【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、モノクローナル抗体の抗原分子同定法、詳しくは、哺乳類細胞ｃＤＮＡ発現ライブラリーを用いたモノクローナル抗体の抗原分子同定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
目的とするタンパク質に対する抗体を入手することは、その同定・機能解析において重要な位置を占めるが、動物に目的とする抗原を投与して免疫する従来の方法は、多種・多量の抗原と長い時間、多大な労力を要することから、近年、ファージ抗体ライブラリーを用いて抗体を作製する方法が確立されている。かかる方法は、繊維状ファージのコートタンパク質に抗体を融合させることにより、ファージの表面上に抗体を提示（ディスプレイ）するシステムを応用したもので、抗体遺伝子をＰＣＲで増幅して多種類の抗体遺伝子を含むライブラリーを作製し、これをファージ上に提示させることによってファージディスプレイライブラリーとするものであって、このファージシステム（例えば、非特許文献１参照。）によるとヒトの抗体の抗原を同定することが可能となる。このファージ抗体ライブラリーを用いるスクリーニング方法は、ファージディスプレイ法と呼ばれ、従来から種々の細胞表面レセプターと特異的に結合するリガンドや種々の抗原を同定するために使用されている。ファージ抗体ライブラリーの作製方法やそれを用いたイムノチューブ法、マグネティックビーズ法等のスクリーニング法についても既に数多く報告されている。（例えば、非特許文献２、３参照。）。
【０００３】
その他、膜分子のクローニング方法として、例えばＣＯＳ７細胞とＳＶ４０の複製起点を含んだ発現ベクターによる一過性発現を利用して、動物細胞発現ベクターで作製されたｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ７細胞に導入し、細胞表面上にｃＤＮＡライブラリー由来の膜蛋白質を発現させ、目的とする膜分子を発現している細胞をその膜分子に対する抗体やリガンドを用いてパニングあるいはＦＡＣＳで濃縮し、プラスミドＤＮＡを回収して再びＣＯＳ７細胞にトランスフェクションし、濃縮操作を繰り返す方法や、発現ベクターｃＤＮＡライブラリーをいくつかの小さなプールに分け、ＣＯＳ７細胞に導入し、アイソトープで標識した抗体やリガンドを用いて膜分子の発現を検出し、陽性プールをさらに少数のプラスミドからなるプールに分けてトランスフェクションを繰り返しクローン化する方法が知られている（例えば、非特許文献４参照。）。
【０００４】
また、ヒト細胞からポリアデニル化ＲＮＡを単離し、単離されたポリアデニル化ＲＮＡを用いて２本鎖ｃＤＮＡを作り、この２本鎖ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、この組換え発現ベクターで宿主をトランスフォームして前記抗原を発現させ、リューマチ性関節炎患者の血清からの抗体を用いて、前記抗体が前記発現抗原に結合することを、抗ヒトＩｇＭ抗体−アルカリホフファターゼ複合体とアルカリホスファターゼ顕色基質とによって検出することによりトランスフォームされた宿主を選択する、リューマチ性関節炎関連抗体に対して反応性を有するリューマチ性関節炎の診断用抗原をコードする組換えＤＮＡの作製方法（例えば、特許文献１参照。）も知られている。
【０００５】
他方、神経軸索の成長等に関して以下の知見が報告されている。
神経系の発達は、軸索が活発に成長する能力によって特徴づけられており、成長円錐という特異化された先端によって率先されることにより、多くの軸索が胚脳中において活発に伸張する（例えば、非特許文献５、６参照。）。しかし、中枢神経系が成熟すると、軸索は成長能力を喪失する（例えば、非特許文献７参照。）。中枢軸索の再生に関する研究がこれまで盛んに行なわれてきたが、臨床において軸索の再生を誘導することはたいへん難しいとされている。胚軸索と成体軸索は成長能力に関して異なっているが、これは成体神経系における成長抑制環境が原因の一つであると考えられている（例えば、非特許文献８参照。）。例えば、インビボ及びインビトロの両方において調査を行なった過去の研究から、中枢ミエリンが成体神経系における軸索成長の阻止に関与していることがすでに知られている（例えば、非特許文献９、１０参照。）。
【０００６】
嗅覚体系は、嗅球及びそれが終脳中まで成長した嗅索（ＬＯＴ）とよばれるものから成り立っている。嗅索は単純であり（例えば、非特許文献１１、１２参照。）器官培養により簡単に再生できることから（例えば、非特許文献１３参照。）、軸索ガイダンスの細胞機構及び分子機構に関する有益な情報を提供してきた（例えば、非特許文献１４〜１７参照。）。また、ミエリンにおける軸索反発因子（ａｘｏｎａｌ ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）であるＮｏｇｏ（例えば、非特許文献１８〜２２参照。）が成体神経系中において希突起膠細胞により産出されることは、過去の研究からすでに知られている（例えば、非特許文献２３〜２５参照。）。また、Ｎｏｇｏが中枢軸索の成長を阻止することもすでに知られている（例えば、非特許文献２６、２７参照。）。
【０００７】
抗Ｎｏｇｏモノクローナル抗体として知られているＩＮ−１が、中枢神経系において軸索の再生をインビトロとインビボの両方で増進させることが報告されている（例えば、非特許文献１７、２３、２５〜３０参照。）。Ｎｏｇｏは、小胞体（ＥＲ）膜貫通蛋白質の一部であるレチキュロン（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ）ファミリーに属している（例えば、非特許文献３１、３２参照。）。レチキュロンファミリーの他のメンバーと同様に、Ｎｏｇｏは主にＥＲに局在しているが、細胞表面にも存在している（例えば、非特許文献１９、２０、２３参照。）。Ｎｏｇｏには、３つのスプライシングアイソフォーム、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−Ｂ及びＮｏｇｏ−Ｃがあり、これらはＣ−末端ドメインが共通しているが、Ｎ−末端配列が相違している。Ｎｏｇｏ−Ａは最も長いアイソフォームで、ラットでは１１６３個のアミノ酸残基からなっている。Ｎｏｇｏ−Ｂは、Ｎｏｇｏ−ＡのＮ−末端部分と、スプライスされた共通のＣ−末端ドメインを有している。Ｎｏｇｏ−Ｃは最も短いアイソフォームで、共通のＣ−末端ドメイン以外に、Ｎ−末端上にある独特の短いアミノ酸を含んでいる。最近の研究により、Ｎｏｇｏは、反発作用に対する２つの機能的ドメイン、すなわち、共通するＣ−末端ドメインにある６６アミノ酸配列と、Ｎｏｇｏ−Ａに特異的なＮ−末端配列をもつことがわかっている（例えば、非特許文献３３参照。）。
【０００８】
また、嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長し（例えば、非特許文献１３、３４参照。）、この軸索の道標となる神経細胞（道標細胞）を特異的に標識するマーカー抗体としてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｌｏｔ１が知られている（例えば、非特許文献３５参照。）。道標細胞は、軸索の伸長に先だって、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導するが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１がどのような抗原分子を認識しているのかは不明であった。この抗原分子は、少なくとも発生期の終脳においては道標細胞のみで発現されており、道標細胞特有の何らかの機能と関係する可能性が考えられている。
【０００９】
そしてまた、グルタミン酸は、神経終末より放出され、シナプス後膜あるいは神経終末に存在するグルタミン酸受容体を介して神経細胞活性あるいは神経伝達物質の放出を調節するなど、高等動物の中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であると考えられており、グルタミン酸受容体は、中枢における興奮性シナプス伝達に中心的役割を担っていることが知られている。グルタミン酸受容体は、シグナル伝達機構等から、イオンチャネルを内蔵して速いシナプス伝達を担うイオンチャネル型グルタミン酸の受容体と、Ｇタンパク質と共役することにより間接的にシグナルを伝える代謝調節型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）とに大別され、遺伝子のクローニングによりｍＧｌｕＲには異なる８種類のサブタイプｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８が存在することも知られている。ｍＧｌｕＲ１〜ｍＧｌｕＲ８はそれぞれ異なる脳内分布を示し、ｍＧｌｕＲ１及びｍＧｌｕＲ５はＧタンパク質を介してホスホリパーゼ、イノシトール３リン酸、カルシウムと情報を伝える受容体とされ、ｍＧｌｕＲ１は長い細胞該ドメインをもつ７回膜貫通タンパク質で、神経伝達物質グルタミン酸のレセプターとして機能すると考えられている（例えば、非特許文献３６、３７参照。）。
【００１０】
【特許文献１】
特表平１０−５１３２５７号公報
【非特許文献１】
Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０， １１９４−１１９８， １９８３
【非特許文献２】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９， ３８６−３９０， １９９０
【非特許文献３】
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７， ２２８−２５７， １９９３
【非特許文献４】
Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４， ３３６５−３３６９， １９８７
【非特許文献５】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３， ７４０−７４６， １９８６
【非特許文献６】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， １１２３−１１３１， １９９６
【非特許文献７】
Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ １１， ８９−９４， ２００１
【非特許文献８】
Ｎａｔｕｒｅ ２９６， １５０−１５２， １９８２
【非特許文献９】
Ｎｅｕｒｏｎ ２４， ６３９−６４７， １９９９
【非特許文献１０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ８， ２３８１−２３９３， １９８８
【非特許文献１１】
Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｒｅｖ． １１， １−４５， １９８６
【非特許文献１２】
Ｊ． Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２， １９８４
【非特許文献１３】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６
【非特許文献１４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３２， ４１５−４２５， １９９７
【非特許文献１５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ３８， ９３−１０４， １９９９
【非特許文献１６】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１
【非特許文献１７】
Ｎａｔｕｒｅ ３４３， ２６９−３４３， １９９０
【非特許文献１８】
Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０６， １２８１−１２８８， １９８８
【非特許文献１９】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００
【非特許文献２０】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３９−４４４， ２０００
【非特許文献２１】
Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ３８３−３８４， ２０００
【非特許文献２２】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３， １９２８３−１９２９３， １９９８
【非特許文献２３】
Ｎｅｕｒｏｎ １， ８５−９６， １９８８
【非特許文献２４】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４
【非特許文献２５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献２６】
Ｎａｔｕｒｅ ３７８， ４９８−５０１， １９９５
【非特許文献２７】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ８０６１−８０６８， ２０００
【非特許文献２８】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ２２７５−２２８６， ２０００
【非特許文献２９】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １２， ２１１２−２１１９， １９９２
【非特許文献３０】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９， １１２６−１１３３， １９８９
【非特許文献３１】
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３２， １９１−１９９， １９９６
【非特許文献３２】
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８， １３４３９−１３４４７， １９９３
【非特許文献３３】
Ｎａｔｕｒｅ ４０９， ３４１−３４６， ２００１
【非特許文献３４】
Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２， １９８４
【非特許文献３５】
Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８
【非特許文献３６】
Ｎａｔｕｒｅ ３４９， ７６０−７６５， １９９１
【非特許文献３７】
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２， １３１８−１３２１， １９９１
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、これまでモノクローナル抗体の抗原分子同定法には、ファージライブラリーを用いた発現スクリーニングの系が実用化されていたが、この系では半ば変性した蛋白質断片を抗体に認識させるので、抗原蛋白質の立体構造を認識するような抗体については適用できず、かかる方法では同定できない抗原が多数存在していた。そのため、抗原タンパク質に対する疾病の診断薬・治療薬に有効なモノクローナル抗体を立体構造の視点から同定することができなかった。本発明の課題は、モノクローナル抗体が認識する抗原を効率よく短時間で同定できる方法を提供することにある。抗原が明らかとなったモノクローナル抗体は、その抗原の機能や性質によって、例えば、疾患の診断マーカー、再生医療、疾患治療などへの応用が期待できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の認識する抗原は、免疫染色のパターンから膜タンパク質であると予想されたが、ウエスタンブロットでも免疫沈降でも、この抗原分子を検出することはできなかった。このことは、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原決定部位が、膜からの抽出や可溶性にともなって破壊されたためであると考えられていた。このような性質の抗原決定部位をもつモノクローナル抗体の場合、その抗原分子を同定することは極めて困難である。免疫沈降により抗原タンパク質を精製することはもちろん不可能であるし、ファージライブラリーを用いた発現検索系でも抗原を同定できる可能性は極めて低い。そこで発想を変えて、タンパク質をなるべく本来の立体構造に近い形で発現することにより、抗原分子を検索しようと考えた。具体的には、モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを哺乳類用発現ベクターに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養株細胞（ＣＯＳ細胞）に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。この方法であれば、たとえそのｃＤＮＡに膜タンパク質がコードされていたとしても、その産物は通常どおり細胞膜に組み込まれていて本来の立体構造を取りうるはずである。このように考えて、ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索した。上記の発現検索系を用いてｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローンを単離し、このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。すなわち、本発明者らは、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込み、全長ｃＤＮＡライブラリーを作製し、かかる全長ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類動物細胞に導入して培養し、ｃＤＮＡにコードされたタンパク質を哺乳類培養細胞上に立体構造を形成した状態で発現させ、かかる立体構造を形成した状態でタンパク質を発現している哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色することにより、抗原遺伝子ｃＤＮＡを同定することができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｃＤＮＡがコードするタンパク質を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるタンパク質を発現した哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色し、被検モノクローナル抗体により免疫染色された免疫陽性細胞を選択し、選択された免疫陽性細胞からｃＤＮＡクローンを単離し、前記哺乳類培養細胞上に発現したタンパク質をコードする遺伝子を同定することを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項１）や、ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡを組み込むことにより調製したｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項２）や、ｃＤＮＡライブラリーが、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡを組み込むことにより調製した全長ｃＤＮＡライブラリーであることを特徴とする請求項２記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項３）や、哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項４）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法（請求項５）に関する。
【００１４】
また本発明は、哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した全長ｃＤＮＡライブラリーを導入した哺乳類培養細胞を含むことを特徴とするモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項６）や、哺乳類培養細胞用発現ベクターが、プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳであることを特徴とする請求項６記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項７）や、哺乳類培養細胞が、ＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項６又は７記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定キット（請求項８）や、請求項１〜５のいずれか記載のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により得られることを特徴とする抗原が同定されたモノクローナル抗体（請求項９）や、請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の診断薬（請求項１０）や、請求項８記載のモノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする抗原に対する疾病の治療薬（請求項１１）に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法としては、ｃＤＮＡライブラリーを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｃＤＮＡがコードするタンパク質を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるタンパク質を発現した哺乳類培養細胞を被検モノクローナル抗体で免疫染色し、被検モノクローナル抗体により免疫染色された免疫陽性細胞を選択し、選択された免疫陽性細胞からｃＤＮＡクローンを単離し、前記哺乳類培養細胞上に発現したタンパク質をコードする遺伝子を同定する方法であれば特に制限されるものではなく、上記被検モノクローナル抗体は、例えば、所定の組織、器官、臓器の一部又は全部を用いて免疫したラットのリンパ球と、マウスのミエローマ細胞とを用いて常法により作製することができる。
【００１６】
上記ｃＤＮＡライブラリーとしては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡ、好ましくは全長ｃＤＮＡを組み込むことにより調製したｃＤＮＡライブラリー、好ましくは全長ｃＤＮＡライブラリーを挙げることができる。ｃＤＮＡライブラリーは、前記被検モノクローナル抗体の作製に用いた所定の組織、器官、臓器と同じ組織、器官、臓器等から抽出したｍＲＮＡを鋳型としてオリゴｄＴをプライマーとした逆転写により相補的ＤＮＡを合成し、これを二本鎖ＤＮＡとしてクローニングベクターに組み込むことにより調製することが好ましい。
【００１７】
上記ｃＤＮＡライブラリーの作製に用いられる哺乳類培養細胞用発現ベクターとしては、真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換することができるプラスミドベクターやトランスフェクションすることができるファージベクターであればどのようなものでもよく、発現ベクタ−の複製を可能とする複製オリジン、発現のためのプロモ−タ−、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、薬剤選択マ−カ−、エンハンサ−等を必要に応じて選択し、組み合わせて構築することができる。発現ベクタ−の複製を可能とする複製オリジンとしては、ＳＶ４０ウィルス、パピロ−マウィルス、ＥＢウィルス等を挙げることができ、また発現のためのプロモ−タ−としては、β−アクチンプロモ−タ−、チミジンキナ−ゼプロモ−タ−、ＳＶ４０プロモ−タ−、アデノウィルス主要後期プロモ−タ−、サイトメガロウィルスプロモ−タ−等を挙げることができる。さらに、スプライスシグナル、ポリＡ付加シグナル、クローン選択を効率化するための薬剤選択マ−カ−、細胞特異的に働くエンハンサ−の他、導入遺伝子の発現を制御する転写制御遺伝子等を付加してもよい。具体的には、上記プラスミドベクターとしてｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８， １９３−２００， １９９１）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８， ４６６−４７２， １９８８）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８， ５３２２， １９９０）等を好適に例示することができるが、これらの中でも、サイトメガロウィルスのエンハンサ−、チキンβ−アクチンプロモ−タ−、ラビットβ−グロビン３’スプライスシグナル、ラビットβ−グロビン３’隣接領域、ＳＶ４０複製オリジンを有し、哺乳動物細胞中で組込んだ遺伝子を高い効率で発現することができるｐＣＡＧＧＳ（図１１参照）が特に好ましい。また、上記哺乳類培養細胞としては、哺乳類培養細胞用発現ベクターにｃＤＮＡを組み込んだｃＤＮＡライブラリー由来の膜抗原タンパク質をトランジェントにあるいはステイブルに細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現させることができる、哺乳類由来の培養細胞であれば特に制限されるものではなく、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ｎｅｕｒｏ２ａ細胞等を例示することができるが、上記膜抗原タンパク質を効率よくトランジェントに発現させうる点でＣＯＳ細胞が好ましい。
【００１８】
また、モノクローナル抗体での免疫染色方法としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等で酵素標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、前記酵素の基質及び発色剤の添加によって色素を生成させ、呈色した色素を観察する酵素免疫染色方法や、ＦＩＴＣ等で蛍光標識されたモノクローナル抗体を、抗原抗体反応により細胞表面上に立体構造を形成した状態で発現している膜タンパク質に反応させた後、蛍光顕微鏡で観察する蛍光免疫染色方法を挙げることができる。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定キットとしては、前記プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ等の哺乳類培養細胞用発現ベクターに全長ｃＤＮＡをクローニングすることにより構築した全長ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞等の哺乳類培養細胞を含むものであればどのようなものでもよく、また、本発明の抗原が同定されたモノクローナル抗体としては、上記本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により、はじめて抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体であれば特に制限されず、具体的には、ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａを特異的に認識するモノクロナール抗体ＮＧ１や、膜蛋白質Ｍ６ａを特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ１−１Ｂ４や、ｒｅｔｉｃｕｌｏｎ １を特異的に認識するモノクロナール抗体９−４ｃ１や、プロゲステロン結合タンパク質（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を特異的に認識するモノクロナール抗体８−２ｆ６や、ＧＡＰ−４３を特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ２−１Ａ７や、代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）を特異的に認識するモノクロナール抗体ｌｏｔ１や、膜蛋白質Ｎ−ＣＡＭを特異的に認識するモノクロナール抗体Ｈ２−３Ｆ２や、ｃ−ｋｉｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒを特異的に認識するモノクロナール抗体ｈ１２ｃ７や、ＮＥＤＤ結合タンパク質を特異的に認識するモノクロナール抗体７−１ｄ８や、ｍＮａｐｏｒを特異的に認識するモノクロナール抗体ａ−ｐａｌｅｏや、ＣＤ５９を特異的に認識するモノクロナール抗体８−１ｇ８等を挙げることができる。
【００２０】
本発明の抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体は、抗原分子の細胞外ドメインに結合することを特徴とし、所定の組織、器官、臓器の一部又は全部を用いて免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の所定の組織、器官、臓器の一部又は全部の切片上で反応させる、免疫組織化学的方法によりスクリーニングすることができるが、抗原分子のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記抗原分子を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかる抗原分子をその表面に発現した哺乳類培養細胞を、上記免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、抗原分子の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。例えば、ｍＧｌｕＲ１のｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記ｍＧｌｕＲ１を哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるｍＧｌｕＲ１を発現した哺乳類培養細胞を、嗅球で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。ｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとしては特に制限されないが、Ｒａｔ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｌｏｔ１を好適に例示することができる。このＲａｔ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｌｏｔ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６４として寄託されている。
【００２１】
また、例えばＮｏｇｏ−ＡのｃＤＮＡを哺乳類培養細胞に導入し、前記Ｎｏｇｏ−Ａを哺乳類培養細胞上に発現させ、かかるＮｏｇｏ−Ａを発現した哺乳類培養細胞を、嗅球軸索で免疫した非ヒト動物の脾細胞と、前記非ヒト動物と異種のミエローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリドーマを培養し、ハイブリドーマの培養上澄液を前記非ヒト動物と異種の終脳の切片上で反応させる免疫組織化学的方法によりスクリーニングしたモノクローナル抗体で免疫染色することにより、Ｎｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインに結合するモノクローナル抗体を再現性よく製造することができる。ミエリンにおける軸索反発因子であるＮｏｇｏ−Ａの細胞外ドメインを特異的に認識するモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマとしては特に制限されないが、Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１を好適に例示することができる。このＨａｍｓｔｅｒ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＮＧ１は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６３として寄託されている。
【００２２】
本発明の抗原に対する疾病の診断薬や抗原に対する疾病の治療薬は、本発明のモノクローナル抗体の抗原分子同定法により、はじめて抗原分子が明らかにされたモノクローナル抗体を有効成分とするものであればどのようなものでもよく、具体的には、抗原ｍＧｌｕＲ１に起因する神経変性疾患、精神***病、てんかん等の疾病や、抗原Ｎｏｇｏ−Ａに起因する神経変性疾患、神経損傷等を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明の上記予防・治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。これら予防・治療薬を用いる予防・治療方法においては、患者の性別・体重・症状に見合った適切な投与量の上記予防・治療薬を、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１［モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定］
実施例１Ａ（実験材料と方法）
（マウス）
日本エスエルシー株式会社からＩＣＲマウスを購入した。腟栓が見つかった日の昼を、胚日齢０．５日（Ｅ０．５）とみなした。生後２〜３ヶ月の成体マウスを本実験において用いた。また、オリエンタル酵母工業株式会社から、生後８週間のアルメニアンハムスターを購入した。本実験における手法は、国立遺伝学研究所動物委員会による承認をうけている。
【００２５】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５である約３００個のマウス胚から嗅索（ＬＯＴ）を機械的に切除し、リン酸バッファー（ＰＢＳ）中で４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定し、ＰＢＳ中で洗浄及び懸濁をした後、これを免疫源としてアルメニアンハムスターの後足に注射した。この免疫処理を３週間ごとに４回繰り返し、最後の追加抗原刺激免疫処理を行なってから３日後に、鼠径リンパ節及び膝窩リンパ節を回収して、それらをマウス骨髄腫細胞（ＮＳ１）と公知の方法を用いて融合させた（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０， ３０９−３１２， １９８３、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １２２， ９０−１００， １９８７）。胚日齢１４．５日のマウス終脳由来の免疫ハイブリドーマ培養物の培養上澄液を免疫組織化学的方法によってスクリーニングした。クローニングを行なうため、先端の尖ったガラス製キャピラリーを用いてハイブリドーマ細胞個体を取りだし、１０％のウシ胎児血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及び１０％のハイブリドーマクローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ社製）を含む９６ウェル細胞プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に蒔いた。
【００２６】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）中で凍結させた。これを凍結切片作製装置（クリオスタット）上で厚さ１４〜２０μｍの切片に分け、ガラススライド（松浪ガラス社製）上に載せた。かかる切片を、１％スキムミルク／ＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０）を有するモノクローナル抗体ＮＧ１ハイブリドーマクローンの培養上澄液を１／１０に希釈した溶液中で一晩インキュベーションし、ＴＥＳＴを用いて洗浄した後、蛍光発光（ＦＩＴＣ）が結合している抗アルメニアンハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて結合抗体を視覚化した。ラビット抗グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼπ抗体（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）及びＣｙ３結合抗ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）を用いてラビット抗希突起膠細胞を染色した。ホールマウント免疫染色法は、公知の方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０， ５８０２−５８１２， ２０００）に準拠した方法で行った。すなわち、Ｅ１３．５マウス胚の終脳半球を切断し、２４〜２８時間、５％のスキムミルク／ＴＢＳＴを用いてモノクローナル抗体ＮＧ１培養上澄液を１０倍に希釈した溶液中においてインキュベーションした。この免疫反応を視覚化するために、ビオチン化した抗アルメニアンハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製）及びＥｌｉｔｅ ＡＢＣ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて処理した。
【００２７】
（嗅球神経の分離培養）
Ｍａｓｕｄａ−Ｎａｋａｇａｗａ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２３， １７１， １９９９）及びＭｏｒｉ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｒｅｓ． ２４， １６０， ２０００）に記載の方法に従い、Ｅ１４．５の嗅球をトリプシン処理し、穏やかなピペット処理を行なうことにより単一細胞に分離した。ポリリシン（Ｓｉｇｍａ社製）によりコーティングした４ウェルチャンバースライド（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに細胞密度が１×１０５細胞となるように調整した。神経膠細胞を用いて条件づけ、Ｂ−２７ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を補った神経細胞培養用基礎培地Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍを用いてＣＯ２インキュベーター中において５日間、かかる細胞を培養した。培養が終了してから２時間、４％のＰＦＡで得られた細胞を固定し、上記方法によりモノクロナール抗体を用いてかかる細胞に対して免疫染色を行なった。
【００２８】
（モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローング）
モノクローナル抗体ＮＧ１の抗原の発現クローングは以下のように行った。Ｅ１４．５のマウス胚の背軸嗅球から得たポリＡ ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ（大阪大学宮崎純一博士より供与）中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ ６； Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体ＮＧ１を用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ ２； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２４０個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローンをサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定した。また、マウスＮｏｇｏ−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した（受入番号：ＡＢ０７３６７２）。
【００２９】
実施例１Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ＮＧ１の作製）
Ｅ１４．５のマウスの終脳から機械で切除した嗅球軸索を用いてハムスターを免疫した。かかるハムスターから調製したリンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞の培養上澄液を、嗅球軸索からなるＬＯＴに結合させるため、切片上で免疫組織化学的にスクリーニングした（図１Ａ、Ｂ）。スクリーニングを行った約２０００のハイブリドーマ細胞株から、ＬＯＴへの強い結合を示したモノクローナル抗体ＮＧ１を単離した。かかるモノクローナル抗体ＮＧ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００３０】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色）
嗅球軸索の盛んな伸長が、Ｅ１４．５の終脳に認められている（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）が、モノクローナル抗体ＮＧ１は、ＬＯＴにおける成長中の軸索を強く標識した（図１Ｃ）。これらの軸索は均一には染色されず、ところどころに強く標識される部位が斑点状に認められた（図１Ｄ）が、こうした斑点に対応する構造は同定できなかった。ＬＯＴのより深い領域では、嗅覚皮質中で腺維の染色も認められた（図１Ｃ）。これは、嗅覚皮質の内在ニューロン（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）の突起部が染色されたものと思われる。嗅球においては、嗅球を通る多くの腺維が至るところで染色されていた（図１Ｅ）。ＬＯＴへと伸長している軸索も同様に染色されているが、こうした伸長ニューロンの細胞体は、はっきりとは染色されていなかった（図１Ｅ）。
【００３１】
胚形成期の終脳のホールマウント調製物において、嗅球軸索がモノクローナル抗体ＮＧ１によって強く染色されているのが認められた（図１Ｅ）。標識した軸索は、嗅覚皮質でアーチ形の突起部を形成しており、これは、以前に報告（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２１， ２３７３−２３７９， ２００１、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７， １９９６）されている嗅球軸索用マーカーによる染色と類似している。しかし、終脳の他の部分では、モノクローナル抗体ＮＧ１による標識は弱いものだった。このことは、弱いものではあるが至るところで生じている抗原の発現が、発生期の神経系において、モノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。
出生後も、ＬＯＴはモノクローナル抗体ＮＧ１により染色された（図１Ｇ）。しかし、その場合は、終脳の他の部位で染色が広範囲に及ぶことは少なかった。それ以前の発生ステージの場合と比較して、軸索には斑点が見られず、もっと均一に染色されていた。
【００３２】
（神経系の他の部位の免疫染色パターン）
一般に、モノクローナル抗体ＮＧ１は、長く成長した軸索を強く標識していた。内包、前交連、脳梁、分界条といった主要な軸索経路はすべて、胚形成期中に強く染色された（図２Ａ、Ｂ）。分化したニューロンが豊富な、皮質板などの領域も染色された（図１Ｃ、２Ａ）。脳とは別個に、嗅神経及び視神経は、かかるモノクローナル抗体に強く染色された（図２Ｃ、Ｄ）。モノクローナル抗体ＮＧ１は、末梢神経及び筋肉も標識したが、他の非神経組織は標識しなかった（図２Ｄ）。これは、神経系及び筋肉においてかかる抗原の特異的発現がモノクローナル抗体ＮＧ１に認識されたことを示唆している。発生が進行するにつれ、モノクローナル抗体ＮＧ１による軸索の標識の鮮明度は低下していった。Ｐ７の時点で、まだ基線レベルより強く染色される軸索もあった（図２Ｅ、Ｆ）が、周辺部に弱い染色部位が偏在していたため、不鮮明だった。
【００３３】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による成長円錐の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１は、発生期の神経系における成長中の軸索を強く標識するため、培養中に盛んに伸長する神経突起における、モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原の細胞中の局在について調べた。モノクローナル抗体ＮＧ１は、嗅球ニューロンの神経突起の遠位部分を優先的に標識した（図３）。遠位末端（ｄｉｓｔａｌ ｔｉｐ）の成長円錐はとくに強く標識された。細胞体及び神経突起で、小胞染色が明瞭に認められることもあった。生存ニューロンを、固定を行わずにモノクローナル抗体と共にインキュベーションしたところ、細胞表面の標識は検出されなかった。これは、モノクローナル抗体ＮＧ１に対するエピトープが、これらのニューロンの細胞質中に存在することを示唆している。
【００３４】
（モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ＮＧ１が認識する抗原を同定するため、ＣＯＳ７細胞中でｃＤＮＡライブラリーを発現させ、モノクローナル抗体ＮＧ１に免疫反応性をもつ生成物を産生するクローンをスクリーニングした。およそ２４，０００のｃＤＮＡクローンを分析した後、＃４−１Ｄ９というクローンが、強い免疫陽性をもつ物質を産生することがわかった（図４Ｂ）。挿入物のヌクレオチド配列から、Ｎｏｇｏのマウス相同物をコードする１つのオープンリーディングフレームが判明した。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９は、Ｎｏｇｏ−Ａを部分的にコードしており、完全な配列の３’側半分をカバーしている（図４Ａ）。ＣＯＳ−７でかかるクローンを発現させたとき、Ｎ−末端から推定５９３番目の残基上の内部メチオニンで翻訳が始まり、Ｃ−末端の最後まで続くと推測された（図４Ａの＃４−１Ｄ９）。Ｎｏｇｏの共通するＣ−末端ドメインには、２つの疎水性ドメインが含まれており、これらはＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能すると考えられている（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １０７， ２４０３−２４１６， １９９４）。＃４−１Ｄ９クローンが産生した免疫反応性生成物は、実際に、ＣＯＳ−７細胞中に広がるレース様の網状組織に分布していた（図４Ｂ）。これは、ＥＲの典型的な分布を示すものである。
【００３５】
モノクローナル抗体ＮＧ１があらゆる形のＮｏｇｏを認識するのか、それともＮｏｇｏ−Ａだけを認識するのかを調べるため、ｃＤＮＡクローンから共通のＣ−末端ドメインを切除した（図４Ａの＃４−１Ｄ９ΔＣ）。その場合もやはりモノクローナル抗体ＮＧ１は、前記の切除を受けた蛋白質を認識したが、Ｃ−末端上のＥＲにおける保存シグナルの欠失により、その分布は細胞質全体に広がった（図４Ｃ）。この結果により、モノクローナル抗体ＮＧ１はＮｏｇｏ−Ａに特異的に結合するが、その他の形のＮｏｇｏには結合しないことがわかった。モノクローナル抗体ＮＧ１が認識するＮｏｇｏ−Ａ特異的ドメインには、レチキュロンファミリーの他のメンバーとの相同性がまったくない。そのため、モノクローナル抗体ＮＧ１が他のレチキュロン蛋白質とも結合するとは考えにくい。事実、本発明者らは、モノクローナル抗体ＮＧ１がＣＯＳ−７細胞中で発現しているレチキュロン１Ａとは結合しないことを確認している。
【００３６】
（モノクローナル抗体ＮＧ１による、成体神経系中の希突起膠細胞の標識）
モノクローナル抗体ＮＧ１が切片中のＮｏｇｏ−Ａを認識するかどうかを調べるため、成体の中枢神経系の切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色した。成体神経系の軸索は、モノクローナル抗体ＮＧ１によってはほとんど染色されなかった。そのかわり、脳全体に散在する細胞体が強く染色されているのが観察された（図５Ａ、Ｂ）。モノクローナル抗体ＮＧ１陽性細胞の形態及び分布から、それらが希突起膠細胞であることがわかった。このことは、希突起膠細胞のマーカーであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）π（ＥＭＢＯ Ｊ． １９， ３４１−３４８， ２０００）によるかかる切片の二重免疫染色で確認された（図５Ｃ、Ｄ）。
【００３７】
成体の脊髄におけるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の分布については、これまでにいくつかの研究報告がある（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）。それらに従い、成体の脊髄切片をモノクローナル抗体ＮＧ１で染色した。かかるモノクローナル抗体により、脊髄の白質全体に分布している希突起膠細胞及びその突起部分が強く染色された（図５Ｅ）。この染色パターンは、報告されている、Ｎｏｇｏ−Ａに対するポリクローナル抗体を用いた場合の免疫染色（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００）と同一だった。しかし、本来Ｎｏｇｏ−Ａに対する抗体であるモノクローナル抗体ＩＮ−１を用いた染色（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ． ２３， ２０９−２１７， １９９４）と比較すると、モノクローナル抗体ＮＧ１による染色では、希突起膠細胞の細胞体がより鮮明に浮かびあがっており、かかる抗体自体は、ミエリン化軸索にはほとんど結合していなかった。染色パターンがこのように異なる理由は、現在のところ不明である。
【００３８】
本実施例において、本発明者らは、発生期の神経系における成長中の軸索と強く結合するモノクローナル抗体ＮＧ１を作製し、このモノクローナル抗体がＮｏｇｏ−Ａ蛋白質と特異的に結合することを示した。成体の神経系をこのモノクローナル抗体で染色した場合の染色パターンは、報告されているＮｏｇｏ−Ａの発現と一致するものだった（Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３４−４３８， ２０００、Ｎａｔｕｒｅ ４０３， ４３９−４４４， ２０００）。発生期のニューロンにはＮｏｇｏ ｍＲＮＡの強い発現が見られるとの最近の報告（Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １６９， ３１９−３２８， ２００１）と考えあわせ、モノクローナル抗体ＮＧ１は発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識すると結論づけることができる。本発明により、モノクローナル抗体ＮＧ１が発生期の神経系中のＮｏｇｏ−Ａを認識するということから、盛んに成長している軸索中で、軸索成長の阻害因子であるＮｏｇｏが強く発現しているという、やや意外な新たな知見が得られた。
【００３９】
実施例２［モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定］
実施例２Ａ（実験材料と方法）
（動物）
中部科学資材社（日本国、名古屋）からＩＣＲ系統マウス及びＷｉｓｔａｒ系ラットを購入した。膣栓が検出された日をＥ０．５とした。エーテル深麻酔下で雌親の胚をＨＢＳＳ中で解離した。次に、全ての胚の発達段階をＴｈｅｉｌｅｒ （１９８９）の定義に従って決定した（ＴＨＥ ＨＯＵＳＥ ＭＯＵＳＥ： ＡＴＬＡＳ ＯＦ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ， ｓｐｒｉｎｇｅｒ， １９８９）。また、抗ｍＧｌｕＲ１抗体は、フナコシ社から購入したラビットポリｍＧｌｕＲ１αの他、生理学研究所の重本隆一博士から供与を受けた抗ｍＧｌｕＲ１抗体を用いた。
【００４０】
（モノクロナール抗体の作製）
Ｅ１４．５のマウス胚から得た約３０個の嗅球を、０．１ｍｌのＨＢＳＳ中に懸濁し、２７ゲージ針を用いて粉砕し、ラットの左後足に注入した。３週間おきに４回、ラットを免疫した。追加抗原を用いて最終免疫を行なってから３日間経過後に、既知の方法（ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＰＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ３５１−３７２， Ｆｒｅｅｍａｎ， １９８１、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２２， ９０−１００， １９９６）を用いて、左鼠径リンパ節及び左膝窩リンパ節をミエローマ細胞と融合させた（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１）。ハイブリドーマ培養物の上清をＥ１４．５マウス終脳の切片上で免疫組織化学的方法を用いてスクリーニングした。先端が尖ったガラス製キャピラリーを用いて細胞を１個ずつ回収し、１０％のウシ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｎｅｘａ， ＫＳ）及び１０％のハイブリドーマ細胞・クローニング因子（Ｉｇｅｎ社製）を加えたＤＭＥＭ（日水社製、東京、日本国）を加えた９６ウェル培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）の各ウェルに移して、クローニングした。
【００４１】
（免疫組織化学法）
マウス胚の脳を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳに４℃下で一晩固定し、２０％スクロースを含むＰＢＳに一晩浸し、ＯＣＴコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、 Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ社製）で凍結した。クリオスタットで冠状切片を１４μｍ厚さに切り分け、ポリ−Ｌ−リシンでコーティングしたグラススライド（Ｓｉｇｍａ社製）上に置いた。かかる切片を、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）共存下で１０分間インキュベートしてＯＣＴ化合物を除去し、その後さらにハイブリドーマ培養物上清共存下で１時間培養した。結合抗体をＣｙ３で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、視覚化した。
ホールマウント免疫染色は、文献（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２９， １２７−１３７， １９９６）記載の手法に従って行った。簡潔に説明すると、終脳及び培養物を、４％ＰＦＡを含むＰＢＳに４℃下で１２時間固定し、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴにおいて１時間インキュベートして抗体の非特異的結合を阻害した。プロテインＡカラム（Ａｆｆｉｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰｓ ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を通過させることにより親和精製したモノクローナル抗体ｌｏｔ１（１０μｇ／ｍｌ）共存下において上記標本をインキュベートした。結合抗体をＣｙ３又はＣｙ２で標識した抗ラットＩｇ抗体（１：５００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて視覚化した。
【００４２】
免疫染色処理には以下の抗体も用いた。ウサギ抗ニューロピリン−１抗体（２μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＭＡＰ２抗体（１：５００、Ｓｉｇｍａ社製）、マウス抗リーリンモノクローナル抗体ＣＲ−５０（２μｇ／ｍｌ；Ｎｅｕｒｏｎ １４， ８９９−９１２， １９９５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １７， ２３−３１， １９９７）、マウス抗ニューロフィラメントモノクローナル抗体２Ｈ３（１：１００ハイブリドーマ上清、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ Ｂａｎｋ）、ウサギ抗カルレチニン抗体（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）、ウサギ抗ネスチン抗体（１：５００、大阪大学吉川博士から供与）。二次抗体として、ＦＩＴＣ標識化抗マウスＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）又はＦＩＴＣ標識化抗ウサギＩｇ抗体（１：１００、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用した。
【００４３】
（全胚培養法）
既知の方法（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ２９， １２７−１３７）を用いて、器官型培養を行った。具体的には、Ｅ１２．５マウスから得た終脳半球を切片に分け、軟膜を除去し、表面がコラーゲンで覆われている膜フィルター（Ｔｒａｎｓｗａｌｌ−ＣＯＬ ３４１８， Ｃｏｓｔａｒ社製）上に、心室側を下にして置いた。Ｅ１３．５終脳から嗅球を分離し、Ｅ１２．５終脳片のＬＯＴ部位と結合させて共培養を行った。１０％のウシ血清を含むＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ミディアム（混合比１：１、日水社製）において、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃で２〜３日間外植片を培養した。（Ｈｉｒａｔａ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓａｗａ， １９９７）に記載の方法で、嗅球を培養した（Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ ３２， ４１５−４２５， １９９７）。
【００４４】
実施例２Ｂ（結果）
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１の作製）
免疫処理したマウス３匹から得たリンパ球とマウスミエローマ細胞を融合させ、ハイブリドーマ細胞株を得た。Ｅ１４．５マウス終脳の切片を免疫染色し、約２０００個のハイブリドーマ細胞株を含有している培養上清をスクリーニングした。なお、ＬＯＴ周辺にある細胞サブセットを特異的に染色するモノクローナル抗体ｌｏｔ１を単離した。他のハイブリドーマ細胞株では、同様の染色パターンはみられなかった。かかるモノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いた免疫染色パターンを以下に示す。
【００４５】
（道標細胞の起源）
嗅球の神経細胞の軸索は、終脳の特定領域を選択的に伸長する（図６Ａ、Ｊ．Ｃｏｍｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２２３， １７７−２０２ １９８４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２９， １２７−１３７ １９９６）。この軸索の道標となるのが、モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する神経細胞である（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８， ７８００−７８１０， １９９８）。この道標細胞は、軸索の伸長に先立って、将来の軸索伸長経路に並び、軸索をこの経路へと誘導する。Ｅ１２．５の終脳をモノクローナル抗体ｌｏｔ１でホールマウント免疫染色した結果、道標細胞のマーカーであるモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色された道標細胞がつくる帯の上を嗅球の軸索が伸長していた（図６Ｂ）。そこで、道標細胞の起源を探索するため、道標細胞が***をしているＥ１０．５の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養し、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、終脳新皮質と呼ばれる領域を培養したときに限って、分化してくることが示された（図７Ａ）。さらに、終脳新皮質領域の神経幹細胞を１つ１つ単離して、クローン増殖させても、その中から一定の確率で道標細胞が分化してくることがわかった（図７Ｂ）。したがって、道標細胞を生み出す能力は、終脳新皮質の幹細胞に自律的に備わっていると考えられた。新皮質と隣接する線状体原基の幹細胞を、同様にしてクローン培養しても、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される細胞は、決して現れてこなかった。
【００４６】
（道標細胞の移動）
終脳新皮質は、将来道標細胞が並ぶ軸索経路に比較すると、はるかに背側に位置する、かなり広い領域であるが、この中ではどこの領域をとっても、道標細胞は同じように分化してくる（図７Ｂ）。もし実際の生体内でも、新皮質全体から道標細胞が発生してくるとすれば、これらの細胞は、将来の軸索経路に並ぶために、かなりの距離にわたって終脳半球を腹側方向に移動しなければならない。しかし、このような方向の細胞移動は、これまで報告されていなかった。そこで、この時期の終脳における実際の細胞移動の様子を、マウス胚全体を子宮外で培養する全胚培養法を用いて解析した。Ｅ１０．５の胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し、その胚を２日間全胚培養した。その結果、終脳新皮質で生まれた細胞が確かに腹側方向へと選択的に移動し、将来の軸索経路に並ぶことが確かめられた（図８Ａ）。このようにして移動した細胞の少なくとも一部は、モノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞へと分化することも示された（図８Ｂ、Ｃ）。以上の結果を総合すると、道標細胞は終脳新皮質全体で発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に並ぶという興味深い発生過程をたどると考えられる。
【００４７】
（Ｘｔ突然変異マウスにおける道標細胞の分布異常）
道標細胞発生の分子機構の手がかりを得るために、終脳の発生に異常を示す様々な突然変異マウスを入手して、これらのマウス脳における道標細胞の動態を観察した。その結果、Ｅｘｔｒａ−ｔｏｅｓ（Ｘｔ）と呼ばれる突然変異マウスにおいて、道標細胞が終脳新皮質全体に散在していることを見い出した。すなわち、野生型マウス（＋／＋）胚において、道標細胞は、終脳新皮質の広い領域から発生し、腹側方向に移動して、将来の軸索経路に配列するが、Ｘｔ突然変異マウス（Ｘｔ／Ｘｔ）においては、終脳の細胞が移動せず、道標細胞が新皮質全体に散在する（図９）。この突然変異マウスの終脳では、腹側方向に向かう細胞移動も観察されず、この細胞移動の異常が道標細胞の分布異常の直接の原因であると考えられた。なお、Ｘｔ突然変異の原因遺伝子は転写制御因子Ｇｌｉ３であることが明らかにされており（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６， ７９９−８０４， １９９２、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ３， ２４１−２４５， １９９３）、またこの変異により脳の背腹軸に乱れが生じるといわれている（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２５， ２３１５−２３２５， １９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６， ３５６１−３５７１， １９９９）。
【００４８】
（モノクローナル抗体ｌｏｔ１が認識する抗原分子の同定）
モノクローナル抗体ｌｏｔ１の抗原物質を豊富に発現する発生期の終脳領域からｍＲＮＡを調製して全長ｃＤＮＡを合成し、これを哺乳類用発現ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んでライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリーをＣＯＳ細胞に導入し、コードするタンパク質を強制発現させた。ｃＤＮＡライブラリーを導入したＣＯＳ細胞を、モノクローナル抗体ｌｏｔ１を用いて免疫染色し、顕微鏡下で染色される細胞を検索し、約２０００００のｃＤＮＡクローンを検索したところ、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で強く染色される細胞を生じるｃＤＮＡクローン♯６−２Ｅ１０を単離することができた。このクローンの塩基配列を決定したところ、代謝型グルタミン酸レセプター１（ｍＧｌｕＲ１）をコードしていることが明らかになった。ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入し、ｍＧｌｕＲ１タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図１０Ａ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図１０Ｂ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。また、細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞をモノクローナル抗体ｌｏｔ１と２種類の抗ｍＧｌｕＲ１抗体で免疫染色した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（図１０Ｃ）と重本博士供与の抗ｍＧｌｕＲ１抗体（図１０Ｄ）では免疫染色が認められたが、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体では免疫染色が認められなかった。これらの結果から、モノクローナル抗体ｌｏｔ１はｍＧｌｕＲ１の細胞外ドメインに結合することが示された。また、市販の抗ｍＧｌｕＲ１抗体はｍＧｌｕＲ１の細胞内ドメインの一部を認識すると考えられた。さらに、このｍＧｌｕＲ１が本当にモノクローナル抗体の抗原分子であるのかを確かめるために、ｍＧｌｕＲＩ遺伝子欠損マウス（Ｃｅｌｌ ７９， ３６５−３７５， １９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２， ２３７−２４３， １９９４）を入手して、モノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において染色性が完全に欠失していることが示された。その結果、ホモ欠損マウス胚の脳において、染色性が完全に欠失していることが示された。
【００４９】
実施例３［モノクローナル抗体９−４ｃが認識する抗原分子の同定］
（モノクローナル抗体９−４ｃの作製）
マウス胎児における嗅覚皮質の発生を調べるために、新規モノクローナル抗体９−４ｃを作製した。実施例１と同様にして、マウスの嗅覚皮質で免疫したラットのリンパ球とマウスのミエローマ細胞との融合によりハイブリドーマクローンを産生した。およそ５０００個のハイブリドーマから、胚日齢が１４．５日のマウス終脳の冠状切片における免疫組織化学スクリーニング法により選択し、モノクローナル抗体９−４ｃを作製した。
【００５０】
（モノクローナル抗体９−４ｃにより認識される抗原の同定）
モノクローナル抗体９−４ｃにより認識された抗原を同定するため、ＣＯＳ−７細胞でｃＤＮＡライブラリーを発現し、モノクローナル抗体９−４ｃと免疫反応する抗原を産生するクローンを選択した。胚日齢１４．５日のマウス胚の背軸嗅球から得たポリアデニル化ＲＮＡを、ｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。真核細胞中に蛋白質を効率的に発現可能とし、且つコンピテント細胞に形質転換するプラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ中に、前記ｃＤＮＡを挿入することにより、約１００クローンのプラスミドのプールを調製し、トランスフェクション試薬（ＦｕＧｅｎｅ ６； Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクションした。続けて２日間、ＰＢＳ中の４％のＰＦＡを用いて固定し、モノクローナル抗体９−４ｃを用いて免疫染色した。免疫応答細胞は、蛍光顕微鏡を用いてスクリーニングした（Ａｘｉｏｐｌａｎ ２； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）。スクリーニングで得た約２００００個のプールから、強い免疫陽性細胞を産出するプールを同定した。かかるプールをさらに小さなプールに分け、単一ポジティブｃＤＮＡクローンが得られるまでアッセイを繰り返した。単離したｃＤＮＡクローン＃４−８Ｅ９をサブクローンし、ＤＮＡシーケンサー（ＣＥＱ２０００；Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて配列を決定し、モノクローナル抗体９−４ｃにより認識される抗原がＲｔｎ１であることを同定した。このマウスＲｔｎ１−Ａのヌクレオチド配列をデータベースに登録した。
【００５１】
神経内分泌特異的タンパク質（ＮＳＰ）としてよく知られているＲｔｎ１は、膜貫通型ＥＲタンパク質である（図２Ａ）。Ｒｔｎ１の機能は未だ明らかにされていないが、Ｒｔｎ１は神経及び神経内分泌において発現すること（Ｗｉｅｃｚｏｒｅｋ ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ， １９９１、ｖａｎ ｄｅ Ｖｅｌｄｅ， １９９４ｂ）や、３つの異なったスプライシングアイソフォーム、Ｒｔｎ１−Ａ、Ｒｔｎ１−Ｂ及びＲｔｎ１−Ｃが存在することも知られている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋ， １９９６）。かかる３つのアイソフォームは、共通したＣ−末端ドメインと変異したＮ末端配列とを有している。Ｒｔｎ１−Ａは、最も長いアイソフォームであって、Ｒｔｎ１−Ｂの３６０アミノ酸を全て含む７６０アミノ酸から構成されている。また、Ｒｔｎ１−Ｃは、共通したＣ−末端ドメインに加えてアミノ酸の伸長が短いＮ末端を含んでいる。単離されたｃＤＮＡクローン＃４−８Ｅ９は、開始メチオニンを含むＲｔｎ１−Ｂの全てのアミノ酸配列を含んでいるが、Ｒｔｎ１−Ｂに対する５′非翻訳領域のヌクレオチド配列を欠損していた（図２Ａ）。このことから、かかるクローンは、Ｒｔｎ１−Ａ又はＲｔｎ１−ＢのｍＲＮＡのどちらかを発現することができるが、Ｒｔｎ１−Ｂは癌細胞のみにおいて発現し、正常組織においては発現しないことが既に報告されている（Ｒｏｅｂｒｏｅｋ， １９９３）ことから、Ｒｔｎ１ＡのｍＲＮＡに由来すると考えられる。いずれにしても、クローン＃４−８Ｅ９がＣＯＳ−７細胞において発現する際、Ｒｔｎ−１Ｂタンパク質が産生されるのではないかと考えられる。
【００５２】
Ｒｔｎ１に共通するＣ−末端ドメインは、疎水性アミノ酸を親水性部分で分けた２つの伸長を含んでいる（図２Ａ）。このことから、かかるドメインは、ＥＲにおいて保持したシグナルとして機能することが示唆される。実際、クローン＃４−８Ｅ９をＣＯＳ−７細胞で発現させると、モノクローナル抗体９−４ｃは、かかる細胞においてレース様のネットワーク伸長、すなわち、ＥＲの典型的な分布を標識していた（図２Ｂ）。共通するＣ−末端ドメインを切除しても、なお、モノクローナル抗体９−４ｃはトランケート体を認識していたが、その分布は細胞質間で散布し（図２Ｃ）、モノクローナル抗体９−４ｃは、Ｒｔｎ１Ａ及びＢに結合していたが、Ｒｔｎ１Ｃには結合していなかった。また、モノクローナル抗体９−４ｃは、終脳の他、ＬＧＥ及びＭＧＥの脳室帯や視索前部及び隔膜に対して免疫反応することや、脳室領域であるＶＰと反応する。
【００５３】
【発明の効果】
本発明によると、モノクローナル抗体が認識する抗原を効率よく短時間で同定することができ、組織的・網羅的なモノクローナル抗体の作製と応用に役立つばかりでなく、抗原の決定できた抗体については、その抗原の機能や性質によってはさまざまな応用、例えば、疾患の診断マーカー、再生医療、疾患治療などへの応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体ＮＧ１による中枢嗅覚系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：終脳の側面（Ａ）及び冠状面（Ｂ）の概略図。（Ａ）の左部分が吻側であり、（Ｂ）の左部分が側面である。（Ａ）（Ｂ）共にその上部が背面となっている。嗅球（ＯＢ）軸索が、終脳内部の尾側に伸長し、終脳表面で外側嗅索（ＬＯＴ）を形成している。
（Ｃ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の終脳の冠状切片。ＬＯＴ（矢印）が強く染色されている点に注意。嗅覚皮質（矢頭）及び皮質板も、かかるモノクローナル抗体で染色されている。
（Ｄ）：高拡大率でのＬＯＴ。軸索は均一に染色されておらず、強く標識された部位が斑点となっている。
（Ｅ）：前記モノクローナル抗体で染色した、大量の繊維をもつＥ１４．５の嗅球。
（Ｆ）：モノクローナル抗体ＮＧ１による、Ｅ１３．５の終脳の全量免疫染色。他の終脳部位と同様に、ＬＯＴ（矢印）を形成している嗅球軸索でも染色が認められる。
（Ｇ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＰ０の終脳。ＬＯＴ（矢印）は、やはり他の部位よりも強く染色されている。
スケールバーは５０μｍ（Ａ−Ｄ及びＦ）、５００μｍ（Ｅ）を表す。
【図２】モノクローナル抗体ＮＧ１による、神経系の他部位の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色したＥ１４．５の前脳の冠状切片。内包（矢印）及び髄条（矢頭）において軸索が強く染色されている点に注意。
（Ｂ）：Ｅ１４．５の前脳の後部水平部位（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｌｅｖｅｌ）上の切片。分界条（矢印）中の軸索の束が強く標識されている。
（Ｃ）：Ｅ１４．５の嗅上皮から伸長している嗅覚神経（矢頭）の強い染色。
（Ｄ）：Ｅ１４．５の眼球の、強く標識された視神経（矢印）。眼筋（矢頭）も前記モノクローナル抗体によって染色されている。
（Ｅ）：Ｐ７の前交連（矢印）は、やはり前記モノクローナル抗体によって強く染色されている。
（Ｆ）：Ｐ７の脳梁（矢印）は、周辺部位よりもやや強いレベルで染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図３】モノクローナル抗体ＮＧ１による、培養した嗅球ニューロンの免疫染色の様子を示す図である。
Ｅ１４．５の嗅球ニューロンを解離し（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、５日間培養した。神経突起の成長円錐（矢印）が、モノクローナル抗体ＮＧ１によって強く標識されている。スケールバーは５０μｍを表す。
【図４】モノクローナル抗体ＮＧ１によるＮｏｇｏ−Ａ蛋白質の認識の様子を示す図である。
（Ａ）：Ｎｏｇｏの３つのアイソフォームの蛋白質構造。Ｎｏｇｏ−Ａには、Ｎｏｇｏ−Ｂのアミノ酸配列がすべて含まれている。Ｎｏｇｏ−Ｃは、Ｎ−末端（縞のボックス）上に、独特の配列を有している。３種類のアイソフォームすべてに共通するＣ−末端領域におけるグレーのボックスは、ＥＲ中で膜貫通ドメインとして機能する疎水性アミノ酸配列を示している。単離したｃＤＮＡクローンである＃４−１Ｄ９の構造が、かかる３つのＮｏｇｏアイソフォームの下に示されている。翻訳は、左側の点線部分、すなわちＮｏｇｏ−Ａのほぼ中央にあたる位置で始まるとされている。底部にあるｃＤＮＡ構造物の＃４−１Ｄ９ΔＣにおいては、共通するＣ−末端ドメインは、右側の点線部分で欠失し、Ｎｏｇｏ−Ａ特異的な３１６のアミノ酸からなるトランケート蛋白質が後に残っている。
（Ｂ）：＃４−１Ｄ９クローンを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。ＥＲの特徴であるレース様の網状組織が染色されている。
（Ｃ）：＃４−１Ｄ９ΔＣを用いてトランスフェクションし、モノクローナル抗体ＮＧ１で免疫染色を行ったＣＯＳ細胞。細胞質が広く染色されている。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図５】モノクローナル抗体ＮＧ１による成体神経系の免疫染色の様子を示す図である。
（Ａ、Ｂ）：脳梁近辺の成体終脳の切片。モノクローナル抗体ＮＧ１は、終脳全体に散在する細胞体を染色している。切片（Ｂ）は、（Ａ）の拡大率を高くしたものである。
（Ｃ、Ｄ）：抗ＧＳＴ抗体で染色して希突起膠細胞を視覚化した（Ａ、Ｂ）の同一の図。同じ細胞（矢頭）が、（Ｂ）及び（Ｄ）において標識されている。
（Ｅ）：モノクローナル抗体ＮＧ１で染色した成体の脊髄切片。白質中の希突起膠細胞及びその突起部が強く染色されていることに注意。灰白質中でいくつかのニューロンが染色されているのは、二次抗体の非特異的結合によるものである。
スケールバーは５０μｍを表す。
【図６】嗅球軸索と道標細胞の様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１２日目頃のマウス終脳の外側図。左が吻側、上が背側を示す。嗅球の軸索（緑）は、道標細胞（赤）がつくる帯の上を伸長する。
（Ｂ）：胎生１２．５日目の終脳。嗅球から最初に伸び出す軸索を、緑の色素で標識した（矢印）。道標細胞はモノクローナル抗体ｌｏｔ１で赤く染色されている。
スケールバーは１００μｍを表す。
【図７】培養下における道標細胞の発生の様子を示す図である。
（Ａ）：道標細胞が***をしている胎生１０．５日目の終脳新皮質から細胞を解離して、チミジン類似体のＢｒｄＵ存在下で５日間培養した。モノクローナル抗体ｌｏｔ１で染色される道標細胞が分化している（赤）。そのうち半数以上の細胞は、ＢｒｄＵ（緑）を核に取り込んでおり、培養下で***したことがわかる（矢頭）。
（Ｂ）：培養下で道標細胞を生み出す終脳領域。数字は、その領域を培養したときにモノクローナル抗体ｌｏｔ１陽性の道標細胞が分化した確率（％）を示す。赤字が終脳新皮質領域、黒字が線状体原基領域。赤の斜線は予想される将来の嗅球軸索経路の位置を示す。
【図８】道標細胞が終脳新皮質から腹側方向に移動する様子を示す図である。
（Ａ）：胎生１０．５日目胚の終脳新皮質の神経幹細胞を、蛍光色素で標識し（星印）、その胚を２日間全胚培養した。色素標識された細胞が、腹側方向に移動し（矢印）、逆Ｔ字を描いて将来の軸索経路に配列している（矢頭）。
（Ｂ）：終脳新皮質から移動し、軸索領域に並んだ標識細胞（矢頭）。長い突起を将来の軸索経路の方向に伸長している。
（Ｃ）：（Ｂ）の標本をモノクローナル抗体ｌｏｔ１で免疫染色した写真。標識細胞は道標細胞と入り交じって、細胞の帯を形成している。
スケールバーは、（Ａ）５００μｍ、（Ｂ）（Ｃ）１００μｍを表す。
【図９】野生型およびＸｔ突然変異マウスにおける道標細胞の誕生と移動の様子を示す図である。
【図１０】モノクローナル抗体ｌｏｔ１がｍＧｌｕＲ１を認識する様子を示す図である。
（Ａ）（Ｂ）：ｃＤＮＡクローン＃６−２Ｅ１０を導入したＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ａ）と抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｂ）による二重免疫染色像。
（Ｃ）（Ｄ）：細胞内ドメインを欠失させたｍＧｌｕＲ１変異タンパク質を発現するＣＯＳ細胞。モノクローナル抗体ｌｏｔ１（Ｃ）も抗ｍＧｌｕＲ１抗体（Ｄ）もよく似た染色を示す。
【図１１】発現ベクターｐＣＡＧＧＳを示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody, and more particularly, to a method for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody using a mammalian cell cDNA expression library.
[0002]
[Prior art]
Obtaining antibodies against the target protein occupies an important position in its identification and functional analysis.However, conventional methods of administering and immunizing animals with a target antigen require a large amount of various antigens and a long time. Since a great deal of labor is required, a method for producing an antibody using a phage antibody library has recently been established. This method applies a system that displays (displays) an antibody on the surface of a phage by fusing the antibody to the coat protein of a filamentous phage. Is prepared as a phage display library by displaying the library on a phage. According to this phage system (for example, see Non-patent Document 1), the antigen of a human antibody is identified. It is possible to do. This screening method using a phage antibody library is called a phage display method, and has conventionally been used to identify ligands and various antigens that specifically bind to various cell surface receptors. Many methods for preparing a phage antibody library and screening methods using the same, such as an immunotube method and a magnetic bead method, have already been reported. (See, for example, Non-Patent Documents 2 and 3.)
[0003]
In addition, as a cloning method of a membrane molecule, for example, a cDNA library prepared with an animal cell expression vector is introduced into COS7 cells by utilizing transient expression using an expression vector containing an origin of replication of COS7 cells and SV40, Expression of a membrane protein derived from a cDNA library on the cell surface, concentration of cells expressing the target membrane molecule by panning or FACS using an antibody or ligand against the membrane molecule, and collection of plasmid DNA Transfection into COS7 cells again and repetition of the enrichment procedure, expression vector cDNA library is divided into several small pools, introduced into COS7 cells, and the expression of membrane molecules is carried out using isotope-labeled antibodies and ligands. Detect and turn positive pools into pools with fewer plasmids Only way to clone repeated transfection it is known (e.g., see Non-Patent Document 4.).
[0004]
Further, a polyadenylated RNA was isolated from human cells, a double-stranded cDNA was prepared using the isolated polyadenylated RNA, and the double-stranded cDNA was inserted into a cloning vector to prepare a recombinant expression vector. Transforming the host with a recombinant expression vector to express the antigen and using an antibody from the serum of a rheumatoid arthritis patient to bind the antibody to the expressed antigen using an anti-human IgM antibody-alkaline phosphatase Preparation of a recombinant DNA encoding a rheumatoid arthritis diagnostic antigen reactive to a rheumatoid arthritis-related antibody, selecting a transformed host by detection with the complex and an alkaline phosphatase developing substrate A method (for example, see Patent Document 1) is also known.
[0005]
On the other hand, the following findings regarding the growth of nerve axons and the like have been reported.
The development of the nervous system is characterized by the ability of axons to actively grow, and many axons actively elongate in the embryonic brain, led by a specialized tip called the growth cone ( For example, see Non-Patent Documents 5 and 6.) However, as the central nervous system matures, axons lose growth potential (see, for example, Non-Patent Document 7). Although studies on central axon regeneration have been actively conducted so far, it is considered that it is very difficult to induce axonal regeneration in clinical practice. Embryonic and adult axons differ in their growth potential, which is thought to be due in part to the growth-inhibitory environment in the adult nervous system (see, for example, Non-Patent Document 8). For example, it has been previously shown that central myelin has been implicated in the inhibition of axonal growth in the adult nervous system from previous studies, both in vivo and in vitro. reference.).
[0006]
The olfactory system is composed of the olfactory bulb and the olfactory cord (LOT) that has grown into the telencephalon. Since the olfactory tract is simple (for example, see Non-Patent Documents 11 and 12) and can be easily regenerated by organ culture (for example, see Non-Patent Document 13), it is useful information on the cellular and molecular mechanisms of axon guidance (For example, see Non-Patent Documents 14 to 17). It has also been shown from past studies that Nogo, which is an axonal repulsive factor in myelin, is produced by oligodendrocytes in the adult nervous system (see, for example, Non-Patent Documents 18 to 22). It is known (for example, see Non-Patent Documents 23 to 25). It is also known that Nogo blocks the growth of central axons (see, for example, Non-Patent Documents 26 and 27).
[0007]
IN-1 known as an anti-Nogo monoclonal antibody has been reported to enhance axonal regeneration both in vitro and in vivo in the central nervous system (eg, Non-Patent Documents 17, 23, 25-30). reference.). Nogo belongs to the Reticulon family, which is a part of the endoplasmic reticulum (ER) transmembrane protein (for example, see Non-Patent Documents 31 and 32). Like other members of the reticulon family, Nogo is mainly located in the ER, but also on the cell surface (see, for example, Non-Patent Documents 19, 20, and 23). Nogo has three splicing isoforms, Nogo-A, Nogo-B and Nogo-C, which share a common C-terminal domain but differ in the N-terminal sequence. Nogo-A is the longest isoform, consisting of 1163 amino acid residues in rat. Nogo-B has the N-terminal portion of Nogo-A and a common spliced C-terminal domain. Nogo-C is the shortest isoform and contains a unique short amino acid on the N-terminus, in addition to the common C-terminal domain. Recent studies have shown that Nogo has two functional domains for repulsion, a 66 amino acid sequence in the common C-terminal domain and an N-terminal sequence specific for Nogo-A. (For example, see Non-Patent Document 33.)
[0008]
In addition, axons of nerve cells of the olfactory bulb selectively extend a specific region of the telencephalon (see, for example, Non-Patent Documents 13 and 34), and identify a nerve cell (a signpost cell) as a signpost of the axon. Monoclonal antibody (mAb) lot1 is known as a marker antibody for labeling (for example, see Non-Patent Document 35). Signpost cells align with future axon outgrowth pathways and guide axons into this pathway prior to axon outgrowth, but it is unclear what antigen molecule lot1 recognizes. Was. This antigen molecule is expressed only in signpost cells at least in the developing telencephalon, and it is thought that it may be related to some function unique to signpost cells.
[0009]
Glutamate is also released from nerve endings and regulates major neuronal activities in the central nervous system of higher animals, such as regulating neuronal activity or release of neurotransmitters via glutamate receptors present in the postsynaptic membrane or nerve endings. It is thought to be an excitatory neurotransmitter, and glutamate receptors are known to play a central role in central excitatory synaptic transmission. Glutamate receptor is a metabotropic glutamate receptor that transmits signals indirectly by coupling with G protein, and a receptor for ion channel-type glutamate, which incorporates ion channels and plays a key role in synaptic transmission due to signal transduction mechanism. (MGluR), and it is also known that there are eight different subtypes of mGluR1 to mGluR8 in mGluR by gene cloning. mGluR1 to mGluR8 each show a different distribution in the brain, mGluR1 and mGluR5 are receptors that transmit information to phospholipase, inositol triphosphate, and calcium via G protein, and mGluR1 is a seven-cell transmembrane having a long cell domain. It is a protein that is thought to function as a receptor for the neurotransmitter glutamate (for example, see Non-Patent Documents 36 and 37).
[0010]
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Japanese Patent Publication No. 10-513257
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[0011]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, a method of expression screening using a phage library has been put to practical use in the antigen molecule identification method of a monoclonal antibody so far, but in this system, a semi-denatured protein fragment is recognized by the antibody. The method cannot be applied to an antibody that recognizes the three-dimensional structure of an antigen protein, and there are many antigens that cannot be identified by such a method. Therefore, it has not been possible to identify a monoclonal antibody effective as a diagnostic or therapeutic agent for a disease against the antigen protein from the viewpoint of the three-dimensional structure. An object of the present invention is to provide a method for efficiently identifying an antigen recognized by a monoclonal antibody in a short time. Monoclonal antibodies whose antigens have been revealed can be expected to be applied to, for example, disease diagnostic markers, regenerative medicine, disease treatment, and the like, depending on the function and properties of the antigen.
[0012]
[Means for Solving the Problems]
The antigen recognized by the monoclonal antibody lot1 was predicted to be a membrane protein based on the pattern of immunostaining, but neither the Western blot nor the immunoprecipitation could detect this antigen molecule. This was thought to be due to the fact that the antigen-determining site of the monoclonal antibody lot1 was destroyed due to extraction from the membrane and solubility. In the case of a monoclonal antibody having an antigenic determinant having such properties, it is extremely difficult to identify the antigen molecule. It is of course impossible to purify the antigen protein by immunoprecipitation, and it is extremely unlikely that the antigen can be identified even by an expression search system using a phage library. Therefore, I changed my idea and tried to search for antigen molecules by expressing proteins as close as possible to their original three-dimensional structure. Specifically, mRNA was prepared from a region that abundantly expresses the antigenic substance of the monoclonal antibody lot1, a full-length cDNA was synthesized, and this was inserted into a mammalian expression vector to prepare a library. This cDNA library was introduced into a cultured mammalian cell line (COS cell), and the encoded protein was forcibly expressed. According to this method, even if the cDNA encodes a membrane protein, the product should be incorporated into the cell membrane as usual, and can assume the original three-dimensional structure. With this in mind, COS cells into which the cDNA library had been introduced were immunostained using the monoclonal antibody lot1, and cells to be stained were searched under a microscope. When a cDNA clone was searched using the above expression search system, a cDNA clone that produced cells that stained strongly with the monoclonal antibody lot1 was isolated. The nucleotide sequence of this clone was determined, and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) was determined. It became clear that it was coding. That is, the present inventors incorporated a full-length cDNA into an expression vector for cultured mammalian cells, prepared a full-length cDNA library, introduced the full-length cDNA library into mammalian cells, cultured the resultant, and obtained a protein encoded by the cDNA. Is expressed in the form of a three-dimensional structure on cultured mammalian cells, and the antigen-gene cDNA is identified by immunostaining with a test monoclonal antibody the cultured mammalian cells expressing the protein in the three-dimensional structure. The inventors have found that the present invention can be performed, and completed the present invention.
[0013]
That is, in the present invention, a cDNA library is introduced into cultured mammalian cells, the protein encoded by the cDNA is expressed on the cultured mammalian cells, and the cultured mammalian cells expressing the protein are immunostained with a test monoclonal antibody. Selecting immunopositive cells immunostained by a monoclonal antibody, isolating a cDNA clone from the selected immunopositive cells, and identifying a gene encoding a protein expressed on the cultured mammalian cells. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein the method for identifying an antigen molecule of the antibody (Claim 1) or the cDNA library is a cDNA library prepared by incorporating cDNA into an expression vector for cultured mammalian cells. Antigen molecule identification method (Claim 2), cDNA live 3. The method according to claim 2, wherein the library is a full-length cDNA library prepared by incorporating a full-length cDNA into an expression vector for cultured mammalian cells. 4. The method for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 3, wherein the expression vector for cells is a plasmid vector pCAGGS (claim 4), and the cultured mammalian cell is a COS cell. A method for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 4 (claim 5).
[0014]
The present invention also provides a monoclonal antibody antigen molecule identification kit comprising a cultured mammalian cell into which a full-length cDNA library constructed by cloning a full-length cDNA into an expression vector for a cultured mammalian cell has been introduced (claim 6). The kit for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody according to claim 6, wherein the expression vector for mammalian cultured cells is a plasmid vector pCAGGS (claim 7), and that the cultured mammalian cells are COS cells. An antigen obtained by the kit for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody according to claim 6 or 7 (claim 8) or the method for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody according to any one of claims 1 to 5. The monoclonal antibody (claim 9) in which is identified or the monoclonal antibody according to claim 8. A diagnostic agent for a disease against an antigen characterized by being used as an active ingredient (Claim 10) or a therapeutic agent for a disease against an antigen characterized by using the monoclonal antibody according to claim 8 as an active ingredient (Claim 11) About.
[0015]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
As a method for identifying the antigen molecule of the monoclonal antibody of the present invention, a cDNA library is introduced into cultured mammalian cells, the protein encoded by the cDNA is expressed on cultured mammalian cells, and the cultured mammalian cells expressing the protein are tested. Immunostaining with a monoclonal antibody, immunopositive cells immunostained with the test monoclonal antibody are selected, a cDNA clone is isolated from the selected immunopositive cells, and a gene encoding a protein expressed on the mammalian cultured cells is isolated. The identification method is not particularly limited as long as it is a method for identification. The test monoclonal antibody is, for example, a predetermined tissue, an organ, a rat lymphocyte immunized using part or all of an organ, and a mouse myeloma cell. And can be produced by a conventional method.
[0016]
Examples of the cDNA library include a cDNA library prepared by incorporating a cDNA, preferably a full-length cDNA, into an expression vector for cultured mammalian cells, and preferably a full-length cDNA library. The cDNA library is obtained by reverse transcription using oligo dT as a primer and mRNA extracted from the same tissue, organ, organ, or the like as the predetermined tissue, organ, or organ used for preparing the test monoclonal antibody. It is preferable to prepare by synthesizing and incorporating this into a cloning vector as double-stranded DNA.
[0017]
As the expression vector for mammalian cultured cells used for preparing the above cDNA library, a plasmid vector capable of efficiently expressing a protein in a eukaryotic cell and capable of transforming a competent cell, or transfection is used. Any phage vector can be used, as long as it is a phage vector, a replication origin that enables replication of the expression vector, a promoter for expression, a splice signal, a polyA addition signal, a drug selection marker, Enhancers and the like can be selected as needed and constructed in combination. Examples of the replication origin that enables the replication of the expression vector include SV40 virus, papilloma virus, and EB virus. Examples of the promoter for expression include β-actin promoter, Thymidine kinase promoter, SV40 promoter, adenovirus major late promoter, cytomegalovirus promoter and the like. Furthermore, a splice signal, a poly-A addition signal, a drug selection marker for improving clone selection efficiency, an enhancer that works cell-specifically, and a transcription control gene for controlling the expression of a transgene are added. Is also good. Specifically, pCAGGS (Gene 108, 193-200, 1991), pcDL-SRα296 (Molecular and Cellular Biology 8, 466-472, 1988), and pEF-BOS (Nucleic Acid 22, 19, 1923) are used as the above plasmid vectors. Among these, cytomegalovirus enhancer, chicken β-actin promoter, rabbit β-globin 3 ′ splice signal, rabbit β-globin 3 ′ flanking region, SV40 Particularly preferred is pCAGGS (see FIG. 11), which has a replication origin and can express the integrated gene in mammalian cells with high efficiency. Further, as the above cultured mammalian cells, a membrane antigen protein derived from a cDNA library obtained by incorporating cDNA into an expression vector for cultured mammalian cells can be expressed in a state where a three-dimensional structure is formed on the cell surface in a transient or stable manner. There is no particular limitation on cultured cells derived from mammals, and examples thereof include COS cells, BHK21 cells, HeLa cells, L cells, NIH3T3 cells, and neuro2a cells. COS cells are preferred in that they can be expressed transiently.
[0018]
As a method for immunostaining with a monoclonal antibody, for example, peroxidase, alkaline phosphatase, a monoclonal antibody labeled with an enzyme such as β-galactosidase is expressed in a state where a three-dimensional structure is formed on the cell surface by an antigen-antibody reaction. After reacting with a membrane protein, a dye is generated by adding a substrate of the enzyme and a color former, and an enzyme immunostaining method for observing the colored dye, or a monoclonal antibody fluorescently labeled with FITC or the like is used as an antigen-antibody antibody. After the reaction with a membrane protein expressed in a state where a three-dimensional structure is formed on the cell surface by the reaction, a fluorescent immunostaining method of observing with a fluorescence microscope can be exemplified.
[0019]
The kit for identifying an antigen molecule of a monoclonal antibody of the present invention includes a cultured mammalian cell such as a COS cell into which a full-length cDNA library constructed by cloning a full-length cDNA into an expression vector for a cultured mammalian cell such as the above-described plasmid vector pCAGGS is introduced. Any monoclonal antibody may be used as long as the antigen of the present invention is identified, and the monoclonal antibody whose antigen molecule is first clarified by the method for identifying an antigen molecule of the monoclonal antibody of the present invention is used as the monoclonal antibody. There is no particular limitation as long as the monoclonal antibody NG1 specifically recognizes Nogo-A, which is an axon repulsive factor in myelin, and the monoclonal antibody H1- specifically recognizes the membrane protein M6a. Specific recognition of 1B4 and reticulon 1 Monoclonal antibody 9-4c1, monoclonal antibody 8-2f6 specifically recognizing progesterone binding protein, monoclonal antibody H2-1A7 specifically recognizing GAP-43, metabolic type A monoclonal antibody lot1 that specifically recognizes a glutamate receptor (mGluR), a monoclonal antibody H2-3F2 that specifically recognizes a membrane protein N-CAM, and a monoclonal antibody that specifically recognizes a c-kit receptor h12c7, a monoclonal antibody 7-1d8 specifically recognizing NEDD binding protein, a monoclonal antibody a-paleo specifically recognizing mNapor, and a monoclonal antibody 8-1g8 specifically recognizing CD59. Ceremony Rukoto can.
[0020]
The monoclonal antibody in which the antigen molecule of the present invention has been identified is characterized in that it binds to the extracellular domain of the antigen molecule. Cells, a hybridoma obtained by fusing the non-human animal and the heterologous myeloma cells are cultured, and the culture supernatant of the hybridoma is a predetermined tissue, organ, part of an organ or a heterogeneous non-human animal. The reaction can be performed on all sections, and can be screened by immunohistochemical methods. The cDNA of the antigen molecule is introduced into cultured mammalian cells, and the antigen molecule is expressed on cultured mammalian cells. By immunostaining the cultured mammalian cells expressed on the surface with the monoclonal antibody screened by the immunohistochemical method described above, Can be produced with good reproducibility monoclonal antibodies that bind to the extracellular domain of the molecule. For example, the mGluR1 cDNA is introduced into cultured mammalian cells, the mGluR1 is expressed on the cultured mammalian cells, and the cultured mammalian cells expressing the mGluR1 are spleen cells of a non-human animal immunized with an olfactory bulb, and the non-human animal. A hybridoma obtained by culturing a hybridoma obtained by fusing a hybridoma with a heterologous myeloma cell, and a monoclonal antibody screened by an immunohistochemical method in which a culture supernatant of the hybridoma is reacted with the non-human animal on a section of a heterologous telencephalon By immunostaining with, a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 can be produced with good reproducibility. The hybridoma producing a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of mGluR1 is not particularly limited, but Rat-Mouse hybridoma lot1 can be preferably exemplified. The Rat-Mouse hybridoma lot 1 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8264.
[0021]
Further, for example, a non-human animal obtained by introducing Nogo-A cDNA into mammalian cultured cells, expressing the Nogo-A on mammalian cultured cells, and immunizing the cultured mammalian cells expressing Nogo-A with olfactory bulb axons. Culturing a hybridoma obtained by fusing the spleen cells of the above with the non-human animal and a heterologous myeloma cell, and reacting the culture supernatant of the hybridoma on a telencephalic section heterologous to the non-human animal. By immunostaining with the monoclonal antibody screened by the histochemical method, a monoclonal antibody that binds to the extracellular domain of Nogo-A can be produced with good reproducibility. The hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the extracellular domain of Nogo-A, which is an axon repulsion factor in myelin, is not particularly limited, but Hamster-Mouse hybridoma NG1 can be preferably exemplified. This Hamster-Mouse hybridoma NG1 has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the deposit number FERM BP-8263.
[0022]
Any diagnostic agent for a disease against the antigen of the present invention or any therapeutic agent for a disease against the antigen may be used as long as the monoclonal antibody whose antigen molecule is first identified by the monoclonal antibody antigen molecule identification method of the present invention is used as an active ingredient. Such specific examples include neurodegenerative diseases, schizophrenia, and epilepsy caused by the antigen mGluR1, neurodegenerative diseases caused by the antigen Nogo-A, and nerve damage.
[0023]
When the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent of the present invention is used as a pharmaceutical, a pharmaceutically acceptable usual carrier, binder, stabilizer, excipient, diluent, pH buffer, disintegrant, solubilization Formulation components for various preparations such as agents, solubilizing agents, and isotonic agents can be added. In the prophylactic / therapeutic method using these prophylactic / therapeutic agents, the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents can be administered orally or parenterally at an appropriate dose according to the sex, weight, and symptoms of the patient. That is, it can be orally administered in a commonly used dosage form, for example, a powder, granule, capsule, syrup, suspension or the like, or, for example, a solution, emulsion, suspension or the like. The preparation can be administered parenterally in the form of an injection, or can be administered intranasally in the form of a spray.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 [Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody NG1]
Example 1A (Experimental materials and methods)
(mouse)
ICR mice were purchased from Japan SLC, Inc. The day at which the vaginal plug was found was considered to be embryonic day 0.5 (E0.5). Adult mice 2-3 months of age were used in this experiment. Also, 8 weeks old Armenian hamsters were purchased from Oriental Yeast Co., Ltd. The method used in this experiment has been approved by the Animal Committee of the National Institute of Genetics.
[0025]
(Preparation of monoclonal antibody)
The olfactory tract (LOT) was mechanically excised from approximately 300 mouse embryos at E14.5, fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffer (PBS), and washed in PBS. After suspension, the mixture was injected into the hind paws of Armenian hamsters as an immunogen. This immunization was repeated four times every three weeks, and three days after the last booster immunization, the inguinal and popliteal lymph nodes were collected and used as mouse myeloma cells (NS1). Fusion was performed using a known method (J. Immunol. 130, 309-312, 1983, J. Neurosci. 18, 7800-7810, 1998, Dev. Biol. 122, 90-100, 1987). Culture supernatants of immunohybridoma cultures derived from mouse telencephalon at embryonic day 14.5 were screened by immunohistochemical methods. For cloning, a hybridoma cell individual is taken out using a glass capillary with a sharp tip, and Dulbecco's modified with 10% fetal bovine serum (manufactured by JRH Bioscience) and 10% hybridoma cloning factor (manufactured by Igen). The cells were plated on a 96-well cell plate (Becton Dickinson) containing Eagle's medium (DMEM) (Sigma).
[0026]
(Immunohistochemistry)
The mouse embryo brain was fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde (PFA) overnight at 4 ° C., immersed in PBS containing 20% sucrose overnight, and frozen in OCT compound (Sakura Finetechnical). . This was divided into sections having a thickness of 14 to 20 μm on a frozen section preparation apparatus (cryostat) and mounted on a glass slide (manufactured by Matsunami Glass Co., Ltd.). The section was diluted 1/10 of the culture supernatant of the monoclonal antibody NG1 hybridoma clone having 1% skim milk / TBST (10 mM Tris-HCL, pH 7.4, 130 mM NaCl, 0.1% Tween 20). After overnight incubation in the solution and washing with TEST, the bound antibodies were visualized using anti-Armenian hamster IgG (Jackson Immunoresearch) to which fluorescence (FITC) was bound. Rabbit anti-oligodendrocytes were stained with a rabbit anti-glutathione-S-transferase π antibody (Medical Biological Laboratories) and a Cy3-conjugated anti-rabbit IgG antibody (Jackson). The whole mount immunostaining method was performed according to a known method (J. Neurobiol. 29, 127-137, 1996, J. Neurosci. 20, 5802-5812, 2000). That is, the telencephalic hemisphere of the E13.5 mouse embryo was cut and incubated for 24-28 hours in a solution obtained by diluting the culture supernatant of the monoclonal antibody NG1 10-fold using 5% skim milk / TBST. To visualize this immune response, the cells were treated with biotinylated anti-Armenian hamster IgG antibody (Jackson) and Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
[0027]
(Isolation culture of olfactory bulb nerve)
According to the method described in Masuda-Nakagawa (Neurosci. Res. 23, 171, 1999) and Mori (Neurosci. Res. 24, 160, 2000), the olfactory bulb of E14.5 is trypsinized and subjected to gentle pipetting. To separate into single cells. The cell density was 1 × 10 4 per well of a 4-well chamber slide (manufactured by Nalge Nunc) coated with polylysine (manufactured by Sigma). 5 Adjusted to be cells. Conditioning was performed using glial cells, and CO was added using a neurobasal medium for neuronal culture supplemented with B-27 component (manufactured by Invitrogen). 2 Such cells were cultured in an incubator for 5 days. The cells obtained were fixed with 4% PFA for 2 hours after the culture was completed, and the cells were subjected to immunostaining using a monoclonal antibody according to the method described above.
[0028]
(Cloning expressing the antigen of monoclonal antibody NG1)
Expression cloning of the monoclonal antibody NG1 antigen was performed as follows. Poly A RNA obtained from the dorsal olfactory bulb of the mouse embryo of E14.5 was reverse transcribed into cDNA using a cDNA library construction kit (Stratagene). By inserting the cDNA into a plasmid vector pCAGGS (provided by Dr. Junichi Miyazaki) which enables efficient expression of the protein in eukaryotic cells and transforms into competent cells, a plasmid of about 100 clones is obtained. Was prepared and transfected into COS-7 cells using a transfection reagent (FuGene 6; manufactured by Roche). Subsequently, the cells were fixed with 4% PFA in PBS for 2 days and immunostained with the monoclonal antibody NG1. The immune response cells were screened using a fluorescence microscope (Axioplan 2; Carl Zeiss). From the pool of about 240 obtained by the screening, a pool producing strong immunopositive cells was identified. The pool was divided into smaller pools and the assay was repeated until a single positive cDNA clone was obtained. The isolated cDNA clone was subcloned, and its sequence was determined using a DNA sequencer (CEQ2000; manufactured by Beckman). In addition, the nucleotide sequence of mouse Nogo-A was registered in the database (accession number: AB073722).
[0029]
Example 1B (Result)
(Preparation of monoclonal antibody NG1)
Hamsters were immunized using olfactory bulb axons machined from the telencephalon of E14.5 mice. Lymphocytes prepared from such hamsters were fused with mouse myeloma cells. Culture supernatants of hybridoma cells were immunohistochemically screened on sections to bind to LOT consisting of olfactory bulb axons (FIGS. 1A, B). From about 2,000 hybridoma cell lines screened, monoclonal antibody NG1 that showed strong binding to LOT was isolated. The immunostaining pattern using the monoclonal antibody NG1 is shown below.
[0030]
(Immunostaining of central olfactory system by monoclonal antibody NG1)
Active extension of olfactory bulb axons has been observed in the telencephalon of E14.5 (J. Neurobiol. 29, 127-137, 1996), but monoclonal antibody NG1 strongly labels growing axons in LOT. (FIG. 1C). These axons were not uniformly stained, and spots that were strongly labeled in some places were observed in spots (FIG. 1D), but the structure corresponding to such spots could not be identified. In deeper areas of the LOT, glandular staining was also observed in the olfactory cortex (FIG. 1C). This may be due to staining of the projections of intrinsic neurons in the olfactory cortex. In the olfactory bulb, many glands passing through the olfactory bulb were stained everywhere (FIG. 1E). Axons extending to LOT were stained as well, but the cell bodies of these elongated neurons were not clearly stained (FIG. 1E).
[0031]
In the whole mount preparation of the telencephalon during embryogenesis, it was observed that the olfactory bulb axons were strongly stained by the monoclonal antibody NG1 (FIG. 1E). Labeled axons form arched protrusions in the olfactory cortex, which have been reported previously (J. Neurosci. 21, 2373-2379, 2001; J. Neurobiol. 29, 127-137, 1996). ) Is similar to the staining with the olfactory bulb axon marker. However, in other parts of the telencephalon, labeling with monoclonal antibody NG1 was weak. This suggests that weak but ubiquitous expression of the antigen was recognized by the monoclonal antibody NG1 in the developing nervous system.
Even after birth, LOT was stained with monoclonal antibody NG1 (FIG. 1G). However, in that case, staining was less extensive at other parts of the telencephalon. The axons had no patches and were more uniformly stained than in the earlier developmental stage.
[0032]
(Immunostaining pattern of other parts of the nervous system)
In general, monoclonal antibody NG1 strongly labeled long growing axons. All major axon pathways, including endogenous, precommissural, corpus callosum, and demarcation streaks, were strongly stained during embryogenesis (FIGS. 2A, B). Areas such as cortical plates, rich in differentiated neurons, were also stained (FIGS. 1C, 2A). Apart from the brain, the olfactory and optic nerves were strongly stained with such monoclonal antibodies (FIGS. 2C, D). Monoclonal antibody NG1 also labeled peripheral nerves and muscle, but not other non-neural tissues (FIG. 2D). This suggests that the specific expression of such an antigen in the nervous system and muscle was recognized by the monoclonal antibody NG1. As development progressed, the sharpness of labeling of axons by monoclonal antibody NG1 decreased. At the time of P7, some axons were still more intensely stained than at baseline level (FIGS. 2E, F), but were unclear due to uneven distribution of weakly stained sites around the periphery.
[0033]
(Labeling of growth cone with monoclonal antibody NG1)
Because monoclonal antibody NG1 strongly labels growing axons in the developing nervous system, the cellular localization of the antigen recognized by monoclonal antibody NG1 in neurites that are actively growing in culture was examined. Monoclonal antibody NG1 preferentially labeled the distal part of neurites of olfactory bulb neurons (FIG. 3). The growth cone at the distal tip was particularly strongly labeled. Vesicle staining was sometimes clearly observed in cell bodies and neurites. When surviving neurons were incubated with the monoclonal antibody without fixation, no cell surface label was detected. This suggests that an epitope for the monoclonal antibody NG1 is present in the cytoplasm of these neurons.
[0034]
(Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody NG1)
To identify the antigen recognized by monoclonal antibody NG1, a cDNA library was expressed in COS7 cells, and clones producing a product immunoreactive with monoclonal antibody NG1 were screened. After analyzing approximately 24,000 cDNA clones, it was found that clone # 4-1D9 produced a substance with strong immunopositivity (FIG. 4B). The nucleotide sequence of the insert revealed one open reading frame encoding a mouse homolog of Nogo. The isolated cDNA clone, # 4-1D9, partially encodes Nogo-A and covers the 3 'half of the complete sequence (Figure 4A). When such clones were expressed in COS-7, translation was presumed to begin at an internal methionine on the estimated 593th residue from the N-terminus and continue to the end of the C-terminus (# 4-1D9 in FIG. ). The common C-terminal domain of Nogo contains two hydrophobic domains, which are thought to function as transmembrane domains in the ER (J. Cell. Sci. 107, 2403-2416, 1994). The immunoreactive product produced by the # 4-1D9 clone was actually distributed in a race-like network that spreads into COS-7 cells (FIG. 4B). This shows a typical distribution of ER.
[0035]
To determine whether monoclonal antibody NG1 recognizes all forms of Nogo or only Nogo-A, the common C-terminal domain was excised from the cDNA clone (# 4-1D9ΔC in FIG. 4A). Again, monoclonal antibody NG1 recognized the excised protein, but its distribution was spread throughout the cytoplasm due to the loss of a conserved signal in the ER on the C-terminus (FIG. 4C). The results showed that monoclonal antibody NG1 specifically bound to Nogo-A, but did not bind to other forms of Nogo. The Nogo-A-specific domain recognized by monoclonal antibody NG1 has no homology with other members of the reticulon family. Therefore, it is unlikely that the monoclonal antibody NG1 binds to other reticulon proteins. In fact, the present inventors have confirmed that the monoclonal antibody NG1 does not bind to reticulon 1A expressed in COS-7 cells.
[0036]
(Labeling of oligodendrocytes in the adult nervous system with monoclonal antibody NG1)
To determine whether monoclonal antibody NG1 recognizes Nogo-A in sections, adult central nervous system sections were immunostained with monoclonal antibody NG1. Axons of the adult nervous system were hardly stained by the monoclonal antibody NG1. Instead, cell bodies scattered throughout the brain were observed to be strongly stained (FIGS. 5A, B). The morphology and distribution of monoclonal antibody NG1-positive cells indicated that they were oligodendrocytes. This was confirmed by double immunostaining of such sections with glutathione-S-transferase (GST) π (EMBO J. 19, 341-348, 2000), a marker for oligodendrocytes (FIGS. 5C, D). ).
[0037]
There have been several reports on the distribution of Nogo-A protein in the adult spinal cord (Nature 403, 434-438, 2000, J. Neurocytol. 23, 209-217, 1994). In accordance therewith, adult spinal cord sections were stained with the monoclonal antibody NG1. With such a monoclonal antibody, oligodendrocytes and their projections distributed throughout the white matter of the spinal cord were strongly stained (FIG. 5E). This staining pattern was identical to the reported immunostaining using a polyclonal antibody against Nogo-A (Nature 403, 434-438, 2000). However, when compared with the staining using the monoclonal antibody IN-1 which is originally an antibody against Nogo-A (J. Neurocytol. 23, 209-217, 1994), the staining with the monoclonal antibody NG1 revealed Appeared more clearly, and the antibody itself hardly bound to myelinated axons. The reason for this different staining pattern is currently unknown.
[0038]
In this example, we generated a monoclonal antibody, NG1, that strongly binds to growing axons in the developing nervous system and demonstrates that this monoclonal antibody specifically binds to Nogo-A protein. Was. The staining pattern when the adult nervous system was stained with this monoclonal antibody was consistent with the reported Nogo-A expression (Nature 403, 434-438, 2000, Nature 403, 439-444, 2000). ). Considering the recent report that Developing neurons show strong expression of Nogo mRNA (Exp. Neurol. 169, 319-328, 2001), the monoclonal antibody NG1 is capable of producing Nogo-A in the developing nervous system. You can conclude that you recognize According to the present invention, since monoclonal antibody NG1 recognizes Nogo-A in the developing nervous system, Nogo, which is an inhibitor of axonal growth, is strongly expressed in actively growing axons. A new and unexpected finding was obtained.
[0039]
Example 2 [Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody lot1]
Example 2A (Experimental materials and methods)
(animal)
ICR strain mice and Wistar strain rats were purchased from Chubu Scientific Materials (Nagoya, Japan). The day when the vaginal plug was detected was defined as E0.5. Embryos of female parents were dissociated in HBSS under deep ether anesthesia. Next, the developmental stage of all embryos was determined according to Theiler (1989) definition (THE HOUSE MOUSE: ATLAS OF EMBRYONIC DEVELOPMENT, springer, 1989). The anti-mGluR1 antibody used was rabbit poly-mGluR1α purchased from Funakoshi, and an anti-mGluR1 antibody provided by Dr. Ryuichi Shigemoto of the National Institute for Physiological Sciences.
[0040]
(Preparation of monoclonal antibody)
Approximately 30 olfactory bulbs from mouse embryos at E14.5 were suspended in 0.1 ml HBSS, triturated with a 27 gauge needle and injected into the left hind paw of rats. Rats were immunized four times every three weeks. Three days after the final immunization with the booster antigen, the left inguinal lymph was obtained using a known method (SELECTED METHPODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY 351-372, Freeman, 1981, Dev Biol 122, 90-100, 1996). Nodal and left popliteal lymph nodes were fused with myeloma cells (P3X63Ag8U1). Supernatants of hybridoma cultures were screened on sections of E14.5 mouse telencephalon using immunohistochemical methods. Cells were collected one by one using a glass capillary having a sharp tip, and DMEM (10% bovine serum (JRH Bioscience, Lenexa, KS) and 10% hybridoma cell / cloning factor (Igen)) were added. The cells were transferred to each well of a 96-well culture plate (Becton Dickinson) supplemented with Nissui, Tokyo, Japan and cloned.
[0041]
(Immunohistochemistry)
The mouse embryo brain was fixed overnight in PBS containing 4% paraformaldehyde (PFA) at 4 ° C., immersed in PBS containing 20% sucrose overnight, and treated with OCT compound (Tissue-Tek, manufactured by Sakura Finetechnical). Frozen. Coronal sections were cut to a thickness of 14 μm with a cryostat and placed on glass slides (Sigma) coated with poly-L-lysine. The section was incubated for 10 minutes in the presence of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 130 mM NaCl, and 0.1% Tween 20 (TBST) to remove the OCT compound, and then further coexisted with the hybridoma culture supernatant. The cells were cultured for 1 hour under the following conditions. The bound antibody was visualized using an anti-rat Ig antibody labeled with Cy3 (1: 500, manufactured by Amersham).
Whole mount immunostaining was performed according to the method described in the literature (J Neurobiol 29, 127-137, 1996). Briefly, telencephalons and cultures were fixed in PBS containing 4% PFA at 4 ° C. for 12 hours and incubated in TBST containing 5% skim milk for 1 hour to inhibit nonspecific binding of antibodies. The sample was incubated in the presence of a monoclonal antibody lot1 (10 μg / ml), which was affinity-purified by passing through a protein A column (Affigel Protein A MAPs kit, manufactured by Bio-Rad). The bound antibody was visualized using an anti-rat Ig antibody (1: 500, Amersham) labeled with Cy3 or Cy2.
[0042]
The following antibodies were also used for the immunostaining treatment. Rabbit anti-neuropilin-1 antibody (2 μg / ml), mouse anti-MAP2 antibody (1: 500, manufactured by Sigma), mouse anti-reelin monoclonal antibody CR-50 (2 μg / ml; Neuron 14, 899-912, 1995, J. Neurosci 17, 23-31, 1997), mouse anti-neurofilament monoclonal antibody 2H3 (1: 100 hybridoma supernatant, Developmental Studies Hybrid Bank), rabbit anti-calretinin antibody (1: 100, manufactured by Chemicon International), rabbit anti-nestin (1: 500, provided by Dr. Yoshikawa, Osaka University). As the secondary antibody, a FITC-labeled anti-mouse Ig antibody (1: 100, manufactured by Amersham) or a FITC-labeled anti-rabbit Ig antibody (1: 100, manufactured by Amersham) was used.
[0043]
(Whole embryo culture method)
Organotypic culture was performed using a known method (J Neurobiol 29, 127-137). Specifically, the telencephalic hemisphere obtained from the E12.5 mouse was divided into sections, the buffy coat was removed, and the ventricle side was placed on a membrane filter (Transwall-COL 3418, manufactured by Costar) whose surface was covered with collagen. Was laid down. The olfactory bulb was separated from the E13.5 telencephalon, and co-cultured with the LOT site of the E12.5 telencephalic piece. In DMEM / Ham's F12 medium (mixing ratio 1: 1, manufactured by Nissui) containing 10% bovine serum, CO 2 Explants were cultured at 37 ° C. for 2 to 3 days under an atmosphere of 5% concentration. (Hirata and Fujisawa, 1997), and the olfactory bulb was cultured (J Neurobiol 32, 415-425, 1997).
[0044]
Example 2B (Result)
(Preparation of monoclonal antibody lot1)
Lymphocytes obtained from three immunized mice were fused with mouse myeloma cells to obtain a hybridoma cell line. Sections of the E14.5 mouse telencephalon were immunostained and a culture supernatant containing about 2000 hybridoma cell lines was screened. In addition, a monoclonal antibody lot1 that specifically stains a subset of cells around the LOT was isolated. Similar staining patterns were not seen in other hybridoma cell lines. The immunostaining pattern using the monoclonal antibody lot1 is shown below.
[0045]
(Origin of signpost cells)
Axons of nerve cells of the olfactory bulb selectively elongate specific regions of the telencephalon (FIG. 6A, J. Comp. Neurol. 223, 177-202 1984, J. Neurobiol. 29, 127-137 1996). The signpost of this axon is a nerve cell recognized by the monoclonal antibody lot1 (J. Neurosci. 18, 7800-7810, 1998). The guidepost cells align with and guide axons to future axon outgrowth pathways prior to axon outgrowth. As a result of whole mount immunostaining of the telencephalon of E12.5 with the monoclonal antibody lot1, the axon of the olfactory bulb extended over the band created by the signpost cells stained red with the monoclonal antibody lot1, which is a marker for the signpost cells ( (FIG. 6B). Therefore, in order to search for the origin of the signpost cells, the cells were dissociated from the telencephalic neocortex of E10.5 where the signpost cells were dividing, cultured in the presence of the thymidine analog BrdU for 5 days, and the monoclonal antibody lot1 Immunostaining showed that cells stained with the monoclonal antibody lot1 differentiated only when a region called telencephalic neocortex was cultured (FIG. 7A). Furthermore, it was found that even if neural stem cells in the telencephalic neocortical region were isolated one by one and cloned and propagated, guidepost cells were differentiated from them at a certain probability (FIG. 7B). Therefore, the ability to generate guidepost cells was thought to be autonomous in the stem cells of the telencephalic neocortex. Even if the stromal primordium stem cells adjacent to the neocortex were clone-cultured in the same manner, cells stained with the monoclonal antibody lot1 never appeared.
[0046]
(Migration of signpost cells)
The telencephalic neocortex is a much larger area located farther back than the axon pathway in which future guidepost cells line up, but no matter where the guidepost cells are differentiated in the same way. (FIG. 7B). If, in real life, the signpost cells are generated from the entire neocortex, these cells will travel a significant distance ventrally through the telencephalic hemisphere to align with future axonal pathways. Must. However, cell migration in such a direction has not been reported before. Therefore, the actual state of cell migration in the telencephalon at this time was analyzed using a whole embryo culture method in which the entire mouse embryo was cultured outside the uterus. Neural stem cells of the telencephalic neocortex of the E10.5 embryo were labeled with a fluorescent dye, and the embryo was cultured for 2 days in whole embryo. As a result, it was confirmed that the cells born in the telencephalic neocortex certainly migrated selectively in the ventral direction and lined up with future axon pathways (FIG. 8A). It was also shown that at least a part of the cells thus migrated differentiated into monoclonal antibody lot1-positive signpost cells (FIGS. 8B and 8C). Taken together, the results suggest that signpost cells develop throughout the telencephalic neocortex, move ventrally, and follow an interesting developmental process of lining up with future axonal pathways.
[0047]
(Abnormal distribution of signpost cells in Xt mutant mice)
To gain insight into the molecular mechanism of signpost cell development, we obtained various mutant mice with abnormalities in telencephalic development and observed the behavior of signpost cells in these mouse brains. As a result, in a mutant mouse called Extra-toes (Xt), it was found that signpost cells were scattered throughout the telencephalic neocortex. That is, in wild-type mouse (+ / +) embryos, the signpost cells develop from a large area of the telencephalic neocortex, migrate ventrally, and sequence into future axonal pathways, while the Xt mutant mouse In (Xt / Xt), telencephalic cells do not move and guidepost cells are scattered throughout the neocortex (FIG. 9). No cell migration in the ventral direction was observed in the telencephalon of this mutant mouse, suggesting that this abnormal cell migration was directly responsible for the abnormal distribution of signpost cells. It has been clarified that the causative gene of the Xt mutation is a transcriptional regulator Gli3 (Development 116, 799-804, 1992, Nature Genet. 3, 241-245, 1993). It is said that the dorsoventral axis is disturbed (Development 125, 2315-2325, 1998, Development 126, 3561-3571, 1999).
[0048]
(Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody lot1)
MRNA was prepared from a nascent telencephalic region that abundantly expresses the antigenic substance of the monoclonal antibody lot1, a full-length cDNA was synthesized, and this was incorporated into a mammalian expression vector pCAGGS to prepare a library. This cDNA library was introduced into COS cells, and the encoded protein was forcibly expressed. The COS cells into which the cDNA library was introduced were immunostained using the monoclonal antibody lot1, and cells to be stained were searched under a microscope. About 200,000 cDNA clones were searched. Was able to be isolated. Determination of the nucleotide sequence of this clone revealed that it encodes metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1). The cDNA clone # 6-2E10 was introduced, and COS cells expressing the mGluR1 protein were immunostained with the monoclonal antibody lot1 and two kinds of anti-mGluR1 antibodies. Immunostaining was observed with the monoclonal antibody lot1 (FIG. 10A) and the anti-mGluR1 antibody (FIG. 10B) provided by Dr. Shigemoto, but no immunostaining was observed with the commercially available anti-mGluR1 antibody. In addition, COS cells expressing the mGluR1 mutant protein in which the intracellular domain was deleted were immunostained with the monoclonal antibody lot1 and two kinds of anti-mGluR1 antibodies. Immunostaining was observed with the monoclonal antibody lot1 (FIG. 10C) and the anti-mGluR1 antibody (FIG. 10D) provided by Dr. Shigemoto, but no immunostaining was observed with the commercially available anti-mGluR1 antibody. These results indicated that the monoclonal antibody lot1 binds to the extracellular domain of mGluR1. It was also considered that a commercially available anti-mGluR1 antibody recognizes a part of the intracellular domain of mGluR1. Further, in order to confirm whether this mGluR1 is really an antigen molecule of the monoclonal antibody, mGluRI gene-deficient mice (Cell 79, 365-375, 1994, Nature 372, 237-243, 1994) were obtained and the monoclonal antibody lot1 was obtained. For immunostaining. As a result, it was shown that the stainability was completely deleted in the brain of the homo-deficient mouse embryo. As a result, it was shown that the staining of the brain of the homo-deficient mouse embryo was completely deleted.
[0049]
Example 3 [Identification of antigen molecule recognized by monoclonal antibody 9-4c]
(Preparation of monoclonal antibody 9-4c)
To investigate the development of olfactory cortex in mouse embryos, a novel monoclonal antibody 9-4c was generated. In the same manner as in Example 1, a hybridoma clone was produced by fusing rat lymphocytes immunized with the mouse olfactory cortex with mouse myeloma cells. Approximately 5000 hybridomas were selected by immunohistochemical screening on coronal sections of mouse telencephalon at embryonic day 14.5 to produce monoclonal antibody 9-4c.
[0050]
(Identification of antigen recognized by monoclonal antibody 9-4c)
To identify the antigen recognized by monoclonal antibody 9-4c, a cDNA library was expressed in COS-7 cells, and a clone producing an antigen immunoreactive with monoclonal antibody 9-4c was selected. Polyadenylation RNA obtained from the dorsal axis olfactory bulb of a mouse embryo at an embryonic day of 14.5 days was reverse transcribed into cDNA using a cDNA library construction kit (Stratagene). A plasmid pool of about 100 clones was prepared by inserting the cDNA into a plasmid vector pCAGGS which enables efficient expression of the protein in eukaryotic cells and transforms into competent cells. (FuGene 6; manufactured by Roche) was used to transfect into COS-7 cells. Subsequently, the cells were fixed with 4% PFA in PBS for 2 days and immunostained with monoclonal antibody 9-4c. The immune response cells were screened using a fluorescence microscope (Axioplan 2; Carl Zeiss). From the pool of about 20,000 obtained by the screening, a pool producing strong immunopositive cells was identified. The pool was divided into smaller pools and the assay was repeated until a single positive cDNA clone was obtained. The isolated cDNA clone # 4-8E9 was subcloned and sequenced using a DNA sequencer (CEQ2000; manufactured by Beckman) to identify that the antigen recognized by the monoclonal antibody 9-4c was Rtn1. The nucleotide sequence of this mouse Rtn1-A was registered in a database.
[0051]
Rtn1, well-known as a neuroendocrine specific protein (NSP), is a transmembrane ER protein (FIG. 2A). Although the function of Rtn1 has not yet been elucidated, Rtn1 is expressed in neurons and neuroendocrine (Wieczorek and Hughes, 1991, van de Velde, 1994b) and three different splicing isoforms, Rtn1-A, Rtn1 It is also known that -B and Rtn1-C are present (Roebroek, 1996). These three isoforms have a common C-terminal domain and a mutated N-terminal sequence. Rtn1-A is the longest isoform and is composed of 760 amino acids including all 360 amino acids of Rtn1-B. In addition, Rtn1-C contains an N-terminal having a short amino acid extension in addition to a common C-terminal domain. The isolated cDNA clone # 4-8E9 contained the entire amino acid sequence of Rtn1-B including the starting methionine, but lacked the nucleotide sequence of the 5 'untranslated region for Rtn1-B (FIG. 2A). ). From this, it has already been reported that such clones can express either Rtn1-A or Rtn1-B mRNA, but that Rtn1-B is expressed only in cancer cells and not in normal tissues. (Roebroek, 1993), it is considered to be derived from Rtn1A mRNA. In any case, it is thought that when clone # 4-8E9 is expressed in COS-7 cells, Rtn-1B protein is produced.
[0052]
The C-terminal domain common to Rtn1 contains two extensions separating a hydrophobic amino acid by a hydrophilic portion (FIG. 2A). This suggests that such domains function as signals retained in the ER. Indeed, when clone # 4-8E9 was expressed in COS-7 cells, monoclonal antibody 9-4c labeled a race-like network extension in such cells, a typical distribution of ER (FIG. 2B). . Although the common C-terminal domain was excised, the monoclonal antibody 9-4c still recognized the truncated form, but its distribution was scattered between the cytoplasms (FIG. 2C), and the monoclonal antibody 9-4c showed Rtn1A And B, but not Rtn1C. In addition, the monoclonal antibody 9-4c reacts with the telencephalon, immunoreacts with the ventricular zone of LGE and MGE, the anterior optic segment and the diaphragm, and reacts with VP, which is a ventricular region.
[0053]
【The invention's effect】
According to the present invention, an antigen recognized by a monoclonal antibody can be efficiently identified in a short time, and not only is it useful for the preparation and application of a systematic and comprehensive monoclonal antibody, but also for an antibody whose antigen can be determined, Depending on the function and properties of the antigen, various applications, for example, diagnostic markers for diseases, regenerative medicine, disease treatment, etc. can be expected.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a state of immunostaining of a central olfactory system by a monoclonal antibody NG1.
(A, B): Schematic representation of the lateral (A) and coronal (B) surfaces of the telencephalon. The left part of (A) is the rostral side, and the left part of (B) is the side. In both (A) and (B), the upper part is the back surface. Olfactory bulb (OB) axons extend caudally inside the telencephalon, forming the lateral olfactory cord (LOT) on the telencephalic surface.
(C): Coronal section of telencephalon of E14.5 stained with monoclonal antibody NG1. Note that LOT (arrow) is strongly stained. The olfactory cortex (arrowhead) and cortical plate have also been stained with such monoclonal antibodies.
(D): LOT at high magnification. Axons are not uniformly stained, with strongly labeled sites being spotted.
(E): E14.5 olfactory bulb with a large amount of fibers stained with the monoclonal antibody.
(F): Total immunostaining of the telencephalon of E13.5 with monoclonal antibody NG1. As with other telencephalic sites, staining is also observed in the olfactory bulb axons forming the LOT (arrow).
(G): Telencephalon of P0 stained with monoclonal antibody NG1. LOT (arrow) is also more intensely stained than other sites.
Scale bars represent 50 μm (AD and F), 500 μm (E).
FIG. 2 is a diagram showing a state of immunostaining of other parts of the nervous system by the monoclonal antibody NG1.
(A): E14.5 coronal section of forebrain stained with monoclonal antibody NG1. Note that the axons are strongly stained in the internal capsule (arrow) and the medulla (arrowhead).
(B): Section on posterior level of E14.5 forebrain. The bundle of axons in the demarcation line (arrow) is strongly labeled.
(C): Strong staining of the olfactory nerve (arrowhead) extending from the olfactory epithelium of E14.5.
(D): Strongly labeled optic nerve of the E14.5 eye (arrow). The eye muscle (arrowhead) is also stained with the monoclonal antibody.
(E): The precommissory (arrow) of P7 is also strongly stained by the monoclonal antibody.
(F): The corpus callosum (arrow) at P7 is stained at a slightly stronger level than at the surrounding site.
Scale bar represents 50 μm.
FIG. 3 is a diagram showing immunostaining of cultured olfactory bulb neurons by monoclonal antibody NG1.
The olfactory bulb neurons at E14.5 were dissociated and cultured for 5 days. Neurite growth cones (arrows) are strongly labeled by monoclonal antibody NG1. Scale bar represents 50 μm.
FIG. 4 is a diagram showing recognition of Nogo-A protein by monoclonal antibody NG1.
(A): Protein structures of the three isoforms of Nogo. Nogo-A contains the entire amino acid sequence of Nogo-B. Nogo-C has a unique sequence on the N-terminus (striped box). Gray boxes in the C-terminal region common to all three isoforms indicate hydrophobic amino acid sequences that function as transmembrane domains in the ER. The structure of the isolated cDNA clone, # 4-1D9, is shown below these three Nogo isoforms. Translation is said to start at the dotted line on the left side, that is, at a position substantially at the center of Nogo-A. In the bottom <RTIgt; cDNA </ RTI> construct # 4-1D9AC, the common C-terminal domain is deleted at the dotted line on the right, leaving behind a Nogo-A specific 316 amino acid truncated protein.
(B): COS cells transfected with # 4-1D9 clone and immunostained with monoclonal antibody NG1. The lace-like network characteristic of ER is stained.
(C): COS cells transfected with # 4-1D9ΔC and immunostained with monoclonal antibody NG1. The cytoplasm is widely stained.
Scale bar represents 50 μm.
FIG. 5 is a diagram showing immunostaining of the adult nervous system with the monoclonal antibody NG1.
(A, B): Section of adult telencephalon near the corpus callosum. Monoclonal antibody NG1 stains cell bodies scattered throughout the telencephalon. The section (B) is obtained by increasing the magnification of (A).
(C, D): Same picture of (A, B) in which oligodendrocytes were visualized by staining with an anti-GST antibody. The same cells (arrowheads) are labeled in (B) and (D).
(E): Adult spinal cord section stained with monoclonal antibody NG1. Note that oligodendrocytes and their projections in white matter are strongly stained. The staining of some neurons in gray matter is due to non-specific binding of secondary antibodies.
Scale bar represents 50 μm.
FIG. 6 is a diagram showing a state of olfactory bulb axons and guidepost cells.
(A): lateral view of the mouse telencephalon around day 12 of embryo. The left side is rostral and the upper side is dorsal. The axon of the olfactory bulb (green) extends above the band created by the signpost cells (red).
(B): Telencephalon on day 12.5 of embryo. Axons that initially extend from the olfactory bulb were labeled with a green dye (arrow). The signpost cells are stained red with the monoclonal antibody lot1.
Scale bar represents 100 μm.
FIG. 7 is a diagram showing the appearance of signpost cells in culture.
(A): Cells were dissociated from the telencephalic neocortex at day 10.5 of embryonic division of the guidepost cells and cultured for 5 days in the presence of the thymidine analog BrdU. The signpost cells stained with the monoclonal antibody lot1 are differentiated (red). Among them, more than half of the cells incorporated BrdU (green) into their nuclei, indicating that they had divided in culture (arrowheads).
(B): telencephalic region that produces signpost cells in culture. The numbers indicate the probability (%) of differentiation of monoclonal antibody lot1 positive signpost cells when the region was cultured. Red letters indicate telencephalic neocortex area, and black letters indicate striatum primordium area. The red shaded lines indicate the location of the expected future olfactory bulb axon pathway.
FIG. 8 is a diagram showing a manner in which guidepost cells move in a ventral direction from the telencephalic neocortex.
(A): Neural stem cells of the telencephalic neocortex of a 10.5 day embryo embryo were labeled with a fluorescent dye (star), and the embryo was cultured for 2 days in whole embryo. Dye-labeled cells migrate in the ventral direction (arrows) and are arranged in a future axonal pathway in an inverted T-shape (arrowheads).
(B): Labeled cells (arrowheads) that migrated from the telencephalic neocortex and lined up in the axon region. Long protrusions extend in the direction of future axonal pathways.
(C): Photograph of the specimen of (B) immunostained with monoclonal antibody lot1. The labeled cells intermingle with the signpost cells to form a band of cells.
The scale bar represents (A) 500 μm and (B) and (C) 100 μm.
FIG. 9 is a diagram showing the appearance and migration of signpost cells in wild-type and Xt mutant mice.
FIG. 10 is a view showing a state in which monoclonal antibody lot1 recognizes mGluR1.
(A) and (B): COS cells into which cDNA clone # 6-2E10 has been introduced. Double immunostained image with monoclonal antibody lot1 (A) and anti-mGluR1 antibody (B).
(C) and (D): COS cells expressing mGluR1 mutant protein in which the intracellular domain has been deleted. Both monoclonal antibody lot1 (C) and anti-mGluR1 antibody (D) show similar staining.
FIG. 11 shows the expression vector pCAGGS.
