【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ＭＵＣ１およびケラチン１９のｍＲＮＡの発現量を指標とし、癌転移の有無を判断する医療および臨床検査分野における癌マーカーの検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳癌の手術後化学療法の進展は術後予後の改善をもたらしたが、化学療法は、時に生活の質（ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ：ＱＯＬ）を損ない、２次的悪性腫瘍のリスクを患者に与える。かくして、化学療法による補助治療の前に、正確に再発のリスクを推定することは必須である。
【０００３】
骨は、乳癌にもっとも頻繁に波及（併発）する組織の一つである。骨髄または末梢血の潜在的な癌細胞の検出は、原発癌からの内転移を表すと考えられる。実際、骨髄及び血液における潜在的癌細胞を検出することは乳癌だけでなく大腸癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、そして前立腺癌の初期再発の指標となりうることが報告されてきた。さらに、最近、免疫細胞化学の技術によって骨髄における微小転移の検出は、最も有力な手段と考えられてきた。
【０００４】
癌細胞を検出するために、多くの癌マーカーが報告されているが、そのひとつとして、ムチンが上皮由来の癌マーカーとして注目されている。ムチンは上皮細胞の産生する粘液の主成分であり、セリン、スレオニンの含量が多く、Ｏ−グリコシド結合糖鎖、シアル酸、硫酸基に富むなどの生化学的特徴を有している糖タンパク質であり、ＭＵＣ１からＭＵＣ８まで知られている。なかでもＭＵＣ１は膜貫通型糖タンパク質として存在し、癌細胞とその微小循環を形成している宿主の細胞との相互作用を規定する糖鎖表出分子である。ＭＵＣ１は種々の癌細胞に発現し、癌の増殖、細胞接着さらに転移に関与することが知られている。大腸癌においては、進行度とともにＭＵＣ１の発現量が増加し、さらに原発巣より転移巣において発現量が増加することも報告されている。また、ＭＵＣ１の免疫原性の高く、潰瘍性大腸炎患者の一部において抗ＭＵＣ１抗体陽性者を検出したとの報告（非特許文献１）や乳癌あるいは卵巣癌患者の一部において、ＭＵＣ１と抗ＭＵＣ１抗体の免疫複合体が検出されたと報告がある（非特許文献２）。さらに、肺癌患者の予後の検査のために、ＭＵＣ１を免疫学的手法により検査する方法が特許文献１に開示されている。
【０００５】
ケラチンは、細胞の繊維性骨格を形成するタンパク質の一つで、少なくとも２０個の遺伝子群からなるファミリーを形成する。ケラチン１９などが上皮細胞に特異的に発現する癌マーカーとして知られている。
【０００６】
癌マーカーの検出は、多くは免疫細胞化学技術又はＲＴ−ＰＣＲにより行われる。しかし、癌細胞は１０４〜１０５の骨髄細胞あたり一つ存在する程度であるから、免疫細胞化学技術では感度良く検出することが困難であり、また交差反応が生じる等の技術的困難性の問題があった（非特許文献３および４）。一方、近年では骨髄細胞に散在する癌細胞を検出するため、ＲＴ−ＰＣＲ分析法が多く採用されている。このＲＴ−ＰＣＲ法は高感度であるが、同時に異常遺伝子の偽陽性検出の機会を増長させるという欠点もある。
【０００７】
乳癌患者の進展を判断するために、骨髄細胞での癌マーカーを微小転移の初期の検出で検出することが重要である。定量的な逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法は骨髄細胞における癌細胞を検出するために使われてきた。しかし予後的ファクターとしてのその評価はなお曖昧である。癌の分野では、ＱＯＬ向上のために化学療法剤の投与を必要最小限にし、手術の郭清範囲はできるだけ小さくすることが望ましい。このため、癌転移の有無をより的確かつ迅速に判断するための癌マーカーの選択および検査方法の開発が待たれている。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｈｉｎｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， ３５， １６３−１６８， １９９３
【非特許文献２】
Ｇｏｕｒｅｖｉｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ， ７２， ９３４−９３８， １９９５
【非特許文献３】
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４９， ｐ．２５１０−２５１４ ，１９８９
【非特許文献４】
Ｃａｎｃｅｒ ６３， ｐ．２５０９−２５１４ ，１９８９
【特許文献１】
特開平１１−２３０９６６号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、癌転移のリスクをより的確かつ迅速に行うための検査方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、乳癌患者の骨髄における癌マーカーの発現に着目し、鋭意研究を重ねた結果、癌関連表面抗原および組織結合分子、特にＭＵＣ１およびケラチン１９の各ｍＲＮＡ発現レベルを定量し、総合的に発現量を検査することが、乳癌の初期再発を予知するための有力な手段であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、
１．癌関連表面抗原および組織結合分子のｍＲＮＡ発現量を測定し、各発現量を癌の初期再発および／または転移のリスクマーカーとすることを特徴とする癌マーカー検査方法、
２．ＭＵＣ１ｍＲＮＡおよびケラチン１９ｍＲＮＡの発現量を測定し、各発現量を癌の初期再発および／または転移のリスクマーカーとすることを特徴とする癌マーカー検査方法、
３．ＭＵＣ１ｍＲＮＡおよびケラチン１９ｍＲＮＡの発現量をスコア化し、総合したスコア値が少なくとも３以上の場合に癌の初期再発および／または転移のリスクを判断する前項２に記載の検査方法、
４．ＭＵＣ１ｍＲＮＡおよびケラチン１９ｍＲＮＡの発現量をスコア化し、いずれのスコア値も少なくとも２以上の場合に癌の初期再発および／または転移のリスクを判断する前項２または３に記載の検査方法、
５．骨髄細胞中および／または末梢血中のＭＵＣ１ｍＲＮＡおよびケラチン１９ｍＲＮＡの発現量を測定する前項２〜４のいずれか１に記載の検査方法、
６．核酸増幅方法により測定する前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法、
７．転移する癌が乳癌である前項１〜５のいずれか１に記載の検査方法。
８．前項１〜７のいずれか１に記載の検査方法に使用する試薬または検査用試薬キット、からなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、乳癌の患者の転移に関する癌マーカー、癌関連表面抗原および組織結合分子、特にＭＵＣ１およびケラチン１９のｍＲＮＡの発現レベルを定量し、癌の初期再発および／または転移のリスクを判断する方法に関する。健康成人の測定は、転移判断のためのカットオフ値決定のために行う。各マーカーの発現レベルをスコア化して分析し、臨床データと比較する。その結果、本発明の方法は、乳癌の初期再発および／または転移のリスクを予知するための有力な手段となる。以下、その内容について詳細に説明する。
【００１３】
本発明において、癌の初期再発とは治癒切除後６ヶ月での乳癌の再発をいい、転移とは、癌が最初に発生した部位（原発巣）を離れ、他の臓器へ移行し、そこに癌を生じることをいう。
【００１４】
ＭＵＣ１およびケラチン１９のｍＲＮＡの発現レベルの検査は核酸増幅方法により行うことができる。核酸増幅方法は、自体公知の方法を採用することができる。例えば、ＰＣＲ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０：１３５０−１３５４，１９８５）やＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ 法、Ｎａｔｕｒｅ， ３５０，９１−９２，１９９１、特許第 ２６４８８０２号公報および特許第 ２６５０１５９号公報記載）およびＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｉｔｏｎ ｏｆ ＤＮＡ増幅法、国際公開ＷＯ００／２８０８２号公報）などの核酸増幅方法を採用することができる。
【００１５】
（測定試料）
測定試料としては、癌転移を反映しうる生体組織または生体組織を使用することができる。具体的には、骨髄、末梢血などが例示される。例えば骨髄は、術後の背腹上部腸骨窩脊椎から吸引して得たものを用いることができ、末梢血は採血により得ることができる。
【００１６】
骨髄は、最も頻繁に乳癌と併発する組織の一つである。骨髄又は末梢血の潜在的な癌細胞の検出は、原発癌からの内転移を示すと考えられる。実際、骨髄及び血液における潜在的癌細胞の検出は乳癌だけでなく大腸癌、肺癌、腎臓癌、神経芽腫、そして前立腺癌の初期再発の好適な癌マーカーとして役立つことが報告されてきた。
【００１７】
骨髄または末梢血についての測定試料は、通常の方法により調製することができる。具体的には次のようにして調製することができるが、これらの方法に限定されるものでないことは明らかである。
骨髄は、骨髄サンプルをヘパリン化骨髄の約６ｍｌを皮膚切開により背腹上部腸骨窩脊椎から吸引し、単核細胞はフィコール・コンレイ勾配を使った密度遠心法によって集めることができる。集めた細胞を燐酸緩衝液等の緩衝液を用いて約２回程度洗浄し、細胞ペレットとする。該細胞ペレットはＲＮＡ抽出溶出緩衝液（ＩＳＯＧＥＮ、Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）で溶解し、使用まで−７０℃で保存する。
末梢血についても同様に処理し、ＲＮＡ抽出用緩衝液で溶解して、ＲＮＡを抽出することができる。
【００１８】
（癌マーカーの測定）
ＭＵＣ１およびケラチン１９のｍＲＮＡのレベルを定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により確認することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＲＮＡを逆転写酵素によりｃＤＮＡとしたのちに、ＰＣＲで増幅する方法である（臨床検査法提要，第３１版，ｐ．１３１４ （１９９８年発行））。本方法により測定する場合には、核酸増幅用プライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）、各ｄＮＴＰ、逆転写酵素等が試薬として用いられる。癌マーカーであるＭＵＣ１およびケラチン１９のＤＮＡ増幅用プライマーは、公知のプライマーおよび今後開発されるプライマーから適宜選択して使用することができる。また、サンプル中の癌マーカー量を正確に判断するために、通常組織中に恒常的に含まれる物質、例えばβ−アクチンやＧＡＰＤＨなどのｍＲＮＡ量を内部コントロールとして測定し、これらの内部コントロール量との相対比較により癌マーカー量を決定することができる。
癌マーカー量の測定は、ＰＣＲ測定において通常採用されている方法、例えば競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲ法やリアルタイムＰＣＲ法を採用することができる（臨床検査法提要，第３１版，ｐ．１３１７〜１３１８ （１９９８年発行））。
【００１９】
（スコア化）
本発明においてスコア化は、次のように定義づけられる。
健常人および乳癌の患者についてＭＵＣ１／β−アクチンおよびケラチン１９／β−アクチンを癌マーカーとして各々測定し、各癌マーカーについてカットオフ値を決定する。
【００２０】
ＭＵＣ１／β−アクチンおよびケラチン１９／β−アクチンの両マーカーがカットオフ値以下を組み合わせスコア２、どちらか一方がカットオフ値以上１００倍未満でもう一方がカットオフ値以下を組み合わせスコア３、どちらか一方がカットオフ値の１００倍以上でかつもう一方がカットオフ値以下、あるいは両方がカットオフ値以上１００倍未満の場合を組み合わせスコア４、どちらか一方がカットオフ値以上１００倍未満で、もう一方が１００倍以上の場合を組み合わせスコア５、両方とも１００倍以上の場合を組み合わせスコア６とする。
【００２１】
本発明では、スコア３〜６の場合に癌の転移リスクが高いと判断でき、一方のマーカーが１であって他のマーカーが２以上の場合でも癌の初期再発および／または転移のリスクが高いと判断できるが、特に両マーカーが２以上のスコア４〜６の場合に該リスクがより高いと判断することができる（図１参照）。
【００２２】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のマーカーの検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、核酸増幅に必要な各種のオリゴヌクレオチド、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類で少なくとも２以上を含むキットが提供される。本発明は、本発明の方法に使用される単品からなる測定用試薬および２以上の試薬を含む測定用試薬キットに及ぶ。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例１】
ＭＵＣ１およびケラチン１９をＲＴ−ＰＣＲ法により測定した。ＭＵＣ１およびケラチン１９のｍＲＮＡの発現量を求めるにあたり、β−アクチンのｍＲＮＡの発現量を基準としてβ−アクチンの発現量に対する割合でもとめた。
【００２５】
（プライマーの調製）
ＭＵＣ１、ケラチン１９およびβ−アクチンのｍＲＮＡを増幅、検出するためのプライマーおよび検出のためのプローブとして、公知の以下の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。
【００２６】
ＭＵＣ１測定用：
フォワードプライマー：５−ＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴ−３（配列番号１）
リバースプライマー：５−ＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＡＧＣＣＧＡＡＧＴＣ−３（配列番号２）
検出プローブ：５−ＣＡＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＣＡＴ−３（配列番号３）
【００２７】
ケラチン１９：
フォワードプライマー：５−ＡＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＣＧＡＣＣＡＴＣＣＡ−３（配列番号４）
リバースプライマー：５−ＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧ−３（配列番号５）
検出プローブ：５−ＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＡＧＣＴＴ−３（配列番号６）
【００２８】
β−アクチン：
フォワードプライマー：５−ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ−３（配列番号７）
リバースプライマー：５−ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ−３（配列番号８）
検出プローブ：５−ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴ−３（配列番号９）
【００２９】
（試料の調製）
約６ｍＬの骨髄液を採取し、骨髄細胞をフィコール−コンレイの密度勾配遠心分離によって集めた。集めた細胞から日本ジーン社製のＲＮＡ抽出用緩衝液（ＩＳＯＧＥＮ）を用いてＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡの３μｇを以下に示す組成の反応液中で３７℃で７０分間反応させ、その後９５℃で５分間加熱し、その後冷却してリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＴ法により分析した。
【００３０】
（細胞を用いた測定）
ＭＵＣ１とケラチン１９の両方を発現している人***癌ＭＣＦ−７細胞を陽性コントロールとして使用した。ＭＣＦ−７細胞は、１０％加熱不活化ウシ胎児血清を加えた、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地を用いて、３７℃で５％ＣＯ２インキュベータ中で、培養した。ＭＵＣ１もケラチン１９も発現していない人のバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞を陰性コントロールとして使用した。
【００３１】
（リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＴ法による分析）
１）１μＬの１本鎖ｃＤＮＡ、１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液（３．５ｍＭ塩化マグネシウム、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＵＴＰ、５単位のＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧ、０．５μＭの各プライマー及び１μＭのＴａｑＭａｎプローブを含む）の反応混合物５０μＬを用いて定量的ＰＣＲを行なった。
２）５０℃で２分間インキュベーション後、９５℃で１０分間ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄの活性化を行なった。
３）６０℃、１分間のアニーリングと延伸反応、９５℃１５秒間の変性のサイクルを４０サイクル行ない、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００の配列検出システムで解析した。
【００３２】
【参考例１】
（臨床例）臨床例での骨髄細胞でのＭＵＣ１とケラチン１９のｍＲＮＡの発現
検査は慈恵医大及び川口市立医療センターで、各機関の倫理委員会のガイドラインにそって行われた。
【００３３】
ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩの原発性乳癌と診断され、手術を受けた３４患者について検査を行った。年齢は２８〜８３歳で、平均５３．４歳であった。ステージングは、抗癌国際ユニオン（ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ）のｐＴＮＭシステム（１９９７）に従った。これら患者のフォローアップ期間は平均４５ヶ月（４０〜４８ヶ月）であった。健常人については、移植のための骨髄ドナーの健康成人ボランティア１０名からインフォームドコンセントを得て、試料を取得した。
全ＲＮＡは、単核細胞から抽出した。そして、β−アクチン、ＭＵＣ１、及びケラチン１９のｍＲＮＡの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲで定量した。
本発明において定義された発現スコアの合計を総合発現スコアとし、それが評価の基礎として使用された。
【００３４】
その結果、健康な成人ボランティアの骨髄細胞中のＭＵＣ１／β−アクチン及びケラチン１９／β−アクチンのｍＲＮＡはそれぞれ１．１×１０−４、１．０×１０−７であった。一方乳癌患者ではＭＵＣ１／β―アクチンは６．２×１０−２±２．２×１０−２、ケラチン１９／β−アクチンは４．８×１０−２±１．９×１０−２であった。上記結果により、ＭＵＣ１／β−アクチンのカットオフ値を６．１×１０−４とし、ケラチン１９／β−アクチンのカットオフ値を７．３×１０−７と設定した。
【００３５】
【参考例２】
３４名の乳癌患者について各マーカーの検査を行い、本発明におけるスコアと転移の状況について関係を調べた。その結果を図１に示した。尚、図１に示す領域の内、いずれのマーカーもカットオフ値以下の場合は白い背景で表し、いずれか一方のマーカーはカットオフ値以下であるが、他方のマーカーがカットオフ値以上を示す場合は薄い灰色で表し、いずれのマーカーもカットオフ値以上の場合は濃い灰色で表した。
【００３６】
本処置が行われた期間は、４５ヶ月間であった。遠隔に転移を認めなかった患者は２５名で、そのうち１１名（４４％）は組み合わせスコアが２であった。１４名の患者（５６％）は、組み合わせスコアが３〜６であり、５名（３６％）は、両マーカーがカットオフ値以上であった。
一方、転移を認めた患者９名中８名は（８９％）は組み合わせスコア３〜６であり、組み合わせスコア２の患者は１名（１１％）であり、２名（２２％）は、両マーカーがカットオフ値以上であった。
【００３７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のマーカー検査方法によりＭＵＣ１及びケラチン１９のｍＲＮＡの発現量を組み合わせて検査し、得られたスコア値から、癌の初期再発および／または転移のリスクおよび度合いが有効に判断できることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】３４名の乳癌患者について各マーカーの検査をしたときの両マーカーの組合せスコアを示す図である。（参考例２）
【符号の説明】
▲２▼ 組合せスコア２の領域
▲３▼ 組合せスコア３の領域
▲４▼ 組合せスコア４の領域
▲５▼ 組合せスコア５の領域
▲６▼ 組合せスコア６の領域
【配列表】
[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for examining a cancer marker in the medical and clinical examination fields for determining the presence or absence of cancer metastasis using the expression levels of MUC1 and keratin 19 mRNA as an index.
[0002]
[Prior art]
Although the development of postoperative chemotherapy for breast cancer has led to improved postoperative prognosis, chemotherapy sometimes impairs quality of life (QOL) and presents patients with a risk of secondary malignancy. Thus, it is essential to accurately estimate the risk of recurrence before adjuvant chemotherapy.
[0003]
Bone is one of the most frequent spreads (complications) of breast cancer. Detection of potential cancer cells in the bone marrow or peripheral blood is considered to represent metastasis from the primary cancer. In fact, it has been reported that detecting potential cancer cells in bone marrow and blood can be an indicator of the early recurrence of breast, but also colon, lung, kidney, neuroblastoma, and prostate cancer. Furthermore, detection of micrometastases in the bone marrow by immunocytochemistry techniques has recently been considered the most powerful means.
[0004]
Many cancer markers have been reported for detecting cancer cells, and as one of them, mucin has attracted attention as a cancer marker derived from the epithelium. Mucin is a major component of mucus produced by epithelial cells, is a glycoprotein that has a high content of serine and threonine, and has biochemical characteristics such as rich in O-glycoside-linked sugar chains, sialic acid, and sulfate groups. Yes, known from MUC1 to MUC8. Above all, MUC1 exists as a transmembrane glycoprotein and is a sugar chain-expressing molecule that regulates the interaction between cancer cells and host cells that form their microcirculation. MUC1 is expressed in various cancer cells and is known to be involved in cancer growth, cell adhesion and metastasis. In colorectal cancer, it has been reported that the expression level of MUC1 increases with the degree of progression, and that the expression level increases in metastatic foci than in primary foci. In addition, it has been reported that MUC1 has high immunogenicity and that anti-MUC1 antibody-positive persons were detected in some patients with ulcerative colitis (Non-patent Document 1). There is a report that an immune complex of the MUC1 antibody was detected (Non-Patent Document 2). Further, Patent Literature 1 discloses a method of testing MUC1 by an immunological technique for testing the prognosis of a lung cancer patient.
[0005]
Keratin is one of the proteins that form the fibrous skeleton of cells, forming a family of at least 20 genes. Keratin 19 and the like are known as cancer markers specifically expressed in epithelial cells.
[0006]
Detection of cancer markers is often performed by immunocytochemical techniques or RT-PCR. However, since there is only one cancer cell per 10 4 to 10 5 bone marrow cells, it is difficult to detect it with high sensitivity by immunocytochemical technology, and there are technical difficulties such as cross-reaction. There was a problem (Non-Patent Documents 3 and 4). On the other hand, in recent years, in order to detect cancer cells scattered in bone marrow cells, an RT-PCR analysis method is often used. Although this RT-PCR method is highly sensitive, it also has the disadvantage of increasing the chance of false positive detection of an abnormal gene.
[0007]
It is important to detect cancer markers in bone marrow cells by early detection of micrometastasis to determine the progress of breast cancer patients. Quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) has been used to detect cancer cells in bone marrow cells. However, its evaluation as a prognostic factor is still ambiguous. In the field of cancer, it is desirable to minimize the administration of chemotherapeutic agents to improve QOL and to minimize the surgical dissection area. Therefore, the development of a method of selecting a cancer marker and developing a test method for more accurately and promptly determining the presence or absence of cancer metastasis has been awaited.
[0008]
[Non-patent document 1]
Hinode et al. , Immunol. Lett. , 35, 163-168, 1993.
[Non-patent document 2]
Gourwich et al. , Br. J. Cancer, 72, 934-938, 1995.
[Non-Patent Document 3]
Cancer Res. 49, p. 2510-2514, 1989
[Non-patent document 4]
Cancer 63, p. 2509-2514, 1989
[Patent Document 1]
JP-A-11-230966
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a test method for performing the risk of cancer metastasis more accurately and promptly.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors focused on the expression of cancer markers in the bone marrow of breast cancer patients, and as a result of intensive studies, quantified the mRNA expression levels of cancer-associated surface antigens and tissue-binding molecules, particularly MUC1 and keratin 19, and Investigation of the expression level was found to be a powerful means for predicting the early recurrence of breast cancer, and the present invention was completed.
[0011]
That is, the present invention
1. A cancer marker test method comprising measuring mRNA expression levels of a cancer-associated surface antigen and a tissue-binding molecule, and using each expression level as a risk marker for early recurrence and / or metastasis of cancer,
2. A method for testing a cancer marker, comprising measuring the expression levels of MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA, and using each expression level as a risk marker for early recurrence and / or metastasis of cancer;
3. The test method according to the preceding item 2, wherein the expression levels of MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA are scored, and the risk of early recurrence and / or metastasis of cancer is determined when the total score is at least 3 or more,
4. The test method according to the above item 2 or 3, wherein the expression levels of MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA are scored, and the risk of early recurrence and / or metastasis of cancer is determined when any score value is at least 2 or more,
5. The test method according to any one of Items 2 to 4, wherein the expression levels of MUC1 mRNA and keratin 19 mRNA in bone marrow cells and / or peripheral blood are measured.
6. The test method according to any one of Items 1 to 5, which is performed by a nucleic acid amplification method
7. The test method according to any one of Items 1 to 5, wherein the metastatic cancer is breast cancer.
8. 7. A reagent or a test reagent kit used in the test method according to any one of the above items 1 to 7.
[0012]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention provides a method for quantifying the expression levels of cancer markers, cancer-associated surface antigens and tissue-binding molecules, particularly mRNAs of MUC1 and keratin 19, for metastasis of breast cancer patients, and determining the risk of early recurrence and / or metastasis of cancer. About. The measurement of healthy adults is performed to determine a cut-off value for determining metastasis. The expression level of each marker is scored and analyzed and compared with clinical data. As a result, the method of the present invention is a powerful tool for predicting the risk of early recurrence and / or metastasis of breast cancer. Hereinafter, the contents will be described in detail.
[0013]
In the present invention, the initial recurrence of cancer refers to the recurrence of breast cancer 6 months after curative resection, and the metastasis leaves the site (primary lesion) where the cancer first occurred, and migrates to other organs. Refers to causing cancer.
[0014]
Examination of the expression levels of MUC1 and keratin 19 mRNA can be performed by a nucleic acid amplification method. As the nucleic acid amplification method, a method known per se can be adopted. For example, a PCR method (Science, 230: 1350-1354, 1985), a NASBA method (Nucleic Acid Sequence Based Amplification method, Nature, 350, 91-92, 1991, Patent Nos. 2648802 and 2650159) and the like. A nucleic acid amplification method such as a LAMP method (Loop-measured isothermal amplification of DNA amplification method, International Publication WO00 / 28082) can be employed.
[0015]
(Measurement sample)
As a measurement sample, a living tissue or a living tissue that can reflect cancer metastasis can be used. Specifically, bone marrow, peripheral blood and the like are exemplified. For example, bone marrow can be obtained by aspiration from the post-abdominal upper iliac vertebra spine, and peripheral blood can be obtained by blood sampling.
[0016]
Bone marrow is one of the tissues most frequently associated with breast cancer. Detection of potential cancer cells in the bone marrow or peripheral blood would be indicative of metastasis from the primary cancer. In fact, detection of potential cancer cells in bone marrow and blood has been reported to serve as a suitable cancer marker for the early recurrence of breast, but also colon, lung, kidney, neuroblastoma, and prostate cancers.
[0017]
A measurement sample for bone marrow or peripheral blood can be prepared by an ordinary method. Specifically, it can be prepared as follows, but it is apparent that the method is not limited to these methods.
Bone marrow can be obtained by aspirating a bone marrow sample from the dorso-abdominal upper iliac spine with a skin incision of approximately 6 ml of heparinized bone marrow, and mononuclear cells can be collected by density centrifugation using a Ficoll-Conley gradient. The collected cells are washed about twice using a buffer such as a phosphate buffer to obtain a cell pellet. The cell pellet is lysed in RNA extraction and elution buffer (ISOGEN, Nippongene) and stored at -70 ° C until use.
Peripheral blood can be treated in the same manner and dissolved in an RNA extraction buffer to extract RNA.
[0018]
(Measurement of cancer markers)
The levels of MUC1 and keratin 19 mRNA can be confirmed by quantitative RT-PCR. The RT-PCR method is a method in which RNA is converted into cDNA using reverse transcriptase and then amplified by PCR (Procedure of Clinical Testing Methods, 31st Edition, p. 1314 (1998)). When measuring by this method, a nucleic acid amplification primer (forward primer, reverse primer), each dNTP, reverse transcriptase, etc. are used as reagents. Primers for DNA amplification of MUC1 and keratin 19, which are cancer markers, can be appropriately selected from known primers and primers to be developed in the future. In addition, in order to accurately determine the amount of a cancer marker in a sample, a substance normally contained in a normal tissue, for example, the amount of mRNA such as β-actin or GAPDH is measured as an internal control. The amount of a cancer marker can be determined by relative comparison of
For the measurement of the amount of the cancer marker, a method usually employed in PCR measurement, for example, a competitive RT-PCR method or a real-time PCR method can be adopted (Clinical Examination Method Proposal, 31st edition, p. 1317- 1318 (issued in 1998)).
[0019]
(Scoring)
In the present invention, scoring is defined as follows.
MUC1 / β-actin and keratin 19 / β-actin are measured as cancer markers in healthy individuals and patients with breast cancer, respectively, and cut-off values are determined for each cancer marker.
[0020]
Score 2 when MUC1 / β-actin and keratin 19 / β-actin markers are combined at or below the cutoff value, and score 2 when one of the markers is at or above the cutoff value and less than 100-fold and the other is at or below the cutoff value. One of the cut-off values is 100 times or more and the other is not more than the cut-off value, or both are not more than the cut-off value and less than 100 times. The combination score is 5 when the other is 100 times or more, and the combination score is 6 when both are 100 times or more.
[0021]
In the present invention, when the score is 3 to 6, the risk of cancer metastasis can be determined to be high. Even when one marker is 1 and the other marker is 2 or more, the risk of early recurrence and / or metastasis of cancer is high. The risk can be determined to be higher especially when both markers have a score of 4 to 6 of 2 or more (see FIG. 1).
[0022]
(Reagents, reagent kits, etc.)
Various reagents necessary for detecting the marker of the present invention can be packaged in advance and made into a kit. Specifically, various oligonucleotides required for nucleic acid amplification, dNTP as a substrate for complementary strand synthesis, a DNA polymerase for performing strand displacement-type complementary strand synthesis, a buffer for providing suitable conditions for enzymatic reaction, and Accordingly, there is provided a kit containing at least two or more reagents necessary for detecting a reaction product. The present invention extends to a single measurement reagent and a measurement reagent kit containing two or more reagents used in the method of the present invention.
[0023]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0024]
Embodiment 1
MUC1 and keratin 19 were measured by RT-PCR. In determining the expression levels of MUC1 and keratin 19 mRNA, the expression level of β-actin mRNA was determined based on the expression level of β-actin mRNA.
[0025]
(Preparation of primer)
As a primer for amplifying and detecting mRNA of MUC1, keratin 19 and β-actin, and a probe for detection, oligonucleotides having the following known sequences were used.
[0026]
For MUC1 measurement:
Forward primer: 5-CACCCAGCTCTCCTTTCTTCCT-3 (SEQ ID NO: 1)
Reverse primer: 5-TTCTCTGGGGTAGCCGAAGTC-3 (SEQ ID NO: 2)
Detection probe: 5-CAGTTGTTACAGGTTCTGGCTATGCAT-3 (SEQ ID NO: 3)
[0027]
Keratin 19:
Forward primer: 5-AGCCACTACTACTACACGACCATCCA-3 (SEQ ID NO: 4)
Reverse primer: 5-CCTCATGGTCTCTTCTCAGG-3 (SEQ ID NO: 5)
Detection probe: 5-CAGATCGAAGGCCTGAAGGAAGAGCTT-3 (SEQ ID NO: 6)
[0028]
β-actin:
Forward primer: 5-TCACCCACACTGTGCCCCATCTACGA-3 (SEQ ID NO: 7)
Reverse primer: 5-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3 (SEQ ID NO: 8)
Detection Probe: 5-ATGCCCTCCCCCCATGCCATCCTGGCGT-3 (SEQ ID NO: 9)
[0029]
(Sample preparation)
About 6 mL of bone marrow fluid was collected and bone marrow cells were collected by Ficoll-Conley density gradient centrifugation. RNA was extracted from the collected cells using an RNA extraction buffer (ISOGEN) manufactured by Nippon Gene. 3 μg of the extracted RNA was reacted at 37 ° C. for 70 minutes in a reaction solution having the following composition, then heated at 95 ° C. for 5 minutes, cooled, and analyzed by a real-time quantitative RT-PCT method.
[0030]
(Measurement using cells)
Human breast cancer MCF-7 cells expressing both MUC1 and keratin 19 were used as a positive control. MCF-7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal calf serum at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. Burkitt's lymphoma Daudi cells from a person who did not express MUC1 or keratin 19 were used as a negative control.
[0031]
(Analysis by real-time quantitative RT-PCT method)
1) 1 μL of single-stranded cDNA, 1.25 units of Taq polymerase, PCR buffer (3.5 mM magnesium chloride, 200 μM each of dATP, dCTP, dGTP and dUTP, 5 units of AmpErase UNG, 0.5 μM of each primer And 1 μM of the TaqMan probe) were used to perform quantitative PCR.
2) After incubation at 50 ° C for 2 minutes, activation of AmpliTaq Gold was performed at 95 ° C for 10 minutes.
3) 40 cycles of annealing and extension reaction at 60 ° C. for 1 minute and denaturation at 95 ° C. for 15 seconds were performed, and analyzed by ABI PRISM 7700 sequence detection system.
[0032]
[Reference Example 1]
(Clinical Example) In the clinical example, the mRNA expression test of MUC1 and keratin 19 in bone marrow cells was performed at Jikei University and Kawaguchi City Medical Center according to the guidelines of the ethics committee of each institution.
[0033]
Testing was performed on 34 patients who were diagnosed with stage I, II, III primary breast cancer and had surgery. The ages ranged from 28 to 83, with an average of 53.4. Staging was in accordance with the pTNM system of the International Union Against Cancer (1997). The follow-up period for these patients averaged 45 months (40-48 months). For healthy individuals, informed consent was obtained from 10 healthy adult volunteers of bone marrow donors for transplantation, and samples were obtained.
Total RNA was extracted from mononuclear cells. Then, the expression levels of β-actin, MUC1, and keratin 19 mRNA were quantified by RT-PCR.
The sum of the expression scores defined in the present invention was taken as the overall expression score, which was used as the basis for the evaluation.
[0034]
As a result, the mRNAs of MUC1 / β-actin and keratin 19 / β-actin in bone marrow cells of healthy adult volunteers were 1.1 × 10 −4 and 1.0 × 10 −7 , respectively. On the other hand, in a breast cancer patient, MUC1 / β-actin was 6.2 × 10 −2 ± 2.2 × 10 −2 , and keratin 19 / β-actin was 4.8 × 10 −2 ± 1.9 × 10 −2. Was. Based on the above results, the cutoff value of MUC1 / β-actin was set to 6.1 × 10 −4, and the cutoff value of keratin 19 / β-actin was set to 7.3 × 10 −7 .
[0035]
[Reference Example 2]
Each marker was examined for 34 breast cancer patients, and the relationship between the score of the present invention and the state of metastasis was examined. The result is shown in FIG. In the region shown in FIG. 1, when any of the markers is below the cutoff value, it is represented by a white background, and one of the markers is below the cutoff value, while the other is above the cutoff value. Cases are shown in light gray, and all markers are shown in dark gray when they are above the cutoff value.
[0036]
The duration of this treatment was 45 months. Twenty-five patients had no distant metastases, of which 11 (44%) had a combined score of 2. Fourteen patients (56%) had a combined score of 3-6, and five (36%) had both markers above cutoff.
On the other hand, 8 out of 9 patients who showed metastasis (89%) had a combination score of 3 to 6, 1 patient had a combination score of 2 (11%), and 2 (22%) had a combination score of 2 The marker was above the cutoff value.
[0037]
【The invention's effect】
As described above, the expression levels of MUC1 and keratin 19 mRNA are tested in combination by the marker test method of the present invention, and the risk and degree of early recurrence and / or metastasis of cancer are effectively determined from the obtained score values. I knew I could do it.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a combined score of both markers when each marker was examined for 34 breast cancer patients. (Reference Example 2)
[Explanation of symbols]
(2) Area of combination score 2 (3) Area of combination score 3 (4) Area of combination score 4 (5) Area of combination score 5 (6) Area of combination score 6 [Sequence Table]
