はカテキン混合物、或いはこの混合物を含むカテキン溶液(例えばカテキン抽出液や浸出液)などを他の飲食品材料、例えば炭酸、賦形剤(造粒剤含む)、希釈剤、或いは更に甘味剤、フレーバー、小麦粉、でんぷん、糖、油脂類等の各種タンパク質、糖質原料やビタミン、ミネラルなどの飲食品材料群から選ばれた一種或いは二種以上と混合したり、或いは、現在公知の飲食品、例えばスポーツ飲料、果実飲料、乳飲料、茶飲料、野菜ジュース、乳性飲料、アルコール飲料、ゼリー、ゼリー飲料、炭酸飲料、チューインガム、チョコレート、キャンディ、ビスケット、スナック、パン、乳製品、魚肉練り製品、畜肉製品、冷菓、乾燥食品、サプリメントなどに添加して製造することができる。
【0025】
本発明における有効成分の含有量は、使用方法によっても異なるが、医薬品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を、乾燥重量換算で0.001〜1重量%、特に0.01〜0.5重量%配合するのが好ましく、
飲食品であれば、カテキン或いはこれらの混合物を0.001〜1重量%、特に0.01〜0.5重量%配合するのが好ましい。特に飲料の形態とする場合、通常飲用されるお茶の1.4倍〜8倍の濃度に調製するのが好ましい。
なお、摂取量としては、カテキン或いはこれらの混合物を乾燥重量換算で大人一日に10〜5000mg、好ましくは100〜1500mg程度摂取するのが好ましい。
【0026】
(試験)
骨組織リモデリングは、破骨細胞と骨芽細胞により行われることは周知の事実であるが、破骨細胞が吸収した骨質と等量の骨質を形成すると、骨芽細胞は活動を停止して、自ら分泌した骨質内に埋もれたのち、骨細胞となって増殖能力を失うと理解される。したがって、骨芽細胞の生存決定要因の追究は、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の発症原因解明研究のみならず、治療方法開発研究のうえでも、極めて大きな病態生理学的意義を持つと推察される。したがって、本研究では初代培養骨芽細胞を用いて、培養メディウム交換により引き起こされる細胞死について多面的解析を行った。
【0027】
<方法>
(試薬調整)
テアフラン90S(組成(重量%):EGCg43.14、EC0.82、ECg16.30、GCg4.16、Cg1.44、カテキンTOTAL総量65.86)及びテアニン(theanine)をPBS中に懸濁し、それぞれ100mg/mL及び1Mのstock solutionを作成した。
また、(−)−エピカテキン(EC)、(−)−エピカテキンガレート(ECg)、(−)−エピガロテキテキン(EGC)及び(−)−エピガロカテキンガレート(EGCg)をDMSO中に懸濁し、それぞれ100mMのstock solution(貯蔵液)を作成した。
【0028】
(骨芽細胞培養法)
1)Wistar系新生仔ラット(1−2日齢)を70%ethanolで消毒後に屠殺した。
2)頭蓋骨皮膚を剥離後、頭蓋骨をPBS中へ摘出した(ただし、後頭骨部分は除去)。
3)付着した血球や髄膜を除去し、PBSで洗浄した。
4)頭蓋骨を酵素溶液(0.1% collagenase、0.25% trypsin in PBS)10mL中で37℃、5分間攪拌後、細胞浮遊画分を吸引除去した。
5)新しい酵素溶液10mLを添加し37℃、10分間攪拌後、細胞浮遊画分を10%FBS−αMEM中へ回収した。
6)5)の作業をさらに3回繰り返し、それぞれの細胞浮遊画分を回収した。
7)回収した画分を細胞ろ過用フィルターでろ過した。
8)ろ液を250g、5分間遠心後、沈渣を10%FBS−αMEMで懸濁した。
9)1×104 cell/cm2の密度で各プレートに播種した。
10)翌日、メディウムを50mg/mL ascorbic acid及び5mM β−glycerophosphateを含む10%FBS−αMEMへ交換し、この日を培養0日目(開始日)とした。以後1日おきにメディウムを交換した。
【0029】
頭蓋骨由来骨芽細胞株MC3T3−E1についても、10%FBS−αMEMを用いて同様に培養した。
【0030】
(細胞生存活性測定法)
細胞生存活性の測定手順を図1に示す。
1)細胞は、各培養日数経過まで、10%FBSを含むαMEM中で培養した。
2)各培養日数経過後に、細胞培養メディウムを、被検化合物を含む10%FBS−αMEMに交換した。
3)メディウム交換12時間後に、cell counting kit−8 (DOJINDO)を添加後、450nmの吸光度を測定した(参照波長650nm)。
【0031】
(細胞死測定法)
1)細胞をPBSで2回洗浄後、10mg/mL Hoechst33342 及び 5mg/mL propidium iodideを添加し、室温で15分間反応させた。
2)励起主波長405nmまたは546nmのダイクロイックミラーを用いて、オリンパス倒立型顕微鏡で蛍光の観察をした。
【0032】
(DNA結合能測定法)
細胞核抽出液
1)細胞をPBSで2回洗浄後、10mM HEPES−NaOH緩衝液(pH 7.9)[10mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10mM 各種 phosphatase inhibitors (sodium fluoride及びsodium β−glycerophosphate)、及び1 mg/mL 各種 protease inhibitors [(p−amidinophenyl)methanesulfonyl fluoride、benzamidine、leupeptin 及び antipain]]中で懸濁した。
2)10% Nonidet P40を最終濃度0.6%になるように添加し、攪拌後20,000g、5分間遠心分離した。
3)沈渣を50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)[400mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10%glycerol、10mM 上記各種 phosphatase inhibitors、及び1 mg/mL 上記各種 protease
inhibitors]を用いて懸濁した。
4)懸濁液を氷水中で30分間静置後、20,000g、5分間遠心分離し、その上清を細胞核抽出液とした。
【0033】
(ゲルシフト法)
1)細胞核抽出液を、[α−32P]deoxy−ATPで放射ラベルしたAP1 (5’−CTAGTGATGAGTCAGCCGGATC−3’)プローブ、またはNF−kB(5’−AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC−3’)プローブと、50mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)[1 mg poly (dI−dC)、160mM KCl、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM DTT、10% glycerol、5mM 上記各種 phosphatase inhibitors、及び1mg/mL 上記各種 protease inhibitors]中で25℃、30分間反応させた。
2)反応終了後、6%ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動用緩衝液(pH8.5)(50mM Tris、0.38M glycine、2mM EDTA)中で、80V定電圧、2℃、1.5時間泳動分離した。ゲルを乾燥したのち、オートラジオグラフィー法によりゲル中の放射能を検出した。
【0034】
<結果>
培養液交換に関しては、培養開始後3日目までの初代培養骨芽細胞では、培養メディウムをαMEMからDMEMに交換すると、その12時間後には骨芽細胞の生存率は著明に減少した(図2〜図4)。これに対して、5日間以上αMEM中で培養した細胞では、培養液をDMEMに交換しても12時間後の細胞生存率は著変を示さなかった(図5)。培養0日目の細胞では、培養メディウム交換後2時間目には既に50%以上の細胞死が誘発され、交換後4時間目には殆ど全ての細胞が死滅した(図2)。これに対して、培養1日目の細胞では、メディウム交換2時間後でも60%以上の細胞の生存が確認されたが、交換後8時間目には殆どの細胞が死滅した(図3)。培養3日目の細胞では、メディウム交換後6時間目までは著明な細胞死は観察されなかったが、交換後12時間目には著しい細胞死が誘発された(図4)。したがって、αMEMメディウム中での培養初期にのみ、メディウム交換による骨芽細胞死が誘発されることは明白である。
【0035】
DNA結合能に関しては、3日間培養した細胞について、培養メディウム交換直後に細胞を回収して、遺伝子転写制御因子のDNA結合能を測定した。その結果、交換後60分目ではAP1 DNA結合に著変は見られなかったが、120分後にはAP1結合は2倍以上増強された。しかしながら、交換後240分経過時には有意なAP1結合上昇は観察されなかった。これに対して、NF−kBのDNA結合能は、メディウム交換後120分経過時に10倍以上の上昇が認められただけでなく、240分経過後にも5倍の上昇が見られた。したがって、培養メディウム交換はAP1の一過性発現のみならず、NF−kBの持続的発現を招来すると推察される。
【0036】
細胞死に関しては、3日間培養細胞について、メディウム交換後12時間目に細胞を染色して、蛍光顕微鏡で観察すると、Hoechst33342で染色した場合は、細胞核凝集を示す細胞が認められた。同様に、細胞をpropidium iodideで染色すると、高い染色性を示す細胞が複数観察された。したがって、培養メディウム交換に伴う細胞死には、アポトーシスとネクローシスの両方が関与すると推察される。
【0037】
株化細胞に関しては、初代培養骨芽細胞だけでなく、頭蓋骨由来株化細胞MC3T3−E1についても同様の検討を行ったところ、初代培養細胞の場合と同様に、1日間培養した株化細胞においても、培養メディウム交換により著明な細胞死が誘発された。
したがって、初代培養骨芽細胞だけでなく株化骨芽細胞でも、未成熟な発達段階では培養メディウムをα−MEMからDMEMに交換すると、著明な細胞死が出現することは明らかである。
【0038】
生存因子に関しては、骨芽細胞の生存に必須な物質を、αMEMとDMEM間の組成相違を基に検討した。3日間培養細胞について、交換メディウムDMEM中にピルビン酸やシステインを添加すると、メディウム交換後12時間目でも著明な細胞死が出現しないことが判明した。したがって、ピルビン酸やシステインは骨芽細胞の生存に必須な内在性物質であると類推される。
【0039】
次いで、骨芽細胞生存に必要な外因性物質を探索するために、多価フェノール群(カテキンやテアニンなど)の効果について検索を進めた。
【0040】
まず、緑茶成分カテキンの混合物であるテアフラン90Sについて同様の解析を行ったが、培養0日目及び培養1日目の細胞の場合は、交換メディウムDMEM中にテアフランを添加しても、メディウム交換に伴う骨芽細胞死は著明な影響を受けなかった(図18、図19)。これに対して、3日間培養細胞の場合は100μg/mLテアフラン90S添加の場合に著明な防御効果が観察されたが、より高濃度でもテアフランには細胞死防御作用は見られなかった(図20)。一方、培養7日目の細胞ではメディウム交換に伴う細胞死は元来誘発されなかったが、高濃度のテアフラン90Sを添加したαMEMにメディウムを交換すると、12時間後には殆どの骨芽細胞が死滅することが明らかとなった(図21)。これらの結果は、位相差顕微鏡による観察でも確認された(図22〜図27)。
以上の結果から、混合物であるテアフラン90S中には、未熟骨芽細胞において観察されるメディウム交換に伴う細胞死を防御する物質だけでなく、骨芽細胞死を誘導する物質が含まれることは明らかである。そこで次に、テアフラン90S中の各含有成分それぞれについて、メディウム交換誘発性細胞死に対する影響を検索した。
【0041】
エピカテキン(EC)に関しては、培養0日目から3日目までの細胞では、0.3から300μMまでのエピカテキン添加DMEMにメディウムを交換しても、メディウム交換に伴う細胞死には著明な変化は認められなかった(図28〜図30)。また、7日間培養細胞でも各濃度のエピカテキンは、細胞生存率に著変を与えなかった(図31)。
以上の結果から、エピカテキンは骨芽細胞の成熟度に拘わらず、メディウム交換に伴う細胞死を防御する活性や、或いは細胞死を誘導する活性を持たないと推察される。
【0042】
エピカテキンガレート(ECg)に関しては、培養0日目細胞の場合は、0.4から400μMまでのエピカテキンガレートを添加しても、メディウム交換に伴う細胞死は影響されなかったが(図32)、培養1日目及び3日目の細胞の場合は、メディウム交換による細胞死は40から400μMのエピカテキンガレート添加により阻止された。しかしながら、7日間培養した骨芽細胞では、高濃度(400μM)のエピカテキンガレートを添加したDMEMにメディウム交換すると、12時間後には軽度ではあるが有意な細胞死が招来された。
以上の結果から、エピカテキンガレートは超未熟な骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、強い防御作用を発揮することが判明した。しかしながら、成熟発達段階にある骨芽細胞では、極めて高濃度のエピカテキンガレートは弱い細胞毒性を示す可能性が考えられる。
【0043】
エピガロカテキン(EGC)に関しても、エピカテキンの場合と同様に、培養0日目から3日目までの細胞では、1から1,000μMまでの濃度を添加しても、メディウム交換に伴う細胞死に対する著明な影響を与えなかったが、エピカテキンの場合とは異なり、7日間培養細胞では高濃度のエピガロカテキン添加により、12時間後に殆どの骨芽細胞が死滅した。
以上の結果から、エピガロカテキンは未熟骨芽細胞におけるメディウム交換性細胞死を防御する活性を示さないのに対して、成熟発達段階にある骨芽細胞では極めて高濃度で強い細胞毒性を発揮する可能性が示唆される。
【0044】
エピガロカテキンガレート(EGCg)の場合は、培養0日目の細胞ではメディウム交換による細胞死に対する影響は認められなかったが、1日間培養及び3日間培養の細胞では、100μMでは有意な保護作用を示したのに対して、1,000μMでは有意な保護効果は見られなかった。一方、7日間培養細胞では、1,000μMエピガロカテキンガレート添加により、12時間後には著しい細胞死が誘発された。
以上の結果から、エピガロカテキンガレートは超未熟骨芽細胞におけるメディウム交換誘発性細胞死は防御できないが、未熟骨芽細胞における細胞死に対しては、二相性の防御効果を発揮することが判明した。すわなち、100μMでは強い防御効果を示すのに対して、1000μMではメディウム交換に伴う細胞死に対する保護作用は全く観察されなかった。この原因の一つには、成熟発達段階の骨芽細胞で見られたように、高濃度エピガロカテキンガレート自身の細胞毒性を挙げることができる。
【0045】
他の緑茶成分であるテアニンについてもカテキンと同様の検索を行ったが、何れの条件でも、テアニン10μMから10mMは、初代骨芽細胞の生存率に著明な影響を与えなかった。
したがって、カテキンとは異なり、テアニンにはメディウム交換に伴う骨芽細胞死に対する防御活性はないものと類推される。
【0046】
<考察>
緑茶成分カテキンの中でも、エピカテキンガレートは骨芽細胞の増殖、分化、あるいは成熟過程に対する影響を通じて、骨細胞による骨形成を促進させて、骨組織リモデリングに貢献する可能性が考えられる。この効果は、単に骨折後の回復過程促進だけでなく、骨粗鬆症をはじめとする代謝性骨疾患の症状軽減に臨床医学的意義を持つと類推される。
【図面の簡単な説明】
【図1】培養した骨芽細胞の生存活性の測定手順を示す図である。
【図2】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図3】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図4】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の生存率を経時的に示したグラフである。
【図5】細胞培養メディウムを培養0日目から培養21日目までのαMEMのまま又はDMEMに交換した日における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図6】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図7】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による120分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図8】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による240分後のAP1 DNA結合能の観察結果である。
【図9】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60〜240分後のAP1 DNA結合能の測定結果を示したグラフである。
【図10】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図11】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による120分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図12】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による240分後のNF−κB DNA結合能の観察結果である。
【図13】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)のオートラジオグラフィーを用いたゲル泳動分離による60〜240分後のNF−κB DNA結合能の測定結果を示したグラフである。
【図14】細胞培養メディウムをDMEMに交換した日(培養3日目)の12時間後に骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)をHoechst33342で染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図15】細胞培養メディウムをDMEMに交換した日(培養3日目)の12時間後に骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)をpropidium iodideで染色したものの蛍光顕微鏡写真である。
【図16】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はDMEMに交換した日(培養1日目)における頭蓋骨由来初代培養骨芽細胞及び株化骨芽細胞の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図17】細胞培養メディウムを培養3日目にDMEMに交換する際に各種物質を添加した場合における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図18】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図19】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図20】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図21】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを0〜1000μg/mL添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図22】細胞培養メディウムをαMEMのまま3日間培養した骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来、コントロール)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図23】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを添加しないDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図24】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを100μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図25】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図26】細胞培養メディウムをαMEMのまま7日間培養した骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来、コントロール)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図27】細胞培養メディウムをテアフラン90Sを1000μg/mL添加したDMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の位相差顕微鏡写真である。
【図28】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図29】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図30】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンを0〜300μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図31】細胞培養メディウムをエピカテキンを0〜300μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図32】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図33】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図34】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピカテキンガレートを0〜400μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図35】細胞培養メディウムをエピカテキンガレートを0〜400μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図36】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図37】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図38】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図39】細胞培養メディウムをエピガロカテキンを0〜1000μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図40】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図41】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図42】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図43】細胞培養メディウムをエピガロカテキンガレートを0〜1000μM添加したαMEMに交換した日(培養7日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図44】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養0日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図45】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養1日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
【図46】細胞培養メディウムをαMEMのまま又はテアニンを0〜10000μM添加したDMEMに交換した日(培養3日目)における骨芽細胞(Wistar系新生仔ラット由来)の12時間後の生存率を示したグラフである。
Claims (5)
- カテキンを有効成分として含有する骨形成促進剤。
- カテキン混合物を有効成分として含有する骨形成促進剤。
- 上記のカテキン又はカテキン混合物とは、(−)エピカテキン(EC)、(−)エピガロカテキン(EGC)、(−)エピカテキンガレート(ECg)、(−)エピガロカテキンガレート(EGCg)、(−)カテキン(C)、(−)ガロカテキン(GC)、(−)カテキンガレート(Cg)及び(−)ガロカテキンガレート(GCg)のいずれか、或いはこれらのうちの二種類以上の組合わせからなる混合物である請求項1又は2に記載の骨形成促進剤。
- (−)エピカテキンガレート(ECg)を有効成分とする骨形成促進剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の骨形成促進剤の有効成分を有効成分として含有する骨形成促進飲食物。
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