JP2004141159A - Hybridization assay of nucleic acid amplification product by utilizing nucleic acid precipitant - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸沈澱剤を利用した核酸増幅産物のハイブリダイゼーションアッセイに関する。より詳細には、標的配列をLAMP増幅して得られるインバーテッドリピート構造を有する核酸の核酸沈澱剤を利用したハイブリダイゼーションアッセイに関する。 The present invention relates to a nucleic acid amplification product hybridization assay using a nucleic acid precipitant. More specifically, the present invention relates to a hybridization assay using a nucleic acid precipitant for a nucleic acid having an inverted repeat structure obtained by subjecting a target sequence to LAMP amplification.
核酸のハイブリダイゼーションアッセイは、サザンブロッティング法から、遺伝子チップやアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ法にいたるまで、様々な方法が開発されている。特に、固相担体を用いない液相でのハイブリダイゼーションアッセイでは、標的配列と標識プローブの結合物（Ｂ）を遊離の標識プローブ（Ｆ）と分離する「B/F分離」が不可欠となる。 Various methods have been developed for nucleic acid hybridization assays, from Southern blotting to gene chips, arrays, and RT-PCR. In particular, in a hybridization assay in a liquid phase without using a solid phase carrier, "B / F separation" for separating a conjugate (B) of a target sequence and a labeled probe from a free labeled probe (F) is indispensable.
こうしたB/F分離剤として、従来ハイドロキシアパタイトを用いる方法が知られている。ハイドロキシアパタイトは、適当な条件下では二本鎖核酸のみを選択的に吸着することができる不溶性物質である。したがって、標的配列と標識プローブがハイブリダイズした二本鎖核酸をハイドロキシアパタイトに吸着・沈澱させ、遊離の標識プローブと分離した後、沈澱中の標識を指標として標的配列を検出することができる。この方法は、ニトロセルロースやナイロンメンブレン上に標的配列を固定し、標識プローブとハイブリダイズさせる古典的な方法と比べて、液相で反応が行われるため迅速に反応が進み、多検体の処理や処理の自動化に向いているという利点がある（例えば、特許文献１参照）。 方法 Conventionally, a method using hydroxyapatite as such a B / F separating agent is known. Hydroxyapatite is an insoluble substance that can selectively adsorb only double-stranded nucleic acids under appropriate conditions. Therefore, the double-stranded nucleic acid in which the target sequence and the labeled probe are hybridized is adsorbed and precipitated on hydroxyapatite, separated from the free labeled probe, and the target sequence can be detected using the label in the precipitate as an index. In this method, compared to the classical method of immobilizing the target sequence on nitrocellulose or nylon membrane and hybridizing with a labeled probe, the reaction is performed in the liquid phase, so that the reaction proceeds quickly, and processing of multiple samples and There is an advantage that it is suitable for automatic processing (for example, see Patent Document 1).
一方、ハイドロキシアパタイトは、核酸の鎖長が長いほど吸着しやすく、鎖長が短いほど吸着しにくいという特徴を有している。すなわち、検出対象のゲノムから調製した鎖長の長い核酸を標的配列として、鎖長の短い標識プローブにより検出を行った場合には良好な分離が得られるが、鎖長が短い核酸を標的核酸とした場合には、ハイドロキシアパタイトに対する標的配列と標識プローブの結合物の吸着量が少なく、分離能の低下とともに、検出感度も低下してしまう。 On the other hand, hydroxyapatite has the characteristic that the longer the nucleic acid chain length, the easier it is to adsorb, and the shorter the chain length, the more difficult it is to adsorb. In other words, when a long nucleic acid prepared from the genome to be detected is used as a target sequence and detection is performed with a labeled probe having a short chain length, good separation can be obtained, but the nucleic acid having a short chain length is regarded as a target nucleic acid. In this case, the amount of the adsorbed substance of the target sequence and the labeled probe to hydroxyapatite is small, so that the separation sensitivity is lowered and the detection sensitivity is also lowered.
近年、PCR等の核酸増幅法が普及し、微量の標的核酸もハイブリダイゼーションアッセイによらずに直接検出することが可能になった。そのため、検出対象が限定される、ハイドロキシアパタイトを用いたハイブリダイゼーションアッセイはあまり行われていない。 In recent years, nucleic acid amplification methods such as PCR have become widespread, and it has become possible to directly detect minute amounts of target nucleic acids without using a hybridization assay. For this reason, hybridization assays using hydroxyapatite, in which the detection target is limited, are rarely performed.
他方、ハイドロキシアパタイトとは別に、各種の塩基性ポリマーが核酸の共沈剤として知られている。代表的なものとしては、ポリエチレンイミン、ポリ-L-リジン、及び硫酸プロタミン等があげられる。しかし、これらの物質は核酸の存在下に沈澱を形成するが、その沈澱は非常に粘稠で取り扱いが困難なため、酵素の精製の際の核酸除去剤として実用化されているにすぎない（例えば、特許文献２及び３参照）。
On the other hand, apart from hydroxyapatite, various basic polymers are known as coprecipitants for nucleic acids. Representative examples include polyethyleneimine, poly-L-lysine, and protamine sulfate. However, these substances form a precipitate in the presence of a nucleic acid, but the precipitate is very viscous and difficult to handle, so that it is only practically used as a nucleic acid removing agent in the purification of an enzyme ( For example, refer to
ところで、発明者らは、PCR法で不可欠とされる複雑な温度制御を必要としない新しい核酸増幅法：LAMP法（Loop-mediated isothermal amplification）の開発に成功している（例えば、特許文献４及び非特許文献１参照）。LAMP法では、特有のプライマーを用いることで、同一鎖上末端に互いに相補的な配列を有する増幅産物が生成する。生成した増幅産物は、相補的配列間のアニールによって形成されるループを起点とした伸長反応と、このループにアニールする別なプライマー（ループプライマー）による伸長反応によって、インバーテッドリピート構造（同一鎖上に互いに相補的な配列が繰り返し含まれる構造）を有する長鎖の増幅産物を生成する。発明者らは、このLAMP法の高い増幅効率を利用して、目視（濁度）による遺伝子の検出方法等（例えば、非特許文献２参照）を報告している。しかしながら、これまでLAMP産物の液相でのハイブリダイゼーションアッセイに関する報告は少なく、またそれらは核酸沈澱剤を用いたものではない。
本発明は、液相ハイブリダイゼーションアッセイにおけるB/F分離の問題を解決し、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出しうる核酸検出方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the problem of B / F separation in a liquid-phase hybridization assay and to provide a nucleic acid detection method capable of detecting a trace amount of a target to be detected with high sensitivity and ease regardless of its chain length. .
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、標的配列のLAMP増幅で得られるような、インバーテッドリピート構造を有する核酸は、核酸沈澱剤と吸着しやすく、遊離の短鎖核酸プローブと良好に分離されることを見出した。そして、この方法を利用すれば微量検体の高感度な検出や、多検体の同時検出が可能であることを見出し、本発明を完成させた。 The present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, as obtained by LAMP amplification of a target sequence, a nucleic acid having an inverted repeat structure is easily adsorbed with a nucleic acid precipitant and a free short nucleic acid probe. And good separation. The inventors have found that the use of this method enables highly sensitive detection of a small amount of a sample and simultaneous detection of multiple samples, thereby completing the present invention.
すなわち、本発明は、標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸に、該標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせ、生成したハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成させることにより、前記インバーテッドリピート構造を有する核酸と遊離の核酸プローブを分離することを特徴とする、ハイブリダイゼーションアッセイに関する。
本発明のアッセイでは、凝集塊又は上清よりインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出を行う。
That is, the present invention provides a nucleic acid having an inverted repeat structure comprising a target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand, and a nucleic acid probe specific to the target sequence. The present invention relates to a hybridization assay, which comprises separating a nucleic acid having an inverted repeat structure and a free nucleic acid probe by hybridizing and adsorbing a nucleic acid precipitant to a generated hybrid to form an aggregate.
In the assay of the present invention, a nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid is detected from the aggregate or the supernatant.
ある実施態様において、インバーテッドリピート構造を有する核酸は、以下のプライマー(a)及び／又は(b)を用いた増幅法によって提供される。
(a) 鋳型核酸上の標的配列の3’側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸上の標的配列の5’側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー
例えば、前記増幅法としてLAMP法を用いることができる。
In one embodiment, the nucleic acid having an inverted repeat structure is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b).
(a) when selecting the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the same as the F1c And the primer comprising the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order.
(b) when the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, complementary to the R1 A primer containing the target sequence R1c and the same sequence R2 as the R2 in this order from the 5 ′ side to the 3 ′ side. For example, the LAMP method can be used as the amplification method.
また、ある実施態様において、インバーテッドリピート構造を有する核酸と遊離の核酸プローブは親水性基材上で分離してもよい。前記親水性基材上には、あらかじめ核酸沈澱剤がスポットされていてもよいし、あらかじめ核酸プローブと核酸沈澱剤がスポットされていてもよい。 In one embodiment, a nucleic acid having an inverted repeat structure and a free nucleic acid probe may be separated on a hydrophilic substrate. The nucleic acid precipitant may be spotted on the hydrophilic substrate in advance, or the nucleic acid probe and the nucleic acid precipitant may be spotted in advance.
本発明で用いられる親水性基材としては、例えば、濾紙、ナイロンメンブレン、セルロースエステル類等の一般的にイムノクロマト法で用いられている基材を用いることができる。 基材 As the hydrophilic substrate used in the present invention, for example, a substrate generally used in an immunochromatography method, such as filter paper, nylon membrane, cellulose esters, etc. can be used.
また、ある実施態様において、本発明のハイブリダイゼーションアッセイは以下の工程を含む：
１）鋳型核酸上の標的配列をLAMP増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記インバーテッドリピート構造を有する核酸に、標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせる工程；
３）生成したハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成させ、遊離の核酸プローブと分離する工程；及び
４）得られた凝集塊又は上清より、上記インバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列を検出する工程。
In one embodiment, the hybridization assay of the present invention comprises the following steps:
1) a step of subjecting a target sequence on a template nucleic acid to LAMP amplification to obtain a nucleic acid having an inverted repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand;
2) a step of hybridizing a nucleic acid probe having the inverted repeat structure with a nucleic acid probe specific to a target sequence;
3) adsorbing a nucleic acid precipitant to the generated hybrid to form an aggregate and separating it from a free nucleic acid probe; and 4) obtaining a nucleic acid having the above inverted repeat structure from the obtained aggregate or supernatant. Detecting a target sequence in the nucleic acid.
本発明のアッセイでは、インバーテッドリピート構造を有する核酸中の標的配列又は核酸プローブを標識し、該標識に基づいてインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出を行うことができる。 In the assay of the present invention, a target sequence or a nucleic acid probe in a nucleic acid having an inverted repeat structure is labeled, and a nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid can be detected based on the label. .
あるいは、核酸プローブを標識し、該プローブの標識に基づいてインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出を行うこともできる。
あるいはまた、鋳型核酸上の標的配列を、標識プライマー又は標識核酸基質を用いて増幅することにより、インバーテッドリピート構造を有する核酸中の標的配列を標識し、該標識に基づいてインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出を行うこともできる。
Alternatively, a nucleic acid probe can be labeled, and a nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid can be detected based on the label of the probe.
Alternatively, by amplifying a target sequence on a template nucleic acid using a labeled primer or a labeled nucleic acid substrate, a target sequence in a nucleic acid having an inverted repeat structure is labeled, and an inverted repeat structure is formed based on the label. The detection of a nucleic acid having the same or a target sequence in the nucleic acid can also be performed.
本発明のアッセイでは、核酸沈澱剤として、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジン、及びジエチルアミノエチル デキストランからなる群より選ばれるいずれか一つ又は二つ以上を好適に用いることができる。
本発明のアッセイでは、核酸プローブとしてペプチド核酸、又はロックド核酸を好適に用いることができる。
In the assay of the present invention, as the nucleic acid precipitating agent, one or more selected from the group consisting of hydroxyapatite, polyethyleneimine, protamine sulfate, poly-L-lysine, and diethylaminoethyl dextran can be suitably used. it can.
In the assay of the present invention, a peptide nucleic acid or a locked nucleic acid can be suitably used as a nucleic acid probe.
本発明はまた、本発明のアッセイを利用することにより、標的配列の増幅産物であるインバーテッドリピート構造を有する核酸と、該標的核酸を増幅するための未反応プライマーとを区別する方法を提供する。
さらに本発明は、本発明のアッセイを利用することにより、標的配列中の一塩基多型を検出する方法を提供する。
The present invention also provides a method for distinguishing between a nucleic acid having an inverted repeat structure, which is an amplification product of a target sequence, and an unreacted primer for amplifying the target nucleic acid, by utilizing the assay of the present invention. .
Further, the present invention provides a method for detecting a single nucleotide polymorphism in a target sequence by utilizing the assay of the present invention.
さらにまた本発明は、以下のi）〜vi）の少なくとも一つ以上を含む、ハイブリダイゼーションアッセイ用キットを提供する。
i）以下の(a)及び／又は(b)のインナープライマー、若しくはそれらの標識物
(a) 鋳型核酸上の標的配列の3’側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸上の標的配列の5’側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー
ii）以下の(c)及び／又は(d)のアウタープライマー
(c) 鋳型核酸鎖上の任意配列F2cよりも3'末端方向に任意配列F3cを選択したとき、該F3cに相補的な配列F3を含むプライマー
(d) 鋳型核酸鎖上の任意配列R2よりも5'末端方向に任意配列R3を選択したとき、該R3と同一の配列を含むプライマー
iii）標的配列の少なくとも一部に相補的な配列、又は標的配列の少なくとも一部に相同な配列を含み、該配列又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズしうる核酸プローブ、あるいはその標識物
iv）核酸沈澱剤
v）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ
vi）要素v)の基質となるヌクレオチド、又はその標識物
Furthermore, the present invention provides a kit for a hybridization assay, which comprises at least one of the following i) to vi).
i) the following inner primers of (a) and / or (b) or their labeled products: (a) in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are selected, a primer containing the same sequence as the F1c and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order (b) From the 5 'side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5' end on the template nucleic acid, when the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are sequentially selected, a sequence R1c complementary to the R1 is selected. And a primer containing the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
ii) Outer primer of the following (c) and / or (d): (c) When an arbitrary sequence F3c is selected in the direction of the 3 ′ end from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid chain, a sequence F3 complementary to the F3c is selected. (D) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 ′ end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3
iii) a nucleic acid probe containing a sequence complementary to at least a part of the target sequence or a sequence homologous to at least a part of the target sequence, and capable of specifically hybridizing to the sequence or its complementary strand, or a labeled product thereof
iv) Nucleic acid precipitant
v) DNA polymerase that catalyzes strand displacement complementary strand synthesis
vi) nucleotide used as a substrate of element v), or a labeled product thereof
前記キットは、さらに、以下の(e)及び／又は(f)のループプライマー、あるいはその標識物を含んでいてもよい。
(e) インナープライマー上のF1c及びF2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
(f) インナープライマー上のR1c及びR2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
The kit may further include the following loop primer (e) and / or (f) or a label thereof.
(e) A primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer (f) A primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer
前記キットにおいて、核酸沈澱剤としては、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジン、及びジエチルアミノエチル デキストランからなる群より選ばれるいずれか一つ又は二つ以上を好適に用いることができる。 In the kit, as the nucleic acid precipitant, any one or more selected from the group consisting of hydroxyapatite, polyethyleneimine, protamine sulfate, poly-L-lysine, and diethylaminoethyl dextran can be suitably used. .
本発明によれば、液相ハイブリダイゼーションアッセイにおけるB/F分離の問題を解決し、微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。また、この方法は多検体同時処理や、処理の自動化、リアルタイムモニタリングも可能である。 According to the present invention, the problem of B / F separation in a liquid phase hybridization assay can be solved, and a very small amount of an object to be detected can be detected with high sensitivity and ease regardless of its chain length. In addition, this method enables simultaneous processing of multiple samples, automation of processing, and real-time monitoring.
本発明は、標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸に、該標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせ、生成したハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成させることにより、前記インバーテッドリピート構造を有する核酸と遊離の核酸プローブを分離することを特徴とする、ハイブリダイゼーションアッセイとそのためのキットに関する。 The present invention hybridizes a nucleic acid probe specific to the target sequence to a nucleic acid having an inverted repeat structure containing a target sequence and a sequence complementary thereto one or more times repeated on the same strand. A nucleic acid having an inverted repeat structure and a free nucleic acid probe by adsorbing a nucleic acid precipitant on the generated hybrid to form an aggregate, and a hybridization assay and a kit therefor. About.
以下、本発明について詳細に説明する。
１．用語の定義
核酸：本明細書中における「核酸」は天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。該核酸には、DNA、cDNA、RNA、cRNA、及びPNA等の全てを含むものとする。また１本鎖核酸及び２本鎖核酸の双方を含むものとする。さらに、部分的に修飾された、あるいは全体が完全に人工的構造からなるヌクレオチド誘導体であっても、それが塩基対結合を形成しうるものであるかぎり、本発明の核酸に含まれる。また、遺伝子（生命に関わる特定の機能や情報を担う核酸）という用語も、核酸に含まれる。なお、本発明における核酸の構成塩基数は制限されない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Definition of Terms Nucleic acid: As used herein, "nucleic acid" may be natural or artificially synthesized. The nucleic acid includes all of DNA, cDNA, RNA, cRNA, PNA and the like. In addition, it includes both single-stranded nucleic acids and double-stranded nucleic acids. Furthermore, nucleotide derivatives that are partially modified or wholly entirely composed of artificial structures are included in the nucleic acids of the present invention as long as they can form base pairing. In addition, the term gene (nucleic acid that carries a specific function or information related to life) is also included in nucleic acid. In the present invention, the number of constituent bases of the nucleic acid is not limited.
標的配列：本明細書中における「標的配列」又は「標的核酸」とは、検出すべき核酸配列又は核酸分子を意味する。
核酸プローブ：本明細書中における「核酸プローブ」とは、標的配列に特異的にハイブリダイズし、該配列を検出するための核酸断片を意味する。なお、後述するように核酸プローブは、ペプチド核酸であってもよい。
インバーテッドリピート構造：「インバーテッドリピート（逆反復反復）構造」とは、互いに相補的な２つの配列が同一鎖上に繰り返し含まれる構造を意味するものとする。このインバーテッドリピート構造については、次項で詳述する。
鋳型と相補鎖：本明細書中における「鋳型」とは、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ「相補鎖」は、鋳型に対応する鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。
鋳型核酸：本発明において「鋳型核酸」とは、本来の検出対象であって、その分子中に標的配列を含み、インバーテッド構造を有する核酸増幅産物調製やそのためのプライマー設計の基礎となる核酸を意味する。
ハイブリダイズ：「ハイブリダイズ」と「アニール」とは、核酸がワトソン−クリックのモデルに基づく相補的塩基対結合によって2本鎖を形成することを意味する。したがって、塩基対結合を構成する核酸鎖が同一鎖上にあっても、分子内の相補的な塩基配列が塩基対結合を形成すれば、ハイブリダイズ、あるいはアニールである。本発明において、ハイブリダイズとアニールは、核酸が塩基対結合による2本鎖構造を構成する点で同義である。
Target sequence: As used herein, "target sequence" or "target nucleic acid" refers to a nucleic acid sequence or nucleic acid molecule to be detected.
Nucleic acid probe: As used herein, the term "nucleic acid probe" refers to a nucleic acid fragment that specifically hybridizes to a target sequence and detects the sequence. In addition, as described later, the nucleic acid probe may be a peptide nucleic acid.
Inverted repeat structure: An “inverted repeat (inverted repeat) structure” shall mean a structure in which two mutually complementary sequences are repeatedly contained on the same strand. This inverted repeat structure will be described in detail in the next section.
Template and complementary strand: "Template" in the present specification means a nucleic acid on the side that serves as a template for complementary strand synthesis. A “complementary strand” having a base sequence complementary to a template has a meaning as a strand corresponding to the template, but the relationship between the two is merely relative.
Template nucleic acid: In the present invention, the term "template nucleic acid" refers to a nucleic acid that is the original target of detection, contains a target sequence in its molecule, and serves as a basis for preparation of a nucleic acid amplification product having an inverted structure and primer design for that purpose. means.
Hybridization: "Hybridize" and "anneal" mean that the nucleic acid forms a duplex through complementary base pairing based on the Watson-Crick model. Therefore, even if the nucleic acid strands forming the base pairing are on the same strand, hybridization or annealing is performed if the complementary base sequence in the molecule forms a base pairing. In the present invention, hybridization and annealing are synonymous in that a nucleic acid forms a double-stranded structure by base pairing.
２． インバーテッドリピート構造を有する核酸
２．１ インバーテッドリピート構造
本発明のアッセイで用いられるインバーテッドリピート構造を有する核酸は、「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」を同一鎖上に１回又は２回以上反復して含む。
2. Nucleic Acid Having Inverted Repeat Structure 2.1 Inverted Repeat Structure The nucleic acid having an inverted repeat structure used in the assay of the present invention has a “structure in which a target sequence and a sequence complementary thereto are arranged in tandem” on the same strand. Includes repeated one or more times.
本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸の鎖長は、特に限定されないが、通常少なくとも１００塩基長以上、平均１０００塩基長程度が好ましい。これは、核酸沈澱剤は核酸の鎖長が長いほど吸着しやすく、鎖長が短いほど吸着しにくいという特徴を有しているため、検出対象である核酸が比較的長鎖であるほうがB/F分離が良くなるからである。 鎖 The chain length of the nucleic acid having an inverted repeat structure of the present invention is not particularly limited, but it is usually preferably at least 100 bases or more, and about 1000 bases on average. This is because the nucleic acid precipitant has a characteristic that it is easily adsorbed as the nucleic acid has a longer chain length and is less adsorbed as the nucleic acid has a shorter chain length. This is because F separation is improved.
また、前記インバーテッドリピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列とこれに相補的な配列が縦列した構造」の反復数は特に限定されないが、通常少なくとも１〜１０回程度、平均１０回以上が好ましい。該核酸中に含まれる標的配列の数が多いほど、核酸プローブとのハイブリッド形成がよく、したがって検出感度が高くなるからである。 Further, the number of repetitions of the "structure in which the target sequence and the sequence complementary thereto are tandemly" contained in the nucleic acid having the inverted repeat structure is not particularly limited, but is usually at least about 1 to 10 times, and an average of 10 times or more. Is preferred. This is because the greater the number of target sequences contained in the nucleic acid, the better the hybridization with the nucleic acid probe and the higher the detection sensitivity.
なお、インバーテッドリピート構造を有する核酸は、後述するような核酸増幅反応によって提供されるものであるため、必ずしも均一ではなく、様々な鎖長、増幅率のものが含まれる。したがって、上記鎖長や反復数の好ましい数値については、「平均」という表現を用いるものとする（なお、平均は通常の相加平均を意味する）。 The nucleic acid having the inverted repeat structure is provided by a nucleic acid amplification reaction as described below, and is not necessarily uniform, and includes nucleic acids having various chain lengths and amplification rates. Therefore, the preferred numerical value of the above-mentioned chain length and the number of repetitions uses the expression “average” (the average means a normal arithmetic average).
本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸中に含まれる「標的配列」は、検出対象とする核酸（ゲノム遺伝子やｍＲＮＡ）の一部であっても、全部であってもよい。含まれる領域は、検出対象とする核酸に特異的な配列を選択して用いることが好ましく、例えば、構造遺伝子ならば繰り返し配列を含まない、mRNA3'非翻訳領域に存在する配列特異性が高い部分等を好適に用いることができる。
The “target sequence” contained in the nucleic acid having an inverted repeat structure of the present invention may be a part or the whole of a nucleic acid (genomic gene or mRNA) to be detected. The included region is preferably used by selecting a sequence specific to the nucleic acid to be detected.For example, if the structural gene does not contain a repeated sequence, a portion having high sequence specificity present in the
また「これに相補的な配列」とは、例えば、5'-agttcatc-3'に対して、その相補的配列3'-tcaagtag-5'を意味するが、これらは同一鎖上に含まれるため、後者は5'-gatgaact-3'として逆方向に配置される。この互いに相補的な２つの配列は少なくとも一部において、鎖内アニール（同一鎖内でアニール）することによってループ構造を形成しうる。そして、このループ形成は本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸に特異な２次（あるいは３次）構造を与える。例えば、同一鎖上の両端にループが形成されると、本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸はダンベル型構造となり、同一鎖上に多数のループが形成されれば、該インバーテッドリピート構造を有する核酸はカリフラワー型構造となる。本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸が、高いB/F分離や強いシグナル強度を示すのは、主として長い鎖長と標的配列の高い反復数（高い増幅効率）によるものと思われるが、前記した特異な構造も一部で寄与していることが考えられる。 Further, the "sequence complementary thereto" means, for example, a complementary sequence 3'-tcaagtag-5 'for 5'-agttcatc-3', since these are contained on the same chain. The latter is arranged in the opposite direction as 5'-gatgaact-3 '. The two sequences complementary to each other can form, at least in part, a loop structure by annealing in a chain (annealing in the same chain). Then, this loop formation gives a specific secondary (or tertiary) structure to the nucleic acid having the inverted repeat structure of the present invention. For example, when loops are formed at both ends on the same chain, the nucleic acid having an inverted repeat structure of the present invention has a dumbbell structure, and when a large number of loops are formed on the same chain, the inverted repeat structure has The nucleic acid has a cauliflower type structure. The reason that the nucleic acid having the inverted repeat structure of the present invention exhibits high B / F separation and strong signal intensity is considered to be mainly due to the long chain length and the high number of repeats of the target sequence (high amplification efficiency). It is conceivable that this unique structure also contributes in part.
２．２ インバーテッドリピート構造を有する核酸の調製
本発明のインバーテッドリピート構造を有する核酸は、本来の検出であるゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等を鋳型核酸に対し、その少なくとも一部を標的配列として、調製することができる。調製方法は特に限定されず、化学的合成等の公知の核酸合成法や、PCR法、SDA法等の公知の核酸増幅法を適宜選択しうるが、特に、後述するX1c+X2構造を有するプライマーを用いた増幅法（例えば、LAMP法等）を利用すれば、効率的に調製することができる。
2.2 Preparation of Nucleic Acid Having Inverted Repeat Structure The nucleic acid having an inverted repeat structure of the present invention is prepared by using genomic DNA, mRNA, or the like, which is the original detection, as a template nucleic acid and using at least a part thereof as a target sequence. can do. The preparation method is not particularly limited, a known nucleic acid synthesis method such as chemical synthesis, a PCR method, a known nucleic acid amplification method such as an SDA method can be appropriately selected, in particular, a primer having an X1c + X2 structure described below. If an amplification method (for example, the LAMP method) is used, the preparation can be performed efficiently.
（１）X1c+X2構造を有するプライマーを用いた増幅法
本発明のプローブは、X1c+X2構造を有するプライマーを用いた増幅法によって効率的に合成することができる。
X1c＋X2構造を有するプライマーは、具体的には以下のようにして設計する。
(a) 鋳型核酸鎖上の標的配列の3’側から当該鋳型核酸鎖上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸鎖上の標的配列の5’側から当該鋳型核酸鎖上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー
(1) Amplification method using a primer having an X1c + X2 structure The probe of the present invention can be efficiently synthesized by an amplification method using a primer having an X1c + X2 structure.
The primer having the X1c + X2 structure is specifically designed as follows.
(a) from the 3 'end of the target sequence on the template nucleic acid strand toward the 3' end on the template nucleic acid strand, when selecting the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c in order, the F1c And a primer comprising, in this order, the same sequence and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side.
(b) from the 5 'side of the target sequence on the template nucleic acid strand toward the 5' end on the template nucleic acid strand, when sequentially selecting the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2, the R1 A primer comprising, in this order, a sequence R2 that is complementary to
なお、上記プライマーは(a)(b)をペアとして用いてもよいし、(a)(b)どちらか一方と通常のプライマーをペアにして用いてもよい。
増幅反応は、例えば上記プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド基質及びDNA（RNA）ポリメラーゼを用いて、通常のPCR法により達成できる。
さらに、前記増幅反応はポリメラーゼとして鎖置換型DNAポリメラーゼを用いれば、等温条件下で行うこともできる。これは、プライマーがX1c+X2の構造を有するため、該プライマーからの伸長生成物はX1c+(X2+)X1の相補的配列（下線部）を含み、これが鎖内アニールして、合成された2本鎖核酸上に1本鎖部分を生成するためである。すなわち、2本鎖を高温で解離させなくとも、伸長生成物上には鎖内アニールによる新たな鎖置換反応の開始点が与えられる。この反応の概略は後述するLAMP法を参照されたい。
As the primer, (a) and (b) may be used as a pair, or either (a) or (b) may be used as a pair with a normal primer.
The amplification reaction can be achieved by an ordinary PCR method using, for example, the above primer, template nucleic acid, nucleotide substrate, and DNA (RNA) polymerase.
Further, the amplification reaction can be performed under isothermal conditions by using a strand displacement DNA polymerase as a polymerase. This is because, since the primer has the structure of X1c + X2, the extension product from the primer contains the complementary sequence of X1c + (X2 +) X1 (underlined), which was annealed in the strand and synthesized 2 This is for generating a single-stranded portion on the single-stranded nucleic acid. That is, a new starting point for a strand displacement reaction by intrachain annealing is provided on the extension product without dissociating the double strand at a high temperature. For the outline of this reaction, refer to the LAMP method described below.
なお、前記鎖置換型DNAポリメラーゼとしては、例えばBst DNAポリメラーゼ、Bca(exo-)DNAポリメラーゼ、E. coli DNA ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Vent DNAポリメラーゼ、Vent(Exo-)DNAポリメラーゼ（Vent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、DeepVent DNAポリメラーゼ、DeepVent(Exo-)DNAポリメラーゼ（DeepVent DNAポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ29ファージDNAポリメラーゼ、MS-2ファージDNAポリメラーゼ、Z-Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造製）、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）等が挙げられる。 Examples of the strand displacement DNA polymerase include Bst DNA polymerase, Bca (exo-) DNA polymerase, Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase (Vent DNA polymerase). From which exonuclease activity has been removed), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (from which exonuclease activity has been removed from DeepVent DNA polymerase), Φ29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), KOD DNA polymerase (Toyobo) and the like.
（２）LAMP法
1)LAMP（Loop-mediated isothermal amplification）法の概要
前記増幅法の好適な態様として、LAMP法による増幅法を用いることができる。「LAMP法」とは本発明者らが開発した核酸の増幅方法で、インナープライマーペア或いはこれにアウタープライマーペア、さらにループプライマーペアを加えた、2種、4種或いは6種の特異的プライマーと、鎖置換型ポリメラーゼ及び基質であるヌクレオチドを用いて、等温条件下（65℃前後）でDNA又はRNAを迅速かつ安価に増幅する方法である。LAMP法の概要については、文献：Notomi, T et al.:Nucleic Acids Res. 28(12):e63(2000)、特許：国際公開WO 00/28082号、あるいは栄研化学(株)ホームページ（http://www.eiken.co.jp/）を参照されたい。
(2) LAMP method
1) Outline of LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) method As a preferred embodiment of the amplification method, an amplification method by the LAMP method can be used. The `` LAMP method '' is a method for amplifying nucleic acids developed by the present inventors, and an inner primer pair or an outer primer pair, plus a loop primer pair, and two, four or six specific primers. This is a method for rapidly and inexpensively amplifying DNA or RNA under isothermal conditions (around 65 ° C.) using a strand displacement polymerase and nucleotides as substrates. For an overview of the LAMP method, see Reference: Notomi, T et al .: Nucleic Acids Res. 28 (12): e63 (2000), Patent: International Publication WO 00/28082, or Eiken Chemical Co., Ltd. http://www.eiken.co.jp/).
LAMP法では、増幅生成物の同一鎖上末端に互いに相補的な配列が生成し、これらがアニールしてヘアピン状のループが形成され、そのループを起点としたポリメラーゼによる伸長反応が起きる。同時に、ループ内にアニールしたプライマーからは鎖置換型伸長反応が起こり、先の伸長生成物を1本鎖に解離させていく。解離した1本鎖もまた、末端に相補的配列を有するため、この反応は繰り返し起きる。こうして、LAMP法では増幅生成物の同一鎖上の複数の位置で、伸長反応と増幅反応が同時進行するため、DNAの増幅が超指数関数的にしかも等温条件下で達成され、本発明で用いられるインバーテッド構造を有する核酸を効率的に合成できる。 In the LAMP method, mutually complementary sequences are generated at the same chain end of the amplification product, and these are annealed to form a hairpin-like loop, and an elongation reaction by a polymerase starting from the loop occurs. At the same time, a strand displacement extension reaction occurs from the primer annealed in the loop, and the extension product is dissociated into single strands. This reaction occurs repeatedly because the dissociated single strand also has a complementary sequence at the end. Thus, in the LAMP method, since the extension reaction and the amplification reaction proceed simultaneously at a plurality of positions on the same strand of the amplification product, amplification of DNA is achieved in an exponential manner under isothermal conditions, and is used in the present invention. The resulting nucleic acid having an inverted structure can be efficiently synthesized.
2)LAMP法用プライマー
LAMP法ではインナープライマー、アウタープライマー、ループプライマーと呼ばれる、特異的プライマーが用いられる。
インナープライマーとはLAMP法に必須のプライマーであって、鋳型DNAのそれぞれの鎖において、3’側に存在する任意配列X2c、これより5’側の任意配列X1cを選択したとき、該X2cに相補的配列X2と該X1cと同一の配列X1cを3’側から5’側にこの順で含む（X1c＋X2の構造をもつ）プライマーをいう。機能的にいえば、インナープライマー上のX2は鋳型に特異的にアニールして相補鎖合成の起点を与える部分であり、X1cは増幅（伸長）生成物がループを形成するための相補的配列を与える。そして、このループが新たな相補鎖合成の起点となる。
2) Primers for LAMP method In the LAMP method, specific primers called inner primer, outer primer and loop primer are used.
The inner primer is a primer essential to the LAMP method, and in each strand of the template DNA, when an arbitrary sequence X2c present on the 3 ′ side and an
アウタープライマーとは、インナープライマーよりも外側（すなわち鋳型の3’側）の任意配列X3cに相補的配列を有し、これにアニールしうるプライマー2種（2本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。
なお、プライマーの鋳型核酸へのアニールを容易にするため、上記X1（X1c）、X2（X2c）、X3（X3c）の長さは5〜100塩基が好ましく、10〜50塩基がさらに好ましい。
上記インナープライマー及びアウタープライマーは、2本鎖（F及びR）のそれぞれについて必要であり、インナープライマー（F1c＋F2、R1c+R2）、アウタープライマー（F3、R3）の各々2種が設計される。
The outer primer is a primer having a sequence complementary to an arbitrary sequence X3c outside of the inner primer (that is, on the 3 'side of the template) and capable of annealing to it (one for each complementary to the double strand). Each).
In order to facilitate annealing of the primer to the template nucleic acid, the length of X1 (X1c), X2 (X2c), and X3 (X3c) is preferably 5 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases.
The inner primer and the outer primer are required for each of the double strands (F and R), and two types of each of the inner primer (F1c + F2, R1c + R2) and the outer primer (F3, R3) are designed.
各任意配列は、LAMP法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、分子内アニールを優先的に生じ、末端ヘアピン構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、F1c配列とF2c配列との間の距離及びR1配列とR1c配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、0〜500塩基、好ましくは0〜100塩基、最も好ましくは10〜70塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、F1c配列及びF2c配列自身並びにR1配列及びR2配列自身を含まない塩基数を示している。 Each optional sequence is preferably selected so that the amplification product obtained by the LAMP method preferentially causes intramolecular annealing rather than intermolecular annealing to form a terminal hairpin structure. For example, in order to cause intramolecular annealing to occur preferentially, in selecting an arbitrary sequence, it is important to consider the distance between the F1c and F2c sequences and the distance between the R1 and R1c sequences. . Specifically, it is preferable that both sequences are selected so as to exist at a distance of 0 to 500 bases, preferably 0 to 100 bases, most preferably 10 to 70 bases. Here, the numerical values indicate the number of bases not including the F1c and F2c sequences themselves and the R1 and R2 sequences, respectively.
また、ループプライマーとは、LAMP法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、該ループ内の配列に相補的な塩基配列をその3’末端に含むプライマー2種（2本鎖に相補的な各々について１つずつ）をいう。前記アウタープライマーとループプライマーはLAMP法に必須のプライマーではないが、これらがあれば増幅（伸長）反応はより効率的に進行する。 In addition, a loop primer is a base sequence complementary to a sequence in the loop at its 3 ′ end when complementary sequences generated on the same strand of an amplification product by the LAMP method anneal to each other to form a loop. 2 primers (one for each complementary to double strand). Although the outer primer and the loop primer are not essential primers for the LAMP method, the amplification (extension) reaction proceeds more efficiently if they are provided.
3)増幅用鋳型核酸
LAMP法で用いられる増幅用鋳型核酸はDNAであってもRNAであってもよく、組織又は細胞等の生物学的試料から公知方法により、あるいは化学合成法により調製することができる。この場合、増幅すべき領域（標的領域という）の両側には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する。両側配列とは、当該標的領域の5’末端からポリヌクレオチド鎖の5’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の3'末端からポリヌクレオチド鎖の3’末端までの領域の配列を意味する。両側配列の長さは、標的領域の5'側及び3'側のいずれの領域も、10〜1000塩基、好ましくは30〜500塩基である。
3) Template nucleic acid for amplification The template nucleic acid for amplification used in the LAMP method may be DNA or RNA, and is prepared from a biological sample such as a tissue or a cell by a known method or by a chemical synthesis method. Can be. In this case, a template polynucleotide is prepared such that a sequence of an appropriate length (both side sequences) exists on both sides of a region to be amplified (called a target region). The two-sided sequence means the sequence of the region from the 5 'end of the target region to the 5' end of the polynucleotide chain, and the sequence of the region from the 3 'end of the target region to the 3' end of the polynucleotide chain. . The length of both side sequences is 10 to 1000 bases, preferably 30 to 500 bases in both the 5 'and 3' regions of the target region.
4)反応条件
一連の反応は、酵素反応に好適なpHを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度(Tm)の調整剤等の共存下で行うことが好ましい。緩衝剤としては、Tris-HCl等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。pHは使用するDNAポリメラーゼに応じて調整すればよい。塩類としては、例えばKCl、NaCl、あるいは(NH4)2SO4等が、酵素の活性維持とDNAの融解温度(Tm)調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。また、融解温度(Tm)調整剤としては、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド、あるいはホルムアミドを一般的に利用することができる。
4) Reaction conditions A series of reactions consist of a buffer that gives a pH suitable for the enzyme reaction, salts necessary for maintaining and annealing the catalytic activity of the enzyme, a protective agent for the enzyme, and, if necessary, a melting temperature (Tm It is preferable to carry out the reaction in the coexistence of the adjusting agent and the like. As the buffering agent, one having a neutral to weakly alkaline buffering action such as Tris-HCl is used. The pH may be adjusted according to the DNA polymerase used. As the salts, for example, KCl, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4 or the like is appropriately added for maintaining the activity of the enzyme and adjusting the melting temperature (Tm) of the DNA. Bovine serum albumin and saccharides are used as enzyme protecting agents. As a melting temperature (Tm) regulator, betaine, proline, dimethyl sulfoxide, or formamide can be generally used.
5)LAMP反応
LAMP法における反応は、鋳型核酸に対して、以下の成分（i）（ii）（iii）を加え、インナープライマーが鋳型核酸上の相補的配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ鎖置換型ポリメラーゼが酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は50〜75℃、好ましくは55〜70℃であり、インキュベート時間は1分〜10時間、好ましくは5分〜4時間である。
(i) インナープライマー2種、或いはさらにアウタープライマー2種、或いはさらにループプライマー2種
(ii) 鎖置換型ポリメラーゼ
(iii)基質ヌクレオチド
5) LAMP reaction In the LAMP reaction, the following components (i), (ii), and (iii) are added to the template nucleic acid, and the inner primer forms a stable base pair bond with a complementary sequence on the template nucleic acid. It proceeds by incubating at a temperature that can form and that the strand displacement polymerase can maintain enzymatic activity. The incubation temperature is 50-75 ° C, preferably 55-70 ° C, and the incubation time is 1 minute to 10 hours, preferably 5 minutes to 4 hours.
(i) 2 inner primers, or 2 outer primers, or 2 more loop primers (ii) strand displacement polymerase (iii) substrate nucleotide
上記、インナープライマーや基質ヌクレオチドは適当な標識によりラベルされていてもよい。標識物質としては、例えば、蛍光色素（FITC、ROC等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、DNP）、ビオチン、DIG（ジゴキシゲニン）等を挙げることができる。標識されたインナープライマーや基質ヌクレオチドを使用すれば、増幅産物であるインバーテッドリピート構造を有する核酸は標識され、そのシグナル強度に基き、インバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出が可能になる。 (4) The inner primer and the substrate nucleotide may be labeled with an appropriate label. Examples of the labeling substance include a fluorescent dye (FITC, ROC, etc.), an enzyme, a protein, a radioisotope, a chemiluminescent substance (eg, DNP), biotin, DIG (digoxigenin) and the like. If a labeled inner primer or a substrate nucleotide is used, the amplified nucleic acid having an inverted repeat structure, which is an amplification product, is labeled, and based on the signal intensity, detection of a nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid Becomes possible.
３． 核酸プローブ
核酸プローブは、一般的には検出すべき標的配列の少なくとも一部に相補的な配列を意味するが、本発明では標的配列とその相補鎖からなるインバーテッドリピート構造を有する核酸を検出する。したがって、本発明における核酸プローブは、検出すべき標的配列の少なくとも一部に相補的な配列、又は検出すべき標的配列の少なくとも一部に相同な配列のどちらでもよい。
3. Nucleic acid probe A nucleic acid probe generally means a sequence complementary to at least a part of a target sequence to be detected. In the present invention, a nucleic acid having an inverted repeat structure consisting of a target sequence and its complementary strand is detected. . Therefore, the nucleic acid probe in the present invention may be either a sequence complementary to at least a part of the target sequence to be detected or a sequence homologous to at least a part of the target sequence to be detected.
前記核酸プローブの鎖長は、通常５〜５０塩基長程度、好ましくは１０〜３０塩基長程度である。これは、核酸沈澱剤は長鎖の核酸に吸着しやすいという性質を有するため、遊離のプローブへの沈澱剤の吸着を防止して良好なB/F分離を達成するには、核酸プローブは比較的短鎖であることが必要だからである。 The length of the nucleic acid probe is usually about 5 to 50 bases, preferably about 10 to 30 bases. This is because the nucleic acid precipitant has the property of easily adsorbing to long-chain nucleic acids.To prevent the adsorption of the precipitant to a free probe and achieve good B / F separation, the nucleic acid probe must be compared. It is necessary to be a short chain.
しかしながら、本発明においては、沈澱剤添加時の温度をプローブのTm付近に調整するなど反応条件を調整すれば、前記プローブの長さにかかわらず良好なB/F分離が可能となる。これは、B/F分離の効率が核酸と沈澱剤間の反応ではなく、インバーテッドリピート構造を有する核酸と核酸プローブ間の反応に主として依存しているからである。つまり、一般に短いプローブを使った場合には低温で、長いプローブを用いた場合は選択性を高めるために高温で沈澱剤を添加すれば、良好なB/F分離が達成できる。その意味では、プローブは、選択性、反応性などから決定される実用上有意義な長さを選択すればよい。 However, in the present invention, if the reaction conditions are adjusted such as adjusting the temperature at the time of adding the precipitant to around the Tm of the probe, good B / F separation can be performed regardless of the length of the probe. This is because the efficiency of B / F separation mainly depends on the reaction between the nucleic acid having an inverted repeat structure and the nucleic acid probe, not on the reaction between the nucleic acid and the precipitant. In other words, in general, good B / F separation can be achieved by adding a precipitant at a low temperature when a short probe is used, and at a high temperature to enhance selectivity when a long probe is used. In that sense, the probe may be of a practically significant length determined by selectivity, reactivity, and the like.
前記核酸プローブは、検出のために適当な試薬で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、蛍光色素（FITC、ROC等）、酵素、タンパク、放射性同位体、化学発光物質（例えば、DNP）、ビオチン、DIG（ジゴキシゲニン）等を挙げることができる。 The nucleic acid probe may be labeled with an appropriate reagent for detection. Examples of the labeling substance include a fluorescent dye (FITC, ROC, etc.), an enzyme, a protein, a radioisotope, a chemiluminescent substance (eg, DNP), biotin, DIG (digoxigenin) and the like.
また、核酸プローブはペプチド核酸、又はロックド核酸であってもよい。ペプチド核酸（ＰＮＡ：Peptide nucleic acid）とはペプチド骨格に核酸塩基を有する分子であり、具体的には２−アミノエチルグリシンを骨格単位とし、これにメチレンカルボニル基を介して核酸塩基を結合させた構造を有する分子である（Nielsen, P. E.et al., Science 254, 1497〜1500 (1991)）。 The nucleic acid probe may be a peptide nucleic acid or a locked nucleic acid. A peptide nucleic acid (PNA: Peptide nucleic acid) is a molecule having a nucleobase in a peptide skeleton, specifically, a 2-aminoethylglycine skeleton unit, to which a nucleobase is bonded via a methylenecarbonyl group. It is a molecule having a structure (Nielsen, PE et al., Science 254, 1497-1500 (1991)).
ペプチド核酸は、ｓｓＤＮＡ（single strand ＤＮＡ）及びｄｓＤＮＡ（double strand ＤＮＡ）、ＲＮＡに結合し、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体よりも高い安定性を有するため、核酸プローブとして用いる際にＤＮＡより短鎖で済み、ミスマッチの検出も容易である。また、ＤＮＡよりも核酸沈澱剤が吸着しやすい。さらに、ハイブリッド形成がｐＨ、塩濃度に依存しないため、核酸検出時にｐＨ、塩濃度を考慮する必要がなく、プロテアーゼとも反応しないため生物試料の検出にも使用できる。このため、ペプチド核酸は本発明のアッセイ用プローブとして好適である。 ロックド核酸（Locked Nucleic Acid（LNA））は、フラノース環の2’及び4’位にO-メチレン（オキシ-LNA）、S-メチレン（チオ-LNA）、又はNH2-メチレン成分（アミノ-LNA）が結合している二環核酸類似体である。2’及び4’位の置換基の結合はフラノース環の構造上の自由度を制限し、DNA類似体に対する親和性を高度に増加させる（WO99/14226、特表2002-521310）。このため、ロックド核酸は本発明のアッセイ用プローブとして好適である。 Peptide nucleic acids bind to ssDNA (single strand DNA), dsDNA (double strand DNA) and RNA, and have higher stability than complementary DNA / DNA and RNA / DNA complexes. It is shorter than DNA, and mismatch detection is easy. In addition, nucleic acid precipitants are more easily adsorbed than DNA. Furthermore, since hybridization does not depend on pH or salt concentration, there is no need to consider pH and salt concentration at the time of nucleic acid detection, and since it does not react with protease, it can be used for detection of biological samples. For this reason, peptide nucleic acids are suitable as the assay probe of the present invention. Locked nucleic acids (Locked Nucleic Acid (LNA)) is the 2 'and 4' positions of the furanose ring O- methylene (oxy-LNA), S- methylene (thio-LNA), or NH 2 - methylene component (amino-LNA ) Are attached bicyclic nucleic acid analogs. Attachment of the substituents at the 2 'and 4' positions limits the structural freedom of the furanose ring and greatly increases the affinity for DNA analogs (WO99 / 14226, JP 2002-521310). For this reason, locked nucleic acids are suitable as the assay probe of the present invention.
４． 核酸沈澱剤
本発明で用いられる核酸沈澱剤は、核酸に吸着して凝集塊を形成させるものであれば特に限定されないが、鎖長の短い核酸よりも鎖長の長い核酸と選択的に結合するものが好ましい。すなわち、核酸沈澱剤としては、界面活性剤、ジヒドロキシベンゼン、ドデシル硫酸ナトリウム、ジイソブチルスルホコハク酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム、ジヒドロキシベンゼン、サルコシル（Sarkosyl）、及びSO4、PO4、Cl、HCOOとのアルカリ金属塩及びアンモニウム塩等が公知であるが、本発明においては、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジン、及びジエチルアミノエチル デキストラン（DEAE dextran）が好ましい。ポリエチレンイミンは、特に重合度が４０以下程度のものが好ましい。
4. Nucleic acid precipitating agent The nucleic acid precipitating agent used in the present invention is not particularly limited as long as it is capable of adsorbing to a nucleic acid to form an aggregate, but selectively binds to a nucleic acid having a longer chain length than a nucleic acid having a shorter chain length. Are preferred. That is, examples of the nucleic acid precipitant include surfactants, dihydroxybenzene, sodium dodecyl sulfate, sodium diisobutylsulfosuccinate, sodium tetradecyl sulfate, dihydroxybenzene, sarkosyl, and alkali metals with SO 4 , PO 4 , Cl, and HCOO. Salts and ammonium salts are known, but in the present invention, hydroxyapatite, polyethyleneimine, protamine sulfate, poly-L-lysine, and diethylaminoethyl dextran (DEAE dextran) are preferred. Polyethyleneimine is particularly preferably one having a degree of polymerization of about 40 or less.
使用する核酸沈澱剤の濃度や量は、各沈澱剤の性質によって決定される。例えば、重合度14のポリエチレンイミンであれば、濃度0.1M〜2M程度、添加量は反応液25μlに対して4〜200μg程度が好ましい。 濃度 The concentration and amount of the nucleic acid precipitant to be used are determined by the properties of each precipitant. For example, in the case of polyethyleneimine having a polymerization degree of 14, the concentration is preferably about 0.1 M to 2 M, and the addition amount is preferably about 4 to 200 μg per 25 μl of the reaction solution.
核酸沈澱剤添加時の反応液のｐＨも各沈澱剤の性質によって決定されるが、一般的に６〜１０が好ましい。これは反応液のｐＨが高すぎるとプローブが核酸にハイブリダイズしにくくなり、一方ｐＨが低すぎると核酸のプロトン化によりB/F分離が低下するからである。 ＰＨ The pH of the reaction solution at the time of adding the nucleic acid precipitant is also determined by the properties of each precipitant, but generally 6 to 10 is preferable. This is because if the pH of the reaction solution is too high, it becomes difficult for the probe to hybridize to the nucleic acid, while if the pH is too low, protonation of the nucleic acid lowers the B / F separation.
また、核酸沈澱剤添加時の反応液のイオン強度も各沈澱剤の性質によって決定されるが、一般的に０．１５mol/l以下が好ましい、イオン強度が高すぎると沈澱剤と核酸の静電的相互作用が阻害され、十分な凝集塊の形成が望めないからである。
さらに、核酸沈澱剤添加時の温度は２０〜７０℃程度が好ましい。
In addition, the ionic strength of the reaction solution at the time of adding the nucleic acid precipitant is also determined by the properties of each precipitant, but is generally preferably 0.15 mol / l or less. This is because the interaction is inhibited, and formation of a sufficient aggregate cannot be expected.
Furthermore, the temperature at the time of adding the nucleic acid precipitant is preferably about 20 to 70 ° C.
５． 核酸ハイブリダイゼーションアッセイの具体的手順
本発明のアッセイの、インバーテッドリピート構造を有する核酸の調製から検出までの具体的な手順は以下の工程を含む。
１）鋳型核酸上の標的配列をLAMP法等を用いて増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記インバーテッドリピート構造を有する核酸に、標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせる工程；
３）生成したハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成させ、遊離の核酸プローブと分離する工程；及び
４）得られた凝集塊又は上清より、上記インバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列を検出する工程。
5. Specific Procedure of Nucleic Acid Hybridization Assay The specific procedure of the assay of the present invention from preparation of a nucleic acid having an inverted repeat structure to detection thereof includes the following steps.
1) The target sequence on the template nucleic acid is amplified by the LAMP method or the like, and has an inverted repeat structure containing the target sequence and its complementary sequence repeated once or twice or more on the same strand. Obtaining a nucleic acid;
2) a step of hybridizing a nucleic acid probe having the inverted repeat structure with a nucleic acid probe specific to a target sequence;
3) adsorbing a nucleic acid precipitant to the generated hybrid to form an aggregate and separating it from a free nucleic acid probe; and 4) obtaining a nucleic acid having the above inverted repeat structure from the obtained aggregate or supernatant. Detecting a target sequence in the nucleic acid.
５．１ 標的配列の増幅
まず、鋳型核酸上の標的配列を増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸を得る。
5.1 Amplification of target sequence First, a target sequence on a template nucleic acid is amplified, and an inverted repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand is used. To obtain a nucleic acid.
例えば、生物試料中の特定遺伝子の検出であれば、周知の方法に従って細胞より全RNAあるいはmRNAを調製し、このmRNAを逆転写によりcDNAとして増幅してインバーテッドリピート構造を有する核酸を調製してもよい。解析対象とする核酸量が少ない場合には、さらに前記cDNAをT7RNAポリメラーゼによってcRNAとして増幅して用いてもよい。増幅方法としては、前述したX1c+X2の構造を有するプライマーを用いた増幅反応や、LAMP法を好適に用いることができる。 For example, for detection of a specific gene in a biological sample, a total RNA or mRNA is prepared from cells according to a well-known method, and the mRNA is amplified as cDNA by reverse transcription to prepare a nucleic acid having an inverted repeat structure. Is also good. When the amount of the nucleic acid to be analyzed is small, the cDNA may be further amplified as cRNA using T7 RNA polymerase before use. As the amplification method, an amplification reaction using a primer having the above-described structure of X1c + X2 and the LAMP method can be suitably used.
５．２ ハイブリダイゼーション
次に、インバーテッドリピート構造を有する核酸に、標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズさせる条件は特に限定されないが、通常５０〜７０℃で、５分程度インキュベートする。なお、あらかじめ反応液中に核酸プローブを添加して前記増幅反応を行った場合、前記増幅工程とハイブリダイゼーション工程はほぼ同時に進行する。
5.2 Hybridization Next, a nucleic acid having an inverted repeat structure is hybridized with a nucleic acid probe specific to a target sequence. The conditions for hybridization are not particularly limited, but the incubation is usually performed at 50 to 70 ° C. for about 5 minutes. When the amplification reaction is performed by adding a nucleic acid probe to a reaction solution in advance, the amplification step and the hybridization step proceed almost simultaneously.
５．３ 核酸沈澱剤の吸着
次いで、生成したインバーテッドリピート構造を有する核酸と核酸プローブとのハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成し、遊離の核酸プローブと分離する。
前述のように、核酸沈澱剤は短鎖の核酸プローブより長鎖のインバーテッドリピート構造を有する核酸と核酸プローブのハイブリッドに選択的に吸着して、凝集塊を生じるため、良好なB/F分離が可能となる。
良好なB/F分離のための、核酸沈澱剤の濃度や添加量、あるいは反応液のｐＨやイオン強度は、前述したように用いる核酸沈澱剤の種類によって決定される。
5.3 Adsorption of Nucleic Acid Precipitant Next, the nucleic acid precipitant is adsorbed to the generated hybrid of the nucleic acid having an inverted repeat structure and the nucleic acid probe to form an aggregate, which is separated from the free nucleic acid probe.
As described above, the nucleic acid precipitating agent selectively adsorbs to the hybrid of the nucleic acid and the nucleic acid probe having a long inverted repeat structure rather than the short nucleic acid probe, and forms an aggregate. Becomes possible.
The concentration and addition amount of the nucleic acid precipitant, or the pH and ionic strength of the reaction solution for good B / F separation are determined by the type of the nucleic acid precipitant used as described above.
５．４ 検出
最後に得られた凝集塊又は上清よりインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列を検出する。
ここで、検出は定性的なものと定量的なものの両方を含む。例えば、前述したように、核酸プローブ又はインバーテッドリピート構造を有する核酸を適当な標識でラベルし、そのシグナル強度に基づいてインバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列の検出、定量を行うことができる。シグナル強度の読み取りは、例えば、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）等、市販の装置を用いて常法に基づき実施することができる。得られたデータは、通常沈澱剤を添加しない時のシグナル強度に対する相対的値として評価することが好ましい。
5.4 Detection A nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid is detected from the finally obtained aggregate or supernatant.
Here, detection includes both qualitative and quantitative. For example, as described above, a nucleic acid probe or a nucleic acid having an inverted repeat structure is labeled with an appropriate label, and detection and quantification of a nucleic acid having an inverted repeat structure or a target sequence in the nucleic acid are performed based on the signal intensity. It can be carried out. The reading of the signal intensity can be carried out using a commercially available device such as a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN) according to an ordinary method. It is preferable that the obtained data is usually evaluated as a relative value to the signal intensity when no precipitant is added.
一方、標的配列の有無等、定性的な検出であれば、凝集塊を除いた上清の目視確認によっても実施することが可能である。
後述する実施例から明らかなように、本発明のアッセイを用いれば、各標的配列又はこれに対応する核酸プローブを異なる標識でラベルすることにより、多検体を同時処理することも可能である。
On the other hand, qualitative detection, such as the presence or absence of a target sequence, can also be performed by visual confirmation of the supernatant from which aggregates have been removed.
As will be apparent from the examples described later, by using the assay of the present invention, it is possible to simultaneously process multiple samples by labeling each target sequence or a nucleic acid probe corresponding thereto with different labels.
５．５ その他
本発明のアッセイでは、核酸プローブがハイブリダイズしうる標的配列が試料中に存在しない場合においても、インバーテッドリピート構造を有する核酸と遊離の核酸プローブは核酸沈澱剤によって好適に分離される。そして、検出すべき標的配列の有無は、得られる凝集塊や上清を観察することにより判断できる。上記のような場合も、もちろん、本発明のハイブリダイゼーションアッセイの範囲に含まれるものとする。
5.5 Others In the assay of the present invention, a nucleic acid having an inverted repeat structure and a free nucleic acid probe are preferably separated by a nucleic acid precipitant even when a target sequence to which the nucleic acid probe can hybridize is not present in the sample. You. The presence or absence of the target sequence to be detected can be determined by observing the obtained aggregate or supernatant. The above cases are, of course, included in the scope of the hybridization assay of the present invention.
６．親水性基材を用いた固相上でのB/F分離
本発明のアッセイでは、親水性基材を用いた固相上でB/F分離を行ってもよい。固相上でのB/F分離は、液相におけるB/F分離のように遠心による沈澱形成の必要がないため簡便である。
用いられる親水性基材としては、濾紙、ナイロンメンブレン、セルロースエステル類等の一般的にイムノクロマト法で用いられている基材を用いることができる。特に、その表面に負電荷が導入された基材（例えば日本ポール社製バイオダインＣなど）が好ましい。例えば、インバーテッドリピート構造を有する核酸に、標的配列特異的核酸プローブと核酸沈澱剤を加えた反応液を、濾紙上にスポットして展開する。インバーテッドリピート構造を有する核酸と核酸プローブと核酸沈澱剤で形成される凝集塊と、遊離の核酸プローブは固相上での移動度が明確に異なるため、両者は容易に分離することができる。
6. B / F Separation on Solid Phase Using Hydrophilic Substrate In the assay of the present invention, B / F separation may be performed on a solid phase using a hydrophilic substrate. B / F separation on a solid phase is simple because there is no need to form a precipitate by centrifugation unlike B / F separation in a liquid phase.
As the hydrophilic substrate to be used, a substrate generally used in an immunochromatography method, such as filter paper, nylon membrane, and cellulose esters, can be used. In particular, a substrate (eg, Biodyne C manufactured by Nippon Pall Co., Ltd.) having a negative charge introduced into its surface is preferable. For example, a reaction solution obtained by adding a target sequence-specific nucleic acid probe and a nucleic acid precipitant to a nucleic acid having an inverted repeat structure is spotted and developed on filter paper. An aggregate formed by a nucleic acid having an inverted repeat structure, a nucleic acid probe and a nucleic acid precipitant, and a free nucleic acid probe have clearly different mobilities on a solid phase, so that the two can be easily separated.
前記方法では、親水性基材の適当な位置に、あらかじめ核酸沈澱剤をスポットしておいてもよい。インバーテッドリピート構造を有する核酸に標的配列特異的核酸プローブを加えた反応液を基材上で展開すると、核酸沈澱剤がスポットされている位置でインバーテッドリピート構造を有する核酸と核酸プローブと核酸沈澱剤との凝集塊が形成される。 で は In the above method, the nucleic acid precipitating agent may be spotted at an appropriate position on the hydrophilic substrate in advance. When a reaction solution obtained by adding a target sequence-specific nucleic acid probe to a nucleic acid having an inverted repeat structure is developed on a substrate, the nucleic acid having an inverted repeat structure, the nucleic acid probe and the nucleic acid precipitate are deposited at the position where the nucleic acid precipitant is spotted. Agglomerates with the agent are formed.
あるいは、親水性基材の所定の位置に、あらかじめ核酸沈澱剤と標的核酸特異的核酸プローブをスポットして、インバーテッドリピート構造を有する核酸を展開してもよい。この場合、インバーテッドリピート構造を有する核酸が展開されるより前方位置に核酸プローブを、より後方位置に核酸沈澱剤をスポットしておくことが必要である。これにより、基材上で核酸プローブとハイブリダイズしたインバーテッドリピート構造を有する核酸が、さらに核酸沈澱剤のスポット位置まで移動し、凝集塊を形成することができる。凝集塊は、前項同様、核酸プローブあるいはインバーテッドリピート構造を有する核酸のいずれかを標識しておくことにより、容易に検出することができる。 Alternatively, a nucleic acid having an inverted repeat structure may be developed by spotting a nucleic acid precipitant and a target nucleic acid-specific nucleic acid probe at a predetermined position on a hydrophilic substrate in advance. In this case, it is necessary to spot the nucleic acid probe at a position before the nucleic acid having the inverted repeat structure is developed and the nucleic acid precipitant at a position behind the nucleic acid. As a result, the nucleic acid having an inverted repeat structure hybridized with the nucleic acid probe on the base material can be further moved to the spot position of the nucleic acid precipitating agent to form an aggregate. Aggregates can be easily detected by labeling either the nucleic acid probe or the nucleic acid having an inverted repeat structure as in the preceding paragraph.
７．標的配列のハイブリダイゼーションアッセイ用キット
本発明はまた、本発明のハイブリダイゼーションアッセイに用いられるキットを提供する。該キットは、以下のi）〜vi）の少なくとも一つ以上を含む。
7. Kit for hybridization assay of target sequence The present invention also provides a kit used for the hybridization assay of the present invention. The kit includes at least one of the following i) to vi).
i）以下の(a)及び／又は(b)のインナープライマー、若しくはそれらの標識物
(a) 鋳型核酸上の標的配列の3’側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸上の標的配列の5’側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー
ii）以下の(c)及び／又は(d)のアウタープライマー
(c) 鋳型核酸鎖上の任意配列F2cよりも3'末端方向に任意配列F3cを選択したとき、該F3cに相補的な配列F3を含むプライマー
(d) 鋳型核酸鎖上の任意配列R2よりも5'末端方向に任意配列R3を選択したとき、該R3と同一の配列を含むプライマー
iii）標的配列の少なくとも一部に相補的な配列、又は標的配列の少なくとも一部に相同な配列を含み、該配列又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズしうる核酸プローブ、あるいはその標識物。
iv）核酸沈澱剤
v）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ
vi）要素v)の基質となるヌクレオチド、又はその標識物
ここで、前記核酸沈澱剤は、ハイドロキシアパタイト、ポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リジン、及びジエチルアミノエチル デキストランからなる群より選ばれるいずれか一つ又は二つ以上であることが好ましい。
i) the following inner primers of (a) and / or (b) or their labeled products: (a) in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are selected, a primer containing the same sequence as the F1c and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order (b) When the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are selected in order from the 5 'side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5' end on the template nucleic acid, a sequence R1c complementary to the R1 is selected. And a primer containing the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
ii) Outer primer of the following (c) and / or (d): (c) When an arbitrary sequence F3c is selected in the direction of the 3 ′ end from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid chain, a sequence F3 complementary to the F3c is selected. (D) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 ′ end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3
iii) A nucleic acid probe containing a sequence complementary to at least a part of the target sequence or a sequence homologous to at least a part of the target sequence, and capable of specifically hybridizing to the sequence or its complementary strand, or a labeled product thereof.
iv) Nucleic acid precipitant
v) DNA polymerase that catalyzes strand displacement complementary strand synthesis
vi) A nucleotide serving as a substrate of element v) or a labeled product thereof, wherein the nucleic acid precipitating agent is any one selected from the group consisting of hydroxyapatite, polyethyleneimine, protamine sulfate, poly-L-lysine, and diethylaminoethyl dextran. Preferably, one or two or more.
また上記キットは、LAMP増幅をより効率的に進めるために、以下の(e)及び／又は(f)のループプライマー、あるいはその標識物をさらに含んでいてもよい。
(e) インナープライマー上のF1c及びF2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
(f) インナープライマー上のR1c及びR2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
In addition, the kit may further include the following loop primer (e) and / or (f) or a labeled product thereof in order to promote LAMP amplification more efficiently.
(e) A primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer (f) A primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer
本発明のキットには、上記必須構成要素のほか、必要に応じて融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンN-オキシド等）、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な他の試薬類を含んでいても良い。さらに、該キットは、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給するものであってもよい。 The kit of the present invention includes, in addition to the above-mentioned essential components, a melting temperature regulator (for example, betaine, trimethylamine N-oxide, etc.), a buffer solution that provides suitable conditions for the enzymatic reaction, and a synthesis reaction product, if necessary. It may contain other reagents necessary for detection. Further, the kit may supply reagents necessary for one reaction in a state of being dispensed into a reaction container.
８．本発明のハイブリダイゼーションアッセイの利用
本発明のアッセイは微量な検出対象をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。このアッセイは多検体同時処理が可能であるとともに、処理の自動化やリアルタイムモニタリングも可能である。したがって、生物試料中に含まれる微量な遺伝子の検出等、種々の核酸のハイブリダイゼーションアッセイへの応用が期待される。以下、そのような応用例について説明する。
8. Use of the Hybridization Assay of the Present Invention The assay of the present invention can detect a very small amount of a detection target regardless of its chain length with high sensitivity and ease. This assay allows simultaneous processing of multiple samples, as well as automated processing and real-time monitoring. Therefore, application to various nucleic acid hybridization assays, such as detection of a trace amount of a gene contained in a biological sample, is expected. Hereinafter, such an application example will be described.
（１）増幅産物と未反応プライマーを区別する方法
本発明のアッセイは、長鎖核酸と短鎖核酸の効果的な区別（分離）を可能とする。したがって、本発明のアッセイを利用すれば、核酸増幅反応における未反応プライマーとその伸長物（増幅産物）を効果的に区別することも可能である。
例えば、２．２の（１）に記載したX1c+X2構造を有するプライマーを用いた増幅法における該プライマー、あるいは同（２）に記載したLAMP法におけるインナープライマーやループプライマーを標識して増幅を行い、その反応液に核酸沈澱剤を添加すれば、得られた凝集塊や上清を観察することで、増幅産物と未反応プライマーを区別（分離）することが可能となる。
(1) Method for distinguishing amplification product from unreacted primer The assay of the present invention enables effective distinction (separation) between long nucleic acid and short nucleic acid. Therefore, by utilizing the assay of the present invention, it is possible to effectively distinguish unreacted primers and their extension products (amplification products) in a nucleic acid amplification reaction.
For example, amplification is performed by labeling the primer in the amplification method using the primer having the X1c + X2 structure described in 2.2 (1) or the inner primer or the loop primer in the LAMP method described in (2). When the nucleic acid precipitating agent is added to the reaction solution, the amplified product and the unreacted primer can be distinguished (separated) by observing the resulting aggregates and supernatant.
（２）ＳＮＰ（一塩基多型）の検出方法
本発明のアッセイは、微量な標的遺伝子を効率良く増幅し、高感度に検出することを可能にする。したがって、ゲノム中の多型、特に一塩基多型の検出にも好適に利用することができる。一塩基多型の検出では、標的配列にマッチした核酸プローブと一塩基ミスマッチの核酸プローブを用意し、これらを同時にハイブリダイズさせ、後は前記した手順どおり核酸沈澱剤を加えてアッセイを行う。
(2) Method for Detecting SNP (Single Nucleotide Polymorphism) The assay of the present invention enables a small amount of a target gene to be efficiently amplified and detected with high sensitivity. Therefore, it can be suitably used for detecting polymorphisms in a genome, particularly single nucleotide polymorphisms. In the detection of a single nucleotide polymorphism, a nucleic acid probe matched with a target sequence and a single nucleotide mismatched nucleic acid probe are prepared, hybridized at the same time, and then assayed by adding a nucleic acid precipitant according to the above-described procedure.
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕 ポリエチレンイミン（PEI）による2検体同時検出
１．試験方法
PSA（prostate-specific antigen cDNA fragment；配列番号1）、λ-DNA（宝酒造；GenBank Accession No.J02459）の配列をもとに、LAMP用プライマーを設計し、LAMP反応を行った。LAMP反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、表１に示す反応液組成にて、65℃、60分反応させた。次いで、反応液に3’末端をFITC又はROCラベルした検出用プローブを各々40nMになるよう添加し、65℃で5分間インキュベートした。さらに1MのPEI（重合度14）を反応液25μlに対して1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[Example 1] Simultaneous detection of two samples using polyethyleneimine (PEI) Test Method LAMP primers were designed based on the sequences of PSA (prostate-specific antigen cDNA fragment; SEQ ID NO: 1) and λ-DNA (Takara Shuzo; GenBank Accession No. J02459), and a LAMP reaction was performed. In the LAMP reaction, the reaction was performed at 65 ° C. for 60 minutes in the reaction solution composition shown in Table 1 without heat denaturation of the template nucleic acid. Next, a detection probe having a 3 ′ end labeled with FITC or ROC was added to the reaction solution to a concentration of 40 nM, respectively, and incubated at 65 ° C. for 5 minutes. Further, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 minute.
PSA用プライマー及びプローブ：
FIP; 5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3'(配列番号5)
RIP; 5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3'(配列番号6)
F3; 5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3'(配列番号7)
R3; 5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3'(配列番号8)
probe; 5'-TTTCATCCTGAAGACACAGG-3'(3'末端はFITC標識；配列番号9)
（FIP、RIPはそれぞれForward Inner Primer、Reverese Inner Primerを、F3、R3はそれぞれForward Outer Primer、Reverse Outer Primerを示す。）
PSA primers and probes:
FIP; 5'-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 5)
RIP; 5'-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3 '(SEQ ID NO: 6)
F3; 5'-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3 '(SEQ ID NO: 7)
R3; 5'-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 8)
probe; 5'-TTTCATCCTGAAGACACAGG-3 '(3' end is FITC-labeled; SEQ ID NO: 9)
(FIP and RIP stand for Forward Inner Primer and Reverese Inner Primer, respectively, and F3 and R3 stand for Forward Outer Primer and Reverse Outer Primer, respectively.)
λ-DNA用プライマー及びプローブ：
FIP; 5'-TCCCCTCAGAACATAACATAGTAATGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTC-3'(配列番号10)
RIP; 5'-TGAAAATTCCCCTAATTCGATGAGGTCGGCGCATAGCTGATAACAAT-3'(配列番号11)
F3; 5'-GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGC-3'(配列番号12)
R3; 5'-GCTGATCGGCAAGGTGTTCT-3'(配列番号13)
probe；5'-CCATTCTTCATAATTCAATCCAT-3'(3'末端はROX標識；配列番号14)
Primers and probes for λ-DNA:
FIP; 5'-TCCCCTCAGAACATAACATAGTAATGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTC-3 '(SEQ ID NO: 10)
RIP; 5'-TGAAAATTCCCCTAATTCGATGAGGTCGGCGCATAGCTGATAACAAT-3 '(SEQ ID NO: 11)
F3; 5'-GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 12)
R3; 5'-GCTGATCGGCAAGGTGTTCT-3 '(SEQ ID NO: 13)
probe; 5'-CCATTCTTCATAATTCAATCCAT-3 '(3' end is ROX-labeled; SEQ ID NO: 14)
２．検出
１）目視観察
チューブ内に堆積した沈澱物を蛍光イルミネーター（波長365nm）で励起して目視観察した。
２）蛍光測定
PEI 沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて以下の条件で測定した。
FITC測定条件 励起波長 485nm ; 測定波長 535nm
ROX測定条件 励起波長 560nm ; 測定波長 595nm
2. Detection 1) Visual observation The precipitate deposited in the tube was excited with a fluorescent illuminator (wavelength 365 nm) and visually observed.
2) Fluorescence measurement The fluorescence intensity of the supernatant after PEI precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN) under the following conditions.
FITC measurement conditions Excitation wavelength 485nm; Measurement wavelength 535nm
ROX measurement conditions Excitation wavelength 560nm; Measurement wavelength 595nm
３．結果
１）目視観察
全てのチューブには、FITCラベルしたPSA用プローブとROXラベルしたλ-DNA用プローブが含まれているが、PSAのみが増幅されているチューブ（図１左）ではFITCの蛍光色（緑）が、λ-DNAのみが増幅されているチューブ（図1右）ではROXの蛍光色（赤）が目視確認できた。また、どちらも増幅されているチューブ（図１中）ではそれらの中間色（オレンジ）が目視確認できた。すなわち、LAMP産物のPEI沈澱により完全なB/F分離ができることが確認できた。
２）蛍光測定
各サンプルの相対蛍光強度（PEI無添加時の蛍光に対する、添加後の上清の蛍光強度比）を図２に示す。プローブが結合するLAMP産物が存在している上清では明らかに蛍光強度が減少しており、PEI沈澱により2検体の同時検出が可能なことが確認された。
3. Result 1) Visual observation All tubes contain FITC-labeled PSA probes and ROX-labeled λ-DNA probes, but FITC fluorescence was observed in tubes in which only PSA was amplified (Fig. 1, left). In the tube where the color (green) was amplified only with λ-DNA (right in FIG. 1), the fluorescent color (red) of ROX could be visually confirmed. In addition, in the tubes (in FIG. 1) in which both were amplified, their intermediate colors (orange) could be visually confirmed. That is, it was confirmed that complete B / F separation was possible by PEI precipitation of the LAMP product.
2) Fluorescence measurement FIG. 2 shows the relative fluorescence intensity (the ratio of the fluorescence intensity of the supernatant after addition to the fluorescence without PEI) of each sample. In the supernatant containing the LAMP product to which the probe binds, the fluorescence intensity was clearly reduced, and it was confirmed that simultaneous detection of two samples was possible by PEI precipitation.
〔実施例２〕 硫酸プロタミン及びポリ−L−リジンによるλ-DNAの検出
１．試験方法
実施例１と同様にしてPSA及びλ-DNAをLAMP増幅し、λ-DNAプローブのみを40nM添加し、65℃で5分間インキュベートした。次いで、10mg/ml 硫酸プロタミン（大和化成株式会社製）及び4M ポリ-L-リジン（Mw 4000-15000；Sigma社製）をそれぞれ反応液25μlに対して1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いてROC測定条件（励起波長 560nm ; 測定波長 595nm）で測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図３に示す。この結果から、硫酸プロタミン、ポリ-Ｌ-リジンでもPEI同様のB/F分離が可能なことが確認できた。
[Example 2] Detection of λ-DNA by protamine sulfate and poly-L-lysine Test method PSA and λ-DNA were LAMP-amplified in the same manner as in Example 1, only 40 nM of λ-DNA probe was added, and the mixture was incubated at 65 ° C for 5 minutes. Next, 1 μl of 10 mg / ml protamine sulfate (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.) and 4M poly-L-lysine (Mw 4000-15000; manufactured by Sigma) were added to 25 μl of the reaction solution, respectively, and incubated at 65 ° C. for 1 minute. .
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN) under ROC measurement conditions (excitation wavelength: 560 nm; measurement wavelength: 595 nm).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. From these results, it was confirmed that B / F separation similar to PEI was possible with protamine sulfate and poly-L-lysine.
〔実施例３〕B/F分離に対する温度の影響
１．試験方法
実施例１と同様にPSA及びλ-DNAをLAMP増幅し、PSA検出用プローブを40nMになるように添加した。この反応液25μlに、種々の温度条件下で1MのPEI（重合度14）を1μl添加し、１分間インキュベートした。
比較のため、LAMP産物を含まないPSA検出用プローブ溶液に同様の条件でPEIを添加しインキュベートした。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの、相対蛍光強度を図４及び図５に示す。その結果、22℃、77℃、及び99℃では、PSAのLAMP産物では明らかなB/F分離の低下が確認され、沈澱剤添加時の温度は20〜70℃程度が好ましいと思われた。一方、LAMP産物を含まない溶液では、PEIとプローブ間の反応には温度依存性は認められず、遊離のプローブは核酸沈澱剤によって沈澱していないことが確認された。
Example 3 Effect of temperature on B / F separation Test method PSA and λ-DNA were LAMP-amplified in the same manner as in Example 1, and a PSA detection probe was added to a concentration of 40 nM. To 25 μl of the reaction solution, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added under various temperature conditions, and the mixture was incubated for 1 minute.
For comparison, PEI was added to the probe solution for PSA detection containing no LAMP product under the same conditions and incubated.
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIGS. As a result, at 22 ° C., 77 ° C., and 99 ° C., a clear decrease in B / F separation was confirmed in the LAMP product of PSA, and it was considered that the temperature at the time of adding the precipitant was preferably about 20 to 70 ° C. On the other hand, in the solution containing no LAMP product, the temperature dependence was not observed in the reaction between PEI and the probe, and it was confirmed that the free probe was not precipitated by the nucleic acid precipitant.
〔実施例４〕 B/F分離に対する核酸沈澱剤（PEI）の濃度の影響
１．試験方法
実施例１と同様にPSA及びλ-DNAをLAMP増幅し、PSA検出用プローブを40nMになるように添加した。この反応液25μlに、種々の濃度のPEI（重合度14）を1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。
さらに重合度42のPEIを同様に種々の濃度でLAMP産物とPSA検出用プローブを含む反応液に添加しインキュベートした。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図６及び図７に示す。その結果より、PEIの添加濃度が高すぎても低すぎてもB/F分離は不調になることが確認された。重合度14のPEIの場合、0.1〜2M程度が好ましい濃度と考えられた。また、遊離のプローブは、PEIによってほとんど沈澱しないことが確認された。
[Example 4] Effect of concentration of nucleic acid precipitant (PEI) on B / F separation Test method PSA and λ-DNA were LAMP-amplified in the same manner as in Example 1, and a PSA detection probe was added to a concentration of 40 nM. 1 μl of various concentrations of PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 minute.
Further, PEI having a polymerization degree of 42 was similarly added to the reaction solution containing the LAMP product and the PSA detection probe at various concentrations, followed by incubation.
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIGS. From the results, it was confirmed that the B / F separation was unsatisfactory whether the added concentration of PEI was too high or too low. In the case of PEI having a polymerization degree of 14, a concentration of about 0.1 to 2 M was considered to be a preferable concentration. It was also confirmed that the free probe hardly precipitated by PEI.
重合度42のPEI沈澱の結果から、PEIでは重合度が高くなると、B/F分離能が低下することが確認された。このB/F分離能の低下は、λDNA-LAMP産物に比べて、PSA-LAMP産物のほうが大きかったが、目視では明確な差違は確認できなかった。PEIについては、その重合度は40以下程度であることが好ましいと思われた。 結果 From the result of the precipitation of PEI having a polymerization degree of 42, it was confirmed that the higher the degree of polymerization, the lower the B / F separation ability of PEI. This decrease in B / F resolution was greater for the PSA-LAMP product than for the λDNA-LAMP product, but no clear difference could be confirmed visually. Regarding PEI, it was considered that the degree of polymerization was preferably about 40 or less.
〔実施例５〕 B/F分離に対する核酸沈澱剤（PEI）添加量の検討
１．試験方法
実施例１と同様にPSA及びλ-DNAをLAMP増幅し、PSA検出用プローブを40nMになるように添加した。この反応液25μlに、1MのPEI（重合度14）を様々に希釈し、希釈倍率分だけ添加量を増やして添加し、65℃で1分間インキュベートした。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図８に示す。その結果、PEIの濃度が低くても添加量が多ければ良好なB/F分離が得られることが確認された。すなわち、良好なB/F分離には、PEIの濃度ではなく、反応液中に添加されるPEIの絶対量が重要であることが確認された。重合度14のPEIの場合、実施例4の結果とあわせて考えると、25μlの反応液に対して、PEIをおよそ4μg〜200μg添加することが好ましいと考えられた。
[Example 5] Examination of the amount of nucleic acid precipitant (PEI) added for B / F separation Test method PSA and λ-DNA were LAMP-amplified in the same manner as in Example 1, and a PSA detection probe was added to a concentration of 40 nM. To 25 μl of this reaction solution, 1 M PEI (degree of polymerization 14) was variously diluted, added in increasing amounts by the dilution factor, and incubated at 65 ° C. for 1 minute.
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. As a result, it was confirmed that good B / F separation was obtained with a large amount of PEI even if the concentration of PEI was low. That is, it was confirmed that not the PEI concentration but the absolute amount of PEI added to the reaction solution was important for good B / F separation. In the case of PEI having a degree of polymerization of 14, it is considered that it is preferable to add about 4 μg to 200 μg of PEI to 25 μl of the reaction solution in consideration of the results of Example 4.
〔実施例６〕M13増幅系における鋳型非依存性プライマー伸張物の識別
プライマーの設計が不十分な場合、鋳型を含まないLAMP反応液を長時間反応させると、鋳型DNA配列に非依存性のプライマー伸張物が生成する場合がある。PEI沈澱法で、このプライマー伸張物と正規のLAMP産物との区別を試みた。
１．試験方法
まず、鋳型としてM13mp18（配列番号2）の配列をもとに、LAMP用プライマーを設計し、LAMP反応を行った。LAMP反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、実施例１と同様の反応液組成（表1）にて、65℃、180分反応させた。次いで、反応液に3’末端をFITCラベルしたLAMP産物検出用プローブ及びPrimer伸長物検出用プローブ を各々40nMになるように添加し、65℃で5分間インキュベートした。さらに1MのPEI（重合度14）を反応液25μlに対して1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。
[Example 6] Identification of template-independent primer extension in M13 amplification system When the primer design is insufficient, a long time reaction of a template-free LAMP reaction solution results in a primer independent of the template DNA sequence. An extension may be formed. An attempt was made to distinguish this primer extension from the regular LAMP product by PEI precipitation.
1. Test Method First, a LAMP primer was designed based on the sequence of M13mp18 (SEQ ID NO: 2) as a template, and a LAMP reaction was performed. In the LAMP reaction, the reaction was carried out at 65 ° C. for 180 minutes using the same reaction solution composition as in Example 1 (Table 1) without heat denaturation of the template nucleic acid. Next, a LAMP product detection probe and a Primer extension detection probe each having a 3′-end FITC-labeled at the 3 ′ end were added to the reaction solution at a concentration of 40 nM, respectively, and incubated at 65 ° C. for 5 minutes. Further, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 minute.
M13用プライマー及びプローブ
FIP; 5'-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT-3'(配列番号15)
RIP; 5'-ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC-3'(配列番号16)
F3; 5'-ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA-3'(配列番号17)
R3; 5'-GTTGGGAAGGGCGATCG-3'(配列番号18)
LAMP産物検出用probe; 5'-ACAGCTATGACCATGATTACG-3'
(3'末端はFITC標識；配列番号19)
primer伸張物検出用probe; 5'-GCGTAATAGCAAGAGGC-3'
(3'末端はFITC標識；配列番号20)
M13 primers and probes
FIP; 5'-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT-3 '(SEQ ID NO: 15)
RIP; 5'-ACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC-3 '(SEQ ID NO: 16)
F3; 5'-ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA-3 '(SEQ ID NO: 17)
R3; 5'-GTTGGGAAGGGCGATCG-3 '(SEQ ID NO: 18)
Probe for detecting LAMP product; 5'-ACAGCTATGACCATGATTACG-3 '
(The 3 'end is labeled with FITC; SEQ ID NO: 19)
probe for detecting primer extension; 5'-GCGTAATAGCAAGAGGC-3 '
(The 3 'end is labeled with FITC; SEQ ID NO: 20)
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図９に示す。その結果、正規のLAMP産物では上清の蛍光強度が減少したが、プライマー伸張物では上清の蛍光強度があまり減少しなかった。一方、プライマーにハイブリダイズ可能なプローブ（プライマーのR2部分の相補鎖）を用いた場合は、正規のLAMP産物でもプライマー伸張物でも上清の蛍光強度が減少した。したがって、本発明のアッセイにより、正規のLAMP産物とプライマー伸張物を識別できることが確認てきた。
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. As a result, the fluorescence intensity of the supernatant decreased with the regular LAMP product, but the fluorescence intensity of the supernatant did not decrease significantly with the primer extension. On the other hand, when a hybridizable probe (complementary strand of the R2 portion of the primer) was used as the primer, the fluorescence intensity of the supernatant decreased with both the regular LAMP product and the primer extension. Therefore, it was confirmed that the assay of the present invention can discriminate between a regular LAMP product and a primer extension.
〔実施例７〕 HBV増幅系におけるミスマッチの区別
1塩基のみが異なるプローブのPEI沈澱法による識別が可能か否かを検討した。
１．試験方法
まず、鋳型としてpBR322にクローニングしたHBV DNA（配列番号3）の配列をもとに、LAMP用プライマーを設計し、LAMP反応を行った。LAMP反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、実施例１と同様の反応液組成（表1）にて、60℃、60分反応させた。次いで、反応液に3’末端をFITCラベルしたマッチプローブ及びミスマッチプローブを各々40nMになるように添加し、25℃で5分間インキュベートした。さらに1MのPEI（重合度14）を反応液25μlに対して1μl添加し、25℃で1分間インキュベートした。
[Example 7] Discrimination of mismatch in HBV amplification system It was examined whether or not a probe differing only by one base could be distinguished by PEI precipitation.
1. Test Method First, a primer for LAMP was designed based on the sequence of HBV DNA (SEQ ID NO: 3) cloned into pBR322 as a template, and a LAMP reaction was performed. In the LAMP reaction, the reaction was performed at 60 ° C. for 60 minutes using the same reaction solution composition as in Example 1 (Table 1) without heat denaturation of the template nucleic acid. Next, a match probe and a mismatch probe each having a 3′-end FITC-labeled were added to the reaction solution to a concentration of 40 nM, respectively, and incubated at 25 ° C. for 5 minutes. Further, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 1 minute.
HBV用プライマー及びプローブ
FIP; 5'-CCTACACAGACGCCGCAAAATAGCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3'(配列番号21)
RIP; 5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTCCATACAACGGGCAAACAG-3'(配列番号22)
F3; 5'-AAATTCGCAGTCCCCAACC-3'(配列番号23)
R3; 5'-AGGTCCTTGTAGTTGGT-3'(配列番号24)
マッチプローブ
FL10; 5'-ATAGCCAGGA-3'(3'末端はFITC標識；配列番号25)
ミスマッチプローブ
FL10_a; 5'-ATAGCAAGGA-3'(3'末端はFITC標識；配列番号26)
FL10_t; 5'-ATAGCTAGGA-3'(3'末端はFITC標識；配列番号27)
FL10_g; 5'-ATAGCGAGGA-3'(3'末端はFITC標識；配列番号28)
HBV primers and probes
FIP; 5'-CCTACACAGACGCCGCAAAATAGCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 21)
RIP; 5'-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTCCATACAACGGGCAAACAG-3 '(SEQ ID NO: 22)
F3; 5'-AAATTCGCAGTCCCCAACC-3 '(SEQ ID NO: 23)
R3; 5'-AGGTCCTTGTAGTTGGT-3 '(SEQ ID NO: 24)
Match probe
FL10; 5'-ATAGCCAGGA-3 '(3' end is FITC-labeled; SEQ ID NO: 25)
Mismatch probe
FL10_a; 5′-ATAGCAAGGA-3 ′ (3 ′ end is FITC-labeled; SEQ ID NO: 26)
FL10_t; 5′-ATAGCTAGGA-3 ′ (3 ′ end is FITC-labeled; SEQ ID NO: 27)
FL10_g; 5'-ATAGCGAGGA-3 '(3' end is FITC labeled; SEQ ID NO: 28)
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図１０に示す。その結果、プローブ内に１塩基のミスマッチを導入しても、ミスマッチがある場合（FL10_a, t, g）とマッチしている場合(FL10)を本発明のアッセイで区別できることが確認された。また、プローブが短くて融解温度（Tm）が低い場合（FL10のTmは28.5℃）でも、PEI添加時の温度を下げることで、良好な識別が可能なことが確認された。以上より、PEIは、良好なB/F分離を可能にすることが明らかになった。すなわち、LAMP反応でSNP部位を含む領域を増幅した後、そのSNPを認識するプローブ及びPEIを反応させることにより、SNPの識別が可能であることが確認された。
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. As a result, it was confirmed that even when a single base mismatch was introduced into the probe, the case of the mismatch (FL10_a, t, g) and the case of the match (FL10) could be distinguished by the assay of the present invention. In addition, even when the probe was short and the melting temperature (Tm) was low (Tm of FL10 was 28.5 ° C.), it was confirmed that good discrimination was possible by lowering the temperature at the time of adding PEI. From the above, it became clear that PEI enables good B / F separation. That is, it was confirmed that the SNP can be identified by amplifying a region including the SNP site by the LAMP reaction and then reacting the probe with PEI recognizing the SNP and PEI.
〔実施例８〕 B/F分離に対するイオン強度の影響
１．試験方法
LAMP反応液を常法にしたがってフェノール-クロロフォルム抽出及びエタノール沈澱し精製した（この時点でイオン強度はゼロと見なした）。そのLAMP産物に対して、任意のイオン強度となるようにKCl溶液を添加した。その後、実施例１と同様の方法でPSAとλ-DNAについてPEI沈澱を行った。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図１１に示す。イオン強度が高いと、B/F分離能が低下する。これは、イオン強度が高いとPEIとDNA間の静電的相互作用が阻害され、十分な沈澱形成反応が起こらないためと思われる。この結果から、良好なB/F分離には、イオン強度は少なくとも0.15以下であることが必要であることが確認された。
Example 8 Effect of ionic strength on B / F separation Test Method The LAMP reaction solution was purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation according to a conventional method (at this time, the ionic strength was regarded as zero). A KCl solution was added to the LAMP product so as to have an arbitrary ionic strength. Thereafter, PSA and λ-DNA were subjected to PEI precipitation in the same manner as in Example 1.
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. If the ionic strength is high, the B / F separation ability decreases. This is probably because if the ionic strength is high, the electrostatic interaction between PEI and DNA is inhibited, and a sufficient precipitation reaction does not occur. From these results, it was confirmed that the ionic strength needs to be at least 0.15 or less for good B / F separation.
〔実施例９〕 B/F分離に対するpHの影響
PEI沈澱法によるB/F分離の効率へのpHの影響を調べた。
１．試験方法
実施例１と同様にPSA及びλ-DNAをLAMP増幅し、種々の濃度の希HClあるいはKOH水溶液を5μl添加した。そこにPSA検出用プローブを40nMになるように添加して65℃で5分間インキュベート後、その反応液25μlに1MのPEI（重合度14）を1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。なお、用いた蛍光色素(FITC)の蛍光強度がpH依存性を持つので、コントロール（PEI無添加）のpHも各サンプルと同じpHとなるように調整した。
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図１２に示す。PHが高い場合、極端なB/F分離能の低下が認められた。これは、pHが高いためプローブがLAMP産物にハイブリしなくなったためと思われる。PHが低い場合もわずかにB/F分離能が低下した。これは、DNAのリン酸基がプロトン化することでその負電荷が減少したためと思われた。PEIがプロトン化すれば、その正電荷は増加するはずなので、良好なB/F分離を得るためには、DNAの負電荷量とPEIの正電荷量（両者のpKaによる）に至適の範囲があると推定される。本実施例の場合、およそpHが6から10の範囲が至適であると考えられた。
Example 9 Effect of pH on B / F separation The effect of pH on the efficiency of B / F separation by the PEI precipitation method was examined.
1. Test method PSA and λ-DNA were LAMP-amplified in the same manner as in Example 1, and 5 μl of various concentrations of diluted HCl or KOH aqueous solutions were added. A PSA detection probe was added thereto at 40 nM and incubated at 65 ° C. for 5 minutes. Then, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 minute. Since the fluorescence intensity of the used fluorescent dye (FITC) has pH dependence, the pH of the control (without PEI added) was also adjusted to be the same as that of each sample.
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. When the pH was high, an extreme decrease in B / F separation ability was observed. This may be because the probe was not hybridized to the LAMP product due to the high pH. Even when the pH was low, the B / F resolution was slightly reduced. This was probably because the protonation of the phosphate group of DNA reduced its negative charge. If PEI becomes protonated, its positive charge should increase. Therefore, in order to obtain good B / F separation, the optimal range of the negative charge of DNA and the positive charge of PEI (depending on both pKa) It is estimated that there is. In the case of this example, it was considered that the pH range of about 6 to 10 was optimal.
〔実施例１０〕 ペプチド核酸プローブ用いたPEI沈澱
DNAプローブ自身もLAMP産物同様に負電荷を持つので、ある程度はPEIと結合してしまう。これは、本検出法のバックグランドノイズとなる。ペプチド核酸は、負電荷を持たないという点で、DNAプローブより本検出法に用いるプローブとして適している可能性がある。そこで、蛍光標識したペプチド核酸をプローブとした同様の実験を試みた。
１．試験方法
まず、鋳型としてk-Ras（配列番号4）の配列をもとに、LAMP用プライマーを設計し、LAMP反応を行った。LAMP反応は、鋳型核酸の熱変性を行わず、実施例１と同様の反応液組成（表1）にて、60℃、60分反応させた。次いで、反応液に3’末端をFITCラベルしたペプチド核酸（PNA）プローブを40nMになるように添加し、65℃で5分間インキュベートした。さらに1MのPEI（重合度14）を反応液25μlに対して1μl添加し、65℃で1分間インキュベートした。
比較のため、同様にPSAのLAMP産物にペプチド核酸プローブとPEIを添加し、検出を行った。
Example 10 PEI Precipitation Using Peptide Nucleic Acid Probe Since the DNA probe itself has a negative charge like the LAMP product, it binds to PEI to some extent. This is the background noise of the present detection method. Peptide nucleic acids may be more suitable as probes for use in the present detection method than DNA probes in that they have no negative charge. Therefore, a similar experiment using a fluorescently labeled peptide nucleic acid as a probe was attempted.
1. Test Method First, a LAMP primer was designed based on the sequence of k-Ras (SEQ ID NO: 4) as a template, and a LAMP reaction was performed. In the LAMP reaction, the reaction was performed at 60 ° C. for 60 minutes using the same reaction solution composition as in Example 1 (Table 1) without heat denaturation of the template nucleic acid. Next, a peptide nucleic acid (PNA) probe whose 3 ′ end was labeled with FITC was added to the reaction solution to a concentration of 40 nM, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 5 minutes. Further, 1 μl of 1 M PEI (degree of polymerization 14) was added to 25 μl of the reaction solution, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 minute.
For comparison, a peptide nucleic acid probe and PEI were similarly added to the LAMP product of PSA, and detection was performed.
k-RAS用プライマー及びプローブ
FIP; 5'-CTACGCCACCAGCTCCAACTTTTTATAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3'(配列番号29)
RIP; 5'-CAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCG-3'(配列番号30)
F3; 5'-TGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTC-3'(配列番号31)
R3; 5'-ATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3'(配列番号32)
Probe 5'-TACGCCACCAGCTCC-3'(FITCラベル；配列番号33)
Primers and probes for k-RAS
FIP; 5'-CTACGCCACCAGCTCCAACTTTTTATAAGGCCTGCTGAAAATGACT-3 '(SEQ ID NO: 29)
RIP; 5'-CAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCG-3 '(SEQ ID NO: 30)
F3; 5'-TGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTC-3 '(SEQ ID NO: 31)
R3; 5'-ATCAAAGAATGGTCCTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 32)
Probe 5'-TACGCCACCAGCTCC-3 '(FITC label; SEQ ID NO: 33)
PNAプローブの蛍光標識法
100mM リン酸buffer (pH7.0)中 で10μMのPNA probe及び10uMの Fluorescein Succinimidyl Ester を混合し、遮光下、37℃で2h反応を行った。この反応液をDWで10倍希釈し1μMのFITC-PNAとして実験に用いた。
Fluorescent labeling of PNA probe
10 μM of a PNA probe and 10 μM of Fluorescein Succinimidyl Ester were mixed in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) and reacted at 37 ° C. for 2 hours under light shielding. This reaction solution was diluted 10-fold with DW and used in the experiment as 1 μM FITC-PNA.
２．検出
沈澱後の上清の蛍光強度を、蛍光プレートリーダー polarion（TECAN社製）を用いて測定した。
３．結果
各サンプルの相対蛍光強度を図１３に示す。その結果、ペプチド核酸のプローブを用いても、良好なB/F分離が達成できることが確認された。
2. Detection The fluorescence intensity of the supernatant after precipitation was measured using a fluorescent plate reader polarion (manufactured by TECAN).
3. Results The relative fluorescence intensity of each sample is shown in FIG. As a result, it was confirmed that good B / F separation could be achieved even using a peptide nucleic acid probe.
〔実施例１１〕親水性基材（濾紙）を利用した固相上でのB/F分離
液相でのB/F分離では、PEI-DNA複合体を遠心して沈澱形成させてから目視観察する必要がある。そこで、濾紙のような親水性基材を利用した固相上でのB/F分離を以下の3つの方法；（１）プローブ-LAMP産物-PEI混合液を基材に展開する方法、（２）PEIをあらかじめ基材にスポットしておく方法、（３）PEIとプローブをあらかじめ基材にスポットしておく方法、で試みた。
Example 11 B / F Separation on Solid Phase Using Hydrophilic Substrate (Filter Paper) In B / F separation in a liquid phase, the PEI-DNA complex is centrifuged to form a precipitate and then visually observed. There is a need. Therefore, B / F separation on a solid phase using a hydrophilic substrate such as filter paper is carried out by the following three methods: (1) a method of developing a probe-LAMP product-PEI mixed solution on a substrate, (2) ) The method of spotting PEI on the substrate in advance and the method of (3) spotting PEI and probe on the substrate in advance were tried.
LAMP反応液として、実施例１と同様の方法でPSA及びλ-DNAをLAMP増幅したものを用いた。またプローブとして、PSA及びλ-DNAのそれぞれについて、蛍光プローブ（FITC（緑色）又はROX（赤）標識）と呈色プローブ（SACY5又はSACGP標識）を作製した。SACY5は、Cy5化Strept avidin（フナコシ社；Cy5/streptavidin＝2〜8；青色）、SACGPは、Streptavidin Colloidal Gold Particle（コスモバイオ社；直径15nm；桃色）である。呈色用プローブは、3'biotin化したそれぞれのプローブに各呈色試薬を反応させることにより合成した。
蛍光プローブ
PSA: 5'-TTTCATCCTGAAGACACAGG-FITC （配列番号34）
λ: 5'-ATGGATTGAATTATGAAGAATG-ROX （配列番号35）
呈色プローブ
PSA: 5- TTTCATCCTGAAGACACAGG-SACY5 （配列番号34）
λ: 5'-ATGGATTGAATTATGAAGAATG-SACGP （配列番号35）
As the LAMP reaction solution, a solution obtained by LAMP-amplifying PSA and λ-DNA in the same manner as in Example 1 was used. As a probe, a fluorescent probe (FITC (green) or ROX (red) label) and a color probe (SACY5 or SACGP label) were prepared for each of PSA and λ-DNA. SACY5 is Cy5-modified Streptavidin (Funakoshi; Cy5 / streptavidin = 2 to 8; blue), and SACGP is Streptavidin Colloidal Gold Particle (Cosmo Bio; 15 nm in diameter; pink). The color probes were synthesized by reacting each of the 3′-biotinized probes with each color reagent.
Fluorescent probe
PSA: 5'-TTTCATCCTGAAGACACAGG-FITC (SEQ ID NO: 34)
λ: 5'-ATGGATTGAATTATGAAGAATG-ROX (SEQ ID NO: 35)
Color probe
PSA: 5-TTTCATCCTGAAGACACAGG-SACY5 (SEQ ID NO: 34)
λ: 5'-ATGGATTGAATTATGAAGAATG-SACGP (SEQ ID NO: 35)
（１）プローブ-LAMP産物-PEI混合液を基材に展開する方法
LAMP反応液に、PSA用プローブ及びλ用プローブをそれぞれ1.6pmol、PEI（重合度14）0.4μmolを加えた。その液を濾紙片（ADVANTEC No1）の中心にスポットし、室温で数分放置後スポット部分を観察した。
(1) Method of developing probe-LAMP product-PEI mixed solution on a substrate 1.6 pmol of a PSA probe and 1.6 μmol of a λ probe and 0.4 μmol of PEI (degree of polymerization 14) were added to a LAMP reaction solution. The solution was spotted on the center of a piece of filter paper (ADVANTEC No. 1), left at room temperature for several minutes, and the spot was observed.
蛍光プローブを用いた場合は、蛍光イルミネータ（365nm）上で目視観察した（図14上）。PSAのみ含む試料ではPSA検出用プローブの蛍光色（緑）、λ-DNAのみ含む試料ではλ-DNA検出用プローブの蛍光色（赤）、PSAとλ-DNAを共に含む試料では両蛍光色が混ざった色（橙色）が観察された。 When a fluorescent probe was used, it was visually observed on a fluorescent illuminator (365 nm) (upper in FIG. 14). In the sample containing only PSA, the fluorescence color of the probe for PSA detection (green), in the sample containing only λ-DNA, the fluorescence color of the probe for λ-DNA detection (red), and in the sample containing both PSA and λ-DNA, both fluorescence colors A mixed color (orange) was observed.
呈色プローブを用いた場合、PSAのみ含む試料ではPSA検出用プローブの呈色（青）、λ-DNAのみ含む試料ではλ-DNA検出用プローブの呈色（桃色）が観察された（図14下）。 When the color probe was used, the color of the probe for PSA detection (blue) was observed in the sample containing only PSA, and the color (pink) of the probe for λ-DNA detection was observed in the sample containing only λ-DNA (FIG. 14). under).
（２）PEIをあらかじめ基材にスポットしておく方法
PEI（重合度233）2μmolをあらかじめ濾紙（帯状；日本ポール社バイオダインC）上にスポットして乾燥させ、その一端にλ用呈色プローブを加えたLAMP反応液を滴下して展開し、PEIスポット部でのシグナルを観察した。
λ-DNAのLAMP反応液では、λ-DNA検出用プローブの呈色（桃色）が観察された（図15上）。対応するプローブがないPSAのLAMP反応液やLAMP産物を含まないNegative Contorolでは呈色は観察されなかった（図15中及び下）。
(2) Method of spotting PEI on a substrate in
In the LAMP reaction solution of λ-DNA, the color (pink) of the probe for detecting λ-DNA was observed (upper in FIG. 15). No color was observed in the PSA LAMP reaction solution without the corresponding probe or in the Negative Control containing no LAMP product (FIG. 15 and bottom).
（３）PEIとプローブをあらかじめ基材にスポットしておく方法
λ用蛍光プローブ40pmolとPEI（重合度14）0.4μmolをあらかじめ濾紙（帯状；日本ポール社バイオダインC）上にスポットして乾燥させ、そこにLAMP反応液を滴下して展開した（LAMP産物は、プローブスポット部を通過してからPEI スポット部に達する）。上下どちらの基材にもλ用蛍光プローブがスポットしてある。λ-DNA産物を展開した場合は、PEIスポット部にλ用蛍光プローブの発色が見られた（白黒撮影のため黒いバンドとして観察されている）。一方、PSA産物を展開した場合は、バンドが観察されなかった。なお、ここで用いたバイオダインCは、表面に負電荷を導入した基材であり、こうした基材が本発明の実施には好ましいと思われた。
(3) Method of spotting PEI and probe on a substrate in advance 40 pmol of a fluorescent probe for λ and 0.4 μmol of PEI (degree of polymerization: 14) are spotted in advance on a filter paper (band-shaped; Biodyne C, Nippon Pall Corporation) and dried. Then, the LAMP reaction solution was dropped and developed (the LAMP product reaches the PEI spot after passing through the probe spot). Fluorescent probes for λ are spotted on both the upper and lower substrates. When the λ-DNA product was developed, the color of the λ fluorescent probe was observed at the PEI spot (observed as a black band due to black-and-white photography). On the other hand, when the PSA product was developed, no band was observed. Note that Biodyne C used here was a substrate having a surface into which a negative charge was introduced, and it was considered that such a substrate was preferable for practicing the present invention.
本発明のハイブリダイゼーションアッセイはB/F分離が容易で、微量な標的核酸をその鎖長にかかわらず高感度かつ簡便に検出することができる。したがって該方法は、多検体同時処理、自動処理、リアルタイムモニタリングに利用できる。また、本方法を固相上で行った場合は、B/F分離から検出までの工程が極めて容易になり、特別な装置を一切用いることなく検出操作が行える。このようなシステムは、現在強く開発が望まれている遺伝子Point of care test（POCT）システムへの応用が期待される。 ハ イ The hybridization assay of the present invention facilitates B / F separation, and can detect a very small amount of a target nucleic acid with high sensitivity and convenience regardless of its chain length. Therefore, the method can be used for simultaneous processing of multiple samples, automatic processing, and real-time monitoring. Further, when the present method is performed on a solid phase, the steps from B / F separation to detection become extremely easy, and the detection operation can be performed without using any special device. Such a system is expected to be applied to a gene point of care test (POCT) system, which is currently strongly desired to be developed.
配列番号5−人工配列の説明：プライマー
配列番号6−人工配列の説明：プライマー
配列番号7−人工配列の説明：プライマー
配列番号8−人工配列の説明：プライマー
配列番号9−人工配列の説明：プローブ
配列番号10−人工配列の説明：プライマー
配列番号11−人工配列の説明：プライマー
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配列番号14−人工配列の説明：プローブ
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配列番号31−人工配列の説明：プライマー
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配列番号33−人工配列の説明：プローブ
配列番号34−人工配列の説明：プローブ
配列番号35−人工配列の説明：プローブ
SEQ ID NO: 5-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 6-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 7-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 8-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 9-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 10-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 11-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 12-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 13-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 14-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 15-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 16-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 17-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 18-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 19-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 20-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 21-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 22-Description of Artificial Sequence: Pla SEQ ID NO: 23-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 24-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 25-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 26-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 27-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 28-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 29-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 30-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 31-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 32-Description of Artificial Sequence: Primer SEQ ID NO: 33-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 34-Description of Artificial Sequence: Probe SEQ ID NO: 35-Description of Artificial Sequence: Probe
Claims (19)
(a) 鋳型核酸上の標的配列の3’側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸上の標的配列の5’側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー The assay according to claim 1 or 2, wherein the nucleic acid having an inverted repeat structure is provided by an amplification method using the following primers (a) and / or (b).
(a) when selecting the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, the same as the F1c And the primer comprising the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order.
(b) when the third optional sequence R1 and the fourth optional sequence R2 are selected in order from the 5 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5 ′ end on the template nucleic acid, complementary to the R1 A primer comprising the target sequence R1c and the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
１）鋳型核酸上の標的配列をLAMP増幅し、該標的配列とこれに相補的な配列とを同一鎖上に１回又は２回以上反復して含むインバーテッドリピート構造を有する核酸を得る工程；
２）上記インバーテッドリピート構造を有する核酸に、標的配列に特異的な核酸プローブをハイブリダイズさせる工程；
３）生成したハイブリッドに核酸沈澱剤を吸着させて凝集塊を形成させ、遊離の核酸プローブと分離する工程；及び
４）得られた凝集塊又は上清より、上記インバーテッドリピート構造を有する核酸又は該核酸中の標的配列を検出する工程。 Hybridization assay comprising the following steps:
1) a step of subjecting a target sequence on a template nucleic acid to LAMP amplification to obtain a nucleic acid having an inverted repeat structure containing the target sequence and a sequence complementary thereto repeated once or twice or more on the same strand;
2) a step of hybridizing a nucleic acid probe having the inverted repeat structure with a nucleic acid probe specific to a target sequence;
3) adsorbing a nucleic acid precipitant to the generated hybrid to form an aggregate and separating it from a free nucleic acid probe; and 4) obtaining a nucleic acid having the above inverted repeat structure from the obtained aggregate or supernatant. Detecting a target sequence in the nucleic acid.
i）以下の(a)及び／又は(b)のインナープライマー、若しくはそれらの標識物
(a) 鋳型核酸上の標的配列の3’側から該鋳型核酸上の3'末端方向に向かって、順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cを選択したとき、該F1cと同一の配列及び該F2cに相補的な配列F2を5’側から3’側にこの順で含むプライマー
(b) 鋳型核酸上の標的配列の5’側から該鋳型核酸上の5'末端方向に向かって、順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2を選択したとき、該R1に相補的配列R1c及び該R2と同一の配列R2を5'側から3’側にこの順で含むプライマー
ii）以下の(c)及び／又は(d)のアウタープライマー
(c) 鋳型核酸鎖上の任意配列F2cよりも3'末端方向に任意配列F3cを選択したとき、該F3cに相補的な配列F3を含むプライマー
(d) 鋳型核酸鎖上の任意配列R2よりも5'末端方向に任意配列R3を選択したとき、該R3と同一の配列を含むプライマー
iii）標的配列の少なくとも一部に相補的な配列、又は標的配列の少なくとも一部に相同な配列を含み、該配列又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズしうる核酸プローブ、あるいはその標識物
iv）核酸沈澱剤
v）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼ
vi）要素v)の基質となるヌクレオチド、又はその標識物 A kit for hybridization assay, comprising at least one of the following i) to vi):
i) the following inner primers of (a) and / or (b) or their labeled products: (a) in order from the 3 ′ side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 3 ′ end on the template nucleic acid, When the first arbitrary sequence F1c and the second arbitrary sequence F2c are selected, a primer containing the same sequence as the F1c and the sequence F2 complementary to the F2c from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order (b) When the third arbitrary sequence R1 and the fourth arbitrary sequence R2 are selected in order from the 5 'side of the target sequence on the template nucleic acid toward the 5' end on the template nucleic acid, a sequence R1c complementary to the R1 is selected. And a primer containing the same sequence R2 as the R2 from the 5 ′ side to the 3 ′ side in this order
ii) Outer primer of the following (c) and / or (d): (c) When an arbitrary sequence F3c is selected in the direction of the 3 ′ end from the arbitrary sequence F2c on the template nucleic acid chain, a sequence F3 complementary to the F3c is selected. (D) When an arbitrary sequence R3 is selected in the direction of the 5 ′ end from the arbitrary sequence R2 on the template nucleic acid strand, a primer containing the same sequence as the R3
iii) a nucleic acid probe containing a sequence complementary to at least a part of the target sequence or a sequence homologous to at least a part of the target sequence, and capable of specifically hybridizing to the sequence or its complementary strand, or a labeled product thereof
iv) Nucleic acid precipitant
v) DNA polymerase that catalyzes strand displacement complementary strand synthesis
vi) nucleotide used as a substrate of element v), or a labeled product thereof
(e) インナープライマー上のF1c及びF2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー
(f) インナープライマー上のR1c及びR2の間の任意配列に相補的な配列を含むプライマー The kit according to claim 17, further comprising the following loop primer (e) and / or (f), or a labeled product thereof.
(e) A primer containing a sequence complementary to any sequence between F1c and F2 on the inner primer (f) A primer containing a sequence complementary to any sequence between R1c and R2 on the inner primer
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