JP2004121253A - Humanized antibody against human tissue factor (tf) and process for production of the same - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a humanized antibody against human tissue factor (TF) and to provide a process for production of the same. <P>SOLUTION: In a method for producing the natural humanized antibody with reduced immunogenicity having a complementary determining region (CDR) originated from nonhuman and a frame work region (FR) originated from natural human antibody, prepares multiple human antibodies having high homology to amino acid sequence of FR of nonhuman monoclonal antibody reactive to antigen, prepares a first humanized antibody by transducing with FR corresponding to nonhuman monoclonal antibody, produces a second humanized antibody by transducing 1 to 3 of the FR in the humanized antibody with FR corresponding to human antibody different from that used before, and compares both antibodies on coupling properties with antigen, or capacity neutralizing the biological activity of the antigen, and selects the humanized antibody manifesting a preferable activity. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

　本発明は、ヒト組織因子（TF）に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（V領域）とヒト抗体の定常領域（C領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（L鎖）V領域及び重鎖（H鎖）V領域の相捕性決定領域（CDR）がヒト抗体に移植されているヒト型化（humanized）抗体、該抗体のL鎖及びH鎖、並びに該抗体のL鎖又はH鎖を構成するV領域の断片に関する。本発明はさらに、ヒトTFに対するヒト型化抗体の作製方法に関する。 The present invention relates to a human / mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody to human tissue factor (TF) and a constant region (C region) of a human antibody, and a light chain of a mouse monoclonal antibody to human TF ( A humanized antibody in which the L region) V region and the heavy chain (H chain) V region catchability determining region (CDR) are transplanted into a human antibody; the L chain and H chain of the antibody; The present invention relates to a fragment of a V region constituting an L chain or an H chain of an antibody. The present invention further relates to a method for producing a humanized antibody against human TF.

　本発明はさらに、上記の抗体、特にそのV領域の断片をコードするDNA、及びV領域を含むL鎖又はH鎖をコードするDNAに関する。本発明はさらに、該DNAを含む組換えベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主に関する。
　本発明はさらに、ヒトTFに対するキメラ抗体及びヒト型化抗体の製造方法に関する。本発明はさらに、ヒトTFに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び播種性血管内凝固症候群（DIC）治療薬に関する。 The present invention further relates to the above-mentioned antibodies, particularly DNAs encoding V region fragments, and DNAs encoding L or H chains containing the V region. The present invention further relates to a recombinant vector containing the DNA, and a host transformed with the vector.
The present invention further relates to a method for producing a chimeric antibody against human TF and a humanized antibody. The present invention further relates to a pharmaceutical composition comprising a humanized antibody against human TF as an active ingredient, and a therapeutic agent for disseminated intravascular coagulation (DIC).

　組織因子（TF）は、細胞表面に発現される凝固第VII因子受容体であり、凝固第VII因子との複合体形成を通じて、凝固第IX因子およびX因子の活性化に不可欠な役割を担っており、血液凝固反応の実質的な開始因子と位置づけられている。
　TFは血管を構成する線維芽細胞や平滑筋細胞などに発現されており、血管損傷の際に凝固系を活性化して止血機能を果たすことが知られている。 Tissue factor (TF) is a coagulation factor VII receptor expressed on the cell surface, and plays an essential role in the activation of coagulation factors IX and X through the formation of a complex with coagulation factor VII. And is positioned as a substantial initiator of the blood coagulation reaction.
TF is expressed in fibroblasts, smooth muscle cells, and the like constituting blood vessels, and is known to activate the coagulation system and perform a hemostatic function when the blood vessels are damaged.

　DICは、血管内での凝固系の活性化によって全身の主として細小血管内に血栓が多発する疾患である。血小板や凝固因子が消費されて低下することにより、血栓とは逆の現象である出血を生じることも少なくない。また多発した微小血栓により重要臓器の微小循環不全をきたし、一旦発症すると不可逆的な機能障害を残すことも多く、DICの予後が不良となるため、重要な疾患と認識されている。 DIC is a disease in which thrombosis frequently occurs mainly in small blood vessels throughout the body due to activation of the coagulation system in blood vessels. Consumption and reduction of platelets and coagulation factors often cause bleeding, a phenomenon opposite to that of thrombus. Also, multiple microthrombi cause microcirculatory insufficiency in important organs, and once they develop, they often leave irreversible dysfunction, leading to poor prognosis of DIC, which is recognized as an important disease.

　厚生省特定疾患血液凝固異常症調査研究班平成2年度および4年度の研究報告書から推定される基礎疾患の割合は、造血器悪性腫瘍が約30％、固形癌約20％、感染症約15％、産科的疾患約10％、肝疾患6％、ショック5％、心血管系疾患3％である。またDICの発症頻度は白血病が約15％、悪性リンパ種が6〜7％と高く、固形癌では3％程度である。 Ministry of Health, Labor and Welfare Hematological Coagulation Disorder Research Group The proportion of underlying diseases estimated from research reports in 1990 and 2004 is about 30% for hematopoietic malignancies, about 20% for solid tumors, and about 15% for infectious diseases , Obstetric diseases about 10%, liver diseases 6%, shock 5%, cardiovascular diseases 3%. The incidence of DIC is as high as about 15% for leukemia and 6 to 7% for malignant lymphoma, and about 3% for solid cancer.

　これら種々の疾患に合併してDICは発症するが、その原因物質は共通であり、それがTFである。すなわち、急性白血病や悪性リンパ腫、固形癌においては腫瘍細胞のTFの生成・発現の異常亢進、感染症（特にグラム陰性菌性敗血症）においては単球・血管内皮細胞におけるTF産生・発現の亢進、劇症肝炎では壊死した肝組織からのTFの血中への流入、大動脈瘤・心臓瘤・巨大血管腫では血管内面でのTF形成、また産科的疾患（羊水栓塞・常位胎盤早期剥離）や手術・外傷・火傷においてもTFの血中への流入がDICの発症機序と考えられている。 DIC DIC develops in association with these various diseases, but its causative agent is common, and it is TF. That is, in acute leukemia, malignant lymphoma, and solid cancer, abnormally enhanced production and expression of TF in tumor cells, and in infectious diseases (especially gram-negative bacterial sepsis), enhanced production and expression of TF in monocytes and vascular endothelial cells. In fulminant hepatitis, influx of TF into the blood from necrotic liver tissue, in aortic aneurysms, aneurysms, and giant hemangiomas, TF formation on the inner surface of blood vessels, obstetric diseases (amniotic plugging, premature exfoliation of the placenta), In the case of surgery, trauma, and burns, the influx of TF into the blood is thought to be the pathogenic mechanism of DIC.

　原疾患（基礎疾患）の治療が第一であるが、実際にはこれが容易ではない。
　現状のDIC治療法としては、抗凝固療法と補充療法が行われている。抗凝固療法の中心となっているのはヘパリン製剤（未分画ヘパリン、低分子ヘパリン）であり、合成蛋白分解酵素阻害剤（メシル酸ガベキサート、メシル酸ナファモスタット）や濃縮血漿製剤（アンチトロンビンIII、活性化プロテインC製剤）も用いられている。補充療法としては濃縮血小板血漿や新鮮凍結血漿（フィブリンの補給）、洗浄赤血球等がある。 Treatment of the underlying disease (the underlying disease) is first, but in practice this is not easy.
Current DIC treatment includes anticoagulant therapy and replacement therapy. At the center of anticoagulant therapy are heparin preparations (unfractionated heparin and low-molecular-weight heparin). Synthetic protease inhibitors (gabexate mesylate, nafamostat mesilate) and concentrated plasma preparations (antithrombin III) Activated Protein C formulation) has also been used. The replacement therapy includes concentrated platelet plasma, fresh frozen plasma (supplementation of fibrin), and washed red blood cells.

　しかし現状の治療薬では、有効性や副作用の面で十分に満足できるものはなく、DICからの完全離脱が出来ない場合がほとんどであることより、治療効果が高く副作用の少ない薬剤の使用が期待されている。 However, the current therapeutics are not fully satisfactory in terms of efficacy and side effects, and in most cases, complete withdrawal from DIC is not possible.Therefore, use of a drug with high therapeutic effect and few side effects is expected. Have been.

　一方、新しいDIC治療の試みとしては、トロンボモジュリン製剤やヒルジン、抗PAF剤がある。TFPI （Tissue Factor PathwayInhibitor）や、FXa選択的阻害剤が経口投与可能な抗凝固・抗血栓剤として注目を集めている。また、TFの活性を中和するものとして、WO88／07543には、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体が、WO96／40921には、ヒト型化抗ヒトTF抗体として開示されている。 On the other hand, new trials of DIC treatment include thrombomodulin preparations, hirudin, and anti-PAF agents. TFPI (Tissue Factor Pathway Inhibitor) and FXa selective inhibitors are attracting attention as orally available anticoagulant and antithrombotic agents. WO88 / 07543 discloses a mouse anti-human TF monoclonal antibody, and WO96 / 40921 discloses a humanized anti-human TF antibody as a neutralizing agent for TF activity.

　マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体は、DICに於いて主薬効に伴う出血傾向などを示さない安全で有効な治療薬となることが期待できる。しかしながら、マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免疫原性（「抗原性」という場合もある）を有し、このため、ヒトにおけるマウスモノクローナル抗体の医学療法的価値は制限されている。例えば、マウス抗体をヒトに投与すると異物として代謝されうるので、ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短く、期待された効果を充分に発揮できない。さらに、投与したマウス抗体に対して発生するヒト抗マウス抗体（HAMA）は、血清病又は他のアレルギー反応など、患者にとって不都合で危険な免疫応答を惹起する。したがって、マウスモノクローナル抗体をヒトに頻回投与することはできない。 The mouse anti-human TF monoclonal antibody is expected to be a safe and effective therapeutic agent that does not show bleeding tendency associated with the main drug effect in DIC. However, mouse monoclonal antibodies are highly immunogenic in humans (sometimes referred to as "antigenic"), which limits the therapeutic value of mouse monoclonal antibodies in humans. For example, when a mouse antibody is administered to humans, it can be metabolized as a foreign substance, so that the half-life of mouse antibodies in humans is relatively short, and the expected effects cannot be sufficiently exerted. In addition, human anti-mouse antibodies (HAMA) raised against administered mouse antibodies elicit inconvenient and dangerous immune responses to patients, such as serum sickness or other allergic reactions. Therefore, mouse monoclonal antibodies cannot be frequently administered to humans.

　これらの問題を解決するため、非ヒト由来の抗体、例えばマウス由来のモノクローナル抗体の免疫原性を低減させる方法が開発された。その一つが、抗体の可変領域（V領域）はもとのマウスモノクローナル抗体に由来し、定常領域（C領域）は適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を作製する方法である。 方法 In order to solve these problems, a method was developed to reduce the immunogenicity of non-human-derived antibodies, for example, mouse-derived monoclonal antibodies. One method is to prepare a chimeric antibody in which the variable region (V region) of the antibody is derived from the original mouse monoclonal antibody and the constant region (C region) is derived from an appropriate human antibody.

　得られるキメラ抗体はもとのマウス抗体の可変領域を完全な形で含有するので、もとのマウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが期待できる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に由来するアミノ酸配列の比率が実質的に滅少しており、それ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低いと予想されるが、それでもなおマウス可変領域に対する免疫応答が生ずる可能性がある（LoBuglio, A., F.らProc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989）。 キ メ ラ Since the obtained chimeric antibody contains the complete variable region of the original mouse antibody, it can be expected to bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody. In addition, chimeric antibodies have a substantially reduced proportion of non-human amino acid sequences, and are therefore expected to be less immunogenic than the original mouse antibody, but still have a reduced mouse variable region An immune response may be generated (LoBuglio, A., F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).

　マウス抗体の免疫原性を低減させるための第二の方法は一層複雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさらに大幅に低下させることが期待される。この方法においては、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（complementarity determining region; CDR）のみをヒト可変領域に移植して「再構成」（reshaped）ヒト可変領域を作製する。ただし、必要によっては、再構成ヒト可変領域のCDRの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、CDRを支持しているフレームワーク領域（FR）の一部のアミノ酸配列をマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植する場合がある。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体のヒト以外のアミノ酸配列に由来する部分は、CDR及び極く一部のFRのみである。CDRは超可変アミノ酸配列により構成されており、これらは種特異的配列を示さない。 第二 The second method for reducing the immunogenicity of a mouse antibody is more complex, but is expected to further reduce the potential immunogenicity of the mouse antibody. In this method, only a complementarity determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody is transplanted into a human variable region to produce a "reshaped" human variable region. However, if necessary, in order to make the CDR structure of the reshaped human variable region more similar to that of the original mouse antibody, the amino acid sequence of a part of the framework region (FR) In some cases, the variable region of an antibody is transplanted to a human variable region. Next, these humanized reshaped human variable regions are ligated to human constant regions. The portion derived from the non-human amino acid sequence of the finally reconstructed humanized antibody is only the CDRs and only a part of the FRs. CDRs are composed of hypervariable amino acid sequences, which do not show species-specific sequences.

　ヒト型化抗体については、さらに、 Riechmann, L.らNature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M.らScience, 239, 1534-1536, 1998; Kettleborough, C.A.ら Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Maeda, H., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991;Gorman, S.D.ら Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, P.R., Bio／Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M.S.ら Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Cater, P.らProc.Natl.Acad.Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co,M.S. らJ.Immunol., 148, 1149-1154, 1992; 及びSato, K., らCancer Res., 53, 851-856, 1993を参照のこと。 For humanized antibodies, see also Riechmann, L. et al. Nature, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. et al. Science, 239, 1534-1536, 1998; Kettleborough, CA et al. Protein Engng., 4, 773. -783, 1991; Maeda, H., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Gorman, SD et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185, 1991; Tempest, PR, Bio / Technology, 9, 266-271, 1991; Co, MS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Cater, P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992; Co, MS et al. J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992; and Sato, K., et al. Cancer Res., 53, 851-856, 1993.

　従来のヒト型化技術では、フレームワーク領域（FR）の一部にマウス抗体の可変領域からヒト可変領域に移植されたアミノ酸配列を含む。そのため、ヒトにおいて治療薬として投与した場合に、可変領域の一ないし数アミノ酸ではあるが、ヒトに存在しないアミノ酸配列を有する部位に対する抗体ができる危険性が存在する。この危険性を回避するために、第三のヒト型化技術を考案した。すなわち、三個のCDRの立体構造を保持するために必要な四個のFR（FR1〜4）について、一つのFRを単位として、データベース上に存在するマウス抗体のFRと相同性の高いヒト抗体のFRを置換する方法である。この際、データベース上に存在するヒト抗体から数種類のFRを選択し、順次置換（shuffle）することにより活性の高いヒト型化抗体の作製を行う。 で は In the conventional humanization technique, a part of the framework region (FR) contains an amino acid sequence grafted from the variable region of a mouse antibody to a human variable region. Therefore, when administered as a therapeutic agent in humans, there is a risk that an antibody against a site having an amino acid sequence that is one or several amino acids in the variable region but does not exist in humans may be formed. To avoid this danger, a third humanization technique was devised. That is, for the four FRs (FR1 to 4) required to maintain the three-dimensional structure of the three CDRs, a human antibody having high homology to the mouse antibody FRs existing in the database, using one FR as a unit This is a method to replace FR. At this time, a humanized antibody having high activity is prepared by selecting several types of FRs from human antibodies present in the database and sequentially substituting (shuffle).

　こうすることにより、可変領域の中でCDRを除くFRは、全てヒト抗体由来のアミノ酸配列を有するヒト型化抗体を作製することが出来る。このため、マウスCDRを担持するヒト型化抗体は、もはやヒトCDRを含有するヒト抗体より強い免疫原性を有しないはずである。 に よ り By doing so, it is possible to prepare a humanized antibody in which all the FRs except for the CDRs in the variable region have an amino acid sequence derived from a human antibody. For this reason, humanized antibodies carrying mouse CDRs should no longer have stronger immunogenicity than human antibodies containing human CDRs.

　前記のごとく、ヒト型化抗体は療法目的のために有用であると予想されるが、ヒト型化抗体の製造方法において任意の抗体に普遍的に適用し得る画一的な方法は存在せず、特定の抗原に対して十分な結合活性、中和活性を示すヒト型化抗体を作製するためには種々の工夫が必要である（例えば、Sato, K.ら、Cancer Res., 53, 851-856, 1993を参照のこと）。 As described above, humanized antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, but there is no uniform method that can be universally applied to any antibody in the method for producing humanized antibodies. In order to prepare a humanized antibody exhibiting a sufficient binding activity and a neutralizing activity for a specific antigen, various measures are required (for example, Sato, K. et al., Cancer Res., 53, 851). -856, 1993).

　本発明は、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（V領域）とヒト抗体の定常領域（C領域）とからなるヒト／マウスキメラ抗体、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体の軽鎖（L鎖）V領域及び重鎖（H鎖）V領域の相捕性決定領域がヒト抗体に移植されているヒト型化（humanized）抗体、該抗体のL鎖及びH鎖、並びに該抗体のL鎖又はH鎖を構成するV領域の断片を提供することを目的とする。本発明はさらに、ヒトTFに対するヒト型化抗体の作製方法を提供することを目的とする。 The present invention relates to a human / mouse chimeric antibody comprising a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody to human TF and a constant region (C region) of a human antibody, and a light chain (L chain) V of a mouse monoclonal antibody to human TF. Humanized antibody in which a region and a heavy chain (H chain) V region have a capture determining region grafted to a human antibody, an L chain and an H chain of the antibody, and an L chain or an H chain of the antibody It is an object of the present invention to provide a fragment of the V region constituting Another object of the present invention is to provide a method for producing a humanized antibody against human TF.

　本発明はさらに、上記の抗体、特にそのV領域の断片をコードするDNA、及びV領域の断片を含むL鎖又はH鎖をコードするDNAを提供することを目的とする。本発明はさらに、該DNAを含む組換えベクター、及ぶ該ベクターにより形質転換された宿主を提供することを目的とする。本発明はさらに、ヒトTFに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及び播種性血管内凝固症候群（DIC）治療薬を提供することを目的とする。 Another object of the present invention is to provide a DNA encoding the above-described antibody, particularly a fragment of the V region thereof, and a DNA encoding an L chain or H chain containing the fragment of the V region. It is a further object of the present invention to provide a recombinant vector comprising said DNA, and a host transformed with said vector. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a humanized antibody against human TF as an active ingredient and a remedy for disseminated intravascular coagulation (DIC).

　本発明者らは、上記課題に基づいて鋭意研究を行った結果、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のヒトにおける免疫原性が低減されている抗体を得ることに成功し、また、新しいヒト型化抗体の作製方法を開発し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ヒト抗体のH鎖C領域、及びヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域の断片を含むキメラH鎖に関する。H鎖V領域としては、配列番号9で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、C領域としてはCγ4領域のものが挙げられる。 The present inventors have conducted intensive studies based on the above problems, and as a result, succeeded in obtaining an antibody in which the immunogenicity of a mouse monoclonal antibody against human TF in humans has been reduced, and a new humanized antibody The present invention was completed by developing a method for producing the same.
That is, the present invention relates to a chimeric H chain comprising a fragment of the H chain C region of a human antibody and the H chain V region of a mouse monoclonal antibody against human TF. Examples of the H chain V region include those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, and examples of the C region include those of the Cγ4 region.

　さらに、本発明は、ヒト抗体のL鎖C領域、及びヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のL鎖V領域の断片を含むキメラL鎖に関する。L鎖V領域としては、配列番号15で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられ、L鎖C領域としてはCκ領域のものが挙げられる。
　さらに、本発明は、前記キメラH鎖及びキメラL鎖を含む、ヒトTFに対するヒトマウスキメラモノクローナル抗体に関する。 Furthermore, the present invention relates to a chimeric L chain comprising a fragment of the L chain C region of a human antibody and the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human TF. Examples of the L chain V region include those containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15, and examples of the L chain C region include those of the Cκ region.
Further, the present invention relates to a human mouse chimeric monoclonal antibody against human TF, comprising the chimeric H chain and chimeric L chain.

　さらに、本発明は、ヒト抗体のH鎖V領域のフレームワーク領域（FR）1〜4、及びヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域の相補性決定領域（CDR）1〜3を含む、ヒト型化抗体のH鎖V領域の断片に関する。CDR1〜3としては、それぞれ配列番号133〜135で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ヒト抗体のH鎖V領域のFR1としては、マウス抗体のH鎖V領域FR1との相同性が40％以上のヒト抗体FR1が挙げられ、FR2としては、マウス抗体のH鎖V領域FR2との相同性が40％以上のヒト抗体FR2が挙げられ、FR3としては、マウス抗体のH鎖V領域FR3との相同性が40％以上のヒト抗体FR3が挙げられ、FR4としては、マウス抗体のH鎖V領域FR4との相同性が40％以上のヒト抗体FR4が挙げられる。 Further, the present invention comprises a framework region (FR) 1-4 of the H chain V region of the human antibody and a complementarity determining region (CDR) 1-3 of the H chain V region of the mouse monoclonal antibody to human TF. The present invention relates to a fragment of the H chain V region of a humanized antibody. CDRs 1 to 3 include those containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 133 to 135, respectively. As the FR1 of the H chain V region of a human antibody, a human antibody FR1 having a homology of 40% or more with the H chain V region FR1 of a mouse antibody can be mentioned. As the FR2, the FR1 of the H chain V region FR2 of a mouse antibody can be used. A human antibody FR2 having a homology of 40% or more is listed, and FR3 is a human antibody FR3 having a homology of 40% or more with the H chain V region FR3 of a mouse antibody. FR4 is a mouse antibody H2 A human antibody FR4 having a homology of 40% or more with the chain V region FR4 is exemplified.

　好ましくは、ヒト抗体のH鎖V領域のFR1としては、マウス抗体のH鎖V領域FR1との相同性が50％以上のヒト抗体FR1が挙げられ、FR2としては、マウス抗体のH鎖V領域FR2との相同性が70％以上のヒト抗体FR2が挙げられ、FR3としては、マウス抗体のH鎖V領域FR3との相同性が65％以上のヒト抗体FR3が挙げられ、FR4としては、マウス抗体のH鎖V領域FR4との相同性が80％以上のヒト抗体FR4が挙げられる。具体的な例としては、ヒト抗体のH鎖V領域のFR1としては、ヒト抗体L39130が挙げられ、FR2としては、ヒト抗体L39130、ヒト抗体P01742およびヒト抗体のZ80844が挙げられ、FR3としては、ヒト抗体L39130、ヒト抗体Z34963、ヒト抗体P01825、ヒト抗体M62723、ヒト抗体Z80844、ヒト抗体L04345、ヒト抗体S78322、ヒト抗体Z26827、ヒト抗体U95239およびヒト抗体L03147が挙げられ、FR4としては、ヒト抗体L39130が挙げられる。 Preferably, the FR1 of the H chain V region of a human antibody includes a human antibody FR1 having 50% or more homology with the H chain V region FR1 of a mouse antibody, and the FR2 is the H chain V region of a mouse antibody. FR2 includes a human antibody FR2 having a homology of 70% or more, FR3 includes a human antibody FR3 having a homology of 65% or more with the H chain V region FR3 of a mouse antibody, and FR4 includes a mouse antibody FR4. A human antibody FR4 having 80% or more homology with the H chain V region FR4 of the antibody is exemplified. As a specific example, FR1 of the H chain V region of a human antibody includes human antibody L39130, and FR2 includes human antibody L39130, human antibody P01742 and human antibody Z80844, and FR3 includes Human antibody L39130, human antibody Z34963, human antibody P01825, human antibody M62723, human antibody Z80844, human antibody L04345, human antibody S78322, human antibody Z26827, human antibody U95239 and human antibody L03147, and FR4 include human antibody L39130 Is mentioned.

　好ましい例としては、ヒト抗体のH鎖V領域のFR1としては、ヒト抗体L39130が挙げられ、FR2としては、ヒト抗体L39130、およびヒト抗体のZ80844が挙げられ、FR3としては、ヒト抗体Z34963、ヒト抗体M62723およびヒト抗体U95239が挙げられ、FR4としてヒト抗体L39130が挙げられる。さらに好ましい例としては、ヒト抗体のH鎖V領域のFR1としては、ヒト抗体L39130が挙げられ、FR2としては、ヒト抗体L39130が挙げられ、FR3としては、ヒト抗体Z34963およびヒト抗体U95239が挙げられ、FR4としてヒト抗体L39130が挙げられる。 Preferred examples of human antibody H39 V region FR1 include human antibody L39130, FR2 includes human antibody L39130 and human antibody Z80844, and FR3 include human antibody Z34963 and human Antibody M62723 and human antibody U95239 are mentioned, and FR4 is human antibody L39130. More preferred examples include human antibody L39130 as FR1 of the H chain V region of human antibody, human antibody L39130 as FR2, and human antibody Z34963 and human antibody U95239 as FR3. And FR4 include human antibody L39130.

　さらに、本発明は、フレームワーク領域中の番号としてKabatの規定（Kabat, E.A.ら、US Dept. Health and Human Services,US Government Printing Offices, 1991）による。
　さらに、本発明は、配列番号30、40、42、50、52、58、60、64、70、72、76、78、82、84で表されるいずれかのアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のH鎖V領域の断片に関する。 Furthermore, the present invention is based on the Kabat rules (Kabat, EA et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) as numbers in the framework regions.
Further, the present invention relates to a humanized form comprising any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30, 40, 42, 50, 52, 58, 60, 64, 70, 72, 76, 78, 82, 84. It relates to a fragment of the H chain V region of an antibody.

　さらに、本発明は、ヒト抗体のL鎖V領域のFR1〜4、及びヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のL鎖V領域のCDR1〜3を含む、ヒト型化抗体のL鎖V領域の断片に関する。CDR1〜3としては、それぞれ配列番号136〜138で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。ヒト抗体のL鎖V領域のFR1としては、マウス抗体のL鎖V領域FR1との相同性が40％以上のヒト抗体FR1が挙げられ、FR2としては、マウス抗体のL鎖V領域FR2との相同性が40％以上のヒト抗体FR2が挙げられ、FR3としては、マウス抗体のL鎖V領域FR3との相同性が40％以上のヒト抗体FR3が挙げられ、FR4としては、マウス抗体のL鎖V領域FR4との相同性が40％以上のヒト抗体FR4が挙げられる。 Furthermore, the present invention relates to a fragment of the L chain V region of a humanized antibody, comprising FR1 to FR4 of the L chain V region of a human antibody and CDR1 to CDR3 of the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human TF. CDRs 1 to 3 include those containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 136 to 138, respectively. As the FR1 of the L region V region of the human antibody, a human antibody FR1 having a homology of 40% or more with the L region V region FR1 of the mouse antibody is exemplified. As the FR2, the FR1 of the L region V region FR2 of the mouse antibody is used. A human antibody FR2 having a homology of 40% or more can be mentioned. As FR3, a human antibody FR3 having a homology of 40% or more with the L chain V region FR3 of a mouse antibody can be mentioned. As FR4, a mouse antibody L2 can be used. A human antibody FR4 having a homology of 40% or more with the chain V region FR4 is exemplified.

　好ましくは、ヒト抗体のL鎖V領域のFR1としては、マウス抗体のL鎖V領域FR1との相同性が75％以上のヒト抗体FR1が挙げられ、FR2としては、マウス抗体のL鎖V領域FR2との相同性が80％以上のヒト抗体FR2が挙げられ、FR3としては、マウス抗体のL鎖V領域FR3との相同性が70％以上のヒト抗体FR3が挙げられ、FR4としては、マウス抗体のL鎖V領域FR4との相同性が80％以上のヒト抗体FR4が挙げられる。具体的な例としては、ヒト抗体のL鎖V領域のFR1としては、ヒト抗体Z37332が挙げられ、FR2としては、ヒト抗体Z37332およびヒト抗体X93625が挙げられ、FR3としては、ヒト抗体Z37332、ヒト抗体S68699およびP01607が挙げられ、FR4としてヒト抗体Z37332が挙げられる。さらに好ましい例としては、ヒト抗体のL鎖V領域のFR1としては、ヒト抗体Z37332が挙げられ、FR2としては、ヒト抗体X93625が挙げられ、FR3としては、ヒト抗体S68699が挙げられ、FR4としてヒト抗体Z37332が挙げられる。 Preferably, the FR1 of the L chain V region of the human antibody includes a human antibody FR1 having a homology of 75% or more with the L chain V region FR1 of a mouse antibody. The FR2 is the L chain V region of a mouse antibody. FR2 includes a human antibody FR2 having a homology of 80% or more, FR3 includes a human antibody FR3 having a homology of 70% or more with the L chain V region FR3 of a mouse antibody, and FR4 includes a mouse antibody FR4. A human antibody FR4 having 80% or more homology with the antibody L chain V region FR4 is exemplified. As a specific example, FR1 of the L region V region of a human antibody includes a human antibody Z37332, FR2 includes a human antibody Z37332 and a human antibody X93625, and FR3 includes a human antibody Z37332 and a human antibody Antibodies S68699 and P01607 are included, and FR4 includes human antibody Z37332. More preferred examples include human antibody Z37332 as FR1 of the L chain V region of a human antibody, human antibody X93625 as FR2, human antibody S68699 as FR3, and human human FR4 as FR4. Antibody Z37332 is mentioned.

　さらに、本発明は、フレームワーク領域中の番号としてKabatの規定（Kabat, E.A.ら、US Dept. Health and Human Services,US Government Printing Offices, 1991）による。
　さらに、本発明は、配列番号93、99、101、107又は109で表されるアミノ酸配列を含む、ヒト型化抗体のL鎖V領域の断片に関する。 Furthermore, the present invention is based on the Kabat rules (Kabat, EA et al., US Dept. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) as numbers in the framework regions.
Furthermore, the present invention relates to a fragment of the L chain V region of the humanized antibody, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 93, 99, 101, 107 or 109.

　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のH鎖V領域の断片及びヒト抗体のH鎖C領域の断片を含む、ヒトTFに対するヒト型化抗体のH鎖に関する。ここで、C領域としてはCγ4領域、ヒト抗体由来のFR1〜4としては、それぞれヒト抗体L39130（FR1）、ヒト抗体L39130（FR2）、ヒト抗体Z34963（FR3）またはヒト抗体U95239（FR3）、ヒト抗体L39130（FR4）由来のもの、そしてCDR1〜3としてはそれぞれ配列番号133〜135で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。 The present invention further relates to a humanized antibody H chain to human TF, comprising the humanized antibody H chain V region fragment and the human antibody H chain C region fragment. Here, the C region is the Cγ4 region, and the human antibodies FR1 to FR4 are human antibody L39130 (FR1), human antibody L39130 (FR2), human antibody Z34963 (FR3) or human antibody U95239 (FR3), human antibody Those derived from the antibody L39130 (FR4) and those containing the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 133 to 135 as CDRs 1 to 3 are exemplified.

　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のL鎖V領域の断片及びヒト抗体のL鎖C領域の断片を含む、ヒトTFに対するヒト型化抗体のL鎖に関する。ここで、C領域としてはCκ領域、ヒト抗体由来のFR1〜4としては、それぞれヒト抗体Z37332（FR1）、ヒト抗体X93625（FR2）、ヒト抗体S68699（FR3）、ヒト抗体Z37332（FR4）由来のもの、そしてCDR1〜3としてはそれぞれ配列番号136〜138で表されるアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のL鎖及びH鎖を含む、ヒトTFに対するヒト型化抗体に関する。 Furthermore, the present invention relates to an L chain of a humanized antibody against human TF, comprising a fragment of the V region of the L chain of the humanized antibody and a fragment of the C region of the L chain of the human antibody. Here, the C region is a Cκ region, and the human antibodies FR1 to FR4 are human antibody Z37332 (FR1), human antibody X93625 (FR2), human antibody S68699 (FR3), and human antibody Z37332 (FR4), respectively. And CDRs 1 to 3 each include an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 136 to 138, respectively.
Furthermore, the present invention relates to a humanized antibody against human TF, comprising the L chain and the H chain of the humanized antibody.

　さらに、本発明は、ヒトTFに対するヒト型化抗体の作製方法に関する。ヒト型化の作製方法とは、H鎖またはL鎖の抗原認識部位であるCDR1〜3の構造を支えるFR1〜4の選択方法に関する。すなわち、各FRを一つの単位として、マウス抗体由来のFRと相同性の高いヒト抗体のFRを複数選択し、そのFRを順次置換（shuffle）して所望の活性を有するヒト型化抗体の作製方法に関する。 Furthermore, the present invention relates to a method for producing a humanized antibody against human TF. The method for preparing a humanized form relates to a method for selecting FR1 to FR4 that supports the structure of CDR1 to CDR3, which are antigen recognition sites for H or L chains. That is, using each FR as one unit, a plurality of human antibody FRs having high homology to the mouse antibody-derived FRs are selected, and the FRs are sequentially substituted (shuffled) to prepare a humanized antibody having a desired activity. About the method.

　さらに詳しくは、本発明のヒト型化抗体の製造方法の一例においては、非ヒト由来の相補性決定領域（CDR）及び天然ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）を有する免疫原性を低減させた天然ヒト型化抗体の製造方法において、
　（1）目的とする抗原に対して反応性の非ヒトモノクローナル抗体を用意し、
　（2）前記（1）のモノクローナル抗体中のFRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有するヒト抗体を複数用意し、
　（3）前記（2）における1種類のヒト抗体の4個のFRを前記（1）の非ヒトモノクローナル抗体の対応するFRにより置換して第一のヒト型化抗体を作製し、
　（4）前記（3）において作製したヒト型化抗体の抗原への結合性又は抗原の生物活性を中和する能力を測定し、
　（5）前記（3）において作製したヒト型化抗体中の1〜3個のFRを、（2）で用意したヒト抗体の内、（3）で使用したものとは異なるヒト抗体の対応するFRにより置換して第二のヒト型化抗体を作製し、
　（6）前記（5）で作製した第二のヒト型化抗体と前記（3）で得た第一のヒト型化抗体とを、抗原に対する結合性、又は抗原の生物活性を中和する能力について比較し、好都合な活性を示すヒト型化抗体を選択し、
　（7）前記（6）で選択されたヒト型化抗体について、前記（3）〜（6）の段階を実施し、そして
　（8）前記（1）における非ヒトモノクローナル抗体と同等の活性を有するヒト型化抗体が得られるまで前記（3）〜（6）の段階を反復する、
ことを特徴とする。 More specifically, in one example of the method for producing a humanized antibody of the present invention, immunogenicity having a non-human derived complementarity determining region (CDR) and a framework region (FR) derived from a natural human antibody is reduced. In a method for producing a natural humanized antibody,
(1) Prepare a non-human monoclonal antibody reactive to the target antigen,
(2) preparing a plurality of human antibodies having high homology to the amino acid sequence of FR in the monoclonal antibody of (1),
(3) replacing the four FRs of one human antibody in (2) with the corresponding FRs of the non-human monoclonal antibody of (1) to produce a first humanized antibody;
(4) measuring the ability of the humanized antibody prepared in (3) to bind to the antigen or neutralize the biological activity of the antigen,
(5) One to three FRs in the humanized antibody prepared in (3) above correspond to human antibodies different from those used in (3) among the human antibodies prepared in (2). Substituting with FR to produce a second humanized antibody,
(6) The ability of the second humanized antibody prepared in (5) and the first humanized antibody obtained in (3) to bind to an antigen or to neutralize the biological activity of the antigen And selecting a humanized antibody showing favorable activity,
(7) The steps (3) to (6) are performed on the humanized antibody selected in (6) above, and (8) It has the same activity as the non-human monoclonal antibody in (1) above. Repeating steps (3) to (6) until a humanized antibody is obtained,
It is characterized by the following.

　ヒトTFに対する中和活性をある程度有するヒト型化抗体が得られれば、そのH鎖及びL鎖のV領域の特定のFRに対してさらに相同性の検索を行い、さらに相同性の高いヒト抗体を選択することが出来る。ここで得られたヒト抗体を上記の工程（2）の複数のヒト抗体群に加えて、さらに工程（3）〜（6）を反復し、所望の活性を有するヒト型化抗体を得ることが出来る。 If a humanized antibody having a certain degree of neutralizing activity against human TF is obtained, a homology search for a specific FR in the V region of the H chain and L chain is further performed, and a human antibody with higher homology is obtained. You can choose. The human antibody obtained here is added to the plurality of human antibody groups in the above step (2), and the steps (3) to (6) are further repeated to obtain a humanized antibody having a desired activity. I can do it.

　さらに、本発明は、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域の断片又はL鎖V領域の断片をコードするDNAに関する。H鎖V領域の断片及びL鎖V領域の断片のアミノ酸配列及びDNAとしては、それぞれ配列番号9又は15で表される塩基配列を含むものが挙げられる。 The present invention further relates to a DNA encoding a fragment of the H chain V region or a fragment of the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human TF. Examples of the amino acid sequence and DNA of the fragment of the H chain V region and the fragment of the L chain V region include those containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or 15, respectively.

　さらに、本発明は、前記キメラH鎖又はキメラL鎖をコードするDNAに関する。該H鎖をコードするDNAとしては例えば配列番号9で表される塩基配列を含むものが挙げられ、該L鎖をコードするDNAとしては配列番号15で表される塩基配列を含むものが挙げられる。 The present invention further relates to a DNA encoding the chimeric H chain or the chimeric L chain. Examples of the DNA encoding the H chain include those containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9, and examples of the DNA encoding the L chain include those containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15. .

　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のH鎖V領域の断片又はL鎖V領域の断片をコードするDNAに関する。H鎖V領域の断片をコードするDNAとしては配列番号29、39、41、49、51、57、59、63、69、71、75、77、81又は83で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられ、L鎖V領域の断片をコードするDNAとしては配列番号92、98、100、106又は108で表される塩基配列を含むものが挙げられる。 Further, the present invention relates to a DNA encoding a fragment of the H chain V region or a fragment of the L chain V region of the humanized antibody. As the DNA encoding the fragment of the H chain V region, any one of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 29, 39, 41, 49, 51, 57, 59, 63, 69, 71, 75, 77, 81 or 83 And a DNA encoding a fragment of the L chain V region includes a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 92, 98, 100, 106 or 108.

　さらに、本発明は、ヒト型化抗体のH鎖をコードするDNAに関する。
　さらに、本発明は、配列番号30、40、42、50、52、58、60、64、70、72、76、78、82又は84で表されるいずれかのアミノ酸配列をコードするDNAを含む、ヒト型化抗体のH鎖DNAに関する。該DNAとしては、配列番号29、39、41、49、51、57、59、63、69、71、75、77、81又は83で表されるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。
　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体のL鎖をコードするDNAに関する。 Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding the H chain of the humanized antibody.
Furthermore, the present invention includes a DNA encoding any of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 30, 40, 42, 50, 52, 58, 60, 64, 70, 72, 76, 78, 82 or 84. And H chain DNA of a humanized antibody. Examples of the DNA include those containing any of the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 29, 39, 41, 49, 51, 57, 59, 63, 69, 71, 75, 77, 81, or 83.
Furthermore, the present invention relates to a DNA encoding the L chain of the humanized antibody.

　さらに、本発明は、配列番号93、99、101、107又は109で表されるアミノ酸配列をコードする、ヒト型化抗体のL鎖DNAである。該DNAとしては配列番号92、98、100、106又は108で表される塩基配列を含むものが挙げられる。
　さらに、本発明は、前記いずれかのDNAを含む組換えベクターに関する。
　さらに、本発明は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体に関する。
　さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からヒトTFに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体を採取することを特徴とするヒトTFに対するキメラ抗体又はヒト型化抗体の製造方法に関する。
　さらに、本発明は、前記ヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物又はDIC治療剤に関する。 Furthermore, the present invention relates to a humanized antibody L chain DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 93, 99, 101, 107 or 109. Examples of the DNA include those containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 92, 98, 100, 106 or 108.
Furthermore, the present invention relates to a recombinant vector containing any one of the above DNAs.
Further, the present invention relates to a transformant transformed by the recombinant vector.
Furthermore, the present invention provides a method for producing a chimeric or humanized antibody to human TF, comprising culturing the transformant and collecting a chimeric or humanized antibody to human TF from the resulting culture. About.
Further, the present invention relates to a pharmaceutical composition or a therapeutic agent for DIC comprising the humanized antibody as an active ingredient.

　以下、本発明を詳細に説明する。
1.ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体の作製
　TFに対するマウスモノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからTF活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製される。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Preparation of mouse monoclonal antibody against human TF A mouse monoclonal antibody against TF is prepared by hybridizing antibody-producing cells obtained from an animal immunized with an antigen with myeloma cells to prepare a hybridoma, and specific TF activity is obtained from the obtained hybridoma. It is prepared by selecting a clone that produces an antibody that specifically inhibits.

　すなわち、ヒト胎盤より精製したTFを抗原として免疫したマウスの脾細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマのスクリーニングは、抗体のTFとの結合能はTF高発現細胞株J82を用いたCell-ELISAで、TFに対する中和能は凝固第X因子（Factor X：FX）の活性化に対する阻害活性を指標にした測定系で行った。その結果、TF／VIIa複合体のFX活性化を強く阻害する抗体6種を産生するハイブリドーマの樹立に成功した。 That is, spleen cells of mice immunized with TF purified from human placenta as an antigen were fused with myeloma cells to prepare hybridomas. In the screening of hybridomas, the ability of the antibody to bind to TF was determined by Cell-ELISA using a high TF-expressing cell line J82, and the ability to neutralize TF was determined by inhibiting the activity of coagulation factor X (Factor X: FX). The measurement was performed using a measurement system as an index. As a result, we succeeded in establishing a hybridoma that produces six antibodies that strongly inhibit FX activation of the TF / VIIa complex.

（1）抗原の調製
　動物の免疫に用いるTFとしては、組換えDNA法又は化学合成により調製したTFのアミノ酸配列の一部のペプチド、又はヒト胎盤由来のTFなどが挙げられる。例えば、Itoらの方法（Ito T.ら J.Biochem. 114, 691-696, 1993）に準じて行い精製したヒト胎盤由来のTFを抗原として用いることができる。
　得られたヒトTFは、アジュバントと混合し抗原として用いる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。 (1) Preparation of antigen Examples of TF used for immunization of animals include a partial peptide of the amino acid sequence of TF prepared by recombinant DNA method or chemical synthesis, or TF derived from human placenta. For example, human placenta-derived TF purified according to the method of Ito et al. (Ito T. et al. J. Biochem. 114, 691-696, 1993) can be used as the antigen.
The obtained human TF is mixed with an adjuvant and used as an antigen. Examples of the adjuvant include Freund's complete adjuvant and Freund's incomplete adjuvant, and any of these may be mixed.

（2）免疫及び抗体産生細胞の採取
　上記のようにして得られた抗原を非ヒト哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは4〜21日間間隔で免疫する。
　最終の免疫日から2〜3日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は1回にマウス1匹当たり、0.1〜100μgが用いられる。 (2) Immunization and collection of antibody-producing cells The antigen obtained as described above is administered to non-human mammals, for example, mammals such as mice, rats, horses, monkeys, rabbits, goats and sheep. Immunization can be performed by any of the existing methods, and is mainly performed by intravenous injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, or the like. The immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 4 to 21 days.
The antibody-producing cells are collected 2-3 days after the last immunization. Antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, and spleen cells are generally used. The amount of antigen immunization used is 0.1 to 100 μg per mouse at a time.

（3）抗体価の測定
　免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、又は抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。
　抗体検出の方法としては、公知技術、例えばEIA（エンザイムイムノアッセイ）、RIA（ラジオイムノアッセイ）、ELISA（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。 (3) Measurement of antibody titer In order to confirm the immune response level of the immunized animal and to select the desired hybridoma from the cells after the cell fusion treatment, the antibody titer in the blood of the immunized animal or the antibody-producing cell The antibody titer in the culture supernatant is measured.
Examples of the method for detecting the antibody include known techniques such as EIA (enzyme immunoassay), RIA (radioimmunoassay), and ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).

（4）細胞融合
　抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばHAT培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に8-アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（HAT）培地に生育できないものである。 (4) Cell fusion As myeloma (myeloma) cells to be fused with antibody-producing cells, cell lines derived from various animals such as mice, rats, and humans and generally available to those skilled in the art are used. As a cell line to be used, a cell line which has drug resistance, cannot survive in a selection medium (for example, HAT medium) in an unfused state, and can survive only in a fused state is used. Generally, an 8-azaguanine-resistant strain is used. This cell line lacks hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase and cannot grow on a hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium.

　ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、P3 （P3x63Ag8.653）（J.Immunol., 123, 1548-1550, 1979）, P3x63Ag8.1 （Current Topics in Micro biology and Immunology, 81, 1-7, 1978）, NS-1 （Kohler, G. and Milstein, C., Eur.J.Immunol. 6, 511-519, 1976）, MPC-11 （Margulies, D.H. Cell, 8, 405-415, 1976）, SP2／0 （Shulman, M. らNature, 276, 269-270, 1978）, F0 （de St.Groth, S.F.らJ.Immunol.Methods, 35, 1-21, 1980）, S194 （Trowbride, I.S., J.Exp.Med., 148, 313-323, 1978）, R210 （GGalfre, G. らNature, 277, 131-133, 1979）等が好適に使用される。 Myeloma cells include various cell lines already known, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol., 123, 1548-1550, 1979), P3x63Ag8.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1). -7, 1978), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. 6, 511-519, 1976), MPC-11 (Margulies, DH Cell, 8, 405-415, 1976), SP2 / 0 (Shulman, M. et al. Nature, 276, 269-270, 1978), F0 (de St. Groth, SF et al., J. Immunol. Methods, 35, 1-21, 1980), S194 (Trowbride) , IS, J. Exp. Med., 148, 313-323, 1978), R210 (GGalfre, G. et al. Nature, 277, 131-133, 1979) and the like are preferably used.

　抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出又は採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をPBS、DMEM、RPMI1640等の培地又は緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。 Antibody-producing cells are obtained from spleen cells, lymph node cells, and the like. That is, the spleen, lymph nodes, and the like are extracted or collected from the various animals, and these tissues are crushed. The obtained crushed product is suspended in a medium or buffer such as PBS, DMEM, RPMI1640 or the like, filtered through a stainless mesh or the like, and then centrifuged to prepare a desired antibody-producing cell.

　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。
　細胞融合は、MEM、DMEM、RPMI1640培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比1：1〜1：10で融合促進剤の存在下、30〜37℃で1〜15分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量1,000〜6,000のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。 Next, the myeloma cells are fused with the antibody-producing cells.
Cell fusion is performed by mixing myeloma cells and antibody-producing cells in a medium for animal cell culture such as MEM, DMEM, RPMI1640 medium at a mixing ratio of 1: 1 to 1:10 in the presence of a fusion promoter at 30 to 37 ° C. By contacting for 1 to 15 minutes. In order to promote cell fusion, a fusion promoter or a fusion virus such as polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or Sendai virus having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 can be used. Alternatively, antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (eg, electroporation).

（5）ハイブリドーマの選択及びクローニング
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（HAT培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。 (5) Selection and cloning of hybridoma The target hybridoma is selected from the cells after the cell fusion treatment. Examples of the method include a method utilizing selective growth of cells in a selection medium. That is, the cell suspension is diluted with an appropriate medium, spread on a microtiter plate, a selection medium (such as a HAT medium) is added to each well, and the culture is then performed by appropriately replacing the selection medium. As a result, the cells that grow can be obtained as hybridomas.

　ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。
　モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、種々の測定系を組み合わせて行うことが出来る。例えば、Cell-ELISAのごとき抗原認識測定系やFactor Xa活性を指標としたTF中和活性測定系、血漿凝固阻害活性測定系のごとき中和活性測定系を組み合わせて所望の活性を有するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。このようにして、例えば、ATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5、ATR-7およびATR-8のごときモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得することが出来る。 Hybridoma screening is performed by a limiting dilution method, a fluorescence excitation cell sorter method, or the like, and finally a monoclonal antibody-producing hybridoma is obtained.
Hybridomas producing monoclonal antibodies can be selected by combining various measurement systems. For example, a monoclonal antibody having a desired activity can be produced by combining an antigen recognition assay system such as Cell-ELISA, a TF neutralization activity assay system using Factor Xa activity as an index, and a plasma coagulation inhibitory activity assay system. Get a hybridoma. In this way, for example, hybridomas producing monoclonal antibodies such as ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5, ATR-7 and ATR-8 can be obtained.

（6）モノクローナル抗体の採取
　取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。
　細胞培養法においては、ハイブリドーマを10〜20％ウシ胎児血清含有RPMI1640培地、DMEM培地、又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃,5％CO2 濃度）で2〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。 (6) Collection of Monoclonal Antibody As a method for collecting a monoclonal antibody from the obtained hybridoma, a usual cell culture method, ascites formation method and the like can be mentioned.
In the cell culture method, the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as an RPMI1640 medium containing 10 to 20% fetal bovine serum, a DMEM medium, or a serum-free medium under ordinary culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). For 2 to 14 days, and the antibody is obtained from the culture supernatant.

　腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜4週間後に腹水又は血清を採取する。
　上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製する。 In the ascites formation method, a hybridoma is administered intraperitoneally to an animal of the same species as a mammal derived from myeloma cells, and the hybridoma is grown in large quantities. Then, ascites or serum is collected 1 to 4 weeks later.
In the above antibody collection method, when purification of the antibody is required, a known method such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or the like is appropriately selected or purified by combining these methods. I do.

2.ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のV領域をコードするDNAのクローニング
（i）mRNAの調製
　ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖およびL鎖V領域をコードするDNAのクローニングを行うため、回収されたハイブリドーマから公知の方法、例えばグアニジン-超遠心法（Chirgwin, J.M.ら、Biochemistry, （1979）, 18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczynski, Pら（1987）, 162, 156-159）等により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit （Pharmacia Biotech）に添付されたオリゴ（dT）-セルロース スパンカラム等によりmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit （Pharmacia Biotech）を用いることにより、全RNAの抽出操作を経ずに、mRNAの調製を行うこともできる。 2. Cloning of DNA encoding V region of mouse monoclonal antibody against human TF (i) Preparation of mRNA Collected for cloning of DNA encoding H chain and L chain V regions of mouse monoclonal antibody against human TF Known methods from hybridomas, for example, guanidine-ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry, (1979), 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P et al. (1987), 162, 156-159) Prepare total RNA and prepare mRNA using oligo (dT) -cellulose span column attached to mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech). In addition, by using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech), mRNA can be prepared without performing a total RNA extraction operation.

（ii）cDNAの調製及び増幅
　上記（i）で得たmRNAから、逆転写酵素を用いてL鎖及びH鎖のV領域におけるcDNAをそれぞれ合成する。cDNAの合成は、Oligo-dTプライマー又はL鎖C領域若しくはH鎖C領域とハイブリダイズする適当なプライマー（例えばキット添付のcDNA合成プライマー）を用いることが出来る。
　cDNA合成反応は、前記mRNAとプライマーとを混合し、逆転写酵素の存在下で例えば52℃で30分の反応を行う。 (Ii) Preparation and Amplification of cDNA From the mRNA obtained in (i) above, cDNA in the V region of the L chain and H chain is synthesized using reverse transcriptase. For cDNA synthesis, an Oligo-dT primer or an appropriate primer that hybridizes with the L chain C region or H chain C region (for example, a cDNA synthesis primer attached to the kit) can be used.
In the cDNA synthesis reaction, the mRNA and the primer are mixed, and the reaction is performed in the presence of reverse transcriptase, for example, at 52 ° C. for 30 minutes.

　cDNAの増幅は、L鎖及びH鎖ともに5’-Ampli FINDER RACE kit （CLONTECH社）を用いた5’-RACE 法（Frohman, M.A.らProc.Natl.Acad. USA 85, 8998-9002, 1988, Belyavsky, A.らNucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989）に基づくPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）にて行うことが出来る。すなわち、上記で合成した2本鎖cDNAの両端にcDNA adapterを連結し、H鎖V領域及びL鎖V領域の断片をコードするDNA（以下、L鎖V領域の断片をコードするDNAを「L鎖V領域のDNA」又は「L鎖V領域をコードするDNA」と略記することもある（H鎖V領域等についても同様））についてPCRを行う。 Amplification of cDNA was performed using the 5'-RACE method (Frohman, MA et al., Proc. Natl. Acad. USA 85, 8998-9002, 1988, using 5'-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH) for both L and H chains. Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) can be performed by PCR (polymerase chain reaction). That is, a cDNA adapter is linked to both ends of the double-stranded cDNA synthesized as described above, and DNA encoding fragments of the H chain V region and L chain V region (hereinafter, DNA encoding the fragment of the L chain V region is referred to as “L PCR may be performed on the DNA of the “chain V region” or “DNA encoding the L chain V region” (the same applies to the H chain V region).

　H鎖V領域のDNAを増幅するためのプライマーとして、例えば5′-側プライマーにはキット添付のAdapter primer 1と3′-側プライマーにはマウス抗体のH鎖定常領域MHC-G1プライマー（配列番号1）（ATR-2、ATR-3、ATR-4およびATR-5）（Cγ1領域）あるいはMHC-G2aプライマー（配列番号2）（ATR-7およびATR-8）（Cγ2a領域）（S.T.Jonesら, Biotechnology, 9, 88, 1991）を用いることが出来る。また、L鎖V領域のDNAを増幅するためのプライマーとして、例えば5′-側プライマーにはキット添付のAdapter primer 1と3′-側プライマーにはマウス抗体のL鎖κ鎖定常領域（Cκ領域）プライマー（例えば配列番号3で表される塩基配列を有するMKCプライマー）を用いることが出来る。 As a primer for amplifying the DNA of the H chain V region, for example, for the 5'-side primer, Adapter primer 1 attached to the kit and for the 3'-side primer, the H chain constant region MHC-G1 primer of a mouse antibody (SEQ ID NO: 1) (ATR-2, ATR-3, ATR-4 and ATR-5) (Cγ1 region) or MHC-G2a primer (SEQ ID NO: 2) (ATR-7 and ATR-8) (Cγ2a region) (STJones et al. Biotechnology, 9, 88, 1991) can be used. As a primer for amplifying the DNA of the L chain V region, for example, the 5′-side primer has Adapter Primer 1 attached to the kit and the 3′-side primer has the L chain κ chain constant region (Cκ region) of the mouse antibody. ) A primer (for example, an MKC primer having a base sequence represented by SEQ ID NO: 3) can be used.

（iii）DNAの精製及び塩基配列の決定
　PCR産物について、公知手法に従ってアガロースゲル電気泳動を行い、目的とするDNA断片を切り出した後、DNAの回収及び精製を行い、ベクターDNAに連結する。
　DNAの精製は、フェノール及びクロロホルムで抽出するか（J.Sambrook, et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、市販のキット（例えばGENECLEAN II; BIO101）を用いて行われる。DNA断片を保持するためのベクターDNAには公知のもの（例えば pUC19、Bluescript等）を用いることができる。 (Iii) Purification of DNA and determination of nucleotide sequence The PCR product is subjected to agarose gel electrophoresis according to a known method to cut out a target DNA fragment, and then the DNA is recovered and purified, and ligated to a vector DNA.
DNA is purified by extraction with phenol and chloroform (J. Sambrook, et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) or using a commercially available kit (eg, GENECLEAN II; BIO101). Known vector DNAs (eg, pUC19, Bluescript, etc.) can be used as the vector DNA for retaining the DNA fragments.

　前記DNAと上記ベクターDNAとを、公知のライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結させ、組換えベクターを得る。次に、得られる組換えベクターを大腸菌JM109コンピテントセル（ニッポンジーン）等に導入した後アンピシリン耐性コロニーを選抜し、公知方法に基づいてベクターDNAを調製する（J.Sambrook, et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。目的とするDNAの塩基配列は、上記ベクターDNAを制限酵素で消化した後、公知方法（例えばジデオキシ法）により決定する（J.Sambrook, et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。本発明では、自動塩基配列決定装置（DNA Sequencer 373A, Perkin-Elmer）を用いることができる。 (4) The DNA and the vector DNA are ligated using a known ligation kit (Takara Shuzo) to obtain a recombinant vector. Next, the resulting recombinant vector is introduced into E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene) and the like, ampicillin-resistant colonies are selected, and vector DNA is prepared based on a known method (J. Sambrook, et al. "Molecular Cloning"). ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). The base sequence of the target DNA is determined by a known method (for example, the dideoxy method) after digesting the vector DNA with a restriction enzyme (J. Sambrook, et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). ). In the present invention, an automatic base sequencer (DNA Sequencer 373A, Perkin-Elmer) can be used.

（iv）相補性決定領域（CDR）
　H鎖V領域及びL鎖V領域は、抗原結合部位を形成し、その全般の構造は互いに類似性を有している。すなわち、それぞれ4つのフレームワーク領域（FR）部分が、3つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（CDR）により連結されている。FRのアミノ酸配列は比較的よく保存されているが、一方、CDR領域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.ら、「Sequence of Proteins of Immunological Interest」US Dept. Health and Human Services, 1983）。 (Iv) Complementarity determining region (CDR)
The H chain V region and the L chain V region form an antigen binding site, and their general structures are similar to each other. That is, each of the four framework regions (FR) is linked by three hypervariable regions, namely, complementarity determining regions (CDRs). Although the amino acid sequence of FR is relatively well conserved, the amino acid sequence of the CDR region has extremely high variability (Kabat, EA, et al., "Sequence of Proteins of Immunological Interest" US Dept. Health and Human Services, 1983). ).

　前記4個のFRの多くの部分は、β-シート構造をとり、その結果3個のCDRはループを形成する。CDRは、ある場合にはβ-シート構造の一部を形成することもある。従って、3個のCDRはFRによって相互に立体的に非常に近い位置に保持され、そしてFRは対をなす領域の3個のCDRと共に抗原結合部位を形成する。 多 く Many parts of the four FRs have a β-sheet structure, so that the three CDRs form a loop. CDRs may in some cases form part of a β-sheet structure. Thus, the three CDRs are held sterically very close to each other by the FRs, and the FRs together with the three CDRs of the paired region form an antigen binding site.

　このような事実に基づき、ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をKabatらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベース（「Sequence of Proteins ofImmunological Interest」US Dept. Health and Human Services,1983）にあてはめて、相同性を調べることによりCDR領域を見いだすことが出来る。 Based on these facts, the amino acid sequence of the variable region of the mouse monoclonal antibody against human TF was determined by Kabat et al. As a database of antibody amino acid sequences ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health and Human Services, 1983). The CDR regions can be found by examining homology.

　CDR領域の配列は、ヒト型化抗体を作製した際にヒトTFに対する結合活性及び中和活性が保持される範囲内であれば、挿入、置換又は欠失による改変体も本発明に含まれる。例えば、配列番号133-138の各CDR又は配列番号139-141,143-144,145-147及び149-150のV領域中の各CDR領域との相同性が90〜100％の配列であるものが挙げられる。好ましくは、相同性が95〜100％の配列であるものが挙げられる。さらに好ましくは、相同性が98〜100％の配列であるものが挙げられる。 The sequence of the CDR region is also included in the present invention as long as the humanized antibody is prepared, so long as the binding activity to human TF and the neutralizing activity are maintained. For example, a sequence having 90 to 100% homology with each CDR of SEQ ID NOs: 133 to 138 or each CDR region in the V regions of SEQ ID NOs: 139 to 141, 143 to 144, 145 to 147, and 149 to 150 is exemplified. Preferably, a sequence having a homology of 95 to 100% is used. More preferably, a sequence having a homology of 98 to 100% is used.

3.キメラ抗体の発現ベクターの作製
　マウスモノクローナル抗体のマウスL鎖（以下、抗体のL鎖又はH鎖を表す場合は、マウスについては「マウスL鎖」、ヒト抗体のH鎖については「ヒトH鎖」のように略記することもある。）及びH鎖V領域をコードするDNA断片がクローニングされれば、これらのマウスV領域をコードするDNAを、ヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結して発現させることによってキメラ抗ヒトTF抗体が得られる。 3. Preparation of Chimeric Antibody Expression Vector Mouse L chain of a mouse monoclonal antibody (hereinafter, when referring to the L chain or H chain of an antibody, “mouse L chain” for a mouse, and And the DNA fragment encoding the H chain V region is cloned, the DNA encoding the mouse V region is ligated to the DNA encoding the human antibody constant region. And a chimeric anti-human TF antibody is obtained.

　キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及びV領域配列を、哺乳類細胞の発現ベクター中にすでに存在するヒト抗体C領域をコードする配列に連結することを含んでなる。あるいは、クローン化されたcDNAに存在するマウスリーダー配列及びV領域配列をヒト抗体C領域をコードする配列に連結した後、哺乳類細胞発現ベクターに連結することを含んでなる。
　ヒト抗体C領域の断片は、任意のヒト抗体のH鎖C領域及びヒト抗体のL鎖C領域のものとすることができ、例えばヒトH鎖のものについてはCγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4、及びL鎖のものについてはCλ又はCκを各々挙げることができる。 The basic method for producing a chimeric antibody is to ligate the mouse leader sequence and V region sequence present in the cloned cDNA to a sequence encoding the human antibody C region already present in the mammalian cell expression vector. To do. Alternatively, the method comprises ligating a mouse leader sequence and a V region sequence present in the cloned cDNA to a sequence encoding a human antibody C region, and then ligating the sequence to a mammalian cell expression vector.
Fragments of the human antibody C region can be those of the H chain C region of any human antibody and the L chain C region of a human antibody; for example, for human H chains, Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4, and For the L chain, Cλ or Cκ can be mentioned, respectively.

　キメラ抗体の製造のためには、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスH鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスL鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含む単一の発現ベクター（例えば、WO94／11523参照）を作製する。次に、この発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン-ビトロ又はイン-ビボで培養してキメラ抗体を製造する（例えば、WO91／16928参照）。単一の発現ベクターには、IgG1κ型抗体発現ベクターN5KG1（V）及びIgG4κ型抗体発現ベクターN5KG4Pを用いることができる。 For production of a chimeric antibody, an expression vector containing DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region under an expression control region such as an enhancer / promoter system, and an expression vector such as an enhancer / promoter system Under the control of the control region, a single expression vector containing DNA encoding the mouse L chain V region and the human L chain C region (for example, see WO94 / 11523) is prepared. Next, a host cell, such as a mammalian cell, is co-transformed with the expression vector, and the transformed cell is cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric antibody (see, for example, WO91 / 16928). . As a single expression vector, an IgG1κ antibody expression vector N5KG1 (V) and an IgG4κ antibody expression vector N5KG4P can be used.

（i）キメラ抗体H鎖の構築
　キメラ抗体のH鎖発現ベクターは、マウスH鎖V領域をコードするcDNAを、ヒト抗体のH鎖C領域をコードするDNAを含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。H鎖C領域としては、例えばCγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4領域が挙げられる。 (I) Construction of chimeric antibody H chain The chimeric antibody H chain expression vector is obtained by introducing a cDNA encoding a mouse H chain V region into an appropriate expression vector containing a DNA encoding a human antibody H chain C region. Can be obtained by Examples of the H chain C region include Cγ1, Cγ2, Cγ3, and Cγ4 regions.

　ここで、マウスH鎖V領域をコードするcDNAを発現ベクターに挿入するにあたり、PCR法により該cDNAに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該cDNAの5’-末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするため該cDNAの開始コドン直前にKozakコンセンサス配列（Kozak, M.et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987）を有するように設計したPCRプライマー、及び、該cDNAの3’-末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したPCRプライマーを用いてPCRを行うことで、これら適当な塩基配列を発現ベクターに導入することができる。 Here, when inserting the cDNA encoding the mouse H chain V region into the expression vector, an appropriate nucleotide sequence can be introduced into the cDNA by PCR. For example, a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. et al., Supra) having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5'-end of the cDNA and immediately before the start codon of the cDNA to improve transcription efficiency. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and a PCR primer designed to have an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 3'-end of the cDNA. By performing PCR, these appropriate nucleotide sequences can be introduced into an expression vector.

　こうして構築したマウスH鎖V領域をコードするcDNAを適当な制限酵素で処理した後、上記発現ベクターに挿入して、H鎖C領域（Cγ1あるいはCγ4）をコードするDNAを含むキメラH鎖発現ベクターを構築する。 After treating the cDNA encoding the mouse H chain V region thus constructed with an appropriate restriction enzyme, the cDNA is inserted into the above expression vector, and a chimeric H chain expression vector containing a DNA encoding the H chain C region (Cγ1 or Cγ4) is obtained. To build.

（ii）キメラ抗体L鎖κ鎖をコードするcDNAを含む発現ベクターの構築
　キメラ抗体のL鎖発現ベクターは、マウスL鎖V領域をコードするcDNAを、ヒト抗体のL鎖C領域をコードするDNAを含む適当な発現ベクターに導入することにより得ることが出来る。L鎖C領域としては、例えばCκ、Cλ領域が挙げられる。 (Ii) Construction of Expression Vector Containing cDNA Encoding Chimeric Antibody L Chain κ Chain The chimeric antibody L chain expression vector comprises a cDNA encoding a mouse L chain V region and a DNA encoding a human antibody L chain C region. Can be obtained by introducing into an appropriate expression vector containing Examples of the L chain C region include Cκ and Cλ regions.

　マウスL鎖V領域をコードするcDNAを含む発現ベクターを構築するにあたり、PCR法により、該cDNAに適当な塩基配列を導入することが出来る。例えば、該cDNAの5’-末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように、そして転写効率をよくするためのKozakコンセンサス配列を有するように設計したPCRプライマー、及び、3’-末端に適当な制限酵素の認識配列を有するように設計したPCRプライマーを用いてPCRを行うことで、これら適当な塩基配列を該cDNAに導入する。 (4) In constructing an expression vector containing a cDNA encoding the mouse L chain V region, an appropriate nucleotide sequence can be introduced into the cDNA by PCR. For example, a PCR primer designed to have an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5′-end of the cDNA and a Kozak consensus sequence to improve transcription efficiency, and an appropriate primer at the 3′-end The appropriate base sequence is introduced into the cDNA by performing PCR using PCR primers designed to have a recognition sequence for the restriction enzyme.

　こうして構築したマウスL鎖V領域をコードするcDNAを適当な制限酵素で処理した後、上記発現ベクターに挿入して、L鎖C領域（Cκ領域）をコードするDNAを含むキメラL鎖発現ベクターを構築する。 After treating the cDNA encoding the mouse L chain V region thus constructed with an appropriate restriction enzyme, the cDNA is inserted into the above-described expression vector to obtain a chimeric L chain expression vector containing the DNA encoding the L chain C region (Cκ region). To construct.

4.ヒト型化抗体の作製
（1）ヒト抗体との相同性検索
　マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体に移植されているヒト型化抗体を作製するためには、マウスモノクローナル抗体のFRとヒト抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが望ましい。従って、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体のH鎖及びL鎖のV領域を、Data Bankを用いて構造が解明されているすべての既知抗体のV領域と比較する。また、同時にKabatらにより、抗体のFRの長さ、アミノ酸の相同性等によって分類されたヒト抗体のサブグループ（HSG： Human subgroup）（Kabat,E.A.ら、US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991）との比較を行う。 4. Preparation of humanized antibody (1) Search for homology with human antibody In order to prepare a humanized antibody in which the CDR of a mouse monoclonal antibody is transplanted to a human antibody, the FR of a mouse monoclonal antibody and the human antibody It is desirable that there be high homology with the FRs. Therefore, the V regions of the H and L chains of the mouse anti-human TF monoclonal antibody are compared with the V regions of all known antibodies whose structures have been elucidated using the Data Bank. At the same time, Kabat et al. (HSG: Human subgroup) (Kabat, EA et al., US Dep. Health and Human Services, US Government) classified by antibody FR length, amino acid homology, etc. Printing Offices, 1991).

　ヒトH鎖V領域の場合は、KabatらによるHSG分類により、HSGI〜IIIに分類することが出来、例えば、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体ATR-5のH鎖V領域は、HSGIのコンセンサス配列と67.8％のホモロジーを有する。一方、ヒトL鎖κ鎖V領域は、KabatらによるHSG分類により、HSGI〜IVに分類することが出来、例えば、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体ATR-5のL鎖κ鎖V領域は、HSGIのコンセンサス配列と72.3％のホモロジーを有する。 In the case of the human H chain V region, it can be classified into HSGI to III by the HSG classification according to Kabat et al. For example, the H chain V region of the mouse anti-human TF monoclonal antibody ATR-5 is 67.8% with the HSGI consensus sequence. % Homology. On the other hand, the human L chain κ chain V region can be classified into HSGI to IV according to the HSG classification by Kabat et al. For example, the L chain κ chain V region of the mouse anti-human TF monoclonal antibody ATR-5 is the HSGI It has 72.3% homology with the consensus sequence.

　従来の技術によりマウス抗体をヒト型化する場合には、必要によっては、ヒト型化V領域のCDRの構造をより一層もとのマウス抗体の構造に近づけるために、CDRを支持しているマウス抗体のV領域のFRの一部のアミノ酸配列をヒトV領域のFRに移植する場合がある。しかしながら、マウス抗体のV領域FRのどのアミノ酸をヒト抗体V領域のFRに移植すべきかについては、一定の法則がない。従って、CDRの構造を保持するために必須のアミノ酸を特定することは、多くの努力を必要とする。 In the case where a mouse antibody is humanized by a conventional technique, if necessary, a mouse supporting CDRs may be used to make the CDR structure of the humanized V region closer to the original mouse antibody structure. In some cases, a partial amino acid sequence of the FRs in the V region of the antibody is transplanted into the FRs in the human V region. However, there is no specific rule as to which amino acid of the V region FR of the mouse antibody should be transplanted to the FR of the human antibody V region. Therefore, identifying the amino acids essential for maintaining the structure of the CDR requires a lot of effort.

　また、FRの一部にマウス抗体のV領域からヒトV領域に移植されたアミノ酸配列に対するヒト抗体ができる危険性が存在する。本発明では、ヒト型化した抗体に於いてCDRを除く全てのアミノ酸配列をヒト抗体由来のアミノ酸配列とするために、CDRの立体構造を保持するために必要な四個のFR（FR1〜4）について、一つのFRを単位として、データベース上に存在するマウス抗体のFRと相同性の高いヒト抗体のFRを検索した。以下に、モノクローナル抗体ATR-5のH鎖及びL鎖のV領域の各FRについて、データーベースと相同性検索した結果を示す。 Also, there is a risk that a human antibody to the amino acid sequence grafted from the V region of the mouse antibody to the human V region is generated in a part of the FR. In the present invention, in order to make all amino acid sequences except for CDRs in a humanized antibody into amino acid sequences derived from human antibodies, four FRs (FR1 to FR4) necessary to maintain the three-dimensional structure of CDRs are used. ), Using one FR as a unit, a human antibody FR having high homology with the mouse antibody FR existing on the database was searched. The results of a homology search with the database for each FR in the V region of the H chain and L chain of the monoclonal antibody ATR-5 are shown below.

Figure 2004121253
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Figure 2004121253
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（2）ヒト型化抗体V領域をコードするDNAの設計
　ヒト型化抗体V領域をコードするDNAの設計における第一段階は、設計の基礎となるヒト抗体V領域の各FRを選択することである。また、FR shuffleにおいては、それぞれのFRにおいて、バラエティーの高いヒト抗体V領域FRを選択する必要がある。 (2) Design of the DNA encoding the humanized antibody V region The first step in designing the DNA encoding the humanized antibody V region is to select each FR of the human antibody V region that serves as the basis for the design. is there. Further, in the FR shuffle, it is necessary to select a human antibody V region FR having a high variety in each FR.

　本発明においては、モノクローナル抗体ATR-5に関しては、H鎖については、マウス抗体H鎖V領域全体と各FRとのホモロジー検索の結果から、FR2については3種類、FR3については10種類のヒト抗体V領域FRを選択した。L鎖については、マウス抗体L鎖V領域全体と各FRとのホモロジー検索の結果から、FR2については3種類、FR3については3種類のヒト抗体V領域FRを選択する事が出来る。 In the present invention, regarding the monoclonal antibody ATR-5, for the H chain, from the result of homology search of the entire mouse antibody H chain V region and each FR, 3 types of FR2, 10 types of human antibodies for FR3 V region FR was selected. For the L chain, from the results of the homology search between the entire mouse antibody L chain V region and each FR, three types of FR2 and three types of human antibody V region FR can be selected for FR3.

　ヒト型化H鎖およびL鎖V領域ともに、第一のバージョン（バージョンa：ver.a）として、マウスモノクローナル抗体ATR-5のH鎖およびL鎖V領域とそれぞれホモロジーの高いヒト抗体H鎖およびL鎖V領域L39130とZ37332を選択する事が出来る。これらのヒト型化抗体を作製するに当たり、FR shuffleを容易に行えるように各CDR内部及びFRの適当な部位に、適当な制限酵素認識部位を設計する事が出来る。こうすることにより、いずれかのFRのみを容易に入れ替えることが可能になる。 The first version (version a: ver.a) of both the humanized H chain and the L chain V region was a human antibody H chain and H chain having high homology to the H chain and the L chain V region of the mouse monoclonal antibody ATR-5, respectively. L chain V region L39130 and Z37332 can be selected. In preparing these humanized antibodies, an appropriate restriction enzyme recognition site can be designed inside each CDR and at an appropriate site in the FR so that FR shuffle can be easily performed. This makes it possible to easily replace only one of the FRs.

　例えばヒト型化H鎖CDR1の制限酵素EcoT22I認識部位、CDR2の制限酵素BalI認識部位、CDR3の制限酵素NcoI認識部位およびFR3の制限酵素XhoI認識部位、例えばヒト型化L鎖CDR1の制限酵素AflII認識部位、CDR2の制限酵素SpeI認識部位、CDR3の制限酵素PstI認識部位およびFR3の制限酵素AccIII認識部位である。
　このように設計したバージョンaを基にして、それぞれのFRについてFR shuffleを行い、所望の活性を有するヒト型化抗体を作製する事が出来る。 For example, humanized H chain CDR1 restriction enzyme EcoT22I recognition site, CDR2 restriction enzyme BalI recognition site, CDR3 restriction enzyme NcoI recognition site and FR3 restriction enzyme XhoI recognition site, for example, humanized L chain CDR1 restriction enzyme AflII recognition A CDR2 restriction enzyme SpeI recognition site, a CDR3 restriction enzyme PstI recognition site, and a FR3 restriction enzyme AccIII recognition site.
Based on version a designed in this manner, FR shuffle is performed for each FR, and a humanized antibody having desired activity can be prepared.

　（3）ヒト型化抗体V領域の断片の作製
　本発明のヒト型化抗体は、該抗体のC領域、及びV領域のFRがヒト抗体由来のものであり、V領域のCDRがマウス抗体由来のものである。本発明のヒト型化抗体のV領域の断片は、鋳型となるヒト抗体のDNA断片が入手可能ならば、PCR法によるCDR-グラフティングと呼ばれる手法により作製することができる。「CDR-グラフティング」とは、マウス由来のCDRをコードするDNA断片を作製し、これを鋳型となるヒト抗体のCDRと入れ換える手法をいう。 (3) Preparation of fragment of humanized antibody V region The humanized antibody of the present invention is such that the C region of the antibody and the FR of the V region are derived from a human antibody, and the CDR of the V region is derived from a mouse antibody. belongs to. The fragment of the V region of the humanized antibody of the present invention can be prepared by a technique called CDR-grafting by PCR if a DNA fragment of a human antibody serving as a template is available. “CDR-grafting” refers to a technique in which a DNA fragment encoding a mouse-derived CDR is prepared, and this is replaced with the CDR of a human antibody serving as a template.

　また、鋳型となるヒト抗体のDNA断片が入手できない場合は、データベースに登録されている塩基配列をDNA合成機で合成し、PCR法によりヒト型化抗体V領域を作製することができる。さらに、アミノ酸配列のみデータベースに登録されている場合は、そのアミノ酸配列を基に、 Kabat, E.A.らの報告（US Dep. Health andHuman Services, US Government Printing Offices, 1991）している抗体のコドン使用頻度に基づいて、全塩基配列を類推することができる。この塩基配列をDNA合成機で合成し、PCR法によりヒト型化抗体V領域の断片を作製することができる。 If a DNA fragment of a human antibody serving as a template is not available, a nucleotide sequence registered in a database can be synthesized using a DNA synthesizer, and a humanized antibody V region can be prepared by PCR. Furthermore, if only the amino acid sequence is registered in the database, the codon usage of the antibody reported by Kabat, EA et al. (US Dep. Health and Human Services, US Government Printing Offices, 1991) based on that amino acid sequence , The entire base sequence can be inferred. This nucleotide sequence is synthesized by a DNA synthesizer, and a fragment of the humanized antibody V region can be prepared by PCR.

（i）ヒト型化H鎖V領域をコードするDNA及び発現ベクターの構築
　本発明では、ヒト型化抗体の鋳型とするヒト抗体のH鎖V領域をコードする遺伝子をデータベースから入手し、ヒト型化H鎖V領域をコードするDNAの全塩基配列をDNA合成機で合成し、PCR法により構築することが出来る。例えば、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体ATR-5のH鎖V領域と高い相同性（ホモロジー）を有するL39130をヒト型化H鎖V領域バージョン“a”として作製することが出来る。ヒト型化H鎖V領域バージョン“a”を作製するためには、例えば配列番号22〜26に示す5本のプライマー及び配列番号27、28に示す2本の外部プライマーに分けて使用する。 (I) Construction of DNA encoding humanized H chain V region and expression vector In the present invention, a gene encoding the H chain V region of a human antibody as a template for a humanized antibody is obtained from a database, The entire base sequence of DNA encoding the modified H chain V region can be synthesized by a DNA synthesizer and constructed by the PCR method. For example, L39130 having high homology (homology) with the H chain V region of the mouse anti-human TF monoclonal antibody ATR-5 can be prepared as a humanized H chain V region version “a”. In order to prepare the humanized H chain V region version “a”, for example, the primers are divided into five primers shown in SEQ ID NOS: 22 to 26 and two external primers shown in SEQ ID NOs: 27 and 28.

　CDR-グラフティングプライマーhR5Hv1S（配列番号22）、hR5Hv2S（配列番号23）及びhR5Hv4S（配列番号24）はセンスDNA配列を有し、そしてCDRグラフティングプライマーhR5Hv3A（配列番号25）及びhR5Hv5A（配列番号26）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に18-35bpの相補的配列を有する。hR5Hv1SはKozakコンセンサス配列（Kozak, M, ら、J.Mol.Biol. 196, 947-950, 1987）およびSalI認識部位を有するように、またhR5Hv5AはNheI認識部位を有するように設計する。また外部プライマーhR5HvPrS（配列番号27）及びhR5HvPrA（配列番号28）はCDRグラフティングプライマーhR5Hv1S及びhR5Hv5Aとホモロジーを有する。 CDR-grafting primers hR5Hv1S (SEQ ID NO: 22), hR5Hv2S (SEQ ID NO: 23) and hR5Hv4S (SEQ ID NO: 24) have a sense DNA sequence, and CDR-grafting primers hR5Hv3A (SEQ ID NO: 25) and hR5Hv5A (SEQ ID NO: 26) ) Has an antisense DNA sequence and each has a complementary sequence of 18-35 bp at each end of the primer. hR5Hv1S is designed to have a Kozak consensus sequence (Kozak, M, et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987) and a SalI recognition site, and hR5Hv5A is designed to have a NheI recognition site. The external primers hR5HvPrS (SEQ ID NO: 27) and hR5HvPrA (SEQ ID NO: 28) have homology with the CDR grafting primers hR5Hv1S and hR5Hv5A.

　PCR法を用いて、5本のプライマーをアセンブリさせ完全長のcDNA合成し、さらに外部プライマーを加えDNAの増幅を行う。PCR法によるアセンブリとは、hR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv4S、hR5Hv3A及びhR5Hv5Aとがその相補的配列によりアニーリングし、完全長のヒト型化H鎖V領域のDNAが合成されることを指す。
　ヒト抗体H鎖C領域は任意のヒトH鎖C領域であることができ、例えばヒトH鎖Cγ1、Cγ2、Cγ3又はCγ4を挙げることができる。 Using the PCR method, five primers are assembled to synthesize a full-length cDNA, and an external primer is added to amplify the DNA. The assembly by the PCR method means that hR5Hv1S, hR5Hv2S, hR5Hv4S, hR5Hv3A and hR5Hv5A anneal with their complementary sequences to synthesize DNA of a full-length humanized H chain V region.
The human antibody H chain C region can be any human H chain C region, for example, human H chain Cγ1, Cγ2, Cγ3 or Cγ4.

　前記のようにして構築したヒト型化抗体H鎖V領域のDNAは、任意のヒト抗体H鎖C領域、例えばヒトH鎖C領域Cγ1またはCγ4のDNAと連結することができる。キメラ抗体H鎖の構築で述べたように、適当な制限酵素にて処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトH鎖C領域をコードするDNAと連結し、ヒト型化H鎖V領域及びヒトH鎖C領域のDNAを含む発現ベクターを作製する。 The DNA of the humanized antibody H chain V region constructed as described above can be ligated to any human antibody H chain C region, for example, DNA of the human H chain C region Cγ1 or Cγ4. As described in the construction of the chimeric antibody H chain, after treatment with an appropriate restriction enzyme, the gene is ligated to a DNA encoding the human H chain C region under an expression control region such as an enhancer / promoter system, and the human type Vector containing the DNA of the modified H chain V region and the DNA of the human H chain C region.

（ii）ヒト型化L鎖V領域をコードするDNA及び発現ベクターの構築
　本発明では、H鎖V領域をコードするDNAの場合と同様、鋳型となるヒト抗体のL鎖V領域の遺伝子をデータベースから入手し、ヒト型化L鎖V領域をコードするDNAの全塩基配列をDNA合成機で合成し、PCR法により構築することが出来る。例えば、マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体ATR-5のL鎖V領域と高い相同性（ホモロジー）を有するZ37332をヒト型化L鎖V領域バージョン“a”として作製することが出来る。 (Ii) Construction of DNA encoding humanized L chain V region and expression vector In the present invention, as in the case of DNA encoding the H chain V region, the gene of the L chain V region of the human antibody serving as a template is used as a database. And the entire base sequence of DNA encoding the humanized L chain V region can be synthesized using a DNA synthesizer and constructed by PCR. For example, Z37332 having high homology (homology) with the L chain V region of the mouse anti-human TF monoclonal antibody ATR-5 can be prepared as a humanized L chain V region version “a”.

　ヒト型化L鎖V領域バージョン“a”を作製するためには、CDR-グラフティングプライマーh5Lv1S（配列番号85）及びh5Lv4S（配列番号86）はセンスDNA配列を、CDRグラフティングプライマーh5Lv2A（配列番号87）、h5Lv3A（配列番号88）及びh5Lv5A（配列番号89）はアンチセンスDNA配列を有し、各プライマーの両端に20bpの相補的配列を有する。プライマーh5Lv1Sは、Kozakコンセンサス配列（Kozak, M, ら、J.Mol.Biol. 196, 947-950, 1987）および制限酵素BglII認識部位を有するように、またh5Lv5Aは制限酵素SplI認識部位を有するように設計する。また、外部プライマーh5LvS（配列番号90）及びh5LvA（配列番号91）はCDRグラフティングプライマーh5Lv1S及びh5Lv5Aとホモロジーを有する。 In order to prepare the humanized L chain V region version “a”, the CDR-grafting primers h5Lv1S (SEQ ID NO: 85) and h5Lv4S (SEQ ID NO: 86) use the sense DNA sequence, and the CDR-grafting primer h5Lv2A (SEQ ID NO: 87), h5Lv3A (SEQ ID NO: 88) and h5Lv5A (SEQ ID NO: 89) have an antisense DNA sequence, and have a complementary sequence of 20 bp at both ends of each primer. Primer h5Lv1S has a Kozak consensus sequence (Kozak, M, et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987) and a restriction enzyme BglII recognition site, and h5Lv5A has a restriction enzyme SplI recognition site. To design. The external primers h5LvS (SEQ ID NO: 90) and h5LvA (SEQ ID NO: 91) have homology with the CDR grafting primers h5Lv1S and h5Lv5A.

　ヒト型化H鎖V領域と同様に、PCR法を用いて、5本のプライマーをアセンブリさせ完全長のcDNA合成し、さらに外部プライマーを加えDNAの増幅を行うことが出来る。
　ヒト抗体L鎖C領域は任意のヒトL鎖C領域であることができ、例えばヒトL鎖CλやCκを挙げることができる。
　前記のようにして構築したヒト型化抗体L鎖V領域のDNAは、任意のヒト抗体L鎖C領域、例えばヒトL鎖CκやCλ領域のものと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトL鎖κ鎖C領域をコードするDNAと連結し、ヒト型化L鎖V領域及びヒトL鎖κ鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクターを作製する。 As in the case of the humanized H chain V region, five primers can be assembled using PCR to synthesize a full-length cDNA, and further, external primers can be added to amplify the DNA.
The human antibody L chain C region can be any human L chain C region, such as human L chain Cλ or Cκ.
The DNA of the humanized antibody L chain V region constructed as described above can be ligated to any human antibody L chain C region, for example, human L chain Cκ or Cλ region. After treatment with an appropriate restriction enzyme, it is ligated to a DNA encoding a human L chain κ chain C region under an expression control region such as an enhancer / promoter system, and the humanized L chain V region and human L chain κ chain An expression vector containing a DNA encoding the C region is prepared.

　前記のようにして、ヒト型化抗体のV領域断片が作製されても、該V領域断片が抗体としての活性（抗原に対する結合活性、中和活性等）を有するか否かは必ずしも明らかではない。そのため、ヒト型化H鎖との組み合わせによりCOS-7のごとき動物細胞で発現させ、活性の有無を検討する必要がある。 Even if a V region fragment of a humanized antibody is prepared as described above, it is not always clear whether or not the V region fragment has an antibody activity (antigen binding activity, neutralizing activity, etc.). . Therefore, expression in animal cells such as COS-7 in combination with a humanized H chain needs to be examined to determine the activity.

（iii）ヒト型化抗体のH鎖及びL鎖V領域のFR shuffle
　本発明者は、作製したヒト型化H鎖及びL鎖V領域を含むヒト型化抗体をCOS-7のごとき動物細胞で一過性に発現させ、抗原結合活性及び中和活性について検討した結果、抗原結合活性及び中和活性を有するものの、キメラ抗体と比較して十分でないことがことが判明した。 (Iii) FR shuffle of V region of H chain and L chain of humanized antibody
The present inventors transiently expressed a humanized antibody containing the prepared humanized H chain and L chain V regions in animal cells such as COS-7 and examined the antigen binding activity and neutralizing activity. It has been found that it has an antigen-binding activity and a neutralizing activity, but is insufficient compared with a chimeric antibody.

　本発明者は、ヒト型化H鎖及びL鎖V領域の各FRを順次 shuffleすることにより、この問題を解決する事が出来る。FRの shuffleに用いるヒト抗体は、既存のデータベースより選択する事が出来る。選択したヒト抗体のFRは、データベースで明らかになっている塩基配列を基に、DNA合成機により合成することが出来る。この際、前記のように、CDRもしくはFRに設計した制限酵素認識配列を付加することにより、上記で作製したヒト型化抗体のH鎖及びL鎖V領域のFRと、容易に shuffleすることが出来る。このようにして作製したヒト型化抗体の活性を調べることにより、所望する抗原結合活性並びに中和活性を有するヒト型化抗体を得ることが出来る。 The present inventor can solve this problem by sequentially shuffling each FR of the humanized H chain and L chain V region. Human antibodies used for FR shuffle can be selected from existing databases. The FRs of the selected human antibody can be synthesized by a DNA synthesizer based on the nucleotide sequence identified in the database. At this time, as described above, by adding the designed restriction enzyme recognition sequence to the CDR or FR, it can be easily shuffled with the FRs of the H chain and L chain V regions of the humanized antibody prepared above. I can do it. By examining the activity of the humanized antibody thus prepared, a humanized antibody having desired antigen binding activity and neutralizing activity can be obtained.

　例えば、ヒト型化抗体V領域H鎖FR3をヒト抗体Z34963（GenBank, Borretzen M.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 91, 12917-12921, 1994）由来のFR3に shuffleする事が出来る。
　FR-シャッフリングプライマーF3RFFS（配列番号35）およびF3RFBS（配列番号36）はセンスDNA配列を有し、F3RFFA（配列番号37）およびF3RFBA（配列番号38）はアンチセンスDNA配列を有する。FR-シャッフリングプライマーF3RFFS、F3RFBS、F3RFFA、F3RFBAはDNA合成機で合成することが出来る。 For example, humanized antibody V region H chain FR3 can be shuffled to FR3 derived from human antibody Z34963 (GenBank, Borretzen M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12917-12921, 1994). .
FR-shuffling primers F3RFFS (SEQ ID NO: 35) and F3RFBS (SEQ ID NO: 36) have a sense DNA sequence, and F3RFFA (SEQ ID NO: 37) and F3RFBA (SEQ ID NO: 38) have an antisense DNA sequence. FR-shuffling primers F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA, and F3RFBA can be synthesized using a DNA synthesizer.

　F3RFFSとF3RFFA、F3RFBSとF3RFBAをアニールさせ、それぞれBalIおよびXhoI、NcoIおよびXhoIで消化した。これらをBalIおよびNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を確認することにより正しい配列を有するプラスミドを得ることが出来る。このようにして得られたヒト型化抗体H鎖を含むプラスミドをhATR5Hvb／CVIDECと命名し、プラスミドhATR5Hvb／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖をバージョン“b”とする。その塩基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号39に示し、バージョン“b”のアミノ酸配列を配列番号40に示す。 F3RFFS and F3RFFA, F3RFBS and F3RFBA were annealed and digested with BalI and XhoI, NcoI and XhoI, respectively. These are introduced into a plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting them with BalI and NcoI, and by confirming the nucleotide sequence, a plasmid having the correct sequence can be obtained. The thus obtained plasmid containing the humanized antibody H chain is designated as hATR5Hvb / CVIDEC, and the humanized H chain contained in the plasmid hATR5Hvb / CVIDEC is referred to as version "b". The nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence are shown in SEQ ID NO: 39, and the amino acid sequence of version "b" is shown in SEQ ID NO: 40.

　同様にして、データベースから選択した他のヒト抗体V領域H鎖およびL鎖由来のFRについても、ヒト型化抗体V領域H鎖及びL鎖のFRと shuffleすることが出来る。
　ヒト型化抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域のFRを shuffleするためのさらに好ましいヒト抗体を選択するためには、以下のようにして行うことが出来る。すなわち、ヒト型化抗体H鎖バージョン“b”とキメラ抗体L鎖の組み合わせでは、キメラ抗体あるいはマウス抗体と同等の中和活性を有する。しかしながら、ヒト型化抗体H鎖バージョン“b”とヒト型化抗体L鎖バージョン“a”との組み合わせでは、キメラ抗体あるいはマウス抗体より中和活性が低下している。 Similarly, other human antibody V region H and L chain-derived FRs selected from the database can be shuffled with the humanized antibody V region H and L chain FRs.
In order to select a more preferable human antibody for shuffling the FRs of the H chain V region and L chain V region of the humanized antibody, the following can be performed. That is, the combination of the humanized antibody H chain version “b” and the chimeric antibody L chain has a neutralizing activity equivalent to that of the chimeric or mouse antibody. However, the combination of the humanized antibody H chain version “b” and the humanized antibody L chain version “a” has a lower neutralizing activity than the chimeric antibody or the mouse antibody.

　このような場合に、FRをshuffleするため候補とするヒト抗体を選択するためには、例えば、ヒト型化抗体H鎖バージョン“b”のFR3（アクセッションNo.Z34963：配列番号115）に対する相同性検索を行い、この配列と相同性の高いヒト抗体を選択することが出来る。例えば、このようにして選択したヒト抗体H鎖V領域FR3では、U95239（配列番号122）やL03147（配列番号123）が挙げられる。
　このようにして作製したヒト型化抗体V領域H鎖のアミノ酸配列を表3及び表4に示し、そしてヒト型化抗体V領域L鎖のアミノ酸配列を表5に示す。 In such a case, in order to select a human antibody as a candidate for shuffling the FRs, for example, homology to FR3 (accession No. Z34963: SEQ ID NO: 115) of the humanized antibody H chain version “b” can be selected. By performing a sex search, a human antibody having high homology to this sequence can be selected. For example, the human antibody H chain V region FR3 thus selected includes U95239 (SEQ ID NO: 122) and L03147 (SEQ ID NO: 123).
The amino acid sequences of the humanized antibody V region H chain thus produced are shown in Tables 3 and 4, and the amino acid sequence of the humanized antibody V region L chain is shown in Table 5.

Figure 2004121253
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　前記のようにして構築したヒト型化抗体H鎖及びL鎖V領域各バージョンは、任意のヒト抗体H鎖C領域およびL鎖C領域、例えばそれぞれヒトH鎖Cγ4およびヒトL鎖Cκ領域のDNAと連結することができる。適当な制限酵素で処理した後、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒトH鎖Cγ4およびヒトL鎖Cκ領域をコードするDNAと連結し、ヒト型化H鎖及びL鎖V領域各バージョンをコードするDNAと、それぞれヒトH鎖Cγ4及びヒトL鎖Cκ領域をコードするDNAとを含む発現ベクターを作製する。 Each version of the humanized antibody H chain and L chain V region constructed as described above is any human antibody H chain C region and L chain C region, for example, DNA of human H chain Cγ4 and human L chain Cκ region, respectively. Can be connected. After treatment with an appropriate restriction enzyme, it is ligated to DNA encoding human H chain Cγ4 and human L chain Cκ region under an expression control region such as an enhancer / promoter system, and the humanized H chain and L chain V regions An expression vector containing DNA encoding each version and DNA encoding human H chain Cγ4 and human L chain Cκ region, respectively, is prepared.

　また、前記のようにして構築したヒト型化抗体H鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAと、ヒト型化L鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAとを、単一の発現ベクター（例えば、WO94／11523参照）に導入し、そして該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン-ビボ又はイン-ビトロで培養して目的とするヒト型化抗体を生産させることができる。 Further, the DNA encoding the humanized antibody H chain V region and human H chain C region and the DNA encoding the humanized L chain V region and human L chain C region constructed as described above are simply An expression vector (see, eg, WO 94/11523) is transformed into a host cell using the vector, and the transformed host is then cultured in vivo or in vitro. Can be produced.

5.キメラ抗体及びヒト型化抗体の製造
　キメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するためには、H鎖V領域及びH鎖C領域をコードするDNA、並びにL鎖V領域及びL鎖C領域をコードするDNAを単一ベクターに連結し、適当な宿主細胞を形質転換し、抗体を産生させることができる。すなわち、キメラ抗体の発現には、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、クローニングされたcDNAに存在するマウスリーダー配列並びにマウスH鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAと、マウスリーダー配列並びにマウスL鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAとを単一の発現ベクター（例えば、WO94／11523参照）に導入する。 5.Production of chimeric antibody and humanized antibody To produce a chimeric antibody or humanized antibody, DNA encoding the H chain V region and H chain C region, and the L chain V region and L chain C region The encoding DNA can be ligated into a single vector and transformed into a suitable host cell to produce an antibody. That is, the expression of the chimeric antibody encodes the mouse leader sequence, mouse H chain V region and human H chain C region present in the cloned cDNA under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system. The DNA and the DNA encoding the mouse leader sequence and the mouse L chain V region and human L chain C region are introduced into a single expression vector (see, for example, WO94 / 11523).

　ヒト型化抗体の発現には、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、ヒト型化H鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAと、ヒト型化L鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAとを単一の発現ベクター（例えば、WO94／11523参照）に導入する。そして、これらのベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこの形質転換された宿主をイン-ビボ又はイン-ビトロで培養して目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体を生産させる。 Expression of a humanized antibody is performed under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system, under the control of a DNA encoding a humanized H chain V region and a human H chain C region, and a humanized L chain V region. The region and the DNA encoding the human L chain C region are introduced into a single expression vector (see, for example, WO94 / 11523). Then, a host cell is transformed with these vectors, and the transformed host is cultured in vivo or in vitro to produce a desired chimeric antibody or humanized antibody.

　また、H鎖V領域およびL鎖V領域を含むそれぞれ2種類の発現ベクターを作製することが出来る。すなわち、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでマウスH鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウスL鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクターを作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとでヒト型化H鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクター、並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域のもとでヒト型化L鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含む発現ベクターを作製する。 In addition, two types of expression vectors each containing an H chain V region and an L chain V region can be prepared. That is, for a chimeric antibody, an expression vector containing DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system, and an expression vector such as an enhancer / promoter system. An expression vector containing DNAs encoding the mouse L chain V region and human L chain C region under the control region is prepared. For the humanized antibody, the expression is controlled by an expression control region such as an enhancer / promoter system. And an expression vector containing DNA encoding a humanized H chain V region and a human H chain C region, and a humanized L chain V region and a human L chain C region under an expression control region such as an enhancer / promoter system. An expression vector containing a DNA encoding is prepared.

　あるいはまた、キメラ抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、マウスH鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNA、並びにマウスL鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含んで成る発現ベクターを作製し、ヒト型化抗体については、エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域による制御のもとで、ヒト型化H鎖V領域及びヒトH鎖C領域をコードするDNA、並びにヒト型化L鎖V領域及びヒトL鎖C領域をコードするDNAを含んで成る発現ベクターを作製する。 Alternatively, for a chimeric antibody, DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region, and a mouse L chain V region and a human L chain under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system. An expression vector comprising a DNA encoding the C region is prepared, and the humanized antibody is subjected to humanized H chain V region and human H chain under the control of an expression control region such as an enhancer / promoter system. An expression vector comprising a DNA encoding a C region and DNAs encoding a humanized L chain V region and a human L chain C region is prepared.

　次に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞をイン-ビトロ又はイン-ビボで培養してキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造する（例えば、WO91／16928参照）。
　以上のようにして目的とするキメラ抗体又はヒト型化抗体をコードする遺伝子で形質転換した形質転換体を培養し、産生したキメラ抗体又はヒト型化抗体は、細胞内又は細胞外から分離し均一にまで精製することができる。 A host cell, such as a mammalian cell, is then co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo to produce a chimeric or humanized antibody (eg, , WO 91/16928).
The transformant transformed with the gene encoding the chimeric or humanized antibody of interest as described above is cultured, and the produced chimeric or humanized antibody is separated from the inside or outside of the cell and homogenized. Can be purified.

　本発明の目的蛋白質であるキメラ抗体又はヒト型化抗体の分離・精製を、プロテインAアガロースカラムを用いて行うことができる。また、その他に、通常の蛋白質で用いられる分離・精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば各種クロマトグラフィー、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組合せれば、キメラ抗体又はヒト型化抗体は分離・精製することができる。 キ メ ラ Separation and purification of the chimeric antibody or humanized antibody as the target protein of the present invention can be performed using a protein A agarose column. In addition, other separation / purification methods used for ordinary proteins may be used, and there is no particular limitation. For example, a chimeric antibody or a humanized antibody can be separated and purified by appropriately selecting and combining various chromatography, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like.

　ヒトTFに対する本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体を製造するために、任意の発現系を使用することができる。例えば、真核細胞を用いる場合は動物細胞（例えば樹立された哺乳類細胞系）、真糸状菌細胞又は酵母細胞などが挙げられ、原核細胞を用いる場合は細菌細胞（例えば大腸菌細胞等）などを使用することができる。好ましくは、本発明のキメラ抗体又はヒト型化抗体は哺乳類細胞、例えばCOS細胞又はCHO細胞中で発現される。 任意 Any expression system can be used to produce the chimeric antibody or humanized antibody of the present invention against human TF. For example, when eukaryotic cells are used, animal cells (for example, established mammalian cell lines) and eukaryotic fungal cells or yeast cells are used. When prokaryotic cells are used, bacterial cells (for example, E. coli cells and the like) are used. can do. Preferably, the chimeric or humanized antibodies of the invention are expressed in mammalian cells, such as COS cells or CHO cells.

　これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト・サイトメガロウィルス前期（human cytomegalovirus immediate early; HCMV）プロモーターを使用するのが好ましい。HCMVプロモーターを含有する発現ベクターの例には、HCMV-VH-HCγ1,HCMV-VL-HCK等であって、pSV2neoに由来するもの（WO92-19759）が含まれる。 In these cases, conventional promoters useful for expression in mammalian cells can be used. For example, it is preferable to use the human cytomegalovirus immediate early (HCMV) promoter. Examples of expression vectors containing the HCMV promoter include HCMV-VH-HCγ1, HCMV-VL-HCK and the like, which are derived from pSV2neo (WO92-19759).

　また、その他に、本発明のために用いることのできる哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとしては、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）などのウイルスプロモーターやヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・ファクター1α（HEF-1α）などの哺乳動物細胞由来のプロモーターを用いればよい。例えばSV40のプロモーターを使用する場合は、Mulliganらの方法（Nature, 277, 108, 1979）、また、HEF-1αプロモーターを使用する場合は、 Mizushima, S.らの方法（Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990）に従えば容易に実施することができる。 Other promoters for gene expression in mammalian cells that can be used for the present invention include viral promoters such as retrovirus, polyomavirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), and human polypeptides. A mammalian cell-derived promoter such as chain elongation factor 1α (HEF-1α) may be used. For example, when using the SV40 promoter, the method of Mulligan et al. (Nature, 277, 108, 1979), and when using the HEF-1α promoter, the method of Mizushima, S. et al. (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).

　複製起原としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、牛パピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができ、さらに宿主細胞系中での遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、ホスホトランスフェラーゼAPH（3′）II又はI（neo）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子等を含むことができる。 As the origin of replication, those derived from SV40, polyoma virus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV) and the like can be used. Further, the expression vector is selected for amplification of the gene copy number in the host cell system. Markers may include phosphotransferase APH (3 ') II or I (neo) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (DHFR) gene, etc. it can.

6.キメラ抗体及びヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性の評価
（1）ELISAによる抗体の濃度測定
　得られた精製抗体の濃度の測定は、ELISAにより行うことができる。
　抗体濃度測定のためのELISAプレートを次のようにして調製する。ELISA用96穴プレート（例えばMaxisorp, NUNC）の各穴を例えば1μg／mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを固相化する。 6. Evaluation of antigen binding activity and neutralizing activity of chimeric antibody and humanized antibody (1) Measurement of antibody concentration by ELISA The concentration of the obtained purified antibody can be measured by ELISA.
An ELISA plate for antibody concentration measurement is prepared as follows. 100 μl of a goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) prepared in a 96-well plate for ELISA (eg, Maxisorp, NUNC) at a concentration of, for example, 1 μg / ml is immobilized.

　200μlの希釈バッファー（以下、DBと称する。例えば50mM Tris-HCl、1mM MgCl2 、0.1M NaCl、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、1％牛血清アルブミン（BSA）、pH7.2）でブロッキングの後、キメラ抗体、若しくはヒト型化抗体を発現させたCOS-7細胞若しくはCHO細胞の培養上清、又は精製キメラ抗体、若しくはヒト型化抗体を段階希釈して各穴に加える。次にアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG抗体100μlを加え、1mg／mlの基質溶液（Sigma104、p-ニトロフェニルリン酸、SIGMA）を加え、次に405／655nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio Rad）で測定する。濃度測定のスタンダードとしてIgG4κ（The Binding Site）を用いることができる。 Blocking with 200 μl of a dilution buffer (hereinafter referred to as DB; for example, 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA), pH 7.2) Thereafter, the culture supernatant of COS-7 cells or CHO cells expressing the chimeric antibody or humanized antibody, or the purified chimeric antibody or humanized antibody is serially diluted and added to each well. Next, 100 μl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG antibody was added, 1 mg / ml of a substrate solution (Sigma104, p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured using a microplate reader (Bio Rad ). IgG4κ (The Binding Site) can be used as a standard for concentration measurement.

（2）抗原結合能の測定
　抗原結合測定のためのCell ELISAプレートでは、次のようにして調製する。ヒト膀胱癌細胞J82（ATCC HTB-1）を、細胞培養用96穴プレートの60穴に1×106 個の細胞数で播き込む。これをCO2 インキュベーターで1日培養し（10％の牛胎児血清（GIBCO）を含むRPMI1640培地）、細胞を接着させる。培養液を捨て、300μlのPBSで各穴を2回洗浄する。4％のパラホルムアルデヒドを含むPBS（以下、PFA／PBSと称す）を各穴に100μl加え、氷上で10分間静置し、細胞を固相化する。 (2) Measurement of antigen binding ability A Cell ELISA plate for antigen binding measurement is prepared as follows. Human bladder cancer cells J82 (ATCC HTB-1) are seeded at 1 × 10 6 cells into 60 wells of a 96-well plate for cell culture. This is cultured in a CO 2 incubator for one day (RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (GIBCO)) to allow the cells to adhere. Discard the culture medium and wash each well twice with 300 μl of PBS. 100 μl of PBS containing 4% paraformaldehyde (hereinafter referred to as PFA / PBS) is added to each well, and left still on ice for 10 minutes to immobilize the cells.

　PFA／PBSを捨て、300μlのPBSで各穴を2回洗浄後、250μlのDBでブロッキングする。キメラ抗体またはヒト型化抗体を含む培養上清、あるいは精製したキメラ抗体またはヒト型化抗体をDBにて段階希釈して100μlを各穴に加え、室温にて2時間インキュベートしRBで洗浄後、DBで1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを加える。室温にて1時間インキュベートしRBで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に405／655nmでの吸光度をマイクロプレートリーダー（Bio-Rad）で測定する。 捨 て Discard PFA / PBS, wash each well twice with 300 µl of PBS, and block with 250 µl of DB. Culture supernatant containing a chimeric or humanized antibody, or a purified chimeric or humanized antibody is serially diluted in DB, 100 μl is added to each well, incubated at room temperature for 2 hours, washed with RB, Add 100 μl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) diluted 1000-fold with DB. After incubating at room temperature for 1 hour and washing with RB, the substrate solution is added, and the absorbance at 405/655 nm is measured with a microplate reader (Bio-Rad).

（3）中和活性の測定
　マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S（Behringwerke AG）によるファクターXa産生阻害活性を指標に測定する事が出来る。すなわち、1.25mg／mlのThromborel S 10μlと適当な濃度に希釈した抗体10μlに緩衝液（5mMのCaCl2 、0.1％のBSAを含むTBS）60μlを加え、96穴プレート中で室温で1時間反応させる。 (3) Measurement of Neutralizing Activity Neutralizing activities of a mouse antibody, a chimeric antibody and a humanized antibody can be measured using the inhibitory activity of factor Xa production by human placenta-derived thromboplastin and Thromborel S (Behringwerke AG) as an index. That is, 10 μl of 1.25 mg / ml Thromborel S and 10 μl of an antibody diluted to an appropriate concentration are added with 60 μl of a buffer solution (TBS containing 5 mM CaCl 2 and 0.1% BSA) and reacted in a 96-well plate at room temperature for 1 hour. Let it.

　これに3.245μg／mlのヒトファクターX（セルサス・ラボラトリーズ）および82.5ng／mlのヒトファクターVIIa（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ10μl加え、さらに室温で1時間反応させる。0.5MのEDTAを10μl加え、反応を停止させ、発色基質溶液を50μl加え、Microplate Reader （Bio Rad）で405／655nmの吸光度を測定する。室温で1時間反応させ、再度405／655nmの吸光度を測定する。抗体無添加の1時間の吸光度変化を100％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出することにより、中和活性を測定する。 (4) To this, 10 μl of 3.245 μg / ml of human factor X (Celsus Laboratories) and 82.5 ng / ml of human factor VIIa (Enzyme Research) are added, and the mixture is further reacted at room temperature for 1 hour. 10 μl of 0.5 M EDTA is added to stop the reaction, 50 μl of a chromogenic substrate solution is added, and the absorbance at 405/655 nm is measured using a Microplate Reader (Bio Rad). The reaction is performed at room temperature for 1 hour, and the absorbance at 405/655 nm is measured again. The neutralization activity is measured by calculating the residual activity (%) from the change in absorbance assuming that the change in absorbance for 1 hour without addition of the antibody is 100%.

　発色基質溶液はテストチーム発色基質S-2222（Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、精製水で2倍希釈した後、ポリブレン液（0.6mg／ml ヘキサジメチリンブロマイド、SIGMA）と1：1で混和し調製する。 The chromogenic substrate solution was prepared by dissolving the test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) according to the package insert, diluting it twice with purified water, and mixing 1: 1 with a polybrene solution (0.6 mg / ml hexadimethylin bromide, SIGMA). And prepare.

7.ヒト型化抗体と可溶性TFとの相互作用による反応速度論的解析
　BIACOREによって本発明の抗TF抗体のkinetics parameter、すなわち解離定数（KD）、解離速度定数（kdiss）及び結合速度定数（kass）を測定することができる。
　組換型ProteinGをセンサーチップに固相化し、これに抗体を結合させ、抗原として精製した組換型TF（1-219にFLAGペプチドタグを付した可溶型TF）（以下、可溶型TFと称す）を用い、種々の濃度に調製した可溶型TFをアナライトとする。得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーター（解離速度定数kdiss及び結合速度定数kass）を算出することによって解離定数を求めることができる。速度論的解析に関しては、「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions witha new biosensor based analytical system 」（karlsson, R. et al.（1991）J. Immunol. Methods 145, 229-240.）などを参考にすることができる。 7. Kinetic analysis by interaction between humanized antibody and soluble TF By kinetics parameters of anti-TF antibody of the present invention, ie, dissociation constant (KD), dissociation rate constant (kdiss) and binding rate constant (kass ) Can be measured.
Recombinant Protein G was immobilized on a sensor chip, an antibody was bound to the sensor chip, and purified as an antigen. Recombinant TF (a soluble TF obtained by adding a FLAG peptide tag to 1-219) (hereinafter referred to as a soluble TF) TF), and soluble TF prepared at various concentrations is used as an analyte. The dissociation constant can be determined by calculating the kinetic parameters (dissociation rate constant kdiss and association rate constant kass) from the obtained sensorgram. For kinetic analysis, refer to “Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system” (karlsson, R. et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240.) can do.

　本発明の抗TF抗体は、解離定数（KD）が小さい値であるほど中和活性を有する点で好ましい。本発明の抗TF抗体において、KD値は2.30×10-8[1／M]以下であることが好ましく、2.30×10-9[1／M]以下であることがより好ましく、1.17×10-9[1／M]以下のものが最も好ましい。
　また、KD値は解離速度定数（kdiss）及び結合速度定数（kass）の2つのパラメーターから決定される（KD=kdiss／kass）。したがって、kdissの値が小さく、kassの値が大きければ、KD値が小さくなることは明らかである。 The anti-TF antibody of the present invention is preferable because the smaller the dissociation constant (KD), the more neutralizing activity it has. In the anti-TF antibody of the present invention, it is preferable that KD value is less 2.30 × 10 -8 [1 / M ], more preferably 2.30 × 10 -9 [1 / M ] or less, 1.17 × 10 - Most preferably 9 [1 / M] or less.
The KD value is determined from two parameters, a dissociation rate constant (kdiss) and an association rate constant (kass) (KD = kdiss / kass). Thus, it is clear that the smaller the value of kdiss and the larger the value of kass, the smaller the KD value.

　具体的には、本発明の抗TF抗体の場合、kdissの値が9.52×10-3[1／sec]以下であればよい。好ましくは、kdissの値が9.52×10-4[1／sec]以下であり、最も好ましくは6.35×10-4[1／sec]以下である。
　一方、kassの値は4.15×104 [1／M・sec]以上であればよい。好ましくは、kassの値が4.15×105 [1／M・sec]以上であり、最も好ましくは4.65×105 [1／M・sec]以上である。 Specifically, in the case of the anti-TF antibody of the present invention, the value of kdiss may be 9.52 × 10 −3 [1 / sec] or less. Preferably, the value of kdiss is 9.52 × 10 −4 [1 / sec] or less, and most preferably, it is 6.35 × 10 −4 [1 / sec] or less.
On the other hand, the value of kass may be 4.15 × 10 4 [1 / M · sec] or more. Preferably, the value of kass is at least 4.15 × 10 5 [1 / M · sec], and most preferably at least 4.65 × 10 5 [1 / M · sec].

　さらに、kdissの値が9.52×10-3[1／sec]以下であり、かつ、kassの値が4.15×104 [1／M・sec]以上の抗TF抗体も好ましい。
　さらに具体的には、本発明の抗TF抗体は、KD値が1.09×10-10 〜2.30×10-8[1／M]の範囲であり、1.09×10-9〜2.30×10-9[1／M]のものが好ましく、1.09×10-9〜1.39×10-9[1／M]のものが最も好ましい。 Further, an anti-TF antibody having a kdiss value of 9.52 × 10 −3 [1 / sec] or less and a kass value of 4.15 × 10 4 [1 / M · sec] or more is also preferable.
More specifically, the anti-TF antibody of the present invention has a KD value in the range of 1.09 × 10 −10 to 2.30 × 10 −8 [1 / M], and 1.09 × 10 −9 to 2.30 × 10 −9 [ 1 / M], and most preferably 1.09 × 10 −9 to 1.39 × 10 −9 [1 / M].

　また、kdiss値が5.06×10-4〜9.52×10-3[1／sec]の範囲であり、5.06×10-4〜9.52×10-4[1／sec]のものが好ましく、5.06×10-4〜6.49×10-4[1／sec]のものが最も好ましい。
　そしてkass値は、4.15×104 〜5.44×105 [1／M・sec]の範囲であり、4.15×105 〜5.44×105 [1／M・sec]のものが好ましく、4.65×105 〜5.44×105 [1／M・sec]のものが最も好ましい。
　これらのKD値、kdiss値及びkass値は、BIACORE以外にもスキャッチャード解析、あるいはBIACOREなどの表面プラズモン共鳴センサー等により得ることができるが、BIACOREを用いて得ることが好ましい。 In addition, the kdiss value is in the range of 5.06 × 10 −4 to 9.52 × 10 −3 [1 / sec], preferably 5.06 × 10 −4 to 9.52 × 10 −4 [1 / sec], and more preferably 5.06 × 10 −4 . -4 to 6.49 × 10 -4 [1 / sec] is most preferable.
The kass values are in the range of 4.15 × 10 4 ~5.44 × 10 5 [1 / M · sec], preferably has 4.15 × 10 5 ~5.44 × 10 5 [1 / M · sec], 4.65 × 10 Those with 5 to 5.44 × 10 5 [1 / M · sec] are most preferred.
These KD value, kdiss value and kass value can be obtained by Scatchard analysis or a surface plasmon resonance sensor such as BIACORE in addition to BIACORE, but it is preferably obtained using BIACORE.

8.ヒト型化抗体のヒトTFへの反応性の測定
　ドットブロットハイブリダイゼーション法によって、本発明のヒト型化抗体の非変性TF、非還元下変性TF、還元下変性TFへの反応性を検討することができる。 8. Measurement of the reactivity of the humanized antibody to human TF The reactivity of the humanized antibody of the present invention to non-denatured TF, non-denatured TF, and denatured TF is examined by dot blot hybridization. can do.

　TFはヒト組織より精製したもの、もしくはCHO細胞の哺乳動物細胞で発現させ精製したもの等を用い、検討できる。また、変性剤には尿素の代わりにグアニジン塩酸塩やSDS等を用いることができ、還元剤にはDTTの代わりに2-メルカプトエタノールなどのSH還元試薬を用いることもできる。ヒト型化抗体の検出には様々な物質で標識された抗ヒトIgG抗体を用いることができる。ここでいう標識物質は例えば、放射性物質、ビオチン、FITC等の蛍光物質、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素などである。本発明の抗TF抗体は、非変性TF、非還元下変性TFならびに還元下変性TFのいずれにも反応する。 TF can be examined using purified TF from human tissue, or expressed and purified from mammalian CHO cells. In addition, guanidine hydrochloride, SDS, or the like can be used instead of urea as the denaturing agent, and an SH reducing reagent such as 2-mercaptoethanol can be used as the reducing agent instead of DTT. For detection of a humanized antibody, anti-human IgG antibodies labeled with various substances can be used. The labeling substance here is, for example, a radioactive substance, biotin, a fluorescent substance such as FITC, or an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase. The anti-TF antibody of the present invention reacts with non-denatured TF, non-denatured TF under reduction, and denatured TF under reduction.

9.ヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びDIC治療剤
　ヒトTFに対するヒト型化抗体の治療効果を確認するには、ヒト型化抗ヒトTF抗体を高DIC症状を呈した動物に投与し、DICの指標を測定することによりその治療効果を確認することができる。
　本発明で使用される抗体は、ヒトTFに対するヒト型化された抗体である。この抗体は、ヒトTFに結合することにより、ヒトTFの活性を中和する抗体であり、特に、好ましくはヒト型化されたATR5抗体が挙げられる。ヒト型化ATR5抗体の作製方法は、実施例に記載されている。 9.Pharmaceutical composition containing humanized antibody as an active ingredient and therapeutic agent for DIC To confirm the therapeutic effect of humanized antibody on human TF, humanized anti-human TF antibody can be administered to animals with high DIC symptoms. The therapeutic effect can be confirmed by administering and measuring the index of DIC.
The antibody used in the present invention is a humanized antibody against human TF. This antibody is an antibody that neutralizes the activity of human TF by binding to human TF, and particularly preferred is a humanized ATR5 antibody. A method for producing a humanized ATR5 antibody is described in the Examples.

　本発明で使用される抗体は、塩析法、HPLC等を用いたゲル濾過法、プロテインAカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィー法等の通常の精製手段を組み合わせて高純度に精製することができる。このように精製された抗体は、放射免疫測定法（RIA）、酵素免疫測定法（EIA、ELISA）、あるいは蛍光抗体法（Immunofluorescence Analysis）等の通常の免疫学的手段により、高精度にヒトTFを認識することを確認できる。 The antibody used in the present invention can be purified to a high purity by a combination of ordinary purification means such as a salting-out method, a gel filtration method using HPLC or the like, and an affinity chromatography method using a protein A column or the like. . Antibodies purified in this manner can be purified with high precision by human immunological assays such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA, ELISA) or immunofluorescence analysis (Immunofluorescence Analysis). Can be confirmed.

　本発明のTFに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びDIC治療剤は、非経口的に全身又は局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.01mgから1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり10mg／body、好ましくは1〜1000mg／bodyの投与量を選ぶことができる。 The pharmaceutical composition and the therapeutic agent for DIC of the present invention containing a humanized antibody against TF as an active ingredient can be parenterally administered systemically or locally. For example, intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection can be selected, and the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient. The effective dose is selected in the range of 0.01 mg to 1000 mg per kg of body weight at a time. Alternatively, a dose of 10 mg / body, preferably 1-1000 mg / body per patient can be chosen.

　本発明のTFに対するヒト型化抗体を有効成分として含む医薬組成物及びDIC治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択されるが、これらに限定されるものではない。 医 薬 The pharmaceutical composition and the therapeutic agent for DIC of the present invention containing a humanized antibody against TF as an active ingredient may contain pharmaceutically acceptable carriers and additives depending on the administration route. Examples of such carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, sodium alginate, water-soluble dextran, Sodium carboxymethyl starch, pectin, methylcellulose, ethylcellulose, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, diglycerin, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), Mannitol, sorbitol, lactose, surfactants acceptable as pharmaceutical additives, and the like. The additives to be used are appropriately selected from the above or in combination according to the dosage form of the present invention, but are not limited thereto.

　本発明により、ヒトTFに対するキメラ抗体およびヒト型化抗体ならびにヒト型化抗体の作製方法が提供される。これらの抗体は、ヒトにおける抗原性が低いことから、治療薬として有用である。 The present invention provides a chimeric antibody, a humanized antibody, and a method for producing a humanized antibody against human TF. These antibodies are useful as therapeutics because of their low antigenicity in humans.

　次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例1.　ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のV領域をコードするDNAのクローニ　　　　　ング
（1）mRNAの調製
　ハイブリドーマATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5（IgG1κ）、ATR-7、及びATR-8（IgG2aκ）からmRNAをQuick Prep mRNA Purification Kit（Pharmacia Biotech）を用いて調製した。キット添付の処方に従い、それぞれのハイブリドーマ細胞を抽出緩衝液で完全にホモジナイズし、オリゴ（dT）-セルローススパンカラムにてmRNAを精製し、エタノール沈殿を行った。mRNA沈殿物を溶出緩衝液に溶解した。 Next, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
Example 1. Human TF DNA cloning of encoding the V region of mouse monoclonal antibody against (1) mRNA preparation hybridomas ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5 (IgG1κ), ATR-7, And ATR-8 (IgG2aκ) to prepare mRNA using Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotech). According to the prescription attached to the kit, each hybridoma cell was completely homogenized with an extraction buffer, and mRNA was purified with an oligo (dT) -cellulose span column, followed by ethanol precipitation. The mRNA precipitate was dissolved in the elution buffer.

（2）マウス抗体V領域をコードする遺伝子のcDNAの作製及び増幅
　（i）H鎖V領域cDNAのクローニング
　ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のH鎖V領域をコードする遺伝子のクローニングは、5′-RACE 法（Frohman, M.A.et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al.,Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989）により行った。5′-RACE法にはMarathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。 (2) Preparation and amplification of cDNA for gene encoding mouse antibody V region (i) Cloning of H chain V region cDNA Cloning of the gene encoding the H chain V region of mouse monoclonal antibody against human TF was performed by 5'-RACE Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989). For the 5'-RACE method, a Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH) was used, and the operation was performed according to the instructions attached to the kit.

　前記のようにして調製したmRNA約1μgを鋳型として、キット添付の cDNA synthesis primerを加え、逆転写酵素と42℃、60分間反応させることによりcDNAへの逆転写を行った。これをDNAポリメラーゼI、DNAリガーゼ、RNaseHで16℃、1.5時間、T4 DNAポリメラーゼで16℃、45分間反応させることにより、2本鎖cDNAを合成した。2本鎖cDNAをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。 (4) Using about 1 μg of the mRNA prepared as described above as a template, a cDNA synthesis primer attached to the kit was added thereto, and reverse transcription to cDNA was performed by reacting with reverse transcriptase at 42 ° C. for 60 minutes. This was reacted with DNA polymerase I, DNA ligase, and RNaseH at 16 ° C. for 1.5 hours and with T4 DNA polymerase at 16 ° C. for 45 minutes to synthesize double-stranded cDNA. The double-stranded cDNA was extracted with phenol and chloroform, and recovered by ethanol precipitation.

　T4 DNAリガーゼで16℃で一夜反応することにより、2本鎖cDNAの両端にcDNA アダプターを連結した。反応混合液は10mM Tricine-KOH（pH8.5）、0.1mM EDTA溶液で50倍に希釈した。これを鋳型としてPCRによりH鎖V領域をコードする遺伝子を増幅させた。5′-側プライマーにはキット添付のアダプタープライマー1を、3′-側プライマーにはMHC-G1プライマー（配列番号1）（ATR-2、ATR-3、ATR-4及びATR-5）あるいはMHC-G2aプライマー（配列番号2）（ATR-7及びATR-8）（S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991）を使用した。 C By reacting with T4 DNA ligase at 16 ° C overnight, cDNA adapters were ligated to both ends of the double-stranded cDNA. The reaction mixture was diluted 50-fold with a 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5), 0.1 mM EDTA solution. Using this as a template, the gene encoding the H chain V region was amplified by PCR. For the 5'-side primer, use the adapter primer 1 provided with the kit. For the 3'-side primer, use the MHC-G1 primer (SEQ ID NO: 1) (ATR-2, ATR-3, ATR-4 and ATR-5) or MHC-G1 primer. The -G2a primer (SEQ ID NO: 2) (ATR-7 and ATR-8) (ST Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991) was used.

　ATR-2、3、4及び5抗体H鎖V領域に対するPCR溶液は、100μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、30〜50pmoleのアダプタープライマー1並びにMHC-G1プライマー、及びcDNAアダプターを連結したcDNAの反応混合物1〜5μlを含有する。
　PCRはいずれもDNA Thermal Cycler 480 （Perkin-Elmer）を用い、94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、74℃にて1分間の温度サイクルで30回行った。 The PCR solution for the H region V region of the ATR-2, 3, 4, and 5 antibodies was 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100 in 100 μl. , 0.001% BSA, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), 30-50 pmole of adapter primer 1 and MHC-G1 primer, and cDNA adapter Contains 1-5 μl of the reaction mixture of ligated cDNA.
All PCRs were performed 30 times using a DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer) at a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute.

（ii）L鎖V領域cDNAのクローニング
　ヒトTFに対するマウスモノクローナル抗体のL鎖V領域をコードする遺伝子のクローニングは、5′-RACE 法（Frohman, M.A.etal., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989）により行った。5′-RACE法にはMarathon cDNA Amplification Kit（CLONTECH）を用い、操作はキット添付の処方に従って行った。前記のようにして調製したmRNA約1μgを鋳型としてcDNA合成プライマーを加え、逆転写酵素と42℃、60分間反応させることによりcDNAへの逆転写を行った。 (Ii) Cloning of L chain V region cDNA Cloning of the gene encoding the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human TF was performed by the 5'-RACE method (Frohman, MAetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. 17, 2919-2932, 1989). For the 5'-RACE method, a Marathon cDNA Amplification Kit (CLONTECH) was used, and the operation was performed according to the instructions attached to the kit. Using about 1 μg of the mRNA prepared as described above as a template, a cDNA synthesis primer was added thereto, and reacted with reverse transcriptase at 42 ° C. for 60 minutes to perform reverse transcription to cDNA.

　これをDNAポリメラーゼI、DNAリガーゼ、RNaseHで16℃、1.5時間、T4 DNAポリメラーゼで16℃、45分間反応させることにより、2本鎖cDNAを合成した。2本鎖cDNAをフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿により回収した。T4 DNAリガーゼで16℃で一夜反応することにより、2本鎖cDNAの両端にcDNA アダプターを連結した。反応混合液は10mM Tricine-KOH（pH8.5）、0.1mMEDTA溶液で50倍に希釈した。これを鋳型としてPCRによりL鎖V領域をコードする遺伝子を増幅させた。5′-側プライマーにはアダプタープライマー1を、3′-側プライマーにはMKCプライマー（配列番号3）（S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991）を使用した。 2 Double-stranded cDNA was synthesized by reacting this with DNA polymerase I, DNA ligase, and RNaseH for 1.5 hours at 16 ° C and with T4 DNA polymerase at 16 ° C for 45 minutes. The double-stranded cDNA was extracted with phenol and chloroform, and recovered by ethanol precipitation. By reacting overnight at 16 ° C. with T4 DNA ligase, a cDNA adapter was ligated to both ends of the double-stranded cDNA. The reaction mixture was diluted 50-fold with a 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5), 0.1 mM EDTA solution. Using this as a template, the gene encoding the L chain V region was amplified by PCR. Adapter primer 1 was used as the 5'-side primer, and MKC primer (SEQ ID NO: 3) (S.T.Jones, et al., Biotechnology, 9, 88-89, 1991) was used as the 3'-side primer.

　PCR溶液は、100μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、30〜50pmoleのアダプタープライマー1並びにMKCプライマー、及びcDNA アダプターを連結したcDNAの反応混合物1μlを含有する。 The PCR solution contained 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 100 μl) in 100 μl. dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), 30 to 50 pmole of adapter primer 1 and MKC primer, and 1 μl of a reaction mixture of cDNA ligated cDNA adapter.

　PCRはDNA Thermal Cycler 480 （Perkin-Elmer）を用い、94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、74℃にて1分間の温度サイクルで30回行った。 PCR was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 1 minute using DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer).

（3）PCR生成物の精製及び断片化
　前記のPCR反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したDNA断片をエタノール沈殿により回収した。DNA断片を制限酵素XmaI（New England Biolabs）により37℃で1時間消化した。XmaI消化混合物を2％から3％のNuSieve GTG アガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、H鎖V領域として約500bp長、L鎖V領域として約500bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、10mM Tris-HCl（pH8.0）、1mM EDTA溶液（以下、TEと称す）10μlに溶解した。 (3) Purification and fragmentation of PCR product The PCR reaction mixture was extracted with phenol and chloroform, and the amplified DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. The DNA fragment was digested with the restriction enzyme XmaI (New England Biolabs) at 37 ° C. for 1 hour. The XmaI digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 2% to 3% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts) and contained a DNA fragment of about 500 bp long as the H chain V region and about 500 bp long as the L chain V region. Agarose pieces were cut out. The agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragments were precipitated with ethanol, and then dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 10 μl of 1 mM EDTA solution (hereinafter referred to as TE).

　上記のようにして調製したマウスH鎖V領域及びL鎖V領域をコードする遺伝子を含むXmaI消化DNA断片と、XmaIで消化することにより調製したpUC19プラスミドベクターとをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。
　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。 The DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) was prepared by digesting the XmaI-digested DNA fragment containing the genes encoding the mouse H-chain V region and L-chain V region prepared as described above and the pUC19 plasmid vector prepared by digestion with XmaI. ) And allowed to react for 1 hour at 16 ° C. according to the attached prescription and ligated.
The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was left on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute.

　次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml アンピシリンを含むLB寒天培地（Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）（以下、LBA寒天培地と称す）上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。
　この形質転換体を50μg／ml アンピシリンを含有するLB培地（以下、LBA培地と称す）3mlあるいは4mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製し、塩基配列の決定を行った。 Then, after adding 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) and incubating at 37 ° C. for 1 hour, LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press) , 1989) (hereinafter, referred to as LBA agar medium), and incubated at 37 ° C overnight to obtain an E. coli transformant.
This transformant is cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml or 4 ml of an LB medium (hereinafter referred to as LBA medium) containing 50 μg / ml ampicillin, and plasmid DNA is obtained from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). Was prepared, and the nucleotide sequence was determined.

（4）マウス抗体V領域をコードする遺伝子の塩基配列決定
　前記のプラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）（配列番号4）及びM13 Primer RV（宝酒造）（配列番号5）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。 (4) Determination of the nucleotide sequence of the gene encoding the mouse antibody V region The DNA sequencer 373A (Perkin-Elmer) was prepared using the Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). ). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 4) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) (SEQ ID NO: 5) as sequencing primers, the sequence was determined by confirming the nucleotide sequence in both directions.

　こうして得られたハイブリドーマATR-2、ATR-3、ATR-4、ATR-5、ATR-7及びATR-8に由来するマウスH鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれATR-xHv／pUC19（x=2、3、4、5、7又は8）と命名し、そしてL鎖V領域をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれATR-xLv／pUC19（x=2、3、4、5、7又は8）と命名した。プラスミドATR-xHv／pUC19（x=2、3、4、5、7又は8）に含まれる各マウス抗体のH鎖V領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号6から11に、プラスミドATR-xLv／pUC19（x=2、3、4、5、7又は8）に含まれる各マウス抗体のL鎖V領域をコードする遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）をそれぞれ配列番号12から17に示す。 Plasmids containing the genes encoding the mouse H chain V regions derived from the hybridomas ATR-2, ATR-3, ATR-4, ATR-5, ATR-7 and ATR-8 thus obtained were respectively ATR-xHv / Plasmids named pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7, or 8) and containing the gene encoding the L chain V region were designated ATR-xLv / pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, , 7 or 8). The nucleotide sequence (including the corresponding amino acid sequence) of the gene encoding the H chain V region of each mouse antibody contained in the plasmid ATR-xHv / pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7, or 8) Nos. 6 to 11 show the nucleotide sequence of the gene encoding the L chain V region of each mouse antibody contained in the plasmid ATR-xLv / pUC19 (x = 2, 3, 4, 5, 7 or 8) (corresponding amino acid sequence Are shown in SEQ ID NOs: 12 to 17, respectively.

実施例2.　キメラ抗体の構築
　マウスATR-5抗体V領域をヒト抗体C領域に連結したキメラATR-5抗体を作製した。ATR-5抗体V領域をコードする遺伝子をヒト抗体C領域をコードする発現ベクターに連結することにより、キメラ抗体発現ベクターを構築した。 Example 2 Construction of Chimeric Antibody Chimeric ATR-5 antibody was prepared by linking the mouse ATR-5 antibody V region to the human antibody C region. A chimeric antibody expression vector was constructed by ligating the gene encoding the ATR-5 antibody V region to the expression vector encoding the human antibody C region.

（1）キメラ抗体H鎖V領域の構築
　ヒト抗体H鎖C領域をコードする発現ベクターに連結するために、ATR-5抗体H鎖V領域をPCR法により修飾した。5′-側プライマーch5HS（配列番号18）はV領域をコードするDNAの5′-末端にハイブリダイズし、且つKozakコンセンサス配列（Kozak, M.et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987）及び制限酵素SalIの認識配列を有するように設計した。3′-側プライマーch5HA（配列番号19）はJ領域をコードするDNAの3′-末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素NheIの認識配列を有するように設計した。 (1) Construction of chimeric antibody H chain V region The ATR-5 antibody H chain V region was modified by PCR to ligate it to an expression vector encoding the human antibody H chain C region. The 5'-primer ch5HS (SEQ ID NO: 18) hybridizes to the 5'-end of the DNA encoding the V region and has a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and a restriction enzyme SalI recognition sequence. The 3′-side primer ch5HA (SEQ ID NO: 19) was designed to hybridize to the 3′-end of the DNA encoding the J region and to have a recognition sequence for the restriction enzyme NheI.

　PCR溶液は、100μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、50pmoleのch5HSプライマー並びにch5HAプライマー、及び鋳型DNAとして1μlのプラスミドATR5Hv／pUC19を含有する。PCRはDNA Thermal Cycler 480 （Perkin-Elmer）を用い、94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、74℃にて1分間の温度サイクルで30回行った。 The PCR solution contained 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 100 μl) in 100 μl. dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), 50 pmole of ch5HS and ch5HA primers, and 1 μl of plasmid ATR5Hv / pUC19 as template DNA. PCR was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute using DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer).

　PCR反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したDNA断片をエタノール沈殿により回収した。DNA断片を制限酵素NheI（宝酒造）により37℃で1時間消化し、次いで制限酵素SalI（宝酒造）により37℃で1時間消化した。この消化混合物を3％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約450bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TE20μlに溶解した。 The PCR reaction mixture was extracted with phenol and chloroform, and the amplified DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. The DNA fragment was digested with the restriction enzyme NheI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour and then with the restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 3% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 450 bp was cut out. The agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in 20 μl of TE.

　クローニングベクターには制限酵素NheI、SalI及びSplI、BglIIの認識配列を導入した改変pUC19ベクター（以下、CVIDECと称す）を用いた。上記のようにして調製したマウスH鎖V領域をコードする遺伝子断片とNheI及びSalIで消化することにより調製したCVIDECベクターをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 改 変 A modified pUC19 vector (hereinafter, referred to as CVIDEC) into which recognition sequences for restriction enzymes NheI, SalI, SplI, and BglII were introduced was used as the cloning vector. The gene fragment encoding the mouse H chain V region prepared as described above and the CVIDEC vector prepared by digestion with NheI and SalI were used at 16 ° C. using DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions. The reaction was allowed to proceed for 1 hour and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このATR-5抗体H鎖V領域をコードする遺伝子を含有し、5′-側にSalI認識配列及びKozakコンセンサス配列、3′-側にNheI認識配列を持つプラスミドをchATR5Hv／CVIDECと命名した。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions. A plasmid containing the gene encoding the H region of the ATR-5 antibody H chain V region and having a SalI recognition sequence and a Kozak consensus sequence on the 5′-side and an NheI recognition sequence on the 3′-side was named chATR5Hv / CVIDEC.

（2）キメラ抗体L鎖V領域の構築
　ヒト抗体L鎖C領域をコードする発現ベクターに連結するために、ATR-5抗体L鎖V領域をPCR法により修飾した。5′-側プライマーch5LS（配列番号20）はV領域をコードするDNAの5′-末端にハイブリダイズし、且つKozakコンセンサス配列（Kozak, M.et al., J.Mol.Biol., 196, 947-950, 1987）及び制限酵素BglIIの認識配列を有するように設計した。3′-側プライマーch5LA（配列番号21）はJ領域をコードするDNAの3′-末端にハイブリダイズし、且つ制限酵素SplIの認識配列を有するように設計した。 (2) Construction of chimeric antibody L chain V region The ATR-5 antibody L chain V region was modified by PCR to ligate it to an expression vector encoding the human antibody L chain C region. The 5'-primer ch5LS (SEQ ID NO: 20) hybridizes to the 5'-end of the DNA encoding the V region and has a Kozak consensus sequence (Kozak, M. et al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, 1987) and a restriction enzyme BglII recognition sequence. The 3′-side primer ch5LA (SEQ ID NO: 21) was designed to hybridize to the 3′-end of the DNA encoding the J region and to have a recognition sequence for the restriction enzyme SplI.

　PCR溶液は、100μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、50pmoleのch5LSプライマー並びにch5LAプライマー、及び鋳型DNAとして1μlのプラスミドATR5Lv／pUC19を含有する。PCRはDNA Thermal Cycler 480 （Perkin-Elmer）を用い、94℃にて30秒間、55℃にて30秒間、74℃にて1分間の温度サイクルで30回行った。 The PCR solution contained 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 100 μl) in 100 μl. dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), 50 pmole of ch5LS and ch5LA primers, and 1 μl of plasmid ATR5Lv / pUC19 as template DNA. PCR was performed 30 times at a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, and 74 ° C. for 1 minute using DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer).

　PCR反応混合液をフェノール及びクロロホルムで抽出し、増幅したDNA断片をエタノール沈殿により回収した。DNA断片を制限酵素SplI（宝酒造）により37℃で1時間消化し、次いで制限酵素BglII（宝酒造）により37℃で1時間消化した。この消化混合物を3％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約400bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、20μlのTEに溶解した。 The PCR reaction mixture was extracted with phenol and chloroform, and the amplified DNA fragment was recovered by ethanol precipitation. The DNA fragment was digested with the restriction enzyme SplI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour and then with the restriction enzyme BglII (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 3% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 400 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, DNA fragments were precipitated with ethanol, and then dissolved in 20 μl of TE.

　上記のようにして調製したマウスL鎖V領域をコードする遺伝子断片とSplI及びBglIIで消化することにより調製したCVIDECベクターをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 The gene fragment encoding the mouse L chain V region prepared as described above and the CVIDEC vector prepared by digestion with SplI and BglII were used at 16 ° C. using DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions. The reaction was allowed to proceed for 1 hour and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このATR-5抗体L鎖V領域をコードする遺伝子を含有し、5′-側にBglII認識配列及びKozakコンセンサス配列、3′-側にSplI認識配列を持つプラスミドをchATR5Lv／CVIDECと命名した。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions. A plasmid containing the gene encoding the ATR-5 antibody L chain V region and having a BglII recognition sequence and a Kozak consensus sequence on the 5′-side and a SplI recognition sequence on the 3′-side was named chATR5Lv / CVIDEC.

（3）キメラ抗体発現ベクターの構築
　IDEC社より導入した抗体発現ベクターを用いてキメラ抗体発現ベクターを構築した。ベクターにはIgG1型抗体発現ベクターN5KG1（V）及びIgG4型抗体発現ベクターN5KG4Pを用いた。発現ベクターN5KG1（V）あるいはN5KG4Pのヒト抗体H鎖C領域の直前にあるSalI-NheI部位にATR-5のH鎖V領域をコードする遺伝子を、ヒト抗体L鎖C領域の直前にあるBglII-SplI部位にATR-5のL鎖V領域をコードする遺伝子を連結することによって、キメラATR-5抗体発現ベクターを作製した。 (3) Construction of chimeric antibody expression vector A chimeric antibody expression vector was constructed using the antibody expression vector introduced from IDEC. The vectors used were an IgG1-type antibody expression vector N5KG1 (V) and an IgG4-type antibody expression vector N5KG4P. At the SalI-NheI site immediately before the human antibody H chain C region of the expression vector N5KG1 (V) or N5KG4P, a gene encoding the ATR-5 H chain V region is inserted into the BglII-immediate region immediately before the human antibody L chain C region. A chimeric ATR-5 antibody expression vector was prepared by ligating a gene encoding the L chain V region of ATR-5 to the SplI site.

　（i）H鎖V領域の導入
　プラスミドchATR5Hv／CVIDECを制限酵素NheI（宝酒造）により37℃で3時間消化し、次いで制限酵素SalI（宝酒造）により37℃で3時間消化した。この消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約450bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TE20μlに溶解した。 (I) Introduction of H chain V region The plasmid chATR5Hv / CVIDEC was digested with the restriction enzyme NheI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours, and then with the restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours. This digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 450 bp was cut out. The agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in 20 μl of TE.

　発現ベクターN5KG1（V）及びN5KG4Pを制限酵素NheI（宝酒造）により37℃で3時間消化し、次いで制限酵素SalI（宝酒造）により37℃で3時間消化した。この消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約9000bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TE60μlに溶解した。 The expression vectors N5KG1 (V) and N5KG4P were digested with the restriction enzyme NheI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours and then with the restriction enzyme SalI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 3 hours. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 9000 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in 60 μl of TE.

　上記のようにして調製したH鎖V領域をコードする遺伝子を含むSalI-NheI DNA断片とSalI及びNheIで消化したN5KG1（V）あるいはN5KG4PをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 The SalI-NheI DNA fragment containing the gene encoding the H chain V region prepared as described above and N5KG1 (V) or N5KG4P digested with SalI and NheI were used with DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo), The reaction was carried out at 16 ° C. for 1 hour according to the prescription, and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。これらキメラATR-5抗体H鎖をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれchATR5Hv／N5KG1（V）、及びchATR5Hv／N5KG4Pと命名した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN). The plasmids containing the gene encoding the chimeric ATR-5 antibody H chain were named chATR5Hv / N5KG1 (V) and chATR5Hv / N5KG4P, respectively.

　（ii）L鎖V領域の導入
　プラスミドchATR5Lv／CVIDECを制限酵素BglII（宝酒造）及びSplI（宝酒造）により37℃で1.5時間消化した。この消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約400bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、20μlのTEに溶解した。 (Ii) Introduction of V region of L chain The plasmid chATR5Lv / CVIDEC was digested with restriction enzymes BglII (Takara Shuzo) and SplI (Takara Shuzo) for 1.5 hours at 37 ° C. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 400 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, DNA fragments were precipitated with ethanol, and then dissolved in 20 μl of TE.

　プラスミドchATR5Hv／N5KG1（V）及びchATR5Hv／N5KG4Pを制限酵素BglII（宝酒造）及びSplI（宝酒造）により37℃で1.5時間消化した。この消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約9400bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TE20μlに溶解した。 Plasmids chATR5Hv / N5KG1 (V) and chATR5Hv / N5KG4P were digested with restriction enzymes BglII (Takara Shuzo) and SplI (Takara Shuzo) for 1.5 hours at 37 ° C. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 9400 bp was cut out. The agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in 20 μl of TE.

　上記のようにして調製したL鎖V領域をコードする遺伝子を含むSplI-BglII DNA断片とSplI及びBglIIで消化したchATR5Hv／N5KG1（V）あるいはchATR5Hv／N5KG4PをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 The SplI-BglII DNA fragment containing the gene encoding the L chain V region prepared as described above, and chATR5Hv / N5KG1 (V) or chATR5Hv / N5KG4P digested with SplI and BglII were ligated with DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo). The reaction was carried out at 16 ° C. for 1 hour according to the attached prescription, and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体を50μg／ml アンピシリンを含有する2×YT培地1lで37℃にて一夜培養し、菌体画分からPlasmid Maxi Kit（QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。これらキメラATR-5抗体をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれchATR5／N5KG1（V）、chATR5／N5KG4Pと命名した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . This transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 1 liter of 2 × YT medium containing 50 μg / ml ampicillin, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). Plasmids containing the genes encoding these chimeric ATR-5 antibodies were named chATR5 / N5KG1 (V) and chATR5 / N5KG4P, respectively.

（4）COS-7細胞へのトランスフェクション
　キメラ抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをCOS-7細胞にトランスフェクションし、キメラ抗体を一過性に発現させた。
　プラスミドchATR5／N5KG1（V）あるいはchATR5／N5KG4PをGene Pulser装置（Bio Rad）を用いてエレクトロポレーションによりCOS-7細胞に形質導入した。ダルベッコPBS（-）（以下、PBSと称す）中に1x107 細胞／mlの細胞濃度で懸濁されているCOS-7細胞0.78mlに、プラスミド50μgを加え、1,500V,25μFの静電容量にてパルスを与えた。 (4) Transfection into COS-7 cells To evaluate the antigen binding activity and neutralizing activity of the chimeric antibody, the expression plasmid was transfected into COS-7 cells, and the chimeric antibody was transiently expressed.
The plasmid chATR5 / N5KG1 (V) or chATR5 / N5KG4P was transduced into COS-7 cells by electroporation using a Gene Pulser apparatus (Bio Rad). To 0.78 ml of COS-7 cells suspended at a cell concentration of 1 × 10 7 cells / ml in Dulbecco's PBS (-) (hereinafter referred to as PBS), add 50 μg of plasmid, and adjust the capacitance to 1,500 V, 25 μF. To give a pulse.

　室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を5％の Ultra Low IgGウシ胎児血清（GIBCO）を含有するDMEM培地（GIBCO）に懸濁し、10cm培養皿を用いてCO2 インキュベーターにて培養した。24時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地HBCHO（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに72時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。 After a 10 minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were suspended in DMEM medium (GIBCO) containing 5% Ultra Low IgG fetal calf serum (GIBCO), and the CO was removed using a 10 cm culture dish. The cells were cultured in two incubators. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was removed by suction, and a serum-free medium HBCHO (Irvine Scientific) was newly added. After a further 72 hours of culture, the culture supernatant was collected and cell debris was removed by centrifugation.

（5）抗体の精製
　COS-7細胞の培養上清からキメラ抗体を、rProtein A Sepharose Fast Flow（Pharmacia Biotech）を用いて以下のように精製した。
　1mlのrProtein A Sepharose Fast Flowをカラムに充填し、10倍量のTBSを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにCOS-7細胞の培養上清をアプライした後、10倍量のTBSによってカラムを洗浄した。 (5) Purification of Antibody A chimeric antibody was purified from the culture supernatant of COS-7 cells using rProtein A Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech) as follows.
The column was packed with 1 ml of rProtein A Sepharose Fast Flow, and the column was equilibrated by flowing 10 volumes of TBS. After applying the culture supernatant of COS-7 cells to the equilibrated column, the column was washed with 10 times the amount of TBS.

　次に、13.5mlの2.5mM HCl（pH3.0）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出し、直ちに1.5mlの1M Tris-HCl（pH8.0）を加えることによって溶出液を中和した。
　精製された抗体画分について、セントリプレップ100（Amicon）を用いた限外濾過を2回行うことにより、150mM NaClを含む50mM Tris-HCl（pH7.6）（以下、TBSと称す）に溶媒を置換し、最終的に約1.5mlまで濃縮した。 Next, the adsorbed antibody fraction was eluted from the column by flowing 13.5 ml of 2.5 mM HCl (pH 3.0), and the eluate was immediately added by adding 1.5 ml of 1 M Tris-HCl (pH 8.0). Summed up.
The purified antibody fraction was subjected to ultrafiltration twice using Centriprep 100 (Amicon), whereby a solvent was added to 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 150 mM NaCl (hereinafter referred to as TBS). And finally concentrated to about 1.5 ml.

（6）CHO安定産生細胞株の樹立
　キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、CHO-S-SFMII無血清培地（GIBCO） に馴化したCHO細胞（DG44）に前記発現プラスミドを導入した。 (6) Establishment of a stable cell line for producing CHO In order to establish a cell line for stable production of chimeric antibodies, the above-mentioned expression plasmid was introduced into CHO cells (DG44) conditioned to a CHO-S-SFMII serum-free medium (GIBCO).

　プラスミドchATR5／N5KG1（V）あるいはchATR5／N5KG4Pを制限酵素SspI（宝酒造）で切断して直鎖状DNAにし、フェノール及びクロロホルムで抽出の後、エタノール沈殿でDNAを回収した。直鎖状にしたプラスミドをGene Pulser装置（Bio Rad）を用いてエレクトロポレーションによりDG44細胞に形質導入した。PBS中に1x107 細胞／mlの細胞濃度で懸濁されているDG44細胞0.78mlに、プラスミド10μgを加え、1,500V,25μFの静電容量にてパルスを与えた。 Plasmid chATR5 / N5KG1 (V) or chATR5 / N5KG4P was cut with a restriction enzyme SspI (Takara Shuzo) into linear DNA, extracted with phenol and chloroform, and recovered by ethanol precipitation. The linearized plasmid was transduced into DG44 cells by electroporation using a Gene Pulser apparatus (Bio Rad). To 0.78 ml of DG44 cells suspended at a cell concentration of 1 × 10 7 cells / ml in PBS, 10 μg of the plasmid was added, and pulsed with a capacitance of 1,500 V and 25 μF.

　室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞をヒポキサンチン・チミジン（GIBCO）を含有するCHO-S-SFMII培地（GIBCO）に懸濁し、2枚の96穴プレート（Falcon）を用いてCO2 インキュベーターにて培養した。培養開始翌日に、ヒポキサンチン・チミジン（GIBCO）及び500μg／ml GENETICIN （G418Sulfate、GIBCO）を含有するCHO-S-SFMII培地（GIBCO）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。選択培地交換後、2週間前後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、後述の抗体濃度測定ELISAにて抗体産生量を測定し、抗体産生量の多い細胞を選別した。 After a 10-minute recovery period at room temperature, the electroporated cells were suspended in CHO-S-SFMII medium (GIBCO) containing hypoxanthine / thymidine (GIBCO), and two 96-well plates (Falcon ) And cultured in a CO 2 incubator. On the day after the start of the culture, the cells were replaced with a selection medium of CHO-S-SFMII medium (GIBCO) containing hypoxanthine / thymidine (GIBCO) and 500 μg / ml GENETICIN (G418Sulfate, GIBCO), and cells into which the antibody gene was introduced were selected. did. After replacing the selective medium, observe the cells under a microscope about 2 weeks, and after successful cell growth is observed, measure the amount of antibody production by the antibody concentration measurement ELISA described below to select cells with high antibody production did.

実施例3.　ヒト型化抗体の構築
（1）ヒト型化抗体H鎖の構築
（i）ヒト型化H鎖バージョン“a”の構築
　ヒト型化ATR-5抗体H鎖を、PCR法によるCDR-グラフティングにより作製した。ヒト抗体L39130（DDBJ, Gao L.ら、未発表、1995）由来のFRを有するヒト型化ATR-5抗体H鎖バージョン“a”の作製のために7個のPCRプライマーを使用した。CDR-グラフティングプライマーhR5Hv1S（配列番号22）、hR5Hv2S（配列番号23）及びhR5Hv4S（配列番号24）はセンスDNA配列を有し、そしてCDRグラフティングプライマーhR5Hv3A（配列番号25）及びhR5Hv5A（配列番号26）はアンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端に18-35bpの相補的配列を有する。 Example 3. Construction of humanized antibody (1) Construction of humanized antibody H chain (i) Construction of humanized H chain version "a" Humanized ATR-5 antibody H chain was subjected to CDR by PCR. -Made by grafting. Seven PCR primers were used to generate a humanized ATR-5 antibody heavy chain version "a" with FRs from human antibody L39130 (DDBJ, Gao L. et al., Unpublished, 1995). CDR-grafting primers hR5Hv1S (SEQ ID NO: 22), hR5Hv2S (SEQ ID NO: 23) and hR5Hv4S (SEQ ID NO: 24) have a sense DNA sequence, and CDR-grafting primers hR5Hv3A (SEQ ID NO: 25) and hR5Hv5A (SEQ ID NO: 26) ) Has an antisense DNA sequence and each has a complementary sequence of 18-35 bp at each end of the primer.

　hR5Hv1SはKozakコンセンサス配列（Kozak,M,ら、J.Mol.Biol.196,947-950,1987）及びSalI認識部位を有するように、またhR5Hv5AはNheI認識部位を有するように設計した。また外部プライマーhR5HvPrS（配列番号27）はCDRグラフティングプライマーhR5Hv1Sと、hR5HvPrA（配列番号28）はCDRグラフティングプライマーhR5Hv5Aとホモロジーを有する。
　CDR-グラフティングプライマーhR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv3A、hR5Hv4S及びhR5Hv5A、ならびに外部プライマーhR5HvPrS及びhR5HvPrAはPharmacia Biotechにより合成及び精製された。 hR5Hv1S was designed to have a Kozak consensus sequence (Kozak, M, et al., J. Mol. Biol. 196, 947-950, 1987) and a SalI recognition site, and hR5Hv5A was designed to have a NheI recognition site. The external primer hR5HvPrS (SEQ ID NO: 27) has homology with the CDR grafting primer hR5Hv1S, and the hR5HvPrA (SEQ ID NO: 28) has homology with the CDR grafting primer hR5Hv5A.
CDR-grafting primers hR5Hv1S, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S and hR5Hv5A, and external primers hR5HvPrS and hR5HvPrA were synthesized and purified by Pharmacia Biotech.

　PCRは、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、98μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、CDR-グラフティングプライマーhR5Hv1S、hR5Hv2S、hR5Hv3A、hR5Hv4S及びhR5Hv5Aをそれぞれ5pmoleを含む条件で添付緩衝液を使用して94℃にて30秒間、50℃にて1分間、72℃にて1分間の温度サイクルで5回行い、さらに100pmoleの外部プライマーhR5HvPrS及びhR5HvPrAを加え、100μlの系で同じ温度サイクルを25回行った。PCR法により増幅したDNA断片を2％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。 PCR was performed using KOD DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) in 98 μl of 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 0.2% mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), CDR-grafting primers hR5Hv1S, hR5Hv2S, hR5Hv3A, hR5Hv4S and hR5Hv5S each containing 5 pmole with buffer and 5pmole attached Perform the solution 5 times with a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, further add 100 pmole of external primers hR5HvPrS and hR5HvPrA, and add the same temperature in 100 μl system The cycle was performed 25 times. DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 2% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

　約430bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、3倍量（ml／g）のTEを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、その3分の1量を水17μlに溶解した。得られたPCR反応混合物をNheI及びSalIで消化し、NheI及びSalIで消化することにより調製したプラスミドベクターCVIDECに、DNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い添付の処方に従って反応させ連結した。 (4) An agarose piece containing a DNA fragment of about 430 bp was excised, 3 times (ml / g) of TE was added, and the DNA fragment was purified by phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction. After the purified DNA was precipitated with ethanol, one third of the amount was dissolved in 17 μl of water. The obtained PCR reaction mixture was digested with NheI and SalI, and ligated to a plasmid vector CVIDEC prepared by digesting with NheI and SalI, using a DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) according to the attached protocol.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions.

　EcoT22I認識部位の前もしくは後に変異、欠失が認められたため、それぞれ正しい配列を有する断片を連結して再度CVIDECにサブクローニングし、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hva／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hva／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“a”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号29に示す。また、バージョン“a”のアミノ酸配列を配列番号30に示す。 変 異 Since mutations or deletions were found before or after the EcoT22I recognition site, fragments having the correct sequence were ligated, subcloned again into CVIDEC, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hATR5Hva / CVIDEC. SEQ ID NO: 29 shows the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version "a" contained in plasmid hATR5Hva / CVIDEC. In addition, the amino acid sequence of version “a” is shown in SEQ ID NO: 30.

　（ii）ヒト型化H鎖バージョン“b”及び“c”の構築
　バージョン“b”及び“c”をFR-シャッフリング法によってバージョン“a”のFR3を別のヒト抗体由来のFR3に置換し作製した。バージョン“b”ではFR3をヒト抗体Z34963 （DDBJ、Borretzen M.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 91, 12917-12921, 1994）由来のものに置換するため、FR3をコードするDNAプライマーを4個作製した。FR-シャッフリングプライマーF3RFFS（配列番号31）及びF3RFBS（配列番号32）はセンスDNA配列を有し、F3RFFA（配列番号33）及びF3RFBA（配列番号34）はアンチセンスDNA配列を有する。 (Ii) Construction of humanized H chain versions "b" and "c" Versions "b" and "c" were prepared by substituting FR3 of version "a" with FR3 derived from another human antibody by FR-shuffling method did. In version "b", a DNA primer encoding FR3 to replace FR3 with that derived from human antibody Z34963 (DDBJ, Borretzen M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12917-12921, 1994). Were produced. FR-shuffling primers F3RFFS (SEQ ID NO: 31) and F3RFBS (SEQ ID NO: 32) have a sense DNA sequence, and F3RFFA (SEQ ID NO: 33) and F3RFBA (SEQ ID NO: 34) have an antisense DNA sequence.

　F3RFFSとF3RFFAは互いに相補的な配列を有し、両端にBalI及びXhoIの認識配列を有する。バージョン”c”ではFR3をヒト抗体P01825（SWISS-PROT、Poljak RJ.ら, Biochemistry, 16, 3412-3420, 1977）由来のものに置換するため、FR3をコードするDNAプライマーを4個作製した。FR-シャッフリングベクターF3NMFS（配列番号35）及びF3NMBS（配列番号36）はセンスDNA配列を有し、F3NMFA（配列番号37）及びF3NMBA（配列番号38）はアンチセンスDNA配列を有する。F3RFBSとF3RFBAは互いに相補的な配列を有し、両端にXhoI及びNcoIの認識配列を有する。 F3RFFS and F3RFFA have sequences complementary to each other, and have BalI and XhoI recognition sequences at both ends. In version "c", four DNA primers encoding FR3 were prepared to replace FR3 with that derived from human antibody P01825 (SWISS-PROT, Poljak RJ. Et al., Biochemistry, 16, 3412-3420, 1977). The FR-shuffling vectors F3NMFS (SEQ ID NO: 35) and F3NMBS (SEQ ID NO: 36) have a sense DNA sequence, and F3NMFA (SEQ ID NO: 37) and F3NMBA (SEQ ID NO: 38) have an antisense DNA sequence. F3RFBS and F3RFBA have complementary sequences to each other, and have XhoI and NcoI recognition sequences at both ends.

　F3RFFS、F3RFBS、F3RFFA、F3RFBA、F3NMFS、F3NMBS、F3NMFA及びF3NMBAはPharmacia Biotechにより合成された。F3RFFSとF3RFFA、F3RFBSとF3RFBAをアニールさせ、それぞれBalI及びXhoI、NcoI及びXhoIで消化した。これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvb／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvb／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“b”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号39に示す。また、バージョン“b”のアミノ酸配列を配列番号40に示す。 F3RFFS, F3RFBS, F3RFFA, F3RFBA, F3NMFS, F3NMBS, F3NMFA and F3NMBA were synthesized by Pharmacia Biotech. F3RFFS and F3RFFA, F3RFBS and F3RFBA were annealed and digested with BalI and XhoI, NcoI and XhoI, respectively. These were introduced into plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting them with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hATR5Hvb / CVIDEC. SEQ ID NO: 39 shows the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version "b" contained in plasmid hATR5Hvb / CVIDEC. In addition, the amino acid sequence of version “b” is shown in SEQ ID NO: 40.

　F3NMFSとF3NMFA、F3NMBSとF3NMBAをアニールさせ、それぞれBalI及びXhoI、NcoI及びXhoIで消化した。これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvc／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvc／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“c”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号41に示す。また、バージョン“c”のアミノ酸配列を配列番号42に示す。 F3NMFS and F3NMFA, F3NMBS and F3NMBA were annealed and digested with BalI and XhoI, NcoI and XhoI, respectively. These were introduced into plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting them with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hATR5Hvc / CVIDEC. SEQ ID NO: 41 shows the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version "c" contained in plasmid hATR5Hvc / CVIDEC. The amino acid sequence of version “c” is shown in SEQ ID NO: 42.

（iii）ヒト型化H鎖バージョン“d”及び“e”の構築
　バージョン“d”及び“e”をFR-シャッフリング法によってバージョン“a”のFR3を別のヒト抗体由来のFR3に置換し作製した。バージョン”d”ではFR3をヒト抗体M62723 （DDBJ、Pascual V.ら, J.Clin.Invest., 86, 1320-1328, 1990）由来のものに置換するため、FR3をコードするDNAプライマーを4個作製した。FR-シャッフリングプライマーF3EPS（配列番号43）はセンスDNA配列を有し、F3EPA（配列番号44）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。 (Iii) Construction of humanized H chain versions "d" and "e" Prepare version "d" and "e" by substituting FR3 of version "a" with FR3 derived from another human antibody by FR-shuffling method did. In version "d", four DNA primers encoding FR3 were used to replace FR3 with that derived from human antibody M62723 (DDBJ, Pascual V. et al., J. Clin. Invest., 86, 1320-1328, 1990). Produced. FR-shuffling primer F3EPS (SEQ ID NO: 43) has a sense DNA sequence, F3EPA (SEQ ID NO: 44) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has a complementary sequence of 18 bp.

　また外部プライマーF3PrS（配列番号45）及びF3PrA（配列番号46）はFR-シャッフリングプライマーF3EPS及びF3EPAとホモロジーを有し、他のFR3のシャッフリングにも用いることができる。バージョン“e”ではFR3をヒト抗体Z80844（DDBJ、Thomsett AR.ら,unpublished）由来のものに置換するため、FR3をコードするDNAプライマーを2個作製した。FR-シャッフリングプライマーF3VHS（配列番号47）はセンスDNA配列を有し、F3VHA（配列番号48）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。F3EPS、F3EPA、F3PrS、F3PrA、F3VHS及びF3VHAは Pharmacia Biotechにより合成された。 The external primers F3PrS (SEQ ID NO: 45) and F3PrA (SEQ ID NO: 46) have homology to FR-shuffling primers F3EPS and F3EPA, and can be used for shuffling other FR3. In version "e", two DNA primers encoding FR3 were prepared to replace FR3 with that derived from human antibody Z80844 (DDBJ, Thomsett AR. Et al., Unpublished). FR-shuffling primer F3VHS (SEQ ID NO: 47) has a sense DNA sequence, F3VHA (SEQ ID NO: 48) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has a complementary sequence of 18 bp. F3EPS, F3EPA, F3PrS, F3PrA, F3VHS and F3VHA were synthesized by Pharmacia Biotech.

　PCRは、KOD DNA Polymerase（東洋紡績）を用い、100μlの反応混合液に1μMのFR-シャッフリングプライマーF3EPSとF3EPA、又はF3VHSとF3VHAをそれぞれ5μl、0.2mMのdNTPs、1.0mMのMgCl2 、2.5UのKOD DNAポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して94℃にて30秒間、50℃にて1分間、74℃にて1分間の温度サイクルで5回行い、さらに100pmoleの外部プライマーF3PrS及びF3PrAを加え、同じ温度サイクルを25回行った。 PCR is, KOD DNA Polymerase (Toyobo) using a reaction mixture to 1μM of FR- shuffling primers F3EPS and F3EPA of 100 [mu] l, or F3VHS and F3VHA, respectively 5 [mu] l, 0.2 mM of dNTPs, MgCl 2 of 1.0 mM, 2.5 U Performed 5 times at a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, and 74 ° C. for 1 minute using the attached buffer under conditions including KOD DNA polymerase, and further performed with 100 pmole of external primer F3PrS F3PrA was added and the same temperature cycle was performed 25 times.

　PCR法により増幅したDNA断片を2％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。424bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、3倍量（ml／g）のTEを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、その3分の1量を水14μlに溶解した。得られたPCR反応混合物をBalI及びNcoIで消化し、これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。 (4) The DNA fragment amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 2% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products). A piece of agarose containing a 424 bp long DNA fragment was cut out, 3 times (ml / g) of TE was added, and the DNA fragment was purified by phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction. After the purified DNA was precipitated with ethanol, one third of the amount was dissolved in 14 μl of water. The obtained PCR reaction mixture was digested with BalI and NcoI, introduced into a plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting these with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined.

　正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvd／CVIDEC及びhATR5Hve／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvd／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“d”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号49に、バージョン“d”のアミノ酸配列を配列番号50に示す。また、プラスミドhATR5Hve／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“e”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号51に、バージョン“e”のアミノ酸配列を配列番号52に示す。 プ ラ ス ミ ド Plasmids having the correct sequence were designated as hATR5Hvd / CVIDEC and hATR5Hve / CVIDEC. The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version “d” contained in plasmid hATR5Hvd / CVIDEC are shown in SEQ ID NO: 49, and the amino acid sequence of version “d” is shown in SEQ ID NO: 50. In addition, the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version “e” contained in plasmid hATR5Hve / CVIDEC are shown in SEQ ID NO: 51, and the amino acid sequence of version “e” is shown in SEQ ID NO: 52.

（iv）ヒト型化H鎖バージョン“f”及び“g”の構築
　バージョン“f”及び“g”はFR-シャッフリング法によってバージョン“a”のFR3を別のヒト抗体由来のFR3に置換し作製した。バージョン“f”はヒト抗体L04345 （DDBJ、Hillson JL. ら, J.Exp.Med., 178, 331-336, 1993）由来のFR3に、バージョン“g”はS78322 （DDBJ、Bejcek BE.ら, Cancer Res., 55, 2346-2351, 1995）由来のFR3に置換するためFR3をコードするプライマーを2個ずつ合成した。バージョン“f”のFR-シャッフリングプライマーF3SSS（配列番号53）はセンスDNA配列を有し、F3SSA（配列番号54）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。 (Iv) Construction of humanized H chain versions "f" and "g" Versions "f" and "g" were prepared by replacing FR3 of version "a" with FR3 derived from another human antibody by the FR-shuffling method. did. Version “f” is FR3 from human antibody L04345 (DDBJ, Hillson JL. Et al., J. Exp. Med., 178, 331-336, 1993), and version “g” is S78322 (DDBJ, Bejcek BE. Et al. Cancer Res., 55, 2346-2351, 1995), and two primers encoding FR3 were synthesized to replace FR3. Version “f” of FR-shuffling primer F3SSS (SEQ ID NO: 53) has a sense DNA sequence, F3SSA (SEQ ID NO: 54) has an antisense DNA sequence, and the 3′-end of the primer has a complementary sequence of 18 bp. Having.

　バージョン“g”のFR-シャッフリングプライマーF3CDS（配列番号55）はセンスDNA配列を有し、F3CDA（配列番号56）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。F3SSS、F3SSA、F3CDS及びF3CDAは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。PCRは、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、100μlの反応混合液に1μMのFR-シャッフリングプライマーF3SSS及びF3SSAもしくはF3CDS及びF3CDAをそれぞれ5μlずつ、0.2mMのdNTPs、1.0mMのMgCl2、2.5UのKOD DNAポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して94℃にて30秒間、50℃にて1分間、74℃にて1分間の温度サイクルで5回行い、さらに100pmoleの外部プライマーF3PrS及びF3PrAを加え、同じ温度サイクルを25回行った。 Version "g" of FR-shuffling primer F3CDS (SEQ ID NO: 55) has a sense DNA sequence, F3CDA (SEQ ID NO: 56) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has an 18 bp complementary sequence. Having. F3SSS, F3SSA, F3CDS and F3CDA were synthesized and purified by Pharmacia Biotech. PCR, using KOD DNA polymerase (Toyobo), 5 μl each of 1 μM FR-shuffling primer F3SSS and F3SSA or F3CDS and F3CDA in 100 μl reaction mixture, 0.2 mM dNTPs, 1.0 mM MgCl2, 2.5 U Performed 5 times at a temperature cycle of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 1 minute, and 74 ° C for 1 minute using the attached buffer under conditions including KOD DNA polymerase, and further performed with 100 pmole of external primers F3PrS and F3PrA. And the same temperature cycle was performed 25 times.

　PCR法により増幅したDNA断片を2％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。424bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、3倍量（ml／g）のTEを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、その3分の1量を水14μlに溶解した。得られたPCR反応混合物をBalI及びNcoIで消化し、これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。 DNA DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 2% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products). An agarose piece containing a 424 bp long DNA fragment was cut out, 3 times (ml / g) of TE was added, and the DNA fragment was purified by phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction. After the purified DNA was precipitated with ethanol, one third of the amount was dissolved in 14 μl of water. The obtained PCR reaction mixture was digested with BalI and NcoI, introduced into a plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting these with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined.

　正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvf／CVIDEC及びhATR5Hvg／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvf／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“f”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“f”アミノ酸配列を配列番号57及び58に示す。また、プラスミドhATR5Hvg／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“g”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“g”のアミノ酸配列を配列番号59、60に示す。 プ ラ ス ミ ド Plasmids having the correct sequence were designated as hATR5Hvf / CVIDEC and hATR5Hvg / CVIDEC. The nucleotide sequence of the humanized H chain version “f” contained in the plasmid hATR5Hvf / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of the version “f” are shown in SEQ ID NOs: 57 and 58. In addition, SEQ ID NOS: 59 and 60 show the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version "g" contained in plasmid hATR5Hvg / CVIDEC, and the amino acid sequence of version "g".

（v）ヒト型化H鎖バージョン“h”の構築
　バージョン“h”はFR-シャッフリング法によってバージョン“a”のFR3を別のヒト抗体由来のFR3に置換し作製した。バージョン“h”はヒト抗体Z26827 （DDBJ、Van Der Stoep ら, J.Exp.Med., 177, 99-107, 1993）由来のFR3に置換するためFR3をコードするプライマーを2個ずつ合成した。バージョン“h”のFR-シャッフリングプライマーF3ADS（配列番号61）はセンスDNA配列を有し、F3ADA（配列番号62）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。 (V) Construction of humanized H chain version “h” Version “h” was prepared by substituting FR3 of version “a” with FR3 derived from another human antibody by the FR-shuffling method. For version "h", two primers encoding FR3 were synthesized to replace FR3 derived from human antibody Z26827 (DDBJ, Van Der Stoep et al., J. Exp. Med., 177, 99-107, 1993). Version "h" FR-shuffling primer F3ADS (SEQ ID NO: 61) has a sense DNA sequence, F3ADA (SEQ ID NO: 62) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has a complementary sequence of 18 bp. Having.

　F3ADS及びF3ADAは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。PCRは、KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）を用い、100μlの反応混合液に1μMのFR-シャッフリングプライマーF3ADS及びF3ADAをそれぞれ5μlずつ、0.2mMのdNTPs、1.0mMのMgCl2 、2.5UのKOD DNAポリメラーゼを含む条件で添付緩衝液を使用して94℃にて30秒間、50℃にて1分間、74℃にて1分間の温度サイクルで5回行い、さらに100pmoleの外部プライマーF3PrS及びF3PrAを加え、同じ温度サイクルを25回行った。PCR法により増幅したDNA断片を2％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。 F3ADS and F3ADA were synthesized and purified by Pharmacia Biotech. PCR is used KOD DNA polymerase (Toyo Boseki), the reaction mixture 100 [mu] l 1 [mu] M of FR- shuffling primers F3ADS and F3ADA one by 5μl each, 0.2 mM of dNTPs, MgCl 2 of 1.0 mM, KOD DNA polymerase 2.5U Performed 5 times in a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 74 ° C. for 1 minute using the attached buffer under the conditions including The same temperature cycle was performed 25 times. DNA fragments amplified by the PCR method were separated by agarose gel electrophoresis using 2% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products).

　424bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、3倍量（ml／g）のTEを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、その3分の1量を水14μlに溶解した。得られたPCR反応混合物をBalI及びNcoIで消化し、これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvh／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvh／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“h”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を配列番号63に示す。また、バージョン“h”のアミノ酸配列を配列番号64に示す。 A piece of agarose containing a DNA fragment of 424 bp in length was cut out, 3 times (ml / g) of TE was added, and the DNA fragment was purified by phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction. After the purified DNA was precipitated with ethanol, one third of the amount was dissolved in 14 μl of water. The obtained PCR reaction mixture was digested with BalI and NcoI, introduced into a plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting these with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined. The plasmid having the correct sequence was named hATR5Hvh / CVIDEC. SEQ ID NO: 63 shows the nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version "h" contained in plasmid hATR5Hvh / CVIDEC. The amino acid sequence of version “h” is shown in SEQ ID NO: 64.

（vi）ヒト型化H鎖バージョン“i”及び“j”の構築
　バージョン“i”及び“j”はFR-シャッフリング法によってバージョン“a”のFR3を別のヒト抗体由来のFR3に置換し作製した。バージョン“i”はヒト抗体U95239（DDBJ、Manheimer-Lory AJ., unpublished）由来のFR3に、バージョン“j”はL03147（DDBJ、Collet TA.ら, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 89, 10026-10030, 1992）由来のFR3に置換するためFR3をコードするプライマーを2個ずつ合成した。バージョン“i”のFR-シャッフリングプライマーF3MMS（配列番号65）はセンスDNA配列を有し、F3MMA（配列番号66）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。 (Vi) Construction of humanized H chain versions "i" and "j" Versions "i" and "j" were prepared by replacing FR3 of version "a" with FR3 derived from another human antibody by the FR-shuffling method. did. Version “i” is FR3 derived from human antibody U95239 (DDBJ, Manheimer-Lory AJ., Unpublished) and version “j” is L03147 (DDBJ, Collet TA. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10026-10030, 1992), two primers encoding FR3 were synthesized. Version "i" FR-shuffling primer F3MMS (SEQ ID NO: 65) has a sense DNA sequence, F3MMA (SEQ ID NO: 66) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has an 18 bp complementary sequence. Having.

　バージョン“j”のFR-シャッフリングプライマーF3BMS（配列番号67）はセンスDNA配列を有し、F3BMA（配列番号68）はアンチセンスDNA配列を有し、プライマーの3′-末端は18bpの相補的配列を有する。F3MMS、F3MMA、F3BMS及びF3BMAは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。PCRは、Ampli Taq Gold （Perkin-Elmer）を用い、100μlの反応混合液に1μMのFR-シャッフリングプライマーF3MMSとF3MMA、又はF3BMSとF3BMAをそれぞれ5μlずつ、0.2mMのdNTPs、1.5mMのMgCl2 、2.5UのAmpli Taq Goldを含む条件で添付緩衝液を使用して94℃にて30秒間、50℃にて1分間、74℃にて1分間の温度サイクルで5回行い、さらに100pmoleの外部プライマーF3PrS及びF3PrAを加え、同じ温度サイクルを25回行った。 Version "j" of the FR-shuffling primer F3BMS (SEQ ID NO: 67) has a sense DNA sequence, F3BMA (SEQ ID NO: 68) has an antisense DNA sequence, and the 3'-end of the primer has an 18 bp complementary sequence. Having. F3MMS, F3MMA, F3BMS and F3BMA were synthesized and purified by Pharmacia Biotech. PCR is, Ampli Taq Gold (Perkin-Elmer ) using a reaction mixture and FR- shuffling primers F3MMS of 1μM to F3MMA of 100 [mu] l, or F3BMS and F3BMA one by 5μl each, 0.2 mM of dNTPs, 1.5 mM of MgCl 2, Performed 5 times at a temperature of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 1 minute and 74 ° C for 1 minute 5 times using the attached buffer under conditions containing 2.5 U Ampli Taq Gold, and an external primer of 100 pmole F3PrS and F3PrA were added and the same temperature cycle was performed 25 times.

　PCR法により増幅したDNA断片を2％のNu Sieve GTGアガロース（FMC Bio.Products）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。424bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、3倍量（ml／g）のTEを添加し、フェノール抽出、フェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出によりDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、その3分の1量を水14μlに溶解した。得られたPCR反応混合物をBalI及びNcoIで消化し、これらをBalI及びNcoIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hva／CVIDEC（BalI／NcoI）に導入し、塩基配列を決定した。 DNAThe DNA fragment amplified by the PCR method was separated by agarose gel electrophoresis using 2% Nu Sieve GTG agarose (FMC Bio. Products). A piece of agarose containing a 424 bp long DNA fragment was cut out, 3 times (ml / g) of TE was added, and the DNA fragment was purified by phenol extraction, phenol / chloroform extraction, and chloroform extraction. After the purified DNA was precipitated with ethanol, one third of the amount was dissolved in 14 μl of water. The obtained PCR reaction mixture was digested with BalI and NcoI, introduced into a plasmid hATR5Hva / CVIDEC (BalI / NcoI) prepared by digesting these with BalI and NcoI, and the nucleotide sequence was determined.

　正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvi／CVIDEC及びhATR5Hvj／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvi／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“i”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“i”アミノ酸配列を配列番号69及び70に示す。また、プラスミドhATR5Hvj／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“j”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“j”のアミノ酸配列を配列番号71及び72に示す。 プ ラ ス ミ ド Plasmids having the correct sequence were designated as hATR5Hvi / CVIDEC and hATR5Hvj / CVIDEC. SEQ ID NOS: 69 and 70 show the nucleotide sequence of humanized H chain version "i" contained in plasmid hATR5Hvi / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence, and the amino acid sequence of version "i". The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version “j” contained in plasmid hATR5Hvj / CVIDEC and the amino acid sequence of version “j” are shown in SEQ ID NOs: 71 and 72.

（vii）ヒト型化H鎖バージョン“b1”及び“d1”の構築
　バージョン“b1”及び“d1”はFR-シャッフリング法によってバージョン“b”及び“d”のFR2を別のヒト抗体由来のFR2に置換し作製した。ヒト抗体P01742 （SWISS-PROT、Cunningham BA.ら, Biochemistry, 9, 3161-3170, 1970）由来のものに置換するため、FR2をコードするDNAプライマーを2個作製した。FR-シャッフリングベクターF2MPS（配列番号73）はセンスDNA配列を有し、F2MPA（配列番号74）はアンチセンスDNA配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはEcoT22I及びBalIの認識配列を有する。 (Vii) Construction of humanized H chain versions “b1” and “d1” Versions “b1” and “d1” were obtained by replacing FR2 of versions “b” and “d” with FR2 derived from another human antibody by the FR-shuffling method. Was prepared. Two DNA primers encoding FR2 were prepared to substitute for those derived from human antibody P01742 (SWISS-PROT, Cunningham BA. Et al., Biochemistry, 9, 3161-3170, 1970). FR-shuffling vector F2MPS (SEQ ID NO: 73) has a sense DNA sequence, and F2MPA (SEQ ID NO: 74) has an antisense DNA sequence. In addition, they have sequences complementary to each other, and have EcoT22I and BalI recognition sequences at both ends.

　F2MPS、F2MPAは Pharmacia Biotechにより合成及び精製された。F2MPSとF2MPAをアニールさせ、EcoT22I及びBalIで消化した。これをEcoT22I及びBalIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hvb／CVIDEC（EcoT22I／BalI）及びhATR5Hvd／CVIDEC（EcoT22I／BalI）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvb1／CVIDEC及びhATR5Hvd1／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvb1／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“b1”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“b1”アミノ酸配列を配列番号75及び76に示す。また、プラスミドhATR5Hvd1／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“d1”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“d1”のアミノ酸配列を配列番号77及び78に示す。 F2MPS and F2MPA were synthesized and purified by Pharmacia Biotech. F2MPS and F2MPA were annealed and digested with EcoT22I and BalI. This was introduced into plasmids hATR5Hvb / CVIDEC (EcoT22I / BalI) and hATR5Hvd / CVIDEC (EcoT22I / BalI) prepared by digesting with EcoT22I and BalI, and the nucleotide sequence was determined. Plasmids with the correct sequence were named hATR5Hvb1 / CVIDEC and hATR5Hvd1 / CVIDEC. The nucleotide sequence of the humanized H chain version “b1” contained in the plasmid hATR5Hvb1 / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of the version “b1” are shown in SEQ ID NOs: 75 and 76. The nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence of the humanized H chain version “d1” contained in the plasmid hATR5Hvd1 / CVIDEC and the amino acid sequence of the version “d1” are shown in SEQ ID NOS: 77 and 78.

（viii）ヒト型化H鎖バージョン“b3”及び“d3”の構築
　バージョン“b3”及び“d3”はFR-シャッフリング法によってバージョン“b”及び“d”のFR2を別のヒト抗体由来のFR2に置換し作製した。ヒト抗体Z80844 （DDBJ、Thomsett AR.ら,unpublished）由来のFR2に置換するため、FR2をコードするDNAプライマーを2個作製した。FR-シャッフリングベクターF2VHS（配列番号79）はセンスDNA配列を有し、F2VHA（配列番号80）はアンチセンスDNA配列を有する。また、互いに相補的な配列を有し、両端にはEcoT22I及びBalIの認識配列を有する。F2VHS、F2VHAは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。 (Viii) Construction of humanized H chain versions “b3” and “d3” Versions “b3” and “d3” were obtained by replacing FR2 of versions “b” and “d” with FR2 derived from another human antibody by the FR-shuffling method. Was prepared. Two DNA primers encoding FR2 were prepared to substitute for FR2 derived from human antibody Z80844 (DDBJ, Thomsett AR. Et al., Unpublished). FR-shuffling vector F2VHS (SEQ ID NO: 79) has a sense DNA sequence and F2VHA (SEQ ID NO: 80) has an antisense DNA sequence. In addition, they have sequences complementary to each other, and have EcoT22I and BalI recognition sequences at both ends. F2VHS and F2VHA outsourced synthesis and purification to Pharmacia Biotech.

　F2VHSとF2VHAをアニールさせ、EcoT22I及びBalIで消化した。これをEcoT22I及びBalIで消化することにより調製したプラスミドhATR5Hvb／CVIDEC（EcoT22I／BalI）及びhATR5Hvd／CVIDEC（EcoT22I／BalI）に導入し、塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドをhATR5Hvb3／CVIDEC及びhATR5Hvd3／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Hvb3／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“b3”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“b3”アミノ酸配列を配列番号81及び82に示す。また、プラスミドhATR5Hvd3／CVIDECに含まれるヒト型化H鎖バージョン“d3”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“d3”のアミノ酸配列を配列番号83及び84に示す。 F2VHS and F2VHA were annealed and digested with EcoT22I and BalI. This was introduced into plasmids hATR5Hvb / CVIDEC (EcoT22I / BalI) and hATR5Hvd / CVIDEC (EcoT22I / BalI) prepared by digesting with EcoT22I and BalI, and the nucleotide sequence was determined. Plasmids with the correct sequence were named hATR5Hvb3 / CVIDEC and hATR5Hvd3 / CVIDEC. The nucleotide sequence of the humanized H chain version “b3” contained in the plasmid hATR5Hvb3 / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of the version “b3” are shown in SEQ ID NOs: 81 and 82. The nucleotide sequence and corresponding amino acid sequence of humanized H chain version “d3” contained in plasmid hATR5Hvd3 / CVIDEC and the amino acid sequence of version “d3” are shown in SEQ ID NOS: 83 and 84.

（2）ヒト型化抗体L鎖V領域の構築
　（i）バージョン”a”
　ヒト型化ATR5抗体L鎖を、PCR法によるCDR-グラフティングにより作製した。ヒト抗体Z37332 （DDBJ、Welschof Mら, J.Immunol.Methods, 179, 203-214, 1995）由来のフレームワーク領域を有するヒト型化抗体L鎖（バージョン”a”）の作製のために7本のPCRプライマーを使用した。 (2) Construction of humanized antibody L chain V region (i) Version "a"
The humanized ATR5 antibody L chain was prepared by CDR-grafting by PCR. Seven lines for the production of a humanized antibody L chain (version "a") having a framework region derived from human antibody Z37332 (DDBJ, Welschof M et al., J. Immunol. Methods, 179, 203-214, 1995) PCR primers were used.

　CDR-グラフティングプライマーh5Lv1S（配列番号85）及びh5Lv4S（配列番号86）はセンスDNA配列を、CDRグラフティングプライマーh5Lv2A（配列番号87）、h5Lv3A（配列番号88）及びh5Lv5A（配列番号89）はアンチセンスDNA配列を有し、各プライマーの両端に20bpの相補的配列を有する。外部プライマーh5LvS（配列番号90）及びh5LvA（配列番号91）はCDRグラフティングプライマーh5Lv1S及びh5Lv5Aとホモロジーを有する。CDR-グラフティングプライマーh5Lv1S、h5Lv4S、h5Lv2A、h5Lv3A、h5Lv5A、h5LvS及びh5LvAは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。 CDR-grafting primers h5Lv1S (SEQ ID NO: 85) and h5Lv4S (SEQ ID NO: 86) have antisense DNA sequences, while CDR-grafting primers h5Lv2A (SEQ ID NO: 87), h5Lv3A (SEQ ID NO: 88) and h5Lv5A (SEQ ID NO: 89) have antisense. It has a sense DNA sequence and has a complementary sequence of 20 bp at both ends of each primer. External primers h5LvS (SEQ ID NO: 90) and h5LvA (SEQ ID NO: 91) have homology with CDR grafting primers h5Lv1S and h5Lv5A. CDR-grafting primers h5Lv1S, h5Lv4S, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv5A, h5LvS and h5LvA were outsourced to Pharmacia Biotech for synthesis and purification.

　PCR溶液は、100μl中に120mM Tris-HCl（pH8.0）、10mM KCl、6mM （NH4 ）2 SO4 、0.1％ Triton X-100、0.001％ BSA、0.2mM dNTPs（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）、1mM MgCl2 、2.5ユニットのKOD DNAポリメラーゼ（東洋紡績）、5pmoleのCDRグラフティングプライマーh5Lv1S、h5Lv2A、h5Lv3A、h5Lv4S、及びh5Lv5Aを含有する。 The PCR solution contained 120 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM KCl, 6 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 0.001% BSA, 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, 100 μl) in 100 μl. dTTP), 1 mM MgCl 2 , 2.5 units of KOD DNA polymerase (Toyobo), 5 pmole of CDR grafting primers h5Lv1S, h5Lv2A, h5Lv3A, h5Lv4S, and h5Lv5A.

　PCRはDNA Thermal Cycler 480 （Perkin-Elmer） を用い、94℃にて30秒間、50℃にて1分間、72℃にて1分間の温度サイクルを5回行うことにより、5本のCDRグラフティングプライマーをアセンブルした。この反応混合液に100pmoleの外部プライマーh5LvS及びh5LvAを加え、94℃にて30秒間、52℃にて1分間、72℃にて1分間の温度サイクルを30回行うことにより、アセンブルしたDNA断片を増幅した。 PCR was performed using DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer) for 5 CDR cycles of 5 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute. Primers were assembled. 100 pmole of the external primers h5LvS and h5LvA were added to the reaction mixture, and the assembled DNA fragment was subjected to a temperature cycle of 94 ° C. for 30 seconds, 52 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute 30 times to thereby assemble the DNA fragment. Amplified.

　PCR反応混合液を3％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts） を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約400bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノール沈殿により回収した。回収したDNA断片を制限酵素SplI（宝酒造）及びBglII（宝酒造）により37℃で4時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TE10μlに溶解した。上記のようにして調製したヒト型化抗体L鎖V領域をコードする遺伝子を含むSplI-BglII DNA断片とSplI及びBglIIで消化することにより調製したCVIDECベクターをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 (4) The PCR reaction mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 3% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose fragment containing a DNA fragment of about 400 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and DNA fragments were recovered by ethanol precipitation. The recovered DNA fragment was digested with restriction enzymes SplI (Takara Shuzo) and BglII (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 4 hours. The digestion mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragment was precipitated with ethanol and then dissolved in 10 μl of TE. A DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) was prepared by digesting SplI-BglII DNA fragment containing the gene encoding the humanized antibody L chain V region prepared as described above and SplI and BglII. The reaction was carried out at 16 ° C. for 1 hour according to the attached prescription, and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。このヒト型化抗体L鎖V領域をコードする遺伝子を含有し、5′-側にBglII認識配列及びKozak配列、3′-側にSplI認識配列を持つプラスミドをhATR5Lva／CVIDECと命名した。ヒト型化L鎖バージョン”a”の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号92に示す。また、バージョン“a”のアミノ酸配列を配列番号93に示す。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions. A plasmid containing the gene encoding the humanized antibody L chain V region and having a BglII recognition sequence and a Kozak sequence on the 5′-side and a SplI recognition sequence on the 3′-side was designated as hATR5Lva / CVIDEC. SEQ ID NO: 92 shows the nucleotide sequence (including the corresponding amino acid) of humanized L chain version "a". The amino acid sequence of version “a” is shown in SEQ ID NO: 93.

　（ii）バージョン“b”及び“c”
　バージョン“b”及び“c”を、バージョン“a”のFR3を置換（FR-シャッフリング）することにより作製した。バージョン“b”にはヒト抗体S68699 （DDBJ、Hougs L ら,Exp.Clin.Immunogen et., 10, 141-151, 1993）由来のFR3を、バージョン“c”にはヒト抗体P01607 （SWISS-PROT、Epp O ら,Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975）由来のFR3をそれぞれ使用した。 (Ii) Versions “b” and “c”
Versions "b" and "c" were made by substituting (FR-shuffling) FR3 of version "a". Version "b" is FR3 derived from human antibody S68699 (DDBJ, Hougs L et al., Exp. Clin. Immunogen et., 10, 141-151, 1993), and version "c" is human antibody P01607 (SWISS-PROT , Epp O et al., Biochemistry, 14, 4943-4952, 1975).

　バージョン“b”のFR3をコードするプライマーF3SS（配列番号94）とF3SA（配列番号95）、あるいはバージョン“c”のFR3をコードするプライマーF3RS（配列番号96）とF3RA（配列番号97）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素KpnI及びPstIの認識配列を有する。F3SS、F3SA、F3RS、F3RAは Pharmacia Biotechに合成、精製を委託した。各100pmoleのF3SSとF3SA、あるいはF3RSとF3RAを96℃にて2分間、50℃にて2分間処理することによりアニーリングさせ、2本鎖DNA断片を作製した。 Primers F3SS (SEQ ID NO: 94) and F3SA (SEQ ID NO: 95) encoding version “b” FR3 or primers F3RS (SEQ ID NO: 96) and F3RA (SEQ ID NO: 97) encoding version “c” FR3 It has a complementary sequence, and has recognition sequences for the restriction enzymes KpnI and PstI at both ends. F3SS, F3SA, F3RS, and F3RA were commissioned to Pharmacia Biotech for synthesis and purification. Each 100 pmole of F3SS and F3SA or F3RS and F3RA was annealed by treating at 96 ° C. for 2 minutes and at 50 ° C. for 2 minutes to prepare a double-stranded DNA fragment.

　これら2本鎖DNA断片を制限酵素KpnI（宝酒造）により37℃で1時間消化し、次いで制限酵素PstI（宝酒造）により37℃で1時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TEに溶解した。 These double-stranded DNA fragments were digested with the restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour, and then digested with the restriction enzyme PstI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour. The digestion mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragment was precipitated with ethanol and then dissolved in TE.

　プラスミドhATR5Lva／CVIDECを制限酵素KpnI（宝酒造）により37℃で1時間消化し、次いで制限酵素PstI（宝酒造）により37℃で1時間消化した。消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約3000bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TEに溶解した。 Plasmid hATR5Lva / CVIDEC was digested with the restriction enzyme KpnI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour, and then digested with the restriction enzyme PstI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and a piece of agarose containing a DNA fragment of about 3000 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in TE.

　上記のようにして調製したバージョン“b”あるいは“c”のFR3をコードするKpnI-PstI DNA断片とKpnI及びPstIで消化することによりFR3を除去したhATR5Lva／CVIDECベクターをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 A KpnI-PstI DNA fragment encoding FR3 of version “b” or “c” prepared as described above and the hATR5Lva / CVIDEC vector from which FR3 was removed by digestion with KpnI and PstI were used as a DNA ligation kit ver.2 ( (Takara Shuzo) and allowed to react at 16 ° C. for 1 hour according to the attached prescription and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地3mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Then, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 3 ml of LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions.

　これらヒト型化抗体L鎖バージョン“a”のFR3を置換したバージョン“b”あるいはバージョン“c”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれhATR5Lvb／CVIDEC、hATR5Lvc／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Lvb／CVIDECに含まれるヒト型化L鎖バージョン“b”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列ならびにバージョン“b”アミノ酸配列を配列番号98、99に示す。また、プラスミドhATR5Lvc／CVIDECに含まれるヒト型化L鎖バージョン“c”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列およびバージョン“c”のアミノ酸配列を配列番号100および101に示す。 プ ラ ス ミ ド The plasmids containing the gene encoding the version “b” or the version “c” of the humanized antibody L chain version “a” that has been substituted for FR3 are named hATR5Lvb / CVIDEC and hATR5Lvc / CVIDEC, respectively. SEQ ID NOS: 98 and 99 show the nucleotide sequence, corresponding amino acid sequence, and version "b" amino acid sequence of humanized L chain version "b" contained in plasmid hATR5Lvb / CVIDEC. SEQ ID NOS: 100 and 101 show the nucleotide sequence of humanized L chain version "c" contained in plasmid hATR5Lvc / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of version "c".

　（iii）バージョン“b1”及び“b2”
　バージョン“b1”及び“b2”を、バージョン“b”のFR2を置換することにより作製した。バージョン“b1”にはヒト抗体S65921 （DDBJ、Tonge DWら,Year Immunol., 7, 56-62, 1993）由来のFR2を、バージョン“b2”にはヒト抗体X93625 （DDBJ、CoxJPら,Eur.J.Immunol., 24, 827-836, 1994）由来のFR2をそれぞれ使用した。 (Iii) Versions “b1” and “b2”
Versions "b1" and "b2" were created by replacing FR2 of version "b". Version “b1” is FR2 derived from human antibody S65921 (DDBJ, Tonge DW et al., Year Immunol., 7, 56-62, 1993), and version “b2” is human antibody X93625 (DDBJ, CoxJP et al., Eur. J. Immunol., 24, 827-836, 1994).

　バージョン“b1”のFR2をコードするプライマーF2SS（配列番号102）とF2SA（配列番号103）、あるいはバージョン“b2”のFR2をコードするプライマーF2XS（配列番号104）とF2XA（配列番号105）は互いに相補的な配列を有し、両端に制限酵素AflII及びSpeIの認識配列を有する。F2SS、F2SA、F2XS及びF2XAは Pharmacia Biotechにより合成された。各100pmoleのF2SSとF2SA、あるいはF2XSとF2XAを96℃にて2分間、50℃にて2分間処理することによりアニーリングさせ、2本鎖DNA断片を作製した。 Primers F2SS (SEQ ID NO: 102) and F2SA (SEQ ID NO: 103) encoding version “b1” FR2 or primers F2XS (SEQ ID NO: 104) and F2XA (SEQ ID NO: 105) encoding version “b2” FR2 It has a complementary sequence, and has recognition sequences for the restriction enzymes AflII and SpeI at both ends. F2SS, F2SA, F2XS and F2XA were synthesized by Pharmacia Biotech. Each 100 pmole of F2SS and F2SA or F2XS and F2XA was annealed by treating at 96 ° C. for 2 minutes and at 50 ° C. for 2 minutes to prepare a double-stranded DNA fragment.

　これら2本鎖DNA断片を制限酵素AflII（宝酒造）及びSpeI（宝酒造）により37℃で1時間消化した。消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TEに溶解した。
　プラスミドhATR5Lvb／CVIDECを制限酵素AflII（宝酒造）及びSpeI（宝酒造）により37℃で1時間消化した。消化混合物を1.5％ NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約3000bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TEに溶解した。 These double-stranded DNA fragments were digested with restriction enzymes AflII (Takara Shuzo) and SpeI (Takara Shuzo) for 1 hour at 37 ° C. The digestion mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA fragment was precipitated with ethanol and then dissolved in TE.
Plasmid hATR5Lvb / CVIDEC was digested with restriction enzymes AflII (Takara Shuzo) and SpeI (Takara Shuzo) at 37 ° C. for 1 hour. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and a piece of agarose containing a DNA fragment of about 3000 bp was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in TE.

　上記のようにして調製したバージョン“b1”あるいは“b2”のFR2をコードするAflII-SpeI DNA断片とAflII及びSpeIで消化することによりFR2を除去したhATR5Lvb／CVIDECベクターをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。 The AflII-SpeI DNA fragment encoding FR2 of version "b1" or "b2" prepared as described above and the hATR5Lvb / CVIDEC vector from which FR2 was removed by digestion with AflII and SpeI were used as a DNA ligation kit ver.2 ( (Takara Shuzo) and allowed to react at 16 ° C. for 1 hour according to the attached prescription and ligated.

　この連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／ml LBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。この形質転換体をLBA培地4mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。 The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Next, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium, and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant. . The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 4 ml of an LBA medium, and a plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a QIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN).

　プラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列をDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Perkin-Elmer）を用い、DNA Sequencer 373A （Perkin-Elmer）により決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M4（宝酒造）及びM13 Primer RV（宝酒造）を用い、両方向の塩基配列を確認することにより配列を決定した。 塩 基 The nucleotide sequence of the cDNA coding region in the plasmid was determined by DNA Sequencer 373A (Perkin-Elmer) using Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer). Using M13 Primer M4 (Takara Shuzo) and M13 Primer RV (Takara Shuzo) as sequencing primers, the sequences were determined by confirming the nucleotide sequences in both directions.

　これらヒト型化抗体L鎖バージョン“b”のFR2を置換したバージョン“b1”あるいはバージョン“b2”をコードする遺伝子を含有するプラスミドをそれぞれhATR5Lvb1／CVIDEC及びhATR5Lvb2／CVIDECと命名した。プラスミドhATR5Lvb1／CVIDECに含まれるヒト型化L鎖バージョン“b1”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“b1”アミノ酸配列を配列番号106及び107に示す。また、プラスミドhATR5Lvb2／CVIDECに含まれるヒト型化L鎖バージョン“b2”の塩基配列及び対応するアミノ酸配列及びバージョン“b2”のアミノ酸配列を配列番号108及び109に示す。 (4) Plasmids containing the gene encoding version "b1" or version "b2" obtained by substituting FR2 of humanized antibody L chain version "b" were designated as hATR5Lvb1 / CVIDEC and hATR5Lvb2 / CVIDEC, respectively. The nucleotide sequence of the humanized L chain version “b1” contained in the plasmid hATR5Lvb1 / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of the version “b1” are shown in SEQ ID NOs: 106 and 107. The nucleotide sequence of the humanized L chain version “b2” contained in the plasmid hATR5Lvb2 / CVIDEC, the corresponding amino acid sequence and the amino acid sequence of the version “b2” are shown in SEQ ID NOs: 108 and 109.

（3）ヒト型化抗体の発現ベクターの構築
　（i）ヒト型化H鎖とキメラL鎖との組合せ
　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hva／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHva-chLv／N5KG4Pと命名した。　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb-chLv／N5KG4Pと命名した。 (3) Construction of humanized antibody expression vector (i) Combination of humanized H chain and chimeric L chain Plasmid hATR5Hva / CVIDEC containing H chain V region was digested with NheI and SalI, and humanized H chain The cDNA fragment of the V region was recovered, and introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting chATR5 antibody expression plasmid vector, chATR5 / N5KG4P with NheI and SalI. The plasmid thus prepared was designated as hHva-chLv / N5KG4P. The plasmid hATR5Hvb / CVIDEC containing the H chain V region is digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region is recovered, and the chATR-5 antibody expression plasmid vector, chATR5 / N5KG4P is digested with NheI and SalI. This was introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI). The plasmid thus prepared was designated as hHvb-chLv / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvc／CVIDEC、hATR5Hvd／CVIDEC及びhATR5Hve／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvc-chLv／N5KG4P、hHvd-chLv／N5KG4P及びhHve-chLv／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvc / CVIDEC, hATR5Hvd / CVIDEC and hATR5Hve / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered. N5KG4P was introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvc-chLv / N5KG4P, hHvd-chLv / N5KG4P and hHve-chLv / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvf／CVIDEC及びhATR5Hvh／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvf-chLv／N5KG4P及びhHvh-chLv／N5KG4Pと命名した。 The plasmids hATR5Hvf / CVIDEC and hATR5Hvh / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the chATR-5 antibody expression plasmid vector, chATR5 / N5KG4P was replaced with NheI and It was introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digestion with SalI. The plasmids thus prepared were named hHvf-chLv / N5KG4P and hHvh-chLv / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvi／CVIDEC及びhATR5Hvj／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvi-chLv／N5KG4P及びhHvj-chLv／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvi / CVIDEC and hATR5Hvj / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the chATR-5 antibody expression plasmid vector, It was introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digestion with SalI. The plasmids thus prepared were named hHvi-chLv / N5KG4P and hHvj-chLv / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb1／CVIDEC及びhATR5Hvd1／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、chATR-5抗体発現プラスミドベクター、chATR5／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したchATR5／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb1-chLv／N5KG4P及びhHvd1-chLv／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvb1 / CVIDEC and hATR5Hvd1 / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered.The chATR-5 antibody expression plasmid vector, chATR5 / N5KG4P was It was introduced into chATR5 / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digestion with SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb1-chLv / N5KG4P and hHvd1-chLv / N5KG4P.

　（ii）ヒト型化L鎖とキメラH鎖との組み合わせ
　抗体発現ベクターN5KG4Pを用いて、キメラH鎖との組み合わせでヒト型化抗体を発現させることにより、ヒト型化L鎖の評価を行った。 (Ii) Combination of humanized L chain and chimeric H chain Using the antibody expression vector N5KG4P, the humanized L chain was evaluated by expressing a humanized antibody in combination with the chimeric H chain. .

　プラスミドhATR5Lva／CVIDEC、hATR5Lvb／CVIDEC、hATR5Lvc／CVIDEC、hATR5Lvb1／CVIDEC、hATR5Lvb2／CVIDECを制限酵素BglII（宝酒造）及びSplI（宝酒造）により37℃で2〜3時間消化した。消化混合物を1.5％または2％　NuSieve GTGアガロース（FMC BioProducts）を用いたアガロースゲル電気泳動により分離し、約400bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り出した。アガロース片をフェノール及びクロロホルムで抽出し、DNA断片をエタノールで沈殿させた後、TEに溶解した。 Plasmids hATR5Lva / CVIDEC, hATR5Lvb / CVIDEC, hATR5Lvc / CVIDEC, hATR5Lvb1 / CVIDEC, and hATR5Lvb2 / CVIDEC were digested with restriction enzymes BglII (Takara Shuzo) and SplI (Takara Shuzo) for 2-3 hours. The digestion mixture was separated by agarose gel electrophoresis using 1.5% or 2% @NuSieve GTG agarose (FMC BioProducts), and an agarose piece containing a DNA fragment of about 400 bp in length was cut out. Agarose pieces were extracted with phenol and chloroform, and DNA fragments were precipitated with ethanol and then dissolved in TE.

　これら各バージョンのヒト型化L鎖V領域をコードする遺伝子を含むSplI-BglII DNA断片とSplI及びBglIIで消化したchATR5Hv／N5KG4PをDNAライゲーションキットver.2（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で1時間反応させ連結した。
　連結混合物を大腸菌JM109コンピテント細胞（ニッポンジーン）100μlに加え、氷上で30分間、42℃にて1分間静置した。次いで300μlのHi-Competence Broth（ニッポンジーン）を加え37℃にて1時間インキュベートした後、100μg／mlLBA寒天培地上にこの大腸菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。 The SplI-BglII DNA fragment containing the gene encoding the humanized L chain V region of each of these versions and chATR5Hv / N5KG4P digested with SplI and BglII were subjected to DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo) according to the attached instructions. The reaction was carried out at a temperature of 1 hour for ligation.
The ligation mixture was added to 100 μl of E. coli JM109 competent cells (Nippon Gene), and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes and at 42 ° C. for 1 minute. Next, 300 μl of Hi-Competence Broth (Nippon Gene) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, the Escherichia coli was spread on 100 μg / ml LBA agar medium, and incubated at 37 ° C. overnight to obtain an E. coli transformant.

　この形質転換体をLBA培地250mlまたは500mlで37℃にて一夜培養し、菌体画分からPlasmid Maxi Kit （QIAGEN）を用いてプラスミドDNAを調製した。これらキメラH鎖とヒト型化L鎖をコードする遺伝子を導入したプラスミドをそれぞれchHv-hLva／N5KG4P、chHv-hLvb／N5KG4P、chHv-hLvc／N5KG4P、chHv-hLvb1／N5KG4P及びchHv-hLvb2／N5KG4Pと命名した。 The transformant was cultured overnight at 37 ° C. in 250 ml or 500 ml of LBA medium, and plasmid DNA was prepared from the cell fraction using a Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). Plasmids into which the genes encoding the chimeric H chain and the humanized L chain were introduced were respectively chHv-hLva / N5KG4P, chHv-hLvb / N5KG4P, chHv-hLvc / N5KG4P, chHv-hLvb1 / N5KG4P and chHv-hLvb2 / N5KG4P. Named.

（iii）ヒト型化H鎖とヒト型化L鎖の組合せ
　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hva／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“a”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLva／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLva／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHva-hLva／N5KG4Pと命名した。 (Iii) Combination of humanized H chain and humanized L chain The plasmid hATR5Hva / CVIDEC containing the H chain V region was digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered. The plasmid chHv-hLva / N5KG4P containing the sequence of the modified ATR-5 antibody L chain version “a” cDNA was introduced into hLva / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting with NheI and SalI. The plasmid thus prepared was designated as hHva-hLva / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb／CVIDEC及びhATR5Hvc／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“a”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLva／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLva／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb-hLva／N5KG4P及びhHvc-hLva／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvb / CVIDEC and hATR5Hvc / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version "a" cDNA The plasmid chHv-hLva / N5KG4P containing the above sequence was introduced into hLva / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb-hLva / N5KG4P and hHvc-hLva / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb／CVIDEC、hATR5Hvd／CVIDEC及びhATR5Hve／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb-hLvb／N5KG4P、hHvd-hLvb／N5KG4P及びhHve-hLvb／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvb / CVIDEC, hATR5Hvd / CVIDEC and hATR5Hve / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered to obtain a humanized ATR-5 antibody L chain version. The plasmid chHv-hLvb / N5KG4P containing the sequence of the “b” cDNA was introduced into hLvb / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb-hLvb / N5KG4P, hHvd-hLvb / N5KG4P and hHve-hLvb / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvf／CVIDEC、hATR5Hvg／CVIDEC及びhATR5Hvh／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvf-hLvb／N5KG4P、hHvg-hLvb／N5KG4P及びhHvh-hLvb／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvf / CVIDEC, hATR5Hvg / CVIDEC and hATR5Hvh / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was collected to obtain a humanized ATR-5 antibody L chain version. The plasmid chHv-hLvb / N5KG4P containing the sequence of the “b” cDNA was introduced into hLvb / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvf-hLvb / N5KG4P, hHvg-hLvb / N5KG4P and hHvh-hLvb / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvi／CVIDEC及びhATR5Hvj／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvi-hLvb／N5KG4P及びhHvj-hLvb／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvi / CVIDEC and hATR5Hvj / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version "b" cDNA Was introduced into hLvb / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting the plasmid chHv-hLvb / N5KG4P containing NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvi-hLvb / N5KG4P and hHvj-hLvb / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb1／CVIDEC及びhATR5Hvd1／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb1-hLvb／N5KG4P及びhHvd1-hLvb／N5KG4Pと命名した。 The plasmids hATR5Hvb1 / CVIDEC and hATR5Hvd1 / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, and the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version "b" cDNA Was introduced into hLvb / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting the plasmid chHv-hLvb / N5KG4P containing NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb1-hLvb / N5KG4P and hHvd1-hLvb / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb3／CVIDEC及びhATR5Hvd3／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb3-hLvb／N5KG4P及びhHvd3-hLvb／N5KG4Pと命名した。 Plasmids hATR5Hvb3 / CVIDEC and hATR5Hvd3 / CVIDEC containing the H chain V region were digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region was recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version "b" cDNA Was introduced into hLvb / N5KG4P (SalI / NheI) prepared by digesting the plasmid chHv-hLvb / N5KG4P containing NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb3-hLvb / N5KG4P and hHvd3-hLvb / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvb／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b1”及び“b2”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb1／N5KG4P及びchHv-hLvb2／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb1／N5KG4P（SalI／NheI）及びhLvb2／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvb-hLvb1／N5KG4P及びhHvb-hLvb2／N5KG4Pと命名した。 The plasmid hATR5Hvb / CVIDEC containing the H chain V region is digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region is recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version “b1” and “b2” cDNA Were introduced into hLvb1 / N5KG4P (SalI / NheI) and hLvb2 / N5KG4P (SalI / NheI) which were prepared by digesting plasmids chHv-hLvb1 / N5KG4P and chHv-hLvb2 / N5KG4P with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvb-hLvb1 / N5KG4P and hHvb-hLvb2 / N5KG4P.

　H鎖V領域を含むプラスミドhATR5Hvi／CVIDECをNheI及びSalIで消化し、ヒト型化H鎖V領域のcDNA断片を回収し、ヒト型化ATR-5抗体L鎖バージョン“b1”及び“b2”cDNAの配列を含むプラスミドchHv-hLvb1／N5KG4P及びchHv-hLvb2／N5KG4PをNheI及びSalIにて消化することにより調製したhLvb1／N5KG4P（SalI／NheI）及びhLvb2／N5KG4P（SalI／NheI）に導入した。こうして作製したプラスミドをhHvi-hLvb1／N5KG4P及びhHvi-hLvb2／N5KG4Pと命名した。 The plasmid hATR5Hvi / CVIDEC containing the H chain V region is digested with NheI and SalI, the cDNA fragment of the humanized H chain V region is recovered, and the humanized ATR-5 antibody L chain version “b1” and “b2” cDNA Were introduced into hLvb1 / N5KG4P (SalI / NheI) and hLvb2 / N5KG4P (SalI / NheI) which were prepared by digesting plasmids chHv-hLvb1 / N5KG4P and chHv-hLvb2 / N5KG4P with NheI and SalI. The plasmids thus prepared were named hHvi-hLvb1 / N5KG4P and hHvi-hLvb2 / N5KG4P.

（4）COS-7細胞へのトランスフェクション
　ヒト型化抗体の抗原結合活性及び中和活性を評価するため、前記発現プラスミドをCOS-7細胞で一過性に発現させた。
　構築した発現プラスミドベクターをGene Pulser装置（Bio-Rad）を用いてエレクトロポレーションによりCOS-7細胞に形質導入した。PBS中に1×107 細胞／mlの細胞濃度で懸濁されているCOS-7細胞0.78mlに、プラスミド50μgあるいは20μgを加え、1,500V,25μFの静電容量にてパルスを与えた。 (4) Transfection into COS-7 cells In order to evaluate the antigen-binding activity and neutralizing activity of the humanized antibody, the expression plasmid was transiently expressed in COS-7 cells.
The constructed expression plasmid vector was transduced into COS-7 cells by electroporation using a Gene Pulser apparatus (Bio-Rad). 50 μg or 20 μg of the plasmid was added to 0.78 ml of COS-7 cells suspended at a cell concentration of 1 × 10 7 cells / ml in PBS, and a pulse was applied with a capacitance of 1,500 V and 25 μF.

　室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を5％の Ultra Low IgGウシ胎児血清（GIBCO） を含有するDMEM培地（GIBCO）に懸濁し、10cm培養皿あるいは15cm培養皿を用いてCO2 インキュベーターにて培養した。24時間の培養の後、培養上清を吸引除去し、新たに無血清培地HBCHO（アーバインサイエンティフィック）を加えた。さらに72時間もしくは96時間の培養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除去した。 After a 10 minute recovery period at room temperature, the electroporated cells are suspended in DMEM medium (GIBCO) containing 5% Ultra Low IgG fetal calf serum (GIBCO) and cultured in 10 cm or 15 cm culture dishes. And cultured in a CO 2 incubator. After culturing for 24 hours, the culture supernatant was removed by suction, and a serum-free medium HBCHO (Irvine Scientific) was newly added. After a further 72 or 96 hours of culture, the culture supernatant was collected and cell debris was removed by centrifugation.

（5）抗体の精製
　COS-7細胞の培養上清からの抗体の精製をAffiGel ProteinA MAPSIIキット（Bio-Rad）、あるいはrProtein A Sepharose FastFlow（Pharmacia Biotech）を用いて行った。AffiGel Protein A MAPSIIキットを用いた精製はキット添付の処方に従って行った。rProtein A Sepharose Fast Flowを用いた精製は以下のように行った。 (5) Purification of antibody The antibody was purified from the culture supernatant of COS-7 cells using AffiGel ProteinA MAPSII kit (Bio-Rad) or rProtein A Sepharose FastFlow (Pharmacia Biotech). Purification using the AffiGel Protein A MAPSII kit was performed according to the instructions attached to the kit. Purification using rProtein A Sepharose Fast Flow was performed as follows.

　1mlのrProtein A Sepharose Fast Flowをカラムに充填し、10倍量のTBSを流すことによってカラムを平衡化した。平衡化したカラムにCOS-7細胞の培養上清をアプライした後、10倍量のTBSによってカラムを洗浄した。次に13.5mlの2.5mM HCl（pH3.0）を流すことによって吸着した抗体画分をカラムより溶出した。1.5mlの1M Tris-HCl（pH8.0）を加えることによって溶出液を中和した。
　精製された抗体画分について、セントリプレップ30もしくは100（amicon）を用いた限外濾過を2〜3回行うことにより、TBSに溶媒を置換し、最終的に約1.5mlまで濃縮した。 The column was packed with 1 ml of rProtein A Sepharose Fast Flow, and the column was equilibrated by flowing 10 volumes of TBS. After applying the culture supernatant of COS-7 cells to the equilibrated column, the column was washed with 10 times the amount of TBS. Next, the adsorbed antibody fraction was eluted from the column by flowing 13.5 ml of 2.5 mM HCl (pH 3.0). The eluate was neutralized by adding 1.5 ml of 1 M Tris-HCl (pH 8.0).
The purified antibody fraction was subjected to ultrafiltration using Centriprep 30 or 100 (amicon) 2-3 times to replace the solvent with TBS, and finally concentrated to about 1.5 ml.

実施例4.　抗体の定量及び活性評価
（1）ELISAによる抗体濃度の測定
　抗体濃度測定のためのELISAプレートを次のようにして調製した。ELISA用96穴プレート（Maxisorp, NUNC）の各穴を固相化バッファー（0.1M NaHCO3 、0.02％ NaN3 、pH9.6）（以下、CBと称す）で1μg／mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlで固相化し、200μlの希釈バッファー（50mM Tris-HCl、1mM MgCl2 、0.1M NaCl、0.05％ Tween20、0.02％ NaN3 、1％ ウシ血清アルブミン（BSA）、pH8.1）（以下DBと称す）でブロッキングの後、抗体を発現させたCOS-7細胞の培養上清あるいは精製抗体をDBにて段階希釈して各穴に加えた。 Example 4. Antibody quantification and activity evaluation (1) Measurement of antibody concentration by ELISA An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows. A goat prepared by adjusting each well of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) to a concentration of 1 μg / ml with a solid-phase buffer (0.1 M NaHCO 3 , 0.02% NaN 3 , pH 9.6) (hereinafter referred to as CB). Immobilized with 100 μl of anti-human IgGγ antibody (BioSource), 200 μl of dilution buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl 2 , 0.1 M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN 3 , 1% bovine serum albumin (BSA), pH 8 After blocking in .1) (hereinafter referred to as DB), the culture supernatant of the COS-7 cells expressing the antibody or the purified antibody was serially diluted with DB and added to each well.

　1時間室温にてインキュベートし0.05％Tween20を含むダルベッコPBS（以下RBと称す）で洗浄後、DBで1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを加えた。1時間室温にてインキュベートしRBで洗浄の後、1mg／mlとなるようにSigma104（p-ニトロフェニルリン酸、SIGMA）を基質バッファー（50mM NaHCO3 、10mM MgCl2 、pH9.8）に溶解したもの（以下、基質溶液と称す）を加え、405／655nmでの吸光度をmicroplate reader （Bio Rad）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてIgG4κ（The Binding Site）を用いた。 After incubation at room temperature for 1 hour and washing with Dulbecco's PBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as RB), 100 µl of alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) diluted 1000-fold with DB was added. After incubating at room temperature for 1 hour and washing with RB, Sigma104 (p-nitrophenylphosphate, SIGMA) was dissolved in a substrate buffer (50 mM NaHCO 3 , 10 mM MgCl 2 , pH 9.8) to a concentration of 1 mg / ml. (Hereinafter referred to as substrate solution), and the absorbance at 405/655 nm was measured with a microplate reader (Bio Rad). IgG4κ (The Binding Site) was used as a standard for concentration measurement.

（2）抗原結合能の測定
　抗原結合測定のためのCell ELISAプレートは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞J82（ATCC HTB-1）を用いた。細胞培養用96穴プレートの60穴に1×106 個のJ82細胞を播き込んだ。これをCO2 インキュベーターで1日培養し（10％の牛胎児血清（GIBCO）を含むRPMI1640培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、300μlのPBSで各穴を2回洗浄した。4％のパラホルムアルデヒドを含むPBS（以下、PFA／PBSと称す）を各穴に100μl加え、氷上で10分間静置し、細胞を固相化した。 (2) Measurement of antigen binding ability A Cell ELISA plate for antigen binding measurement was prepared as follows. The cells used were human bladder cancer cells J82 (ATCC HTB-1). 1 × 10 6 J82 cells were seeded in 60 wells of a 96-well plate for cell culture. This was cultured in a CO 2 incubator for 1 day (RPMI1640 medium containing 10% fetal bovine serum (GIBCO)) to allow the cells to adhere. The culture solution was discarded, and each well was washed twice with 300 μl of PBS. 100 μl of PBS containing 4% paraformaldehyde (hereinafter referred to as PFA / PBS) was added to each well, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes to immobilize the cells.

　PFA／PBSを捨て、300μlのPBSで各穴を2回洗浄後、250μlのDBでブロッキングした。培養上清あるいは精製抗体をDBにて段階希釈して100μlを各穴に加えた。室温にて2時間インキュベートしRBで洗浄後、DBで1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを加えた。室温にて1時間インキュベートしRBで洗浄ののち、基質溶液を加え、次に405／655nmでの吸光度をMicroplate Reader （Bio-Rad）で測定した。 The PFA / PBS was discarded, and each well was washed twice with 300 µl of PBS, and then blocked with 250 µl of DB. The culture supernatant or the purified antibody was serially diluted with DB, and 100 μl was added to each well. After incubation at room temperature for 2 hours and washing with RB, 100 μl of an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) diluted 1000-fold with DB was added. After incubating at room temperature for 1 hour and washing with RB, the substrate solution was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured with a Microplate Reader (Bio-Rad).

（3）中和活性の測定
　マウス抗体、キメラ抗体及びヒト型化抗体の中和活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S（Behringwerke AG） による Factor Xa産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、1.25mg／mlのThromborel S 10μlと適当な濃度に希釈した抗体10μlに緩衝液（5mMのCaCl2 、0.1％のBSAを含むTBS）60μlを加え、96穴プレート中で室温で1時間反応させた。これに3.245μg／mlのヒトファクターX（セルサス・ラボラトリーズ）及び82.5ng／mlのヒトファクターVIIa（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ10μl加え、さらに室温で1時間反応させた。 (3) Measurement of Neutralizing Activity Neutralizing activities of a mouse antibody, a chimeric antibody and a humanized antibody were measured using factor Xa production inhibitory activity by human placenta-derived thromboplastin and Thromborel S (Behringwerke AG) as an index. That is, 10 μl of 1.25 mg / ml Thromborel S and 10 μl of an antibody diluted to an appropriate concentration are added with 60 μl of a buffer solution (TBS containing 5 mM CaCl 2 and 0.1% BSA) and reacted in a 96-well plate at room temperature for 1 hour. I let it. To this, 10 μl each of 3.245 μg / ml human factor X (Celsus Laboratories) and 82.5 ng / ml human factor VIIa (Enzyme Research) were added, and the mixture was further reacted at room temperature for 1 hour.

　0.5MのEDTAを10μl加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を50μl加え、Microplate Reader（Bio Rad）で405／655nmの吸光度を測定した。室温で1時間反応させ、再度405／655nmの吸光度を測定した。抗体無添加の1時間の吸光度変化を100％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
　発色基質溶液はテストチーム発色基質S-2222（Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、精製水で2倍希釈した後、ポリブレン液（0.6mg／ml ヘキサジメチリンブロマイド、SIGMA）と1：1で混和し調製した。 The reaction was stopped by adding 10 μl of 0.5 M EDTA. To this, 50 μl of a coloring substrate solution was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured using a Microplate Reader (Bio Rad). The reaction was carried out at room temperature for 1 hour, and the absorbance at 405/655 nm was measured again. The change in absorbance for one hour without addition of the antibody was defined as 100% activity, and the remaining activity (%) was calculated from the change in absorbance for each.
The chromogenic substrate solution was prepared by dissolving the test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) according to the package insert, diluting it twice with purified water, and mixing 1: 1 with a polybrene solution (0.6 mg / ml hexadimethylin bromide, SIGMA). Prepared.

（4）活性の評価
（i）ヒト型化H鎖バージョン“a”とキメラL鎖との組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“a”とキメラL鎖を組み合わせた抗体（a-ch）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた（図1）。FXa産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体（ch-ch）に比べて弱い活性であった（図2）。よってヒト型化H鎖はFR-シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はCOS-7細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。 (4) Evaluation of activity (i) Combination of humanized H chain version “a” and chimeric L chain An antibody (a-ch) was prepared by combining humanized H chain version “a” and chimeric L chain. When the antigen binding ability was examined by cell ELISA, the amount of binding to the antigen decreased at the higher concentration side (FIG. 1). The activity of neutralizing the antigen by inhibiting FXa production was weaker than that of the positive control chimeric antibody (ch-ch) (FIG. 2). Therefore, the humanized H chain was decided to be upgraded by FR-shuffling. The chimeric antibody used here was evaluated using an antibody expressed and purified in COS-7 cells.

（ii）ヒト型化L鎖バージョン“a”とキメラH鎖との組合せ
　ヒト型化L鎖バージョン“a”とキメラH鎖を組み合わせた抗体（ch-a）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、キメラ抗体と同等以上の抗原結合活性が認められた（図1）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて弱い活性であった（図2）。よってヒト型化L鎖もFR-シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はCOS-7細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。 (Ii) Combination of humanized L chain version "a" and chimeric H chain An antibody (ch-a) combining humanized L chain version "a" and chimeric H chain was prepared, and antigen was determined by cell ELISA. Examination of the binding ability revealed that the antigen binding activity was equal to or higher than that of the chimeric antibody (FIG. 1). On the other hand, the antigen neutralizing ability was weaker than that of the positive control chimeric antibody (FIG. 2). Therefore, the humanized L chain was also upgraded by FR-shuffling. The chimeric antibody used here was evaluated using an antibody expressed and purified in COS-7 cells.

（iii）ヒト型化H鎖バージョン“a”とヒト型化L鎖バージョン“a”との組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“a”とヒト型化L鎖バージョン“a”を組み合わせた抗体（a-a）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、高濃度側で抗原に対する結合量が低下していた（図3）。FXa産生阻害による抗原中和能についても陽性対照のキメラ抗体に比べてかなり弱い活性であった（図4）。よってヒト型化H鎖及びL鎖のFR-シャッフリングによるバージョンアップを行うことにした。なお、ここで用いたキメラ抗体はCOS-7細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。 (Iii) Combination of humanized H chain version “a” and humanized L chain version “a” An antibody (aa which combines humanized H chain version “a” and humanized L chain version “a” ) Was prepared, and the antigen binding ability was examined by cell ELISA. As a result, the amount of antigen binding decreased at the high concentration side (FIG. 3). The antigen neutralizing ability by inhibiting FXa production was also considerably weaker than that of the positive control chimeric antibody (FIG. 4). Therefore, it was decided to upgrade the humanized H and L chains by FR-shuffling. The chimeric antibody used here was evaluated using an antibody expressed and purified in COS-7 cells.

（iv）ヒト型化H鎖バージョン“b”、“c”及び“d”とキメラL鎖との組合せ
　FR-シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化H鎖とキメラL鎖を組み合わせた抗体（それぞれ“b-ch”、“c-ch”、及び“d-ch”）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、“d-ch”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“b-ch”及び“c-ch”はわずかに劣る抗原結合活性を示した（図5,6）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“b-ch”はほぼ同等、“d-ch”はわずかに弱い活性であった。またバージョン“c-ch”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図7）。よってヒト型化H鎖バージョン“b”及び“d”がヒト型化H鎖で高い活性を示すと考えられるバージョンであった。 (Iv) Combination of humanized H chain versions “b”, “c” and “d” with chimeric L chain An antibody obtained by combining a humanized H chain upgraded by FR-shuffling with a chimeric L chain (each “ b-ch ”,“ c-ch ”, and“ d-ch ”) were prepared, and the antigen-binding ability was examined by cell ELISA. As a result,“ d-ch ”showed the same antigen-binding activity as the chimeric antibody. As a result, “b-ch” and “c-ch” exhibited slightly inferior antigen binding activity (FIGS. 5 and 6). On the other hand, the antigen-neutralizing ability was almost the same for "b-ch" and slightly weaker for "d-ch" than the positive control chimeric antibody. The version "c-ch" had much weaker activity than the chimeric antibody (FIG. 7). Therefore, the humanized H chain versions "b" and "d" were the versions considered to show high activity in the humanized H chain.

（v）ヒト型化H鎖バージョン“b”とヒト型化L鎖バージョン“a”との組合せ
　FR-シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化H鎖バージョン“b”とヒト型化L鎖バージョン“a”を組み合わせた抗体（b-a）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、高濃度で抗原に対する結合量が低下していた（図5）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、かなり弱い活性であった（図8）。よって“b-a”が“a-a”より高い活性を示すバージョンであった。なお、ここで用いたキメラ抗体はCOS-7細胞で発現させ精製した抗体を用い評価したものである。 (V) Combination of humanized H chain version “b” and humanized L chain version “a” Humanized H chain version “b” and humanized L chain version “a” upgraded by FR-shuffling Was prepared, and the antigen-binding ability was examined by cell ELISA. As a result, the binding amount to the antigen was reduced at a high concentration (FIG. 5). On the other hand, the antigen neutralizing ability was considerably weaker than that of the positive control chimeric antibody (FIG. 8). Therefore, "ba" was a version showing higher activity than "aa". The chimeric antibody used here was evaluated using an antibody expressed and purified in COS-7 cells.

（vi）ヒト型化L鎖バージョン“b”、“c”とキメラH鎖との組合せ
　ヒト型化L鎖バージョン“b”及び“c”をキメラH鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ch-b”、“ch-c”）を作製したところ、いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体と同等の活性を示した（図9及び10）。よってバージョン“b”及び“c”をヒト型化抗体L鎖の候補とした。マウス抗体由来のアミノ酸残基数が1つ少ないバージョン“b”の方がバージョン“c”より抗原性の点で優れていると考えられる。なお、ここで用いたキメラ抗体はCHO細胞DG44で発現させ精製した抗体を用い評価したもので、これ以降の評価でもこの抗体を陽性対照に用いた。 (Vi) Combination of humanized L chain versions "b" and "c" with chimeric H chain An antibody obtained by combining humanized L chain versions "b" and "c" with a chimeric H chain ("ch- b "and" ch-c "), all antibodies showed the same activity as the chimeric antibody in both antigen binding ability and antigen neutralizing ability (FIGS. 9 and 10). Therefore, versions "b" and "c" were used as humanized antibody L chain candidates. Version "b", which has one less amino acid residue from the mouse antibody, is considered to be superior to version "c" in terms of antigenicity. The chimeric antibody used herein was evaluated using an antibody expressed and purified in CHO cells DG44, and this antibody was used as a positive control in the subsequent evaluations.

（vii）ヒト型化H鎖バージョン“b”とヒト型化L鎖バージョン“b”及び“c”との組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“b”をヒト型化L鎖バージョン“b”及び“c”と組み合わせた抗体（それぞれ“b-b”及び“b-c”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。いずれの抗体も抗原結合能、抗原中和能ともにキメラ抗体よりわずかに劣る活性を示した（図11及び12）。 (Vii) Combination of humanized H chain version “b” and humanized L chain versions “b” and “c” Humanized H chain version “b” is converted to humanized L chain versions “b” and “ Antibodies ("bb" and "bc", respectively) combined with "c" were prepared, and their antigen-binding ability and antigen-neutralizing ability were measured. All antibodies showed slightly lower activity than chimeric antibodies in both antigen binding ability and antigen neutralizing ability (FIGS. 11 and 12).

（viii）ヒト型化H鎖バージョン“b”及び“d”とヒト型化L鎖バージョン“b”との組合　　　　せ
　FR-シャッフリングによってバージョンアップしたヒト型化H鎖とヒト型化L鎖バージョン“b”を組み合わせた抗体（それぞれ“b-b”及び“d-b”）を作製し、cell ELISAにて抗原結合能を調べたところ、“d-b”はキメラ抗体と同等の抗原結合活性が認められ、“b-b”は高濃度でわずかに劣る抗原結合活性を示した（図13）。一方、抗原中和能は陽性対照のキメラ抗体に比べて、“b-b”はわずかに弱い活性で、“d-b”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図14）。よって“b-b”は抗原活性中和能の高いバージョン、“d-b”は抗原結合能の高いバージョンであることが示された。 (Viii) Combination of humanized H chain versions "b" and "d" with humanized L chain version "b" Humanized H chain and humanized L chain version upgraded by FR-shuffling Antibodies ("bb" and "db", respectively) combined with "b" were prepared, and the antigen-binding ability was examined by cell ELISA. As a result, "db" showed the same antigen-binding activity as the chimeric antibody. "" Showed slightly inferior antigen binding activity at high concentrations (FIG. 13). On the other hand, as for the antigen neutralizing ability, "bb" had a slightly weaker activity and "db" had a considerably weaker activity than the chimeric antibody as a positive control chimeric antibody (FIG. 14). Therefore, it was shown that "bb" is a version having high antigen activity neutralizing ability, and "db" is a version having high antigen binding ability.

　（ix）ヒト型化H鎖バージョン“e”とキメラL鎖及びヒト型化L鎖バージョン“b”との　　　　組合せ
　ヒト型化L鎖バージョン“e”をキメラL鎖及びヒト型化バージョン“b”と組み合わせた抗体（それぞれ“e-ch”及び“e-b”）を作製したところ、“e-ch”の抗原結合能はキメラ抗体と同等の活性を示したが、“e-b”は抗体の発現量が非常に低く、且つ抗原結合能も殆ど喪失していた（図15）。また“e-ch”の抗原活性中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図16）。よってH鎖バージョン“e”はL鎖バージョン“b”との組合せが悪いと考えられた。 (Ix) Combination of humanized H chain version “e” with chimeric L chain and humanized L chain version “b” Humanized L chain version “e” is converted into chimeric L chain and humanized version “b” ("E-ch" and "eb", respectively), the antigen binding ability of "e-ch" showed the same activity as the chimeric antibody, but "eb" showed the expression level of the antibody. Was very low, and the antigen binding ability was almost lost (FIG. 15). The antigen-neutralizing ability of “e-ch” was considerably weaker than that of the chimeric antibody (FIG. 16). Therefore, the combination of the H chain version “e” and the L chain version “b” was considered to be bad.

（x）ヒト型化H鎖バージョン“f”、“g”及び“h”とヒト型化L鎖バージョン“b”との　　 組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“f”、“g”及び“h”をヒト型化L鎖バージョン“b”と組み合わせた抗体を（それぞれ“f-b”、“g-b”及び“h-b”）作製したところ、“f-b”及び“h-b”の抗体は抗体の発現量が非常に低くかった。なお、バージョン“f”、“h”についてはキメラL鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。“g-b”は低い濃度から飽和状態に達し、キメラ抗体より弱い抗原結合能を示した（図17）。“g-b”の抗原中和能は、キメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図18）。 (X) Combination of humanized heavy chain versions “f”, “g” and “h” with humanized light chain version “b” Humanized heavy chain versions “f”, “g” and “h” Were combined with humanized L chain version “b” (“fb”, “gb” and “hb”, respectively). The antibodies of “fb” and “hb” showed very high antibody expression levels. It was low. In addition, an antibody in combination with the chimeric L chain was prepared for versions “f” and “h”, but was not expressed. “Gb” reached saturation from a low concentration and showed weaker antigen binding ability than the chimeric antibody (FIG. 17). The antigen neutralizing ability of “gb” was considerably weaker than that of the chimeric antibody (FIG. 18).

（xi）ヒト型化H鎖バージョン“b1”及び“d1”とヒト型化L鎖バージョン“b”との組合　　　せ
　ヒト型化H鎖バージョン“b1”及び“d1”をヒト型化L鎖バージョン“b”と組み合わせた抗体を（それぞれ“b1-b”及び“d1-b”）作製したところ、ともに抗体は殆ど発現されなかった。なお、これらについてはキメラL鎖と組み合わせた抗体も作製したが、発現されなかった。 (Xi) Combination of humanized H chain versions "b1" and "d1" and humanized L chain version "b" Humanized H chain versions "b1" and "d1" are humanized L chain versions When antibodies in combination with "b" were produced ("b1-b" and "d1-b", respectively), almost no antibodies were expressed. For these, antibodies in combination with the chimeric L chain were also prepared, but were not expressed.

（xii）ヒト型化H鎖バージョン“b3”及び“d3”とヒト型化L鎖バージョン“b”との組合　　　 せ
　ヒト型化H鎖バージョン“b3”及び“d3”をヒト型化L鎖バージョン“b”と組み合わせた抗体を（それぞれ“b3-b”及び“d3-b”）作製したところ、“d3-b”の抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っており、“b3-b”の抗原結合能はさらに劣っていた（図19）。“b3-b”の抗原中和能は“b-b”より上回る活性を示したものの、キメラ抗体の活性には及ばず、“d3-b”は“b-b”と同程度の活性にとどまった（図20）。 (Xii) Combination of humanized H chain versions "b3" and "d3" and humanized L chain version "b" Humanized H chain versions "b3" and "d3" are humanized L chain versions When antibodies in combination with "b" were prepared ("b3-b" and "d3-b", respectively), the antigen-binding ability of "d3-b" was slightly inferior to that of the chimeric antibody, and "b3-b" Had an even lower antigen binding ability (FIG. 19). Although the antigen neutralizing ability of “b3-b” was higher than that of “bb”, it did not reach the activity of the chimeric antibody, and “d3-b” was only as active as “bb” (Fig. 20).

（xiii）ヒト型化H鎖バージョン“i”及び“j”とキメラL鎖及びヒト型化L鎖バージョン　　　　“b”との組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“i”及び“j”をキメラL鎖と組み合わせた抗体（それぞれ“i-ch”及び“j-ch”）とヒト型化L鎖バージョン“b”と組み合わせた抗体（それぞれ“i-b”及び“j-b”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はいずれの抗体もキメラ抗体とほぼ同等の活性を示した（図21、22）。“i-ch”にはキメラ抗体の活性を上回る抗原中和能が認められ、“j-ch”の抗原中和能はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図23）。“i-b”はキメラ抗体と同等の活性が認められ、“j-b”はキメラ抗体に比べかなり弱い活性であった（図24）。 (Xiii) Combination of humanized H chain versions "i" and "j" with chimeric L chain and humanized L chain version "b" Humanized H chain versions "i" and "j" are combined with chimeric L chain Antibody ("i-ch" and "j-ch", respectively) and humanized light chain version "b"("ib" and "jb", respectively) to produce an antibody Antigen neutralizing ability was measured. All the antibodies exhibited almost the same antigen binding activity as the chimeric antibody (FIGS. 21 and 22). “I-ch” showed an antigen neutralizing ability exceeding the activity of the chimeric antibody, and “j-ch” had a much weaker antigen neutralizing ability than the chimeric antibody (FIG. 23). “Ib” had activity equivalent to that of the chimeric antibody, and “jb” had considerably weaker activity than the chimeric antibody (FIG. 24).

（xiv）ヒト型化L鎖バージョン“b1”及び“b2”
　ヒト型化L鎖バージョン“b1”及び“b2”をキメラH鎖と組み合わせた抗体（それぞれ、“ch-b1”及び“ch-b2”）を作製したところ、いずれの抗体もキメラ抗体と同等の抗原結合能を示した（図25）。抗原中和能については、“ch-b1”ではキメラ抗体と同等の活性を示し、“ch-b2”では高濃度側でキメラ抗体を若干上回る活性が認められた（図26）。バージョン“b1”及び“b2”ともにヒト型化抗体L鎖の候補になり得るが、より強い活性を有するという点でバージョン“b2”の方が優れている。 (Xiv) humanized light chain versions "b1" and "b2"
Antibodies ("ch-b1" and "ch-b2", respectively) in which the humanized L chain versions "b1" and "b2" were combined with the chimeric H chain were prepared. The antigen binding ability was shown (FIG. 25). With respect to the antigen neutralizing ability, "ch-b1" exhibited an activity equivalent to that of the chimeric antibody, and "ch-b2" exhibited an activity slightly higher than that of the chimeric antibody on the high concentration side (FIG. 26). Both versions "b1" and "b2" can be candidates for humanized antibody L chain, but version "b2" is superior in that it has stronger activity.

（xv）ヒト型化H鎖バージョン“b”とヒト型化L鎖バージョン“b2”との組合せ
　ヒト型化H鎖バージョン“b”をヒト型化L鎖バージョン“b2”と組み合わせた抗体（“b-b2”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。抗原結合能はキメラ抗体よりわずかに劣っていた（図27）。抗原中和能は“b-b”の活性を上回ったものの、“i-b”の活性には及ばなかった（図28）。 (Xv) Combination of humanized H chain version “b” and humanized L chain version “b2” An antibody obtained by combining humanized H chain version “b” with humanized L chain version “b2” (“ b-b2 ″) was prepared, and the antigen-binding ability and antigen-neutralizing ability were measured. The antigen binding ability was slightly inferior to the chimeric antibody (FIG. 27). Although the antigen neutralizing ability exceeded the activity of "bb", it did not reach the activity of "ib" (FIG. 28).

（xvi）ヒト型化H鎖バージョン“i”とヒト型化L鎖バージョン“b1”又は“b2”との組合　　　 せ
　ヒト型化H鎖バージョン“i”をヒト型化L鎖バージョン“b1”又は“b2”と組み合わせた抗体（それぞれ“i-b1”及び“i-b2”）を作製し、抗原結合能及び抗原中和能を測定した。“i-b2”の抗原結合能はキメラ抗体とほぼ同等で、“i-b1”はわずかに劣る程度であった（図29）。また、“i-b1”及び“i-b2”の抗原中和能はキメラ抗体や“i-b”を上回る活性を示し、“i-b2”>“i-b1”の順に強かった（図30）。 (Xvi) Combination of humanized H chain version “i” and humanized L chain version “b1” or “b2” Humanized H chain version “i” is converted to humanized L chain version “b1” or Antibodies ("i-b1" and "i-b2", respectively) combined with "b2" were prepared, and their antigen-binding ability and antigen-neutralizing ability were measured. The antigen-binding ability of “i-b2” was almost the same as that of the chimeric antibody, and “i-b1” was slightly inferior (FIG. 29). The antigen-neutralizing ability of “i-b1” and “i-b2” was higher than that of the chimeric antibody or “ib”, and was stronger in the order of “i-b2”> “i-b1” (FIG. 30). .

実施例5.　CHO細胞産生ヒト型化抗体の作製及び活性評価
（1）CHO安定産生細胞株の樹立
　ヒト型化抗体（b-b、i-b及びi-b2）の安定産生細胞株を樹立するため、無血清培地に馴化したCHO細胞（DG44）に抗体発現遺伝子ベクターを導入した。 Example 5. Preparation of CHO cell-producing humanized antibody and evaluation of activity (1) Establishment of stable CHO-producing cell line In order to establish a stable cell line of humanized antibody (bb, ib and i-b2), The antibody expression gene vector was introduced into CHO cells (DG44) conditioned to serum medium.

　プラスミドDNA、hHvb-hLvb／N5KG4P、hHvi-hLvb／N5KG4P及びhHvi-hLvb2／N5KG4Pを制限酵素SspI（宝酒造）で切断して直鎖状にし、フェノール及びクロロフォルム抽出した後、エタノール沈殿により精製した。エレクトロポーレーション装置（Gene Pulser;Bio Rad）により、直鎖状にした発現遺伝子ベクターをDG44細胞に導入した。DG44細胞をPBSに1×107 ／mlの細胞密度で懸濁し、この懸濁液約0.8mlに前記のDNAを10もしくは50μgを加え、1,500V,25μFの静電容量にてパルスを与えた。 Plasmid DNA, hHvb-hLvb / N5KG4P, hHvi-hLvb / N5KG4P and hHvi-hLvb2 / N5KG4P were cut into linear forms by restriction enzyme SspI (Takara Shuzo), extracted with phenol and chloroform, and purified by ethanol precipitation. The linearized expression gene vector was introduced into DG44 cells using an electroporation apparatus (Gene Pulser; Bio Rad). DG44 cells were suspended in PBS at a cell density of 1 × 10 7 / ml, 10 or 50 μg of the above DNA was added to about 0.8 ml of the suspension, and pulses were applied at a capacitance of 1,500 V and 25 μF. .

　室温にて10分間の回復期間の後、ヒポキサンチン-チミジン（GIBCO）（以下、HT）を含有するCHO-S-SFMII培地に処理された細胞を懸濁し、2枚の96穴平底プレート（Falcon）に100μl／穴となるように播種し、CO2 インキュベーターにて培養した。培養開始8〜9時間後にHT及び1mg／mlのGENETICIN （GIBCO）を含有するCHO-S-SFMII培地を100μl／穴加え、500μg／mlのGENETICIN選択培地に変換し、抗体遺伝子の導入された細胞を選択した。3〜4日に一度1／2量の培地を新鮮な培地と交換し、選択培地への変換から約2週間経過した時点で、その4〜5日後に細胞の順調な増殖が観察された穴の培養上清の一部を回収した。この培養上清中に発現された抗体濃度を前述の抗体濃度測定ELISAにより測定し、抗体産生量の高い細胞を選出した。 After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the treated cells were suspended in a CHO-S-SFMII medium containing hypoxanthine-thymidine (GIBCO) (hereinafter, HT), and two 96-well flat bottom plates (Falcon ) Was seeded at 100 μl / well and cultured in a CO 2 incubator. Eight to nine hours after the start of the culture, 100 μl / well of CHO-S-SFMII medium containing HT and 1 mg / ml GENETICIN (GIBCO) was added, the cells were converted to a 500 μg / ml GENETICIN selective medium, and the cells into which the antibody gene had been introduced. Was selected. One half of the medium was replaced with fresh medium once every 3 to 4 days, and approximately 2 weeks after the conversion to the selective medium, 4 to 5 days after that, the wells where cell growth was observed to be good A part of the culture supernatant was recovered. The concentration of the antibody expressed in the culture supernatant was measured by the above-described antibody concentration measurement ELISA, and cells having a high antibody production were selected.

（2）ヒト型化抗体の大量精製
　前記のように選出したヒト型化抗体（“b-b”、“i-b”及び“i-b2”）発現DG44細胞株を2Lローラーボトル（CONING）を用い、500ml／ボトルのCHO-S-SFMII培地中で数日培養後、培養液を回収して新鮮なCHO-S-SFMII培地を加え、再び培養した。培養液は遠心分離により細胞破片を除去し、0.22μmもしくは0.45μmのフィルターで濾過した。これを繰り返し、それぞれ全量約2Lの培養上清を得た。得られた培養上清を Protein Aアフィニティーカラム（Poros）を接続したConSep LC100システム（ミリポア）にて抗体を精製した。 (2) Large-scale purification of humanized antibody The humanized antibody ("bb", "ib" and "i-b2")-expressing DG44 cell line selected as described above was used for 500 ml using a 2L roller bottle (CONING). After culturing for several days in a CHO-S-SFMII medium / bottle, the culture solution was recovered, fresh CHO-S-SFMII medium was added, and the cells were cultured again. The culture broth was centrifuged to remove cell debris and filtered through a 0.22 μm or 0.45 μm filter. This was repeated to obtain a total of about 2 L of the culture supernatant. The antibody was purified from the obtained culture supernatant using a ConSep LC100 system (Millipore) connected to a Protein A affinity column (Poros).

（3）ELISAによる抗体濃度の測定
　抗体濃度測定のためのELISAプレートを次のようにして調製した。ELISA用96穴プレート（Maxisorp, NUNC）の各穴をCBで1μg／mlの濃度に調製したヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlで固相化し、200μlのDBでブロッキングの後、抗体を発現させたCOS細胞の培養上清あるいは精製抗体をDBにて段階希釈して各穴に加えた。 (3) Measurement of antibody concentration by ELISA An ELISA plate for antibody concentration measurement was prepared as follows. Each well of a 96-well ELISA plate (Maxisorp, NUNC) was immobilized with 100 µl of a goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) prepared with CB to a concentration of 1 µg / ml, and after blocking with 200 µl of DB, the antibody was expressed. The culture supernatant of the COS cells or the purified antibody was serially diluted with DB and added to each well.

　1時間室温にてインキュベートしRBで洗浄後、DBで1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを加えた。1時間室温にてインキュベートしRBで洗浄の後、基質溶液を100μl加え、405／655nmでの吸光度をmicroplate reader（Bio Rad）で測定した。濃度測定のスタンダードとしてIgG4κ（The Binding Site）を用いた。 After incubation at room temperature for 1 hour and washing with RB, 100 μl of an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) diluted 1000-fold with DB was added. After incubating for 1 hour at room temperature and washing with RB, 100 μl of the substrate solution was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured with a microplate reader (Bio Rad). IgG4κ (The Binding Site) was used as a standard for concentration measurement.

（4）抗原結合能の測定
　抗原結合測定のためのCell ELISAプレートでは、次のようにして調製した。細胞はヒト膀胱癌細胞J82（ATCC HTB-1）を用いた。細胞培養用96穴プレートに1×106 個のJ82細胞を播き込んだ。これをCO2インキュベーターで1日培養し（10％の牛胎児血清（GIBCO）を含むRPMI1640培地）、細胞を接着させた。培養液を捨て、PBSで各穴を2回洗浄した。PFA／PBSを各穴に100μl加え、氷上で10分間静置し、細胞を固相化した。 (4) Measurement of antigen binding ability A Cell ELISA plate for antigen binding measurement was prepared as follows. The cells used were human bladder cancer cells J82 (ATCC HTB-1). 1 × 10 6 J82 cells were seeded on a 96-well plate for cell culture. This was cultured in a CO2 incubator for one day (RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum (GIBCO)) to allow the cells to adhere. The culture solution was discarded, and each well was washed twice with PBS. 100 μl of PFA / PBS was added to each well, and left still on ice for 10 minutes to immobilize the cells.

　PFA／PBSを捨て、300μlのPBSで各穴を2回洗浄後、250μlのDBでブロッキングした。精製抗体を上測定結果をもとに、DBにて10μg／mlより公比2で段階希釈して100μlを各穴に加えた。室温にて2時間インキュベートしRBで洗浄後、DBで1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGγ抗体（BioSource）100μlを加えた。室温にて1時間インキュベートしRBで洗浄ののち、基質溶液を100μl加え、次に405／655nmでの吸光度をMicroplate Reader （Bio-Rad）で測定した。 The PFA / PBS was discarded, and each well was washed twice with 300 µl of PBS, and then blocked with 250 µl of DB. Based on the above measurement results, the purified antibody was serially diluted with DB at 10 μg / ml at a common ratio of 2, and 100 μl was added to each well. After incubation at room temperature for 2 hours and washing with RB, 100 μl of an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgGγ antibody (BioSource) diluted 1000-fold with DB was added. After incubating at room temperature for 1 hour and washing with RB, 100 μl of the substrate solution was added, and then the absorbance at 405/655 nm was measured with a Microplate Reader (Bio-Rad).

（5）TF中和活性（ファクターXa産生阻害活性）の測定
　ヒト型化抗体のファクターXa産生阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S（Behringwerke AG）による Factor Xa産生阻害活性を指標に測定した。すなわち、5mg／mlのThromborel S 10μlと抗体10μlに緩衝液（5mMのCaCl2 、0.1％のBSAを含むTBS）60μlを加え、96穴プレート中で室温で1時間反応させた。抗体は緩衝液で200μg／mlより公比5で段階希釈した。 (5) Measurement of TF neutralizing activity (Factor Xa production inhibitory activity) The factor Xa production inhibitory activity of the humanized antibody was measured using Factor Xa production inhibitory activity by human placenta-derived thromboplastin, Thromborel S (Behringwerke AG) as an index. . That is, 10 μl of 5 mg / ml Thromborel S and 10 μl of an antibody were added with 60 μl of a buffer (TBS containing 5 mM CaCl 2 and 0.1% BSA), and reacted at room temperature for 1 hour in a 96-well plate. The antibody was serially diluted with a buffer at a common ratio of 5 from 200 μg / ml.

　これに3.245μg／mlのヒトファクターX（セルサス・ラボラトリーズ）及び82.5ng／mlのヒトファクターVIIa（エンザイム・リサーチ）をそれぞれ10μl加え、さらに室温で45分間反応させた。0.5MのEDTAを10μl加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を50μl加え、Microplate Reader （Bio Rad）で405／655nmの吸光度を測定した。室温で30分間反応させ、再度405／655nmの吸光度を測定した。抗体無添加の30分間の吸光度変化を100％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
　発色基質溶液はテストチーム発色基質S-2222（Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（0.6mg／ml ヘキサジメチリンブロマイド、SIGMA）と1：1で混和し調製した。 To this, 10 μl each of 3.245 μg / ml human factor X (Celsus Laboratories) and 82.5 ng / ml human factor VIIa (Enzyme Research) were added, and the mixture was further reacted at room temperature for 45 minutes. The reaction was stopped by adding 10 μl of 0.5 M EDTA. To this, 50 μl of a coloring substrate solution was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured using a Microplate Reader (Bio Rad). The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes, and the absorbance at 405/655 nm was measured again. The change in absorbance for 30 minutes without addition of the antibody was defined as 100% activity, and the remaining activity (%) was calculated from each change in absorbance.
The chromogenic substrate solution was prepared by dissolving the test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) according to the package insert and mixing 1: 1 with a polybrene solution (0.6 mg / ml hexadimethylinbromide, SIGMA).

（6）TF中和活性（ファクターX結合阻害活性）の測定
　ヒト型化抗体のファクターX結合阻害活性は、ヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S（Behringwerke AG）を用い、予めTFとFactor VIIaの複合体を形成させ、その複合体の Factor Xa産生阻害活性を指標にファクターX結合阻害活性を測定した。すなわち、5mg／mlのThromborel S 10μlと82.5ng／mlのヒトFactor VIIa（エンザイム・リサーチ）10μlに緩衝液（5mMのCaCl2、0.1％のBSAを含むTBS）60μlを加え、96穴プレート中で室温で予め1時間反応させた。 (6) Measurement of TF neutralizing activity (Factor X binding inhibitory activity) The factor X binding inhibitory activity of the humanized antibody was determined using a human placenta-derived thromboplastin, Thromborel S (Behringwerke AG), and a complex of TF and Factor VIIa in advance. Was formed, and the Factor X binding inhibitory activity was measured using the Factor Xa production inhibitory activity of the complex as an index. That is, 10 μl of 5 mg / ml Thromborel S and 10 μl of 82.5 ng / ml human Factor VIIa (Enzyme Research) were added with 60 μl of a buffer (TBS containing 5 mM CaCl 2 and 0.1% BSA), and placed in a 96-well plate at room temperature. For 1 hour in advance.

　これに抗体溶液を10μl加え、室温で5分間反応させた後、3.245μg／mlのヒトFactor X（セルサス・ラボラトリーズ）を10μl加え、さらに室温で45分間反応させた。なお抗体は緩衝液で200μg／mlより公比2で段階希釈した。0.5MのEDTAを10μl加え、反応を停止させた。これに発色基質溶液を50μl加え、Microplate Reader（Bio Rad）で405／655nmの吸光度を測定した。室温で30分間反応させ、再度405／655nmの吸光度を測定した。抗体無添加の30分間の吸光度変化を100％の活性とし、それぞれの吸光度変化から残存活性（％）を算出した。
　発色基質溶液はテストチーム発色基質S-2222（Chromogenix）を添付文書に従い溶解し、ポリブレン液（0.6mg／ml ヘキサジメチリンブロマイド、SIGMA）と1：1で混和し調製した。 10 μl of the antibody solution was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature for 5 minutes. Then, 10 μl of 3.245 μg / ml human Factor X (Celsus Laboratories) was added, and the mixture was further reacted at room temperature for 45 minutes. The antibody was serially diluted with a buffer at a common ratio of 2 from 200 μg / ml. The reaction was stopped by adding 10 μl of 0.5 M EDTA. To this, 50 μl of a coloring substrate solution was added, and the absorbance at 405/655 nm was measured using a Microplate Reader (Bio Rad). The reaction was carried out at room temperature for 30 minutes, and the absorbance at 405/655 nm was measured again. The change in absorbance for 30 minutes without addition of the antibody was defined as 100% activity, and the remaining activity (%) was calculated from each change in absorbance.
The chromogenic substrate solution was prepared by dissolving the test team chromogenic substrate S-2222 (Chromogenix) according to the package insert and mixing 1: 1 with a polybrene solution (0.6 mg / ml hexadimethylinbromide, SIGMA).

（7）TF中和活性（血漿凝固阻害活性）の測定
　ヒト型化抗体のTF中和活性（血漿凝固阻害活性）はヒト胎盤由来トロンボプラスチン、Thromborel S（Behringwerke AG）を用いたプロトロンビン時間を指標に測定した。すなわち、サンプルカップにヒト血漿（コスモ・バイオ）100μlを入れ、これに様々な濃度に希釈した抗体を50μl加え、37℃で3分間加温した。予め37℃に加温しておいた1.25mg／mlのThromborel Sを50μl加え、血漿凝固を開始させた。この凝固時間はAmelung CR-Aを接続したAmelung KC-10A（ともにエム・シー・メディカル）にて測定した。 (7) Measurement of TF neutralizing activity (plasma coagulation inhibitory activity) The TF neutralizing activity (plasma coagulation inhibitory activity) of the humanized antibody is measured by using prothrombin time using thromboplastin derived from human placenta and Thromborel S (Behringwerke AG). It was measured. That is, 100 μl of human plasma (Cosmo Bio) was placed in a sample cup, 50 μl of antibody diluted to various concentrations was added thereto, and the mixture was heated at 37 ° C. for 3 minutes. 50 μl of 1.25 mg / ml Thromborel S pre-warmed to 37 ° C. was added to initiate plasma coagulation. The coagulation time was measured using Amelung KC-10A (both MC Medical) connected to Amelung CR-A.

　抗体は80μg／mlより公比2で0.1％のBSAを含有するTBS（以下、BSA-TBS）にて段階希釈した。測定した抗体無添加の凝固時間を100％のTF血漿凝固活性とし、Thromborel Sの濃度と凝固時間をプロットした検量線により抗体を添加した際のそれぞれの凝固時間からTF残存活性を算出した。
　検量線は様々なThromborel Sの濃度とその凝固時間を測定することにより作成した。適当に希釈したThromborel S、50μlに50μlのBSA-TBSを加え、37℃で3分間加温し、予め37℃に加温しておいたヒト血漿を100μl加えて凝固を開始させ凝固時間を測定した。Thromborel Sは6.25mg／mlより公比2で25mMのCaCl2を含むハンクス緩衝液（GIBCO）にて段階希釈した。横軸にThromborel S濃度、縦軸に凝固時間を両対数グラフにプロットし、これを検量線とした。 The antibody was serially diluted with TBS containing 0.1% BSA at a common ratio of 2 from 80 μg / ml (hereinafter, BSA-TBS). The measured coagulation time without addition of the antibody was defined as 100% TF plasma coagulation activity, and the TF residual activity was calculated from the respective coagulation times when the antibody was added using a calibration curve plotting the concentration of Thromborel S and the coagulation time.
Calibration curves were created by measuring the concentrations of various Thromborel S and their clotting times. Add 50 μl of BSA-TBS to 50 μl of appropriately diluted Thromborel S, heat at 37 ° C. for 3 minutes, add 100 μl of human plasma pre-warmed to 37 ° C., start coagulation, and measure coagulation time did. Thromborel S was serially diluted with Hanks' buffer (GIBCO) containing 25 mM CaCl 2 at a common ratio of 2 from 6.25 mg / ml. The abscissa plots Thromborel S concentration and the ordinate plots coagulation time on a log-log graph, which was used as a calibration curve.

（8）活性の評価
　“b-b”、“i-b”及び“i-b2”のヒト型化抗体すべてはキメラ抗体と同等以上の活性を有していた（図31）。Factor Xa産生阻害活性、Factor X結合阻害活性及び血漿凝固阻害活性においても、ヒト型化抗体“b-b”、“i-b”及び“i-b2”はキメラ抗体と同等以上の活性を有しており、“i-b2”>“i-b”>“b-b”の順に活性が強かった（図32、33及び34）。 (8) Evaluation of Activity All humanized antibodies “bb”, “ib” and “i-b2” had an activity equal to or higher than that of the chimeric antibody (FIG. 31). Factor Xa production inhibitory activity, Factor X binding inhibitory activity and plasma coagulation inhibitory activity, the humanized antibody "bb", "ib" and "i-b2" have at least the same activity as the chimeric antibody, The activity was strong in the order of “i-b2”>“ib”> “bb” (FIGS. 32, 33 and 34).

実施例6.　BIACOREを用いたTFと抗TF抗体の相互作用における反応速度論的解析
　BIACOREを用いて、抗原抗体反応の速度論的解析を行った。組換型ProteinGをセンサーチップに固相化し、これに抗体を結合させた。抗原として精製した組換型TF（1-219にFLAGペプチドタグを付した可溶型TF）（以下、可溶型TFと称す）を用い、種々の濃度に調製した可溶型TFをアナライトとした。得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーター（解離速度定数kdiss及び結合速度定数kass）を算出した。速度論的解析に関して、「Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system 」（karlsson, R. et al. （1991） J. Immunol. Methods 145, 229-240.）を参考にした。 Example 6. Kinetic analysis of interaction between TF and anti-TF antibody using BIACORE Kinetic analysis of the antigen-antibody reaction was performed using BIACORE. Recombinant Protein G was immobilized on a sensor chip, and an antibody was bound thereto. Using recombinant TF purified as a antigen (soluble TF obtained by adding a FLAG peptide tag to 1-219) (hereinafter referred to as soluble TF), soluble TF prepared at various concentrations was used as an analyte. And Kinetic parameters (dissociation rate constant kdiss and association rate constant kass) were calculated from the obtained sensorgram. For kinetic analysis, reference was made to "Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interactions with a new biosensor based analytical system" (karlsson, R. et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240.) .

（1）センサーチップへの Protein Gの固相化
　センサーチップCM5（BIACORE）へProtein G（ZYMED）を固相化する。
　ランニングバッファーとしてHBS-EP 緩衝液（0.01M　HEPES pH7.4, 0.15M NaCl, 3mMEDTA, 0.005％ ポリソルベート　20（v／v））（BIACORE） を用い、流速は5μL／分とした。センサーチップCM5上のカルボキシメチルデキストランのカルボキシル基を100μLの0.05M N-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）／0.2M 塩酸N-エチル-N' -（3-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド（EDC）のインジェクトにより活性化した。 (1) Immobilization of Protein G to sensor chip Immobilize Protein G (ZYMED) to sensor chip CM5 (BIACORE).
HBS-EP buffer (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% polysorbate 20 (v / v)) (BIACORE) was used as a running buffer, and the flow rate was 5 μL / min. The carboxyl group of carboxymethyl dextran on the sensor chip CM5 was converted to 100 μL of 0.05M N-hydroxysuccinimide (NHS) /0.2M N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (EDC) hydrochloride Activated by JECT.

　引き続き、10μLの50μg／mL Protein Gをインジェクトし、これを3回行って固相化した。Protein Gは10mg／mlになるように10mMトリス-塩酸緩衝液（pH7.5）に溶解し、10mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.0）にて50μg／mLに希釈し調製した。さらに100μLの1.0Mエタノールアミン-塩酸（pH8.5）をインジェクトし、過剰の活性基をブロックした。これに10μLの0.1Mグリシン-塩酸緩衝液（pH2.5）および10μLの10mM塩酸をインジェクトし、非共有結合している物質を洗浄した。これを各フローセルについて行い、72nMのヒト型化抗TF抗体バージョン“ib2”を10μLインジェクトし、約1000RU結合することを確認した。 Subsequently, 10 μL of 50 μg / mL Protein G was injected, and this was performed three times to immobilize the protein. Protein G was dissolved in 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) so as to be 10 mg / ml, and diluted to 50 μg / mL with 10 mM sodium acetate buffer (pH 4.0). Further, 100 μL of 1.0 M ethanolamine-hydrochloric acid (pH 8.5) was injected to block excess active groups. To this, 10 μL of 0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer (pH 2.5) and 10 μL of 10 mM hydrochloric acid were injected to wash non-covalently bound substances. This was performed for each flow cell, and 10 μL of a humanized anti-TF antibody version “ib2” of 72 nM was injected to confirm that about 1000 RU was bound.

（2）固相化抗TF抗体とヒトTFとの相互作用
　ヒトTFは、アミノ酸配列1-219のC末端にFLAGペプチドを連結させたものをCHO細胞にて発現させて精製した。これを可溶型ヒトTFとして用いた。 (2) Interaction between immobilized anti-TF antibody and human TF Human TF was purified by expressing in a CHO cell a product obtained by linking the FLAG peptide to the C-terminal of amino acid sequence 1-219. This was used as soluble human TF.

　ランニングバッファーとしてHBS-EP 緩衝液を用い、流速20μL／分で72nMの抗体溶液を10μLインジェクトし、抗体を固相化した。抗体の希釈はHBS-EP 緩衝液を用いて行った。これに各種濃度の可溶型ヒトTF溶液40μLを流速30μL／分でインジェクトし、分析はインジェクトする80秒を結合相とし、その後HBS-EP 緩衝液に切り替え、120秒の解離相とした。解離相終了後、10μLの20mM塩酸をインジェクトすることにより、センサーチップを再生した。この結合・解離・再生を分析の1サイクルとし、各種抗体についてセンサーグラムを得た。なお、可溶型ヒトTF溶液はHBS-EP 緩衝液を用い、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM、15.6nM、7.81nM、3.91nMの濃度に調製した。また、ブランクには希釈に用いたHBS-EP 緩衝液をインジェクトして得られたセンサーグラムを用いた。
　以上のことをフローセルの1〜3それぞれで行った。 Using a HBS-EP buffer as a running buffer, 10 μL of a 72 nM antibody solution was injected at a flow rate of 20 μL / min to immobilize the antibody. Antibody dilution was performed using HBS-EP buffer. To this, 40 μL of soluble human TF solutions of various concentrations were injected at a flow rate of 30 μL / min, and the analysis was performed using the injection phase of 80 seconds as the binding phase. . After completion of the dissociation phase, the sensor chip was regenerated by injecting 10 μL of 20 mM hydrochloric acid. This binding / dissociation / regeneration was regarded as one cycle of analysis, and sensorgrams were obtained for various antibodies. The soluble human TF solution was prepared at a concentration of 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM, 15.6 nM, 7.81 nM, and 3.91 nM using HBS-EP buffer. As a blank, a sensorgram obtained by injecting the HBS-EP buffer used for dilution was used.
The above was performed for each of the flow cells 1 to 3.

（3）相互作用の速度論的解析
　目的のデータファイルを読み込み、目的の反応領域について、HBS-EP 緩衝液のセンサーグラムをベースラインとして、重ね書きによる反応パターンの比較を行った。さらにカーブフィッティングによるカイネティクスパラメーター（結合速度定数kass及び解離速度定数kdiss）の算定を行う BIACORE専用の解析アプリケーションソフトウェアである「BIAevaluation 2.1 」（Pharmacia） を用いて、相互作用の速度論的解 析を行った。なお、結合速度定数kassを求める際には、解析モデルタイプ4を用いた（BIAevaluation 2.1 Software Hand book, A1〜A5） 。それぞれのフローセルから算出した値から、各種抗体のカイネティクスパラメーターを得た。結果（各フローセルから算出した値の平均値±標準偏差）を表6に示す。 (3) Kinetic analysis of interaction The target data file was read, and the reaction pattern of the target reaction region was compared by overwriting using the HBS-EP buffer sensorgram as a baseline. Furthermore, the kinetic analysis of the interaction is performed using “BIAevaluation 2.1” (Pharmacia), which is BIACORE's dedicated analysis application software that calculates kinetic parameters (binding rate constant kass and dissociation rate constant kdiss) by curve fitting. went. In determining the binding rate constant kass, an analysis model type 4 was used (BIAevaluation 2.1 Software Handbook, A1 to A5). The kinetic parameters of various antibodies were obtained from the values calculated from each flow cell. Table 6 shows the results (average of the values calculated from each flow cell ± standard deviation).

Figure 2004121253
Figure 2004121253

実施例7.　ヒト型化抗TF抗体のヒトTFへの反応性の測定
　ドットブロットハイブリダイゼーション法（「改訂版分子生物学研究のためのタンパク実験法」（羊土社）竹縄忠臣／編 p.101 ）によって、非変性TF、非還元下変性TF、還元下変性TFへの反応性を検討した。TFは細胞外領域にFLAGタグを付したものをCHO細胞にて発現させ、精製したもの（shTF）を用いた。shTFをそれぞれ次の3種の緩衝液（緩衝液A：10mM Tris-HCl, pH8.0; 緩衝液B：10mM Tris-HCl, pH8.0, 8M 尿素; 緩衝液C：10mM Tris-HCl, pH8.0, 8M 尿素, 5mM DTT）にて希釈した。緩衝液Aで処理したものは非変性TFであり、一方、非還元下変性TFは緩衝液Bで処理し、還元下変性TFは緩衝液Cで処理して調製した。それぞれのサンプルは室温で24時間処理した。処理後、ニトロセルロース膜（Bio-Rad）にサンプルをブロッティングした。 Example 7 Measurement of Reactivity of Humanized Anti-TF Antibody to Human TF Dot Blot Hybridization Method ("Revised Edition of Protein Experimental Method for Molecular Biology Research" (Yodosha) Tadaomi Takenawa / Ed. .101), the reactivity to non-denatured TF, denatured TF under non-reduction, and denatured TF under reduction was examined. TF was prepared by expressing a FLAG tag in the extracellular region in CHO cells and then purifying (shTF). shTF was added to each of the following three buffers (buffer A: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; buffer B: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 8 M urea; buffer C: 10 mM Tris-HCl, pH 8 .0, 8M urea, 5mM DTT). Those treated with buffer A were non-denatured TF, whereas denatured TF under non-reduction was treated with buffer B and denatured TF under reduction was prepared by treatment with buffer C. Each sample was processed at room temperature for 24 hours. After the treatment, the sample was blotted on a nitrocellulose membrane (Bio-Rad).

　サンプルを0.5μl、1μl及び2μl（3μg／ml）膜にブロットし、膜を風乾した。DB（50mMTris-HCl, pH8.1, 0.15M NaCl, 1mM MgCl2 , 0.05％（v／v） Tween 20, 0.02％（w／v） NaN3 , 1％（w／v） BSA）でブロッキングした。膜をヒト型化抗TF抗体を含むDBもしくはDB（コントロール）で反応させた。0.05％（v／v） Tween 20を含むPBSで洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG抗体（DAKO）を含むDBで反応させた。0.05％（v／v） Tween 20を含むPBSで洗浄した後、ECL Western Blotting reagent （Amersham） で処理し、X線フィルムに30秒間暴露させた。 Samples were blotted onto 0.5 μl, 1 μl and 2 μl (3 μg / ml) membranes and the membranes were air dried. Blocked with DB (50 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.15 M NaCl, 1 mM MgCl 2 , 0.05% (v / v) Tween 20, 0.02% (w / v) NaN 3 , 1% (w / v) BSA) . The membrane was reacted with DB containing humanized anti-TF antibody or DB (control). The plate was washed with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, and reacted with DB containing a peroxidase-labeled anti-human IgG antibody (DAKO). After washing with PBS containing 0.05% (v / v) Tween 20, it was treated with ECL Western Blotting reagent (Amersham) and exposed to X-ray film for 30 seconds.

　図35に示したようにキメラ型抗TF抗体及びヒト型化抗TF抗体（バージョン“bb”“ib”及び“ib2”）は非変性TF、非還元下変性TF、還元下変性TF全てに反応した。 As shown in FIG. 35, the chimeric anti-TF antibody and the humanized anti-TF antibody (versions “bb”, “ib”, and “ib2”) react with all of non-denatured TF, non-denatured TF under reduction, and denatured TF under reduction. did.

実施例8.　ラット急性DICモデルにおける抗血栓作用の確認
　抗TF抗体の抗血栓作用について、ラットを用いたトロンボプラスチン誘発DIC モデルで確認した。すなわち、SD系雄性ラットにヒトトロンボプラスチン溶液を40mg／kg の用量で3時間かけて静脈内に持続注入することでDIC モデルを作製した。抗TF抗体（キメラおよびヒト型化抗TF抗体i-b2）は各々0.2mg／kgの用量でトロンボプラスチン溶液の注入開始5分前に静脈内投与した。トロンボプラスチン溶液の持続注入終了15分後に腹部大動脈からクエン酸加血液を採取し、血小板数、活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）、フィブリノーゲン濃度（Fib） 、可溶性フィブリンモノマー複合体（sFMC）濃度、トロンビン／ アンチトロンビンIII 複合体（TAT） 濃度を測定した。 Example 8. Confirmation of antithrombotic effect in rat acute DIC model The antithrombotic effect of anti-TF antibody was confirmed in a thromboplastin-induced DIC model using rats. That is, a human thromboplastin solution was continuously infused intravenously into male SD rats at a dose of 40 mg / kg over 3 hours to prepare a DIC model. The anti-TF antibody (chimeric and humanized anti-TF antibody i-b2) was administered intravenously at a dose of 0.2 mg / kg each 5 minutes before the start of the infusion of the thromboplastin solution. 15 minutes after the end of the continuous infusion of the thromboplastin solution, citrated blood was collected from the abdominal aorta, and the platelet count, activated partial thromboplastin time (aPTT), fibrinogen concentration (Fib), soluble fibrin monomer complex (sFMC) concentration, thrombin / Antithrombin III complex (TAT) concentrations were measured.

　その結果、表7に示すように、トロンボプラスチンの持続注入により血小板数の減少、aPTTの延長、フィブリノーゲン濃度の減少、sFMCおよびTAT 濃度の上昇が認められ、明らかな凝固亢進状態を呈した。これに対し、キメラおよびヒト型化抗TF抗体はともにこれらの変化をほぼ同様に強く抑制した。
　この結果から、ヒト型化抗TF抗体は抗血栓薬として有用なことが示された。 As a result, as shown in Table 7, the continuous infusion of thromboplastin showed a decrease in platelet count, an increase in aPTT, a decrease in fibrinogen concentration, and an increase in sFMC and TAT concentrations, indicating a clear hypercoagulable state. In contrast, both the chimeric and humanized anti-TF antibodies strongly inhibited these changes almost as well.
This result indicated that the humanized anti-TF antibody was useful as an antithrombotic agent.

Figure 2004121253
Figure 2004121253

　参考例1.　抗TFモノクローナル抗体の作製
1.ヒトTFの精製
　ヒト胎盤からのTFの精製は、Itoらの方法（Ito,T.ら J.Biochem. 114, 691-696, 1993）に準じて行った。すなわち、ヒト胎盤を10mM塩化ベンザミジン、1mMフッ化フェニルメチルスルフォニル、1mMジイソプロピルフルオロフォスフェートおよび0.02％アジ化ナトリウムを含むトリス緩衝生理食塩液（TBS,pH7.5）中でホモジナイズ後、沈殿を冷アセトンで脱脂し、得られた脱脂粉末を2％ Triton X-100を含む上記緩衝液に懸濁してTFを可溶化した。 Reference Example 1. Preparation of anti-TF monoclonal antibody
1. Purification of human TF Purification of TF from human placenta was performed according to the method of Ito et al. (Ito, T. et al., J. Biochem. 114, 691-696, 1993). That is, the human placenta was homogenized in Tris-buffered saline (TBS, pH 7.5) containing 10 mM benzamidine chloride, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mM diisopropylfluorophosphate and 0.02% sodium azide, and the precipitate was cooled with acetone. The resulting defatted powder was suspended in the above-mentioned buffer containing 2% Triton X-100 to solubilize TF.

　この上清から Concanavalin A-Sepharose 4Bカラム（Pharmacia）および抗TF抗体を結合させたSepharose 4Bカラム（Pharmacia）を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、精製TFを得た。これを限外濾過膜（PM-10, Amicon）で濃縮し、精製標品として4℃で保存した。
　精製標品中のTF含量は、市販の抗TFモノクローナル抗体（American Diagnostica）とポリクローナル抗体（American Diagnostica）を組合せたSandwich ELISAで、組換え型TFを標準にして定量した。
　また精製標品の純度は、4-20％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEしたものを銀染色することで確認した。 From the supernatant, affinity chromatography was performed using a Concanavalin A-Sepharose 4B column (Pharmacia) and a Sepharose 4B column (Pharmacia) to which an anti-TF antibody was bound, to obtain purified TF. This was concentrated with an ultrafiltration membrane (PM-10, Amicon) and stored at 4 ° C. as a purified sample.
The TF content in the purified sample was quantified by Sandwich ELISA combining a commercially available anti-TF monoclonal antibody (American Diagnostica) and a polyclonal antibody (American Diagnostica), using recombinant TF as a standard.
In addition, the purity of the purified sample was confirmed by silver staining of SDS-PAGE using a 4-20% gradient polyacrylamide gel.

2.免疫とハイブリドーマの作製
　精製ヒトTF（約70μg／ml）を等容量のFreundの完全アジュバント（Difco）と混合後、5週齢のBalb／c系雄性マウス（日本チャールスリバー）の腹部皮下に、TFとして10μg／マウスとなるように免疫した。12,18及び25日にはFreundの不完全アジュバントと混合したTFを5μg／マウスとなるように皮下に追加免疫し、最終免疫として32日にPBSで希釈したTF溶液を5μg／マウスで腹腔内投与した。 2. Immunization and preparation of hybridomas Purified human TF (about 70 μg / ml) was mixed with an equal volume of Freund's complete adjuvant (Difco) and subcutaneously injected into the abdomen of a 5-week-old male Balb / c mouse (Charles River Japan). , TF was 10 μg / mouse. On days 12, 18, and 25, booster immunization with 5 μg / mouse of TF mixed with Freund's incomplete adjuvant was performed subcutaneously, and 5 μg / mouse of TF solution diluted with PBS was given intraperitoneally as final immunization on day 32. Was administered.

　最終免疫の3日後に4匹のマウスから脾細胞を調製し、細胞数で1／5のマウスミエローマ細胞株P3U1とポリエチレングリコール法を用いて融合させた。融合細胞を10％ウシ胎仔血清を含むRPMI-1640培地（以下RPMI-培地とする）（Lifetech oriental）に懸濁し、96穴プレートに1匹のマウスにつき400穴（約400個／穴）播種した。融合後、1,2,3,5日目に培地の半量をHAT（大日本製薬）およびcondimed H1（Boehringer Mannheim GmbH）を含むRPMI-培地（以下HAT-培地とする）に交換することで、ハイブリドーマのHAT選択を行った。
　下記のスクリーニング法で選択したハイブリドーマは2回の限界希釈を行うことでクローン化した。 Three days after the final immunization, spleen cells were prepared from four mice, and fused with a mouse myeloma cell line P3U1 having a cell number of 1/5 using the polyethylene glycol method. The fused cells were suspended in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as RPMI-medium) (Lifetech oriental) and seeded in a 96-well plate at 400 wells (about 400 cells / well) per mouse. . After the fusion, by replacing half of the medium with an RPMI-medium containing HAT (Dainippon Pharmaceutical) and condimed H1 (Boehringer Mannheim GmbH) on days 1, 2, 3, and 5 (hereinafter referred to as HAT-medium), Hybridoma HAT selection was performed.
Hybridomas selected by the following screening method were cloned by performing two limiting dilutions.

　限界希釈は、96穴プレート2枚に一穴あたり0.8個の細胞を播種した。検鏡により単一コロニーであることが確認できた穴について、下記に示したTF結合活性とTF中和活性の測定を行いクローンを選択した。得られたクローンはHAT-培地からRPMI-培地に馴化し、馴化による抗体産生能の低下が無いことを確認したうえで、再度限界希釈を行い、完全なクローン化を行った。以上の操作により、TF／ファクターVIIa複合体とファクターXとの結合を強く阻害する抗体6種（ATR-2,3,4,5,7及び8）を産生するハイブリドーマが樹立できた。 For limiting dilution, 0.8 cells were seeded per well in two 96-well plates. For the wells that were confirmed to be a single colony by microscopy, the TF binding activity and TF neutralizing activity shown below were measured and clones were selected. The obtained clones were adapted from HAT-medium to RPMI-medium, and after confirming that there was no decrease in the antibody-producing ability due to the adaptation, limiting dilution was performed again to complete cloning. By the above operations, hybridomas producing six kinds of antibodies (ATR-2, 3, 4, 5, 7, and 8) that strongly inhibit the binding between the TF / Factor VIIa complex and Factor X were established.

3.腹水の作製および抗体の精製
　樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、in vitroで継代したハイブリドーマ106 個を、あらかじめ鉱物油を2回腹腔内に投与しておいたBalb／c系雄性マウスの腹腔内に移植した。移植後1〜2週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
　腹水からの抗体の精製は、 Protein Aカラム（日本ガイシ）を装着した ConSepLC100システム（Millipore）を用いて行った。 3. Preparation of Ascites and Purification of Antibody The ascites of the established hybridoma was prepared according to a conventional method. That is, the hybridoma 106 which were passaged in vitro, and transplanted in advance mineral oil intraperitoneally Balb / c male mice that had been administered in two intraperitoneal. One to two weeks after transplantation, ascites was collected from mice whose abdomen was enlarged.
Purification of the antibody from the ascites was performed using a ConSepLC100 system (Millipore) equipped with a Protein A column (NGK).

4.Cell-ELISA
　TFを高発現することで知られているヒト膀胱癌由来細胞株J82（Fair D.S.ら、J.Biol.Chem., 262, 11692-11698, 1987）をATCCより導入し、RPMI-培地中、37℃、5％CO2 、100％湿度の条件で継代・維持した。
　Cell-ELISA用プレートは、96穴プレートにJ82細胞を105 個／穴の濃度で播種し、上記条件で1日培養後、培地を除いてリン酸緩衝生理食塩液（PBS）で2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）を加えて氷冷下で10分静置することで固定化することによって作製した。PFAを除去し、PBSで洗浄後、1％BSAおよび0.02％アジ化ナトリウムを含むTris緩衝液（Blocking緩衝液）を加えて、使用時まで4℃で保存した。 4.Cell-ELISA
A human bladder cancer-derived cell line J82 (Fair DS et al., J. Biol. Chem., 262, 11692-11698, 1987), which is known to express TF at a high level, was introduced from the ATCC, and was introduced into RPMI-medium at 37%. The cells were passaged and maintained under the conditions of ° C., 5% CO 2 , and 100% humidity.
Cell-ELISA plates is the J82 cells to a 96-well plate were seeded at a concentration of 10 5 cells / well, after one-day culture under the above conditions, 2 times with phosphate buffered saline (PBS) with the exception of the medium washed Then, a 4% paraformaldehyde solution (PFA) was added, and the mixture was allowed to stand still for 10 minutes under ice-cooling to fix the cells. After removing PFA and washing with PBS, Tris buffer containing 1% BSA and 0.02% sodium azide (Blocking buffer) was added, and stored at 4 ° C. until use.

　Cell-ELISAは以下のように行った。すなわち、上記のように作製したプレートからBlocking緩衝液を除去し、抗TF抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清を加えて室温で1.5時間反応させた。0.05％ Tween20を含むPBSで洗浄後、アルカリフォスファターゼを結合したヤギ抗マウスIgG（H+L）（Zymed）を1時間反応させ、洗浄後、1mg／mlのp-ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム（Sigma）を添加して1時間後に405nmにおける吸光度を測定することで、J82細胞に結合した抗TF抗体量を定量した。 Cell-ELISA was performed as follows. That is, the blocking buffer was removed from the plate prepared as described above, an anti-TF antibody solution or a hybridoma culture supernatant was added, and the mixture was reacted at room temperature for 1.5 hours. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20, an alkaline phosphatase-conjugated goat anti-mouse IgG (H + L) (Zymed) was reacted for 1 hour. After washing, 1 mg / ml disodium p-nitrophenyl phosphate (Sigma) was used. One hour after the addition, the amount of anti-TF antibody bound to J82 cells was quantified by measuring the absorbance at 405 nm.

5.ファクターXa活性を指標としたTF中和活性測定系
　50μlの5mMCaCl2 および0.1％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液（TBS：pH7.6）に10μlのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（5mg／ml）（Thromborel S）（Boehring）と10μlのファクターVIIa溶液（82.5ng／ml）（American Diagnostica）を添加し、室温で1時間反応させることでTF／Factor VIIa 複合体を形成させた後、10μlの所定濃度に希釈した抗TF抗体溶液もしくはハイブリドーマ培養上清および10μlのFactor X溶液（3.245μg／ml）（Celsus Laboratorise）を添加して45分間反応させ、0.5M EDTAを10μl添加することで反応を止めた。ここに2mM S-2222溶液（第一化学薬品）を50μl添加し、30分間の405nmにおける吸光度変化をもってTFの Factor Xa産生活性とした。この方法では、TF／Factor VIIa 複合体とFactor Xとの結合を阻害する抗体の活性は測定できる。 5. TF neutralization activity measurement system using factor Xa activity as an index 10 μl of a human placenta-derived thromboplastin solution (5 mg / 5%) was added to Tris buffered saline (TBS: pH 7.6) containing 50 μl of 5 mM CaCl 2 and 0.1% bovine serum albumin. ml) (Thromborel S) (Boehring) and 10 μl of Factor VIIa solution (82.5 ng / ml) (American Diagnostica), and allowed to react at room temperature for 1 hour to form a TF / Factor VIIa complex. Of the anti-TF antibody solution or hybridoma culture supernatant diluted to a predetermined concentration and 10 μl of Factor X solution (3.245 μg / ml) (Celsus Laboratorise), react for 45 minutes, and add 10 μl of 0.5 M EDTA Stopped. To this was added 50 μl of a 2 mM S-2222 solution (first chemical), and the change in absorbance at 405 nm for 30 minutes was used as Factor Xa production activity of TF. According to this method, the activity of the antibody that inhibits the binding between the TF / Factor VIIa complex and Factor X can be measured.

6.血漿凝固阻害活性測定系
　市販の正常ヒト血漿（コージンバイオ）を用い、この100μlに適当に希釈した抗TF抗体溶液50μlを混和して37℃で3分間反応させた後、50μlのヒト胎盤由来トロンボプラスチン溶液（1.25mg／ml）を添加し、血漿が凝固するまでの時間を血漿凝固時間測定装置（CR-A：Amelung）で測定した。
7.抗体のアイソタイプの決定
　ハイブリドーマの培養上清もしくは精製抗体について、マウスモノクロナール抗体アイソタイピングキット（Amersham社製）を用いて抗体のアイソタイプを確認し、結果を下に示した。 6. Plasma coagulation inhibitory activity measurement system Using commercially available normal human plasma (Kojin Bio), mix 100 μl of this appropriately diluted 50 μl of anti-TF antibody solution, react at 37 ° C. for 3 minutes, and then add 50 μl of human placenta. A derived thromboplastin solution (1.25 mg / ml) was added, and the time until the plasma clotted was measured with a plasma coagulation time measuring device (CR-A: Amelung).
7. Determination of antibody isotype The antibody isotype of the hybridoma culture supernatant or purified antibody was confirmed using a mouse monoclonal antibody isotyping kit (Amersham), and the results are shown below.

Figure 2004121253
Figure 2004121253

参考例2.　可溶型ヒトTFの作製法
　可溶型ヒトTF（shTF）は以下のように作製した。
　ヒトTFの貫通領域（220番目のアミノ酸）以下をFLAGペプチドM2に置換したものをコードする遺伝子を、哺乳動物細胞用の発現ベクター（ネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子を含む）に挿入し、CHO細胞に導入した。ヒトTFのcDNA配列はJames H. Morrisseyらの報告（Cell（1987） 50, 129-135）を参考にした。この可溶型ヒトTFの遺伝子配列とアミノ酸配列を配列番号151に示した。G418により薬剤セレクションし、発現細胞を選抜し、さらにメトトレキサートで発現増幅をかけ、shTF発現細胞を樹立した。 Reference Example 2. Preparation of soluble human TF Soluble human TF (shTF) was prepared as follows.
The gene encoding the human TF with the FLA peptide M2 substituted for the penetrating region (amino acid at position 220) is inserted into an expression vector for mammalian cells (including the neomycin resistance gene and DHFR gene), and the CHO cells are inserted into CHO cells. Introduced. The cDNA sequence of human TF was referred to the report of James H. Morrissey et al. (Cell (1987) 50, 129-135). The gene sequence and amino acid sequence of this soluble human TF are shown in SEQ ID NO: 151. The drug was selected by G418, the expressing cells were selected, and the expression was amplified with methotrexate to establish shTF expressing cells.

　この細胞を無血清培地CHO-S-SFMII（GIBCO）で培養し、shTFを含む培養上清を得た。同容量の40mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）で2倍に希釈し、20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.5）で平衡化した Q-Sepharose Fast Flowカラム（100mL,Pharmacia Biotech）に添加し、0.1M NaClを含む同緩衝液で洗浄後、NaClの濃度を0.3Mとし、shTFをカラムから溶出した。得られたshTF画分に終濃度2.5Mとなるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作（10,000rpm、20分）により夾雑蛋白質を沈殿させた。上清をButyl TOYOPEARL （30mL,TOSOH）に添加し、2.5Mの硫酸アンモニウムを含む50mMトリス塩酸緩衝液（pH6.8）で洗浄した。 The cells were cultured in a serum-free medium CHO-S-SFMII (GIBCO) to obtain a culture supernatant containing shTF. Diluted 2-fold with the same volume of 40 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) and added to a Q-Sepharose Fast Flow column (100 mL, Pharmacia Biotech) equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5). After washing with the same buffer containing 0.1 M NaCl, the concentration of NaCl was adjusted to 0.3 M, and shTF was eluted from the column. Ammonium sulfate was added to the resulting shTF fraction to a final concentration of 2.5 M, and the contaminating proteins were precipitated by centrifugation (10,000 rpm, 20 minutes). The supernatant was added to Butyl TOYOPEARL (30 mL, TOSOH), and washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing 2.5 M ammonium sulfate.

　50mMトリス塩酸緩衝液（pH6.8）中、硫酸アンモニウム濃度を2.5Mから0Mまで直線的に下げ、shTFを溶出させた。shTFを含むピーク画分をCentri-Prep 10（アミコン）で濃縮した。150mM NaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したTSKgel G3000SWGカラム（21.5×600mm,TOSOH）に濃縮液を添加し、shTFのピーク画分を回収した。これを0.22μmのメンブランフィルターで濾過滅菌し、可溶型ヒトTF（shTF）とした。試料の吸光度280nmのモル吸光係数をε=40,130、分子量を43,210として、試料の濃度を算出した。 In a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), the ammonium sulfate concentration was linearly reduced from 2.5 M to 0 M, and shTF was eluted. The peak fraction containing shTF was concentrated with Centri-Prep 10 (Amicon). The concentrate was added to a TSKgel G3000SWG column (21.5 × 600 mm, TOSOH) equilibrated with a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, and a peak fraction of shTF was collected. This was sterilized by filtration through a 0.22 μm membrane filter to obtain soluble human TF (shTF). The concentration of the sample was calculated by setting the molar extinction coefficient at 280 nm of the sample to ε = 40,130 and the molecular weight to 43,210.

配列表フリーテキスト
　配列表の<223>に記載した内容は次の通りである。
配列番号：１：プライマーMHC-G1
配列番号：２：プライマーMHC-G2a
配列番号：３：プライマーMKC
配列番号：４：M13プライマーM4
配列番号：５：M13プライマーRV
配列番号：６：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-2のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：７：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-3のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列 The contents described in <223> of the free text sequence listing in the sequence listing are as follows.
SEQ ID NO: 1: Primer MHC-G1
SEQ ID NO: 2: Primer MHC-G2a
SEQ ID NO: 3: Primer MKC
SEQ ID NO: 4: M13 primer M4
SEQ ID NO: 5: M13 primer RV
SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-2 and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 7: Amino acid of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-3 Sequence and base sequence encoding it

配列番号：８：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-4のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：９：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-5のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：10：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-7のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：11：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-8のH鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：12：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-2のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：13：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-3のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列 SEQ ID NO: 8: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-4 and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 9: Amino acid of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-5 SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-7 and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 11: Anti-TF mouse monoclonal antibody ATR- 8 amino acid sequence of H chain V region and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 12: amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-2 and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 13: Amino acid sequence of V region of L chain of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-3 and nucleotide sequence encoding it

配列番号：14：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-4のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：15：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-5のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：16：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-7のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：17：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-8のL鎖V領域のアミノ酸配列及びそれ　　　　　　　をコードする塩基配列
配列番号：18：プライマーch5HS
配列番号：19：プライマーch5HA
配列番号：20：プライマーch5LS
配列番号：21：プライマーch5LA SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-4 and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 15: Amino acid of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-5 SEQ ID NO: 16: Amino acid sequence of V region of L chain of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-7 and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 17: Anti-TF mouse monoclonal antibody ATR- Amino acid sequence of V region of L chain of No. 8 and base sequence encoding it SEQ ID NO: 18: Primer ch5HS
SEQ ID NO: 19: Primer ch5HA
SEQ ID NO: 20: Primer ch5LS
SEQ ID NO: 21: Primer ch5LA

配列番号：22：CDRグラフィティングプライマーhR5Hv1S
配列番号：23：CDRグラフィティングプライマーhR5Hv28
配列番号：24：CDRグラフィティングプライマーhR5Hv4S
配列番号：25：CDRグラフィティングプライマーhR5Hv3A
配列番号：26：CDRグラフィティングプライマーhR5Hv5A
配列番号：27：プライマーhR5HvPrS
配列番号：28：プライマーhR5HvPrA
配列番号：29：ヒト型化H鎖V領域バージョン“a”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：30：ヒト型化H鎖V領域バージョン“a”のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 22: CDR grafting primer hR5Hv1S
SEQ ID NO: 23: CDR grafting primer hR5Hv28
SEQ ID NO: 24: CDR grafting primer hR5Hv4S
SEQ ID NO: 25: CDR grafting primer hR5Hv3A
SEQ ID NO: 26: CDR grafting primer hR5Hv5A
SEQ ID NO: 27: Primer hR5HvPrS
SEQ ID NO: 28: Primer hR5HvPrA
SEQ ID NO: 29: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “a” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 30: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “a”

配列番号：31：FRシャッフリングプライマーF3RFFS
配列番号：32：FRシャッフリングプライマーF3RFBS
配列番号：33：FRシャッフリングプライマーF3RFFA
配列番号：34：FRシャッフリングプライマーF3RFBA
配列番号：35：FRシャッフリングプライマーF3NMFS
配列番号：36：FRシャッフリングプライマーF3NMBS
配列番号：37：FRシャッフリングプライマーF3NMFA
配列番号：38：FRシャッフリングプライマーF3NMBA
配列番号：39：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：40：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b”のアミノ酸配列
配列番号：41：ヒト型化H鎖V領域バージョン“c”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列 SEQ ID NO: 31: FR shuffling primer F3RFFS
SEQ ID NO: 32: FR shuffling primer F3RFBS
SEQ ID NO: 33: FR shuffling primer F3RFFA
SEQ ID NO: 34: FR shuffling primer F3RFBA
SEQ ID NO: 35: FR shuffling primer F3NMFS
SEQ ID NO: 36: FR shuffling primer F3NMBS
SEQ ID NO: 37: FR shuffling primer F3NMFA
SEQ ID NO: 38: FR shuffling primer F3NMBA
SEQ ID NO: 39: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 40: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b” SEQ ID NO: 41: Amino acid sequence of humanized H chain V region version "c" and nucleotide sequence encoding it

配列番号：42：ヒト型化H鎖V領域バージョン“c”のアミノ酸配列
配列番号：43：FRシャッフリングプライマーF3EPS
配列番号：44：FRシャッフリングプライマーF3EPA
配列番号：45：プライマーF3PrS
配列番号：46：プライマーF3PrA
配列番号：47：FRシャッフリングプライマーF3vHS
配列番号：48：FRシャッフリングプライマーF3vHA
配列番号：49：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：50：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d”のアミノ酸配列
配列番号：51：ヒト型化H鎖V領域バージョン“e”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列 SEQ ID NO: 42: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “c” SEQ ID NO: 43: FR shuffling primer F3EPS
SEQ ID NO: 44: FR shuffling primer F3EPA
SEQ ID NO: 45: Primer F3PrS
SEQ ID NO: 46: Primer F3PrA
SEQ ID NO: 47: FR shuffling primer F3vHS
SEQ ID NO: 48: FR shuffling primer F3vHA
SEQ ID NO: 49: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d” and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 50: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d” SEQ ID NO: 51: Amino acid sequence of humanized H chain V region version "e" and base sequence encoding it

配列番号：52：ヒト型化H鎖V領域バージョン“e”のアミノ酸配列
配列番号：53：FRシャッフリングプライマーF3SSS
配列番号：54：FRシャッフリングプライマーF3SSA
配列番号：55：FRシャッフリングプライマーF3CDS
配列番号：56：FRシャッフリングプライマーF3CDA
配列番号：57：ヒト型化H鎖V領域バージョン“f”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：58：ヒト型化H鎖V領域バージョン“f”のアミノ酸配列
配列番号：59：ヒト型化H鎖V領域バージョン“g”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：60：ヒト型化H鎖V領域バージョン“g”のアミノ酸配列
配列番号：61：FRシャッフリングプライマーF3ADS
配列番号：62：FRシャッフリングプライマーF3ADA
配列番号：63：ヒト型化H鎖V領域バージョン“h”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列 SEQ ID NO: 52: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “e” SEQ ID NO: 53: FR shuffling primer F3SSS
SEQ ID NO: 54: FR shuffling primer F3SSA
SEQ ID NO: 55: FR shuffling primer F3CDS
SEQ ID NO: 56: FR shuffling primer F3CDA
SEQ ID NO: 57: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “f” and its coding base sequence SEQ ID NO: 58: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “f” SEQ ID NO: 59: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “g” and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 60: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “g” SEQ ID NO: 61: FR shuffling primer F3ADS
SEQ ID NO: 62: FR shuffling primer F3ADA
SEQ ID NO: 63: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “h” and base sequence encoding it

配列番号：64：ヒト型化H鎖V領域バージョン“h”のアミノ酸配列
配列番号：65：FRシャッフリングプライマーF3MMS
配列番号：66：FRシャッフリングプライマーF3MMA
配列番号：67：FRシャッフリングプライマーF3BMS
配列番号：68：FRシャッフリングプライマーF3BMA
配列番号：69：ヒト型化H鎖V領域バージョン“i”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：70：ヒト型化H鎖V領域バージョン“i”のアミノ酸配列
配列番号：71：ヒト型化H鎖V領域バージョン“j”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：72：ヒト型化H鎖V領域バージョン“j”のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 64: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “h” SEQ ID NO: 65: FR shuffling primer F3MMS
SEQ ID NO: 66: FR shuffling primer F3MMA
SEQ ID NO: 67: FR shuffling primer F3BMS
SEQ ID NO: 68: FR shuffling primer F3BMA
SEQ ID NO: 69: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “i” and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 70: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “i” SEQ ID NO: 71: Amino acid sequence of humanized H chain V region version "j" and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 72: Amino acid sequence of humanized H chain V region version "j"

配列番号：73：FRシャッフリングプライマーF2MPS
配列番号：74：FRシャッフリングプライマーF2MPA
配列番号：75：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b1”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：76：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b1”のアミノ酸配列
配列番号：77：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d1”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：78：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d1”のアミノ酸配列
配列番号：79：FRシャッフリングプライマーF2VHS
配列番号：80：FRシャッフリングプライマーF2VHA
配列番号：81：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b3”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列 SEQ ID NO: 73: FR shuffling primer F2MPS
SEQ ID NO: 74: FR shuffling primer F2MPA
SEQ ID NO: 75: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b1” and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 76: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b1” SEQ ID NO: 77: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d1” and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 78: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d1” SEQ ID NO: 79: FR shuffling primer F2VHS
SEQ ID NO: 80: FR shuffling primer F2VHA
SEQ ID NO: 81: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b3” and base sequence encoding it

配列番号：82：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b3”のアミノ酸配列
配列番号：83：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d3”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：84：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d3”のアミノ酸配列
配列番号：85：FRシャッフリングベクターLv1S
配列番号：86：FRシャッフリングベクターh5Lv4S
配列番号：87：FRシャッフリングベクターh5Lv2A
配列番号：88：FRシャッフリングベクターh5Lv3A
配列番号：89：FRシャッフリングプライマーh5Lv5A
配列番号：90：プライマーh5LvS
配列番号：91：プライマーh5LvA SEQ ID NO: 82: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “b3” SEQ ID NO: 83: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d3” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 84: Amino acid sequence of humanized H chain V region version “d3” SEQ ID NO: 85: FR shuffling vector Lv1S
SEQ ID NO: 86: FR shuffling vector h5Lv4S
SEQ ID NO: 87: FR shuffling vector h5Lv2A
SEQ ID NO: 88: FR shuffling vector h5Lv3A
SEQ ID NO: 89: FR shuffling primer h5Lv5A
SEQ ID NO: 90: Primer h5LvS
SEQ ID NO: 91: Primer h5LvA

配列番号：92：ヒト型化L鎖V領域バージョン“a”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：93：ヒト型化L鎖V領域バージョン“a”のアミノ酸配列
配列番号：94：FRシャッフリングプライマーF3SS
配列番号：95：FRシャッフリングプライマーF3SA
配列番号：96：FRシャッフリングプライマーF3RS
配列番号：97：FRシャッフリングプライマーF3RA
配列番号：98：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　塩基配列
配列番号：99：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b”のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 92: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “a” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 93: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “a” SEQ ID NO: 94: FR shuffling primer F3SS
SEQ ID NO: 95: FR shuffling primer F3SA
SEQ ID NO: 96: FR shuffling primer F3RS
SEQ ID NO: 97: FR shuffling primer F3RA
SEQ ID NO: 98: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 99: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b”

配列番号：100：ヒト型化L鎖V領域バージョン“c”のアミノ酸配列及びそれをコードする　　　　　　　 塩基配列
配列番号：101：ヒト型化L鎖V領域バージョン“c”のアミノ酸配列
配列番号：102：FRシャッフリングプライマーF2SS
配列番号：103：FRシャッフリングプライマーF2SA
配列番号：104：FRシャッフリングプライマーF2XS
配列番号：105：FRシャッフリングプライマーF2XA
配列番号：106：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b1”のアミノ酸配列及びそれをコードす　　　　　　　 る塩基配列
配列番号：107：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b1”のアミノ酸配列
配列番号：108：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b2”のアミノ酸配列及びそれをコードす　　　　　　　 る塩基配列
配列番号：109：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b2”のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 100: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “c” and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 101: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “c” SEQ ID NO: 102: FR shuffling primer F2SS
SEQ ID NO: 103: FR shuffling primer F2SA
SEQ ID NO: 104: FR shuffling primer F2XS
SEQ ID NO: 105: FR shuffling primer F2XA
SEQ ID NO: 106: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b1” and base sequence encoding it SEQ ID NO: 107: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b1” SEQ ID NO: 108 : Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b2” and nucleotide sequence encoding it SEQ ID NO: 109: Amino acid sequence of humanized L chain V region version “b2”

配列番号：110：ヒト型化H鎖V領域全バージョンのFR1のアミノ酸配列
配列番号：111：ヒト型化H鎖V領域バージョン“a”〜“j”のFR2のアミノ酸配列
配列番号：112：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b1”及び“d1”のRF2のアミノ酸配列
配列番号：113：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b3”及び“d3”のRF2のアミノ酸配列
配列番号：114：ヒト型化H鎖V領域バージョン“a”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：115：ヒト型化H鎖V領域バージョン“b”,“b1”及び“b3”のFR3のアミノ酸配　　　　　　　 列
配列番号：116：ヒト型化H鎖V領域バージョン“c”のFR3のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 110: Amino acid sequence of FR1 in all versions of humanized H chain V region SEQ ID NO: 111: Amino acid sequence of FR2 in humanized H chain V region versions “a” to “j” SEQ ID NO: 112: Human Amino acid sequence SEQ ID NO: 113 of the RF2 of the humanized H chain V region version “b1” and “d1” SEQ ID NO: 114: Human amino acid sequence of the RF2 of the humanized H chain V region version “b3” and “d3” Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “a” SEQ ID NO: 115: Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “b”, “b1” and “b3” SEQ ID NO: 116: Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version "c"

配列番号：117：ヒト型化H鎖V領域バージョン“d”,“d1”及び“d3”のFR3のアミノ酸配　　　　　　　 列
配列番号：118：ヒト型化H鎖V領域バージョン“e”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：119：ヒト型化H鎖V領域バージョン“f”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：120：ヒト型化H鎖V領域バージョン“g”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：121：ヒト型化H鎖V領域バージョン“h”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：122：ヒト型化H鎖V領域バージョン“i”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：123：ヒト型化H鎖V領域バージョン“j”のFR3のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 117: Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “d”, “d1” and “d3” SEQ ID NO: 118: FR3 amino acid of humanized H chain V region version “e” SEQ ID NO: 119: FR3 amino acid sequence of humanized H chain V region version “f” SEQ ID NO: 120: Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “g” SEQ ID NO: 121: Human Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “h” SEQ ID NO: 122: Amino acid sequence of FR3 of humanized H chain V region version “i” SEQ ID NO: 123: Humanized H chain V region version “j” Amino acid sequence of FR3

配列番号：124：ヒト型化H鎖V領域全バージョンのFR4のアミノ酸配列
配列番号：125：ヒト型化L鎖V領域全バージョンのFR1のアミノ酸配列
配列番号：126：ヒト型化L鎖V領域バージョン“a”,“b”及び“c”のFR2のアミノ酸配列
配列番号：127：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b1”のFR2のアミノ酸配列
配列番号：128：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b2”のFR2のアミノ酸配列
配列番号：129：ヒト型化L鎖V領域バージョン“a”のFR3のアミノ酸配列
配列番号：130：ヒト型化L鎖V領域バージョン“b”,“b1”、及び“b2”のFR3のアミノ酸　　　　　　　 配列
配列番号：131：ヒト型化L鎖V領域バージョン“c”のFR3のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 124: Amino acid sequence of FR4 in all versions of humanized H chain V region SEQ ID NO: 125: Amino acid sequence of FR1 in all versions of humanized L chain V region SEQ ID NO: 126: Humanized L chain V region Amino acid sequence of FR2 version "a", "b" and "c" SEQ ID NO: 127: humanized L chain V region Amino acid sequence of FR2 version "b1" SEQ ID NO: 128: humanized L chain V region Amino acid sequence SEQ ID NO: 129 of version "b2" FR2 Amino acid sequence SEQ ID NO: 130 of FR3 of humanized L chain V region version "a" Version "b", "b1" of humanized L chain V region And amino acid sequence of FR3 of “b2” SEQ ID NO: 131: Amino acid sequence of FR3 of humanized L chain V region version “c”

配列番号：132：ヒト型化L鎖V領域全バージョンFR4のアミノ酸配列
配列番号：133：ヒト型化H鎖V領域全バージョンCDR1のアミノ酸配列
配列番号：134：ヒト型化H鎖V領域全バージョンのCDR2のアミノ酸配列
配列番号：135：ヒト型化H鎖V領域全バージョンのCDR3のアミノ酸配列
配列番号：136：ヒト型化L鎖V領域全バージョンのCDR1のアミノ酸配列
配列番号：137：ヒト型化L鎖V領域全バージョンのCDR2のアミノ酸配列
配列番号：138：ヒト型化L鎖V領域全バージョンのCDR3のアミノ酸配列
配列番号：139：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-2のH鎖V領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 132: Amino acid sequence of humanized L chain V region full version FR4 SEQ ID NO: 133: Amino acid sequence of humanized H chain V region full version CDR1 SEQ ID NO: 134: Humanized H chain V region full version CDR2 amino acid sequence SEQ ID NO: 135: Humanized H chain V region full version CDR3 amino acid sequence SEQ ID NO: 136: Humanized L chain V region full version CDR1 amino acid sequence SEQ ID NO: 137: Human SEQ ID NO: 138: Amino acid sequence of CDR3 of all versions of humanized L chain V region SEQ ID NO: 139: H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-2 Amino acid sequence of

配列番号：140：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-3のH鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：141：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-4のH鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：142：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-5のH鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：143：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-7のH鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：144：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-8のH鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：145：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-2のL鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：146：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-3のL鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：147：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-4のL鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：148：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-5のL鎖V領域のアミノ酸配列 SEQ ID NO: 140: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-3 SEQ ID NO: 141: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-4 SEQ ID NO: 142: Anti Amino acid sequence of H chain V region of -TR mouse monoclonal antibody ATR-5 SEQ ID NO: 143: Amino acid sequence of H chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-7 SEQ ID NO: 144: Anti-TF mouse monoclonal antibody ATR -8: amino acid sequence of H chain V region SEQ ID NO: 145: amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-2 SEQ ID NO: 146: L chain V of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-3 Region amino acid sequence SEQ ID NO: 147: amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-4 SEQ ID NO: 148: amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-5

配列番号：149：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-7のL鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：150：抗-TFマウスモノクローナル抗体ATR-8のL鎖V領域のアミノ酸配列
配列番号：151：可溶型ヒトTFのアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列
配列番号：152：可溶型ヒトTFのアミノ酸配列 SEQ ID NO: 149: Amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-7 SEQ ID NO: 150: Amino acid sequence of L chain V region of anti-TF mouse monoclonal antibody ATR-8 SEQ ID NO: 151: Possible Amino acid sequence of soluble human TF and nucleotide sequence encoding the same SEQ ID NO: 152: Amino acid sequence of soluble human TF

図1は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化aバージョン／L鎖キメラ抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化aバージョン抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 1 is a graph comparing the antigen-binding activities of an H-chain chimeric / L-chain chimeric antibody, an H-chain humanized a-version / L-chain chimeric antibody, and an H-chain chimeric / L-chain humanized a-version antibody. 図2は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化aバージョン／L鎖キメラ抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化aバージョン抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 2 compares the neutralizing activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain humanized a version / L chain chimeric antibody, and the H chain chimera / L chain humanized a version antibody against human TF. It is a graph. 図3は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化aバージョン／L鎖ヒト型化aバージョン抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 3 is a graph comparing the antigen-binding activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody and the H chain humanized a version / L chain humanized a version antibody. 図4は、抗-TF-マウスモノクローナル抗体ATR-5、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンa／L鎖ヒト型化バージョンa抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 4 shows the neutralizing activity of anti-TF-mouse monoclonal antibody ATR-5, H chain chimera / L chain chimera antibody, and H chain humanized version a / L chain humanized version a antibody on human TF. It is the graph which compared. 図5は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンa抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 5 compares the antigen binding activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain humanized version b / L chain chimeric antibody, and the H chain humanized version b / L chain humanized version a antibody. It is a graph. 図6は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンc／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンd／L鎖キメラ抗体の抗原結合活性を測定したグラフである。FIG. 6 is a graph showing the measured antigen-binding activities of the H-chain chimera / L-chain chimeric antibody, the H-chain humanized version c / L-chain chimeric antibody, and the H-chain humanized version d / L-chain chimeric antibody. 図7は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンc／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンd／L鎖キメラ抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 7 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain chimeric antibody, H chain humanized version c / L chain chimeric antibody, H chain humanized version d / L chain chimera. 4 is a graph comparing the neutralizing activities of antibodies against human TF. 図8は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンa抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 8 is a graph comparing the neutralizing activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody and the H chain humanized version b / L chain humanized version a antibody to human TF. 図9は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンc抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 9 is a graph comparing the antigen-binding activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain chimera / L chain humanized version b antibody, and the H chain chimera / L chain humanized version c antibody. 図10は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンc抗体の、ヒトTFに対する中和活性の比較を示すグラフである。FIG. 10 shows a comparison of the neutralizing activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain chimera / L chain humanized version b antibody, and the H chain chimera / L chain humanized version c antibody against human TF. It is a graph shown. 図11は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンc抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 11 shows antigen binding of H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, and H chain humanized version b / L chain humanized version c antibody. It is a graph which compared activity. 図12は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンc抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 12 shows the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, and the H chain humanized version b / L chain humanized version c antibody. It is a graph which compared the neutralization activity with respect to TF. 図13は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンd／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 13 shows antigen binding of H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, and H chain humanized version d / L chain humanized version b antibody It is a graph which compared activity. 図14は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンd／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 14 shows the H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, and H chain humanized version d / L chain humanized version b antibody of human It is a graph which compared the neutralization activity with respect to TF. 図15は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンe／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンe／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 15 compares the antigen binding activity of the H chain chimera / L chain chimera antibody, the H chain humanized version e / L chain chimeric antibody, and the H chain humanized version e / L chain humanized version b antibody. It is a graph. 図16は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンe／L鎖キメラ抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 16 is a graph comparing the neutralizing activities of the H-chain chimera / L-chain chimeric antibody and the H-chain humanized version e / L-chain chimeric antibody to human TF. 図17は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンg／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 17 is a graph comparing the antigen-binding activities of the H-chain chimera / L-chain chimeric antibody and the H-chain humanized version g / L-chain humanized version b antibody. 図18は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンg／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 18 is a graph comparing the neutralizing activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody and the H chain humanized version g / L chain humanized version b antibody to human TF. 図19は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb3／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンd3／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 19 shows the antigen binding of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b3 / L chain humanized version b antibody, and H chain humanized version d3 / L chain humanized version b antibody. It is a graph which compared activity. 図20は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb3／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンd3／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 20 shows that the H chain chimera / L chain chimera antibody, the H chain humanized version b3 / L chain humanized version b antibody, and the H chain humanized version d3 / L chain humanized version b antibody were human It is a graph which compared the neutralization activity with respect to TF. 図21は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンj／L鎖キメラ抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 21 is a graph comparing the antigen-binding activities of the H-chain chimeric / L-chain chimeric antibody, the H-chain humanized version i / L-chain chimeric antibody, and the H-chain humanized version j / L-chain chimeric antibody. 図22は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンj／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 22 shows the antigen binding of H chain chimera / L chain chimera antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain humanized version j / L chain humanized version b antibody It is a graph which compared activity. 図23は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖キメラ抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンj／L鎖キメラ抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 23 compares the neutralizing activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain humanized version i / L chain chimeric antibody, and the H chain humanized version j / L chain chimeric antibody to human TF. It is a graph. 図24は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンj／L鎖ヒト型化バージョンb抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 24 shows the H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain It is a graph which compared the neutralization activity with respect to human TF of humanized version j / light chain humanized version b antibody. 図25は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb1抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 25 is a graph comparing the antigen binding activities of the H chain chimera / L chain chimera antibody, the H chain chimera / L chain humanized version b1 antibody, and the H chain chimera / L chain humanized version b2 antibody. 図26は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb1抗体、及びH鎖キメラ／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 26 compares the neutralizing activity of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, the H chain chimera / L chain humanized version b1 antibody, and the H chain chimera / L chain humanized version b2 antibody against human TF. It is a graph. 図27は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 27 is a graph comparing the antigen-binding activities of the H chain chimera / L chain chimeric antibody and the H chain humanized version b / L chain humanized version b2 antibody. 図28は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 28 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, and H chain It is the graph which compared the neutralization activity with respect to human TF of humanized version b / light chain humanized version b2 antibody. 図29は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb1抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 29 shows the antigen binding of the H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b1 antibody, and H chain humanized version i / L chain humanized version b2 antibody It is a graph which compared activity. 図30は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb1抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性を比較したグラフである。FIG. 30 shows H chain chimera / L chain chimera antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b1 antibody, and H chain It is the graph which compared the neutralization activity with respect to human TF of humanized version i / light chain humanized version b2 antibody. 図31は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の抗原結合活性を比較したグラフである。FIG. 31 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain It is the graph which compared the antigen binding activity of humanized version i / light chain humanized version b2 antibody. 図32は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性（TFのファクターXa産生阻害活性）を比較したグラフである。FIG. 32 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain It is a graph which compared the neutralization activity (the factor Xa production inhibitory activity of TF) of humanized version i / L chain humanized version b2 antibody to human TF. 図33は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性（ファクターX結合阻害活性）を比較したグラフである。FIG. 33 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain It is a graph comparing the neutralization activity (factor X binding inhibitory activity) of humanized version i / L chain humanized version b2 antibody to human TF. 図34は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、及びH鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の、ヒトTFに対する中和活性（TFの血漿凝固阻害活性）を比較したグラフである。FIG. 34 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, and H chain 4 is a graph comparing humanized version i / L chain humanized version b2 antibody with neutralizing activity against human TF (TF coagulation inhibitory activity). 図35は、H鎖キメラ／L鎖キメラ抗体、H鎖ヒト型化バージョンb／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb抗体、H鎖ヒト型化バージョンi／L鎖ヒト型化バージョンb2抗体の各種条件で処理したヒトTFへの反応性を比較した図である。FIG. 35 shows H chain chimera / L chain chimeric antibody, H chain humanized version b / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version i / L chain humanized version b antibody, H chain humanized version FIG. 4 is a diagram comparing the reactivity of a humanized version i antibody with humanized TF treated under various conditions with a humanized version i / L chain antibody.

Claims (4)

　非ヒト由来の相補性決定領域（CDR）及び天然ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）を有する免疫原性を低減させた天然ヒト型化抗体の製造方法において、
　（1）目的とする抗原に対して反応性の非ヒトモノクローナル抗体を用意し、
　（2）前記（1）のモノクローナル抗体中のFRのアミノ酸配列に対して高い相同性を有するヒト抗体を複数用意し、
　（3）前記（2）における１種類のヒト抗体の４個のFRを前記（1）の非ヒトモノクローナル抗体の対応するFRにより置換して第一のヒト型化抗体を作製し、
　（4）前記（3）において作製したヒト型化抗体の抗原への結合性又は抗原の生物活性を中和する能力を測定し、
　（5）前記（3）において作製したヒト型化抗体中の１〜３個のFRを、(2）で用意したヒト抗体の内、(3）で使用したものとは異なるヒト抗体の対応するＦＲにより置換して第二のヒト型化抗体を作製し、
　（6）前記（5）で作製した第二のヒト型化抗体と前記（3）で得た第一のヒト型化抗体とを、抗原に対する結合性、又は抗原の生物活性を中和する能力について比較し、好都合な活性を示すヒト型化抗体を選択し、
　（7）前記（6）で選択されたヒト型化抗体について、前記（3)〜(6）の段階を実施し、そして
　（8）前記（1）における非ヒトモノクローナル抗体と同等の活性を有するヒト型化抗体が得られるまで前記（3)〜(6）の段階を反復する、
ことを特徴とする方法。 In a method for producing a natural humanized antibody having reduced immunogenicity having a non-human derived complementarity determining region (CDR) and a framework region (FR) derived from a natural human antibody,
(1) Prepare a non-human monoclonal antibody reactive to the target antigen,
(2) preparing a plurality of human antibodies having high homology to the amino acid sequence of FR in the monoclonal antibody of (1),
(3) replacing the four FRs of one human antibody in (2) with the corresponding FRs of the non-human monoclonal antibody of (1) to produce a first humanized antibody;
(4) measuring the ability of the humanized antibody prepared in (3) to bind to the antigen or neutralize the biological activity of the antigen,
(5) One to three FRs in the humanized antibody prepared in (3) above correspond to human antibodies different from those used in (3) among the human antibodies prepared in (2). Creating a second humanized antibody by substituting with FR,
(6) The ability of the second humanized antibody prepared in (5) and the first humanized antibody obtained in (3) to bind to an antigen or to neutralize the biological activity of the antigen And selecting a humanized antibody showing favorable activity,
(7) performing the steps (3) to (6) on the humanized antibody selected in (6) above, and (8) having the same activity as the non-human monoclonal antibody in (1) above Repeating the above steps (3) to (6) until a humanized antibody is obtained,
A method comprising: 　前記目的とする抗原がヒト組織因子(TF)である、請求項１に記載の方法。 方法 The method according to claim 1, wherein the antigen of interest is human tissue factor (TF). 　請求項１の方法により得られるヒト型化抗体。 [4] A humanized antibody obtained by the method of claim 1. 　請求項２の方法により得られるヒト型化抗体。 [4] A humanized antibody obtained by the method of claim 2.
JP2003347456A 1998-04-03 2003-10-06 Humanized antibody against human tissue factor (TF) and method for producing humanized antibody Expired - Fee Related JP4014558B2 (en)

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