【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）とアポリポタンパク（ａ）との非共有結合により形成されるリポタンパク（ａ）（Ｌｐ（ａ））の発現、（Ｌｐ（ａ））が血管（平滑筋細胞）の硬化へ関与していること、（Ｌｐ（ａ））が石灰化形成を促進する機能を持つ因子であること、（Ｌｐ（ａ））により動脈硬化複合病変をはじめとする血管石灰化が誘導されること、及び、ＬＤＬ受容体以外のＬｐ（ａ）受容体が存在すること等の発見、並びに、血管石灰化は骨形成に関与することが知られている因子群の発現調節と同様の基盤のうえに成り立つ疾患であることの発見に基づくものである。
【０００２】
【従来の技術】
１９６３年、Ｂｅｒｇ（１）がリポタンパク（ａ）［Ｌｐ（ａ）］を発見して以来、多くの臨床的、疫学的、遺伝的研究によって、Ｌｐ（ａ）の血漿濃度が高いと冠動脈心疾患、卒中、再狭窄などヒトの心血管疾患をきたすことがわかっているが（２−４）、これに対していくつかの研究ではそのような関連を立証することができなかった（５，６）。アテローム硬化症の病因におけるＬｐ（ａ）の関与は、まずヒトのアテローム性病変にＬｐ（ａ）が存在することによって示唆され（７，８）、その後の多くの研究からもアテローム性プラークでのＬｐ（ａ）沈着は不安定な冠動脈症候群の重症度に相関することが指摘されている（９）。それにもかかわらず、Ｌｐ（ａ）がアテローム性血管疾患のリスクを上昇させる機序はほとんど未解明である。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験でＬｐ（ａ）の機能的役割を解明する上での大きな問題点は、適切な実験動物がいないことに帰する。つまり、Ｌｐ（ａ）はサルとヒトにのみに存在することが知られており、霊長類以外ではハリネズミが唯一Ｌｐ（ａ）様タンパクを産生する動物である（１０）。トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを用いた４つの報告では、アポリポタンパク（ａ）［ａｐｏ（ａ）］Ｔｇマウスに高脂肪食を与えると、ａｐｏ（ａ）が大動脈脂肪斑の形成を促進する可能性を示唆している（１１−１４）。ただし、異なる２つの研究ではａｐｏ（ａ）のみまたはヒトａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢのいずれかを発現するＴｇマウスでａｐｏ（ａ）のアテローム形成を促進する効果は確認されなかった（１５，１６）。
【０００４】
当実験室（１７）では、ヒトａｐｏ（ａ）を発現するＴｇウサギを作製し、ヒトａｐｏ（ａ）がウサギＬＤＬと結合することによりＬｐ（ａ）を形成することを明らかにした。これはヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇマウスとは対照的で、ヒトａｐｏ（ａ）はマウスＬＤＬに結合しないためにこのマウス血漿中にはＬｐ（ａ）は存在しない（１９）。我々は最近、高コレステロール食を与えたＴｇウサギで、Ｌｐ（ａ）によって大動脈および冠動脈硬化病変の形成が促進することを報告した（２０，２１）。ＴｇウサギまたはＴｇマウスを対象とするこのような実験では、ａｐｏＢと結合する（Ｔｇウサギの場合）結合しない（Ｔｇマウスの場合）に関係なく、高コレステロール食の場合にａｐｏ（ａ）が動脈硬化病変の形成を促進する因子であることが明らかになったが、このような研究ではＬｐ（ａ）が動脈硬化複合病変を悪化させる因子になり得るかどうかという問いに答えられなかった。コレステロールを与えた動物で形成される病変は主に脂肪斑で、初期病変として定義されるが、これに対してヒトの動脈硬化複合病変はさらに進行しており、破裂および石灰化に関与していることが多いため、このようなモデルで回答を得るのは困難な問題である（２２）。虚血性発作および冠動脈心疾患のリスクを高め、多くの臨床徴候をもたらすのはこのような動脈硬化複合病変なのである。もうひとつの問題点は、コレステロールを与えた動物では、肝および腸に由来するレムナントリポタンパク（いわゆるβ−ＶＬＤＬ）が多く存在しているために、ヒトのように高ＬＤＬ値が原因で起こる動脈硬化症の成因と異なる可能性も否定できないということにある（２３）。
【０００５】
以下の非特許文献の番号は、本明細書中で括弧内で示された番号と一致するものである。
【非特許文献１】
Ｂｅｒｇ， Ｋ． （１９６３） Ａｃｔａ Ｐａｔｈｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ Ｓｃａｎｄ ５９， ３６９−３８２
【非特許文献２】
Ｍａｈｅｒ， Ｖ． Ｍ．， ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ， Ｂ． Ｇ． （１９９５） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄ ６， ２２９−２３５
【非特許文献３】
Ｄｊｕｒｏｖｉｃ， Ｓ．， ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｋ．（１９９７） Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ５２， ２８１−２９２
【非特許文献４】
Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ． Ｍ．， ａｎｄ Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ， Ｍ． Ｌ． （１９９８） Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ８２， ５７Ｕ−６６Ｕ；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ８６Ｕ．
【非特許文献５】
Ｒｉｄｋｅｒ， Ｐ．Ｍ．， Ｈｅｎｎｅｋｅｎｓ， Ｃ． Ｈ．， ａｎｄ Ｓｔａｍｐｆｅｒ， Ｍ． Ｊ． （１９９３） ＪＡＭＡ ２７０，２１９５−２１９９
【非特許文献６】
Ｇｕｒｅｗｉｃｈ， Ｖ．， ａｎｄ Ｍｉｔｔｌｅｍａｎ， Ｍ． （１９９４）．ＪＡＭＡ ２７１， １０２５−１０２６
【非特許文献７】
Ｒａｔｈ， Ｍ．， Ｎｉｅｎｄｏｒｆ， Ａ．， Ｒｅｂｌｉｎ， Ｔ．， Ｄｉｅｔｅｌ， Ｍ．， Ｋｒｅｂｂｅｒ， Ｈ． Ｊ．， ａｎｄ Ｂｅｉｓｉｅｇｅｌ， Ｕ．（１９８９）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ９， ５７９−５９２
【非特許文献８】
Ｊｕｒｇｅｎｓ， Ｇ．， Ｃｈｅｎ， Ｑ．， Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ， Ｈ．， Ｍａｉｒ， Ｓ．， Ｌｅｄｉｎｓｋｉ， Ｇ．， ａｎｄ Ｄｉｎｇｅｓ，． Ｈ． Ｐ．（１９９３） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ Ｔｈｒｏｍｂ １３， １６８９−１６９９
【非特許文献９】
Ｄａｎｇａｓ， Ｇ．， Ｍｅｈｒａｎ， Ｒ．， Ｈａｒｐｅｌ， Ｐ． Ｃ．， Ｓｈａｒｍａ， Ｓ． Ｋ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ． Ｍ．， Ｄｕｂｅ，Ｇ．， Ａｍｂｒｏｓｅ， Ｊ． Ａ．， ａｎｄ Ｆａｌｌｏｎ， Ｊ． Ｔ． （Ｉ９９８）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ３２， ２０３５−２０４２．
【非特許文献１０】
Ｌａｐｌａｕｄ， Ｐ．Ｍ．， Ｂｅａｕｂａｔｉｅ， Ｌ．， Ｒａｌｌ， Ｓ．Ｃ．， Ｊｒ．， Ｌｕｃ， Ｇ．， ａｎｄ Ｓａｂｏｕｒｅａｕ， Ｍ．
（１９８８） Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２９， １１５７−１１７０
【非特許文献１１】
Ｌａｗｎ， Ｒ． Ｍ．， Ｗａｄｅ， Ｄ． Ｐ．， Ｈａｍｍｅｒ， Ｒ． Ｅ．， Ｃｈｉｅｓａ， Ｇ．， Ｖｅｒｓｔｕｙｆｔ， Ｊ． Ｇ．， ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ，． Ｅ． Ｍ． （１９９２） Ｎａｔｕｒｅ ３６０， ６７０−６７２
【非特許文献１２】
Ｌｉｕ， Ａ． Ｃ．， Ｌａｗｎ， Ｒ． Ｍ．， Ｖｅｒｓｔｕｙｆｔ， Ｊ． Ｇ．， ａｎｄ Ｒｕｂｉｎ， Ｅ．Ｍ．（１９９４）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ３５， ２２６３−２２６７
【非特許文献１３】
Ｌａｗｎ， Ｒ． Ｍ．， Ｐｅａｒｌｅ， Ａ．Ｄ．， Ｋｕｎｚ， Ｌ． Ｌ， Ｒｕｂｉｎ， Ｅ， Ｍ．， Ｒｅｃｋｌｅｓｓ， Ｊ．， Ｍｅｔｃａｌｆｅ， Ｊ．Ｃ．， ａｎｄ Ｇｒａｉｎｇｅｒ， Ｄ． Ｊ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， ３１３６７−３１３７１
【非特許文献１４】
Ｂｏｏｎｍａｒｋ， Ｎ． Ｗ．， Ｌｏｕ， Ｘ． Ｊ．， Ｙａｎｇ， Ｚ． Ｊ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｋ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ． Ｌ．， Ｒｕｂｉｎ， Ｅ．Ｍ．， ａｎｄ Ｌａｗｎ， Ｒ． Ｍ． （１９９７） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００， ５５８−５６４
【非特許文献１５】
Ｍａｎｃｉｎｉ， Ｆ． Ｐ．， Ｎｅｗｌａｎｄ， Ｄ． Ｌ．， Ｍｏｏｓｅｒ， Ｖ．，Ｍｕｍｔａ， Ｊ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ．， Ｙｏｕｎｇ， Ｓ Ｇ．， Ｈａｍｍｅｒ， Ｒ． Ｅ．， Ｓａｎａｎ， Ｄ． Ａ．，． ａｎｄ Ｈｏｂｂｓ，．Ｈ．Ｈ．（１９９５） Ａｒｔｅｒｉｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １５， １９１１−１９１６
【非特許文献１６】
Ｓａｎａｎ， Ｄ． Ａ．， Ｎｅｗｌａｎｄ， Ｄ． Ｌ．， Ｔａｏ， Ｒ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｍｏｏｓｅｒ， Ｖ．， Ｈａｍｍｅｒ， Ｒ． Ｅ．， ａｎｄ Ｈｏｂｂｓ， Ｈ． Ｈ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９５， ４５４４−４５４９
【非特許文献１７】
Ｆａｎ， Ｊ．， Ａｒａｋｉ， Ｍ．， Ｗｕ，Ｌ．， Ｃｈａｌｌａｈ，Ｍ．， Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ， Ｈ．， Ｌａｗｎ， Ｍ． Ｒ．，
Ｋａｋｕｔａ， Ｈ．， Ｓｈｉｋａｍａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｔ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２５５， ６３９−６４４
【非特許文献１８】
Ｒｏｕｙ， Ｄ．， Ｄｕｖｅｒｇｅｒ， Ｎ．， Ｌｉｎ， Ｓ． Ｄ．， Ｅｍｍａｎｕｅｌ， Ｆ．，Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ， Ｌ．Ｍ．， Ｄｅｎｅｆｌｅ， Ｐ．， Ｖｉｇｌｉｅｔｔａ， Ｃ．， Ｇｏｎｇ， Ｅ．， Ｒｕｂｉｎ， Ｅ． Ｍ．， ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ， Ｓ． Ｄ． （１９９８） ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３， １２４７−１２５１．
【非特許文献１９】
Ｃｈｉｅｓａ， Ｇ．， Ｈｏｂｂｓ， Ｈ． Ｈ．， Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ， Ｍ． Ｌ．， Ｌａｗｎ， Ｒ． Ｍ．， Ｍａｉｋａ， Ｓ． Ｄ．， ａｎｄ Ｈａｍｍｅｒ， Ｒ． Ｅ． （１９９２） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７， ２４３６９−２４３７４
【非特許文献２０】
Ｆａｎ， Ｊ．， Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ， Ｈ．， Ｓｕｎ， Ｈ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ．， Ｈｏｎｄａ， Ｋ．， ａｎｄ Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｔ． （２００１） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２１， ８８−９４
【非特許文献２１】
Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｔ．， Ｕｎｏｋｉ， Ｈ．， Ｓｕｎ， Ｈ．， Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ， Ｈ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ，Ｓ． Ｍ．，
Ｓｈｉｋａｍａ， Ｈ．， Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｔ．， ａｎｄ Ｆａｎ， Ｊ． （２００２） Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６０， ２２７−２３６
【非特許文献２２】
Ｓｔａｒｙ， Ｈ． Ｃ．， Ｃｈａｎｄｌｅｒ， Ａ． Ｂ．， Ｄｉｎｓｍｏｒｅ， Ｒ． Ｅ．， Ｆｕｓｔｅｒ， Ｖ．， Ｇｌａｇｏｖ， Ｓ．， Ｉｎｓｕｌｌ，Ｗ．， Ｊｒ．， Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ． Ｅ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｃ． Ｊ．， Ｗａｇｎｅｒ， Ｗ． Ｄ．， ａｎｄ Ｗｉｓｓｌｅｒ， Ｒ． Ｗ．（１９９５） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １５， １５１２−１５３１．
【非特許文献２３】
Ｋｒｏｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｇ．Ｍ．， ａｎｄ Ｃｈａｏ， Ｙ． Ｓ．（１９８５） Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． ５６，
３２３−３２９．
【非特許文献２４】
Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｂｉｓｈｏｐ， Ｒ． Ｗ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｍ． Ｓ．， Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｊ． Ｌ．， ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ． （１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２， １２３０−１２３７
【非特許文献２５】
Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｙ． （１９８０） Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ３６， ２６１−２６８
【非特許文献２６】
Ｆａｎ， Ｊ．， Ｃｈａｌｌａｈ， Ｍ．， Ｓｈｉｍｏｙａｍａｄａ， Ｈ．， Ｓｈｉｏｍｉ， Ｍ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ．， ａｎｄ
Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｔ． （２０００） Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４１， １００４−１０１２
【非特許文献２７】
Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｖ． Ｗ．， Ｃｒｅｍｅｒ， Ｐ．， Ｅｂｅｒｌｅ，． Ｅ．， Ｍａｎｋｅ，． Ａ．， Ｓｃｈｕｌｚｅ， Ｆ．， Ｗｉｅｌａｎｄ， Ｈ．，Ｋｒｅｕｚｅｒ， Ｈ．， ａｎｄ Ｓｅｉｄｅｌ， Ｄ． （１９８６） Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ６２， ２４９−２５７
【非特許文献２８】
Ｓｅｅｄ， Ｍ．， Ｈｏｐｐｉｃｈｌｅｒ， Ｆ．， Ｒｅａｖｅｌｅｙ， Ｄ．， ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｓ．， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｇ．Ｒ．，
Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ， Ｅ．， ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ， Ｇ． （１９９０） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２２， １４９４−１４９９
【非特許文献２９】
Ｃａｎｔｉｎ， Ｂ．， Ｇａｇｎｏｎ， Ｆ．， Ｍｏｏｒｊａｎｉ， Ｓ．， Ｄｅｓｐｒｅｓ， Ｊ．Ｐ．， Ｌａｍａｒｃｈｅ， Ｂ．， Ｌｕｐｉｅｎ， Ｐ． Ｊ．， ａｎｄ Ｄａｇｅｎａｉｓ， Ｇ． Ｒ． （１９９８）Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏ１ ３１， ５１９−５２５．
【非特許文献３０】
Ｆａｎ， Ｊ．， Ｊｉ， Ｚ．−Ｓ．， Ｈｕａｎｇ， Ｙ．， ｄｅ Ｓｉｌｖａ， Ｈ．， Ｓａｎａｎ， Ｄ．， Ｍａｈｌｅｙ， Ｒ．， Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ， Ｔ， ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ． （１９９８） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０１， ２１５１−２１６４
【非特許文献３１】
Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｈｉｎｍａｎ， Ｊ．， Ｍａｒｃｏｖｉｎａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｓｃａｎｕ，Ａ．Ｍ． （２００１）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２８８，２０１−２０８．
【非特許文献３２】
Ｐａｒｈａｍｉ， Ｆ．， Ｍｏｒｒｏｗ， Ａ．Ｄ．， Ｂａｌｕｃａｎ， Ｊ．， Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ， Ｎ．， Ｗａｔｓｏｎ， Ａ．Ｄ．， Ｔｉｎｔｕｔ，Ｙ．， Ｂｅｒｌｉｎｅｒ， Ｊ． Ａ．， ａｎｄ Ｄｅｍｅｒ， Ｌ．Ｌ． （１９９７） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ ＶａｓｃＢｉｏｌ １７，６８０−６８７．
【非特許文献３３】
Ｖｅｎｉａｎｔ， Ｍ． Ｍ．， Ｓｕｌｌｉｖａｎ， Ｍ． Ａ．， Ｋｉｍ， Ｓ． Ｋ．， Ａｍｂｒｏｚｉａｋ， Ｐ．， Ｃｈｕ， Ａ．， Ｗｉｌｓｏｎ， Ｍ．Ｄ．， Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ｋ．， Ｒｕｄｅｌ， Ｌ． Ｌ．， Ｗａｌｚｅｍ， Ｒ． Ｌ．， ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓ．Ｇ． （２０００）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０６， １５０１−１５１０．
【非特許文献３４】
Ｕｔｅｒｍａｎｎ， Ｇ． （１９９５） ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ
Ｄｉｓｅａｓｅ （Ｓｃｒｉｖｅ ＣＲ， Ｂ． Ａ．， Ｓｌｙ ＷＳ，， ｅｄ）， ｐｐ． １８８７−１９１２， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ＮｅｗＹｏｒｋ
【非特許文献３５】
Ｈｓｕ， Ｈ． Ｈ．， Ｃａｍａｃｈｏ， Ｎ．Ｐ．， Ｓｕｎ， Ｆｉ．，Ｔａｗｆｉｋ， Ｏ．， ａｎｄ Ａｏｎｏ， Ｈ．（２０００） Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １５３， ３３７−３４８．
【非特許文献３６】
Ｄｅｍｅｒ， Ｌ． Ｌ． （１９９１） Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８３， ２０８３−２０９３．
【非特許文献３７】
Ｄｏｈｅｒｔｙ， Ｔ． Ｍ．， ａｎｄ Ｄｅｔｒａｎｏ， Ｒ． Ｃ． （１９９４） Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ ５４， ２２４−２３０．
【非特許文献３８】
Ｐａｒｈａｍｉ， Ｆ．， Ｔｉｎｔｕｔ， Ｙ．， Ｐａｔｅｌ， Ｊ． Ｋ．， Ｍｏｄｙ， Ｎ．， Ｈｅｍｍａｔ， Ａ．， ａｎｄ．Ｄｅｍｅｒ，Ｌ．Ｌ．（２００１） Ｚ Ｋａｒｄｉｏｌ ９０， ２７−３０．
【非特許文献３９】
Ｔｉｎｔｕｔ， Ｙ．， ａｎｄ Ｄｅｍｅｒ，． Ｌ． Ｌ． （２００１） Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １２， ５５５−５６０．
【非特許文献４０】
Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｄ．， Ｓｋｅｐｐｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｓｈａｎａｈａｎ， Ｃ． Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ， Ｐ． Ｌ． （１９９８） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １８， ３７９−３８８
【非特許文献４１】
Ｈａｎｓｅｎ， Ｐ． Ｒ．， Ｋｈａｒａｚｍｉ， Ａ， Ｊａｕｈｉａｉｎｅｎ， Ｍ．， ａｎｄ Ｅｈｎｈｏｌｍ， Ｃ． （１９９４） Ｅｕｐ ＪＣｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２４， ４９７−４９９
【非特許文献４２】
Ｇａｌｌｅ， Ｊ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｒ．， Ｈｅｉｎｌｏｔｈ， Ａ．， Ｗａｎｎｅｒ， Ｃ．， Ｇａｌｌｅ， Ｐ． Ｒ．， Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ， Ｅ．， Ｄｉｍｍｅｌｅｒ， Ｓ．， ａｎｄ Ｈｅｅｒｍｅｉｅｒ， Ｋ． （１９９９） Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ５５， １４５０−１４６１．
【非特許文献４３】
Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｄ．， Ｓｋｅｐｐｅｒ， Ｊ． Ｎ．， Ｈｅｇｙｉ， Ｌ．， Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｍ． Ｒ．， Ｓｈａｎａｈａｎ， Ｃ． Ｍ．， ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇ， Ｐ． Ｌ． （２０００） Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ８７， １０５５−１０６２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者等は、さらにＬｐ（ａ）の動脈硬化複合病変への関与を調べるために、ヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギとヒトの家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の動物モデルであるＷＨＨＬウサギとを交配して、ａｐｏ（ａ）Ｔｇ ＷＨＨＬウサギを作製した。ＷＨＨＬウサギはＬＤＬ受容体機能が欠損している（２４）。このａｐｏ（ａ）Ｔｇ ＷＨＨＬモデルは普通食餌でＬＤＬコレステロールの血漿濃度が高くなり、ヒトに類似した動脈硬化病変を形成するため、Ｌｐ（ａ）の動脈硬化病変への関与を調べる理想的な動物モデルである（２５）。さらに、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギはＬＤＬ受容体が欠損するため、野生型ａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギに比べて、血漿中のＬｐ（ａ）濃度が４倍高い（２６）。一方、疫学的研究により、家族性高コレステロール血症患者は健常集団よりＬＰ（ａ）値が高いことが明らかにされており、ＬＤＬコレステロール値が高いとＬｐ（ａ）濃度が有意に上昇することが示唆されている（２７，２８）。それ故、高値のＬｐ（ａ）はＬＤＬコレステロール値が高い患者にとって、冠動脈心疾患のより一層強い危険因子になるのではないかと示唆する研究者らもいる（２９）。
【０００７】
したがってａｐｏ（ａ）Ｔｇ ＷＨＨＬモデルを用いて、Ｌｐ（ａ）とＬＤＬの血漿濃度が高い状態での動脈硬化複合病変形成における影響を明らかにすることも可能である。我々は本研究により、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギではｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギに比べて広範な動脈硬化複合病変を形成していることを明らかにした。我々の知る限り、本発明はＬｐ（ａ）が動脈硬化複合病変形成と石灰化を促進する作用をもつことを示した世界で最初の知見に基づくものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
１．大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有することを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
２．血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られることを特徴とする、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとの交配から得られたウサギ［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）。
３．リポタンパク（ａ）から成る、血管の石灰化を促進する因子。
４．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム蓄積を亢進する因子。
５．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＭＧＰのｍＲＮＡ発現を増加する因子。
６．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＯＰＮのｍＲＮＡ発現を減少させる因子。
７．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を増強させる因子。
８．リポタンパク（ａ）から成る、大動脈平滑筋細胞におけるＯｓｆ２のｍＲＮＡ発現を誘導させる因子。
９．リポタンパク（ａ）がヒト由来である、態様３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
１０．リポタンパク（ａ）が、ヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ由来である、態様３ないし８のいずれか一項に記載の因子。
１１．リポタンパク（ａ）の機能を阻害又は抑制する因子を含む医薬組成物。
１２．血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する作用を有することを特徴とする、態様１１記載の医薬組成物。
１３．アテローム硬化症の治療薬であることを特徴とする、態様１１記載の医薬組成物。
１４．態様３ないし１０のいずれか一項に記載の因子に対する抗体。
１５．ヒトアポリポタンパク（ａ）に対する抗体。
１６．態様１４又は１５に記載の抗体から成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
１７．態様１４又は１５に記載の抗体から成る、アテローム硬化症の治療剤。
１８．アポリポタンパク（ａ）遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
１９．ＤＮＡオリゴマーである態様１８記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２０．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化の抑制剤。
２１．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る、アテローム硬化症の治療剤。
２２．リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２３．態様１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２４．リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２５．アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する方法。
２６．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制することを特徴とする、態様２３又は２４に記載の方法。
２７．リポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
２８．態様１４又は１５に記載の抗体との反応によってリポタンパク（ａ）の作用を阻害することにより、進行性アテローム硬化症を治療するする方法。
２９．リポタンパク（ａ）の産生を抑制することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
３０．アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、アテローム硬化症を治療する方法。
３１．態様１８又は１９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドとの反応によって、アテローム硬化症を治療することを特徴とする、態様２９又は３０に記載の方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明に係るウサギ（［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／−］又は［ＬＤＬｒ−／−，ａｐｏ（ａ）＋／＋］）は、トランスジェニックウサギとホモ接合Ｗａｔａｎａｂｅ家族性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギとから、当業者に公知の連続育種法により得られたものである。このウサギは、実施例に記載されているような特徴を有し、例えば、大動脈弓及び胸／腹大動脈に進行性アテローム病変を有し、又、血管におけるカルシウム沈着又は石灰化が見られる。このウサギは、高Ｌｐ（ａ）患者のアテローム硬化症治療において、いくつかの薬剤の利点を試験するためのきわめて有用なモデルである。
【００１０】
リポタンパク（ａ）から成る本発明に係る因子は、血管の石灰化を促進する機能、大動脈平滑筋細胞におけるカルシウム蓄積を亢進する機能、大動脈平滑筋細胞におけるＭＧＰのｍＲＮＡ発現を増加する機能、大動脈平滑筋細胞におけるオステオポンチン（ＯＰＮ）のｍＲＮＡ発現を減少させる機能、大動脈平滑筋細胞におけるアルカリフォスファターゼ活性を増強させる機能、及び、大動脈平滑筋細胞におけるＯｓｆ２のｍＲＮＡ発現を誘導させる機能などを有するものである。
このリポタンパク（ａ）は各種動物、特にヒト及びヒトアポリポタンパク（ａ）を発現するトランスジェニックウサギ由来である。又、大動脈平滑筋細胞はヒト及びウサギ等の哺乳類由来のものである。
【００１１】
本発明の医薬組成物は、上記に示されたようなリポタンパク（ａ）の各種機能を阻害又は抑制する因子を有効成分として含有するものである。
この医薬組成物生物は、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制する作用を有し、又は、アテローム硬化症の治療薬として有用である。
このような因子は、例えば、本明細書に記載された大動脈平滑筋細胞を用いる各ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養系を利用して、リポタンパク（ａ）の機能を阻害又は抑制する作用に基づいて、当業者であれば容易にスクリーニングし、同定・単離することが出来る。
医薬組成物中には、当業者に公知の薬学上許容できる任意の各種補助剤を適当量含有させることができる。
医薬組成物中の有効成分及び各種補助剤の含有量は、それら各成分の種類、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１２】
ヒトアポリポタンパク（ａ）又はヒトリポタンパク（ａ）から成る因子に対する本発明の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル等の任意の種類の抗体であり得る。これらの各種抗体は、当業者に公知の適当な方法で容易に作製することが出来る。こうして得られる抗体は、例えば、血管におけるカルシウム沈着或いは石灰化の抑制剤、又は、アテローム硬化症の治療剤として有用である。
【００１３】
本発明のアポリポタンパク（ａ）遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知である当該遺伝子配列に基づき当業者が容易に設計し製造することが出来る。それは、例えば、ＤＮＡオリゴマー又はｓｃＲＮＡである。
こうして得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、血管におけるカルシウム沈着或いは石灰化の抑制剤、又は、アテローム硬化症の治療剤として有用である。
【００１４】
本発明の抑制剤及び治療剤中には、当業者に公知の薬学上許容できる任意の各種補助剤を適当量含有させることができる。
各薬剤中の有効成分及び各種補助剤の含有量は、それら各成分の種類、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１５】
本発明は、血管におけるカルシウム沈着、又は石灰化を抑制したり、又は、進行性アテローム硬化症を治療する方法に係る。
これらの本発明方法は、例えば、上記の医薬組成物、若しくは本発明の抗体を使用することによってリポタンパク（ａ）の作用を阻害したり、更に、例えば、上記の医薬組成物、若しくは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することによってリポタンパク（ａ）の産生を抑制したり、アポリポタンパク（ａ）遺伝子の発現を制御することにより、実施することが出来る。
本発明方法において、医薬組成物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は各種薬剤の使用時期、使用頻度、及び使用量等は、治療目的、治療対象の体重、年齢、及び性別、並びに疾患の程度等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００１６】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実験方法
ヒトａｐｏ（ａ） Ｔｇ ＷＨＨＬウサギ
ヒトａｐｏ（ａ）を発現するＴｇウサギは、既報の方法（２６）に従いホモ接合ＷＨＨＬウサギと交配した。連続育種法を用いて、ｎｏｎ−Ｔｇ（野生型）ホモ接合ＷＨＨＬウサギ［ＬＤＬｒ−／−］およびヒトａｐｏ（ａ）を発現するホモ接合Ｔｇ ＷＨＨＬウサギ［ＬＤＬｒ−／−， ａｐｏ（ａ）＋／−］の２群のＷＨＨＬウサギを得た。ヒトａｐｏ（ａ）導入遺伝子の存在はヒトａｐｏ（ａ）ｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロッティング法で確認し、ＬＤＬ受容体の遺伝型はＰＣＲ解析法で同定した（２６）。計８匹のＴｇ ＷＨＨＬウサギと７匹の同腹ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギを得て、７〜８ヵ月齢時に動脈硬化病変の病理学的解析を行った。
【００１８】
血漿中の脂質、リポタンパク、アテローム性病変の解析
７ヵ月齢のＴｇ ＷＨＨＬウサギの血漿中の脂質およびリポタンパクの分布を同月齢のｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギと比較した（３０）。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの血漿Ｌｐ（ａ）値を測定した（２６）。大動脈病変の解析はズダンＩＶで染色した後、画像解析装置を用いて病変面積を測定した（２０）。大動脈の病変部位を病理学的に解析するため、大動脈弓、胸大動脈、腹大動脈の重複しない３部位から、大動脈の各部を横断面に切除した（２１）。すべての切片をパラフィン包埋し、ヘマトキシリン・エオジンおよびエラスチカ・ワンギーソンで染色した。各切片の内膜肥厚の程度はコンピュータによる画像解析システムで測定した。
病変部の細胞成分およびリポタンパク沈着を調べるために、既報の方法（２１）に従い免疫組織化学的染色を行った。さらに、筑波大学附属病院から急性心筋梗塞で死亡した患者の剖検冠動脈検体１２例を入手し、上記の方法で石灰化とＬＰ（ａ）蓄積の相関を評価した。
【００１９】
ＳＭＣ石灰化のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ウサギ大動脈より平滑筋細胞（ＳＭＣ）を分離し、２０％ＦＢＳを含む最小必須培地（ＭＥＭ， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で培養した。当研究室の健常者６名から血漿を採取し、既報（３１）に従い一連の超遠心分離とゲルろ過クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によってヒトＬＰ（ａ）を精製した。抗ａｐｏ（ａ）および抗ａｐｏＢ抗体（Ａｂ）を用いたウェスタンブロッティング法により、精製したタンパク質がＬｐ（ａ）であることを確認した。Ｌｐ（ａ）が内毒素に汚染されていないことを確認した（＜１０ｐｇ／ｍＬ）。
Ｌｐ（ａ）で処理後、既報（３２）にしたがって、ＳＭＣの細胞関連アルカリホスファターゼ活性およびカルシウムの蓄積を測定した。カルシウム沈着を直接視覚化するために、５〜３０ｍｇ／ｄｌのＬｐ（ａ）にＳＭＣを１３日間曝露し、ファン・コッサ染色法で染色した（３２）。
【００２０】
逆転写ＰＣＲ解析
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは次のとおりである。（１）オステオポンチン（ＯＰＮ）５’−ＴＴＣ ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＴＣ ＧＴＴ ＣＣＣ ＡＣ−３’および５’−ＴＴＴ ＣＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＴＴ Ｇ−３’。（２）骨芽細胞特異因子−２（Ｏｓｆ２）５’−ＡＣＡ ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＴＣ−３’および５’−ＡＴＴ ＣＧＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＴ ＧＴＣ ＴＣ−３’。（３）基質Ｇｌａタンパク（ＭＧＰ）５’−ＧＣＣ ＴＧＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＴＣ−３’および５’−ＧＴＡ ＣＡＴ ＡＴＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＧＧ ＧＣ−３’。（４）β−アクチン５’−ＡＴＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＧ−３’および５’−ＣＧＴ ＣＡＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＴ ＧＣ−３’。
【００２１】
トリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて、ＳＭＣからＲＮＡを単離し、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキットを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で解析した。各ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルで電気泳動し、Ｖｉｓｔｒａ Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で染色した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の濃度はＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。ＲＴ−ＰＣＲ産物がプライマー特異的増幅産物であることをＤＮＡ塩基配列解析により確認した。
【００２２】
統計解析
血漿中の脂質とｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のデータは、スチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性を評価した。動脈硬化病変面積の解析結果はマン・ホイットニーのＵ検定を用いて、統計的有意差を評価した。全例について統計的有意性をＰ＜０．０５に設定した。
【００２３】
結果
血漿中の脂質とリポタンパク
普通食餌によって、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギおよびｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギが同等に高脂血症を発症した（総コレステロール：７９１±１４１ｍｇ／ｄＬ， Ｔｇ（ｎ＝８）と７１７±１３５ｍｇ／ｄＬ， ｎｏｎ−Ｔｇ（ｎ＝７）、トリグリセリド：２１６±５２ｍｇ／ｄＬ， Ｔｇと２５０±５５ｍｇ／ｄＬ， ｎｏｎ−Ｔｇ， Ｐ＞０．０５）。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギにおけるＬｐ（ａ）の平均血漿濃度は１５．４±２．２ｍｇ／ｄＬであった。アガロースゲル電気泳動によるリポタンパク分布を解析することによって、ＷＨＨＬウサギはＴｇでもｎｏｎ−Ｔｇでも、正常な野生型ウサギに比べて、βに移動するリポタンパクが著しく増加し、αに移動するリポタンパクが減少していることが示された（図１Ａ）。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ウェスタンブロッティングを行い、ヒトａｐｏ（ａ）がウサギＬＤＬに結合して、Ｌｐ（ａ）複合体を形成することがわかった（図１Ｂ）。非還元条件下、高分子として存在するごく少量（約２０％）の血漿ａｐｏ（ａ）がウサギａｐｏＢと共存しており、このことは共有結合および共有結合以外の結合によって、ＴｇウサギのＬｐ（ａ）様粒子［ヒトａｐｏ（ａ）／ウサギａｐｏＢ］が産生されることを示唆している（図１Ｃ）。異なる密度でリポタンパク画分を解析することによって、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギがｎｏｎ−Ｔｇウサギとほぼ同量のａｐｏＢ， ＡｐｏＥおよびＡｐｏＡＩを有していることが明らかになった（図１Ｄ）。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでは、ヒトａｐｏ（ａ）が主にｄ＝１．０２〜１．０８ｇ／ｍＬ（Ｆ３〜Ｆ５）で分布し、ａｐｏＢを含有するリポタンパクもこの範囲に分布する（図１Ｄ）。注目すべきは、少量のヒトａｐｏ（ａ）がたとえばＶＬＤＬ（ｄ＜１．００６ｇ／ｍＬ）および中間密度リポタンパク（ｄ＝１．００６〜１．０２ｇ／ｍＬ， Ｆ２）画分など、密度の低い画分でも確認されており、このことはＬＤＬのほかに、ａｐｏ（ａ）がａｐｏＢを含有する他の大きい粒子に結合できることを示唆している。密度による血漿画分中の脂質を定量化することによって、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギがｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギとほぼ同じリポタンパクの分布パターンを有することがわかった。
【００２４】
大動脈アテローム硬化
病変発現の組織分布的かつ空間的評価を行うために、我々はスダン好性ｅｎ ｆａｃｅ（正面）病変面積及び内膜肥厚を測定した。大動脈全体のｅｎ ｆａｃｅ病変部はＴｇウサギとｎｏｎ−Ｔｇウサギに有意差がなく、２７．７±８．４％， Ｔｇ ＷＨＨＬ， ｎ＝７と２６．６±８．４％， ｎｏｎ−Ｔｇ， ｎ＝８， ｐ＝０．３であった。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギのスダン染色病変は、ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギより著明に厚かったので、さらに各部位の内膜病変を定量的に評価した。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの内膜病変部はｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギに比べて有意に多く、大動脈弓で３．３倍（Ｐ＜０．０１）、胸／腹大動脈で２倍（Ｐ＝０．０８）であった（図２Ａ）。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギのアテローム性病変の病理学的特徴はｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギとは著明に異なった。ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでは、アテローム性病変は脂肪斑であり、混在したＳＭＣの小個体群とともにマクロファージ由来の泡沫細胞に富んでいた（図２Ｂ、上の写真）。明確に異なるのは、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでは進行病変が形成されており、アテローム、線維性アテロームおよび石灰化を含んでいることである（図２Ｂ、下３つの写真）。このような病変は線維性の被膜層で覆われ、カルシウム沈着または石灰化に関係することが多い壊死性コアまたは脂質コアを含むため、進行性アテローム性病変とした。免疫組織化学的染色法によって、壊死性コアがマクロファージ由来泡沫細胞を含むのに対して、肥厚した線維性の被膜層は主にＳＭＣから成っていた（図２Ｂ）。
【００２５】
病変の質がＴｇ ＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギとできわめて異なるため、さらに大動脈弓で各種病変が占める領域を定量化し、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの病変分布とｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギのそれを比較した。そのため米国心臓学会の分類（２２）をもとにこの病変を３つのカテゴリーに恣意的に分類した。その３つのカテゴリーとは、脂肪斑（ＩＩ型）、アテローマ（ＩＶ型）および線維性アテローマ（Ｖａ型）を含む線維性プラーク、カルシウム沈着または石灰化のいずれかを含む合併プラーク（Ｖｂ型）である。図２Ｃに示すように、脂肪斑の病変面積はＴｇ ＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−ＴｇＷＨＨＬウサギで著明な差がない。しかし、線維性プラークの病変部および進行性病変（ＩＶ型およびＶ型）はｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギに比べ、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギで著しく大きかった。
本研究により、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギのいくつかの病変で血管の石灰化が病変の侵食または破裂を明らかに増強しているように思われるため、我々はＴｇ ＷＨＨＬウサギの進行性病変に関連する著しい血管の石灰化に特に関心を持った（図３Ａ）。ａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢに対するＡｂを用いた免疫染色によって、ａｐｏ（ａ）が石灰化領域の周囲に蓄積し、ａｐｏＢと共存することが多いことがわかった（図３Ｂ）。ａｐｏ（ａ）はＴｇＷＨＨＬウサギの線維性プラークの脂質コアでも確認されているが、これは石灰化に関連することが多い（図３Ｃ）。大動脈全体のＸ線解析によって、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギで大動脈、特に病変の生じやすい部位（肋間動脈口）に多くの石灰化部位が存在したが、ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギではそのような部位は認められなかった（図３Ｄ）。
【００２６】
ＳＭＣの石灰化に対するＬｐ（ａ）の作用
Ｌｐ（ａ）がＴｇ ＷＨＨＬウサギで認められる血管の石灰化を加速する制御因子として働くかどうかという論点に答えるため、培養ＳＭＣでカルシウム蓄積に対するヒトＬｐ（ａ）の作用を調べた。生理的濃度のＬｐ（ａ）を添加することによって、ＳＭＣのカルシウム取り込みが著しく増加し、その作用は用量依存的かつ時間依存的であった（図４Ａ）。さらに、Ｌｐ（ａ）で処理したＳＭＣは、２日目および４日目にカルシウム結合タンパクである基質Ｇｌａタンパク（ＭＧＰ）のｍＲＮＡ発現を増強した（図４Ｂ、左）。２日目にオステオポンチン（ＯＰＮ）発現がやや増加したが、４日目に著しく低下した（図４Ｂ、右）。しかもＬｐ（ａ）は細胞内アルカリホスファターゼ活性を増強しながら、骨芽細胞特異因子−２（Ｏｓｆ２ ）ｍＲＮＡ発現を誘導して、骨芽細胞の分化誘導と同様の現象が観察された（図５Ｃ）。比較的高濃度である３０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）でＳＭＣを３日間インキュベートすると、このＳＭＣは小結節性形成物の数が対照に比べて多くなった（図５Ｄ）。Ｌｐ（ａ）添加１３日後、ファン・コッサ染色によってカルシウム沈着が明瞭に示された（図５Ｅ）。
【００２７】
ヒトアテローム硬化症にみるＬｐ（ａ）の沈着と石灰化
Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの方が広範な進行性病変を有するという知見と培養ＳＭＣでのＬｐ（ａ）のカルシウム沈着誘導能とが、石灰化がヒトのアテローム硬化症をきたした血管壁のＬｐ（ａ）沈着に関連するのか、我々が調べる契機となった。複数の患者から得た典型的冠動脈アテローム硬化症の３検体では種々の程度の石灰化が認められ、び漫性（陳旧性）石灰化（図６Ａ，Ｂ）または細胞成分に関連する低密度のカルシウム沈着（図６Ｃ）を認めるいずれかの部位の近傍でＬｐ（ａ）が検出されることを確認した。
【００２８】
考察
我々は本研究によって初めてＴｇ ＷＨＨＬウサギでＬｐ（ａ）が進行性病変の進展を促していることを示した。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギは、血漿ＬＤＬコレステロール値が高く、この点はｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギと同じであるが、ヒトＬｐ（ａ）濃度も比較的高い。この点で２つのモデル（ａｐｏ（ａ）Ｔｇおよびｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬ）によって、１つの危険因子と２つの危険因子、つまり、高ＬＤＬコレステロール血症単独と高ＬＤＬコレステロールおよび高Ｌｐ（ａ）血症のアテローム生成性を比較することができると言えよう。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギはｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギに比べて、大動脈弓および胸／腹大動脈でアテローム性病変がそれぞれ多く、その病変はアテローム、線維性アテロームおよび石灰化など進行性病変から成る。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの広範な進行性アテローム病変の知見は、Ｌｐ（ａ）がアテローム硬化症を進展させる危険因子であるという意見を支持するばかりでなく、アテローム硬化症に対する高コレステロール血症のリスクが高Ｌｐ（ａ）の状況で有意に上昇するという一般的な見解を強化するものでもある。
【００２９】
Ｌｐ（ａ）によってＴｇ ＷＨＨＬウサギのスダン好性病変の範囲が有意に拡大することがないのは驚くべきことであり、我々がコレステロールを与えたａｐｏ（ａ）Ｔｇウサギで確認した結果とは異なる（２０）。コレステロールを与えたＴｇウサギとＷＨＨＬ Ｔｇウサギの間にみられるこの矛盾は、そのアテローム生成性粒子（大β−ＶＬＤＬと小ＬＤＬ）の差によるものか（３３）、あるいはＷＨＨＬウサギのきわめて高いＬＤＬ濃度が初期の病変形成に対するＬｐ（ａ）の作用を上回ったのではないかと考えている。ヒトでは、３０ｍｇ／ｄＬを超えるＬｐ（ａ）値がアテローム生成性であると考えられている（３４）。ＴｇＷＨＨＬウサギでは、血漿Ｌｐ（ａ）値（１５ｍｇ／ｄＬ）がこの恣意的な閾値より低くとも、それでも尚この値が通常内因性Ｌｐ（ａ）を持たないウサギにとって著しくアテローム形成を促進する要因であると思われる。ＴｇＷＨＨＬウサギとｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギのリポタンパク分布は本質的に同じで、コレステロールおよびＬＤＬ中ａｐｏＢの量がＴｇ ＷＨＨＬウサギの進行性アテローム硬化症を促進させる可能性は否定できる。したがって、血漿Ｌｐ（ａ）の存在がＴｇ ＷＨＨＬウサギの病変を著しく増悪させる主要因子であると考える。Ｔｇ ＷＨＨＬの進行性病巣における脂質コアおよび線維性被膜層の存在はヒトのアテローム硬化症の特徴に似ている（２２）。
【００３０】
本研究に関するひとつの重要な知見は、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギで著明な血管の石灰化を示したことであり、これがｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでは確認されなかった。我々はＴｇ ＷＨＨＬウサギの石灰化が血漿リン酸塩またはカルシウムの上昇および／またはアルカリホスファターゼ活性の増強によるものでないことを確認している。血管の石灰化がヒトａｐｏ（ａ）Ｔｇマウス（１１）またはコレステロールを与えたＴｇウサギ（２０）のいずれにも観察されないことは注目に値する。かなりコレステロール値の高い（２％）飼料を与えた正常なウサギでは、石灰化病変ではなく、石灰化可能な基質小胞の形成が大動脈で報告されており（３５）、一方、ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬウサギは、コレステロール、ビタミンＤおよびカルシウムを多く含む飼料を与えた場合（３８）または平均年齢が１５ヵ月に達すると、血管の石灰化を生ずることが確認されている。血管の石灰化はヒトのアテローム硬化病変によくみられる特徴であり、冠動脈心疾患および大動脈破裂など多くの臨床問題の一因である（３７）。この点について、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの病変はヒトの進行性アテローム硬化症でみられる石灰化の多くの特徴に共通しているため、このウサギはアテローム硬化症に関連する血管の石灰化を試験するための理想的なモデルとして使用できよう。Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの病変に石灰化が存在し、ヒトのアテローム性病変にみるＬｐ（ａ）と石灰化の深い関連によって、我々はＬｐ（ａ）が血管の石灰化プロセスの潜在的なメディエイターであるという仮説を提唱するに至った。血管の石灰化の原因は、加齢の末期的、受動的または変性プロセスというより（３８，３９）、むしろ能動的なプロセスである可能性が本研究により示唆された。
【００３１】
重大な問題は、Ｌｐ（ａ）がＳＭＣのような血管細胞で本当に石灰化を誘発することができるのかということである。この問いに答えるため、我々は複数の段階を踏み、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養ＳＭＣの石灰化に対するＬｐ（ａ）の作用を調べた。まず、生理的濃度のＬｐ（ａ）でＳＭＣを処理することによって、用量依存的かつ時間依存的にカルシウム蓄積が亢進した。次にＬｐ（ａ）は４日目にＳＭＣのＭＧＰ ｍＲＮＡ発現を有意にアップレギュレートしたのに対して、ＳＭＣのＯＰＮ発現をダウンレギュレートした。骨原性タンパク発現のこのパターン（ＭＧＰの増加とＯＰＮの減少）は、ＳＭＣの石灰化がヒトの血管ＳＭＣの高ＭＧＰおよび低ＯＰＮに関連するこという見解と一致する（４２）。さらに、Ｌｐ（ａ）で処理したＳＭＣにおいて、Ｏｓｆ２がアップレギュレートされると同時にアルカリホスファターゼ活性が増強したため、Ｌｐ（ａ）はＳＭＣの骨芽細胞への分化を誘導することによって、石灰化を亢進すると思われる。以上のことから、このような結果はＬｐ（ａ）が血管の石灰化プロセスに関与している可能性があることを強く示唆する。
【００３２】
Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでＬｐ（ａ）による進行性アテローム性病変の形成が促される機序は未解明であるが、病変に壊死性コアまたは脂質コアが存在することによって、壊死またはアポトーシスのいずれかによる細胞死が生じることが示されており、これによってＬｐ（ａ）が直接的または間接的にそのような細胞死を誘導するのか、細胞死も次の石灰化プロセスに関与または必要であるのかという興味深い疑問がわく。従来の研究から、Ｌｐ（ａ）は単球でのスーパーオキサイド産生を亢進し（４１）、ヒトの内皮細胞およびウサギの大動脈でアポトーシスを誘導することがわかっている（４２）。この機序が実際にｉｎ ｖｉｖｏで働いているとすれば、確かにＴｇ ＷＨＨＬウサギで観察された知見を説明するのに有用である。この可能性に一致するように、培養ＳＭＣを用いたいくつかの試験で、ＳＭＣの石灰化より前にアポトーシスが生じ、アポトーシス小体に血管の石灰化を開始する能力があることがわかっている（４３）。
【００３３】
結論として、我々の今回の研究では、Ｌｐ（ａ）がアテローム硬化症の発症に対する危険因子であるばかりでなく、病変形成の進行を促す誘発物質でもあるという証拠がさらに得られた。しかも、我々はＬｐ（ａ）がアテローム硬化症に関連する血管の石灰化において潜在的な制御因子であることを示している。Ｌｐ（ａ）のアテローム生成性と石灰化に関する分子機構は十分に解明されていないが、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギでの進行性アテローム硬化症の形成は、ヒトのアテローム硬化症の研究や、プラークの破裂および動脈瘤などアテローム硬化症の合併症を研究するために有益であると明確に証明された。今後の研究では、Ｔｇ ＷＨＨＬウサギが心筋梗塞の発症率を増加させるかどうか、評価することも興味深い。我々は高Ｌｐ（ａ）で進行性アテローム硬化症のＴｇ ＷＨＨＬモデルが、高Ｌｐ（ａ）患者のアテローム硬化症治療において、いくつかの薬剤の利点を試験するためのきわめて有用なモデルであろうと考えている。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によって、Ｌｐ（ａ）における石灰化の関与は、生活習慣病におけるマルチプルリスクファクター症候群のように、骨粗鬆症と動脈硬化．血管石灰化が共通の上に立つ疾患である可能性を示唆した。従って、両者を総合的に制御する因子群の発見、ひいては骨粗鬆症の病態解明につながるものと期待される。加えて、膨大な数の調節因子群の関与が想像できることから、医学関連産業に及ぼす影響力は極めて大きい。即ち、本発明は、動脈硬化複合病変により惹起される循環障害、虚血性心疾患、脳梗塞の新しい治療原理、予防法、診断法、薬剤の開発を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】血漿リポタンパクの解析
Ａ．普通食餌を与えたＷＨＨＬウサギおよび正常ウサギから得た血漿のアガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。血漿（２μｌ）をＦａｔ Ｒｅｄ ７Ｂ により染色した結果（上）、ヒトａｐｏ（ａ）モノクロ−ナル抗体を用いたウェスタンブロッティング解析の結果（下）。
Ｂ−Ｃ．Ｔｇ ＷＨＨＬウサギおよびヒト血漿ａｐｏ（ａ）のウェスタンブロッティング法による解析の結果を示す写真である。
３．５％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）あるいは非還元条件下（Ｃ、左）または還元条件下（Ｃ、右）の４％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥのいずれかの方法で、血漿を分離した。ウェスタンブロッティングを行った同じ膜をストリッピングの後、ａｐｏＢ 抗体で再プローブした。＊はａｐｏ（ａ）とａｐｏＢとが共有結合してＬｐ（ａ）を成していることを示し、＊＊は非共有結合により会合するＬｐ（ａ）と遊離ａｐｏ（ａ）を示す。
Ｄ．血漿リポタンパクの密度による７画分（Ｆ１〜Ｆ７）を分離し、１％アガロースゲル電気泳動法によって解析した結果を示す写真である。Ｆ１はｄ＜１．００６ｇ／ｍｌ、Ｆ２はｄ＝１．００６〜１．０２ｇ／ｍｌ、Ｆ３はｄ＝１．０２〜１．０４ ｇ／ｍｌ、Ｆ４はｄ＝１．０４〜１．０６、Ｆ５はｄ＝１．０６〜１．０８、Ｆ６はｄ＝１．０８〜１．１０ｇ／ｍｌ、Ｆ７はｄ＝１．１０〜１．２１ｇ／ｍｌである。リポタンパクはＦａｔｒｅｄ ７Ｂで染色し、各アポリポタンパクはウェスタンブロッティング法で検出した（３０）。
【図２】大動脈におけるアテローム性病変の定量解析と組織学的解析
Ａ．大動脈弓または胸大動脈および腹大動脈から得た最もスダン好性の病変５切片を試験し、画像解析システムを用いて内膜病変部を評価した。＊ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬに対してＰ＜０．０１
Ｂ．アテローム性病変の組織学的試験と免疫組織化学的試験の結果を示す写真である。パラフィン包埋した大動脈弓の連続断片をヘマトキシリンイオジン（ＨＥ）またはマクロファージ（ＭФ）およびＳＭＣ（ＳＭ−α−アクチン）に対する抗体のいずれかを用いて染色した。上段写真：典型的脂肪線条、ＩＩ型病変（ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬ）。下３つのうち上段写真：被覆および壊死性コアを伴う典型的線維性プラーク、ＩＶ型病変（Ｔｇ ＷＨＨＬ）。下３つのうち中段写真：著明な脂質コアおよびカルシウム沈着を伴うＶａ型病変（Ｔｇ ＷＨＨＬ）。下３つのうち下段写真：著明な石灰化を伴うＶｂ型病変（Ｔｇ ＷＨＨＬ）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｃ．大動脈における種々の病変の定量。この病変を主に泡沫細胞である脂肪斑、典型的な壊死性コアおよび線維性被覆を含む線維性プラーク（ＩＶ型およびＶａ型を含む）、カルシウム沈着症または完全な石灰化を含む合併プラーク（Ｖｂ型病変）に分類した。切片上で各種病変の占める面積を測定した。＊ｎｏｎ−Ｔｇ ＷＨＨＬに対してＰ＜０．０５
【図３】Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの石灰化に関連する進行性病変像を示す写真である。
Ａ．大動脈病変をＨＥで染色し、血管の石灰化（矢印）が病変の侵食または破裂を増強しているように思われる。目盛りは２００μｍを表す。
Ｂ．石灰化（Ｖｂ型）を伴う大動脈弓の連続凍結切片をａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢに対する抗体を用いて免疫染色した。ａｐｏ（ａ）およびａｐｏＢが石灰化の近傍で検出された。目盛りは２００μｍを表す。
Ｃ．Ｔｇ ＷＨＨＬウサギの典型的線維性プラークの壊死性コアにみる石灰化像。このカルシウム沈着はフォン・コッサ染色によって検出され、ａｐｏ（ａ）が近傍に検出された（Ｃ上段）。病変の中心にはマクロファージを含み、ＳＭＣによって覆われている（Ｃ下段）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｄ．大動脈石灰化の放射線像。Ｔｇ ＷＨＨＬ大動脈には多くの石灰化部位（白の矢印で示す）があることに注目。
【図４】ＳＭＣにおけるカルシウム沈着に対するＬｐ（ａ）の作用
Ａ．Ｌｐ（ａ）は用量依存的かつ時間依存的にカルシウム沈着を亢進する。ウサギの大動脈ＳＭＣへのカルシウム沈着は、４８時間Ｌｐ（ａ）を記載の濃度で処理し（左図）、１０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）または同量のＬＤＬの存在下、記載の期間にわたりインキュベートした（右図）。＊対照に対してＰ＜０．０１
Ｂ．ＭＧＰ（左）およびＯＰＮ（右）のｍＲＮＡ発現に対するＬｐ（ａ）の作用。１０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）の存在下、ＳＭＣを４８時間インキュベートした。結果をβ−アクチンに対するＭＧＰ発現量およびβ−アクチンに対するＯＰＮ発現量の比で示す。＊対照に対してＰ＜０．０５
【図５】Ｃ．Ｌｐ（ａ）はＳＭＣでＯｓｆ２ｍＲＮＡの発現（左）と細胞内アルカリホスファターゼ活性（右）を増強する。記載した濃度でのＬｐ（ａ）存在下、ＳＭＣを３日間インキュベートした。Ｏｓｆ２ ｍＲＮＡ発現は定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析で測定した。結果はβ−アクチンに対するＯｓｆ２発現量で表す。ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の結果を示す写真を上に示す。＊対照に対してＰ＜０．０１
Ｄ．３０ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）を用いて３日間処理したＳＭＣを示す写真であり、小結節性形成物の数が増えた（右）。目盛りは２００μｍを表す。
Ｅ．Ｌｐ（ａ）で１３日間ＳＭＣを処理した後を示す写真であり、フォン・コッサ染色によってカルシウム沈着が示された（右）。目盛りは２００μｍを表す。
【図６】ヒト冠動脈中の石灰化とＬｐ（ａ）の密接な関係を示す写真である。
Ａ．右の写真に石灰化領域の表面に沿って認められるＬｐ（ａ）沈着（矢印で示す）を示す。
Ｂ．陳旧性石灰化の周囲に存在するＬｐ（ａ）を示す。
Ｃ．この病変ではカルシウム沈着が泡沫細胞の下に低密度に分布し、Ｌｐ（ａ）沈着がＳＭＣに混在する。もとの倍率：目盛りは２００μｍを表す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the expression of lipoprotein (a) (Lp (a)) formed by non-covalent binding between low-density lipoprotein (LDL) and apolipoprotein (a), and the expression of (Lp (a)) in blood vessels (smooth). (Lp (a)) is a factor having a function of promoting calcification, and (Lp (a)) is responsible for vascular calcification including atherosclerotic complex lesions. That vascular calcification is induced and that Lp (a) receptor other than LDL receptor is present, and that vascular calcification is known to be involved in bone formation. It is based on the discovery that it is a disease that is based on the same basis.
[0002]
[Prior art]
Since the discovery of lipoprotein (a) [Lp (a)] by Berg (1) in 1963, a number of clinical, epidemiological and genetic studies have shown that high plasma concentrations of Lp (a) have Although it has been shown to cause human cardiovascular disease such as disease, stroke, and restenosis (2-4), some studies have failed to establish such an association (5,5). 6). The involvement of Lp (a) in the pathogenesis of atherosclerosis was first suggested by the presence of Lp (a) in human atherosclerotic lesions (7,8), and many subsequent studies have shown that It has been pointed out that Lp (a) deposition correlates with the severity of unstable coronary syndrome (9). Nevertheless, the mechanism by which Lp (a) increases the risk of atherosclerotic disease is largely unknown.
[0003]
A major problem in elucidating the functional role of Lp (a) in in vivo experiments is due to the lack of suitable experimental animals. That is, Lp (a) is known to be present only in monkeys and humans, and among primates, hedgehogs are the only animals that produce Lp (a) -like proteins (10). Four reports using transgenic (Tg) mice suggest that apolipoprotein (a) [apo (a)] fed Tg mice on a high fat diet may promote apo (a) to promote aortic lipid plaque formation (11-14). However, two different studies did not confirm the effect of promoting apo (a) atherogenesis in Tg mice expressing either apo (a) alone or human apo (a) and apoB (15, 16). .
[0004]
In this laboratory (17), Tg rabbits expressing human apo (a) were prepared, and it was revealed that human apo (a) forms Lp (a) by binding to rabbit LDL. This is in contrast to the human apo (a) Tg mouse, where human apo (a) does not bind to mouse LDL and thus no Lp (a) is present in the mouse plasma (19). We have recently reported that Lp (a) promotes the formation of aortic and coronary atherosclerotic lesions in Tg rabbits fed a high cholesterol diet (20, 21). In such experiments involving Tg rabbits or Tg mice, apo (a) is associated with atherosclerosis on a high cholesterol diet, regardless of whether it binds to apoB (for Tg rabbits) or not (for Tg mice). Although revealed to be a factor promoting lesion formation, such studies did not answer the question whether Lp (a) could be a factor that exacerbates atherosclerotic complex lesions. Lesions formed in cholesterol-fed animals are primarily fatty plaques, defined as early lesions, whereas human atherosclerotic complex lesions are more advanced and involved in rupture and calcification Obtaining an answer with such a model is a difficult problem because there are many cases (22). It is these atherosclerotic complex lesions that increase the risk of ischemic stroke and coronary heart disease and lead to many clinical signs. Another problem is that in animals fed cholesterol, arteries caused by high LDL levels, such as humans, due to the presence of a large amount of liver and intestinal remnant lipoproteins (so-called β-VLDL). It cannot be ruled out that the cause may be different from the cause of sclerosis (23).
[0005]
The numbers of the following non-patent documents correspond to the numbers shown in parentheses in this specification.
[Non-patent document 1]
Berg, K.C. (1963) Acta Pathol Microbiolo Scan 59, 369-382.
[Non-patent document 2]
Maher, V .; M. , And Brown, B.C. G. FIG. (1995) Curr Opin Lipid 6, 229-235
[Non-Patent Document 3]
Djurovic, S.D. And Berg, K .; (1997) Clin Genet 52, 281-292.
[Non-patent document 4]
Marcovina, S.M. M. , And Koschinsky, M .; L. (1998) Am J Cardiol 82, 57U-66U; discussion 86U.
[Non-Patent Document 5]
Ridker, P .; M. Hennekens, C .; H. , And Stampfer, M.W. J. (1993) JAMA 270, 2195-2199
[Non-Patent Document 6]
Gurewich, V.W. , And Mittleman, M .; (1994). JAMA 271, 1025-1026
[Non-Patent Document 7]
Rath, M.A. , Niendorf, A .; Reblin, T .; , Dietel, M .; Kreber, H .; J. , And Beisiegel, U.S.A. (1989) Arteriosclerosis 9, 579-592.
[Non-Patent Document 8]
Jurgens, G .; Chen, Q. et al. , Esterbauer, H .; , Mair, S.M. , Ledinski, G .; , And Dinges,. H. P. (1993) Arterioscl Thromb 13, 1689-1699.
[Non-Patent Document 9]
Dangas, G .; , Mehran, R .; Harpel, P .; C. , Sharma, S.M. K. Marcovina, S .; M. , Dube, G .; , Ambrose, J .; A. , And Fallon, J.M. T. (I998) J Am Coll Cardiol 32, 2035-2042.
[Non-Patent Document 10]
Laplaud, P .; M. , Beaubatie, L.A. Rall, S .; C. Jr., Jr. , Luc, G .; , And Saboureau, M .;
(1988) J Lipid Res 29, 1157-1170.
[Non-Patent Document 11]
Lawn, R.A. M. Wade, D .; P. Hammer, R .; E. FIG. Chiesa, G .; , Verstuyft, J. et al. G. FIG. , And Rubin,. E. FIG. M. (1992) Nature 360, 670-672.
[Non-Patent Document 12]
Liu, A .; C. , Lawn, R.A. M. , Verstuyft, J. et al. G. FIG. , And Rubin, E.A. M. (1994) J Lipid Res 35, 2263-2267.
[Non-patent document 13]
Lawn, R.A. M. Pearle, A .; D. Kunz, L .; L. Rubin, E, M.S. Reckless, J .; , Metcalfe, J. et al. C. , And Grainger, D.C. J. (1996) J Biol Chem 271, 31367-31371.
[Non-patent document 14]
Boommark, N.M. W. Lou, X .; J. , Yang, Z .; J. Schwartz, K .; , Zhang, J .; L. Rubin, E .; M. , And Lawn, R.A. M. (1997) J Clin Invest 100, 558-564.
[Non-Patent Document 15]
Mancini, F .; P. , Newland, D.C. L. , Mooser, V .; , Mumta, J .; Marcovina, S .; , Young, SG. Hammer, R .; E. FIG. , Sanan, D.A. A. ,. and Hobbs,. H. H. (1995) Artiscler. Thromb. Vasc. Biol. 15, 1911-1916
[Non-Patent Document 16]
Sanan, D.M. A. , Newland, D.C. L. Tao, R .; Marcovina, S .; , Wang, J .; , Mooser, V .; Hammer, R .; E. FIG. , And Hobbs, H .; H. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 4544-4549
[Non-Patent Document 17]
Fan, J.M. Araki, M .; Wu, L .; , Challah, M .; , Shimoyamada, H .; , Lawn, M.A. R. ,
Kakuta, H .; Shimama, H .; , And Watanabe, T .; (1999) Biochem. Biophy. Res. Commun. 255, 639-644
[Non-Patent Document 18]
Rouy, D.S. , Duverger, N .; Lin, S .; D. , Emmanuel, F .; Houdebine, L .; M. , Denefle, P .; Viglietta, C .; Gong, E .; Rubin, E .; M. , And Hughes, S.M. D. (1998) JBiol Chem 273, 1247-1251.
[Non-Patent Document 19]
Chiesa, G .; Hobbs, H .; H. Koschinsky, M .; L. , Lawn, R.A. M. , Maika, S.M. D. , And Hammer, R.A. E. FIG. (1992) J Biol Chem 267, 24369-24374.
[Non-Patent Document 20]
Fan, J.M. , Shimoyamada, H .; Sun, H .; Marcovina, S .; , Honda, K .; , And Watanabe, T .; (2001) Arterioscler Thromb Vasc Biol 21, 88-94.
[Non-Patent Document 21]
Ichikawa, T .; , Unoki, H .; Sun, H .; , Shimoyamada, H .; , Marcovina, S .; M. ,
Shikama, H .; Watanabe, T .; , And Fan, J.A. (2002) Am J Pathol 160, 227-236
[Non-Patent Document 22]
Starry, H .; C. , Chandler, A .; B. , Dinsmore, R .; E. FIG. Foster, V .; Glagov, S .; Insul, W .; Jr., Jr. , Rosenfeld, M.A. E. FIG. Schwartz, C .; J. , Wagner, W.C. D. , And Wissler, R.A. W. (1995) Arterioscler Thromb Vasc Biol 15, 1512-1531.
[Non-Patent Document 23]
Kroon, P .; A. Thompson, G .; M. , And Chao, Y .; S. (1985) Atherosclerosis. 56,
323-329.
[Non-Patent Document 24]
Yamamoto, T .; , Bishop, R .; W. , Brown, M.A. S. , Goldstein, J. et al. L. , And Russell, DW. (1986) Science 232, 1230-1237
[Non-Patent Document 25]
Watanabe, Y .; (1980) Atherosclerosis 36, 261-268.
[Non-Patent Document 26]
Fan, J.M. , Challah, M .; , Shimoyamada, H .; , Shiomi, M .; Marcovina, S .; , And
Watanabe, T.W. (2000) J Lipid Res 41, 1004-1012.
[Non-Patent Document 27]
Armstrong, V .; W. , Cremer, P .; , Eberle,. E. FIG. , Manke,. A. Schulze, F .; Wieland, H .; Kreuzer, H .; , And Seidel, D.C. (1986) Atherosclerosis 62, 249-257.
[Non-Patent Document 28]
Seed, M.C. Hoppichler, F .; Reaveley, D .; McCarthy, S.M. Thompson, G .; R. ,
Boerwinkle, E.A. , And Utermann, G .; (1990) New Engl J Med 322, 1494-1499.
[Non-Patent Document 29]
Cantin, B .; Gagnon, F .; Moorjani, S .; , Despres, J .; P. , Lamarche, B .; Lupien, P .; J. , And Dagenais, G .; R. (1998) J Am Coll Cardio 31, 519-525.
[Non-Patent Document 30]
Fan, J.M. Ji, Z .; -S. Huang, Y .; , De Silva, H .; , Sanan, D.A. , Mahley, R .; , Innerarity, T, and Taylor, J.M. (1998) J Clin Invest 101, 2151-2164.
[Non-Patent Document 31]
Edelstein, C.E. , Hinman, J .; Marcovina, S .; , And Scanu, A .; M. (2001) Anal Biochem 288, 201-208.
[Non-patent document 32]
Parhami, F .; Morrow, A .; D. , Balucan, J. et al. Leitinger, N .; Watson, A .; D. , Tintut, Y .; , Berliner, J. et al. A. , And Demer, L .; L. (1997) Arterioscler Thromb VascBiol 17,680-687.
[Non-Patent Document 33]
Venient, M.C. M. Sullivan, M .; A. Kim, S .; K. Ambroziak, P .; Chu, A .; , Wilson, M.A. D. , Hellerstein, M.A. K. Rudel, L .; L. , Walzem, R .; L. , And Young, S.M. G. FIG. (2000) J Clin Invest 106, 1501-1510.
[Non-Patent Document 34]
Utermann, G .; (1995) in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited
Disease (Scrive CR, BA, Sly WS ,, ed), pp. 1887-1912, McGraw-Hill, New York
[Non-Patent Document 35]
Hsu, H .; H. , Camacho, N .; P. , Sun, Fi. Tawfik, O .; , And Aono, H .; (2000) Atherosclerosis 153, 337-348.
[Non-Patent Document 36]
Demer, L .; L. (1991) Circulation 83, 2083-2093.
[Non-Patent Document 37]
Doherty, T .; M. , And Detrano, R.A. C. (1994) Calcif Tissue Int 54, 224-230.
[Non-Patent Document 38]
Parhami, F .; , Tintut, Y .; Patel, J .; K. , Mody, N .; Hemmat, A .; , And. Demer, L .; L. (2001) Z Kardiol 90, 27-30.
[Non-Patent Document 39]
Tintut, Y. , And Demer,. L. L. (2001) Curr Opin Lipidol 12, 555-560.
[Non-Patent Document 40]
Proudfoot, D.A. , Skepper, J. et al. N. , Shanahan, C .; M. , And Weissberg, P .; L. (1998) Arterioscler Thromb Vasc Biol 18, 379-388.
[Non-Patent Document 41]
Hansen, P .; R. , Kharazmi, A, Jauhiainen, M .; , And Ehnholm, C .; (1994) Eup JClin Invest 24, 497-499.
[Non-Patent Document 42]
Galle, J.M. Schneider, R .; Heinloth, A .; , Wannar, C .; Galle, P .; R. , Conzelmann, E .; , Dimmeler, S .; , And Heermeier, K .; (1999) Kidney Int 55, 1450-1461.
[Non-Patent Document 43]
Proudfoot, D.A. , Skepper, J. et al. N. Hegyi, L .; , Bennett, M .; R. , Shanahan, C .; M. , And Weissberg, P .; L. (2000) Circ Res 87, 1055-1062.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The present inventors further investigated the involvement of Lp (a) in atherosclerotic complex lesions by examining human apo (a) Tg rabbits and WHHL rabbits, which are human animal models of familial hypercholesterolemia (FH). Were crossed to produce apo (a) Tg WHHL rabbit. WHHL rabbits are deficient in LDL receptor function (24). This apo (a) Tg WHHL model is an ideal animal for examining the involvement of Lp (a) in atherosclerotic lesions because normal diets increase plasma levels of LDL cholesterol and form atherosclerotic lesions similar to humans. Model (25). In addition, Tg WHHL rabbits have LDL receptor deficiency and therefore have a plasma Lp (a) concentration four times higher than wild type apo (a) Tg rabbits (26). On the other hand, epidemiological studies have revealed that LP (a) levels are higher in familial hypercholesterolemia patients than in healthy populations, and that higher LDL cholesterol levels significantly increase Lp (a) levels. Have been suggested (27, 28). Therefore, some researchers suggest that elevated Lp (a) may be an even greater risk factor for coronary heart disease in patients with high levels of LDL cholesterol (29).
[0007]
Therefore, it is also possible to clarify the effect of Lp (a) and LDL on the formation of atherosclerotic complex lesions in a high plasma state using the apo (a) Tg WHHL model. We have shown by this study that Tg WHHL rabbits form more extensive atherosclerotic complex lesions than non-Tg WHHL rabbits. To our knowledge, the present invention is based on the world's first finding that Lp (a) has an effect of promoting atherosclerotic complex lesion formation and calcification.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
That is, the present invention relates to the following embodiments.
1. From crosses between transgenic rabbits expressing human apolipoprotein (a) and homozygous Watanabe familial hyperlipidemia (WHHL) rabbits, characterized by progressive atheroma lesions in the aortic arch and thoracic / abdominal aorta The obtained rabbit [LDLr − / −, apo (a) +/−] or [LDLr − / −, apo (a) + / +]).
2. A rabbit obtained from a cross between a transgenic rabbit expressing human apolipoprotein (a) and a homozygous Watanabe familial hyperlipidemia (WHHL) rabbit, characterized by calcification or calcification in blood vessels. [LDLr − / −, apo (a) +/−] or [LDLr − / −, apo (a) + / +]).
3. A factor consisting of lipoprotein (a) that promotes calcification of blood vessels.
4. A factor consisting of lipoprotein (a) that enhances calcium accumulation in aortic smooth muscle cells.
5. A factor consisting of lipoprotein (a) that increases MGP mRNA expression in aortic smooth muscle cells.
6. An agent consisting of lipoprotein (a), which decreases mRNA expression of OPN in aortic smooth muscle cells.
7. A factor consisting of lipoprotein (a) that enhances alkaline phosphatase activity in aortic smooth muscle cells.
8. A factor comprising lipoprotein (a), which induces Osf2 mRNA expression in aortic smooth muscle cells.
9. The factor according to any one of aspects 3 to 8, wherein the lipoprotein (a) is derived from a human.
10. The factor according to any one of aspects 3 to 8, wherein the lipoprotein (a) is derived from a transgenic rabbit expressing human apolipoprotein (a).
11. A pharmaceutical composition comprising a factor that inhibits or suppresses the function of lipoprotein (a).
12. The pharmaceutical composition according to aspect 11, which has an action of suppressing calcium deposition or calcification in blood vessels.
13. The pharmaceutical composition according to aspect 11, which is a therapeutic agent for atherosclerosis.
14． An antibody against the factor according to any one of aspects 3 to 10.
15. An antibody against human apolipoprotein (a).
16. An agent for inhibiting calcification or calcification in blood vessels, comprising the antibody according to aspect 14 or 15.
17. A therapeutic agent for atherosclerosis, comprising the antibody according to aspect 14 or 15.
18. Antisense oligonucleotides against mRNA of apolipoprotein (a) gene.
19. 19. The antisense oligonucleotide according to aspect 18, which is a DNA oligomer.
20. An inhibitor of calcium deposition or calcification in blood vessels, comprising the antisense oligonucleotide according to aspect 18 or 19.
21. A therapeutic agent for atherosclerosis, comprising the antisense oligonucleotide according to aspect 18 or 19.
22. A method for inhibiting calcification or calcification in blood vessels by inhibiting the action of lipoprotein (a).
23. A method for inhibiting calcium deposition or calcification in blood vessels by inhibiting the action of lipoprotein (a) by reacting with the antibody according to aspect 14 or 15.
24. A method for suppressing calcification or calcification in blood vessels by suppressing the production of lipoprotein (a).
25. A method for suppressing calcium deposition or calcification in blood vessels by controlling the expression of the apolipoprotein (a) gene.
26. 25. The method according to aspect 23 or 24, wherein calcification or calcification in blood vessels is suppressed by reacting with the antisense oligonucleotide according to aspect 18 or 19.
27. A method for treating atherosclerosis by inhibiting the action of lipoprotein (a).
28. A method for treating progressive atherosclerosis by inhibiting the action of lipoprotein (a) by reacting with the antibody according to aspect 14 or 15.
29. A method for treating atherosclerosis by suppressing the production of lipoprotein (a).
30. A method for treating atherosclerosis by controlling the expression of the apolipoprotein (a) gene.
31. 31. The method according to aspect 29 or 30, characterized in that atherosclerosis is treated by reacting with the antisense oligonucleotide according to aspect 18 or 19.
[0009]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The rabbit according to the present invention ([LDLr − / −, apo (a) +/−] or [LDLr − / −, apo (a) + / +]) is a transgenic rabbit homozygous for Watanabe familial hyperlipidemia. The disease was obtained from a rabbit (WHHL) by a continuous breeding method known to those skilled in the art. The rabbit has characteristics as described in the examples, for example, having progressive atheroma lesions in the aortic arch and thoracic / abdominal aorta, and calcification or calcification in blood vessels. This rabbit is a very useful model to test the benefits of some drugs in treating atherosclerosis in high Lp (a) patients.
[0010]
The factor comprising the lipoprotein (a) according to the present invention has a function of promoting vascular calcification, a function of increasing calcium accumulation in aortic smooth muscle cells, a function of increasing MGP mRNA expression in aortic smooth muscle cells, It has a function of decreasing mRNA expression of osteopontin (OPN) in smooth muscle cells, a function of enhancing alkaline phosphatase activity in aortic smooth muscle cells, and a function of inducing Osf2 mRNA expression in aortic smooth muscle cells. .
This lipoprotein (a) is derived from various animals, particularly humans and transgenic rabbits expressing human apolipoprotein (a). Aortic smooth muscle cells are derived from mammals such as humans and rabbits.
[0011]
The pharmaceutical composition of the present invention contains, as an active ingredient, a factor that inhibits or suppresses various functions of lipoprotein (a) as described above.
This pharmaceutical composition organism has an action of suppressing calcification or calcification in blood vessels, or is useful as a therapeutic agent for atherosclerosis.
Such factors can be determined by those skilled in the art based on, for example, the effect of inhibiting or suppressing the function of lipoprotein (a) using each in vitro culture system using aortic smooth muscle cells described herein. Then, screening, identification and isolation can be easily performed.
The pharmaceutical composition can contain appropriate amounts of various pharmaceutically acceptable auxiliaries known to those skilled in the art.
The contents of the active ingredient and various adjuvants in the pharmaceutical composition may be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of each ingredient, the purpose of treatment, the weight, age, and sex of the subject to be treated, and the degree of the disease. Can be done.
[0012]
The antibody of the present invention against the factor consisting of human apolipoprotein (a) or human lipoprotein (a) can be any kind of antibody such as polyclonal and monoclonal. These various antibodies can be easily prepared by an appropriate method known to those skilled in the art. The antibody thus obtained is useful, for example, as an inhibitor of calcification or calcification in blood vessels, or as a therapeutic agent for atherosclerosis.
[0013]
An antisense oligonucleotide for the mRNA of the apolipoprotein (a) gene of the present invention can be easily designed and manufactured by those skilled in the art based on the known gene sequence. It is, for example, a DNA oligomer or scRNA.
The antisense oligonucleotide thus obtained is useful, for example, as an inhibitor of calcification or calcification in blood vessels, or as a therapeutic agent for atherosclerosis.
[0014]
The suppressor and the therapeutic agent of the present invention can contain appropriate amounts of various pharmaceutically acceptable auxiliaries known to those skilled in the art.
The content of the active ingredient and various adjuvants in each drug can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of each component, the purpose of treatment, the weight, age, and sex of the subject to be treated, and the degree of the disease. I can do it.
[0015]
The present invention relates to a method for inhibiting calcification or calcification in blood vessels or treating progressive atherosclerosis.
These methods of the present invention inhibit the action of lipoprotein (a) by using, for example, the above-mentioned pharmaceutical composition or the antibody of the present invention. By using the antisense oligonucleotide (1), the production of lipoprotein (a) can be suppressed or the expression of apolipoprotein (a) gene can be controlled.
In the method of the present invention, the timing, frequency, and amount of use of the pharmaceutical composition, antibody, antisense oligonucleotide, or various drugs are determined according to the purpose of treatment, the weight, age, and sex of the treatment target, and the degree of disease. A person skilled in the art can appropriately select the method according to the above.
[0016]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0017]
experimental method
Human apo (a) Tg WHHL rabbit
Tg rabbits expressing human apo (a) were bred with homozygous WHHL rabbits according to the previously reported method (26). Using the continuous breeding method, non-Tg (wild type) homozygous WHHL rabbit [LDLr − / −] and homozygous Tg WHHL rabbit expressing human apo (a) [LDLr − / −, apo (a) + / -], Two groups of WHHL rabbits were obtained. The presence of the human apo (a) transgene was confirmed by Southern blotting using a human apo (a) cDNA probe, and the genotype of the LDL receptor was identified by PCR analysis (26). A total of 8 Tg WHHL rabbits and 7 littermate non-Tg WHHL rabbits were obtained, and pathological analysis of atherosclerotic lesions was performed at 7 to 8 months of age.
[0018]
Analysis of lipids, lipoproteins and atheromatous lesions in plasma
The distribution of lipids and lipoproteins in the plasma of 7-month-old Tg WHHL rabbits was compared to non-Tg WHHL rabbits of the same age (30). Plasma Lp (a) values of Tg WHHL rabbits were measured (26). For analysis of aortic lesions, after staining with Sudan IV, the lesion area was measured using an image analyzer (20). In order to pathologically analyze the lesion site of the aorta, each portion of the aorta was excised in a cross section from three non-overlapping sites of the aortic arch, the thoracic aorta, and the abdominal aorta (21). All sections were paraffin-embedded and stained with hematoxylin and eosin and Elastica Wangieson. The degree of intimal thickening of each section was measured by a computer-based image analysis system.
In order to examine the cellular components and lipoprotein deposition of the lesion, immunohistochemical staining was performed in accordance with the previously reported method (21). Further, 12 autopsy coronary artery specimens of patients who died of acute myocardial infarction were obtained from the University Hospital of Tsukuba, and the correlation between calcification and LP (a) accumulation was evaluated by the above method.
[0019]
SMC calcification in vitro test
Smooth muscle cells (SMC) were isolated from rabbit aorta and cultured in a minimum essential medium (MEM, Gibco BRL) containing 20% FBS. Plasma was collected from 6 healthy subjects in our laboratory, and human LP (a) was purified by a series of ultracentrifugation and gel filtration chromatography (Sephacryl S-400, Amersham Pharmacia Biotech) according to a previous report (31). By Western blotting using anti-apo (a) and anti-apoB antibody (Ab), it was confirmed that the purified protein was Lp (a). It was confirmed that Lp (a) was not contaminated with endotoxin (<10 pg / mL).
After treatment with Lp (a), cell-associated alkaline phosphatase activity and calcium accumulation of SMC were measured according to a previous report (32). To directly visualize calcification, SMCs were exposed to 5-30 mg / dl Lp (a) for 13 days and stained with Van Kossa staining (32).
[0020]
Reverse transcription PCR analysis
The oligonucleotide primers used in the quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method are as follows. (1) Osteopontin (OPN) 5'-TTC ACT GAA GTC GTT CCC AC-3 'and 5'-TTT CAT ATT GGC TGG CAT CTT G-3'. (2) Osteoblast-specific factor-2 (Osf2) 5'-ACA TAT TCC GCG AGA TCA TC-3 'and 5'-ATT CGT TCT TCT CGT GTC TC-3'. (3) Substrate Gla protein (MGP) 5'-GCC TGC TTC TTC TCA CTG TTC-3 'and 5'-GTA CAT ATC AGT CTG GGG GC-3'. (4) β-actin 5′-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3 ′ and 5′-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3 ′.
[0021]
RNA was isolated from SMC using Trizol reagent (Gibco BRL) and analyzed by RT-PCR using QIAGEN OneStep RT-PCR kit. Each RT-PCR product was electrophoresed on a 1.2% agarose gel and stained with Vistra Green (Amersham Pharmacia Biotech). The concentration of the RT-PCR product was measured using FluorImager 595 (Amersham Pharmacia Biotech). It was confirmed by DNA base sequence analysis that the RT-PCR product was a primer-specific amplification product.
[0022]
Statistical analysis
Plasma lipids and in vitro test data were evaluated for statistical significance using a Student's t-test. Statistical significance of the analysis results of atherosclerotic lesion area was evaluated using the Mann-Whitney U test. Statistical significance was set at P <0.05 for all cases.
[0023]
result
Lipids and lipoproteins in plasma
Tg WHHL rabbits and non-Tg WHHL rabbits developed hyperlipidemia equally with normal diet (total cholesterol: 791 ± 141 mg / dL, Tg (n = 8) and 717 ± 135 mg / dL, non-Tg ( n = 7), triglycerides: 216 ± 52 mg / dL, Tg and 250 ± 55 mg / dL, non-Tg, P> 0.05). The average plasma concentration of Lp (a) in Tg WHHL rabbits was 15.4 ± 2.2 mg / dL. By analyzing the lipoprotein distribution by agarose gel electrophoresis, the lipoproteins migrating to β were significantly increased in the WHHL rabbits, both Tg and non-Tg, compared to normal wild-type rabbits, and the lipoproteins migrating to α Was shown to be reduced (FIG. 1A). After non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis, Western blotting was performed, and it was found that human apo (a) binds to rabbit LDL and forms an Lp (a) complex (FIG. 1B). Under non-reducing conditions, only a small amount (approximately 20%) of plasma apo (a), present as a macromolecule, coexists with rabbit apoB, which indicates that covalent and non-covalent bonds can cause Tg rabbit Lp ( a) suggests that like-like particles [human apo (a) / rabbit apoB] are produced (FIG. 1C). Analysis of the lipoprotein fractions at different densities revealed that Tg WHHL rabbits had approximately the same amount of apoB, ApoE and ApoAI as non-Tg rabbits (FIG. 1D). In Tg WHHL rabbits, human apo (a) is mainly distributed at d = 1.02 to 1.08 g / mL (F3 to F5), and lipoproteins containing apoB are also distributed in this range (FIG. 1D). It should be noted that small amounts of human apo (a) were found to be of low density, eg, VLDL (d <1.006 g / mL) and medium density lipoprotein (d = 1.006 to 1.02 g / mL, F2) fractions. A low fraction was also observed, suggesting that, in addition to LDL, apo (a) can bind to other large particles containing apoB. Quantification of lipids in the plasma fraction by density indicated that Tg WHHL rabbits had a lipoprotein distribution pattern that was approximately the same as non-Tg WHHL rabbits.
[0024]
Aortic atherosclerosis
To perform a histo-distributive and spatial assessment of lesion development, we measured Sudan-preferred en face lesion area and intimal hyperplasia. The en face lesions in the entire aorta were not significantly different between Tg rabbits and non-Tg rabbits, 27.7 ± 8.4%, Tg WHHL, n = 7 and 26.6 ± 8.4%, non-Tg, n = 8, p = 0.3. The Sudan-stained lesions of Tg WHHL rabbits were significantly thicker than the non-Tg WHHL rabbits, and the intimal lesions at each site were quantitatively evaluated. Intimal lesions in Tg WHHL rabbits were significantly greater than in non-Tg WHHL rabbits, 3.3 times in the aortic arch (P <0.01) and 2 times in the thoracic / abdominal aorta (P = 0.08). (FIG. 2A). The pathological features of atheromatous lesions in Tg WHHL rabbits were significantly different from non-Tg WHHL rabbits. In non-Tg WHHL rabbits, the atheromatous lesions were fatty plaques and were enriched in macrophage-derived foam cells along with a small population of mixed SMCs (FIG. 2B, top picture). The clear difference is that advanced lesions have formed in Tg WHHL rabbits, including atheroma, fibrous atheroma and calcification (FIG. 2B, bottom three pictures). Such lesions were referred to as progressive atheromatous lesions because they were covered with a fibrous cap layer and contained necrotic or lipid cores often associated with calcification or calcification. By immunohistochemical staining, the necrotic core contained macrophage-derived foam cells, whereas the thickened fibrous cap layer consisted mainly of SMC (FIG. 2B).
[0025]
Since the lesion quality was very different between Tg WHHL rabbits and non-Tg WHHL rabbits, the area occupied by various lesions in the aortic arch was further quantified, and the lesion distribution of Tg WHHL rabbits was compared with that of non-Tg WHHL rabbits. Therefore, the lesion was arbitrarily classified into three categories based on the classification of the American Heart Association (22). The three categories are fatty plaques (type II), fibrous plaques containing atheromas (type IV) and fibrous atheromas (type Va), and combined plaques containing either calcification or calcification (type Vb). is there. As shown in FIG. 2C, there is no significant difference in the lesion area of the fatty spot between the Tg WHHL rabbit and the non-Tg WHHL rabbit. However, fibrotic plaque lesions and progressive lesions (types IV and V) were significantly larger in Tg WHHL rabbits than in non-Tg WHHL rabbits.
We show that in some of the lesions of Tg WHHL rabbits, vascular calcification appears to clearly enhance lesion erosion or rupture, so we have shown that significant vascularization associated with progressive lesions in Tg WHHL rabbits. Of particular interest in calcification (FIG. 3A). Immunostaining of apo (a) and apoB with Ab revealed that apo (a) accumulated around the calcified area and often co-existed with apoB (FIG. 3B). Apo (a) has also been identified in the lipid core of fibrous plaques of TgWHHL rabbits, which is often associated with calcification (FIG. 3C). X-ray analysis of the entire aorta revealed that the Tg WHHL rabbit had many calcified sites in the aorta, particularly at sites where lesions are likely to occur (intercostal artery ostium), but no such sites were found in the non-Tg WHHL rabbit. (FIG. 3D).
[0026]
Effect of Lp (a) on calcification of SMC
To answer the question of whether Lp (a) acts as a regulator of accelerating vascular calcification found in Tg WHHL rabbits, the effect of human Lp (a) on calcium accumulation in cultured SMC was examined. Addition of physiological concentrations of Lp (a) significantly increased the calcium uptake of SMC, and its effect was dose- and time-dependent (FIG. 4A). Furthermore, SMC treated with Lp (a) enhanced mRNA expression of the calcium-binding protein substrate Gla protein (MGP) on days 2 and 4 (FIG. 4B, left). Osteopontin (OPN) expression increased slightly on day 2 but dropped significantly on day 4 (FIG. 4B, right). Moreover, Lp (a) induced osteoblast-specific factor-2 (Osf2) mRNA expression while enhancing intracellular alkaline phosphatase activity, and a phenomenon similar to the induction of osteoblast differentiation was observed (FIG. 5C). ). Incubation of SMC with a relatively high concentration of 30 mg / dL Lp (a) for 3 days resulted in an increase in the number of nodular formations in the SMC compared to the control (FIG. 5D). Thirteen days after the addition of Lp (a), calcium deposition was clearly shown by Van Kossa staining (FIG. 5E).
[0027]
Lp (a) deposition and calcification in human atherosclerosis
The finding that Tg WHHL rabbits have more extensive progressive lesions and the ability of Lp (a) to induce calcification in cultured SMCs are based on the Lp (a) of the vascular wall where calcification caused human atherosclerosis. This gave us an opportunity to investigate whether it was related to the deposition. Three samples of typical coronary atherosclerosis from multiple patients show varying degrees of calcification, with diffuse (old) calcification (FIGS. 6A, B) or low density associated with cellular components It was confirmed that Lp (a) was detected in the vicinity of any site where calcium deposition (FIG. 6C) was observed.
[0028]
Consideration
We have shown for the first time in this study that Lp (a) promotes the development of progressive lesions in Tg WHHL rabbits. Tg WHHL rabbits have high plasma LDL cholesterol levels, similar to non-Tg WHHL rabbits, but also have relatively high human Lp (a) concentrations. In this regard, two models (apo (a) Tg and non-Tg WHHL) provide one risk factor and two risk factors: high LDL cholesterol alone and high LDL cholesterol and high Lp (a) Atherogenicity can be compared. Tg WHHL rabbits have more atheromatous lesions in the aortic arch and thoracic / abdominal aorta than non-Tg WHHL rabbits, respectively, and the lesions are composed of progressive lesions such as atheroma, fibrous atheroma and calcification. The findings of extensive progressive atherosclerotic lesions in Tg WHHL rabbits not only support the opinion that Lp (a) is a risk factor for developing atherosclerosis, but also increase the risk of hypercholesterolemia for atherosclerosis. It also reinforces the general view that it rises significantly in the context of Lp (a).
[0029]
It is surprising that Lp (a) does not significantly increase the range of Sudan-favored lesions in Tg WHHL rabbits, which is different from the results we observed in cholesterol-fed apo (a) Tg rabbits (20). This discrepancy between cholesterol-fed Tg rabbits and WHHL Tg rabbits may be due to differences in their atherogenic particles (large β-VLDL and small LDL) (33) or very high LDL concentrations in WHHL rabbits. Probably exceeded the effect of Lp (a) on early lesion formation. In humans, Lp (a) values above 30 mg / dL are considered atherogenic (34). In TgWHHL rabbits, even though the plasma Lp (a) value (15 mg / dL) is below this arbitrary threshold, it is still a factor that significantly promotes atherogenesis for rabbits that do not normally have endogenous Lp (a). It appears to be. The distribution of lipoproteins in TgWHHL rabbits and non-Tg WHHL rabbits is essentially the same, and the possibility that the amount of apoB in cholesterol and LDL promotes progressive atherosclerosis in Tg WHHL rabbits can be ruled out. Therefore, the presence of plasma Lp (a) is considered to be a major factor that significantly exacerbates the pathology of Tg WHHL rabbits. The presence of a lipid core and a fibrous cap layer in the progressive lesions of Tg WHHL mimics the characteristics of atherosclerosis in humans (22).
[0030]
One important finding for this study was that Tg WHHL rabbits showed marked vascular calcification, which was not confirmed in non-Tg WHHL rabbits. We have confirmed that the calcification of Tg WHHL rabbits is not due to elevated plasma phosphate or calcium and / or enhanced alkaline phosphatase activity. It is notable that vascular calcification was not observed in either human apo (a) Tg mice (11) or cholesterol-fed Tg rabbits (20). In normal rabbits fed a fairly high cholesterol (2%) diet, the formation of calcifiable matrix vesicles was reported in the aorta rather than calcified lesions (35), while non-Tg WHHL Rabbits have been found to develop vascular calcification when fed a diet rich in cholesterol, vitamin D and calcium (38) or when the average age reaches 15 months. Vascular calcification is a common feature of atherosclerotic lesions in humans and contributes to many clinical problems such as coronary heart disease and aortic rupture (37). In this regard, since the lesions in Tg WHHL rabbits are common to many of the features of calcification seen in human progressive atherosclerosis, the rabbits were tested for vascular calcification associated with atherosclerosis. Could be used as an ideal model for Due to the presence of calcification in the lesions of Tg WHHL rabbits and the close association between Lp (a) and calcification in human atheromatous lesions, we find that Lp (a) is a potential mediator of the vascular calcification process I came up with the hypothesis. This study suggests that vascular calcification may be due to an active rather than terminal, passive or degenerative process of aging (38,39).
[0031]
A crucial question is whether Lp (a) can really induce calcification in vascular cells such as SMC. To answer this question, we took several steps to examine the effect of Lp (a) on the calcification of cultured SMCs in vitro. First, treatment of SMC with a physiological concentration of Lp (a) enhanced calcium accumulation in a dose-dependent and time-dependent manner. Next, Lp (a) significantly up-regulated MGP mRNA expression in SMCs on day 4 while down-regulated OPN expression in SMCs. This pattern of osteogenic protein expression (increased MGP and decreased OPN) is consistent with the view that calcification of SMCs is associated with high MGP and low OPN in human vascular SMC (42). Furthermore, in SMC treated with Lp (a), Osf2 was up-regulated and alkaline phosphatase activity was enhanced at the same time, so that Lp (a) induced differentiation of SMC into osteoblasts, thereby reducing calcification. Seems to be exacerbated. From the above, such results strongly suggest that Lp (a) may be involved in the calcification process of blood vessels.
[0032]
The mechanism by which Lp (a) promotes the formation of progressive atherosclerotic lesions in Tg WHHL rabbits is unclear, but the presence of necrotic or lipid cores in the lesions may lead to either necrotic or apoptotic cells. Death has been shown to occur, whereby it is interesting to see whether Lp (a) directly or indirectly induces such cell death, and whether cell death is also involved or required in the subsequent calcification process. I have doubts. Previous studies have shown that Lp (a) enhances superoxide production in monocytes (41) and induces apoptosis in human endothelial cells and rabbit aorta (42). If this mechanism does work in vivo, it is certainly useful in explaining the findings observed in Tg WHHL rabbits. Consistent with this possibility, several studies with cultured SMC have shown that apoptosis occurs prior to SMC calcification and that apoptotic bodies are capable of initiating vascular calcification. (43).
[0033]
In conclusion, our current study provides further evidence that Lp (a) is not only a risk factor for the development of atherosclerosis, but also an inducer of the progression of lesion formation. Moreover, we show that Lp (a) is a potential regulator in vascular calcification associated with atherosclerosis. Although the molecular mechanisms of Lp (a) for atherogenesis and calcification are not well understood, the formation of progressive atherosclerosis in Tg WHHL rabbits has been studied in human atherosclerosis studies, plaque rupture and It has been clearly demonstrated to be useful for studying atherosclerotic complications such as aneurysms. It is also interesting to evaluate whether Tg WHHL rabbits increase the incidence of myocardial infarction in future studies. We believe that the Tg WHHL model of high Lp (a) and progressive atherosclerosis would be a very useful model to test the benefits of some drugs in treating atherosclerosis in high Lp (a) patients thinking.
[0034]
【The invention's effect】
According to the present invention, the involvement of calcification in Lp (a) can be attributed to osteoporosis and arteriosclerosis, such as multiple risk factor syndrome in lifestyle-related diseases. He suggested that vascular calcification might be a common disease. Therefore, it is expected that this will lead to the discovery of a group of factors that comprehensively control both factors, and eventually to the elucidation of the pathology of osteoporosis. In addition, the implications for the medical industry are enormous, as the immense number of regulators involved can be imagined. That is, the present invention provides the development of new therapeutic principles, preventive methods, diagnostic methods, and drugs for circulatory disorders, ischemic heart disease, and cerebral infarction caused by atherosclerotic complex lesions.
[Brief description of the drawings]
Fig. 1. Analysis of plasma lipoprotein
A. 4 is a photograph showing the results of agarose gel electrophoresis of plasma obtained from WHHL rabbits and normal rabbits fed a normal diet. Plasma (2 μl) stained with Fat Red 7B (top), Western blot analysis using human apo (a) monoclonal antibody (bottom).
BC. 4 is a photograph showing the results of Western blot analysis of Tg WHHL rabbit and human plasma apo (a).
Plasma was separated by either 3.5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (B) or 4% SDS-PAGE under non-reducing conditions (C, left) or reducing conditions (C, right). . The same membrane that was subjected to Western blotting was stripped and reprobed with the apoB antibody. * Indicates that apo (a) and apoB are covalently bonded to form Lp (a), and ** indicates Lp (a) and free apo (a) associated by non-covalent bonding.
D. It is a photograph which shows the result of having separated seven fractions (F1-F7) according to the density of a plasma lipoprotein, and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis. F1 is d <1.006 g / ml, F2 is d = 1.006 to 1.02 g / ml, F3 is d = 1.02 to 1.04 g / ml, and F4 is d = 1.04 to 1.06. , F5 is d = 1.06 to 1.08, F6 is d = 1.08 to 1.10 g / ml, and F7 is d = 1.10 to 1.21 g / ml. Lipoproteins were stained with Fatred 7B, and each apolipoprotein was detected by Western blotting (30).
FIG. 2. Quantitative and histological analysis of atheromatous lesions in the aorta.
A. Five sections of the most Sudan-favored lesions from the aortic arch or thoracic and abdominal aorta were examined and intimal lesions were evaluated using an image analysis system. * P <0.01 against non-Tg WHHL
B. 3 is a photograph showing the results of a histological test and an immunohistochemical test of an atheromatous lesion. Serial sections of paraffin-embedded aortic arch were stained with either hematoxylin-iodin (HE) or antibodies to macrophages (MФ) and SMC (SM-α-actin). Top row: typical fatty streak, type II lesion (non-Tg WHHL). Upper photo of lower three: typical fibrous plaque with covering and necrotic core, type IV lesion (Tg WHHL). Middle photo of lower three: Va-type lesion with prominent lipid core and calcification (Tg WHHL). Bottom photograph of lower three: Vb type lesion with marked calcification (Tg WHHL). The scale represents 200 μm.
C. Quantification of various lesions in the aorta. The lesions may be predominantly foam cells, fatty plaques, fibrous plaques (including types IV and Va) containing a typical necrotic core and a fibrous covering, combined plaques containing calcification or complete calcification ( Vb-type lesion). The area occupied by various lesions was measured on the sections. * P <0.05 against non-Tg WHHL
FIG. 3 is a photograph showing a progressive lesion image associated with calcification of a Tg WHHL rabbit.
A. Aortic lesions were stained with HE, and calcification of the blood vessels (arrows) appeared to enhance erosion or rupture of the lesions. The scale represents 200 μm.
B. Serial frozen sections of the aortic arch with calcification (type Vb) were immunostained with antibodies to apo (a) and apoB. apo (a) and apoB were detected near calcification. The scale represents 200 μm.
C. Calcification image of necrotic core of typical fibrous plaque of Tg WHHL rabbit. This calcium deposition was detected by von Kossa staining, and apo (a) was detected in the vicinity (C upper row). The center of the lesion contains macrophages and is covered by SMC (C bottom). The scale represents 200 μm.
D. Radiation image of aortic calcification. Note that the Tg WHHL aorta has many calcification sites (indicated by white arrows).
FIG. 4. Effect of Lp (a) on calcification in SMC.
A. Lp (a) enhances calcium deposition in a dose-dependent and time-dependent manner. Calcium deposition on rabbit aortic SMC was treated with the indicated concentrations of Lp (a) for 48 h (left panel) and incubated in the presence of 10 mg / dL Lp (a) or the same amount of LDL for the indicated period. (Right figure). * P <0.01 vs control
B. Effect of Lp (a) on MGP (left) and OPN (right) mRNA expression. SMC were incubated for 48 hours in the presence of 10 mg / dL Lp (a). The results are shown by the ratio of the expression level of MGP to β-actin and the expression level of OPN to β-actin. * P <0.05 vs control
FIG. Lp (a) enhances Osf2 mRNA expression (left) and intracellular alkaline phosphatase activity (right) in SMC. SMC were incubated for 3 days in the presence of Lp (a) at the indicated concentrations. Osf2 mRNA expression was measured by quantitative RT-PCR analysis. The results are expressed as the expression level of Osf2 relative to β-actin. A photograph showing the result of gel electrophoresis of the PCR product is shown above. * P <0.01 vs control
D. FIG. 4 is a photograph showing SMC treated with 30 mg / dL Lp (a) for 3 days, in which the number of nodular formations increased (right). The scale represents 200 μm.
E. FIG. Photograph showing SMC treated with Lp (a) for 13 days, showing calcification by von Kossa staining (right). The scale represents 200 μm.
FIG. 6 is a photograph showing a close relationship between calcification in human coronary arteries and Lp (a).
A. The right photograph shows Lp (a) deposits (indicated by arrows) observed along the surface of the calcified area.
B. Lp (a) present around old calcification is shown.
C. In this lesion, calcium deposits are distributed at low density below the foam cells, and Lp (a) deposits are intermingled in SMC. Original magnification: Scale represents 200 μm.
