【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、複数の乳酸菌を培養して得られる乳酸菌生産物質と、上記乳酸菌生産物質の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸菌は、腸内で腸内微生物の生育に大きな影響を与え、腸内環境を良好に保つことが知られている。この乳酸菌は人の腸内にいわゆる善玉菌として生息し、上記腸内環境を維持している。したがって、この乳酸菌数が低下したり、活性が低下したりすることによって上記腸内環境が崩れる原因になる。
そこで、近年乳酸菌の生菌を腸内に補給するために、その生菌を含むヨーグルトや飲料などが販売されている。そして、これらのヨーグルトや飲料を直接体内に取り入れて、腸内の乳酸菌量を増加させるようにしている。
なお、本願出願人は、先行技術調査をおこなうことなく、公知の技術を基に本願発明を開発したので、本件に係る先行技術文献情報はない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記生菌を含むヨーグルトや飲料などの食料品を摂取したとしても、その生菌が腸に到達するまでに、胃酸で分解されたり、消化されたりして、生菌のほとんどが死滅してしまう。つまり、ヨーグルトや飲料などから生菌を摂取したとしても、生きたまま腸に到達する乳酸菌はほんのわずかな量になってしまう。
したがって、乳酸菌による期待通りの整腸作用が得られないことが多い。
【０００４】
また、上記のように生菌の死滅を考慮すると、上記乳酸菌を含む食品を大量に摂取しなければならず、十分な整腸作用が得られない。しかしながら、ヨーグルトなどの飲食単位（ヨーグルト一瓶）に含まれている乳酸菌の量に限りがあるので、大量の乳酸菌を一度に摂取することは、かなり難しくなる。
この発明の目的は、少量を摂取することで乳酸菌による効果を得ることができる乳酸菌生産物質とその製造方法を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
第１の発明は、複数種の乳酸菌を共生培養した培養液をろ過したろ液からなることを特徴とする。
第２の発明は、乳酸菌として、連鎖球菌属、乳酸桿菌属、ビフィズス菌属を用いたことを特徴とする。
【０００６】
第３の発明は、複数種の乳酸菌を混合し、これを共生培養するとともに、この培養液をろ過してろ液を得ることを特徴とする。
第４の発明は、混合培養は、乳酸菌の少なくとも２種類を混合する第１次培養と、少なくともこの第１次培養した第１次培養菌を含む第２次培養と、少なくともこの第２次培養した第２次培養菌を含む第３次培養と、少なくともこの第３次培養した第３次培養菌を含む最終培養とを有することを特徴とする。
第５の発明は、乳酸菌として、連鎖球菌属、乳酸桿菌属、ビフィズス菌属を用いたことを特徴とする。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本願出願人は、乳酸菌の代謝産物に着目し、この乳酸菌の代謝産物が腸内環境の調整に役立つものと考えた。すなわち、上記乳酸菌の代謝産物が腸内に供給されることによって、これら代謝産物に含まれる成分が、腸内良性菌の栄養源となって、それら良性菌が活性化されるものとの仮説を立て、いろいろな実験を繰り返した。
【０００８】
（実験例１）
そこで、先ず、複数の乳酸菌を共生培養し、その生産物質の中から乳酸菌を取り除くことによって、乳酸菌の代謝産物を含んだ乳酸菌生産物質を得た。
このようにして得た乳酸菌生産物質を次の条件の下で１００人に経口摂取させた。すなわち、各人に、７ｍｌずつ、朝、昼、夜の食間空腹時に、８週間継続的に摂取させた。その結果、表１に示すように、体のしびれ、便秘、腹部膨満、頭痛などの自覚感覚に対して、ある程度の好転が見られた。
【表１】
【０００９】
このように自覚感覚に好転が見られたのは、菌の生存に関わりなく、多くの代謝産物が腸内に供給され、それが腸内良性菌の栄養源となって、良性菌が活性化されたものと考えられる。
【００１０】
なお、上記複数の乳酸菌としては、次のものを用いた。
上記乳酸菌として連鎖球菌属、乳酸桿菌属、ビフィズス菌属を用いた。また、上記連鎖球菌属としては、Ｌ．ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｃａｌｉｓ）、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を用いた。乳酸桿菌属としては、Ｌ．カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用いた。ビフィズス菌属としては、Ｂ．ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）を用いた。
なお、上記実験１は、北京中日友好医院中医内科に依頼したものである。
【００１１】
（実験例２）
実験例２においては、血糖値の高い人に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で５０人に経口摂取させた。すなわち、各人に、７ｍｌずつ、朝、昼、夜の食間空腹時に、１６週間継続的に摂取させた。その結果、血糖値の顕著な低下が見られたが、その実験結果を示したのが表２である。なお、この表２は、上記５０人の平均値を示したものである。実験結果は、「参照値±標準値」で表示した。
【００１２】
【表２】
【００１３】
上記表２に示したように、乳酸菌生産物質を経口摂取させることによって、静脈血糖値（ＧＬＵ）および糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）ともに明らかに低下したことが分かる。したがって、上記乳酸菌生産物質は、静脈血糖値（ＧＬＵ）および糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）に対して著しい効果作用があるといえる。
また、乳酸菌生産物質の摂取を止めてから１ヶ月後でも、これが再び上昇することがなかった。
【００１４】
上記のような乳酸菌生産物質は、腸内環境を良好に保つとともに、腸内環境が整うことによって、腸内の栄養の吸収効率が上昇して、体内の恒常性を維持するものと考えられる。
なお、上記実験例２は、北京中日友好医院中医内科に依頼したものである。
【００１５】
（実験例３）
実験例３においては、消化系腫瘍患者に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で５０人に経口摂取させた。すなわち、各人に、一日一回７ｍｌを経口摂取させた。摂取期間は４０日を１クールとした。その結果、食欲増加の自覚症状が２３例あり、全体の４６％を占めた。また、精神疲労が好転したという自覚症状が２４例あり、全体の４８％を占めた。
【００１６】
さらに、足、腰の虚脱感が改善した例は２４例であり、全体の４８％を占めた。体重増加は２２例で、全体の４４％を占めた。また、生存品質（ＱＯＬ）が向上したと観察された例は２６例で５２％を占めた。口の渇き改善例が１７例であり３４％を占めた。
これらの結果は乳酸菌生産物質が肝臓、脾臓に対して有益だということを示していると考えられる。
【００１７】
また、血液検査の結果を表３に示している。
表３に示したように、血色素（Ｈｂ）の上昇、ＮＫ細胞活性の上昇、Ｔ細胞亜群ＣＤ３の上昇、ＣＤ４／ＣＤ８値の上昇が確認された。いずれの上昇率も著しいものであった。
さらに、白血球、血小板（ＢＰＣ）の値も一定の上昇が確認できた。また、血糖値には改善の傾向があった。
なお、この実験例３は、北京中西医結合学会南陽腫瘍医、癌研究基金会興腫瘍医院、中日友好医院中医腫瘍科に依頼したものである。
【００１８】
【表３】
【００１９】
（実験例４）
実験例４においては、慢性腎炎患者に対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で３０人に経口摂取させた。すなわち、各人に、一回７ｍｌずつ、朝、昼、晩の食事の前に経口摂取させた。実験期間は２ヶ月とした。この結果を表４および表５に示した。
【００２０】
【表４】
【００２１】
【表５】
【００２２】
上記表４に示したように、腫れ、高血圧、腰痛、脱力感の各症状について改善が見られた。また、上記表５は尿蛋白量を参照値±標準差で表示している。この表５のように、明らかに尿蛋白量が低減された。
なお、上記実験例４は、北京中日友好医院、河北省玉田具医院、北京慧忠医院、北京中医薬開発協会問診部に依頼したものである。
【００２３】
（実験例５）
実験例５においては、アロキサン誘発糖尿病ラットに対して、実験例１と同様の乳酸菌生産物質を次の条件の下で経口投与した。まず、ラット１５匹にストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を１ｍＬ／ｋｇとなるようにクエン酸緩衝液で溶解した後、尾静脈より投与し、ラットの血糖値が１８０ｍｇ／ｄＬとなるようにした。そして、これを５匹ずつ３つのグループに分け、これをグループ１〜３とした。
上記グループ１には蒸留水４ｍｌを、グループ２には乳酸菌生産物質２ｍｌ＋蒸留水２ｍｌを、グループ３には乳酸菌生産物質４ｍｌを経口投与した。経口投与は１日１回２８日間おこなった。そして、これらのラットの血漿中グルコース濃度を測定した。測定結果は、平均値および標準誤差で示した。
【００２４】
上記実験例５の結果、グループ１では試験期間を通して、２００ｍｇ／ｄＬ以上という高い値を維持した。これに対して、乳酸菌生産物質を投与したグループ２では投与前の２７４．４±１７．４に比べ、投与１週目には３０％以上低下し１７８．２±２７．６となり、２週目以降は、１５９．３±９．８とグループ１に対して優位な差が見られた。
また、乳酸菌生産物質を投与したグループ３では、投与１週目では１５３．８±７．６で、グループ１と比較して優位な差が見られた。２週目では１６０．１±５．５とその効果が持続された。さらに、３週目では９５．２±２．２、試験最終日には１０３．２±１１．１であった。これは、ＳＴＺ処理していない健常のラットとほぼ同じ値であった。
以上のことから、乳酸菌生産物質は明らかに高血糖を正常値に改善することが分かった。
【００２５】
また、上記試験の後、各グループの肝臓と十二指腸とをホルマリン固定して、組織切片を作成し、組織学的評価を行った。
その結果、グループ１ではランゲルハンス島β細胞の脱顆粒すなわち、顆粒の減少が見られ、細胞の空洞化などが確認された。またβ細胞数はＳＴＤ処理しないラットでは１９以上であったが、このグループ１では７．０±２．０であり、β細胞数の減少も確認された。
これに対し、乳酸菌生産物質を投与したグループ２，３では容量依存的にβ細胞数減少の抑制が認められた。このときのβ細胞数は、１０．３±２．３であった。
また、グループ２ではβ細胞の顆粒減少および細胞の空洞化が見られたが、グループ１に比べて少数であった。
【００２６】
以上の結果から、乳酸菌生産物質は血糖値を濃度依存的に優位に低下させ、正常値に改善させるが、その機序としては１つの作用機序ではなく、複数の作用機序が存在する。それは、組織学的にランゲルハンス島β細胞の変性を改善させたがこれだけでは血糖値をほぼ正常値に回復させるには不十分と思われるからである。つまり、乳酸菌生産物質の投与によって、糖代謝に何らかの作用をもたらし、結果的に血糖値を正常値に改善させたものと考えられる。
なお、上記実験例５は、株式会社 薬物安全性試験センターに依頼したものである。
【００２７】
【実施例】
この実施例では、乳酸菌として連鎖球菌属、乳酸桿菌属、ビフィズス菌属を用いた。上記連鎖球菌属としては、Ｌ．ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｌ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｅ．フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｃａｌｉｓ）、Ｓ．サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を用いた。乳酸桿菌属としては、Ｌ．カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．アシドフィラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．デルブリッキ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を用いた。ビフィズス菌属としては、Ｂ．ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．アドレセンス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）を用いた。
【００２８】
これら各乳酸菌は次のようにして継代培養したものである。すなわち、各乳酸菌を、３２℃で１２時間培養した後、３７℃で１２時間培養し、さらに４０℃で２４時間培養した。そして、これら継代培養したものを、すぐに共生培養させないときには、それら乳酸菌を５℃で冷蔵保存しておいた。
【００２９】
上記のようにして継代培養した各乳酸菌を用いて、図１に示す組み合わせの下で共生培養した。なお、この組み合わせ表に基づいて、各菌には１〜３５のナンバーを付したので、以下には、共生培養のステップをこのナンバーを用いて説明する。
【００３０】
Ｎｏ．１〜３５の各乳酸菌を用いて、８つのバルクスターターを生成したが、次に、これら第１〜第８のバルクスターターの生成ステップを説明する。
第１のバルクスターターは、Ｎｏ．１〜４の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．１のＥ．フェカリスとＮｏ．２のＬ．カゼイを用いて行った。第２次共生培養は、第１次共生培養液にＮｏ．３のＬ．アシドフィラスを添加して行った。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮＯ．４のＬ．ガセリを添加して行った。
【００３１】
第２のバルクスターターは、Ｎｏ．５〜８の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．５のＬ．カゼイとＮｏ．６のＳ．サーモフィラスを用いて行った。第２次共生培養は、第１次共生培養液にＮｏ．７のＬ．ラクティスを添加して行った。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮＯ．８のＬ．クレモリスを添加して行った。
【００３２】
第３のバルクスターターは、Ｎｏ．９〜１２の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．９のＬ．カゼイとＮｏ．１０のＥ．フェカリスを用いて行った。第２次共生培養は、第１次共生培養液にＮｏ．１１のＬ．アシドフィラスを添加して行った。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮＯ．１２のＢ．ロンガムを添加して行った。
【００３３】
第４のバルクスターターは、Ｎｏ．１３〜１６の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．１３のＬ．デルブリッキとＮｏ．１４のＬ．ブルガリクスを用いて行った。
第２次共生培養は、第１次共生培養液にＮｏ．１５のＬ．アシドフィラスを添加して行った。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮＯ．１６のＢ．ビフィダムを添加して行った。
【００３４】
第５のバルクスターターは、Ｎｏ．１７〜２１の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．１７のＢ．ロンガムとＮｏ．１８のＬ．アシドフィラスとの組み合わせと、Ｎｏ．１９Ｌ．カゼイとＮｏ．２０Ｂ．ブレーベとの組み合わせを用いて行った。
第２次共生培養は、上記２組の第１次共生培養液同士をさらに共生培養して行ったものである。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮｏ．２１のＢ．インファンティスを添加して行った。
【００３５】
第６のバルクスターターは、Ｎｏ．２２〜２６の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．２２のＢ．ロンガムとＮｏ．２３のＢ．インファンティスとの組み合わせと、Ｎｏ．２４のＢ．ビフィダムとＮｏ．２５のＬ．ファーメンタムとの組み合わせを用いて行った。
第２次共生培養は、上記２組の第１次共生培養液同士をさらに共生培養して行ったものである。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮｏ．２６のＢ．ブレーベを添加して行った。
【００３６】
第７のバルクスターターは、Ｎｏ．２７〜３１の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．２７のＢ．ロンガムとＮｏ．２８のＳ．サーモフィラスとの組み合わせと、Ｎｏ．２９のＢ．ブレーベとＮｏ．３０のＬ．プランタラムとの組み合わせを用いて行った。
第２次共生培養は、上記２組の第１次共生培養液同士をさらに共生培養して行ったものである。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮｏ．３１のＢ．ビフィダムを添加して行った。
【００３７】
第８のバルクスターターは、Ｎｏ．３２〜３５の乳酸菌を用いて、これらを第１次〜第３次共生培養して得たものである。上記第１次共生培養は、Ｎｏ．３２のＥ．フェカリスとＮｏ．３３のＢ．ビフィダムを用いて行った。
第２次共生培養は、第１次共生培養液にＮｏ．３４のＢ．ブレーベを添加して行った。第３次共生培養は、第２次共生培養液にＮＯ．３５のＢ．アドレセンスを添加して行った。
以上第１〜第８のバルクスターターをさらに最終共生培養して最終共生培養液を生成した。
【００３８】
なお、上記第１〜第３次共生培養および最終培養において、培地と培養条件は次の通りである。
第１次共生培養は、半流動培地を用い、３７℃でｐＨ４．６になるまで約６〜１２時間行った。第２次共生培養は、半流動培地を用い、３７℃でｐＨ４．６になるまで約４〜１０時間行った。第３次共生培養では、培地として豆乳と脱脂乳とを１：１の割合で混合し、これにブドウ糖０．５％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）を添加したものを用いた。そして、３７℃でｐＨ４．５５になるまで約６〜１０時間培養を行った。
【００３９】
最終培養には、豆乳と脱脂乳とを５：１の割合で混合し、これに酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）、ブドウ糖０．５％（ｗ／ｖ）を添加し培地を用いた。そして、最初に３２℃で２４時間培養し、次に４０℃で４８時間培養し、さらに３７℃で２４時間培養し、最後に５３℃で１８時間培養し、これを最終培養とした。
【００４０】
上記最終培養液は、高圧蒸気滅菌法を用いて６５℃で４０分間加熱し、最終培養液中の乳酸菌を殺菌する。そして、この殺菌した最終培養液を１５℃まで冷却する。最終培養液を１５℃に冷却することによって、脂肪分等の不要物を凝固させることができる。このように脂肪分を凝固させると、後で説明するろ過によってこれを除去できる。上記脂肪分を除去すれば、上記ろ過したときのろ液が懸濁するのを防止することができる。また、脂肪分が酸化することによって、ろ液の中に酸化物が増加するのを防止することもできる。
【００４１】
さらに、上記冷却した培養液に１２％無水エタノールを添加して、高速ホモジナイザーでミキシングする。このように無水エタノールを添加することによって、上記乳酸菌の菌体内の成分を抽出することができる。
【００４２】
上記ミキシングした最終培養液は、ステンレス製のろ過器（濾紙３ミクロン）に注入して自然ろ過した後、０．１ミクロンの中空糸膜でろ過する。このとき、上記したように脂肪分が取り除かれる。また、上記のろ過でろ液の中から死菌も除去される。
このように最終培養液から、脂肪分や死菌を除去したものが乳酸菌生産物質となる。
【００４３】
上記のようにして得られた乳酸菌生産物質の中には、大量の代謝産物が含まれている。この乳酸菌生産物質に含まれる代謝産物を示したのが表６である。
【００４４】
【表６】
【００４５】
上記表に示したように、乳酸菌生産物質に含まれる代謝産物は、微生物の栄養因子であることが分かる。したがって、上記乳酸菌生産物質を摂取することによって、上記栄養因子を腸内に供給することができる。腸内微生物は、上記栄養因子によって活性化し、腸内環境を良好に維持することができるものと推測される。このように腸内環境が良好に維持されれば、腸からの栄養吸収や***物の***がスムーズに行われ、その結果、自然治癒力が向上するものと考えられる。
また、複数種の乳酸菌を共生培養することによって、上記分析結果には表れない、各菌に特有の代謝産物も多く含まれていると思われる。これら代謝産物の豊富な種類も上記腸内細菌の活性化に寄与していると考えられる。
【００４６】
また、上記のように乳酸菌生産物質の中には、大量の生産代謝物が含まれるので、これを摂取するときには、少量を摂取すれば十分であり、従来のように、大量の生菌を摂取する必要がない。
さらに、乳酸菌を加熱殺菌しているので、この乳酸菌が変質するのを防止することができる。乳酸菌の変質を防止することによって、乳酸菌生産物質の品質を一定に保つことができる。
【００４７】
【発明の効果】
この発明によれば、複数の乳酸菌を培養して乳酸菌生産物質を得ることができるので、この乳酸菌生産物質には多くの種類の生産代謝物を大量に含有させることができる。この乳酸菌生産物質を摂取した場合には、上記生産代謝物によって、腸内良性菌が活性化し、腸内環境を良好にすることができる。つまり、乳酸菌の生菌を直接摂取することなく、乳酸菌の効果を得ることができる。
また、上記乳酸菌生産物質には大量の生産代謝産物が含まれているので、これを摂取するときにも、たくさん摂取する必要がない。
【図面の簡単な説明】
【図１】乳酸菌の共生培養の組み合わせを示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a lactic acid bacteria production material obtained by culturing a plurality of lactic acid bacteria and a method for producing the lactic acid bacteria production material.
[0002]
[Prior art]
Lactic acid bacteria are known to greatly influence the growth of intestinal microorganisms in the intestine and keep the intestinal environment favorable. The lactic acid bacteria live in the human intestine as so-called good bacteria and maintain the intestinal environment. Therefore, when the number of lactic acid bacteria decreases or the activity decreases, the intestinal environment is destroyed.
Therefore, in recent years, yogurt, beverages and the like containing the live bacteria have been sold in order to supply live bacteria of lactic acid bacteria to the intestines. These yogurts and beverages are taken directly into the body to increase the amount of lactic acid bacteria in the intestines.
Since the applicant of the present application has developed the present invention based on a known technique without conducting a prior art search, there is no prior art document information related to the present case.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
However, even if you ingest food products such as yogurt or beverages that contain the above live bacteria, by the time the live bacteria reach the intestines, they are decomposed or digested by stomach acid, and most of the live bacteria are killed. End up. In other words, even if live bacteria are ingested from yogurt or beverages, only a small amount of lactic acid bacteria reaches the intestines alive.
Therefore, the expected intestinal action by lactic acid bacteria is often not obtained.
[0004]
In addition, considering the killing of viable bacteria as described above, a large amount of food containing the lactic acid bacteria must be ingested, and a sufficient intestinal regulation action cannot be obtained. However, since the amount of lactic acid bacteria contained in a food and beverage unit such as yogurt (a bottle of yogurt) is limited, it is considerably difficult to take a large amount of lactic acid bacteria at one time.
An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium-producing substance capable of obtaining an effect of lactic acid bacteria by ingesting a small amount and a method for producing the same.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
1st invention consists of the filtrate which filtered the culture solution which co-cultured the multiple types of lactic acid bacteria, It is characterized by the above-mentioned.
The second invention is characterized in that Streptococcus, Lactobacillus and Bifidobacterium are used as lactic acid bacteria.
[0006]
The third invention is characterized in that a plurality of types of lactic acid bacteria are mixed and co-cultivated, and the culture solution is filtered to obtain a filtrate.
According to a fourth aspect of the present invention, the mixed culture includes a primary culture in which at least two types of lactic acid bacteria are mixed, a secondary culture including at least the primary cultured primary culture, and at least the secondary culture. It is characterized by having a tertiary culture containing the secondary culture and the final culture containing at least the tertiary culture.
The fifth invention is characterized in that Streptococcus, Lactobacillus, and Bifidobacterium are used as lactic acid bacteria.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The applicant of the present application paid attention to the metabolite of lactic acid bacteria and thought that the metabolite of lactic acid bacteria was useful for adjusting the intestinal environment. That is, it is hypothesized that when the above-mentioned metabolites of lactic acid bacteria are supplied into the intestines, the components contained in these metabolites become nutrient sources for the intestinal benign bacteria and the benign bacteria are activated. He stood up and repeated various experiments.
[0008]
(Experimental example 1)
Therefore, first, a plurality of lactic acid bacteria were symbiotically cultured, and lactic acid bacteria were removed from the produced substances to obtain lactic acid bacteria-producing substances containing lactic acid bacteria metabolites.
The lactic acid bacteria-producing substance thus obtained was orally ingested by 100 people under the following conditions. That is, 7 ml was continuously ingested by each person for 8 weeks during fasting between meals in the morning, noon and night. As a result, as shown in Table 1, a certain degree of improvement was observed for subjective sensations such as numbness, constipation, abdominal distension, and headache.
[Table 1]
The improvement of the sense of consciousness was seen in this way, regardless of the survival of the bacteria, many metabolites were supplied into the intestine, which became the nutrient source for the intestinal benign bacteria and activated the benign bacteria It is thought that it was done.
[0010]
In addition, the following were used as said several lactic acid bacteria.
Streptococcus, Lactobacillus and Bifidobacterium were used as the lactic acid bacteria. In addition, as the above streptococcus, L. Lactis ( Lactococcus lactis subsp. Lactis ), L. Cremoris ( Lactococcus lactis subsp. Cremoris ), E. coli . Enterococcus fecalis , S. A thermophilus ( Streptococcus thermophilus ) was used. Examples of Lactobacillus include L. Casei ( Lactobacillus casei , Lactobacillus acidophilus ), L. Lactobacillus acidophilus , L. Fermentum ( Lactobacillus fermentum ), L. Bulgaricus ( Lactobacillus bulgaricus ), L. Gasseri ( Lactobacillus gasseri ), L. Lactobacillus delbrueckii , L. Plantarum ( Lactobacillus plantarum ) was used. Bifidobacteria include B. B. longum ( Bifidobacterium longum ), B. Bifidobacterium ( Bifidobacterium bifidum ), B. Breve (Bifidobacterium breve), B. Infantitis ( Bifidobacterium infantis ), B. Addressense ( Bifidobacterium adolescentis ) was used.
The experiment 1 was requested from the Chinese medicine department in Beijing China-Japan Friendship Hospital.
[0011]
(Experimental example 2)
In Experimental Example 2, 50 people were orally ingested the same lactic acid bacteria-producing substance as in Experimental Example 1 for people with high blood glucose levels under the following conditions. That is, each person continuously ingested 7 ml at a time of fasting between meals in the morning, noon and night for 16 weeks. As a result, a significant decrease in blood glucose level was observed. Table 2 shows the experimental results. This Table 2 shows the average value of the above 50 people. The experimental results were displayed as “reference value ± standard value”.
[0012]
[Table 2]
[0013]
As shown in Table 2 above, it can be seen that both venous blood glucose level (GLU) and glycated hemoglobin (HbAlc) were clearly reduced by ingesting the lactic acid bacteria-producing substance. Therefore, it can be said that the lactic acid bacteria-producing substance has a remarkable effect on venous blood glucose level (GLU) and glycated hemoglobin (HbAlc).
In addition, even after one month from stopping the intake of the lactic acid bacteria production substance, this did not rise again.
[0014]
The lactic acid bacterium-producing substance as described above is considered to maintain a good intestinal environment and to improve the absorption efficiency of nutrients in the intestine and maintain homeostasis by maintaining the intestinal environment.
In addition, the above experimental example 2 was requested from the Chinese medicine department in Beijing China-Japan Friendship Hospital.
[0015]
(Experimental example 3)
In Experimental Example 3, 50 patients were orally ingested the same lactic acid bacteria-producing substance as in Experimental Example 1 to digestive tumor patients under the following conditions. That is, each person ingested 7 ml once a day. The intake period was one course of 40 days. As a result, there were 23 subjective symptoms of increased appetite, accounting for 46% of the total. There were 24 subjective symptoms that mental fatigue improved, accounting for 48% of the total.
[0016]
Furthermore, 24 cases improved the feeling of collapse of the legs and waist, accounting for 48% of the total. Weight gain was 22 cases, accounting for 44% of the total. In addition, 26 cases accounted for 52%, in which survival quality (QOL) was observed to be improved. There were 17 cases of dry mouth improvement, accounting for 34%.
These results are considered to indicate that the lactic acid bacteria-producing substance is beneficial to the liver and spleen.
[0017]
Table 3 shows the blood test results.
As shown in Table 3, an increase in hemoglobin (Hb), an increase in NK cell activity, an increase in T cell subgroup CD3, and an increase in CD4 / CD8 values were confirmed. Both rates of increase were significant.
Furthermore, it was confirmed that the values of white blood cells and platelets (BPC) were constantly increased. Moreover, there was a tendency for improvement in blood glucose level.
This Experimental Example 3 was requested to Nanjing Oncologist, Beijing Zhongxi Medical Association, Cancer Research Foundation Xingang Clinic, and Chunichi Oncology Clinic.
[0018]
[Table 3]
[0019]
(Experimental example 4)
In Experimental Example 4, 30 patients with chronic nephritis were orally ingested the same lactic acid bacteria-producing substance as in Experimental Example 1 under the following conditions. That is, each person ingested 7 ml once orally before meals in the morning, noon and evening. The experimental period was 2 months. The results are shown in Tables 4 and 5.
[0020]
[Table 4]
[0021]
[Table 5]
[0022]
As shown in Table 4 above, improvement was observed for each of the symptoms of swelling, high blood pressure, low back pain, and weakness. Table 5 shows the amount of urine protein as a reference value ± standard difference. As shown in Table 5, the amount of urine protein was clearly reduced.
Note that Experimental Example 4 was requested from the Beijing-China-Japan Friendship Clinic, Hebei Province Tamadaggu Clinic, Beijing Zhongcheng Clinic, and the Beijing China Pharmaceutical Development Association Interview Department.
[0023]
(Experimental example 5)
In Experimental Example 5, the same lactic acid bacteria-producing substance as in Experimental Example 1 was orally administered to alloxan-induced diabetic rats under the following conditions. First, streptozotocin (STZ) was dissolved in 15 rats with a citrate buffer solution at 1 mL / kg and then administered through the tail vein so that the blood glucose level of the rats was 180 mg / dL. And this was divided into three groups of 5 animals each, and this was made into groups 1-3.
Group 1 was orally administered with 4 ml of distilled water, Group 2 with 2 ml of lactic acid bacteria producing substance + 2 ml of distilled water, and Group 3 with 4 ml of lactic acid bacteria producing substance. Oral administration was performed once a day for 28 days. Then, the plasma glucose concentration of these rats was measured. The measurement results are shown as average values and standard errors.
[0024]
As a result of Experimental Example 5, in Group 1, a high value of 200 mg / dL or more was maintained throughout the test period. On the other hand, in group 2 to which the lactic acid bacteria-producing substance was administered, compared to 274.4 ± 17.4 before administration, it decreased by 30% or more to 178.2 ± 27.6 in the first week of administration to 178.2 ± 27.6. From then on, a significant difference was seen over Group 1 at 159.3 ± 9.8.
In group 3 to which the lactic acid bacterium-producing substance was administered, 153.8 ± 7.6 at the first week of administration, showing a significant difference compared to group 1. In the second week, the effect was maintained at 160.1 ± 5.5. Furthermore, it was 95.2 ± 2.2 at the third week and 103.2 ± 11.1 at the last day of the test. This was almost the same value as that of healthy rats not treated with STZ.
From the above, it was found that the lactic acid bacteria-producing substance clearly improves hyperglycemia to normal values.
[0025]
Moreover, after the said test, the liver and duodenum of each group were formalin fixed, the tissue section was created, and histological evaluation was performed.
As a result, in Group 1, the degranulation of the islets of Langerhans β cells, that is, the decrease of the granules was observed, and the cavitation of the cells was confirmed. The number of β cells was 19 or more in rats not treated with STD, but in this group 1, it was 7.0 ± 2.0, and a decrease in the number of β cells was also confirmed.
On the other hand, in the groups 2 and 3 to which the lactic acid bacteria-producing substance was administered, suppression of the decrease in the number of β cells was recognized in a dose-dependent manner. The number of β cells at this time was 10.3 ± 2.3.
In group 2, β-cell granule reduction and cell cavitation were observed, but the number was smaller than in group 1.
[0026]
From the above results, the lactic acid bacteria-producing substance lowers the blood glucose level predominantly in a concentration-dependent manner and improves it to a normal value, but the mechanism is not a single action mechanism but a plurality of action mechanisms. This is because histologically it improved the degeneration of Langerhans islet β cells, but this alone is considered insufficient to restore blood glucose levels to almost normal levels. That is, it is considered that administration of a lactic acid bacterium-producing substance has some effect on glucose metabolism, and as a result, the blood glucose level is improved to a normal level.
Note that Experimental Example 5 was requested from the Drug Safety Testing Center Co., Ltd.
[0027]
【Example】
In this example, Streptococcus, Lactobacillus, and Bifidobacterium were used as lactic acid bacteria. Examples of the genus Streptococcus include L. Lactis ( Lactococcus lactis subsp. Lactis ), L. Cremoris ( Lactococcus lactis subsp. Cremoris ), E. coli . Enterococcus fecalis , S. A thermophilus ( Streptococcus thermophilus ) was used. Examples of Lactobacillus include L. Casei ( Lactobacillus casei , Lactobacillus acidophilus ), L. Lactobacillus acidophilus , L. Fermentum ( Lactobacillus fermentum ), L. Bulgaricus ( Lactobacillus bulgaricus ), L. Gasseri ( Lactobacillus gasseri ), L. Lactobacillus delbrueckii , L. Plantarum ( Lactobacillus plantarum ) was used. Bifidobacteria include B. B. longum ( Bifidobacterium longum ), B. Bifidobacterium ( Bifidobacterium bifidum ), B. Breve (Bifidobacterium breve), B. Infantitis ( Bifidobacterium infantis ), B. Addressense ( Bifidobacterium adolescentis ) was used.
[0028]
Each of these lactic acid bacteria is subcultured as follows. That is, each lactic acid bacterium was cultured at 32 ° C. for 12 hours, then cultured at 37 ° C. for 12 hours, and further cultured at 40 ° C. for 24 hours. When these subcultured cultures are not immediately symbiotically cultured, the lactic acid bacteria are stored in a refrigerator at 5 ° C.
[0029]
Using each lactic acid bacterium subcultured as described above, symbiotic culture was performed under the combination shown in FIG. In addition, based on this combination table | surface, since the numbers 1-35 were attached | subjected to each microbe, the step of a symbiotic culture is demonstrated using this number below.
[0030]
No. Eight bulk starters were generated using each of 1 to 35 lactic acid bacteria. Next, the steps of generating these first to eighth bulk starters will be described.
The first bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 1-4 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. E.1. Fecaris and No. 2 L. This was done using casei. In the second symbiotic culture, No. 3 L. Performed with the addition of acidophilus. In the third symbiotic culture, NO. 4 L. This was done by adding gasseri.
[0031]
The second bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 5 to 8 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 5 L. Casei and No. 6 S.M. This was performed using a thermophilus. In the second symbiotic culture, No. 7 L. Performed with the addition of lactis. In the third symbiotic culture, NO. 8 L. This was done by adding cremolith.
[0032]
The third bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 9 to 12 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 9 L. Casei and No. E.10. Performed with Fecalis. In the second symbiotic culture, No. 11 L. Performed with the addition of acidophilus. In the third symbiotic culture, NO. 12 B.I. Long gum was added.
[0033]
The fourth bulk starter is No. These were obtained by first to third co-cultivation using 13 to 16 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 13 L. Delblick and No. 14 L. This was done using Bulgarix.
In the second symbiotic culture, No. 15 L. Performed with the addition of acidophilus. In the third symbiotic culture, NO. 16B. Bifidum was added.
[0034]
The fifth bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 17-21 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 17B. Longham and No. 18 L. In combination with Acidophilus; 19L. Casei and No. 20B. A combination with a breve was used.
The second symbiotic culture is performed by further co-culturing the two sets of the first symbiotic cultures. In the third symbiotic culture, No. 2 was added to the second symbiotic culture solution. B. 21. Infantis was added.
[0035]
The sixth bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 22-26 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 22B. Longham and No. B. 23. In combination with Infantis, B. 24. Bifidam and No. 25 L. This was done using a combination with fermentum.
The second symbiotic culture is performed by further co-culturing the two sets of the first symbiotic cultures. In the third symbiotic culture, No. 2 was added to the second symbiotic culture solution. 26 B.E. This was done by adding breve.
[0036]
The seventh bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 27 to 31 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 27. Longham and No. 28 S.C. In combination with thermophilus, No. 29. Breve and No. 30 L. It was performed using a combination with plantarum.
The second symbiotic culture is performed by further co-culturing the two sets of the first symbiotic cultures. In the third symbiotic culture, No. 2 was added to the second symbiotic culture solution. 31 B.I. Bifidum was added.
[0037]
The eighth bulk starter is No. These were obtained by primary to tertiary co-cultivation using 32-35 lactic acid bacteria. The first symbiotic culture is No. 1. 32 E.C. Fecaris and No. 33 B.I. I went with a bifidum.
In the second symbiotic culture, No. 34 B.I. This was done by adding breve. In the third symbiotic culture, NO. 35 B.I. Performed with the addition of addressence.
As described above, the first to eighth bulk starters were further subjected to final symbiotic culture to produce a final symbiotic culture solution.
[0038]
In the first to third symbiotic cultures and the final culture, the medium and the culture conditions are as follows.
The first symbiotic culture was performed for about 6 to 12 hours using a semi-fluid medium until the pH reached 4.6 at 37 ° C. The second symbiotic culture was performed using a semi-fluid medium for about 4 to 10 hours at 37 ° C. until the pH reached 4.6. In the third symbiotic culture, soy milk and skim milk are mixed at a ratio of 1: 1 as a medium, and glucose 0.5% (w / v) and yeast extract 0.5% (w / v) are added thereto. What was done was used. And it culture | cultivated for about 6 to 10 hours until it became pH 4.55 at 37 degreeC.
[0039]
For the final culture, soy milk and skim milk are mixed in a ratio of 5: 1, yeast extract 0.2% (w / v) and glucose 0.5% (w / v) are added to this, and the medium is used. It was. The cells were first cultured at 32 ° C. for 24 hours, then cultured at 40 ° C. for 48 hours, further cultured at 37 ° C. for 24 hours, and finally cultured at 53 ° C. for 18 hours.
[0040]
The final culture solution is heated at 65 ° C. for 40 minutes using a high-pressure steam sterilization method to sterilize lactic acid bacteria in the final culture solution. The sterilized final culture is then cooled to 15 ° C. By cooling the final culture solution to 15 ° C., unnecessary substances such as fat can be coagulated. When the fat is coagulated in this way, it can be removed by filtration described later. If the fat is removed, the filtrate when filtered can be prevented from being suspended. Moreover, it can also prevent that an oxide increases in a filtrate, when fat content oxidizes.
[0041]
Further, 12% absolute ethanol is added to the cooled culture medium and mixed with a high-speed homogenizer. By adding absolute ethanol in this way, the components in the lactic acid bacteria can be extracted.
[0042]
The mixed final culture solution is poured into a stainless steel filter (filter paper 3 microns) and naturally filtered, and then filtered through a 0.1 micron hollow fiber membrane. At this time, the fat is removed as described above. Moreover, dead bacteria are also removed from the filtrate by the above filtration.
Thus, what removed fat and dead bacteria from the final culture solution becomes a lactic acid bacteria production substance.
[0043]
A large amount of metabolites is contained in the lactic acid bacteria-producing substance obtained as described above. Table 6 shows the metabolites contained in the lactic acid bacteria-producing substance.
[0044]
[Table 6]
[0045]
As shown in the above table, it can be seen that the metabolite contained in the lactic acid bacteria-producing substance is a microbial nutrient factor. Therefore, the nutrition factor can be supplied into the intestine by ingesting the lactic acid bacteria-producing substance. Intestinal microorganisms are presumed to be activated by the above-mentioned nutritional factors and maintain the intestinal environment well. If the intestinal environment is maintained well in this way, nutrient absorption from the intestine and excretion of excreta are performed smoothly, and as a result, natural healing power is considered to be improved.
In addition, by co-culturing a plurality of types of lactic acid bacteria, it seems that many metabolites peculiar to each bacteria that are not shown in the above analysis result are included. Abundant types of these metabolites are thought to contribute to the activation of the intestinal bacteria.
[0046]
In addition, as described above, since a large amount of production metabolites are contained in the lactic acid bacteria-producing substance, it is sufficient to consume a small amount when ingesting this, and a large amount of live bacteria is ingested as before. There is no need to do.
Furthermore, since the lactic acid bacteria are sterilized by heating, the lactic acid bacteria can be prevented from being altered. By preventing the deterioration of lactic acid bacteria, the quality of the lactic acid bacteria production substance can be kept constant.
[0047]
【The invention's effect】
According to this invention, since a lactic acid bacteria production substance can be obtained by culturing a plurality of lactic acid bacteria, the lactic acid bacteria production substance can contain many kinds of production metabolites in large quantities. When this lactic acid bacterium-producing substance is ingested, the intestinal benign bacteria are activated and the intestinal environment can be improved by the production metabolite. That is, the effect of lactic acid bacteria can be obtained without directly ingesting live lactic acid bacteria.
In addition, since the lactic acid bacterium-producing substance contains a large amount of produced metabolites, it is not necessary to consume a large amount when taking it.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a combination of symbiotic cultures of lactic acid bacteria.
