JP2004141158A - プライマーの伸長反応検出方法、塩基種判別方法、塩基種判別装置、ピロリン酸の検出装置、核酸の検出方法および試料溶液導入チップ - Google Patents

Abstract

【課題】核酸の塩基配列中の塩基種を判別する簡便な技術を提供する。
【解決手段】核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、および工程（ｅ）の検出結果に基づいて前記核酸の塩基配列中の塩基種を判別する工程（ｆ）を含む。
【選択図】図５

Description

　本発明は、プライマーの伸長反応を検出する伸長反応検出方法、核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別方法、核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別装置、ピロリン酸の検出装置、核酸の検出方法および試料溶液導入チップに関する。

　（第１の従来技術）
　特定の塩基配列を有する核酸の有無を調べる技術は非常に重要な技術である。例えば、遺伝病の診断、細菌およびウイルス等による食品の汚染検査、細菌およびウイルス等の人体への感染検査などにおいて必須の技術である。

　重症複合型免疫不全症、家族性高コレステロール血症等の遺伝病は、特定の遺伝子の欠損が原因で起こることが明らかになっている。このため、上記遺伝病の原因となる特定の塩基配列を有する遺伝子の有無を調べることによって、遺伝病の有無を診断できる。

　近年、大腸菌Ｏ１５７等による食品汚染が社会的問題となっている。このような細菌およびウイルス等による食品の汚染検査は、汚染が疑われる細菌あるいはウイルスに特有のＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列の有無を解析することによって、汚染の有無を判断することができる。人体への感染検査に関しても同様である。

　通常、上述のような特定の核酸の塩基配列の検出技術では、試料である特定の塩基配列を含む核酸が微量である場合が多いので、検出感度が非常に高いことが求められる。現在、最も一般的に用いられている検出技術は、標的塩基配列を有する核酸の増幅法を利用する技術である。例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。これらの核酸の増幅法によって、試料中の標的塩基配列を有する核酸を大量に増幅し、標的塩基配列を有する核酸を検出する。上記の増幅法は、容易に標的塩基配列を有する核酸を増幅できる。しかし、増幅された標的塩基配列を有する核酸を検出する方法には幾つか不具合がある。

　増幅された標的塩基配列を有する核酸を検出するための最も汎用的な方法の１つは、増幅された標的塩基配列を有する核酸を電気泳動によって分離した後、臭化エチジウム等の蛍光インターカレート剤を用いる方法である。この方法は簡便である一方で、蛍光インターカレート剤が発ガン物質であるため、取り扱いには非常に注意を要する。

　また他の方法としてはドットブロット法が挙げられる。ドットブロット法は、まず増幅された標的塩基配列を有する二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを、熱処理によって一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに変性させ、ナイロン等のメンブレンに固定する。続いて、放射性標識あるいは蛍光標識がなされ、かつ上記一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに特異的に反応する核酸プローブをメンブレン上でハイブリダイズさせる。最後に、放射性標識あるいは蛍光標識の検出を行なうことによって増幅された標的塩基配列を有する二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの検出を行なう。しかしこの方法では、放射性標識された核酸プローブを用いる場合、通常１〜５日程度の日数がかかる。また、蛍光標識された核酸プローブを用いる場合でも数時間〜十数時間を要する。さらに、増幅された標的塩基配列を有する核酸のそれぞれに対して、標識された核酸プローブを調製する必要があるため、非常に煩雑である。

　ＰＣＲ法は、通常ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーからのＤＮＡ伸長反応（以下、プライマー伸長反応と称する）を繰り返しながら標的塩基配列を有する核酸を増幅する技術である。プライマー伸長反応を用いた応用は、標的塩基配列を有する核酸の検出に限られない。

　近年では、いわゆるＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）と呼ばれる塩基配列中のわずか１塩基対の多型が糖尿病や高血圧等の疾患に対するなりやすさや、あるいは薬の効きやすさ等に影響を与えていることが明らかになってきている。従って、各個人のＳＮＰパターンを解析する、いわゆるＳＮＰタイピング技術が非常に重要視されている。また、ゲノムＤＮＡにおける塩基配列中のたった１塩基対の置換が重篤な疾病の原因となる例が知られている。従って、このような１塩基対の置換の有無を解析することもまた非常に重要になってきている。ＳＮＰタイピング技術は、このような１塩基対の置換の有無の判別においても有効な技術である。

　現在、様々なＳＮＰタイピング技術が開発あるいは既に実施されている。それらの技術のうち、最も簡便な技術の１つでは、プライマー伸長反応を利用する。この技術では、プライマー伸長反応が起こるか否かを判定することによって、ＳＮＰタイピングを行なう。

　現在、プライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術は、大きく二種類に分けられる。一方は、４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を用いるプライマー伸長反応を利用する方法であり、もう一方は、一種類のｄＮＴＰあるいはｄｄＮＴＰのみを用いるプライマー伸長反応を利用する方法である。

　４種類のｄＮＴＰを用いてプライマー伸長反応を利用する方法を図１９および図２０を参照しながら説明する。この方法では、標的ＤＮＡのＳＮＰ部位に隣接する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種に応じて伸長反応の進行に差を生じさせるプライマー（以下、タイピングプライマーと称する）を用いる。具体的には、以下に説明する工程を実施する。

　まず、図１９（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ１を有する標的のＤＮＡ１を含む試料溶液を調製する。同様に、図２０（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ２を有する標的のＤＮＡ２を含む試料溶液を調製する。

　次に、図１９（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ１を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ３および４とする。同様に、図２０（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ２を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ５および６とする。

　次に、図１９（ｃ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ３および４を含む試料溶液に、タイピングプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰを添加する。同様に、図２０（ｃ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ５および６を含む試料溶液に、タイピングプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰを添加する。ここで、タイピングプライマー７は、その３’末端の塩基（ここでは、チミン（以下Ｔと記す））以外は、一本鎖ＤＮＡ４および６のＳＮＰ部位よりも３’末端側の領域と完全にハイブリダイズするように設計されている。

　図１９（ｃ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ１がアデニン（以下Ａと記す）である一本鎖ＤＮＡ４にタイピングプライマー７は完全にハイブリダイズする。このため、図１９（ｄ）に示す工程で、プライマー伸長反応が起こり、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＮＴＰが消費される。

　一方、図２０（ｃ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ２がグアニン（以下Ｇと記す）である一本鎖ＤＮＡ６にタイピングプライマー７の３’末端の塩基（Ｔ）のみハイブリダイズできない。このため、図２０（ｄ）に示す工程で、正常なプライマー伸長反応が起こりにくい。従って、ｄＮＴＰはほとんど消費されない。

　従って、これらの伸長反応の進行の差を解析することによってＳＮＰ部位の塩基の判別ができる。このように、プライマー伸長反応が起こるか否かによってＳＮＰ部位の塩基の判別を行なう。この方法では、ＳＮＰ部位の塩基が３種類あるいは４種類の可能性がある場合にも、それぞれに対応したタイピングプライマーを用意すれば同様に解析できる。

　タイピングプライマーに関しては、上述のような３’末端塩基を、ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基と対応させたプライマー以外のものも開発されている。例えば、東洋紡績（株）によって開発されたＡＳＰ（Ａｌｌｅｌｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｐｒｉｍｅｒ）が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＡＳＰは、その３’末端から２番目の塩基がＳＮＰ部位に対応しており、さらにその３’末端から３番目の塩基が標的の塩基に対して必ず非相補的であるように設計されているプライマーである。

　ＡＳＰを、校正活性の強いα型ＤＮＡポリメラーゼとともに用いることによって、上述の図１９および図２０に示した方法よりも正確なＳＮＰ部位の塩基種の判別が可能となると報告されている。すなわち、ＳＮＰ部位がＡＳＰの３’末端から２番目の塩基と相補的である場合には良好に伸長反応が起き、相補的でない場合は正常に伸長反応が起きない。また、伸長反応が起きた場合と起きない場合とにおける伸長反応の進行の差が、上記図１９および図２０に示した方法に比べて大きいと報告されている。

　次に、１種類のｄＮＴＰ（またはｄｄＮＴＰ）を用いてプライマー伸長反応を利用する方法を図２１および図２２を参照しながら説明する。この方法では、標的の一本鎖ＤＮＡにおいてＳＮＰ部位に隣接した領域とハイブリダイズするように設計されたプライマーを用いて伸長反応を行なう。すなわちプライマー配列中にＳＮＰ部位に対応する部位は存在しない。具体的には、以下に説明する工程を実施する。

　まず、図２１（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ１を有する標的のＤＮＡ１を含む試料溶液を調製する。同様に、図２２（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ２を有する標的のＤＮＡ２を含む試料溶液を調製する。

　次に、図２１（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ１を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ３および４にする。同様に、図２２（ｂ）に示す工程で、ＤＮＡ２を熱変性などによって一本鎖ＤＮＡ５および６にする。

　次に、図２１（ｃ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ３および４を含む試料溶液に、プライマー９、ＤＮＡポリメラーゼ８およびｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）を添加する。同様に、図２２（ｃ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ５および６を含む試料溶液に、プライマー９、ＤＮＡポリメラーゼ８およびｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）を添加する。ここで、プライマー９は、一本鎖ＤＮＡ４および６のＳＮＰ部位よりも３’末端側に隣接する領域と完全にハイブリダイズするように設計されている。従って、一本鎖ＤＮＡ４，６にプライマー９は完全にハイブリダイズする。

　次に、図２１（ｄ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ４のＳＮＰ部位Ｓ１がＡであり、ｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）しか供給されていないので、プライマー伸長反応は起こらない。このため、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）がほとんど消費されない。

　一方、図２２（ｄ）に示す工程で、一本鎖ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２がＧであるため、ｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）の供給によって正常なプライマー伸長反応が起こる。従って、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＣＴＰ（またはｄｄＣＴＰ）が消費される。

　なお、ＳＮＰ部位の塩基が三種類あるいは四種類の可能性がある場合は、それぞれに対応したｄＮＴＰあるいはｄｄＮＴＰを用いることによって同様に解析できる。

　このように、１種類のｄＮＴＰあるいはｄｄＮＴＰのみを用いる方法では、上記の４種類全てのｄＮＴＰを用いる方法とは異なり、ｄＮＴＰを用いる場合は通常１〜数塩基程度、ｄｄＮＴＰを用いる場合は１塩基しかプライマーに付加されない。従って、伸長反応の進行の差を検出することが非常に困難である。そこで、以下に示す特許文献１および２では、伸長反応の進行の差を検出するために、プライマー伸長反応の進行に伴って生成されるピロリン酸をＡＴＰに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用してピロリン酸の量を測定する方法を用いている。１種類のｄＮＴＰのみを用いる方法の利点としては、プライマーの設計の仕方によって、図２１あるいは図２２に示す各工程に準ずる工程を繰り返すことによって、ＳＮＰ部位だけでなく、ＳＮＰ部位近辺の塩基配列を判別することも可能であるという点が挙げられる。

　以上のようにプライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術は幾つかの種類があるが、いずれのＳＮＰ部位の塩基種の判別技術においても、プライマー伸長反応の進行の差を解析してＳＮＰ部位の塩基種の判別を行なうという点は共通している。

　このようなＳＮＰ部位の塩基種の判別技術は、いわゆるＳＮＰ部位のみならず所望の特定塩基の判別にも応用が可能である非常に有用な技術である。近い将来、大小様々な規模の病院で日常的に利用される可能性が高い。従って、より安全かつ正確にプライマー伸長反応の差を解析できる方法が必要とされている。

　（第２の従来技術）
　ピロリン酸は、細胞内における酵素反応に深く関与していることが知られている。例えば、タンパク質の合成過程において、アミノ酸がアミノアシルアデニル酸を経由してアミノアシルｔＲＮＡを形成する反応においてピロリン酸が生成される。また、例えば、植物などに見られるデンプン合成の過程では、グルコース−１−リン酸とＡＴＰとの反応によってＡＤＰ−グルコースが生成される際に、ピロリン酸が生成される。これら以外にも、種々の酵素反応においてピロリン酸が関与していることが知られている。従って、ピロリン酸を定量的に検出する技術は、細胞状態、あるいは上記の酵素反応等を解析する上で重要な技術である。

　特許文献３では、酵素を利用した三種類のピロリン酸検出方法が開示されている。それらに関して以下に説明する。

　第１の方法は、ピロリン酸をホスホエノ−ルピルビン酸およびアデノシン一リン酸の存在下で、ピルベートオルソホスフェートジキナーゼを作用させる方法である。この反応によってビルビン酸が生成されるので、ピルビン酸の量を測定することによってピロリン酸の量を算出することができる。なお、ピルビン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、ラクテートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してピルビン酸をＮＡＤＨで還元する際に、ＮＡＤＨの減少を比色定量する方法である。もう１つは、生成したピルビン酸にピルベートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導くことによって比色定量する方法である。

　第２の方法は、ピロリン酸をシチジン二リングリセロールの存在下でグリセロール−３−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼに作用させる方法である。この反応によってグリセロール三リン酸が生成される。従って、グリセロール三リン酸の生成量を測定することでピロリン酸の量を算出することができる。グリセロール三リン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。１つは、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してグリセロール三リン酸をＮＡＤ（Ｐ）で酸化する際に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの増加を比色定量する方法である。もう１つは、生成したグリセロール三リン酸にグリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを作用させて生成する過酸化水素を色素に導きこれを比色定量する方法である。

　第３の方法は、ピロリン酸をシチジン二リン酸リビトールの存在下でリビトール−５−ホスフェートシチジルトランスフェラーゼを作用させる方法である。この反応によってＤ−リビトール−５−リン酸が生成されるため、その生成量を測定することでピロリン酸量を測定することができる。Ｄ−リビトール−５−リン酸を測定する方法は、ＮＡＤ（またはＮＡＤＰ）の存在下でリビトール−５−ホスフェートデヒドロゲナーゼを作用させてＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の増加を比色定量する方法が提案されている。
東洋紡績（株）ウェブサイト、平成14年10月1日検索、ＵＲＬ（http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/product/custom/snps/snps.html） ＷＯ９８／２８４４０号（要約の欄） ＷＯ９８／１３５２３号（要約の欄） 特開昭６１−１２３００号公報

　上記第１の従来技術で述べたように、プライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術は幾つかの種類があり、いずれのＳＮＰ部位の塩基種の判別技術においても、プライマー伸長反応の進行の差を解析してＳＮＰ部位の塩基種の判別を行なうという点で共通している。

　プライマー伸長反応の差を解析する方法は２種類ある。１つは、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等の標的塩基配列の増幅法と、核酸検出技術を利用する技術である。つまり、プライマーの１つとして上記のタイピングプライマーを用いてＳＮＰ部位を含む塩基配列の増幅を行なう。その結果、タイピングプライマーの３’末端塩基が解析対象ＳＮＰ部位と相補的である場合、標的塩基配列を有する核酸が良好に増幅されるが、相補的でない場合、核酸が増幅されにくい。従って、蛍光インターカレート剤等の標識物質を用いて、目的の塩基配列断片の量を測定することでＳＮＰ部位の塩基種の判別ができる。しかし既に述べたように、蛍光インターカレート剤が発ガン物質であるため非常に危険な操作が必要となる不具合がある。

　もう１つは、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等の標的塩基配列の増幅法と、ピロリン酸検出技術を利用する技術である。つまり、プライマーの１つとして上記のタイピングプライマーを用いてＳＮＰ部位を含む塩基配列の増幅を行なうことに関しては上記の技術と同様であるが、この方法では核酸を検出するのではなく、プライマー伸長に伴って生成されるピロリン酸を検出することで標的塩基配列の増幅量の解析、すなわちＳＮＰ部位の塩基種の判別を行う。この場合に用いられるピロリン酸検出方法としては、ピロリン酸をＡＴＰに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用する方法が知られている。しかし、プライマー伸長反応においてｄＡＴＰを用いる場合、ｄＡＴＰはＡＴＰと同様にルシフェラーゼ反応の基質になる。このため、正確なＳＮＰ部位の塩基種の判別ができない。従って、ｄＡＴＰの代わりにＤＮＡポリメラーゼの基質として作用し、且つルシフェラーゼ反応の基質としては作用しない特殊なｄＡＴＰアナログを用いる必要があるという不具合がある。なおこの方法の場合、上記方法とは異なり、タイピングプライマーのみを用いて、そこからのプライマー伸長反応を解析することで、ＳＮＰ部位の塩基種を判別することも可能である。

　また、上記第２の従来技術で述べたように、他のピロリン酸の検出技術においても、複数種の酵素、試薬などを必要とし、コストが増大し、工程が複雑化してしまうという不具合がある。

　本発明は上記不具合を解決するためになされたものであり、プライマーの伸長反応を検出する簡便な技術、核酸の塩基配列中の塩基種を判別する簡便な技術、ならびに核酸の検出技術を提供する。

　本発明のプライマーの伸長反応を検出する伸長反応検出方法は、核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、前記試料溶液を前記伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、および工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、を含む。

　本発明の核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別方法は、核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、および工程（ｅ）の検出結果に基づいて前記核酸の塩基配列中の塩基種を判別する工程（ｆ）、を含む。

　　核酸の塩基配列中の塩基種を判別する方法として、例えば、判別したい塩基の３’末端側に隣接する塩基配列に対して完全に相補的な配列を有するプライマーと、判別したい塩基の予想される塩基種に対して相補的であるｄＮＴＰとを用いてプライマー伸長反応を行なった場合に、プライマー伸長反応の進行の程度によって、判別したい塩基の塩基種を判別する方法がある。また、判別したい塩基を含む塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ４種類のｄＮＴＰを同時に用いてプライマー伸長反応を行なった場合に、判別したい塩基の塩基種に依存してプライマー伸長反応の進行の程度に差が生じるプライマーを用いる方法もある。いずれの方法も、プライマー伸長反応の進行の程度によって、特定の塩基の塩基種を判別する点が共通している。プライマー伸長反応が起こると、ピロリン酸が生成する。本発明では、プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸を検出することによって、プライマー伸長反応の進行の程度を解析することができる。従って、核酸の塩基配列中の塩基種を判別することが可能である。本明細書でいう「核酸の塩基配列中の塩基種の判別」とは、例えばＤＮＡのＳＮＰ部位が特定の塩基であるか否かの判別、ＳＮＰ部位の塩基種の決定、突然変異部位の存在の有無の判別、突然変異部位の決定および突然変異部位の塩基種の決定が挙げられる。

　自然界では、Ｈ⁺−ピロホスファターゼは、そのピロリン酸を加水分解する活性部位が液胞膜の外側（表面側）に露出するように液胞膜に保持されており、１分子のピロリン酸から２分子のリン酸を生成する加水分解反応に伴って、液胞膜の外側から液胞膜の内側（裏面側）に向けてＨ⁺を輸送する性質を有する。このため、Ｈ⁺−ピロホスファターゼの酵素反応によって、液胞膜の内部ではＨ⁺濃度が増大し、液胞膜の外部ではＨ⁺濃度が減少する。本発明によれば、Ｈ⁺−ピロホスファターゼのピロリン酸を加水分解する活性部位が露出している第１領域に、伸長反応が進行した場合にピロリン酸を含むことになる試料溶液を貯留することによって、伸長反応が進行した場合には第１領域から第２領域へＨ⁺が輸送され、液胞膜の表面側と裏面側のＨ⁺濃度が変化する。このため、表面側および裏面側のいずれか一方のＨ⁺濃度を測定することによって、試料溶液中のピロリン酸の量を検出することができる。したがって、プライマーの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を検出することにより、核酸の塩基配列中の塩基種を判別する本発明の方法によると、ピロリン酸の検出に複数種の酵素、試薬などが不要であり、工程も単純で、コストが低減される。

　　例えば、工程（ｄ）では、前記表面側の溶液のＨ^＋濃度と、工程（ｂ）後であって工程（ｃ）前の前記試料溶液のＨ^＋濃度との差を測定する。また、工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出する。前記塩基種の判別が、ＳＮＰ部位の塩基種の判別である場合、前記対照値は、前記核酸として前記ＳＮＰ部位が変異していない核酸を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果とすることができる。

　また、例えば、工程（ｄ）において、前記裏面側の溶液のＨ^＋濃度を検出し、工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出することができる。前記塩基種の判別が、ＳＮＰ部位の塩基種の判別である場合、工程（ａ）において、前記ヌクレオチドとして１種類のヌクレオチドを用い、前記対照値は、前記核酸として前記ＳＮＰ部位の塩基種が異なる核酸を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果とすることができる。

　工程（ｄ）では、Ｈ^＋の濃度を光学的に測定してもよい。この場合、例えば、前記表面側の溶液および前記裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素を添加し、前記色素の光学的応答性を測定することにより、Ｈ^＋濃度を測定することができる。前記ｐＨ感受性色素としては、例えば、アクリジンオレンジが挙げられる。前記膜電位感受性色素としては、例えばオクソールＶが挙げられる。

　工程（ｄ）では、Ｈ^＋濃度を電気的に測定してもよい。

　伸長反応は、例えば、ＰＣＲ法に従った伸長反応としてもよい。

　本発明の核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別装置は、プライマーの伸長反応に必要な温度調節を行う反応部と、前記プライマー伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を検出するピロリン酸検出部とを備え、前記反応部は、溶液を貯留する反応用貯留領域を備え、前記ピロリン酸検出部は、溶液を貯留する検出用貯留領域と、前記検出用貯留領域を第１領域と第２領域とに分離するＨ^＋難透過性膜と、第１領域および第２領域の少なくともいずれか一方の領域に貯留された溶液のＨ^＋濃度を測定する測定手段とを備え、前記Ｈ^＋難透過性膜は、表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有し、前記ピロリン酸検出部において、前記反応部から送出される反応溶液は、第１領域に貯留される構成である。

　　特定の塩基の塩基種を判別する方法として、例えば、判別したい塩基の３’末端側に隣接する塩基配列に対して完全に相補的な配列を有するプライマーと、判別したい塩基の予想される塩基種に対して相補的であるｄＮＴＰとを用いてプライマー伸長反応を行なった場合に、プライマー伸長反応の進行の程度によって、判別したい塩基の塩基種を判別する方法がある。また、判別したい塩基を含む塩基配列に対して相補的な塩基配列を有し、且つ４種類のｄＮＴＰを同時に用いてプライマー伸長反応を行なった場合に、判別したい塩基の塩基種に依存してプライマー伸長反応の進行の程度に差が生じるプライマーを用いる方法もある。いずれの方法も、プライマー伸長反応の進行の程度によって、特定の塩基の塩基種を判別する点が共通している。プライマー伸長反応が起こると、ピロリン酸が生成する。本発明の塩基種判別装置によれば、プライマー伸長反応によって生成するピロリン酸を測定することによって、プライマー伸長反応の進行の程度を解析することができる。従って、特定の塩基の塩基種を判別することが可能である。

　　また、試料溶液中に特定の塩基配列を有する核酸の有無を判別したい場合、プライマー伸長反応が進行していれば、溶液中に、プライマーに相補的な塩基配列を有する核酸が存在していることがわかる。逆に、プライマー伸長反応があまり進行していなければ、溶液中に、プライマーに相補的な塩基配列を有する核酸が存在していないことがわかる。このように、本発明の塩基種判別装置を用いて、試料溶液中の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判別、すなわち、特定の核酸を検出することも可能である。

　前記測定手段は、例えばＨ^＋濃度を光学的に測定する構成とすることができる。また、前記測定手段は、例えばＨ^＋濃度を電気的に測定する構成とすることができる。

　前記塩基種判別装置は、前記反応部および前記ピロリン酸検出部を制御し、前記測定手段による測定結果を解析する解析手段をさらに備える構成としてもよい。

　前記塩基種判別装置は、前記反応用貯留領域および前記検出用貯留領域を具備したチップを挿入可能なスロットをさらに備える構成としてもよい。

　本発明のピロリン酸検出装置は、容器と、前記容器内を第１領域と第２領域とに分離するＨ^＋難透過性膜と、第１領域に貯留される溶液に接触するように設けられた電極と、第２領域に貯留される溶液に接触するように設けられたＨ^＋感受性電極とを備え、前記Ｈ^＋難透過性膜は、その表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が第１領域に露出するように配置されたＨ^＋−ピロホスファターゼを有する構成である。

　本発明の特定の塩基配列を有する核酸の検出方法は、試料と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、および工程（ｅ）の検出結果に基づいて前記核酸を検出する工程（ｆ）を含む。

　プライマーは、相補的な塩基配列を有する核酸にハイブリダイズし、プライマー伸長反応によって伸長する。プライマー伸長反応が起こると、ピロリン酸が生成する。本発明によれば、プライマー伸長反応の進行の程度を、すなわちピロリン酸の量を検出することによって、具体的にはＨ^＋濃度を測定することによって解析することができる。プライマー伸長反応が進行していれば、試料溶液中に、プライマーに相補的な塩基配列を有する核酸が存在していることがわかる。逆に、プライマー伸長反応があまり進行していなければ、試料溶液中に、プライマーに相補的な塩基配列を有する核酸がほとんど存在していないことがわかる。このようにして、試料溶液中の特定の塩基配列を有する核酸の有無を判別することができる。

　例えば、工程（ｄ）で、前記表面側の溶液のＨ^＋濃度と、工程（ｂ）後であって工程（ｃ）前の前記試料溶液のＨ^＋濃度との差を測定する。また、例えば、工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出する。このとき、前記対照値として、核酸を含まない前記試料を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果を使用することができる。

　工程（ｄ）では、Ｈ^＋濃度を光学的に測定してもよい。この場合、例えば、表面側の溶液および裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素を添加し、前記色素の光学的応答性を測定することにより、Ｈ^＋濃度を測定することができる。前記ｐＨ感受性色素としては、例えば、アクリジンオレンジが挙げられる。前記膜電位感受性色素としては、例えばオクソールＶが挙げられる。

　また、工程（ｄ）では、Ｈ^＋濃度を電気的に測定してもよい。

　前記伸長反応は、例えば、ＰＣＲ法に従った伸長反応としてもよい。

　本発明の試料溶液導入チップによれば、プライマーの伸長反応を行うための反応槽と、ピロリン酸を検出するためのピロリン酸検出槽と、前記反応槽と前記ピロリン酸検出槽とを接続する流路とを備えるように構成されている。

　また、前記流路は開閉可能に構成してもよい。この場合、反応槽とピロリン酸検出槽とを容易に分離することが可能である。従って、互いに反応温度条件が異なるプライマー伸長反応とピロリン酸の検出とを１つのチップ上で行うことができる。

　前記ピロリン酸検出槽は、Ｈ^＋難透過性膜によって分離された第１領域および第２領域を有し、前記Ｈ^＋難透過性膜は、その表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が第１領域に露出するように配置されたＨ^＋−ピロホスファターゼを有し、前記ピロリン酸検出槽において、前記反応槽から前記流路を介して送出される反応溶液は、第１領域に貯留されるように構成されていることが好ましい。

　ピロリン酸検出槽内に試料溶液が注入されると、試料溶液中にピロリン酸が存在する場合、Ｈ^＋−ピロホスファターゼの酵素反応が生じて、膜によって隔てられた第２領域ではＨ^＋濃度が増大し、第１領域ではＨ^＋濃度が減少する。このため、電極とＨ^＋感受性電極とによって、電気的にＨ^＋濃度を測定することができ、ピロリン酸の量を検出することができる。

　本発明によれば、プライマーの伸長反応を検出する簡便な技術、核酸の塩基配列中の塩基種を判別する簡便な技術、ピロリン酸を検出する簡便な技術および特定の塩基配列を有する核酸を検出する簡便な技術を提供することができる。

　以下、図面を参照しながら本発明の実施形態を説明する。なお、本明細書中に記載されているＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸は、特に指示のない限り二本鎖である。

　（実施形態１）
　本実施形態では、試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する方法を説明する。具体的には、４種類のｄＮＴＰを用いてプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等の増幅反応）を利用する方法を図１および図２を参照しながら説明する。図１および図２は、本実施形態の試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する方法を表す工程図である。

　本実施形態の方法では、標的ＤＮＡのＳＮＰ部位を含む塩基配列に対して実質的に相補的結合を行い、かつ標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種に応じて伸長反応の進行に差を生じさせるプライマー（以下、タイピングプライマーと称する）を用いる。なお、本実施形態では、タイピングプライマーが作用する方の一本鎖状態の標的ＤＮＡにおけるＳＮＰ部位の塩基がＡかＧの可能性があり、Ｇの場合だとプライマー伸長反応は行われないが、Ａの場合だと行われるように設計されたタイピングプライマーを用いる例を示す。

　まず、図１（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ１を有する標的のＤＮＡ１、タイピングプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰを含む試料溶液を調製する。同様に、図２（ａ）に示す工程で、ＳＮＰ部位Ｓ２を有する標的のＤＮＡ２、タイピングプライマー７、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰを含む試料溶液を調製する。ここで、タイピングプライマー７は、その３’末端の塩基（ここでは、チミン（以下Ｔと記す））以外は、一本鎖ＤＮＡ４および６のＳＮＰ部位よりも３’末端側の領域と完全にハイブリダイズするように設計されている。また、本実施形態で用いるＤＮＡポリメラーゼ８は、一般にＰＣＲ等に用いられる耐熱性を有する公知の酵素である。

　次に、図１（ｂ）に示す工程で、試料溶液を加温し、ＤＮＡ１を熱変性させることによって一本鎖ＤＮＡ３および４とする。同様に、図２（ｂ）に示す工程で、試料溶液を加温し、ＤＮＡ２を熱変性させることによって一本鎖ＤＮＡ５および６とする。

　次に、図１（ｃ）に示す工程で、試料溶液を冷却し、一本鎖ＤＮＡ４に、タイピングプライマー７をハイブリダイズさせる。一本鎖ＤＮＡ４のＳＮＰ部位Ｓ１がアデニン（以下Ａと記す）であるため、タイピングプライマー７は一本鎖ＤＮＡ４に完全にハイブリダイズする。同様に、図２（ｃ）に示す工程で、試料溶液を冷却し、一本鎖ＤＮＡ６に、タイピングプライマー７をハイブリダイズさせる。一本鎖ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２がグアニン（以下Ｇと記す）であるため、タイピングプライマー７は一本鎖ＤＮＡ４にその３’末端の塩基（Ｔ）のみハイブリダイズしない。

　次に、図１（ｄ）に示す工程で、試料溶液の温度をプライマー伸長反応に最適な温度に調節する。タイピングプライマー７は一本鎖ＤＮＡ４に完全にハイブリダイズしている。このため、プライマー伸長反応が起こり、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＮＴＰが消費され、ピロリン酸が生成する。

　一方、図２（ｄ）に示す工程でも、試料溶液の温度をプライマー伸長反応に最適な温度に調節する。しかしながら、タイピングプライマー７は、一本鎖ＤＮＡ６に、その３’末端の塩基（Ｔ）がハイブリダイズしていない状態にある。このため、正常なプライマー伸長反応が起こりにくい。従って、ｄＮＴＰはほとんど消費されず、ピロリン酸はほとんど生成されない。

　続いて、以上に述べた図１（ｂ）から（ｄ）に示す工程、および図２（ｂ）から（ｄ）に示す工程を繰り返すことによって、プライマー伸長反応を繰り返す。このことによって、図１（ｄ）および図２（ｄ）に示すプライマー伸長反応の進行の差が顕著に現れる。

　なお、本実施形態の方法に代えて、タイピングプライマー７をＰＣＲ反応時に使用する２本のプライマーのうちの１本として用い、もう１本のプライマーと共に用いることによってＰＣＲ反応を行なってもよい。このことによって、プライマー伸長反応の進行の差は指数関数的に広がっていく。また、ＰＣＲ法以外の増幅反応を適用することも可能である。

　最後に、図１（ｄ）および図２（ｄ）に示すプライマー伸長反応の進行の差を、ピロリン酸の定量検出によって解析する。このことによって、ＳＮＰ部位の塩基種の判別ができる。次に、本実施形態のピロリン酸の定量検出方法を図３を参照しながら説明する。

　本実施形態では、ピロリン酸を検出するために、Ｈ⁺−ピロホスファターゼを用いる。Ｈ⁺−ピロホスファターゼは通常、植物の液胞膜等に存在する膜タンパク質である。図３は、植物の液胞膜に内在された状態のＨ⁺−ピロホスファターゼを模式的に表す図である。

　図３に示すように、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ１１は、１分子のピロリン酸１０から２分子のリン酸１２を生成する加水分解反応に伴って、Ｈ⁺を通さない、あるいは通しにくい液胞膜１３の外側（表面１３ａ側）から液胞膜１３の内側（裏面１３ｂ側）に向けてＨ⁺を輸送する性質を有する。このため、Ｈ⁺−ピロホスファターゼの酵素反応によって、液胞膜の内部ではＨ⁺濃度が増大し、液胞膜の外部ではＨ⁺濃度が減少する。

　本実施形態では、Ｈ^＋−ピロホスファターゼの上記性質および膜タンパク質であるという形態を利用して、ピロリン酸の検出を行う。すなわち、Ｈ^＋−ピロホスファターゼを保持する膜で領域を分離し、少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度の変化を測定することにより、Ｈ^＋−ピロホスファターゼが加水分解に寄与したピロリン酸の量を検出することができる。このように、本実施形態の方法では、Ｈ^＋−ピロホスファターゼの作用に直接的にかかわったＨ^＋の濃度変化を検出することにより、ピロリン酸の検出を行うので、簡便かつ高感度の検出が可能である。また、上述の検出を行うためには、Ｈ^＋の輸送元の領域と、Ｈ^＋の輸送先の領域との分離が必須要件となるが、Ｈ^＋−ピロホスファターゼが膜タンパク質であることにより、その形態を領域の分離に利用することができる。このことは、検出の簡便化に寄与する。

　本実施形態では、ピロリン酸を含む試料溶液を、植物細胞等から単離してきた液胞膜に内在している状態のＨ⁺−ピロホスファターゼに接触させる。この後、液胞膜の内側あるいは液胞膜の外側のＨ⁺濃度の変化を測定する。液胞膜の内側あるいは液胞膜の外側のＨ^＋濃度の変化は、実施例に後述するように、試料溶液中のピロリン酸の量と相関関係があるので、Ｈ^＋濃度の変化を測定することによって、試料溶液中のピロリン酸の量を検出する。ピロリン酸の量の多い方の試料溶液がプライマーの伸長反応が進行した試料溶液であり、ピロリン酸の量の少ない方の試料溶液がプライマーの伸長反応が進行しにくかった試料溶液である。すなわち、プライマーの伸長反応の進行の差によって、ＳＮＰ部位の塩基種を判別する。例えば、図１（ｄ）と図２（ｄ）の溶液を比較した場合、図１（ｄ）の方が図２（ｄ）よりピロリン酸の量が多く検出される。この結果に基づいて、ＤＮＡ４のＳＮＰ部位Ｓ１は、プライマー７の３’末端の塩基Ｔに相補的な塩基Ａであると判別される。そして、ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２は、プライマー７の３’末端の塩基Ｔに相補的な塩基Ａでないと判別される。本実施形態では、ＳＮＰ部位の塩基がＡかＧであることがわかっているので、ＤＮＡ６のＳＮＰ部位Ｓ２はＧであると決定される。

　　なお、Ｈ^＋の濃度の変化が所定値に達したか否かによって、ピロリン酸の有無を決定し、ピロリン酸の有無に応じてプライマー伸長反応の進行の有無を決定しても良い。本明細書においては、Ｈ^＋濃度の変化が所定値に達したか否かによってピロリン酸の有無を決定する検出を、ピロリン酸の定性検出という。これに対し、ピロリン酸の量の値（例えば濃度）の検出を、ピロリン酸の定量検出というという。

　プライマーの伸長反応の進行の有無、すなわちピロリン酸の定性検出によって、試料中に含まれるＳＮＰ部位が使用したプライマーに対応する塩基種か否か判別する場合について説明する。例えば、図１（ｄ）については、プライマー伸長反応が進行したと判別され、ＳＮＰ部位が使用したプライマーの３’末端の塩基Ｔに相補的な塩基Ａであると決定される。図２（ｄ）については、プライマー伸長反応が進行しなかったと判別され、ＳＮＰ部位が使用したプライマーの３’末端の塩基Ｔに相補的な塩基Ａではないと判別される。本実施形態においては、上述のように、ＳＮＰ部位の塩基がＡかＧの可能性があることがわかっているので、図２（ｄ）において、ＳＮＰ部位の塩基がＡでないと判別されると、残る可能性はＧということになり、ＳＮＰ部位の塩基種が決定される。

　　尚、本実施形態のように、ＳＮＰ部位の塩基種が予め２種類に特定されていなくても、上述する、プライマーの伸長反応の進行の有無の判別によって、試料中に含まれるＳＮＰ部位が使用したプライマーに対応する塩基種か否か判別する操作を複数種のプライマーを用いて行うことにより、最終的にＳＮＰ部位の塩基種を決定することができる。

　　本明細書における「核酸の塩基配列中の塩基種の判別」は、ＳＮＰ部位の塩基種が特定の塩基種であるか否かの判別およびＳＮＰ部位の塩基種の決定、いずれをも含む。

　Ｈ⁺濃度の変化を測定する方法としては、Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法と、電気的に測定する方法が挙げられる。Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化に変換して測定する方法としては、ｐＨ試験紙やｐＨ感受性色素、膜電位感受性色素等を用いる方法が挙げられる。電気的に測定する方法としては、金属電極法（水素電極法、キンヒドロン電極法、アンチモン電極法等）、ガラス電極法、ＩＳＦＥＴ電極法、パッチクランプ法、ＬＡＰＳ法（Ｌｉｇｈｔ−Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ　Ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ　Ｓｅｎｓｏｒ）等が挙げられる。

　上記のＨ⁺濃度の変化を測定する方法と、上記のＨ⁺−ピロホスファターゼの反応を併用することによって、試料溶液中のピロリン酸を光学的シグナルあるいは電気的シグナルに変換して測定することができる。

　なお、Ｈ⁺濃度の変化を測定する方法は、上記の測定方法に限られず、Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化あるいは電気的変化に変換し、その光学的変化あるいは電気的変化を検知できる方法であればよい。

　次に、本実施形態のピロリン酸の検出方法を図４および図５を参照しながら説明する。図４および図５は、ピロリン酸の検出方法を表す図である。

　図４に示すように、Ｈ⁺−ピロホスファターゼが膜に内在し、内部にｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素を含む膜小胞３３が懸濁された溶液を反応容器３１中に注いでおき、次いで、反応容器３１の中に図１（ｄ）または図２（ｄ）で得られる試料溶液３２を添加する。このとき、Ｈ⁺−ピロホスファターゼのピロリン酸を加水分解する活性部位は、膜小胞（Ｈ^＋難透過性膜）３３の外部に露出している。膜小胞３３の内部に含まれる溶液はＨ^＋−ピロホスファターゼの輸送によるＨ^＋濃度の変化の検出を阻害するものでなければ、特に限定されない。尚、膜小胞３３の外面３３ａを表面とし、内面３３ｂを裏面とする。ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素は、試料溶液３２に添加されていても良い。

　試料溶液３２中にピロリン酸が存在する場合、Ｈ⁺−ピロホスファターゼの酵素反応が生じて、膜小胞３３の内部ではＨ⁺濃度が増大し、膜小胞３３の外部ではＨ⁺濃度が減少する。このため、膜小胞３３の内部のＨ⁺濃度の増大によって、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素の蛍光強度が変化する。この蛍光強度の変化を光学的に測定することによって、ピロリン酸の定性検出及び定量検出を行うことができる。

　膜小胞３３としては、細胞から単離された液胞から調製されたものを用いることができる。また、膜小胞３３として、Ｈ⁺−ピロホスファターゼを単離および精製した後、人工的に形成した脂質二重層膜やＬＢ膜などのＨ⁺を通さない、あるいは通しにくい膜内に内在するように再構築することによって形成されたものを用いてもよい。

　なお、ピロリン酸を加水分解する活性部位が、内部に露出しているＨ⁺−ピロホスファターゼが膜小胞３３に含まれていてもよい。但し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が内部に露出しているＨ⁺−ピロホスファターゼが含まれている膜小胞３３を用いる場合、膜小胞３３の内部のピロリン酸の濃度は、膜小胞３３の外部のピロリン酸の濃度よりも低くしておくことが好ましく、膜小胞３３の内部にはピロリン酸を含まないことが最も好ましい。このことによって、膜小胞３３の内部から外部へのＨ⁺の輸送が減少あるいは停止し、膜小胞３３の外部から内部へのＨ⁺の輸送が優勢となって、膜小胞３３の外部および内部のＨ⁺濃度の変化が、試料溶液３２中に含まれるピロリン酸によるものにほぼ限定される。従って、試料溶液３２中に含まれるピロリン酸の量を正確に見積もることができる。

　また、膜小胞３３の膜には、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ以外のタンパク質が含まれていてもよい。但し、これらのタンパク質は、ピロリン酸と反応しない、あるいは反応性の低いタンパク質であることが好ましい。すなわち、ピロリン酸が膜小胞３３の膜中にあるＨ⁺−ピロホスファターゼ以外のタンパク質と反応する場合、Ｈ⁺−ピロホスファターゼと反応するピロリン酸の量が減少し、それに伴ってＨ⁺の輸送量が減少するからである。また、ピロリン酸とは反応せず、且つピロリン酸以外の物質との反応によってＨ⁺を輸送するタンパク質が膜小胞３３の膜に含まれている場合、そのタンパク質が反応する物質が試料溶液３２中にほとんど含まれていないことが好ましい。具体的には、膜小胞３３の膜には、ピロリン酸とほとんど反応せず、且つＡＴＰとの反応によってＨ⁺を輸送するタンパク質であるＡＴＰａｓｅが含まれている場合、試料溶液３２中にＡＴＰをほとんど含まないようにすることが好ましい。

　なお、ｐＨ感受性色素としては、アクリジンオレンジが挙げられる。また、膜電位感受性色素としては、オクソールＶが挙げられる。いずれも、微少なｐＨまたは膜電位の変化に対して非常に鋭敏な色素である。このため、ピロリン酸の検出を高感度で行なうことが可能である。

　また、図５に示すピロリン酸検出装置を用いてもよい。図５に示すように、ピロリン酸検出装置５０は、容器３４と、電極３５と、容器３４内に設けられた内部槽３６とを備える。内部槽３６には、Ｈ⁺−ピロホスファターゼが内在している膜（Ｈ^＋難透過性膜）３７が形成されており、内部槽３６の底部には、Ｈ⁺感受性電極３８が設けられている。このとき、Ｈ⁺−ピロホスファターゼのピロリン酸を加水分解する活性部位は、内部槽３６の外部に露出している。膜３７は、その上面３７ａを表面とし、下面３７ｂを裏面とする。

　容器３４内に試料溶液３２が注入されると、試料溶液３２中にピロリン酸が存在する場合、Ｈ⁺−ピロホスファターゼの酵素反応が生じて、膜３７によって隔てられた内部槽３６の内部領域（第２領域）３９の溶液ではＨ⁺濃度が増大し、内部槽３６の外部ではＨ⁺濃度が減少する。このため、電極３５とＨ⁺感受性電極３８とを用いて、電気的にＨ⁺濃度の変化を測定することによって、ピロリン酸を定性的または定量的に検出することができる。本実施形態では、予め容器３４および内部領域３９内に、ｐＨが測定可能であるバッファーなどの溶液を貯留した後、容器３４内に試料溶液３２を注入するが、これに限定されない。例えば、膜３７を予め内部槽３６内のＨ⁺感受性電極３８上に配置しておき、試料溶液３２を容器３４中に添加してもよい。このことによって、容器３４内に試料溶液３２を注入すると、試料溶液３２のうちの膜３７を透過する成分（つまりピロリン酸を含まない溶液）が内部領域３９を満たし、電極３５とＨ⁺感受性電極３８とを用いて、電気的にＨ⁺濃度の変化を測定することが可能になる。

　なお、ピロリン酸を加水分解する活性部位が、内部領域３９に露出しているＨ⁺−ピロホスファターゼが膜３７に含まれていてもよい。但し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が内部領域３９に露出しているＨ⁺−ピロホスファターゼが含まれている膜３７を用いる場合、内部領域３９のピロリン酸の濃度は、内部槽３６の外部のピロリン酸の濃度よりも低くしておくことが好ましく、内部領域３９にはピロリン酸を含まないことが最も好ましい。このことによって、内部領域３９から内部槽３６の外部へのＨ⁺の輸送が減少あるいは停止し、内部槽３６の外部から内部領域３９へのＨ⁺の輸送が優勢となって、内部槽３６の外部および内部領域３９のＨ⁺濃度の変化が、試料溶液３２中に含まれるピロリン酸によるものにほぼ限定される。従って、試料溶液３２中に含まれるピロリン酸の量を正確に見積もることができる。

　また、膜３７には、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ以外のタンパク質が含まれていてもよい。但し、これらのタンパク質は、ピロリン酸と反応しない、あるいは反応性の低いタンパク質であることが好ましい。すなわち、ピロリン酸が膜３７中にあるＨ⁺−ピロホスファターゼ以外のタンパク質と反応する場合、Ｈ⁺−ピロホスファターゼと反応するピロリン酸の量が減少し、それに伴ってＨ⁺の輸送量が減少するからである。また、ピロリン酸とは反応せず、且つピロリン酸以外の物質との反応によってＨ⁺を輸送するタンパク質が膜３７に含まれている場合、そのタンパク質が反応する物質が試料溶液３２中にほとんど含まれていないことが好ましい。具体的には、膜３７に、ピロリン酸とほとんど反応せず、且つＡＴＰとの反応によってＨ⁺を輸送するタンパク質であるＡＴＰａｓｅが含まれている場合、試料溶液３２中にＡＴＰをほとんど含まないようにすることが好ましい。

　また、ピロリン酸検出装置５０では、電極３５とＨ⁺感受性電極３８とによって、電気的にピロリン酸の量を測定しているが、これに限定されない。例えば、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素を含む溶液を内部槽の内部領域３９に添加してもよい。このことによって、内部のＨ⁺濃度の増大に伴ってｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素の蛍光強度が変化する。この蛍光強度の変化を光学的に測定することによって、ピロリン酸の量を測定することができる。

　以上に述べたように、ピロリン酸を検出するために用いるＨ⁺−ピロホスファターゼが内在している膜の形状は、球状であっても、平面状であっても構わない。つまり、Ｈ⁺−ピロホスファターゼが内在している膜により隔てられた２つの領域の間のＨ⁺の移動の全て、あるいはほとんどが、Ｈ⁺−ピロホスファターゼによって行なわれる条件を構築すればよい。

　また、本実施形態の、試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する方法を応用して、試料中の塩基配列中の突然変異部位の存在の有無の判別、突然変異部位の決定および突然変異部位の塩基種の決定を行うことができる。突然変異部位の存在の有無の判別は、突然変異部位を有さない目的の塩基配列と完全に相補的なプライマーを用いてプライマー伸長反応を行い、反応によって生成したピロリン酸の量が、目的の塩基配列を含有する試料と、該目的の塩基配列に完全に相補的なプライマーを用いてプライマー伸長反応を行った場合に生成するピロリン酸の量（対照値）と同程度であるかあるいは少ないかによって、試料中の塩基配列中の突然変異部位の存在の有無を判別する。すなわち、基準値と同程度であると判別される場合は、突然変異部位が存在しないと判別し、基準値より少ないと判別される場合は、突然変異部位が存在すると判別する。

　突然変異部位の決定の場合、１塩基ずつずらして設計した複数のプライマーを用いてプライマー伸長反応を行い、生成したピロリン酸の量を測定し、ピロリン酸の量が最小となるプライマーの３’末端に対応する部位を特定することによって突然変異部位を決定することができる。

　突然変異部位の塩基種の決定は、突然変異部位の決定の後、上述のＳＮＰ部位の塩基種の決定と同様の方法により決定することができる。

　　本明細書における核酸の「塩基配列中の塩基種の判別」は、塩基配列中の突然変異部位の存在の有無の判別、突然変異部位の決定および突然変異部位の塩基種の決定、いずれをも含む。

　次に、試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する装置を説明する。図６は、本実施形態の塩基種判別装置を表す模式図である。

　図６に示すように、塩基種判別装置６０は、プライマー伸長反応を行なう反応部５１ａおよびピロリン酸を検出するピロリン酸検出部５１ｂを備える反応手段５１と、反応部５１ａとピロリン酸検出部５１ｂとを制御し、得られた結果を解析する解析手段５２とを備える。また、反応手段５１は、試料溶液を導入するためチップ５３を挿入可能なスロットを有する。

　反応部５１ａは、プライマー伸長反応に必要な温度調節を行なうことが可能な構成であればよい。例えば、プライマー伸長反応としてＰＣＲ法を用いる場合、反応部５１ａは、試料溶液導入チップ５３内の試料溶液を、核酸の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼによるプライマー伸長反応のそれぞれに適した温度を、それぞれ設定した時間で制御できるヒーター部およびプログラム温度制御部を備える構成であることが好ましい。また、ＩＣＡＮ法およびＬＡＭＰ法などの等温反応を用いる場合、反応部５１ａは、一定の温度（例えば６５℃）で保持することができるヒーター部および温度制御部を備える構成であることが好ましい。なお、本実施形態では、ＰＣＲ法に用いるサーマルサイクラーと同じ構成となっている。

　ピロリン酸検出部５１ｂの構成は、Ｈ⁺濃度の変化を測定する測定手段によって異なる。上述の図４に示すように、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素のような色素を用いてＨ⁺濃度の変化を光学的に測定する場合、ピロリン酸検出部５１ｂは、蛍光色素を励起するための光源部、発生した蛍光の強度を測定する蛍光強度測定部を備える構成であることが好ましい。

　また、上述の図５に示すように、電極を用いてＨ⁺濃度の変化を電気的に測定する場合、ピロリン酸検出部５１ｂは、電極３５およびＨ⁺感受性電極３８のそれぞれに電気的に接続することが可能な接点部または端子と、電極３５およびＨ⁺感受性電極３８との間の電位差を測定することができる電位差測定部とを備える構成であることが好ましい。

　試料溶液を導入するためチップ５３は、ＰＣＲ槽（反応用貯留領域）７３と、上述の図５に示すピロリン酸検出装置（検出用貯留領域を含む）５０と、ＰＣＲ槽７３とピロリン酸検出装置５０とを接続する流路７４ｃとを備える。

　ＰＣＲ槽７３は、精製されたＤＮＡ、タイピングプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種類のｄＮＴＰを含む試料溶液において、ＰＣＲ（プライマー伸長反応）を行なうための槽である。なお、ＰＣＲ槽７３には、それぞれ必要な試薬を、予め入れておいてもよいし、塩基種判別装置６０に挿入する直前に導入してもよい。

　ピロリン酸検出装置５０は、上記説明の通りの構成であるので、ここでは説明を省略する。なお、ピロリン酸検出装置５０の代わりに、Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化あるいは電気的変化に変換し、その光学的変化あるいは電気的変化を検知できる装置を用いることが可能である。

　流路７４ｃには、開閉部材が設けられており、開閉部材の開状態においては、流路７４ｃにおける流体の流通が許容され、開閉部材の閉状態においては、流路７４ｃにおける流体の流通が阻止される。このような構成により、ＰＣＲ槽７３と、ピロリン酸検出装置５０とがそれぞれ隔離される構造となっている。開閉部材は、上記塩基種判別装置６０の反応手段５１により開閉できる構成となっている。尚、チップ５３において、流路７４ｃは必ずしも開閉部材を備えた構成である必要はなく、ＰＣＲ反応の工程においては、ＰＣＲ槽７３に反応溶液が保持されるとともに、外部からの溶液の流入が阻止され、ピロリン酸の検出工程においては、ピロリン酸検出装置５０内に反応後の溶液が保持されるとともに、外部からの溶液の流入が阻止される構成であれば良い。

　また、解析手段５２は、反応手段５１に接続されており、具体的にはパーソナルコンピュータ（ＰＣ）等である。

　塩基種判別装置６０の動作は以下の通りである。

　まず、ＳＮＰ部位を有する標的のＤＮＡ、タイピングプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種類のｄＮＴＰを含む試料溶液をＰＣＲ槽７３に導入したチップ５３を用意する。

　次に、チップ５３を反応手段５１のスロットに挿入する。図６に示すように、チップ５３が反応手段５１のスロットに挿入されると、ＰＣＲ槽７３が反応部５１ａ内に（ＰＣＲ槽７３と反応部５１ａとを合わせて反応部ともいう）、ピロリン酸検出装置５０がピロリン酸検出部５１ｂ内に（ピロリン酸検出装置５０とピロリン酸検出部５１ｂとを合わせてピロリン酸検出部ともいう）それぞれ位置するように、チップ５３は反応手段５１内に配置される。

　次に、反応手段５１は反応部５１ａにおいて、上記図１（ｂ）から（ｄ）に示す工程、および図２（ｂ）から（ｄ）に示す工程を繰り返し行ない、チップ５３のＰＣＲ槽７３に導入されている試料溶液中でプライマー伸長反応を生じさせる。なお、上記図１（ｂ）から（ｄ）に示す工程、および図２（ｂ）から（ｄ）に示す工程を繰り返す回数は、解析手段５２に設定しておく。

　次に、上記図１（ｂ）から（ｄ）に示す工程、および図２（ｂ）から（ｄ）に示す工程が終了すると、チップ５３の流路７４ｃが反応手段５１により開放され、ピロリン酸検出装置５０内に試料溶液が導入される。ピロリン酸検出部５１ｂは、プライマー伸長反応により生じたピロリン酸の量を検出する。具体的な検出方法は、上述した通りであるので、ここでは説明を省略する。

　次に、解析手段５２は、ピロリン酸検出部５１ｂから得られる結果を解析し、試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する。ここでいう塩基種の判別とは、特定の塩基種であるか否かの判別および塩基種の決定いずれをも含む。また、図６に示す塩基種判別装置６０を用いて、塩基配列中の突然変異部位の存在の有無の判別、突然変異部位の決定、および突然変異部位の塩基種の決定を行うこともできる。この場合、解析手段５２において、ピロリン酸検出部５１ｂから得られる結果を解析し、突然変異部位の存在の有無の判別、突然変異部位の決定、および突然変異部位の塩基種の決定を行う。

　次に、チップ５３の代わりに用いることができる別のチップ５３ａを説明する。図７（ａ）は、本実施形態の別のチップを模式的に表す上面図であり、図７（ｂ）は、図７に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。

　図７（ａ）および（ｂ）に示すように、チップ５３ａは、サンプル注入口７０と、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、ＰＣＲ槽７３と、ピロリン酸検出装置（検出用貯留領域を含む）５０と、ＤＮＡ抽出槽７１とＤＮＡ精製槽７２とを接続する流路７４ａと、ＤＮＡ精製槽７２とＰＣＲ槽７３とを接続する流路７４ｂと、ＰＣＲ槽（反応用貯留領域）７３とピロリン酸検出装置５０とを接続する流路７４ｃとを備える。つまり、チップ５３ａは、図６に示したチップ５３にさらに、サンプル注入口７０と、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、流路７４ａおよび７４ｂとが設けられた構成となっている。

　サンプル注入口７０は、外部とＤＮＡ抽出槽７１とを繋いでいる。サンプル注入口７０からＤＮＡ抽出槽７１へ、血液、唾液、毛髪および毛根などを必要に応じて薬液処理した試料溶液が注入される。

　ＤＮＡ精製槽７２は、ＤＮＡを精製し、不純物を除去するための薬液処理を行なう槽である。勿論、ＤＮＡを精製するためのカラムが設けられている構成であってもよい。

　ＰＣＲ槽７３は、ＤＮＡ精製槽７２において精製されたＤＮＡ、タイピングプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種類のｄＮＴＰを含む試料溶液において、ＰＣＲ（プライマー伸長反応）を行なうための槽である。

　なお、ＤＮＡ抽出槽７１、ＤＮＡ精製槽７２およびＰＣＲ槽７３には、それぞれ必要な試薬を予め入れておいてもよいし、塩基種判別装置６０に挿入する直前に導入してもよい。

　ピロリン酸検出装置５０は、上記説明の通りの構成であるので、ここでは説明を省略する。なお、ピロリン酸検出装置５０の代わりに、Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化あるいは電気的変化に変換し、その光学的変化あるいは電気的変化を検知できる装置を用いることが可能である。

　流路７４ａ、７４ｂおよび７４ｃには、開閉部材７５が設けられており、それぞれの開閉部材７５が持ち上がると、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、ＰＣＲ槽７３と、ピロリン酸検出装置５０とがそれぞれ密閉される構造となっている。開閉部材７５は、上記塩基種判別装置６０の解析手段５２により開閉できる構成となっている。

　なお、開閉部材７５の代わりに、例えば、逆流防止弁等を流路７４ａ、７４ｂおよび７４ｃに設けてもよい。また、ピロリン酸検出装置５０に通じる脱気孔を設け、サンプル注入口７０に排気ポンプを、上記脱気孔に吸気ポンプを取り付けることにより、試料溶液を、ＤＮＡ抽出槽７１、ＤＮＡ精製槽７２、ＰＣＲ槽７３、ピロリン酸検出装置５０の各部に輸送する構成としてもよい。さらに、上記排気ポンプおよび吸気ポンプを、試料溶液と混合しない油を排出および吸引するポンプとしてもよい。いずれの構成にせよ、上記塩基種判別装置６０の反応手段５１において、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、ＰＣＲ槽７３と、ピロリン酸検出装置５０とをそれぞれ隔離することが可能であればよい。ここでいう「隔離」とは、各槽７１，７２，７３における処理中に、各槽７１，７２，７３に処理対象の溶液が保持され、他の溶液の流入が阻止される状態をいう。したがって、各槽７１，７２，７３の隔離が可能な構成であれば、開閉部材等を設けなくても達成することができる。たとえば、各槽７１，７２，７３が流路７４ａ，７４ｂ，７４ｃより一段くぼんでおり、各槽７１，７２，７３に溶液が保持された状態においては、送液手段等を動作させない限り溶液の流出入がない状態が確保される構成等が可能である。このことによって、互いに酵素の反応条件（例えば、至適温度など）が異なるプライマー伸長反応とピロリン酸の検出とを１つのチップ上で行なうことができる。

　また、本実施形態のチップ５３ａでは、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、ＰＣＲ槽７３とが個別の槽に分離されているが、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの精製およびＰＣＲを１つの槽で行なう構成としてもよい。

　図８は、本実施形態の別のチップを模式的に表す上面図である。

　図８に示すように、チップ５３ｂは、図７に示すチップ５３ａと同様に、サンプル注入口７０と、ＤＮＡ抽出槽７１と、ＤＮＡ精製槽７２と、ＰＣＲ槽（反応用貯留領域）７３と、ピロリン酸検出装置（検出用貯留領域を含む）５０と、ＤＮＡ抽出槽７１とＤＮＡ精製槽７２とを接続する流路７４ａと、ＤＮＡ精製槽７２とＰＣＲ槽７３とを接続する流路７４ｂと、ＰＣＲ槽７３とピロリン酸検出装置５０とを接続する流路７４ｃとを備えている。特に、流路７４ｂが二股に別れており、ＰＣＲ槽７３と、ピロリン酸検出装置５０と、ＰＣＲ槽７３とピロリン酸検出装置５０とを接続する流路７４ｃが２つずつ設けられている。

　チップ５３ｂを用いて、２つのＰＣＲ槽７３にそれぞれ異なるタイピングプライマーを導入することによって、同時に２つのＳＮＰ部位の塩基種を判別することが可能である。また、１つのＳＮＰ部位について、同時に２種のタイピングプライマーを導入することができ、ＳＮＰ部位の塩基種の決定に有用である。

　図９は、本実施形態の更に別のチップ（縦型チップ）を模式的に表す斜視図である。

　図９に示すように、チップ９０は、サンプル導入部９１と、ＤＮＡ精製部９２と、ＰＣＲ部９３と、ピロリン酸検出装置５０とを備えている。

　サンプル導入部９１は、サンプル導入槽９１ａとＤＮＡ抽出カラム９１ｂとを有する。血液、唾液、毛髪および毛根などを必要に応じて薬液処理した試料溶液は、サンプル導入槽９１ａに注入され、ＤＮＡ抽出カラム９１ｂを通過する。なお、血液、唾液などの液体は、薬液処理せずにサンプル導入槽９１ａに注入してもよい。

　ＤＮＡ精製部９２は、ＤＮＡ精製槽９２ａとＤＮＡ精製カラム９２ｂとを有する。ＤＮＡ抽出カラム９１ｂを通過した試料溶液は、ＤＮＡ精製槽９２ａに導入され、続いてＤＮＡ精製カラム９２ｂを通過する。

　ＰＣＲ部９３は、ＰＣＲ槽（反応用貯留領域）９３ａと隔離部材９３ｂとを有する。ＤＮＡ精製カラム９２ｂを通過することによって精製されたＤＮＡを含む試料溶液は、ＰＣＲ槽９３ａに導入され、ＤＮＡ、タイピングプライマー、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種類のｄＮＴＰを添加される。このことによって、ＰＣＲ（プライマー伸長反応）が起こる。

　隔離部材９３ｂは、上記塩基種判別装置６０の反応手段５１により開閉できる構成となっている。ＰＣＲ槽９３ａにおいてＰＣＲが終了すると、反応手段５１は、隔離部材９３ｂを開放し、試料溶液をピロリン酸検出装置（検出用貯留領域を含む）５０に通過させる。

　尚、上記チップ５３ａ，５３ｂ，９０においては、ＤＮＡ精製槽７２または９２ａを備える構成としたが、ここでは試料溶液中にＰＣＲ反応の阻害物が含まれないように、またはＰＣＲ反応の阻害物を不活性とするように試料溶液が処理されれば十分である。

　ピロリン酸検出装置５０は、上記説明の通りの構成であるので、ここでは説明を省略する。なお、ピロリン酸検出装置５０の代わりに、Ｈ⁺濃度の変化を光学的変化あるいは電気的変化に変換し、その光学的変化あるいは電気的変化を検知できる装置を用いることが可能である。

　本実施形態では、ピロリン酸の量を検出することによって、プライマー伸長反応の進行の差を解析したが、勿論、プライマー伸長反応に限られず、試料溶液中に存在するピロリン酸の量を正確に測定することができる。

　また特に、プライマー伸長反応においては、Ｈ⁺−ピロホスファターゼは、ＡＴＰおよびｄＡＴＰが阻害剤となるため、試料溶液中にＡＴＰまたはｄＡＴＰが存在し、且つピロリン酸の量が少ない場合、Ｈ⁺濃度はほとんど変化しない。逆にプライマー伸長反応によって試料溶液中のｄＡＴＰが消費され、且つピロリン酸の量が多い場合、Ｈ⁺濃度は大きく変化する。つまり、プライマー伸長反応の進行の差を、より大きな差として測定することが可能になる。従って、高精度で塩基種を判別することができる。

　（実施形態２）
　本実施形態では、試料中に特定の塩基配列を有するＤＮＡが含まれるか否かを判別する方法、すなわち、特定の塩基配列を有するＤＮＡの検出方法を説明する。具体的には、４種類のｄＮＴＰを用いてプライマー伸長反応（例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等の増幅反応）を利用する方法を図１０を参照しながら説明する。図１０は、本実施形態の試料中に特定の塩基配列を有するＤＮＡが含まれるか否かを判別する方法を表す工程図である。

　本実施形態の方法では、特定の塩基配列を有するＤＮＡに相補的に結合可能な塩基配列を有するプライマーを用いる。

　まず、図１０（ａ）に示す工程で、特定の塩基配列を有するＤＮＡが含まれるか否かを判別したい溶液に、特定の塩基配列を有するＤＮＡに相補的に結合可能な塩基配列を有するプライマー１０１、ＤＮＡポリメラーゼ８および４種類のｄＮＴＰを添加し、試料溶液１００を調製する。なお、プライマー１０１は、特定の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡに完全にハイブリダイズするように設計されている。

　次に、図１０（ｂ）に示す工程で、試料溶液１００の熱処理を行なう。このことによって、試料溶液１００中に含まれているほとんどのＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする。

　次に、図１０（ｃ）に示す工程で、試料溶液１００を冷却する。このことによって、試料溶液１００中に、特定の塩基配列を有するＤＮＡから生成した一本鎖ＤＮＡ１０２が存在する場合、一本鎖ＤＮＡ１０２にプライマー１０１がハイブリダイズする。

　次に、図１０（ｄ）に示す工程で、試料溶液１００の温度をプライマー伸長反応に最適な温度に調節する。一本鎖ＤＮＡ１０２が存在する場合、一本鎖ＤＮＡ１０２にプライマー１０１がハイブリダイズするので、プライマー伸長反応が起こる。このため、ＤＮＡポリメラーゼ８によってｄＮＴＰが消費され、ピロリン酸が生成する。

　なお、このとき、特定の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ１０２が存在しない場合、プライマー１０１はハイブリダイズできない。このため、プライマー伸長反応は起こらない。従って、ｄＮＴＰはほとんど消費されず、ピロリン酸はほとんど生成されない。

　次に、ピロリン酸を定性的に検出することによって、プライマー伸長反応の進行の有無を判別する。ピロリン酸が存在すると判別された場合は、プライマーの伸長反応が進行したと判別する。そして、試料中に特定の塩基配列を有するＤＮＡが存在したと判別する。一方、ピロリン酸が存在しないと判別された場合は、プライマーの伸長反応が進行しなかったと判別する。そして、試料中に特定の塩基配列を有するＤＮＡが存在しなかったと判別する。すなわち、特定の塩基配列を有するＤＮＡの有無を判別できる。なお、本実施形態のピロリン酸の定性検出方法は、上記実施形態１と全く同様であり、ここでは説明を省略する。

　以上に述べたように、試料中の特定の塩基配列を有する核酸の増幅法において生成されるピロリン酸を、Ｈ⁺−ピロホスファターゼを用いてＨ⁺濃度変化を解析することによって、試料中における特定の塩基配列を有する核酸の有無を判別することができる。また、本実施形態の方法を応用して、ある特定の塩基配列を有する核酸に相補的なプライマーを用いてプライマーの伸長反応を行い、反応によって生成したピロリン酸の量を基準となる配列のプライマーを用いてプライマーの伸長反応を行った場合に生成したピロリン酸の量と比較することにより、ある特定の塩基配列の基準となる塩基配列に対する相対的定量を行うこともできる。

　なお、本実施形態で説明した特定の塩基配列を有する核酸の有無を判別する方法は、上記実施形態１で説明したピロリン酸検出装置５０、塩基種判別装置６０、ならびにチップ５３ａ、５３ｂまたは９０を用いて実施することが可能である。

　上記実施形態１および２では、４種類のｄＮＴＰを用いてプライマー伸長反応を利用する方法を説明したが、勿論、従来の技術で図２１および２２を参照しながら説明した、１種類のｄＮＴＰ（またはｄｄＮＴＰ）を用いるプライマー伸長反応を利用することも可能である。また、タイピングプライマーを含む２種類以上のプライマーを用いるＰＣＲ法等の特定の塩基配列を有する核酸の増幅法を併用してもよい。また、タイピングプライマーについても、３’末端がＳＮＰ部位に対応し、ＳＮＰ部位に隣接する塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列を有するプライマーに限定されることはなく、プライマー伸長反応の進行の程度によって塩基種を判別できるプライマーであればよい。たとえば、３’末端がＳＮＰ部位に対応し、ＳＮＰ部位に隣接する塩基配列に対して１塩基を除いて完全に相補的な塩基配列を有するプライマー、３’末端に隣接する部位がＳＮＰ部位に対応するプライマー等の公知のプライマーを用いることもできる。つまり、解析対象となるＳＮＰ部位を含む塩基配列を有する核酸の増幅をＨ⁺−ピロホスファターゼを用いて解析し、ＳＮＰ部位の塩基種の判別を行えばよい。

　勿論、上記実施形態１の方法によれば、ＳＮＰ部位の塩基種の判別だけでなく、特定の塩基配列を判別することも可能である。

　また、上記実施形態１および２では、ＤＮＡの塩基配列中の塩基種の判定およびＤＮＡの検出について説明したが、勿論、ＤＮＡに限られず、ＲＮＡの塩基配列中の塩基種の判定およびＲＮＡの検出も同様に行なうことができる。さらに、試料として、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡに関わらず用いることが可能である。

　（ピロリン酸の検出実験１）
　本実施例を、Ｓｈｉｚｕｏ　Ｙｏｓｈｉｄａらの方法（Ｍａｓａｙｏｓｈｉ　Ｍａｅｓｈｉｍａ　ａｎｄ　Ｓｈｉｚｕｏ　Ｙｏｓｈｉｄａ、１９８９年、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.、２６４（３３）、２００６８−２００７３ページ）に準じて以下に示すように行なった。

　まず、ヤエナリ由来の液胞膜からなる膜小胞をＴｒｉｓ／Ｍｅｓバッファー（濃度５ｍＭ、ｐＨ７．０）、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、ＤＴＴ（濃度２ｍＭ）からなる溶液中に溶かし液胞膜からなる膜小胞の懸濁液とした。

　次に、この懸濁液を、ＭｇＳＯ₄（濃度１ｍＭ）、ＫＣｌ（濃度５０ｍＭ）、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、アクリジンオレンジ（ｐＨ感受性色素、濃度３μＭ）、Ｈｅｐｅｓ／Ｂｒｉｓｔｒｉｓ　ｐｒｏｐａｎｅ（濃度２５ｍＭ、ｐＨ７．２）からなる反応液中に混合し、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ液とした。

　次に、このＨ⁺−ピロホスファターゼ液を４本のチューブに均等に分注し、これらに対してピロリン酸ナトリウムの各最終濃度がそれぞれ１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭおよび１００μＭとなるようにピロリン酸ナトリウム溶液を添加し、ピロリン酸のＨ⁺−ピロホスファターゼによる加水分解反応を開始した。

　本実施例では、上記の各反応液に４９３ｎｍの励起光を照射し、ピロリン酸ナトリウム溶液を添加する前後における５４０ｎｍの蛍光強度の変化を解析した。その結果を図１１に示す。

　図１１は、ピロリン酸ナトリウムの濃度と、５４０ｎｍの蛍光強度の変化との関係を表すグラフである。ここでは、５４０ｎｍの蛍光強度の変化を、各ピロリン酸ナトリウム濃度に対応する反応液における単位秒当たりの消光率で表している。なお、ピロリン酸ナトリウムの最終濃度が１００μＭの反応液における単位秒当たりの消光率を１００％として、各ピロリン酸ナトリウム濃度に対応する反応液における単位秒当たりの消光率を換算している。

　図１１に示すように、ピロリン酸ナトリウムの濃度に依存してアクリジンオレンジの１秒当たりの消光率がほぼ双曲線関数の関係で変化するという結果が得られた。このことから、アクリジンオレンジの１秒当たりの消光率を測定することにより、ピロリン酸を定量的に検出できることがわかる。

　　（ピロリン酸の検出実験２）
　本実施例を、Ｍａｓａｓｕｋｅ　Ｙｏｓｈｉｄａ等の方法（ＭａｓａＨ.Ｓａｔｏ、Ｍａｓａｈｉｋｏ　Ｋａｓａｈａｒａ、Ｎｏｒｉｙｕｋｉ　Ｉｓｈｉｉ、Ｈａｒｕｏ　Ｈｏｍａｒｅｄａ、Ｈｉｄｅｏ　ＭａｔｓｕｉおよびＭａｓａｓｕｋｅ　Ｙｏｓｈｉｄａ、１９９４年、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.、２６９（９）、６７２５−６７２８ページ）に準じて以下に示すように行なった。

　まず、カボチャの種から液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼの精製を行なった。

　続いて、大豆のホスファチジルコリンとコレステロールとから調製した脂質混合液に、精製して得られた液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼを添加し、液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼのプロテオリポソーム液を調製した。このプロテオリポソーム液を、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ−Ｎａ（濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＥＧＴＡ（濃度０．１ｍＭ）、ＫＣｌ（濃度５０ｍＭ）、オクソノールＶ（膜電位感受性色素、濃度０．２μＭ）からなる反応液中に混合した後、５本のチューブに均等に分注した。

　続いて、５本のチューブにピロリン酸ナトリウムの最終濃度がそれぞれ１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭおよび１００μＭとなるようにピロリン酸ナトリウム溶液を添加し、ピロリン酸のＨ⁺−ピロホスファターゼによる加水分解反応を開始した。

　本実施例では、上記の各反応液に６１０ｎｍの励起光を照射し、ピロリン酸ナトリウム溶液を添加する前後における６３９ｎｍの蛍光強度の変化を測定することによって、ピロリン酸ナトリウム溶液の添加前後における各反応液に含まれるプロテオリポソームの膜電位変化について解析した。その結果を図１２に示す。

　図１２は、ピロリン酸ナトリウムの濃度と、６３９ｎｍの蛍光強度の変化との関係を表すグラフである。ここでは、６３９ｎｍの蛍光強度の変化を、各ピロリン酸ナトリウム濃度に対応する反応液における単位秒当たりの消光率で表している。なお、ピロリン酸ナトリウムの終濃度が１００μＭの反応液における単位秒当たりの消光率を１００％として、各ピロリン酸ナトリウム濃度に対応する反応液における単位秒当たりの消光率を換算している。

　図１２に示すように、ピロリン酸ナトリウムの濃度に依存してオクソノールＶの１秒当たりの消光率がほぼ双曲線関数の関係で変化するという結果が得られた。このことから、オクソノールＶの１秒当たりの消光率を測定することにより、ピロリン酸を定量的に検出できることがわかる。

　　（ピロリン酸の検出実験３）
　本実施例は、特開平６−９０７３６号公報に開示された方法に準じて行なった。

　まず、上記実施例２と同様にカボチャの種由来の液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼを用い、市販のＩＳＦＥＴ-ｐＨセンサ上に液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼを含む脂質二重層を固定した。ただし、脂質二重層の外部はＭｇＳＯ₄（濃度１ｍＭ）、ＫＣｌ（濃度５０ｍＭ）、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、Ｈｅｐｅｓ／Ｂｒｉｓｔｒｉｓ　ｐｒｏｐａｎｅ（濃度２５ｍＭ、ｐＨ７．２）からなる反応溶液によって満たした。

　次に、上述した液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼを含む脂質二重層が固定されたＩＳＦＥＴ-ｐＨセンサを用いて、上記反応溶液中のピロリン酸ナトリウムの最終濃度がそれぞれ２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ、８０μＭおよび１００μＭとなるようにピロリン酸ナトリウム溶液を添加した場合の各ｐＨ値を測定した。その結果を図１３に示す。

　図１３に示すように、ピロリン酸ナトリウムの濃度に依存してｐＨ値が減少していく結果が得られた。このことから、ｐＨ値を測定することによって、ピロリン酸を定量的に検出できることがわかる。

　本実施例では、試料中におけるλＤＮＡ（λＤＮＡの全塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｖ００６３６、Ｊ０２４５９、Ｍ１７２３３、Ｘ００９０６を参照）の検出を行なった。

　まず、λＤＮＡ（宝酒造（株）製）が１０ｎｇ／μＬの濃度で蒸留水中に溶解されている試料液Ａ、および蒸留水のみからなる試料液Ｂを用意した。また、図１４（ａ）に示すように、λＤＮＡの特定の塩基配列に完全にハイブリダイズし得る２種類のプライマーＣおよびプライマーＤをそれぞれ蒸留水に溶かしたプライマー溶液ＥおよびＦ（いずれも２０μＭ）を用意した。

　上記試料液ＡおよびＢそれぞれに、ＴａＫａＲａ　Ｌａ　Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ、宝酒造（株）製）、ＴａＫａＲａ　Ｌａ　Ｔａｑの専用バッファーである２×ＧＣ　ｂｕｆｆｅｒＩ（宝酒造（株）製）、ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（各濃度２．５ｍＭ、宝酒造（株）製）、ならびにプライマー溶液ＥおよびＦを添加して、図１４（ｂ）に示す組成のＰＣＲ反応液ＧおよびＨを調製した。

　次に、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨのそれぞれについて、図１４（ｃ）に示す反応温度条件でＰＣＲ反応を行なった。

　ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨのそれぞれを、上記実施例１に記載のＨ⁺−ピロホスファターゼ液と混合し反応させた。

　本実施例では、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨのそれぞれについて、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ液を混合する前後におけるアクリジンオレンジの蛍光強度変化について解析した。アクリジンオレンジの蛍光強度解析については、４９３ｎｍの励起光を照射し５４０ｎｍの蛍光強度について解析した。その結果を図１５（ａ）に示す。

　図１５（ａ）は、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨのそれぞれに、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ液を混合する前後における蛍光強度変化率を示している。なお、蛍光強度変化率は、図１５（ｂ）に示す式で表される。

　図１５（ａ）に示すように、ＰＣＲ反応液Ｇの方が、ＰＣＲ反応液Ｈよりも明らかに蛍光強度変化率が大きい。すなわち、ＰＣＲ反応液Ｇではピロリン酸が生成されており、プライマー伸長反応が進行したことがわかる。かかる結果に基づいて、ＰＣＲ反応液Ｇには、標的核酸が存在していたと判別される。従って、アクリジンオレンジの蛍光強度を測定することにより標的核酸の検出ができることがわかる。

　本実施例では、λＤＮＡの塩基配列内におけるある塩基を人為的に他の塩基に置換した変異型λＤＮＡを作製し、通常のλＤＮＡと変異型λＤＮＡとを判別できるか否かについて検討した。

　まず、λＤＮＡ（宝酒造（株）製）を用いて変異型λＤＮＡを作製した。変異型λＤＮＡは、図１６に示したλＤＮＡ（以下、通常のλＤＮＡのことを野性型λＤＮＡと記す）の二本鎖ＤＮＡ配列内に存在するＧＣ塩基対（図中の領域Ｒ₁）を当業者に周知の方法で人為的にＡＴ塩基対（図中の領域Ｒ₂）に置換した。

　次に、野性型λＤＮＡおよび変異型λＤＮＡのそれぞれを最終濃度１０ｎｇ／μＬとなるように蒸留水に溶解したものをそれぞれ野性型λＤＮＡ液および変異型λＤＮＡ液とした。

　次に、上記の塩基の違いを判別するために、図１６（ａ）に示すタイピングプライマーを用意した。続いて、タイピングプライマーを最終濃度２０μＭとなるように蒸留水に溶解したタイピングプライマー溶液を調製した。

　なお、図１６（ａ）に示すタイピングプライマーは、野性型λＤＮＡの下の段に記した一本鎖ＤＮＡに完全にハイブリダイズする。しかし、このタイピングプライマーの３’末端のＧは、変異型λＤＮＡの下の段に記した一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズできない。従って、このタイピングプライマーを用いてプライマー伸長反応を行なうと、野性型λＤＮＡの場合は良好に反応が進行するが、変異型λＤＮＡの場合は反応があまり進行しない。

　また、上記実施例４で用いたプライマー溶液Ｆも用意した。

　次に、野性型λＤＮＡ液および変異型λＤＮＡ液のそれぞれについて、ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ、宝酒造（株）製）、およびＴａＫａＲａ　Ｔａｑ専用の１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造（株）製）、およびｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ（各濃度２．５ｍＭ、宝酒造（株）製）、およびタイピングプライマー溶液およびプライマー溶液Ｆを用いて、図１６（ｂ）に示す組成のＰＣＲ反応液ＩおよびＪを調製した。

　次に、ＰＣＲ反応液ＩおよびＪにおいて、それぞれ図１６（ｃ）に示す反応温度条件でＰＣＲ反応を行なった。

　ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液ＩおよびＪを、それぞれＨ⁺−ピロホスファターゼ・リポソーム液と混合し反応させた。Ｈ⁺−ピロホスファターゼ・リポソーム液は、Ｍａｓａｓｕｋｅ　Ｙｏｓｈｉｄａ等の方法（ＭａｓａＨ.Ｓａｔｏ、Ｍａｓａｈｉｋｏ　Ｋａｓａｈａｒａ、Ｎｏｒｉｙｕｋｉ　Ｉｓｈｉｉ、Ｈａｒｕｏ　Ｈｏｍａｒｅｄａ、Ｈｉｄｅｏ　Ｍａｔｓｕｉ　ａｎｄ　Ｍａｓａｓｕｋｅ　Ｙｏｓｈｉｄａ.、１９９４年、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.、２６９（９）、６７２５−６７２８ページ）に準じて調製した。

　具体的には、まず、カボチャの種から液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼの精製を行なった。続いて、大豆のホスファチジルコリンとコレステロールとから調製した脂質混合液に、精製して得られた液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼを添加し、液胞膜Ｈ⁺−ピロホスファターゼのプロテオリポソーム液を調製した。このプロテオリポソーム液を、ｓｏｒｂｉｔｏｌ（濃度０．２５Ｍ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ−Ｎａ（濃度１０ｍＭ、ｐＨ７．５）、ＥＧＴＡ（濃度０．１ｍＭ）、ＫＣｌ（濃度５０ｍＭ）、オクソノールＶ（膜電位感受性色素、濃度０．２μＭ）からなる反応液中に混合し、これをＨ⁺−ピロホスファターゼ・リポソ−ム液とした。

　本実施例では、上記の各ＰＣＲ反応液に６１０ｎｍの励起光を照射し、ピロリン酸ナトリウム溶液を添加する前後におけるオクソノールＶの６３９ｎｍの蛍光強度の変化を測定することによって、各反応液に含まれるプロテオリポソームの膜電位変化について解析した。その結果を図１７に示す。

　図１７は、ＰＣＲ反応液ＩおよびＪのそれぞれの混合前後における蛍光強度変化率を示している。図１７に示すように、ＰＣＲ反応液Ｉの方が、変異型ＰＣＲ反応液Ｊよりも明らかに蛍光強度変化率が大きい。これは、ＰＣＲ反応液ＪではＰＣＲ反応が良好に進行しなかったが、ＰＣＲ反応液Ｉは良好に進行し、その結果、生成されたピロリン酸がリポソームに存在するＨ⁺−ピロホスファターゼと反応し、リポソーム内にＨ⁺が輸送されたためと考えられる。

　従って、本実施例によれば、ＤＮＡの特定の塩基配列中の１塩基対の違いを判別できることがわかる。すなわち、本実施例の方法は、ＳＮＰ部位の塩基種の判別、突然変異による１塩基対の変異など、特定の塩基種を判別するために非常に有効であることを示すものである。

　本実施例では、上記実施例５とは異なり、１塩基伸長反応とＨ⁺−ピロホスファターゼの反応とを組み合わせた方法で、野生型λＤＮＡと変異型λＤＮＡとの間の１塩基対の違いを判別できるか否かについて検討した。

　まず、上記実施例５で用いたものと同じ野性型λＤＮＡおよび変異型λＤＮＡをそれぞれ終濃度が５ｍＭとなるように蒸留水に溶解した野性型λＤＮＡ（５ｍＭ）液および変異型λＤＮＡ（５ｍＭ）液を調製した。

　次に、図１８（ａ）に示すプライマーを用意した。このプライマーは、実施例５で、図１６（ａ）に示した野性型λＤＮＡの下段側の一本鎖ＤＮＡに、５’末端のＣを除く配列に対して完全にハイブリダイズし得る。すなわち、実施例５で示した変異型λＤＮＡ配列の下段側の一本鎖ＤＮＡ配列においても同様に、５’末端のＴを除く配列に対して完全にハイブリダイズし得る。

　次に、このプライマーを、最終濃度０．２ｍＭとなるように蒸留水に溶かしたプライマー溶液Ｍを調製した。

　続いて、野性型λＤＮＡ（５ｍＭ）液および変異型λＤＮＡ（５ｍＭ）液それぞれについて、ＴａＫａＲａ　Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ、宝酒造（株）製）、およびＴａＫａＲａ　Ｔａｑ専用の１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造（株）製）、および２．５ｍＭのｄＡＴＰ溶液、およびプライマー溶液Ｍを用いて、図１８（ｂ）に示す組成の伸長反応液ＫおよびＬを調製した。

　続いて、伸長反応液ＫおよびＬのそれぞれについて、図１８（ｃ）に示す反応温度条件で１塩基伸長反応を行なった。

　１塩基伸長反応終了後、各伸長反応液をＨ⁺−ピロホスファターゼを固定した修飾ＩＳＦＥＴ電極に導入した。修飾ＩＳＦＥＴ電極は、上記実施例３で用いたものである。

　この修飾ＩＳＦＥＴ電極を用いて、各伸長反応液を添加した場合の各ｐＨ値を測定した。その結果、伸長反応液ＫのｐＨは６．８９であったのに対し、伸長反応液ＬのｐＨは６．０２であった。この結果は、野性型λＤＮＡを含む伸長反応液Ｋでは伸長反応が起きなかったが、変異型λＤＮＡを含む伸長反応液ＬではｄＡＴＰによる１塩基伸長反応が起こり、その結果、生成されるピロリン酸が修飾ＩＳＦＥＴ電極上のＨ⁺−ピロホスファターゼと反応し、Ｈ⁺が修飾ＩＳＦＥＴ電極側に輸送されたためと考えられる。

　本方法によれば、標的核酸の塩基配列中の１塩基対の違いを判別できることがわかる。つまり、本方法はＳＮＰ部位の塩基種の判別、突然変異による１塩基対の置換など、特定の塩基配列を判別するための非常に有効な方法であることがわかる。

　本発明の塩基種判別方法および塩基種判別装置は、ＳＮＰ部位の塩基種の判別に利用することができ、従ってＳＮＰタイピングに基づいた薬の投与といったテーラーメード医療に有用である。また、本発明の塩基判別方法および塩基種判別装置は、ＤＮＡの塩基配列中の突然変異の解析に有用であり、かかる解析結果を創薬や臨床に利用することができる。

　本発明の核酸の検出方法は、遺伝病の診断、細菌およびウイルス等による食品の汚染検査、細菌およびウイルス等の人体への感染検査に有用である。

図１は、実施形態１の試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する方法を表す工程図である。 図２は、実施形態１の試料中の標的ＤＮＡのＳＮＰ部位の塩基種を判別する方法を表す工程図である。 図３は、Ｈ⁺−ピロホスファターゼを模式的に表す図である。 図４は、ピロリン酸の検出方法を表す図である。 図５は、ピロリン酸の検出装置を表す図である。 図６は、実施形態１の塩基種判別装置を表す模式図である。 図７（ａ）は、実施形態１のチップを模式的に表す上面図であり、図７（ｂ）は、図７に示したＸ−Ｘ線に沿った断面図である。 図８は、実施形態１の別のチップを模式的に表す上面図である。 図９は、実施形態１の更に別のチップを模式的に表す斜視図である。 図１０は、実施形態２の試料中に特定の塩基配列を有するＤＮＡが含まれるか否かを検出する方法を表す工程図である。 図１１は、ピロリン酸ナトリウムの濃度と、５４０ｎｍの蛍光強度の変化との関係を表すグラフである。 図１２は、ピロリン酸ナトリウムの濃度と、６３９ｎｍの蛍光強度の変化との関係を表すグラフである。 図１３は、ピロリン酸ナトリウムの濃度とｐＨ値との関係を表すグラフである。 図１４（ａ）は、λＤＮＡの特定の塩基配列に完全にハイブリダイズし得る２種類のプライマーＣおよびプライマーＤを表す図であり、図１４（ｂ）は、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨの組成を表す表であり、図１４（ｃ）は、ＰＣＲ反応を行なった反応温度条件を表すフローチャートである。 図１５（ａ）は、ＰＣＲ反応液ＧおよびＨのそれぞれに、Ｈ⁺−ピロホスファターゼ液を混合する前後における蛍光強度変化率を示すグラフであり、図１５（ｂ）は、蛍光強度変化率を示す式である。 図１６（ａ）は、野性型λＤＮＡ、変異型λＤＮＡおよびタイピングプライマーを表す図であり、図１６（ｂ）は、ＰＣＲ反応液ＩおよびＪの組成を表す表であり、図１６（ｃ）は、ＰＣＲ反応を行なった反応温度条件を表すフローチャートである。 図１７は、ＰＣＲ反応液ＩおよびＪのそれぞれの混合前後における蛍光強度変化率を示している。 図１８（ａ）は、プライマーを表す図であり、図１８（ｂ）は、ＰＣＲ反応液ＫおよびＬの組成を表す表であり、図１８（ｃ）は、ＰＣＲ反応を行なった反応温度条件を表すフローチャートである。 従来のプライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術を表す工程である。 従来のプライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術を表す工程である。 従来のプライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術を表す工程である。 従来のプライマー伸長反応を利用したＳＮＰ部位の塩基種の判別技術を表す工程である。

符号の説明

　１、２　ＤＮＡ
　３、４、５、６　一本鎖ＤＮＡ
　７　タイピングプライマー
　８　ＤＮＡポリメラーゼ
　１０　ピロリン酸
　１１　Ｈ⁺−ピロホスファターゼ
　１２　リン酸
　１３　液胞膜
　３１　反応容器
　３２　試料溶液
　３３　膜小胞
　３４　容器
　３５　電極
　３６　内部槽
　３７　膜
　３８　Ｈ⁺感受性電極
　３９　内部領域（第２領域）
　５０　ピロリン酸測定装置
　５１　反応手段
　５１ａ　反応部
　５１ｂ　ピロリン酸測定部
　５２　解析手段
　５３、５３ａ、５３ｂ、９０　チップ
　６０　塩基種判別装置
　７０　サンプル注入口
　７１　ＤＮＡ抽出槽
　７２　ＤＮＡ精製槽
　７３　ＰＣＲ槽
　７４ａ、７４ｂ、７４ｃ　流路
　７５　開閉部材
　９１　サンプル導入部
　９１ａ　サンプル導入槽
　９１ｂ　ＤＮＡ抽出カラム
　９２　ＤＮＡ精製部
　９２ａ　ＤＮＡ精製槽
　９２ｂ　ＤＮＡ精製カラム
　９３　ＰＣＲ部
　９３ａ　ＰＣＲ槽
　９３ｂ　隔離部材
　１００　試料溶液
　１０１　プライマー
　１０２　一本鎖ＤＮＡ

Claims (30)

1. 　プライマーの伸長反応を検出する伸長反応検出方法であって、該方法は以下の工程を包含する；
   　核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、
   　　前記試料溶液を前記伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、
   　　表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、
   　　前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、および
   　　工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）。
2. 　核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別方法であって、該方法は以下の工程を包含する；
   　核酸と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、
   　　前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、
   　　表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、
   　　前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、
   　　工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、および
   　　工程（ｅ）の検出結果に基づいて前記核酸の塩基配列中の塩基種を判別する工程（ｆ）。
3. 　工程（ｄ）において、前記表面側の溶液のＨ^＋濃度と、工程（ｂ）後であって工程（ｃ）前の前記試料溶液のＨ^＋濃度との差を測定する、請求項２に記載の塩基種判別方法。
4. 　工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出する、請求項３に記載の塩基種判別方法。
5. 　前記塩基種の判別が、ＳＮＰ部位の塩基種の判別であり、
   　前記対照値は、前記核酸として前記ＳＮＰ部位が変異していない核酸を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果である、請求項４に記載の塩基種の判別方法。
6. 　工程（ｄ）において、前記裏面側の溶液のＨ^＋濃度を検出し、
   　工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出する、請求項２に記載の塩基種判別方法。
7. 　前記塩基種の判別が、ＳＮＰ部位の塩基種の判別であり、
   　工程（ａ）において、前記ヌクレオチドとして１種類のヌクレオチドを用い、
   　前記対照値は、前記核酸として前記ＳＮＰ部位の塩基種が異なる核酸を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果である、請求項６に記載の塩基種判別方法。
8. 　工程（ｄ）では、前記Ｈ^＋濃度を光学的に測定する、請求項２に記載の塩基種判別方法。
9. 　工程（ｄ）では、前記表面側の溶液および前記裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素が添加されている、請求項８に記載の塩基種判別方法。
10. 　工程（ｄ）では、前記表面側の溶液および前記裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、アクリジンオレンジまたはオクソールＶが添加されている、請求項９に記載の塩基種判別方法。
11. 　工程（ｄ）では、前記Ｈ^＋濃度を電気的に測定する、請求項２に記載の塩基種判別方法。
12. 　前記伸長反応は、ＰＣＲ法に従った伸長反応である、請求項２に記載の塩基種判別方法。
13. 　核酸の塩基配列中の塩基種を判別する塩基種判別装置であって、
    　プライマーの伸長反応に必要な温度調節を行う反応部と、
    　前記プライマー伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を検出するピロリン酸検出部とを備え、
    　前記反応部は、溶液を貯留する反応用貯留領域を備え、
    　前記ピロリン酸検出部は、溶液を貯留する検出用貯留領域と、前記検出用貯留領域を第１領域と第２領域とに分離するＨ^＋難透過性膜と、第１領域および第２領域の少なくともいずれか一方の領域に貯留された溶液のＨ^＋濃度を測定する測定手段とを備え、
    　前記Ｈ^＋難透過性膜は、その表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有し、
    　前記ピロリン酸検出部において、前記反応部から送出される反応溶液は、第１領域に貯留される、塩基種判別装置。
14. 　前記測定手段は、Ｈ^＋濃度を光学的に測定する、請求項１３に記載の塩基種判別装置。
15. 　前記測定手段は、Ｈ^＋濃度を電気的に測定する、請求項１３に記載の塩基種判別装置。
16. 　前記反応部および前記ピロリン酸検出部を制御し、前記測定手段による測定結果を解析する解析手段をさらに備える、請求項１３に記載の塩基種判別装置。
17. 　前記反応用貯留領域および前記検出用貯留領域を具備したチップを挿入可能なスロットをさらに備える、請求項１３に記載の塩基種判別装置。
18. 　容器と、前記容器内を第１領域と第２領域とに分離するＨ^＋難透過性膜と、第１領域に貯留される溶液に接触するように設けられた電極と、第２領域に貯留される溶液に接触するように設けられたＨ^＋感受性電極とを備え、
    　前記Ｈ^＋難透過性膜は、その表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有する、ピロリン酸検出装置。
19. 　特定の塩基配列を有する核酸の検出方法であって、該方法は以下の工程を包含する；
    　試料と、前記核酸に相補的に結合する相補結合領域を含む塩基配列を有するプライマーと、ヌクレオチドとを含む試料溶液を調製する工程（ａ）、
    　　前記試料溶液を前記プライマーの伸長反応が生じる条件下におき、前記伸長反応が生じた場合にピロリン酸を生成する工程（ｂ）、
    　　表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有するＨ^＋難透過性膜の表面に前記試料溶液を接触させる工程（ｃ）、
    　　前記Ｈ^＋−ピロホスファターゼを溶液に浸漬させた状態で、前記Ｈ^＋難透過性膜の表面側の溶液もしくは前記Ｈ^＋難透過性膜の裏面側の溶液の少なくともいずれか一方のＨ^＋濃度を測定する工程（ｄ）、
    　　工程（ｄ）の測定結果に基づいて前記伸長反応を検出する工程（ｅ）、および
    　　工程（ｅ）の検出結果に基づいて前記核酸を検出する工程（ｆ）。
20. 　工程（ｄ）において、前記表面側の溶液のＨ^＋濃度と、工程（ｂ）後であって工程（ｃ）前の前記試料溶液のＨ^＋濃度との差を測定する、請求項１９に記載の核酸の検出方法。
21. 　工程（ｅ）において、工程（ｄ）の測定結果を対照値と比較することにより前記伸長反応を検出する、請求項２０に記載の核酸の検出方法。
22. 　前記対照値は、核酸を含まない前記試料を用いて工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）を行い、工程（ｄ）で得られた測定結果である、請求項２１に記載の核酸の検出方法。
23. 　工程（ｄ）では、前記Ｈ^＋濃度を光学的に測定する、請求項１９に記載の核酸の検出方法。
24. 　工程（ｄ）では、前記表面側の溶液および前記裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、ｐＨ感受性色素または膜電位感受性色素が添加されている、請求項２３に記載の核酸の検出方法。
25. 　工程（ｄ）では、前記表面側の溶液および前記裏面側の溶液のうち少なくともいずれか一方に、アクリジンオレンジまたはオクソールＶが添加されている、請求項２４に記載の核酸の検出方法。
26. 　工程（ｄ）では、前記Ｈ^＋濃度を電気的に測定する、請求項１９に記載の塩基種判別方法。
27. 　前記伸長反応は、ＰＣＲ法に従った伸長反応である、請求項１９に記載の塩基種判別方法。
28. 　プライマーの伸長反応を行うための反応槽と、ピロリン酸を検出するためのピロリン酸検出槽と、前記反応槽と前記ピロリン酸検出槽とを接続する流路とを備える、試料溶液導入チップ。
29. 　前記流路は、開閉可能である、請求項２８に記載の試料溶液導入チップ
30. 　前記ピロリン酸検出槽は、Ｈ^＋難透過性膜によって分離された第１領域および第２領域を有し、
    　前記Ｈ^＋難透過性膜は、その表裏を貫通し、ピロリン酸を加水分解する活性部位が表面に露出しているＨ^＋−ピロホスファターゼを有し、
    　前記ピロリン酸検出槽において、前記反応槽から前記流路を介して送出される反応溶液は、第１領域に貯留される、請求項２８に記載の試料溶液導入チップ。

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